BRPI0618672A2 - bactérias e composições pró-apoptóticas para a distribuição e a expressão de antìgenos - Google Patents

Abstract

BACTéRIAS E COMPOSIçõES PRó-APOPTóTICAS PARA A DISTRIBUIçãO E A EXPRESSãO DE ANTìGENOS. A presente invenção se refere a vacinas de células inteiras e a métodos para acentuar a imunogenicidade de microorganismos celulares para uso na produção de reações imunológicas protetoras em hospedeiros vertebrados subseqúentemente expostos a bactérias patogênicas, ou para uso como vetores para expressar antígenos exógenos e induzir reações contra outros agentes infecciosos ou células de câncer. A presente invenção envolve um método adicional de acentuar a apresentação de antigenos por bactérias intracelulares de uma maneira que melhore a eficácia da vacina. Após a identificação de uma enzima que possua um efeito anti-apoptótico sobre células hospedeiras infectadas por um micróbio intracelular, a atividade da enzima produzida pelo micróbio intracelular é reduzida através da expressão de uma cópia mutante da enzima, desta forma modificando o micróbio para que a imunogenicidade seja aumentada.

Description

RELATÓRIO DESCRITIVO

Pedido de Patente de Invenção para "BACTÉRIAS E COMPOSIÇÕES PRÓ-APOPTÓTICAS PARA A DISTRIBUIÇÃO E A EXPRESSÃO DE ANTÍGENOS"

Referência a Pedidos de Patente Relacionados

Este pedido de patente reivindica o benefício do Pedido de Patente Provisório No. US 60/737,525, depositado em 15 de novembro de 2005, e que é aqui incorporado por referência.

Declaração de Suporte Governamental

Esta invenção foi feita com suporte governamental nos termos da NIH Grant AI51561, e parte do trabalho envolveu o uso de unidades de pesquisa no Department of Veteran's Affair Medicai Centers. O Governo dos E.U.A. pode possuir certos direitos sobre esta invenção.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

Campo da Invenção

A presente invenção se refere ao campo da vacinação, incluindo a indução de fortes reações imunológicas e a prevenção e o tratamento de doenças infecciosas e do câncer. Especificamente, a presente invenção se refere a métodos para: acentuar a imunogenicidade de uma bactéria pela expressão de mutantes dominantes negativos de superóxido desmutase, glutamina sintase, e outras enzimas anti-apoptóticas. Ela se refere ainda a métodos para produzir uma vacina segura e eficaz e a métodos para acentuar uma reação imunológica eficaz em animais Hospedeiros subseqüentemente expostos à infecção por patógenos bacterianos como, por exemplo, o Mycobacterium tuberculosis. As vacinas imunogênicas construídas pela utilização desses métodos podem também ser vetores para expressar antígenos exógenos e utilizadas para induzir uma reação imunológica contra agentes infecciosos não relacionados e o câncer.

Fundamentos

As reações imunológicas adaptativas envolvendo linfócitos B- e T- são um importante componente de como o sistema imunológico protege o hospedeiro de infecções e do câncer. Há uma especialização na reação imunológica adaptativa com células e fatores diferentes conferindo proteção contra diferentes ameaças. Por exemplo, as reações imunológicas humorais são mediadas por células-B que amadurecem em células de plasma. Estas células podem produzir anticorpos neutralizantes que desativam toxinas microbianas (por ex., toxina da difteria, toxina da coqueluche). Os anticorpos são solúveis e podem exercer seu efeito ao longo de grandes distâncias. Em contraste, as células-T mediam reações imunológicas celulares que geralmente requerem um contato de célüla-em-célula, direto ou próximo.

