BRPI0706149B1 - Módulo para a cultura de células dependentes de ancoragem, sistema de cultura de células dependentes de ancoragem, método para o cultivo de células eucariotas dependentes de ancoragem e método para a produção de vírus, em grande escala - Google Patents

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MÓDULO PARA A CULTURA DE CÉLULAS DEPENDENTES DE

ANCORAGEM, SISTEMA DE CULTURA DE CÉLULAS DEPENDENTES DE

ANCORAGEM, MÉTODO PARA O CULTIVO DE CÉLULAS EUCARIOTAS DEPENDENTES DE ANCORAGEM E MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE VÍRUS, EM GRANDE ESCALA

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a um sistema de cultura de células eucariotas dependentes de ancoragem, particularmente para a produção de vírus, antígenos virais, proteínas ou outros metabólitos celulares em escala industrial.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Muitos vírus e proteínas terapêuticas são produzidos em células dependentes de ancoragem onde a ancoragem celular a uma superfície é um requisito para o crescimento, a expressão ou a atividade biológica.

Convencionalmente, é muito difícil desenvolver culturas de células animais ex-vivo a alta densidade, uma vez que, ao contrário dos microorganismos procariontes, elas possuem requisitos nutricionais especiais e são mais difíceis de adaptar a sistemas de cultura in-vitro.

Existem diversos sistemas desenvolvidos para a cultura de células; dos quais os reatores agitados mecanicamente, também chamados bioreatores, constituem o sistema mais amplamente difundido. Outros sistemas também difundidos são reatores do tipo 'air-lift1, de fibra oca e culturas em frascos roladores.

No campo da produção de produtos biológicos, ou seja, proteínas recombinantes de uso terapêutico como vacinas, muitas empresas preferem os culturas com células em suspensão, uma vez que, até o momento, consistiam na melhor alternativa disponível para efetuar escaladas a nível industrial. Entretanto, a escalada em um bioreator não é simples, principalmente devido à natureza frágil das células animais, as quais podem ser danificadas pelas forças de corte. Por outro lado, às vezes basta adicionar sistemas de perfusão para incrementar a produtividade celular, cuja colocação no ponto é dificultosa.

Muitas das linhagens de células animais na indústria biotecnológica (CHO, BHK, etc.) foram adaptadas de seu ambiente natural de aderência a linhagens celulares em suspensão, por isso podem ser escaladas em bioreatores.

Entretanto, este processo demanda muito tempo e esforço até obter uma linhagem que possa ser escalada com êxito. Por outro lado, a produtividade e a bioatividade de produtos provenientes de células em suspensão podem ser reduzidas significativamente, o que, combinado com as limitações da escalada em fermentadores, obriga a aumentar o volume para compensar os rendimentos obtidos.

Foram descritos diferentes sistemas para a cultura de células dependentes de ancoragem. Alguns deles puderam ser levados a níveis industriais. A seguir são mencionados resumidamente alguns deles com as suas vantagens e desvantagens: Culturas em frascos T, fábricas de çélulas ou garrafas do tipo rollers: são sistemas muito difundidos em pequena escala, de grande simplicidade, fácil manejo e de bom rendimento. Normalmente são utilizados para a colocação no ponto dos processos já que são práticos para o ensaio de diferentes condicione de cultura. Algumas indústrias conseguiram estabelecer este tipo de sistemas em suas produções industriais. Entretanto, eles requerem muito trabalho manual e espaço, posto que a maneira de aumentar a escala consiste simplesmente em aumentar a quantidade de frascos por lote e o número de operadores. Por outro lado, o controle de variáveis do processo é muito limitado.

Microcarreadores: Constituem uma alternativa que aproveita os bioreatores agitados para manter em suspensão pequenas esferas (90 a 250 micra de diâmetro) onde as células podem aderir e crescer. São descritos microcarreadores em diversas patentes, tais como US 3.717.551, US 4.189.534, US 4.448,884, Pode ser obtida uma boa relação de superfície/volume resultando em um sistema de alto rendimento. Podem ser escalados a níveis industriais com sistemas de controle de parâmetros automáticos. Pela densidade e tamanho das pérolas que são utilizadas, é possível separar facilmente as células do sobrenadante durante a colheita. Apesar das vantagens mencionadas, foi observado que o atrito entre as pérolas devido à agitação provoca um estresse celular e dificulta a amplificação durante a escalada, requerendo um pessoal com grande experiência. A obtenção de um ambiente sob estresse por cisalhamento durante a cultura e manter o mesmo estável para a formação de produtos por períodos extensos de culturas acaba sendo muito dificultosa.

Fibra oca: Neste sistema descrito nas patenteie norte- americanas n". 3.883.393 e n°. 4.184.922, as células crescem aderidas a uma membrana semipermeável que define dois espaços, um externo ou extracapilar, onde crescem as células, e outro interno ou intracapilar, por onde passa o meio de cultura juntamente com os nutrientes. Isto permite trabalhar com dois sistemas de recirculação simultâneos (um para a cultura celular e o outro para a colheita); além disso, a quantidade de fibras que podem ser utilizadas gera uma grande superfície. Possivelmente este seja o sistema que maior variabilidade possui. Entretanto, o fato de ter tantas variáveis o torna muito complexo e difícil de otimizar e escalar. Possivelmente por este motivo ele não tenha tanta aplicação a nível industrial. Outra desvantagem deste sistema de cultura é que, dependendo das características da membrana, alguns nutrientes podem atravessá-la e outros não, gerando mudanças nas condições de cultura que afetam o processo {Gramer MJ, Maas J. A cultura ideal de células NSO em um bioreator de fibras ocas requer uma concentração maior de soro ou um suplemento de colesterol no lado da célula da fibra. Biotechnol Prog 2003 Nov-Dic;19(6):1762-6).

