BRPI0708477B1 - A method for identifying a first maize plant or a first maize germplasm comprising in its genome a diaglicerol o-acyltransferase type 1 (DGAT) gene, isolated polynucleotide, method for producing a plant or part of a plant having a selected phenotype, method to identify the presence of a marker locus - Google Patents

A method for identifying a first maize plant or a first maize germplasm comprising in its genome a diaglicerol o-acyltransferase type 1 (DGAT) gene, isolated polynucleotide, method for producing a plant or part of a plant having a selected phenotype, method to identify the presence of a marker locus Download PDF

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Description

MÉTODO PARA. IDENTIFICAR UMA PRIMEIRA PLANTA DE MILHO OU UM PRIMEIRO GERMOPLASMA DE MILHO COMPREENDENDO EM SEU GENOMA UM GENE DE DIAGLICEROL O-ACILTRANSFERASE DO TIPO 1 (DGAT)r POLINUCLEOTÍDEO ISOLADO, MÉTODO PARA PRODUZIR UMA PLANTA OU PARTE DE PLANTA POSSUINDO UM FENÓTIPO SELECIONADO, MÉTODO
PARA IDENTIFICAR A PRESENÇA DE UM LÓCUS MARCADOR
CAMPO DA INVENÇÃO
[001] A invenção relaciona-se ao campo de reprodução de plantas e manipulação genética de plantas, partí cuia oriente para a modulação do conteúdo de óleo e conteúdo oleico em uma planta ou parte desta planta.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
[002] Mais de 50% da safra de grão de milho produzida nos EUA é usada para alimentação de animais (Perry (1988) Com and Com Improvement, eds., Sprague and Dudley (Madison, WI), páginas 941-963). O grào de milho com elevada concentração de óleo possui um maior conteúdo calórico comparado com grão de milho padrão e é vantajoso como uma fonte alimentar para animais. A alimentação de suínos e aves domésticas com grão de milho de alto conteúdo de óleo em vez de grão de milho com níveis padrões de concentração de óleo resultou em ganho de peso acelerado (Han e outros (1987) jt Poult. Sei. 66:103-111 and Gross e outros (1992) Proc, of the 47th Ann, Com and Sorghum Res. Conference, páginas 82-92), Assim, o desenvolvimento de germoplasma com alto teor de óleo é um objetivo de alguns programas de reprodução de milho.
[003] A tecnologia de marcador molecular tem permitido a associação de marcadores de DNA com importantes traços agornômicos tal como rendimento, altura de planta, resistência à doenças, etc. Métodos e composições que melhoram o conteúdo de óleo de plantas e também fornecem novos marcadores moleculares que consideram métodos de reprodução eficientes para identificar as plantas de alto teor de óleo são necessários na técnica.
BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[004]Composições relacionadas ao lócus 6 de traço quantitativo (QTL6) em milho e métodos para seu uso são fornecidos. As composições são loci marcadores moleculares novos que são geneticamente ligados ao QTL6 e que estão associados ao conteúdo de óleo aumentado e/ou conteúdo de ácido oléico aumentado de uma planta ou parte desta planta, e/ou uma relação entre ácido oléico/ácido linoleico aumentada em uma planta ou parte desta planta. Estes novos marcadores são caracterizados pela presença de pelo menos um polimorfismo relativo ao lócus marcador correspondente da região de QTL6 de pé de milho com conteúdo de óleo normal. Em algumas modalidades, os novos loci marcadores compreender codificar seqüência para um polipeptídeo, onde pelo menos um polimorfismo dentro do lócus marcador resulta na expressão de um polipeptídeo variante que está associado ao conteúdo de óleo aumentado, e/ou conteúdo de ácido oléico aumentados, e/ou uma relação entre ácido oleico/ácido linoleico aumentada dentro da planta ou parte desta planta. Em tal modalidade, o lócus marcador compreende uma seqüência codificadora para um DGAT1-2 de milho ou variante biologicamente ativa deste, part o DGAT1-2(ASK) de milho ou variante biologicamente ativa deste. Os loci marcadores da invenção e fragmentos adequados destes, são úteis na seleção assitida por marcador de uma planta, por exemplo, um pé de milho, ou parte da planta, possuindo um conteúdo de óleo aumentado, e/ou conteúdo de ácido oléico aumentado, e/ou uma relação entre o ácido oleico e o ácido linoleico, e para reprodução assistida por marcador do alto traço de óleo e/ou alto traço de ácido oléico, incluindo conteúdo de ácido oleico aumentado e relação aumentada entre o ácido oléico/ácido linoléico.
[005] Desta forma, a presente invenção fornece métodos para identificar um pé de milho ou germoplasma de milho que possua um conteúdo de óleo aumentado, um conteúdo de ácido oléico aumentado, e/ou uma relação aumentada entre o ácido oléico/ácido linoléico, os métodos compreendendo detectar na planta pi germoplasma pelo menos um polimorfismo em de um lócus marcador da invenção que esteja associado com o conteúdo de óleo aumentado, o conteúdo de ácido oléico aumentado ou a relação aumentada entre o ácido oléico/ácido linoléico. Em algumas modalidades, a detecção compreende o uso de um marcador detectável compreendendo todo ou parte do lócus marcador ou de um complemento deste. Plantas ou germoplasmas identificados como possuindo o traço de alto teor de óleo desejável, e/ou o traço de alto teor de ácido oléico, e/ou o traço de relação aumentada entre o ácido oléico/ácido linoléico podem ser selecionadas para uso em métodos de reprodução tradicionais para introduzit o traço desejado em qualquer planta ou germeplasca adequados de interesse.
[006] A presente invenção também fornece métodos para identificar a presença de um lócus QTL6 que esteja associado a um conteúdo de óleo aumentado, um conteúdo de ácido oléico aumentado e/ou uma relação aumentada entre o ácido oléico/ácido linoléico em um pé de milho ou germoplasma de milho. Os métodos compreendem medir a concentração de ácido oléico da semente do referido pé de milho ou germoplasma de milho, onde uma concentração de ácido oléico de pelo menos 35% é indicativa que de o pé de milho ou germoplasma de milho provavelmente compreendem este lócus QTL6. Plantas ou germoplasmas identificados como possuindo o lócus QTL6 de alto teor de óleo/alto teor de ácido oléico desejável pode ser selecionada para uso em métodos de procriação tradicionais para introduzir este lócus desejado em qualquer planta ou germoplasma adequados de interesse.
[007]As composições da invenção também compreendem polinucleotideos isolados por cinco quadros de leitura abertos em uma região de QTL6 de milho aqui divulgada e os polipeptideos codificados por estes. Os cinco quadros de leitura abertos codificam um DGAT de milho, designado ZmDGATl-2(ASK); uma permease 1 de aminoácido de milho, degignada ZmAAP 1; uma proteína do sistema de efluxo de potássio de milho, designada ZmPESP, uma proteína S24 ribossomal de milho, designada ZmS24, um transportador ABC tipo PDR de milho, designado ZmABCT e variantes biologicamente ativas destes. É também fornecido o quadro de leitura aberto que condifica o ZmDGATl-2 correspondente das linhas consaguíneas de milho de teor de milho normais e o polipeptídeo codificado por este. Adicionalmente, a invenção fornece sequências promotoras isoladas para o gene ZmDGATl-2 (ASK) , para um gene DGAT 1-2 de teor de óleo normal correspondente, designado ZmDAGTl-2(Mol7), e para os genes ZmAAP 1, ZmPESP(Mol7) e ZmPESP(ASK), ZmS24 e ZmABCT da invenção. Estas seqüências promotoras encontram uso no direcionamento da expressão de polinucleotideos operativamente ligados que condificam polipeptideos de interesse, incluindo os respectivos polinucleotideos nativos codificando os polipeptideos ZmDGATl-2(ASK) , ZmDGATl-2(Mol7), ZmAAP 1, ZmPESP, ZmS24, e ZmABCT de interesse.
[008] As composições da invenção encontram uso na manipulação de óleo, e/ou conteúdo de ácido oléico e/ou relação entre ácido oléico/ácido linoleico dentro de uma planta de interesse ou parte da planta. Desta forma, a presente invenção também fornece cassetes de expressão compreendendo um ou mais polinucleotideos da invenção, e células de planta transformadas, plantas e semente compreendendo estes cassetes de expressão. Os cassetes de expressão encontram uso em métodos da invenção direcionadas para aumentar o conteúdo de óleo, aumentar o conteúdo de ácido oléico e/ou aumentar a relação entre ácido oléico/ácido linoleico em uma planta ou parte desta planta.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[009] A Figura 1 mostra o mapeamento de QTL6 em uma população BC2.
[010] A Figura 2 é um desenho esquemático ilustrando o mapeamento progressivo de QTL6 de uma região de 47,2 cM em BC2 abaixo de um fragmento de aproximadamente 195 kb em BC4S2, que corresponde a três clones BAC se sobrepondo (bl21c.n3, b33a.k3 e be46c.n5) em um mapa fisico de Mol7 consanguineo.
[011] A Figura 3 fornece dados que mostram que o QTL6 aumenta as concentrações de óleo no embrião e semente. Em média, 10 sementes de cada espiga homozigótica foram analisadas pata óleo na semente e óleo no embirão por NMR. Para i óleo da semente, sementes secas ao ar foram usadas para medições de NMR diretas. Para o óleo do embrião, as sementes foram imersas em água durante a noite. Os embrições foram dissecados dos endospermas, secos a vácuo e sujeitados a análises de NMR. QTL6 aumenta consistentemente as concentrações de óleo no embrião e de óleo na semente em várias gerações.
[012] A Figura 4 fornece dados que mostram que o QTL6 também aumentam a relação entre ácido oléico/ácido linoleico nas sementes. Em média, cinco sementes de cada espiga homozigótica foram sujeitadas ao perfil de ácido graxo. Porque mais de 80% do óleo de semente total é oriunda de embriões, apenas sementes inteiras foram analisadas para ácidos graxos. As sementes foram trituradas e extraídas com hexanos grau HPLC. O extrato de hexano/óleo é misturado com hidróxido de trimetilsulfônio 1/10 volume em um frasco de cromatografia gasosa (GC). A composição de ácido graxo foi determinada por GC capilar em um cromatógrafo a gás modelo 6890 Agilent com detector de ionização de chama. Os ésteres metílicos de ácido graxo foram separados em uma coluna capilar ZB-Wax Zebron™. Os dados estão expressados como o percentual normalizados de todos os ésteres metílicos do ácido graxo identificado.
[013] A Figura 5 fornece dados mostrando que QTL6 de óleo e Leafy Cotyledon 1 (LEC1) possuem efeitos aditivos sobre o óleo. Cotilédone Folhoso de Milho 1 (LEC1), um ativador transcricional contendo domínio-B, mostrou aumentar o óleo do embrião. Uma linha ASKC28lBlxEF09B BC2S2 homozigótica para QTL6 foi cruzada com plantas homozigóticas contendo o transgene LEC1 de milho. 0 óleo de embrião e de semente das sementes Fl resultantes foram analisados por NMR. Os dados indicam que QTL6 r LEC1 possuem efeitos aditivos sobre as concentrações de óleo do embrião assim como sobre as concentrações de óleo da semente.
[014] A Figura 6 fornece um mapeamento esquemático da região de QTL6, incluindo os cinco quadros de leitura abertos (Open Reading Frames (ORFs)). Conforme descrito na Figura 2, um QTL de óleo/ácido oléico importante foi finalmente mapeado para uma pequena região no cromossomo 6 localizada entre os marcadores SNP BAC18 e BAC29. Três BACs soprepostos cobrindo a região de QTL6 da linha de milho consaguinea Mo 17 foram sequenciados. A inserção genômica total nestes três clones é aproximadamente de 280 kb. QTL6 pode ser também mapeado para uma região de 195 kb que contém cinco quadros de leitura abertos (ORFs) dividindo significante homologia com genes conhecidos. Os cinco ORFs e marcadores polimórficos ligados intimamente são marcados. Devido à natureza repetitiva do genoma de milho, alguns pequenos espaços e a orientação de alguns fragmentos devem ser determinados. Dois dos ORFs (proteína ribossomal 40S e permease de aminoácido) estão localizados dentro de um espaço de 18 kb. O ORF transportador de ABC está localizado na extremidade da região sequenciada, e apenas metade da extremidade 5' deste ORF grande (mais de 1500 AA) para o transportador de ABC está localizada nestes três BACs.
[015] A Figura 7 fornece um alinhamento do marcador molecular QTL6 BAC05 desenvolvido das seqüências de extremidade BAC das três seqüências BAC Mol7 que cobrem a região de QTL6. 0 marcador BAC05-ASK (Id. de Seq. n°: 1) está alinhado com a seqüência correspondente de BAC05-EF09B (Id. de Seq. n°: 2) . 0 alinhamento também fornece o iniciador de avanço (Id. de Seq. n°: 68) e o inicidor reverso (Id. de Seq. n°: 69) que podem ser usados para amplificar este marcador.
[016] A Figura 8 fornece um alinhamento do marcador molecular QTL6 BAC05 desenvolvido das seqüências de extremidade BAC das três seqüências BAC Mol7 que cobrem a região de QTL6. O marcador BAC17-ASK (Id. de Seq. n°: 3) está alinhado com a seqüência correspondente de BAC17-EF09B (Id. de Seq. n°: 4). O alinhamento também fornece o iniciador de avanço (Id. de Seq. n°: 70) e o inicidor reverso (Id. de Seq. n°: 71) que podem ser usados para amplificar este marcador.
[017] A Figura 9 fornece um alinhamento do marcador molecular QTL6 BAC05 desenvolvido das seqüências de extremidade BAC das três seqüências BAC Mol8 que cobrem a região de QTL6. O marcador BAC18-ASK (Id. de Seq. n°: 5) está alinhado com a seqüência correspondente de BAC18-EF09B (Id. de Seq. n°: 6). O alinhamento também fornece o iniciador de avanço (Id. de Seq. n°: 72) e o inicidor reverso (Id. de Seq. n°: 73) que podem ser usados para amplificar este marcador.
[018] A Figura 10 fornece um alinhamento do marcador molecular QTL6 BAC20 desenvolvido das seqüências de extremidade BAC das três seqüências BAC Mol7 que cobrem a região de QTL6. O marcador BAC20-ASK (Id. de Seq. n°: 7) está alinhado com a seqüência correspondente de BAC17-EF09B (Id. de Seq. n°: 8). 0 alinhamento também fornece o iniciador de avanço (Id. de Seq. n°: 74) e o inicidor reverso (Id. de Seq. n°: 75) que podem ser usados para amplificar este marcador.
[019] A Figura 11 fornece um alinhamento do marcador molecular QTL6 BAC22 desenvolvido das seqüências de extremidade BAC das três seqüências BAC Mol7 que cobrem a região de QTL6. O marcador BAC22-ASK (Id. de Seq. n°: 9) está alinhado com a seqüência correspondente de BAC22-EF09B (Id. de Seq. n°: 10). O alinhamento também fornece o iniciador de avanço (Id. de Seq. n°: 76) e o inicidor reverso (Id. de Seq. n°: 77) que podem ser usados para amplificar este marcador.
[020] A Figura 12 fornece um alinhamento do marcador molecular QTL6 BAC24 desenvolvido das seqüências de extremidade BAC das três seqüências BAC Mol7 que cobrem a região de QTL6. O marcador BAC24-ASK (Id. de Seq. n°: 11) está alinhado com a seqüência correspondente de BAC24-EF09B (Id. de Seq. n°: 12). O alinhamento também fornece o iniciador de avanço (Id. de Seq. n°: 78) e o inicidor reverso (Id. de Seq. n°: 79) que podem ser usados para amplificar este marcador.
[021] A Figura 13 fornece um alinhamento do marcador molecular QTL6 BAC29 desenvolvido das seqüências de extremidade BAC das três seqüências BAC Mol7 que cobrem a região de QTL6. O marcador BAC29-ASK (Id. de Seq. n°: 13) está alinhado com a seqüência correspondente de BAC29-EF09B (Id. de Seq. n°: 14) . O alinhamento também fornece o iniciador de avanço (Id. de Seq. n°: 80) e o inicidor reverso (Id. de Seq. n°: 81) que podem ser usados para amplificar este marcador.
[022] A Figura 14 fornece um alinhamento do marcador molecular QTL6 BAC32 desenvolvido das seqüências de extremidade BAC das três seqüências BAC Mol7 que cobrem a região de QTL6. O marcador BAC32-ASK (Id. de Seq. n°: 15) está alinhado com a seqüência correspondente de BAC32-EF09B (Id. de Seq. n°: 16). O alinhamento também fornece o iniciador de avanço (Id. de Seq. n°: 82) e o inicidor reverso (Id. de Seq. n°: 83) que podem ser usados para amplificar este marcador.
[023] A Figura 15 fornece um alinhamento do marcador molecular QTL6SNP7 desenvolvido das seqüências de extremidade BAC das três seqüências BAC Mol7 que cobrem a região de QTL6. O marcador QTL6SNP7-ASK (Id. de Seq. n°: 17) está alinhado com a seqüência correspondente de QTL6SNP7-EF09B (Id. de Seq. n°: 18). O alinhamento também fornece o iniciador de avanço (Id. de Seq. n°: 84) e o inicidor reverso (Id. de Seq. n°: 85) que podem ser usados para amplificar este marcador.
[024] A Figura 16 fornece um alinhamento do marcador molecular QTL6SNP8 desenvolvido das seqüências de extremidade BAC das três seqüências BAC Mol7 que cobrem a região de QTL6. O marcador QTL6SNP8-ASK (Id. de Seq. n°: 19) está alinhado com a seqüência correspondente de QTL6SNP8-EF09B (Id. de Seq. n°: 20). O alinhamento também fornece o iniciador de avanço (Id. de Seq. n°: 86) e o inicidor reverso (Id. de Seq. n°: 87) que podem ser usados para amplificar este marcador.
[025] A Figura 17 fornece um alinhamento do marcador molecular QTL6SNP9 desenvolvido das seqüências de extremidade BAC das três seqüências BAC Mol7 que cobrem a região de QTL6. 0 marcador QTL6SNP9-ASK (Id. de Seq. n°: 21) está alinhado com a seqüência correspondente de QTL6SNP9-EF09B (Id. de Seq. n°: 22). 0 alinhamento também fornece o iniciador de avanço (Id. de Seq. n°: 88) e o inicidor reverso (Id. de Seq. n°: 89) que podem ser usados para amplificar este marcador.
[026] A Figura 18 fornece um alinhamento do marcador molecular QTL6SNP13 desenvolvido das seqüências de extremidade BAC das três seqüências BAC Mol7 que cobrem a região de QTL6. O marcador QTL6SNP13-ASK (Id. de Seq. n°: 23) está alinhado com a seqüência correspondente de QTL6SNP13-EF09B (Id. de Seq. n°: 24). O alinhamento também fornece o iniciador de avanço (Id. de Seq. n°: 90) e o inicidor reverso (Id. de Seq. n°: 91) que podem ser usados para amplificar este marcador.
[027] A Figura 19 fornece um alinhamento do marcador molecular QTL6SNP14 desenvolvido das seqüências de extremidade BAC das três seqüências BAC Mol7 que cobrem a região de QTL6. O marcador QTL6SNP14-ASK (Id. de Seq. n°: 25) está alinhado com a seqüência correspondente de QTL6SNP14-EF09B (Id. de Seq. n°: 26) . O alinhamento também fornece o iniciador de avanço (Id. de Seq. n°: 92) e o inicidor reverso (Id. de Seq. n°: 93) que podem ser usados para amplificar este marcador.
[028] A Figura 20 fornece um alinhamento do marcador molecular QTL6SNP15 desenvolvido das seqüências de extremidade BAC das três seqüências BAC Mol7 que cobrem a região de QTL6. O marcador QTL6SNP15-ASK (Id. de Seq. n°: 27) está alinhado com a seqüência correspondente de QTL6SNP15-EF09Β (Id. de Seq. n°: 28) . 0 alinhamento também fornece o iniciador de avanço (Id. de Seq. n°: 94) e o inicidor reverso (Id. de Seq. n° : 95) que podem ser usados para amplificar este marcador.
[029] A Figura 21 fornece um alinhamento do marcador molecular QTL6SNP16 desenvolvido das seqüências de extremidade BAC das três seqüências BAC Mol7 que cobrem a região de QTL6. O marcador QTL6SNP16-ASK (Id. de Seq. n°: 29) está alinhado com a seqüência correspondente de QTL6SNP16-EF09B (Id. de Seq. n°: 30). O alinhamento também fornece o iniciador de avanço (Id. de Seq. n°: 96) e o inicidor reverso (Id. de Seq. n°: 97) que podem ser usados para amplificar este marcador.
[030] A Figura 22 fornece um alinhamento do marcador molecular QTL6SNP17 desenvolvido das seqüências de extremidade BAC das três seqüências BAC Mol7 que cobrem a região de QTL6. O marcador QTL6SNP17-ASK (Id. de Seq. n°: 31) está alinhado com a seqüência correspondente de QTL6SNP17-EF09B (Id. de Seq. n°: 32). O alinhamento também fornece o iniciador de avanço (Id. de Seq. n°: 98) e o inicidor reverso (Id. de Seq. n°: 99) que podem ser usados para amplificar este marcador.
[031] A Figura 23 fornece um alinhamento do marcador molecular QTL6MZA5002 desenvolvido das seqüências de extremidade BAC das três seqüências BAC Mol7 que cobrem a região de QTL6. O marcador QTL6MZA5002-ASK (Id. de Seq. n°: 33) está alinhado com a seqüência correspondente de QTL6MZA5002-EF09B (Id. de Seq. n°: 34). O alinhamento também fornece o iniciador de avanço (Id. de Seq. n°: 100) e o iniciador reverso (Id. de Seq. n°: 101) que pode ser usado para amplificar este marcador.
[032] A Figura 24 fornece um alinhamento do marcador molecular QTL6MZA13321 desenvolvido das seqüências de extremidade BAC das três seqüências BAC Mol7 que cobrem a região de QTL6. O marcador QTL6MZA13321-ASK (Id. de Seq. n°: 35) está alinhado com a seqüência correspondente de QTL6MZA13321-EF09B (Id. de Seq. n° : 36). O alinhamento também fornece o iniciador de avanço (Id. de Seq. n°: 102) e o iniciador reverso (Id. de Seq. n°: 103) que pode ser usado para amplificar este marcador.
[033] A Figura 25 fornece um alinhamento do marcador molecular QTL6MZA15785 desenvolvido das seqüências de extremidade BAC das três seqüências BAC Mol7 que cobrem a região de QTL6. O marcador QTL6MZA15785-ASK (Id. de Seq. n°: 37) está alinhado com a seqüência correspondente de QTL6MZA15785-EF09B (Id. de Seq. n°: 38). O alinhamento também fornece o iniciador de avanço (Id. de Seq. n°: 104) e o iniciador reverso (Id. de Seq. n°: 105) que pode ser usado para amplificar este marcador.
[034] A Figura 26 fornece um alinhamento do marcador molecular QTL6MZA13118 desenvolvido das seqüências de extremidade BAC das três seqüências BAC Mol7 que cobrem a região de QTL6. O marcador QTL6MZA13118-ASK (Id. de Seq. n°: 39) está alinhado com a seqüência correspondente de QTL6MZA13118-EF09B (Id. de Seq. n°: 40). O alinhamento também fornece o iniciador de avanço (Id. de Seq. n°: 106) e o iniciador reverso (Id. de Seq. n° : 107) que pode ser usado para amplificar este marcador.
[035] A Figura 27 fornece um alinhamento do marcador molecular QTL6MZA11771 desenvolvido das seqüências de extremidade BAC das três seqüências BAC Mol7 que cobrem a região de QTL6. 0 marcador QTL6MZA11771-ASK (Id. de Seq. n°: 41) está alinhado com a seqüência correspondente de QTL6MZA11771-EF09B (Id. de Seq. n°: 42). O alinhamento também fornece o iniciador de avanço (Id. de Seq. n°: 108) e o iniciador reverso (Id. de Seq. n°: 109) que pode ser usado para amplificar este marcador.
[036] A Figura 28 fornece um alinhamento do marcador molecular QTL6MZA9351 desenvolvido das seqüências de extremidade BAC das três seqüências BAC Mol7 que cobrem a região de QTL6. O marcador QTL6MZA9351-ASK (Id. de Seq. n°: 43) está alinhado com a seqüência correspondente de QTL6MZA9351-EF09B (Id. de Seq. n°: 44). O alinhamento também fornece o iniciador de avanço (Id. de Seq. n°: 110) e o iniciador reverso (Id. de Seq. n°: 111) que pode ser usado para amplificar este marcador.
[037] A Figura 29 fornece um alinhamento do marcador molecular QTL6MZA8135 desenvolvido das seqüências de extremidade BAC das três seqüências BAC Mol7 que cobrem a região de QTL6. O marcador QTL6MZA8135-ASK (Id. de Seq. n°: 45) está alinhado com a seqüência correspondente de QTL6MZA8135-EF09B (Id. de Seq. n°: 46). O alinhamento também fornece o iniciador de avanço (Id. de Seq. n°: 112) e o iniciador reverso (Id. de Seq. n°: 113) que pode ser usado para amplificar este marcador.
[038] A Figura 30 fornece um alinhamento da proteína ZmDGATl-2(ASK) (Id. de Seq. n°: 48) com a proteína ZmDGATl- 2 das linhas consaguíneas de milho com teor de óleo normal (quando comparado ao amarelo #2) EF09B (Id. de Seq. n°: 52), Mol7 (Id. de Seq. n°: 50) e B73 (Id. de Seq. n°: 54). A deleção de glutamina dentro da proteína ZmDGATl-2(ASK) está descrita como ocorrendo na posição correspondente a Gln67 da proteína ZmDGATl-2 com teor de óleo normal, embora a deleção possa ocorrer na posição correspondente a Gln64, Gln65, Gln66 ou Gln67 da proteína ZmDGATl-2 com teor normal de óleo. Também, a inserção de fenilalanina dentro da proteína ZmDGAT 1-2(ASK) está descrita como correspondente a uma inserção de fenilalanina entre Phe469 e Ser470 da proteína ZmDGATl-2 com teor normal de óleo. Entretanto esta inserção poderá corresponder a uma inserção de fenilalanina entre Trp467 e Phe468 da proteína ZmDGATl-2 com teor normal de óleo, ou uma inserção de fenilalanina entre Phe469 e Ser47o da proteína ZmDGATl-2 com teor normal de óleo.
[039]A Figura 31 fornece um alinhamento da seqüência codificadora para a proteína ZmDGATl-2(ASK) (Id. de Seq. n°: 47) com a seqüência codifcadora para a proteína ZmDGATl-2 das linhas consaguíneas de milho com teor de óleo normal EF09B (Id. de Seq. n°: 51), Mo 17 (Id. de Seq. n°: 49) e B73 (Id. de Seq. n°: 53). Note que neste alinhamento, a mudança polimórfica (deleção de um códon CAG dentro da seqüência codificadora para ZmDGAT 1-2(ASK) exposta em Id. de Seq. n°: 47) que resulta em uma deleção de um resíduo de glutamina dentro da proteína ZmDGAT 1-2(ASK) está descrita como ocorrendo dentro do codon para o resíduo de glutamina correspondente à posição 67 da proteína ZmDGATl-2 com teor normal de óleo. Entretanto, dado o estiramento dos quatro resíduos de glutamina repetidos dentro da proteína ZmDGATl-2 com teor normal de óleo, a mudança polimórfica (deleção de um códon CAG) poderá ocorrer dentro do códon para o resíduo de glutamina correspondente à posição 64 da proteína ZmDGATl-2 com teor normal de óleo (isto é, representado pela deleção de nucleotídeos (nt) 190-192 da seqüência codificadora para a proteína ZmDGATl-2 com teor normal de óleo exposta em Id. de Seq. n°: 51, 49 ou 53), posição 65 da proteína ZmDGATl-2 com teor normal de óleo (isto é, representada pela deleção de nt 193-195 de Id. de Seq. n°: 51, 49 ou 53), posição 66 da proteína ZmDGATl-2 com teor normal de óleo (isto é, representada pela deleção de nt 196-198 de Id. de Seq. n°: 51, 49 ou 53), ou posição 67 da proteína ZmDGATl-2 com teor normal de óleo (isto é, representada pela deleção de nt 199-201 de Id. de Seq. n°: 51, 49 ou 53 conforme aqui mostrado).
[040]Também, neste alinhamento, a mudança polimórfica (inserção de um códon TTC dentro da seqüência codificadora para ZmDGATl-2 (ASK) exposta em Id. de Seq. n°: 47) que resulta em uma inserção do resíduo de fenilalanina dentro da proteína ZmDGATl-2(ASK) está descrita como ocorrendo entre o códon para o resíduo de fenilalanina correspondendo à posição 469 da proteína ZmDGATl-2 com teor normal de óleo e o códon para o resíduo de serina correspondendo à posição 470 da proteína ZmDGATl-2 com teor de óleo normal. Entretanto, dado o estiramento de três resíduos de fenilalanina repetidos dentro da proteína ZmDGATl-2(ASK), a mudança polimórfica (inserção de um códon TTC) poderá ocorrer entre o último nucleotídeo do códon para o resíduo de triptofano correspondente à posição 467 e o primeiro nucleotídeo do códon para o resíduo de fenilalanina correspondente à posição 468 da proteína ZmDGATl-2 com teor normal de óleo (isto é, entre os nucleotídeos (nt) 1401 e 1402 da seqüência codificadora para a proteína ZmDGATl-2 com teor de óleo normal exposta em Id. de Seq. n°: 51, 49 ou 53), entre o último nucleotideo do códon para o resíduo de fenilalanina correspondendo à posição 468 e o primeiro nucleotideo do códon para o resíduo de fenilalanina correspondendo à posição 469 da proteína ZmDGATl-2 com teor de óleo normal (isto é, entre nt 1404 e 1405 de Id. de Seq. n°: 51, 4 9 ou 53) , ou entre o último nucleotideo do códon para o resíduo de fenilalanina correspondendo à 469 e o primeiro nucleotideo do códon para o resíduo de serina correspondendo à posição 470 da proteína ZmDGATl-2 com teor normal de óelo (isto é, entre nt 1407 e 1408 de Id. de Seq. n°: 51, 49 ou 53, conforme aqui mostrado).
[041] A Figura 32 mostra os resultados da análise filogenética de DGATs e seqüências relacionadas. A análise filogenética foi executada usando-se o programa PHYLIP (J. Felsenstein, University of Washington) e exposta usando-se o programa TreeView (Página (1996) Computer Appl. Biosci. 12:357-358). Números de acesso são fornecidos para seqüência pública. As seqüências proprietárias são indicadas por nomes de clone de EST ou por nomes de gene Unicom (PCOs) .
[042] A Figura 33 mostra o alinhamento da seqüência de aminoácido de DGAts e aciltransferases relacionadas. O programa Vector NTI é usado para alinhamentos múltiplos com método CLUSTALW (Higgins e outros (1994) Nucleic Acids Res. 22:4673-4680). Caixas maiores (numeradas 1, 2, 3, 4, 5, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 e 17) indicam domínios de seqüência conservados em todos os DGAT1 da planta. As duas caixas menores (numeradas como 6 e 18) indicam domínios de seqüência únicos para todos os membros do subgrupo DGATl-2.
[043] A Figura 34 fornece um alinhamento da proteína ZmAAPl com outras proteínas conhecidas.
[044] A Figura 35 fornece um alinhamento da proteína ZmPESP com outras proteínas conhecidas.
[045] A Figura 36 fornece um alinhamento da proteína ZmS24 com outras proteínas conhecidas.
[046] A Figura 37 fornece um alinhamento da proteína ZmABCT com outras proteínas conhecidas.
[047] A Figura 38 fornece um alinhamento de seqüência de vários elementos da família do ativador transcricional HAP3. O alinhamento fornece uma seqüência de consenso e também descreve os domínios A, B e C.
[048] A Figura 39 fornece um alinhamento de seqüência de vários domínios B tipo LEC-1 (levemente sombreado) e domínios B tipo não-LEC-1.
[049] A Figura 40 ilustra o mapeamento final de QTL6. O QTL6 com alto teor de óelo/alto teor de ácido oléico foi previamente mapeado para uma região de aproximadamente 195 kb, contendo cinco genes. Para mapear QTL6 também, oito novos marcadores SNP (QTL6SNP7, 8, 9, 13, 14, 15, 16 e 17) dentro desta região foram desenvolvidos com base nas seqüências BAC Mol7 (nem todos os marcadores são mostrados). Aproximadamente 4.000 sementes BC5S1 separadas por QTL6 foram plantas em pequenos potes e foram desenvolvidas em uma estufa. As mudas foram genotipadas por marcadores BAC17 e BAC32 para identificação de recombinantes entre DGAT1-2 e os genes transportadores ABC tipo PDR. Um total de 90 plantas recombinantes foram indentificados e foram depois genotipadas pelos novos marcadores SNP para identificar a localização precisa de hibridizações. As plantas recombinantes foram transferidas para potes regulares e foram auto-polinizadas para produzir sementes BC5S2. Os dados de óleo e ácido oléico foram obtidos de 14 arelha recombinantes criticas conforme descrito nos exemplos aqui abaixo.
[050] A Figura 41 mostra a concentração de óleo no embrião (A) , concentração de óleo na semenete (B) , concentração de ácido oléico (C) e concentração de ácido linoleico (D) para pés de milho transgênicos para o alelo ASKC28IM ou EF09B de DGATl-2. As sementes TI separadas foram classificadas como transgênicas ou cernes nulos usando-se fluorescência vermellha como um marcador. Métodos para análise de óleo e definição de perfil de ácido graxo são conforme descrito nos exemplos aqui abaixo. O % de mudança refere-se à diferença entre as sementes positivas para fluorescência e sementes negativas para fluorescência em linhas transgênicas ou sementes ASKC2IB1 homozigóticas contra sementes homozigóticas EF09B em BC4S2 NILs. Os dados transgênicos representam médias de 10 eventos, 10 transgênicas e 10 sementes nulas analisadas por evento. Os dados de BC4S2 representam as médias de 5 ASKC28IB1 homozigóticas e 5 EF09B NILs homozigóticas, 10 sementes por linha analisada.
[051] A Figura 42 mostra os resultados de um ensaio de atividade de DGAT (A) e acúmulo de TAG em células de levedura (B). ASK, o alelo original de DGATl-2 cDNA isolado de ASKC28IB1 pai (ZmDGATl-2 (ASK) de Id. de Seq. n°:47). EF09B, o alelo original de DGATl-2 cDNA isolado de EF09B pai (ZmDGATl-2 (EF09B) de Id. de Seq. n°:51). O ASK-F, o alelo ASKC28IB1 (Id. de Seq. n°: 47) com o códom para o resíduo F469 do polipeptídeo codificado (ZmDGATl-2(ASK) de Id. de Seq. n°:48) deletado. EF09B+F, o alelo EF09B (Id. de Seq. n°: 51) com uma insenção de um códon TTC entre o códon para F469 e o códon para S470 de Id. de Seq. n°: 52 para restaurar o resíduo de fenilalanina correspondente à inserção F469 em ZmDGAT 1-2 (ASK) de Id. de Seq. n°:48. Os métodos para ensaio de DGAT e a medição da quantidade de TAG são conforme aqui descrito no exemplo aqui abaixo. Os dados da atividade de DGAT são as médias de quatro repetoições. Os dados de TAG são as médias de três repetições.
[052] A Figura 43 mostra a distribuição de alelos DAGT1-2 em consanguíneos de milho selecionados. Os conteúdos de óleo do embrião e do ácido oléico para 73 consanguíneos selecionados foram determinados conforme descrito. O DNA foi extraído de discos de folha usando-se mudas de aproximadamente 3 semanas de vida. Os iniciadores DGAT1-2 (Id. de Seq. n°s: 124/125 e 126/127) foram usados para amplificar por PCR os fragmentos que abrangem as três mudanças de aminoácido na região de terminação-N de DGAT1-2 (ASK) (isto é, V45G; P55S; e as deleções de Q64, Q65, Q66 ou Q67) ou a inserção de fenilalanina na posição 467, 468 ou 469 na terminação-C de DGAT 1-2 (ASK) . Os fragmentos de PCR foram sequenciados para determinação dos alelos.
[053] A Figura 44 demonstra que QTL6 (DGAT 1-2) e FAD2 são aditivos no aumento do conteúdo de ácido oléico. QTL6+/+, alelo ASKC28IB1 homozigótico; QTL6-/-, alelo EF09B homozigótico; FAD2 +/+, alelo favorável homozigótico; FAD2-/-, alelo não favorável homozigótico. A concentração de ácido oléico foi determinada usando-se extração com hexano e GC conforme descrito nos exemplos aqui abaixo. 0 residuo de semente restante da extração com hexano foi usado para isolamento de DNA com Qiagen's DNeasy Plant Mini Kit (Cat. No. 69104). Os alelos DGAT 1-2 e FAD2 foram determinados por amplificação por PCR gene especifica e análise de marcador CAP.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[054] A presente invenção será agora descrita mais completamente aqui após com referência aos exemplos em anexo, que estão mostrados em algumas mas não em todas as modalidades da invenção. Realmente, esta invenção pode ser incorporada em muitas diferentes formas e não deve ser interpretada como limitada às modalidades expostas aqui, em vez disso, estas modalidades são fornecidas de forma que esta divulgação satisfaça as exigências legaus aplicáveis. Números parecidos referem-se a elementos semelhantes por toda a divulgação.
[055] Muitas modificações e outras modalidades da invenção expostas aqui virão à mente daqueles habilitados na técnica à qual esta invenção pertence possuindo o beneficio dos ensinamentos apresentados nas descrições supracitadas. Portanto, deve-se compreender que a invenção não está limitada às modalidades especificas divulgadas e que modificações e outras modalidades são objetivadas para estarem inclusas dentro do escopo das reivindicações em anexo. Embora termos específicos sejam aqui empregados, eles são usados em um sentido genérico e descritivo apenas e não para propósitos de limitação.
[056] Os artigos "um" e "uma" são usados aqui para se referirem a um ou a mais de um (isto é, a pelo menos um) do objeto gramatical do artigo. Por meio de exemplo, "um elemento" significa um elemento ou a mais de um elemento. I. Visão Geral [057]Um "lócus de traço quantitativo" ou "QTL" refere-se a uma localização geneticamente definida para uma coleção de um ou mais genes (alelos) que contribuem para uma característica observada. A presente invenção desenvolveu linhas isogênicas próximas para QTL6, que é um QTL de óleo notável, e demonstrou que o QTL6 é um QTL principal no controle das concentrações de óleo do embrião e concentrações de ácido oléico, e portanto a relação entre ácido oléico e ácido linoleico. Vários métodos e composições para a reprodução e manipulação de QTL6 são fornecidos. As composições compreendem novos loci marcadores que se separam do QTL6, e métodos de emprego destes marcadores nos programas de reprodução de milho assitidos por marcador para identificar os pés de milho e os germoplasmas que possuem conteúdo de óleo aumentado, um conteúdo de ácido oléico aumentado, ou uma relação entre ácido oléico e ácido linoleico aumentada são fornecidos. A presente invenção também mapeia QTL6 a uma região de aproximadamente 195 kb que compreende múltiplos quadros de leitura abertos, que são caracterizados em maiores detalhes abaixo. Os polinucleotídeos e polipeptídeos associados com QTL6 podem ser usados em vários métodos para aumentar o conteúdo de óleo e/ou o conteúdo de ácido oléico em uma planta de interesse, e/ou para aumentar o conteúdo de ácido oléico em relação ao conteúdo de ácido linoléico, e portanto fornecer uma relação entre ácido oléico e ácido linoléico maior. De interesse particupar à presente invenção são os novos loci marcadores que são associados com um alto teor de óleo e/ou alto teor de ácido oléico e/ou alta relação de fenótipo entre ácido oléico e ácido linoléico, e que segregam geneticamente a região de QTL6 que é flanqueada por uma primeira seqüência de borda que compreende os nucleotideos 1-10 de Id. de Seq. n°:2, aqui referida como "borda de BAC05", e uma segunda seqüência de borda que compreende os nucleotideos 477-496 de Id. de Seq. n°:46 aqui referida como "borda de MZA8135". Também de interesse à presente invenção são os novos loci marcadores mapeados dentro uma região também definida dentro desta região de QTL6, onde a região também definida compreende uma primeira seqüência de borda que compreende os nucleotideos 1-20 de Id. de Seq. n°:6 (referida como "borda esquerda de QTL6 de BAC18"; ver Figura 6) e uma segunda seqüência de borda que compreende os nucleotideos 482-501 de Id. de Seq. n°:14 (referida como "borda direita de QTL6 de BAC29"; ver Figura 6) . Também de interesse à presente invenção é um novo lócus marcador mapeado dentro de uma segunda região também definida dentro desta região de QTL6, onde a segunda região também definida compreende uma primeira seqüência de borda que compreende nucleotideos 1-20 de Id. de Seq. n°:10 (referida como "borda esquerda de QTL6 de BAC22"; ver Figura 11) e uma segunda seqüência de borda que compreende os nucleotideos 488-507 de Id. de Seq. n°: 4 (referida como "borda direita de QTL6 de BAC17).
[058]Consequentemente, a presente invenção fornece novas técnicas de reprodução, plantas e partes de planta, junto com nocos polinucleotideos e polipetídeos, cada um dos quais pode ser empregado para aumentar o conteúdo de óleo, aumentar o conteúdo de ácido oléico, e/ou aumentar a relação entre ácido oléico e ácido linoléico em uma palnta ou parte de planta. Conforme aqui usado, a expressão "conteúdo de óleo crescente" inclui qualquer aumento no nivel de óleo na planta ou parte desta planta, por exemplo, na semente ou cerne e/ou no embrião ou germe, ou qualquer combinação destes. Em modalidades especificas, o aumento em óleo ocorre no germe e/ou no cerne. Por exemplo, o conteúdo de óleo aumentado pode compreender um aumento total no conteúdo de óleo na planta ou parte desta planta de cerca de 0,1%, 0,5%, 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 120% ou mais quando comparado a uma planta ou parte desta planta de controle. Alternativamente, o nivel aumentado de óleo pode incluir cerca de 0,5 vez, 1 vez, 2 vezes, 4 vezes, 8 vezes, 16 vezes, 32 vezes ou mais de aumento total no nível de óleo na planta ou parte desta planta quando comparado a um controle de planta ou parte desta planta.
