BRPI0709783A2 - plataformas de cromossomos artificiais de planta via truncagem de telâmero - Google Patents

Abstract

<B>PLATAFORMAS DE CROMOSSOMOS ARTIFICIAIS DE PLANTA VIA TRUNCAGEM DE TELOMERO<D>A presente invenção refere-se a minicromossomos de planta elaborados que são gerados por truncagem mediada por telômero de cromossomos nativos. Esses minicromossomos são fielmente transmitidos de uma geração à próxima e fornecem uma plataforma ideal para a criação de genes em variedades desejadas de plantas sem problemas, tal como arrastede ligação, associada com métodos de criação padrão.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PLATAFOR-MAS DE CROMOSSOMOS ARTIFICIAIS DE PLANTA VIA TRUNCAGEMDE TELÔMERO".

Este pedido reivindica a prioridade do Pedido de Patente Provi-5 sória U.S. N9 Serial 60/798,830, depositado em 9 de Maio de 2006, e do Pe-dido de Patente Provisória U.S. Nq Serial 60/862,733, depositado em 24 deOutubro de 2006, as descrições inteiras dos quais são especificamente in-corporadas aqui por referência.Campo da Invenção

A invenção refere-se aos campos de biologia molecular e gené-tica de plantas. Mais especificamente, a invenção refere-se a plataformas deminicromossomo artificial de planta e métodos para sua produção e uso.

Descrição da Técnica Relacionada

A manutenção e a herança de cromossomos em um organismotipicamente exigem três elementos essenciais: origens de replicação, umcentrômero e telômeros, como previamente identificados com cromossomosartificiais de levedura. Murray e Szostak (1983), por exemplo, descreveramum sistema de clonagem baseado na construção in vitro de cromossomosartificiais de levedura lineares. Entretanto, nenhum dos elementos de ácidonucléico que foram identificados é suficiente para manter cromossomos arti-ficiais em sistemas eucarióticos multicelulares.

Um método para gerar um cromossomo artificial é por constru-ção de novo, isto é, conjunto de centrômeros, telômeros e marcadores sele-cionáveis e reintrodução em plantas (Patente U.S. Nq 7.015.372). Entretanto,os cromossomos são conhecidos como tendo um limite de tamanho mínimopara eficiente transmissão através de meiose (Schubert, 2001). Embora amaior parte dos minicromossomos mamíferos de novo possa transmitir du-rante mitose, a transmissão de tais minicromossomos em linhas genéticasnão foi relatada. Os únicos cromossomos artificiais de novo transmitidos deforma meiótica em eucariotes até agora são cromossomos artificiais de leve-dura (Murray e Szostak, 1983; Murray e Szostak, 1986). Adicionalmente, foiindicado que centrômeros de plantas necessitam ser maiores do que apro-ximadamente uma megabase em tamanho para transmissão normal (Kaszase Birchler, 1998) e esse tamanho é maior do que pode atualmente ser mon-tado in vitro.

Em contraste, alguns cromossomos truncados com centrômerosnativos são transmissíveis através de meiose (Shinohara e outros, 2000;Tomizuka e outros, 1997, 2000; Voet e outros, 2001; Shen e outros, 1997,2000; Schubert, 2001; Zheng e outros, 1999; Kato e outros, 2005; McCIin-tock, 1938; Brock e Pryor1 1996; Nasuda e outros, 2005). Um método paratruncar cromossomos que foi aplicado em sistemas de mamíferos é trunca-gem mediada por telômero (Farr e outros, 1991, 1992, 1995; Barnett e ou-tros, 1993; Itzhaki e outros, 1992; Heller e outros, 1996; Mills e outros, 1999;Saffery e outros, 2001). Entretanto, nenhum método para truncagem media-da por telômero de cromossomos de plantas foi descrito até agora.

Outros métodos de apagar cromossomos foram aplicados a sis-temas de plantas. Por exemplo, cromossomos de milho alterados foram ge-rados por raio X ou irradiação gama de pólen de milho (McCIintock, 1938;Brock e Pryor, 1996) ou através de uma translocação B-9 com 9S duplicado(Zheng e outros, 1999; Kato e outros, 2005). Entretanto, cromossomos alte-rados criados por esses métodos careciam de transmissão estável durantemeiose ou mitose, não carregam sítios de recombinação específica em sítio,não habilitaram expressão eficiente de seqüências heterólogas ou foram di-fíceis de produzir. Assim, permanece uma grande necessidade na técnicapor métodos para produzir e usar minicromossomos de planta.

Sumário da Invenção

A invenção supera limitações na técnica fornecendo minicro-mossomos de planta que podem ser eficientemente transmitidos através demitose e meiose. O termo "minicromossomo" refere-se a cromossomos cria-dos por engenharia feitos apagando partes de um cromossomo nativo. As-sim, os minicromossomos são distintos de cromossomos artificiais feitos denovo por técnicas de DNA recombinante. Em modalidades específicas, osminicromossomos de planta descritos aqui são fornecidos derivados de umcromossomo de planta nativo de partida que é truncado pela inserção derepetições de telômero. Assim, os minicromossomos de planta da invençãopodem ser definidos como compreendendo pelo menos um braço de cro-mossomo que foi truncado. Em algumas modalidades adicionais, um mini-cromossomo de planta é truncado em ambos os braços. Um minicromosso-mo de planta pode, em alguns aspectos, ser eficientemente transmitidos du-rante mitose e meiose em uma planta que é a mesma espécie da planta docromossomo de partida. Um versado na técnica entenderá que tais minicro-mossomos geralmente compreendem um centrômero funcional e origens dereplicação, ambos os quais permitem manutenção fiel.

Em um aspecto da invenção, um minicromossomo de plantacompreende um centrômero nativo. Os centrômeros nativos são encontra-dos em cromossomos endógenos e são compreendidos de repetições decentrômeros (Jiang e outros, 2003). Essas seqüências fornecem segregaçãoeficiente de cromossomos durante a divisão celular tal como mitose e meio-se. Assim, em certos aspectos da invenção, um minicromossomo de planta édefinido como compreendendo uma seqüência de centrômero de planta na-tivo. Em modalidades adicionais, um minicromossomo da invenção pode serdefinido como não compreendendo um neocentrômero.

Um minicromossomo pode adicionalmente compreender se-qüências de telômero criadas por engenharia. Como usado aqui, o termo"seqüência de telômero criadas por engenharia" refere-se à seqüências detelômero que estão em um contexto diferente daquelas encontradas em umcromossomo nativo. Por exemplo, as seqüências de telômero criadas porengenharia em minicromossomos da invenção podem estar mais próximasao centrômero do minicromossomo se comparado a um telômero nativo. Porexemplo, em um minicromossomo de planta da invenção, uma seqüência detelômero criada por engenharia pode ser definida como aproximadamente 10kb a aproximadamente 10 Mb do centrômero da seqüência de cromossomonativo. Em modalidades mais específicas, um telômero criado por engenha-ria pode ser aproximadamente 10 kb a aproximadamente 5 Mb ou aproxima-damente 100 kb a aproximadamente 1, 2, 3, 4 ou 5 Mb a partir do centrôme-ro de uma seqüência de cromossomo nativo. Os minicromossomos de plantada invenção podem adicionalmente compreender duas seqüências de telô-mero criadas por engenharia, que podem ser distâncias diferentes do cen-trômero do minicromossomo.

As seqüências de telômero criadas por engenharia podem serde uma variedade de fontes. Por exemplo, as seqüências de telômero cria-das por engenharia podem ser da mesma espécie de planta ou variedadecomo as seqüências de cromossomos nativos ou de uma espécie de plantadiferente relativa às seqüências de cromossomos nativos. Por exemplo, asseqüências de telômero podem ser as seqüências de telômero clonadas depAtT4 compreendendo repetições diretas do motivo telomérico tipo Arabi-dopsis, TTTAGGG (SEQ ID NO:1), ou derivados desses (Richards e Ausub-el, 1988). Nesse caso, cada repetição compreende 430 pares base de se-qüências teloméricas. As seqüências de repetição de telômero criadas porengenharia podem ser de milho, trigo, aveia, arroz, Arabidopsis e soja. Oversado na técnica entenderá que os telômeros criados por engenharia po-dem compreender uma pluralidade de seqüências de repetição de telômero.

Por exemplo, em certas modalidades, um telômero criado por engenharia dainvenção pode compreender entre 2 e 100, 2 e 50 ou 2 e 10 repetições, in-cluindo 6 repetições. Em algumas modalidades da invenção, as seqüênciasde telômero em um vetor de truncagem de telômero tal como aqueles exem-plificados aqui (por exemplo, pWY76, pWY86 e pJV21) são fornecidas. Emuma modalidade da invenção, um vetor de truncagem de telômero pode serempregado para gerar um minicromossomo truncado. O vetor de truncagemde telômero pode ser empregado para gerar um minicromossomo truncado.

O vetor de truncagem de telômero pode ser compreendido no minicromos-somo ou pode ser separado dele. Em uma modalidade da invenção, o vetorde truncagem de telômero pode ser apagado durante a geração do minicro-mossomo. Um transgene poderia então, por exemplo, ser introduzido no mi-nicromossomo para gerar um minicromossomo compreendendo um ou maistransgene(s) adicionado(s). Um minicromossomo formado por tais métodoscompreende uma modalidade da invenção.

Um aspecto de minicromossomos de planta é seu tamanho. Osminicromossomos descritos aqui preferencialmente codificam um númeromínimo de genes endógenos que podem afetar perigosamente o fenótipo deuma planta compreendendo o minicromossomo. Assim, pode ser preferenci-al que uma parte grande de um cromossomo endógeno seja apagado parafazer um minicromossomo, enquanto mantendo um tamanho suficiente paratransmissão estável. Isso pode ser importante quando o cromossomo nativoé um cromossomo A. Os cromossomos B não codificam tipicamente funçõesessenciais e, portanto, podem ser menos prováveis para criar fenótipos peri-gosos. Contudo, pode-se observar que os minicromossomos que são muitopequenos não são fielmente mantidos através de mitose e meiose. Assim,em certas modalidades da invenção, um minicromossomo de planta com-preende uma seqüência de cromossomo de planta nativo onde aproxima-damente 1 a aproximadamente 99,9 por cento da seqüência de cromossomonativo é apagada. Em algumas modalidades, aproximadamente 10, 20, 25,35, 50, 75, 85, 90, 93, 95, 97, 99, 99,5 ou 99,9 por cento ou qualquer faixaderivável nesta da seqüência de cromossomo nativo é apagada em um mini-cromossomo.

Em certos aspectos adicionais da invenção, um minicromosso-mo de planta pode ser definido por seu tamanho. Por exemplo, um minicro-mossomo de planta pode ser definido como aproximadamente 0,1 a aproxi-madamente 20 ou 30 Mb em tamanho. Em modalidades adicionais, um mini-cromossomo de planta pode ser aproximadamente 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 4, 5, 7,0,9, 10, 20, 50 ou 100 Mb em tamanho ou qualquer faixa derivável nesta. Porexemplo, em alguns casos, os minicromossomos de planta descritos aquiestão entre aproximadamente 1 e 10 Mb ou entre aproximadamente 5 e 10Mb em tamanho.

Em alguns aspectos da invenção, um minicromossomo de plantapode ser definido como sendo transmitido através de mitose com uma fre-qüência de 100%. Em casos adicionais, um cromossomo de planta é defini-do pela freqüência com a qual ele é transmitido durante meiose. Por exem-plo, um minicromossomo de planta pode ser transmitido com mais do queaproximadamente uma freqüência de 10%, 20%, 25% ou 30% durante meio-se (50% sendo transmissão perfeita). Assim, um cromossomo de planta dainvenção pode compreender um cromossomo A ou B truncado que é trans-mitido com mais do que 35% de freqüência durante meiose quando o mini-cromossomo é transmitido em uma planta da mesma espécie do cromosso-mo de partida.

Uma variedade de plantas pode ser usada para obter minicro-mossomos de planta de acordo com a invenção. Em algumas modalidades,a planta é definida como uma planta dicotiiedônea ou monocotiledônea. Porexemplo, a planta pode ser alfafa, Tripsacum, milho, canola, arroz, soja, ta-baco, gramado, aveia, centeio, Arabidopsis ou trigo. Em certos aspectos dainvenção, o minicromossomo pode ser definido a partir de planta milho.

Em modalidades adicionais, um minicromossomo de planta dainvenção pode ser derivado de um cromossomo A de planta. Por exemplo, ominicromossomo pode compreender seqüências de cromossomo nativo deum cromossomo A, por exemplo, no caso de um minicromossomo de milho,ele pode compreender seqüências nativas de cromossomo de milho 1,2,3,4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10. Em uma modalidade, um minicromossomo de plantada invenção é derivado de um cromossomo de milho 7.

