BRPI0708499A2

BRPI0708499A2 - compostos esteroidais como inibibodres de sulfatase de esteróide

Info

Publication number: BRPI0708499A2
Application number: BRPI0708499-4A
Authority: BR
Inventors: Barry Victor Lloyd Potter; Michael John Reed; Lok Wai Lawrence Woo; Atul Purohit; Paul Foster
Original assignee: Sterix Ltd
Priority date: 2006-03-01
Filing date: 2007-02-28
Publication date: 2011-05-31
Also published as: IL192689A0; AU2007220359A1; RU2428427C2; GB0604142D0; JP2009528334A; RU2008138165A; MX2008011292A; ES2439947T3; CA2636431A1; NZ570094A; AU2007220359B2; CN101395171B; CA2636431C; HK1126225A1; WO2007099304A1; KR20080100470A; EP1996604A1; EP1996604B1; CN101395171A; JP5144543B2

Abstract

COMPOSTOS ESTEROIDAIS COMO INIBIBODRES DE SULFATASE DEESTEROIDE é proporcionado composto tendo a Fórmula (1) em que G é um grupo fluorocarbi1a e em que R^ 1^ é qualquer um de um grupo sulfamato, um grupo fosfonato, um grupo tiofosfonato, um grupo sulfonato ou um grupo sulfonamida, capaz de inibição de sulfatase de esteróide.

Description

Relatório Descritivo

Pedido de Patente de Invenção Para: "COMPOSTOSESTEROIDAIS COMO INIBIBODRES DE SULFATASE DE ESTERÓIDE".CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção se refere a um composto. Emparticular, a presente invenção proporciona compostoscapazes de inibir a sulfatase de esteróide.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

O câncer de mama é uma doença devastadora a qualpermanece como uma causa principal de morte para asmulheres na maioria dos países ocidentais. Estima-se queele afete aproximadamente 1 milhão de mulheres por ano portodo o globo.1

A Grã-Bretanha tem uma das taxas mais 'elevadas demortalidade por câncer de mama em todo o mundo, com mais de35.000 mulheres diagnosticadas anualmente respondendo porquase um em cada cinco casos de todos os cânceres. Estima-se que 1 em 10 mulheres que vivem até a idade de 85 na Grã-Bretanha desenvolverão câncer de mama durante o curso desua vida. Apesar dos métodos modernos de tratamento, bemcomo a detecção precoce da doença tenham melhoradosignificativamente as taxas de sobrevivência, o câncer demama continua a ser a principal causa de morte das mulherescom idades compreendidas entre 35-54.2Todas as mulheres estão em risco de câncer de mama,embora uma série de fatores de risco tenham sidoidentificados, a maioria deles sendo relacionados aohistórico hormonal e reprodutivo da mulher, bem como a seuantecedente familiar da doença. As mulheres com maior riscosão geralmente aquelas com uma forte história familiar dadoença, início precoce da menarca, menopausa tardia ouaparecimento de uma primeira gravidez a termo após a idadede 3O.2

Nas primeiras fases de um câncer de mama, a cirurgiaparece ser o tratamento de escolha. Na maioria dos casos,técnicas cirúrgicas que preservam a mama, tal como incisãolocal de nódulo(s) na(s) mama(s), estão envolvidas em vezde mastectomia. Para prevenir 'qualquer recorrência dadoença, radioterapia é freqüentemente prescrita,particularmente se técnicas de preservação da mama estãoenvolvidas.3 Ela também é usada para reduzir grandestumores a um tamanho operável, de modo que a cirurgiaconvencional possa ser realizada.4

Para cânceres de mama avançados, quando o tumor seespalhou ou re-ocorreu, o objetivo do tratamento já não é acura, mas alcançar um controle paliativo. Este é o casoquando metástases do tumor atingem localizações tais comoossos, pele, nódulos linfáticos ou cérebro. 0 tratamentovaria dependendo do estado hormonal da paciente (se é umamulher na pré- ou pós-menopausa a ser tratada) e dependendodo tipo de tumor. Na verdade, foi provado que determinadostumores contam com estrogênios para o seu crescimento edesenvolvimento, levando àquilo que é denominado um Câncerde Mama Hormônio-Dependente (HDBC, veja 1-1) . Embora não-HDBC sejam tratados com quimioterapia, onde o objetivo ématar diferencialmente células cancerígenas usando umacombinação de agentes citotóxicos,3 espera-se que HDBCresponda à terapia endócrina.

0 conceito de tumores dependentes de hormônio apareceuno início dos anos 60, quando o modelo de ação deestrogênios foi primeiro introduzido.6 De modo que osestrogênios regulem o crescimento e função celular em serèshumanos, uma proteína específica, denominada Receptor deEstrogênio humano (hER) deve estar presente.7 Estaproteína, localizada no núcleo, interage com estrogênios,resultando na formação de um complexo de ligação. Esse atuacomo um fator de transcrição através de. ativação deprodução de m-RNA de genes específicos, um ou mais dosquais provavelmente são essenciais para o crescimentoeficaz de células cancerígenas.

Pacientes com um nível mensurável de proteína dereceptor são classificadas como receptor de estrogêniopositivos (ER +), era oposição a receptor de estrogênio-negativos (ER -). Cerca de 50% das mulheres em pré-menopausa e 75% das mulheres em pós-menopausa caem no grupoER+8, onde o desenvolvimento de câncer de mama pode estardiretamente ligado à presença de estrogênios. Foi provadoque terapia endócrina, onde o uso de fármacos resulta emuma privação de estimulo estrogênico às células, é umaabordagem eficaz para o tratamento de HDBC. Inicialmente,duas classes de fármacos, que respondem à diferentesestratégias, foram desenvolvidas: anti-estrogênios einibidores de aromatase.

Anti-estrogênios, como antagonistas do receptor deestrogênio, foram um dos primeiros tratamentos consideradospara HDBC. A sua ação repousa sobre sua capacidade de seligar competitivamente à proteína receptor-específica hER,assim, impedindo o acesso de estrogênios endógenos ao seusítio de ligação específico. Conseqüentemente, o hormônionatural é incapaz de manter o crescimento de tumor.

Dos anti-estrogênios comumente utilizados em terapiade câncer de mama, o tamoxifeno (abaixo) é o maisamplamente utilizado em virtude do perfil de toxicidademuito baixo da molécula. A despeito de seu esqueleto não-esteroidal, o tamoxifeno possui uma atividade agonista-antagonista mista que limita o potencial terapêutico9. Alémdisso, alguma forma de resistência ao fármaco foi reportadaem pacientes após tratamentos de longa duração comtamoxif eno10.

Novos fármacos anti-estrogênicos puros, tal como ICI164384 (abaixo), foram desde então descobertos, mas a perdade potência comparado com o tamoxifeno sugeriu anecessidade de projetar alvos mais altamente potentes11.

<formula>formula see original document page 6</formula>

Há alguns anos, um novo tipo de anti-estrogêniosurgiu, combinando o agonismo do estrogênio em tecidosalvos, tais como ossos ou fígado, e antagonismo e/ouagonismo mínimo em tecidos reprodutivos, tais como mama ouútero12. Esses compostos, designados como ModuladoresSeletivos do Receptor de Estrogênio (SERMs), não são apenaspotencialmente eficazes na redução de um risco de carcinomade mama para o paciente, mas também foi mostrado que elesaumentam a densidade óssea mineral e previnem a osteoporoseem mulheres na pós-menopausa. O Raloxifeno é o primeirodessa classe de compostos a ser usado clinicamente13. MaisSERMs estão atualmente em ensaios clínicos e estasmoléculas poderiam, um dia, substituir o tamoxifeno como otratamento de primeira linha para as mulheres com HDBC.

O uso de agentes terapêuticos que inibem uma ou váriasenzimas da via de biossíntese de esteróides representaoutra importante estratégia para controlar odesenvolvimento de tumores dependentes de estrogênio14. Aenzima aromatase, a qual converte esteróides androgênicosC19 a esteróides estrogênicos C18, foi o primeiro alvo pararedução dos níveis de estrogênio. Esse complexo enzimático,o qual contém uma hemoproteína de citocroma P4 50, catalisaa aromatização do anel A de androgênio com a subseqüenteperda do grupo C19 metila para proporcionar estrogênios.

Aminoglutetimida (abaixo) foi o primeiro inibidor dearomatase usado para o tratamento de câncer de mama.Contudo, mostrou uma série de efeitos colateraisindesejáveis dado seu amplo espectro de efeitos inibitóriosem outras enzimas P450-dependentes e tentativas de melhorara estrutura original conduziram a uma série de compostosnão-esteróides entrando em ensaios clínicos15. A últimageração desenvolveu compostos, tais como letrozola, osquais combinam alta potência e alta seletividade pelaenzima e são também melhor tolerados.<formula>formula see original document page 8</formula>

Letrozola

Estrutura de diferentes tipos de inibidores de aromatase.Geração I: aminoglutetimida, AG; Geração III, letrozola.

Tradicionalmente, inibidores de aromatase sãoreservados como tratamento de segunda linha para pacientescom HDBC avançado cujas doenças não são mais controladaspelo tamoxifeno. No entanto, em virtude do perfil detoxicidade extremamente bom de alguns dos últimosinibidores de aromatase, ensaios clínicos recentes foramconduzidos para avaliar a sua adequabilidade comotratamento de primeira linha para HDBC.

Fortes evidências emergiram durante a última década,bioquímica e clinicamente, de que a inibição única daenzima aromatase não pode proporcionar uma redução eficazde estímulo estrogênico ao HDBC, a razão sendo que outrasvias estão envolvidas na biossíntese de estrogênio. A viade sulfatase é agora considerada como sendo a maior viapara a síntese de estrogênio em tumor de mama, uma vez quedescobriu-se que a atividade de sulfatase proporciona 10vezes mais estrona do que a atividade de aromatase16.Na via de sulfatase, estrogênios são sintetizados apartir do precursor sulfato de estrona altamentedisponível, via duas enzimas (esquema abaixo): sulfatase deestrona (STS), a qual hidrolisa sulfato de estrona emestrona e dehidrogenase de 17β-hidróxi-esteróide (ΐνβ-HSD),a qual reduz a estrona em estradiol. Essas duas enzimasrepresentam os últimos alvos para estratégias de privaçãode estrogênio.

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Origem dos estrogênios em células normais e em tumor demama. AR, aromatase; ST: sulfotransferase de esteróide;STS, sulfatase de esteróide; 17P-HSD, dehidrogenase de 1-7 β -hidróxi-esteróide; Δ5, A4-isomerase de dehidrogenase 3β-Ι5,3β-hidróxi-esteróide; ER, receptor de estrogênio.

Diversos inibidores potentes foram identificados parasulfatase de estrona. Todos eles compartilham acaracterística estrutural em comum de um anel aromáticotrazendo um substituinte que imita o anel A fenólico dosubstrato enzimático, sulfato de estrona. Nodesenvolvimento de inibidores esteroidais, uma amplavariedade de grupos químicos foi introduzida em C3, dosquais descobriu-se que o 3-0-sulfamato é o mais potentepara a molécula de estrona. O composto resultante, estrona-3-O-sulfamato (abaixo), levou à identificação da estruturade aril-O-sulfamato como um farmacoforo ativo requeridopara inibição potente de STS. Foi mostrado que o EMATEinibe a atividade de sulfatase de esteróide de uma maneiratempo- e concentração-dependente17 e era ativo in vivoquando de administração oral18. Contudo, ele foi reveladoser altamente estrogênico, o que estimulou a necessidade deprojetar inibidores de STS desprovidos de atividadeagonista sobre á hER.

Para evitar os problemas relacionados a um núcleoativo de esteróides, inibidores não baseados em esteróideforam sintetizados. Sulfamato de cumarina, tal como 4-metilcoumarin-7-O- sulfamato (COUMATE, abaixo), onde ofarmacoforo ativo é conservado, está dentre os primeirosinibidores desse tipo a ser identificado19. Embora COUMATEseja menos potente do que o EMATE, ele tem a vantagem deser não estrogênico20. Alguns sulfamatos baseados emcumarina triciclica foram desenvolvidos e verificou-seserem muito mais potentes do que COUMATE, ao mesmo tempo emque mantém a sua característica não estrogênica21.667COUiyiATE, o qual é algumas vezes 3 vezes mais potente doque o EMATE in vitro está agora em desenvolvimento pré-clínico para experimentos clínicos22.

EMATB OOUMA.TB 667COUMATE

Estruturas dos inibidores de sulfatase de esteróide EMATE,COUMATE e 667COUMATE.

O documento PCT/GB92/01587 ensina novos inibidores desulfatase de esteróide e composições farmacêuticas contendoos mesmos para uso no tratamento de tumores estrona-dependentes, especialmente câncer de mama. Esses inibidoresde sulfatase de esteróide são ésteres de sulfamato, taiscomo estrona-3-sulfamato de Ν,Ν-dimetila e, de preferência,estrona-3-sulfamato (EMATE). Sabe-se que o EMATE é uminibidor potente de El-STS, uma vez que ele mostra umainibição de mais de 99% de atividade de El-STS em célulasMCF-7 intactas a 0,1 mM. 0 EMATE também inibe a enzima El-STS de uma maneira tempo- e concentração-dependente,indicando que ele atua como um inativador sítio-dirigidoativo. Embora o EMATE tenha sido originalmente projetadopara a inibição de El-STS, ele também inibe a sulfatase dedehidroepiandrosterona (DHA-STS), a qual é uma enzima quese acredita ter um papel central na regulação dabiossíntese do esteróide estrogênico androstenodiol.

Também, há evidência para sugerir que o androstenodiolpossa ser mesmo de maior importância como um promotor dodesenvolvimento de tumor de mama. 0 EMATE é também ativo invivo, uma vez que a inibição quase completa de atividadesde El-STS (99%) e DHA-STS (99%) em fígado de rato foiresultante da administração oral ou subcutânea. Além disso,foi mostrado que o EMATE tem um efeito de intensificação damemória em ratos. Estudos em camundongos sugeriram umaassociação entre a atividade de DHA-STS e a regulação departe da resposta imune. Acredita-se que ele pode tambémocorrer em seres humanos. 0 O-átomo de ligação em ponte daporção de sulfamato no EMATE é importante para atividadeinibitória. Assim, quando o 3-O-átomo é substituído poroutros heteroátomos conforme em estrona-3-N-sulfamato eestrona-3-S-sulfamato, esses análogos eram ativadores maisfracos não dependentes do tempo.

Embora possa ser obtida potência ótima para inibiçãode El-STS no EMATE, é possível que a estrona possa serliberada durante inibição de sulfatase e que o EMATE e seucongênere estradiol podem possuir atividade estrogênica.17β-HSD, ο qual catalisa a etapa final na biossíntesede estrogênios e androgênios, também apareceu como um alvopara estratégias de privação de estrogênio. Essa enzima éresponsável pela interconversão da forma oxidada (menosativa) e da forma reduzida (mais ativa) de esteróides. Essaatividade suporta diretamente o crescimento edesenvolvimento de tumores dependentes de estrogênio, umavez que ele, de preferência, reduz o estrogênio emestradiol25 e, em uma extensão menor, via a conversão doandrogênio DHEA em androstenodiol (Adiol), o qual foirecentemente comprovado ter propriedades estrogênicas e sercapaz de se ligar ao receptor de estrogenxo26.

O 17β-HSD pertence a uma família de isoenzimas, 11 dasquais foram identificadas até o momento e clonadas27. Cadatipo tem uma afinidade substrato-seletiva e atividadedirecional, o que significa que seletividade de ação dofármaco tem de ser obtida. O tipo 17P-HSD 1 é o isotipo quecatalisa a interconversão de estrona e estradiol.

Diferente dos inibidores de STS, somente poucosinibidores de 17β-HSD foram reportados. Muitos dosinibidores esteroidais para 17β-HSD tipo 1 têm em comum umaestrutura de anel D modificada. Foi mostrado que derivadosde estradiol os quais contêm uma cadeia lateral com um bomgrupo de condução na posição 16a- têm uma classe potente deinibidores. Em particular, 16α-(bromoalquil)-estradiol28onde as cadeias laterais exibem alta reatividade porresíduos de aminoácidos nucleofílicos no lugar ativo daenzima são inibidores irreversíveis promissores. Análogoscontendo porções curtas de bromoalquila na posição 16exibiram uma atividade maior com 16a-(Bromopropil) -estradiol, seguido por 16a-(Bromobutil)-estradiol, o maispotente da série (3 e 4) . Eles, contudo, viriam a serevelar agonistas puros do receptor de estrogênio.

<formula>formula see original document page 14</formula>

Inibidores 17p-HSD do tipo 1: 16a-(bromopropil)-estradiol,3; 16a-(bromopropil)-estradiol, 4 e um derivado de flavona,apigenina.

Em uma tentativa de eliminar a estrogenicidadeintrínseca de inibidores potentes e, possivelmente, aomesmo tempo, manipular propriedades anti-estrogênicas namolécula, diversos derivados de 16a-(amplo)-estradioltrazendo a cadeia lateral de C7a-alquilamida do anti-estrogênio ICI 164384 conhecido foram sintetizados29.Contudo, inibição muito pobre de 17p-HSD tipo 1 foi obtida,com propriedades estrogênicas e anti-estrogênicas nãocompletamente abolidas ou introduzidas, respectivamente.

Em paralelo, inibidores não-esteroidais de 17p-HSDtipo 1 foram projetados. Flavonóides, os quais sãoestruturalmente similares aos estrogênios, são capazes dese ligar ao receptor de estrogênio com atividadesestrogênicas ou anti-estrogênicas30. Sua ação sobre aatividade aromatase é bem documentada e, em estudosrecentes, descobriu-se que eles reduzem a conversão deestrona em estradiol catalisada por 17β-Η3ϋ tipo l31.Derivados de flavona, tal como apigenina (Figura 6),surgiram de um estudo SAR como compostos promissores comalguma atividade inibitória sobre 17β-HSD do tipo 1 semserem estrogênicos na concentração inibitória32.

Ahmed e colaboradores (Biochem Biophys Res Commun., 2 7de Janeiro de 1999; 254(3): 811-5) reportam em um estudo arelação estrutura-atividade de inibidores esteroidais e nãoesteroidais de STS.

Dehidrogenases de esteróide (DH), tal comodehidrogenase de 17p-hidróxi-esteróide de estradiol(E2HSD), têm papéis centrais na regulação dadisponibilidade de ligantes para interagirem com o receptorde estrogênio. E2HSD do Tipo I reduz a estrona (El) aoestrogênio biologicamente ativo, estradiol (E2), enquantoque E2HSD do Tipo II inativa E2 catalisando sua oxidação emEl. Assim, a identificação de compostos tendo atividadeinibitória de DHi em particular, inibidores de E2HSD doTipo I, seriam de valor terapêutico na inibição da formaçãode E2.

0 documento W003/033518 divulga compostos da Fórmula:

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em que G é H ou um substituinte. Os compostos têm atividadecomo inibidores, inter alia, de sulfatase de esteróide.

RESUMO DOS ASPECTOS DA PRESENTE INVENÇÃO

A presente invenção proporciona novos compostos osquais são capazes de atuar como inibidores eficazes desulfatase de esteróide. A presente invenção identifica queos compostos do presente pedido são inibidores eficazes desulfatase de esteróide.

A Figura 1 mostra algumas das enzimas envolvidas nasíntese in situ de estrona a partir de sulfato de estrona eestradiol. "STS" denota Sulfatase de estrona, "E2DH do TipoI" denota Dehidrogenase de 17p-hidróxi-esteróide deestradiol do Tipo I ou Dehidrogenase de 17p-hidróxi-esteróide de estradiol do Tipo 1, 3, 5 e/ou 7 e "E2DH doTipo II" denota Dehidrogenase de 17β-hidróxi-esteróide deestradiol do Tipo II ou Dehidrogenase de 17p-hidróxi-esteróide de estradiol do Tipo 2 e/ou 8.

Como pode ser visto, duas enzimas que estão envolvidasna síntese periférica de estrogênios são as enzimasDehidrogenase de 17p-hidróxi-esteróide de estradiol e aenzima sulfatase de estrona.

Acredita-se que a síntese in situ de estrogêniodesempenhe uma importante contribuição para os níveiselevados de estrogênio em tumores e, portanto, inibidoresespecíficos da biossíntese de estrogênio são de valorpotencial para o tratamento de tumores endócrino-dependentes.

Além disso, mesmo embora a formação de estrogênio emtecidos malignos de mama e endométrio através da viasulfatase faça uma grande contribuição para a concentraçãoelevada de estrogênios, ainda existem outras viasenzimáticas que contribuem para síntese in vivo deestrogênio.

Assim, existe uma necessidade urgente de desenvolvernovas terapias para o tratamento desses cânceres.

A presente invenção, portanto, pretende superar um oumais dos problemas associados aos métodos de técnicasanteriores de tratamento de cânceres da mama e endométrio.Em um aspecto, portanto, a presente invençãoproporciona o uso de um composto para o preparo de ummedicamento que possa afetar, tal como inibirsubstancialmente, a via de sulfatase de estrona - via aqual converte a estrona em e a partir de estradiol - e/ouafeta, tal como inibe substancialmente, a via dedehidrogenase de esteróide - via a qual converte a estronaem e a partir de estradiol.

Esse aspecto da presente invenção é vantajoso porque épossível que a administração de um tipo de compostobloqueie a síntese de estradiol a partir de estrona ou EIS.Por isso, a presente invenção proporciona compostos que têmvantagens terapêuticas consideráveis, particularmente parao tratamento de cânceres de mama e endométrio.

Os compostos da presente invenção podem compreenderoutros substituintes. Esses outros substituintes podem, porexemplo, aumentar adicionalmente a atividade dos compostosda presente invenção e/ou aumentar a estabilidade (ex vivoe/ou in vivo).