[059]Os níveis dos vários constituintes no óleo podem também ser modulados usando-se os vários métodos e composições da invenção. Por exemplo, a expressão "conteúdo de ácido oléico crescente" inclui qualquer aumento no nível de ácido oléico ou qualquer alteração na relação entre ácido oléico e outros constituintes de óleo em uma planta ou parte desta planta, por exemplo, a semente ou cerne e/ou o embrião ou gerne, ou qualquer combinação destes. Por exemplo, o conteúdo de ácido oléico crescente pode compreender um aumento no nível de ácido oléico total de cerca de 0,1%, 0,5%, 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 120% ou mais quando comparado a uma planta ou parte desta planta de controle. Alternativamente, o nivel aumentado de ácido oléico pode incluir cerca de 0,5 vez, 1 vez, 2 vezes, 4 vezes, 8 vezes, 16 vezes, 32 vezes ou mais de aumento no nivel de ácido oléico na planta ou parte desta planta quando comparado a um controle de planta ou parte desta planta.
[060]A ligação simples delta-12 de ácido oléico (C18:l) pode ser convertida em uma ligação dupla conjugada, produzidno assim ácido linoléico (C18:). Portanto, um conteúdo de ácido oléico crescente pode também modular a relação entre ácido oléico e ácido linoléico em uma planta ou parte desta planta. Desta maneira, os métodos e composições da presente invenção podem ser usados para aumentar a relação entre ácido oléico e ácido linoléico em uma planta ou parte desta planta. Por exemplo, a expressão "relação entre ácido oléico e ácido linoléico crescente" inclui qualquer aumento na relação entre ácido oléico e ácido linoléico em uma planta ou parte desta planta, por exemplo, a semente ou cerne e/ou o embrião ou gerne, ou qualquer combinação destes. Assim, por exemplo, relação entre ácido oléico e ácido linoléico em uma planta ou parte desta planta pode ser aumentada em cerca de 0,1%, 0,5%, 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 120% ou mais quando comparada a uma planta ou parte desta planta de controle. Alternativamente, relação aumentada entre ácido oléico e ácido linoléico pode incluir cerca de 0,5 vez, 1 vez, 2 vezes, 4 vezes, 8 vezes, 16 vezes, 32 vezes ou mais de aumento relação entre ácido oléico e ácido linoléico na planta ou parte desta planta quando comparado a um controle de planta ou parte desta planta. Métodos de análise para os níveis de ácido oléico e o ácido linoléico são conhecidos na técnica. Veja, por exemplo, a Publicação do Pedido de Patente U. S. de número 20050160494, aqui incorporada por raferência integralmente. Usando-se os métodos e composições aqui divulgados, a produção total de óleo pode ser aumentada e/ou as características do óleo podem ser modificadas.
[061] O óleo e/ou os constituintes do óleo, tal como ácido oléico e ácido linoléico, podem ser medidos por qualquer método conhecido na técnica. A fim de se fazer uma determinação da quantidade de óleo nas sementes e/ou a quantidade de ácidos graxos específicos presentes no óleo e suas respectivas concentrações, sementes maduras podem ser trituradas (por exemplo, em uma prensa hidráulica) , e o óleo endógeno pode ser facilmente extraído com hexano ou por quaisquer outras técnicas adequadas de acordo com os procedimentos conhecidos na técnica. Similarmente, qualquer tecido de planta pode ser triturado ou mopido e então extraído com hexano para recuperar o óleo.
[062] O hexano pode ser separado do óleo por evaporação, e a quantidade de óleo restante foi determinada. Os ácidos graxos podem ser determinados seguindo-se a transmetilação. Os ésteres metílicos resultantes dos ácidos graxos podem ser separados e suas concentrações determinadas pelo uso de cromatografia a gás capilar de acodo com os procedimentos operacionais padrões conhecidos na técnica. Além disso, a quantificação do conteúdo de óleo das sementes pode ser executada com métodos convencionais, tais como análise por infravermelho (MR) , imagem por ressonância magnética nuclear (NMR), extração com extrator Soxhlet, extração acelerada com solvente (ASE), extração com microondas, e extração com fluido super critica. A espectroscopia por infravermelho próximo (NIR) tornou-se um método padrão para selecionar amostras de semente sempre que a amostra de interesse for receptiva a esta técnica. As amostras estudadas incluem trigo, milho, soja, canola, arroz, alfafa, aveia e outros. Métodos de medição do óleo e constituintes de óleo em cernes de milho, germe dissecado e endosperma são divulgados, por exemplo, em WO 2005/003312 e WO 02/062129, aqui incorporados por referência integralmente. II. Caracterização de QTL6 (A) Lócus marcador para QTL6 [063] Composições compreendendo marcadores para o lócus QTL6 são fornecidas. Conforme aqui usado, um "marcador genético" é qualquer diferença fenotipica morfológica, bioquímica ou baseada em ácido que revela um polimorfismo de DNA. Exemplos de marcadores genéticos incluem, mas não estão limitados a RFLPs (polimorfismos de comprimento de fragmento por restrição), RAPDs (DNA polimórfico amplificado aleatoriamente), polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs), alozimas, SSRs (repetições de seqüência única) e AFLPs (polimorfismos de comprimento de fragmento por amplificação). O termo "lócus marcador" refere-se a uma localização geneticamente definida de um polimorfismo de DNA. Tais loci marcadores podem ser usados como um ponto de referência quando se identificam geneticamente os loci marcadores.
[064] Um "mapa genético" é uma descrição das relações de ligação genética entre os loci em um ou mais cromossomos (ou grupos de ligação) dentro de uma dada espécie, geralmente descrita de uma forma diagramática ou em tabela. 0 "mapeamento" é o processo de definição das relações de ligação dos loci através do uso de marcadores genéticos, população que segrega os marcadores, e princípios genéticos padrões de frequência de recombinação. Uma "localização no mapa" é uma localização determinada em um mapa genético relativa aos marcadores genéticos ligados onde um marcador específico pode ser encontrado dentro de uma dada espécie.
[065]Os métodos e composições da invenção requerem detecção de pelo menos um polimorfismo ou qualquer combinação dos polimorfismos dentro de um lócus marcador favorável aqui divulgado. O termo "lócus marcador favorável" refere-se a um lócus marcador que se segrega geneticamente com a região de QTL6 aqui divulgada e que está associada com o traço fenotípico da planta desejável de alto conteúdo de óleo e/ou alto conteúdo de ácido oléico e/ou relação entre ácido oléico e ácido linoléico aumentada dentro da planta ou uma ou mais partes de planta desta. Exemplos não limitantes das seqüências correspondentes a estes loci marcadores favoráveis são fornecidos em Id. de Seq. n°s: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46 e 51 com pelo menos um polimorfismo contido neste. Exemplos de polimosfismos específicos dentro de cada lócus marcador favorável da região de QTL6 são identificados na Tabela 2 (loci marcadores não codificadores) e Tabela 3 (lócus marcador compreendendo a seqüência codificadora) nos Exemplos 2 e 4 aqui abaixo. Exemplos não limitantes de seqüências para loci marcadores favoráveis da invenção são expostos em Id. de Seq. n°s: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45 e 47 e o(s) respectivo(s) polimorfismo(s) que ocorre(m) dentro destes loci marcadores favoráveis são mostrados nas Tabelas 2 e 3 aqui abaixo. Veja também os alinhamentos mostrados nas Figuras 7-29 e 31.
[066] Conforme aqui usados, um "alelo de um lócus marcador" é um de uma pluralidade de seqüências de nucleotideo polimórficas em um lócus marcador. Para os propósitos da presente invenção, um "alelo de um lócus marcador favorável da invenção" compreende pelo menos uma das mudanças polimórficas encontradas no lócus marcador favorável. Conseqüentemente, um alelo do lócus marcador favorável pode ter pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais nucleotideos polimórficos encontrados no lócus marcador favorável aqui divulgado. Assim, um alelo de um lócus marcador pode ter pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de seqüência ao lócus marcador favorável aqui divulgado.
[067] No contexto da presente invenção, um lócus marcador pode estar associado com um outro lócus marcador, com algum outro lócus genético (por exemplo, um lócus de alto teor de óleo e/ou um lócus de alto teor de ácido oléico, tal como QTL6) e/ou com um traço (isto é, alto conteúdo de óleo, alto conteúdo de ácido oléico, e/ou alta relação entre ácido oléico e ácido linoléico). Por "associado com " pretende-se dizer que o lócus marcador e o segundo lócus marcador ou o lócus marcador e o lócus genético estão no mesmo grupo de ligação e estão em desequilíbrio de ligação entre si. "Desequilíbrio de ligação" é definido como a segregação não aleatória de alelos em dois ou mais loci. 0 desequilíbrio de ligação portanto descreve uma situação em que a combinação de alelos ou marcadores genéticos ocorre mais freqüentemente em uma população do que seria esperado a partir de uma formação aleatória de haplótipos de alelos basaeados em suas frequências. 0 termo "geneticamente ligado" refere-se aos loci genéticos que estão em desequilíbrio de ligação e foram estatisticamente determinados para não serem classificados independentemente. Os loci geneticamente ligados reunem mais de 50% do tempo.
[068]Conforme aqui usado, um marcador que é geneticamente ligado a um outro marcador do lócus genético estará no mesmo grupo de ligação e tipicamente dentro de 10 centimorgans (cM) entre si. Por exemplo, um lócus marcador da presente invenção está associado com o traço de alto conteúdo de óleo e/ou alto conteúdo de ácido oléico e/ou relação aumentada entre ácido oléico e ácido linoleico se o marcador e a seqüência que confere o traço fenotípico de alto conteúdo de óleo e/ou alto conteúdo de ácido oléico e/ou relação aumentada entre ácido oléico e ácido linoleico não estão mais de 10 cM, 9 cM, 8 cM, 7 cM, 6 cM, 5 cM, 4 cM, 3 cM, 2 cM, 1 cM, 0,75 cM, 0,5 cM, 0,25 cM afastadas no mesmo grupo de ligação. Isto é, os dois elementos genéticos associados passam por recombinação durante a meiose entre si a uma frequência de menos de ou igual a cerca de 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,75%, 0,5%, 0,25% ou menos. Espera-se que cada um dos marcadores identificados esteja em proximidade física ou genética (resultanto na ligação física e/ou genética) em relação a um elemento genético (QTL6) que contribui para ura conteúdo de óleo aumentado e/ou conteúdo de ácido oléico aumentado e/ou relação entre ácido oléico e ácido linoléico aumentada.
[069] Conforme aqui usado, o termo "intimamente ligado" significa que a recombinação entre dois lóci ligados ocorre com uma frequência de cerca de 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,75%, 0,5%, 0,25% ou menos. Em outras palavras, os loci intimamente ligados co-segregam pelo menos 90% do tempo. Assim, os loci marcadores intimamente ligados da invenção, são suficientemente próximos ao traço que confere conteúdo de óleo aumentado e/ou conteúdo de ácido oléico aumentado e/ou relação aumentada entre o ácido oléico/ácido linoléico de forma que eles podem ser usados como um instrumento de previsão para o próprio traço.
[070] Em uma modalidade, o lócus marcador favorável geneticamente ligado ao QTL6 compreende o polinucleotideo exposto em qualquer uma das Id. de Seq. n°s: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43 e 45. Os loci marcadores favoráveis expostos em Id. de Seq. n°s: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43 e 45, que estão associados com o traço fenotipico de alto conteúdo de óleo e/ou alto conteúdo de ácido oléico e/ou relação aumentada entre o ácido oléico e ácido linoléico, estão alinhados nas Figuras 7-29 com a seqüência para o lócus marcador correspondente para a linha consanguinea de milho EF09B (teor normal de óleo). A presente invenção também fornece alelos de lócus marcador geneticamente ligado a QTL6.
[071] Em outras modalidades, o lócus marcador favorável é um ácido nucleico expressado que está associado com o traço fenotipico de alto conteúdo de óleo desejável e/ou o alto conteúdo de ácido oléico e/ou relação aumentada entre o ácido oléico/ácido linoléico. Em ainda outras modalidades, o lócus marcador favorável está dentro do polinucleotideo codificado DGTA, por exemplo, dentro do polinucleotideo codificando DGAT1-2. Por exemplo, o lócus marcador favorável pode compreender um polimorfismo no polinucleotideo codificando ZmDGATl-2 (por exemplo, a seqüência codificadora exposta em Id. de Seq. n°:51) onde a mudança polimórfica à seqüência codificadora de ZmDGATl-2 resulta em uma substituição do resíduo de glicina pelo resíduo de serina na posição do aminoácido correspondente ao resíduo 45 de Id. de Seq. n°:52; uma substituição do resíduo de serina pelo resíduo de prolina na posição do aminoácido correspondente ao resíduo 55 de Id. de Seq. n°:52; uma deleção do resíduo de glutamina correspondente àquela posição do aminoácido 64, 65, 66 ou 67 de Id. de Seq. n°:52; e/ou uma inserção de um resíduo de fenilalanina em uma posição localizada entre um par de resíduos, onde o par de resíduos corresponde a um par de resíduos dentro de Id. de Seq. n°:52 selecionado a partir do grupo consistindo de: (a) o resíduo de triptofano na posição 467 do aminoácido de Id. de Seq. n°:52 e o resíduo de fenilalanina na posição 468 do aminoácido de Id. de Seq. n°:52, (b) o resíduo de fenilalanina na posição 468 do aminoácido de Id. de Seq. n°: 52 e o resíduo de fenilalanina na posição 469 do aminoácido de Id. de Seq. n°:52, e (c) o resíduo de fenilalanina na posição 469 do aminoácido de Id. de Seq. n°:52. Um exemplo não limitante de um lócus marcador favorável dentro de um polinucleotideo codificando DGAT 1-2 é uma seqüência compreendendo a seqüência exposta em Id. de Seq. n°:47, que codifica a proteína ZmDGATl-2(ASK) exposta em Id. de Seq. n°:48. As mudanças polimórficas específicas para a seqüência codificadora para a proteína ZmDGATl-2(ASK) de Id. de Seq. n°:48 são exemplificados na Fiqura 31 (ver também a descrição para esta figura fornecida aqui acima), e descrito na Tabela 3 aqui abaixo. Ver também o alinhamento da proteína ZmDGATl-2(ASK) com a proteína ZmDGATl-2 a partir de três linhas consanguíneas de milho com teor de óleo normal (Figura 30) e a descrição para esta figura aqui fornecida acima.
[072]Qualquer um habilitado na técnica irá avaliar que os loci marcadores aqui fornecidos e discutidos são meramente exemplares e que outros numerosos loci marcadores podem ser identificados com base na ligação genética e/ou proximidade física de um cromossomo aos loci marcadores aqui fornecidos. Assim as composições e métodos da presente invenção aqui descritos não são objetivados para serem limitados aos loci marcadores favoráveis compreendendo Id. de Seq. n°s:2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46 e 51 com pelo menos um polimorfismo contido neste, ou aos exemplos de seqüências para estes loci marcadores favoráveis conforme exposto em Id. de Seq. n°s: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, e 47, mas também incluem marcadores adicionais ligados a ele. Adicionalmente, embora alelos favoráveis dos loci marcadores exemplares estejam aqui divulgados, será facilmente avaliado por aqueles habilitados na técnica, que os alelos favoráveis dos loci adicionais ligados aos loci marcadores aqui descritos podem ser determinados sem experimentação indevida e empregados nas composições e métodos da presente invenção. Conseqüentemente, qualquer lócus marcador ligado aos loci marcadores aqui descritos e localizados em um segmento de cromossomo identificado pelos loci marcadores da invenção, pode também ser usado para identificar este segmento de cromossomo, e para definir o genótipo de uma planta de interesse, ou para selecionar as formas alélilas favoráveis de um segmento de cromossomo correlacionado com o traço fenotipico de alto conteúdo de óleo e/ou alto conteúdo de ácido oléico e/ou relação aumentada entre o ácido oléico e o ácido linoléico.
[073]Pelo menos um dos polimorfismos presentes em um ou mais loci marcadores favoráveis aqui divulgados pode ser usado para identificar uma primeira planta de milho ou um primeiro germoplasma de milho que possui um álto conteúdo de óleo ou um conteúdo de ácido oléico aumentado ou uma relação aumentada entre o ácido oléico/ácido linoléico, e portanto compreende o traço fenotipico de alto conteúdo de óleo e/ou alto conteúdo de ácido oléico e/ou uma relação aumentada entre o ácido oléico/ácido linoléico. Desta maneira, a presente invenção fornece tal método de identificação, compreendendo detectar no primeiro pé de milho ou no primeiro germoplasma de milho pelo menos um polimorfismo dentro de um ou mais dos loci marcadores favoráveis que estão associados com o traço de conteúdo de óleo aumentado, conteúdo de ácido oléico aumentado e/ou relação aumentada entre o ácido oléico/ácido linoléico. Nas modalidades especificas, os polimorfismos do marcador de um ou mais lócus marcador podem ser empregados. Assim, aspectos da invenção usam uma coleção de diferentes loci marcadores. 0 número de loci marcadores em tal coleção irá variar e será, por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 ou maior.
[074] Vários métodos são conhecidos na técnica para detectar o lócus marcador favorável da presente invenção. A detecção de pelo menos um polimorfismo do lócus marcador favorável pode incluir, mas não está limitada à detecção de um ou mais dos polimorfismo por polimorfismo de comprimento de fragmentos de restrição (RFLP), extensão de base única, eletroforese, alinhamento de seqüência, hibridização de oligonucleotideo alelo especifico (ASO), RAPD, detecção de seqüências variáveis amplificadas do genoma de planta, detecção de repetições de seqüência simples (SSRs), e detecção de polimorfismo de nucleotideo simples (SNPs), etc. Ensaios de marcador incluem extensão de base única conforme divulgado na Patente U. S. de número 6.013.431 e discriminação alélica onde a atividade da endonuclease libera um corante repórter a partir de um marcador de hibridização conforme divulgado na Patente U. S. de número 5.538.848, cujas divulgações estão aqui incorporadas por referência.
[075] Iniciadores de amplificação para amplificar os loci marcadores favoráveis e marcadores adequados para detectar os loci marcadores favoráveis são fornecidos. As Figuras 7-29 e Id. de Seq. n°s: 68-115 fornecem iniciadores específicos que podem ser usados para amplificar os respectivos loci marcadores da invenção. Qualquer um habilitado na técnica irá reconhecer que outras seqüências em qualquer um dos lados dos dados iniciadores podem ser usadas no lugar dos dados iniciadores, contanto que os iniciadores possam amplificar o alelo desejado de um lócus marcador favorável da invenção. Além disso, marcadores para estes loci favoráveis são também fornecidos. Assim, a presente invenção não é limitada aos iniciadores e marcadores especificamente aqui citados.
[076]Em uma modalidade, a presente invenção fornece um polinucleotideo isolado compreendendo pelo menos 12 nucleotideos consecutivos, onde a referida seqüência dos referidos 12 nucleotideos consecutivos compreende pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100% de identidade de seqüência em relação ao complemento de um alelo de um lócus marcador favorável compreendendo uma seqüência exposta em Id. de Seq. n°: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45 ou 47 onde o referido polinucleotideo pode detectar um polimorfismo em um lócus marcador favorável associado com alto conteúdo de óleo, alto conteúdo de ácido oléico e/ou alta relação entre o ácido oléico/ácido linoléico. Em algumas modalidades, o polinucleotideo isolado compreende pelo menos 12 nucleotideos consecutivos da seqüência exposta em Id. de Seq. n°: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45 ou 47 . Em outras modalidades, o polinucleotideo isolado compreende um marcador detectável. O marcador detectável pode ser, por exemplo, um elemento radioativo ou um corante. Em algumas modalidades, o iniciador ou marcador da invenção também compreendem um marcador fluorescente e uma têmpera, por exemplo, para uso nos ensaios de marcador de hibridização dos tipos conhecidos como ensaios Taqman, disponíveis a partir de Applied Biosystems (Foster City, Califórnia). (B) Reprodução de Planta [077] Os loci marcadores favoráveis da invenção podem ser usados na seleção de plantas assistida por marcador que possuem o fenótipo de alto teor de óleo desejado, e/ou fenótipo de alto teor de ácido oléico e/ou fenótipo de alto teor de ácido/baixo teror de ácido linoléico (isto é, relação aumentada entre o ácido oléico/ácido linoléico) e subsequente reprodução destas plantas selecionadas para obter linhas genéticas de planta e/ou variedades possuindo o fenótipo de alto teor de óleo desejado e/ou fenótipo de alto teor de ácido oléico e/ou fenótipo de alto teor de ácido/baixo teror de ácido linoléico.
[078] O termo "germoplasma" refere-se a um indivíduo, um grupo de indivíduos, ou um clone representando um genótipo, variedade, espécie ou cultura, ou o material genético deste.
[079] Um "genótipo" é a constituição genética de um indivíduo (ou um grupo de indivíduos) em um ou mais loci genéticos. Genótipo é definido pelo(s) alelo(s) de um ou mais loci conhecidos que o indivíduo herdou de seus pais. Um "halótipo" é o genótipo de um indivíduo em uma pluralidade de loci genéticos. Tipicamente, os loci genéticos descritos por um halótipo são fisicamente e genéticamente ligados, isto é, no mesmo segmento do cromossomo.
[080] Um indivíduo é "homozigoto" se o indivíduo possui apenas um tipo de alelo em um dado lócus (por exemplo, um indivíduo diplóide com duas cópias do mesmo alelo em um lócus). Um indivíduo é "heterozigoto" se mais de um tipo de alelo está presente em um dado lócus (por exemplo, um indivíduo diplóide com uma cópia de cada um dos dois alelos diferentes). 0 termo "homogeneidade" indica que elementos de um grupo possuem o mesmo genótipo em um ou mais loci específicos. Contrariamente, o termo "heterogeneidade" é usado para indicar que os indivíduos dentro do grupo diferem em genótipo em um ou mais loci específicos.
[081] Uma "linha" ou "cepa" é um grupo de indivíduos de ascendência idêntica que são geralmente consanguíneos em algum grau e que são geralmente isogênicos ou quase isogênicos.
[082] A expressão linhas "quase isogênicas" refere-se a linhas que são geneticamente similares entre si exceto em um ou em um pequeno número de loci genéticos (por exemplo, em 1, 2 ou cerca de 5 a cerca de 10 loci genéticos específicos). Estas podem ser criadas conforme descrito para sublinhas baseadas em marcador ou baseadas em diferenças para qualquer traço qualitativo que pode servir como um marcador genético efetivo. O percentual de similaridade entre linhas quase isogênicas é uma função da similaridade dos pais da cruza original e a geração em que a auto-polinização é executada. Em média, o parentesco entre os elementos de uma dada linha consanguínea aumenta 50% com cada ciclo de procriação consanguínea, devido a um aumento de 50% na homozigosidade em cada ciclo de procriação consanguínea. A similaridade percentul pode ser mais precisamente determinada com marcadores genéticos que se estendem sobre o genoma. Em alguns casos, linhas quase isogânicas diferem entre si em um lócus genético definido.
[083] Uma "linha elite" ou "cepa elite" é uma linha agronomicamente superior que resultou de muitos ciclos de reprodução e seleção para performance agronômica superior. Similarmente, um "germoplasma elite" é um germoplasma agronomicamente superior, tipicamente derivado de e/ou capaz de dar origem a uma planta com performance agronômica superior, tal como uma linha elite de milho existente ou recentemente desenvolvida.
[084] Linhas de milho consanguineas são tipicamente desenvolvidas para uso na produção de híbridos de milho e para uso como germoplasma em populações de reprodução para a criação de novas e distintas linhas de milho consanguineas. Linhas de milho consanguineas são muitas vezes usadas como alvos para a introgressão de novos traços através de técnicas de reprodução tradicionais e/ou técnicas de introgressão molecular. Linhas de milho consanguineas necessitam ser altamente homogêneas, homozigóticas e reproduzíveis para serem úteis como ascendentes de híbridos comerciais. Muitos métodos analíticos estão disponíveis para determinar a homozigosidade e estabilidade fenotípica de linhas consanguineas.
[085] A expressão "plantas híbridas" refere-se a plantas que resultam de um crizamento entre indivíduos geneticamente diferentes.
[086] O termo "cruzado" ou "cruzamento" no contexto desta invenção significa a fusão de gametas, por exemplo, através de polinização para produzir descendência (isto é, células, sementes ou plantas) no caso de plantas. O termo abrange cruzamentos sexuais (a polinização de uma planta por outra) e no caso de plantas, auto-polinização, isto é, quando o pólen e, o óvulo são da mesma planta.
[087] 0 termo "introgressão" refere-se à transmissão de um alelo desejado de um lócus genético de uma base genética à outra. Em um método, os alelos desejados podem ser introgredidos através de um cruzamento sexual entre dois ascendentes, onde pelo menos um dos ascendentes possui o alelo desejado em seu genoma. 0 alelo desejado pode ser um lócus marcador, um QTL, um transgene ou semelhante. Em algumas modalidades da invenção, o alelo desejado é um aleno de um lócus marcador favorável aqui divulgado. i. Seleção Assistida por Marcador [088] A "Seleção Assistida por Marcador" ou "MAS" refere-se à prática de selecionar fenótipos desejados entre elementos de uma população de cruzamento usando-se marcadores genéticos. 0 objetivo principal de qualquer programa de reprodução é combinar tantos alelos favoráveis quanto possível em variedades elite de germoplasma que são geneticamente superiores (com relação a um ou mais traços agronômicos) em relação a seus ancestrais. Os marcadores aqui fornecidos identificam segmentos cromossômicos, isto é, regiões genômicas, e alelos (formas alélicas) da região de QTL6 que estão associados com o traço fenotípico de alto teor de óleo e/ou alto teor de ácido oléico e/ou alto teor de ácido oléico/baixo teor de ácido linoléico. Conseqüentemente, estes marcadores podem ser usados para seleção de plantas assistida por marcadores, por exemplo, pés de milho, com o traço fenotípico de alto teor de óleo e/ou alto teor de ácido oléico e/ou alto teor de ácido oléico/baixo teor de ácido linoléico (isto é, relação aumentada entre o ácido oléico/ácido linoléico). Por exemplo, em um cruzamento entre ascendentes que complementam alelos favoráveis no loci alvo, a descendência pode ser selecionada a qual inclui mais alelos favoráveis que qualquer um dos ascendentes.
[089] A seleção assistida por marcador (MAS), empregando os marcadores da presente invenção, e os segmentos cromossômicos que eles identificam, é útil no contexto de um programa de reprodução de milho para aumentar o conteúdo de óleo e/ou conteúdo de ácido oléico e/ou a relação entre o ácido oléico e ácido linoléico de uma planta ou parte desta planta. A seleção fenotípica para um traço de interesse, tal como alto conteúdo de óleo, alto conteúdo de ácido oléico ou relação aumentada entre o ácido oléico/ácido linoléico para grandes números de amostras pode ser cara, assim como consumidora de tempo. Além disso, a seleção fenotípica apenas é muitas vezes não confiável devido aos efeitos de epistasia e contribuições não genéticas (por exemplo, ambientais) ao fenótipo. MAS oferece a vantagem sobre a avaliação de campo porque pode ser executada em qualquer momento do ano sem levar em consideração a estação de crescimento ou estágio de desenvolvimento. Além disso, MAS facilita a avalaiação de organismos desenvolvidos em regiões díspares ou sob condições diferentes.
[090] Um criador de habilidade comum, desejando cultivar plantas com conteúdo de óleo aumentado e/ou conteúdo de ácido oléico aumentado e/ou relação aumentada entre o ácido oléico e ácido linoléico, pode aplicar os métodos para MAS aqui descritos, usando-se, por exemplo, o lócus marcador favorável exemplar fornecido aqui ou os loci marcadores ligados localizados aos segmentos de cromossomo identificados pelos loci marcadores favoráveis aqui fornecidos, para originar linhas de planta com conteúdo de óleo aumentos e/ou conteúdo de ácido oléico aumentado e/ou relação aumentada entre o ácido oléico e ácido linoléico.
[091]Alelos marcadores genéticos, por exemplo, os loci marcadores exemplares expostos em Id. de Seq. n°s: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45 e 47 e alelos destes compreendendo um ou mais dos respectivos polimorfismos identificados nas Tabelas 2 e 3 aqui abaixo, marcadores ligados, e QTL, identificamndo os segmentos de cromossomo que abrangem os elementos genéticos que são importantes para alto conteúdo de óleo e/ou alto conteúdo de ácido oléico e/ou relação aumentada entre o ácido oléico e ácido linoléico, são usados para identificar plantas que contêm um genótipo desejado em um ou mais loci, e que se espera que transfiram o genótipo desejado, junto com um fenótipo desejado a sua prole. Os alelos marcadores (ou alelos de QTL) podem ser uados para identificar plantas que contêm um genótipo desejado em um lócus, ou em vários loci não ligado ou ligado (por exemplo, um haplótipo) e que se espera que transfira o genótipo desejado, junto com um fenótipo desejado a sua prole. Similarmente, identificando-se as plantas que carecem do alelo desejado, as plantas com um fenótipo indesejável, por exemplo, plantas com um teor de óleo não muito alto e/ou fenótipo com teor de ácido oléico não muito alto, ou fenótipo com teor de óleo normal (quando comparado ao amarelo #2), podem ser identificadas, e, por exemplo, eliminadas de cruzamentos subsequentes. Será avaliado que para os propósitos de MAS, o termo marcador pode abranger tanto os loci marcadores quanto os loci de QTL, uma vez que ambos podem ser usados para indentificar plantas com um fenótipo desejado.
[092]Por exemplo, MAS pode ser usado para desenvolver linhas ou cepas de milho e germoplasma de milho com alto conteúdo de óleo e/ou alto conteúdo de ácido oléico e/ou relação aumentada entre o ácido oléico e ácido linoléico identificando-se as formas alélicas favoráveis dos segmentos de cromossomo mostrados como sendo importantes, por exemplo, que incluem um elemento genético, para alto conteúdo de óleo e/ou alto conteúdo de ácido oléico. Desta maneira, os loci marcadores favoráveis aqui divulgados podem ser empregados como previsores para o traço de alto teor de óleo e/ou o traço de alto teor de ácido oléico, e assim ser previsores para o traço fenotipico de alto teor de ácido oléico/baixo teor de ácido linoléico (isto é, relação aumentada entre o ácido oléico e ácido linoléico). Resumidamente, os pés de milho ou germoplasma podem ser selecioandos por um ou mais loci marcadores favoráveis ou alelos de loci marcadores favoráveis que se correlacionam positivamente com o alto teor de óleo e/ou alto conteúdo de ácido oléico, e/ou relação aumentada entre o ácido oléico e ácido linoléico, sem verdadeiramente dar origem ao milho através de seu ciclo de vida e executar avaliações fenotipicas (isto é, medir o alto teror de óleo e/ou alto conteúdo de ácido oléico e/ou relação aumentada entre o ácido oléico/ácido linoléico). Conforme discutido acima, a presente invenção fornece meios para identificar plantas, particularmente pés de milho, que possuem um conteúdo de óleo aumentado e/ou um conteúdo de ácido oléico aumentado e/ou uma relação aumentada entre o ácido oléico e ácido linoléico através da identificação de plantas que possuem um lócus marcador favorável exposto em Id. de Seq. n°: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46 ou 51 com pelo menos um polimorfismo neste, por exemplo, o lócus marcador favorável divulgado em Id. de Seq. n°: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45 ou 47 ou um alelo deste compreendendo um ou mais dos polimorfismos aqui identificados (ver, por exemplo, as Tabelas 2 e 3 aqui abaixo). Similarmente, em outras modalidades, os pés de milho podem ser selecionados contra se eles possuem um ou mais loci marcadores que se correlacionam negativamente com alto teor de óleo e/ou alto conteúdo de ácido oléico e/ou relação aumentada entre o ácido oléico e ácido linoléico. Além disso, estes loci marcadores podem ser intregredido em qualquer base genômica desejada, germoplasma, linha, variedade etc., como parte do programa de seleção assistido por marcador projetado para aumentar o conteúdo de óleo e/ou o conteúdo de ácido oléico, ou para aumentar a relação entre ácido oléico e ácido linoléico no milho.
[093]Resumidamente, na seleção assitida por marcador, uma amostra de tecido é tomada de um primeiro pé de milho ou de um primiro germoplasma de milhoe é selecionada para determinar se o primeiro pé de milho ou o primeiro germoplasma de milho compreende um lócus marcador apropriado ou alelo deste que está correlacionado com alto conteúdo de óleo e/ou alto conteúdo de ácido oleico e/ou relação aumentada entre o ácido oléico e ácido linoléico. Os pés de milho ou germoplasma de milho possuindo o lócus marcador desejado são selecionados e cruzados com um segundo pé de milho ou germoplasma.
[094] Em ainda outras modalidades, os loci marcadores desejados ou alelos deste são introgredidos em um segundo pé de milho ou um segundo germoplasma de milho pra produzir um pé de milho ou germoplasma de milho introgredido. Em modalidades especificas, o pé de milho introgredido ou germoplasma apresenta um conteúdo de óleo aumentado, um conteúdo de ácido oléico aumentado ou uma relação aumentada entre o ácido oléico e ácido linoléico quando comparados ao segundo pé de milho ou germoplasma.
[095] Será avaliado que plantas positivas para um ou mais loci marcadores favoráveis da invenção podem ser selecionados e cruzados de acordo com qualquer protocolo de reprodução relevante ao programa de reprodução particular. Conseqüentemente, a prole pode ser gerada de uma planta selecionada pelo cruzamento da planta selecionada para uma ou mais plantas selecionadas na base do mesmo marcador ou de um marcador diferente, por exemplo, um marcador diferente correlacionando-se com alto conteúdo de óleo e/ou alto conteúdo de ácido oléico e/ou relação aumentada entre o ácido oléico e ácido linoléico, ou um fenótipo diferente de interesse, por exemplo, resistência a uma doença particular. Alternativamente, uma planta selecionada pode ser retrocruzada com um ou ambos os progenitores. O retrocruzamento é freqüentemente feito para o propósito de introgredir um ou alguns loci de um progenitor doador, por exemplo, um progenitor doador compreendendo germoplasma exótico, em uma outra base genética diferente do prohenitor recorrente (tipicamente, uma elite).
[096] Quanto mais ciclo de retrocruzamento são executados, maior a contribuição genética do progenitor recorrente à variedade resultante. Uma planta selecionada pode também ser retrocruzada, por exemplo, a uma planta ou linha não presete em sua genealogia. Tal planta pode ser selecionada entre uma população de interesse para uma rodada de análise prévia, ou pode ser introduzida novamente no progroma de cruzamento. Uma planta positiva para um marcador desejado pode também ser auto-cruzada para criar uma linha de cruzamento verdadeira com o mesmo genótipo. ii. Uso de conteúdo de ácido oléico para monitorar e confirmar a presença de QTL6 [097] Conforme notato nos exemplos aqui abaixo, a concentração de ácido oléico mostra um maior aumento que o conteúdo de óleo dentro de pés de milho que portam a região de QTL6 de alto teor de óleo/alto teor de ácido oléico favorável aqui descrita. Este traço fenotipico pode ser usado para monitorar e confirmar a presença de um lócus marcador favorável da invenção, e assim prever se um pé de milho ou germoplasma de milho terá o traço desejável de alto conteúdo de óleo e/ou relação aumentada entre o ácido oléico e ácido linoléico.
[098] Em algumas modalidades, o lócus marcador favorável a ser detectado está dentro do polinucleotideo codificando DGTA, por exemplo, dentro do polinucleotideo codificando DGATl-2. Desta forma, o lócus marcador favorável a ser detectado pode compreender um polimorfismo no polinucleotídeo codificando ZmDGATl-2 (por exemplo, a seqüência codificadora exposta em Id. de Seq. n°:51) onde a mudança polimórfica à seqüência codificadora de ZmDGATl-2 resulta em uma substituição do resíduo de glicina pelo resíduo de serina na posição do aminoácido correspondente ao resíduo 45 de Id. de Seq. n°:52; uma substituição do resíduo de serina pelo resíduo de prolina na posição do aminoácido correspondente ao resíduo 55 de Id. de Seq. n°:52; uma deleção do resíduo de glutamina correspondente àquela posição do aminoácido 64, 65, 66 ou 67 de Id. de Seq. n°:52; e/ou uma inserção de um resíduo de fenilalanina em uma posição localizada entre um par de resíduos, onde o par de resíduos corresponde a um par de resíduos dentro de Id. de Seq. n°:52 selecionado a partir do grupo consistindo de: (a) o resíduo de triptofano na posição 467 do aminoácido de Id. de Seq. n°:52 e o resíduo de fenilalanina na posição 468 do aminoácido de Id. de Seq. n°:52, (b) o resíduo de fenilalanina na posição 468 do aminoácido de Id. de Seq. n°: 52 e o resíduo de fenilalanina na posição 469 do aminoácido de Id. de Seq. n°:52 e (c) o resíduo de fenilalanina na posição 469 do aminoácido de Id. de Seq. n°:52 e o resíduo de serina na posição 470 do aminoácido de Id. de Seq. n°:52. Um exemplo não limitante de um lócus marcador favorável dentro de um polinucleotídeo condificanto DGATl-2 é uma seqüência compreendendo a seqüência exposta em Id. de Seq. n°:47, que codifica a proteína ZmDGATl-2(ASK) exposta em Id. de Seq. n°:48.
[099]Assim, a presente invenção fornece um método para detectar a presença de um ou mais lócus marcador favorável da invenção, e assim identificar a presença da região de QTL6 aqui descrita, em um pé de milho ou germoplasma de milho, onde o método compreende determinar a concentração de ácido oléico da planta ou germoplasma, particularmente dentro da semente ou embrião. Desta maneira, uma concentração de ácido oléico na semente ou embrião de pelo memos 35% (isto é, 35% ou mais do óleo da semente ou embrião são representados pelo ácido oléico) será preditiva de que o pé de milho ou germoplasma de milho provavelmente compreendem um ou mais loci marcadores favoráveis da invenção, e portanto a região de QTL6 desejada aqui definida, e portanto será beneficamente continuada no processo de reprodução e seleção. Alternativamente, uma concentração de ácido oléico na semente ou embrião de memos de 35% (isto é, o ácido oléico representa menos de 35% do óleo da semente ou embrião) será preditiva de que o pé de milho ou germoplasma de milho não portam a região de QTL6 desejada em seu genoma.
[100]Esta etapa de seleção de ácido oléico pode ser também suplementada com seleções genômicas para a presença de um ou mais loci marcadores favoráveis da região de QTL6 descrita aqui, e portanto a presença da região de QTL6 desejada. Em um tal exemplo, a presença da região de QTL6 desejada é confirmada pela detecção da presença da inserção do códon TTC dentro da seqüência codificadora de ZmDGAT 1-2 que resulta na inserção de Phe467, Phe468 ou Phe469 na proteína ZmDGAT 1-2(ASK). Isto pode ser alcançado, por exemplo, pela amplificação de um fragmento de DNA em torno dete códon usando Id. de Seq. n°:126 e 127, conforme descrito nos Exemplos 3 e 13 aqui abaixo. (C) Polinucleotídeos e/ou Polipeptídeos Associados com QTL6 [101]A presente invenção fornece plantas ou partes de planta que têm estavelmente incorporado em seu genoma um polinucleotideo heterólogo compreendendo pelo menos uma sequência associada ao alto conteúdo de óleo e/ou pelo menos uma seqüência associada ao alto conteúdo de ácido oléico operativamente ligada a um promotor ativo na planta ou parte desta planta, onde a referida seqüência associada ao alto conteúdo de óleo ou a referida seqüência associada ao alto conteúdo de ácido oléico é derivada de uma seqüência de nucleotideo genômico geneticamente ligada a pelo menos um alelo de um ou mais loci marcadores favoráveis que estão associados com o alto conteúdo de óleo e/ou alto conteúdo de ácido oléico, e/ou relação aumentada entre o ácido oléico e ácido linoléico de uma planta ou parte desta planta. Em algumas modalidades, os loci marcadores favoráveis são geneticamente ligados com uma região de QTL6 que é flanqueada por uma primeira seqüência de borda que compreende os nucleotideos de 1-20 de Id. de Seq. n°:2, e uma segunda seqüência de borda que compreende os nucleotideos 477-496 de Id. de Seq. n°:46. Em outras modalidades, os loci marcadores favoráveis são geneticamente ligados com uma região também definida desta região de QTL6, onde a região também definida é flanqueada por uma primeira seqüência de borda que compreende os nucleotideos de 1-20 de Id. de Seq. n°:6,e uma segunda seqüência de borda que compreende os nucleotideos de 4 82-501 de Id. de Seq. n°: 14. Em ainda outras modalidades, os loci marcadores favoráveis são geneticamente ligados com uma segunda também definida regição desta região de QTL6, onde a segunda região também definida é flanqueada por uma primeira seqüência de borda que compreende os nucleotideos de 1-20 de Id. de Seq. n°: 10, e uma segunda seqüência de borda que compreende os nucleotideos de 488-507 de Id. de Seq. n°:4. Esta segunda região também definida, que reside em um gene único, DGAT1-2, controla tanto as concentrações de óleo quanto de ácido oléico no embrião. É reconhecido que os loci marcadores favoráveis da invenção podem compreender seqüências que não são codificadoras, por exemplo, RNA não codificador que funciona sem ser traduzido em uma proteína, também referido como pequeno RNA (sRNA), incluindo microRNAs (miRNAs) e pode compreende seqüência codificadora, por exemplo, um quadro de leitura aberto, conforme notado aqui acima.