Em ainda modalidades adicionais, um minicromossomo de plan-ta da invenção compreende seqüências de cromossomo nativo de um cro-mossomo B de planta. Para certas aplicações, os cromossomos B truncadosde telômero podem fornecer benefício à medida que eles compreendem ge-nes não essenciais que não são esperados para interferir com o fenótipo deplanta ou com a expressão de transgenes do cromossomo. OS métodos detruncagem de telômero descritos aqui resultam em apagamento de seqüên-cias de cromossomos nativos do cromossomo B, particularmente aquelasregiões que são distais do centrômero. Por apagamento de regiões do cro-mossomo B que controlam não-disjunção através da trucagem de telômero,os minicromossomos baseados nos cromossomos B segregarão normal-mente. Virtualmente qualquer tipo de cromossomos B de planta pode serusado como descrito aqui para obter minicromossomos de planta. Por e-xemplo, um minicromossomo de planta pode compreender seqüências decromossomo B nativo de milho, centeio ou sorgo ou de qualquer espécie deplanta com cromossomos B ou qualquer espécie compreendendo um cro-mossomo B que foi introduzido (Jones e Rees, 1982). Em algumas modali-dades, a truncagem cromossômica pode ser executada em uma célula deplanta compreendendo múltiplos cromossomos B, tal como uma célula com-preendendo pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou mais cópias de cro-mossomos B.

Em certos aspectos da invenção, pode ser preferencial que umminicromossomo compreendendo cromossomos B ausentes em plantas co-mo a presença de um cromossomo B intacto possa causar não-disjunção deminicromossomos derivados de cromossomo B. Assim, em algumas modali-dades, a invenção fornece um método para manipular a dosagem de umminicromossomo de planta compreendendo seqüências de cromossomo Batravés da introdução de um cromossomo B intacto ou uma parte de um cro-mossomo B. Por exemplo, a dosagem de um minicromossomo de plantapode ser modulada introduzindo-se a seqüência de cromossomo B que con-trola a não-disjunção de centrômero B.

Um minicromossomo de planta de acordo com a invenção podecompreender um marcador selecionável que confere uma vantagem decrescimento sob condições particulares para células de plantas carregando omarcador, desse modo permitindo a identificação de plantas, células deplantas ou partes de plantas compreendendo o minicromossomo. Um mar-cador selecionável pode funcionar em células bacterianas. Um minicromos-somo pode também compreender marcadores selecionáveis "negativos" queconferem susceptibilidade a um agente antibiótico, herbicida ou outro agen-te, desse modo permitindo a seleção contra plantas, células de plantas oucélulas de outro organismo de interesse compreendendo o minicromossomoparticular. Além disso, em alguns aspectos, um minicromossomo de plantapode compreender um gene de restauração de fertilidade masculina tal co-mo um gene Rf3.

Um minicromossomo de planta pode adicionalmente compreen-der seqüências de recombinação específica em sítio. Por exemplo, os mini-cromossomos da invenção podem compreender um sítio Iox ou FRT. A re-combinação específica em sítio fornece um método conveniente para movergenes dentro e fora de cromossomos artificiais tal como os minicromosso-mos de planta da invenção. A mutagênese aleatória pode também ser forne-cida dessa maneira. Os métodos para usar recombinação específica em sítiopara mediar transferência de gene in vivo são bem-conhecidos na técnica. Arecombinação específica em sítio pode ser usada para seqüencialmente adi-cionar genes a um minicromossomo de modo a fornecer os genes para umcaminho bioquímico inteiro ou um conjunto de características agronomica-mente de elite. Em alguns aspectos da invenção, a seqüência de telômeroinserida em um cromossomo de planta de partida compreende seqüênciasde recombinação específica em sítio. Nesse aspecto, os minicromossomosde planta compreendendo seqüências de recombinação específica em sítiopodem ser rapidamente gerados.

Em certas modalidades adicionais, um minicromossomo de plan-ta pode compreender genes que controlam o número de cópia do minicro-mossomo em uma célula. Um exemplo de tal gene é o elemento de cromos-somos B que media não-disjunção como descrito acima. Um ou mais genesestruturais podem também ser compreendidos em um minicromossomo. Es-pecificamente observados como sendo útil são tantos genes estruturaisquanto podem ser inseridos em um minicromossomo enquanto ainda man-tendo um cromossomo artificial transmitido funcional e fielmente. Isso podeincluir um, dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove ou mais genes es-truturais.

Em outra modalidade, a invenção fornece métodos para expres-sar um ou mais genes estranhos em plantas, células de plantas ou célulasde qualquer outro organismo de interesse. O gene(s) estranho(s) pode serde qualquer organismo, incluindo plantas, animais e bactérias. Em uma mo-dalidade, o gene(s) estranho(s) conferem características agronômicas aper-feiçoadas a uma dada planta. Por exemplo, o transgene pode conferir umtraço tal como resistência a inseto, tolerância a herbicida, metabolismo decarboidrato alterado, metabolismo de ácido graxo alterado, resistência à do-enças, e resistência a pesticida. Observa-se adicionalmente que os minicro-mossomos podem ser usados para simultaneamente transferir múltiplos ge-nes estranhos a uma planta compreendendo caminhos regulatórios ou bio-químicos inteiros. Em ainda outra modalidade, observa-se que os minicro-mossomos de planta podem ser usados como vetores de clonagem de DNA.Tal vetor poderia ser usado em projetos de seqüenciamento de plantas eanimais. Em alguns casos específicos, um transgene pode ser introduzidoem um cromossomo de partida junto com seqüências de repetição de telô-mero desse modo gerando um minicromossomo de planta compreendendo otransgene.

Em uma modalidade adicional, é fornecida uma célula de plantacompreendendo o minicromossomo de planta. A célula de planta pode ser amesma espécie da espécie do cromossomo de planta de partida, entretanto,em certos casos, ela pode ser uma espécie diferente. Assim, uma planta ouuma semente de planta compreendendo um minicromossomo de plantatambém forma parte da invenção. Em certos aspectos, uma planta compre-endendo o minicromossomo é uma planta de milho.

Em geral, os métodos e composições da invenção envolvemtruncagem de cromossomo mediado por telômero. Por exemplo, um vetorcompreendendo telômeros de plantas é introduzido em uma célula de planta.Tais vetores podem ser introduzidos em uma célula de planta por qualquerdos métodos que são bem-conhecidos na técnica, por exemplo, bombarde-amento de DNA ou transformação mediada por Agrobacteríum. Por exemplo,em certas modalidades, a transformação mediada por Agrobacteríum podeser usada para gerar minicromossomos de planta derivados de cromosso-mos A. De forma oposta, em alguns casos, o bombardeamento de DNA po-de ser usado para gerar minicromossomos de planta derivados de cromos-somos B. Mediante a integração de seqüências de telômero em uma oumais posições de um cromossomo de planta, o cromossomo será truncadono ponto de integração. Assim, um método da invenção pode compreendertransformar um cromossomo de planta de partida com um ácido nucléicoheterólogo compreendendo pelo menos duas seqüências de repetição detelômero e permitindo que a truncagem do cromossomo de planta de partidaocorra para produzir um minicromossomo de planta. Um ou ambos os bra-ços de um cromossomo podem ser truncados por integração de telômero.

Os minicromossomos de planta resultantes podem então ser truncados porintegração de telômero. Os minicromossomos de planta resultantes podementão ser varridos para determinar seu tamanho e origem, por exemplo, porSouthern blot ou FISH.

Em alguns métodos adicionais da invenção, um cromossomo deplanta de partida é transformado com seqüência de ácido nucléico heterólo-ga compreendendo repetições de telômero e seqüências adicionais tais co-mo seqüências de recombinação específica em sítio, seqüência de transge-ne ou outra seqüência selecionada. Alternativamente, um cromossomo deplanta de partida pode ser transformado com seqüência de ácido nucléicoheteróloga compreendendo repetições de telômero para gerar um minicro-mossomo de planta. Subseqüentemente, o minicromossomo de planta podeser transformado com uma segunda seqüência de ácido nucléico heterólogacompreendendo uma seqüência adicional tal como um transgene. Por e-xemplo, seqüências adicionais podem compreender sítio Iox ou FRT. Emalguns casos, a seqüência adicional pode também compreender um geneque confere resistência a inseto, tolerância a herbicida, metabolismo de car-boidrato alterado, metabolismo de ácido graxo alterado, resistência à doen-ças, restauração de fertilidade masculina e resistência a pesticida. Assim,em certas modalidades, o gene adicional pode ser um gene de restauraçãode fertilidade masculina tal como um gene Rf3. Esse aspecto da invençãopode ser particularmente vantajoso desde que os minicromossomos de plan-ta que restauram fertilidade masculina possam ser transmitidos a células deprogênie com eficiência muito alta.

As modalidades discutidas no contexto de métodos e/ou compo-sição da invenção podem ser empregadas com relação a qualquer outro mé-todo ou composição descrita aqui. Assim, uma modalidade pertencente a ummétodo ou composição pode ser aplicada a outros métodos e composiçõesda invenção também.Como usado aqui na especificação, "um" ou "uma" pode signifi-car um ou mais. Como usado aqui nas reivindicações, quando usado emconjunto com a palavra "compreendendo", as palavras "um" ou "uma" po-dem significar um ou mais do que um.

O uso do termo "ou" nas reivindicações é usado para significar"e/ou" a menos que explicitamente indicado para se referir a alternativassomente ou as alternativas são mutuamente exclusivas, embora a descriçãosuporte uma definição que se refira a somente alternativas e "e/ou". Comousado aqui, "outro" pode significa pelo menos um segundo ou mais.

Por todo este pedido de patente, o termo "aproximadamente" éusado para indicar que um valor inclui a variação inerente de erro para o dis-positivo, o método sendo empregado para determinar o valor, ou a variaçãoque existe entre os objetos de estudo.

Outros objetivos, características e vantagens da presente inven-ção se tornarão aparentes a partir da seguinte descrição detalhada. Dever-se-ia entender, entretanto, que a descrição detalhada e os exemplos especí-ficos, enquanto indicando modalidades preferenciais da invenção, são dadosa título de ilustração somente, desde que várias mudanças e modificaçõesno espírito e escopo da invenção se tornarão aparentes àqueles versados natécnica a partir desta descrição detalhada.

Breve Descrição das Figuras

Os seguintes desenhos formam parte da presente especificaçãoe são incluídos para adicionalmente demonstrar certos aspectos da presenteinvenção. A invenção pode ser mais bem entendida por referência a um oumais desses desenhos em combinação com a descrição detalhada de moda-lidades específicas apresentadas aqui.

A figura 1: exemplos de construções de truncagem cromossômi-ca. As construções pWY76 e pWY86, e a construção de controle pWY96 sãodiagramadas. Os significados das designações de letra na figura são comosegue: LB, borda esquerda de T-DNA; RB, borda direita de T-DNA; Tvsp,terminador a partir do gene de proteína de armazenamento vegetativo desoja; Bar, gene de resistência a bialafos como um gene marcador selecioná-vel; TEV1 região não traduzida de vírus mosaico do tabaco 5'; P35S, promo-tor 2X35S de vírus mosaico de couve-flor (CaMV); Tnos, terminador Nos doAgrobacterium tumefaciens] Tmas, terminador Mas de A. tumefaciens·, Pnos1promotor Nos de A. tumefaciens; Pmasl1, promotor Mas de A. tumefaciens;

sítios de recombinação específica em sítio Iox e FRT; HPT, gene de resis-tência a higromicina B; GFP, gene de proteína fluorescente; DsRed, proteínafluorescente vermelha; FLP, gene de recombinase específica em sítio; Te-lômeros, unidades de telômero de pAtT4 isolados a partir de Arabidopsisthaiiana (Richards e Ausubel 1988). As setas indicam a direção de transcri-ção ou no caso das repetições de telômero, a orientação cromossômica.

A figura 2 ilustra a estrutura de pJV21. As quatro partes funcio-nais são indicadas por parênteses e rotuladas. LB, borda esquerda; RB, bor-da direita; lox, sítio lox66; Cre, gene de Cre recombinase; bar, gene de resis-tência a bialafos; 35S, promotor 35S de CaMV; ubi, promotor de ubiquitinade milho; n3', seqüência terminadora do gene de sintase nopalina; telo, repe-tições de telômero 400 bp de Arabidopsis; Notl e Ascl, sítios de enzima derestrição.

Descrição Detalhada da Invenção

Um dos objetivos de cultivo de plantas é a seleção de caracterís-ticas desejáveis tal como doença e resistência a inseto, taxa de crescimento,exigências e resultados de nutrientes. Infelizmente, em muitas variedades deespécies de plantas diferentes são ótimas para regiões geográficas e climá-ticas. Entretanto, cultivar uma característica desejável ou gene em cada va-riedade pode levar anos desde que qualquer dada característica deve serselecionada enquanto mantendo as vantagens específicas de uma dada va-riedade. Modificando alguns traços ou empilhamento de traços podem exigirmúltiplos transgenes, que complica a introgressão. Assim, idealmente genesque conferem características agronomicamente superiores poderiam ser for-necidos em um cromossomo separado e assim seria não ligado a outros ge-nes e facilmente selecionados em plantas de progênie. Entretanto, até agoraum minicromossomo de planta que é capaz de codificar genes não foi des-crito.A invenção supera as limitações na técnica fornecendo minicro-mossomos de planta que podem ser usados para incorporar transgenes de-sejáveis. Em certos casos, o minicromossomo pode ser passado por intro-gressão em qualquer variedade particular de planta desde que ele não sejaligado a quaisquer genes de fundo, codificados em outros cromossomos.