Cubo de célula, descrito por Weiss e Schleicher na patente norte-americana n°. 3.407.120, consiste em um módulo de placas paralelas onde as células crescem em ambas as faces.

Ele tem um circuito de circulação do meio entre os módulos onde crescem as células e outro para a perfusão do meio de cultura. Ele pode estar dotado de um sistema de controle e automatização que permite o monitoramento das variáveis mais importantes do processo, (Blasey HD, Isch C, e Bernard AR.

Cell Cube: A New System For Large Scale Growth Of Adherent Cells. Biotechnology Techniques. Volume 9 Número 10, 1995. Páginas 725-728.). 0 sistema de cubo de célula pode ser escalado ao incrementar a sua superfície mediante a agregação de vários módulos. Entretanto, ele fica limitado, uma vez que o número de módulos que podem ser adicionados aumenta muito a complexidade do sistema; isto faz com que a sua aplicação industrial fique limitada.

Propagador de esferas de vidro, descrito por Spier e Whiteside (Spier RE, Whiteside JP. The production of foot- and-mouth disease virus from BHK 21 C 13 cells grown on the surface of glass spheres. Biotechnol Bioeng. 1976 May; 18 (5):649-57; J. P. Whiteside, R. E. Spier. The scale-up from 0.1 to 100 liter of a unit process system based on 3-mm- diameter glass spheres for the production of four strains of FMDV from BHK monolayer cells Biotechnology and Bioengineering Volume 23, Issue 3, 1981. Páginas 551-565), consiste em um recipiente para crescimento celular que contém um leito de esferas de vidro de 3 mm de diâmetro, e também contém um reservatório com meio de cultura com um sistema do tipo airlift. Quando uma mistura de ar com 5% de C02 passa através do airlift, o meio circula através das esferas por meio do reservatório do meio de cultura. Neste sistema é dificultoso manter caudais e fluxos do meio de cultura constantes e não é possível trabalhar com pérolas de menos de 3 mm de diâmetro. Este último fator é devido ao fato que o leito de pérolas de menor tamanho deve produzir muito movimento e flutuação dos carreadores. Por outro lado, as pérolas de 3 mm se mantêm fixas pelo seu peso.

No caso de um broto de infecção viral, é crítica a produção de grandes quantidades de dose de antígeno para a produção de uma vacina em um curto período de tempo. Os métodos e suportes existentes não propiciam procedimentos convenientes, econômicos e confiáveis para a cultura em escala industrial de células eucariotas dependentes de ancoragem para a produção de vírus e de proteínas terapêuticas.

OBJETIVO DA INVENÇÃO

Portanto, um objetivo da presente invenção consiste na superação dos problemas dos métodos anteriormente descritos, mediante um sistema de cultura de alta densidade para células dependentes de ancoragem. 0 novo sistema da presente invenção permite efetuar escaladas a nível industrial controlando as variáveis do processo. 0 objetivo da presente invenção consiste no desenvolvimento de um sistema de cultura para células dependentes de ancoragem, facilmente escalável e de baixo custo.

De acordo com um aspecto da presente invenção, é apresentado um módulo para a cultura de células dependentes de ancoragem que compreende uma pluralidade de pérolas empilhadas e em contato umas com as outras alojadas em um recipiente, em que a dita pluralidade de pérolas é aprisionada de modo a impedir os movimentos entre as mesmas.

As pérolas são preferivelmente pérolas de vidro, com um formato preferivelmente esférico, cujo diâmetro fica compreendido entre 0,5 e 2,5 mm, sendo preferidas as pérolas de 1 ou 2 mm de diâmetro.

De acordo com outro aspecto da presente invenção, é apresentado um sistema de cultura de células animais que compreende uma pluralidade de pérolas de vidro empilhadas e em contato umas com as outras, sobre cuja superfície as células podem aderir e proliferar, em que as pérolas estão alojadas em um módulo de recipiente pelo qual circula o meio de cultura. São apresentados meios para a oxigenação e circulação contínuas.

De acordo com uma realização da presente invenção, é apresentado um sistema de cultura de células animais, o qual compreende: i) um recipiente oxigenador para a oxigenação do meio de cultura; ii) um recipiente ou tubo para cultura de células que contém uma pluralidade de pérolas aprisionadas e em contato umas com as outras; iii) um meio de bombeamento para a circulação do meio de cultura entre o recipiente oxigenador e o tubo de cultura; iv) uma tubulação de entrada ao tubo de cultura para a alimentação contínua do meio de cultura oxigenado do oxigenador; v) uma tubulação de saída do tubo de cultura para o oxigenador para a condução do meio de cultura; vi) um reservatório de meio de cultura fresco para a alimentação contínua ao recipiente oxigenador; vii) um meio de bombeamento para a alimentação contínua do meio de cultura fresco entre o reservatório de meio de cultura fresco e o recipiente oxigenador; viii) sensores de pH e de oxigênio dissolvido no meio de cultura.

Adicionalmente, o sistema é dotado de meios para a recoleta do produto de cultura ou colheita. Preferivelmente, a colheita é executada do recipiente oxigenador para um reservatório de colheita, mediante meios de bombeamento.