[102]Em algumas modalidades, os loci marcadores compreendem uma seqüência selecionada a partir do grupo consistindo das seqüências expostas em Id. de Seq. n°:2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46 e 51 com pelo menos um polimorfismo neste que confere ou está associado com o alto conteúdo de óleo e/ou alto conteúdo de ácido oléico e/ou relação aumentada entre o ácido oléico e ácido linoléico de uma planta ou parte desta planta. Exemplos não limitantes destes polimorfismosn estão divulgados na Tabela 2 e 6 aqui abaixo. Em algumas destas modalidades, os loci marcadores favoráveis incluem o lócus marcador exposto em Id. de Seq. n°:4 com pelo menos um polimorfismo ocorrendo em uma posição de nucleotídeo (nt) dentro de Id. de Seq. n°:4 selecioada a partir do grupo consistindo de nt 28, 204, 256, 302, 305, 341, 429, 461, e qualquer combinação destes; o lócus marcador exposto em Id. de Seq. n°:6 com pelo menos um polimorfismo ocorrendo em uma posição nt dentro de Id. de Seq. n°:6 selecionado a partir do grupo consistindo de nt 43, 74, 208, 224 e qualquer combinação destes; o lócus marcador exposto em Id. de Seq. n°:8 com pelo menos um polimorfismo ocorrendo a uma posição nt dentro de Id. de Seq. n°: 8 selecionada a partir do grupo consistinde de 25, 55, 88, 100, 195, 223, 238, 242, 255, 279, 306, 307, 345, 399, e qualquer combinação destes; o lócus marcador exposto em Id. de Seq. n°: 10 com pelo menos um polimorfismo ocorrendo a uma posição nt dentro de Id. de Seq. n°:10 selecionada selecionada de nt 40, 41, 88, 89, 126, 134, 146, 218 e qualquer combinação destes; o lócus marcador exposto em Id. de Seq. n°: 12 com pelo menos um polimorfismo ocorrendo em uma posição nt dentro de Id. de Seq. n°: 12 selecionada a partir de nt 128, 195, 256, 257, 293, 294, 295, 296, 327, qualquer combinação destes; o lócus marcador exposto em Id. de Seq. n°: 14 com pelo menos um polimorfismo ocorrendo em uma posição nt dentro de Id. de Seq. n°: 14 selecionada a partir de nt 262, 311, e qualquer combinação destes; o lócus marcador exposto em Id. de Seq. n°: 16 com pelo menos um polimorfismo ocorrendo em uma posição nt 428 de Id. de Seq. n°: 16; o lócus marcador exposto em Id. de Seq. n°s: 18 com pelo menos um polimorfismo ocorrendo em uma posição nt dentro de Id. de Seq. n°: 18 selecionada a partir de nt 119, 396, 420, e qualquer combinação destes; o lócus marcador exposto em Id. de Seq. n°: 20 com pelo menos um polimorfosmo ocorrendo em uma posição nt dentro de Id. de Seq. n°:20 selecionado a partir de nt 194, 258, 259, 260, 365, 366, 489, e qualquer combinação destes; o lócus marcador exposto em Id. de Seq. n°:22 com pelo menos um polimorfosmo ocorrendo em uma posição nt dentro de Id. de Seq. n°:22 selecionada a partir de nt 48, 50 ,56, 60, 63, 101, 133, 166, 170, 179, 181, 206, 207, 211, 231, 237, 255, 273, 282, 294, 312, 324, 343, 345, 358, 377, 381, 385, 387, 404, e qualquer combinação destes; o lócus marcador exposto em Id. de Seq. n°:24 com pelo menos um polimorfismo ocorrendo em uma posição nt dentro de Id. de Seq. n°:24 selecionada a partir de nt 358, 359, 371, 421, 422, 423, 425, 426, e qualquer combinação destes; o lócus marcador exposto em Id. de Seq. n°:26 com pelo menos um polimorfismo ocorrendo em uma posição nt em Id. de Seq. n°:26 com pelo menos um polimorfismo ocorrendo em uma posição nt em Id. de Seq. n°:26 selecionada a partir de nt 28, 31, 35, 43, 50, 111, 117, 143, 192, 197, 219, 266 e qualquer combinação destes; o lócus marcador exposto em Id. de Seq. n°:28 com pelo menos um polimorfismo ocorrendo em uma posição nt dentro de Id. de Seq. n°:28 selecionada a partir de nt 41, 62, 92, 158, 182, 194, 200, 226, 229, 349 e qualquer combinação destes; o lócus marcador exposto em Id. de Seq. n°:30 com pelo menos um polimorfismo ocorrendo em uma posição nt dentro de Id. de Seq. n°:30 selecionada a partir de nt 102, 145, 162, 165, 198, 199, 221, 247, 251, 253, 306, 331, 352, 451, 461, 464, e qualquer combinação destes; o lócus marcador exposto em Id. de Seq. n°:32 com pelo menos um polimorfismo ocorrendo em uma posição nt dentro de Id. de Seq. n°:32 selecionada de nt 61, 73, 87, 143, 199, 208, 209, 210, 211, 225, 327, 328, 335 e qualquer combinação destes; e o lócus marcador exposto em Id. de Seq. n°:51 com pelo menos um polimorfismo ocorrendo em uma posição nt dentro de Id. de Seq. n°:51 selecionada a partir de nt 134; nt 163; nt 190-192 ou 193-195 ou 196-198 ou 199-201; nt 1401 ou 1404 ou 1407; e qualquer combinação destes. Mudanças polimórficas exemplares dentro destes loci marcadores estão expostas nas Tabelas 2 e 3 aqui abaixo. Em algumas modalidades, o lócus marcador favorável compreende a seqüência divulgada em Id. de Seq. n°: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45 ou 47, ou um alelo deste compreendendo um ou mais dos polimorfismos identificados nesta (ver, por exemplo, Tabela 2 e Tabela 3, aqui abaixo).
[103]É reconhecido que as plantas transformadas de maneira estável podem compreender qualquer um ou todos os polinucleotideos para os loci marcadores favoráveis aqui identificados. Em tais modalidades, a expressão do polinucleotideo heteróligo compreendendo a seqüência associada com alto teor de óleo ou alto teor de ácido oléico aumenta o conteúdo de óleo ou o conteúdo de ácido oléico na planta ou parte desta planta, e pode aumentar de forma favorável a relação entre o ácido oléico e ácido linoléico na planta ou parte desta planta. (i) Quadros de Leitura Abertos do lócus QTL6 [104JQTL6 foi finamente mapeado a uma região de aproximadamente 195 kb que foi caracterizada e encontrada para conter cinco quadros de leitura abertos. Sem estar preso pela teoria, uma ou mais proteínas coificadas por estes quadros de leitura abertos estão associadas com um fenótipo de alto teor de óleo, e/ou um fenótipo de alto teor de ácido oléico, e/ou um fenótipo de alto teor de óleo/baixo teor de ácido linoléico (isto é, relação aumentada entre o ácido oléico e ácido linoléico). Assim, o conteúdo de óleo e/ou o conteúdo de ácido oléico e/ou a relação entre o ácido oléico e ácido linoléico de uma planta ou parte desta planta podem ser manipulados por superexpressão de uma ou mais destas proteínas na planta ou parte desta planta. (a) Diacilglicerol o-aciltransferase tipo 1 (DGAT) [105]A presente invenção fornece uma nova variante de uma diacilglicerol o-aciltransferase tipo 1 (DGAT) que, sob expressão em uma planta ou parte desta planta, aumenta o conteúdo de óleo, aumenta o conteúdo de ácido oléico, e/ou aumenta a relação entre o ácido oléico e ácido linoléico na planta ou parte desta planta, quando comparada à seqüência de DGAT tipo 1 de uma planta que não exibe fenótipo de alto teor de óleo e/ou alto conteúdo de ácido oléico e/ou alto teor de ácido oleico/baixo teor de ácido linoléico, por exemplo, a seqüência de DGAT 1-2 de milho de teor normal de óleo exposta em Id. de Seq. n°:52 (designada ZmDGATl-2(EF09B)). Uma seqüência de DGAT variante que aumenta o conteúdo de óleo, aumenta o conteúdo de ácido oléico e/ou aumenta a relação entre o ácido oléico e ácido linoléico em uma planta ou parte desta planta desta forma é referida aqui como "uma variante de alto teor de óleo/alto teor de ácido oléico" de DGAT, e a seqüência condificadora para esta variante representa a seqüência associada a alto teor de óleo e alto teor de ácido oléico da invenção. O termo "variante" refere-se a uma proteína que compreende uma seqüência de aminoácido que se difere da seqüência de aminoácido para a proteína de referência pelas deleções de aminoácido, substituições de aminoácido ou ambos.
[106] A variante de alto teor de óleo/alto teor de ácido oléico de DGAT da presente invenção designada ZmDGATl-2(ASK) compreende uma seqüência de aminoácido que se difere da seqüência de DGAT 1-2 de milho com teor normal de óleo de referência tendo uma substituição do resíduo de glicina pelo resíduo de valina na posição do aminoácido correspondente ao resíduo 45 de Id. de Seq. n°:52; uma substituição do resíduo de serina pelo resíduo de prolina na posição do aminoácido correspondente ao resíduo 55 de Id. de Seq. n°: 52; uma deleção do resíduo de glutamina correspondendo àquela posição no aminoácido 64, 65, 66 ou 67 de Id. de Seq. n°:52; e/ou uma inserção de um resíduo de fenilalanina em uma posição localizada entre um par de resíduos, onde o par de resíduos corresponde a um par de resíduos dentro de Id. de Seq. n°:52 selecinado a partir do grupo consistindo de: (a) o resíduo de triptofano na posição 467 do aminoácido de Id. de Seq. n°:52 e o resíduo de fenilalanina na posição 468 do aminoácido de Id. de Seq. n°:52, (b) o resíduo de fenilalanina na posição 468 do aminoácido de Id. de Seq. n°: 52 e o resíduo de fenilalaninana posição 4 69 do aminoácido de Id. de Seq. n°:52, (c) o resíduo de fenilalanina na posição 469 do aminoácido de Id. de Seq. n°:52 e o resíduo de serina na posição 470 do aminoácido de Id. de Seq. n°:52. Veja a seqüência de polipeptídeo ZmDGATl-2(ASK) exposta em Id. de Seq. n°:48. Veja também o alinhamento do polipeptídeo ZmDGATl-2 (ASK) com a seqüência de polipeptídeo ZmDGATl-2 a partir de três linhas consanguíneas com teor normal de óleo, EF09B, Mo 17 e B73, mostradas na Figura 30. Um alinhamento das respectivas seqüências codificadoras é mostrado na Figura 31. A variante de DGAT de alto teor de óleo/alto teor de ácido oléico da invenção pode ter uma ou mais destas várias modificações. Conforme aqui usado, a seqüência de aminoácido de referência para DGAT 1-2 de milho a partir de linhas consanguineas com teor normal de óleo é mostrada em Id. de Seq. n°:52 (seqüência para ZmDGATl-2(EF09B)), que é codificada por uma seqüência de nucleotideo tal como aquela exposta em Id. de Seq. n°:51.
[107]Uma ou mais das substituições particulares aqui divulgadas resulta em uma variante de DGAt que retém as atividades desejadas de considerar um aumento nos níveis de óleo e/ou ácido oléico e/ou um aumento na relação entre o ácido oléico e ácido linoléico de uma planta ou parte desta, quando comparada a uma planta ou parte desta planta de controle apropriada, conforme descrito em algum lugar aqui. Tendo-se identificado as posições dentro da seqüência de DGAT de alto teor de óleo/alto teor de ácido oléico (isto é, a seqüência ZmDGATl-2(ASK)) e as substituições, deleções e inserções relevantes, faz parte das habilidades de qualquer um habilitado na técnica variar outros resíduos dentro da seqüência variante de DGAT para se obter variantes de DGAT de alto teor de óleo/alto teor de ácido oléico aqui divulgada que também retêm a atividade desejada, isto é, aumentando o conteúdo de óleo e/ou aumentando o conteúdo de ácido oléico, e/ou aumentando a relação entre o ácido oléico e ácido linoléico de uma planta ou parte desta planta. Tais variantes da variante de DGAT de alto teor de óleo/alto teor de ácido oléico divulgadas aqui são também objetivadas para serem abrangidas pela presente invenção, e são também definidas abaixo. A presente invenção também fornece quaisquer seqüências de nucleotideo codificando as variantes de DGAT de alto teor de óleo/alto teor de ácido oléico da invenção, por exemplo, a seqüência codificadora exposta em Id. de Seq. n°:47, que codifica a variante de DGAT de alto teor de óleo/alto teor de ácido oléico ZmDGATl-2(ASK) (Id. de Seq. n° : 48) .
[108]Diacilglicerol aciltransferase [DGAT, EC 2.3.1.20) usa acil-CoA graxo e diacilglicerol como substratos para catalisar a etapa comprometida na síntese de triacilglicerol. DGATs executam um papel fundamental no metabolismo de glicerolipídeos celulares. Muitos elementos da família de DGAT foram identificados em plantas, vários dos quais são mostrados em um alinhamento na Figura 33. A DGTA de alto teor de óleo/alto teor de ácido oléico da presente invenção (ZmDGATl-2(ASK)) está também mostrada na Figura 33. Análise filogênica (ver Figura 32) destes polipeptídeos de DGAT foi executada usando-se o programa PHYLIP (J. Felsenstein, University of Washington) e foi apresentada usando-se o programa TreeView (Página (1996) Computer Appl. Biosci. 12:357-358). A diacilglicerol aciltransferases tipo I e tipo II de planta, glicerol-3-fosfato aciltransferases (GPAT) e lisofosfatidil aciltransferases (LPAT) foram inclusas na análise. Os resultados mostram que a DGAT tipo 1 (DGAT1) é distinta da DGAT tipo 2 (DGAT2), GPAT e LPAT. Dentro da DGTA tipo 1, um subgrupo DGAT 1-2 composto de várias espécies de monocotilédone pode ser também diferenciado. O ORF de DGAT localizado na região de QTL6 da invenção é um elemento do subgrupo DGAT 1-2.
[109]São também fornecidos aqui o polipeptideo ZmDGATl-2 com teor normal de óleo conforme identificado nas linhas consanguineas de milho com teor normal de óleo EF09B, Mo 17 e B73. Para os propósitos da presente invenção, este polipeptideo é referido aqui como ZmDGATl-2 or ZmDAGTl-2(EF09B), ZmDGATl-2(Mol7) ou ZmDGATl-2(B73) com "teor normal de óleo", dependendo da linha consanguinea de milho com teor de óleo normal a partir da qual o polipeptideo ZmDGATl-2 com teor normal de óleo foi derivado. O polipeptideo ZmDGATl-2 com teor normal de óleo está exposto em Id. de Seq. n°:50 (referido aqui referido como ZmDGATl-2(Mol7), Id. de Seq. n°:52 (referido aqui como ZmDGATl-2 (EF0 9B) e Id. de Seq. n°:54 (referido aqui como ZmDGATl-2(B73) ) . Os polinucleotideos codificando o polipeptideo ZmDGATl-2 com teor normal de óleo são também abrangidos pela presente invenção. Os polinucleotideos exemplares são expostos em Id. de Seq. n°:49 (aqui referido como seqüência codificadora de ZmDGAT 1-2(Mo 17), Id. de Seq. n°:51 (aqui referido como seqüência codificadora de ZmDGAT 1-2(EF09B) e Id. de Seq. n°:53 (aqui referido como seqüência codificadora de ZmDGATl-2(B73)). Conforme notado acima, para propósitos de comparação das mudanças polimórficas entre as seqüências codificadoras de ZmDGAT 1-2 (ASK) de alto teor de óleo/alto teor de ácido oléico e seqüências de polipeptideo e as respectivas seqüências codificadoras de ZmDGAT 1-2 com teor normal de óleo e as seqüências de polipeptideo, ZmDGAT 1-2 (EF0 9B) serve como a ZmDGAT 1-2 com teor normal de óleo de referidaArencia (isto é, a seqüência de aminoácido exposta em Id. de Seq. n°:52 e a seqüência codificadora exemplar exposta em Id. de Seq. n°:51). Variantes do polipeptídeo ZmDGATl-2 com teor normal de óleo e polinucleotídeos codificando estes variantes são também abrangidos pela presente invenção.
[110] 0 polipeptídeo ZmDGATl-2 com teor normal de óleo e as seqüências que codificam esta proteína e variantes destes que retêm a atividade da proteína ZmDGATl-2 com teor normal de óleo, e portanto estão envolvidas na biosíntese de óleo, também encontram uso no aumento do conteúdo de óleo e/ou conteúdo de ácido oléico e/ou relação crescente entre o ácido oléico e ácido linoléico de acordo com os métodos da presente invenção. Desta forma, a superexpressão do polipeptídeo ZmDGATl-2 com teor normal de óleo, ou os fragmentos funcionais e variantes destes conforme definido em algum lugar aqui, podem fornecer conteúdo de óleo aumentado, conteúdo de ácido oléico aumentado e/ou relação aumentada entre o ácido oléico e ácido linoléico em uma planta ou parte desta planta, conforme descrito aqui abaixo. Ver também Exemplo 11 abaixo. (b) Permease de Aminoácido [111] A presente invenção também fornece o quadro de leitura aberto para o polipeptídeo permease 1 de aminoácido de milho (AAP1) (Id. de Seq. n°:56, designado ZmAAPl) e variantes biologicamente ativas desta conforme aqui definido abaixo. Os polinucleotídeos isolados codificando o polipeptídeo ZmAAPl são também abrangidos pela presente invenção. Em tal modalidade, o polinucleotídeo isolado compreende a seqüência exposta em Id. de Seq. n°:55 ou variante desta codificando um polipeptídeo AAPl biologicamente ativo. A Figura 34 mostra um alinhamento do polipeptideo ZmAAPl com outros polipeptideos AAP relacionados a partir de outras espécies de planta. Para uma revisão das permeases de aminoácido no transporte de aminoácidos, em geral, veja, por exemplo, Wipf e outros, (2002) Trends Biochem. Sei. 27(3): 139-147. 139-147. (c) Proteína de Sistema de Efluxo de K+ (PESP) [112] A presente invenção também fornece o quadro de leitura aberto para a proteína de sistema de efluxo de potássio de milho (Id. de Seq. n°:58, designado ZmPESP) e variantes biologicamente ativas desta conforme aqui definido abaixo. Os polinucleotídeos isolados codificando o polipeptideo ZmPESP são também abrangidos pela presente invenção. Em tal modalidade, o polinucleotídeo isolado compreende a seqüência exposta em Id. de Seq. n°:57 ou variante desta codificando um polipeptideo PESP
biologicamente ativo. A Figura 35 mostra um alinhamento do polipeptideo ZmPESP com outros polipeptideos PESP relacionados a partir de outras espécies de planta. Para uma revisão dos polipeptideos PESP, em geral, veja, por exemplo, Ferguson e outros, (1993) Mol. Microbiol. 9(6): 1297-1303.
(d) Proteína S24 Ribossômica 40S
[113] A presente invenção também fornece o quadro de leitura aberto para a proteína S24 ribossômica 40S (Id. de Seq. n°:60, designado ZmS24) e variantes biologicamente ativas desta conforme aqui definido abaixo. Os polinucleotídeos isolados codificando o polipeptideo ZmS24 são também abrangidos pela presente invenção. Em tal modalidade, o polinucleotídeo isolado compreende a seqüência exposta em Id. de Seq. n°:59 ou variante desta codificando uma proteína S24 ribossômica 40S biologicamente ativa. A Figura 36 mostra um alinhamento do polipeptídeo ZmS24 com outras proteínas ribossômicas relacionadas a partir de outras espécies de planta. Para uma revisão dos polipeptídeos S24 ribossômicos, em geral, veja, por exemplo, Xu e Roufa (1996) Gene 169:257-262.
(e) Transportador ABC
[114] A presente invenção também fornece o quadro de leitura aberto para o polipeptídeo do transportador ABC tipp PDR de milho (ABCT) (seqüência compósita mostrada em Id. de Seq. n°:64, designado ZmABCT(compósito) aqui) e variantes biologicamente ativas desta conforme aqui definido abaixo. Os polinucleotídeos isolados codificando o polipeptídeo ZmABCT(compósito) são também abrangidos pela presente invenção. Em tal modalidade, o polinucleotídeo isolado compreende a seqüência exposta em Id. de Seq. n°:63 ou variante desta codificando um polipeptídeo do ABCT biologicamente ativo.
[115] A seqüência codificadora de comprimento total foi construída a partir de uma seqüência de cDNA de ORF parcial de ZmABCT clonada a partir da linha de milho consanguínea Mo 17 sem alto teor de óleo, sem alto teor de ácido oléico (seqüência exposta em Id. de Seq. n°:61), codificado a seqüência de aminoácido de terminal N exposta em Id. de Seq. n°:62) e EST e a seqüência genômica para linha de milho consanguíneas B73 sem alto teor de óleo, sem alto teor de ácido oléico. A Figura 37 mostra um alinhamento do polipeptídeo ZmABCT(compósito) com outros polipeptídeos ABCT relacionados a partir de outras espécies de planta.
Para uma revisão dos polipeptideos ABCT, em geral, veja, por exemplo, Van den Brule e Smart (2002) Planta 216:95-106. (C) Variantes e Fragmentos [116]A invenção abrange composições de polinucleotideo ou de proteína substancialmente purificados ou isolados. Um polinucleotideo ou proteína "isolada" ou "purificada" ou porção biologicamente ativa destes, está substancialmente ou essencialmente livre de componentes que normalmente acompanham ou interagem com polinucleotideo ou proteína conforme encontrados em seu ambiente ocorrendo naturalmente. Assim, um polinucleotideo ou proteína isolada ou purificada é substancialmente livre de outro material celular, ou meio de cultura quando produzido por técnicas recombinantes, ou substancialmente livre de precursores químicos ou outros produtos químicos quando sintetizados quimicamente. De forma ideal, um polinucleotideo "isolado" é livre de seqüências (preferivelmente, seqüências que codificam proteína) que flanqueiam naturalmente o polinucleotideo (isto é, seqüências localizadas nas extremidades 5' e 3' do polinucleotideo) no DNA genômico do organismo a partir do qual o polinucleotideo é derivado. Por exemplo, em várias modalidades, o polinucleotideo isolado pode conter menos de cerca de 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb ou 0,1 kb de seqüências de nucleotídeo que flanqueiam naturalmente o polinucleotideo no DNA genômico da célula a partir da qual o polinucleotideo é derivado. Uma proteína que é substancialmente livre de material celular inclui preparações de proteína possuindo menos de cerca de 30%, 20%, 10%, 5% ou 1% (em peso seco) de proteína contaminante. Quando a proteína da invenção ou porção biologicamente ativa desta é produzida de forma recombinante, preferivelmente o meio de cultura representa menos de cerca de 30%, 20%, 10%, 5% ou 1% (em peso seco) dos precursores químicos ou produtos químicos não-proteicos de interesse.
[117] Os fragmentos e variantes dos polinucleotídeos divulgados e quaisquer proteínas codificadas por estes são também abrangidos pela presente invenção. Por "fragmento" pretende-se dizer uma parte do polinucleotídeo, por exemplo, uma parte do polinucleotídeo para o lócus marcador compreende a seqüência exposta em Id. de Seq. n°: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, ou, no caso de uma proteína da invenção, uma parte da seqüência de man e por conseguinte a proteína codificada por este.
[118] Onde o polinucleotídeo da invenção compreende um quadro de leitura aberto, por exemplo, um polinucleotídeo codificando os polipeptídeos ZmDGATl-2(ASK) com alto teor de óleo/alto teor de ácido oléico, ZmDGATl-2 com teor normal de óleo, ZmAAPl, ZmPESP, ZmS24 ou ZmABCT(compôsito), tal como, por exemplo, o polinucleotídeo exposto em Id. de Seq. n°:47, 51, 55, 57, 59 ou 63, respectivamente, um fragmento do polinucleotídeo pode codificar os fragmentos de proteína que retêm a atividade biologica do polipeptídeo de comprimento total, e por conseguinte aumentar o conteúdo de óleo e/ou aumentar o conteúdo de ácido oléico e/ou aumentar a relação entre o ácido oléico e ácido linoléico em uma planta ou parte desta planta quando comparada a uma planta de controle apropriada ou parte desta planta.
Alternativamente, fragmentos de um polinucleotídeo que compreendem uma seqüência codificadora e que são úteis como marcadores de hibridização geralmente não codificam proteínas de fragmentos que retêm a atividade biológica. Assim, os fragmentos de uma seqüência de nucleotídeo podem variar de pelo menos cerca de 10 nucleotídeos, cerca de 20 nucleotídeos, cerca de 50 nucleotídeos, cerca de 100 nucleotídeos e até o polinucleotídeo de tamanho completo aqui divulgado, dependendo do uso objetivado do polinucleotídeo.
[119]Assim, por exemplo, onde o polinucleotídeo representa uma seqüência não codificadora, por exemplo, um lócus marcador compreendendo uma seqüência exposta em Id. de Seq. n°: 1, 3, 5, 7,9, 11, 13, 15, 17, 19, 21,23, 25,27, 29, 31,33,35, 37, 39, 41, 43 ou 45, um fragmento do polinucleotídeo pode compreender pelo menos 12, 16, 20, 50, 75, 100, 150, 200 ou 250 nucleotídeos contínuos, ou até o número de nucleotídeos presenta em uma seqüência de nucleotídeo de comprimento total para um lócus marcador favorável aqui divulgado (por exemplo, 523, 507, 257, 511, 241, 371, 510, 592, 550, 520, 464, 514, 505, 410, 522, 507, 553, 972, 469, 413, 457, 762 ou 499 nucleotídeos para Id. de Seq. n°: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43 ou 45, respectivamente). Fragmentos de um lócus marcador favorável possuindo uma seqüência que não é uma seqüência codificadora irão compreender pelo menos um dos polimorfismos aqui identificados. Assim, por exemplo, um fragmento de um lócus marcador compreendendo a seqüência exposta em Id. de Seq. n°: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43 ou 45 compreende uma parte da sequência de nucleotideo que compreende pelo menos um dos polimorfismos identificados nesta; veja, por exemplo, Tabela 2 abaixo e os alinhamentos fornecidos nas Figuras 7-29 aqui.
[120] Um fragmento de um polinucleotideo que codifica uma proção biologicamente ativa de uma DGAT de alto teor de óleo/alto teor de ácido oléico (por exemplo, ZmDGATl-2 (ASK) ) , uma DGAT com teor de óleo normal (por exemplo, ZmDGATl-2(EF09B)), uma permease de aminoácido, uma PESP, uma proteína ribossômica ou uma proteína transportadora ABC da invenção irá codificar pelo menos 15, 25, 30, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 650, 700 aminoácidos contínuos, ou até o número total de aminoácidos presentes em uma DGAT de alto teor de óleo/alto teor de ácido oléico de comprimento total, uma DGAT com teor de óleo normal, uma permease de aminoácido, uma PESP, uma proteína ribossômica ou uma proteína transportadora ABC da invenção. Os fragmentos de um polinucleotideo que são úteis como marcadores de hibridização ou iniciadores de PCR geralmente não necessitam codificar uma porção biologicamente ativa de uma DGAT de alto teor de óleo/alto teor de ácido oléico, uma DGAT com teor de óleo normal, uma permease de aminoácido, uma PESP, uma proteína ribossômica ou uma proteína transportadora ABC.
[121] Assim, um fragmento de um polinucleotideo da invenção pode codificar uma porção bilogicamente ativa de uma DGAT de alto teor de óleo/alto teor de ácido oléico, uma DGAT com teor de óleo normal, uma permease de aminoácido, uma PESP, uma proteína ribossômica ou uma proteína transportadora ABC, ou ele pode ser um fragmento que pode ser usado como um marcador de hibridização ou iniciador de PCR usando-se métodos divulgados abaixo. Uma porção biologicamente ativa de uma DGAT de alto teor de óleo/alto teor de ácido oléico, uma DGAT com teor de óleo normal, uma permease de aminoácido, uma PESP, uma proteína ribossômica ou uma proteína transportadora ABC pode ser preparada isolando-se uma parte de um dos respectivos polinucleotídeos codificando estas proteínas, expressando a porção codificada da DGAT de alto teor de óleo/alto teor de ácido oléico, DGAT com teor de óleo normal, a permease de aminoácido, a PESP, a proteína ribossômica ou a proteína transportadora ABC (por exemplo, pela expressão recombinante in vitro) , e analisando-se a atividade da porção codificada da respectiva proteína. Os polinucleotídeos que são fragmentos de uma seqüência de nucleotídeo codificando uma DGAT de alto teor de óleo/alto teor de ácido oléico, uma DGAT com teor de óleo normal, uma permease de aminoácido, uma PESP, uma proteína ribossômica ou uma proteína transportadora ABC compreende pelo menos 16, 20, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350 ou 400 nucleotídeos contínuos, ou até o número de nucleotídeos presentes em uma seqüência de nucleotídeo de comprimento total codificando uma DGAT de alto teor de óleo/alto teor de ácido oléico, uma DGAT com teor de óleo normal, uma permease de aminoácido, uma PESP, uma proteína ribossômica ou uma proteína transportadora ABC aqui divulgadas (por exemplo, 1485, 1485, 1389, 1896, 414 e 4710 nucleotídeos para Id. de Seq. n°:47, 51, 55, 57, 59 e 63 respectivamente).
[122] Em algumas modalidades, o polinucleotídeo codifica um fragmento do polipeptideo ZmDGATl-2(ASK) exposto em Id. de Seq. n°:48, onde o fragmento compreende pelo menos um entre o residuo de glicina na posição 45 do aminoácido de Id. de Seq. n°:48, o residuo de serina na posição 55 do aminoácido de Id. de Seq. n°:48, e o residuo de fenilalanina na posição 467, 468 ou 469 do aminoácido de Id. de Seq. n°:48, onde a expressão do fragmento de polipeptideo codificado em uma planta ou parte desta planta aumenta o conteúdo de óleo, aumenta o conteúdo de ácido oléico, e/ou aumenta a relação entre o ácido oléico e ácido linoléico na planta ou parte desta planta.
[123] Em outras modalidades, o polinucleotídeo codifica um fragmento do polipeptideo ZmDGATl-2 com teor normal de óleo exposto em Id. de Seq. n°:52 com pelo menos uma alteração selecionada a partir do grupo consistindo de: (a) uma substituição de um resíduo de glicina pelo resíduo de valina na posição 45 do aminoácido de Id. de Seq. n°:52; (b) um resíduo de serina pelo resíduo de prolina na posição 55 do aminoácido de Id. de Seq. n°:52; (c) uma deleção do resíduo de glutamina correspondente à posição 64, 65, 66 ou 67 do aminoácido de Id. de Seq. n°:52; e (d) uma inserção de um resíduo de fenilalanina em uma posição localizada entre um par de resíduos, onde o par de resíduos corresponde a um par de resíduos dentro de Id. de Seq. n°:52 selecionado a partir do grupo consistindo de: (i) o resíduo de triptofano na posição 467 do aminoácido de Id. de Seq. n°:52 e o resíduo de fenilalanina na posição 468 do aminoácido de Id. de Seq. n°:52, (ii) o residuo de fenilalanina na posição 468 do aminoácido de Id. de Seq. η°: 52 e ο resíduo de fenilalania na posição 469 do aminoácido de Id. de Seq. n°:52, e (iii) o resíduo de fenilalanina na posição 469 do aminoácido de Id. de Seq. n°:52 e o resíduo de serina na posição 470 do aminoácido de Id. de Seq. n°:52; onde a expressão do fragmento de polipeptídeo codificado em uma planta ou parte desta planta aumenta o conteúdo de óleo, aumenta o conteúdo de ácido oléico e/ou aumenta a relação entre o ácido oléico e ácido linoléico na planta ou parte desta planta.
[124] Em ainda outras modalidades, o fragmento de um polinucleotídeo codifica um fragmento do polipeptídeo ZmDGATl-2 com teor normal de óleo exposto em Id. de Seq. n°: 52 (expondo ZmDGATl-2(EF09B), que possui a mesma seqüência dos polipeptídeos ZmDGATl-2(Mol7) e ZmDGATl-2(B73), respectivamente, expostos em Id. de Seq. n°:50 e 54), onde a superexpressão do fragmento de polipeptídeo codificado em uma planta ou parte desta planta aumenta o conteúdo de ácido oléico e/ou aumenta a relação entre o ácido oléico e ácido linoléico na planta ou parte desta planta.
[125] O termo "variantes" objetiva significar substancialmente seqüências similares. Para os polinucleotídeos, uma variante compreende uma deleção e/ou adição de um ou mais nucleotídeos em um ou mais sítios interno dentro do polinucleotídeo nativo e/ou uma substituição de um ou mais nucleotídeos em um ou mais sítios no polinucleotídeo nativo. Conforme aqui usado, um polinucleotídeo ou polipeptídeo "nativo" compreende uma seqüência de nucleotídeo ou uma seqüência de aminoácido que ocorrem naturalmente, respectivamente.
[126]Onde o polinucleotídeo representa uma seqüência não codificadora, por exemplo, um lócus marcador compreendendo a seqüência exposta em Id. de Seq. n°: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43 ou 45, uma variande do lócus marcador favorável irá compreender uma seqüência de nucleotideo compreendendo pelo menos um dos polimorfismos identificados na seqüência para o respectivo lócus marcador (veja, por exemplo, a Tabela 2 e os alinhamentos apresentados nas Figuras 7-29 aqui) e irá reter a caracterisitca de estar associada ao traço fenotípico de alto conteúdo de óleo e/ou alto conteúdo de ácido oléico e/ou alto conteúdo de ácido oléico/baixo conteúdo de ácido linoléico (isto é, relação aumentada entre o ácido oléico e ácido linoléico). Para os polinucleotideos que codificam uma proteína da invenção, variantes conservativas incluem aquelas seqüências que, por causa da degeneração do código genético, codificam a seqüência de aminoácido da DGAT de alto teor de óleo/alto teor de ácido oléico, DGAT com teor de óleo normal, permease de aminoácido, PESP, proteína ribossômica ou proteína transportadora ABC da invenção. Os variantes alélicos que ocorrem naturalmente tais como estes podem ser identificados com o uso de técnicas de biologia molecular bem conhecidas, como, por exemplo, com reação de cadeia de polimerase (PCR) e técnicas de hibridização conforme descrito abaixo. Os polinucleotideos variantes também incluem polinucleotideos derivados sinteticamente, tais como aqueles gerado, por exemplo, pelo uso de mutagênese sítio-dirigida, e, para seqüências codificadoras, ainda codificam a seqüência de aminoácido da DGAT de alto teor de óleo/alto teor de ácido oléico, DGAT com teor de óleo normal, permease de aminoácido, PESP, proteína ribossômica ou proteína transportadora ABC da invenção. Geralmente, as variantes de um polinucleotídeo particular da invenção possuirão pelo menos cerca de 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de seqüência em relação àquele polinucleotídeo particular conforme determinado pelos programas de alinhamento de seqüência e parâmetros descritos em algum lugar aqui.
[127]As variantes de um polinucleotídeo particular da invenção (isto é, o polinucleotídeo de referência) que codifica um polipeptídeo da invenção podem também ser avaliadas por comparação do percentual de identidade de seqüência entre o polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo variante e o polipeptídeo codificado pelo polinucleotídeo de referência. Assim, por exemplo, um polinucleotídeo isolado que codifica um polipeptídeo com um dado percentualde identidade de seqüência em relação ao polipeptídeo de Id. de Seq. n°:48, 52, 56, 58, 60 e 64 são divulgados. O percentual de identidade de seqüência entre qualquer um dos dois polipeptídeos pode ser calculado usando-se programas de alinhamento de seqüência e os parâmetros descritos aqui em algum lugar. Onde qualquer dado par de polinucleotídeo da invenção é avaliado por comparação do percentual de identidade de seqüência compartilhado pelos dois polipeptídeos que eles codificam, o percentual de identidade de seqüência entre os dois polipeptídeos codificados é pelo menos de cerca de 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de seqüência.
[128]0 termo proteína "variante" é objetivado para significar uma proteína derivada da proteína nativa pela deleção ou adição de um ou mais aminoácidos em um ou mais sítios internos na proteína nativa e/ou substituição de um ou mais aminoácidos em um ou mais sítios na proteína nativa. As proteínas variantes abrangidas pela presente invenção são biologicamente ativas, isto quer dizer que elas continuam a possuir a atividade biológica desejada da proteína que ocorre naturalmente, isto é, a atividade biológica desejada da proteína ZmDGATl-2(ASK), proteína ZmDGATl-2 com teor normal de óleo (por exemplo, ZmDGATl-2(EF09B)), a proteína ZmAAPl, a proteína ZmPESP, a proteína ZmS24 e a proteína ZmABCT conforme aqui descrito. Tais variantes podem resultar de, por exemplo, um ou mais polimorfismos genéticos ou de manipulação humana. As variantes biologicamente ativas de uma DGAT de alto teor de óleo/alto teor de ácido oléico que ocorre naturalmente da invenção, tal como ZmDGATl-2 (ASK) , DGAT com teor de óleo normal da invenção, tal como ZmDGATl-2(EF09B), permease de aminoácido da invenção, tal como ZmAAPl, PESP da invenção, tal como ZmPESP, proteína ribossômica da invenção, tal como ZmS24, ou proteína transportadora ABC da invenção, tal como ZmABCT, possuirão pelo menos cerca de 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de seqüência em relação à seqüência de aminoácido para a proteína nativa conforme determinado pelos programas de alinhamento de seqüência e parâmetros descritos em algum lugar aqui. Uma variante biologicamente ativa de uma proteína da invenção pode diferir daquela proteína por apenas 1-15 resíduos de aminoácidos, apenas 1-10, tal como 6-10, apenas 5, apenas 4, 3, 2, ou mesmo 1 resíduo de aminoácido.
[129] As proteínas da invenção podem ser alteradas de várias maneiras incluindo substituições de aminoácidos, exclusões, truncações, e inserções. Métodos para tais manipulações são gerlmente conhecidos na técnica. Por exemplo, variantes de seqüência de aminoácido e fragmentos da proteína ZmDGATl-2(ASK), proteína ZmDGATl-2 com teor normal de óleo (por exemplo, ZmDGATl-2(EF09B)), a proteína ZmAAPl, a ZmPESP, a proteína ZmS24 e a proteína ZmABCT podem ser preparadas por mutações no DNA. Métodos para a mutagênese e alterações de polinucleotídeo são bem conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82:488-492); Kunkel e outros, (1987) Methods in Enzymol. 154:367-382; Patente U.S. de número 4.873.192; Walker e Gaastra, eds. (1983) Techniques in Molecular Biology (MacMillan Publishing Company, New York) e as referências citadas nesta. Orientação para as substituições de aminoácidos apropriadas que não afetam a atividade biológica da proteína de interesse pode ser encontrada no modelo de Dayhoff e outros. (1978) Atlas of Protein Sequence and Structure (Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.), aqui incorporado para referência. Substituições conservativas, tal como a troca de um aminoácido com um outro possuindo propriedades similares, pode ser preferível.
[130] Assim, os genes e os polinucleotídeox da invenção incluem tanto as seqüências que ocorrem naturalmente quanto as formas mutantes. De maneira semelhante, as proteínas da invenção abrangem tanto as proteínas que ocorrem naturalmente quanto as variações e formas modificadas desta. Tais variantes irão continuar a possuir a atividade desejada. Assim, por exemplo, variantes da proteína ZmDGATl-2(ASK) continuarão a conceder o fenótipo de alto teor de óleo/alto teor de ácido oléico em uma planta ou parte desta planta. Variantes da proteína ZmDGATl-2 com teor normal de óleo (por exemplo, ZmDGATl-2(EF09B)) continuarão a possuir a atividade desejada de estarem envolvidas na biossíntese de óleo, e portanto quando superexpressadas em uma planta ou parte desta palnta, resultarão em um aumento no conteúdo de óleo, conteúdo de ácido oléico e/ou relação entre o ácido oléico e ácido linoléico daquela planta ou parte desta planta. Obviamente, as mutações que serão feitas no DNA que codifica a variante não devem colocar a seqüência fora do quadro de leitura e preferivelmente não criarão regiões complementares que poderão produzir estrutura secundária de mRNA. Ver, a Publicação do Pedido de Patente EP de n° 75.444.
[131] Não se espera que as deleções, inserções, e substituições das seqüências de proteína abrangidas aqui produzam mudanças radicais nas características da proteína. Entretanto, quando é difícil prever o efeito exato da substituição, deleção ou inserção antes que estas sejam feitas, qualquer um habilitado na técnica irá avaliar que o efeito será avaliado por ensaios de classificação rotineiros.
[132] Polinucleotídeos variantes e proteína também abrangem seqüências e proteínas derivadas de um procedimento mutagênico e recombinogênico tal como combinações aleatórias de DNA (DNA shuffling) . Com tal procedimento, uma ou mais seqüências codificadoras diferentes para a proteína ZmDGATl-2(ASK), a proteína ZmDGATl-2 com teor de óleo normal (por exemplo, ZmDGATl-2(EF09B)), a proteína ZmAAP, a ZmPESP, a proteína ZmS24, ou as seqüências que codificam a proteína ZmABCT podem ser manipuladas para criar uma nova proteína DGATl-2, proteína AAPl, PESP, proteína S24 ribossômica 40S ou proteína ABCT possuindo as propriedades desejadas. Desta maneira, as bibliotecas de polinucleotídeos recombinantes são geradas a partir de uma população de polinucleotídeos relacionados compreendendo regiões de seqüência que possuem substancial identidade de seqüência e podem ser de forma homóloga recombinadas in vitro ou in vivo. Por exemplo, usando-se este método, os motivos de seqüência que condificam um domínio de interesse podem ser combinados aleatoriamente entre a seqüência codificadora para a proteína ZmDGATl-2 (ASK) , ZmDGATl-2 com teor normal de óleo (por exemplo, ZmDGATl-2(EF09B)), ZmAAPl, ZmPESP, ZmS24 ou ZmABCT da invenção e seqüências codificadoras para outras proteínas DGATl-2, AAPl, PESP, S24, ABCT respectivas conhecidas para se obter um novo gene codificando para uma proteína com uma propriedade de interesse melhorada. Estratégias para tal combinação aleatória de DNA são conhecidas na técnica. Ver, por exemplo, Stemmer (1994) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91: 10747-10751; Stemmer (1994) Nature 370:389-391; Crameri e outros (1997) Nature Biotech. 15:436-438, Moore e outros (1997) J. Mol. Biol. 272:336-347; Zhang e outros (1997) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 94:4504-4509; Cramerietal. (1998) Nature 391:288-291; e Patentes U. S. de números 5.605.793 e 5.837.458.
[133] As composições da invenção também incluem moléculas de ácido nucleico isoladas compreendendo a sequência de nucleotideo promotora ZmDGATl-2(Mol7) (filamento complementar exposto em Id. de Seq. n°: 119); sequência de nucleotideo promotora ZmDGATl-2(ASK) (filamento complementar exposto em Id. de Seq. n°: 130); seqüência de nucleotideo promotora ZmAAPl (exposta em Id. de Seq. n°: 120); seqüência de nucleotideo promotora ZmPESP(Mol7) (exposta em Id. de Seq. n°: 121); seqüência de nucleotideo promotora ZmPESP(ASK) (exposta em Id. de Seq. n°: 129; seqüência de nucleotideo promotora ZmS24 (exposta em Id. de Seq. n°: 122); e seqüência de nucleotideo promotora ZmABCT (exposta em Id. de Seq. n°: 123) . Por "promotor" é objetivado uma região reguladora de DNA compreendendo freqüentemente uma caixa TATA capaz de direcionar a RNA polimerase II para iniciar a síntese de RNA no sítio de iniciação de transcrição apropriado para uma seqüência de codificação particular. Um promotor pode adicionalmente compreender outras seqüências de reconhecimento geralmente posicionadas acima ou 5' em relação a caixa TATA, referido como elementos promotores superiores, que influenciam a taxa de iniciação de transcrição.