Esses minicromossomos podem adicionalmente compreender sítios de re-combinação específica em sítio que habilitam os genes a serem rapidamentemovidos dentro ou fora de qualquer variedade de planta compreendendo ominicromossomo. Assim, esses novos minicromossomos de planta reduzemos problemas associados com arraste de ligação fornecendo uma plataformade expressão geneticamente isolada.

1. Sistemas de Recombinação

Em certas modalidades da invenção, os minicromossomos deplanta compreendem pelo menos um sítio de recombinase específica emsítio. Os sistemas de recombinase integrase específica em sítio foram identi-ficados em vários organismos incluindo, mas não limitados a, sistemaCre/lox de bacteriófago P1 (Abremski e outros, 1983; Patente U.S. Ne4.959.317; Patente U.S. Ne 5.658.772), o sistema de levedura FLPf FRT (Go-lic e Lindquist, 1989), a Pin recombinase de E. coli (Enomoto e outros,1983), a GinIgix recombinase de fago Mu (Maeser e outros, 1991), o sistemaR/RS do plasmídeo pSR1 de Zygosaccharomyces rouxii (Onouchi e outros,1991; Araki e outros, 1992) e a R recombinase de Zygosaccharomyces rouxii(Onouchi e outros, 1995). Todos esses sistemas foram mostrados para fun-cionar em plantas (0'Gorman e outros, 1991; Maeser e outros, 1991; Onou-chi e outros, 1991; Dale e Ow1 1991). Acredita-se que os sistemas de inte-gração direcionados em sítio como Cre/lox ou FLP/FRT exigem um interme-diário de DNA circular. Desses sistemas, Cre/lox e FLP/FRT foram ampla-mente utilizados.

O sistema FLP/FRT é nativo à levedura Saceharomyces eerevi-siae (Golic e Lindquist, 1989; revisado em Futcher, 1988). Em levedura, aenzima de recombinase (FLP) reside em um plasmídeo de 2μ e reconhecerepetições invertidas de 599 pares base (bp) inclui somente 34 bp; duas re-petições invertidas de 13 bp separadas por uma região espaçadora de 8 bpassimétrica embora uma terceira repetição não-essencial da seqüência 13bp esteja freqüentemente presente (Sauer, 1994). O rearranjo mediado porFLP de DNA flanqueado por repetições invertidas de seqüência FRT fre-qüentemente resulta na inversão do DNA entre os sítios alvo FRT. Nessecaso, ambos os sítios FRT são retidos. A FLP recombinase pode tambémreconhecer diretamente repetidos sítios alvo FRT. Os rearranjos mediadospor FLP de DNA flanqueado por sítios FRT diretamente repetidos freqüen-temente resultam na excisão do DNA localizado entre os sítios alvo FRT.

Nesse caso, o DNA excisado é liberado na forma circular compreendendoum sítio FRT enquanto o segundo sítio FRT permanece na molécula de DNAmodelo. A FLP recombinase pode também mediar recombinação entre ossítios FRT em diferentes moléculas de DNA; por exemplo, a FLP recombina-se pode mediar a recombinação entre sítios FRT em diferentes cromosso-mos. Sadowski (1995) mostrou que a recombinação catalisada por FLP/FRTé reversível em natura.

A troca de DNA catalisada por FLP/FRT pode ser executada invitro à medida que a FLP recombinase purificada foi mostrada para mediar arecombinação entre sítios FRT (Meyer-Leon e outros, 1984). A combinaçãode levedura FLP/FRT foi também usada para recombinação específica emsítio direta, ambas a excisão e a amplificação de seqüências flanqueadaspor sítios FRT, em Escherichia coli (Cox, 1983) bem como em genomas deDrosophila (Golic e Lindquist, 1989; Golic, 1994). FLP/FRT também foi em-pregado para direcionar excisão específica em sítio de partes de transgenesde DNA de plasmídeo em protoplastos de milho e arroz por recombinaçãohomóloga (vide, por exemplo, Patente U.S. Nq 5.527.695). FLP/FRT foi tam-bém utilizada em milho transformado estavelmente para direcionar excisãoem sítio de seqüências inseridas no genoma de milho que são flanqueadaspor sítios FRT (Patentes U.S. N9S 5.929.301 e 6.175.058). O direcionamentocromossômico específico em sítio de DNA estranho em cromossomos bacte-rianos e mamíferos pode também ser efetuado por FLP/FRT (Huang e ou-tros, 1991; 0'Gorman e outros, 1991) e sua inserção por FLP em sítios FRTfoi mostrada como sendo reversível em genomas não-levedura (Huang eoutros, 1997). É possível suficientemente alterar sítios FRT tal que a recom-binação ocorra, mas não é reversível (Patente U.S. Nq 6.187.994) ou favore-ce uma reação adiante em relação a uma reação reversa (Senecoff e outros,1988).

Um segundo sistema de recombinação bem caracterizado é a-quele de Cre/lox de bacteriófago P1 (Abremski e outros, 1983; revisado emCraig, 1988; Sauer, 1994; Ow, 1996). A Cre recombinase (causando recom-binação) reconhece seqüências alvo Iox (local de recombinação (x)) e mediaa recombinação específica em sítio entre os sítios Iox compatíveis. Os sítioscompatíveis podem ou não compreender seqüências idênticas. Os sítios Ioxsão 34 pares base em comprimento, compreendendo duas repetições inver-tidas de 13 bp separadas por 8 bp ou outros nucleotídeos espaçadores. Asseqüências lox incluem IoxP de bacteriófago P1 (Albert e outros, 1995) bemcomo sítios loxB, loxL, e loxR que são seqüências de nucleotídeos isoladasde E. Coli (Hoess e outros, 1982). As variantes funcionais de sítios IoxP rela-tados incluem, mas não são limitados a lοχ66, lox71, e lox72 (Albert e ou-tros, 1995; Langer e outros, 2002). As seqüências Iox podem também serproduzidas por uma variedade de técnicas sintéticas que são conhecidas natécnica. Exemplos de técnicas sintéticas para produzir sítios Iox funcionaissão descritos por Ogilvie e outros (1982) e Ito e outros (1982).

O sítio lox é uma seqüência de nucleotídeo assimétrica e comotal, sítios Iox na mesma molécula de DNA podem ter a mesma orientação ouorientação oposta com relação um ao outro. A recombinação entre sítios Ioxna mesma orientação resulta em um apagamento do segmento de DNA lo-calizado entre os dois sítios lox. Nesse caso, a ligação entre os térmicos re-sultantes da molécula de DNA original ocorre e um sítio Iox é retido. O seg-mento de DNA apagado forma uma molécula circular de DNA que tambémcontém um único sítio lox. A recombinação entre sítios Iox em orientaçõesoposta na mesma molécula de DNA resulta em uma inversão da seqüênciade nucleotídeo do segmento de DNA localizado entre os dois sítios lox. Emadição, a troca recíproca de segmentos de DNA próximos a sítios Iox Iocali-zados em duas diferentes moléculas de DNA pode ocorrer. Todos esses e-ventos de recombinação são catalisados pelo produto da região de codifica-ção Cre e são reversíveis. É possível, entretanto, alterar suficientementesítios Iox tal que os eventos de recombinação ocorrem, mas são resistentesà reação de recombinação reversa (Albert e outros, 1995; Araki e outros.,1997; Publicação PCT WO 01/11058) ou tal que dois sítios são substratosde recombinação "não compatíveis" para a recombinase (Hoess e outros,1986; Trinh e Morrison, 2000; Lee e Saito, 1988; EP 1 035 208). É tambémpossível impedir que a reação reversa ocorra removendo a fonte de recom-binase, por exemplo, cultivando ou usando promotores regulatórios particula-res.

A Cre recombinase também efetua integração direcionada emsítio. Por exemplo, um gene repórter IacZ foi integrado com o genoma decélulas de ovários de Hamster Chinês (CHO) usando Cre-recombinase, umúnico sítio Iox no vetor de direcionamento IacZ e um único sítio Iox previa-mente localizado no DNA genômico de CHO (Fukushige e Sauer, 1992). Acre recombinase foi mostrada para mediar a recombinação entre sítios Ioxem levedura (Sauer, 1987) e plantas, tal como tabaco e Arabidopsis (vide,por exemplo, Patente U.S. Ne 5.658.772; Medberry, e outros, 1995; Albert eoutros, 1995) bem como em células de mamíferos tal como ratos (Sauer eHenderson, 1988; Fukushige e Sauer, 1992; Sauer, 1998). A integração es-pecífica em sítio de grandes fragmentos BAC (minicromossomo bacteriano)em genomas de plantas e fungos utilizando um sistema de recombinaçãoCre/lox foi reportada (Choi e outros, 2000). Acredita-se que de modo a al-cançar integração direcionada em sítio em um único sítio Iox genômico, umamolécula de DNA circular compreendendo um único sítio Iox deve ser intro-duzida na célula. Portanto, os métodos da presente invenção tornam possí-vel alcançar integração direcionada em sítio de moléculas de DNA carecen-do de seqüências auxiliares que são freqüentemente presentes de modo areplicar e manter as moléculas circular em uma célula hospedeira bacteria-na. Wallace e outros (2000) e Day e outros (2000) discutem o uso de inte-gração direcionada em sítio como um método para pré-selecionar sítios nogenoma para expressão repetitiva de transgenes em células-tronco embrio-nárias ou tabaco, respectivamente.

A Cre recombinase pode contatar e efetuar recombinação utili-zando um número de sítios Iox incluindo, mas não limitados a IoxP e um nú-mero de variantes do IoxP tipo selvagem tal como lox66 (Albert e outros,1995). A troca de DNA direcionada pelos sítios Iox ocorre na região espaça-dora de 8 bp e essencialmente afeta uma troca das repetições invertidas de13 bp dos dois sítios Iox envolvidos. Por exemplo, a recombinação direcio-nada em sítio na qual um único sítio Iox em uma molécula de DNA recombi-na com um segundo único sítio Iox em uma segunda molécula de DNA gerauma seqüência na qual o DNA integrado é flanqueado por um sítio Iox emqualquer lado. Quando os únicos sítios Iox nas moléculas separadas envol-vidas são idênticos, os dois sítios Iox resultantes adjacentes ao DNA inseridosão também idênticos. Se, entretanto, os dois únicos sítios Iox nas molécu-Las de partida não são idênticos nas repetições invertidas de 13 bp, os doissítios Iox resultantes adjacentes ao DNA inserido diferirão dos sítios Iox departida. Por exemplo, se um primeiro único sítio lox66 é envolvido em inte-gração direcionada em sítio com um segundo único sítio Ιοχ71, os sítios Ioxresultantes flanqueando o DNA inserido compreendem seqüências de sítiosIoxP e lox72 (Albert e outros, 1995).

A integração direcionada em sítio utilizando sítios Iox ou FRTidênticos nas duas moléculas recombinantes resulta no DNA inserido sendoflanqueado por sítios de recombinação idênticos, uma reação que é facil-mente revertida pela recombinase. Para impedir o apagamento da seqüênciainserida, é freqüentemente desejável remover a fonte de enzima recombina-se, por exemplo, por segregação ou localizando o gene de recombinase sobo controle de um promotor induzido e removendo a fonte de indução. Alter-nativamente, um versado na técnica pode usar seqüências de recombinaçãoespecíficas em sítio projetadas tal que depois de reação de integração, ossítios resultantes não são compatíveis para uma reação reversa ou recombi-nam em uma taxa reduzida.

Um versado na técnica reconhecerá que a enzima integrase, talcomo Cre ou FLP recombinase, pode ser fornecida ao sítio ou sítios alvo, talcomo lox ou FRT, por qualquer meio conhecido na técnica. Por exemplo, arecombinase pode ser fornecida de forma transiente por expressão de umgene, e seqüências de controle apropriadas, que residem em um plasmídeoseparadamente mantido nas células hospedeiras. O gene de recombinase eseqüências de controle apropriadas podem ser inseridos no genoma do or-ganismo e estavelmente expressos nas células hospedeiras. Alternativamen-te, o cruzamento sexual ou o cultivo pode ser usado para introduzir a recom-binase a células contendo o sítio ou sítios Iox ou FRT alvo; nesse caso, umorganismo tal como planta contendo o gene de recombinase poderia sercruzado para uma planta contendo os sítios Iox ou FRT alvo e a progêniedessa união conteria ambos a recombinase e o sítio ou sítios alvo. Em al-guns casos, a codificação mRNA para a recombinase desejada pode serintroduzida nas células hospedeiras para codificar e fornecer a proteína re-combinase. Em outros casos, um pode introduzir proteína recombinase iso-lada em uma célula hospedeira compreendendo um sítio de recombinaçãoalvo. EM qualquer desses casos, o promotor direcionando expressão de re-combinase pode ser, mas não limitado a maneira constitutiva ou induzida.

