BRPI0619918A2 - dìmeros e adutos de 6-triazolpirimidinas [fenil (substituìdas)] úteis como agentes anticáncer - Google Patents

Abstract

DìMEROS E ADUTOS DE 6-TRIAZOLPIRIMIDINAS [FE-NIL (SUBSTITUìDAS)] úTEIS COMO AGENTES ANTICáNCER. São divulgados certos adutos e dímeros de compostos 6-triazolpirimidinas [fenhl (substituidas)] ou sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos e composições que contêm os ditos compostos ou os sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos, em que os ditos compostos são agentes anticâncer úteis para o tratamento de câncer em mamíferos. Também é descrito um processo para tratar ou inibir o crescimento de células de tumor canceroso e doenças associadas em um mamífero e um processo para o tratamento ou a prevenção de tumores cancerosos que expressam múltipla resistência a fármaco (MDR) ou são resistentes por causa da MDR, em um mamífero que necessite os mesmos cujo processo compreende administrar ao dito mamífero uma quantidade eficaz dos ditos compostos ou de sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos. Também é descrito um processo de tratamento ou de inibição do crescimento de células de tumor canceroso e de doenças associadas em um mamífero que necessite o mesmo por promoção de polimerização em microtúbulo que compreende administrar ao dito mamífero uma quantidade eficaz dos ditos compostos e dos sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "DÍMEROS E ADUTOS DE 6-TRIAZOLPIRIMIDINAS [FENIL (SUBSTITUÍDAS)] ÚTEIS COMO AGENTES ANTICÂNCER".

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a certos adutos e dímeros de compostos 6-triazolpirimidinas [fenil (substituídas)] ou a sais farmaceutica- mente aceitáveis dos mesmos e a composições que contêm os ditos com- postos ou os sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos, em que os ditos compostos são agentes anticâncer úteis para o tratamento de câncer em mamíferos, para o tratamento ou a prevenção de tumores cancerosos que expressam múltipla resistência a fármacos (MDR) ou são resistentes por causa da MDR, um processo de tratamento ou de inibição do crescimento de células de tumor canceroso e de doenças associadas em um mamífero que necessite o mesmo por promoção de polimerização em microtúbulo e um processo de tratamento ou de inibição do crescimento de tumores cancero- sos e em um mamífero com resistência inerente ou adquirida a agentes qui- mioterápicos usados em tratamento de quimioterapia e em particular agen- tes antimitóticos por administração de uma quantidade eficaz de um com- posto da invenção ou de sais farmaceuticamente aceitáveis do mesmo.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

A maioria dos citostáticos em uso atualmente inibe a formação de precursores essenciais para a biossíntese de DNA ou de DNA polimera- ses em bloco ou interferem na função de matriz de DNA porque o DNA era o alvo principal para o desenvolvimento de fármacos terapêuticos para quimio- terapia. Infelizmente, a inibição da formação dos precursores essenciais pa- ra a biossíntese de DNA Ao bloqueio de DNA polimerases ou a interferência com a função da matriz de DNA também afeta os tecidos normais.

Os fármacos antimicrotúbulos são uma categoria principal de agentes anticâncer (Rowinsky, E.K. e Tolcher, A.W., Antimicrotúbulo agents. Em: V.T. Devita, Jr., S. Hellman e S.A. Rosenberg (eds.), Câncer Principies e Practice, Ed. 6, pp. 431-452. Filadélfia: Lippincott Williams e Wilkins, 2001). Eles trabalham por inteferência na função de microtúbulos celulares, particularmente o eixo mitótico. A interrupção da função normal do eixo con- duz à morte da célula apoptótica.

Atualmente, há três classes principais de agentes farmacológi- cos antimicrotúbulos conhecidos. Cada um tem uma região de ligação distin- ta sobre a β-tubulina e efeitos distintos sobre a função do microtúbulo. Estas classes são: 1) agentes de sítio taxano que promovem a formação de micro- túbulo e estabilizam os microtúbulos; 2) agentes de sítio vinca/peptídeo, que desestabilizam os microtúbulos e freqüentemente induzem a formação de polímeros anormais ou de agregados a altas concentrações e 3) agentes de sítio cholchicina que também desestabilizam os microtúbulos e geralmente não induzem outros polímeros (Hamel, E. Antimitotic natural products and their interactions with tubulin. Med. Res. Rev., 16: 207-231, 1996). A maior parte dos Iigantes para todas as três classes de sítios são produtos naturais ou derivados semi-sintéticos de produtos naturais.

O paclitaxel e seu derivado semi-sintético docetaxel (Taxotere®) interferem na formação de microtúbulo e estabilizam os microtúbulos. O pa- clitaxel (Taxol®) é um diterpeno isolado da casca da conífera Taxus brevifo- Iia do Oeste do Pacífico e é representante de uma nova classe de agente terapêutico que tem um sistema de anel de taxano. Ele foi adicionalmente encontrado em outros membros da família das the Taxacae inclusive a es- pécie Taxus canadensis do Canadá encontrada em Gaspesia, leste do Ca- nadá e Taxus baccata encontrada na Europa cujas agulhas contêm paclita- xel e análogos e, portanto fornecem uma fonte renovável de paclitaxel e de- rivados do mesmo. O extrato bruto foi testado pela primeira vez durante os 1960s e seu princípio ativo foi isolado em 1971 e a estrutura química identifi- cada (M.C. Wani e outros, J. Am. Chem. Soc., 93, 2325 (1971)). Além disso, uma ampla faixa de atividade sobre células de melanoma, de leucemia, de vários carcinomas, de sarcomas e de Iinformas sem ser de Hodkin, assim como alguns tumores sólidos em animais, foi apresentada através de testa- gem adicional. O paclitaxel e seus análogos foram produzidos por síntese parcial partindo da 10-desacetilbacatina III, um precursor obtido das agulhas e dos gravetos da Taxus brevifolia e por síntese total (Holton e outros, J. Am. Chem. Soe. 116:1597-1601 (1994) e Nicolaou e outros, Nature 367: 630-634 (1994)). Foi demonstrado que o paciitaxel possui atividade antineoplásica. Mais recentemente, foi demonstrado que a atividade antitumor do paciitaxel é devida a uma promoção da polimerização do microtúbulo (Kumar, N., J.

Biol. Chem. 256:10435-10441 (1981); Rowinsky e outros, J. Natl. Câncer Inst., 82: 1247-1259 (1990) e Schiff e outros, Nature, 277: 665-667 (1979)). O paciitaxel demonstrou agora eficiência em diversos tumores humanos em experiências clínicas (McGuire e outros, Ann. Int. Med., 111: 273-279 (1989); Holmes e outros, J. Natl. Câncer Inst., 83: 1797-1805 (1991); Kohn e outros, J. Natl. Câncer Inst., 86: 18-24 (1994) e A. Bicker e outros, Anti-Cancer Drugs, 4,141-148(1993).

Dois agentes de sítio taxano (paciitaxel e docetaxel) e três agen- tes de sítio vinca/peptídeo (vinblastina, vincristina e vinorrelbina) são usados clinicamente para tratar vários cânceres humanos. Foi provado que os taxa- nos são de grande utilidade contra tumores sólidos (por exemplo, do pulmão, da mama, ovariano) do que os alcalóides vinca, sugerindo que os agentes que promovem a formação de microtúbulo pudessem ser superiores clinica- mente àqueles que desestabilizam os microtúbulos. Os agentes de sítio col- quicina não são usados terapeuticamente.

Apesar do uso clínico bastante difundido de paciitaxel e doceta- xel, estes fármacos têm diversas limitações que criam uma necessidade de agentes aperfeiçoados. Primeiro, muitos tumores são inerentemente resis- tentes (por exemplo, tumores no cólon) ou se tornam resistentes depois de múltiplos ciclos de tratamento, pelo menos em parte devido à expressão de transportadores do fármaco localizados em membranas da célula cancerosa que bombeiam os fármacos para fora das células e assim diminuem a sua eficiência (Gottesman, M.M. Mechanisms of câncer drug resistance. Annu. Rev. Med., 53: 615-627, 2002). O mais bem-conhecido destes transportado- res é a P-glicoproteína. Conseqüentemente, há uma necessidade de novos agentes com efeito semelhantes ao taxano sobre a polimerização do micro- túbulo que não são substratos de P-glicoproteína ou outras tais bombas e que portanto irão vencer esta causa de resistência ao taxano em pacientes. Em segundo lugar, o paclitaxel e o docetaxel têm baixa solubili- dade em água e o paclitaxel deve ser formulado em Cremophor EL, um veí- culo que induz fortes reações de hipersensibilidade (Li, C.L., Newman, R.A. e Wallace, S. Reformulating paclitaxel. Science & Medicine, Jan/Fev: 38-47, 1999). Os pacientes são tipidameante pré-medicados com corticoesteróides e anti-histaminas antes da administração de paclitaxel para minimizar estas toxicidades. Conseqüentemente, há uma necessidade de novos agentes com efeitos semelhantes ao taxano sobre a polimerização de microtúbulo que sejam altamente solúveis em água e podem ser administrados em solu- ção salina ou em outro veículo não tóxico adequado.

Em terceiro lugar, o paclitaxel é um produto natural que tem uma estrutura altamente complexa e o docetaxel é um derivado semi-sintético intimamente relacionado. Portanto, há uma necessidade de compostos que sejam prontamente disponíveis através desta síntese, que sejam estrutural- mente diferentes dos taxanos e que tenham efeitos semelhantes aos do ta- xano sobre a polimerização do microtúbulo.

Conseqüentemente, ainda há uma necessidade na técnica de agentes citotóxidos para uso em terapia de câncer. Em particular, há uma necessidade de agentes citotóxicos que inibam ou tratem o crescimento de tumores que têm um efeito similar ao paclitaxel e interfiram com o processo de formação de microtúbulo. Adicionalmente, há uma necessidade na técni- ca de agentes que acelerem a polimerização da tubulina e estabilizem os microtúbulos reunidos.

Conseqüentemente, seria vantajoso fornecer novos compostos que forneçam um processo de tratamento ou de inibição da proliferação da célula, crescimento neoplásico e crescimento do tumor maligno em mamífe- ros pela administração de compostos que tenham atividade anticâncer como o paclitaxel.

Adicionalmente, seria vantajoso fornecer novos compostos que forneçam um processo para tratamento ou inibição do crescimento de tumo- res cancerosos que expressem múltipla resistência a fármacos (MDR) ou são resistentes por causa da MDR. Além disso, seria vantajoso fornecer novos compostos que for- neçam um processo de tratamento ou de inibição do crescimento de tumores cancerosos em um mamífero com resistência inerente ou adquirida a agen- tes quimioterápicos e em particular a agentes antimitóticos.

É descrita na técnica a preparação e o uso de triazolpirimidinas substituídas em agricultura como fungicidas nas Patentes US Nss. 5.593.996; 5.756.509; 5.948.783; 5.981.534; 5.612.345; 5.994.360 6.020.338; 5.985.883; 5.854.252; 5.808.066; 5.817.663; 5.955.252 5.965.561; 5.986.135; 5.750.766; 6.117.865; 6.117.876; 6.124.301 Ί0 6.204.269; 6.255.309; 6.268.371; 6.277.856; 6.284.762; 6.297.251 6.387.848; nas Publicações dos Pedidos de Patente US N°. US2002/0045631A1; US2002/0061882A1; US20030055069A1 e Publica- ções Internacional ou Européia N9S.: W098/46607; W098/46608; W099/48893; W099/41255; WOOO/18227; W001/35738A2; "W002/46195A1; W002/067679A1; W002/083676A1; EPO 834513A2; EPO 782997A2; EP0550113B1; FR2784381A1; EPO 989130A1; W098/41496; W094/20501; EPO 945453A1; EPO 562615A1; EPO 562615B1; EP 550113A2; EP 943241B1; EP 988790B1 e que tem a formula geral a seguir:

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Está descrição na Publicação Internacional Ne. WO 02/02563 o uso de triazolpirimidinas como agentes anticâncer.