De acordo com um objetivo adicional da presente invenção, é apresentado um método para a cultura de células eucariotas dependentes de ancoragem, em grande escala, utilizando um sistema de cultura em tubo, o qual compreende as etapas de: emprego de um recipiente ou tubo para cultura de células que contém uma pluralidade de pérolas aprisionadas e em contato umas com as outras, para obter uma superfície de crescimento para as células; semeadura do meio de cultura líquido com as ditas células e circulação do dito meio semeado dentro do tubo para cultura; monitoramento da aderência das células sobre a superfície das pérolas; circulação do meio de cultura líquido oxigenado entre as ditas pérolas de vidro para manter um crescimento celular uniforme até a formação de uma monocapa substancialmente confluente sobre a superfície das ditas pérolas.

De acordo com um objetivo adicional da presente invenção, é apresentado um método para a produção de vírus, o qual compreende as etapas de: emprego de um recipiente ou tubo para cultura de células que contém uma pluralidade de pérolas aprisionadas e em contato entre si, para obter uma superfície de crescimento para as células; semeadura do meio de cultura líquido com as ditas células e circulação do dito meio semeado dentro do tubo para cultura; monitoramento da aderência das células sobre a superfície das pérolas; circulação do meio de cultura líquido oxigenado entre as ditas pérolas de vidro para manter um crescimento celular uniforme até a formação de uma monocapa substancialmente confluente sobre a superfície das ditas pérolas, infecção das células cultivadas mediante a adição de um meio de infecção líquido fresco contendo um vírus selecionado; continuação da circulação do meio líquido oxigenado até alcançar a concentração desejada de vírus; e recuperação do vírus do meio de infecção através de um sistema de perfusão contínua. A principal vantagem que o sistema da presente invenção oferece é a possibilidade de executar a escalada dos culturas atingindo níveis similares àqueles obtidos industrialmente em suspensão, mediante uma de três estratégias: 1) aumento do volume do tubo, 2) diminuição do diâmetro das pérolas, ou 3) aumento do número de módulos por sistema.

Outra vantagem fundamental deste sistema de cultura é a oferecer um solução aos problemas de fluxos de circulação através do uso de uma bomba, preferivelmente uma bomba peristãltica como meio de bombeamento. Esta última permite que a oxigenação das células, aderidas às pérolas aprisionadas, seja eficiente. 0 aprisionamento das pérolas faz pressão sobre as tampas de extremidade do recipiente ou tubo de cultura e permite que o dito recipiente de cultura seja completamente cheio, assegurando a oxigenação da superfície de todas as pérolas com suas células aderidas. A diferença de alguns sistemas de cultura que são em "batch" (rollers, frascos "T" e bioreator com agitação mecânica), o uso de um sistema de perfusão contínua descrito na presente invenção permite manter culturas por períodos de tempo prolongados. Isto é obtido através do aporte de nutrientes frescos, a eliminação de metabólitos tóxicos e células mortas (ou que não aderiram às pérolas) evitando a acumulação das mesmas. 0 fato de que as pérolas estejam contidas ou aprisionadas proporciona vantajosamente um aumento da eficiência do sistema, permite trabalhar com pérolas de menor tamanho e desse modo aumentar a superfície para o crescimento celular.

Por outro lado, o desenvolvimento e a colocação em ponto de um sistema de controle automático e sensores de 02 dissolvido e pH permite controlar todas as variáveis do processo e levar a cabo um seguimento exaustivo da cultura. 0 sistema da presente invenção é de alta produtividade e de baixo custo com respeito a outros sistemas de culturas, uma vez que ele pode ser reutilizado pelo menos dez vezes.

Este sistema de cultura da presente invenção propicia um ambiente que simula as condições in vivo, distribuindo nutrientes e oxigênio através dos módulos onde crescem as células.

No sistema da presente invenção é previsto o uso de mais de um módulo de cultura, os quais serão preferivelmente dispostos em um arranjo em paralelo. 0 método é aplicável para a produção de múltiplos tipos de células eucariotas e vírus que são utilizados em processos em escala industrial. Este sistema e processo são aplicáveis para qualquer produto obtido a partir de células que possam ser crescidas em uma superfície.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Figura 1: é mostrado um esquema do módulo de tubo da invenção, de acordo com um corte longitudinal.

Figura 2: é mostrado um esquema de exemplo do sistema de cultura da invenção.

Figuras 3: são mostradas fotografias de crescimento celular sobre pérolas de vidro do sistema da invenção.

Figura 3A: São mostradas fotografias de monocapa de células MDBK (1) crescendo em pérolas de vidro (2) de 2 mm de diâmetro.

Figura 3B: São mostradas fotografias de monocapa de células BoTur crescendo em pérolas de vidro de 1 mm de diâmetro.

Figura 3C: São mostradas fotografias de monocapa de células BHK21 C-13 crescendo em pérolas de vidro de 2 mm de diâmetro.

Figura 3D: São mostradas fotografias de monocapa de células PK15 crescendo em pérolas de vidro de 1 mm de diâmetro.

Figura 4: é mostrada uma curva típica de crescimento celular (MDBK) durante um processo de cultura no tubo da invenção.

Figura 5: é mostrado o consumo de glicose no sistema de perfusão da cultura em tubo da invenção e o ácido láctico produzido neste mesmo processo. Também é mostrada a curva de velocidades de perfusão.

Figura 6: é mostrada a cinética de aderência celular em uma cultura de células MDBK em sistema de cultura no tubo da invenção. Pode ser observada a queda do número de células com o passar do tempo.