[134] É reconhecido que se tendo identificado as seqüências de nucleotideo para as regiões promotoras aqui divulgadas, elas estão inseridas no estado da técnica para isolar e identificar elementos reguladores adicionais na região 5'-não traduzida à montante da região promotora particular aqui identificada. Assim, por exemplo, as respectivas regiões promotoras aqui divulgadas podem também compreeder elementos reguladores à montante que conferem expressão tecido-preferida das seqüências de nucleotideo heteróloga operativamente ligada à seqüência promotora divulgada. Veja particularmente, a Patente Australiana de número AU-A-77751/94 e Patentes U. S. de números 5.466.785 e 5.635.618.
[135] Os fragmentos e variantes das seqüências de nucleotideo promotoras ZmDGATl-2(Mol7), AmDGATl-2(ASK), ZmAAPl, ZmPESP(Mol7), ZmPESP(ASK), ZmS24 e ZmABCT são também abrangidos pela presente invenção. Por "fragmento" de uma seqüência promotora é objetivado uma porção da seqüência de nucleotideo promotora. Os fragmentos de uma seqüência de nucleotideo promotora podem reter atividade biológica e por conseguinte reter sua atividade reguladora transcricional. Assim, por exemplo, menos que a seqüência promotora inteira aqui divulgada pode ser utilizada para direcionar a expressão de uma seqüência de nucleotideo operativamente ligada de interesse, tal como uma seqüência de nucleotideo codificando uma proteína heteróloga. Alternativamente, fragmentos de uma seqüência promotora de nucleotideo que são úteis como marcadores de hibridização geralmente não retêm a atividade biológica. Assim, os fragmentos de uma seqüência promotora de nucleotideo podem variar de pelo menos cerca de 20 nucleotídeos, cerca de 50 nucleotídeos, cerca de 100 nucleotídeos, e até a seqüência promotora de nucleotideo de tamanho completo da invenção.
[136] Assim, um fragmento de uma seqüência promotora de nucleotideo ZmDGATl-2 (Mol7), ZmDGATl-2(ASK), ZmAAPl, ZmPESP(Mol7), ZmPESP(ASK), ZmS24 ou ZmABCT pode codificar uma porção biologicamente ativa do respectivo promotor, ou pode ser um fragmento que pode ser usado como um marcador de hibridização ou iniciador de PCR usando os métodos divulgados abaixo. Uma porção biologicamente ativa do promotor ZmDGATl-2 (Mol7), ZmDGATl-2(ASK) , ZmAAPl, ZmPESP(Mol7), ZmPESP(ASK), ZmS24 ou ZmABCT pode ser preparada isolando-se uma porção da respectiva seqüência promotora de nucleotideo da invenção, e analisando-se a atividade da porção do respectivo promotor. As moléculas de ácido nucleico que são fragmentos de uma seqüência promotora de nucleotideo ZmDGATl-2(Mol7), ZmDGATl-2(ASK), ZmAAPl, ZmPESP(Mol7), ZmPESP(ASK), ZmS24 ou ZmABCT compreendem pelo menos 16, 20, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450 nucleotideos ou até o número de nucleotideos presentes em uma seqüência promotora de nucleotideo ZmDGATl-2(Mol7) , ZmDGATl-2(ASK), ZmAAPl, ZmPESP(Mol7) , ZmPESP(ASK) , ZmS24 ou ZmABCT de comprimento total aqui divulgada (por exemplo, até 3.000 nucleotideos para o promotor ZmDGATl-2(Mol7), a seqüência complementar da qual está apresentada em Id. de Seq. n°: 119; até 3.000 nucleotideos para o promotor AmDGATl-2(ASK), a seqüência complementar da qual está apresentada em Id. de Seq. n°: 130; até 728 nucleotideos para o promotor ZmAAPl apresentado em Id. de Seq. n°: 120; até 3.000 nucleotideos para o promotor ZmPESP(Mol7) apresentado em Id. de Seq. n°: 121); até 3.000 nucleotideos para o promotor ZmPESP(ASK) apresentado em Id. de Seq. n°: 129); até 3.000 bp para o promotor ZmS24 apresentado em Id. de Seq. n°: 122); até 728 nucleotideos para o promotor ZmABCT apresentado em Id. de Seq. n°: 123) . Ensaios para determinar a atividade de uma seqüência promotora são bem conhecidos na técnica. Por exemplo, um fragmento promotor ZmDGATl-2(Mol7) ou variante pode ser operativamente ligado à seqüência de nucleotideo codificando qualquer proteína repórter, tal como a proteína β-glucuronidase (repórter GUS) ou a proteína luciferase. A construção do DNA é inserida no genoma de uma planta ou parte desta planta, e o mRNA ou o nível proteico da seqüência repórter é determinado. Ver, por exemplo, Eulgem e outros, (1999) EMBO Journal 18: 4689-4699.
[137]Os polinucleotídeos da invenção podem ser usados para isolar as seqüências correspondentes de outros organismos, particularmente, outras plantas, mais particularmente outras plantas tipo monocotiledôneas. Desta maneira, métodos tais como PCR, hibridização, e etc. podem ser usados para identificar tais seqüências baseadas em sua homologia de seqüência para as seqüências aqui expostas. Seqüências isoladas com base em sua identidade de seqüência para a seqüência inteira de um lócus marcador aqui divulgado, incluindo os cinco quadros de leitura abertos para a região de QTL6 aqui divulgada, para uma DGAT com teor de óleo normal aqui divulgada (por exemplo, ZmDGATl-2(EF09B)), ou para variantes e fragmentos destes, são abrangidas pela presente invenção. Tais seqüências incluem seqüências que são ortólogas das seqüências divulgadas. 0 termo "ortólogos" pretende significar genes derivados de um gene ancestral comum e que são encontrados em diferentes espécies como um resultado de evolução. Genes encontrado em espécies diferentes são considerados ortólogos quando suas seqüências de nucleotídeos e/ou suas seqüências de proteína codificadas compartilham pelo menos 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de seqüência. As funções de ortólogos são freqüentemente conservadas entre as espécies. Assim, os polinucleotideos isolados que codificam para uma proteina DGAT 1-2, uma proteina AAP1, uma PESP, uma proteina S24 ribossômica 40S, ou uma proteina ABCT, e que hibridizam-se sob condições severas às respectivas seqüências aqui divulgadas como Id. de Seq. n°s:47 ou 51 (ZmDGATl-2(ASK) e ZmDGATl-2(EF09B), respectivamente), 55, 57, 59 e 63, ou às variantes ou fragmentos destas, ou qualquer complemento destas, são abrangidas pela presente invenção. Similarmente, os polinucleotideos que conferem atividade promotora, e que hibridizam-se sob condições severas ao complemente das respectivas seqüências promotoras aqui divulgadas como Id. de Seq. n°s:120, 121, 122, 123, 129 e o complenento de Id. de Seq. n°: 119 ou o complemento de Id. de Seq. n°: 130, ou às variantes ou fragmentos destas, ou a qualquer complemento destas, são abrangidos pela presente invenção.
[138] Em um método de PCR, os iniciadores de oligonucleotideo podem ser designados para uso em reações de PCR para amplificar seqüências de DNA correspondentes a partir de cDNA ou DNA genômico extraído de qualquer planta de interesse. Métodos para designar os iniciadores de PCR e clonagem por PCR são geralmente conhecidos na técnica e estão divulgados em Sambrook e outros, (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York). Ver também Innis e outros, eds. (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, New York); Innis e Gelfand, eds. (1995) PCR Strategies (Academic Press, New York); e Innis e Gelfand, eds. (1999) PCR Methods Manual (Academic Press, New York). Os métodos conhecidos de PCR incluem, mas não estão limitados a, métodos que usam iniciadores emparelhados, iniciadores aninhados, iniciadores específicos únicos, iniciadores degenerados, iniciadores gene-específicos, iniciadores vetor-específico, iniciadores parcialmente desemparelhado, e etc.
[139]Nas técnicas de hibridização, toda ou parte de um polinucleotídeo conhecido é usada como um marcador que se hibridiza de forma seletiva a outros polinucleotídeos correspondentes presentes em uma população de fragmentos de DNA genômicos clonados ou de fragmentos de cDNA (isto é, bibliotecas genômicas ou de cDNA) de um organismo escolhido. Os marcadores de hibridização podem ser fragmentos de DNA genômicos, fragmentos de cDNA, fragmentos de RNA, ou outros oligonucleotídeos, e podem ser marcados com um grupo detectável tal como 32P, ou qualquer outro marcador detectável. Assim, por exemplo, os marcadores para hibridização podem ser feitos mancando-se oligonucleotídeos sintéticos com base nos polinucleotídeos para os loci marcadores favoráveis da invenção, incluindo Id. de Seq. n°s: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43 e 45, assim como os quadros de leitura abertos expostos em Id. de Seq. n°:47, 51, 55, 57, 59 e 63. Métodos de preparação dos marcadores para hibridização e para construção de cDNA e bibliotecas genômicas são geralmente conhecidos na técnica e estão divulgados em Sambrook e outros, (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York).
[140]Por exemplo, o polinucleotídeo ZmDGATl-2(ASK) inteiro aqui divulgado como Id. de Seq. n°:47, ou uma ou mais porções deste, ou o polinucleotídeo ZmDGATl-2(EF09B) inteiro aqui divulgado como Id. de Seq. n°:51, ou uma ou mais porções deste, pode ser usado como um marcador capaz de hibridizar-se especificamente aos polinucleotídeos DGATl-2 correspondente e RNAs mensageiros. Para alcançar hibridização específica sob uma variedade de condições, tais marcaodres incluem seqüências que são únicas entre as seqüências de polinucleotídeo DGATl-2 e possuem preferivelmente pelo menos um tamnaho de cerca de 10 nucleotídeo, e ainda mais preferivelmente pelo menos um tamanho de cerca de 20 nucleotídeos. Tais marcadores podem ser usados para amplificar os polinucleotídeos DGATl-2 correspondentes, particularmente os polinucleotídeos DGAT1-2 que possuem um ou mais dos polimorfismos identificados em Id. de Seq. n°:47, ou os polinucleotídeos DGAT-12 codificando variantes da proteína DGATl-2 com teor de óleo normal da invenção, a partir de uma planta escolhida por PCR. Esta técnica pode ser usada para isolar seqüências codificadoras adicionais a partir de uma planta desejada ou como um ensaio de diagnóstico para determinar a presença de seqüências codificadoras em uma planta. As técnicas de hibridização incluem seleção por hibridização de bibliotecas de DNA palqueadas (ou placas ou colônias; ver, por exemplo, Sambrook e outros, (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York).
[141] A hibridização de tais seqüências pode ser executada sob condições severas. Por "condições severas" ou "condições de hibridização severas" é objetivado condições sob as quais um marcador irá se hibridizar a sua seqüência alvo a um grau de forma mais detectável que a outras seqüências (por exemplo, pelo menos 2 vezes sobre a base). As condições severas são dependentes da seqüência e serão diferentes em diferentes circunstâncias. Controlando-se a severidade das condições de hibridização e/ou de lavagem, as seqüências alvo que são 100% complementares ao marcador podem ser identificadas (marcador homólogo). Alternativamente, as condições de severidade podem ser ajustadas para permitir algum desemparelhamento nas seqüências de modo que graus de similaridade menores sejam detectados (marcador heterólogo). Geralmente, um marcador é menor que cerca de 1.000 nucleotideos de tamanho, preferivelmente menor que 500 nucleotideos de tamanho.
[142] Tipicamente, condições severas serão àquelas nas quais a concentração de sal é menor que cerca de 1,5 M de ions Na, tipicamente uma concentração de cerca de 0,01 a 1,0 M de ions Na (ou outros sais) a um pH variando de 7,0 a 8,3 e a temperatura é de pelo menos cerca de 30°C para marcadores pequenos (por exemplo, de 10 a 50 nucleotideos) e pelo menos cerca de 60°C para marcadores longos (por exemplo, mais de 50 nucleotideos). As condições severas podem também ser alcançadas com a adição de agentes desestabilizantes tal como formamida. Condições de baixa severidade exemplares incluem hibridização com uma solução tampão de 30 a 35% de formamida, NaCl 1M, SDS (sulfato de dodecil sódico) 1% a 37°C, e uma lavagem em SSC de IX a 2X (SSC 20X = NaCl 3M/citrato trissódico 0,3M) a uma temperatura entre 50 e 55°C. Condições de severidade moderadas exemplares incluem hibridização em formamida 40 a 45%, NaCl 1M, SDS 1% a 37°C, e uma lavagem em SSC de 0,5X a IX a uma temperatura entre 55 e 60°C. Condições de severidade altas exemplares incluem hibridização em formamida 50%, NaCl 1M, SDS 1% a 37°C, e uma lavagem em SSC 0,1X a uma temperatura entre 60 e 65°C. Opcionalmente, os tampões de lavagem podem compreender de cerca de 0,1% a cerca de 1% de SDS. A duração da hibridização é geralmente menor que cerca de 24 horas, freqüentemente de cerca de 4 a cerca de 12 horas. A duração do tempo de lavagem será de pelo menos um período de tempo suficiente para alcançar o equilíbrio.
[143]A especificidade é tipicamente a função das lavagens pós-hibridização, sendo fatores importantes a força iônica e a temperatura da solução de lavagem final. Para os híbridos DNA-DNA, o Tm pode ser aproximado a partir da equação de Meinkoth e Wahl (1984) Anal. Biochem. 135:267-284: Tm = 81,5°C + 16,6 (log M) + 0,41 (% de GC) -0,61(% de form.) - 500/L; onde M é a molaridade dos cátions monovalentes, % de GC é o percentual de nucleotídeos guanosina e citosina no DNA, % de form. é o percentual de formamida na solução de hibridização, e L é o comprimento do híbrido nos pares de base. A Tm é a temperatura (sob força iônica e pH definidos) na qual 50% de uma seqüência alvo complementar hibridiza-se a um marcador perfeitamente emparelhado. A Tm é reduzida em cerca de 1°C para cada 1% de desemparelhamento; assim, Tm, hibridização, e/ou condições de lavagem podem ser ajustados para hibridizar às sequências da identidade desejada. Por exemplo, se seqüências com identidade > 90% são procuradas, a Tm pode ser diminuída 10°C. Geralmente, condições severas são selecionadas para estarem cerca de 5°C abaixo do ponto de fusão térmica (Tm) para a sequência específica e seu complemento a uma força iônica e pH definidos. Entretanto, condições bastante severas podem utilizar uma hibridização e/ou lavagem a 1, 2, 3 ou 4°C abaixo do ponto de fusão térmica (Tm) ; condições moderadamente severas podem utilizar uma hibridização e/ou lavagem a 6, 7, 8, 9 ou 10°C abaixo do ponto de fusão térmica (Tm) ; condições de severidade baixas podem utilizar uma hibridização e/ou lavagem a 11, 12, 13, 14, 15 ou 20°C abaixo do ponto de fusão térmica (Tm) . Usando-se a equação, composições de hibridização ou lavagem, e a Tm desejada, aqueles habilitados na técnica irão compreender que variações na severidade das soluções de hibridização e/ou lavagem estão inerentemente descritas. Se o grau desejado de desemparelhamento resulta em uma Tm de menos de 45 °C (solução aquosa) ou 32°C (solução de formamida), é preferido aumentar a concentração de SSC de modo que uma temperatura mais alta possa ser usada. Um guia extenso para a hibridização de ácidos nucléicos é encontrado em Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acld Probes, Parte I, Capítulo 2 (Elsevier, New York); e Ausubel e outros, eds. (1995) Current Protocola in Molecular Biology, Capítulo 2 (Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York). Ver Sambrook e outros (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York).
[144] Os seguintes termos são usados para descrever os relacionamentos de seqüência entre dois ou mais polinucleotideos ou polipeptideos: (a) "seqüência de referência", (b) "janela de comparação", (c) "identidade de seqüência", e (d) "percentual de identidade de seqüência".
[145] (a) Conforme aqui usado, a expressão "seqüência de referência" é uma seqüência definida usada como uma base para uma comparação de seqüência. Uma seqüência de referência pode ser um subconjunto ou a integridade de uma seqüência especificada, por exemplo, como um segmento de um cDNA de comprimento total ou seqüência do gene, ou o cDNA completo ou seqüência do gene.
[146] (b) Conforme aqui usado, a expressão "janela de comparação" faz referência a um segmento continuo e especificado de uma seqüência de polinucleotideo, onde a seqüência de polinucleotideo na janela de comparação pode compreender adições ou deleções (isto é, espaços) comparada à seqüência de referência (que não compreende adições ou deleções) para alinhamento ideal dos dois polinucleotideos. Geralmente, a janela de comparação possui pelo menos 20 nucleotideos continuos de tamanho, e opcionalmente pode ser de 30, 40, 50, 100 ou maior. Aqueles habilitados na técnica compreendem que para evitar uma alta similaridade a uma seqüência de referência devida à inclusão de espaços na seqüência de polinucleotideo, uma penalidade de intervalo é tipicamente introduzida e é subtraida a partir do número de emparelhamentos.
[147] Métodos de alinhamento de seqüências para comparação são bem conhecidos na técnica. Assim, a determinação do percentual de identidade de seqüência entre quaisquer duas seqüências pode ser executada usando-se um algoritmo matemático. Exemplos não limitantes de tais algoritmos matemáticos são o algoritmo de Myers e Miller (1988) CABIOS 4:11-11; o algoritmo de alinhamento local de Smith e outros (1981) Adv. Appl. Math. 2:482; algoritmo de alinhamento global de Needleman e Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443-453; método de pesquisa por alinhamento local de Pearson e Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sei. 85:2444-2448; o algoritmo de Karlin e Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87:2264, modificado como em Karlin e Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:5873-5877.
[148]As implementações de computador destes algoritmos matemáticos podem ser utilizadas para comparação de seqüências para determinar a identidade de seqüência. Tais implementações incluem, mas não estão limitadas a: CLUSTAL no programa PC/Gene (disponível a partir de Intelligenetics, Mountain View, Califórnia); o programa ALIGN (versão 2.0) e GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA e TFASTA no pacote de software GCG Wisconsin Genetics, Versão 10 (disponível a partir de Accelrys Inc., 9685 Scranton Road, San Diego, Califórnia, USA). Os alinhamentos que usam estes programas podem ser executados usando os parâmetros padrões. O programa CLUSTAL é bem descrito por Higgins e outros. (1988) Gene 73:237-244 (1988); Higgins e outros (1989) CABIOS 5:151-153; Corpet e outros (1988) Nucleic Acids Res. 16:10881-90, Huang e outros (1992) CABIOS 8:155-65; e Pearson e outros (1994) Meth. Mol. Biol, 24:307-331. O programa ALIGN é baseado no algoritmo de Myers e Miller (1988) supra. Uma tabela de resíduo de peso PAM120, uma penalidade de comprimento de intervalo de 12 e uma penalidade de intervalo de 4 podem ser usadas com o programa ALIGN quando se está comparando seqüências de aminoácido. Os programas BLAST de Altschul e outros (1990) J. Mol. Biol. 215:403 são baseados no algoritmo de Karlin e Altschul (1990) supra. As pesquisas de nucleotideo BLAST podem ser executadas com o programa BLASTN, pontuação = 100, tamanho de palavra = 12, para se obter seqüências de nucleotideo homólogas a uma seqüência de nucleotideo codificando uma proteina da invenção. As pesquisas de proteína BLAST podem ser executadas com o programa BLASTX, pontuação = 50, tamanho de palavra = 3, para se obter seqüências de aminoácidos homólogas a uma proteína ou polipeptídeo da invenção. Para se obter alinhamentos intervalados para propósitos de comparação, o Gapped BLAST (em BLAST 2.0) pode ser utilizado conforme descrito em Altschul e outros. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389.
Alternativamente, PSI-BLAST (em BLAST 2.0) pode ser usado para executar uma pesquisa repetida que detecta relações distantes entre as moléculas. Ver Altschul e outros (1997) supra. Quando se utiliza BLAST, Gapped BLAST, PSI-BLAST, os parâmetros dos respsctivos programas (por exemplo, BLASTN para seqüências de nucleotideo, BLASTX para proteínas) podem ser usados. Veja www.ncbi.nlm.nih.gov. O alinhamento pode também ser executado manualmente por inspeção.
[149]A menos que de outra forma afirmado, os valores de identidade de seqüência/similaridade aqui se referem ao valor obtido usando GAP versão 10 usando-se os seguintes parâmetros: % de identidade e % de similaridade para uma seqüência de nucleotideo usando-se GAP Weight de 50 e Length Weight de 3, e a matriz de pontuação nwsgapdna.cmp; % de indentidade e % de similaridade para uma seqüência de aminoácido usando GAP Weight de 8 e Length Weight de 2, e a matriz de pontuação BLOSUM62. Por "programa equivalente" é objetivado qualquer programa de comparação de seqüência que, para quaisquer duas seqüências em questão, gera um alinhamento possuindo emparelhamentos de nucleotideo idênticos ou de resíduos de aminoácido e um percentual de identidade de seqüência idêntico quando comparadas ao alinhamento correspondente gerado pelo GAP Versão 10.
[150]GAP usa o algorítimo de Needleman e Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443-453, para descobrir o alinhamento de duas seqüências completas que maximiza o número de emparelhamentos e minimiza o número de intervalos. 0 GAP considera todos os possíveis alinhamentos e posições do intervalo e cria o alinhamento com o maior número de bases emparelhadas e o menor número de intervalos. Ele leva em conta a provisão de uma penalidade de criação de intervalo e uma penalidade de extensão de intervalo em unidades de bases emparelhadas. O GAP deve tirar proveito do número de penalidades de criação de intervalo dos emparelhamentos de cada intervalo que ele insere. Se uma penalidade de extensão de intervalo maior que zero é escolhida, o GAP deve, além disso, tirar proveito para cada intervalo inserido do tamanho do intervalo vezes a penalidade de extensão do intervalo. Os valores padrões da penalidade de criação de intervalo e da penalidade de extensão do intervalo na Versão 10 do GCG Wisconsin Genetics Software Package para seqüências de proteína são 8 e 2, respectivamente. Para as seqüências de nucleotideo, a penalidade de criação de intervalo padrão é 50 enquanto a penalidade de extensão do intervalo padrão é 3. As penalidades de criação de intervalo e de extensão de intervalo podem ser expressas como um inteiro selecionado a partir do grupo de inteiros consistindo de 0 a 200. Assim, por exemplo, penalidades de criação de intervalo e de extensão de intervalo podem ser 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65 ou maiores.
[151] O GAP apresenta um elemento da família de alinhamentos melhores. Pode haver vários elementos desta família, mas nenhum outro elemento possui uma qualidade melhor. O GAP mostra quatro figuras de mérito para alinhamentos: Qualidade, Proporção, Identidade e Similaridade. A Qualidade é a medida maximizada a fim de alinhar as seqüências. A proporção é a qualidade dividida pelo número de bases no menor segmento. 0 percentual de identidade é o percentual dos símbolos que realmente se emparelham. O percentual de similaridade é o percentual dos simbolos que são similares. Os simbolos que estão através dos intervalos são ignorados. Uma similaridade é pontuada quando o valor da matriz de pontuação para um par de simbolos é maior ou igual a 0,50, o limite de similaridade. A matriz de pontuação usada na Versão 10 do GCG Wisconsin Genetics Software Package é BLOSUM62 (ver Henikoff e Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89:10915).
[152] (c) Conforme aqui usado, "identidade de seqüência" ou "identidade" no contexto das duas seqüências de polinucleotídeo ou polipeptídeo faz referência ao resíduo nas duas seqüências que são os mesmos quando alinhadas para correspondência máxima sobre uma janela de comparação específica. Quando o percentual de identidade de seqüência é usado em referência às proteínas, é reconhecido que as posições do resíduo que não sejam idênticos frequentemente diferem por substituições de aminoácido conservativas, onde os resíduos de aminoácido são substituídos por outros resíduos de aminoácido com propriedades químicas similares (por exemplo, carga ou hidrofobicidade) e portanto não mudam as propriedades funcionais da molécula. Quando as seqüências diferem em substituições conservativas, o percentual de identidade de seqüência pode ser ajustado para cima para corrigir a natureza conservativa da substituição. Seqüências que diferem por tais substituições conservativas são ditas como tendo "similaridade de seqüência" ou "similaridade". Meios para fazer este ajuste são bem conhecidos daqueles habilitados na técnica. Tipicamente, isto envolve pontuar uma substituição conservativa como um desemparelhamento parcial em vez de completo, assim aumentando o percentual de identidade de seqüência. Assim, por exemplo, onde a um aminoácido idêntico é dada uma pontuação de 1 e a uma substituição não conservativa é dada uma pontuação de zero, a uma substituição conservativa é dada uma pontuação entre zero e 1. A pontuação das substituições conservativas é calculada, por exemplo, conforme implementado no programa PC/GENE (Intelligenetics, Mountain View, Califórnia).
[153](d) Conforme aqui usado, "percentual de identidade de seqüência" significa o valor determinado pela comparação de duas seqüências perfeitamente alinhadas sobre uma janela de comparação, onde a porção da seqüência de polinucleotídeo na janela de comparação pode compreende adições ou deleções (isto é, intervalos) conforme comparada à seqüência de referência (que não compreende adições ou deleções) para alinhamento ideal das duas seqüências. 0 percentual é calculado pela determinação do número de posições nas quais a base do ácido nucléico ou resíduo de aminoácido idênticos ocorre em ambas as seqüências para produzir o número de posições emparelhadas, dividindo-se o número de posições emparelhadas pelo número total de posições na janela de comparação, e multiplicando-se o resultado por 100 para produzir o percentual de identidade de seqüência. (D) Cassete de Expressão [154] O uso do termo "polinucleotídeo" não é objetivado para limitar a presente invenção aos polinucleotídeos que compreendem DNA. Aqueles habilitados na técnica irão reconhecer que os polinucleotídeos, podem compreender ribonucleotídeos e combinações de ribonucleotídeos e desoxiribonucleotídeos. Tais desoxirribonucletídeos e ribonucleotídeos incluem tanto moléculas que ocorrem naturalmente quanto análogos sintéticos. Os polinucleotídeos da invenção também abrangem todas as formas de seqüências incluindo, mas não limitadas às formas de filamento único, formas de duplo filamento, grampo de cabelo, estruturas "stem-and-loop", e etc.
[155] Quaisquer seqüências de polinucleotídeo associadas ao alto teor de óleo ou alto teor de ácido oléico na região de QTL6 que confira o traço fenotípico de alto teor de óleo e/ou alto teor de ácido oléico e/ou relação aumentada entre o ácido oléico e ácido linoléico, incluindo as seqüências de loci marcadores expostas em Id. de Seq. n°s:l, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43 e 45, e as seqüências codificadoras expostas em Id. de Seq. n°s:47, 55, 57, 59 e 63, assim como as variantes e fragmentos destas, podem ser incluídas como parte de um cassete de expressão. Assim, por exemplo, os polinucleotídeos codificando a DGAT de alto teor de óleo/alto teor de ácido oléico (isto é, ZmDGATl-2(ASK)), permease de aminoácido, PESP, proteína ribossômica ou a proteína transportadora ABC da invenção podem ser fornecidas em cassetes de expressão para expressão na planta de interesse. Alternativamente, ou em adição a uma ou mais destas seqüências de loci marcadores, o polinucleotídeo codificando a DGAT com teor de óleo normal da invenção (por exemplo, Id. de Seq. n°:51 codificando ZmDGATl-2 (EF0 9B) de Id. de Seq. n°:52), assim como as variantes e fragmentos destas, podem ser incluídas no mesmo ou em diferentes cassetes de expressão para fornecer superexpressão da DGAT com teor de óleo normal. Destaforma, o cassete irá incluir as seqüências reguladoras 5' e 3' operativamente ligadas a um polinucleotídeo codificando a DGAT com alto teor de óleo/alto teor de ácido oléico, DGAT com teor normal de óleo, permease de aminoácido, PESP, proteína ribossômica ou a proteína transportadora ABC da invenção. "Operativamente ligado" é objetivado para significar uma ligação funcional entre dois ou mais elementos. Por exemplo, uma ligação operável entre um polinucleotídeo de interesse e uma seqüência reguladora (isto é, um promotor) é uma ligação funcional que permite a expressão do polinucleotídeo de interesse. Elementos operativamente ligados podem ser contínuos ou não contínuos. Quando usada para se referir à união de duas regiões codificadoras de proteína, a expressão "operativamente ligada" objetiva significar que as regiões codificadoras estão no mesmo quadro de leitura. 0 cassete pode conter adicionalmente pelo menos um gene adicional para ser co-transformado no organismo. Alternativamente, o(s) gene(s) adicional(ais) pode(m) ser fornecido(s) em cassetes de expressão múltiplos. Tal cassete de expressão é fornecido com uma pluralidade de sítios de restrição e/ou sítios de recombinação para inserção do polinucleotídeo de interesse, por exemplo, polinucleotídeos codificando a DGTA de alto teor de óleo/alto teor de ácido oléico, a DGAT com teor normal de óleo, permease de aminoácido, PESP, proteína ribossômica ou a proteína transportadora ABC da invenção, para estar sob regulação transcricional das regiões reguladoras. 0 cassete de expressão pode adicionalmente conter genes marcadores selecionáveis.
[156]0 cassete de expressão incluirá na diração 5'-3' de transcrição, uma região de início transcricional e traducional (isto é, um promotor), um polinucleotídeo da invenção, por exemplo, um polinucleotídeo codificando a DGTA de alto teor de óleo/alto teor de ácido oléico, a DGAT com teor normal de óleo, permease de aminoácido, PESP, proteína ribossômica ou a proteína transportadora ABC da invenção, e uma região de finalização transcricional e traducional (isto é, uma região de finalização) funcional em plantas. As regiões reguladoras (isto é, promotores, regiões reguladoras transcricionais e regiões de finalização traducional) e/ou o polinucleotídeo da invenção podem ser nativos/análogos à célula hospedeira ou entre si. Alternativamente, as regiões reguladoras e/ou o polinucleotideo da invenção podem ser heterólogos à célula hospedeira ou entre si. Conforme aqui usado, "heterólogo" em referência a uma seqüência é uma seqüência que se origina de uma espécie estranha, ou, se da mesma espécie, é substancialmente modificada a partir de sua forma nativa em composição e/ou lócus genômico por intervenção humana deliberada. Por exemplo, um promotor operativamente ligado a um polinucleotideo heterólogo é de uma espécie diferente daquela espécie a partir da qual o polinucleotideo foi derivado, ou, se da mesma espécie ou de espécia análoga, um ou ambos são substancialmente modificados a partir de sua forma original e/ou lócus genômico, ou o promotor não é o promotor mativo para o polinucleotideo operativamente ligado. Conforme aqui usado, um gene quimérico compreende uma seqüência de codificação operativamente ligada a uma região de iniciação de transcrição que é heteróloga à seqüência de codificação.
[157] Embora possa ser ideal expressar as seqüências usando-se promotores heterólogos, as seqüências promotoras nativas podem ser usadas. Tais construções podem mudar os níveis de expressão da DGTA de alto teor de óleo/alto teor de ácido oléico, a DGAT com teor normal de óleo, permease de aminoácido, PESP, proteína ribossômica ou a proteína transportadora ABC da invenção na planta ou célula da planta. Assim, o fenótipo da planta ou célula de planta pode ser alterado.
[158] Desta maneira, a expressão da DGTA de alto teor de óleo/alto teor de ácido oléico, por exemplo, a ZmDGATl- 2 (ASK) de Id. de Seq. n°:48, codificada, por exemplo, pelo polinucleotídeo ZmDGATl-2(ASK) exposto em Id. de Seq. n°:47, pode ser direcionada por sua seqüência promotora nativa (o filamento complementar ao promotor ZmDGATl-2(ASK) está exposto em Id. de Seq. n°: 130), ou uma seqüência promotora para um polipeptideo DGAT relacionado, por exemplo, a seqüência promotora ZmDGATl-2(Mol7) (o filamento complementar ao promotor ZmDGATl-2(Mol7) está exposto em Id. de Seq. n°: 119) ou variantes biologicamente ativas destes.
[159] De maneira semelhante, a expressão da DGTA de teor de óleo normal, por exemplo, a ZmDGATl-2(Mol7) de Id. de Seq. n°:50, codificada, por exemplo, pelo polinucleotídeo ZmDGATl-2 (Mol7) exposto em Id. de Seq. n°:49, pode ser direcionada por sua seqüência promotora nativa (o filamento complementar ao promotor ZmDGATl-2(Mol7) está exposto em Id. de Seq. n°: 119), ou uma seqüência promotora para um polipeptideo DGAT relacionado, por exemplo, a seqüência promotora ZmDGATl-2(ASK) (o filamento complementar ao promotor ZmDGATl-2(ASK)) está exposto em Id. de Seq. n°: 130) ou variantes biologicamente ativas destes.
[160] Similarmente, a expressão da ZmAAPl de Id. de Seq. n°:56, codificada, por exemplo, pelo polinucleotídeo ZmAAPl exposto em Id. de Seq. n°:55, pode ser direcionada por sua seqüência promotora nativa, exposta como os nucleotídeos 6161-6888 de Id. de Seq. n°: 117 (ver também Id. de Seq. N°: 120) ou uma variante biologicamente ativa destes. A expressão da ZmPESP de Id. de Seq. n°:58, codificada, por exemplo, pelo polinucleotídeo ZmPESP exposto em Id. de Seq. n°:57, pode ser direcionada por sua seqüência promotora nativa, exposta como os nucleotideos 153888-156887 de Id. de Seq. n° : 116 (ver também Id. de Seq. N°: 121) uma variante biologicamente ativa destes (ver, por exemplo, a seqüência promotora ZmPESP(ASK) exposta em Id. de Seq. n°: 129) . A expressão da ZmS24 de Id. de Seq. n°:60, codificada, por exemplo, pelo polinucleotideo ZmS24 exposto em Id. de Seq. n°:59, pode ser direcionada por sua seqüência promotora nativa, exposta como os nucleotideos 1824-4823 de Id. de Seq. n°: 117 (ver também Id. de Seq. N°: 122) ou uma variante biologicamente ativa destes. A expressão da ZmABCT de Id. de Seq. n°:64, codificada, por exemplo, pelo polinucleotideo ZmABCT exposto em Id. de Seq. n°:63, pode ser direcionada por sua seqüência promotora nativa, exposta como os nucleotideos 254826-257825 de Id. de Seq. n° : 116 (ver também Id. de Seq. N°: 123) ou uma variante biologicamente ativa destes.
[161]A região de finalização pode ser nativa com a região de iniciação transcricional, pode ser nativa com o polinucleotideo de interesse operativamente ligado, pode ser nativa com o hospedeiro da planta, ou pode ser derivada de uma outra fonte (isto é, estranha ou heteróloga) em relação ao promotor, polinucleotideo de interesse, hospedeiro de planta ou qualquer combinação destes. Regiões de terminação convenientes estão disponíveis a partir de Ti-plasmídeo de A. tumefaciens, tal como as regiões de terminação de sintase de octopina e sintase de nopalina. Ver também Guerineau e outros (1991) Mol. Gen. Genet. 262:141-144; Proudfoot (1991) Cell 64:671-674; Sanfacon e outros (1991) Genes Dev. 5:141-149; Mogen e outros, (1990) Plant Cell 2:1261-1272; e Munroe e outros (1990) Gene 91:151-158; Bailas e outros (1989) Nucleic Acids Res. 17:7891-7903, e Joshi e outros (1987) Nucleic Acids Res. 15:9627-9639.
[162] Onde apropriado, os polinucleotídeos podem ser otimizados para expressão aumentada na planta transformada. Isto é, os polinucleotídeos podem ser sintetizados usando-se códons de planta preferida para expressão melhorada. Ver, por exemplo, Campbell e Gowri (1990) Plant Physiol. 92:1-11 para uma discussão de uso de códom hospedeiro preferido. Métodos estão disponíveis na técnica para sintetizar os genes de planta preferida. Veja, por exemplo, as Patentes U. S. de números 5.380.831 e 5.436.391, e Murray e outros, (1989) Nucleic Acids Res. 17:477-498, aqui incorporada para referência.
[163] Sabe-se que as modificações de seqüência adicionais melhoram a expressão do gene em uma célula hospedeira. Estas incluem a eliminação de seqüências codificando sinais de poliadenilação espúria, sinais de sítio de junção exon-intron, repetições semelhante a transposon, e outras tais seqüências bem caracterizadas que podem ser deletérias à expressão do gene. O conteúdo de G-C da seqüência pode ser ajustado a níveis médios para um dado hospedeiro celular, conforme calculado com referência aos genes conhecidos expressos na célula hospedeira. Quando possível, a seqüência é modificada para evitar as previstas estruturas de mRNA secundário de grampo de cabelo.
[164] O cassete de expressão pode adicionalmente conter seqüências líderes 5'. Tais seqüências líderes podem atuar para melhorar a tradução. Os líderes de tradução são conhecidos na técnica e incluem: lideres de picomavírus, por exemplo, lider de EMCV (região não codificadora 5' de encefalomiocardite) (Elroy-Stein e outros (1989) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86:6126-6130); lider de potivirus, por exemplo, lider TEV (Virus "Etch" do Fumo) (Gallie e outros (1995) Gene 165(2):233-238), lider de MDMV (Virus do Mosaico do Milho ("Maize Dwarf Mosaic Virus")) (Virology 154:9-20), e proteína de ligação de cadeia extensa de imunoglobulina humana (BiP) (Macejak e outros (1991) Nature 353:90-94); líder não traduzido do mRNA de proteína da cobertura de vírus do mosaico de alfafa (AMV RNA 4) (Jobling e outros (1987) Nature 325:622-625); líder de vírus do mosaico de fumo (TMV) (Gallie e outros (1989) em Molecular Biology of RNA, ed. Cech (Liss, New York), pág. 237-256); e líder de "Vírus do Mosqueado Clorótico do Milho" (MCMV) (Lommel e outros (1991) Virology 81:382-385). Ver também Della-Cioppa e outros (1987) Plant Physiol. 84:965-968.
[165]Na preparação do cassete de expressão, os vários fragmentos de DNA podem ser manipulados, de modo a atender à necessidade de seqüências de DNA na orientação adequada e, conforme apropriado, no quadro de leitura adequado. Para este fim, adaptadores ou ligantes podem ser empregados para unir os fragmentos de DNA ou outras manipulações podem ser envolvidas para atender à necessidade por sítios de restrição convenientes, remoção de DNA supérfluo, remoção de sítios de restrição, e etc. Para este propósito, a mutagênese in vitro, reparação do iniciador, restrição, fortalecimento, ressubstituições. Por exemplo, transições e transversões, podem estar envolvidas.
[166] Vários promotores podem ser usado na prática da invenção, incluindo o promotor nativo da seqüência de polinucleotideo de interesse. Os promotores podem ser selecionados com base no resultado desejado. Os ácidos nucleicos podem ser combinados com promotores constitutivos, tecido-preferido ou outros promotores para expressão em plantas.
[167] Tais promotores constitutivos incluem, por exemplo, o promotor central do promotor Rsyn7 e outros promotores constitutivos divulgados em WO 99/43838 e Patente U. S. de número 6.072.050; o promotor 35S CaMV central (Odell e outros, (1985) Nature 313:810-812); actina de arroz (McElroy e outros, (1990) Plant Cell 2:163-171); ubiquitina (Christensen e outros (1989) Plant Mol. Biol. 12:619-632 e Christensen e outros (1992) Plant Mol. Biol. 16:675-689); pEMU (Last e outros (1991) Theor. Appl. Genet. 81:581-588); MAS (Velten e outros (1984) EMBO J. 3:2723-2730); promotor ALS (Patente U. S. de número 5.659.026) e etc. Outros promotores constitutivos incluem, por exemplo, as Patentes U. S. de números 5.608.149; 5.608.144; 5.604.121; 5.569.597; 5.466.785; 5.399.680; 5.268.463; 5.608.142 e 6.177.611.
[168] Os promotores regulados quimicamente podem ser usados para modular a expressão de um gene em uma planta através da aplicação de um regulador químico exógeno. Dependendo do objetivo, o promotor pode ser um promotor indutível quimicamente, onde a aplicação do produto químico induz a expressão do gene, ou um promotor reprimível quimicamente, onde a aplicação do produto químico reprime a expressão do gene. Os promotores indutíveis quimicamente são conhecidos na técnica e incluem, mas não estão limitados ao promotor In2-2 de milho, que é ativado por herbicidas de benzenossulfonamida e safeners, o promotor GST de milho, que é ativador por compostos hidrofóbicos eletrofilicos que são usados como herbicidas pré- emergentes, e o promotor PR-la de tabaco, que é ativado por ácido salicilico. Outros promotores regulados quimicamente de interesse incluem promotores responsivos a esteróides (veja, por exemplo, o promotor indutivel por glicocorticóide em Schena e outros (1991) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88:10421-10425; McNellis e outros (1998) Plant J. 14(2):247-257) e promotores indutiveis por tetraciclina e reprimiveis por tetraciclina (veja, por exemplo, Gatz e outros (1991) Mol. Gen. Genet. 227:229-237) , e Patentes U. S. de números 5.814.618 e 5.789.156), aqui incorporadas para referência.
[169]Os promotores de tecido preferido podem ser utilizados para objetiva a expressão melhorada da seqüência de interesse, por exemplo, a DGTA de alto teor de óleo/alto teor de ácido oléico, a DGAT com teor normal de óleo, permease de aminoácido, PESP, proteína ribossômica e/ou a proteína transportadora ABC da invenção, dentro de um tecido de planta particular. Os promotores de tecido preferido incluem Yamamoto e outros, (1997) Plant Cell 12:2255; e Kawamata e outros (1997) Plant Cell Physíol. 38(7):792-803; Hansen e outros (1997) Mol. Gen Genet. 254(3):337-343,- Russell e outros (1997) Transgenic Res. 6(2): 157-168, Rinehart e outros, (1996) Plant Physiol. 112(3):1331-1341,- Van Camp e outros (1996) Plant Physiol. 112(2):525-535,- Canevascini e outros (1996) Plant Physiol. 112(2):513-524,- Yamamoto e outros (1994) Plant Cell Physiol. 35(5):773-778; Lam (1994) Results Probl. Cell Differ. 20:181-196, Orozco e outros (1993) Plant Mol Biol. 23(6): 1129-1138; Matsuoka e outros (1993) Proc. Natl.
Acad. Sei. USA 90(20):9586-9590,- e Guevara-Garcia e outros (1993) Plant J. 4(3):495-505. Tais promotores podem ser modificados, se necessário, para expressão mais fraca.