Existem duas amplas categorias de células-T que intermediam as funções efetoras da reação imunológica adaptativa. Esses dois tipos de células-T são distinguíveis pelos antígenos de superfície e pela função (Seder, R. A. e outros, 2000). As células-T que exibem um antígeno de superfície CD4 incluem as "células auxiliares". Algumas células auxiliares produzem IFN-gama, que ativa macrófagos para produzir mais espécies de oxigênio reativo e dessa forma acentuar suas funções microbicidas. Outras células-T CD4+ produzem IL-2 e outras interleucinas que promovem a proliferação de populações de células-T da memória em células-T efetoras durante um combate subseqüente com um agente infeccioso. As células CD8+ exercem seu efeito protetor de diversas maneiras, incluindo a atividade de linfócitos-T citotóxicos (LTC) que resulta na Iise de células infectadas, ao matar bacilos intracelulares através da liberação da granulisina de peptídeo antimicrobiana, e através da produção de IFN-gama (Cho, S. e outros, 2000; Serbina, Ν. V. e outros, 2000; Silva, C. L. e outros, 1999).

A imunologia clássica ensina que os linfócitos CD4+ e os linfócitos CD 8+ são preparados para uma reação imunológica utilizando diferentes caminhos de apresentação de antígenos (Seder, R. A. e outros, 2000). Ao induzir reações que envolvem células-T CD4+, antígenos estranhos exógenos são trazidos ou resgatados de micróbios ingeridos dentro do fagossomo das células que apresentam os antígenos. Aí os antígenos são degradados em fragmentos por catepsinas e ligados na superfície dessas células em moléculas do MHC Classe II para apresentação às células-T CD+. Esse processo é chamado de caminho "exógeno" da apresentação de antígenos, uma vez que ele lida com antígenos que estavam originalmente fora da célula e ingeridos pela célula. As moléculas do MHC Classe Π são restringidas principalmente a alguns poucos tipos de leucócitos conhecidos como "células apresentadoras de antígenos", que inclui macrófagos e células dendríticas.

A ativação da célula-T CD 8+ é alcançada através de um mecanismo diferente, que envolve moléculas do MHC Classe I, que são encontradas essencialmente em todas as células nucleadas. As proteínas produzidas pela célula ou introduzidas dentro do citoplasma da célula nucleada são degradadas em peptídeos e apresentadas na superfície da célula no contexto das moléculas do MHC Classe I para as células-T CD8+. A apresentação de antígenos do MHC Classe I é geralmente referida como o caminho "endógeno", que lida com antígenos que vêm do citoplasma, tipicamente antígenos de vírus que infectam células.

O presente pedido revela métodos para reduzir a atividade de uma enzima microbiana anti-apoptótica. São também reveladas bactérias modificadas feitas de acordo com os métodos revelados que acentuam a imunogenicidade.

Síntese da Invenção

A presente invenção envolve um método de modificação de uma bactéria para acentuar a apresentação de antígenos de uma maneira que melhora a eficácia da vacina. A modificação de um organismo intracelular para expressar um fenótipo pró-apoptótico é fornecida.

Também, como a indução de fortes reações de células-T CD8+ tem sido de um modo geral difícil de conseguir com as estratégias de vacinação atuais, os presentes micróbios modificados oferecem uma maneira muito eficaz de acessar esse braço do sistema imunológico. O micróbio pode ser adicionalmente alterado pela adição de antígenos imunodominantes codificadores de DNA exógeno de outros micróbios patogênicos incluem vírus, bactérias, protozoários è fungos, ou com antígenos de câncer codificadores de DNA, e então utilizado para vacinar um animal hospedeiro. Portanto, a presente bactéria atenuada pode ser utilizada como um veículo de distribuição de vacina para apresentar antígenos para processamento pelos caminhos do MHC Classe I e do MHC Classe II. E por causa dos fortes sinais co-estimulantes induzidos por componentes microbianos no vetor da vacina que interagem com os receptores de células-T na célula hospedeira, isso direciona o sistema imunológico hospedeiro a reagir contra o antígeno exógeno ao invés de desenvolver tolerância imunológica. Além disso, a apresentação simultânea de antígenos pelos caminhos do MHC Classe I e do MHC Classe II por células dendríticas facilita o desenvolvimento de "auxílio" do CD4 para as reações de linfócitos-T citotóxicos do CD8, desta forma superando as limitações da apresentação de antígenos dos vetores atuais que foram projetados para acessar, ou o caminho exógeno (por ex., muitos vetores bacterianos, fagossomo-associados), ou o caminho endógeno (por ex., muitos vetores virais, citoplasma e proteassomo-associados) da apresentação de antígenos.