ASPECTOS DETALHADOS DA PRESENTE INVENÇÃO

De acordo com um aspecto da presente invenção, éproporcionado um composto tendo a Fórmula I:<formula>formula see original document page 19</formula>

era que G é um grupo fluorocarbila.

De acordo com um aspecto da presente invenção, éproporcionado uma composição farmacêutica compreendendo umcomposto tendo a Fórmula I:

<formula>formula see original document page 19</formula>

em que G é um grupo fluorocarbila, misturado com umveículo, iluente, excipiente ou adjuvantefarmaceuticamente aceitável.

De acordo com um aspecto da presente invenção, éproporcionado um composto tendo Fórmula I:

<formula>formula see original document page 19</formula>

em que G é um grupo fluorocarbila, para uso em medicina

De acordo com um aspecto da presente invenção, éproporcionado o uso de um composto tendo a Fórmula I:<formula>formula see original document page 20</formula>

Fórmula I

em que G é um grupo f luorocarbi la, na fabricação de ummedicamento para uso em terapia de uma condição ou doençaassociada à sulfatase de esteróide (STS).

De acordo com um aspecto da presente invenção, éproporcionado o uso de um composto tendo a Fórmula I:

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em que G é um grupo f luorocarbila, na fabricação de ummedicamento para uso em terapia de uma condição ou doençaassociada a níveis adversos de STS.

<formula>formula see original document page 20</formula>

Fórmula Iem que G é um grupo f luorocarbi la, na fabricação de umproduto farmacêutico para inibição de atividade desulfatase de esteróide (STS).

De acordo com um aspecto da presente invenção, éproporcionado um método de inibição de atividade desulfatase de esteróide (STS) em um indivíduo que precisa domesmo, o método compreendendo administração de um compostotendo a Fórmula I:

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Fórmula I

em que G é um grupo fluorocarbila.

De acordo com um aspecto da presente invenção, é·proporcionado o uso de um composto tendo a Fórmula I:

<formula>formula see original document page 21</formula>

em que G é um grupo f luorocarbila, na fabricação de umproduto farmacêutico para modulação e/ou interrupção e/ouinibição de ciclo celular e/ou para modulação e/ou induçãode apoptose.

<formula>formula see original document page 21</formula>

Fórmula IPara facilidade de referência, esses e outros aspectosda presente invenção são agora discutidos sob cabeçalhos deseção apropriados. Contudo, os ensaios sob cada seção nãoestão necessariamente limitados a cada seção em particular.

ASPECTOS PREFERÍVEIS

SISTEMA DE ANEL

Em alguns aspectos da presente invenção, o compostotem, de preferência, a Fórmula II:

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em que G é um grupo fluorocarbila e em que R1 é qualquer umde -OH, -um grupo sulfamato, um grupo fosfonato, um grupotiofosfonato, um grupo sulfonato ou um grupo sulfonamida.

Em alguns aspectos da presente invenção, o compostotem, de preferência, a Fórmula III:

<formula>formula see original document page 22</formula>

em que G é um grupo fluorocarbila e em que R1 é qualquer umde -OH, um grupo sulfamato, um grupo fosfonato, um grupotiofosfonato, um grupo sulfonato ou um grupo sulfonamida.Em alguns aspectos da presente invenção, o compostotem, de preferência, a Fórmula IV:

<formula>formula see original document page 23</formula>

em que G é um grupo f luorocarbila e em que R1 é qualquer umde -OH, um grupo sulfamato, um grupo fosfonato, um grupotiofosfonato, um grupo sulfonato ou um grupo sulfonamida.

Em alguns aspectos da presente invenção, o compostotem, de preferência, a Fórmula V:

<formula>formula see original document page 23</formula>

em que G é um grupo fluorocarbila e em que R1 é qualquer umde -0H, um grupo sulfamato, um grupo fosfonato, um grupotiofosfonato, um grupo sulfonato ou um grupo sulfonamida.

Em alguns aspectos da presente invenção, o compostotem, de preferência, a Fórmula VI:

<formula>formula see original document page 23</formula>Fórmula VIem que G é um grupo fluorocarbila e em que Rl é qualquer umde -OH, um grupo sulfamato, um grupo fosfonato, um grupotiofosfonato, um grupo sulfonato ou um grupo sulfonamida.

Em alguns aspectos da presente invenção, o compostotem, de preferência, a Fórmula VII:

<formula>formula see original document page 24</formula>

em que G é um grupo fluorocarbila e em que Rl é qualquer umde -OH, um grupo sulfamato, um grupo fosfonato, um grupotiofosfonato, um grupo sulfonato ou um grupo sulfonamida.

Em alguns aspectos da presente invenção, o compostotem, de preferência, a Fórmula VIII:

<formula>formula see original document page 24</formula>

Fórmula VIII

Em alguns aspectos da presente invenção, o compostotem, de preferência, a Fórmula IX:<formula>formula see original document page 25</formula>

Fórmula IX

Em alguns aspectos da presente invenção, o compostotem, de preferência, a Fórmula X:

<formula>formula see original document page 25</formula>

Fórmula X

em que "G é um grupo f luorocarbila e em que Ra é qualquer umde -OH, um grupo sulfamato, um grupo fosfonato, um grupotiofosfonato, um grupo sulfonato ou um grupo sulfonamida.

Em alguns aspectos da presente invenção, o compostotem, de preferência, a Fórmula XI:

<formula>formula see original document page 25</formula>

Fórmula XIem que G é um grupo f luorocarbila e em que R1 é qualquer umde -OH, um grupo sulfamato, um grupo fosfonato, um grupotiofosfonato, um grupo sulfonato ou um grupo sulfonamida.

Em alguns aspectos da presente invenção, o compostotem, de preferência, a Fórmula XII:

<formula>formula see original document page 26</formula>

Fórmula XII

em que G é um grupo fluorocarbila e em que R1 é qualquer umde -OH, um grupo sulfamato, um grupo fosfonato, um grupotiofosfonato, um grupo sulfonato ou um grupo sulfonamida.

Em alguns aspectos da presente invenção, o compostotem, de preferência, a Fórmula XIII:

<formula>formula see original document page 26</formula>

Fórmula XIII

Um composto muito altamente preferido tem a Fórmula:<formula>formula see original document page 27</formula>

ou uma forma de sal ou éster farmaceuticamente aceitável domesmo.

Conforme é bem conhecido na técnica, uma estrutura deanel esteroidal clássica tem a Fórmula genérica de:

<formula>formula see original document page 27</formula>

Na Fórmula acima, os anéis foram rotulados da maneiraconvencional.

Um exemplo de um bioisóstero é quando qualquer um oumais dos anéis A, B, C e D é um anel heterociclico e/ouquando qualquer um dos anéis A', B, CeD foram substituídose/ou quando qualquer um ou mais dos anéis A, B, CeD forammodificados; mas em que o bioisóstero tem propriedadesesteroidais.

A esse respeito, o sistema de anel da presenteinvenção é análogo a uma estrutura de anel esteroidal epode ser um bioisóstero de uma estrutura de anelesteroidal.A estrutura da presente estrutura policíclica pode serapresentada como:

<formula>formula see original document page 28</formula>

em que cada anel A', B1 e C1 representa, independentemente,um anel heterocíclico ou um anel não- heterocíclico e emque cada anel pode ser independentemente substituído ou nãosubstituído, saturado ou insaturado.

Como forma de exemplo, qualquer um ou mais dos anéisA1, B', C1 e D1 podem ser independentemente substituídospor grupos adequados - tal como um grupo alquila, um grupoarila, um grupo hidróxi, um grupo halo, um grupohidrocarbila, um grupo oxihidrocarbila, etc.

Pelo menos um de A', B1 e C' pode ser um grupoheterocíclico (um heterociclo) ou um grupo não-heterocíclico.

Pelo menos um de A1, B1, C1 e D1 pode ser umaestrutura de anel saturada ou uma estrutura de anelinsaturada (tal como um grupo arila).

De preferência, pelo menos um de A', B1, C1 e D1 é umanel de arila.

De preferência, o composto conterá, inclusive de todosos substituintes, não mais do que cerca de 50 átomos decarbono, mais usualmente não mais do que cerca de 3 0 a 4 0átomos de carbono.

Um exemplo de D1 é um anel de cinco ou seis elementos.Anéis A1-D1 com núcleos esteroidais preferidos nosquais os compostos da presente invenção podem ser baseadosincluem anéis A-D de:

Estronas e estronas substituídas, viz;

<table>table see original document page 29</column></row><table>

Estradióis e estradióis substituídos, viz:

<table>table see original document page 29</column></row><table>

Estriôis e estriõis substituídos, viz:estriol17-deóxiestriol4-OH-estriol2-OH-estriol6a-OH-estriol2-MeO-estriol7a-OH-estriol

Dehidroepiandrosteronas e dehidroepiandrosteronassubstituídas, viz:

dehidroepiandrosteronas16a-OH-dehidroepiandros terona6a-0H-dehidroepiandrosterona 16β-0H-dehidroepiandrosterona7a-0H-dehidroepiandrosterona 5-androstenodiol

GRUPO G

O grupo G é um grupo f luorocarbila. O termo"fluorocarbila", conforme usado aqui, significa um grupocompreendendo pelo menos um átomo de carbono e flúor.

Em uma modalidade, o grupo G é um grüpoperfluoroalquila. Mais preferivelmente, o grupo G é umgrupo Cl-IO perfluoroalquila.

0 termo "perfluoroalquila", conforme usado aqui, serefere a um grupo alquila em que todos os átomos dehidrogênio foram substituídos por flúor. Exemplos de gruposperfluoroalquila são trifluorometila, pentafluoroetila,heptafluoropropila etc.

Em uma modalidade alternativa preferida, o grupo Gcompreende pelo menos um carbono, flúor e um outroelemento. Mais preferivelmente, o grupo G compreende pelomenos um carbono, flúor e hidrogênio. Mais preferivelmente,o grupo G compreende somente carbono, flúor e hidrogênio.

De preferência, o grupo G compreende de 1 a 10 átomosde carbono, mais pref erivelmente de 1 a 6, maispreferivelmente de 1 a 3.

De preferência, o grupo G tem a Fórmula -A-B, em que Aé um grupo alquileno de cadeia reta, ramificada ou cíclicade 1 a 9 átomos de carbono e B é um grupo perfluoroalquilade cadeia reta, ramificada ou cíclica de 1 a 10 átomos decarbono. De preferência, A é um grupo da Fórmula -(CH2)n-em que η é um número inteiro de 1 a 9. De preferência, Atem dois átomos de carbono. De preferência, B é um grupo daFórmula -(CF2)mCF3 era que m é 0 ou um número inteiro de 1 a9. De preferência, B tem um átomo de carbono.

De preferência, o grupo G tem a Fórmula(CH2)n(CF2)mCF3 em que η é um número inteiro de 1 a 9, m é 0ou um número inteiro de 1 a 9. De preferência, n+m estáentre 1 e 10. De preferência, η é 2. De preferência, m é 0.

Ainda mais pref erivelmente, o grupo G é 3,3,3-trifluoropropila (-CH2CH2CF3) .GRUPO R1

O grupo R1 dos compostos da presente invenção équalquer um de -OH, um grupo sulfamato, um grupo fosfonato,um grupo tiofosfonato, um grupo sulfonato ou um gruposulfonamida.

Em um aspecto preferido, R1 é, de preferência, umgrupo sulfamato.

R1 ou o grupo sulfamato pode ser um grupo sulfamato daFórmula:

<formula>formula see original document page 32</formula>

em que R4 e R5 são independentemente selecionados de H,alquila, cicloalquila, alquenila e arila ou combinações dosmesmos ou juntos representam alquileno, em que a ou cadaalquila ou cicloalquila ou alquenila contém opcionalmenteum ou mais heteroátomos ou grupos.

Em uma modalidade alternativa preferida, R1 é -OH.

Em alguns aspectos da presente invenção, depreferência pelo menos um de R4 e R5 é H.

Em alguns aspectos da presente invenção, depreferência R4 e R5 são H.

SUBSTITUINTES

O composto da presente invenção pode ter outrossubstituintes que não aqueles dos sistemas de anelmostrados aqui. Além disso, os sistemas de anel aqui sãofornecidos como Fórmulas gerais e devem ser interpretadoscomo tal. A ausência de quaisquer substituintesespecificamente mostrados sobre um determinado elemento doanel indica que o elemento do anel pode ser substituído porqualquer porção, da qual H é somente um exemplo. 0 sistemade anel pode conter um ou mais graus de insaturação, porexemplo, em alguns aspectos, um ou mais anéis do sistema deanel são aromáticos. 0 sistema de anel pode sercarbocíclico ou pode conter um ou mais heteroátomos.

0 composto da invenção, em particular o composto com osistema de anel da presente invenção, pode conter outrossubstituintes que não aqueles mostrados aqui. Como forma deexemplo, esses outros substituintes podem ser um ou maisde: um ou mais grupo (s) sulfamato, um ou mais grupo (s)fosfonato, um ou mais grupo (s) tiofosfonato, um ou máisgrupo(s) sulfonato, um ou mais grupo(s) sulfonamida, um oumais grupo (s) halo, um ou mais grupo (s) O, um ou maisgrupo (s) hidróxi, um ou mais grupo (s) amino, um ou maisgrupo(s) contendo enxofre, um ou mais grupo(s) hidrocarbila- tal como um grupo oxihidrocarbila.

Em termos gerais, o sistema de anel A1B1CD1 dospresentes compostos pode conter uma variedade desubstituintes de não-interferência. Em particular, osistema de anel A1B1C1D' pode conter um ou mais hidróxi,alquila, especialmente (Ci-C6) alquila inferior, porexemplo, metila, etila, n-propila, isopropila, n-butila,sec-butila, terc-butila, n-pentila e outros isômeros depentila e n-hexila e outros isômeros de hexila, alcóxiespecialmente (C1-C6) alcóxi inferior, por exemplo, metóxi,etóxi, propóxi etc., alquinila, por exemplo, etinila ouhalogênio, por exemplo, substituintes fluoro.

Para alguns compostos da presente invenção, épreferido que o sistema de anel seja substituído por umgrupo hidrocarbil-sulfanila. Mais preferivelmente, o anelA1 do sistema de anel é substituído por um grupohidrocarbil-sulfanila. O termo "hidrocarbil-sulfanila11significa um grupo que compreende pelo menos um grupohidrocarbila (conforme aqui definido) e enxofre, depreferência -S-hidrocarbila, Mais preferivelmente, -S-hidrocarboneto. O grupo enxofre pode ser opcionalmenteoxidado.

Para alguns compostos da presente invenção, éaltamente preferido que pelo menos a posição 2 do anel A1do sistema de anel seja substituída por um grupohidrocarbil-sulfanila.

De preferência, o grupo hidrocarbil-sulfanila é -S-C1-10 alquila, mais pref erivelmente -S-C1-S alquila, maispref erivelmente -S-C^ alquila, mais pref erivelmente -S-CH2CH2CH3, -S-CH2CH3 OU - SCH3.Para alguns compostos da presente invenção, éaltamente preferido que o anel A' do sistema de anel sejasubstituído por um grupo alcóxi.

Para alguns compostos da presente invenção, éaltamente preferido que pelo menos a posição 2 do anel A1do sistema de anel seja substituída por um grupo alcóxi.

De preferência, o grupo alcóxi é metóxi.

Para alguns compostos da presente invenção, éaltamente preferido que pelo menos o anel A' do sistema deanel seja substituído por um grupo hidrocarbila.

Para alguns compostos da presente invenção, éaltamente preferido que pelo menos a posição 2 do anel A'do sistema de anel seja substituída por um grupo alquila.

De preferência, o grupo alquila é etila.

Para alguns compostos da presente invenção, éaltamente preferido que o composto compreenda pelo menosdois ou mais de um grupo sulfamato, um grupo fosfonato, umgrupo tiofosfonato, um grupo sulfonato ou um gruposulfonamida.

Para alguns compostos da presente invenção, éaltamente preferido que o composto compreenda pelo menosdois grupos sulfamato.

Para alguns compostos da presente invenção, éaltamente preferido que o composto compreenda pelo menosdois grupos sulfamato, em que os referidos grupos sulfamatonão estão sobre o mesmo anel.

Para alguns compostos da presente invenção, éaltamente preferido que o anel A1 do sistema de anelcompreenda pelo menos um grupo sulfamato e em que o anel D'do sistema de anel compreende pelo menos um gruposulfamato.

Em alguns aspectos da presente invenção, depreferência, o anel a' contém um ou mais de um substituintealcóxi e um substituinte alquila. Assim, de acordo com umaspecto da presente invenção, é proporcionado um compostotendo a Fórmula XIII:

<formula>formula see original document page 36</formula>

grupos hidrocarbila, em que pelo menos um de R2 e R3 é umgrupo hidrocarbila.

Em aspectos preferidos da presente invenção, éproporcionado um composto selecionado de compostos tendo asFórmula XIV a XIX:<formula>formula see original document page 37</formula>

Fórmula IV

<formula>formula see original document page 37</formula>

Fórmula XV

<formula>formula see original document page 37</formula>

Fórmula XVI

<formula>formula see original document page 37</formula>

Fórmula XVII

<formula>formula see original document page 37</formula>

Fórmula XVIII<formula>formula see original document page 38</formula>

Fórmula XIX

em que R2 e R3 são independentemente selecionados de H egrupos hidrocarbila, em que pelo menos um de R2 e R3 é umgrupo hidrocarbila.

De preferência, pelo menos um de R2 e R3 é um grupoalquila. De preferência pelo menos um de R2 e R3 é um grupoCiCi0 alquila, mais preferivelmente um grupo Ci-C6 alquila,de preferência grupo Ci-C3 alquila. De preferência, pelomenos um de R2 e R3 é -CH3 ou -CH2CH3.

Em um aspecto, de preferência, R2 é um grupohidrocarbila e R3 é H.

Em outro aspecto preferido, pelo menos um de R2 e R3 éum grupo alcóxi. De preferência, pelo menos um de R2 e R3 émetóxi.

Compostos altamente preferidos da presente invençãopodem ser selecionados de:em que:

R = (CH2)2CF3 e R2 = H

R2 = OMe R2 = -S-Me

OUTROS ASPECTOS

De acordo com um aspecto da presente invenção, éproporcionado um composto de acordo com a presente invençãopara uso em medicina.

De acordo com um aspecto da presente invenção, éfornecida uma composição farmacêutica compreendendo ocomposto de acordo com a presente invenção opcionalmentemisturado com um veículo, diluente, excipiente ou adjuvantefarmaceuticamente aceitável.

De acordo com um aspecto da presente invenção, éproporcionado o uso de um composto de acordo com a presenteinvenção na fabricação de um medicamento para uso emterapia de uma condição ou doença associada ã STS.

De acordo com um aspecto da presente invenção, éproporcionado o uso de um composto de acordo com a presenteinvenção na fabricação de um medicamento para uso emterapia de uma condição ou doença associada a níveisadversos de STS.

Para algumas aplicações, de preferência, os compostosnão têm nenhum ou um efeito estrogênico mínimo.Para algumas aplicações, de preferência, os compostostêm um efeito estrogênico.

Para algumas aplicações, de preferência, os compostostêm uma ação reversível.

Para algumas aplicações, de preferência, os compostostêm uma ação irreversível.

Em uma modalidade, os compostos da presente invençãosão úteis para o tratamento de câncer de mama.

Os compostos da presente invenção podem estar na formade.um sal.

A presente invenção também abrange novosintermediários que são úteis para preparar os compostos dapresente invenção. Por exemplo, a presente invenção abrangenovos precursores de álcool para os compostos. Como outraforma de exemplo, a presente invenção abrange precursoresbis protegidos para os compostos. Exemplos de cada umdesses precursores são apresentados aqui. A presenteinvenção também abrange um processo compreendendo cada umou ambos esses precursores para a síntese dos compostos dapresente invenção.

Nós também identificamos que, em alguns aspectos dapresente invenção, os presentes compostos podem tambéminibir a atividade de dehidrogenase de esteróide (HSD).Por dehidrogenase de esteróide ou HSD entenda-sedehidrogenase de 17β hidróxi esteróide. Era um aspecto, adehidrogenase de 17 β hidróxi esteróide é EC 1.1.1.62.

De preferência, a HSD é do Tipo 1, 3, 5 e/ou 7. Depreferência, a HSD converte estrona (cetona) em estradiol(hidróxi).

De preferência, a HSD é do Tipo 2 e/ou 8. Depreferência, a HSD converte estradiol (hidróxi) em estrona(cetona).

Assim, em outros aspectos, a presente invençãofornece:

• 0 uso de um composto da presente invenção nafabricação de um medicamento para uso em terapia de umacondição ou doença associada à dehidrogenase de esteróide.

• O uso de um composto da presente invenção nafabricação de um medicamento para uso em terapia de umacondição ou doença associada a níveis adversos dedehidrogenase de esteróide.

• O uso de um composto da presente invenção nafabricação de um produto farmacêutico para inibição deatividade de dehidrogenase de esteróide.

• O uso de um composto da presente invenção nafabricação de um produto farmacêutico para inibição deatividade de dehidrogenase de esteróide.• Um método compreendendo (a) realização de um ensaiode dehidrogenase de esteróide com um ou mais compostoscandidatos da presente invenção; (b) determinação se um oumais dos referidos compostos candidatos é/são capazes demodulação de atividade de dehidrogenase de esteróide; e (c)seleção de um ou mais dos referidos compostos candidatosque é/são capazes de modulação de atividade dedehidrogenase de esteróide.

• Um método compreendendo (a) realização de um ensaiode dehidrogenase de esteróide com um ou mais compostoscandidatos da presente invenção; (b) determinação se um oumais dos referidos compostos candidatos é/são capazes deinibição de atividade de dehidrogenase de esteróide; e (c)seleção de um ou mais dos referidos compostos candidatosque é/são capazes de inibição de atividade de dehidrogenasede esteróide.