[170]Promotores de "semente preferida" incluem os promotores "específicos a semente" (aqueles promotores ativos durante o desenvolvimento da semenete tais como os promotores das proteínas de armazenagem de semente) assim como os promotores de "germinação de semente" (aqueles promotores ativos durante a germinação da semente). Ver Thompson e outros (1989) BioEssays 10:108, aqui incorporada para referência. Tais promotores de semente preferida incluem, mas não estão limitados a Ciml (mensagem induzida por citoquina); cZ19Bl (zeína de 19 kDa de milho); milps (mio-inositol-l-fosfato sintase) (veja WO 00/11177 e Patente U. S. de número 6.225.529; aqui incorporada para referência). A gama-zeína é um promotor específico a endosperma. Globulina 1 (Glb-1) é um promotor específico a embrião representativo. Para dicotilédones, os promotores específicos a semente incluem, mas não estão limitados a β-faseolina de feijão, napina, β-conglicinina, lecitina de soja, cruciferina e etc. Para monocotilédones, os promotores específicos a semente incluem, mas não estão limitados a zeína de 15 kDa de milho, zeína de 22 kDa, zeína de 27 kDa, gama-zeína, ceráceos, shrunken 1, shrunken 2, Globulina 1, etc. Veja também WO 00/12733, onde os promotores de semente preferida dos genes endl e end2 são divulgados; aqui incorporados por referência.
[171]0 cassete de expressão pode também compreender um gene marcador selecionável para a seleção de células transformadas. Os genes marcadores selecionáveis são utilizados para a seleção de células ou tecidos transformados. Os genes marcadores incluem genes que codificam resistência a antibiótico, tais como aqueles que codificam a neomicina fosfotransferase II (NEO) e higromicina fosfotransferase (HPT), assim como genes que conferem resistência a compostos herbicidas, tais como glufosinato de amônio, bromoxinil, imidazolinonas e 2,4-diclorofenoxiacetato (2,4-D). Marcadores selecionáveis adicionais incluem marcadores fenotípicos tais como β-galactosidase e proteínas fluorescentes tais como proteína verde fluorescente (GFP) (Su e outros (2004) Biotechnol Bioeng 55:610-9 e Fetter e outros (2004) Plant Cell 76:215-28), proteína ciano fluorescente (CYP) (Boite e outros (2004) J. Cell Science 117:943-54 e Kato e outros (2002) Plant Physiol 129:913-42), e proteína amarela fluorescente (PhiYFP™ de Evrogen, veja, Boite e outros (2004) J. Cell Science 117:943-54). Para marcadores selecionávies adicionais, veja geralmente, Yarranton (1992) Curr. Opin. Biotech. 3:506-511; Christopherson e outros, (1992) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89:6314-6318; Kuziel e outros (1992) Cell 71:63-72; Reznikoff (1992) Mol. Microbiol. 6:2419-2422; Barkley e outros (1980) em The Operon, páginas 177220; Hu e outros (1987) Cell 48:555-566; Brown e outros (1987) Cell 49:603-612; Figge e outros (1988) Cell 52:713-722; Deuschle e outros (1989) Proc. Natl. Acad. Aci. USA 86:5400-5404; Fuerst e outros (1989) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86:2549-2553; Deuschle e outros (1990) Science 248:480-483; Gossen (1993) Ph.D. Thesis, University of Heidelberg; Reines e outros (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:1917-1921; Labow e outros (1990) Mol. Cell. Bíol. 10:3343-3356; Zambretti e outros (1992) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89:3952-3956; Bairn e outros (1991) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88:5072-5076; Wyborski e outros (1991) Nucleic Acids Res. 19:4647-4653; Hillenand-Wissman (1989) Topics Mol. Struc. Biol. 10:143-162; Degenkolb e outros (1991) Antimicrob. Agents Chemother. 35:1591-1595; Kleinschnidt e outros (1988) Biochemistry 27:1094-1104; Bonin (1993) Ph.D. Thesis, University of Heidelberg; Gossen e outros (1992) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89:5547-5551; Oliva e outros (1992) Antimicrob. Agents Chemother. 36:913-919; Hlavka e outros (1985) Handbook of Experimental Pharmacology, Vol. 78 (Springer-Verlag, Berlin); Gill e outros (1988) Nature 334:721-724. Tais divulgações estão aqui incorporadas por referência.
[172] A lista acima de genes marcadores selecionáveis não é objetivada para ser limitante. Qualquer gene marcador selecionável pode ser usado na presente invenção. (E) Métodos de Introdução do Polinucleotideo Recombinante em uma Planta ou Parte desta Planta [173] Os métodos da invenção envolvem introduzir um polipeptideo ou polinucleotideo em uma planta. "Introduzir" é objetivado para significar apresentar à planta o polinucleotideo ou polipeptideo de tal forma que a seqüência ganhe acesso ao interior de uma célula da planta. Os métodos da invenção não dependem de um método particular para introduzir uma seqüência em uma planta, apenas que o polinucleotídeo ou polipeptideo ganha acesso ao interior de pelo menos uma célula da planta. Métodos para introduzir o polinucleotídeo ou polipeptideo em plantas são conhecidos na técnica incluindo, mas não limitados a, métodos de transformação estável, métodos de transformação transitória, e métodos mediados por vírus.
[174] Por "transformação estável" é objetivado que a construção de nucleotídeo introduzida em uma planta integre-se dentro do genoma da planta e seja capaz de ser herdado pela prole deste. "Transformação transitória" é objetivada para significar que um polinucleotídeo é introduzido na planta e não se integra no genoma da planta ou um polipeptideo é introduzido em uma planta.
[175] Os protocolos de transformação assim como os protocolos para a introdução de seqüências de polipeptídeos e polinucleotídeos em plantas podem variar dependendo do tipo de planta ou célula de planta, isto é, monocotilédone ou dicotilédone, objetivado para transformação. Métodos adequados de introdução de polipeptídeos e polinucleotídeos em células de planta incluem microinjeção (Crossway e outros (1986) BioTechniques 4:320-334), eletroporação (Riggs e outros (1986) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 83:5602-5606, transformação mediada por Agrobacterium (Patente U.S. de número 5.563.055 e Patente U.S. de número 5.981.840), transferência de gene direta (Paszkowski e outros (1984) EMBO J. 3:2717-2722), e aceleração balística de partícula (veja, por exemplo, Patente U. S. de número 4.945.050; Patente U. S. de número 5.879.918; Patentes U. S. de números 5.886.244 e 5.932.782; Tomes e outros (1995) em Plant Cell, Tissue, e Organ Culture: Fundamental Methods, ed. Gamborg e Phillips (Springer-Verlag, Berlin); McCabe e outros (1988) Biotechnology 6:923-926); e transformação de Lecl (WO 00/28058). Veja também Weissinger e outros (1988) Ann. Rev. Genet. 22:421-477; Sanford e outros (1987) Particulate Science and Technology 5:27-37 (cebola); Christou e outros (1988) Plant Physiol. 87:671-674 (soja); McCabe e outros (1988) BioTechnology 6:923-926 (soja); Finer e McMullen (1991) In Vitro CellDev. Biol. 27P:175-182 (soja); Singh e outros (1998) Theor. Appl. Genet. 96:319324 (soja); Datta e outros (1990) Biotechnology 8:736-740 (arroz); Klein e outros (1988) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85:4305-4309 (milho); Klein e outros (1988) Biotechnology 6:559-563 (milho); Patentes U. S. de números 5.240.855; 5.322.783 e, 5.324.646; Klein e outros (1988) Plant Physiol. 91:440-444 (milho); Fromm e outros (1990) Biotechnology 8:833-839 (milho); Hooykaas-Van Slogteren e outros (1984) Nature (London) 311:763-764; Patente U. S. de número 5.736.369 (cereais); Bytebier e outros (1987) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84:5345-5349 (Liliaceae) ; De Wet e outros (1985) em The Experimental Manipulation of Ovule Tissues, ed. Chapman e outros (Longman, New York), páginas 197-209 (pólen); Kaeppler e outros (1990) Plant Cell Reports 9:415-418 e Kaeppler e outros (1992) Theor. Appl. Genet. 84:560-566 (transformação mediada por pêlos); D'Halluin e outros (1992) Plant Cell 4:1495-1505 (eletroporação); Li e outros (1993) Plant Cell Reports 12:250-255 e Christou e Ford (1995) Annals of Botany 75:407-413 (arroz); Osjoda e outros (1996) Nature Biotechnology 14:745-750 (milho através de Agrobacterium tumefaciens); todos os quais estão aqui incorporados por referência. Em modalidades especificas, um ou mais dos polinucleotideos da invenção, por exemplo, as seqüências dos loci marcadores expostas em Id. de Seq. n°s: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43 e 45, e as seqüências condif icadoras expostas em Id. de Seq. n°s: 47, 51, 55, 57, 59 e 63, assim como variantes e fragmentos destes, podem ser fornecidos a uma planta usando-se uma variedade de métodos de transformação transitórios. Tais métodos de transformação transitórios incluem, mas não estão limitados à introdução da DGTA de alto teor de óleo/alto teor de ácido oléico, a DGAT com teor normal de óleo, permease de aminoácido, PESP, proteína ribossômica e/ou a proteína transportadora ABC da invenção ou variantes e fragmentos destas diretamente na planta ou a introdução na planta de um polinucleotídeo codificando estas respectivas proteínas. Tais métodos incluem por exemplo, microinjeção ou bombardeamento de partículas. Veja, por exemplo, Crossway e outros (1986) Mol Gen. Genet. 202:179-185; Nomura e outros (1986) Plant Sei. 44:53-58; Hepler e outros (1994) Proc. Natl. Acad. Sei. 91: 2176-2180 e Hush e outros (1994) The Journal of Cell Science 107:775-784, todas as quais estão aqui incorporadas por referência. Alternativamente, o polinucleotídeo de interesse, incluindo as seqüências dos loci marcadores expostas em Id. de Seq. n°s: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19,21,23,25,27,29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43 e 45, e as seqüências codificadoras expostas em Id. de Seq. n°s:47, 51, 55, 57, 59 e 63, assim como variantes e fragmentos destes, podem ser transformados de forma transitória na planta usando-se métodos conhecidos na técnica. Tais técnicas incluem sistema de vetor viral e a precipitação do polinucleotideo de uma maneira que se evite a liberação subsequente do DNA. Assim, a transcrição do DNA ligado a partícula pode ocorrer, mas a frequência com a qual ele é liberado para se tornar integrado no genola é reduzida enormemente. Tais métodos incluem o uso de partículas revestidas com polietilimina (PEI; Sigma #P3143).
[176] Em outras modalidades, o polinucleotideo da invenção podem ser introduzido em plantas através do contato das plantas com um vírus ou ácidos nucléicos virais. Geralmente, tais métodos envolvem incorporar uma construção de nucleotídeo da invenção dentro de uma molécula de DNA ou RNA viral. É reconhecido que um polipeptídeo da invenção, por exemplo, a DGTA de alto teor de óleo/alto teor de ácido oléico, a DGAT com teor normal de óleo, permease de aminoácido, PESP, proteína ribossômica e/ou a proteína transportadora ABC da invenção pode ser iniciamente sinstetizado como parte de uma poliproteína viral, que pode ser processada depois por proteólise in vivo ou in vitro para produzir a proteína recombinante desejada. Também, é reconhecido que os promotores da invenção também abrange, promotores utilizados para transcrição por polimerases de RNA viral. Métodos para introduzir polinucleotídeos em plantas e expressar uma proteína codificada nesta, envolvendo moléculas de DNA ou RNA viral, são conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Patente U. S. de número 5.889.191, 5.889.190, 5.866.785, 5.589.367 e 5.316.931, e Porta e outros (1996) Molecular Biotechnology 5:209-221; aqui incorporados por referência.
[177] Os métodos são conhecidos na técnica para a inserção objetivada de um polinucleotideo em uma localização especifica no genoma da planta. Em uma modalidade, a inserção do polinucleotideo em um local genômico desejado é alcançada usando-se um sistema de recombinação sitio-especifica. Veja, por exemplo, W099/25821, W099/25854, WO99/25840, W099/25855 e W099/25853, todos os quais estão aqui incorporados por referência. Resumidamente, o polinucleotideo da invenção pode estar contido no cassete de transferência flanqueado por dois sítios de recombinação não recombinogênicos. 0 cassete de transferência é introduzido em uma planta possuindo estavelmente incorporado em seu genoma um sítio alvo que é flanqueado por dois sítis de recombinação não recombinogênicos que correspondem aos sítios do cassete de transferência. Uma recombinase apropriada é fornecida e o cassete de transferência é integrado no sítio alvo. 0 polinucleotideo de interesse é portanto integrado em uma posição cromossomial específica no genoma da planta.
[178]As células que foram transformadas podem ser desenvolvidas em plantas de acordo com formas convencionais. Ver, por exemplo, McCormick e outros, (1986) Plant Cell Reports 5:81-84. Estas plantas podem então ser desenvolvidas, e ou polinizadas com a mesma cepa transformada ou com cepas diferentes, e a prole resultante possuindo expressão constitutiva da característica fenotípica desejada identificada. Duas ou mais gerações podem ser desenvolvidas para assegurar que a expressão da característica fenotípica desejada seja mantida de forma estável e herdada e então as sementes colhidas para assegurar que a expressão da característica fenotípica desejada foi alcançada. Desta maneira, a presente invenção fornece a semente transformada (também referida como "semente transgência") possuindo um polinucleotideo da invenção, por exemplo, um cassete de expressão da invenção, estavelmente incorporado em seu genoma. (F) Plantas e Partes destas Plantas [179] As composições da invenção também incluem plantas, partesd e planta e células de planta possuindo um ou mais dos polinucleotideos recombinantes da invenção. Nas modalidades especificas, o(s) polinucleotideo(s) recombinante(s) está(ão) estavelmente integrado(s) no genoma da planta, parte da planta ou célula da planta.
[180] Conforme aqui usado, o termo planta inclui células de planta, protoplastos de planta, culturas de tecido de célula de planta a partir das quais as plantas podem ser regeneradas, calos de planta, molhos de planta e células de planta que estão intactos nas plantas ou partes da planta tais como embriões, (germe) pólen, óvulos, sementes, folhas, flores, ramos, frutos, cernes, espigas, sabugos, cascas, talos, raizes, pontas de raizes, anteras e etc. Grão é objetivado para significa a semente madura produzida por produtores comerciais para propósitos outros que não o desenvolvimento ou reprodução da espécie. A prole, variantes, e mutantes das plantas regeneradas estão também incluídos dentro do escopo da invenção, desde que estas partes compreendam os polinucleotideos introduzidos.
[181] A presente invenção pode também ser udada para transformação de qualquer espécie de planta, incluindo, mas não limitada a monocotilédones e edicotilédones. Exemplos de espécies de planta de interesse incluem, mas não estão limitados a milho (Zea mays) , Brassica sp. B. napus, B. rapa, B. juncea), particularmente aquelas espécies de Brassica úteis como fontes de óleo de semente, alfafa (Medicago sativa) , arroz (Oryza sativa) , centeio (Secale cereale), sorgo (Sorghum vulgare), milho miúdo ou painço (por exemplo, milho miúdo perolado (Pennisetum glaucum), milho miúdo comum/proso (Panicum miliaceum), milho painço da Itália (Setaria italica), milho miúdo palito (Eleusine coracana), girassol (Helianthus annuus), cártamo (Carthamus tinctorius), trigo (Triticum aestivum) , soja (Glycine max), tabaco (Nicotiana tabacum), batata (Solanum tuberosum), amendoim (Arachis hypogaea), algodão (Gossypium barbadense, Gossypium hirsutum), batata doce (Ipomoea batatus), mandioca (Manihot esculenta), café (Coffea spp.), coco (Cocos nucifera) , abacaxi (Ananas comosus), árvores cítricas (Citrus spp.), cacau (Theobroma cacao) , chá (Camellia sinensis) , banana (Musa spp.), abacate (Persea americana) , figo (Ficus casica) , goiaba (Psidium guajava) , manga (Mangifera indica) , oliva (Olea europaea) , mamão (Carica papaya) , caju (Anacardium occidentale) , macadâmia (Macadamia integrifolia) , amêndoa (Prunus amygdalus) , beterraba (Beta vulgaris) , cana-de-açúcar (Saccharum spp.), aveia, cevada, vegetais, plantas ornamentais, e coníferas.
[182]Os vegetais incluem tomates (Lycopersicon esculentum), alface (por exemplo, Lactuca sativa), feijão verde (Phaseolus vulgaris) , feijão de lima (Phaseolus limensis), ervilhas (Lathyrus spp.), e emelemtos do gênero Cucumis tal como pepino (C. sativus) , cantaloupe (C. cantalupensis) , e melão almiscarado (C. melo) . As plantas ornamentais incluem azaléia (Rhododendron spp.), hortênsia (Macrophylla hydrangea), hibiscus (Hibiscus rosasanensis), rosas (Rosa spp.), tulipas (Tulipa spp.), narciso (Narcissus spp.), petúnias (Petunia hybrida), cravo (Dianthus caryophyllus), bico-de-papagaio (Euphorbia pulcherrima), e crisântemo.
[183] As coníferas que podem ser empregadas na prática da presente invenção incluem, por exemplo, pinheiros tais como pinheiro de incenso (Pinus taeda), pitespaine (Pinus elliotii), Pinho Ponderosa (Pinus ponderosa) , Pinus contorta (Pinus contorta) e pinho de Monterey (Pinus radiata) ; douglásia (Pseudotsuga menzíesíí); pinheiro do Canadá (Tsuga canadensis); epícea-de-Sitka (Picea glauca); pinho vermelho (Sequoia sempervirens); abetos verdadeiros tal como abeto concolor (Abies amabilis) e abeto balsâmico (Abies balsamea); e cedros tal como cedro do incenso (Thuja plicata) e cedro amarelo do Alaska (Chamaecyparis nootkatensis). Em modalidades específicas, as plantas da presente invenção são plantas de cultura (por exemplo, milho, alfafa, girassol, Brassica, soja, algodão, cártamo, amendoim, sorgo, trigo, milho miúdo, tabaco, e etc). Em outras modalides, os pés de milho e soja são ideais, e ainda em outras modalidades os pés de milho são ideais.
[184] Outras plantas de interesse incluem plantas em grão que fornecem sementes de interesse, plantas de semente oleaginosa, e plantas leguminosas. Sementes de interesse incluem sementes de cereais, tais como milho, trigo, cevada, arroz, sorgo, centeio, etc. As plantas de semente oleaginosa incluem algodão, soja, cártamo, brássica, milho, palma, coco, etc. As plantas leguminosas incluem feijões e ervilhas. Os feijões incluem guar, semente de alfarroba , feno-grego, soja, fejoeiro-de-trepar, grão-de-bico, feijão mungo, feijão-de-lima, fava, lentilhas, grão-de-bico, etc.
[185]Em algumas modalidades, as plantas da invenção compreendem um polinucleotideo heterólogo que é geneticamente ligado à região de QTL6 aqui identificada e que confere o traço fenotipico de proporção de alto teor de óleo e/ou alto teor de ácido oléico e/ou teor de ácido oléico/ácido linoléico aumentado a uma planta ou parte de planta. Desta maneira, as plantas de invenção podem compreender, incorporadas de maneira estável em seu genoma, um polinucleotideo heterólogo compreendendo pelo menos uma seqüência associada a alto teor de óleo ou pelo menos uma seqüência associada a alto teor ácido oléico, ligada de forma operável a um promotor ativo na planta ou parte de planta, onde a seqüência associada a alta oleosidade ou seqüência de alto ácido oléico é derivada de uma seqüência de nucleotideo genômico geneticamente ligada a pelo menos um lócus marcador favorável que esteja associado a conteúdo de alto teor de óleo ou alto teor de ácido oléico, onde o lócus marcador seja selecionado a partir do grupo consistindo da Id. de Seq. n°: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, e 51 com pelo menos um polimorfismo na mesma. A expressão do polinucleotideo heterólogo compreendendo a seqüência associada a alto teor de óleo ou a seqüência associada a alto teor de ácido oléico aumenta o conteúdo de óleo ou conteúdo de ácido oléico na planta ou parte de planta. Em algumas modalidades, o polinucleotideo heterólogo compreende pelo menos uma seqüência selecionada a partir do grupo consistindo das seqüências expostas nas Id. de Seq. η°: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, e 47, ou uma variante ou fragmento destas compreendendo pelo menos um dos polimorfismos identificados nestas respectivas seqüências, onde a expressão do polinucleotideo heterólogo de interesse aumenta o conteúdo de óleo e/ou conteúdo de ácido oléico na planta ou parte de planta.
[186] Em outras modalidades, as plantas compreendem uma construção de expressão compreendendo um polinucleotideo codificando o polipeptideo de DGAT de óleo normal da invenção (por exemplo, ZmDGAT12-2(EF09B), ou uma variante biologicamente ativa ou fragmento da mesma, ligada de forma operável a um promotor que é funcional em uma célula de planta. Esta construção de expressão oferece uma superexpressão do polipeptideo DGAT de teor de óleo normal, ou um fragmento ativo ou variante deste. Como o DGAT de teor de óleo normal está envolvido na biossintese de óleo, a superexpressão desta proteína ou superexpressão de um variante biologicamente ativa ou fragmento deste em uma planta ou parte de planta pode levar a um aumento no conteúdo de óleo, conteúdo de ácido oléico e/ou proporção ácido oléico/ácido linoléico na planta ou parte de planta. Ver, por exemplo, os métodos descritos no Exemplo 11 abaixo.
[187] Em certas modalidades, os polinucleotídeos da presente invenção podem ser empilhados em qualquer combinação das seqüências de polinucleotideo de interesse a fim de criar plantas com um traço desejado. Um traço, conforme aqui utilizado, refere-se ao fenótipo derivado de uma seqüência em particular ou grupos de seqüências. Por exemplo, um ou mais nucleotídeos da presente invenção que conferem o fenótipo de alto teor de óleo e/ou alto teor de ácido oléico, podem ser empilhados com quaisquer outros polinucleotideos codificando polipeptideos possuindo atividade pesticida e/ou inseticida, como outras proteínas tóxicas de Bacillus thuringiensis (descritas nas Patentes U. S. de número 5.366.892; 5.747.450; 5.737.514; 5.723.756; 5.593.881; e Geiser e outros (1986) Gene 48:109), lecitinas (Van Damme e outros (1994) Plant Mol. Biol. 24:825), pentina (descrita na Patente U. S. de número 5.981.722) e similares. As combinações geradas podem também incluir múltiplas cópias de qualquer um dos polinucleotídeo de interesse. Os polinucleotideos da presente invenção podem ser também empilhados com qualquer outro gene ou combinação de genes para produzir plantas com uma variedade de combinações de traços desejados incluindo, mas não limitados a, traços desejáveis para farinha para animais, como genes de alto teor de óleo (por exemplo, Patente U. S. de número 6.232.529) ou genes que estejam envolvidos na biossíntese de óleo, incluindo o DGAT de óleo normal aqui descrito (por exemplo, ZmDGATl-2(EF09B); aminoácidos balanceados (por exemplo, hordotioninas (Patentes U. S. de número 5.990.389; 5.885.801; 5.885.802 e 5.703.409); alto teor de lisina em cevada (Williamson e outros (1987) Eur. J. Biochem. 165:99-106; e WO 98/20122) e proteínas de alto teor de metionina (Pedersen e outros (1986) J. Biol. Chem. 261:6279; Kirihara e outros (1988) Gene 71:359; e Musumura e outros (1989) Plant Mol. Biol. 12:123)); digestinilidade aumentada (por exemplo, proteínas de armazenamento modificadas (Pedido de Patente U.S. de número de série 10/053.410, depositado em 7 de novembro de 2001); e tioredoxinas (Pedido de Patente U.S. de número de série 10/005.429, depositado em 3 de dezembro de 2001); as divulgações dos quais estão aqui incorporados por referência.
[188]Os polinucleotideos da presente invenção podem ser também empilhados com traços desejáveis para resistência a doenças e a herbicidas (por exemplo, genes de desintoxicação de fumonisina (Patente U. S. de número 5.792.931); genes de resistência a virulência e doenças (Jones e outros (1994) Science, 266:789; Martin e outros (1993) Science, 262:1432; Martin e outros (1984) Cell 78:1089); mutantes de acetolactato sintase (ALS) que levam a resistência a herbicidas como mutações do S4 e/ou Hra; inibidores de glutamina sintase como fosfinotricina ou basta (por exemplo, gene bar); e resistência a glifosato (gene EPSPS)); e traços desejáveis para o processamento ou processo de produtos como alto teor de óleo (por exemplo, Patente U. S. de número 6.232.529); óleos modificados (por exemplo, genes de ácido graxo dessaturado (Patente U. S. de número 5.952.544; WO 94/11516)); amidos modificados (por exemplo, ADPG pirofosforilases (AGPase), amido sintase (SS), enzimas ramificantes de amido (SBE) e enzimas desramificantes de amido (SDBE)); e polímeros ou bioplásticos (por exemplo, Patente U. S. de número 5.602.321; beta-cetotiolase, polihidroxibutirato sintase e acetoacetil-CoA sintase (Schubert e outros (1988) J. Bacteriol. 170:5837-5847) facilitar a expressão de polihidroxialcanoatos (PHAs)); a divulgação das quais está aqui incorporada por referência. Pode-se ainda combinar os polinucleotídeos da presente invenção com os polinucleotídeos fornecendo traços agronômicos como esterilidade de machos (por exemplo, ver Patente U. S. de número 5.583.210), resistência de caule, tempo de floração, ou traços de tecnologia de transformação como regulação de ciclo celular ou recombinação genética (por exemplo, WO 99/61619, WO 00/17364 e WO 99/25821); a divulgação das quais está aqui incorporada por referência.
[189]Estas combinações empilhadas podem ser criadas por qualquer método, incluindo, mas não limitado a, plantas hidribizadas por qualquer metodologia convencional ou TopCross, ou transformação genética. Se as seqüências estão empilhadas por transformação genética das plantas, as seqüências de polinucleotideo de interesse podem ser combinadas a qualquer momento e em qualquer ordem. Por exemplo, uma planta transgênica compreendendo um ou mais traços desejado pode ser utilizadas como alvo para introdução de traços adicionais por transformação subseqüente. Os traços podem ser introduzidos simultaneamente em um protocolo de co-transformação com os polinucleotídeos de interesse fornecidos por qualquer combinação de cassete de transformação. Por exemplo, se duas seqüências serão introduzidas, as duas seqüências podem estar contidas em cassetes de transformação separados (trans) ou contidas no mesmo cassete de transformação (cis). A expressão destas seqüências pode ser induzida pelo mesmo promotor ou por promotores diferentes. Em certos casos, pode ser desejável introduzir um cassete de transformação que irá suprimir a expressão de outro polinucleotideo de interesse. Isto pode ser combinado com qualquer combinação de outros cassetes de supressão ou cassetes de superexpressão para gerar a combinação desejada de traços na planta. É adicionalmente reconhecido que seqüências de polinucleotideo podem ser empilhadas em uma localização genômica desejada utilizando-se um sistema de recombinação de sitio especifico. Ver, por exemplo, WO 99/25821, WO 99/25854, WO 99/25840, WO 99/25855, e WO 99/25853, a totalidades das quais está incorporada por referência.
[190]Em tal modalidade, um ou mais polinucleotideos associados a alto teor de óleo e/ou alto teor de ácido oléico da invenção (por exemplo, ZmDGATl-2 (ASK) da Id. de Seq. n°:47), ou um polinucleotideo DGAT de teor de óleo normal da invenção (por exemplo, ZmDGATl-2(EF09B) da Id. de Seq. n°:51), ou qualquer combinação da mesma, são empilhados com um polinucleotideo heterólogo codificando um ativador do tipo transcricional Cotilédone folhoso 1 (LEC1) de domínio B ou uma variante biologicamente ativa ou fragmento desta, que fornece a modulação adicional do nível de óleo em uma planta. O ativador transcricional Cotilédone folhoso 1 (LEC1) é um membro da família do ativador de transcrição HAP (proteína ativada por heme) 3, cujos membros são caracterizados como possuindo três regiões: Os domínios A, C e C. O domínio B central é conservado entre os membros da família e compreende motivo de ligação de caixa CCAAT de ligação de DNA conservado. A Figura 33 fornece um alinhamento de seqüência de vários membros da família do ativador transcricional HAP3 e marca as posições de domínio A, B e C e ainda mostra a caixa CCAAT conservada. Com base na identidade de seqüência e função, os membros da família HAP3 foram divididos em duas classes: membros possuindo o tipo LEC1 de domínio B e membros possuindo um tipo não LEC1 de domínio B. A superexpressão de um polipeptídeo compreendendo um tipo LEC1 de domínio B em uma planta ou parte de planta do mesmo aumenta de forma benéfica a produção de óleo em uma planta ou parte de planta deste. Ver, por exemplo, a Publicação de Pedido de Patente U.S. de número 20050160494, aqui incorporada por referência.
[191] Os domínios B de vários membros da família de ativador transcricional HAP3 estão alinhados na Figura 34. O domínio B para o LEC1 Arabidopsis, do resíduo de aminoácido 28 ao resíduo 117, compartilham entre 55% e 63% de identidade (75% a 85% de similaridade) com outros membros da família HAP3, incluindo milho (HAP3), frango, lampreia, Xenopus, humano, camundongo, Emericella nidulens, Schizosaccharomyces pombe, Saccharomyces cerevisiae and Kluuyveromyces lactis (Lotan e outros (1998) Cell 93: 11931205) . As seqüências superiores, levemente sombreadas são membros representativos do tipo LEC1 de domínio B, enquanto as seqüências inferiores, fortemente sombreadas, são representativas dos membros do domínio de tipo não LEC1.
[192] Geralmente, o tipo LEC1 de domínio B compreende 16 resíduos conservados que diferem dos resíduos conservados em posições equivalentes nos domínios B do tipo não LEC1 (Lee e outros (2003) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 100:2152-2156, aqui incorporado por referência em sua totalidade). Estes resíduos residem em um motivo do domínio B do tipo LEC1 que é representado pela seqüência de consenso exposta na Id. de Seq. n° 49. É reconhecido, entretanto, que os 16 resíduos conservados expostos na seqüência de consenso para este motivo de um domínio B de tipo LEC1 podem ser alterados o polipeptídeo LEC1 ainda mantém atividade LEC1. Ver, por exemplo, Lee e outros, (2003) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 100:2152-2156, aqui incorporado por referência em sua totalidade, o qual demonstra alterações específicas em alguns dos resíduos conservados continuam a permitir que o polipeptídeo mantenha a atividade LEC1. Descobriu-se que o aminoácido D28 da Id. de Seq. n° 49 desempenha um importante papel na preservação da atividade LEC1. Em uma modalidade, o domínio B de tipo LEC1 compreende o domínio B de tipo LEC1 exposto nos resíduos 36 a 126 da Id. de Seq. n° 51, que expõe o polipeptídeo LEC1 de milho. O domínio B do tipo LEC1 do polipeptídeo LEC1 do milho é codificado pelos nucleotídeos 106 a 378 da Id. de Seq. n° 50, que expõe a seqüência de codificação para o polipeptídeo LEC1 do milho. Vários polinucleotídeo e polipeptídeo possuindo domínio B do tipo LEC1 são expostos nas Publicações dos Pedidos de Patente U. S. de número 20030126638 e 20030204870, as quais estão aqui incorporadas por referência em sua totalidade.
[193]Conforme descrito em detalhes em outro local deste, variantes biologicamente ativas e fragmentos do domínio B de tipo LEC1 podem ser também empregados nos métodos da invenção direcionados ao empilhamento de um ou mais dos polinucleotídeos associados ao alto teor de óleo/alto teor de ácido oléico da presente invenção, um polinucleotídeo DGAT de teor de óleo normal da invenção, ou qualquer combinação destes, com um polinucleotídeo heterólogo codificando um domínio B do tipo LEC1, assim conferindo um fenótipo de alto teor de óleo e/ou alto teor de ácido oléico e/ou proporção aumentada de ácido oléico/ácido linoléico em uma planta ou parte de planta deste. Tais variantes e fragmentos são conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, a Figura 34 e também Lee e outros, (2003) PNAS 2152-2156 e Publicação de Pedido de Patente U. S. de número 20050034193.
[194] Fragmentos biologicamente ativos e variantes de um dominio B do tipo LEC1 continuarão a sustentar atividade LEC1 quando o dominio for colocado no contexto de um dominio funcional A e/ou funcional C de um ativador transcricional HAP3. Conforme aqui utilizado, "atividade LEC1" é definida como a capacidade de um polipeptídeo em melhorar a síntese de lipídios como refletido em produção de óleo aumentada.
[195] Em uma modalidade, o polinucleotídeo ou polipeptídeo LEC1 empregado na invenção compreende o polinucleotídeo e polipeptídeo exposto na Id. de Seq. n° 50 e Id. de Seq. n° 51, respectivamente. Conforme descrito em detalhes em outro local deste, variantes biologicamente ativas e fragmentos do polinucleotídeo e polipeptídeos LEC1 podem também ser empregadas nos métodos da invenção. Tais variantes e fragmentos são conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, as Figuras 33 e 34 e também Lee e outros, (2003) PNAS 2152-2156; Kwong e outros, (2003) The Plant Cell 15:5-18; Publicação de Pedido de Patente U. S. de número 20030126638; WO 02/57439, Patente U. S. de número 6.825.397; Patente U. S. de número 6.781.035; Publicação de Pedido de Patente U. S. de número 20050034193; e WO 98/37184 .
[196] Conforme aqui utilizado, um "ativador transcricional HAP3" compreende um membro da família HAP3. Esta família de ativadores transcricionais é estruturalmente bem caracterizada. Ver Li e outros, (1992) Nucleic Acid Research 20:1087-1091; Xing e outros, (1993) EMBO J. 12:4 647-4 655; Kim e outros (1996) Mol Cell Biol. 16:4003-4013; Sinha e outros (1996) Mol Cell Biol 16:328-337; e, Lotan e outros (1998) Cell 93:1195-1205, cada um dos quais está aqui incorporado por referência. Nos métodos e composições da invenção, o ativador transcricional HAP3 compreende um domínio B do tipo LEC1. Conseqüentemente, um ativador transcricional HAP3 empregado na presente invenção pode compreender um polipeptídeo quimérico possuindo um domínio funcional A e/ou funcional B do ativador transcricional HAP3 o que, em sua forma nativa, pode ou não possuir um domínio B do tipo LEC1. Ver, por exemplo, Lee e outros, (2003) PNAS 2152-2156.
[197] EM uma modalidade, um polinucleotídeo heterólogo codificando uma variante de alto teor de óleo/alto teor de ácido oléico de DGAT, por exemplo, o polipeptídeo ZmDAGTl-2(ASK) ou variante ou fragmento biologicamente ativo do mesmo conferindo o fenótipo de alto teor de óleo/alto teor de ácido oléico é empilhado com um polinucleotídeo heterólogo codificando um polipeptídeo compreendendo um domínio B do tipo LEC1 possuindo uma seqüência de aminoácido exposta na Id. de Seq. n° 65 ou uma variante biologicamente ativa ou fragmento da Id. de Seq. n° 65, onde a variante biologicamente ativa compreende pelo menos 80% de identidade de seqüência com Id. de Seq. n° 65, onde o polipeptídeo ou a variante biologicamente ativa ou fragmento do mesmo possui atividade LEC1. Em algumas modalidades, o polinucleotideo heterólogo codificando a variante de alto teor de óleo/alto teor de ácido oléico de DGAT compreende a seqüência de polinucleotideo exposta na Id. de Seq. n° 47 ou variante ou fragmento desta e o polinucleotideo codificando o domínio B do tipo LEC1 compreende a seqüência de polinucleotideo exposta na Id. de Seq. n° 66 ou uma variante ou fragmento desta.
[198]Em ainda outra modalidade, um polinucleotideo heterólogo codificando um DGAT de teor de óleo normal, por exemplo, o polipeptídeo ZmDAGTl-2(EF09B) ou variante ou fragmento biologicamente ativo do mesmo capaz de aumentar o conteúdo de óleo e/ou conteúdo de ácido oléico quando superexpresso em uma planta ou parte de planta deste, é empilhado com um polinucleotideo heterólogo codificando um polipeptídeo compreendendo um domínio B do tipo LEC1 possuindo uma seqüência de aminoácido exposta na Id. de Seq. n° 65 ou uma variante biologicamente ativa ou fragmento da Id. de Seq. n° 65, onde a variante biologicamente ativa compreende pelo menos 80% de identidade de seqüência com Id. de Seq. n° 65, onde o polipeptídeo ou a variante biologicamente ativa ou fragmento do mesmo possui atividade LEC1. Em algumas modalidades, o polinucleotideo heterólogo codificando o DGAT de teor de óleo normal compreende compreende a seqüência de polinucleotideo exposta na Id. de Seq. n° 51 ou variante ou fragmento desta e o polinucleotideo codificando o domínio B do tipo LEC1 compreende a seqüência de polinucleotideo exposta na Id. de Seq. n° 66 ou uma variante ou fragmento desta.
[199] É reconhecido que onde um ou mais polinucleotideos da invenção são empilhados com um polinucleotideo heterólogo codificando um polipeptideo compreendendo um domínio B do tipo LEC1, estas seqüências podem ser também empilhadas com um ou mais polinucleotideos que proporcionem a inibição de expressão ou função de um produto de gene que está envolvido em biossíntese de amido, desta forma melhorando adicionalmente a produção de óleo e alterações na qualidade do óleo. Desta maneira, uma redução na síntese de amido pode ser atingida através de expressão reduzida de genes que codificam proteínas que normalmente servem como proteínas de nucleação de amido, catalisadores enzimáticos ou assimilam transportadores envolvidos na biossíntese de amido. Qualquer um dos mecanismos conhecidos na técnica para efetuar a inibição de expressão genética pode ser utilizado para interferir de maneira ideal com os genes de biossíntese de amido incluindo, mas não limitado a, genes codificando sacarose sintase, hexocinase(s), fosfoglucomutase, fosfoglucoisomerase, ADP-glucose pirofosforilase (AGP), amilogenina (um iniciador de proteína da biogênese de amido), amido sintase solúvel e ligada e enzimas de ramificação de amido, enzimas de desramificação de amido, enzimas de isoamilase, amido fosforilases e a proteína de transporte Brittle-1. Ver, por exemplo, a Publicação de Pedido de Patente U.S. de número 20050160494, intitulada "Alteration of Oil Traits in Plants", aqui incorporada por referência em sua totalidade.
[200] Em outras modalidades, um ou mais nucleotídeos associados a alto teor de óleo/alto teor de ácido oléico da invenção, ou um polinucleotideo DGAT de teor de óleo normal da invenção (por exemplo, ZmDGATl-2 (EF09B) da Id. de Seq. n° 51), ou qualquer combinação destes, são empilhados com um polinucleotideo heterólogo que possibilita a alteração da qualidade do teor de óleo aumentado produzido na planta alterando a expressão ou funcionamento das proteínas ou enzimas que estão envolvidas em modificação lipídica. Exemplos de proteínas e enzimas que modificam as características do óleo no interior das plantas incluem, mas não estão limitados a, qualquer um dos dessaturados de ácido graxo, por exemplo, proteína transportadora de estearoil-acil dessaturase (Fadl; ver Patente U. S. de número 6.117.677), delta-15 dessaturase (omage-3) (Fad3; ver Shah e outros, (1997) Plant Physiol. 114:1533-1539), delta-4 (trans) dessaturase (Fad4; Xiao e outros, (2001) J. Biol. Chem. 27 6:31561-31566), delta-7 dessaturase (Fad5; ver Patente U. S. de número 6.635.451), ácido graxo omega-6 dessaturase (Fad6; ver Patente U. S. de número 6.635.451), ácido graxo Omega-3 dessaturase (Fad7; Iba e outros, (1993) Biol. Chem. 268:24099-24105), delta-5 dessaturase (ver Patente U. S. de número 6.589.767), delta-9 dessaturase (ver Patente U. S. de número 5.723.595), acil-CoA graxo:álcool graxo aciltransferase (cera sintase; ver Patente U. S. de número 6.492.509), beta-cetoacetil-ACP sintase em uma orientação de senso ou antisenso (ver Patente U. S. de número 6.483.008), e ácido graxo delta-12 dessaturase (FAD2), uma enzima que converte ácido oléico em ácido linoléico introduzindo uma ligação dupla na posição delta-12 (Okuley e outros, (1994) Plant Cell 6:147-58).
[201]Exemplos de FAD2 e seqüências de codificação correspondentes são bem conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Acessão GenBank de número NM_112047; Acessão GenBank de número AF243045; Patente Européia de número EP EP0668919 Bl; Patente U. S. de número 6.291.742; Patente U. S. de número 6.310.194; Patente U. S. de número 6.323.392; Patente U. S. de número 6.372.965; Publicação de Pedido de Patente U. S. de número 20030033633; e Publicação de Pedido de Patente U. S. de número 20030140372; todas as quais estão aqui incorporadas em sua totalidade por referência. Foram identificadas proteínas FAD2 em milho. Uma destas proteínas FAD2 é denominada ZmFAD2-l (seqüência de nucleotídeo exposta em Id. de Seq. n° 131, seqüência de aminoácido exposta na Id. de Seq. n° 132) e a outra é denominada ZmFAD2-2 (Kinney e outros, (2001) Biochem. Soc. Trans. 30:1099-1103; e Mikkilineni e outros, (2003) Theor. Appl. Genet. 10 6:132 6-1332). A supressão ou remoção de ambos os genes aumenta a concentração de ácido oléico relativa em 75%.
[202] Assim, ao interferir com a atividade de ácido graxo dessaturase, por exemplo, inibindo a expressão ou funcionamento de FAD2, a conversão de ácido oléico em ácido linoléico pode ser evitada e, assim, o ácido oléico se acumula na planta ou parte de planta deste como sementes, incluindo embriões de semente.