Um versado na técnica também reconhecerá que os genes para genes derecombinase tal como Cre ou FLP podem ser isolados de bacteriófago P1 ouSaccharomyces cerevisiae, respectivamente, e utilizados diretamente em umnovo sistema hospedeiro ou a seqüência de gene pode ser otimizada parauso de códon para expressão no hospedeiro transgênico. De um modo simi-lar, um versado na técnica reconhecerá que nativamente ocorrendo bemcomo sítios alvo sintéticos podem ser reconhecidos e mediam recombinaçãocom uma recombinase apropriada.

Exemplos de substituição de gene mediada por recombinase ouexcisão de gene tipicamente utilizam dois sítios alvo flanqueando a seqüên-cia a ser substituída ou excisada. Por exemplo, Odell e outros (Patente U.S.Ne 5.658.772) descrevem o uso de dois sítios IoxP e Cre-recombinase paragerar substituições de gene específicas em tabaco. O sistema Cre/lox foitambém usado de uma maneira induzida para ativar e remover transgenesem plantas transgênicas (Publicação PCT WO 01/40492). Baszczynski eoutros (Patente U.S. N9 6.187.994) descreve o uso de múltiplos sítios FRTnão idênticos e FLP-recombinase para gerar uma variedade de alteraçõesde gene em milho. Baszczynski e outros (Patente U.S. Ns 6.262.341) tam-bém descrevem o uso de uma Cre/FLP recombinase quimérica com duplaespecificidade de sítio alvo para efetuar recombinação de seqüências deDNA flanqueadas por uma seqüência Iox em uma lateral e uma seqüênciaFRT em outra lateral. Em cada um desses casos, a integração ou excisão deseqüências gera fragmentos de DNA estranhos como parte do esquema derecombinação. A integração direcionada em sítio, entretanto, pode utilizarsomente um sítio alvo no genoma recipiente. A presente invenção propõeintegração direcionada mediada por Cre de uma molécula circular prontapara transformação gerada in vitro não replicada contendo um primeiro únicosítio Iox em um segundo único sítio Iox previamente introduzido no genomaalvo.

II. Genes para uso na invenção

Um versado na técnica entenderá que os minicromossomos dainvenção podem ser usados para expressar uma variedade de genes. Emalgumas modalidades preferenciais, tais genes conferem características a-gronomicamente de elite a uma planta compreendendo um minicromossomoda invenção. Alguns exemplos não Iimitantes de genes para uso na invençãosão fornecidos abaixo.

A. Resistência a Herbicida

Inúmeros genes de resistência a herbicida são conhecidos e po-dem ser empregados com a invenção. Um exemplo é um gene conferindoresistência a um herbicida que inibe o ponto de crescimento ou meristema,tal como uma imidazalinona ou uma sulfoniluréia. Genes exemplificadosnesse código de categoria para enzima ALS e AHAS mutante como descri-tos, por exemplo, por Lee e outros (1988); Gleen e outros, (1992); e Miki eoutros, (1990).

Os genes de resistência para glifosato (resistência conferida por5-enolpiruvil-3 fosfochiquimato sintase (EPSP) e genes aroA, respectivamen-te) e outros compostos fosfono tal como glufosinato (genes fosfinotricina a-cetil transferase (PAT) e Streptomyces hygroscopicus fosfinotricin-acetiltransferase (bafy podem também ser usados. Ver, por exemplo, PatenteU.S. Ns 4.940.835 para Shah, e outros, que descreve a seqüência de nu-cleotídeo de uma forma de EPSPS que pode conferir resistência a glifosato.A molécula de DNA codificando um gene aroA mutante pode ser obtida sobnúmero de acesso ATCC 39256, e a seqüência de nucleotídeo do gene mu-tante é descrita na Patente U.S. Nq 4.769.061 para Cornai. O pedido de pa-tente europeu N5 0 333 033 para Kumada e outros, e a Patente U.S. N94.975.374 para Goodman e outros, descrevem seqüências de nucleotídeode genes glutamina sintetase que conferem resistência a herbicidas tal comoL-fosfinotricina. A seqüência de nucleotídeo de um gene fosfinotricina-acetiltransferase é fornecida no pedido europeu N5 0 242 246 para Leemanse outros, DeGreef e outros (1989), descrevem a produção de plantas trans-gênicas que expressam genes bar quiméricos codificando a atividade defosfinotricina acetil transferase. Exemplos de genes conferindo resistência aácidos fenóxi propiônicos e ciclohexanodionas, tal como setoxidima e haloxi-fop, são os genes Acct-Sl, Acc1-S2 e Acct-S3 descritos por Marshall e ou-tros (1992).

Os genes são também conhecidos conferindo resistência a umherbicida que inibe a fotossíntese, tal como uma triazina (genes psbA e gs+)e uma benzonitrila (gene nitrilase). Przibilla e outros (1991), descrevem atransformação de Chlamydomonas com plasmídeos codificando genes psbAmutantes. As seqüências de nucleotídeos para genes nitrilase são descritasna Patente U.S. Nq 4.810.648 para Stalker, e moléculas de DNA contendoesses genes estão disponíveis sob Nos. de acesso ATCC 53435, 67441, e67442. A clonagem e a expressão de codificação de DNA para uma glutatio-na S-transferase é descrita por Hayes e outros (1992).

B. Esterilidade Masculina e Restauração de Fertilidade masculina

Exemplos de genes conferindo esterilidade masculina bem comorestauradores de fertilidade masculina são conhecidos na técnica e incluemaqueles descritos na Patente U.S. NQ 3.861.709, Patente U.S. NQ 3.710.511,Patente U.S. N9 4.654.465, Patente U.S. N9 4.727.219, Patente U.S. Ne5.530.191, Patente U.S. N9 5.625.132, e Patente U.S. N9 5.689.041, cadauma das descrições são especificamente incorporadas aqui por referênciaem sua totalidade.

Os genes de esterilidade masculina podem aumentar a eficiên-cia com a qual híbridos são feitos, já que eles eliminam a necessidade defisicamente castrar a planta de milho usada como uma fêmea em um dadocruzamento.

Onde um deseja empregar sistemas de esterilidade masculinacom uma planta de milho de acordo com a invenção, pode ser benéfico tam-bém utilizar um ou mais genes restauradores de fertilidade masculina. Porexemplo, quando a esterilidade masculina citoplásmica (CMS) é usada, aprodução de semente hibrida exige três linhagens de cruzamento: (1) umalinhagem de macho citoplasmicamente estéril tendo um citoplasma CMS; (2)um cruzamento fértil com citoplasma normal, que é isogênico com a linha-gem CMS para genes nucleares ("linhagem "mantenedora"); e (3) um cru-zamento fértil distinto com citoplasma normal, carregando um gene de res-tauração de fertilidade (linha "restauradora"). A linhagem CMS é propagadapor polinização com a linhagem mantenedora, com todos da progênie sendomachos estéreis, à medida que o citoplasma CMS é derivado do parentefêmea. Essas plantas estéreis macho podem então ser eficientemente em-pregadas como o parente fêmea em cruzamentos híbridos com a linhagemrestauradora, sem a necessidade por castração física das partes reproduti-vas macho do parente macho.

A presença de um gene restaurador de fertilidade masculina re-sulta na produção de progênie hibrida F1 completamente fértil. Se nenhumgene restaurador está presente no parente macho, os híbridos estéreis ma-chos são obtidos. Tais híbridos são úteis onde o tecido vegetativo da plantade milho é utilizado, por exemplo, para silagem, mas na maioria dos casos,as sementes serão consideradas a parte mais valiosa da colheita, então afertilidade dos híbridos nessas colheitas deve ser restaurada. Portanto, umaspecto da invenção atual considera a planta de milho híbrida CH389090compreendendo um local genético capaz de restaurar a fertilidade masculinaem uma planta macho de outra forma estéril. Exemplos de genes de esterili-dade masculina e restauradores correspondentes que poderiam ser empre-gados com as plantas da invenção são bem-conhecidos àqueles versadosna técnica de cultivo de plantas e são descritos, por exemplo, na PatenteU.S. N9 5.530.191; Patente U.S. Ne 5.689,041; Patente U.S. N9 5.741.684; ePatente U.S. N9 5.684.242, as descrições das quais são especificamenteincorporadas aqui por referência em sua totalidade. Por exemplo, o generestaurador pode ser um gene Rf3 (Duvick, 1965; Chase e Gabay-Laughnan2004; Gabay-Laughnan e outros, 2004) ou genes usados no sistema de res-tauração Barnase/Barstar (Mariani e outros, 1990; Mariani e outros, 1992).C. Resistência a Doenças

As defesas da plana são freqüentemente ativadas por interaçãoespecífica entre o produto de um gene de resistência à doenças (R) na plan-ta e o produto de um gene de avirulência (Avr) no patógeno. Uma linhagemde planta pode ser transformada com gene de resistência clonado para plan-tas criadas por engenharia que são resistentes a cepa patógena específica.Ver, por exemplo, Jones e outros, (1994) (clonagem do gene Cf-9 do tomatepara resistência a Cladosporium fulvum)·, Martin e outros, (1993) (gene Ptodo tomate para resistência a Pseudomonas syringae pv.)\ e Mindrinos e ou-tros, (1994) (gene RSP2 de Arabidopsis para resistência a Pseudomonassyringae).

Uma proteína invasiva viral ou uma toxina complexa derivadadesta pode também ser usada para resistência a doenças virais. Por exem-plo, o acúmulo de proteínas de revestimento viral em células de planta trans-formadas confere resistência à infecção viral e/ou desenvolvimento de doen-ça efetuado pelo vírus a partir do qual o gene de proteína de revestimento éderivado, bem como por vírus relacionados. Ver Beachy e outros (1990). Aresistência mediada por proteína de revestimento foi conferida medianteplantas transformadas contra vírus do mosaico de alfafa, vírus do mosaicode pepino, vírus risca do tabaco, vírus X da batata, vírus Y da batata, vírusetch do tabaco, vírus rattle do tabaco e vírus mosaico do tabaco.Um anticorpo específico de vírus pode também ser usado. Ver,por exemplo, Tavladoraki e outros, (1993), que mostrou que as plantastransgênicas expressando genes de anticorpo recombinante são protegidosde ataque de vírus.

Logemann e outros, (1992), por exemplo, descrevem plantastransgênicas expressando um gene de inativação de ribossoma barley têmuma resistência a doenças fúngicas.

D. Amido Ceroso

A característica cerosa é um exemplo de um traço recessivo.Nesse exemplo, a progênie resultante da primeira geração de retrocruza-mento (BC1) deve estar crescendo e não híbridos. Um teste é então execu-tado na semente não híbrida a partir da planta BC1 para determinar quaisplantas BC1 carregaram o gene recessivo para o traço ceroso. Em outrostraços recessivos, o teste de progênie adicional, por exemplo, gerações adi-cionais crescentes tal como BC1S1, pode ser exigido para determinar quaisplantas carregàm o gene recessivo.

E. Resistência a Inseto

Um exemplo de um gene de resistência a inseto inclui uma pro-teína Bacillus thuringiensis, um derivado dessa ou um polipeptídeo sintéticomodelado neste. Ver, por exemplo, Geiser e outros (1986), que descrevem aclonagem e a seqüência de nucleotídeo de um gene de δ-endotoxina Bt. A-lém disso, os genes δ-endotoxina de codificação das moléculas de DNA po-dem ser adquiridos a partir da American Type Culture Collection, Manassas,Virgínia, por exemplo, sob Nos. De acesso ATCC 40098, 67136, 31995 e31998. Outro exemplo é uma lectina. Ver, por exemplo, Van Damme e ou-tros, (1994), que descrevem as seqüências de nucleotídeo de vários genesde lectina de ligação de manose Clivia miniata. Uma proteína de ligação devitamina pode também ser usada, tal como avidina. Ver Pedido PCTUS93/06487, os conteúdos dos quais são incorporados por referência. Estepedido ensina o uso de avidina e homólogos de avidina como Iarvicidas con-tra pestes de insetos.

Ainda outro gene de resistência a inseto é um inibidor de enzi-ma, por exemplo, um inibidor de protease ou proteinase ou um inibidor deamilase. Ver, por exemplo, Abe e outros, (1987) (seqüência de nucleotídeode inibidor de proteinase de cisteína de arroz), Huub e outros (1993) (se-qüência de nucleotídeo de inibidor I de proteinase de tabaco codificandocDNA), e Sumitani e outros (1993) (seqüência de nucleotídeo de inibidor deα-amilase Streptomyces nitrosporeus). Um hormônio específico de inseto ouferomônio pode também ser usado. Ver, por exemplo, a descrição porHammock e outros (1990), de expressão de baculovírus de esterase dehormônio juvenil clonado, um ativador de hormônio juvenil.