• Um composto identificado através dos métodos acima,seu uso em medicina e composição farmacêutica compreendendoos compostos opcionalmente misturados com um veículo,diluente, excipiente ou adjuvante farmaceuticamenteaceitável.

Em alguns aspectos da presente invenção, é preferidoque a dehidrogenase de esteróide seja dehidrogenase deesteróide do Tipo I.Em alguns aspectos da presente invenção, é preferidoque a dehidrogenase de esteróide seja dehidrogenase deesteróide do Tipo II.

De preferência, a HSD é do Tipo 2 e/ou 8. Depreferência, a HSD converte o estradiol (hidróxi) emestrona (cetona).

Nós também identificamos que, em alguns aspectos, nãoé necessário que os compostos da presente invenção sejamsubstituídos por um de um grupo sulfamato, um grupofosfonato, um grupo tiofosfonato, um grupo sulfonato ou um'grupo sulfonamida para inibir a atividade de dehidrogenasede esteróide (HSD). Assim, em alguns aspectos, a presenteinvenção proporciona um composto conforme definido aqui emque Ri é qualquer substituinte. Nesse aspecto, depreferência, Ri é H, OH ou um grupo hidrocarbila, maispreferivelmente 0H.

Assim, em outros aspectos a presente invençãoproporciona:

• um composto tendo a Fórmula:<formula>formula see original document page 44</formula>

em que G é um grupo fluorocarbila.

• Uso do composto na fabricação de um medicamento parauso em terapia de uma condição ou doença associada àdehidrogenase de esteróide.

• Uso do composto na fabricação de um medicamento parauso em terapia de uma condição ou doença associada a níveisadversos de dehidrogenase de esteróide.

• Uso do composto na fabricação de um produtofarmacêutico para inibição de atividade de dehidrogenase deesteróide.

• Um método compreendendo (a) realização de um ensaiode dehidrogenase de esteróide com um ou mais compostoscandidatos tendo a Fórmula acima; (b) determinação se um oumais dos referidos compostos candidatos é/são capazes demodulação de atividade dehidrogenase de esteróide; e (c)seleção de um ou mais dos referidos compostos candidatosque é/são capazes de modulação de atividade dehidrogenasede esteróide.

• Um método compreendendo (a) realização de um ensaiode dehidrogenase de esteróide com um ou mais compostoscandidatos tendo a Fórmula acima; (b) determinação se um oumais dos referidos compostos candidatos é/são capazes deinibição de atividade de dehidrogenase de esteróide; e (c)seleção de um ou mais dos referidos compostos candidatosque é/são capazes de inibição de atividade de dehidrogenasede esteróide.

• Um composto identificado através dos métodos acima,seu uso em medicina e composição farmacêutica compreendendoos compostos opcionalmente misturados com um veículo,diluente, "excipiente ou adjuvante farmaceuticamenteaceitável.

ALGUMAS VANTAGENS

Uma vantagem chave da presente invenção é que oscompostos da presente invenção podem atuar como inibidoresde STS.

Outra vantagem dos compostos da presente invenção éque eles podem ser potentes in vivo.

Alguns dos compostos da presente invenção podem sercompostos não-estrogênicos. Aqui, o termo "não-estrogênico"significa exibindo nenhuma ou substancialmente nenhumaatividade estrogênica.

Outra vantagem é que alguns dos compostos podem nãoser capazes de serem metabolizados em compostos os quaismostram ou induzem atividade hormonal.

Alguns dos compostos da presente invenção são tambémvantajosos pelo fato de que eles podem ser oralmenteativos.

Alguns dos compostos da invenção têm uma duração deação aperfeiçoada in vivo comparado com inibidores de STSconhecidos.

Alguns dos compostos da presente invenção podem serúteis para o tratamento de câncer, tal como câncer de mama,bem como (ou, alternativamente) condições não-malignas, talcomo a prevenção de doenças auto-imunes, particularmentequando produtos farmacêuticos podem precisar seradministrados a partir de uma idade precoce.

Assim, acredita-se que alguns dos compostos dapresente invenção tenham também outros usos terapêuticosque não para o tratamento de cânceres endócrino-dependentes, tal como o tratamento de doenças autoimunes.

SULFATASE DE ESTERÓIDE

Sulfatase de esteróide - a qual é algumas vezesreferida como sulfatase de esteróide ou sulfatase deesterila ou "STS" para abreviar - hidrolisa diversosesteróides sulfatados, tais como sulfato de estrona,sulfato de dehidroepiandrosterona e sulfato de colesterol.Ao STS foi alocado o número de enzima EC 3.1.6.2.

STS foi clonado e expresso. Por exemplo, veja Stein ecolaboradores (J. Biol. Chem. 264: 13865-13872 (1989)) eYen e colaboradores (Cell 49: 443-454(1987)).

STS é uma enzima que está implicada em uma série decondições doentias.

Como forma de exemplo, pesquisadores descobriram queuma deficiência total de STS produz ictiose. De acordo comalguns pesquisadores, a deficiência em STS é bastanteprevalente no Japão. Os mesmos pesquisadores (Sakura ecolaboradores, J Inhérit Metab Dis, Novembro de 1997;20(6): 807-10) também reportaram que doenças alérgicas -tais como asma brônquica, rinite alérgica ou dermatiteatópica - podem estar associadas a uma deficiência desulfatase de esteróide.

Além dos estados doentios causados por uma total faltade atividade de STS, um nível aumentado de atividade de STSpode também levar à condições doentias. Como forma deexemplo e conforme indicado acima, há forte evidência parasustentar um papel de STS no crescimento e metástase decâncer de mama.STS também foi implicado em outras condições doentias.Como forma de exemplo, Le Roy e colaboradores (Behav Genet,Março de 1999; 29(2): 131-6) determinaram que pode haveruma correlação genética entre a concentração de sulfatasede esteróide e início de comportamento de ataque emcamundongos. Os autores concluem que a sulfatação deesteróides pode ser o motor primário de uma complexa rede,incluindo genes mostrados como estando implicados emagressão através de mutagênese.

INIBIÇÃO DE STS

Acredita-se que algumas condições doentias associadasâ atividade de STS são em virtude da conversão de estronasulfatada não ativa a um estrona não sulfatada ativa. Emcondições 'doentias associadas à atividade de' STS, seriadesejável inibir a atividade de STS.

Aqui, o termo "inibir" inclui reduzir e/ou eliminare/ou mascarar e/ou prevenir a ação prejudicial de STS.INIBIDOR DE STS

De acordo com a presente invenção, o composto dapresente invenção é capaz de atuar como um inibidor de STS.

Aqui, o termo "inibidor", conforme usado aqui comrelação ao composto da presente invenção, significa umcomposto que pode inibir a atividade de STS - tal comoreduzir e/ou eliminar e/ou mascarar e/ou prevenir a açãoprejudicial de STS. O inibidor de STS pode atuar como umantagonista.

A capacidade de compostos de inibir a atividade desulfatase de estrona pode ser avaliada usando microssomasplacentários ou células de câncer de mama MCF-7 intactas.

Além disso, um modelo animal pode ser usado. Detalhes sobreProtocolos de Ensaio adequados são apresentados nas seçõesa seguir. Deve ser notado que outros ensaios poderiam serusados para determinar a atividade de STS e, assim, inibira STS. Por exemplo, referência pode também ser feita aosensinamentos do documento WO-A-99/50453.

De preferência, para algumas aplicações, o composto éainda caracterizado através da característica que se ogrupo sulfamato for substituído por um grupo sulfato paraformar um derivado de sulfato, então o derivado de sulfatoseria hidrolisável por uma enzima tendo atividade desulfatase de esteróide (E. C. 3.1.6.2) - isto é, quandoincubado com sulfatase de esteróide EC 3.1.6.2 em um pH de7,4 e 37°C.

Em uma modalidade preferida, se o grupo sulfamato docomposto for substituído por um grupo sulfato para formarum composto de sulfato, então, esse composto de sulfatoseria hidrolisável por uma enzima tendo atividade desulfatase de esteróide (E. C. 3.1.6.2) e proporcionaria umvalor de Km de menos de 200 mmolar, de preferência, menosde 150 mmolar, de preferência, menos de 100 mmolar, depreferência, menos de 75 mmolar, de preferência, menos de50 mmolar, quando incubado com sulfatase de esteróide EC3.1.6.2 em um pH de 7,4 e 37°C.

Em uma modalidade preferida, se o grupo sulfamato docomposto for substituído por um grupo sulfato para formarum composto de sulfato, então, esse o composto de sulfatoseria hidrolisável por uma enzima tendo atividade desulfatase de esteróide (por exemplo, 3.1.6.2) eproporcionaria um valor de Km de menos de 200 μπιοΐάτ, depreferência, menos de 150 μπιοΐ3Γ, de preferência, menos de100 μπιοΐβ^ de preferência, menos de 75 μιηοΐ3Γ, depreferência, menos do que 50 μπιοΙβΓ, quando incubado comsulfatase de esteróide EC 3.1.6.2 em um pH de 7,4 e 37°C.

Em uma modalidade preferida, o composto da presenteinvenção não é hidrolisável por uma enzima tendo atividadede sulfatase de esteróide (E. C. 3.1.6.2).

Para algumas aplicações, de preferência, o composto dapresente invenção tem uma seletividade de pelo menos cercade 100 vezes por um alvo desejado (por exemplo, STS) , depreferência, uma seletividade de pelo menos cerca de 150vezes pelo alvo desejado, de preferência uma seletividadede pelo menos cerca de 200 vezes pelo alvo desejado, depreferência uma seletividade de pelo menos cerca de 250vezes pelo alvo desejado, de preferência uma seletividadede pelo menos cerca de 300 vezes pelo alvo desejado, depreferência uma seletividade de pelo menos cerca de 350vezes pelo alvo desejado.

É para ser notado que o composto da presente invençãopode ter outras propriedades benéficas além de ou,alternativamente, sua capacidade de inibir a atividade de STS.

DEHIDROGENASE DE ESTERÓIDE

Dehidrogenase de esteróide ou "DH" para abreviar, podeser classificada como consistindo de dois tipos - Tipo I eTipo II. Os dois tipos de enzima, tal como dehidrogenase de17p-hidróxi estradiol de esteróide (E2HSD)', têm papéiscentrais na regulação da disponibilidade de ligantes parainteragir com o receptor de estrogênio. 0 Tipo I reduz aestrona (El) em estrogênio biologicamente ativo, estradiol(E2), enquanto que E2HSD do Tipo II inativa E2 catalisandosua oxidação em E1.

INIBIÇÃO DE DH

Acredita-se que algumas condições doentias associadasã atividade de DH são em virtude da conversão de umaestrona não ativa a um estradiol ativo. Em condiçõesdoentias associadas à atividade de DH, seria desejávelinibir a atividade de DH.

Aqui, o termo "inibir" inclui reduzir e/ou eliminare/ou mascarar e/ou prevenir a ação prejudicial de DH.INIBIDOR DE DH

De acordo com a presente invenção, o composto dapresente invenção é capaz de atuar como um inibidor de DH.

Aqui, o termo "inibidor", conforme usado aqui comrelação ao composto da presente invenção, significa umcomposto que pode inibir a atividade de DH - tal comoreduzir e/ou eliminar e/ou mascarar e/ou prevenir a açãoprejudicial de DH. 0 inibidor de DH pode atuar como umantagonista.

A capacidade de compostos' de inibir a atividade dedehidrogenase de esteróide pode ser avaliada usando célulasde câncer de mama T4 7D nas quais a atividade de E2HSD doTipo I é abundante ou células MDA-MB-231 para estudos deinibidor do Tipo II. Em ambas as linhagens de célula, aformação de produtos é linear com relação ao tempo enúmeros de células. Detalhes sobre um Protocolo de Ensaioadequado são apresentados na seção Exemplos.

Deve ser notado que o composto da presente invençãopode ter outras propriedades benéficas além de ou,alternativamente, a capacidade de inibir a atividade de DH.GRUPO SULFAMATO

Em uma modalidade, o anel X tem um grupo sulfamatocomo um substituinte. 0 termo "sulfamato", conforme usadoaqui, inclui um éster de ácido sulfâmico ou um éster de umderivado de N- substituído de ácido sulfâmico ou um sal domesmo.

Se R1 é um grupo sulfamato, então, o composto dapresente invenção é referido como um composto de sulfamato.

Tipicamente, o grupo sulfamato tem a Fórmula:

(R4) (R5)N-S (O) (O) -0-

em que, de preferência, R4 e R5 são independentementeselecionados de H, alquila, cicloalquila, alquenila e arilaou combinações dos mesmos ou juntos representam alquileno,em que cada alquila ou cicloalquila ou alquenila contémopcionalmente um ou mais heteroátomos ou grupos.

Quando substituídos, os compostos N-substituídos dapresente invenção podem conter um ou dois substituintes N-alquila, N-alquenila, N-cicloalquila ou N-arila, depreferência contendo, cada um, um máximo de 10 átomos decarbono. Quando R4 e/ou R5 é alquila, os valores preferidossão aqueles onde R4 e R5 são, cada um independentemente,selecionados de grupos alquila inferior contendo de 1 a 6átomos de carbono, isto é, metila, etila, propila, etc. R4e R5 podem ser ambos metila. Quando R4 e/ou R5 é arila,valores típicos são fenila e tolila (PhCH3; o). Onde R4 e R5representam cicloalquila, valores típicos são ciclopropila,ciclopentila, ciclohexila, etc. Quando unidos, R4 e R5representam, tipicamente, um grupo alquileno queproporciona uma cadeia de 4 a 6 átomos de carbono,opcionalmente interrompida por um ou mais heteroátomos ougrupos, por exemplo, para proporcionar um heterociclo de 5elementos, por exemplo, morfolino, pirrolidino oupiperidino.

Nos valores dos grupos alquila, cicloalquila,alquenila e arila substituídos estão incluídos, comosubstituintes nos mesmos, um ou mais grupos os quais nãointerferem com a atividade inibitória de sulfatase docomposto em questão. Substituintes de não-interferênciaexemplificativos incluem hidróxi, amino, halo, alcóxi,alquila e arila.

Em algumas modalidades, o grupo sulfamato pode formaruma estrutura de anel sendo fundido a (ou associado a) umou mais átomos em ou sobre o grupo X.

Em algumas modalidades, pode existir mais do que umgrupo sulfamato. À guisa de exemplo, podem existir doissulfamatos, isto é, compostos de bis-sulfamato. Se essescompostos são baseados em um núcleo esteroidal, depreferência, o segundo grupo sulfamato (ou pelo menos umdos adicionais) está localizado na posição 17 do núcleoesteroidal. Esses grupos não precisam ser os mesmos.

Em algumas modalidades preferidas, pelo menos um de R4e R5 é H.

Em algumas outras modalidades preferidas, cada um deR4 e R5 é H.

GRUPO FOSFONATO

Se R1 é um grupo fosfonato, então, o composto dapresente invenção é referido como um composto de fosfonato.

Tipicamente, o grupo fosfonato tem a Fórmula:

<formula>formula see original document page 55</formula>

em que, de preferência, R6 é H, alquila, cicloalquila,alquenila ou arila ou combinações dos mesmos, em que a oucada alquila ou cicloalquila ou alquenila contémopcionalmente um ou mais heteroátomos ou grupos.

Quando substituídos, os compostos N-substituídos dapresente invenção podem conter um ou dois substituintes N-alquila, N-alquenila, N-cicloalquila ou N-arila, depreferência contendo, cada um, um máximo de 10 átomos decarbono. Quando R6 é alquila, R6 pode ser grupos alquilainferior contendo de 1 a 6 átomos de carbono, isto é,metila, etila, propila, etc. Como forma de exemplo, R6 podeser metila. Quando R6 é arila, valores típicos são fenila etolila (PhCH3; o). Onde R6 representa cicloalquila, valorestípicos são ciclopropila, ciclopentila, ciclohexila, etc.R6 pode mesmo compreender um grupo alquileno queproporciona uma cadeia de 4 a 6 átomos de carbono,opcionalmente interrompida por um ou mais heteroátomos ougrupos, por exemplo, para proporcionar um heterociclo de 5elementos, por exemplo, morfolino, pirrolidino oupiperidino.

Em algumas modalidades, o grupo fosfonato pode formaruma estrutura de anel sendo fundido a (ou associado a) umou mais átomos em ou sobre o grupo X.

Em algumas modalidades, pode existir mais de um grupofosfonato. Como forma de exemplo, pode existir doisfosfonatos (isto é, compostos de bis-fosfonato) . Se essescompostos são baseados em um núcleo esteroidal, depreferência o segundo grupo fosfonato (ou pelo menos um dosadicionais) está localizado na posição 17 do núcleoesteroidal. Esses grupos não precisam ser os mesmos.GRUPO TIOFOSFONATO

Se R1 é um grupo tiofosfonato, então, o composto dapresente invenção é referido como um composto detiofosfonato.

Tipicamente, o grupo tiofosfonato tem a Fórmula:

(R7) -P(S) (OH) -0-

em que, de preferência, R7 é H, alquila, cicloalquila,alquenila ou arila ou combinações dos mesmos, em que a oucada alquila ou cicloalquila ou alquenila contémopcionalmente um ou mais heteroátomos ou grupos.

Quando substituídos, os compostos N-substituídos dapresente invenção podem conter um ou dois substituintes N-alquila, N-alquenila, N-cicloalquila ou N-arila, depreferência contendo, cáda um, um máximo de 10 átomos decarbono. Quando R7 é alquila, R7 pode ser grupos alquilainferior contendo de 1 a 6 átomos de carbono, isto é,metila, etila, propila, etc. Como forma de exemplo, R7 podeser metila. Quando R7 é arila, valores típicos são fenila etolila (PhCH3; o). Onde R7 representa cicloalquila, valorestípicos são ciclopropila, ciclopentila, ciclohexila, etc.R7 pode mesmo compreender um grupo alquileno queproporciona uma cadeia de 4 a 6 átomos de carbono,opcionalmente interrompida por um ou mais heteroátomos ougrupos, por exemplo, para proporcionar um heterociclo de 5elementos, por exemplo, morfolino, pirrolidino oupiperidino.

Nos valores de grupos alquila, cicloalquila, alquenilae arila substituídos estão incluídos, como substituintesnos mesmos, um ou mais grupos os quais não interferem com aatividade inibitória de sulfatase do composto em questão.Substituintes de não-interferência exemplificativos incluemhidróxi, amino, halo, alcóxi, alquila e arila.

Em algumas modalidades, o grupo tiofosfonato podeformar uma estrutura de anel sendo fundido a (ou associadoa) um ou mais átomos em ou sobre o grupo X.

Em algumas modalidades, pode existir mais do que umgrupo tiofosfonato. Como forma de exemplo, podem existirdois tiofosfonatos (isto é, compostos de bis-tiofòsfonato).Se esses compostos são baseados em um núcleo esteroidal, depreferência o segundo grupo tiofosfonato (ou pelo menos umdos adicionais) está localizado na posição 17 do núcleoesteroidal. Esses grupos não precisam ser os mesmos.

GRUPO SULFONATO

Se R1 é um grupo sulf onato, então, o composto dapresente invenção é referido como um composto de sulfonato.

Tipicamente, o grupo sulfonato tem a Fórmula:

(R8) -S (O) (O) -O-em que, de preferência, R8 é H, alquila, cicloalquila,alquenila ou arila ou combinações dos mesmos, em que a oucada alquila ou cicloalquila ou alquenila contémopcionalmente um ou mais heteroátomos ou grupos.

Quando substituídos, os compostos N-substituídos dapresente invenção podem conter um ou dois substituintes N-alquila, N-alquenila, N-cicloalquila ou N-arila, depreferência contendo, cada um, um máximo de 10 átomos decarbono. Quando R8 é alquila, R8 pode ser grupos alquilainferior contendo de 1 a 6 átomos de carbono, isto é,metila, etila, propila, etc. Como forma de exemplo, R8 podeser metila. Quando R8 é arila, valores típicos são fenila etolila (PhCH3; o). Onde R8 representa cicloalquila, valorestípicos são ciclopropila, ciclopentila, ciclohexila, etc.R8 pode mesmo compreender um grupo alquileno queproporciona uma cadeia de 4 a 6 átomos de carbono,opcionalmente interrompida por um ou mais heteroátomos ougrupos, por exemplo, para proporcionar um heterociclo de 5elementos, por exemplo, morfolino, pirrolidino oupiperidino.

Em algumas modalidades, o grupo sulfonato pode formaruma estrutura de anel sendo fundido a (ou associado a) umou mais átomos em ou sobre o grupo X.

Em algumas modalidades, pode existir mais do que umgrupo sulfonato. Como forma de exemplo, podem existir doissulfonatos (isto é, compostos de bis-sulfonato). Se essescompostos são baseados em um núcleo esteroidal, depreferência o segundo grupo sulfonato (ou pelo menos um dosadicionais) está localizado na posição 17 do núcleoesteroidal. Esses grupos não precisam ser os mesmos.COMBINAÇÃO DE SULFONATO/FOSFONATO/TIOFOSFONATO/SULFAjMATO

Para alguns compostos da presente invenção, pode estarpresente um de um sulfonato conforme aqui definido ou umfosfonato conforme aqui definido ou um tiofosfonatoconforme aqui definido ou um sulfamato conforme aquidefinido; e outro de um sulfonato conforme aqui definido ouum fosfonato conforme aqui definido ou um tiofosfonatoconforme aqui definido ou um sulfamato conforme aquidefinido. Como forma de exemplo, o composto da presenteinvenção pode compreender um grupo sulfamato e um grupofosfonato.Se esses compostos da presente invenção são baseadosem um núcleo esteroidal, de preferência, o outro dosreferidos grupos está localizado na posição 17 do núcleoesteroidal.