Figura 7: é mostrada a curva de pH durante todo uma cultura de células MDBK infectadas com o vírus IBR-A no sistema de cultura em tubo com perfusão da invenção.

Figura 8: é mostrada uma curva de crescimento celular (MDBK) de células infectadas com o vírus IBR-A no sistema de cultura em tubo da invenção. A flecha indica o momento de infecção viral.

Figura 9: é mostrada a curva de produção do vírus BVD Singer no sistema de cultura em tubo da invenção, assim como a velocidade de perfusão durante o processo, DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

As células animais possuem a capacidade de aderir ao vidro. A presente invenção tira vantagem dessa propriedade através da incorporação de pérolas de vidro dentro de um tubo cilíndrico, gerando uma grande superfície por unidade de volume onde as células crescem aderidas. A presente invenção compreende um sistema para a produção de vírus e de proteínas terapêuticas em escala industrial em cultura de células eucariotas dependentes de ancoragem.

De acordo com uma realização da presente invenção, o crescimento das células é levado a cabo em um recipiente ou tubo 1 tal como esquematizado na Figura 1. 0 recipiente 1 é preferivelmente cilíndrico, fabricado em um material inerte tal como aço inoxidável ou vidro. 0 tubo 1 está cheio com pérolas 2 de silicarcita previamente tratadas com NaOH 0, IN, as quais se encontram empilhadas e em contato. Na Tabela 1 é mostrada a especificação técnica de uma realização preferida para as pérolas de vidro utilizadas na presente invenção.

Tabela 1 Especificação técnica - pérolas de vidro Forma: Esférica Diâmetro: 1-2 mm Temperatura de deformação: 575 °C

Coeficiente de expansão ao calor: L.10'7 (20 - 300eC) Força de rompimento: 150-350 kg/pérola Conteúdo de chumbo: sem conteúdo Composição química: 66¾ de Si02 15% de Na20 7% de CaO 3% de B203 5% de A1203 2% de ZnO 1% de K20 1% de MgO O tubo 1 tratado com louça sanitária 316L, contém as tampas 3 e 4 localizadas em cada extremidade, cada uma delas com aberturas de entrada 5 e saída 6, respectivamente, por onde o meio de cultura flui preferivelmente de baixo para cima à medida que entra em contato com a superfície das pérolas. Na proximidade das tampas são dispostas as malhas de retenção 7 de 0,3 mm a 1,0 mm para manter as pérolas em seu lugar.

As pérolas de vidro são autoclaváveis e esterilizãveis por vapor fluente, o que permite a sua reutilização. A superfície do sistema irá depender do volume do tubo, do diâmetro e da quantidade de pérolas que serão adicionadas.

Na Tabela 2 são apresentados exemplos de variação da superfície de acordo com o volume do tubo 1 ou o diâmetro das pérolas.

Disposição e esquema de funcionamento do sistema Na Figura 2 é apresentado um esquema de configuração do exemplo número 2 {vide mais adiante), onde é utilizado o tubo de cultura celular da presente invenção. Na mesma é possível observar uma bomba de circulação 12 que mobiliza o meio de cultura do recipiente oxigenador 8 para o tubo de cultura celular 1. No recipiente oxigenador 8 são dispostos os filtros de ar 11 (um para a entrada e outro para a saída dos gases), o que permite que uma quantidade predeterminada de mistura de ar esterilizado seja continuamente alimentada no oxigenador 8, permitindo desse modo controlar o oxigênio dissolvido e o pH do meio de cultura. Por outro lado é executada uma alimentação contínua (perfusão contínua) de meio de cultura fresco de um reservatório 10 com uma segunda bomba peristáltica 13, para o recipiente oxigenador 8. Finalmente, do oxigenador 8 para o reservatório 9 é executada a colheita do produto de interesse. Os eletrodos de 02 15 que medem o oxigênio dissolvido no meio de cultura são dispostos na entrada e na saída do tubo de cultura celular 1. O sistema também é dotado de uma quantidade de sensores 16 para monitorar o pH, a temperatura, o nível de líquido do oxigenador, de calibradores para a alimentação de gases, etc. (estes últimos não mostrados na Figura 2). Preferivelmente, o emprego de um PLC permite regular de forma automática os principais parâmetros da cultura, isto é, o pH, o oxigênio dissolvido, e a temperatura.

Em uma operação do sistema da presente invenção, no interior do tubo de cultura 1 é carregada a quantidade de pérolas correspondentes ao seu volume. Por exemplo, aproximadamente 1.000.000 e 11,000.000 de pérolas de 2 mm de diâmetro para tubos de culturas de 8 e 80 litros, respectivamente. A seguir são posicionadas as malhas de retenção 7 superior e inferior, as quais fixam na posição aprisionada ou retida o conjunto de pérolas dentro do tubo de cultura 1.

Continuando, o tubo de cultura 1 é alimentado com o meio de cultura fresco do oxigenador 8, recirculando até serem obtidas as condições de temperatura e oxigênio homogêneas no circuito, seguido de alimentação do meio de cultura contendo uma quantidade predeterminada de células, tal como entre 4 x 109 e 1 x IO10, dependendo da superfície disponível. A fim de facilitar a aderência das células à superfície das pérolas, é então paralisada a recirculação do meio de cultura por determinados lapsos de tempo e para evitar que as células se separem com a força de corte que é produzida ao circular o dito médio. Para conhecer o tempo e a cinética de aderência de uma determinada linhagem celular, amostras da linhagem são extraídas, por exemplo, do septum 14 (vide a Figura 2) durante a etapa de aderência celular a lapsos de tempo fixos e as células totais são contadas em uma câmara de Neubauer. Desse modo, é possível calcular a velocidade de aderência de uma linhagem celular determinada para as pérolas de vidro, com um meio de cultura específico.