Ainda outros exemplos incluem um anticorpo específico de inse-to ou uma imunotoxina derivada deste e uma proteína atrativa de desenvol-vimento. Ver Taylor e outros (1994), que descreveu inativação enzimáticaem tabaco transgênico via a produção de fragmentos de anticorpo de cadeiaúnica.

F. Metabolismo de Ácido Graxo modificado. Carboidrato e Fitato

Os genes podem ser usados conferindo metabolismo de ácidograxo modificado. Por exemplo, os genes estearil-ACP dessaturase podemser usados. Ver Knutzon e outros (1992). Várias dessaturases de ácido gra-xo foram também descritas, tal como um gene 0LE1 de Saccharomyces ce-revisiae codificando dessaturase de ácido graxo Δ9, uma enzima que formaos ácidos graxos oléico (18:1) e palmitoleico (16:1) monoinsaturados depalmitoil (16:0) ou estearoil (18:0) CoA (McDonough e outros, 1992); um ge-ne codificando uma proteína carreadora estearoil-acila delta-9 dessaturasede rícino (Fox e outros, 1993); dessaturases Δ6 e Δ12 de cianobactéria Sy-nechocystis responsável pela conversão de ácido Iinoleico (18:2) em ácidogama-linoleico (gama 18:3) (Reddy e outros, 1993); um gene de Arabidopsisthaliana que codifica uma dessaturase Omega-3 (Arondel e outros, 1992));dessaturases Δ9 de planta (Publicação de Pedido PCT N9 WO 91/13972) edessaturases Δ15 de soja e Brassica (Publicação de Pedido de Patente Eu-ropéia N5 EP 0616644).

O metabolismo de fitato pode também ser modificado pela intro-dução de um gene de codificação de fitase para melhorar a ruptura de fitato,adicionar mais fosfato livre à planta transformada. Por exemplo, ver Van Har-tingsveldt e outros (1993), para uma descrição da seqüência de nucleotídeode um gene de fitase Aspergillus niger. Em milho, isso, por exemplo, poderiaser executado clonando e então reintroduzindo DNA associado com o únicoalelo que é responsável para mutantes de milho caracterizados por baixosníveis de ácido fítico. Ver Raboy e outros (1990).

Um número de genes é conhecido, o que pode ser usado paraalterar metabolismo de carboidrato. Por exemplo, as plantas podem sertransformadas com uma codificação de gene para uma enzima que altera opadrão de ramificação de amido. Ver Shiroza e outros (1988) (seqüência denucleotídeo de gene fructosiltransferase de Streptococcus mutans), Stein-metz e outros, (1985) (seqüência de nucleotídeo de gene Ievansucrase Ba-cillus subtilis), Pen e outros, (1992) (produção de plantas transgênicas queexpressam α-amilase de Bacillus Iicheniformis), Elliot e outros, (1993) (mu·tagênese direcionada em sítio de gene de α-amilase de barley), e Fisher eoutros (1993) (enzima Il de ramificação de amido de endosperma de milho).

O gene Z10 codificando uma proteína de armazenamento de zeína 10kD demilho pode também ser usado para alterar as quantidades de zeína 10kDnas células em relação a outros componentes (Kirihara e outros, 1988).

III. Plantas e Seus Usos

A presente invenção fornece uma planta transgênica compreen-dendo um minicromossomo de planta da invenção incluindo, sem limitação,alfafa, milho, canola, arroz, soja, tabaco, grama, aveia, centeio, e trigo, entreoutros. Também incluída está uma semente de uma planta, a semente com-preende um minicromossomo da invenção.

Por exemplo, em certas modalidades, uma semente compreen-dendo um minicromossomo da invenção pode expressar um gene que for-nece tolerância a herbicida. Um exemplo benéfico de um gene de tolerânciaa herbicida fornece resistência a glifosato, N-(fosfonometil)glicina, incluindo aforma de sal isopropilamina de tal herbicida.

A presente invenção pode ser, na prática, combinada com outrostraços de controle de doença em uma planta para alcançar traços desejadospara melhorar o controle de doenças em plantas. Combinar os traços decontrole de doenças que empregam modos de ação distintos pode fornecerplantas transgênicas protegidas com consistência e durabilidade superioressobre plantas acolhendo um único traço de controle da probabilidade reduzi-da que resistência desenvolverá no campo.

A invenção também se refere a produtos de consumo contendoum ou mais dos minicromossomos da presente invenção, e produzidos apartir de uma planta recombinante ou semente contendo um ou mais mini-cromossomos. Um produto de consumo contendo uma ou mais das seqüên-cias da presente invenção pretende incluir, mas não limitado a, farinhas, ó-leos, grãos inteiros ou triturados de uma planta recombinante ou sementecontendo uma ou mais das seqüências da presente invenção. A detecção deuma ou mais das seqüências da presente invenção em um ou mais produtosde consumo observados aqui é evidência de que o produto de consumocompreende um minicromossomo da invenção.

Um aspecto adicional da invenção refere-se a culturas de tecidode plantas compreendendo minicromossomos. Como usado aqui, o termo"cultura de tecido" indica uma composição compreendendo células isoladasdo mesmo tipo ou tipo diferente ou uma coleção de tais células organizadasem partes de uma planta. Tipos exemplificados de culturas de tecidos sãoprotoplastos, células de planta e calus que estão intactas em plantas ou par-tes de plantas, tal como embriões, pólen, flores, núcleos, espigas, casta-nhas, folhas, cascas, caules, raízes, pontas de raízes, anteras, seda, e seussimilares. Em uma modalidade preferencial, a cultura de tecido compreendeembriões, protoplastos, células meristemáticas, pólen, folhas ou anteras de-rivadas de tecidos imaturos dessas partes de plantas. Meios para preparar emanter culturas de tecido de plantas são bem-conhecidos na técnica (Paten-te U.S. N9 5.538.880; e Patente U.S. Nq 5.550.318, cada uma incorporadaaqui por referência em sua totalidade). A título de exemplo, uma cultura detecido compreendendo órgãos tais como pendões ou anteras foi usada paraproduzir plantas regeneradas (Patente U.S. N9 5.445.961 e Patente U.S. N95.322.789; as descrições das quais são incorporadas aqui por referência).Um tipo de cultura de tecido em milho é cultura de pen-dão/antera. Os pendões contêm anteras que, por sua vez, envolvem micrós-poros. Os micrósporos desenvolvem em pólen. Para cultura de ante-ra/micrósporo, se os pendões são a composição da planta, eles são prefe-rencialmente selecionados em um estágio quando os micrósporos são uni-nucleados, ou seja, incluem somente um núcleo, ao invés de 2 ou 3. Os mé-todos para determinar o estágio correto são bem-conhecidos àqueles versa-dos na técnica e incluem coloração fluorescente de mitramicina, azul de tri-pano (preferencial) e esmagamento em acetocarmina. O estágio de micrós-poro mid-uninucleado foi encontrado como sendo o estágio de desenvolvi-mento mais responsivo aos métodos subseqüentes descritos para por fimproduzir plantas.

Embora os órgãos de plantas contendo micrósporo tal comopendões podem geralmente ser pré-tratados em qualquer temperatura friaabaixo de aproximadamente 25°C, uma faixa de 4 a 25°C é preferencial, euma faixa de 8 a 14°C é particularmente preferencial. Embora outras tempe-raturas resultem em embrióides e plantas regeneradas, as temperaturas friasproduzem taxas de resposta otimizada comparada ao pré-tratamento emtemperaturas fora da faixa preferencial. A taxa de resposta é media como ouo número de embrióides ou o número de plantas regeneradas por número demicrósporos iniciados na cultura. Os métodos exemplificados de cultura demicrósporo são descritos, por exemplo, na Patente U.S. Nq 5.322.789 e Pa-tente U.S. N- 5.445.961, as descrições das quais são especificamente incor-poradas aqui por referência.

Ademais, em certas modalidades da invenção, uma planta departida ou célula de planta é transformada com um ácido nucléico tal comoum veto de truncagem de telômero. Os métodos para transformar células deplantas com ácidos nucléicos são bem-conhecidas àqueles versados na téc-nica. Por exemplo, os métodos podem empregar transformação mediada porAgrobacterium ou bombardeamento com partículas de DNA como exemplifi-cado aqui. Certos métodos exemplificados para transformar ácidos nucléicoscom alto peso molecular também foram desenvolvidos. Por exemplo, o sis-tema BIBAC projetado por Hamilton e amigos (Hamilton, 1997; Hamilton eoutros, 1996; Patente N9 5,733,744) para a transformação de grandes inser-ções de DNA-T em genomas de plantas. O BIBAC é uma combinação dafunção de transferência de DNA-T do plasmídeo Ti e a capacidade de man-ter os grandes fragmentos de DNA do cromossomo artificial bacteriano(BAC). Como com um BAC1 ele tem uma única origem de copia de replica-ção do plasmídeo F de E. coli para manutenção estável do plasmídeo em E.coli. Ele também tem uma única origem de cópia de replicação a partir doplasmídeo Ri de Agrobacterium, e as bordas de DNA-T para transformaçãode DNA-T. UM sistema similar, cromossomos artificiais competentes detransformação (TAC), com uma origem P1 de bacteriófago E. coli, foramtambém usados na transformação de grandes DNAs (Liu e outros, 1999).IV. Cultivo de Plantas Compreendendo um Minicromossomo

Como discutido acima, um cromossomo de planta nativo de par-tida pode ser usado de acordo com a invenção para gerar um minicromos-somo de planta. Em algumas modalidades, os cromossomos nativos parauso na invenção atual serão cromossomos de milho tal como cromossomosB de milho ou um cromossomo A de milho. Por exemplo, quaisquer doscromossomos de Z mays listados na Tabela 1 podem ser usados como umcromossomo de partida para obter um minicromossomo da invenção.

A Tabela 1 ilustra os tamanhos para os cromossomos A de Zeamays em pares de Megabase (Mb) ou em centimorgans (cM). O tamanhoem cM foi determinado via duas estratégias como descrito em Sharopova eoutros, 2002.Tabela 1: tamanhos de cromossomo A de Zea mays

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Entende-se também que em alguns casos, no minicromossomocompreende um sítio de recombinação específica em sítio. Assim, qualquervariedade de planta compreendendo o minicromossomo pode ser transfor-mada com um vetor que habilita a introdução de transgene no minicromos-somo por recombinação específica em sítio. Uma vez que um minicromos-somo de planta é gerado, ele pode ser facilmente passado por introgressãoem um fundo genético desejado por técnicas de cultivo de planta que sãobem-conhecidos na técnica.

Assim, a presente invenção fornece processos para cultivarplantas que compreendem um minicromossomo. De acordo com tal proces-so, uma primeira planta parente pode ser cruzada com uma segunda plantaparente onde estas compreendem um minicromossomo, ou onde pelo me-nos uma das plantas compreende um minicromossomo. Por exemplo, asplantas de milho (Zea mays L.) compreendendo um minicromossomo podemser cruzadas ou por técnicas naturais ou mecânicas.

A polinização natural ocorre em plantas com flor quando o ventoou insetos espalham pólen de uma planta. Entretanto, a polinização mecâni-ca pode ser efetuada controlando-se os tipos de pólen que são introduzidosou por polinização manual. Em uma modalidade, o cruzamento compreendeas etapas de:

(a) plantar em proximidade de polinização, sementes de umaprimeira e uma segunda planta parente, e preferencialmen-te, sementes de uma primeira planta endogâmica e umasegunda planta endogâmica distinta;

(b) cultivar ou fazer crescer sementes da primeira e da segun-da planta parente em plantas que produzem flores;

(c) emascular flores ou da primeira ou da segunda planta pa-rente, isto é, tratar as flores tal como para impedir a produ-ção de pólen, ou alternativamente, usar como a planta pa-rente fêmea uma planta estéril macho, desse modo forne-cendo uma planta parente emasculada;

(d) permitir que a polinização cruzada natural ocorra entre aprimeira e a segunda plantas parentes;

(e) colher sementes produzidas na planta parente emascula-da; e, onde desejado,

(f) cultivar a semente colhida em uma planta, preferencial-mente, uma planta híbrida.

As plantas parentais são tipicamente plantas em proximidade depolinização uma com a outra plantando-se as plantas parentais em linhasalternadas, em nós ou em qualquer outro padrão de plantação conveniente.Quando as plantas parentais diferem em tempo de maturidade sexual, pode-se desejar plantar a primeira planta que matura mais lentamente, desse mo-do assegurando a disponibilidade de pólen a partir da planta parente machodurante o tempo no qual a planta parente fêmea é receptiva ao pólen. Asplantas de ambos os parentes parentais são cultivados e permitidos a cres-cer até o tempo de florescimento. Vantajosamente, durante esse estágio decrescimento, as plantas são, em geral, tratadas com fertilizante e/ou outrasquímicas agrícolas se considerado apropriado pelo agricultor.