HIDROCARBILA

O termo "grupo hidrocarbila", conforme usado aqui,significa um grupo compreendendo pelo menos um C e H e podeopcionalmente compreender um ou mais de outrossubstituintes adequados. Exemplos de tais substituintespodem incluir halo, alcóxi, nitro, um grupo alquila, umgrupo cíclico, etc. Além da possibilidade dos substituintesserem um grupo cíclico, uma combinação de substituintespode formar um grupo cíclico. Se o grupo hidrocarbilacompreende 'mais do que um C, então, esses carbonos nãoprecisam necessariamente estar ligados uns aos outros. Porexemplo, pelo menos dois dos carbonos podem estar ligadosvia um elemento ou grupo adequado. Assim, o grupohidrocarbila pode conter heteroátomos. Heteroátomosadequados serão evidentes para aqueles habilitados natécnica e incluem, por exemplo, enxofre, nitrogênio eoxigênio. Um exemplo não limitativo de um grupohidrocarbila é um grupo acila.

Um grupo hidrocarbila típico é um grupohidrocarboneto. Aqui, o termo "hidrocarboneto" significaqualquer um de um grupo alquila, um grupo alquenila, umgrupo alquinila, grupos os quais podem ser de cadeia reta,ramificada ou cíclica ou um grupo arila. 0 termohidrocarboneto também inclui esses grupos, mas em que elesforam opcionalmente substituídos. Se o hidrocarboneto é umaestrutura ramificada tendo substituinte(s) sobre o mesmo,então, a substituição pode estar na parte principal dohidrocarboneto ou na ramificação; alternativamente, assubstituições podem estar na parte principal dohidrocarboneto e na ramificação.

OXIHIDROCARBILA

O termo grupo "oxihidrocarbila", conforme usado aqui,significa um grupo compreendendo pelo menos um C, HeOepode opcionalmente compreender uni ou mais de outrossubstituintes adequados. Exemplos de tais substituintespodem incluir halo-, alcóxi-, nitro-, um grupo alquila, umgrupo cíclico, etc. Além da possibilidade dos substituintesserem um grupo cíclico, uma combinação de substituintespode formar um grupo cíclico. Se o grupo oxihidrocarbilacompreende mais do que um C, então, esses carbonos nãoprecisam necessariamente estar ligados uns aos outros. Porexemplo, pelo menos dois dos carbonos podem estar ligadosvia um elemento ou grupo adequado. Assim, o grupooxihidrocarbila pode conter heteroátomos. Heteroátomosadequados serão evidentes para aqueles habilitados natécnica e incluem, por exemplo, enxofre e nitrogênio.

Em uma modalidade da presente invenção, o grupooxihidrocarbila é um grupo oxihidrocarboneto.

Aqui o termo "oxihidrocarboneto" significa qualquer umde um grupo alcóxi, um grupo oxialquenila, um grupooxialquinila, grupos os quais podem ser de cadeia reta,ramificada ou cíclica ou um grupo oxiarila. 0 termooxihidrocarboneto também inclui esses grupos, mas em queeles foram opcionalmente substituídos. Se ooxihidrocarboneto é uma estrutura ramificada tendosubstituinte(s) sobre o mesmo, então, a substituição podeestar na parte principal do hidrocarboneto ou naramificação; alternativamente, as substituições podem estarna parte principal do hidrocarboneto e na ramificação.

Tipicamente, o grupo oxihidrocarbila é da Fórmula Ci-60(tal como C1-3O) .

ENSAIO PARA DETERMINAÇÃO DE ATIVIDADE DE STS USANDO CÉLULASCANCERÍGENAS (PROTOCOLO 1)

Inibição de Atividade de sulfatase de esteróide em célulasMCF-7

A atividade de sulfatase de esteróide é medida invitro usando células de câncer de mama MCF-7 intactas. Essalinhagem de célula hormônio-dependente é amplamente usadapara estudar o controle de crescimento de células de câncerde mama em seres humanos. Ela possui atividade de sulfatasede esteróide significativa (Maclndoe e colaboradores.Endocrinology, 123, 1281-1287 (1988); Purohit & Reedi Int.J. Câncer, 50, 901- 905 (1992)) e está disponível nosE.U.A. da American Type Culture Collection (ATCC) e noReino Unido (por exemplo, da The Imperial Câncer Research Fund).

As células são mantidas em Meio Essencial Mínimo (MEM)(Flow Laboratories, Irvine, Escócia) contendo HEPES a 20mM, soro fetal bovino a 5%, glutamina a 2 mM, aminoácidosnão essenciais e bicarbonato de sódio a 0,075%. Até 30réplicas de frascos de cultura tecidual de 25 cm2 sãosemeados com aproximadamente 1 χ IO5 células/frascos usandoo meio acima. As células são desenvolvidas até 8 0% deconfluência e o meio é trocado a cada trinta dias.

Monocamadas intactas de células MCF-7 em frascos decultura tecidual em triplicata de 25 cm2 são lavadas comSolução Salina Equilibrada de Earle (EBSS da ICN Flow, HighWycombe, Reino Unido) e incubadas durante 3-4 horas a 370Ccom 5 pmoles (7 χ IO5 dpm) de [6,7-3H] estrona-3-sulfato(atividade específica de 60 Ci/mmoles da New EnglandNuclear, Boston, Mass., E.U.A.) em MEM isento de soro (2,5ml) junto com estrona-3-sulfamato (11 concentrações: 0;IfM; 0,01 pM; 0,1 pM; 1 pM; 0,01 ηΜ; Ο,ΙηΜ; 1 ηΜ; 0,01 mM;0,1 mM; 1 mM). Após incubação, cada frasco é resfriado e omeio (1 ml) é pipetado em tubos separados contendo[14CJestrona (7 χ IO3 dpm) (atividade específica de 97Ci/mmoles da Amersham International Radiochemical Centre,Amersham, Reino Unido). A mistura é totalmente agitadadurante 3 0 segundos com tolueno (5 ml). Experimentosmostraram que >90% de [14C] estrona e <0,1% de [3HJestrona-3-sulfato são removidos da fase aquosa através dessetratamento. Uma porção (2 ml) da fase orgânica é removida,evaporada e os teores de 3H e 14C do resíduo determinadosatravés de espectrometria por cintilação. A massa deestrona-3-sulfato hidrolisada foi calculada a partir decontagens de 3H obtidas (corrigida para os volumes do meioe fase orgânica usada e para recuperação de [14CJ estronaadicionada) e a atividade específica do substrato. Cadalote de experimentos inclui incubações de microssomaspreparados a partir de placenta humana sulfatase-positiva(controle positivo) e frascos sem células (para avaliar ahidrólise não-enzimática evidente do substrato). 0 númerode núcleos de célula por frasco é determinado usando umContador Coulter após tratamento das monocamadas de célulacom Zaponina. Um frasco em cada lote é usado para avaliar oestado da membrana celular e viabilidade usando o método deexclusão com Azul de Tripano (Phillips, H.J. (1973) Em:Tissue culture and applications, [eds: Kruse, D.F. &Patterson, M. K.]; páginas 406-408; Academic Press, NovaYork).

Os resultados para atividade de sulfatase de esteróidesão expressos como a média ± 1 dp (desvio padrão) doproduto total (estrona + estradiol) formado durante operíodo de incubação (20 horas) calculado para IO6 célulase, para valores mostrando significância estatística, comouma redução percentual (inibição) para incubações contendonenhuma estrona-3 -sulfamato. Teste T de Student não pareadofoi usado para testar a significância estatística dosresultados.

ENSAIO PARA DETERMINAÇÃO DE ATIVIDADE DE STS USANDOMICROSSOMAS PLACENTAIS (PROTOCOLO 2)

Inibição de Atividade de sulfatase de esteróide emMicrossomas Placentais

Placentas humanas sulfatase-positivas de gestaçõesnormais a termo são totalmente trituradas com pinças elavadas uma vez com tampão de fosfato gelado (pH 7,4, 50mM), então, re-suspensas em tampão de fosfato gelado (5ml/g de tecido). Homogeneização é realizada com umhomogeneizador Ultra-Turrax, usando três ciclos de 10segundos separados por períodos de resfriamento em gelo de2 minutos. Os núcleos e resíduos de célula são removidosatravés de centrifugação (4 0C) a 2000 g durante 30 minutose porções (2 ml) do sobrenadante são armazenadas a 2O0C. Aconcentração de proteína dos sobrenadantes é determinadaatravés do método de Bradford (Anal. Biochem., 72, 248-254(1976)) .

As incubações (1 ml) são realizadas usando umaconcentração de proteína de 100 mg/ml, concentração desubstrato de [6,7-3H]estrona-3-sulfato a 20 mM (atividadeespecífica de 60 Ci/mmoles da New England Nuclear, Boston,Mass., E.U.A.) e um tempo de incubação de 20 minutos a37°C. Se necessário, oito concentrações dos compostos sãoempregadas: 0 (isto é, controle); 0,05 mM; 0,1 mM; 0,2 mM;0,4 mM; 0,6 mM; 0,8 mM; 1,0 mM. Após incubação, cadaamostra é esfriada e o meio (1 ml) foi pipetado em tubosseparados de [14CJestrona (7 χ IO3 dpm) (atividadeespecífica de 97 Ci/mmoles da Amersham InternationalRadiochemical Centre, Amersham, Reino Unido). A mistura étotalmente agitada durante 3 0 segundos com tolueno (5 ml).Experimentos mostraram que >90% de [14C] estrona e <0,1% de[3H]estrona-3-sulfato são removidos da fase aquosa atravésdesse tratamento. Uma porção (2 ml) da fase orgânica foiremovida, evaporada e os teores de 3H e 14C do resíduodeterminados através de espectrometria por cintilação. Amassa de estrona-3-sulfato hidrolisada é calculada a partirdas contagens de 3H obtidas (corrigidas para os volumes domeio e fase orgânica usados e para recuperação de[14C] estrona adicionada) e a atividade especifica dosubstrato.

ENSAIO COM MODELO ANIMAL PARA DETERMINAÇÃO DE ATIVIDADE DESTS (PROTOCOLO 3)

Inibição de atividade de sulfatase de estrona in vivo

Os compostos da presente invenção podem ser estudadosusando um modelo animaL, em particular em ratosovariectomisados. Nesse modelo, compostos os quais sãoestrogênicos estimulam o desenvolvimento uterino.

0 composto (10 mg/Kg/dia durante cinco dias) foiadministrado oralmente a ratos, com outro grupo de animaisrecebendo veículo somente (propileno glicol). Um outrogrupo recebeu o composto EMATE subcutaneamente em umaquantidade de 10 μς^ίβ durante cinco dias. No final doestudo, amostras de tecido do fígado foram obtidas e aatividade de sulfatase de estrona ensaiada usando sulfatode 3H estrona como o substrato, conforme previamentedescrito (veja PCT/GB95/02638).

ENSAIO COM MODELO ANIMAL PARA DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADEESTROGÊNICA (PROTOCOLO 4)

Falta de estrogenicidade in vivoOs compostos da presente invenção podem ser estudadosusando um modelo com animais, em particular em ratosovariectomisados. Nesse modelo, compostos os quais sãoestrogênicos estimulam , o desenvolvimento uterino.

O composto (10 mg/Kg/dia durante cinco dias) foiadministrado oralmente a ratos, com outro grupo de animaisrecebendo veículo somente (propileno glicol). Um outrogrupo recebeu o composto estrogênico EMATE subcutaneamenteem uma quantidade de 10 pg/dia durante cinco dias. No finaldo estudo, os úteros foram obtidos e pesados, com osresultados sendo expressos como peso uterino/peso corporaltotal χ 100.

Compostos tendo nenhum efeito significativo sobre odesenvolvimento uteriiio não são estrogênicos.TERAPIA

Os compostos da presente invenção podem ser usadoscomo agentes terapêuticos - isto é, em aplicaçõesterapêuticas.

O termo "terapêuticas" inclui efeitos curativos,efeitos de alívio e efeitos profiláticos.

A terapia pode ser em seres humanos ou animais, depreferência, animais fêmeas.

COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICASEm um aspecto, a presente invenção proporciona umacomposição farmacêutica a qual compreende um composto deacordo com a presente invenção e opcionalmente um veículo,diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável(incluindo combinações dos mesmos).

As composições farmacêuticas podem ser para uso emseres humanos ou animais em medicina humana e veterináriae, tipicamente, compreenderão qualquer um ou mais de umveiculo, diluente ou excipiente farmaceuticamenteaceitável. Veículos ou diluentes farmaceuticamenteaceitáveis para uso terapêutico são bem conhecidos natécnica farmacêutica e são descritos, por exemplo, emRemington1S Pharmaceutic Sciences, Mack Publishing Co. (A.R. Gennáro edit. 1985). A escolha do veículo", diluente ouexcipiente farmacêutico pode ser selecionada com relação àvia de administração pretendida e prática farmacêuticapadrão. As composições farmacêuticas podem compreender como- ou além de - o veículo, excipiente ou diluente, qualquer(quaisquer) aglutinante (s), lubrificante (s), agente (s)de suspensão, agente (s) de revestimento, agente (s) desolubilização adequado(s).

Conservantes, estabilizantes, corantes e mesmo agentesflavorizantes podem ser fornecidos na composiçãofarmacêutica. Exemplos de conservantes incluem benzoato desódio, ácido sórbico e ésteres de ácido p-hidróxibenzóico.Antioxidantes e agentes de suspensão podem ser tambémusados.

Podem existir diferentes requisitos decomposição/formulação dependentes nos diferentes sistemasde distribuição. À guisa de exemplo, a composiçãofarmacêutica da presente invenção pode ser formulada paraser distribuída usando uma mini-bomba ou via mucosal, porexemplo, como um spray nasal ou aerossol para inalação ousolução ingerivel ou parenteralmente, na qual a composiçãoé formulada através de uma forma injetável, paradistribuição, por exemplo, através de uma via intravenosa,intramuscular ou subcutânea. Alternativamente, a formulaçãopode ser projetada para ser distribuída através de ambas as vias.

Onde o agente tem de ser distribuído mucosalmenteatravés da mucosa gastrintestinal, ele deverá ser capaz depermanecer estável durante trânsito através do tratogastrintestinal; por exemplo, ele deve ser resistente àdegradação proteolítica, estável em pH ácido e resistenteaos efeitos detergentes da bile.

Onde apropriado, as composições farmacêuticas podemser administradas através de inalação, na forma de umsupositório ou pessário, topicamente na forma de uma loção,solução, creme, pomada ou pó para polvilhar, através do usode um emplastro para a pele, oralmente na forma de tabletescontendo excipientes, tais como amido ou lactose, ou emcápsulas ou óvulos sozinhos ou em mistura com excipientesou na forma de elixires, soluções ou suspensões contendoagentes flavorizantes ou coloração ou elas podem serparenteralmente injetadas, por exemplo intravenosa,intramuscular ou subcutaneamente. Para administraçãoparenteral, as composições podem ser melhor usadas na formade uma solução aquosa estéril a qual pode conter outrassubstâncias, por exemplo, sais ou monossacarídeos obastante para tornar a solução isotônica com sangue. Paraadministração bucal ou sublingual, as composições podem seradministradas na forma de tabletes ou comprimidos os quaispodem ser formulados de um modo convencional.

COMBINAÇÃO FARMACÊUTICA

O composto da presente invenção pode ser usado emcombinação com um ou mais de outros agentes ativos, taiscomo um ou mais de outros agentes farmaceuticamente ativos.

Como forma de exemplo, os compostos da presenteinvenção podem ser usados em combinação com outrosinibidores de STS e/ou outros inibidores, tal como uminibidor de aromatase (tal como, por exemplo, 4-hidróxiandrostenodiona (4-OHA)) e/ou esteróides - tais comoos esterneuroesteróides que ocorrem naturalmente, sulfatode dehidroepiandrosterona (DHEAS) e sulfato de pregnenolona(PS) e/ou outros compostos orgânicos estruturalmentesimilares. Exemplos de outros inibidores de STS podem serencontrados nas referências acima. Como forma de exemplo,inibidores de STS para uso na presente invenção incluemEMATE e ou ambos os compostos 2-etila e 2-metóxi 17-deóxique são análogos ao composto 5 apresentado aqui.

Além disso, ou alternativamente, o composto dapresente invenção pode ser usado em combinação com ummodificador da resposta biológica.

O termo modificador da resposta biológica ("BRM")inclui citocinas, moduladores imunes, fatores decresciménto, fatores de regulação de hematopòiese, fatoresde estimulação de colônia, fatores quimiotáticos,hemolíticos e trombolíticos, receptores de superfíciecelular, ligantes, moléculas de adesão de leucócitos,anticorpos monoclonais, vacinas preventivas e terapêuticas,hormônios, componentes da matriz extracelular,fibronectina, etc. Para algumas aplicações, de preferência,o modificador da resposta biológica é uma citocina.

Exemplos de citocinas incluem: interleucinas (IL) - taiscomo IL-I, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL- 9,IL-IO, IL-Il, IL-12, IL-19; Fator de Necrose Tumoral (TNF)- tal como TNF-α; Interferon alfa, beta e gama; TGF-β. Paraalgumas aplicações, de preferência, a citocina é fator denecrose tumoral (TNF). Para algumas aplicações, o TNF podeser qualquer tipo de TNF - tal como TNF-α, TNF-β, incluindoderivados ou misturas dos mesmos. Mais preferivelmente, acitocina é TNF-α. Ensinamentos sobre o TNF podem serencontrados na técnica - tal como nos documentos WO-A-98/08870 e WO-A-98/13348.

ADMINISTRAÇÃO

Tipicamente, um médico determinará a dosagem real aqual será mais adequada para um indivíduo e ela variará coma idade, peso e resposta do paciente em particular. Asdosagens abaixo são exemplificativas da média dos casos.Naturalmente, podem existir exemplos individuais ondefaixas de dosagem maiores ou menores são consideradas.

As composições da presente invenção podem seradministradas através de injeção direta. A composição podeser formulada para administração parenteral, mucosa,intramuscular, intravenosa, subcutânea, intraocular outransdérmica. Dependendo da necessidade, o agente pode seradministrado em uma dose de 0,01 a 30 mg/kg de pesocorporal, tal como de 0,1 a 10 mg/kg. Mais pref erivelmentede 0,1 a 1 mg/kg de peso corporal.Como outros exemplos, os agentes da presente invençãopodem ser administrados de acordo com um regime de 1 a 4vezes por dia, de preferência, uma vez ou duas vezes pordia. 0 nível de dose e freqüência da dosagem específicospara qualquer paciente em particular podem ser variados edependerão de uma variedade de fatores, incluindo aatividade do composto específico empregado, a estabilidademetabólica e extensão de ação desse composto, a idade, pesocorporal, saúde geral, sexo, dieta, modo e momento deadministração, taxa de excreção, combinação do fármaco, agravidade da condição em particular e o hospedeiro que estáem terapia.

Além dos modos típicos de distribuição - indicadosacima - o termo "administrado" também inclui distribuiçãoatravés de técnicas tais como transfecção mediada porlipídio, lipossomas, imunolipossomas, lipofectina,anfífilos faciais catiônicos (CFAs) e combinações dosmesmos. As vias para tais mecanismos de distribuiçãoincluem, mas não estão limitadas a, vias mucosal, nasal,oral, parenteral, gastrintestinal, tópica ou sublingual.

O termo "administrado" inclui, mas não está limitadoa, distribuição através de uma via mucosal, por exemplo,como um spray nasal ou aerossol para inalação ou como umasolução ingerível; uma via parenteral onde a distribuição éatravés de uma forma injetável tal como, por exemplo, umavia intravenosa, intramuscular ou subcutânea.

Assim, para administração farmacêutica, os inibidoresde STS da presente invenção podem ser formulados dequalquer maneira adequada utilizando técnicas de formulaçãofarmacêuticas convencionais e veículos, adjuvantes,excipientes, diluentes, etc., farmacêuticos e usualmentepara administração parenteral. Taxas de dosagem eficazesaproximadas podem estar na faixa de 1 a 1000 mg/dia, talcomo de 10 a 900 mg/dia ou mesmo de 100 a 800 mg/dia,dependendo das atividades individuais dos compostos emquestão e para um peso corporal médio do paciente (70 Kg).

Taxas de dosagem mais usuais para os compostos preferidos emais ativos estarão na faixa de 200 a 800 mg/dia, maispreferivelmente 200 a 500 mg/dia, ainda maispref erivelmente de 200 a 250 mg/dia. Eles podem serfornecidos em regimes de dose única, regimes de dosedividida e/ou em regimes de doses múltiplas durando váriosdias. Para administração oral, eles podem ser formulados emtabletes, cápsulas, solução ou suspensão contendo de 100 a500 mg do composto por unidade de dose. Alternativamente ede preferência, os compostos serão formulados paraadministração parenteral em um veículo administrávelparenteralmente adequado e proporcionando taxas de dosagemdiária única na faixa de 200 a 800 mg, de preferência, 2 00a 500, .mais pref erivelmente 200 a 250 mg. Tais dosesdiárias eficazes, contudo, variarão dependendo da atividadeinerente do ingrediente ativo e do peso corporal dopaciente, tais variações estando dentro da capacidade ejulgamento do médico.

BAIXA FREQÜÊNCIA DE DOSAGEM

De acordo com um aspecto muito altamente preferido, oscompostos da invenção podem ser administrados em um regimede dosagem o qual é menos freqüente do que diário.Surpreendentemente, descobriu-se que os compostos dainvenção mostram duração de ação extraordinária comparadocom inibidores de sulfatase de esteróide conhecidos.

Conseqüentemente, a invenção proporciona um método deadministração de um composto da invenção compreendendo umesquema de dosagem contínua tendo um intervalo de dosagemselecionado do grupo consistindo de dosagem semanal,dosagem duas vezes por semana, dosagem bi-semanalmente,dosagem duas vezes por mês e mensalmente.