Os compostos da presente invenção são uma nova classe de agentes semelhantes ao taxano que satisfazem as necessidades descritas aqui antes e que diferem de maneiras significativas das classes conhecidas anteriormente de compostos antimicrotúbulo. Os compostos desta invenção se ligam ao sítio vinca da β-tubulina, ele têm ainda muitas propriedades que são similares aos taxanos e distintas dos agentes do sítio vinca. Em particu- lar, os compostos desta invenção melhoram a polimerização da tubulina rica em proteína associada ao microtúbulo (MAP) na presença de GTP a baixas razões molares de composto: tubulina, de uma maneira similar a paclitaxel e docetaxel. Os compostos desta invenção também induzem a polimerização de tubulina altamente purificada na ausência de GTP sob condições experi- mentais adequadas, uma atividade que é uma marca dos taxanos.

Os compostos da presente invenção são potencialmente citotó- xicos para muitas linhagens de células de câncer humano em cultura, inclu- sive linhagens que superexpressam os transportadores de membrana MDR (P-glicoproteína), MRP e MXR, tornando-os assim ativos contra linhagens de células que são resistentes a paclitaxel e vincristina. Em particular, exemplos representativos desta invenção têm alta solubilidade em água e podem ser formulados em solução salina. Exemplos representativos desta invenção são agentes anti-tumor ativos em camundongos que contêm xenoenxertos de tumor de pulmão e de carcinoma do cólon, melanoma e glioblastoma, quan- do dosados intravenosamente ou oralmente.

Foi demonstrado que os compostos da presente invenção, por exemplo, têm ampla atividade antitumor em modelos de xenoenxerto in vivo de câncer do pulmão da célula não pequena humana (NSCLC), câncer do cólon, câncer de mama, melanoma e glioblastoma, inclusive modelos que são resistentes aos taxanos ou a outros compostos microtúbulo-ativos. Por exemplo, estes compostos são ativos quando dosados em um protocolo de uma vez por semana por vias IV ou oral.

As triazolopirimidinas 6-[(fenil substituídas)] são descrições no Pedido de Patente U.S. N2. 10/950.543 como depositado em 24 de setembro de 2004 e publicado na Publicação da Patente U.S. Ns. US2005/0090508A1 em 28 de abril de 2005 e como a Publicação da Patente Internacional N9. W02005/030775 em 7 de abril de 2005. A descrição destes compostos e os métodos de obtenção e de utilização dos mesmos como apresentados no pedido de patente publicado são aqui incorporados como referência em sua totalidade.

Para a presente invenção, foi descoberto que os adutos ácidos e dímeros das triazolopirimidinas 6-[(fenil substituídas)] podem ser formados sob condições especificadas. Tais compostos também serão úteis para me- lhorar a polimerização da tubulina rica em proteína associada ao microtúbulo (MAP) na presença de GTP a baixas razões molares de composto: tubulina e para induzir a polimerização de tubulina altamente purificada na ausência de GTP sob condições experimentais adequadas. Estes compostos também são potentemente citotóxicos para muitas linhagens de células de câncer humano em cultura, inclusive linhagens que superexpressão os transporta- dores de membrana MDR (P-glicoproteína), MRP e MXR e têm ampla ativi- dade antitumor em modelos de xenoenxerto in vivo de câncer do pulmão da célula não pequena humana (NSCLC), câncer do cólon, câncer de mama, melanoma e glioblastoma, inclusive modelos que sejam resistentes aos ta- xanos ou a outros compostos microtúbulo ativos.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

De acordo com a presente invenção, são fornecidos compostos representados pela Fórmula (I):

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em que

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ou um-(C6 - C8) cicloalquila opcionalmente substituído com R8; n é um número inteiro de 2, 3 ou 4;

X é -Cl, -F ou -Br;

Y é-O-,-S-,-CH2-ou-NR4-;

L1 e L2 são cada um independentemente -H, -F, -Cl, -Br, ou -CF3;

R3 é -CF3 ou -C2F5;

R4, R5 e R6 são cada um independentemente -H ou -(C1- C3)-alquila;

R7 é -ZR9 em que Z é -CO-, -NO-, -SO2- ou -PO2H- e R9 é -H, -OH, -(C1-C5) -alquila ou -(C2-C5)-alquenila, o dito alquila ou alquenila op- cionalmente substituído com um ou mais de -O-, halogênio, -OH, -NH2 ou um grupo cicloalquila de cinco ou seis elementos saturado, parcialmente sa- turado ou insaturado em que um a três dos átomos de carbono no anel são opcionalmente substituídos com um átomo de N, O, ou S e o dito grupo ci- cloalquila é substituído com um-CH3, -OH ou halogênio e

R8 é (C1-C3) -alquila ou sais farmaceuticamente aceitáveis ou estereoisômeros dos mesmos.

A presente invenção também fornece compostos de Fórmula (II):

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(II)

10 em que R1 é

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ou um -(C6 - C8)-cicloalquila opcionalmente substituído com R8;

n é um número inteiro de 2, 3 ou 4;

X é-Cl,-F ou-Br;

Y é-O-,-S-,-CH2-ou-NR4-;

L1 e L2 são cada um independentemente -H, -F, -Cl, -Br ou -CF3;

R3 é -CF3 ou -C2F5;

R2, R4, R5, R6 e R9são cada um independentemente -H ou -(C1- C3)-alquila;

R8 é -(C1-C3)-alquila e sais ou estereoisômeros farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos.

A presente invenção também fornece um processo de tratamen- to ou de inibição do crescimento de células de tumor canceroso e doenças associadas em um mamífero por administração de uma quantidade eficaz dos compostos de Fórmula (I) e sais farmaceuticamente aceitáveis dos mes- mos em necessidade dos mesmos.

A presente invenção também fornece um processo de tratamen- to ou de inibição do crescimento de células de tumor canceroso e doenças associadas em mamíferos em necessidade do mesmo pela interação com tubulina e microtúbulos por promoção da polimerização do microtúbulo que compreende a administração ao dito mamífero de uma quantidade eficaz dos compostos de Fórmula (I) ou (II) ou de sais farmaceuticamente aceitá- veis dos mesmos.

Também é fornecido um processo para o tratamento ou a pre- venção de tumores que expressem múltipla resistência fármacos (MDR) ou são resistentes por causa da MDR, em um mamífero que necessite as mes- mas cujo processo compreende administrar ao dito mamífero uma quantida- de eficaz de tais compostos ou de sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos.

Esta invenção também fornece um processo para promover a polimerização de tubulina em um sistema que contém tubulina por contato do dito sistema que contém tubulina com uma quantidade eficaz de um composto de Fórmula (I) ou (II) ou de sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos.

Adicionalmente esta invenção fornece um processo para estabi- lização de microtúbulos em um sistema que contém tubulina que compreen- de o contato do dito sistema que contém tubulina com uma quantidade efi- caz de um composto de Fórmula (I) ou (II) ou de um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

Também é fornecido um processo de tratamento, inibição do crescimento de ou erradicação de um tumor em um mamífero que necessite o mesmo em que o dito tumor é resistente a pelo menos um agente quimio- terapêutico, cujo processo compreende a administração, ao dito mamífero de uma quantidade eficaz dos compostos de Fórmula (I) ou (II) ou dos sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos.

Em um outro aspecto ainda, esta invenção fornece um compos- to de Fórmula (I) em combinação ou em associação com um veículo farma- ceuticamente aceitável. Em particular, a presente invenção fornece uma composição farmacêutica, que compreende uma quantidade eficaz de um composto de Fórmula (I) e um veículo farmaceuticamente aceitável. DESCRIÇÃO DETALHADA DE MODALIDADES ILUSTRATIVAS DA IN- VENÇÃO (a) Definições

O termo "alquila" significa um grupamento de cadeia de hidro- carboneto reta ou ramificada, de preferência de 1 a 3 átomos de carbono.

O termo "í-BOC" como usado neste caso significa terc-butóxi

carbonila.

O termo "aminoalcóxi" signfica um grupamento de fórmula

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O termo "aminoalquila" signfica um grupamento de fórmula

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O termo "aminoalquiltio" signfica um grupamento de fórmula

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O termo "aminoalquilamino" signfica um grupamento de fórmula

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O termo "hidroxialcóxi" signfica um grupamento de fórmula

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O termo "hidróxido de metal alcalino" inclui lítio, potássio ou hi- dróxido de sódio.

O termo "carbonato de metal alcalino" inclui carbonato de lítio, de potássio ou de sódio.

O termo "hidreto de metal alcalino" inclui hidreto de lítio, de po- tássio ou de sódio.

O termo "base forte" significa um hidróxido de metal alcalino, um carbonato de metal alcalino e um hidreto de metal alcalino (por exemplo, hidreto de sódio).

O termo "(C1-C5-alquila" como usado neste caso refere-se a hidrocarboneto linear ou ramificado, saturado que tem desde 1 a 5 átomos de carbono, de preferência 1 a 3 átomos de carbono. Os grupos (C1-C5)- alquila representativos incluem, porém não estão limitados a, metila, etila, propila, isopropila, butila, sec-butila, terc-butila, pentila, isopentila e neopenti- la. Em uma modalidade, o grupo (C1-C5)-alquila está substituído com um ou mais dos seguintes grupos: halogênio, -N3, -NO2, -CN, -OR', -SR', -SO2R', -SO2N(R')2, -N(R')2, -COR', -CO2R', -NROO2R', -NROOR', -NROONR' ou -CON (R')2, em que cada R' é independentemente hidrogênio ou (C1-C5)- alquila não substituída.

O termo "(C2-C5)-alquenila" como usado neste caso refere-se a um hidrocarbonéto linear ou ramificado que tem de 2 a 5 átomos de carbono e que tenha pelo menos uma dupla ligação de carbono-carbono. Em uma modalidade, o (C2-C5)-alquenila tem uma ou duas duplas ligações. O gru- pamento (C2-C5)-alquenila pode existir na conformação E ou Z e os compos- tos da presente invenção incluem ambas as conformações. Os grupos (C2- C5)-alquenila representativos incluem, porém não estão limitados a, etenila, propenila, isopropenila, butenila, sec-butenila, terc-butenila, pentenila, iso- pentenila e neopentenila. Em uma modalidade, o grupo (C2-C5)-alquenila está substituído com um ou mais dos seguintes grupos: halogênio, -N3, -NO2, -CN, -OR', -SR', -SO2R', -SO2N(R')2, -N(R')2, -COR', -CO2R', -NROO2R', -NROOR', -NR'CONR' ou -CON (R')2, em que cada R' é inde- pendentemente hidrogênio ou (C2-C5)-alquila não substituída.

O termo "administrar", "administrando" ou "administração", como usado neste caso refere-se à administração direta de um composto ou de um sal farmaceuticamente aceitável do composto ou da composição a um animal ou à administração de um derivado de pró-fármaco ou análogo do composto ou do sal farmaceuticamente aceitável do composto ou da compo- sição ao animal, que pode formar uma quantidade equivalente de composto ativo dentro do corpo do animal.

O termo "animal" como usado neste caso inclui, sem limitação, um ser humano, um camundongo, um rato, um porquinho da índia, um cão, um gato, um cavalo, uma vaca, um porco, um macaco, um chimpanzé, um babuíno ou um maçado da índia. Em uma modalidade, o animal é um mamí- fero. Em uma outra modalidade, o animal é um ser humano.

O termo "arila" como usado neste caso refere-se a uma espécie aromática que contém 1 a 3 anéis aromáticos, fundidos ou ligados. Em uma modalidade, o grupo arila é substituído com um ou mais dos seguintes gru- pos: -V-halogênio, -V-N3, -V'-NO2, -V-CN, -V-OR', -V-SR', -V-SO2R', -V-SO2N(R')2, -V'-N(Rf)2l -V-COR', -V-CO2R', -V-NROO2R', -V-NROOR', -V'-NR'CONR' ou -V-CON (R')2, em que cada R' é independentemente hi- drogênio ou (C1-C6)-alquila não substituída; e em que cada V' é independen- temente uma ligação ou (C1-C6)-alquila.