Uma vez transcorrido o período de pego, é executada a recirculação do meio de cultura para promover o crescimento das células sobre a superfície das pérolas até a formação de uma monocapa substancialmente confluente.

De acordo com uma realização da invenção, podem ser recuperadas as células eucariotas que são utilizadas em processos em escala industrial. 0 processo também é aplicável à obtenção de produtos obtidos a partir das células aderidas, sendo o produto recoletado do meio circulante. Ainda mais preferivelmente, uma vez alcançada a densidade apropriada das células, elas são infectadas com um vírus, de modo a recuperar uma concentração elevada de vírus destinada, por exemplo, à preparação de vacinas.

De acordo com uma realização do método da presente invenção, as células dependentes de ancoragem são selecionadas do grupo de células aderentes tais como MDBK, BoTur, BHK21 C-13, PK15, MDCK, MA-104, GELA, CHO, CHH-1, Vero, RK13 e outras bem conhecidas no estado da técnica.

De acordo com uma realização do método da presente invenção, o vírus é selecionado do grupo de rinotraqueite bovina infecciosa, tal como IBR-A, IBR-663, o vírus da diarréia viral bovina, tal como BVD Singer, BVD G2, o vírus da gripe bovina, tal como PI3, o vírus da febre aftosa, tal como 01 campos, C3 Indaial, A2001, A2000, A24 Cruzeiro, ou Taiwan, o vírus da raiva, o vírus respiratório sincicial bovino, tal como bRSV, o vírus da Gripe eqüina, tal como Arg A2-93, Arg A2-97, o vírus de herpes eqüino, tal como HVE-1, HVE-4, o vírus da Encefalomielite eqüina do oeste, tal como EEO {do oeste), EEE (do este), o parvovírus de suínos, tal como PPV, o vírus da necrose pancreática infecciosa em peixes, tal como IPN sp (tipo 3), IPN VR-299, Piscirickettsia salmonis, e as quimeras dos mesmos. Está dentro dos conhecimentos do elemento versado na técnica a seleção de célula hospedaria aderente suscetível ao vírus que se deseja propagar, de modo a obter o maior rendimento mediante o método da invenção.

EXEMPLOS

Exemplo Comparativo A produção em garrafas do tipo rollers pode ser considerado o sistema padrão para a elaboração de produtos derivados de células dependentes de ancoragem. Foi feita uma análise de custos e rendimentos comparativos com o sistema da presente invenção.

Na Tabela 3 são apresentados os dados obtidos para a produção de vírus IBR-A (Rinotraqueite bovina infecciosa) em células MDBK (células de rins de bovinos Mardin Darby). A densidade celular (células/ml) obtida em tubo foi 2,7 vezes superior à densidade celular obtida em garrafas do tipo roller. O rendimento (quantidade de dose / unidade de superfície) foi 60% daquele obtido em garrafas do tipo roller. Entretanto, ao comparar os custos por dose, o sistema de invenção resultou ser três vezes mais econômico.

Tabela 3 Comparação de custos e rendimentos de Roller versus o Tubo da invenção Roller Tubo Quantidade utilizada 100 rollers 1 módulo 8 1 Meio de cultura (ml) (a) 25.000 37.000 Quantidade de células 3,8 . 1010 1,5 . 1011 Superfície (m2) 850 1.700 Custo (US$) 500 186 (b) Custo/ superfície (US$/m2) 0,59 0,11 Dose (C) 131.820 158.790 Células/ml 1,52 .10® 4,05 . 106 Rendimento (dose/ m2) 155,08 93,41 Custo/ dose (US$) 3,8 . 10"3 1,2 . 10"3 a) corresponde à quantidade de meio de cultura utilizado para obter confluência celular. b) é suposta uma reutilização de dez vezes, embora de acordo com as experiências realizadas, é possível a sua utilização mas de quinze vezes sem perder as propriedades das pérolas nem do vidro ou do aço do módulo de tubo. c) estão calculadas com base em uma média de dez processos para ambos os culturas.

Exemplo 1 São ensaiadas as condições de aderência de diferentes linhagens celulares a pérolas de vidro de 1 mm e de 2 mm de diâmetro.

Para provar a aderência das células às pérolas de vidro, foram utilizados frascos T225 cheios com pérolas de vidro em toda a sua superfície e meio de cultura MEM (Hy clone) suplementado com 12% de soro bovino adulto, 2 g/1 de NaHC03 e antibióticos a um pH 7,2.

Todas as linhagens celulares provadas demonstraram uma aderência correta às pérolas de vidro e a formação da monocapa característica que é formada em um frasco T (dados não mostrados).

Descrição das fotografias da Figura 3: Fotografia 1: células MDBK crescendo em uma pérola de vidro de 2 mm de diâmetro.

Fotografia 2: células BoTur (células Bovine Turbinate) crescendo em uma pérola de vidro de 1 mm de diâmetro.

Fotografia 3: células BHK (células do rim de filhote de hamster) crescendo em uma pérola de vidro de 2 mm de diâmetro.

Fotografia 4: células PK15 (células do rim de suíno) crescendo em uma pérola de vidro de 2 mm de diâmetro.

Pode ser observado que as células aderem tanto às pérolas de 2 mm quanto àquelas de 1 mm de diâmetro.