Ainda, a invenção proporciona um método deadministração de um composto da invenção compreendendo umesquema de dosagem contínua tendo uma periodicidade dedosagem oscilando de cerca de uma vez a cada 3 dias a cercade uma vez a cada 16 dias.De preferência, a esquema de dosagem contínua émantido até o efeito terapêutico desejado ser obtido.

Por dosagem uma vez por semana entenda-se que umaunidade de dosagem do composto da invenção é administradauma vez por semana, isto é, uma vez durante um período desete dias, de preferência, no mesmo dia de cada semana. Noregime de dosagem de uma vez por semana, a unidade dedosagem é geralmente administrada a cerca de cada setedias. Um exemplo não limitativo de um regime de dosagem umavez por semana requereria a administração de uma unidade dedosagem do composto da invenção a cada domingo. É preferidoque a unidade de dosagem não seja administrada em diasconsecutivos, mas o regime de dosagem uma vez por semanapode incluir um regime de dosagem no qual as unidades' dedosagens são administradas em dois dias consecutivos caindoem dois períodos semanais diferentes.

Taxas de dose eficazes aproximadas podem estar nafaixa de 1 a 1000 mg/semana, tal como de 10 a 900 mg/semanaou mesmo de 100 a 800 mg/semana, dependendo das atividadesindividuais dos compostos em questão e para um pesocorporal médio do paciente (70 Kg) . Taxas de dosagem maisusuais para os compostos preferidos e mais ativos estarãona faixa de 200 a 800 mg/semana, mais preferivelmente, 200a 500 mg/semana, ainda mais pref erivelmente de 200 a 250mg/semana. Elas podem ser fornecidas em regimes de doseúnica, regimes de dose dividida e/ou em regimes de dosemúltipla durando vários dias. Para administração oral, elaspodem ser formuladas em tabletes, cápsulas, solução oususpensão contendo de 100 a 500 mg de composto por unidadede dose. Alternativamente e de preferência, os compostosserão formulados para administração parenteral em umveículo administrável parenteralmente adequado eproporcionando taxas de dosagem semanalmente únicas de 2 00a 800 mg, de preferência, 200 a 500, mais preferivelmente200 a 250 mg.

Por dosagem duas vezes por semana entende-se que umaunidade de dosagem do composto da invenção é administradaduas vezes por semana, isto é, duas vezes durante umperíodo de sete dias, de preferência, nos mesmos dois diasde cada período semanal. No regime de dosagem duas vezespor semana, cada unidade de dosagem é geralmenteadministrada a cerca de cada três a quatro dias. Um exemplonão limitativo de um regime de dosagem duas vezes porsemana requereria a administração de uma unidade de dosagemdo composto da invenção no mesmo domingo e quarta-feira. Épreferido que as unidades de dosagem não sejamadministradas nos mesmos dias ou em dias consecutivos, maso regime de dosagem duas vezes por semana pode incluir umregime de dosagem no qual as unidades de dosagem sãoadministradas em dois dias consecutivos em um períodosemanal ou diferentes períodos semanais.

Taxas de dose eficazes aproximadas podem estar nafaixa de 1 a 1000 mg/duas vezes por semana, tal como de 10a 900 mg/duas vezes por semana ou mesmo de 100 a 800mg/duas vezes por semana, dependendo das atividadesindividuais dos compostos em questão e para um paciente depeso corporal médio (70 kg) . Taxas de dosagens mais usuaispara os compostos preferidos e mais ativos estarão na faixade 200 a 800 mg/duas vezes por semana, maispreferivelmente, 200 a 500 mg/duas vezes por semana, aindamais preferivelmente de 200 a 250 mg/duas vezes por semana.

Elas podem ser fornecidas em regimes de dose única, regimesde dose dividida e/ou em regimes de dose múltipla durandovários dias. Para administração oral, elas podem serformuladas em tabletes, cápsulas, solução ou suspensãocontendo de 100 a 500 mg de composto por unidade de dose.

Alternativamente e de preferência, os compostos serãoformulados para administração parenteral em um veículoadministrável parenteralmente adequado e proporcionandotaxas de dosagem única duas vezes por semana na faixa de200 a 800 mg, de preferência, 200 a 500, maispreferivelmente 200 a 250 mg.Por dosagem bi-semanal entende-se que uma unidade dedosagem do composto da invenção é administrada uma vezdurante um período de duas semanas, isto é, uma vez duranteum período de quatorze dias, de preferência, no mesmo diadurante cada período de duas semanas. No regime de dosagemduas vezes por semana, cada unidade de dosagem é geralmenteadministrada a cerca de cada quatorze dias. Um exemplo nãolimitativo de regime de dosagem bi-semanal requereria aadministração de uma unidade de dosagem do composto dainvenção domingo sim, domingo não. É preferido que aunidade de dosagem não seja administrada em diasconsecutivos, mas o regime de dosagem bi-semanal podeincluir um regime de dosagem no qual a unidade de dosagem éadministrada em dois dias consecutivos em dois períodos bi-semanais diferentes.

Taxas de dose eficazes aproximadas podem estar nafaixa de 1 a 1000 mg/bi-semanalmente, tal como de 10 a 900mg/bi-semanalmente ou mesmo de 100 a 800 mg/bi-semanalmente, dependendo das atividades individuais doscompostos em questão e para um paciente de peso corporalmédio (70 kg) . Taxas de dosagens mais usuais para oscompostos preferidos e mais ativos estarão na faixa de 2 00a 800 mg/bi-semanalmente, mais preferivelmente, 200 a 500mg/bi-semanalmente, ainda mais preferivelmente de 200 a 250mg/bi- semanalmente. Elas podem ser fornecidas em regimes dedose única, regimes de dose dividida e/ou em regimes dedose múltipla durando vários dias. Para administração oral,elas podem ser formuladas em tabletes, cápsulas, solução oususpensão contendo de 100 a 500 mg de composto por unidadede dose. Alternativamente e de preferência, os compostosserão formulados para administração parenteral em umveículo administrável parenteralmente adequado eproporcionando taxas de dosagem bi-semanais únicas na faixade 200 a 800 mg, de preferência, 200 a 500, maispreferivelmente 200 a 250 mg.

Por dosagem duas vezes por mês entenda-se que umaunidade de dosagem do composto da invenção é administradaduas vezes, isto é, duas vezes, durante'um período mensalno calendário. No regime de duas vezes por mês, as dosessão, de preferência, fornecidas nas mesmas duas datas decada mês. No regime de dosagem de duas vezes por mês, cadaunidade de dosagem é geralmente administrada a cerca decada quatorze a dezesseis dias. Um exemplo não limitativode regime de dosagem de duas vezes por mês requereriadosagem em ou cerca do primeiro do mês e no ou cerca dodécimo quinto, isto é, o ponto mediano, do mês. É preferidoque as unidades de dosagens não sejam administradas nosmesmos dias ou em dias consecutivos, mas o regime dedosagem duas vezes por mês pode incluir um regime dedosagem no qual as unidades de dosagens são administradasem dois dias consecutivos em um período mensal oudiferentes períodos mensais. 0 regime de dosagem duas vezespor mês é definido aqui como sendo distinto de e nãoabrangendo o regime de dosagem bi-semanal em virtude dofato de os dois regimes terem uma periodicidade diferente eresultarem na administração de diferentes números dedosagens durante longos períodos de tempo. Por exemplo,durante um período de um ano, um total de cerca de vinte equatro dosagens seria administrado de acordo com o regimeduas vezes por mês (por existir doze meses no calendário emum ano), enquanto que um total de cerca de vinte e seisdosagens seria administrado* de acordo com o regime de bi-semanal (por existir cerca de cinqüenta e duas semanas emum ano).

Taxas de dose eficazes aproximadas podem estar nafaixa de 1 a 1000 mg/duas vezes ao mês, tal como de 10 a900 mg/duas vezes por mês ou mesmo de 100 a 800 mg/duasvezes por mês, dependendo das atividades individuais doscompostos em questão e para um paciente de peso corporalmédio (70 kg). Taxas de dosagens mais usuais para oscompostos preferidos e mais ativos estarão na faixa de 200a 800 mg/duas vezes por mês, mais preferivelmente 200 a 500mg/duas vezes por mês, ainda mais preferivelmente de 200 a250 mg/duas vezes por mês. Elas podem ser fornecidas emregimes de dose única, regimes de dose dividida e/ou emregimes de dose múltipla durando vários dias. Paraadministração oral, elas podem ser formuladas em tabletes,cápsulas, solução ou suspensão contendo de 100 a 500 mg decomposto por unidade de dose. Alternativamente e depreferência, os compostos serão formulados paraadministração parenteral em um veículo administrávelparenteralmente adequado e proporcionando taxas de dosagemúnicas duas vezes por mês na faixa de 200 a 8 00 mg, depreferência, 200 a 500, mais preferivelmente 200 a 250 mg.

Por dosagem mensal entenda-se que uma unidade dedosagem do composto da invenção é administrada uma vez,isto é, uma vez, durante um período mensal no calendário.Com o regime mensal, as doses são, de preferência,fornecidas na mesma data de cada mês. No regime de dosagemmensal, cada unidade de dosagem é geralmente administrada acerca de cada vinte e oito a trinta e dois dias.

Taxas de dose eficazes aproximadas podem estar nafaixa de 1 a 1000 mg/mês, tal como de 10 a 900 mg/mês oumesmo de 100 a 800 mg/mês, dependendo das atividadesindividuais dos compostos em questão e para um paciente depeso corporal médio (70 kg) . Taxas de dosagens mais usuaispara os compostos preferidos e mais ativos estarão na faixade 200 a 800 mg/mês, mais pref erivelmente, 200 a 500mg/mês, ainda mais preferivelmente de 200 a 250 mg/mês.Elas podem ser fornecidas em regimes de dose única, regimesde dose dividida e/ou em regimes de dose múltipla durandovários dias. Para administração oral elas podem serformuladas em tabletes, cápsulas, solução ou suspensãocontendo de 100 a 500 mg de composto por unidade de dose.

Alternativamente e de preferência, os compostos serãoformulados para administração parenteral em um veículoadministrável parenteralmente adequado e proporcionandotaxas de dosagem única mensal na faixa de 200 a 800 mg, depreferência, 200 a 500, mais preferivelmente 200 a 250 mg.

Em uma modalidade altamente preferida, a invençãoproporciona um método para tratamento de uma condição oudoença associada à sulfatase de esteróide em um mamíferoque precisa do mesmo, o referido método compreendendoadministração, ao referido mamífero, de uma quantidadefarmaceuticamente eficaz de um composto da invenção comouma unidade de dosagem de acordo com um esquema tendo umintervalo de dosagem de mais do que diário. De preferência,o intervalo de dosagem é selecionado do grupo consistindode dosagem uma vez por semana, dosagem duas vezes porsemana, dosagem bi-semanal, dosagem duas vezes por mês edosagem mensal, ainda mais preferivelmente, o intervalo dedosagem é dosagem uma vez por semana.

Em uma modalidade alternativa altamente preferida, ainvenção proporciona um método para tratamento de umacondição ou doença associada a níveis adversos de STS em ummamífero que precisa do mesmo, o referido métodocompreendendo administração, ao referido mamífero, de umaquantidade farmaceuticamente eficaz de um composto dainvenção como uma unidade de dosagem de acordo com umesquema tendo um intervalo de dosagem de mais do quediário. De preferência, o intervalo de dosagem éselecionado do grupo consistindo de dosagem uma vez porsemana, dosagem duas vezes por semana, dosagem bi-semanal,dosagem duas vezes por mês e dosagem mensal. Ainda maispreferivelmente, o intervalo de dosagem é dosagem uma vezpor semana.

Em uma modalidade alternativa altamente preferida, ainvenção proporciona um método para tratamento de câncer emum mamífero que precisa do mesmo, o referido métodocompreendendo administração, ao referido mamífero, de umaquantidade farmaceuticamente eficaz de um composto dainvenção como uma unidade de dosagem de acordo com umesquema tendo um intervalo de dosagem de mais do quediário. De preferência, o intervalo de dosagem éselecionado do grupo consistindo de dosagem uma vez porsemana, dosagem duas vezes por semana, dosagem bi-semanal,dosagem duas vezes por mês e dosagem mensal. Ainda maispreferivelmente, o intervalo de dosagem é de uma vez porsemana. De preferência, o câncer é selecionado de um câncerendócrino-dependente. Mais preferivelmente, o câncer éselecionado de câncer de mama, endométrio ou próstata,ainda mais preferivelmente de mama.

Em uma modalidade alternativa altamente preferida, ainvenção proporciona um método para tratamento de câncer emum mamífero que precisa do mesmo, o referido métodocompreendendo administração, ao referido mamífero, de umaquantidade 'farmaceuticamente eficaz de um composto dainvenção como uma unidade de dosagem de acordo com umesquema tendo um intervalo de dosagem de mais do quediário. De preferência, o intervalo de dosagem éselecionado do grupo consistindo de dosagem uma vez porsemana, dosagem duas vezes por semana, dosagem bi-semanal,dosagem duas vezes por mês e dosagem mensal. Ainda maispreferivelmente, o intervalo de dosagem é dosagem uma vezpor semana. De preferência, o câncer é selecionado de umcâncer endócrino-dependente. Mais preferivelmente, o cânceré selecionado de câncer de mama, endométrio ou próstata,ainda mais preferivelmente de mama.

Em uma modalidade alternativa altamente preferida, ainvenção proporciona um método para tratamento de câncer demama em um mamífero que precisa do mesmo, o referido métodocompreendendo administração, ao referido mamífero, de umaquantidade farmaceuticamente eficaz de um composto daFórmula:

como uma unidade de dosagem de acordo com um esquema tendoum intervalo de dosagem de uma vez por semana.

KITS DE TRATAMENTO

Em outras modalidades, a presente invenção se refere aum kit para a realização conveniente e eficazmente dosmétodos de acordo com a presente invenção. Tais kits sãoespecialmente adequados para a distribuição de formas oraissólidas, tais como tabletes ou cápsulas. Tal kit inclui, depreferência, um número de unidades de dosagem. Tais kitspodem incluir um cartão tendo as dosagens orientadas naordem de seu uso pretendido. Um exemplo de tal kit é uma"embalagem blister". Embalagens blister são bem conhecidasna indústria de embalagens e são amplamente usadas paraembalar formas de unidade de dosagem farmacêutica. Sedesejado, um auxiliar de memória pode ser proporcionado,por exemplo, na forma de números, letras ou outrasmarcações ou com uma bula com calendário, designando osdias no esquema de tratamento nos quais as dosagens podemser administradas. Alternativamente, dosagens de placebo ousuplementos de cálcio ou dietéticos, em uma forma similar aou distinta das dosagens de bisfosfonato, podem estarincluídas para proporcionar um kit no qual uma dosagem étomada a cada dia.

SAIS FARMACEUTICAMENTE ACEITÁVEIS

Sais farmaceuticamente aceitáveis podem ser formados apartir de ácidos orgânicos e inorgânicos, por exemplo,ácido acético, propiônico, láctico, cítrico, tartárico,succínico, fumárico, maleico, malônico, mandélico, málico,ftálico, clorídrico, bromídrico, fosfórico, nítrico,sulfúrico, metano-sulfônico, naftaleno-sulfônico, benzeno-sulfônico, tolueno-sulfônico, cânfor-sulfônico e ácidossimilarmente conhecidos aceitáveis quando um composto dapresente invenção contém uma porção básica. Os sais podemtambém ser formados a partir de bases orgânicas einorgânicas, de preferência, sais de metal alcalino, porexemplo, sódio, lítio ou potássio, quando um composto dapresente invenção contém uma porção ácida.

CICLO DE CÉLULA

Os compostos da presente invenção podem ser úteis nométodo de tratamento de um distúrbio do ciclo celular.

Conforme divulgado em "Molecular Cell Biology" 3a. Ed.Lodish e colaboradores, páginas 177-181, diferentes célulaseucariotas podem crescer e se dividir em taxas muitodiferentes. Células de levedo, por exemplo, podem sedividir a cada 120 min. e as primeiras divisões de ovosfertilizados nas células embriônicas de ouriços-do-mar einsetos levam somente 1530 min. em virtude de uma grandecélula pré-existente ser subdividida. Contudo, a maioriadas células de plantas e animais em crescimento leva 10-20horas para duplicar de número e algumas duplicam em umataxa muito lenta. Muitas células em adultos, tais comocélulas nervosas e células de músculo estriado, não sedividem em geral; outras, como os fibroblastos que auxiliamna cicatrização de ferimentos, crescem sob demanda, mas sãode outra forma quiescentes.Ainda, cada célula eucariota que se divide deve estarpronta para doar material genético igual a duas célulasfilhas. A síntese de DNA em eucariotas não ocorre por todoo ciclo de divisão celular, mas está restrita a uma partedo mesmo, antes de divisão celular.

A relação entre síntese de DNA eucariota e divisãocelular foi totalmente analisada em culturas de células demamífero que eram todas capazes de crescimento e divisão.Em contraste a bactérias, descobriu-se que célulaseucarióticas consomem apenas uma parte de seu tempo nasíntese de DNA e ela está terminada horas antes da divisãocelular (mitose). Assim, ocorre um intervalo de tempo apósa síntese de DNA e antes da divisão celular; descobriu-seque outro intervalo ocorre após a divisão e antes dopróximo ciclo de síntese de DNA. Essa análise levou àconclusão de que o ciclo de célula eucariota consiste deuma fase M (mitótica) , uma fase Gi (o primeiro intervalo) ,a fase S (síntese de DNA) , uma fase G2 (o segundointervalo) e volta para M. As fases entre as mitoses (G1, Se G2) são conhecidas coletivamente como a intérfase.

Muitas células de não-divisão em tecidos (por exemplo,todos os fibroblastos quiescentes) suspendem o ciclo apósmitose e exatamente antes de síntese de DNA; tais células"em repouso" são referidas como tendo saído do ciclocelular e estando no estado G0.

É possível identificar as células quando elas estão emum dos três estágios de intérfase do ciclo celular, masusando um selecionador de células fluorescência-ativado(FACS) para medir seu teor relativo de DNA: uma célula queestá em Gi (antes de síntese de DNA) tem uma quantidade χdefinida de DNA; durante S (replicação de DNA) , ela tementre χ e 2x; e, quando em G2 (ou Μ) , tem 2x de DNA.

Os estágios de mitose e citocinese em uma célulaanimal são como seguem.

(a) Intérfase. 0 estágio G2 de intérfase precedeimediatamente o início de mitose. DNA cromossômico foireplicado e ligado 'à proteína durante a fase S, mas óscromossomos ainda não são considerados como estruturasdistintas. 0 nucléolo é a única sub-estrutura nuclear que évisível sob um microscópio luminoso. Em uma céluladiplóide, antes de replicação de DNA, existem doiscromossomos morfológicos de cada tipo e a célula é referidapor sendo 2n. Em G2, após replicação de DNA, a célula é 4n.

Existem quatro cópias de cada DNA cromossômico. Uma vez queos cromossomos irmãos ainda não foram separados uns dosoutros, eles são denominados cromátides irmãs.(b) Profase precoce. Centríolos, cada ura com umcentríolo filho recentemente formado, se movem em direção apólos opostos da célula; os cromossomos podem ser vistoscomo filamentos longos. A membrana nuclear começa adesagregar em pequenas vesículas.

(c) Prófase mediana e tardia. Condensação cromossômicaestá completa; cada estrutura cromossômica visível écomposta de duas cromátides mantidas juntas nos seuscentrômeros. Cada cromátide contém uma das duas moléculasde DNA filha recentemente replicadas. O fuso microtubularcomeça a irradiar das regiões exatamente adjacentes aoscentríolos, os quais estão se movendo para mais próximo deseus pólos. Algumas fibras do fuso atingem de pólo a pólo;a maioria vai para as cromátides e sé prendem noscinetócoros.

(d) Metáfase. Os cromossomos se movem em direção aoequador da célula, onde eles se tornam alinhados no planoequatorial. As cromátides irmãs ainda não foram separadas.

(e) Anáfase. As duas cromátides irmãs se separam emcromossomos independentes. Cada um contém um centrômero queé ligado por uma fibra de fuso a um pólo, para o qual elese move. Assim, uma cópia de cada cromossomo é doada a cadacélula filha. Simultaneamente, a célula se alonga, assimcomo os fusos pólo-a-pólo. Citocinese começa à medida quesulcos de clivagem começam a se formar.

(f) Telófase. Novas membranas se formam em torno donúcleo filha; os cromossomos desenrolam e se tornam menosdistintos, o nucléolo se torna visível novamente e amembrana nuclear se forma em torno de cada núcleo filho.Citocinese está quase completa e o fuso desaparece à medidaque os microtúbulos e outras fibras despolimerizam. Portoda a mitose, o centríolo "filho" em cada pólo cresce atéficar de comprimento total. Na telófase, a duplicação decada um dos centríolos originais está completa e novoscentríolos filho serão gerados durante a próxima intérfase.

(g) Intérfase. Quando de término de citocinese, acélula entra na fase Gi do cicl"o e procede novamente todo ociclo.

Será apreciado que ciclização celular é um processocelular extremamente importante. Desvios de ciclizaçãocelular normal podem resultar em uma série de distúrbiosmédicos. Ciclização celular aumentada e/ou não restritapode resultar em câncer. Ciclização celular reduzida poderesultar em condições degenerativas. O uso do composto dapresente invenção pode proporcionar um meio para tratartais distúrbios e condições.Assim, o composto da presente invenção pode seradequado para uso no tratamento de distúrbios de ciclizaçãocelular tais como cânceres, incluindo cânceres hormônio-dependentes e hormônio-independentes.