O termo "condições eficazes para" como usado neste caso refe- re-se a condições de reação sintética que serão evidentes àqueles versados na técnica de química orgânica sintética.

O termo "grupo cíclico" como usado neste caso inclui um grupo cicloalquila e um grupo heterocíclico. Qualquer posição adequada no anel do grupo cíclico pode estar ligada covalentemente à estrutura química definida. Em uma modalidade, o grupo cíclico é substituído com um ou mais dos se- guintes grupos: -V-halogênio, -V-N3, -V-NO2, -V-CN, -V-OR', -V-SR', -V-SO2R', -V-SO2N(R')2, -V'-N(R')2l -V-COR', -V'-CO2R', -V-NROO2R', -V-NROOR', -V-NBOONR' ou -V-CON (R')2, em que cada R' é indepen- dentemente hidrogênio ou (C1-C6)-alquila não substituída e em que cada V' é independentemente uma ligação ou (C1-C6)-alquila.

O termo "grupo cicloalquila" como usado neste caso refere-se a um anel de carbono de três a sete elementos saturado ou parcialmente insa- turado. Qualquer posição adequada no anel do grupo cicloalquila pode estar ligada covalentemente à estrutura química definida. Exemplos de grupos cicloalquila incluem ciclopropila, ciclobutila, ciclopentila, ciclohexila e ciclo- heptila. Em uma modalidade, o grupo cicloalquila é substituído com um ou mais dos seguintes grupos: -V-halogênio, -V-N3, -V-NO2, -V-CN, -V-OR', -V-SR', -V-SO2R', -V-SO2N(R')2, -V'-N(R')2, -V'-COR', -V'-CO2R', -V'-NR'CO2R', -V-NR'COR', -V'-NR'CONR' ou -V'-CON (R')2, em que cada R' é independentemente hidrogênio ou (C1-C6)-alquila não substituída e em que cada V' é independentemente uma ligação ou (C1-C6)-alquila.

O termo "fenila" como usado neste caso refere-se a um grupo fenila substituído ou não substituído. Em uma modalidade, grupo fenila é substituído com um ou mais dos seguintes grupos: -V-halogênio, -V-N3, -V'-NO2, -V'CN, -V-OR', -V-SR', -V'-SO2R', -V'-S02N(R')2, -V'-N(R')2) -V'-COR', -V'-CO2R', -V'-NR1CO2R', -V'-NROOR', -V'-NR'CONR' ou - V'-CON (R')2, em que cada R' é independentemente hidrogênio ou (C1-C6)- alquila não substituída e em que cada V' é independentemente uma ligação ou (C1-C6)-alquila.

O termo "halogênio" como usado neste caso refere-se a flúor, cloro, bromo e iodo.

O termo "grupo heterocíclico" como usado neste caso refere-se a um grupo cicloalquila de três a sete elementos saturado, parcialmente sa- turado ou insaturado em que um a quarto dos átomos de carbono no anel foram substituídos independentemente com um átomo de N, de O ou de S. Qualquer posição adequada no anel do grupo heterocíclico pode estar ligado covalentemente à estrutura química definida. Exemplos de grupos heterocí- clicos incluem, porém não estão limitados a, azepanila, azetidinila, aziridinila, furanila, furazanila, homopiperazinila, imidazolidinila, imidazolinila, isotiazoli- la, isoxazolila, morpholinila, oxadiazolila, oxazolidinila, oxazolila, oxazolidini- la, pirimidinila, fenantridinila, fenantrolinila, piperazinila, piperidinila, piranila, pirazinila, pirazolidinila, pirazolinila, pirazolila, piridazinila, piridooxazolila, piridoimidazolila, piridotiazolila, piridinila, pirimidinila, pirrolidinila, pirrolinila, quinuclidinila, tetrahidrofuranoíla, tiadiazinila, tiadiazolila, tienila, tienotiazoli- la, tienooxazolila, tienoimidazolila, thiomorpholinila, thiofenila, triazinila e tria- zolila. Em uma modalidade, o grupo heterocíclico é substituído com um ou mais dos seguintes grupos: -V'-halogênio, -V'-N3, -V'-NO2, -V'-CN, -V'-OR', -V'-SR', -V'-SO2R', -V'-SO2N(R1)2, -V'-N(R1)2, -V-COR', -V'-CO2R', -V'-NROO2R', -V'-NROOR', -V'-NROONR' ou -V'-CON (R1)2, em que cada R' é independentemente hidrogênio ou (C1-C6)-alquila não substituída e em que cada V' é independentemente uma ligação ou (C1-C6)-alquila. O termo "quantidade eficaz" como usado neste caso refere-se a uma quantidade de um composto ou de um sal farmaceuticamente aceitável de um composto que, quando administrado a um animal, seja eficaz para prevenir, até pêlo menos melhorar parcialmente ou curar, uma condição de que o animal sofre ou é suspeitado de sofrer.

O termo "veículo", como usado neste caso, deve abranger veí- culos, excipientes e diluentes.

O termo "pró-fármaco", como usado neste caso, significa um composto que pode ser convertido in vivo por meios metabólicios (por e- xemplo, por hidrólise) a um composto de Fórmula (I) ou de Fórmula (II).

O termo "isolado e purificado" como usado neste caso refere-se a um componente separado dos outros componentes de uma mistura da reação ou de uma fonte natural. Em certas modalidades, o isolado contém pelo menos aproximadamente 50%, pelo menos aproximadamente 55%, pelo menos aproximadamente 60%, pelo menos aproximadamente 65%, pelo menos aproximadamente 70%, pelo menos aproximadamente 75%, pelo menos aproximadamente 80%, pelo menos aproximadamente 85%, pelo menos aproximadamente 90%, pelo menos aproximadamente 95% ou pelo menos aproximadamente 98% do composto ou do sal farmaceutica- mente aceitável do composto em peso do isolado.

O termo "sal farmaceuticamente aceitável" como usado neste caso refere-se a um sal de um ácido e a um átomo básico de nitrogênio de um composto da presente invenção. Exemplos de sais incluem, porém não está limitados a, sulfato, citrato, acetato, oxalato, cloreto, cloridrato, brometo, bromidrato, iodeto, nitrato, bissulfato, fosfato, ácido fosfático, isonicotinato, lactato, salicilato, ácido citrático, tartarato, oleato, tanato, pantotenato, bitar- tarato, ascorbato, succinato, maleato, gentissinato, fumarato, gluconato, glu- caronato, sacarato, formiato, benzoato, glutamato, metanossulfonato, eta- nossulfonato, benzenossulfonato, p-toluenossulfonato, canforsulfonato, naf- talenossulfonato, propionato, succinato, fumarato, maleato, malonato, man- delato, malato, ftalato e pamoato. O termo "sal farmaceuticamente aceitável" como usado neste caso também refere-se a um sal de um composto da pre- sente invenção que tem um grupo funcional ácido, tal como um grupo ácido carboxílico funcional e uma base. Exemplos de bases incluem, porém não estão limitados a, hidróxidos de metais alcalino inclusive sódio, potássio e lítio; hidróxidos de metais alcalino-terrosos tais como cálcio e magnésio; hi- dróxidos de outros metais, tais como alumínio e zinco; amônia, aminas orgâ- nicas tais como mono-, di- ou trialquilaminas não substituídas ou hidroxila- substituídas, diciclohexilamina; tributil amina; piridina; N-metila, N-etilamina; dietilamina; trietilamina; mono-, bis- ou tris- (2-OH-(C1-C6)-alquilamina), tais como N,N-dimetil-N-(2-hidroxietil) amina ou tri- (2- hidroxietil) amina; N-metil-D-glucaríiina; morfolina; tiomorfolina; piperidina; pirrolidina e aminoá- cidos tais como arginina, lisina e similares. O termo "sal farmaceuticamente aceitável" também inclui um hidrato de um composto da presente invenção.

O termo "substancialmente isento de seu enantiômero oposto correspondente" como usado neste caso significa que o composto contém não mais do que aproximadamente 10% em peso de seu enantiômero opos- to correspondente. Em outras modalidades, o composto que é substancial- mente isento de seu enantiômero oposto correspondente não contém mais do que aproximadamente 5%, não mais do que aproximadamente 1 %, não mais do que aproximadamente 0,5% ou não mais do que aproximadamente 0,1% em peso de seu enantiômero oposto correspondente. Um enantiômero que é substancialmente isento de seu enantiômero oposto correspondente inclui um composto que foi isolado e purificado ou que foi preparado subs- tancialmente isento de seu enantiômero oposto correspondente.

(b) Compostos e Sais Farmaceuticamente Aceitáveis de Compostos da in- vencão

De acordo com a presente invenção, são fornecidos compostos representados pela Fórmula (I):

<formula>formula see original document page 16</formula>

em que R1 é <formula>formula see original document page 17</formula>

ou um -(C6-C8)-cicloalquila opcionalmente substituído com R8; X é -Cl, -F ou -Br; Y é -O-, -S-, -CH2- ou -NR4-; L1 e L2 são cada um independentemente -H, -F, -Cl, -Br ou -CF3; R3 é -CF3 ou -C2F5; R4, R5 e R6 são cada um independentemente -H ou -(Ci-C3)- alquila;

R7 é -ZR9, em que Z é -CO-, -NO-, -SO2- ou -PO2H-; e R9 é -H, -OH1 -(C1-C5) -alquila ou -(C2-Cs)-alquenila, a dita alquila ou alquenila opcio- nalmente substituída com um ou mais de -O-, halogênio, -OH, -NH2 ou com um grupo cicloalquila de cinco ou de seis elementos parcialmente saturado ou insaturado em que um a três dos átomos de carbono no anel são opcio- nalmente independentemente substituídos com um átomo de Ν, O ou S e o dito grupo cicloalquila opcionalmente é substituído com um -CH3, -OH ou halogênio e

R8 é -(CrC3)-alquila; e

sais farmaceuticamente aceitáveis ou estereoisômeros dos mesmos.

A presente invenção também fornece um composto de Fórmula

(II): <formula>formula see original document page 17</formula> (II)

em que <formula>formula see original document page 17</formula>

ou um - (C6 - C8) -cicloalquila opcionalmente substituído com R8; n é um número inteiro de 2, 3 ou 4; X é -Cl, -F ou -Br;

Y é-O-,-S-,-CH2-ou-NR4-;

L1 e L2 são cada um independentemente -H, -F, -Cl, -Br ou -CF3;

R3 é -CF3 ou -C2F5;

R2, R4, R5 R6 e R9 são cada um independentemente -H ou —(C1- C3)-alquila;

R8é-(Ci-C3)-alquila ou sais farmaceuticamente aceitáveis ou estereoisômeros dos mesmos.

Nos compostos de Fórmula (I) e (II), R6 é de preferência um - (C1-C3)-alquila e até mesmo mais preferivelmente é-CH3.

Nos compostos de Fórmula (I), de preferência R7 é -ZR9, em que Z é -CO- ou -N0-; e R9 é um -(C1-C5)-alquila ou -(C2-C5)-alquenila, op- cionalmente substituído com um ou mais de O, halogênio, -OH, -NH2 ou com um grupo cicloalquila de cinco ou de seis elementos parcialmente saturado ou insaturado em que um a três dos átomos de carbono no anel são opcio- nalmente independentemente substituídos com um átomo de Ν, O ou S e o dito grupo cicloalquila opcionalmente é substituído com um -CH3, -OH ou halogênio. Mais preferivelmente, Z é -CO- e R9 é um -C2-C4 alquila ou -(C2- C4)-alquenila, que tem um grupo CO2H.