Exemplo 2 Propriedades de cultura de células MDBK em tubo celular.

Curva de crescimento e velocidade de aderência celular A fim de conhecer as propriedades de uma cultura de células dependentes de ancoragem no sistema de cultura em um tubo da invenção, foram utilizadas células MDBK em um módulo de 8 litros com pérolas de 2 mm de diâmetro.

Antes de semear as células, o sistema foi cheio com meio de cultura e colocado para circular para homogeneizar a temperatura e oxigenar o meio de cultura.

Inoculação: 0 tubo foi semeado com 3.104 células/cm2, o que corresponde a uma faixa entre 4 ,109 e 1.1010 de células totais dependendo da superfície de trabalho. As células foram suspensas, dentro do oxigenador, em meio de cultura MEM (Hy clone) suplementado com 12% de soro bovino adulto, 2 g/1 de NaHC03 e antibióticos a um pH 7,2. Foram executados dois ciclos de aderência celular de uma hora cada um a 37°C.

Durante o tempo de aderência é conveniente interromper as bombas de circulação para facilitar a aderência das células às pérolas e evitar que elas se separem com a força de corte que é produzida ao circular o meio dentro do tubo. Dependendo da velocidade de aderência de cada linhagem celular às pérolas de vidro, é determinado o tempo de aderência que é correspondente para aplicar.

Para conhecer o tempo e a cinética de aderência de uma determinada linhagem celular às pérolas de vidro em uma determinada condição, amostras do septum 14 (vide a Figura 2) são extraídas a cada cinco minutos durante a etapa de aderência celular e são contadas as células totais em uma câmara de Neubauer. A partir do gráfico de ln ct/cO da Figura 6, é possível calcular a velocidade de aderência celular das células MDBK em pérolas de vidro de 2 mm de diâmetro no meio de cultura utilizado mediante as seguintes fórmulas: CT = CO . e-kt => -ln (Ct/CO) = k . t onde, CT: concentração de células no tempo t (células/ml), CO: concentração inicial de células (células/ml), k: velocidade de aderência (min'1), t: tempo Tal como pode ser visto na Figura 6, no sistema de cultura da presente invenção as células aderem às pérolas de vidro de 2 mm de diâmetro, e aproximadamente aos 100 minutos as células estão virtualmente aderidas.

Cultura: Para a cultura são utilizados aproximadamente 10 litros de meio, o qual é agregado ao oxigenador 8; uma bomba peristáltica 12 circula o meio de cultura para o tubo de cultura 1 e o retorna ao oxigenador 8 a uma velocidade entre 3 1/min e 30 1/min dependendo do volume do tubo. Para suprir oxigênio ao meio de cultura e controlar o pH, são adicionados gases selecionados entre oxigênio medicinal, dióxido de carbono, ar e misturas dos mesmos, ao frasco oxigenador.

Durante a cultura vão sendo registrados parâmetros tais como o consumo de oxigênio, o consumo de glicose e a produção de ácido láctico com o passar do tempo. A Figura 4 mostra a percentagem de consumo de oxigênio em função do tempo em uma curva ideal para este sistema. À fase inicial de crescimento, que conta com um período "lag" e outro de incremento exponencial de atividade metabólica celular, segue um platô. A partir dali, a morte celular que implica uma diminuição de biomassa viável é refletida como uma diminuição do consumo de O2. A Figura 5 mostra que, em uma primeira etapa, aumentam o consumo de glicose e a produção de ácido láctico, à medida que as células aumentam em densidade, e logo estes valores são estabilizados ao chegar à fase estacionária.

Estes valores são compensados pela alimentação contínua do sistema. A Figura 7 mostra como o pH do meio se mantém entre 6,9 e 7,3 durante todo a cultura. Isto é obtido através de um PLC, onde, para baixar o pH é adicionado dióxido de carbono e para elevar o pH é executada a aeração por ventilação aberta.

Assim que a cultura chegou ao estado estacionário (de acordo com o consumo de oxigênio, vide a Figura 4), o módulo de tubo de cultura 1 foi aberto, foram tiradas três amostras de pérolas de três lugares diferentes, foram observadas as células aderidas ao microscópio, foram tiradas fotografias (onde foi possível comprovar a confluência celular), as células foram elevadas com tripsina e contadas em uma câmara de Neubauer. A média dos resultados obtidos foi de 1,82 . 106 células/cm2, o que, extrapolado para a superfície total do sistema, equivale a 3,1 . 1011.

Exemplo 3 0 sistema de cultura da presente invenção é facilmente escalável podendo ser obtidas produções similares àquelas estabelecidas para culturas celulares em suspensão em nível industrial. Podem ser utilizadas diferentes estratégias para aumentar a superfície do sistema de cultura, o que equivale ao lucro de um aumento de escala: 1. Variar o diâmetro das pérolas de vidro. No exemplo número 3.1 mais adiante, são comparados dois processos executados, um com pérolas de vidro de 1 mm de diâmetro e o outro com pérolas de 2 mm de diâmetro, deixando constante o volume do tubo. 2. Variar a quantidade de módulos. No exemplo número 3.2, mais adiante, é mantido fixo o diâmetro das pérolas de vidro e são comparados os sistemas de dois e quatro módulos. 3. Variar o volume do módulo. No exemplo número 3.3, mais adiante, foi aumentado o volume do tubo em dez vezes, de 8 litros para 80 litros, e foram comparados os rendimentos obtidos em cada um.