Os cânceres que podem ser tratados através doscompostos, composições e métodos da invenção incluem, masnão são limitados a: Cardíaco: sarcoma (angiosarcoma,fibrosarcoma, rabdomiosarcoma, liposarcoma), mixoma,rabdomioma, fibroma, lipoma e teratoma; Pulmão: carcinomabroncogênico (célula escamosa, célula pequena nãodiferenciada, célula grande não diferenciada,adenocarcinoma), carcinoma alveolar (bronquiolar), adenomabrônquico, sarcoma, Iinfoma, hamartoma condromatoso,mesotelioma; Gastrintestinal: esôfago (carcinoma de célulaescamosa, adenocarcinoma, leiomiosarcoma, linfoma),estômago (carcinoma, linfoma, leiomiosarcoma) , pâncreas(adenocarcinoma dutal, insulinoma, glucagonoma, gastrinoma,tumores carcinóides, vipoma), intestino delgado(adenocarcinoma, linfoma, tumores carcinóides, sarcoma deKarposi, leiomioma, hemangioma, lipoma, neurofibroma,fibroma), intestino grosso (adenocarcinoma, adenomatubular, adenoma viloso, hamartoma, leiomioma) cólon,cólon-retal, retal; Trato geniturinário: rim(adenocarcinoma, tumor de Wilm [nefroblastoma] , linfoma,leucemia), bexiga e uretra (carcinoma de célula escamosa,carcinoma de célula transicional, adenocarcinoma) , próstata(adenocarcinoma, sarcoma), testículo (seminoraa, teratoma,carcinoma embrionário, teratocarcinoma, coriocarcinoma,sarcoma, carcinoma de célula intersticial, fibroma,fibroadenoma, tumores adenomatóides, lipoma); Fígado:hepatoma (carcinoma hepatocelular), colangiocarcinoma,hepatoblastoma, angiosarcoma, adenoma hepatocelular,hemangioma; Osso: sarcoma osteogênico (osteosarcoma),fibrosarcoma, histiocitoma fibroso maligno, condrosarcoma,sarcoma de Ewing, Iinfoma maligno (sarcoma de célulareticular), mieloma múltiplo, cordoma de tumor maligno decélula gigante, osteocronfroma (exostosesosteocartilaginosas) , condroma benigno,' condroblastoma,condromixofibroma, osteoma osteóide e tumores de célulasgigantes; Sistema Nervoso: crânio (osteoma, hemangioma,granuloma, xantoma, ostein<1>s deformans), meninges(meningioma, meningiosarcoma, gliomatose), cérebro(astrocitoma, meduloblastoma, glioma, ependimoma, germinoma[pinealoma], glioblastoma multiforme, oligodendroglioma,schwannoma, retinoblastoma, tumores congênitos),neurofibroma da coluna espinhal, meningioma, glioma,sarcoma); Ginecológico: útero (carcinoma endometrial),cérvix (carcinoma cervical, displasia cervical pré-tumor),ovários (carcinoma do ovário [cistadenocarcinoraa seroso,cistadenocarcinoma mucinoso, carcinoma não classificado],tumores de células granulosas-teçais, tumores de células deSertoli-Leydig, disgerminoma, teratoma maligno), vulva(carnimoma celular escamoso, carcinoma intra-epitelial,adenocarcinoma, fibrosarcoma, melanoma), vagina (carcinomade células claras, carcinoma de célula escamosa, sarcomabotrióide (rabdomiosarcoma embrionário), trompas de falópio(carcinoma); Hematológico: sangue (leucemia mielóide [agudae crônica], leucemia Iinfoblástica aguda, leucemialinfocltica crônica, doenças mieloproliferativas, mielomamúltiplo, síndrome mielodisplásica), doença de Hodgkin,linfoma não-Hodgkin [linfoma maligno]; Pele: melanomamaligno, carcinoma de célula basal, carcinoma de célulaescamosa, sarcoma de Karposi, moles displásico nevi,lipoma, angioma, dermatofibroma, quelóides, psoríase; eglândulas adrenais: neuroblastoma. Assim, o termo "célulacancerígena", conforme proporcionado aqui, inclui umacélula afetada por qualquer uma das condições acimaidentificadas.

Além disso, o composto da presente invenção pode seradequado para o tratamento de cânceres tais como câncer demama, câncer de ovário, câncer endometrial, sarcomas,melanomas, câncer da próstata, câncer pancreático, etc. eoutros tumores sólidos.

Em uma modalidade preferida, os compostos da presenteinvenção são úteis no tratamento de cânceres endócrino-dependentes. Cânceres endócrino-dependentes preferidos sãocâncer de mama, câncer endometrial, câncer da próstata ecâncer do ovário.

Para algumas aplicações, a ciclização celular éinibida e/ou prevenida e/ou interrompida, de preferência,em que a ciclização celular é prevenida e/ou interrompida.Em um aspecto, a ciclização celular pode ser inibida e/ouprevenida e/ou interrompida na fase G2M. Em um aspecto, aciclização celular pode ser irreversivelmente prevenidae/ou inibida e/òu interrompida, de preferência em que aciclização celular é irreversivelmente prevenida e/ouinterrompida.

Pelo termo "irreversivelmente prevenida e/ou inibidae/ou interrompida" entenda-se que, após aplicação de umcomposto da presente invenção, quando de remoção docomposto, os efeitos do composto, isto é, prevenção e/ouinibição e/ou interrupção de ciclização celular, são aindaobserváveis. Mais particularmente, pelo termo

"irreversivelmente prevenida e/ou inibida e/ouinterrompida" entenda-se que, quando ensaiadas de acordocom o protocolo de ensaio de ciclização celular apresentadoaqui, as células tratadas com um composto de interessemostram menos crescimento após o Estágio 2 do protocolo Ido que células de controle. Detalhes desse protocolo sãoapresentados abaixo.

Assim, a presente invenção proporciona compostos osquais: causam inibição de crescimento de células receptorasestrogênio-positivas (ER+) e ER-negativas (ER-) de câncerde mama in vitro através de prevenção e/ou inibição e/ouinterrupção de ciclização celular; e/ou causam regressão detumores mamários induzidos por nitroso-metil uréia (NMU) emanimais intactos (isto é, não ovariectomisados) e/ouprevinem e/ou inibem e/ou interrompem a ciclização celularem células cancerígenas; e/ou atuam in' vivo através deprevenção e/ou inibição e/ou interrupção de ciclizaçãocelular e/ou atuam como um agonista de ciclização celular.

ENSAIO DE CICLIZAÇÃO CELULAR (PROTOCOLO 5)ProcedimentoEstágio 1

Células de câncer de mama MCF-7 são semeadas emlâminas de cultura com múltiplas cavidades em uma densidadede IO5 células/cavidade. As células foram deixadas seprender e crescer até cerca de 30% de confluência, quandoelas são tratadas como segue:Controle - nenhum tratamento

Composto de interesse (COI) - 20 μΜ

As células são desenvolvidas durante 6 dias em meio decultura contendo o COI com trocas de meio/COI a cada 3dias. No final desse período, o número de células foicontado usando um contador de células Coulter.Estágio 2

Após tratamento de células durante um período de 6dias com o COI, as células são re-semeadas em uma densidadede IO4 células/cavidade. Nenhum outro tratamento éadicionado. As células são deixadas continuar a crescerdurante mais 6 dias na presença de meio de cultura. Nofinal desse período, o número de células é novamentecontado.

ENSAIO PARA DETERMINAÇÃO DE ATIVIDADE DE DH USANDO CÉLULASCANCERÍGENAS (PROTOCOLO 6)

A conversão de estrona em estradiol (El —» E2, E2DH doTipo I) e estradiol em estrona (E2 -» El, E2DH do Tipo II)foi medida em monocamadas de células intactas de câncer demama T47D e MDA-MB-231, respectivamente. As células foramcultivadas em frascos até elas estarem 80-90% confluentes.3H-EI ou 3H-E2 (6 pmol, -90 Ci/mmoles) foi adicionado acada frasco na ausência (controle) ou presença de várioscompostos de teste (10 μΜ) em 2,5 ml de meio. Substrato foitambém adicionado aos frascos sem células e incubado emparalelo (placebos).

Após incubação com células T4 7D durante 30 min oucélulas MDA durante 3h a 3 7°C, 2 ml de meio foramadicionados aos tubos de ensaio contendo 14C-E2 ou 14C-EI(-5000 cpm) e 50 pg de E2 ou El, respectivamente. Osesteróides foram extraídos do meio aquoso com dietil éter(4 ml) . A fase de éter foi decantada em tubos separadosapós congelamento da fase aquosa em uma mistura de dióxidode carbono-metanol sólido. 0 éter foi evaporado até secagemsob uma corrente de ar a 4O0C. O resíduo foi dissolvido emum pequeno volume de dietil éter e aplicado às lâminas deTLC contendo ura indicador fluorescente. El e E2 'foramseparados através de TLC usando DCM-acetato de etila (4:1v/v) . A posição do produto de cada frasco de incubação foimarcada na lâmina de TLC após visualização sob raios UV. Asregiões marcadas foram cortadas e colocadas em frascos decintilação contendo metanol (0,5 ml) para eluir o produto.A quantidade de 3H-produto formada e 14C-EI ou 14C-E2recuperado foi calculada após espectrometria porcintilação. A quantidade de produto formado foi corrigidapara perdas pelo procedimento e para o número de células emcada frasco.CÂNCER

Conforme indicado, os compostos da presente invençãopodem ser úteis no tratamento de um distúrbio de ciclizaçãocelular. Um distúrbio de ciclização celular particular écâncer.

O câncer continua a ser uma principal causa demortalidade em muitos países Ocidentais. As terapiasdesenvolvidas para o câncer até o momento têm incluídobloqueio da ação ou síntese de hormônios para inibir ocrescimento de tumores hormônio-dependentes. Contudo,quimioterapia mais agressiva é correntemente empregada parao tratamento de tumores hormônio-independentes.

Conseqüentemente, o desenvolvimento de um produtofarmacêutico para tratamento anti-cancerígeno de tumoreshormônio-dependentes e/ou hormônio-independentes, carecendoainda de alguns ou todos os efeitos colaterais associados àquimioterapia, representaria um grande avanço terapêutico.

Sabe-se que os estrogênios sofrem uma série de reaçõesde hidroxilação e conjugação após sua síntese. Atérecentemente, acreditava-se que tais reações eram parte deum processo metabólico que, por fim, proporcionariaestrogênios solúveis em água e intensificaria suaeliminação do corpo. É agora evidente que algunsmetabólitos de hidróxi (por exemplo, 2-hidróxi e 16alfa-hidróxi) e conjugados (por exemplo, sulfato de estrona,EIS) são importantes na determinação de algumas das açõescomplexas que os estrogênios têm no corpo.

Pesquisadores têm investigado a formação deestrogênios 2- e 16-hidroxilados com relação à condiçõesque alteram o risco de câncer de mama. Existe agoraevidência de que fatores os quais aumentam a atividade de2-hidróxilase estão associados a um risco reduzido decâncer, enquanto que aqueles que aumentam a 16alfa-hidroxilação podem intensificar o risco de câncer de mama.Interesse adicional no papel biológico de metabólitos deestrogênio tem sido estimulado pelo corpo crescente deevidência de que o 2-metóxiestradiol é um metabólitoendógeno com propriedades antíi-mitóticas. 2-MeOE2 é formadoa partir de 2-hidróxi estradiol (2-OHE2) através de metiltransferase de estrogênio de catecol, uma enzima que estáamplamente distribuída por todo o corpo.

Pesquisadores mostraram que 2-MeOE2 in vivo inibe ocrescimento de tumores que se originam da injeçãosubcutânea de sarcoma Meth A, melanoma B16 ou célulasreceptoras de estrogênio-negativas (ER-) de câncer de mamaMDA-MB-435. Também, ele inibe a proliferação e migração decélulas endoteliais e angiogênese in vitro. Foi sugeridoque a capacidade do 2-MeOE2 de inibir o crescimento detumor in vivo pode ser em virtude de sua capacidade deinibir a angiogênese induzida por tumor ao invés deinibição direta da proliferação de células tumorígenas.

O mecanismo através do qual o 2-MeOE2 exerce potentesefeitos anti-mitogênicos e anti-angiogênicos está aindasendo elucidado. Existe evidência de que altasconcentrações podem inibir a polimerização microtubular eatuar como um inibidor fraco de ligação de colchicina àtubulina. Recentemente, contudo, em concentrações quebloqueiam a mitose, não foi verificado que filamentos detubulina em células são despolimerizados, mas têm umamorfologia idêntica àquela vista após tratamento com taxol.É possível, portanto, que como o taxol, um fármaco que éusado para terapia de câncer de mama e ovário, o 2-MeOE2atue através de estabilização microtubular dinâmica.

Embora a identificação de 2-MeOE2 como uma novaterapia para o câncer represente um avanço importante, abiodisponibilidade de estrogênios oralmente administrados épobre. Além disso, eles podem sofrer metabolismo extensivodurante sua primeira passagem através do fígado. Como partede um programa de pesquisa para desenvolver um inibidor desulfatase de esteróide para terapia de câncer de mama,estrona-3-0-sulfamato (EMATE) foi identificado como umpotente inibidor sítio-dirigido ativo. Inesperadamente, oEMATE provou possuir potentes propriedades estrogênicas,com atividade oral uterotrópica em ratos sendo 100 vezesmaior do que aquela do estradiol. Acredita-se que suaestrogenicidade intensificada resulte de absorção atravésde células sangüíneas vermelhas (rbcs), as quais protegemcontra inativação durante passagem através do figado e asquais atuam como um reservatório para sua liberação lentadurante um período prolongado de tempo. Uma série deanálogos com anel A modificado foram sintetizados etestados, incluindo 2-metóxiestrona-3-0-sulfamato. Emboraesse composto fosse equipotente ao EMATE como um inibidorde sulfatase de esteróide, ele era desprovido deestrogenicidade.

Acreditamos que o composto da 'presente invençãoproporcione um meio para o tratamento de cânceres e,especialmente, câncer de mama.

Além disso ou alternativamente, o composto da presenteinvenção pode ser útil no bloqueio do crescimento decânceres, incluindo leucemias e tumores sólidos, tais comode mama, endométrio, próstata, ovário e pancreático.

TERAPIA COM ESTROGÊNIO

Acreditamos que alguns dos compostos da presenteinvenção podem ser úteis no controle dos níveis deestrogênio no corpo - em particular em mulheres. Assim,alguns dos compostos podem ser úteis como um meio paraproporcionar controle de fertilidade - tal como um tablete,pílula, solução ou comprimido contraceptivo oral.Alternativamente, o composto poderia estar na forma de umimplante ou como um emplastro.

Assim, os compostos da presente invenção podem serúteis no tratamento de condições hormonais associadas aoestrogênio.

Além disso ou alternativamente, o composto da presenteinvenção pode ser útil no tratamento de condições hormonaisalém daquelas associadas ao estrogênio. Conseqüentemente, ocomposto da presente invenção pode também ser capaz deafetar a atividade hormonal e pode também ser capaz deafetar uma resposta imune.

DOENÇAS NEURODEGENERATIVAS

Acreditamos que alguns dos compostos da presenteinvenção podem ser úteis no tratamento de doençasneurodegenerativas e condições similares.

Como exemplo, acredita-se que inibidores de STS podemser úteis na intensificação de função da memória depacientes sofrendo de doenças tais como amnésia, lesões nacabeça, mal de Alzheimer, demência epiléptica, demênciapré-senil, demência pós-traumática, demência senil,demência vascular e demência pós-derrame ou indivíduos quede outro modo buscam intensificação da memória.

TH1

Acredita-se que alguns dos compostos da presenteinvenção podem ser úteis em implicações THl.

Como forma de exemplo, acredita-se que a presença deinibidores de STS em macrófagos ou outras célulasapresentando antígeno pode levar a uma capacidade reduzidade células T sensibilizadas de montar uma resposta TH1(IFNy, IL-2 elevado, IL-4 reduzido). A influênciaregulatória normal de outros esteróides, tais comoglicocorticóides, portanto, predominaria.

CONDIÇÕES INFLAMATÓRIAS

Acredita-s'e que alguns dos compostos da presenteinvenção podem ser úteis no tratamento de condiçõesinflamatórias - tais como condições associadas a qualquerum ou mais de: autoimunidade incluindo, por exemplo,artrite reumatóide, diabetes dos tipos I e II, lupuseritematoso sistêmico, esclerose múltipla, miastenia grave,tireoidite, vasculite, colite ulcerativa e doença de Crohn,distúrbios da pele, por exemplo, psoríase e dermatite decontato; doença enxerto versus hospedeiro; eczema; asma erejeição de órgão após transplante.Como exemplo, acredita-se que inibidores de STS podemprevenir o efeito fisiológico normal de DHEA ou esteróidesrelacionados em respostas imunes e/ou inflamatórias.

Os compostos da presente invenção podem ser úteis nafabricação de um medicamento que revela um efeito como umglicocorticóide endógeno.OUTRAS TERAPIAS

Deve ser entendido também que o composto/composição dapresente invenção pode ter outras importantes implicaçõesmédicas.

Por exemplo, o composto ou composição da presenteinvenção pode ser útil no tratamento dos distúrbioslistados no documento WO-A-99/52890 - viz:

Além disso ou alternativamente", o composto oucomposição da presente invenção pode ser útil no tratamentodos distúrbios listados no documento WO-A-98/05635. Parafacilidade de referência, parte dessa lista é agoraproporcionada: câncer, inflamação ou doença inflamatória,distúrbios dermatológicos, febre, efeitos cardiovasculares,hemorragia, coagulação e resposta de fase aguda, caquexia,anorexia, infecção aguda, infecção por HIV, estados dechoque, reações enxerto versus hospedeiro, doençaautoimune, lesão por reperfusão, meningite, enxaqueca eanti-trombose aspirina-dependente; crescimento, invasão edisseminação de tumor, angiogênese, metástases,malignidades, ascite e efusão pleural maligna; isquemiacerebral, doença cardíaca isquêmica, osteoartrite, artritereumatóide, osteoporose, asma, esclerose múltipla,neurodegeneração, mal de Alzheimer, ateroesclerose,derrame, vasculite, doença de Crohn e colite ulcerativa;periodontite, gengivite; psoríase, dermatite atópica,úlceras crônicas, epidermolise bolhosa; ulceração corneal,retinopatia e cicatrização de ferimento cirúrgico; rinite,conjuntivite alérgica, eczema, anafilaxia; restenose,insuficiência cardíaca congestiva, endometriose,ateroesclerose ou endoesclerose.

Além disso ou alternativamente, o composto oucomposição da presente invenção pode ser útil no tratamentode distúrbios listados no documento WO-A-98/07859. Parafacilidade de referência, parte dessa lista é agoraproporcionada: atividade de citocina eproliferação/diferenciação celular; atividadeimunossupressora ou imuno-estimulante (por exemplo, para otratamento de deficiência imune, incluindo infecção pelovírus de imuno deficiência humana; regulação de crescimentode linfócito; tratamento de câncer e muitas doençasautoimunes e para prevenir rejeição a transplante ouimunicidade tumor-induzida); regulação de hematopoiese, porexemplo, tratamento de doenças mielóides ou linfóides;promoção de crescimento de tecido ósseo, cartilagem,tendão, ligamento e nervo, por exemplo, para cicatrizaçãode ferimento, tratamento de queimaduras, úlceras e doençaperiodontal e neurodegeneração; inibição ou ativação dehormônio de estimulação folicular (modulação defertilidade); atividade quimiotática/quimiocinética (porexemplo, para mobilização de tipos específicos de célula alocais de lesão ou infecção); atividade hemostática etrombolítica (por exemplo, para o tratamento de hemofilia ederrame); atividade anti-inflamatória (para tratamento, porexemplo, de choque séptico ou doença de Crohn); comoantimicrobianos; moduladores, por exemplo, de metabolismoou comportamento; como analgésicos; tratamento dedistúrbios de deficiências específicas; no tratamento, porexemplo, de psoríase, em medicina humana ou veterinária.