[203] Em algumas modalidades, um ou mais polinucleotídeos associados a alto teor de óleo/alto teor de ácido oléico da invenção, ou um polinucleotideo DGAT de teor de óleo normal da invenção (por exemplo, ZmDGATl-2 (EF09B) da Id. de Seq. n° 51), ou qualquer combinação destes, são empilhados em um fundo de germoplasma de planta que possui um alelo favorável para FAD2 que normalmente confere um fenótipo de alto teor de [acido oléico àquela planta. Por "fenótipo de alto teor de ácido oléico" no contexto de um alelo favorável para FAD2, se intenciona que a planta ou parte de planta desta, por exemplo, a semente ou embrião, possua uma concentração de ácido oléico de cerca de 30% ou superior. Assim, por exemplo, em milho, linhas convencionais que não possuem um alelo FAD2 favorável possuem uma concentração de ácido oléico em semente ou embrião de cerca de 25% ou menos. Ver, por exemplo, a concentração de ácido oléico em embrião da linha consangüínea de milho de teor de óleo normal, EF09B, na Figura 4. Tal empilhamento pode ser conseguido introduzindo-se os polinucleotideos associados a alto teor de óleo / alto teor de ácido oléico da invenção (por exemplo, ZmDGATl-2 (ASK) da Id. de Seq. n° 47) , ou o polinucleotideo DGAT de teor de óleo normal da invenção (por exemplo, ZmDGATl-2 (EF09B) da Id. de Seq. n° 51) ou qualquer combinação destes, neste fundo de germoplasma favorável, ou através de métodos de transformação ou através de métodos de reprodução conhecidos na técnica e descritos aqui em outro local. Ver, por exemplo, os métodos descritos no Exemplo 14 aqui abaixo.
[204]Em outras modalidades, um ou mais polinucleotideos associados a alto teor de óleo e/ou alto teor de ácido oléico da invenção (por exemplo, ZmDGATl-2 (ASK) da Id. de Seq. n°:47), ou um polinucleotideo DGAT de teor de óleo normal da invenção (por exemplo, ZmDGATl-2 (EF09B) da Id. de Seq. n°:51), ou qualquer combinação da mesma, são empilhados com um polinucleotideo heterólogo que compreende uma seqüência inibidora de FAD2 projetada para silenciar a expressão de um FAD2. Métodos para silenciar a expressão de FAD2 são descritos na Publicação do Pedido de Patente U. S. de número 20050160494 e WO 2005/063988, aqui incorporadas por referência em sua totalidade. Suprimindo-se a expressão ou função de um FAD2, aumentos adicionais do conteúdo de ácido oléico e/ou da proporção de ácido oléico / ácido linoléico podem ser alcançados além daqueles conferidos pela expressão dos polinucleotideos associados a alto teor de óleo / alto teor de ácido oléico da invenção, ou superexpressão do polinucleotídeo DGAT de teor de óleo normal da invenção.
[205]Uma "seqüência inibidora de FAD2" refere-se a uma seqüência inibidora que é capaz de inibir a expressão de um FAD2 (por exemplo, uma seqüência inibidora de FAD2 objetivando ZmFAD2-l), no nivel de transcrição e/ou tradução, ou que seja capaz de inibir a função de um FAD2. Quando a frase "capaz de inibir" é utilizada no contexto de uma seqüência inibidora de polinucleotídeo, pretende-se significar que a seqüência inibidora em si exerce o efeito inibidor; ou, onde a seqüência inibidora codifica uma molécula de nucleotídeo inibidora (por exemplo, um RNA "grampo de cabelo", miRNA, ou polinucleotideos de RNA de filamento duplo), ou codifica um polipeptídeo inibidor (isto é, um polipeptídeo que inibe a expressão ou função do produto de gene alvo), após sua transcrição (por exemplo, no cado de uma seqüência inibidora codificando um RNA "grampo de cabelo", miRNA u polinucleotídeo de RNA de filamento duplo) ou sua transcrição e tradução (no caso de uma seqüência inibidora codificando um polipeptídeo inibidor), o produto transcrito ou traduzido, respectivamente, exerce o efeito inibidor no produto de gene alvo (isto é, inibe a expressão ou função do produto de gene alvo).
[206]Qualquer seqüência de nucleotideo codificando um FAD2 conhecido na técnica pode ser utilizado nos métodos da invenção que utilize uma abordagem transgênica para empilhar os polinucleotideos associados ao alto teor de óleo e/ou alto teor de ácido oléico da invenção, ou o DGATl-2 de teor normal de óleo da invenção, ou qualquer combinação destes, com um polinucleotídeo heterólogo que seja projetado para inibir a expressão ou função de um FAD2. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo heterólogo compreende uma seqüência de nucleotideo FAD2, como ZmFAD2-l (Id. de Seq. n° 131) , uma seqüência de nucleotideo codificando ZmFAD2-l da Id. de Seq. n° 132, uma seqüência de nucleotideo ZmFAD2-2, combinações de ambas, ou similares. Ver, por exemplo, as seqüências divulgadas em Mikkilineni e outros, (2003) Theor. Appl. Genet. 106:13261332. Em algumas modalidades, a seqüência de FAD2 é selecionada entre, mas não limitada a, aquelas divulgadas na Acessão GenBank de número NM_112047, Acessão GenBank de número AF243045, Patente U. S. de número 6.323.392, Patente U. S. de número 6.372.965, Publicação do Pedido de Patente U. S. de número 20030033633, e Publicação do Pedido de Patente U. S. de número 20030140372, todas as quais estão aqui incorporadas em sua totalidade por referência. Em outras modalidades, o polinucleotídeo heterólogo compreende regiões truncadas da seqüência do nucleotideo ZmFAD2, por exemplo, ZmFAD2-l da Id. de Seq. n° 131, na orientação senso e orientação antisenso; ver, por exemplo, Id. de Seq. n° 133.
[207] Por exemplo, em algumas modalidades, o polinucleotideo heterólogo compreende uma seqüência inibidora de FAD2 que é expressa na orientação senso. Em algumas modalidades, as transcrições em orientação senso provocam co-supressão. Em outras modalidades, a expressão de orientação senso de transcrições de FAD2 trincadas provocam proteínas não funcionais a serem expressas e desta forma inibem a atividade FAD2. Alternativamente, a seqüência ou seqüências inibidora (s) de FAD2 podem ser expressas na orientação antisenso e desta forma inibir a expressão ou atividade de FAD2 endógeno por mecanismos antisenso.
[208] Ainda em outras modalidades, a seqüência ou seqüências inibidora(s) no polinucleotideo heterólogo são expressas como RNA "grampo de cabelo", que possui tanto componente de seqüência senso quanto antisenso. Em modalidades compreendendo uma estrutura de "grampo de cabelo", a estrutura de laço pode compreender qualquer seqüência de nucleotídeo adequada, incluindo, por exemplo, regiões não traduzidas 5' do gene a ser suprimido, como o 5' UTR de FAD2, seqüências de nucleotídeo de íntron de álcool desidrogenase (adhl), nucleotídeos aleatórios, espaçadores de polinucleotideo e similares (ver também Baileu-Serres e Dawe (1996) Plant Physiol. 112:685). Em algumas modalidades, a seqüência ou seqüências inibidora(s) de FAD2 ou expressas como um "grampo de cabelo" são codificadas por uma região invertida de seqüências de nucleotídeo codificando FAD2, como a seqüência de nucleotídeo ZmFAD2-l (Id. de Seq. n° 131) , a seqüência de nucleotídeo ZmFAD2-2, ou uma combinação destas. Ainda em outras modalidades, as seqüências inibidoras são expressas como RNA de duplo filamento, onde uma seqüência de FAD2 inibidora é expressa na orientação senso e outra seqüência complementar é expressa na orientação antisenso. Ver, por exemplo, a seqüência de polinucleotideo inibidora de FAD2 exposta na Id. de Seq. n° 133. RNA de duplo filamento, estruturas de "grampo de cabelo" e combinações destas compreendendo seqüências FAD2 podem operar por interferência de RNA, co-supressão, mecanismo de antisenso e combinação destes, ou por meio de outro mecanismo que provoque a inibição da expressão ou função de FAD2.
[209] Em outras modalidades, um ou mais polinucleotideos associados a alto teor de óleo e/ou alto teor de ácido oléico da invenção são empilhados com um polinucleotideo heterólogo codificando um polipeptídeo envolvido na alteração de traços de óleo em plantas, onde o polipeptídeo é aquele divulgado na Publicação de Pedido de Patente U. S. de número 20030204870, intitulado "Alteration of Oil Traits in Plants", aqui incorporada por referência em sua totalidade. Em tal modalidade, o polinucleotideo codifica um aintegumenta tipo 2 CKC (Id. de Seq. n° 320 da Publicação de Pedido de Patente U. S. de número 20030204870, codificando a seqüência da Id. de Seq. n° 319 desta publicação de pedido de patente), que fornece a modulação adicional do nível de óleo em uma planta.
[210] Em outras modalidades da invenção, um ou mais polinucleotideos associados ao alto teor de óleo e/ou alto teor de ácido oléico da invenção são empilhados com uma base genética "TUSC27". As plantas compreendendo a base genética TUSC27 compreendem um alelo de inserção TUSC Mu hereditário no gene gama-zein 27 kD que contribui para melhorar a qualidade do grão, particularmente capacidade de digestão melhorada do grão. Ver, por exemplo, a Publicação do Pedido de Patente U.S. de número 20050204418, intitulada "Grain Quality through Altered Expression of Seed Proteins", aqui incorporada por referência em sua totalidade. III. Métodos: (A) Modulação do nivel de uma Seqüência da Invenção [211]A introdução e expressão de um ou mais dos polinucleotideos associados a alto teor de óleo e/ou alto teor de ácido oléico da invenção, ou um polinucleotideo DGAT de teor de óleo normal da invenção, em uma planta permite um aumento no nivel da seqüência de polinucleotideo respectiva de interesse, e onde a seqüência compreende seqüência de codificação, permite um aumento no nivel do polipeptideo codificado, por exemplo, uma variante de DGAT com alto teor de óleo / alto teor de ácido oléico, um DGAT de teor normal de óleo, um AAP1, um PESP, uma proteína S24 ribossômica 40S, e/ou uma proteína de transporte ABC. Um "nível modulado" ou "nível de modulação" de um polinucleotideo ou um polipeptideo no contexto dos métodos da presente invenção refere-se a qualquer aumento na expressão, concentração e/ou atividade de um produto de gene (isto é, polipeptideo ou polinucleotideo), incluindo qualquer incremento relativo na expressão, concentração e/ou atividade. O termo "expressão" conforme aqui utilizado no contexto de um produto de gene, refere-se À biossíntese daquele produto incluindo a transcrição e tradução do produto de gene. Em geral, o nível do polipeptídeo ou polinucleotídeo é aumentado em pelo menos 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 120%, ou mais em relação à planta, parte de planta ou célula de controle nativa. A modulação na presente invenção pode ocorrer durante e/ou subsequente ao desenvolvimento da planta ao estágio desejado de desenvolvimento. Em modalidades específicas, os polinucleotídeos ou os polipeptídeos da presente invenção são modulados em monocotilédones, particularmente milho.
[212] O nível de expressão de uma variante de DGAT de alto teor de óleo / alto teor de ácido oléico, um DGAT de teor normal de óleo, um AAP1, um PESP, uma proteína S24 ribossômica 40S e/ou uma proteína transportadora ABC do polipeptídeo da invenção pode ser medido diretamente, por exemplo, realizando-se um ensaio para o nível do polipeptídeo respectivo na planta, ou indiretamente, por exemplo, medindo-se a atividade do respectivo polipeptídeo na planta. Métodos para determinar se a expressão de uma variante de DGAT de alto teor de óleo/alto teor de ácido oléico, um AAP1, um PESP, uma proteína S24 ribossômica 40S, e/ou uma proteína de transporte ABC ou variante biologicamente ativa ou fragmento desta, confere ao fenótipo de alto teor de óleo e/ou alto teor de ácido oléico e/ou ácido oléico/ácido linoléico aumentados em uma planta ou parte de planta deste são conhecidos na técnica e são descritos em outro local deste. De forma similar, métodos para determinar se a superexpressão de um DGAT de teor normal de óleo da invenção, ou variante biologicamente ativa ou fragmento desta, são bem conhecidos na técnica e são descritos em outro local deste.
[213] Em modalidades especificas, o polipeptideo ou o polinucleotideo da invenção é introduzido na célula vegetal. Subseqüentemente, uma célula vegetal possuindo a sequência da invenção introduzida é selecionada utilizando-se métodos conhecidos àqueles habilitados na técnica como, mas não limitado a, análise de Southern blot, sequenciamento de DNA, análise de PCR ou análise fenotipica. Uma planta ou parte de planta alterada ou modificada pelas modalidades precedentes é desenvolvida sob condições formação de planta por um período suficiente para modular a concentração e/ou a composição de polipeptídeos da presente invenção na planta. As condições de formação de planta são bem conhecidas na técnica e discutidas de forma breve em outro local deste.
[214] É também reconhecido que o nível e/ou atividade do polipeptideo pode ser modulado empregado-se um polinucleotideo que não seja capaz de direcionar, em uma planta transformada, a expressão de uma proteína ou um RNA. Por exemplo, os polinucleotídeos da invenção podem ser utilizados para projetar construções de polinucleotideo que possam ser empregadas em métodos para alterar ou causar mutação em uma seqüência de nucleotídeo genômico em um organismo. Algumas construções de polinucleotídeos incluem, mas não estão limitadas a, vetores RNA:DNA, vetores mutacionais RNA:DNA, vetores de reparo RNA:DNA, oligonucleotídeos duplos misturados, oligonucleotídeos de RNA:DNA autocomplementar, e oligonucleobases recombinogênicas. Tais construções de nucleotídeo e métodos para utilização são conhecidos na técnica. Ver, Patentes U. S. de número 5.565.350; 5.731.181; 5.756.325; 5.760.012; 5.795.972; e 5.871.984; todas as quais estão aqui incorporadas por referência. Ver também, WO 98/49350, WO 99/07865, WO 99/25821 e Beetham e outros (1999) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 96:8774-8778, aqui incorporadas para referência.
[215] É desta forma reconhecido que os métodos da presente invenção não dependem da incorporação do polinucleotideo completo dentro do genoma, apenas que a planta ou célula desta seja alterada como um resultado da introdução do polinucleotideo em uma célula. Em uma modalidade da invenção, o genoma pode ser alterado seguindo a introdução do polinucleotideo em uma célula. Por exemplo, o polinucleotideo, ou qualquer parte deste, pode incorporar-se ao genoma da planta. Alterações ao genoma da presente invenção incluem, mas não estão limitadas a adições, exclusões, e substituições de nucleotideos no genoma. Embora os métodos da presente invenção não dependam de adições, exclusões e de substituições de qualquer número particular de nucleotideos, é reconhecido que tais adições, exclusões, ou substituições compreendem pelo menos um nucleotideo.
[216] Em uma modalidade, a atividade e/ou nível de uma variante de DGAT de alto teor de óleo / alto teor de ácido oléico, um DGAT de teor normal de óleo, um AAPl, um PESP, uma proteína S24 ribossômica 40S e/ou uma proteína transportadora ABC da invenção é aumentada(o). Um aumento no nível e/ou atividade do respectivo polipeptídeo da invenção pode ser alcançado fornecendo-se à planta uma variante de DGAT de alto teor de óleo / alto teor de ácido oléico, um DGAT de teor normal de óleo, um AAP1, um PESP, uma proteína S24 ribossômica 40S e/ou uma proteína transportadora ABC. Conforme discutido aqui em outro local, muitos métodos são conhecidos na técnica para fornecer um polipeptídeo a uma planta incluindo, mas não limitado a introdução direta do polipeptídeo na planta, e introdução na planta (de modo provisório ou de forma estável) de uma construção de polinucleotídeo codificando o respectivo polipeptídeo. É também reconhecido que os métodos da invenção podem empregar um polinucleotídeo que não é capaz de controlar, na planta transformada, a expressão de uma proteína ou um RNA. Assim, o nível e/ou atividade de uma variante de DGAT de alto teor de óleo / alto teor de ácido oléico, um DGAT de teor normal de óleo, um AAPl, um PESP, uma proteína S24 ribossômica 40S e/ou uma proteína transportadora ABC pode ser aumentado alterando-se a codificação genética do respectivo polipeptídeo ou seu promotor. Ver, por exemplo, Kmiec, Patente U. S. de número 5.565.350; Zarling e outros, PCT/US93/03868.
Conseqüentemente, plantas mutagenizadas que carreguem mutações no gene codificando uma variante de DGAT de alto teor de óleo / alto teor de ácido oléico, um DGAT de teor normal de óleo, um AAPl, um PESP, uma proteína S24 ribossômica 40S e/ou uma proteína transportadora ABC, onde as mutações que aumentam a expressão do respectivo gene ou aumentam a atividade da variante de DGAT de alto teor de óleo / alto teor de ácido oléico codificada, DGAT de teor normal de óleo, AAPl, PESP, proteína S24 ribossômica 40S e/ou uma proteína transportadora ABC são fornecidas.
[217]Uma "planta ou célula vegetal de interesse" é aquela na qual uma alteração genética, como transformação, foi efetuada enquanto um gene de interesse, ou é uma planta ou célula vegetal que é descendente de uma planta ou célula desta forma alterada e que compreende a alteração. Um "controle" ou "planta de controle" ou "célula vegetal de controle" fornece um ponto de referência para medir alterações no fenótipo da planta ou célula de planta de interesse.
[218] Uma planta ou célula vegetal de controle pode compreender, por exemplo: (a) uma planta ou célula do tipo selvagem, isto é, do mesmo genótipo que o material inicial para a alteração genética que resultou na planta ou célula de interesse; (b) uma planta ou célula vegetal do mesmo genótipo que o material inicial mas que foi transformada com uma construção nula (isto é, com uma construção que não possui efeito conhecido no traço de interesse, como uma construção compreendendo um gene marcador); (c) uma planta ou célula vegetal que é um segregante não transformado em meio à progenia de uma planta ou célula vegetal de interesse; (d) uma planta ou célula vegetal geneticamente idêntica à planta ou célula vegetal de interesse mas que não está exposta às condições ou estímulos que induziríam a expressão do gene de interesse; ou (e) a planta ou célula vegetal em si, sob condições nas quais o gene de interesse não é expressado.
[219] 0 nível de expressão de um polipeptídeo e/ou um RNA pode ser medido diretamente, por exemplo, realizando-se um ensaio quanto ao nível do polipeptídeo ou do RNA na planta, ou indiretamente, por exemplo, medindo-se a atividade do polipeptídeo ou do RNA na planta.
[220] Em modalidades especificas, o polinucleotídeo recombinante da invenção é introduzido na célula vegetal. Subseqüentemente, uma célula vegetal possuindo a seqüência da invenção introduzida é selecionada utilizando-se métodos conhecidos àqueles habilitados na técnica como, mas não limitado a, análise de Southern blot, sequenciamento de DNA, análise de PCR ou análise fenotipica. Uma planta ou parte de planta alterada ou modificada pelas modalidades precedentes é desenvolvida sob condições de formação de planta por um período suficiente para modular a concentração e/ou a composição de polipeptídeos da presente invenção na planta. As condições de formação de planta são bem conhecidas na técnica e discutidas de forma breve em outro local deste. (B) Modulando Conteúdo de Óleo e/ou Conteúdo de Ácido Oléico de uma Planta ou Parte de Planta [221] Os métodos da invenção também fornecem modulação do conteúdo de óleo e/ou conteúdo de ácido oléico e/ou proporção de ácido oléico/acido linoléico de uma planta ou parte da mesma planta. Desta maneira, uma ou mais seqüências associadas a alto teor de óleo e/ou alto teor de ácido oléico geneticamente ligadas a uma região QTL6 que é flanqueada por uma primeira seqüência de borda que compreende nucleotídeos 1 a 20 da Id. de Seq. n° 2 desta e uma segunda seqüência de borda que compreende os nucleotídeos 477 a 496 da Id. de Seq. n° 46 desta, ou uma região QTL6 que seja flanqueada por uma primeira seq de borda que compreende nucleotídeos 1 a 20 da Id. de Seq. n° 6 desta e uma segunda seqüência de borda que compreende nucleotídeos 482 a 501 da Id. de Seq. n° 14 desta, ou uma região QTL6 que esteja flanqueada por uma primeira seqüência de borda que compreenda nucleotideos de 1 a 20 da Id. de Seq. n° 10 desta e uma segunda seqüência de borda que compreenda nucleotideos 488 a 507 da Id. de Seq. n° 4 desta podem ser introduzidas em uma planta ou parte desta planta para conferir o fenótipo de alto teor de óleo e/ou alto teor de ácido oléico e/ou proporção entre ácido oléico/ácido linoléico aumentada na planta ou parte desta planta. Assim, em algumas modalidades, um ou mais dos loci marcadores favoráveis identificados aqui são introduzidos na planta ou parte desta planta por métodos bem conhecidos na técnica, incluindo os métodos de transformação e reprodução discutidos aqui acima. Em algumas modalidades, loci marcadores favorável compreende as seqüências expostas nas Id. de Seq. n° 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, e 51 com pelo menos um polimorfismo contido nestas. Exemplos de polimorfismos específicos em cada locus marcador favorável na região QTL6 são identificados na Tabela 2 (loci marcadores não codificante) e Tabela 3 (loci marcadores compreendendo seqüência de codificação) no Exemplo 2 e 4 abaixo. Exemplos não limitantes de seqüências de loci marcadores favoráveis da invenção são expostos nas Id. de Seq. n° 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, e 47, e os respectivos polimorfismos ocorrendo nestes loci marcadores favoráveis são mostrados nas Tabelas 2 e 3 abaixo. Ver também os alinhamentos mostrados nas Figuras 7 a 29 e 31. A introdução de um ou mais destas seqüências associadas a alto teor de óleo e/ou associadas a alto teor de ácido oléico em uma planta ou parte desta planta podem conferir o fenótipo desejado de alto conteúdo de óleo e/ou alto conteúdo de ácido oléico e/ou proporção aumentada de ácido oléico/ácido linoléico.
[222] Em outras modalidades, os métodos da invenção fornecem modulação do conteúdo de óleo e/ou conteúdo de ácido oléico e/ou proporção de ácido oléico/acido linoléico em uma planta ou parte da mesma planta por superexpressão de um DGAT de teor normal de óleo da presente invenção. Desta maneira, um cassete de expressão compreendendo um polinucleotideo codificando um polipeptídeo DGAT de teor normal de óleo da invenção, por exemplo, o polinucleotideo ZmDGATl-2 (EF09B) da Id. de Seq. n° 51, codificando o ZmDGATl-2 (EF09B) da Id. de Seq. n° 52, para fornecer superexpressão deste polipeptídeo, assim aumentando o conteúdo de óleo e/ou conteúdo de ácido oléico e/ou proporção de ácido oléico/acido linoléico em uma planta ou parte da mesma planta. Assim, em alqumas modalidades, um cassete de expressão compreendendo a Id. de Seq. n° 51 ou um polinucleotideo codificando a Id. de Seq. n° 52 ou uma variante ou fragmento biologicamente ativo deste polipeptídeo é introduzido na planta ou parte desta planta por métodos bem conhecidos na técnica, incluindo os métodos de transformação e reprodução discutidos acima.
[223] Em modalidades específicas, as plantas e partes destas plantas da invenção possuindo o conteúdo de óleo aumentado encontram uso na indústria de moagem em úmido. No processo de moagem em úmido, o propósito é fracionar o cerne e isolar os constituintes químicos de valor econômico em suas partes componentes. 0 processo permite o fracionamento de amido em forma altamente purificada, assim como o isolamento em formas cruas de outros materiais incluindo, por exemplo, óleo não refinado, ou como uma ampla mistura de materiais que comumente recebem pouco ou nenhum processamento adicional além da secagem. Portanto, no processo de moagem em úmido o grão é amaciado por impregnação e quebrado por trituração para liberar o germe dos cernes. 0 germe é separado da mistura de densidade mais pesada de amido, cascas e fibra por "flutuação" dos segmentos de germe livres das outras substâncias em um processo de centrifugação. Isto permite uma separação limpa da fração do grão que contém o óleo dos fragmentos de tecido que contêm a maioria do amido. Uma vez que não é econômico extrair o óleo em uma escala pequena, muitas instalações de moagem em úmido enviam seu germe a instalações de produção de óleo centralizadas grandes. 0 óleo é expelido ou extraído com solventes dos germes secos e a farinha de germe restante é normalmente misturada a farinha de glúten de milho (CGF) , um co-produto da moagem em úmido. Desta forma, o amido contido no germe não é recuperado como tal no processo de moagem em úmido e é canalizado para CGF. Ver, por exemplo, Anderson e outros, (1982) "The Corn Milling Industry"; CRC Handbook of Processing and Utilization in Agriculture, A. Wolff, Boca Raton, FL, CRC Press., Inc., Vol. 11, Parte 1, Plant Products: 31-61 e Eckhoff (24-26 de junho de 1992) Proceedings of the 4th Corn Utilization Conference, St. Louis, MO, impresso pela National Corn Growers Association, CIBA-GEIGY Seed Division e USDA, ambas as quais estão aqui incorporadas por referência. (C) Métodos para Melhorar a Qualidade da Alimentação [224] São fornecidos métodos para melhorar a qualidade do tecido de um animal alimentando-se um animal com uma dieta compreendendo uma planta ou parte de uma planta da presente invenção que possua um conteúdo de óleo aumentado e/ou conteúdo de ácido oléico aumentado. Tais métodos compreendem alimentar o animal com uma dieta compreendendo quantidade suficiente de um grão ou óleo da invenção que compreende o conteúdo de óleo aumentado e/ou conteúdo de ácido oléico aumentado.
[225] 0 alimento empregado na dieta pode compreender cerca de 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 100% do grão da invenção (isto é, um grão compreendendo uma variante de alto teor de óleo / alto teor de ácido oléico de DGAT, o grão compreendendo um cassete de expressão que possibilita a superexpressão de um DGAT de teor normal de óleo aqui divulgado, combinações destes e similares). Em outras modalidades, o alimento empregado na dieta pode compreender cerca de 1% a cerca de 15%, cerca de 10% a cerca de 25%, cerca 20% a cerca de 35%, cerca de 30% a cerca de 45%, cerca de 40% a cerca de 55%, cerca de 50% a cerca de 65%, cerca de 60% a cerca de 75%, cerca de 70% a cerca de 85%, cerca de 80% a cerca de 95% ou cerca de 90% a 100% do grão de invenção.
[226] A qualidade do tecido de qualquer animal pode ser melhorada. Animais de interesse incluem, mas não estão limitados a animais ruminantes, incluindo, mas não limitados a gado bovino, búfalos ou carneiros, assim como animais não ruminantes incluindo, mas não limitados a suínos, aves (isto é, galinhas, galinhas poedeiras, peru, avestruzes e emas) ou peixes.
[227] Na modalidade especifica, a planta, parte de planta, semente, grão ou óleo é um constituinte de alimentação animal ou um produto alimentício. Plantas ou partes destas da presente invenção podem ser utilizadas em métodos, por exemplo, sem limitação, para se obter uma semente, farinha, matéria-prima ou óleo. Plantas utilizadas em tais métodos podem ser processadas. Assim sendo, a presente invenção fornece uma semente, grão, alimento e/ou óleo que são produzidos a partir de uma planta ou parte de planta possuindo um conteúdo de óleo aumentado e/ou conteúdo de ácido oléico aumentado e/ou proporção entre ácido oléico/ácido linoléico aumentada conforme aqui descrito. Métodos para produção de preparações de alimento, farinha, proteína e óleo a partir de várias partes de plantas são bem conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Patentes U. S. de número 4.957.748, 5.100.679, 5.219.596, 5.936.069, 6.005.076, 6.146.669 e 6.156.227. É fornecida ainda uma carne produzida a partir de animais sendo alimentados com a planta, parte de planta, grão e/ou óleo possuindo um conteúdo de óleo aumentado e/ou conteúdo de ácido oléico aumentado e/ou proporção entre ácido oléico/ácido linoléico aumentada conforme aqui descrito em outro local.
(D) Métodos para utilização de seqüências promotoras de ZmDGATl-2, ZmAAPl, ZmPESP, ZmS24 e ZmABCT
[228] A seqüência de nucleotídeo para o promotor de ZmDGATl-2(Mol7), ZmDGAT 1-2(ASK), ZmAAPl, ZmPESP(Mol7), ZmPESP(ASK), ZmS24, ou ZmABCT divulgada na presente invenção, assim como os variantes e fragmentos desta, é útil na manipulação genética de qualquer planta quando montada com uma construção de DNA de forma que a seqüência promotora esteja operativamente ligada com uma seqüência de nucleotideo heteróloga codificando uma proteína de interesse. Desta maneira, a seqüência de nucleotideo promotor de ZmDGATl-2(Mol7), ZmDGAT 1-2(ASK), ZmAAPl, ZmPESP(Mol7), ZmPESP(ASK), ZmS24 ou ZmABCT da invenção é fornecido em cassetes de expressão juntamente com seqüências de nucleotideo heterólogas para expressão na planta de interesse.
[229]Regiões de promotores híbridos sintéticos são conhecidos na técnica. Tais regiões compreendem elementos de promotor à montante de uma seqüência de nucleotideo ligada de forma operativa ao elemento promotor de outra seqüência de nucleotideo. Em uma modalidade da invenção, a expressão de gene heterólogo é controlada por um promotor híbrido sintético compreendendo a seqüência promotora ZmDGAT1-2 (Mol7), ZmDGATl-2 (ASK), ZmAAPl, ZmPESP (Mol7), ZmPESP(ASK), ZmS24 ou ZmABCT da invenção ou uma variante ou fragmento desta, ligada de forma operativa a elemento(s) promotor(es) à montante de um promotor heterólogo. Elementos promotores à montante têm sido identificados e podem ser utilizados para gerar um promotor sintético. Ver, por exemplo, Rushton e outros (1998) Curr. Opin. Plant Biol. 7:311-315. Alternativamente, uma seqüência de promotor ZmDGATl-2 (Mol7), ZmDGATl-2(ASK), ZmAAPl, ZmPESP (Mol7), ZmPESP (ASK), ZmS24 ou ZmABCT sintético pode compreender duplicações dos elementos promotores à montante encontrados na seqüência de promotor ZmDGATl-2 (Mol7), ZmDGATl-2 (ASK), ZmAAPl, ZmPESP (Mol7), ZmPESP (ASK), ZmS24 ou ZmABCT. É reconhecido que uma seqüência de promotor ZmDGATl-2 (Mol7), ZmDGATl-2 (ASK), ZmAAPl, ZmPESP (Mol7), ZmPESP (ASK), ZmS24 ou ZmABCT da invenção pode ser utilizada com sua seqüência de codificação de ZmDGATl-2 (Mol7), ZmDGATl-2 (ASK), ZmAAPl, ZmPESP, ZmS24 ou ZmABCT nativa. Uma construção de DNA compreendendo promotor ZmDGATl-2 (Mol7), ZmDGATl-2 (ASK), ZmAAPl, ZmPESP (Mol7), ZmPESP (ASK), ZmS24 ou ZmABCT ligado de forma operativa com sua seqüência de codificação de ZmDGATl-2 (Mol7), ZmDGATl-2 (ASK), ZmAAPl, ZmPESP, ZmS24 ou ZmABCT nativa pode ser utilizada para transformar qualquer planta de interesse para produzir uma mudança de fenótipo desejada. Onde o promotor e seu gene nativo ocorrem naturalmente na planta, isto é, no milho, a transformação de planta com estas seqüências ligadas de forma operativa também resulta ou em uma mudança de fenótipo, como um conteúdo de óleo aumentado, conteúdo de ácido oléico aumentado e/ou proporção entre ácido oléico/ácido linoléico aumentada, ou na inserção de seqüências ligadas de forma operativa em uma região diferente do cromossomo alterando assim o genoma da planta.
[230]Em outra modalidade da invenção, cassetes de expressão compreenderão uma região de iniciação transcricional compreendendo a seqüência de nucleotideo promotor de ZmDGATl-2 (Mol7), ZmDGATl-2(ASK), ZmAAPl, ZmPESP (Mol7), ZmPESP (ASK), ZmS24 ou ZmABCT aqui divulgadas, ou variantes ou fragmentos destas, ligadas de forma operativa à seqüência de nucleotideo heterólogo de cuja expressão deve ser controlada pelo promotor de ZmDGATl-2 (Mol7), ZmDGATl-2 (ASK), ZmAAPl, ZmPESP (Mol7), ZmPESP (ASK), ZmS24 ou ZmABCT da invenção.
[231] A seqüência de nucleotídeo promotor e métodos divulgados aqui são úteis na regulação da expressão de qualquer seqüência de nucleotídeo heteróloga em uma planta hospedeira a fim de variar o fenótipo de uma planta. Várias mudanças em fenótipo são de interesse, incluindo a modificação da composição de ácido graxo em uma planta, a alteração do conteúdo de aminoácido de uma planta, a alteração de um mecanismo de defesa contra patógenos de uma planta e similares. Estes resultados podem ser alcançados fornecendo-se a expressão de produtos heterólogos ou a expressão aumentada de produtos endógenos em plantas. Alternativamente, os resultados podem ser alcançados atendendo-se à necessidade por uma redução de expressão de um ou mais produtos endógenos, particularmente enzimas ou co-fatores na planta. Estas mudanças resultam em uma mudança no fenótipo da planta transformada.
[232] Os seguintes exemplos são oferecidos por meio de ilustração e não por meio de limitação.
EXPERIMENTAL
Exemplo 1: Mapeamento de QTL6 de Óleo/Ácido Oléico e Informação de Seqüência [233] ASKC28IB1, uma linha consangüínea derivada do ciclo 28 da população sintética de cerne único Alexho (ASK) foi utilizada como doador de alto teor de óleo e EF09B como um pai recorrente em uma série de populações de retrocruzamento contínuas. Para o mapeamento de QTL de óleo inicial, 300 cernes BC1 foram plantados, discos de folha foram coletados de cada muda e o DNA foi extraído. Genotipia de todo o genoma foi executada com todas as mudas individuais utilizando-se marcadores SSR igualmente distribuídos em 10 cromossomos de milho. Todas as 300 plantas BC1 foram retrocruzadas com EF09B para produzir sementes BC2. Dez a 20 cernes de cada espiga de BC2 madura foram analisados por NMR para determinar a guantidade de óleo assim como a concentração de óleo em bases por cerne ou por embrião. Para o óleo de semente, cernes secos ao ar foram utilizados para orientar as medições NMR. Para óleo de embrião, os cernes foram encharcados em água durante a noite. Os embriões foram dissecados de seus endospermas, secos a vácuo e submetidos a análise por NMR.
[234] O mapeamento foi executado utilizando-se dados de marcador das mudas BC1 e dados do óleo das espigas BC2. O mapeamento por intervalo composto de traços de óleo foi executado utilizando-se o programa Windows QTL Cartographer (Wang e outros, North Carolina State University). O nível de significância de QTL para cada traço foi determinado por 300 permutações a p < 0,05.
[235] Um QTL de teor de óleo de embrião e teor de óleo de cerne significativo foi detectado no cromossomo seis (QTL6). Os resultados do mapeamento derivados da concentração de óleo no embrião são mostrados na Figura 1. O QTL6 está localizado entre os marcadores PHI077 (51,2 cM, IBM2+, mapa de meiose simples) e EST723482 (98,4 cM) e com um valor de pico em torno de UMC1918 (Figura 1) . Estes resultados são consistentes com aqueles de Zhong e Williams (2003, dados não mostrados) obtidos de um estudo de mapeamento em uma população F2 derivada de um cruzamento entre ASKC28IB1 e FBI consangüíneos.
[236] O mapeamento fino de QTL6 foi atingido utilizando-se sobreposição de linhas quase isogênicas desenvolvidas ao em torno da região QTL6 (Figura 2). Eventos recombinantes entre PHI077 e EST723482 foram identificados a partir de vários estágios e autopolinizados por duas ou mais gerações para produzir linhas quase isogênicas (NILs). Séries de sobreposições próximas a NILs foram desenvolvidas em BC3S2, BC3S3 E BC4S2. Nas gerações de retrocruzamento e autopolinização subseqüentes, aplicou-se seleção assistida por marcador (MAS) de todo o genoma a cada geração para acelerar a seleção de indivíduos que apenas contêm o genoma ASKC28IB1 na região QTL6. Foi estimado que muitos indivíduos selecionados para desenvolvimento de NIL continham mais de 97,5% e 99% de seus genomas de pai EF09B para BC3 e BC4 respectivamente.
[237] A fim de mapear QTL6 em uma resolução muito mais alta, marcadores SSR e SNP adicionais em torno da região QTL6 foram também desenvolvidos utilizando-se informação de seqüência proprietária ou informação de seqüência de extremidade BAC pública. Os marcadores utilizados neste projeto e alguns marcadores em torno dessa região utilizados e publicados por vários autores, são mostrados na Tabela 1 abaixo.
[238] Tabela 1. Marcadores utilizados para mapeamento fino de teor de óleo /ácido oléico em QTL6. Marcadores em preto são marcadores Pioneer SSR ou SNP utilizados no mapeamento de QTL6. Eles são desenvolvidos a partir de seqüências proprietárias Pioneer (S) ou a partir de seqüências públicas (N) . Se conhecido, as posições no mapa são fornecidas em três diferentes mapas, meiose simples IBM2+ (V 1.5); Visinhos IBM2+ (V 1.6) e Diversidade Pioneer {V 1.4). Marcadores era várias cores sào citados a partir de referências dadas abaixo: 1. Mangolin e outros, 2004, Mapping QTLs for kernei oíl content in a tropical maize population, Euphytica, 137:251-259. 2. Song e outros, 2004, QTL mapping of kernei oíl concentration with high-oil maize by SSR markers, Maydica, 49:41-48. 3. Alrefai e outros, 1995, Quantitative trait locus analysis of fatty acíd concentration in maize, Gerioma, 38:894-901. 4. Johnson e Kocheford, 2003, Evaluation of Near-Isogenic Lines for QTL for kernei concentration in maize, Illinois Corn Breeder's School, oáainas 126-149.
[239]Dados relacionados a óleo foram obtidos dos NILs sobrepostos e classificados de acordo com diferentes classes de marcadores. Para cada par NIL, dados de óleo e perfis de ácido graxo foram obtidos a partir de cinco espigas bomozigotas para alelo ASK (QTL6+/+) e cinco espigas homozigotas para alelo EF09B (QTL6-/-J . Dados da classe QTL6+/+ e classe QTL6-/- foram comparados e uma diferença significativa em p < 0,01 entre a classe ASK homozigota (QTL6+/ +) e a classe de EF09B homozigota (QTL6-/-) sugeriu a presença de QTL6. Em BC3S2, a QTL6 foi mapeada a uma região de 10,8 cM [entre os marcadores ΕΞΤ450983 e MZA5002) . Em BC3S3 e BC4S2, a QTL6 foi mapeada adicíonaimente a uma pequena região entre os marcadores BAC18 e BAC29 (Figura 2) . Esta região corresponde a três clones BAC sobrepostos (bl2ic.n3, b33a.k3 e be46c.n5) no mapa físico de Mol7 consangüíneo. Seqüências destes três BACs foram determinadas e a inserção genômica total nos três clones é de aproximadamente 280 kb. As inserções genômicas nos 3 clones BAC Mol7 seqüenciados são apresentadas em três fragmentos genômicos separados, Id. de Seq. n° 116, Id. de Seq. n° 117 e Id. de Seq. n° 118, devido a alguns espaços não resolvidos.
[240]0 fragmento maior, Id. de Seq. n° 116, é 263762-bp em comprimento e contém ORFs para Proteína do Sistema de Efluxo K+ (ZmPESP; proteína mostrada na Id. de Seq. n° 56), proteína ZmDGATl-2 (Mol7) mostrada na Id. de Seq. n° 50, codificando a seqüência (cDNA) mostrada na Id. de Seq. n° 49), e transportador ABC semelhante a PDR (ZmABCT; proteína mostrada na Id. de Seq. n° 64, seqüência de codificação (cDNA) mostrada na Id. de Seq. n° 63) . Assim, os nucleotídeos (nt) 153888-156887 da Id. de Seq. n° 116 representa o promotor ZmPESP (Mol7) (exposto na Id. de Seq. n° 121); nt 156888-165958 da Id. de Seq. n° 116 representa a seqüência de codificação (seqüências íntron mais exon) para ZmPESP; nt 165959-166382 da Id. de Seq. n° 116 representa a seqüência ZmPESP 3'-UTR; o filamento complementar a nt 173344-17 6343 da Id. de Seq. n° 116 representa o promotor ZmDGATl-2 (Mol7) (filamento cmplementar a este promotor é exposto na Id. de Seq. n° 119); o filamento complementar a nt 167385-173343 da Id. de Seq. n° 116 representa a seqüência de codificação (seqüência exon mais íntron) para ZmDGATl-2 (Mol7); o filamento complementar a nt 167035-167384 da Id. de Seq. n° 116 representa a seqüência ZmDGATl-2 (Mol7) 3'-UTR; nt 254826-257825 da Id. de Seq. n° 116 representa o promotor ZmABCT (expoto na Id. de Seq. n° 124); nt 257826-263762 da Id. de Seq. n° 116 representa a seqüência de codificação parcial (seqüências exon mais íntron) para ZmABCT; e nt 167035-167384 da Id. de Seq. n° 116 representa a seqüência ZmABCT 3'-UTR.
[241] 0 segundo fragmento (Id. de Seq. n° 117) é 1191 bp e contém ORFs para 40 proteínas ribossômicas (ZmS24; proteína mostrada na Id. de Seq. n° 60, seqüência de codificação (cDNA) mostrado na Id. de Seq. n° 59) e aminoácido permease (ZmAAPl; proteína mostrada na Id. de Seq. n° 56, seqüência de codificação (cDNA) mostrada na Id. de Seq. n° 55). Assim, nt 1824-4823 da Id. de Seq. n° 117 representa o promotor ZmS24 (exposto na Id. de Seq. n° 123) ; nt 4824-5994 da Id. de Seq. n° 117 representa a seqüência de codificação de ZmS24 (seqüências íntron mais exon) ; nt 5995-6160 da Id. de Seq. n° 117 representa a seqüência ZmS24 3'-UTR; nt 6161-6888 da Id. de Seq. n° 117 representa o promotor de ZmAAPl (exposto na Id. de Seq. n° 120); nt 6889-8556 da Id. de Seq. n° 117 representa a seqüência de codificação de ZmAAPl (seqüências exon mais íntron) ; nt 8557-8822 da Id. de Seq. n° 117 representa a seqüência ZmAAPl 3'-UTR.
[242] O terceiro fragmento (Id. de Seq. n° 118) possui 6268 bp e não contém ORFs.
[243] A seqüência genômica ASK28IB1 para a região QTL6 foi também obtida. Uma biblioteca BAC foi construída utilizando-se DNA isolado de folhas de ASKC28IB1 e selecionada utilizando-se seqüência BAC 17 (Id. de Seq. n° 3) como um marcador. Um dos clones BAC positivos (clone ASKBAC F4) foi seqüenciado e anotado. A inserção neste clone é de 82725 pares de base (Id. de Seq. n° 128) e contém dois genes, PESP e DGAT1-2. Os outros três genes (Proteína S24 ribossômica 40S, AAP e ABCT) encontrados nos BACs Mol7 estavam fora da região coberta pelo clone F4. As posições de nucleotídeo para promotor, codificação e 3' UTR para ambos os genes PESP e DGAT1-2 no clone BAC ASKC28IB1 são descritas abaixo.