Exemplo 3.1 Comparação de rendimentos modificando o diâmetro das pérolas Neste exemplo foram executadas duas produções virais para obter uma vacina, uma em um módulo de 8 litros com pérolas de vidro de 1 mm de diâmetro, e a outra em um módulo de 8 litros com pérolas de vidro de 2 mm de diâmetro.

Ambas as culturas de células MDBK foram infectadas com o vírus IBR-A (Rinotraqueite bovina infecciosa). A Figura 8 mostra uma típica curva de crescimento junto com a etapa de morte celular provocada logo depois de uma infecção do vírus lítico.

Na Tabela 4, mais adiante são comparados os rendimentos obtidos em ambos os processos. Pode ser observado que, ao diminuir o diâmetro das pérolas o rendimento aumenta mais de três vezes.

Exemplo 3.2 Comparação de rendimentos aumentando o número de módulos de tubo por sistema de cultura Neste exemplo foram executadas duas produções virais para obter uma vacina, uma em dois módulos de 8 litros com pérolas de vidro de 2 mm de diâmetro, e a outra em quatro módulos de 8 litros com pérolas de vidro de 2 mm de diâmetro.

Ambas as culturas de células MDBK foram infectadas com o vírus IBR-A (Rinotraqueite bovina infecciosa). A duplicação do número de módulos por biorreator aumenta significativamente o número de dose (quatro vezes mais) e com isso o rendimento em duas vezes (vide a Tabela 4) .

Exemplo 3.3 Comparação de rendimentos modificando o volume do tubo Neste exemplo foram executadas duas produções virais para obter uma vacina, uma em um módulo de 8 litros com pérolas de vidro de 2 mm de diâmetro, e a outra em um módulo de 80 litros com pérolas de vidro de 2 mm de diâmetro.

Ambas as culturas de células MDBK foram infectadas com o vírus BVD Singer (diarréia viral bovina).

Conforme mostrado na Figura 9, o vírus pode ser mantido em cultura por um pouco mais de oito dias (200 horas) e tem um pico de produção aos três dias após a infecção. O vírus vai sendo colhido a partir do oxigenador do tubo em forma automática através das bombas peristálticas de perfusão (sete na Figura 2).

Neste caso, ao aumentar o volume do módulo de tubo em dez vezes, o número de dose do processo aumenta dezesseis vezes (as últimas duas filas da Tabela 4) e o rendimento (dose/cm2) aumenta 1,5 vez.

Pode ser comprovado, a partir destes três últimos exemplos, que o sistema de cultura pode ser facilmente ampliado em superfície, portanto, podem ser cultivadas mais células por unidade de biorreator durante a escalada e desse modo aumentar os rendimentos de um processo.

Tabela 4 Comparação de rendimentos obtidos para distintos exemplos de sistemas de cultura em tubo. 0 tubo de cultura da presente invenção mostrou que tem capacidade de sustentar uma cultura de células dependentes de ancoragem em densidades superiores âs obtidas em culturas em garrafas do tipo rollers, e com rendimentos comparáveis.

Um dos aspectos mas importantes da presente invenção é que se trata de um sistema de cultura facilmente escalável, e podem ser obtidas produções similares àquelas estabelecidas para culturas celulares em suspensão a nível industrial. Por sua vez, a invenção permite a utilização de diferentes estratégias para obter o aumento de escala, tais como a diminuição do diâmetro das pérolas, o aumento da quantidade de módulos ou o aumento de volume do módulo, oferecendo uma grande variabilidade. A possibilidade de sustentar culturas por períodos de tempo prolongados com células aderidas a uma superfície permite estabelecer sistemas de perfusão onde não é necessário contar com métodos de segregação de células do meio de cultura. Por outro lado, o fato de que as células que se encontram aderidas está vinculado à viabilidade das mesmas faz que não sejam acumuladas células mortas no sistema, o que gera uma população mais homogênea. A reutilização dos módulos permite que o custo da equipe seja amortizada com o uso, obtendo um sistema mais econômico do que a cultura em rollers. 0 sistema de cultura da invenção tem o potencial de ser utilizado para processos produtivos de vírus ou de expressão de proteínas ou outros metabólitos celulares sem a necessidade de recorrer a estratégias de adaptação celular a suspensão e evitando o estresse celular.

Claims (20)

1. MÓDULO PARA A CULTURA DE CÉLULAS DEPENDENTES DE ANCORAGEM, caracterizado pelo fato de compreender um recipiente (1) onde está alojada uma pluralidade de pérolas (2) empilhadas e em contato umas com as outras, em que a dita pluralidade de pérolas é retida por meio de meios de retenção {7) localizados perto das extremidades inferior (3) e superior <4) do recipiente (1), de modo a impedir movimentos entre as mesmas.

2. MÓDULO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato do recipiente [1) ser cilíndrico com formato de tubo, fechado por meio de tampas de extremidade inferior (3) e superior ¢4), em que cada tampa é provida de aberturas de entrada (5) e saída (6) para fluídos, respectivamente.

3. MÓDULO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizado pela pluralidade de pérolas alojadas no interior do recipiente ¢1) ficar retida por meio de meios de retenção inferior e superior (7).

4. MÓDULO, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelos ditos meios de retenção inferior e superior serem malhas com um passo menor do que o diâmetro das pérolas e ficam localizados na proximidade das respectivas tampas de extremidade inferior (3) e superior (4) .

5. MÓDULO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelas pérolas serem de formato esférico, fabricadas em material de vidro.