Na hora do florescimento, no evento em que uma planta com-preendendo um minicromossomo é a planta parente macho, o os órgãos queproduzem pólen da outra planta parental são removidos de todas as plantasempregadas como a planta parental fêmea para evitar autopolinização. Issopode ser alcançado manualmente, mas também pode ser feito por máquina,se desejado. Alternativamente, quando a planta parente fêmea compreendeum gene citoplásmico ou nuclear conferindo esterilidade masculina, a remo-ção dos órgãos que produzem pólen pode não ser exigida. Adicionalmente,um gametocida química pode ser utilizado para esterilizar as flores machoda planta fêmea. Nesse caso, as plantes parentes usadas como o machopodem ou não ser tratadas com o agente químico ou podem compreenderum fator genético que causa resistência aos efeitos emasculantes do agentequímico. Os gametocidas afetam os processos ou células envolvidas no de-senvolvimento, maturação ou liberação de pólen. As plantas tratadas comtais gametocidas são feitas machos estéreis, mas tipicamente permanecemfêmeas férteis. O uso de gametocidas químicos é descrito, por exemplo, naPatente U.S. N9 4.936.904, a descrição da qual é especificamente incorpo-rada aqui por referência em sua totalidade. Ademais, o uso de herbicidaROUNDUP (Monsanto, St. Louis, MO) em combinação com plantas de milhotolerantes a aglifosato para produzir plantas de milho estéreis macho é des-crito na Publicação PCT WO 98/44140.

Seguindo emasculação, as plantas são então tipicamente permi-tidas a continuarem crescendo e a polinização cruzada natural ocorre comoum resultado da ação do vento, que é normal na polinização de gramíneas,tal como milho. Como um resultado da emasculação da planta parente fê-mea, todo o pólen da planta parente macho está disponível para polinizaçãoporque as plantas que florescem produzindo pólen, foi previamente removidode todas as plantas da planta sendo usada como a fêmea na hibridização. Éclaro, durante esse processo de hibridização, as variedades parentais sãocultivadas tal que elas são isoladas de outros campos de plantas para mini-mizar ou impedir qualquer contaminação acidental de pólen a partir de fontesestranhas. Essas técnicas de isolamento são bem-conhecidas pelos versa-dos na técnica.

Ambas as plantas parentais de um cruzamento podem ser per-mitidas a continuar crescendo até a maturidade ou as linhas macho podemser destruídas depois que o florescimento está completo. Somente as se-mentes das plantas parentais fêmeas são colhidas para obter as sementesde um novo híbrido F1. A nova semente hibrida F1 produzida pode então serplantada em uma estação de cultivo em campos comerciais ou, alternativa-mente, avançada em protocolos de semeadura para propósitos de desenvol-vimento de novas linhagens endogâmicas.

Alternativamente, em outra modalidade da invenção, uma ouambas a primeira e a segunda plantas parentes podem compreender umminicromossomo de planta. Assim, qualquer planta compreendendo um mi-nicromossomo da invenção forma uma parte da invenção. Como usado aqui,o cruzamento pode significar autopolinização, retrocruzamento, cruzamentocom outra variedade ou a mesma variedade, cruzamento de populações, eseus similares. Todas as plantas de milho produzidas usando planta com-preendendo um minicromossomo como um parente estão, portanto, dentrodo escopo desta invenção.

EXEMPLOS

Os seguintes exemplos são incluídos para adicionalmente ilus-trar vários aspectos da invenção. Os versados na técnica deveriam apreciarque as técnicas descritas nos exemplos que seguem representam técnicase/ou composições descobertas pelo inventor para funcionarem bem na práti-ca da invenção, e assim podem ser consideradas como constituindo modospreferenciais para sua prática. Entretanto, os versados na técnica deveriam,em face à presente descrição, apreciar que muitas mudanças podem serfeitas nas modalidades específicas que são descritas e ainda obtêm um re-sultado similar sem abandonar o espírito e escopo da invenção.

Exemplo 1

Métodos Gerais de Truncagem de Telômero

A truncagem cromossômica mediada por telômero é executadapela introdução de seis cópias de repetições de telômero em um cromosso-mo de planta endógena via um plasmídeo de transformação. Nesse casoparticular, as repetições de telômero foram feitas a partir de telômeros deArabidopsis previamente clonados por Richards e Ausubel (1988). Embriõesimaturos de milho Hill (Armstrong and Green, 1985) foram transformadosseguindo os protocolos para transformação mediada por Agrobacterium comum vetor binário padrão (Frame e outros, 2002). Durante a transformaçãomediada por Agrobacterium, o DNA-T é protegido por proteínas VirD2 e VirEde Agrobacterium, e integrado no genoma de planta por um mecanismo derecombinação ilegítimo. Pequenos apagamentos podem ocorrer na maiorparte das vezes na região de borda esquerda, e às vezes, na região de bor-da direita. Entretanto, esses apagamentos não destruirão a seqüência detelômero. A presença das repetições de telômero trunca o cromossomo me-diante integração. A truncagem de cromossomo associado a telômero foidemonstrada como ocorrendo, e foi usada para produzir minicromossomosem células de mamíferos (Farr e outros, 1991, 1992, 1995; Barnett e outros,1993; Itzhaki e outros, 1992; Heller e outros, 1996; Mills e outros, 1999; Saf-fery e outros, 2001). Usando duas construções de truncagem cromossômicamediada por telômero, demonstrou-se que seis cópias de unidades de telô-mero de Arabidopsis diretas poderiam produzir a truncagem cromossômicaem milho.

Duas construções binárias para truncagem cromossômica foramconstruídas para transformação de gene mediada por Agrobacterium de em-briões imaturo de milho Hill (pWY76 e pWY86; ver figura 1). Noventa e três eoitenta e três linhas transgênicas foram recuperadas para pWY76 e pWY86,respectivamente. Um método de hibridização in situ por fluorescência (FISH)(Kato e outros, 2004) foi usado para detectar transgenes em cromossomosde metáfase de plantas transgênicas TO. Um total de 123 sítios de integra-ção de transgene para pWY76 e 107 sítios para pWY86 foram visualizados,com 54 e 55 sítios de integração localizados nos térmicos dos cromosso-mos. A absorção de pólen foi também observada em linhas transgênicas nasquais a truncagem cromossômica ocorreu. Ademais, os apagamentos demarcadores FISH distais em várias linhas transgênicas foram detectados porum coquetel de sonda de cariotipagem. Por exemplo, em uma linha transgê-nica pWY76, o braço curto 3 de cromossomo foi truncado. A análise Sou-thern blot demonstrou padrões de mancha de hibridização, que é uma carac-terística típica de telômeros heterogêneos recentemente semeados (Farr eoutros, 1991). Esses estudos indicaram que as truncagens de cromossomoocorreram nessas linhas transgênicas. Em contraste aos transgenes pWY76e pWY86, duas outras construções sem as repetições de telômero foramtambém transformadas simultaneamente; entretanto, nenhuma truncagemcromossômica foi observada. Esses resultados indicaram que as repetiçõesde telômero foram a causa da truncagem cromossômica.

Um minicromossomo derivado de cromossomo A foi encontradoem uma linha pWY86 por varredura FISH. Esse minicromossomo foi encon-trado como originando do cromossomo 7 com a maior parte do braço longoapagado. Esse minicromossomo foi originalmente encontrado em uma linhatetraplóide sem cromossomos B. Como ocorreu em uma poliplóide, a defici-ência causada pela truncagem do cromossomo foi compensada por seushomólogos em gametófitos diplóides. De fato, a típica absorção de pólen de50% observada em linhas diplóides com uma deficiência de cromossomonão foi observada, e as progênies contendo esse minicromossomo foramrecuperadas depois de cruzar o transformante recuperado por uma plantadiplóide, que reduziu o nível plóide a triplóide. O nível plóide foi então redu-zido a diplóide mais o minicromossomo em ambos os fundos Hill e Mo17.Estudos adicionais mostraram que esse minicromossomo não causou quais-quer fenótipos anormais. O minicromossomo transmitiu em taxa de 38,5%(10/26) como macho quando cruzado com uma planta diplóide.

Construções de ácido nucléico para truncagem de telômero emplantas

Duas construções de truncagem e um controle menos telômeroforam construídas usando o vetor binário pTF101.1 (Paz e outros, 2004) eusadas para a produção de minicromossomo (vide figura 1 para mapas deconstruções). Os componentes nessas construções são listados em ordemcomo abaixo: pWY76: LB-Tvsp-Bar-2XP35S-/ox66-GFP-Tnos-Pmas-HPT-Tmas-6x telomeres-RB, pWY86: LB-Tvsp-Bar-2XP35S-/ox77-DsRed-Tnos-Pnos-Ff?7-FLP-Tnos-6x telômeros-RB e pWY96: LB-Tvsp-Bar-2XP35S-/ox77-DsRed-Tnos-Pnos-FflT-FLP-Tnos-Pmas-HPT-Tmas-RB.

Os genes de fusão lox71-DsRed ou lox66-GFP sem promotorforam incluídos em pWY76 e pWY86, respectivamente, para permitir a inte-gração específica de gene adicional no sítio lox. Em adição, um cassetePnos-FRT-FLP-Tnos foi incluído em pWY86 para permitir recombinação es-pecífica em sítio no sítio FRT para integração de gene adicional.

Exemplo 2

Truncaqem de telômero em Cromossomos B

Para produzir minicromossomos B por truncagem cromossômicamediada por telômero, os cromossomos B de células de milho Black Mexi-can Sweet (BMS) foram introduzidos em uma linha A parente Hill de milho epermitidos a acumularem em múltiplas cópias. As duas construções de trun-cagem cromossômica associada a telômero foram misturadas com umaconstrução pACH25 (Christensem e Quail, 1996) para direcionar embriõesimaturos A parentes Hill ou híbridos Hill com múltiplos cromossomos B portransformação biolística (Frame e outros, 2000). O gene bar acionado porum promotor de utiquitina de milho na construção pACH25 habilita seleçãosuficiente de eventos transgênicos em meios suplementados com bialafos.

As seqüências de telômeros nas construções truncam cromossomos B bemcomo cromossomos A uma vez integrados nos cromossomos, assim ambosos minicromossomos a partir de cromossomos BeA truncados podem serproduzidos. Os cromossomos de metáfase de ponta de raiz obtidos a partirde plantas resistentes a herbicida regeneradas (TO) foram varridos por FISHpara minicromossomos. O plasmídeo pACH25 e uma construção pWY96(vide Exemplo 1), que quase todas as outras seqüências de ambos pWY76 epWY86 (vide abaixo) exceto a seqüência de telômero, são usados comosondas para varredura FISH. A sonda pWY96 pode eficientemente hibridizarcom ambos os transgenes pWY76 e pWY86. Uma sonda de repetição de Bfoi usada para identificar truncagens dos cromossomos B (Alfenito e Birchler,1993). Quarenta e oito minicromossomos foram identificados; 41 dos quaisforam a partir do cromossomo B enquanto 7 foram a partir de um cromos-somo A. Todos os minicromossomos a partir dos cromossomos B foramtransmissíveis e a maior parte deles foi recuperada na geração T1. Um tra-tamento de duplicação de cromossomo (Kato e Birchler, 2006) foi conduzidoem três minicromossomos A truncados para preservar os minicromossomosà medida que eles seriam perdidos de outra forma em meiose se mantidosem um diplóide.Exemplo 3

Expressão de Gene Cre por Transformação de Gene Mediada por Agrobac-terium com um Sistema de Vetor BIBAC

O sistema de vetor BIBAC®foi adotado para transformação demilho com uma grande parte de material genético incluindo um gene marca-dor de resistência a herbicida, um DNA genômico de levedura 30 kb comoum marcador par hibridização in situ por fluorescência (FISH)1 e um cassetede 35S-lox-Cre recombinação. Brevemente, o plasmídeo de transformaçãode gene BIBAC pJV21 foi construído como segue. O vetor pCH20 (Hamilton,1997) foi modificado para apagar o BamHI para fragmento Swal. O sítio Ba-mHI foi reconstituído adicionando-se um Iigador BamHI no sítio Swal segui-do com digestão BamHI e religação. O plasmídeo resultante é chamadopJV06. Um fragmento Hindlll/Sall 3,4 kb contendo o cassete de expressãode gene 35S-lox-Cre a partir de pED97 foi clonado no sítio BamHI por liga-ção de extremidade abrupta para fazer pJV08. A seguir, uma seqüência detelômero de 400 bp e um cassete e expressão de gene ubi-bar a partir depAHC25 (Christensen e outros, 1992) foram montados em pBLUESCRIPT™(Strategene, La Joila, Califórnia) e então clonados no sítio Srfl de pJV08 porligação de extremidade abrupta para fazer pJV15 no qual a seqüência detelômero foi localizada na borda esquerda do vetor binário. O gene ubi-barfoi usado como um marcador de seleção para esses estudos. A seqüênciade telômero TTTAGGG (SEQ ID NO:1) foi orientada em direção à borda es-querda. Outra seqüência de telômero de 400 bp foi clonada no sítio Pacl porligação de extremidade abrupta para fazer uma repetição direta dos 800 bpda seqüência de telômero na LB. O clone foi seqüenciado para confirmar aorientação da repetição de telômero. UM DNA de levedura de 3 kb de Bl-BAC1 (Hamilton, 1997; Hamilton e outros, 1996) foi então clonado no sítioNotl para fazer pJV21 (FIG. 2). As construções foram transformadas paracepas de Agrobacterium LBA4404 por eletroporação de células competentesseguindo as instruções do fabricante (Gibco, Invitrogen Co., Carlsbad, Cali-fórnia). Nessa construção, um cassete 35S-lox66-Cre foi clonado adjacenteà borda direita de modo a localizar o sistema de recombinação específicoem sítio Cre/lox no genoma por transformação de gene.Transformação Genética

Uma transformação de gene mediada por Agrobacterium foi e-xecutada com a construção pJV21 para transformar embriões imaturos deplantas Hill com 0 a 12 cromossomos B. Setenta e cinco linhas transforma-das foram recuperadas. Os transgenes foram confirmado por hibridizaçãoSouthern e FISH (Kato e outros, 2004). Em 60 linhas caracterizadas por hi-bridização Southern, 45 linhas tiveram um único transgene cópia. Sessentae três das 75 linhas transgênicas tiveram um único transgene se determina-do por FISH. A integridade do transgene foi analisada por hibridizações Sou-thern blot em ambas as extremidades esquerda e direita da região de DNA-Tusando sondas do gene bar e do gene Cre1 respectivamente. Nas 75 linhasque foram analisadas, 52 linhas transgênicas foram encontradas como tendoo mesmo número de cópia em ambas a borda esquerda e direita, indicandoque os transgenes nesses casos estão intactos.