[244]A seqüência genômica ASKC28IB1 (ASK) de 82725 bp (Id. de Seq. n° 128) contém o ORF para a proteína ZmPESP (ZmS24; mostrada na Id. de Seq. n°. 57 (seqüência de codificação (cDNA) mostrado na Id. de Seq. n° 56) e a proteína ZmDGATl-2 (ASK) mostrada na Id. de Seq. n° 48 (seqüência de codificação (cDNA) mostrada na Id. de Seq. n° 47). Assim, os nucleotídeos (nt) 9306-12305 da Id. de Seq. n° 128 representa o promotor de ZmPESP (ASK) (exposto na Id. de Seq. n° 129) ; nt 12306-21370 da Id. de Seq. n° 128 representa a seqüência de codificação (seqüências exon mais íntron) para ZmPESP; nt 21371-21794 da Id. de Seq. n° 128 representa a seqüência ZmPESP 3'-UTR; o filamento complementar a nt 29472-32471 da Id. de Seq. n° 128 representa o promotor ZmDGATl-2 (ASK) (filamento cmplementar a este promotor é exposto na Id. de Seq. n° 130) ; o filamento complementar para nt 22774-29471 da Id. de Seq. n° 128 representa a seqüência de codificação (seqüências exon mais íntron) para ZmDGATl-2 (ASK); e o filamento complementar a nt 22365-22773 da Id. de Seq. n° 128 representa a seqüência ZmDGATl-2 (ASK) 3'-UTR.
[245JQTL6 pode ser adicionalmente definida a um fragmento de aproximadamente 195 kb, entre BAC18 e BAC29 (Figura 2) .
[246] Os dados de óleo destes NILs mostram que a QTL6 consistentemente aumenta as concentrações de óleo no embrião e na semente em múltiplas gerações. Os dados de óleo de BC3S2 e BC4S2 são resumidos na Figura 3. A QTL6 aumenta a concentração de óleo no embrião de 31,6% a 35,8% (um aumento de 13%) em BC3S2 e de 28,7% a 33,3% (um aumento de 16%) em BC4S2. Ela também aumenta a concentração de 4,4% a 5,1% (um aumento de 17%) em BC3S2 e de 3,7% a 4,4% (um aumento de 19%) em BC4S2. Acredita-se geralmente que esse milho de alto teor de óleo também contém um nivel aumentado de ácido oléico (18:1). Adicionalmente, uma QTL maior controlando a proporção de adido oléico (18:1) e linoléico (18:2) foi mapeada no cromossomo 6 por diferentes grupos (Alrefai e outros, (1995) Genome 38:894-901; Poneleit e outros, (1976) Agron. Abs. 8:59).
[247]O presente estudo investiga se os NILs desenvolvidos para QTL6 também continham níveis aumentados de ácido oléico. Perfis de ácidos graxos para classes ASK e EF09B homozigotas em sementes BC3S2, BC3S2, e BC4S2 foram obtidos. Os dados para BC3S2 e BC4S2 são resumidos na Figura 4. Certamente a QTL6 também aumenta consistentemente a concentração de ácido oléico em sementes em múltiplas gerações. Em BC3S2, a QTL6 aumentou a concentração de ácido oléico de 24,6% a 36,2% (um aumento de 47%) e reduz a concentração de ácido linoléico de 58,5% a 46,4% (uma redução de 21%). Em BC4S2, a QTL6 aumenta a concentração de ácido oléico de 23,6% a 37,9% (um aumento de 61%) e reduz a concentração de ácido linoléico de 59,8% a 45,4% (uma redução de 24%). Embora as concentrações de ácidos graxos nos embriões não fossem diretamente medidas, é razoável assumir que a maioria das mudanças observadas devem-se a mudanças nos embriões uma vez que o teor de óleo dos embriões representam aproximadamente 90% do óleo de semente total. Na resolução de mapeamento de 195 kb, os fenótipos de teor de óleo aumentado e de teor de ácido oléico aumentado não segregam, sugerindo que os genes responsáveis por ambos os fenótipos estão localizados na região de 195 kb.
[248] Em teoria, o milho com maior conteúdo de óleo além da QTL6 pode ser produzido por empilhamento molecular ou genético da QTL6 com outro QTL de teor de óleo ou outros genes conhecidos por aumentarem o teor de óleo. 0 cotilédone folhoso 1 (LEC1) de milho é um fator de transcrição de domínio B (ver Figuras 38 e 39) anteriormente mostrado aumentando o teor de óleo do embrião (ver Figura 5). Para determinar se LEC1 pode aumentar ainda mais o teor de óleo, uma linha homozigótica BC2S2 para QTL6 derivada da população ASKC28IB1 x EF09B foi cruzada com plantas homozigóticas contendo o transgene ÇEC1 de milho. 0 teor de óleo do embrião e semente das plantas Fl resultantes foram analizados e os dados foram comparados àqueles obtidos de plantas carregando QTL6 e LEC1 apenas. Os resultados indicam que QTL6 e LEC1 possuem efeitos aditivos na concentração de óleo no embrião assim como da semente e empilhar geneticamente LEC1 e QTL6 pod eelevar a concentração de óleo no embrião a cerca de 40% e concetração de óleo da semente a cerca de 6% em plantas heterozigóticas (Figura 5).
[249] Para identificar os genes responsáveis pelo aumento de óleo e ácido oléico em QTL6, os três clones de BAC Mol7 (bl21c.n3, b33a.k3 e be46c.n5) foram sequenciados e anotados. O programa FGENESH (Softberry, Inc. 116 Radio Circle, Suite 400 Mount Kisco, NY 10549) foi utilizado para prever os genes localizados nos três clones de BAC. Na região entre BAC18 e BAC29 (aproximadamente 195 kb), cinco quadros de leitura aberta (ORFs) compartilhando significativa homologia com os genes conhecidos foram identificados. Eles codificam uma proteína de sistema de efluxo K+ (PESP), uma diaglicerol O-aciltransferase do tipo 1 (DGAT1-2), uma proteína S24 ribossômica 40S, uma aminoácido permease (AAP) e um transportador ABC semelhante a PDR (ABCT) . Os cinco ORFs e alguns marcadores proximamente ligados são mostrados na Figura 6.
[250] É bem conhecido na técnica que DGAT está envolvido na última etapa de biossíntese de triaciglicerol (TAG) . As seqüências cDNA para o gene DGAT (DGAT 1-2) localizadas na região QTL6 de diversos consangüíneos diferentes foram obtidas, incluindo ASKC28IB1, EF09B, Mol7, e B73. A seqüência do alelo B37 foi derivada dos clones EST Pionner existentes. A seqüência do alelo Mol7 foi deduzida a partir das seqüências do clone BAC descritas abaixo. As seqüências de alelo ASKC28IB1 e EF09B foram clonadas de embriões imaturos por RT-PCR. De forma breve, o RNA total foi extraído de homozigotos dos pares NIL de BC4S2 para ASK (QTL6+/+) ou EF09B (QTL6-/-). O primeiro filamento de cDNA foi sintetizado utilizando-se iniciadores de poli(dT). O comprimento total de cDNA foi amplificado por PCR a partir do primeiro filamento de cDNA utilizando os seguintes iniciadores: iniciador de avanço, 5'-ctggaaccttcctcgcatggccccg (94784) (Id. de Seq. n° 114); iniciador reverso 5'-ctatctacttgcctgggcctgcctgttc (94785) (Id. de Seq. n° 115) . O alinhamento da seqüência de DNA destes quatro alelos é mostrado na Figura 31. Em nivel de nucleotídeo, ASK e alelos normais possuem modificações em nove locais e as mudanças em quatro destes locais levam a mudanças em aminoácidos (Figura 30) . Análises mais detalhadas destas modificações estão presentes no Exemplo 4 abaixo.
Exemplo 2: Informação de Marcador e Iniciador [251] Marcadores polimórficos de nucleofídeo simples (SNP) foram desenvolvidos a partir de seqüêneias de extremidade BAC das três seqüêneias BAC de Mol7 cobrindo a região QTL6. Exemplos nao limitantes de marcadores polimórficos entre alelos ASKC28IB1 (ASK; uma linha de alto teor de óleo / alto* teor de ácido oléico) e EF09B (linha de teor de óleo normal) sâo expostos nas Figuras 11 a 25. A Tabela 2 abaixo mostra os polimorfismo únicos aos marcadores QTL6 de ASK que não sâo encontrados nos locais de marcador correspondentes na região QTL6 das linhas de teor normal de óleo (Id. de Seq. n° para EF09B é utilizada como a seqüência de referência).
[252] Tabela 2. Locais dos polimorfismos nos loci marcadores da região QTL6 de milho. Os identificadores de sequência referem-se ao locus marcador especifico para EF09B (linha consangüínea de milho de teor normal de óleo). NT, a posição de nucleotídeo no identificador de seqüência para EF09B onde um polimorfismo foi identificado no locus marcador correspondente para ASK (linha consangüínea de milho de alto teor de óleo, alto teor de ácido oléico) ; "mudança polimórfica" refere-se à substituição, inserção ou deleçâo especifica ocorrendo no locus marcador correspondente para ASK.
[253] Iniciadores adequados para detecção da presença destes loci marcadores em uma planta ou tecido de planta são expostos nas Figura 7 a 29 e Id. de Seq. n° 68 a 115 e 124 a 127.
Exemplo 3: Reprodução Assistida por Marcador para QTL6 [254] Este exemplo expõe o uso dos polimorfismos nos vários marcadores moleculares de QTL6 para acelerar a incorporação do traço de alto teor de óleo e/ou alto teor de ácido oléico em outro germoplasma de milho com o resultado de aumentar o teor de óleo e/ou teor de ácido oléico no embrião e no cerne, [255] A presente invenção fornece um pé de milho com conteúdo de óleo e/ou ácido oléico no embrião e/ou cerne aumentado(s) selecionado com o uso de reprodução assistida por marcador onde uma população de plantas são selecionadas para a presença de pelo menos uma das seqüências polimórficas exportas no Exemplo 2. A seleção de plantas possuindo pelo menos uma das seqüências polimórficas associadas ao traço de alto teor de óleo e/ou alto teor de ácido oléico compreende marcar o DNA genômico da planta resultante, através do processo de seleção, para a presença do polimorfismo. As plantas contendo o locus marcador desejado continuam na reprodução e no processo de seleção.
[256] Além disso, uma vez que a concentração de ácido oléico mostra um aumento maior que o conteúdo de óleo em plantas transportando o locus marcador de QTL6 de alto teor de óleo/alto teor de ácido oléico e podem ser medidas com precisão, isto pode ser utilizado para monitorar e confirmar a presença de QTL6 durante o processo de reprodução assistida por marcador. Assim, por exemplo, qualquer pé de milho dado ou a progenia resultante dos cruzamentos ou retrocruzamentos entre pés de milho pode ser selecionado pela presença do locus marcador de QTL6 examinando-se seu conteúdo de ácido oléico, particularmente em todo o cerne ou embrião. Desta maneira, a concentração de ácido oléico de uma semente ou embrião de pelo menos 35% (isto é, 35% ou mais do óleo da semente ou embrião é representado por ácido oléico) seria preditivo de que a planta provavelmente compreende o locus marcador de QTL6 desejado e assim podería prosseguir de forma benéfica no processo de reprodução e seleção. Alternativamente, a concentração de ácido oléico em uma semente ou embrião de menos de 35% (isto é, o ácido oléico representa menos de 35% do óleo da semente ou embrião) seria preditivo de que a fonte da planta não transporta o locus QTL6 desejado em seu genoma.
[257] Esta etapa de seleção de ácido oléico podería ser adicionalmente suplementada com seleções genômicas para a presença do locus QTL6. Em tal exemplo, a presença do locus QTL6 desejado é confirmada detectando-se a presença da inserção do códon TTC na seqüência de codificação de ZmDGATl-2 que resulta na inserção de Phe467, Phe468, or Phe469 na proteína ZmDGATl-2 (ASK) . Isto pode ser alcançado, por exemplo, amplificando-se o fragmento de DNA ao redor deste códon utilizando-se a Id. de Seq. n° 126 e 127, conforme descrito no Exemplo 13 abaixo.
Exemplo 4. Caracterização de Seqüência de Quadro de Leitura Aberta em QTL6.
A. DGAT
[258] A Figura 31 mostra o alinhamento da seqüência de ácido nucléico da variante de ZmDGATl-2 de alto teor de óleo / alto teor de ácido oléico (derivada da linha consangüínea ASK; Id. de Seq. n° 48, codificada por Id. de Seq. n° 47) comparada à seqüência ZmDGATl-2 obtida das linhas consangüíneas de milho de teor de óleo normal Mol7 (Id. de Seq. n° 50, codificada por Id. de Seq. n° 49) , EF09B (Id. de Seq. n° 52, codificada por Id. de Seq. n° 51) e b73 (Id. de Seq. n° 54, codificada por Id. de Seq. n° 53). O alinhamento das respectivas seqüências de aminoácidos para estas proteínas é mostrado na Figura 30. O alinhamento de seqüência de ácido nucléico mostra que existem os seguintes polimorfismos únicos ao alelo de alto teor de óleo/alto teor de ácido oléico de ZmDGATl-2 que não são encontrados na seqüência correspondente das linhas consangüineas de milho de teor de óleo normal. A Tabela 3 abaixo resume os polimorfismos identificados na variante de ZmDGATl-2 de alto teor de óleo/alto teor de ácido oléico (isto é, ZmDGATl-2 (ASK)) que levam às mudanças de residuo em ZmDGATl-2(ASK).
[259]Conforme pode ser observado a partir do alinhamento da proteína ZmDGAT 1-2(ASK) com o da proteína DGAT1-2 das linhas consangüineas de milho de teor de óleo normal (isto é, EF09B, Mol7 e B73), a proteína ZmDGAT 1-2(ASK) possui uma deleção de glutamina e inserção de fenilalanina em relação à proteína DGATl-2 de teor de óleo normal. Observe que uma vez que a deleção de glutamina e a inserção da fenilalanina mostradas na Figura 30 ocorre em regiões da proteína DGATl-2 que compreende resíduos de glutamina em repetição e de fenilalanina em repetição, respectivamente, a deleção e inserção podería ocorrer em qualquer um dos resíduos de repetição respectivos. Assim, a deleção da glutamina mostrada na Figura 30 aparece na posição correspondente a Gln67 da proteína DGATl-2 de teor normal de óleo, na realidade, a deleção da glutamina podería representar uma deleção do resíduo correspondente a to Gln64, Gln65, Gln66, ou Gln67 da DGATl-2 de teor normal de óleo (por exemplo, EF09B de Id. de Seq. n° 52) . De forma similar, embora a inserção de fenilalanina em DGATl-2 (ASK) mostrada na Figura 30 seja representada por Phe469 desta proteína, na realidade, a inserção de fenilalanina em relação à DGATl-2 poderia ser representada pela fenílalanína na posição 4 67, 468 ou 469 da DGAT1-2 (ASK) (ver Id. de Seq. n° 48).
[260]Tabela 3. Locais dos polimorfismos nos ORF de ZmDGATÍ-2 da região QTL6 de milho. O identificador de sequência refere-se ao ORF de ZmDGATl-2 para EFG9B {.linha consangüínea de milho de teor normal de óleo; Id. de Seq. n° 51) . NT, a posição de nucleotideo no identificador de sequência para EF09B onde um polimorfismo foi identificado no ORF de ZmDGATl-2 correspondente para ASK {linha consangüínea de milho de alto teor de óleo, alto teor de ácido oléico); "mudança polimórfica" refere-se à substituição, inserção ou deleçâo específica ocorrendo no ORF de ZmDGATl-2 correspondente para ASK (ld. de Seq. n° 47) "mudança de resíduo" refere-se à substituição, deleção ou inserção de aminoácido· na proteína ZmDGATl-2 correspondente para ASK {Id. de Seq. n° 48) conforme comparado à seqüência de referência EF09B {Id. de Seq. n° 52) como um resultado da mudança polimórf ica no ORF de ZmGDATl-2 para ASK (Id. de Seq. n° 47) . * Proteína ZmDGATl-2 para ASK (Id. de Seq. n° 48) está sem o resíduo de glutamína correspondente na posição· 64, 65, 66 ou 67 da proteína ZmDGATl-2 para EF09B {Id. de Seq. n° 52) , dependendo se a deleção dos três nucleotídeos CAG na seqüência de codificação correspondente para a proteína ZmDGATl-2 para EF09B (Id. de Seq. n° 51) ocorre nos nucleotídeos 190 a 192, 193 a 195, 196 a 198 ou 199 a 201.
** 0 resíduo de fenilalanina na posição 4 67, 468 ou 4 69 da proteína ZmDGATl-2 para ASK (id. de Seq. rt° 48) representa uma inserção nesta proteína com relação ao local correspondente na proteína ZmDGATl-2 para EFQ9B (Id. de Seq. n° 52). Assim, Phew na sequência ASK correspondería a uma inserção deste resíduo entre Trp^g? e Phe.<i6S da proteína ZmDGATl-2 para EFQ9B (Id. de Seq. n° 52} . A Phe^e da sequência ASK correspondería a uma inserção deste resíduo entre Phe-aee e Phe.ieg da proteína ZmDGATl-2 para EF09B. A
Phe469 da seqüência ASK correspondería a uma inserção deste resíduo entre Phe469 e Phe470 da proteína ZmDGATl-2 para EF09B. 0 local da inserção do resíduo de fenilalanina na seqüência ASK dependería se a mudança polimórfica observada na seqüência de codificação ASK (isto é, na inserção TTC) ocorre na posição correspondente ao nucleotídeo 1401, 1404 ou 1407 da seqüência de codificação para a proteína ZmDGATl-2 EF09B de teor normal de óleo (isto é, Id. de Seq. n° 51) .
[261] Estes polimorfismos no ORF de ZmDGATl-2 para ASK podem ser caracterizados pela mudança de resíduo ocorrendo na proteína ZmDGATl-2 codificada para ARK (Id. de Seq. n° 48) com relação ao resíduo correspondente para a proteína ZmDGATl-2 para EF09B (Id. de Seq. n° 52) como segue: 1. Polimorfismos de Nucleotídeo Simples a. valina na posição 45 da Id. de Seq. n° 52 é substituída com uma glicina na posição 45 de Id. de Seq. n° 48 b. prolina na posição 55 da Id. de Seq. n° 52 é substituída com uma serina na posição 55 de Id. de Seq. n° 48 2. Deleções [262] O resíduo de glutamina correspondente ao resíduo de glutamina na posição 64, 65, 66 ou 67 do aminoácido de Id. de Seq. n° 52 é deletado em Id. de Seq. n° 48. 3. Inserções [263] A proteína ZmDGATl-2 (ASK) possui uma inserção de um resíduo de fenilalanina em uma posição localizada entre um par de resíduos correspondentes a um par de resíduos em Id. de Seq. n° 52 selecionados entre: a. o resíduo de triptofano em uma posição 4 67 do aminoácido de Id. de Seq. n° 52 e o resíduo de fenilalanina a uma posição de aminoácido 468 de Id. de Seq. n° 52; ou b. o resíduo de fenilalanina na posição de aminoácido 468 de Id. de Seq. n° 52 e o resíduo de fenilalanina na posição de aminoácido 469 de Id. de Seq. n° 52; ou c. o resíduo de fenilalanina em uma posição de aminoácido 469 de Id. de Seq. n° 52 e o resíduo de serina a uma posição de aminoácido 470 de Id. de Seq. n° 52.
[264] A proteína ZmDGATl-2 (ASK) (Id. de Seq. n° 48) compreende todas estas quatro mudanças de resíduo. Os polimorfismos únicos ao ORF de ZmDGATl-2 (Id. de Seq. n° 47, codificando o polipeptídeo de ZmDGATl-2 (ASK) na Id. de Seq. n° 48) da linha consangüínea de alto teor de óleo, alto teor de ácido oléico ASK podem ser também utilizados na seleção e reprodução assistida por marcador conforme descrito no Exemplo 5 abaixo. B. Aminoácido Permease 1 (AAP1) [265] A presente invenção também fornece o quadro de leitura aberta para o polipeptídeo de aminoácido permease 1 (AAP1) de milho (Id. de Seq. n° 56; denominado ZmAAPl) e variantes biologicamente ativas deste conforme definido abaixo. Os polinucleotídeos isolados codificando o polipeptídeo ZmAAPl são também englobados pela presente invenção. Em uma modalidade, o polinucleotídeo isolado compreende a seqüência exposta em Id. de Seq. n° 55 ou variante deste codificando um polipeptídeo AAP1 biologicamente ativo. A Figura 34 mostra um alinhamento do polipeptídeo ZmAAPl com outros polipeptídeos AAP relacionados de outras espécies de plantas. C. Proteína de Sistema de Efluxo de K+ (PESP) [266] A presente invenção também fornece o quadro de leitura aberta para a proteína de sistema de efluxo de potássio de milho (Id. de Seq. n° 58; denominada ZmPESP) e variantes biologicamente ativas desta conforme definido abaixo. Os polinucleotídeos isolados codificando o polipeptídeo ZmPESP são também englobados pela presente invenção. Em uma modalidade, o polinucleotídeo isolado compreende a seqüência exposta em Id. de Seq. n° 57 ou variante deste codificando um polipeptídeo PESP
biologicamente ativo. A Figura 35 mostra um alinhamento do polipeptídeo ZmPESP com outros polipeptídeos PESP relacionados de outras espécies de plantas.
D. Proteína S24 Ribossômica 40S
[267] A presente invenção também fornece o quadro de leitura aberta para a proteína S24 ribossômica 40S de milho (Id. de Seq. n° 60; denominada ZmS24) e variantes biologicamente ativas desta conforme definido abaixo. Os polinucleotídeos isolados codificando o polipeptídeo ZmS24 são também englobados pela presente invenção. Em uma modalidade, o polinucleotídeo isolado compreende a seqüência exposta em Id. de Seq. n° 59 ou variante deste codificando uma proteína S24 ribossômica 40S biologicamente ativa. A Figura 36 mostra um alinhamento do polipeptídeo ZmS24 com outras proteínas ribossômicas relacionadas de outras espécies de plantas.
E. Transportador ABC
[268] A presente invenção também fornece o quadro de leitura aberta para o polipeptídeo de transportador ABC tipo PDR (ABCT) de milho (Id. de Seq. n° 64; denominado ZmABCT (compósito)) e variantes biologicamente ativas deste conforme definido abaixo. Os polinucleotideos isolados codificando o polipeptideo ZmABCT (compósito) são também englobados pela presente invenção. Em uma modalidade, o polinucleotideo isolado compreende a seqüência exposta em Id. de Seq. n° 63 ou variante deste codificando um polipeptideo AAP1 biologicamente ativo.
[269] 0 comprimento total da seqüência de codificação foi construído a partir da seqüência de cDNA de ORF parcial de ZmABCT clonada a linha de milho consangüínea Mol7 de teor normal de óleo (seqüência exposta na Id. de Seq. n° 61, codificando a seqüência de aminoácido N-terminal exposta na Id. de Seq. n° 62) e as seqüências EST e genômica para a linha de milho consangüínea B73 de teor normal de óleo. A Figura 37 mostra um alinhamento do polipeptideo ZmABCT (compósito) com outros polipeptídeos de ABCT relacionados de outras espécies de plantas.
Exemplo 5. Reprodução Assistida por Marcador para QTL6 [270] Este exemplo expõe o uso dos polimorfismos na variante de DGAT de alto teor de óleo / alto teor de ácido oléico, por exemplo, ZmDGATl-2 (ASK) da Id. de Seq. n° 47, à medida que os marcadores moleculares aceleram a incorporação do traço de alto teor de óleo / alto teor de ácido oléico em outro germoplasma com o resultado de aumento de teor de óleo e/ou teor de ácido oléico no cerne, e/ou aumento na proporção de ácido oléico / ácido linoléico no cerne.
[271] A presente invenção fornece um pé de milho com conteúdo de óleo e/ou ácido oléico aumentado no cerne selecionado pelo uso de reprodução assistida por marcador, onde uma população de plantas é selecionada pela presença de pelo menos uma das seqüências polimórficas únicas à variante de alto teor de óleo / alto teor de ácido oléico de DGAT. 0 Exemplo 4, Tabela 3, acima, lista os polimorfismos únicos ao DGAT de alto teor de óleo / alto teor de ácido oléico.
[272] A seleção de plantas possuindo pelo menos uma das seqüências polimórficas da variante de alto teor de óleo / alto teor de ácido oléico de DGAT, que está associada com o traço de alto teor de óleo e/ou alto teor de ácido oléico, compreende marcar o DNA genômico da planta resultante, através do processo de seleção, para a presença do polimorfismo. Iniciadores adequados para detecção da presença da variante de alto teor de óleo / alto teor de ácido oléico são expostos na Id. de Seq. n° 114, 115 e 124 a 127. Por exemplo, o par iniciador exposto como Id. de Seq. n° 124 e 125 amplificará um fragmento que englobe as primeiras três mudanças no N-terminal da proteína DGAT1-2 ASK (nt 134, 163, 199 a 201 na Tabela 3 acima) . O par iniciador exposto como Id. de Seq. n° 126 e 127 amplificará um fragmento que inclua a mudança no C-terminal de DGAT1-2 ASK (nt 1408 a 1410 na Tabela 3 acima) . As plantas contendo o DGAT de alto teor de óleo / alto teor de ácido oléico continuam no processo de reprodução e de seleção.
Exemplo 6. Transformação e Regeneração de Pés de Milho Transgênicos [273] Embriões de milho imaturos de plantas doadoras de estufa são bombardeados com plasmídeos contendo a seqüência de ZmDGATl-2 (ASK) da Id. de Seq. n° 47, ou a seqüência ZmDGATl-2 (EF09B) da Id. de Seq. n° 51, ligada de forma operativa a um promotor de interesse e o gene marcador selecionável PAT (Wohlleben e outros, (1988) Gene 70:25-37), que confere resistência ao herbicida Bialafos. Alternativamente, o gene do marcador selecionável é fornecido em um plasmideo separado. A transformação é executada como segue. Receitas do meio seguem abaixo.
Preparação de Tecido Alvo [274] As espigas são descascadas e a superfície esterilizada em 30% de água sanitária Clorox mais 0,5% de detergente Micro por 20 minutos e rinsadas duas vezes com água estéril. Os embriões não maduros são extirpados e o eixo do embrião voltado para baixo (escutelo voltado para cima) , 25 embriões por placa, em meio 560Y por 4 horas e então alinhados dentro dos 2,5 cm da zona alvo em preparação por bombardeamento.
[275] É produzido um vetor de plasmideo compreendendo a seqüência ZmDGATl-2 (ASK) da Id. de Seq. n° 47, ou a seqüência ZmDGATl-2 (EF09B) da Id. de Seq. n° 51, ligada de forma operativa a um promotor de interesse. Este DNA plasmideo mais DNA plasmideo contendo um marcador selecionável PAT é precipitado sobre pelotas de tungstênio de 1,1 micrômetro (diâmetro médio) usando um procedimento de precipitação de CaCl2 como segue: 100 μΐι de preparado de partículas de tungstênio em água; 10 μΐϋ (1 μg) de DNA em tampão Tris-EDTA (1 μρ total de DNA); 100 μΤ de CaCl2 2,5 M; e, 10 μΐ de espermidina 0,1 M.
[276] Cada reagente é adicionado seqüencialmente à suspensão de partículas de tungstênio enquanto a agitação é mantida no centrifugador de vários tubos. A mistura final é brevemente sonificada e deixada a incubar sob agitação constante por 10 minutos. Após o período de precipitação, os tubos são centrifugados brevemente, o líquido é removido, lavados com 500 mL de etanol 100% e centrifugado por 30 segundos. Novamente o líquido é removido, e 105 μ]1 de etanol a 100% são adicionados à pelota da partícula de tungstênio final. Para bombardeamento por pistola de partículas, as partículas de tungstênio/DNA são brevemente "sonicadas" e são coradas com 10 μύ sobre o centro de cada macrotransportador e deixadas a secar por cerca de 2 minutos antes do bombardeamento.
[277] As placas de amostra são bombardeadas no nível #4 em uma pistola de partículas. Todas as amostras recebem um único disparo a 4,48 MPa, com um total de dez alíquotas tiradas de cada tubo de partículas preparadas/DNA.
[278] Seguindo o bombardeamento, os embriões são mantidos em meio 560Y por 2 dias, e então transferidos a meio de seleção 560R contendo 3 mg/litro de Bialafos e subcultivados a cada 2 semanas. Após aproximadamente 10 semanas de seleção, os clones de calos resistentes à seleção são transferidos a meio 288J para iniciar uma regeneração de planta. Seguindo a maturação do embrião somático (2 a 4 semanas), embriões somáticos bem desenvolvidos são transferidos ao meio para germinação e transferidos ao ambiente de cultura iluminado. Aproximadamente 7 a 10 dias após, plântulas em desenvolvimento são transferidas a meio livre de hormônio 272V em tubos por 7 a 10 dias até que as plântulas estejam bem estabelecidas. As plantas são então transferidas para inserção em superfícies (equivalentes a recipiente de 6,35 cm) contendo terra e foram crescidas por 1 semana em uma câmara de desenvolvimento, um crescimento subseqüente adicional por 1 a 2 semanas na estufa, e então transferidas a 600 recipientes clássicos (6,07 litros) e deixadas a crescer até maturidade. As plantas são monitoradas e registradas quanto ao seu conteúdo de óleo e conteúdo de ácido oléico.
[279] O meio de bombardeamento (560Y) compreende 4,0 g/L de sais basais N6 (SIGMA C-1416) , 1,0 mL/L de Mistura reacional de vitamina de Eriksson (1000X SIGMA-1511), 0,5 mg/L de HC1 tiamina, 120,0 g/L sucrose, 1,0 mg/L de 2,4-D e 2,88 g/L de L-prolina (levado ao volume com D-I H2O seguindo ajuste ao pH 5,8 com KOH) ; 2,0 g/L de Gelrite (adicionado após avolumação com D-I H2O) ; e 8,5 mg/L nitrato de prata (adicionado após esterilizar o meio e resfriar à temperatura ambiente) . O meio de seleção (560R) compreende 4,0 g/L de sais basais N6 (SIGMA C-1416), 1,0 mL/L de Mistura reacional de vitamina de Eriksson (1000X SIGMA-1511), 0,5 mg/L de HC1 tiamina, 30,0 g/L sucrose e 2,0 mg/L de 2,4-D e 2,88 g/L de L-prolina (levado ao volume com D-I H2O seguindo ajuste ao pH 5,8 com KOH); 3,0 g/L de Gelrite (adicionado após avolumação com D-I H2O) ; e 0,85 mg/L nitrato de prata e 3,0 mg/L de bialafos (ambos adicionados após esterilizar o meio e resfriar à temperatura ambiente).
[280] O meio de regeneração de planta (288J) compreende 4,3 g/L de sais MS (GIBCO 11117-074), 5, 0 mL/L de solução comum de vitaminas MS (0,100 g de ácido nicotinico, 0,02 g/L HC1 tiamina, 0,10 g/L de HC1 piridoxina e 0,40 g/L de glicina avolumados com D-I H2O polido) (Murashige and Skoog (1962) Physiol. Plant. 15:473), 100 mg/L de mio-inositol, 0,5 mg/L zeatina, 60 g/L de sucrose, e 1,0 mL/L de ácido abscissico 0,1 mM (avolumado com D-I H2O polido após ajuste ao pH 5,6); 3.0 g/L de Gelrite (adicionado após avolumação com D-I H2O); e 1.0 mg/L ácido indoleacético e 3,0 mg/L de bialafos (adicionado após esterilizar o meio e resfriamento a 60°C). O meio livre de hormônio (272V) compreende 4,3 g/L de sais MS (GIBCO 11117-074), 5,0 mL/L de solução comum de vitaminas MS (0,100 g de ácido nicotinico, 0,02 g/L HC1 tiamina, 0,10 g/L de HC1 piridoxina e 0,40 g/L de glicina avolumados com D-I H2O polido), 0,1 g/L de mio-inositol, e 40,0 g/L de sucrose (avolumados com D-I H2O polido após ajuste ao pH 5,6); e 6.0 g/L de bacto-agar (adicionado após avolumação com D-I H2O) , esterilizado e resfriado a 60°C.
Exemplo 7. Transformação de Milho mediada por Agrobacteri um [281]Para a transformação de milho mediada por Agrobacterium com uma seqüência ZmDGATl-2 (ASK) de Id. de Seq. n° 47 ou uma seqüência ZmDGATl-2 (EF09B) de Id. de Seq. n° 51, o método de Zhao é empregado (Patente U.S. de número 5.981.840, e publicação de patente PCT W098/32326; os conteúdos das quais estão aqui incorporados por referência). De forma breve, embriões imaturos são isolados do milho e os embriões contatados com uma suspensão de Agrobacterium, onde as bactérias são capazes de transferir a seqüência ZmDGATl-2 (ASK) de Id. de Seq. n° 47, ou ZmDGATl-2 (EF09B) de Id. de Seq. n° 51, ligada de forma operativa a um promotor de interesse a pelo menos uma célula de pelo menos um dos embriões imaturos (etapa 1: etapa de infecção). Nesta etapa, os embriões imaturos são imersos em uma suspensão de Agrobacterium para a iniciação de inoculação. Os embriões são co-cultivados por um tempo com o Agrobacterium (etapa 2: etapa de co-cultivação). Os embriões imaturos são cultivados em meio sólido após a etapa de infecção. Após este período de co-cultivação uma etapa de "descanso" opcional é considerada. Nesta etapa de descanso, os embriões são incubados na presença de pelo um antibiótico conhecido para inibir o desenvolvimento de Agrobacterium sem a adição de um agente seletivo para transformantes de planta (etapa 3: etapa de descanso). Os embriões imaturos são cultivados em meio sólido com antibiótico, mas sem um agente de seleção, para eliminação de Agrobacterium e para uma fase de descanso para as células infectadas. A seguir, os embriões inoculados são cultivados em meio contendo um agente seletivo e calos transformados em desenvolvimento são recuperados (etapa 4: etapa de seleção). Os embriões imaturos são cultivados em meio sólido com um agente seletivo resultando no desenvolvimento seletivo de células transformadas. 0 calo é então regenerado em plantas (etapa 5: etapa de regeneração), e preferivelmente, os calos desenvolvidos em meio seletivo são cultivados em meio sólido para regenerar plantas.
Exemplo 8. Transformação do Embrião de Soja A. Condições de Cultivo [282]Culturas de suspensão embriogênicas de soja (cv. Jack) são mantidas em 35 mL de meio líquido SB 196 (ver receitas abaixo) em um agitador rotativo, 150 RPM, 26°C com luzes fluorescentes brancas frias em fotoperíodo de 16:8 h dia/noite a intensidade de luz de 60 a 85 μΕ/ιη2/3. Os cultivos são sub-cultivados a cada 7 dias a duas semanas inoculando-se aproximadamente 35 mg de tecido em 35 mL de SB196 líquido fresco (o intervalo de sub-cultivo preferido é a cada 7 dias).
[283] Os cultivos de suspensão embriogênica de soja são transformados com os plasmídeos e fragmentos de DNA descritos nos seguintes exemplos pelo método de bombardeio por pistola de partículas (Klein e outros, (1987) Nature 327:70) . B. Iniciação de Cultivo de Suspensão Embriogênica de Soja [284] Os cultivos de soja são iniciados duas vezes a cada mês com 5 a 7 dias entre cada iniciação.
[285] Vagens com sementes imaturas de pés de soja disponíveis após 45 a 55 dias de plantio foram escolhidas, removidas de suas cascas e colocadas em uma caixa magenta esterilizada. As sementes de soja são esterilizadas agitando-as por 15 minutos em solução de Clorox a 5% com 1 gota de sabão marfim (95 mL de água destilada autoclavada mais 5 mL de Clorox e 1 gota de sabão) . Misturar bem. As sementes são rinsadas utilizando-se 2 garrafas de 1 litro de água destilada esterilizada e destas menos de 4 mm são colocadas em lâminas de microscópio individuais. A pequena extremidade das sementes é cortada e os cotilédones pressionados para fora do revestimento da semente. Os cotilédones são transferidos a placas contendo meio SB1 (25 a 30 cotilédones por placa). As placas são embrulhadas com fita de fibra e armazenadas por 8 semanas. Após este período embriões secundários são cortados e colocados em meios líquidos SB 196 por 7 dias. C. Preparação de DNA por Bombardeamento [286] Um plasmídeo intacto ou um fragmento de plasmideo de DNA contendo os genes de interesse o gene marcador selecionável são utilizados para bombardeamento. 0 DNA de plasmideo para bombardeamento é rotineiramente preparado e purificado utilizando-se métodos descritos nos Protocolos e Guia de Aplicações Promega™, Segunda Edição (página 106) . Fragmentos dos plasmideos transportando a seqüência ZmDGATl-2 (ASK) da Id. de Seq. n° 47, ou a seqüência ZmDGATl-2 (EF09B) da Id. de Seq. n° 51, ligada de forma operativa a um promotor de interesse são obtidos por isolamento com gel de plasmideos duplamente digeridos. Em cada caso, 100 pg de DNA de plasmideos são digeridos em 0,5 mL da mistura de enzima especifica que é apropriada para o plasmideo de interesse. Os fragmentos de DNA resultantes são separados por eletroforese em gel em agarose GTG SeaPlaque a 1% (BioWhitaker Molecular Applications) e os fragmentos de DNA contendo a sequencia ZmDGATl-2 (ASK) de Id. de Seq. n° 47, ou a sequencia ZmDGATl-2 (EF09B) de Id. de Seq. n° 51, ligada de forma operativa a um promotor de interesse são cortados do gel de agarose. 0 DNA é purificado da agarose utilizando-se a enzima digestiva GELase seguindo-se o protocolo do fabricante.
[287] Uma aliquota de 50 μ]1 de água destilada estéril contendo 3 mg de partículas de ouro (3 mg de ouro) é adicionada a 5 μΐ de uma solução de DNA de 1 μg/μL (seja plasmídeo intacto ou fragmento de DNA preparado como descrito acima), 50 μ]1 de CaCl2 2,5 M e 20 μ]1 de espermidina a 0,1 Μ. A mistura é agitada por 3 minutos no nível 3 de um agitador de vórtice e girada pro 10 segundos em uma centrifuga de mesa. Após uma lavagem com 400 pL de etanol a 100% a pelota é suspensa por sonicação em 40 μ]1 de etanol a 100%. Cinco pL de suspensão de DNA são dispensados em cada disco voador do instrumento Biolistic PDS1000/HE. Cada alíquota de 5 μΐ contém aproximadamente 0,375 mg de ouro por bombardeio (ou seja, por disco).
D. Preparação de Tecido e Bombardeio com DNA
[288] Aproximadamente 150 a 200 mg de cultivos de suspensão embriônica com 7 dias são colocados em uma placa de Petri de 60 x 15 mm estéril vazia e a placa é coberta com uma malha de plástico. O tecido é bombardeado com 1 a 2 disparos por placa com pressão de ruptura de membrana ajustada a 7,58 MPa e a câmara evacuada a um vácuo de 91,43 KPa a 94,82 KPa. O tecido é colocado a aproximadamente 8,9 cm da tela de retenção. E. Seleção de Embriões Transformados [289] Os embriões transformados são selecionados ou utilizando-se higromicina (quando o gene da higromicina fosfotransferase, HPT, é utilizado como um marcador selecionável) ou clorsulfurona (quando o gene da acetolactato sintase, ALS, é utilizado como o marcador selecionável). F. Seleção por Higromicina (HPT) [290] Após o bombardeio, o tecido é colocado em meio SB 196 fresco e cultivado conforme descrito acima. Seis dias após o bombardeio, o SB 196 é trocado por SB 196 fresco contendo um agente de seleção de higromicina a 30 mg/L. Este meio de seleção é renovado semanalmente. Quatro a seis semanas pós-bombardeamento, um tecido transformado verde pode ser observado desenvolvendo-se a partir de grupos embriogênicos necróticos não transformados. 0 tecido verde isolado é removido e inoculado em placas de multicavidades para gerar novas culturas em suspensão embriogênicas transformadas, propagadas de forma clonal. G. Seleção por Clorsulfurona (ALS) [291] Após o bombardeio, o tecido é dividido entre 2 frascos com meio SB 196 fresco e cultivado conforme descrito acima. Seis a sete dias após o bombardeio, o SB 196 é trocado por SB 196 fresco contendo um agente de seleção de clorsulfurona a 100 ng/mL. Este meio de seleção é renovado semanalmente. Quatro a seis semanas pós-bombardeamento, um tecido transformado verde pode ser observado desenvolvendo-se a partir de grupos embriogênicos necróticos não transformados. O tecido verde isolado é removido e inoculado em placas de multicavidades contendo SB 196 para gerar novas culturas em suspensão embriogênicas transformadas, propagadas de forma clonal. H. Regeneração de Embriões Somáticos de Soja em Plantas [292] A fim de se obter plantas completas a partir de cultivos de suspensão embriogênica, o tecido deve ser regenerado. I. Maturação do Embrião [293] Os embriões são cultivados por 4 a 6 semanas a 26°C em SB 196 sob lâmpadas (40 watts) fluorescentes brancas frias (Phillips cool white Econowatt F40/CW/RS/EW) e Agro (Phillips F40 Agro) em um fotoperiodo de 16:8 h com intensidade de luz de 90 a 120 μΕ/ιη2/3. Após este período os grupos de embriões são removidos para um meio de agar sólido, SB 166, por 1 a 2 semanas. Os grupos são então subcultivados a um meio SB 103 por 3 semanas. Durante esse período, embriões individuais podem ser removidos dos grupos e selecionados pelo fenótipo de alto teor de óleo / alto teor de ácido oléico associado com a presença de ZmDGATl-2 (ASK), ou conteúdo de óleo aumentado e/ou conteúdo de ácido oléico aumentado e/ou proporção de ácido oléico/ácido linoléico aumentada devido a superexpressão de ZmDGATl-2 (EF0 9B) de teor normal de óleo. Deve ser observado que qualquer fenótipo detectável, resultando da expressão dos genes de interesse podería ser selecionado neste estágio. J. Dessecação e Germinação de Embrião [294]Os embriões individuais amadurecidos são dessecados colocando-os em uma pequena placa de petri (35x10 mm) por aproximadamente 4 a 7 dias. As placas são seladas com fita de fibra (criando uma pequena cÂmara de umidade). Os embriões dessecados são plantados em meio SB71-4 onde eles são deixados para germinar sob as mesmas condições de cultura descritas acima. As plântulas germinadas são removidas do meio de germinação e rinsadas completamente com água e então plantadas em Redi-Earth em bandeja de 24 células, cobertas com domos de plástico transparente. Após 2 semanas o domo é removido e as plantas enrijecem por uma semana adicional. Se as plântulas aparentarem estar fortes elas são transplantadas a vasos de 25,4 cm com Redi-Earth com até 3 plântulas por vaso. Após 10 a 16 semanas, as sementes maduras são colhidas, cortadas e analisadas quanto a proteínas. K. Receitas de Meios 1. SB 196 - Meio de proliferação liquido FN Lite (por litro) MS FeEDTA - lOOx estoque 1 10 ml Sulfato MS - lOOx estoque 2 10 ml FN Lite Halides - lOOx estoque 3 10 ml FN Lite Ρ,Β,Μο - lOOx estoque 4 10 ml Vitaminas B5 (1 mL/L) 1,0 ml 2,4-D (10 mg/L concentração final) 1,0 ml KN03 2,83 gm (NH4)2 SO 4 0,463 gm Asparagina 1,0 gm Sucrose (1%) 10 gm pH 5,8 Soluções Estoque FN Lite Estoque # MS Fe EDTA lOOx Estoque 1000 mL 500 mL
Na2 EDTA* 3,724 g 1,862 g FeSOi - 7H20 2,784 g 1,392 g * Adicionar primeiro, dissolver em garrafa escura durante agitação 2 MS Sulfato lOOx estoque MgSOí -7H20 37,0 g 18,5 g MnSOí -H20 1,69 g 0,845 g ZnSOí -7H20 0,86 g 0,43 g CuS04 -5H20 0,0025 g 0,00125 g Haletos FN Lite lOOx Estoque CaCl2 -2H20 30,0 g 15,0 g Kl 0,083g 0,0715g CoCl2 - 6H20 0,0025 g 0,00125 g FN Lite Ρ,Β,Μο lOOx Estoque KH2P04 18,5 g 9,25 g H3B03 0,62 g 0,31 g Na2Mo04 - 2H20 0,025 g 0,0125 g [295] Meio sólido SBl (por litro) compreende: 1 Pct. de Sais MS (Gibco / BRL - N° de Cat. 11117-066); 1 mL de vitaminas B5 l.OOOx estoque; 31,5 g sucrose; 2 mL 2,4-D (20 mg/L de concentração final); pH 5,7 e 8 g de TC agar.