6. MÓDULO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelas pérolas terem um diâmetro entre 0,5 e 2,5 mm.

7. MÓDULO, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelas pérolas terem um diâmetro de 2 mm.

8. MÓDULO, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelas pérolas terem um diâmetro de 1 mm.

9. SISTEMA DE CULTURA DE CÉLULAS DEPENDENTES DE ANCORAGEM, caracterizado por compreender uma pluralidade de pérolas de vidro empilhadas e em contato umas com as outras, sobre cuja superfície as células podem aderir e proliferar, em que as pérolas estão alojadas em um módulo de recipiente pelo qual circula o meio de cultura, e o sistema compreende adicionalmente meios para a oxigenação e a circulação contínua, em que o sistema compreende: - um recipiente oxigenador para a oxigenação do meio de cultura; um módulo para a cultura de células que compreende uma pluralidade de pérolas aprisionadas e em contato umas com as outras alojadas em um recipiente ou tubo; - um meio de bombeamento para a circulação do meio de cultura entre o recipiente oxigenador e o módulo de cultura; - uma tubulação de entrada para o módulo de cultura para a alimentação contínua do meio de cultura oxigenado do oxigenador; - uma tubulação de saída do módulo de cultura para o oxigenador para a condução do meio de cultura; - um reservatório de meio de cultura fresco para a alimentação contínua ao recipiente oxigenador; um meio de bombeamento para a alimentação contínua do meio de cultura fresco entre o reservatório de meio de cultura fresco e o recipiente oxigenador; - sensores de pH e de oxigênio dissolvido no meio de cultura, e em que o sistema compreende adicionalmente um recipiente de reservatório de colheita que recebe a colheita do recipiente oxigenador.

10. SISTEMA, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo módulo para a cultura de células ser conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1-8.

11. SISTEMA, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por compreender dois ou mais módulos de cultura celular, dispostos de forma paralela.

12. SISTEMA, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo meio de bombeamento para a circulação do meio de cultura entre o recipiente oxigenador e o módulo de cultura ser uma bomba peristáltica.

13. SISTEMA, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo meio de bombeamento para a alimentação continua do meio de cultura fresco entre o reservatório de meio de cultura fresco e o recipiente oxigenador ser uma bomba peristáltica.

14. MÉTODO PARA O CULTIVO DE CÉLULAS EUCARIOTAS DEPENDENTES DE ANCORAGEM, em grande escala, caracterizado por utilizar um sistema de cultura em tubo, em que dito método compreende as etapas de: emprego de um módulo ou tubo para cultura de células que contém uma pluralidade de pérolas aprisionadas e em contato umas com as outras, para obter uma superfície de crescimento para as células; semeadura do meio de cultura líquido com células eucariotas dependentes de ancoragem e circulação do dito meio semeado dentro do tubo para cultura; monitoramento da aderência das células sobre a superfície das pérolas; e circulação do meio de cultura líquido oxigenado entre as ditas pérolas de vidro para manter um crescimento celular uniforme até a formação de uma monocapa substancialmente confluente sobre a superfície das ditas pérolas.

15. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo sistema de cultura ser um sistema, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 9-13.

16. MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE VÍRUS EM GRANDE ESCALA, caracterizado por utilizar um sistema de cultura em tubo, em que dito método compreende as etapas de: emprego de um módulo ou tubo para cultura de células que contém uma pluralidade de pérolas aprisionadas e em contato umas com as outras, para obter uma superfície de crescimento para as células; semeadura do meio de cultura líquido com as ditas células e circulação do dito meio semeado dentro do tubo para cultura; monitoramento da aderência das células sobre a superfície das pérolas; circulação do meio de cultura líquido oxigenado entre as ditas pérolas de vidro para manter um crescimento celular uniforme até a formação de uma monocapa substancialmente confluente sobre a superfície das ditas pérolas; infecção das células cultivadas mediante a adição de um meio de infecção líquido fresco contendo um vírus selecionado; continuação da circulação do meio líquido oxigenado até alcançar a concentração desejada de vírus; e recuperação do vírus do meio de infecção através de um sistema de perfusão contínua.

17. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o sistema de cultura é um sistema, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 9-13, e em que é um sistema onde o módulo para cultura de células, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1-8.

18. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 14-17, caracterizado pelo fato de que as células dependentes de ancoragem são selecionadas do grupo MDBK, BoTur, ΒΗΚ, PK15, MDCK, MA-104, GELA, CHO, CHH-1, vero, RK13.

19. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 16-18, caracterizado pelo fato de que o virus é selecionado do grupo de rinotraqueite bovina infecciosa (IBR), Diarréia virai bovina (BVD), Gripe bovina (PI3) , febre aftosa, Raiva, respiratório sincicial bovino (RSV), Gripe eqüina (Arg A2 93, Arg A2 97), Herpes eqüino (HVE-1, HVE-4), Encefalomielite eqüina (EEO, EEE), Parvovirus de suínos (PPV), necrose pancreática infecciosa (IPN sp, IPN VR-299), P Salmonis, e as quimeras dos mesmos.

20. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que o vírus é selecionado do grupo IBR-A, IBR-663, BVD Singer, BVD G2, PI3, 01 campos, C3 Indaial, A2001, A24 Cruzeiro, ou Taiwan, Raiva, bRSV, gripe A2-93, gripe A2-97, HVE-1, HVE-4, EEO, EEE, PPV de suínos, IPN sp (tipo 3) , IPN VR-2 99, P Salmonis, e as quimeras dos mesmos.