Integração de um transgene na região de telômero

Um evento transgênico J11-9 mostrou um padrão de mancha dehibridização Southern se comparada aos outros que têm bandas discretas.O padrão de mancha de hibridização é uma marca de telômeros que resul-tou da atividade de telômeros ou neo-telômeros normal semeados duranteuma truncagem cromossômica mediada por telômero, porque a telomeraseadiciona números diferentes do motivo telomérico TTTAGGG; (SEQ IDNO:1) em diferentes células (Farr e outros, 1991; Richards e Ausubel, 1988).Para demonstrar a natureza terminal desse transgene, múltiplas enzimas derestrição que cortam a região distai do transgene exatamente precedendo os800 bp de repetição de telômero foram usadas para digerir o DNA genômicoJ11-9, e uma hibridização Southern foi executada com uma sonda de genebar rotulada 32P (Yu e outros, 2006b). Os padrões de mancha de hibridiza-ção deslocada de acordo com as distâncias entre os três sítios de corte deenzima de restrição (Xba\, Xho\ e Dra\) e as extremidades teloméricas docromossomo. Por exemplo, a enzima mais proximal Dral gerou o padrão demancha maior na faixa de mais de 6 kb, enquanto um Xbal mais distai geroupadrões de mancha na faixa de 3,2 a 4,6 kb e o Xhol produziu manchas en-tre 5 a 6 kb. Em contraste, a clivagem em um sítio Hindlll mais proximal pro-duziu uma banda discreta. Uma banda discreta seria gerada se houvesseum sítio Hindlll distai para a sonda de gene bar. Esse sítio Hindlll estavaprovavelmente presente no telômero natural porque esse sítio não foi encon-trado em nossa seqüência de dados da construção pJV21. Assim a posiçãofinal do transgene em J11-9 foi potencialmente o resultado de um evento deintegração nos telômeros ao invés de uma formação de telômero de novo.Em adição, nenhum crescimento anormal, esterilidade de gametófito, outransmissão reduzida foi observado nas plantas J11-9, indicando que não háperda de material genético funcional causada por esse transgene, um fenô-meno freqüentemente observado em plantas transgênicas com truncagenscromossômicas (Yu e outros, 2006b).

A localização final desse transgene foi também revelada poruma análise citológica. Os cromossomos de pontas de raiz J11-9 foram hi-bridizados com uma sonda de DNA de 30 kb rotulada fluorescina-dUTP mis-turada com um coquetel de cariotipagem (Kato e outros, 2004). Os cariótiposde recipientes de transformação Hill foram produzidos com esse coquetel(Yu e outros, 2006a). O transgene foi identificado na extremidade do braçode cromossomo 3L.

Posição e Distribuição de transqenes

A análise FISH foi estendida a todas as linhas transgênicas demodo a traçar um perfil das posições e distribuições de transgene. Os trans-genes foram encontrados em cada cromossomo no cariótipo (Tabela 2) esítios de integração foram encontrados dentro ou próximo a telômeros, cen-trômeros, regiões eucromáticas, nós heterocromáticos e regiões NOR porFISH. Todos os braços do cromossomo foram incluídos exceto 8S e 10S. Ostransgenes foram distribuídos aleatoriamente entre os 10 cromossomos Acom mais números em grandes cromossomos, e menos números em pe-quenos cromossomos como esperado. Entretanto, nenhum transgene foiobservado em qualquer cromossomo B embora houvesse até 12 cromosso-mos B ("Bs") presentes (média 3,9) nas plantas transformadas.

Tabela 2: Eventos transgênicos com a construção pJV21 de mi-lho por transformação mediada por Agrobacterium

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<table>table see original document page 41</column></row><table>Continuação

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Sistema de recombinacão específica em sítio Cre/lox

A transformação com 84 transgenes localizados na construçãoBIBAC aleatoriamente no genoma de milho. Esses transgenes são na maiorparte intactos como indicado por hibridizações Southern. Noventa e um sí-tios transgênicos foram detectados em 75 linhas transgênicas por hibridiza-ções Southern com uma sonda de gene Cre (Tabela 2). Para demonstrarque esses transgenes Cre foram expressos e funcionais, uma construção derepórter pHK52 (Srivastava e outros, 1999) foi biolisticamente liberada nosembriões imaturos da progênie das plantas transgênicas. A construção p-HL52 contém um gene beta-glucuronidase (GUS) orientado anti-senso sob opromotor de ubiquitina de milho. O gene GUS anti-senso é flanqueado porrepetições invertidas do sítio IoxP. O gene GUS anti-senso revertido para aorientação senso e expresso na presença de uma Cre recombinase que ca-talisa a invenção de elementos genéticos flanqueados por repetições inverti-das de sítios lox. Um ensaio GUS transiente foi executado em embriõesbombardeados de todas as linhas transgênicas. Esse estudo demonstrouque o gene Cre foi funcional em 68 linhas (Tabela 2). Uma população deembriões foi segregadas para o transgene em um fluxo gênico de J11-9 paraa linha Hill. A expressão de GUS foi ativada em 30 de um total de 50 embri-ões, uma relação -1:1.

Exemplo 4

Truncagem de Telômero de Cromossomos B por Transformação de Bom-bardeamento de Partícula

Como o cromossomo B tem muitas propriedades que o tornampreferencial como um minicromossomo, estudos adicionais foram executa-dos para determinar se os minicromossomos de planta derivados de cro-mossomos B podem ser eficientemente gerados. As construções de trunca-gem de telômero, pWY76 e pWY86 (FIG. 1) foram usadas nesses estudos.Adicionalmente, o plasmídeo pWY86-bar foi feito digerindo pWY86 com P-mll/AvrlI e autoligação para apagar o cassete de expressão de gene 35S-bar. O plasmídeo pAHC25 usados nos estudos foi previamente descrito porChristensen e Quail (1996).

Brevemente, embriões imaturos entre 1,2 a 2,0 mm foram disse-cados assepticamente em uma capota de fluxo. A transformação de genemediada por biolística de embriões imaturos de milho foi conduzida comodescrito por Songstad e outros (1996) e Frame e outros (2000). Os embriõesimaturos foram localizados com a face para baixo em meios de iniciação decalus com sais e vitaminas N6 (Chu e outros, 1975) suplementados com 2,0mg/l de 2,4-D, 100,0 mg/l de mio-inositol, 2,8 g/l de prolina, 30,0 g/l de saca-rose, 100,0 mg/l de hidrolisato de caseína, 3,0 g/l de GELRITE, 25 μΜ denitrato de prata, PH 5,8. Os embriões foram induzidos em 28°C por 2-4 dias,então transferidos para meios osmóticos com sais N6 e vitaminas suplemen-tados com 2,0 mg/l de 2,4-D, 100,0 mg/l de mio-inositol, 0,7 g/l prolina, 30,0g/l de sacarose, 100,0 mg/l de hidrolisato de caseína, 36,4 g/l de sorbitol,36,4 g/l de manitol, 3,0 g/l de GELRITE, 25 μΜ de nitrato de prata, pH 5,8para tratamento osmótico de 4 horas antes de bombardeamento.

Os plasmídeos foram preparados com um kit de miniprep Qia-gen (Qiagen, Valencia1 Califórnia). Três miligramas de partículas de ouro de0,6 μ (BIO-RAD, Hercules, Califórnia) foram revestidos com a mistura de 1μg de plasmídeo de truncagem de telômero (pWY76, pWY86, ou pWY86-bar) e 0,25 μg de pAHC25. O bombardeamento foi executado com a armabiolística 1000/He PDS (BIO-RAD) usando os seguintes parâmetros: pres-são de disco de ruptura de4,48 mPa (650 psi), distância alvo de 6 cm, lacunade 6 mm, 1,2 cm de macro-carreador para placa de bloqueio, e vácuo emruptura de 28 Torr.

Os embriões bombardeados nos meios osmóticos foram envol-tos com PARAFILM e incubados a 28°C ao longo da noite e então transferi-do a meios de iniciação de calus na manha seguinte.

Análise FISH de minicromossomos em plantas transqênicasAs plantas transgênicas TO foram varridas para minicromosso-mos por FISH como descrito acima. As sondas de pWY96 e pAHC25 foramrotuladas com Texas red dCTP por tradução de corte (Kato e outros, 2004) ehibridizadas para transgenes. A seqüência de repetição B (Alfenito e Birchler1993) foi rotulada com Alexa Fluor-488 dCTP, e misturada com ou sondasde transgene pWY96 ou pAHC25 para varrer os cromossomos B transfor-mados por transformação mediada por biolística. As sondas CentC (Ananieve outros, 1998) e NOR (Stein e outros, 1998) foram rotuladas com AlexaFluor-488 dCTP (Invitrogen); CRM (Zhong e outros, 2000) foi rotulado comCy5-dCTP. Os minicromossomos foram identificados por seu tamanho secomparado a cromossomos tipo A ou B normais. FISH de células meióticasfoi executado como descrito por Gao e outros (1999) e Yu e outros (2006). Arepetição de B foi rotulada com Texas red dCTP e a seqüência de nó (14) foirotulada verde com Alexa Fluor-488 dCTP.

Duzentos e oitenta e um eventos transgênicos foram regenera-dos a partir de calus de resistência a bialafos (67 com pWY76, 87 compWY86, e 127 com pWY86-bar). FISH revelou que quarenta e um eventostiveram transgenes em cromossomos B, que incluíam 24 minicromossomoscom transgenes distais e 20 cromossomos B intactos com transgenes inter-nos. Adicionalmente, 5 translocações A-B e 1 B-A1 e 7 fragmentos de cro-mossomos A foram identificados. Finalmente, 10 derivados de cromossomoB truncados sem sinais de transgene foram também identificados. Esseseventos foram provavelmente produzidos quando truncagem cromossômicamediada por telômero ocorreu em tal orientação que os transgenes são reti-dos em fragmentos acêntricos e são perdidos durante mitose. Esses mini-cromossomos seriam perdidos durante a seleção no processo de transfor-mação se eles não foram suportados por transgenes adicionais no mesmoevento. Assim, esses minicromossomos foram menos em número do queaqueles com transgenes.

Medição de tamanho de minicromossomo

Para medir o tamanho da repetição de centrômero B de 86B23,os canais verdes de 10 imagens de cromossomo de metáfase que tem repe-tição B rotulada verde foram importados do programa Fujifilm Image GaugeV3.3 (Fuji, Tóquio, Japão). A quantidade do centrômero de minicromossomoe aquela de um centrômero de cromossomo B normal foram medidas e arelação do centrômero de minicromossomo para aquela de um B normal foicalculada a partir de cada célula individual. A relação média e o desvio pa-drão foram calculados. Para medir o tamanho do cromossomo de 86B23, oscromossomos paquítenos foram manchados com 4'-6-Diamidino-2-fenilindol(DAPI), imagens foram capturadas via um microscópio de fluorescênciaZeiss (Carl Zeiss, Inc., Oberkochen, Alemanha) e importadas para o progra-ma Fujifilm Image Gauge (Fuji). Os comprimentos do minicromossomo e docromossomo B normal foram medidos, e sua relação foi calculada. Os tama-nhos de outros minicromossomos foram estimados visualmente com baseem sua aparência se comparado àqueles cromossomos B normais na mes-ma célula. As comparações de tamanho de vários cromossomos B trunca-dos são mostradas na Tabela 3.