Particularmente preferidos são os compostos que têm fórmula (I) em que R1 é R3R5CH-NH- (quando R3 e R5 são como definidos acima) e R7 é carboxialquilcarbonila que contém um total de 3 a 6 átomos de carbono ou carboxialquenilcarbonila que contém um total de 4 a 6 átomos de carbono (de preferência carboxialquilcarbonila que contém um total de 3 a 6 átomos de carbono, por exemplo, -CO-(CH2) 2-C02H) e Y é -O-.

Também preferidos são os compostos que tenham a fórmula (I) ou (II) em que R1 é R3R5CH-NH- (em que R3 e R5 são como definidos aci- ma), X é -Cl, L1 e L2 são -F1 η é 3, R2 é H ou -(C1 a C3) alquila, R6 é -(C1 a C3) alquila (de preferência -CH3) e Y é -O-. Para os compostos de Fórmula (I), estes compostos de preferência terão R7 como carboxialquilcarbonila que contém um total de 3 a 6 átomos de carbono ou carboxialquenilcarbonila que contém um total de 4 a 6 átomos de carbono (de preferência carboxialquil- carbonila que contém um total de 3 a 6 átomos de carbono, por exemplo, - CO-(CH2)2-CO2H).

Nos compostos preferidos de Fórmula (I) e Formula (II), R1 é

<formula>formula see original document page 19</formula>

Os compostos preferidos de Fórmula (I) e de Fórmula (II) irão incluir R3 como -CF3 e/ou R5 como um -C1-C3 alquila.

Os substituintes preferidos para L1 e L2 são cada um indepen- dentemente -F, -CI ou -Br. Mais preferivelmente, L1 e L2 são cada um -F.

Nos compostos de Fórmula (I) e de Fórmula (II), Y é de prefe- rência -O-, η é de preferência 3 e/ou X é de preferência -Cl.

Um composto de Fórmula (I) particularmente preferido é:

<formula>formula see original document page 19</formula>

Um composto de Fórmula (I) da invenção também preferido é:

<formula>formula see original document page 19</formula>

Um composto de Fórmula (I) também ainda preferido inclui:

<formula>formula see original document page 19</formula>

em que r é um número inteiro de O a 5, inclusive.

Os compostos de Fórmula (II) preferidos incluem:

<formula>formula see original document page 19</formula>

Mais particularmente, um composto de Fórmula (II) preferido é:

<formula>formula see original document page 19</formula>

Como é evidente por estes compostos, os compostos desta in- venção podem conter um átomo de carbono assimétrico e alguns dos com- postos desta invenção podem conter um ou mais centros assimétricos e po- de assim dar origem aos estereoisômeros, tais como enantiômeros e diaes- tereômeros. Os estereoisômeros da presente invenção são denominados de acordo com o Sistema Cahn-Ingold-Prelog. Embora apresentado sem rela- ção à estereoquímica, a presente invenção inclui todos os estereoisômeros individuais possíveis; assim como as misturas racêmicas e outras misturas de estereoisômeros ReS (misturas escalêmicas que são misturas de quan- tidades desiguais de enantiômeros) e sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos. Estão incluídos no âmbito da presente invenção os isômeros (R) e (S) dos compostos de Fórmula geral (I) e (II) que tem um centro quiral e os racematos dos mesmos. A presente invenção abrange todos os estereoisô- meros dos compostos sejam isentos de outros estereoisômeros ou mistura- dos com outros estereoisômeros em qualquer proporção e assim inclui, por exemplo, a mistura racêmica de enantiômeros assim como a mistura diaste- reomérica de isômeros. A configuração absoluta de qualquer composto pode ser determinada por cristalografia convencional em raios X.

Os isômeros ópticos podem ser obtidos em forma pura por técni- cas padronizadas de separação ou por síntese específica de enantiômero. Po- de desse modo ser obtido um composto de Fórmula (I) ou de Fórmula (II) que seja substancialmente isento de seu enantiômero oposto correspondente.

Além disso, os polimorfos, hidratos e solvatos dos compostos da presente invenção estão incluídos dentro do âmbito da invenção.

Fica entendido que esta invenção abrange todas as formas cris- talinas e hidratadas dos compostos de Fórmulas (I) e (II) e de seus sais far- maceuticamente aceitáveis. Os sais farmaceuticamente aceitáveis dos com- postos desta invenção são aqueles derivados de tais sais farmaceuticamen- te aceitáveis orgânicos e inorgânicos que formam ácidos como: ácidos lácti- co, cítrico, acético, tartárico, fumárico, succínico, maléico, malônico, clorídri- co, bromídrico, fosfórico, nítrico, sulfúrico, metanossulfônico, benzennossul- fônico, L-aspártico, R ou S-mandélico, palmítico e sais aceitáveis similar- mente conhecidos. Um outro sal é o sal do ácido triflúoracético (TFA). Em particular, são preferidos os sais cloridrato, fumarato e succinato. Para formar o sal, os compostos de Fórmula (I) ou (II) são reagi- dos com um ácido que forma um sal farmaceuticamente aceitável adequado. Como um exemplo representativo de formação de um sal farmaceuticamente aceitável, o sal cloridrato de 5-cloro-6-{2,6-diflúor-4-[3-(metilamino) propóxi] fenila}-N-[(1 S)-2, 2, 2-triflúor-1 -metiletil] [1,2,4] triazol [1, 5-a] pirimidin-7- amina é neutralizado com hidróxido aquoso de metal alcalino ou com carbo- nato aquoso de metal alcalino e também reagido com um ácido farmaceuti- camente aceitável adequado que forma sal descrito aqui a seguir em um solvente adequado. Os solventes adequados que podem ser usados inclu- em: água, metanol, etanol, isopropanol ou combinação dos mesmos e simi- lares. Um solvente preferido é a água.

De preferência, os sais farmaceuticamente aceitáveis podem se formar por aquecimento de compostos de Fórmula (I) ou (II) em um solvente adequado, aproximadamente a 30 - 100°C, de preferência aproximadamente a 65 - 75°C, até que se forme uma solução transparente. Por resfriamento o composto pode ser coletado e seco.

Podem ser formados dihidratos por contato adicional com uma atmosfera de água em torno de 80 - 100% de umidade relativa durante apro- ximadamente 24 horas à temperatura ambiente.

Os compostos desta invenção podem ser preparados partindo • de: (a) materiais de partida comercialmente disponíveis; (b) materiais de par- tida conhecidos que possam ser preparados como descrito em procedimen- tos em literatura ou (c) novos intermediários descritos nos esquemas e em procedimentos experimentais neste caso.

As reações são realizadas em um solvente apropriado para os reagentes e os materiais empregados e adequados para que a transforma- ção seja efetuada. É entendido pelos versados na técnica de síntese orgâni- ca que as várias funcionalidades presentes na molécula devem ser coeren- tes com as transformações químicas propostas. Isto pode necessitar julga- mento em relação à ordem das etapas da síntese. Deve ser feita uma consi- deração apropriada para a proteção de grupos reativos funcnionais para evi- tar reações secundárias indesejadas. Os substituintes nos materiais de par- tida podem ser incompatíveis com algumas das condições da reação. Tais restrições para os substituintes que são compatíveis com as condições da reação serão evidentes para um versado na técnica. As reações são proces- sadas sob atmosferas inertes quando apropriado.

Um material de partida para a preparação de compostos de Fórmula (I) e (II) inclui compostos de Formula (III):

<formula>formula see original document page 22</formula>

Os substituintes são como definidos anteriormente e R2 é de preferência -H.

Tais compostos são obtidos como descrição no Pedido de Pa- tente U.S. N9. 10/950,543 como depositado em 24 de setembro de 2004 pu- blicado como a Publicação da Patente U.S. N9. US2005/0090508A1 em 28 de abril de 2005 e como a Publicação da Patente Internacional Ns. W02005/030775 em 7 de abril de 2005, cuja divulgação é incorporada como referência em sua totalidade para os compostos e os processos de obtenção dos mesmos.

O segundo material de partida é um composto de Fórmula HO- ZR91 em que Z é -CO-; -NO-, -SO2- ou -PO2H- e R9 é -H, -OH1 -(Ci-C5)- alquila ou -(C2-C5)-alquenila, o dito alquila ou alquenila opcionalmente subs- tituído com um ou mais de O, halogênio, -OH, -NH2 ou um grupo cicloalquila de cinco ou seis elementos saturado, parcialmente saturado ou insaturado em que um a três dos átomos de carbono no anel são opcionalmente inde- pendentemente substituídos com um átomo de Ν, O ou S e o dito grupo ci- cloalquila é opcionalmente substituído com um -CH3, -OH ou halogênio.

Um exemplo da reação para produzir um composto específico de Fórmula (I) é como a seguir:

<formula>formula see original document page 22</formula>

em que r é um número inteiro de 0 a 5.

Alternativamente, o segundo material de partida é um composto de Fórmula:

<formula>formula see original document page 23</formula>

em que ρ é 1 ou 2; q é O ou 1; χ e 1, 2 ou 3; Z1 e Z2 são cada um indepen- dentemente -CH2-, -CO-, -NO-, -SO2- ou -PO2H-; e A é um átomo de -O-, -S- ou-N-.

Por exemplo, um composto específico de Fórmula (I) pode ser preparado pela reação a seguir:

<formula>formula see original document page 23</formula>

Para produzir um composto de Fórmula (I), os dois materiais de partida são misturados sob condições apropriadas na presença de um sol- vente éter, incluindo mas não limitado a tetrahidrofurano (THF), éter dietila, t- butil éter de metila e dioxana. Os materiais de partida são misturados duran- te um período de tempo suficiente para produzir um composto de Fórmula (I). A mistura pode ser aquecida quanto necessário para facilitar a reação.

Um composto de Fórmula (II) é preparado por um processo que compreende aquecer a mistura que tem um composto de Fórmula (III):

<formula>formula see original document page 23</formula>

em um sistema de solvente apropriado até uma temperatura e durante um período de tempo suficiente para produzir um composto de Fórmula (II).

Por exemplo, um composto de Fórmula (II) pode ser produzido como a seguir:

<formula>formula see original document page 23</formula>

Composições Farmacêuticas

A presente invenção conseqüentemente fornece uma composi- ção farmacêutica que compreende um composto desta invenção em combi- nação ou em associação com um veículo farmaceuticamente aceitável. Em particular, a presente invenção fornece uma composição farmacêutica que compreende uma quantidade eficaz de um composto desta invenção e um veículo farmaceuticamente aceitável.

Baseado nos resultados de procedimentos de testes farmacolo- góicos padronizados aqui descritos, os compostos desta invenção são úteis como agentes para o tratamento, a inibição ou o controle do crescimento de células de tumor canceroso e de doenças associadas em um mamífero que necessite os mesmos. Os compostos da invenção são úteis como agentes para o tratamento, a inibição ou o controle do crescimento de células de tu- mor canceroso e de doenças associadas em um mamífero que necessite os mesmos por interação com tubulina e microtúbulos e promoção de polimeri- zação de microtúbulo. Os compostos da invenção também são úteis para o tratamento ou a prevenção de tumores cancerosos que expressam múltipla resistência a fármacos (MDR) ou são resistentes por causa da MDR.