Além disso, ou alternativamente, a composição dapresente invenção pode ser útil no tratamento de distúrbioslistados no documento WO-A-98/09985. Para facilidade dereferência, parte dessa lista é agora proporcionada:atividade inibitória de macrófago e/ou inibitória decélulas T e, assim, atividade anti-inflamatória; atividadeanti-imune, isto é, efeitos inibitórios contra uma respostacelular e/ou humonal imune, incluindo uma resposta nãoassociada à inflamação; inibir a capacidade de macrófagos ecélulas T de aderir aos componentes da matriz extracelulare fibronectina, bem como expressão de receptor super-regulado em células T; inibir reação imune indesejada einflamação, incluindo artrite, incluindo artritereumatóide, inflamação associada à hiper-sensibilidade,reações alérgicas, asma, lupus eritematoso sistêmico,doenças de colágeno e outras doenças autoimunes, inflamaçãoassociada à ateroesclerose, arteriosclerose, doençacardíaca ateroesclerótica, lesão por reperfusão, ataquecardíaco, infarto do miocárdio, distúrbios inflamatóriosvasculares, síndrome de dificuldade respiratória ou outrasdoenças cardiopulmonares, inflamação associada à úlcerapéptica, colite ulcerativa e outras" doenças do tratogastrintestinal, fibrose hepática, cirrose hepática ououtras doenças hepáticas, tireoidite ou outras doençasglandulares, glomerulonefrite ou outras doenças renais eurológicas, otite ou outras doenças otorrino-laringológicas, dermatite ou outras doenças dérmicas,doenças periodontais ou outras doenças dentais, orquite ouepididimo-orquite, infertilidade, trauma orquidiano ououtras doenças testiculares imuno-relacionadas, disfunçãoplacentária, insuficiência placentária, aborto habitual,eclampsia, pré-eclampsia e outras doenças ginecológicasimunes e/ou inflamatórias-relacionadas, uveíte posterior,uveíte intermediária, uveíte anterior, conjuntivite, corio-retinite, uveo-retinite, neurite óptica, inflamaçãointraocular, por exemplo, retinite ou edema macularcistóide, oftalmia simpatética, esclerite, retinitepigmentosa, componentes imunes e inflamatórios de doençascom fundo degenerativo, trauma ocular inflamatório,inflamação ocular causada por infecção, vitreo-retinopatiasproliferativas, neuropatia óptica isquêmica aguda,cicatrização excessiva, por exemplo, após operação defiltração de glaucoma, reação imune e/ou inflamação contraimplantes e outras doenças oftálmicas imune- einflamatórias relacionadas, inflamação associada à doençasou condições ou distúrbios autoimunes onde, no sistemanervoso central (CNS) ou em qualquer outro órgão, supressãoimune e/ou inflamação seria benéfica, mal de Parkinson,complicação e/ou efeitos colaterais de tratamento de mal deParkinson, demência relacionada a AIDS, encefalopatiacomplexa relacionada ao HIV, doença de Devic, coréia deSydenham, mal de Alzheimer e outras doenças, condições oudistúrbios degenerativos do CNS, componentes inflamatóriosde derrames, síndrome pós-polio, componentes imunes einflamatórios de distúrbios psiquiátricos, mielite,encefalite, pan-encefalite esclerosante subaguda,encefalomielite, neuropatia aguda, neuropatia subaguda,neuropatia crônica, síndrome de Guillaim-Barre, coréia deSydenham, miastenia grave, pseudo-tumor cerebral, síndromede Down, doença de Huntington, esclerose lateralamiotrófica, componentes inflamatórios de compressão do CNSou trauma do CNS ou infecções do CNS, componentesinflamatórios de atrofias e distrofias musculares e doençasimunes- e inflamatórias relacionadas, condições oudistúrbios dos sistemas nervosos central e periférico,inflamação pós-traumática, choque séptico, doençasinfecciosas, complicações inflamatórias ou efeitoscolaterais de cirurgia, transplante de medula óssea ououtras complicações e/ou efeitos colaterais de transplante,complicações e'efeitos colaterais inflamatórios e/oú imunesde terapia genética, por exemplo, em virtude de infecçãocom um veículo viral ou inflamação associada a AIDS, parasuprimir ou inibir uma resposta humoral e/ou celular imune,para tratar ou melhorar doenças proliferativas de monócitosou leucócitos, por exemplo, leucemia, através de redução daquantidade de monócitos ou linfócitos, para a prevençãoe/ou tratamento de rejeição a enxerto nos casos detransplante de células, tecido e órgãos naturais ouartificiais, tais como córnea, medula óssea, órgãos,lentes, marca-passos, tecido de pele natural ou artificial.PREPARO DE COMPOSTO DE SULFAMATO

Os compostos de sulfamato da presente invenção podemser preparados através de reação de um álcool apropriadocom um cloreto adequado. Como forma de exemplo, oscompostos de sulfamato da presente invenção podem serpreparados através de reação de um álcool apropriado com umcloreto de sulfamoíla adequado, de Fórmula R4R5NSO2CI.

Condições típicas para realização da reação são comosegue.

Hidreto de sódio e um cloreto de sulfamoíla sãoadicionados a uma solução agitada do álcool em dimetilformamida anídrica a 0 0C. Subseqüentemente, a reação édeixada aquecer para a temperatura ambiente, quando do queagitação é continuada durante mais 24 "horas. A mistura dereação é entornada em uma solução saturada gelada debicarbonato de sódio e a fase aquosa resultante é extraídacom diclorometano. Os extratos orgânicos combinados sãosecos sobre MgSO4 anídrico. Filtração, seguida porevaporação do solvente in vácuo e co-evaporação comtolueno, proporcionou um resíduo bruto, o qual é aindapurificado através de cromatografia luminosa.

De preferência, o álcool é derivado, conformeapropriado, antes de reação com o cloreto de sulfamoíla.Onde necessário, grupos funcionais no álcool podem serprotegidos de maneira conhecida e o grupo ou grupos deproteção removido(s) no final da reação.

De preferência, os compostos de sulfamato sãopreparados de acordo com os ensinamentos de Page ecolaboradores (1990 Tetrahedron 46; 2059-2068).

Os compostos de fosfonato podem ser preparados atravésde combinação adequada dos ensinamentos de Page ecolaboradores (1990 Tetrahedron 46; 2059-2068) e doPCT/GB92/01586.

Os compostos de sulfonato podem ser preparados atravésde adaptação adequada dos ensinamentos de Page ecolaboradores (1990 Tetrahedron 46; 2059-2068) e doPCT/GB92/0158 6.

Os compostos de tiofosfonato podem ser preparadosatravés de adaptação adequada dos ensinamentos de Page ecolaboradores (1990 Tetrahedron 46; 2059-2068) e doPCT/GB91/00270.

Preparos preferidos são também apresentados no texto aseguir.RESUMO

Em resumo, a presente invenção proporciona compostospara uso como inibidores de sulfatase de esteróide e/ouinibidores de dehidrogenase de esteróide e composiçõesfarmacêuticas para os mesmos.EXEMPLOS

A presente invenção será agora descrita somente comoforma de exemplo.

Exemplo

Resiamo

O câncer de mama é uma doença de grande importância naEuropa e América do Norte. Na Grã-Bretanha, ele mata maispessoas do que qualquer outro tipo de câncer. O câncer demama hormônio-dependente representa cerca de dois terçosdos casos em mulheres na pós-menopausa; isso corresponde aum tipo de câncer de mama no qual os tumores contam comestrogênios para seu crescimento e desenvolvimento.

Terapia endócrina, onde os níveis de estrogênio emcirculação são'controlados via o uso de fármacos que' inibemuma ou várias vias enzimáticas na biossíntese de estrogênioé a resposta para HDBC. Diferentes alvos podem serconsiderados e muitos dos trabalhos foram feitos sobreanti-estrogênios e inibidores de aromatase. As enzimassulfatase de esteróide e 17β-HSD do tipo 1 surgiram comoalvos potentes.

Embora diversos inibidores potentes tenham sidodesenvolvidos para STS, 17p-HSD do tipo 1 não temestimulado muito interesse e apenas poucas moléculas ativasforam reportadas. Contando com o fato de que derivados deD-anel de EMATE são potentes inibidores de 17β-HSD do tipo1, nós iniciamos o design e síntese de análogos de EMATEcom estrogenicidade reduzida. Isso levou a uma série decompostos onde o D-anel é uma porção de piperidina diona eonde o N-átomo traz uma variedade de cadeias laterais.

Teste biológico contra STSi o qual foi realizado emcélulas de câncer de mama, revelou uma atividade muito altapara derivados trazendo uma cadeia lateral de propila oupicolila. Com uma IC50 de 1 nM, eles são muito maispotentes do que o EMATE.

Experimental

1 - Métodos Gerais

Todos os produtos químicos foram adquiridos da AldrichChemical Co. (Gillingham, Dorset, Reino'Unido) ou LancasterSynthesis (Morecambe, Lancashire, Reino Unido). Todos ossolventes orgânicos com grau A. R. foram fornecidos pelaFisons plc (Loughborough, Reino Unido). N,N-dimetilformamida anídrica (DMF) e N,N-dimetilacetamida(DMA), respectivamente, usadas para todos as reações de N-alquilações e sulfamoilação, foram adquiridos da Aldrich eforam armazenados sob uma pressão positiva de N2 após uso.Cloreto de sulfamoíla foi preparado através de umaadaptação do método de Apel e Berger48 e foi armazenadocomo uma solução em tolueno conforme descrito por Woo ecolaboradores16. Um volume apropriado dessa solução foirecentemente concentrado in vácuo imediatamente antes do uso.

ElS e El foram adquiridos da Sigma Chemical Co.(Poole, Reino Unido). [6,7-3H]ElS (atividade específica de50 Ci/mmol) e [4-14C]El (atividade específica de 52mCi/mmol) foram adquiridos da New England Nuclear (Boston,MA). [6,7-3H]El (atividade específica de 97 Ci/mmol) foiobtido da Amersham International Radiochemical Centre(Amersham, Reino Unido).

Cromatografia em camada fina (TLC) foi realizada emlâminas pré-revestidas (folhas de alumínio para TLC daMerck com gel de sílica 60 F254, Art. No. 5554). 0(s)produto(s) e material de iniciação (SM) foram detectadosatravés de visualização sob raios UV ou tratamento com umasolução metanólica de ácido fosfomolíbdico, seguido poraquecimento. Cromatografia em coluna luminosa foi realizadaem gel de sílica (Sorbsil C60) . Os espectros de IR foramdeterminados como discos de KBr usando um Perkin-ElmerSpectrum RXI FT-IR e posições de pico são expressas em cm"1. Os espectros de NMR por 1H e 13C e DEPI-editados foramregistrados com espectrômetros JMN-GX 400 NMR e os desviosquímicos são reportados em partes por milhão (ppm, δ) comrelação ao tetrametil-silano (TMS) como um padrão interno.As abreviações a seguir são usadas para descrever asressonâncias em espectro 1H NMR e 13C NMR: br, amplo; s,simples; d, duplo; t, triplo; q, quádruplo; m, múltiplo ecombinações tais como dd, duplo de duplas. Os desviosquímicos para sistemas AB (δΑ e δΒ) foram aproximadostomando-se a mediana de cada dupla e a constante deacoplamento correspondente rotulada JaB ou JbA. Como umexemplo, δΑ e δΒ foram calculados seguindo a Fórmulamostrada no apêndice 2 para o composto 21. Análise por HPLCfoi realizada em um instrumento Waters Millenium32 equipadocom um detector Waters 996 PDA. Os traços foram registradosem uma coluna Waters Radialpack C18, 8 χ 100 mm eluída comum gradiente de metanol/água em 2 mL/min. Os espectros demassa foram "registrados no Mass Spectrometry 'ServiceCenter, University of Bath. FAB-MS foram realizados usandoálcool m-nitrobenzíIico (NBA) como a matriz e análiseelemental foi realizada pelo Microanalysis Service,University of Bath. Os pontos de fusão foram determinadosusando um bloqueador Reichert-Jung Thermo Galen Kofler enão são corrigidos.

3-Benzilóxi-estrona<formula>formula see original document page 120</formula>

Hidreto de sódio (dispersão a 60% em óleo mineral,0,68 g, 20,34 mmoles) foi adicionado a uma solução agitadade estrona (5,0 g, 18,4 9 mmoles) em DMF anídrico (50 mL) a0°C sob uma atmosfera de N2 e a suspensão resultante foiagitada durante 1 hora. Brometo de benzila (2,42 mL, 20,34mmoles) foi, então, adicionado e a mistura de reação foiaquecida a 80 °C durante 4 horas. A solução resultante foientornada em gelo/água e a fração orgânica separada foiextraída em acetato de etila (150 mL), lavada com água (4 χ50 mL) , seca (MgSO4), filtrada e evaporada in vácuo. 0bruto amarelo claro resultante foi recristalizado a partirde álcool isopropílico para proporcionar 3-benzilóxi-estrona como cristais brancos floculentos (4,73 g, 71%) : mp129-131 0C [lit,26 (éter de petróleo) 132-134 0C]. IR (KBr)Vmax 3100, 2950-2840, 1730, 1600, 1500 cm"1. 1H NMR (CDCl3) δ0,91 (3H, s, C-I8-H3) , 1,41-2,54 (13H, m) , 2,86-2,93 (2H,m, C-6-H2) , 5,04 (2H, s, OCH2Ar), 6,73 (1H, d, J = 2,5 Hz,C-4-H), 6,80 (1H, dd, J = 8,6 Hz e J = 2,5 Hz, C-2-H), 7,20(1H, d, J = 8,6 Hz, C-l-H) e 7,30-7,44 (5H, m, C6H5).Ácido 3-Benzilóxi-marrianólico

Uma solução de iodo (7,6 g, 29,94 mmoles) em 95 ml deMeOH e uma solução de KOH (13,7 g) em 27 ml de água e 61 mLde MeOH foram adicionadas gota a gota e alternadamente auma solução agitada de 2-benzilóxi-estrona (3,8 g, 10,54mmoles) em MeOH (1 L) de modo que a cor da misturapermanecesse laranja/marrom. A adição foi realizada durante45 minutos e a solução amarelo claro resultante foi agitadadurante a noite em temperatura ambiente sob uma atmosferade N2. A mistura foi, então, concentrada e entornada emágua (800 mL) . Após acidificação com HCl a 5M, a fraçãoorgânica foi extraída em éter (600 mL) , lavada com tio-sulfato de sódio aquoso (4 χ 100 mL) , água (4 χ 100 mL) ,seca (MgSO4) , filtrada e evaporada in vácuo. A espumaamarela resultante (4,54 g) foi, então, dissolvida em umasolução de KOH (7,6 g) em Me0H/H20 a 1:2 (228 mL) eaquecida até refluxo durante 4 horas. A mistura marromfinal foi entornada em água (800 mL) e, após acidificaçãocom HCl a 5M, os orgânicos foram extraídos em acetato deetila (300 mL). Após lavagem com salmoura (4 χ 200 mL), acamada orgânica foi seca (MgSO4) , filtrada e evaporada invácuo para proporcionar um resíduo amarelo (4,32 g) . Essefoi recristalizado a partir de clorofórmio/hexano a 5:3para proporcionar ácido 3-benzilóxi-marrianólico como um pócreme (3,25 g, 75%): mp 212-215 0C [lit.18 (MeOH aq.) 226-227 0C] . IR (KBr) Vmax 3050-2650, 1700, 1600-1500 cm"1. 1HNMR (DMS0-d6) δ 1,02 (3H, s, C-18-H3), 1,20-2,78 (11 H, m) ,2,72-2,76 (2H, m, C-6-H2), 5,05 (2H, s, OCH2Ar), 6,68 (1H,d, J = 2,5 Hz, C-4-H) , 6,75 (1H, dd, J= 8,7 Hz e J = 2,5Hz, C-2-H), 7,18 (1H, d, J = 8,7 Hz, C-l-H), 7,30-7,42 (5H,m, C6H5) e 12,14 (2H, s, CO2H); 13C NMR (DMS0-d6) δ 15,4 (q) ,.25,8, 26,5, 29,7, 35,8, 36,1 (todos t) , 40,7, 41,8, 42,5(todos d), 46,2 (s) , 68,9 (t) , 112,3, 114,0, 126,3, 127,3(2 χ) , 127,3, 128,2 (2x) (todos d), 131,6, 137,2 (2x) ,156,0, 173,9 e 178,6 (todos s) . MS m/z (FAB+) 408,2 [41,M+], 91,1 [100, (CH2Ar)+]. HRMS m/z (FAB+) calculado paraC25H28O5: 408,1937. Encontrado: 408,1940.

3-Benzilóxi-16,17-seco-estra-l,3,5(10)-tieno-16,17-imida

<formula>formula see original document page 122</formula>Ácido 3-Benzil-marrianólico (3,25 g, 7,96 mmoles) euréia (3,25 g, 54,11 mmoles) foram aquecidos a 180°C sobuma atmosfera de N2 durante 45 minutos. 0 resíduo marromresultante foi triturado e acetona adicionada (200 mL) paraproporcionar uma suspensão marrom. Essa mistura foiconcentrada para aproximadamente 100 mL, gel de sílica foiadicionado e o solvente removido. 0 pó resultante foitransferido para uma coluna de cromatografia luminosa.Eluição com clorofórmio/acetona (96:4) proporcionou 3-benzilóxi-16,17-seco-estra-1,3,5(10)-trieno-16,17-imidacomo um sólido branco (2,75 g, 89%) . Para análise, umaamostra foi recristalizada a partir de EtOH paraproporcionar agulhas incolores: mp 225-226 0C. IR (KBr) Vraax1 3260, 2900-2870, 1720, 1700, 1600-1S00 cm"1. 1H NMR (DMSO-d6) δ 1,09 (3H, s, C-I8-H3) , 1,20-2,72 (11 H, m) , 2,76-2,80(2H, m, C -6- H2) , 5,05 (2H, s, OCH2Ar), 6,72 (1H, d, J = 2,5Hz, C-4-H), 6,76 (1H, dd, J = 8,7 Hz e J = 2,5 Hz, C-2-H),7,19 (1H, d, J = 8,7 Hiz, C-l-H) , 7,31-7,44 (5H, m, C6H5) e10,63 (1H, s, NH); 13C NMR (DMS0-d6) δ 16,2 (q) , 25,1 ,25,2, 29,2, 32,4, 32,7 (todos t) , 37,8, 40,3 (todos d),40,5 (s) , 41,9 (d), 68,9 (t) , 112,2, 114,1 , 126,0, 127,3(2x) , 127,4, 128,2 (2x) (todos d), 131,5, 137,0, 137,1 ,156,0, 172,1 e 178,9 (todos s) . MS m/z (FAB+) 390,2 [58,(M+H)+] , 91,1 [100, (CH2Ar)+]. HRMS m/z (FAB+) calculadopara C25H28NO3: 390,2069. Encontrado: 390,2059. Anal.calculado para C25H27NO3: C, 77,09; H, 6,99; N, 3,60.Encontrado: C, 76,90; H, 6,99; N, 3,73.

3-Benzilõxi-N-(3,3,3-trifluoropropil)-16,17-seco-estra-1,3,5(10)-trieno-16,17-imida (CMS01179)

C28H30F3NO3 MW 4 85,54

<formula>formula see original document page 124</formula>

A uma solução de 3-benzilóxi-16,17-seco-estra-1, 3, 5(10)-trieno-16,17-imida (2,0 g, 5,14 mmoles) , emacetonitrilo anidrico (250 mL) foi adicionado carbonato depotássio (0,780 g, 5,66 mmoles, 1,1 eq), iodeto de potássio(0,1 g) 3-bromo-1,1,1-trifluoropropano (1,61 g, 10,3mmoles, 2 eq e 18-crown-6 (2,98 g, 11,31 mmoles, 2,2 eq) ea reação aquecida a 82 0C durante 24 horas. Apósresfriamento e evaporação do acetonitrilo, a espuma laranjaresultante foi re-dissolvida em acetato de etila (200 mL) elavada com salmoura (2 χ 200 mL) seca sobre sulfato demagnésio e evaporada. Cromatografia luminosa (200 g desílica usando uma coluna de 5 cm, fluxo com acetato deetila/hexanos a 20%) eluiu o composto do título como umsólido branco cristalino (1,36 g, 54 %) ; mp 180-182 °C; Rf.0,52 (acetato de etila/hexanos a 20%); 1H NMR (270 MHziCDCl3) δ 1,38 (3H, s, 18-CH3), 1,10-2,00 (6H, m) , 2,20-2,50(6H, m) , 2,80-2,90 (2H, m) , 2,97 (1H, dd, J = 4,7 e 8,3 Hz)3,90-4,20 (2H, m, CH2-CF3), 5,02 (2H, s, O-CH2) 6,71 (1H, d,J = 2,7 Hz, 4-CH) , 6,79 (1H, dd, J = 2,7 e 8,5 Hz, 2-CH) e7,20 (1H, d, J = 8,5 Hz1 1-CH) e 7,30-7,50 (5H, m, 5 χArH); 13C NMR (67,9 MHz, CDCL3) δ 16,8 (CH3), 25,5, 25,8 e29,7 (todos CH2), 31,9 (q, J = 29,3 Hz, CH2CF3), 33,3, 33,5e 33,7 (todos CH2), 38,6 e 40,3 (ambos CH), 41,6 (CH2),42,5 (CH) , 70,0 (O-CH2), 112,8, 114,7 e 126,4 (todos CH),127,5 (2 χ CH), 128,0 (CH) e 128,7 (2 χ CH), 131,6, 137,1 ,137,5, 157,1 , 171,6 e 178,2 (todos C) ; 19F NMR (376 MHz,CDCL3) δ -65,30 (3F, t, J = 10,53 Hz CF3); HPLC (CH3CN a 70% em H2O) ir= XXX (100 %) ; LCMS (AP"), m/z 394,26 (M\ 100%) . Anal. Calculado para C28H30F3NO3: C 69,26, H 6,23, N2,28. Encontrado: C, H , N %.

3-Hidróxi-N-(3,3,3 -trifluoropropil)-16,17-seco-estra-1,3,5(10)-trieno-16,17-imida (CMS01181, STX1937)

C21H24F3NO3 MW 395,42

<formula>formula see original document page 125</formula>Uma solução de 3-Benzilóxi-N-(3,3,3-trifluoropropil)-16, 17-seco-Estra-l,3,5(10)-trieno- 16,17-imida (1,10 g,2,27 mmoles) com Pd/C a 10% (0,10 g) em metanol (40 mL) etetrahidrofurano (40 mL) foi agitada sob uma atmosfera dehidrogênio durante 3 horas. Após remoção do catalisador pormeio de filtração através de uma almofada de celite,evaporação do solvente proporcionou um sólido branco.Recristalização (dietil éter/hexano) proporcionou ocomposto do título como um sólido branco cristalino (0,870g, 97 %) ; mp 194-196 0C; Rf. 0,41 (acetato de etila/hexanosa 20%); 1H NMR (270 MHz, CDCl3) δ 1,16 (3H, s, 18-CH3);1,20-1,60 (3H, m) , 1,65-2,00 (3H, m) , 2,20-2,50 (6H, m) ,2,80-2,90 (2H, m) , 2,96 (1H, dd, J = 4,7 e 8,3 Hz) 3,90-4 4,20 (2H, m, CH2-CF3), 6,57 (1H, d, 'J = 2,5 Hz, 4-CH), 6,64(1H, dd, J = 2,5 e 8,4 Hzi 2-CH) e 7,15 (IHi d, J = 8,4 Hz,1-CH) ; 13C NMR (67,9 MHz, CDCL3) δ 16,3 (CH3), 25,5, 25,7 e29,5 (todos CH2), 31,9 (q, J = 28,7 Hz, CH2CF3), 33,2 (q, J= 3,1 Hz, CH2CH2CF3), 33,5 e 33,7 (ambos CH2), 38,6 e 40,2(ambos CH), 41,6 (C), 42,4 (CH) , 113,1 e 115,0 (ambos CH),Esperado 126,0 (q, J = 276,8 Hz, CF3) mas ausente, 126,5(CH) , 131,4, 137,4, 153,6, 171,6 e 178,4 (todos C) ; 19F NMR(376 MHz, CDCl3) δ -65,341 (3F, t, J = 10,52 Hz, CF3); HPLC(CH3CN a 70% em H2O) tr= 2,58 min (95,15 %) ; LCMS (AP"), m/z394, 26 (M~, 100 %) .Anal. Calculada para C2IH24F3NO3: C 63,79, H 6,12, N3,52. Encontrado: C, Η, N % HRMS (ES+) Encontrado 396,1765;C2iH25F3NO3 (M+H)+ requer 3 96,1781.