[296] Meio sólido SB 166 (por litro) compreende: 1 Pct. de Sais MS (Gibco / BRL - N° de Cat. 11117-066); 1 mL de vitaminas B5 l.OOOx estoque; 60 g maltose; 750 mg de hexahidrato de MgCl2; 5 g de carvão ativado; pH 5,7 e 2 g de Gelrite.
[297] Meio sólido SB 103 (por litro) compreende: 1 Pct. de Sais MS (Gibco / BRL - N° de Cat. 11117-066); 1 mL de vitaminas B5 l.OOOx estoque; 60 g maltose; 750 mg de hexahidrato de MgCl2; pH 5,7 e 2 g de Gelrite.
[298] Meio sólido SB 71-4 (por litro) compreende: 1 garrafa de sais B5 Gamborg com sucrose (Gibco / BRL - N° de Cat. 21153-036); pH 5,7; e 5 g de TC agar.
[299] 2,4-D de estoque é obtido pré-pronto de Phytotech, n° de cat. D 295 - concentração é de 1 mg/mL.
[300] Vitaminas B5 de estoque (por 100 mL) que é armazenada em alíquotas a -20°C compreende: 10 g de mioinositol; 100 mg de ácido nicotínico; 100 mg de piridoxina HC1; e 1 g de tiamina. Se a solução não dissolver rápido o suficiente, aplicar um nível baixo de calor através da placa de agitação a quente. A clorsulfurona de estoque compreende 1 mg/mL em hidróxido de amônio 0,01 N.
Exemplo 9. Identificadores de Sequencla [301] A Tabela 4 fornece um resumo dos identificadores de seqüência para os loci marcadores e sequências associadas aqui mencionadas.
Tabela 4 Resumo de Identificadores de Seqüência Exemplo 10: Mapeamento Final de QTL6 a um Único Gene (DGAT1-2) [302] Para mapear a QTL6 até um único gene, novos marcadores SNP foram desenvolvidos a partir de 3 sequências de clone de BAC e utilizados para genotipar aproximadamente 4,000 mudas de BC551 segregando QTL6. Os dados de óleo e ácido oléico foram obtidos a partir de 14 recombinantes críticos. OS dados mostram que a QTL6 está localizada entre BAC 17 e BAC 22, uma região de aproximadamente 5,0 kb, contendo a seqüência de codificação para a metade de C-termínal de DGATl-2 {4050 bp; codificando aminoácidos 196 a 495) , o 3' UTR (409 bp), e possivelmente a região terminal {54 2 bp) de DGATl-2 (Figura 40) . Desta forma, a QTL6 foi mapeada a uma região em um único gene, DGATl-2. Os dados também mostram que esta região controle tanto as concentrações de óleo quanto de ácido oléico do embrião uma vez que nenhuma segregação entre fenótipos de alto teor de óleo e alto teor de ácido oléico foi observada neste intervalo.
[303] Conforme mostrado na Tabela 3 acima, há apenas 4 mudanças de aminoácido em DGAT1-2 do alelo de alto teor de óleo, alto teor de ácido oléico ASK (isto é, ZmDGATl-2 (ASK) mostrado na Id. de Seq. n° 48) quando comparado ao DGATl-2 do alelo de teor de óleo normal (isto é, ZmDGATl-2 (EF09B) mostrado em Id. de Seq. n° 52) . Estas mudanças incluem a substituição Val45 -► Gly4s; a substituição Pross -» Serss; deleção do resíduo de glutamina correspondendo a Gln64 ou Gln65 ou Gln66 ou Gln67 de DGATl-2 do alelo EF09B; e a inserção de Phe467 ou Phe468 ou Phe469 em DGATl-2 do alelo de alto teor de óleo ASK. Na posição de mapeamento final de QTL6 (entre Bac 17 e Bac 22), a inserção Phe467 ou Phe468 ou Phe469em DGATl-2 do alelo ASK é a única mudança de aminácido entre os dois parentes de mapeamento (ilustrados como inserção Phe469 (/469F) na Figura 40) . Isto sugere que o polimorfismo no alelo de alto teor de óleo, alto teor de ácido oléico ASK que resulta na inserção de Phe467 ou Phe468 ou Phe469 em DGATl-2 do alelo ASK desempenha um papel crucial em aumentar o conteúdo de óleo e ácido oléico.
Exemplo 11: Conformação de QTL6 em Milho Transgênlco [304] O resultado do mapeamento fino descrito no Exemplo 10 acima foi conformado no milho transgênico. As construções contendo promotor de oleosina 16-kD de embrião preferido guiando a expressão do alelo ASKC28IB1 (chamado de ASK; Id. de Seq. n° 47) ou EF09B (Id. de Seq. n° 51) do cDNA DGAT1-2 foram transformadas em milho por infecção de Agrobacterium. As construções também continham um DS-RED direcionado por um promotor de proteína 2 de transferência de lipídio específico de aleurona (LTP2) para facilitar a segregação de cernes transgênicos e nulos para análise fenotípica. Os dados de óleo e perfis de ácidos graxos foram obtidos de cernes TI segregados.
[305] Em média, a superexpressão do alelo ASK leva a um aumento de 27%, 26% e 80% na concentração de óleo do embrião, na concentração de óleo da semente e concentração de ácido oléico, e um decréscimo de 28% nas concentrações de ácido linoléico, cerca de 2 a 3 vezes os efeitos causados pelo alelo EF09B (Figura 41). Os aumentos causados pela superexpressão do alelo ASK foram também mais significantes que aqueles causados pelo alelo ASKC28IB1 nativo observado em BC4S2 NILs (Figure 41). Os cernes transgênicos superexpressando o alelo EF09B de DGAT1-2 também apresentaram mudanças em todos os quatro traços. DGAT catalisa a etapa final em biossíntese de óleo e tem sido implicada como a taxa que limita a etapa. Sem estar preso por qualquer teoria ou mecanismo de ação, a superexpressão do alelo EF09B de DGAT1-2 provavelmente supera esta etapa limitante de taxa levando a mudanças nestes quatro traços de óleo.
[306] Juntos, estes dados indicam que DGATl-2 é o genel causador para QTL6 e é responsável pelos conteúdos aumentados de óleo e ácido oléico no milho.
Exemplo 12: DGAT 1-2 e inserção de resíduo de fenilalanina crítico confirmado com Gene QTL6 em levedura [307] Conforme notado acima, o resíduo extra de fenilalanina localizado na posição 469 da proteina DGAT1-2 para o alelo ASKC28IB1 (isto é, Phe469 de Id. de Seq. n°:48, também referido como F469) quando alinhado com a proteina DGAT 1-2 com teor normal de óleo para o alelo EF09B (ver Figura 30B) pode representar o resultado de uma inserção deste residuo entre os pares seguintes de residuos na proteina DGAT 1-2 com teor normal de óleo correspondente (Id. de Seq. n°:52) para o alelo EF09B entre Trp467 e Phe468 de Id. de Seq. n°:52, entre Phe468 e Phe469 de Id. de Seq. n°:2 ou entre Phe469 e Ser470 de Id. de Seq. n°:2. Para determinar se a inserção representada pelo residuo na posição 467, 468, or 469 da proteina DGAT1-2 para o alelo ASKC28IB1 é responsável pelos fenótipos de alto teor de óleo/alto teor de ácido oléico, as atividade enzimáticas de DGAT 1-2 a partir de diferentes alelos de DGAT 1-2 foi medida em levedura.
[308]Uma cepa de deleção Saccharomyces cerevisiae DGA1 (DGAT) (Id. de clone 12501) foi adquirida a partir de Invitrogen e usada para criar um mutante duplo (AyDGAT, AyPDAT) deficiente na biossintese de TAG pela remoção do gene LROl (fosfolipideo:diacilglicerol aciltransferase, ou PDAT) usando-se recombinação homóloga. 0 alelo ASKC28IB1 ou ORF de EF09B (ZmDGAT 1-2(ASK) de Id. de Seq. n°:47 e ORF de ZmDGAT 1-2(EF09B) de Id. de Seq. n°:51, respectivamente) ou suas formas mutantes (ORF de ZmDGAT 1-2 (ASK) com o códon TTC nas posições nt 1405-1407 deletadas, codificando o ZmDGAT 1-2(ASK) mutante possuindo a sequência exposta em Id. de Seq. n°:48 com o residuo Phe469 deletado; e OFR de ZmDGAT 1-2(EF09B) com um códon de TTC inserido imediatamente depois de nt 1407 Id. de Seq. n°:51, encoding o ZmDGAT 1-2(EF09B) mutante possuindo a sequência exposta em Id. de Seq. n°:52 com uma inserção do resíduo de fenilalanina entre Phe469 e Ser470 de Id. de Seq. n°:52) foram clonado em PTS416 (Stratagene) contendo um promotor de 1.0 kb e um finalizador de 0,5 kb a partir de S. cerevisiae 3-fosfoglicerato quinase (PGK1). Os plasmídeos resultantes e vetor apenas foram usados para transformar o mutante duplo de levedura.
[309] A quantidade de Tag nas células transformadas foi determinada. Resumidamente, 20 mL de meio de crescimento de cultura de levedura para 54 horas foram colhidos. Lipases forma inativadas pelo aquecimento a 80°C por 10 minutos na presença de 1 mL de isopropanol. As células foram lisadas por vórtice na presença de o,5 mL de contas de vicro e 0,5 mL de ácido acético 0,15 M. Como um controle interno, 50 μρ de TAG (C17:0) foram adicionados a cada amostra. Os lipídeos totais foram extraídos com 3 mL de tampão de extração (clorofórmio:metanol=2:1) , lavado com 1,5 mL de clorofórmio. A fase orgânica foi combiada e seca sob corrente de nitrogênio, então dissolvida em 100 pL de clorofórmio. Métade das amostras (50 μί) formam carregados sobre plantas de TLC, desenvolvidos com hexano/éter/ácido acético (70:30:1) e seguido por um breve tingimento com vapor de iodo. As faixas correspondentes forma raspadas para análise com GC similar aquela descrita acima. Os conteúdos totais de TAG foram calculados com base na soma de valores experimentais para C16:0, C16:l, C18:0, e C18:l.
[310] O método de Milcamps e outros (2005) J. Biol. Chem. 280:5370-5377 foi seguido com menores mudanças para preparação de proteína microsoma. Culturas de levedura forma desenvolvidas para começar a fase estacionária em meio de SC menos uracila. Seguindo-se a colheira, as pelotas de levedura foram ressuspensas em 4 mL de 20 mM Tris-HCl, pH 8, 10 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 5% glicerol, 1 mM DTT, e 0,3 M (NH4)2S04. 2 mL de contas de vidro foram adicionados, e células foram lisadas por vórtice por 5 minutos. O lisato foi centrifugado por 15 min a 1500 g a 6°C. O sobrenadante foi então centrifugado a 100.000 g por 1,5 h a 6°C. 0 pelete microssomal foi ressupenso em 500 μΕ de fosfato de potássio 100 mM, pH 7,2 contendo 10% de glicerol e foi congelado em nitrogênio liquido antes da armazenagem a -80°C. As concentrações de proteína forma determinadas pelo método de Bradford, usando-se o reagente Coomassie Plus (Pierce) , com albumina bovina sérica como um padrão.
[311] Os ensaios de DGAT foram feitos por 1 min a 25°C, com fosfato de potássio 50 mM pH 7,2, oleoil-coenzima A marcada com 1-14C 10 μΜ (50 mCi/mmol, Perkin Elmer), e 20 μρ de proteína microsomal em um volume total de reação de de 100 μΕ de volume. A reação foi iniciada adicionando-se proteína microsoma. O ensaio foi interrompido e os lipídeos foram extraído com 2 mL of hexano:isopropanol (3:2) (Hara e Radin (1978) Anal. Biochem. 90:420-426) contendo 4 μL de triacilglicerol não marcado (trioleína, Sigma). Seguindo-se o vórtice por 10 segundos, as fases foram separadas com 1 mL de sulfato de sódio 500 mM e o vórtice foi novamente feito por 10 segundos. Após 10 minutos, a fase superior foi transferida a um outro tubo e seca com nitrogÊnio gasoso. O lipídeo foi ressolubilizado em um pequeno volume de hexano (aproximadamente 100 a 150 μΐ) e aplicado a placas de TLC com K6 sílica, que foram desenvolvidas em 80:20:1 (v/v) hexano: dietileéer:ácido acético. Triacilglicerol foi visualizado e marcado corando-se com vapor de iodo. Após a mancha ter descorado, o triacilglicerol foi raspado, e radioactividade foi determinada por contagem de cintilação liquida.
[312]Células de levedura contendo o ORF de (ZmDGATl-2(ASK) do alelo ASKC28IB1 DGATl-2 expostos em Id. de Seq. n°:47) possuíam atividade de enzima DGAT 2 a 3 vezes maior que aqueles contento o ORF (ZmDGAT 1-2(EF09B) do alelo EF09B DGAT 1-2 mostrado em Id. de Seq. n°:51. De forma mais importante, quando Phe469 foi deletado de DGATl-2 do alelo ASKC28IB1 (usando-se o ORF de ZmDGAT 1-2(ASK) mutante onde nt 1405-1407 (códon TTC) de Id. de Seq. n°:47 foram deletados), a atividade da enzima DGAT dentro destas células de levedura foi reduzida a um nível similar àquele obsercado para células de leveduras contendo o alelo EF09B DGAT 1-2. Inserindo-se um resíduo de fenilalanina entre Phe469 e Ser470 do DGAT 1-2 com teor normal de óleo (usando-se o ORF de ZmDGAT 1-2 (EF09B) mutante com um códon TTC inserido imediatamente depois de nt 1407 de Id. de Seq. n°:51), que resulta em um ZmDGAT 1-2(EF09B) mutante com o resíduo de fenilalanina correspondendo a Phe469 da proteína ZmDGAT 1-2(ASK), restaurou a atividade da enzima ao nível obsercado para células de levedura compreendendo o alelo ASKC28IB1 (isto é, OFR de ZmDGAT 1-2 (ASK) de Id. de Seq. n°:47) . Ver Figura 42A. A quantidade de TAG acumulada nestas células correlacionam-se muito bem com o nível de atividades de DGAT (Figura 42B) . Estes resultados indicam novamente que DGAT 1-2 é o gene responsável por QTL6 e que um resíduo de aminoácido único, Phe469 dentro da proteína ZmDGAT 1-2(ASK) é responsável pela atividade aumentada da enzima DGAT e acúmulo de Tag na levedura.
Exemplo 13: Alelo ASKC28IB1 de DGATl-2 está associado com o germoplasma de alto teor de óleo/alto cteor de ácido oléico [313] Conforme mostrado na Figura 33, o resíduo Phe469 (F469) parece estar presente em todos os DGATs tipo I de plantas e está apenas ausente a partir de certos consanguíneos de milho com conteúdos normais de óleo. Para determinar que alelo é ancestral no milho, um fragmento de DNA circundando a localização do códon para F469 foi amplificado a partir de 50 acessos das linhas de Teosinte usando-se Id. de Seq. n°s: 126 e 127 como iniciadores, e os produtos de PCR resultantes foram sequenciados. Os resutados do sequenciamento mostram que todas as 50 linhas de Teosinte contêm F469, possuindo o mesmo alelo do consanguíneo ASKC28IB1 de milho, sugerindo que o alelo ASKC28IB1 com F469 é ancestral e que o alelo EF09B é uma mutação por deleção.
[314] O mesmo fragmento de DNA de 73 consanguíneos de milho proprietário e público com vários níveis de concentrações de óleo e ácido oléico no embrião foi amplificado e sequenciado. Os resultados mostram que o alelo ASKC28IB1 com F469 é encontrado exclusivamente em consanguíneos de milho com alto teor de óleo e alto conteúdo de ácido oléico (Figura 43A).
[315] Como uma comparação, um fragmento de DNA da extremidade 5' do gene DGATl-2 abrangendo a região que compreende todas as três mudanças de aminoácido descritas mais cedo (a substituição de Val45 — > Gly45 (também referida como V45G) ) ; a substituição Pross —> Serss (também referida como P55S) e a deleção do resíduo de glutamina correspondente a Gln64 ou Gln65 ou Gln66 ou Gln67 de DGATl-do alelo EF09B (também referida como Q64 ou Q65 ou Q66 ou Q67) foi amplificado e sequenciado (usando-se Id. de Seq. n°s: 124 e 125). Contrariamente a F469, os alelos ASKC28IB1 para estes três aminoácidos não estão exclusivamente associados com consanguíneos de milho de alto teor de óleo e alto teor de ácido oléico. Por exemplo, Gly45 (também referido como G45) encontrado em ASKC28IB1 é também encontrado em consanguíneos de milho com níveis de normal a baixo de óleo e ácido oléico, não exclusivamente no grupo ácido de alto teor de óleo e alto teor de ácido oléico (Figura 43B). Estes dados são consistentes com o mapeamento fino de QTL6 e resultados da expressão de levedura.
Exemplo 14: QTL6 (DGAT1-2) e FAD2 possuem efeitos aditivos na concentração de ácido oléico crescente [316]0 gene FAD2 de milho codifica uma desnaturase de ácido graxo delta-12 que catalisa a desnaturação de ácido oléico à forma de ácido linileico. A variação alélica no gene FAD2 é um principal contribuidor para os níveis de ácido oléico em germoplasma de milho. GR1B5 consanguíneo proprietário contém um alelo favorável para o conteúdo de ácido oléico e possui um nível de ácido oléico de cerca de 40%. Para determinar se QTL6 e o FAD2 em GR1B5 são aditivos, uma cruza foi feita entre GR1B5 e uma linha BC3S2 de QTL6 (na base de EF09B) contendo alelos homozigóticos ASKC28IB1 para o gene DGATl-2, e sementes F2 foram subsquentemente produzidas. Os genótipos de DGATl-2 e FAD2 foram determinados em 200 sementes F2 segregadas de uma espiga. A concentração de ácido oléico para cada semente foi também determinada. Os níveis de ácido oléico nos diferentes grupos de genótipo foram comparados. Os dados mostram que os genes QTL6 (DGAT1-2) e FAD2 possuem efeitos aditivos no aumento da concentração de ácido oléico (Figura 44). Sementes F2 contendo alelos ASKC28IB1 homozigóticos de DGATl-2 e alelos não favoráveis homozigóticos de FAD2 possuem um nível de ácido oléico de aproximadamente 38%, enquanto que as sementes que contém alelos favoráveis homozigóticos de FAD2 apenas possuem um conteúdo de ácido oléico de 40%. Por outro lado, os níveis de ácido oléico da semente são maiores que 50% quando alelos favoráveis homozigóticos para DGATl-2 e FAD2 estão presentes.
[317]O efeito aditivo para aumentar a concentração de ácido oléico empilhando-se o alelo DGATl-2(ASK) de alto teor de óleo e alto teor de ácido oléico com alelos de FAD2 favoráveis pode também ser alcançado por métodos transgênicos. Por exemplo, linhas transgênicas de milho desejáveis para a seqüência de ORF de ZmDGATl-2(ASK) e uma seqüência inibitória que tem como alvo a expressão de FAD2 são produzidas. Qualquer seqüência inibitória que reduza ou elimine a expressão de FAD2 pode ser usada para diminuir a atividade/expressão de FAD2 de forma que a conversão de ácido oléico a ácido linoleico seja inibida, favorecendo assim o acúmulo de ácido oléico. Exemplos de seqüências de polinucleotídeo inibitórias de FAD2 e construções inibitórias incluem, mas não estão limitadas àquelas descritas na Publicação do Pedido de Patente U. S. de número 2005-0160494 e WO 2005/063988, aqui incorporados por referência integralmente.
[318] Desta forma, as plantas transgênicas compreendendo o ORF de ZmDGATl-2 (ASK) de Id. de Seq. n°:47 e um cassete de expressão compreendendo a seqüência inibitória de FAD2 exposta em Id. de Seq. n°: 133 são produzidas a fim de conferirem efeito aditivo de concentração de ácido oléico aumentada em sementes destas plantas transgênicas além daquele associado à presença do ORF de ZmDGATl-2(ASK). Estas plantas transgênicas são obtidas empilhando-se a seqüência de ORF de ZmDGATl-2(ASK) com esta seqüência inibitória de FAD2, por exemplo, por cruzamento tradicional de uma linha de planta transgênica compreendendo um cassete de expressão que compreende a seqüência inibitória de FAD2 com uma linha de planta compreendendo o lócus marcador de ZmDGAT 1-2 favorável definido por ZmDGATl-2(ASK) de Id. de Seq. n°:47. Com este método de empilhamento, a linha que planta que porta o lócus marcador de ZmDGAT 1-2 favorável é obtida através de métodos de cruzamento tradicionais, ou é obtida através de um método transgênico, por exemplo, através de transformação com o cassete de expressão compreendendo este lócus marcador favorável.
[319] Alternativamente, o empilhamento é alcançado por métodos transgênicos, onde uma linha de planta é transformada com o ORF de ZmDGAT 1-2(ASK) operativamente ligado a um promotor que é funcional em uma célula de planta, e um cassete de expressão compreendendo a seqüência inibitória de FAD2. 0 ORF de ZmDGAT 1-2 (ASK) e o promotor operativamente ligado são introduzidos na planta em um cassete de expressão separado, em um mesmo vetor ou em um vetor diferente, ou no mesmo cassete de expressão que compreende a seqüência inibidora de FAD2.
[320] Todas as publicações e pedidos de patente mencionados na especificação são indicativos do nível daqueles habilitados na técnica à qual esta invenção pertence. Todas as publicações e pedidos de patente estão aqui incorporados por referência na mesma medida como se cada publicação ou pedido de patente individual fosse especificamente e individualmente indicada para ser incorporada por referência.
[321] Embora a invenção precedente tenha sido descrita em alquns detalhes por meio de ilustração e exemplos para propósitos de clareza de compreensão, certas mudanças e modificações podem ser praticadas dentro do escopo das reivindicações em anexo.
REIVINDICAÇÕES

Claims (33)

1. Método para identificar uma primeira planta de milho ou um primeiro germoplasma de milho compreendendo em seu genoma um gene de diaglicerol O-aciltransferase do tipo 1 (DGAT), codificando o polipeptideo de DGAT definido na SEQ ID No: 48, e em que, o referido polipeptideo compreende um resíduo de fenilalanina na posição de aminoácido correspondente ao resíduo 469 da SEQ ID No: 48, e ainda em que a primeira planta de milho ou o primeiro germoplasma de milho possui um fenótipo selecionado a partir do grupo consistindo de um conteúdo de óleo aumentado, um conteúdo de ácido oléico aumentado, uma relação entre ácido oléico e ácido linoléico aumentada, e quaisquer combinações destes, o referido método caracterizado pelo fato de compreender detectar na primeira planta de milho ou no primeiro germoplasma de milho pelo menos um polimorfismo dentro de um lócus marcador que está associado ao referido fenótipo da referida primeira planta de milho ou do referido primeiro germoplasma de milho, em que o polimorfismo ocorre em, ou imediatamente seguinte, uma ou mais posições de nucleotídeos (nt) dentro do referido lócus do marcador ou em um códon dentro do referido lócus do marcador, em que a referida uma ou mais posições de nt ou o referido códon é selecionado do grupo consistindo em: a) uma posição de nt dentro da SEQ ID No: 4 selecionada do grupo consistindo em nt 28, 204, 256, 302, 305, 341, 429, 461, e qualquer combinações dos mesmos; b) uma posição de nt dentro da SEQ ID No: 6 selecionada do grupo consistindo em nt 43, 74, 208, 224, e qualquer combinações dos mesmos; c) uma posição de nt dentro da SEQ ID No: 8 selecionada do grupo consistindo em nt 25, 55, 88, 100, 195, 223, 238, 242, 255, 279, 306, 307, 345, 399, e qualquer combinações dos mesmos; d) uma posição de nt dentro da SEQ ID No: 10 selecionada do grupo consistindo em nt 40, 41, 88, 89, 126, 134, 146, 218, e qualquer combinações dos mesmos; e) uma posição de nt dentro da SEQ ID No: 12 selecionada do grupo consistindo em nt 128, 195, 256, 257, 293, 294, 295, 296, 327 e qualquer combinações dos mesmos; f) uma posição de nt dentro da SEQ ID No: 14 selecionada do grupo consistindo em nt 262 e 311, e qualquer combinações dos mesmos; g) nt 428 da SEQ ID No: 16; h) uma posição de nt dentro da SEQ ID No: 18 selecionada do grupo consistindo em nt 119, 396, 420, e qualquer combinações dos mesmos; i) uma posição de nt dentro da SEQ ID No: 20 selecionada do grupo consistindo em nt 194, 258, 259, 260, 365, 366, 489, e qualquer combinações dos mesmos; j) uma posição de nt dentro da SEQ ID No: 22 selecionada do grupo consistindo em nt 48, 50, 56, 60, 63, 101, 133, 166, 170, 179, 181, 206, 207, 211, 231, 237, 255, 273, 282, 294, 312, 324, 343, 345, 358, 377, 381, 385, 387, 404, e qualquer combinações dos mesmos; k) uma posição de nt dentro da SEQ ID No: 24 selecionada do grupo consistindo em nt 358, 359, 371, 421, 422, 423, 425, 426, e qualquer combinações dos mesmos; l) uma posição de nt dentro da SEQ ID No: 26 selecionada do grupo consistindo em nt 28, 31, 35, 43, 50, 111, 117, 143, 192, 197, 219, 266, e qualquer combinações dos mesmos; m) uma posição de nt dentro da SEQ ID No: 28 selecionada do grupo consistindo em nt 41, 62, 92, 158, 182, 194, 200, 226, 229, 349, e qualquer combinações dos mesmos; n) uma posição de nt dentro da SEQ ID No: 30 selecionada do grupo consistindo em nt 102, 145, 162, 165, 198, 199, 221, 247, 251, 253, 306, 331, 352, 451, 461, 464, e qualquer combinações dos mesmos; o) uma posição de nt dentro da SEQ ID No: 32 selecionada do grupo consistindo em nt 61, 73, 87, 143, 199, 208, 209, 210, 211, 225, 327, 328, 335, e qualquer combinações dos mesmos; p) pelo menos uma posição de nt dentro da SEQ ID No: 51 selecionado de nt 134 e 163; q) um códon dentro da SEQ ID No: 51 correspondente ao nt 190-192 ou nt 193-195 ou nt 196-198 ou 199-201; e r) nt 1401 ou nt 1404 ou nt 1407 da SEQ ID No: 51, em que o referido lócus marcador está geneticamente ligado com uma primeira região de QTL6 que é flanqueada por uma primeira sequência de borda que consiste nos nucleotideos 1-20 de SEQ ID No:2 e uma segunda sequência de borda que consiste nos nucleotideos 573-592 da SEQ ID No: 14 .
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido lócus marcador está geneticamente ligado com uma terceira região de QTL6 mapeada dentro da referida primeira região de QTL6, onde a referida terceira região de QTL6 é flanqueada por uma primeira sequência de borda que compreende os nucleotideos 1-20 de SEQ ID No:10 e uma segunda sequência de borda que compreende os nucleotideos 488-507 de SEQ ID No:4.
3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o referido aumento no conteúdo de óleo compreende um aumento no óleo de semente, um aumento no óleo de germe ou ambos, um aumento no óleo de semente e um aumento do óleo de germe.
4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o referido aumento no conteúdo de ácido oléico compreende um aumento na concentração do ácido oléico da semente, um aumento na concentração de ácido oléico do germe, ou ambos, um aumento na concentração do ácido oléico da semente e concentração de ácido oléico do germe.
5. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o referido aumento na referida relação entre ácido oléico e ácido linoleico compreende um aumento na referida relação em semente, um aumento na referida relação no referido germe, ou ambos, um aumento na referida relação em semente e em germe.
6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o referido primeiro germoplasma é uma linha de milho ou uma variedade de milho.
7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o método também compreende selecionar uma primeira planta de milho ou uma prole destes ou o primeiro germoplasma de milho ou uma prole deste.
8. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de também compreender cruzar a primeira planta ou germoplasma de milho selecionada com uma segunda planta ou germoplasma de milho.
9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de o método também compreender introgredir um lócus QTL6 compreendendo pelo menos um dos referidos polimorfismos em uma segunda planta de milho ou um segundo germoplasma de milho para produzir uma planta de milho introgredida ou germoplasma de milho de milho introgredido.
10. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a planta de milho introgredida ou germoplasma de milho introgredido apresentam um conteúdo de óleo aumentado, um conteúdo de ácido oléico aumentado, uma relação entre ácido oléico e ácido linoleico aumentada, e quaisquer combinações destes, quando comparados à segunda planta de milho ou segundo germoplasma de milho.
11. Polinucleotideo isolado caracterizado pelo fato de compreender pelo menos 12 nucleotideos consecutivos do complemento do lócus marcador definido na SEQ ID No: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45 ou 47 operativamente ligado um marcador detectável, onde o referido polinucleotideo pode detectar um polimorfismo em um lócus marcador associado com alto conteúdo de óleo, alto conteúdo de ácido oléico ou ambos, alto conteúdo de óleo e alto conteúdo de ácido oléico.
12. Polinucleotideo isolado, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o referido polinucleotideo compreende pelo menos 12 nucleotideos consecutivos de SEQ ID No: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45 ou 47 .
13. Método para produzir uma planta ou parte de planta da mesma compreendendo em seu genoma um gene de diaglicerol O-aciltransferase do tipo 1 (DGAT) , codificando o polipeptideo de DGAT definido na SEQ ID No: 48, e em que, o referido polipeptideo compreende um resíduo de fenilalanina na posição de aminoácido correspondente ao resíduo 469 da SEQ ID No: 48, e ainda em que a planta ou parte de planta da mesma possui um fenótipo selecionado a partir do grupo consistindo de conteúdo de óleo aumentado, conteúdo de ácido oléico aumentado, relação entre ácido oléico e ácido linoleico aumentada, e qualquer combinação destes, o referido método caracterizado pelo fato de compreender introduzir na planta ou parte da planta um polinucleotideo heterólogo compreendendo pelo menos uma sequência associada ao alto conteúdo de óleo ou pelo menos uma sequência associada ao alto conteúdo de ácido oléico operativamente ligada a um promotor ativo na planta ou parte da planta, onde a referida sequência associada ao alto conteúdo de óleo ou a referida sequência associada ao alto conteúdo de ácido oléico é derivada de uma sequência de nucleotídeo genômico geneticamente ligada a pelo menos um lócus marcador favorável que está associado ao alto conteúdo de óleo ou ao alto conteúdo de ácido oléico, onde o marcador é selecionado a partir do grupo consistindo de SEQ ID Nos: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46 e 51 com pelo menos um polimorfismo ocorrendo em, ou imediatamente seguinte, uma ou mais posições de nucleotideos (nt) dentro do referido lócus do marcador ou em um códon dentro do referido lócus do marcador, em que a referido uma ou mais posições de nt ou o referido códon é selecionado do grupo consistindo em: a) uma posição de nt dentro da SEQ ID No: 4 selecionada do grupo consistindo em nt 28, 204, 256, 302, 305, 341, 429, 461, e qualquer combinações dos mesmos; b) uma posição de nt dentro da SEQ ID No: 6 selecionada do grupo consistindo em nt 43, 74, 208, 224, e qualquer combinações dos mesmos; c) uma posição de nt dentro da SEQ ID No: 8 selecionada do grupo consistindo em nt 25, 55, 88, 100, 195, 223, 238, 242, 255, 279, 306, 307, 345, 399, e qualquer combinações dos mesmos; d) uma posição de nt dentro da SEQ ID No: 10 selecionada do grupo consistindo em nt 40, 41, 88, 89, 126, 134, 146, 218, e qualquer combinações dos mesmos; e) uma posição de nt dentro da SEQ ID No: 12 selecionada do grupo consistindo em nt 128, 195, 256, 257, 293, 294, 295, 296, 327, e qualquer combinações dos mesmos; f) uma posição de nt dentro da SEQ ID No: 14 selecionada do grupo consistindo em nt 262 e 311, e qualquer combinações dos mesmos; g) nt 428 da SEQ ID No: 16; h) uma posição de nt dentro da SEQ ID No: 18 selecionada do grupo consistindo em nt 119, 396, 420, e qualquer combinações dos mesmos; i) uma posição de nt dentro da SEQ ID No: 20 selecionada do grupo consistindo em nt 194, 258, 259, 260, 365, 366, 489, e qualquer combinações dos mesmos; j) uma posição de nt dentro da SEQ ID No: 22 selecionada do grupo consistindo em nt 48, 50, 56, 60, 63, 101, 133, 166, 170, 179, 181, 206, 207, 211, 231, 237, 255, 273, 282, 294, 312, 324, 343, 345, 358, 377, 381, 385, 387, 404, e qualquer combinações dos mesmos; k) uma posição de nt dentro da SEQ ID No: 24 selecionada do grupo consistindo em nt 358, 359, 371, 421, 422, 423, 425, 426, e qualquer combinações dos mesmos; l) uma posição de nt dentro da SEQ ID No: 26 selecionada do grupo consistindo em nt 28, 31, 35, 43, 50, 111, 117, 143, 192, 197, 219, 266, e qualquer combinações dos mesmos; m) uma posição de nt dentro da SEQ ID No: 28 selecionada do grupo consistindo em nt 41, 62, 92, 158, 182, 194, 200, 226, 229, 349, e qualquer combinações dos mesmos; n) uma posição de nt dentro da SEQ ID No: 30 selecionada do grupo consistindo em nt 102, 145, 162, 165, 198, 199, 221, 247, 251, 253, 306, 331, 352, 451, 461, 464, e qualquer combinações dos mesmos; o) uma posição de nt dentro da SEQ ID No: 32 selecionada do grupo consistindo em nt 61, 73, 87, 143, 199, 208, 209, 210, 211, 225, 327, 328, 335, e qualquer combinações dos mesmos; p) pelo menos uma posição de nt dentro da SEQ ID No: 51 selecionado de nt 134 e 163; q) um códon dentro da SEQ ID No: 51 correspondente ao nt 190-192 ou nt 193-195 ou nt 196-198 ou 199-201; e r) nt 1401 ou nt 1404 ou nt 1407 da SEQ ID No: 51, através do qual a expressão do polinucleotideo compreendendo a sequência associada ao alto conteúdo de óleo ou a sequência associada ao alto conteúdo de ácido oléico aumenta o conteúdo de óleo da planta ou parte da planta, aumenta o conteúdo de ácido oléico da planta ou parte da planta, aumenta a relação entre o ácido oléico e o ácido linoleico da planta ou parte da planta, ou qualquer combinação destes.
14. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que a sequência associada ao alto conteúdo de óleo aumenta o conteúdo de óleo de germe da planta, o conteúdo de óleo de semente da planta, ou ambos, o conteúdo de óleo de germe e o conteúdo de óleo de semente da planta.
15. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 ou 14, caracterizado pelo fato de que a sequência associada ao alto conteúdo de ácido oléico aumenta o conteúdo de ácido oléico de germe da planta, o conteúdo de ácido oléico de semente da planta, ou ambos, o conteúdo de ácido oléico de germe e o conteúdo de ácido oléico de semente da planta.
16. Método, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a sequência associada ao alto conteúdo de ácido oléico aumenta a relação entre ácido oléico e ácido linoleico no germe da planta, na semente da planta ou em ambos, no germe e na semente da planta.
17. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 16, caracterizado pelo fato de que o referido polinucleotideo compreendendo a sequência associada ao alto conteúdo de óleo ou a sequência associada ao alto conteúdo de ácido oléico compreende um quadro de leitura aberto, um sRNA ou um miRNA.
18. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 17, caracterizado pelo fato de que o polinucleotideo compreendendo a sequência associada ao alto conteúdo de óleo ou a sequência associada ao alto conteúdo de ácido oléico é isolado pela clonagem posicionai e é identificado pela ligação a pelo menos um lócus marcador favorável.
19. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 18, caracterizado pelo fato de que a referida planta ou parte de planta possui estavelmente incorporado em seu genoma um polinucleotideo heterólogo codificando o polipeptideo possuindo um domínio LECl-tipo B consistindo na sequência de aminoácido definida na SEQ ID No:65 operativamente ligada a um promotor ativo na planta ou parte da planta.
20. Método, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que o referido polinucleotideo heterólogo codificando o domínio LECl-tipo B compreende a sequência de polinucleotideo definida na SEQ ID No:66.
21. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 20, caracterizado pelo fato de que a referida planta ou parte de planta também compreende um polinucleotideo heterólogo compreendendo uma sequência inibidora de FAD2 que é capaz de inibir a expressão ou função de FAD2 possuindo uma sequência de aminoácido definida na SEQ ID No:132.
22. Método, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que a referida sequência inibidora de FAD2 consiste na sequência definida na SEQ ID No:133.
23. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 22, caracterizado pelo fato de que a planta ou parte de planta compreende o alelo favorável para FAD2 da SEQ ID No:131, onde o referido alelo favorável está associado com um fenótipo de alto conteúdo de ácido oléico na referida planta ou parte de planta.
24. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 23, caracterizado pelo fato de que a referida planta é uma monocotiledônea.
25. Método, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que a referida monocotiledônea é milho, trigo, arroz, cevada, sorgo ou centeio.
26. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 23, caracterizado pelo fato de que a referida planta é uma dicotiledônea.
27. Método, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que a dicotiledônea é soja, Brassica, girassol, algodão ou alfafa.
28. Método para identificar a presença de um lócus marcador que está associado com um conteúdo de óleo aumentado, um conteúdo de ácido oléico aumentado, e/ou uma relação entre ácido oléico e ácido linoleico aumentada em uma planta de milho ou germoplasma de milho, onde o referido lócus marcador está geneticamente ligado com uma primeira região de QTL6 que é flanqueada por uma primeira sequência de borda que compreende os nucleotideos 1-20 da SEQ ID No:6 e uma segunda sequência de borda que compreende os nucleotídeos 573-592 da SEQ ID No:14, o referido método caracterizado pelo fato de que compreende determinar a concentração de ácido oléico na semente da referida planta de milho ou germoplasma de milho, onde uma concentração (mol/mol) de ácido oléico de pelo menos 35% é preditiva da presença do referido lócus marcador dentro da referida planta de milho ou germoplasma de milho.
29. Método, de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que o referido lócus marcador está geneticamente ligado com uma segunda região de QTL6 mapeada dentro da referida primeira região de QTL6, onde a referida segunda região de QTL6 é flanqueada por uma primeira sequência de borda que compreende os nucleotídeos 1-20 da SEQ ID No: 10 e a segunda sequência de borda que compreende os nucleotídeos 488-507 da SEQ ID No:4.
30. Método, de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que o referido lócus marcador consiste na sequência de polinucleotídeo definida na SEQ ID No: 51 codificando DGAT 1-2 com pelo menos um polimorfismo neste selecionado de: a) pelo menos uma posição de nt dentro SEQ ID No: 51 selecionado de nt 134 e 163; b) um códon dentro da SEQ ID No:51 correspondento ao nt 190-192 ou nt 193-195 ou nt 196-198 ou 199-201; e c) nt 1401 ou nt 1404 ou nt 1407 da SEQ ID No: 51.
31. Método, de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que o referido lócus marcador compreende a sequência definida na SEQ ID No: 47.
32. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 28 a 31, caracterizado pelo fato de que uma concentração de ácido oléico de menos de cerca de 35% é preditiva de que a referida planta de milho ou germoplasma de milho não compreende o referido lócus marcador dentro de seu genoma.
33. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 28 a 32, caracterizado pelo fato de também compreender detectar a presença de um polimorfismo em um lócus marcador consistindo no polinucleotideo definido na SEQ ID No: 51, onde o referido polimorfismo resulta em uma mudança polimórfica selecionada a partir do grupo consistindo de: a) uma substituição de T —» G em nt 134 da SEQ ID No: 51; b) uma substituição de C —> T na posição 163 da SEQ ID No: 51; c) uma exclusão do códon CAG nas posições nt 190-192, 193-195, 196-198 ou 199-201 da SEQ ID No: 51; e d) uma inserção de códon TTC imediatamente depois de nt 1401, 1404 ou 1407.
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