Em particular, quando se realiza o contato de um sistema que contém tubulina com uma quantidade eficaz de um composto de Fórmula (I) ou (II) resulta na promoção da polimerização de microtúbulo e também esta- biliza os microtúbulos e por promoção da polimerização de microtúbulo e estabilização dos microtúbulos os ditos compostos de Fórmula (I) e (II) são úteis como agentes para o tratamento, a inibição ou o controle do crescimen- to de células de tumor canceroso e de doenças associadas. O sistema que contém tubulina pode estar em uma célula do tumor, inibindo desse modo a doença neoplásica por administração de uma quantidade eficaz de um com- posto descrito na presente invenção. Podem ser tratados mamíferos e, em particular, os seres humanos. Além disso, o dito sistema que contém a tubu- lina pode estar em um paciente. No caso de tratamento de câncer, acredita- se que muitas neoplasias tais como leucemia, câncer do pulmão, câncer do cólon, câncer da tireóide, câncer ovariano, câncer renal, câncer da próstata e cânceres de mama podem ser tratados administrando-se eficazmente quantidades eficazes dos compostos de Fórmula (I) ou (II). Adicionalmente, os compostos de Fórmula (I) e (II) são úteis para o tratamento ou a preven- ção de tumores cancerosos que expressam múltipla resistência a fármacos (MDR) ou são resistentes por causa da MDR. Como usado neste caso, o câncer refere-se a todos os tipos de cânceres ou de neoplasmas ou de tu- mores benignos ou malignos. Os cânceres preferidos para tratamento usan- do-se métodos aqui fornecidos incluem carcinoma, sarcoma, Iinfoma ou leu- cemia. Por carcinoma entende-se um tumor epitelial benigno ou maligno e inclui, porém não é limitado a, carcinoma da mama, carcinoma da próstata, carcinoma do pulmão da célula não pequena, carcinoma do cólon, carcino- ma melanoma, carcinoma ovariano ou carcinoma renal. Um hospedeiro pre- ferido é um ser humano.

A dosagem eficaz de ingrediente ativo empregada pode variar dependendo do composto empregado em particular, do modo de administra- ção e da gravidade da condição que está sendo tratada. No entanto, em ge- ral, são obtidos resultados satisfatórios quando os compostos da invenção são administrados em quantidades na faixa de desde aproximadamente 0,10 até aproximadamente 10O mg/kg de peso do corpo por dia. Um regime pre- ferido para resultados ótimos seria de desde aproximadamente 1 mg até a- proximadamente 20 mg/kg de peso do corpo por dia e tais unidades de do- sagem são empregadas que um total de desde aproximadamente 70 mg até aproximadamente 1400 mg do composto ativo para um sujeito com aproxi- madamente 70 kg de peso do corpo são administrados em um período de tempo de 24 horas.

O regime de dosagem para tratamento de mamíferos pode ser ajustado para fornecer a resposta terapêutica ótima. Por exemplo, podem ser administradas diversas doses divididas diariamente ou a dose pode ser reduzida proporcionalmente como indicado pelas exigências da situação te- rapêutica. Uma vantagem decididamente prática é que estes compostos ati- vos podem ser administrados de qualquer maneira conveniente tal como por vias oral, intravenosa, intramuscular ou subcutânea.

Os compostos ativos da invenção podem, de preferência, ser administrados oralmente, por exemplo, com um diluente inerte ou com um veículo comestível assimilável ou eles podem estar encerrados em cápsulas de gelatina dura ou mole ou eles podem ser prensados em comprimidos ou eles podem ser incorporados diretamente ao alimento da dieta. Para admi- nistração terapêutica oral, estes compostos ativos podem ser incorporados a excipientes e usados na forma de comprimidos que podem ser ingeridos, comprimidos bucais, trociscos, cápsulas, elixires, suspensões, xaropes, wa- fers e similares. Tais composições e preparações deviam conter pelo menos 0,1% de composto ativo. A percentagem das composições e das prepara- ções pode, evidentemente, ser variada e pode convenientemente estar entre aproximadamente 2% e aproximadamente 60% do peso da unidade. A quan- tidade de composto ativo em tais composições terapeuticamente úteis é tal que seja obtida uma dosagem adequada. As composições ou preparações preferidas de acordo com a presente invenção são preparadas de modo que uma forma de unidade de dosagem oral contenha entre 10 e 1000 mg de composto ativo.

Os comprimidos, os trociscos, as pílulas, as cápsulas e similares também podem conter o seguinte: um aglutinante tal como goma tragacante, acácia, amido de milho ou gelatina; excipientes tais como fosfato dicálcico; um agente disintegrador tais como amido de milho, amido de batata, ácido algínico e similares; um lubrificante tal como estearato de magnésio e um agente adoçante tais como sacarose, Iactose ou sacarina podem ser adicio- nados ou um agente flavorizante tais como hortelã-pimenta, óleo de gaultéria ou sabor de cereja. Quando aíorma de dosagem for uma cápsula, esta pode conter, além dos materiais do tipo acima, um veículo líquido. Vários outros materiais podem estar presentes como revestimentos ou para de outro modo modificar a forma física da unidade de dosagem. Por exemplo, comprimidos, pílulas ou cápsulas podem ser revestidos com goma laca, açúcar ou ambos. Um xarope ou um elixir pode conter o composto ativo, a sacarose, como um agente adoçante, metil e propilparabens como conservantes, um corante e um flavorizante tal como sabor de cereja ou de laranja. Evidentemente, qualquer material usado no preparo de qualquer forma de unidade de dosa- gem devia ser farmaceuticamente puro e substancialmente não tóxico nas quantidades usadas. Além disso, estes compostos ativos podem ser incorpo- rados a preparações e formulações de liberação retardada. Estes compostos ativos também podem ser administrados pa- renteralmente ou intraperitonealmente. Podem ser preparadas soluções ou suspensões destes compostos ativos como uma base livre ou sal farmacolo- gicamente aceitável em água adequadamente misturada com um tensoativo tal como hidroxipropilcelulose. Também podem ser preparadas dispersões em glicerol, polietileno glicóis líquidos e misturas dos mesmos em óleos. Sob condições ordinárias de armazenagem e uso, estas preparações contêm um conservante para evitar o crescimento de microorganismos.

As formas farmacêuticas adequadas para uso injetável incluem soluções ou dispersões aquosas estéreis e pós estéreis para a preparação extemporânea de soluções ou dispersões injetáveis. Em todos os casos, a forma deve ser estéril e deve ser fluida até a extensão em que exista fácil utilização com seringa. Ela deve ser estável sob as condições de fabricação e armazenagem e deve ser preparada contra a ação contaminante de mi- croorganismos tais como bactérias e fungos. O veículo pode ser um solvente ou um meio de dispersão que contenha, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propileno glicol e polietileno glicol líquido), misturas adequadas dos mesmos e óleos vegetais.

A administração intravenosa é uma maneira preferida de admi- nistração dos compostos da invenção. Para administração intravenosa, e- 1 xemplos de veículos não Iimitativos adequados incluem solução salina, água bacteriostática, Cremophor® ELTM (BASF, Parsippany, N.J.) ou solução salina tamponado com fosfato (PBS). A composição deve ser estéril e devia ser fluida até a extensão de que exista fácil utilização com seringa. Ela devia ser estável sob as condições de fabricação e armazenagem e deve ser pre- parada contra a ação contaminante de microorganismos tais como bactérias e fungos. O veículo pode ser um solvent ou um meio de dispersão que con- tenha, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propileno gli- col e polietileno glicol líquido e similares) e misturas adequadas dos mes- mos. A prevenção da ação dos microorganismos pode ser conseguida por vários agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabenos, clo- robutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal e similares. Em muitos casos, será preferível incluir agentes isotônicos, por exemplo, açúcares, poliálcoois tais como manitol e sorbitol e cloreto de sódio na composição. A absorção prolongada das composições injetáveis pode ser provocada aproximada- mente por inclusão na composição de um agente que retarda a absorção, por exemplo, monoestearato de alumínio e gelatina.

Como usado de acordo com esta invenção, o termo "que forne- ce uma quantidade eficaz de um composto" significa administrar diretamente tal composto ou administrar um pró-fármaco, derivado ou análogo que irá formar uma quantidade eficaz do composto dentro do corpo.

Além das utilidades acima alguns dos compostos desta inven- ção são úteis para a preparação de outros compostos desta invenção. (d) Procedimentos de teste farmacológico padronizados

Os exemplos desta invenção são avaliados em diversos proce- dimentos de teste farmacológico padronizados que demonstraram que os compostos desta invenção possuem atividade significativa como promotores de polimerização de microtúbulo e são agentes antineoplásicos. Baseados na atividade nos procedimentos de teste farmacológico padronizados a se- guir, os compostos desta invenção são, portanto, úteis como agentes anti- câncer. Os cânceres associados são selecionados do grupo que consiste em câncer de mama, de cólon, de pulmão, de próstata, melanoma, epidermal,- leucemia, dos rins, da bexiga, da boca, da laringe, do esôfago, do estômago, do ovário, do pâncreas, do fígado, da pele e cerebral. Em particular, os com- postos desta invenção possuem um efeito similar a Paclitaxel.

Materiais e Métodos

Meios de Cultura de Célula e Reaqentes

O meio é RPMI-1640 com L-glutamina, suplementado com soro fetal de bezerro a 10% inativado pelo calor, 100 unidades/ml de penicilina e 100 pg/ml de estreptomicina (Gibco, Grand lsland, NY). Tubulina rica asso- ciada a microtúbulo (MAP), contendo aproximadamente 70% de tubulina e 30% de MAPs (#ML113) e tubulina altamente purificada (> 99% pura, #TL238), ambas provenientes de cérebro bovino, são obtidas da Cytoskele- ton, Inc., Denver, CO. O tampão PEM (ácido piperazina-N, N'-bis [2- etanossulfônico 80 mM], pH 6,9, ácido etileno glicol-bis (β-aminoetil éter)-N, N, N', N'-tetraacético 1 mM, cloreto de magnésio 1 mM) e guanosina 5'- trifosfato (GTP) também são obtidos da Cytoskeleton. [3H] paclitaxel, ativida- de específica 14,7 Ci/mmols, é adquirida da Moravek Biochemicals (Brea, CA). [3H] vinblastina, atividade específica 9,60 Ci/mmols e colunas MicroSpin G-50 são obtidas da Amersham Biosciences (Piscataway, NJ). [3H] colquici- na, atividade específica 76,5 Ci/mmols, é obtida da New England Nuclear (Boston, MA). Outros reagentes são obtidos da Sigma (St. Louis, MO).

1. Linhagens de células

Linhagens de células de câncer humano, a não ser se for obser- vado de outra maneira, são obtidas da American Type Culture Collection (Rockville, MD). As segunites linhagens de células parentais sensíveis a fármaco e suas contrapartes resistentes a fármaco derivadas, são obtidos dos originadores como relacionado: (a) S1 (linhagem parental de um subclo- ne linhagem de carcinoma de cólon humano LS174T) e derivado S1-M1-3.2 (aqui denominado S1-M1) que expressa a proteína transportadora de fárma- co MXR, são fornecidos por Dr. L. Greenberger, Wyeth Research (Rabin- dran, S.K., He, H., Singh, M., Brown, E., Collins, K.I., Annable, T. e Green- berger, L.M. Reversal of a novel multidrug resistance mechanism in numan colon carcinoma cells by fumitre margin C. Câncer Res., 58: 5850-5858, 1998); (b) linhagem parental de leucemia promielocítica HL-60 humana e derivado HL-60/ADR, que expressa a proteína transportadora de fármaco MRP1, são fornecidos.por Dr. M. Center, University of Kansas (McGrath, T. e Center, M.S. Adriamycin resistence in cells in ahsence of detectable P- glycoprotein Biochem. Biophys. Res. Commun., 145: 1171-1176, 1987), por meio de Dr. L. Greenberger, Wyeth Research e (c) KB-3-1 parental (aqui denominado KB, clonado de um carcinoma epidermóide humano) e as linha- gens derivadas KB-8-5 e KB-V1, que expressam níveis moderados e muito altos da proteína transportadora de fármaco MDR1 (P-glicoproteína), respec- tivamente, são fornecidas por Dr. M. Gottesman, National Câncer Institute (Shen, D.W., Cardarelli, C., Hwang, J., Cornwell, M., Richert, N., Ishii, S., Pastan, I. e Gottesman, Μ.Μ. J. Biol. Chem., 261: 7762-7770, 1986) por meio de Dr. L. Greenberger, Wyeth Research. 2. Teste Farmacológico Padronizado de Citotoxicidade

O ensaio, que é comercializado em uma forma de kit pela Pro- mega (Madison, Wl; CeIITiter 96 Aqueous Non-Radioactive cell Proliferation Assay), é baseado na conversão por células viáveis, mas não por células mortas, do sal de tetrazólio, MTS (3-(4, 5-dimetilatiazol-2-il)-5-(3- carboximetoxifenil)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazólio, sal interno), em um forma- zan colorido solúvel em água que é detectado por espectrofotometria. Os compostos são testados a nove concentrações, para determinar valores de IC5O- Para o procedimento do teste, as células são colhidas por tripsinização (ou, no caso de células não aderentes, por simples ressuspensão), lavadas, contadas e distribuídas a cavidades de placas de microtítulo de fundo plano com 96 cavidades a 1000 células por cavidade em 200 μΙ_ de meio. Além disso, uma fileira de cavidades sobre uma placa separada recebeu células como acima ("placa de tempo 0"). Todas as placas são incubadas a 37°C em CO2 umidificado a 5% em ar durante aproximadamente 24 horas.