Teste de transmissão de minicromossomos

Os resultados desses estudos mostraram que a transmissão deminicromossomos durante a meiose varia (Tabela 3). A transmissão de umR2 univalente (34,8% de autopolinização) foi comparável a um isocromos-somo previamente reportado 8S*8S (37,5%) (Yu e outros, 2006). A transmis-são de minicromossomos tipo B varia de 12% (86-74) a 39% (76-15a) via oparente macho (Tabela 3). A transmissão de minicromossomos foi afetadapor muitos fatores, tais como um limite de tamanho de cromossomo (Schu-bert, 2001; Spence e outros, 2006). Sabe-se também que o tamanho e aestrutura do centrômero B podem afetar a transmissão de derivados de cro-mossomo B (Kaszas e Birchler 1998). A maioria dos minicromossomos deri-vados do cromossomo B passou por não-disjunção na presença de cromos-somos B normais. A região distai do braço longo do cromossomo Beo cen-trômero são responsáveis por não-disjunção de cromossomos B (Carlson1978). Por exemplo, na presença de cromossomos B normais, os parentesmacho transmitiram 2 cópias de minicromossomos à progênie (Tabela 3).Essa propriedade de minicromossomos tipo B fornece um mecanismo paracriar uma série de dosagem dos minicromossomos para expressão aumen-tada de genes de interesse.

Tabela 3: Tamanhos e taxas de transmissão de minicromossomo B

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NM indica não medido. * Número de progênie com minicromos-somos/ número de progênie testado. ** Número de minicromossomos trans-mitidos/número de progênie testado.

Ensaio GUS histoquímico em indivíduos de transqenes em cromossomos Be derivados

Como com cromossomos B supernumerários de outros organis-mos, o cromossomo B de milho é inerte sem quaisquer genes ativos detec-tados (Jones, 1995). Entretanto, sabe-se se a ausência de atividade de geneem cromossomos B é causada pela ausência de genes ou por causa da su-pressão de transcrição de gene pelo cromossomo B devido a sua naturezaheterocromática. A transformação do cromossomo B em milho é usada paradeterminar se há supressão de expressão de transgene. Nesse estudo, 17eventos transgênicos foram gravados, os quais tiveram somente transgenesem cromossomos B. Isso indicou que eles foram provavelmente suportadospela expressão de genes bar transgênicos a partir de cromossomos B, em-bora foi possível que os transgenes em cromossomos A estivessem presen-tes, mas fossem muito pequenos para serem detectados pelo método FISH.A expressão de gene GUS de 9 desses eventos foi determinada pelo ensaiodo calus resistente. A ausência de expressão GUS a partir de outros eventospode ser atribuída ou ao silenciamento do gene GUS ou à ausência de umcassete de gene GUS intacto durante o processo de transformação. Entre-tanto, em pelo menos 6 eventos, a expressão de gene GUS foi atribuída aostransgenes no cromossomo B ou derivados (Tabela 4). Nesses casos, asraízes primárias germinadas da segregação de progênie foram testadas paraexpressão de GUS. Por exemplo, na progênie de 76-15a, 76-15b e 86-74 defluxo gênico para plantas de cepa recipiente, toda a progênie que teve trans-genes no cromossomo B ou derivados truncados (14, 11 e 3 indivíduos, res-pectivamente) expressaram GUS, mas nenhum deles que não tiveramtransgenes nos cromossomos B ou derivados (22, 19 e 22 indivíduos, res-pectivamente) expressou GUS. Em progênie de autopolinizado 86B23 queteve o minicromossomo menor, 23 dos 25 indivíduos que tiveram transgenesnos minicromossomos expressaram GUS, mas nenhum dos 26 que não tive-ram o minicromossomo mostrou expressão de GUS. A ausência de expres-são de GUS a partir de progênie carecendo de transgenes no cromossomoB e derivados demonstrou que a expressão de GUS foi dos transgenes nocromossomo B ou derivados e não de eventos de cromossomo A não detec-tados. Assim, os transgenes inseridos nos cromossomos B foram expressos,pelo menos naqueles sítios que foram testados. Esses sítios parecem seraleatoriamente distribuídos ao longo do cromossomo B a partir do centrôme-ro até a extremidade do braço longo do cromossomo B.

Tabela 4: Expressão de transgene em minicromossomos B

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O ensaio histoquímico de expressão de gene GUS foi executadode acordo com Jefferson e outros (1987) por um kit de manchamento deGUS (Sigma, St. Louis, MO). Calus ou raízes de corte de 2 a 5 mm de com-primento foram localizados diretamente em uma solução de manchamentoGUS de 50 μΙ arranjada em uma placa PCR de 96 cavidades. A placa foienvolta com PARAFILM e incubada a 37°C por 1 hora.

Recombinação entre J11-9 e R2

Para demonstrar o uso de minicromossomos como uma plata-forma AC, o sítio Iox no minicromossomo R2 foi testado para troca catalisadade Cre. Uma planta transgênica J11-9 com um cassete de expressão 35S-lox66-Cre de transgene distai foi cruzada com uma fêmea por R2, que con-tém um gene lox71-DsRed (Clontech, Mountain View, Califórnia) sem pro-motor. Lox6 e lox71 são sítios de recombinação Iox mutantes que podemrecombinar mais favoravelmente na reação dianteira, como descrito acima.A recombinação bem sucedida dos dois transgenes resulta na troca das re-giões distais dos dois transgenes e na adição de material genético ao mini-cromossomo R2 a partir de J11-9. A recombinação pode ser monitorada pelareação recíproca que localiza o gene DsRed sem promotor sob o controle depromotor 35S, assim produzindo uma proteína de fluorescência vermelhareconhecível. Os eventos de recombinação foram varridos em raízes primá-rias de mudas germinadas usando um microscópio estéreo de fluorescênciacom um filtro vermelho Texas. Quatro plantas foram identificadas com baseno ensaio de fluorescência a partir de um total de 44 progênies F1 de umcruzamento de heterozigotos J11-9 por heterozigotos R2. Aproximadamente8,7% da progênie (aproximadamente 4 plantas) deveria ter ambos dostransgenes baseados na transmissão de R2 (Tabela 4) e J11-9.

Para determinar se a fluorescência vermelha foi um resultado derecombinação específica em sítio, DNA genômico foi isolado de cada umadas 4 plantas que expressaram fluorescência vermelha, e foi usado comomodelos para amplificação PCR através de ambos os produtos de recombi-nação predita. Os produtos amplificados foram seqüenciados e a recombi-nação no sítio Iox foi confirmada em cada caso. As configurações das regi-ões seqüenciadas combinaram com os padrões esperados. Assim, esse mi-nicromossomo foi demonstrado como sendo amenizável para manipulaçõesgenéticas via um sistema de recombinação específico em sítio, e pode servircomo um protótipo de minicromossomo com base em cromossomos artifici-ais (ACs).Referências

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Claims (40)

1. Minicromossomo de planta produzido por truncagem de um ouambos os braços de um cromossomo de partida de planta, onde o minicro-mossomo compreende um centrômero de planta nativa e é estavelmentetransmitido durante mitose e meiose em uma planta compreendendo o mini-cromossomo que é da mesma espécie da planta a partir da qual o cromos-somo de partida de planta foi obtido.

2. Minicromossomo da planta, de acordo com a reivindicação 1,em que aproximadamente 25% a aproximadamente 99,9% do cromossomode partida de planta foi truncado.

3. Minicromossomo da planta, de acordo com a reivindicação 1,em que o minicromossomo compreende seqüências de telômero elaboradas.

4. Minicromossomo da planta, de acordo com a reivindicação 3,em que as seqüências de telômero elaboradas compreendem aproximada-mente 2 a 110 repetições de telômero.

5. Minicromossomo da planta, de acordo com a reivindicação 3,em que as seqüências de telômero elaboradas compreendem aproximada-mente 6 repetições de telômero.

6. Minicromossomo da planta, de acordo com a reivindicação 3,em que as seqüências de telômero elaboradas são de Arabidopsis.

7. Minicromossomo da planta, de acordo com a reivindicação 1,em que ambos os braços do cromossomo de partida de planta foram trunca-dos.

8. Minicromossomo da planta, de acordo com a reivindicação 1,em que o minicromossomo tem tamanho de aproximadamente 1 Mb a apro-ximadamente 100 Mb.

9. Minicromossomo da planta, de acordo com a reivindicação 1,em que o cromossomo de partida de planta é um cromossomo A.

10. Minicromossomo da planta, de acordo com a reivindicação 1,em que o cromossomo de partida de planta é um cromossomo B.

11. Minicromossomo da planta, de acordo com a reivindicação 1,em que o cromossomo de partida de planta é de uma dicotiledônea.

12. Minicromossomo da planta, de acordo com a reivindicação 11, em que o cromossomo de partida de planta é a de uma monocotiledônea.

13. Minicromossomo da planta, de acordo com a reivindicação 12, em que o cromossomo de partida de planta é de milho.

14. Minicromossomo da planta, de acordo com a reivindicação 1,adicionalmente compreendendo um sítio de recombinação específica emsítio.

15. Minicromossomo da planta, de acordo com a reivindicação 15, em que o sítio de recombinação específica em sítio é um FRT ou sítio lox.

16. Minicromossomo da planta, de acordo com a reivindicação 1,adicionalmente compreendendo um transgene.

17. Minicromossomo da planta, de acordo com a reivindicação 16, em que o transgene confere um traço selecionado a partir do grupo queconsiste em resistência a inseto, tolerância a herbicida, metabolismo de car-boidrato alterado, metabolismo de ácido graxo alterado, resistência à doen-ças, restauração de fertilidade macho e resistência a pesticida.

18. Célula de planta compreendendo o minicromossoma deplanta como definido na reivindicação 1.

19. Planta compreendendo o minicromossoma de planta comodefinido na reivindicação 1.

20. Planta, como definido na reivindicação 18, em que a planta émilho.

21. Semente compreendendo o minicromossoma de planta dareivindicação 1.

22. Método de produzir um minicromossoma de planta, compre-endendo as etapas de:(a) transformar um cromossoma de partida de planta com umácido nucléico heterólogo compreendendo pelo menos du-as seqüências de repetição de telômeros; e(b) permitir que a truncagem do cromossomo de partida deplanta ocorra para produzir um minicromossoma de planta.

23. Método, de acordo com a reivindicação 22, adicionalmentecompreende transformar o cromossoma de partida de planta com um sítio derecombinação específica em sítio.

24. Método, de acordo com a reivindicação 22, em que o sítio derecombinação específica em sítio é um FRT ou sítio lox.

25. Método, de acordo com a reivindicação 22, em que as se-qüências de repetição de telômero são de Arabidopsis.

26. Método, de acordo com a reivindicação 22, em que o ácidonucléico heterólogo compreende aproximadamente 2 seqüências de repeti-ção de telômero.

27. Método, de acordo com a reivindicação 22, em que o cro-mossomo de partida de planta é transformado por transformação mediadapor Agrobacterium.

28. Método, de acordo com a reivindicação 22, em que o cro-mossomo de partida de planta é transformado por bombardeamento de DNA.

29. Método, de acordo com a reivindicação 22, em que ambosos braços do cromossomo de partida de planta são truncados.

30. Método, de acordo com a reivindicação 22, em que o cro-mossomo de partida de planta é um cromossomo A.

31. Método, de acordo com a reivindicação 22, em que o cro-mossomo de partida de planta é um cromossomo B.

32. Método, de acordo com a reivindicação 22, adicionalmentecompreende transformar o cromossoma de partida de planta com uma se-qüência de codificação selecionada.

33. Método, de acordo com a reivindicação 22, em que a se-qüência de codificação selecionada confere um traço selecionado a partir dogrupo que consiste em resistência a inseto, tolerância a herbicida, metabo-lismo de carboidrato alterado, metabolismo de ácido graxo alterado, resis-tência à doenças, restauração de fertilidade macho e resistência a pesticida.

34. Método, de acordo com a reivindicação 22, em que o cro-mossomo de partida de planta está compreendido em uma célula de planta.

35. Método, de acordo com a reivindicação 34, em que a célulade planta compreende pelo menos 2 cópias de cromossomo B.

36. Método, como definido na reivindicação 18, em que o mini-cromossomo de planta compreende um transgene.

37. Método, de acordo com a reivindicação 22, em que o cro-mossomo A de partida de planta é transformado por transformação mediadapor Agrobacterium.

38. Método, de acordo com a reivindicação 22, em que o cro-mossomo B de partida de planta é transformado por bombardeamento commicro-projétil.

39. Minicromossomo de planta, de acordo com a reivindicação-17, em que a seqüência de codificação conferindo restauração de fertilidademacho é um gene Rf3.

40. Método, de acordo com a reivindicação 33, em que a se-qüência de codificação conferindo restauração de fertilidade macho é umgene Rf3.