3-Sulfomoilõxi-N- (3,3, 3-trifIuoroPropil) -16,17-seco-Estra-1,3,5(10)-trieno-16,17-imida (CMS01188, STX1938)C2IH25F3N2O5S MW 4 74,4 9

Cloreto de sulfamoíla a 0,6M em tolueno (5,80 mL, 3,50mmoles, 2,5 eq.) foi evaporado sob pressão reduzida emtemperatura ambiente. 0 sólido branco resultante foidissolvido em N,N-dimçtilacetamida anidrica (2,5 mL) e ,esfriado para 0 0C sob nitrogênio. A essa solução agitadafoi adicionada, gota a gota, uma solução de 3-Hidróxi-N-(3,3, 3-trifluoropropil)-16,17-seco-Estra-l,3,5(10)-trieno-16,17-imida (0,55 g, 1,39 mmoles) em Ν,Ν-dimetilacetamida(2,5 mL) , então, o resfriamento externo foi removido e areação deixada aquecer para a temperatura ambiente durantea noite. A suspensão marrom clara obtida foi diluída comacetato de etila (50 mL) e lavada com solução de cloreto deamônio aquoso saturada (3 χ 50 mL) e salmoura (50 mL) ,então, seca sobre sulfato de magnésio anídrico, filtrada eevaporada sob pressão reduzida. A goma resultante foidissolvida em uma quantidade mínima de diclorometano (5mL), dietil éter (25 mL) foi adicionado, então, hexano (100mL) foi adicionado em pequenas quantidades para iniciar aprecipitação. Recristalização (diclorometano/hexanos)proporcionou o composto do título como um sólido brancocristalino (0,584 g, 88 %);

mp 192-194 0C; Rf. 0,18 (acetato de etila/hexanos a 20%); 1HNMR (270 MHz, CDCl3) δ 1,16 (3H, s, 18-CH3), 1,20-2,00 (6H,m), 2,20-2,50 (6H, m), 2,85-2,95 (2H, m), 2,96 (1H, dd, J =4,7 e 8,3 Hz) 3,92-4,15 (2H, m, CH2-CF3), 4,97 (2H, s, NH2),7,05 (1H, d, J = 2,5 Hz, 4-CH), 6,64 (1H, dd, J = 2,5 e 8,5Hz, 2-CH) e 7,15 (1H, d, J = 8,5 Hz, 1-CH) ; 13C NMR (67,9MHz, CDCl3 Γ δ 16,3 (CH3), 25,3, 25,4 e 29,3 (fodos CH2),31,9 (q, J = 29,1 Hz, CH2CF3), 33,2 (q, J = 3,8 Hz,CH2CH2CF3), 33,4 e 33,5 (ambos CH2), 38,0 e 40,2 (ambos CH),41,4 (C), 42,6 (CH), 119,3 e 121,8 (ambos CH), 126,0 (q, J= 276,8 Hz, CF3), 126,8 (CH) , 138,2, 138,25, 148,1 , 171,3e 178,1 (todos C) ; 19F NMR (376 MHz, CDCl3) δ -65,317 (3F,t, J = 10,52 Hz, CF3); HPLC (90 % CH3CN em H2O) tx= 1,070 s(1,45 %) tr= 1,921 s (98,55 %) ; LCMS (ES") m/z 473,16 [(Μ-Η)", 100%] HRMS (ES + ) Encontrado 497,1325; C21H25F3N2NaO5S(M+Na)+ requer 497,1334; HRMS (FAB+) calculado para XXX (M)+, encontrado; Anal. Calculada para C21H25F3N2O5S: C 53,16, H5,13, N 5,90. Encontrado: Cf Η, N %.

Comparação de valores IC50 do composto da invenção cominibidor de sulfatase de esterôide conhecido

Os valores IC50 de STX193 8 foram medidos em célulasJEG-3. A IC50 para STX 1938 é de 35 pM, o que se compara aum valor de 18 0 pM para STX213 medido no mesmo ensaio.

As estruturas do STX1938 e STX213 são mostradas paracomparação:

<formula>formula see original document page 129</formula>

A Figura 2 mostra a inibição de atividade de STS emfígado de rato 15 dias após uma única dose p.o. de STX1938.Para comparação, para o STX213, a atividade de STS tinhasido recuperada em 69%, isto é, uma inibição de apenas 31%.Eficácia de STX1938 in vivo

Procedimento de Teste

Células MCF-7sts (Células super expressando STS)

Células MCF-7 foram rotineiramente cultivadas em RPMIcom FCS a 10%. Os cDNAs para a STS foram clonados no vetorpCI-Neo, o qual contém o gene de resistência à neomicina etransfectados em células MCF-7. Os clones estáveis foramselecionados usando G418 e linhagens de célulaestabelecidas e avaliadas com relação à expressão eatividade enzimática.

Camundongos

Camundongos fêmeas MF-I atímicos nus, ovariectomisados(nu/nu) (6-8 semanas de idade) foram obtidos da HarlanOlac. Vinte e quatro horas antes da inoculação de célulasMCF-7sts/ os animais foram injetados s.c. com sulfato deestradiol (E2S) . No dia da inoculação, 5 χ IO8 células MCF-7 sts (50 μΐ em Matrigel) foram injetadas s.c. no flancodireito do camundongo. Após inoculação das células, oscamundongos foram injetados com E2S (100 μς/50 μΐ) ereceberam outra injeção desses esteróides 24h depois. Oscamundongos, então, receberam E2S 3 vezes por semana até ofinal do estudo. Quando os tumores tinham atingidoaproximadamente 8 0 mm3, a dosagem foi iniciada com oscompostos sendo administrados oralmente (100 μΐ; veículoTHF a 10%: propileno glicol a 90%) em 1 mg/kg. Medições dotumor e do peso dos animais foram registradas semanalmente.

As amostras de tumor e tecido hepãtico junto com osangue foram coletadas em uma série de pontos de tempo apóso término de dosagem.

Estudo 1Os camundongos foram dosados 5/7 dias por sèmana comSTX193 8 a 0,1 mg/kg, 1 mg/kg e 10 mg/kg p.o. durante odecorrer do estudo.Estudo 2

Para comparar a eficácia de STX193 8 versus STX64,camundongos foram dosados uma vez por semana durante 7semanas com composto a 1 mg/kg, p.o.

Tumores

Os tumores foram medidos semanalmente e seus volumescalculados usando a equação comprimento χ largura2/2.

Medições de Atividade de STS

Amostras de tecidos de tumor ou fígado foramhomogeneizadas em solução salina tamponada com fosfato (pH7,4 contendo sacarose a 250 mM). Alíquotas duplrcadas foramincubadas durante 4h com [3H-ElS] (53 Ci/mmol, 2-3 nM,Perkin Elmer, Boston MA) ajustado para uma concentraçãofinal de 20 μΜ com substrato não rotulado (Sigma. Poole,Dorset, Reino Unido) . [4-14C] Estrona foi incluída namistura de reação para monitorar as perdas peloprocedimento. No final do período de incubação, a estronaresultante foi isolada da mistura de reação através dedivisão com tolueno. Uma alíquota do tolueno foi removida ea radioatividade de 3H e 14C medida através deespectrometria de líquido por cintilação. A massa desulfato de estrona hidrolizada foi calculada a partir dascontagens de 3H detectadas, corrigidas para as perdas peloprocedimento.

Concentrações de estradiol no plasma

As concentrações de estradiol no plasma foram medidasatravés de um procedimento de radioimunoensaio especifico.Análise dos dados

Teste t de Student foi usado para avaliar asignificância das diferenças nos volumes de tumor para osdiferentes grupos.

Resultados

Estudo 1

Dosagem com STX1938 a 1 mg/kg e 10 mg/kg reduziusignificativamente o crescimento dè tumores E2S-estimuladosem camundongos nus (Fig 3) . A atividade de STS em tumor nasdoses de 1 mg/kg e 10 mg/kg foi quase que completamenteinibida (Fig 4).

Estudo 2

Enquanto dosagem uma vez por semana com STX1938reduziu significativamente o crescimento de tumor nesseesquema de dosagem, o STX64 foi ineficaz (Fig 5) . Dosagemsemanal com STX193 8 resultou na inibição quase que completade STS em tumor (Fig 7) e fígado (Fig 6). A atividade dessaenzima continuou a ser inibida durante um períodoprolongado após o fim da dosagem. Em contraste, o STX64nesse esquema de dosagem, reduziu a atividade de STS emtumor e no fígado apenas em 25 - 50%. Os níveis deestradiol no plasma foram significativamente reduzidosdurante um período prolongado após o término de dosagem comSTX1938 (Fig 8).

Resiimo

O STX193 8 é um inibidor potente de STS o qual, emdoses de 1 mg/kg e 10 mg/kg, inibe significativamente ocrescimento de xenoenxertos E2S-estimulados derivados decélulas de câncer de mama MCF-7 super expressando STS. Aatividade de STS de tumor é quase completamente inibidapelo STX1938.

STX1938, quando fornecido em um esquema de dosagem de*uma vez por semana, é capaz de bloquear o crescimento E2S-estimulado de tumores de xenoenxerto derivados de célulasMCF-7 super expressando STS. A atividade de STS em tumor eno fígado foi também completamente inibida. Acredita-se quea maior eficácia do STX1938 com relação àquela do STX64quando administrado semanalmente resulte de sua duração deação mais longa que ele tem in vivo comparado com aquela doSTX64. Isso sugere que o STX1938 seria adequado paradesenvolvimento como um agente terapêutico para uma vez porsemana.Todas as publicações e patentes e pedidos de patentemencionados na especificação acima são aqui incorporadospor referência.

Várias modificações e variações da presente invençãoserão evidentes para aqueles habilitados na técnica sem sedesviar do escopo e espírito da invenção. Embora a invençãotenha sido descrita com relação à modalidades específicaspreferidas, deve ser entendido que a invenção, conformereivindicado, não deverá estar indevidamente limitada atais modalidades específicas. Na verdade, se pretende quevárias modificações dos modos descritos para realização dainvenção as quais serão óbvias para aqueles habilitados emquímica, biologia ou campos relacionados estejam dentro doescopo dás reivindicações a seguir. *

Abreviações

A Ângstrons

Ac Acetila

Acc MS espectrometria precisa de massa

Adiol androstenodiol

Adiona androstenodiona

AG aminoglutetimida

aq aquoso

Ar arila

arom aromáticoBMA ácido 3-benzil-marrianólico

Bn benzila

br amplo

°C graus Celsius

13C NMR NMR de carbono

ca aproximadamente

cm centímetros

COUMATE 4-metilcoumarin-7-O-sulfamato

δ desvio químico em ppm

d dupla

dd dupla de duplas

DHEA dehidroepiandrosterona

DMF N,N-dimetilformamida

DMSO sulfóxido de dimetila '

El estrona

E2 estradiol

EMATE estrona-3-0-sulfamato

ER receptor de estrogênio

eq equivalente

FAB bombardeamento rápido de átomos

g grama(s)

h hora(s)

hER receptor de estrogênio humano

IH NMR NMR de prótonsHPLC cromatografia de líquido em alta pressão

17ß-HSD dehidrogenase de 17β-hidróxiesteróide

Hz Hertz

IC50 concentração que causa inibição de 50%

IR infravermelho

J constante de acoplamento em Hz

Xmax comprimento de onda de absorção máximaLit. referência na literatura

μ micro

m múltiplo

M mol por litro

m-NBA álcool meta-nitrobenzíIico

m-RNA ácido ribonucléico mensageiro

MHz megahertz

min minuto

mmol milimol

mol mol

mp ponto de fusão

MS espectrometria de massa

m/ζ proporção de massa para carga

NADPH fosfato de dinucleotídeo de adenina nicotinamida

nM nanomol

NMR ressonância magnética nuclear

ppm partes por milhãoRf fator de retenção

r.t. temperatura ambiente

S. D. Desvio padrão

Pd-C paládio-carvão

TBAF fluoreto de tetrabutilamônio

TBDMS terc-butil-dimetil-silila

THF tetrahidrofurano

TLC cromatografia em camada fina

TMS tetrametil-silano

ν freqüência de um sinal em Hz

vs versus

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Claims

1. Composto caracterizado pelo fato de ter a Fórmula I :<formula>formula see original document page 148</formula>em que G é um grupo f luorocarbila e em que R1 é qualquer umde -OH, um grupo sulfamato, um grupo fosfonato, um grupotiofosfonato, um grupo sulfonato ou um grupo sulfonamida ouum sal ou complexo farmaceuticamente aceitável ou complexodo mesmo.

2. Composto de acordo, com a reivindicação 1caracterizado pelo fato de ter a Fórmula II:<formula>formula see original document page 148</formula>ou um sal ou complexo farmaceuticamente aceitável do mesmo.

3. Composto de acordo com a reivindicação 1caracterizado pelo fato de ter a Fórmula III:<formula>formula see original document page 149</formula>Fórmula IIIou. um sal ou complexo farmaceuticamente aceitável do mesmo.

4. Composto de acordo com a reivindicação 1caracterizado pelo fato de ter a Fórmula IV:<formula>formula see original document page 149</formula>Fórmula IVou um sal ou complexo farmaceuticamente aceitável do mesmo.

5. Composto de acordo com a reivindicação 1caracterizado pelo fato de ter a Fórmula VII:<formula>formula see original document page 149</formula>Fórmula VIIou um sal ou complexo farmaceuticamente aceitável do mesmo.

6. Composto de acordo com a reivindicação 1caracterizado pelo fato de ter a Fórmula VIII:<formula>formula see original document page 150</formula> Fórmula VIIIou um sal ou complexo farmaceuticamente aceitável do mesmo.

7. Composto de acordo com a reivindicação 1caracterizado pelo fato de ter a Fórmula XI: <formula>formula see original document page 150</formula> ou um sal ou complexo farmaceuticamente aceitável do mesmo.

8. Composto de acordo com a reivindicação 1caracterizado pelo fato de ter a Fórmula XII: <formula>formula see original document page 150</formula> ou um sal ou complexo farmaceuticamente aceitável do mesmo.

9. Composto de acordo com qualquer uma dasreivindicações precedentes caracterizado pelo fato de que Gé um grupo da Fórmula -A-B em que A é um grupo alquileno decadeia reta, ramificada ou cíclica de 1 a 9 átomos decarbono e B é um grupo perfluoroalquila de cadeia reta,ramificada ou cíclica de 1 a 10 átomos de carbono ou um salou complexo farmaceuticamente aceitável do mesmo.

10. Composto de acordo com a reivindicação 9caracterizado pelo fato de que A é um grupo da Fórmula-(CH2)n- em que η é um número inteiro de 1 a 9 ou um sal oucomplexo farmaceuticamente aceitável do mesmo.

11. Composto de acordo com a reivindicação 9 ou 10caracterizado pelo fato de que o grupo A tem dois átomos decarbono ou um sal ou complexo farmaceuticamente aceitáveldo mesmo.

12. Composto de acordo com qualquer uma dasreivindicações 9 a 11 caracterizado pelo fato de que B é umgrupo da Fórmula -(CF2)mCF3 em que m é 0 ou um númerointeiro de 1 a 9 ou um sal ou complexo farmaceuticamenteaceitável do mesmo.

13. Composto de acordo com a reivindicação 9caracterizado pelo fato de que o grupo G tem a Fórmula -(CH2)n(CF2)mCF3 em que η é um número inteiro de 1 a 9, m é 0ou um número inteiro de 1 a 9 ou um sal ou complexofarmaceuticamente aceitável do mesmo.

14. Composto de acordo com a reivindicação 13caracterizado pelo fato de que n+m está entre 1 e 10.

15. Composto de acordo com qualquer uma dasreivindicações precedentes caracterizado pelo fato de que ogrupo G é 3, 3, 3- trif luoropropila (-CH2CH2CF3) ou um sal oucomplexo farmaceuticamente aceitável do mesmo.

16. Composto de acordo com qualquer uma dasreivindicações precedentes caracterizado pelo fato de queR1 é um grupo sulfamato ou um sal ou complexofarmaceuticamente aceitável do mesmo.

17. Composto de acordo com a reivindicação 1caracterizado pelo fato de ter a fórmula:<formula>formula see original document page 152</formula>ou um sal ou complexo farmaceuticamente aceitável do mesmo.

18. Composto de acordo com qualquer uma dasreivindicações precedentes caracterizado pelo fato de que<formula>formula see original document page 152</formula>R1 ou o grupo sulfamato é da Fórmula:<formula>formula see original document page 152</formula>em que R4 e R5 são independentemente selecionados de H,alquila, cicloalquila, alquenila e arila ou combinações dosmesmos ou juntos representam alquileno, em que a ou cadaalquila ou cicloalquila ou alquenila contém opcionalmenteum ou mais heteroátomos ou grupos ou um sal ou complexofarmaceuticamente aceitável do mesmo.

19. Composto de acordo com a reivindicação 18caracterizado pelo fato de que pelo menos um de R4 e R5 é Hou um sal ou complexo farmaceuticamente aceitável do mesmo.

20. Composto de acordo com a reivindicação 19caracterizado pelo fato de que R4 e R5 são H ou um sal oucomplexo farmaceuticamente aceitável do mesmo.

21. Composto de acordo com qualquer uma dasreivindicações precedentes caracterizado pelo fato de ter aFórmula XII: <formula>formula see original document page 153</formula> em que G é um grupo fluorocarbila;em que R1 é OH ou um grupo sulfamato da Fórmula:<formula>formula see original document page 154</formula>em que R4 e R5 são independentemente selecionados deH, alquila, cicloalquila, alquenila e arila ou combinaçõesdos mesmos ou juntos representam alquileno, em que a oucada alquila ou cicloalquila ou alquenila contémopcionalmente um ou mais heteroátomos ou grupos ou um salou complexo farmaceuticamente aceitável do mesmo.

22. Composto de acordo com a reivindicação 21caracterizado pelo fato de ter a Fórmula:<formula>formula see original document page 154</formula>ou um sal ou complexo farmaceuticamente aceitável do mesmo.

23. Composição farmacêutica caracterizada pelo fatode compreender um composto de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 a 22 opcionalmente misturado com umveículo, diluente, excipiente ou adjuvantefarmaceuticamente aceitável.

24. Composto de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 a 22 caracterizado pelo fato de ser parauso em medicina.

25. Uso de um composto de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 a 22 caracterizado pelo fato de ser para afabricação de um medicamento para uso em terapia de umacondição ou doença associada à sulfatase de esteróide (STS).

26. Uso de um composto de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 a 22 caracterizado pelo fato de ser para afabricação de um medicamento para uso em terapia de umacondição ou doença associada a níveis adversos de STS.

27. Uso de um composto de acordo com qualquer uma dasreivindicaçõés 1 a 22 caracterizado pelo fato de ser para afabricação de um produto farmacêutico para inibição deatividade de sulfatase de esteróide (STS).

28. Uso de um composto de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 a 22 caracterizado pelo fato de ser para afabricação de um produto farmacêutico para inibição deatividade de sulfatase de esteróide (STS).

29. Uso de um composto de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 a 22 caracterizado pelo fato de ser para afabricação de um produto farmacêutico para o tratamento decâncer.

30. Uso de acordo com a reivindicação 29caracterizado pelo fato de que o câncer é selecionado entrecânceres endócrino-dependentes.

31. Uso de acordo com a reivindicação 3 0caracterizado pelo fato de que o câncer é câncer de mama,de endométrio ou de próstata.

32. Uso de um composto de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 a 22 caracterizado pelo fato de ser para afabricação de um produto farmacêutico para o tratamento deuma condição ou doença associada à sulfatase de esteróideem um mamífero que precisa do mesmo, o referido tratamentocompreendendo administração, ao referido mamífero, de umaquantidade farmaceuticamente eficaz do composto da invençãode acordo com um esquema tendo um intervalo de dosagem demais do que diário.

33. Uso de acordo com a reivindicação 32caracterizado pelo fato de que o composto é administradocomo uma unidade de dosagem.

34. Uso de acordo com a reivindicação 32caracterizado pelo fato de que o intervalo de dosagem éselecionado de dosagem uma vez por semana, dosagem duasvezes por semana, dosagem bi-semanal, dosagem duas vezespor mês e dosagem mensal.

35. Uso de acordo com a reivindicação 32caracterizado pelo fato de que o intervalo de dosagem édosagem uma vez por semana.

36. Composto caracterizado pelo fato de sersubstancialmente conforme anteriormente descrito comreferência a qualquer um dos Exemplos.

37. Composição caracterizada pelo fato de sersubstancialmente conforme anteriormente descrito comreferência a qualquer um dos Exemplos.

38. Método caracterizado pelo fato de sersubstancialmente conforme anteriormente descrito comreferência a qualquer um dos Exemplos.

39. Uso caracterizado pelo fato de sersubstancialmente conforme anteriormente descrito comreferência a qualquer um dos Exemplos.