No dia 2, os compostos para teste são diluídos e adicionados às cavidades. Os compostos são dissolvidos em DMSO a 10 mg/mL. Para cada composto, são preparadas nove diluições em série 2 vezes em DMSO. Dez μl de cada diluição em DMSO são transferidos para 100 μl de meio, bem misturados e então 5 μl desta diluição são transferidos em quadruplicata a cavidades que contêm células. A alta concentração final de cada composto é tipicamente de 5 μΜ. As placas são retornadas para a incubadora durante três dias.

Na ocasião da adição de fármaco às placas experimentais, o ensaio MTS é realizado na placa de "tempo 0". Isto produziu o "valor de MTS no tempo 0" que está relacionado ao número de células viáveis por cavidade na ocasião da adição do fármaco.

Depois de três dias de cultura com compostos do teste (dia 5 no total), o ensaio MTS é feito em todas as cavidades das placas experimen- tais. Encontrou-se a média dos valores de absorbância da amostra em qua- druplicata e dividiu-se pela média dos valores de "tempo 0". A média de ca- vidades de controle sem fármaco, dividida pelo valor da média do "tempo 0" vale, fornece o aumento relativo máximo em rendimento de cor de MTS de- vido ao crescimento da célula durante os três dias finais de cultura. A média de cavidades de controle com alta concentração de fármaco, dividida pelo valor do "tempo 0", fornece o rendimento mínimo relativo de cor para as cé- lulas que estão completamente mortas. Os nove valores para cada compos- to são comparados graficamente contra a concentração e a concentração que produz um rendimento de cor relativa na metade do valor entre o valor máximo e mínimo é considerado como o valor de IC5o- Os compostos mais potentes têm os menores valores de IC50.

3. Procedimento do Teste Farmacolóqico Padronizado de Polimerização da Tubulina

São realizadas duas variações deste procedimento, uma que usa a tubulina rica em MAP e uma que usa a tubulina pura.

A tubulina rica em MAP é dissolvida em tampão PEM gelado que contém GTP 1 mM (tampão GPEM) a uma concentração de 1,3 mg/mL. A solução é centrifugada a uma velocidade de topo em uma microcentrífuga Eppendorf model 5415C (Brinkmann Instruments, Westbury, NY) durante 10 minutos a 4°C imediatamente antes do uso. A solução de tubulina é adiciona- da às cavidades de uma placa de 96 cavidades de 1/2 área (Costar N9. 3696, Corning, Inc., Corning, NY) que já contém os compostos de interesse. Cada composto é testado em duplicata a uma concentração final de 0,3 μΜ em um volume de 110 μL por cavidade. A concentração final de DMSO em todas as cavidades é de 0,3%. São feitas reações de controle em quadruplicata, que receberam composto solvente apenas. A placa é colocada em uma leitora de placa SpectraMax Plus (Molecular Devices Corp. Sunnyvale, CA) termostata- da a 24°C e a absorbância de cada cavidade a 340 nm, uma medida do apa- recimento de turbidez devido à formação de polímero de tubulina, é determi- nada todo minuto durante 60 minutos. A absorbância no tempo 0 para cada cavidade é subtraída de cada uma das leituras de absorbância subseqüentes para aquela cavidade e então determinada a média das duplicatas. O procedimento com tubulina pura é similar exceto para as vari- ações a seguir. A tubulina pura é dissolvida em tampão PEM gelado que contém 10% de glicerol e nenhum GTP adicionado a uma concentração de 1,5 até 1,8 mg/mL (15 até 18 μΜ). O sobrenadante depois da centrifugação é distribuído para uma placa de 96 cavidades que já contém os compostos. Cada composto é testado em duplicata em seis diluições de 3 vezes partindo a 24,3 μΜ. A leitora de placa é termostatada a 35°C.

4. Procedimento do Teste Farmacolóqico Padronizado de Ligação Competi- tiva

A ligação dos exemplos desta invenção à tubulina altamente purificada é estudada por métodos competitivos de inibição. O heterodímero de αβ-tubulina contém sítios de ligação para as três principais classes de agentes farmacológicos microtúbulo ativos: taxanos, agentes do sítio vin- ca/peptídeo e agentes do sítio de colquicina. Para estudar a competição possível nos sítios de vinca/peptídeo e nos sítios de colquicina, são feitas incubações sob condições que não favorecem a polimerização porque a vin- blastina e a colquicina se ligam preferencialmente ao heterodímero não po- limerizado. Para estudar a possível competição no sítio do taxano, por outro lado, é usada a tubulin polimerizada (microtúbulos) porque o paclitaxel se liga preferencialmente aos microtúbulos.

A tubulina altamente purificada é dissolvida em tampão PEM sem GTP e usada a uma concentração final de 1,0 até 1,3 mg/ml (10 a 13 μΜ). Á solução de tubulina são adicionadas várias concentrações de exem- plos desta invenção até uma mais alta concentração de 100 μΜ e [3H] vin- blastina ou [3H] colquicina nas concentrações finais de 100 nM ou de 50 nM, respectivamente. Estas soluções são incubadas a 24°C durante 1 hora e então aplicadas a colunas MicroSpin G-50 que são centrifugadas durante 2 minutos a 3000 rpm em uma microcentrífuga Eppendorf 5415C. Uma alíquo- ta de cada efluente da coluna (que contém tubulina e radioligante ligado) é misturado com fluido de cintilação e contado em um espectrômetro de cinti- lação no líquido. Os controles incluíam amostras sem competidor e amostras com vincristina, colquicina ou paclitaxel sem ser etiquetadas. A capacidade de o competidor inibir a ligação do radioligante é expressa como uma per- centagem de ligação de controle na ausência de qualquer competidor.

Para competição com [3H] paclitaxel, a tubulina altamente purifi- cada é dissolvida em tampão PEM que contém glutamato 0,75 M e didesóxi- GTP 25 μΜ; a concentração final da proteína é de 0,25 até 0,35 mg/mL (2,5 até 3,5 μΜ). Estas condições estimularm a rápida formação de polímeros de microtúbulo curtos, estáveis (Hamel, E., dei Campo, A.A. e Lin, C.M. Stability of tubulin polymersformed with dideoxyguanosine nucleotides in the presen- ce and absence of microtubule-associated proteins. J. Biol. Chem., 259: 2501-2508, 1984). Esta solução é incubada durante 30 minutos a 37 0C para permitir que se formem microtúbulos. Então [3H] paclitaxel (concentração final de 2,1 μΜ, 1,2 Ci/mmol) e competidor (concentração final de 20 μΜ, exceto 5 μΜ paclitaxel não etiquetado) são adicionados a alíquotas da solu- ção de tubulina polimerizada e a incubação a 37 0C continua durante mais 30 minutos. Os controles incluíam amostras sem competidor e amostras com vincristina, colquicina ou paclitaxel não etiquetadas. As reações são então centrifugadas à velocidade de topo em uma microcentrífuga Eppendorf 5415C durante 20 minutos à temperatura ambiente para pelotizar a proteína do microtúbulo. As alíquotas em triplicata de cada sobrenadante são mistu- radas com fluido com cintilação e contadas em um espectrômetro de cintila- • ção no fluido. Pela quantidade de radioatividade nos sobrenadantes e a ra- dioatividade de partida total medida, é calculada a quantidade de [3H] pacli- taxel ligado à proteína do microtúbulo pelotizada. A capacidade de cada competidor para inibir ligação de radioligante à proteína pelotizada é expres- sa como uma percentagem de controles em competidor algum.

5. Procedimento do Teste Farmacolóqico Padronizado de Análise de Ciclo da Célula

Células HeLa são colhidas por tripsinização, lavadas, contadas e distribuídas a cavidades de placas de 12 cavidades a 125.000 células por cavidade em 2 mL de meio. As células são cultivadas durante toda a noite. As diluições do composto são feitas em DMSO e são adicionadas alíquotas de 10 μΙ_ a cada cavidade para produzir as concentrações finais desejadas. As células continuam em cultura durante 18 horas depois da adição do com- posto, então são colhidas as células em cada cavidade (tomando cuidado para recuperar tanto as células aderentes e não aderentes) e processadas usando o kit CycIeTEST PLUS® (Becton Dickinson Immunocytometry Sys- tems, San Jose, CA). Citrometria de Fluxo é feita com um instrumento FAC- Sort® (Becton Dickinson).

6. Procedimento do Teste Farmacológico Padronizado da Atividade Antitu- mor em Camundongos Atímicos que Apresentam Xenoenxertos de Tumor Humano

A capacidade de os compostos desta invenção inibirem o cres- cimento de tumor em animais é estudada no teste farmacológico padroniza- do de xenoenxerto em camundongos atímicos. Camundongos fêmeas nu/nu cruzados com uma estrutura genética albina são obtidos de Charles River Laboratories (Wilmington, MA). Os animais são injetados subcutaneamente no flanco com a suspensão de célula de tumor desejada. Vários dias depois, os camundongos com tumores de aproximadamente 150 mm3 são selecio- nados entre aqueles injetados (classificados) e distribuídos aleatoriamente em grupos de 5 - 10. O dia da classificação é denominado dia 0. Os com- postos da invenção, habitualmente formulados em solução salina (as exce- ções são observadas nas tabelas), são administrados aos animais por inje- ção intravenosa ou ingestão oral forçada em várias programações iniciando no dia O ou 1, Como observados nas tabelas. O grupo de controle em cada experimento é dosado com veículo no mesmo protocolo. O tamanho do tu- mor é medido a cada 3 - 7 dias com calibres em duas dimensões ortogonais e o volume do tumor é calculado pela fórmula: volume = [(comprimento χ largura2) 12].

Tumor/Controle (T/C) é obtido dividindo-se o volume médio do tumor do grupo tratado pelo volume médio do tumor do grupo de controle em cada dia de medida. Uma dose de tratamento é definida como ativa se for produzida uma T/C estatisticamente significativa de 0,50 ou menor. Um valor de ρ ^ 0,05, determinado por um teste de estudante de um lado é necessário para significado estatístico. Uma dose de tratamento é definida como tóxica se mais do que 10% dos animais morreram de uma toxicidade relacionada ao composto.

Resultados

1. Procedimento do Teste Farmacológico Padronizado de Citotoxicidde

1.1 Com Células COLO 205

COLO 205 é uma linhagem de célula de carcinoma de cólon humano que é usada para testagem comparativa dos exemplos desta inven- ção e diversos compostos de referência. Esta linhagem é sensível a paclita- xel e vincristina. Foi descoberto que o composto de Fórmula (Ia), por exem- plo, tem um valor de IC5o de 1,9 micromolar em cada uma de duas titiulações separadas. No mesmo ensaio, foi descoberto que o sal de ácido succínico da 5-cloro-6-{2, 6-diflúor-4-[3-(metilamino) propóxi] fenil}-N-[(1S)-2, 2, 2- triflúor-1 -metiletil] [1, 2, 4] triazol [1, 5-a] pirimidin-7-amina tem uma IC50 de 17,5 nanomolar e a IC50 de paclitaxel era de 3.3 + 1,0 nanomolar (média + SD) em 20 ensaios independentes, de acordo com os valores da literatura. 1.2 Com Células KB. KB-8-5 e KB-V1

As linhagens KB expressam diferentes quantidades da bomba de membrana de P-glicoproteína (MDR1) que produz resistência à ação de muitos compostos citotóxicos, inclusive paclitaxel e vincristina. A linhagem de KB parental não expressa P-glicoproteína, KB-8-5 expressa níveis mode- rados da proteína e KB-V1 expressa níveis muito altos. A capacidade da P- glicoproteína de reconhecer e exportar um agente citotóxido potencial pode ser deduzida da variação nos valores de IC50 sobre estas linhagens (Logan- zo, F., Discafani, C.M., Annable, T., Beyer, C., Musto, S., Hari1 M., Tan, X., Hardy, C., Hernandez, R., Baxter, M., Singanallore, T., Khafizova, G., Poru- chynsky, M.S., Fojo, T., Nieman, J.A., Ayral-Kaloustian, S., Zask, A., Ander- sen, R.J. e Greenberger, L.M. HTI-286, a synthetic analogue of the tripeptide hemiasterlin, is a potent antiimicrotubule agent that circumvents P- glycoprotein-mediated resistance in vitro and in vivo. Câncer Res., 63: 1838- 1845, 2003). Se um composto for reconhecido por P-glicoproteína, o seu valor de IC50 irá aumentar substancialmente (diversas centenas de vezes) indo de KB até KB-8-5 até KB-V1; se um composto não for reconhecido, ele terá valores de IC50 similares (3 vezes ou menos de diferença) em todas as três linhagens. Por exemplo, como apresentado na Tabela 2, as células KB- 8-5 são moderadamente resistentes a paclitaxel (19 vezes), vincristina (11 vezes), colquicina (3,4 vezes) e doxorrubicina (3,0 vezes). Exemplos repre- sentativos desta invenção (N-s. 1, 2a, 4a, 20, 25, 30, 32) apresentam uma variação menor do que 2 vezes em valores de IC50·

Mesmo interações leves de compostos com P-glicoproteína po- dem ser determinadas com a linhagem KB-V1, que expressa um nível desta proteína mais alto do que é tipicamente encontrado em amostras clínicas de uma variedade de tumores (Goldstein, L.J., Galski, H., Fojo, T., Willingham, M., Lai1 S.L., Gazdar, A., Pirker, R., Green, A., Crist, W., Brodeur, G.M., Lie- ber, M., Cossman, J., Gottesman, M.M. e Pastan, I. Expression of a multi- drug resistance gene in human cells. J. Natl. Câncer Inst. (Bethesda), 81: 116-124, 1989). As células KB-V1 são altamente resistentes a paclitaxel (> 345 vezes), vincristina (> 156 vezes), colquicina (116 vezes), mitoxantrona (77 vezes) e doxorrubicina (> 130 vezes). Exemplos representativos desta invenção apresentarão uma variação menor do que 3 vezes em IC50 compa- rada à linhagem KB parental. Isto indica que estes compostos não são reco- nhecidos por P-glicoproteína e, portanto, que estes compostos vencem completamente a resistência mediada com a P-glicoproteína para a elimina- ção da célula.

1.3. (Com Células HL-60 e HL-60/ADR)

Células HL-60/ADR superexpressam a proteína da resistência a multifármaco MRP1 que sen/e de mediadora para a resistência a alguns quimioterápicos (Gottesman, M.M., Fojo, T. e Bates, S.E. Multidrug resistan- ce in câncer: role of ATP-dependent transporters. Nature Rev. Câncer, 2: 48- 58, 2002). Os valores de IC50 de exemplos representativos desta invenção, assim como compostos de referência, em HL-60/ADR estão comparados aos valores sobre a linhagem HL-60 parental sensível. Os resultados irão indicar que os compostos desta invenção não são reconhecidos por MRP1 e, portanto, vencem a resistência celular mediada por este transportador. 1.4 Com Células S1 e S1-M1 Células S1-M1 superexpressam o transportador MXR que serve de mediador para a resistência a alguns quimioterápicos (Gottesman, M.M., Fojo, T. e Bates, S.E. Miltidrug resistance in câncer: role of ATP-dependent transporters. Nature Rev. Câncer, 2: 48-58, 2002). Os valores de IC50 de compostos representativos desta invenção, assim como compostos de refe- rência, sobre S1-M1 são comparados aos valores sobre a linhagem S1 pa- rental sensível. Se as células não apresentarem resistência, isto indica que os compostos não são reconhecidos por MXR e, portanto, vencem a resis- tência celular mediada por este transportador.

2. Efeitos de Compostos sobre a Polimerizacão de tubulina rica em MAP e Pura in vitro

Neste ensaio, as reações de controle com a tubulina rica em MAP apresentam um perfil de absorbância de formato S caracterizado por três fases: primeiro, uma fase Iag durante a qual não ocorre variação na ab- sorbância; segundo, uma fase de polimerização em que a absorbância au- menta e terceiro uma fase de patamar em que a absorbância atingiu um má- ximo e ocorre pouca ou nenhuma mudança. Os melhoradores de polimeriza- ção tais como paclitaxel e docetaxel abreviam ou eliminam a, aumentam a velocidade da fase de polimerização e freqüentemente aumentam a altura do patamar. Os inibidores de polimerização tais como vincristina e colquicina reduzem ou evitam o aumento da absorbância. Os compostos desta inven- ção têm um efeito semelhante ao taxano sobre a reação de polimerização.

A tubulina. pura sem adição de GTP não apresenta polimerização nas reações de controle. O docetaxel e até uma extensão muito menor, o pacli- taxei, são capazes de induzir a polimerização da tubulina pura sob estas condi- ções. Diversos exemplos desta invenção também irão induzir a polimerização da tubulina pura sem GTP de uma maneira similar ao docetaxel.

3. Ligação de Compostos à Tubulina

O sítio sobre a tubulina do cérebro bovino altamente purificado ao qual se ligam os compostos desta invenção é determinado por estudos de inibição competitiva com os ligantes radioativos [3H] vinblastina, [3H] col- quicina e [3H] paclitaxel. Se os compostos testados inibirem a ligação de [3H] vinblastina ao heterodímero tubulina, porém não inibem a ligação de [3H] colquicina a heterodímero de tubulina ou de [3H] paclitaxel aos microtúbulos, isto é forte evidência de que estes compostos se ligam no sítio de vin- ca/peptídeo de tubulina e não nos sítios de colquicina ou de taxano. Se os compostos testados melhoram a ligação de [3H] colquicina acima do nível de controle, ele sugere que a ligação destes compostos ao sítio de vin- ca/peptídeo pode induzir uma mudança conformacional na molécula de pro- teína que resulta em ligação melhorada da colquicina. Esta variação parece não ser induzida pela própria vincristina. Se os compostos testados não re- duzirem a ligação de [3H] paclitaxel aos microtúbulos, isto indica que eles nem competem com [3H] paclitaxel para ligação nem despolimerizam os mi- crotúbulos aos quais se liga o [3H] paclitaxel.

4. Efeitos dos Compostos sobre o Ciclo de Progressão da Célula

Este procedimento mede as percentagens de células em uma população que está nas fases G1, S e G2/M fases do ciclo da célula. Ele utiliza o ato de corar os núcleos da célula com iodeto de propídio e análise por citometria do fluxo. O procedimento também fornece uma estimativa de apoptose causada por tratamento com fármaco por medida do aparecimento de partículas com subquantidades G1 de DNA. A altas concentrações (isto é, concentrações de IC50 mais altas do que aproximadamente 5 X) os com- postos ativos de microtúbulo caracteristicamente interrompem as células na fase G2/M do ciclo da célula por causa da interrupção dos microtúbulos que compreendem o eixo mitótico. No entanto, a concentrações mais baixas (va- lores de IC50 próximos) em algumas linhagens de células, por exemplo, He- La, taxanos tais como paclitaxel e docetaxel induzem apoptose substancial antes de ser observado um bloco G2/M (Jordan, M.A., Wendell, K., Gardiner, S., Derry, W.B., Copp, H. e Wilson, L. Mitotic block induced in HeLa cells by low concentrations of paclitaxel (TaxoI) results in abnormal mitotic exit and apoptotic cell death. Câncer Res., 56: 816-825, 1996); este não é o caso com despolimerizadores de microtúbulo tais como vincristina e colquicina. Exemplos representativos desta invenção são testados neste procedimento depois de 18 horas de cultura com células a múltiplas concentrações para observar se eles seguiram o padrão de "estabilizador" (taxano) ou de "de- sestabilizador" (vincristina, colquicina). Os compostos dentro do âmbito da invenção irão seguir o padrão de "estabilizador".

5. Atividade In Vivo Anti-tumor dos Compostos

Foram feitos alguns experimentos com xenoenxertos de tumor humano em camundongos atímicos para avaliar a capacidade de os com- postos desta invenção inibirem o crescimento do tumor in vivo.

Os compostos da invenção podem ser testados em relação a xenoenxertos de melanoma LOX1 carcinoma do cólon DLD1, xenoenxertos de glioblastoma U-87 MG, carcinoma do pulmão A549 e xenoenxertos de carcinoma do cólon LoVo.

Os compostos desta invenção apresentam potente atividade citotóxica contra múltiplas linhagens de células de câncer humano em cultu- ra, inclusive linhagens que são resistentes a paclitaxel e vincristina por cau- sa da superexpressão de transportador de fármaco. Os compostos da inven- ção melhoram a velocidade inicial da polimerização da tubulina rica em MAP, de uma maneira remanescente de taxanos e distinta dos efeitos inibi- dores de despolimerizadores tais como vinca alcalóides e colquicina. Os compostos da invenção também induzem a polimerização da tubulina pura na ausência de GTP. Os compostos desta invenção também induzem a a- poptose em células alvo a baixas concentrações (em torno de valores de IC50 citotóxica) sem o bloco do ciclo da célula, uma outra propriedade que é característica de taxanos porém não vincas ou colquicina. Os compostos representativos da invenção inibem o crescimento de diversos xenoenxertos de tumor humano em camundongos atímicos, inclusive tumores resistentes a taxanos e vinca alcalóides.

EXEMPLO

O exemplo a seguir é útil para a preparação de um exemplo re- presentativo não limitador de um composto desta invenção, que é útil como um promotor de polimerização de microtúbulo e como um agente anticâncer.

Exemplo 1

Ácido S-N-(3-{4-[5-Cloro-7-(2, 2, 2-triflúor-1-metil-etilamino)-[1, 2, 4] triazol [1, 5-a] pirimidin-e-ill-S.õ-diflúor-fenóxi-propil)-N-metil-succinâ- mico (Composto 1)

A mistura de 5-cloro-6-{2, 6-diflúor-4-[3-(metilamino) propóxi] fenil}-N-[(1 S)-2, 2, 2-triflúor-1-metiletil] [1,2,4] triazol [1, 5-a] pirimidin-7-aminà (10,0 g, 21,5 mmols) e anidrido succínico (2,58 g, 25,8 mmols) em THF (50 mL) é agitada durante 1 hora. O solvente é removido por destilação a um resíduo e o resíduo é dissolvido em NaOH (1 N1 100 mL). A solução é filtra- da através de um bloco de CELITE® 545. O filtrado é resfriado até 10 - 15 °C e HCI (3N, ~ 32 mL) é adicionado gota-a-gota até que o pH atingisse 3 - 4. A mistura é agitada durante 30 minutos a 0 - 5 °C. O sólido é filtrado, Ia- vado com água fria (2 χ 20 mL) e seco por fluxo de ar para fornecer um pro- duto sólido do Composto 1 (11,1 g, 92%).

Claims (59)

1. Composto de Fórmula (I): <formula>formula see original document page 41</formula> em que R1 é <formula>formula see original document page 41</formula> ou um-(C6 - C8) cicloalquila opcionalmente substituído com R8; η é um número inteiro de 2, 3 ou 4; X é -Cl, -F ou -Br; Y é -O-, -S-, -CH2- ou -NR4-; L1 e L2 são cada um independentemente -H1 -F, -Cl, -Br, ou -CF3; R3 é -CF3 ou -C2F5; R4, R5 e R6 são cada um independentemente -H ou -(C1- C3)-alquila; R7 é -ZR9 em que Z é -CO-, -NO-, -SO2- ou -PO2H- e R9 é -H, -OH, -(C1-C5) -alquila ou -(C2-C5)-alquenila, a dita alquila ou alquenila op- cionalmente substituída com um ou mais de -O-, halogênio, -OH, -NH2 ou um grupo cicloalquila de cinco ou seis elementos saturado, parcialmente sa- turado ou insaturado em que um a três dos átomos de carbono no anel são opcionalmente substituídos com um átomo de N, O, ou S e o dito grupo ci- cloalquila é substituído com Um-CH3, -OH ou halogênio e R8 é (C1-C3) -alquila ou sais farmaceuticamente aceitáveis ou estereoisômeros dos mesmos.

2. Composto de acordo com a reivindicação 1, em que R6 é - (C1-C3) alquila.

3. Composto de acordo com a' reivindicação 2, em que R6 é -CH3.

4. Composto de acordo com a reivindicação 1, 2 ou 3, em que R7 é -ZR9, em que Z é -CO- ou -NO- e R9 é -C1-C5 alquila, opcionalmente substituído com um ou mais de O, halogênio, -OH, -NH2, ou um grupo ciclo- alquila de cinco ou seis elementos saturado, parcialmente saturado ou insa- turado em que um a três dos átomos de carbono no anel são opcionalmente independentemente substituídos com um átomo de Ν, O ou S e o dito grupo cicloalquila é opcionalmente substituído com um -CH3, -OH ou halogênio.

5. Composto de acordo com a reivindicação 4, em que Z é -C0-.

6. Composto de acordo com a reivindicação 5, em que R9 é - (CH2)2COOH ou - (CH)2COOH.

7. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, em que R1 é <formula>formula see original document page 42</formula>

8. Composto de acordo com a reivindicação 7, em que R3 é -CF3 e R5 é -C1-C3 alquila.

9. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, em que L1 e L2 são cada um independentemente -F, -CI ou -Br.

10.Composto de acordo com a reivindicação 9, em que L1 e L2 são, cada um, -F.

11. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, em que Y é O.

12. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, em que η é 3.

13. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, em que X é -Cl.

14. Composto de acordo com a reivindicação 1, em que o com- posto de Fórmula (I) é <formula>formula see original document page 42</formula>

15. Composto de acordo com a reivindicação 1, em que o com- posto de Fórmula (I) é <formula>formula see original document page 43</formula>

16. Composto de acordo com a reivindicação 1, em que o com- posto de Fórmula (I) é <formula>formula see original document page 43</formula> e r é um número inteiro de 0 a 5, inclusive.

17. Composto de Fórmula (II): <formula>formula see original document page 43</formula> em que ou um - (C6 - Ce) -cicloalquila opcionalmente substituído com R8; η é um número inteiro de 2, 3 ou 4; X é -Cl, -F ou -Br; Y é-O-,-S-,-CH2-ou-NR4-; L1 e L2 são cada um independentemente -H, -F, -Cl, -Br ou -CF3; R3 é -CF3 ou -C2F5; R21 R4, R51 R6 e R9 são cada um independentemente -H ou -(C1- C3) alquila; R8 é C1-C3 alquila, ou sais farmaceuticamente aceitáveis ou estereoisômeros dos mesmos.

18. Composto de acordo com a reivindicação 17, em que R6 é -C1-C3 alquila.

19. Composto de acordo com a reivindicação 18, em que R6 é -CH3.

20. Composto de acordo com as reivindicações 17, 18 ou 19, em que R2 é -H.

21. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações -17 a 20, em que R2 é -(C1-C3) alquila.

22. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações -17 a 21, em que R1 é <formula>formula see original document page 44</formula>

23. Composto de acordo com a reivindicação 22, em que R3 é -CF3 e R5 é -C1-C3 alquila.

24. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações -17 a 23, em que L1 e L2 são cada um independentemente -F, -Cl, ou -Br.

25. Composto de acordo com a reivindicação 24, em que L1 e L2 são -F.

26. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações -17 a 25, em que Y é-O-.

27. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações -17 a 26, em que η é 3.

28. Composto de acordo com as reivindicações 17 a 27, em que X é -Cl.

29. Composto de acordo com a reivindicação 17, em que o com- posto de Fórmula (II) é

30. Composto de acordo com a reivindicação 17, em que o com- posto de Fórmula (II) é <formula>formula see original document page 44</formula>

31. Processo de tratar ou inibir o crescimento de células de tu- mor canceroso e doenças associadas em um mamífero que necessite que o mesmo compreenda administrar uma quantidade eficaz de composto de Fórmula (I) como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 16, ou de um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo a um mamífero que necessi- te do mesmo.

32. Processo de promover polimerização de tubulina em um sis- tema que contém tubulina que compreende o contato do dito sistema que contém tubulina com uma quantidade eficaz de composto de Fórmula (I) como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 16, ou de um sal far- maceuticamente aceitável do mesmo.

33. Processo de estabilização de microtúbulos em um sistema que contém tubulina com uma quantidade eficaz de composto de Fórmula (I) como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 16, ou de um sal far- maceuticamente aceitável do mesmo.

34. Processo para o tratamento ou a prevenção de tumores can- cerosos que expressam múltipla resistência a fármacos (MDR) ou são resis- tentes por causa da MDR1 em um mamífero que necessite as mesmas cujo processo compreende administrar ao dito mamífero uma quantidade eficaz de composto de Fórmula (I) como definido em qualquer uma das reivindica- ções 1 a 16, ou de um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

35. Processo para o tratamento, inibição do crescimento de ou erradicação de um tumor em um mamífero que necessite o mesmo em que o -1 dito tumor é resistente a pelo menos um agente quimioterápico, cujo proces- so compreende fornecer ao dito mamífero uma quantidade eficaz de com- posto de Fórmula (I) como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a -16, de um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

36. Composição farmacêutica que compreende uma quantidade farmaceuticamente aceitável de composto de Fórmula (I) como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 13, ou de um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo e um veículo farmaceuticamente aceitável do mesmo.

37. Composição farmacêutica que compreende uma quantidade farmaceuticamente aceitável de composto de Fórmula (I) como definido na reivindicação 14, 15 ou 16, ou de um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo e um veículo farmaceuticamente aceitável do mesmo.

38. Composição farmacêutica que compreende uma quantidade farmaceuticamente aceitável de composto de Fórmula (II) como definido em qualquer uma das reivindicações de 17 a 28, ou de um sal farmaceuticamen- te aceitável do mesmo e um veículo farmaceuticamente aceitável do mesmo.

39. Composição farmacêutica que compreende uma quantidade farmaceuticamente aceitável de composto de Fórmula (II) como definido na reivindicação 29, ou de um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo e um veículo farmaceuticamente aceitável do mesmo.

40. Composição farmacêutica que compreende uma quantidade farmaceuticamente aceitável de composto de Fórmula (II) como definido na reivindicação 30, ou de um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo e um veículo farmaceuticamente aceitável do mesmo.

41. Processo de tratamento ou de inibição do crescimento de células de tumor canceroso e doenças associadas em um mamífero que ne- cessite o mesmo que compreende administrar uma quantidade eficaz de composto de Fórmula (II) como definido em qualquer uma das reivindicações -17 a 30, ou de um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo a um mamífe- ro que necessite o mesmo.

42. Processo de promover polimerização de tubulina em um sis- tema que contém tubulina que compreende o contato do dito sistema que contém tubulina com uma quantidade eficaz de composto de Fórmula (II) como definido em qualquer uma das reivindicações 17 a 30, ou de um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

43. Processo de estabilização de microtúbulos em um sistema que contém tubulina que compreende o contato do dito sistema que contém tubulina com uma quantidade eficaz de composto de Fórmula (II) como defi- nido em qualquer uma das reivindicações 17 a 30, ou de um sal farmaceuti- camente aceitável do mesmo.

44. Processo para o tratamento ou a prevenção de tumores can- cerosos que expressam múltipla resistência a fármacos (MDR) ou são resis- tentes por causa da MDR, em um mamífero que necessite os mesmos, cujo processo compreende administrar ao dito mamífero uma quantidade eficaz de composto de Fórmula (II) como definido em qualquer uma das reivindica- ções 17 a 30, ou de um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

45. Processo de tratamento, de inibição do crescimento ou de erradicação de um tumor em um mamífero que necessite o mesmo em que o dito tumor é resistente a pelo menos um agente quimioterápico, cujo proces- so compreende fornecer ao dito mamífero uma quantidade eficaz de com- posto de Fórmula (II) como definido em qualquer uma das reivindicações 17 a 30, ou de um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

46. Processo de acordo com a reivindicação 31, em que o dito mamífero é um ser humano.

47. Processo de acordo com a reivindicação 34, em que o dito mamífero é um ser humano.

48. Processo de acordo com a reivindicação 35, em que o dito mamífero é um ser humano.

49. Processo de acordo com a reivindicação 41, em que o dito mamífero é um ser humano.

50. Processo de acordo com a reivindicação 44, em que o dito mamífero é um ser humano.

51. Processo de acordo com a reivindicação 45, em que o dito mamífero é um ser humano.

52. Uso de um composto como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 16 ou 17 a 30, para a fabricação de um medicamento pa- ra tratar ou inibir o crescimento de células de tumor canceroso e doenças associadas em um mamífero.

53. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 37, que também compreende o composto de Fórmula (II) como a seguir: <formula>formula see original document page 47</formula> em que R1 é <formula>formula see original document page 48</formula> ou um (C6-C8) -cicloalquila opcionalmente substituído com R8; n é um número inteiro de 2, 3 ou 4; Xé-Cl,-F ou-Br; Y é -O-, -S-, -CH2- ou -NR4-; L1 e L2 são cada um independentemente -H, -F, -Cl, -Br, ou -CF3; R3 é -CF3 ou -C2F5; R2, R4, R5 R6 e R9 são cada um independentemente -H ou -(C1- C3) alquila; R8 é C1-C3 alquila, ou sais farmaceuticamente aceitáveis ou estereoiômeros da mes- ma.

54. Processo de tratamento ou inibição do crescimento de célu- las de tumor canceroso e doenças associadas em um mamífero que neces- site o mesmo que compreende administrar uma quantidade eficaz de uma composição como definida na reivindicação 53, a um mamífero que necessi- te o mesmo.

55. Processo de promover a polimerização de tubulina em um sistema que contém tubulina que compreende o contato do dito sistema que contém tubulina com uma quantidade eficaz de composto de Fórmula (II) como definido na reivindicação 53, a um mamífero que necessite o mesmo.

56. Processo de estabilização de microtúbulos em um sistema que contém tubulina que compreende o contato do dito sistema que contém tubulina com uma quantidade eficaz de composto de Fórmula (II) como defi- nido na reivindicação 53, a um mamífero que necessite o mesmo.

57. Processo para o tratamento ou a prevenção de tumores que expressam múltipla resistência a fármacos (MDR) ou são resistente por cau- sa da MDR, em um mamífero que necessite os mesmos, cujo processo com- preende administrar ao dito mamífero uma quantidade eficaz de composto de Fórmula (II) como definido na reivindicação 53, a um mamífero que ne- cessite o mesmo.

58. Processo para o tratamento, inibição do crescimento de ou erradicação de um tumor em um mamífero que necessite o mesmo em que o dito tumor é resistente a pelo menos um agente quimioterápico, cujo proces- so compreende fornecer ao dito mamífero uma quantidade eficaz de com- posto de Fórmula (II) como definido na reivindicação 53, a um mamífero que necessite o mesmo.

59. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações -54, 57 e 58, em que o dito mamífero é um ser humano.