Breve Descrição dos Desenhos

A Fig. 1 mostra desenhos da superóxido dismutase co-fatorada com ferro da BCG/M tuberculosis. (A) Monômero da superóxido dismutase (SodA) mostrando as posições de aminoácidos removidos nos mutantes de SodA presentes. Outras remoções, adições e/ou substituições podem ser utilizadas para produzir mutantes de SodA negativo-dominantes adicionais. (B) mostra um tetrâmero de SodA com cada retângulo indicando a posição de dois íons de ferro de local ativo: As setas identificam as posições do ferro de local ativo e de E54 para o mesmo monômero. O desenho foi baixado do servidor web do National Center for Biotechnology Information (NCBI) (http://www.ncbi.nlm.nih. gov/entrez/query.fcfii?db=Structure&itool=toolbar) e modificado para ilustrar as características.

A Fig. 2 fornece um mapeamento (A) e características (B) do vetor pMP399 de integração cromossômica micobacteriana, e um mapeamento (C) e características do vetor plasmídeo pMP349 que expressa SodA ΔΗ28ΔΗ76 em BCG. O nome para o gene que codifica a superóxido dismutase co-fatorada com ferro em M. tuberculosis/BCG é sodA. Ele é expresso atrás de um promotor aceA (icl) passível de indução. A origem de replicação E. coli (oriE) permite que o plasmídeo se replique na E. coli. O gene de resistência à apramicina (aacC41) e os vetores pMP399 e pMP349 foram desenvolvidos por Consaul e Pavelka (Consaul, S. A. e outros, 2004). O gene de resistência à apramicina pode ser substituído por um gene de resistência antibiótica diferente, ou o vetor pode conter um gene bio-sintético que complemente a auxotrofia de aminoácidos na linhagem baçteriana, desse modo permitindo o crescimento em meios que careçam do fator essencial (por ex., o aminoácido) a ser utilizado como um marcador selecionável para a identificação de recombinantes bem sucedidos.

A Fig. 3 mostra a atividade da SOD em sobrenadantes e lisatos de BCG que expressam SodA (ΔΗ28ΔΗ76) comparada à atividade da SOD da linhagem BCG mãe. (A) e (B) mostram os resultados de dois experimentos diferentes. O ensaio é realizado utilizando-se diluições de 2 vezes de sobrenadante ie lisato, e monitorando-se a quantidade de citocromo C reduzido em um ponto fixo do tempo. Uma unidade de atividade da SOD inibe a redução de citocromo C em 50% (da máxima inibição medida). A diluição que inibe a redução de citocromo C em 50% (valor IC50) para cada preparação é indicada por setas. A SodA é segregada por BCG e sendo assim a atividade da SOD do sobrenadante de BCG é maior do que a atividade da SOD do lisato de BCG.

A Fig. 4 mostra a atividade da SOD em sobrenadantes e lisatos de BCG que expressam SodA mutante (ΔΕ54) comparada à atividade da SOD da linhagem BCG mãe.

A Fig. 5 mostra a eficácia comparativa de vacinas BCG versus SD- BCG-AS-SOD. As linhagens da SD-BCG (BCG com SodA diminuída) utilizadas nesses experimentos foram construídas utilizando-se técnicas anti-senso (ver WO 02/062298 intitulada "Pro-apoptotic bacterial vaccines to enhance cellular immune responses", aqui incorporada como referência por seus ensinamentos sobre a redução anti-senso na atividade da SOD), e exibem aproximadamente 1 % da atividade da SOD das linhagens BCG mães. Camoundongos C57B1/6 foram vacinados IV com BCG ou SD-BCG-AS-SOD, descansaram por 7 meses, e então foram desafiados por aerossol com 30 ufc de uma acriflavina-R mutante da linhagem Erdman virulenta da M. tuberculosis. 14 semanas após o desafio, os camundongos não-vacinados e vacinados com BCG mostraram áreas de foco de inflamação pulmonar parencimal densamente celular (seção representativa mostrada em A, x2 e x10). Em contraste, os camundongos vacinados com SD- BCG tinham áreas menos densamente celulares de envolvimento pulmonar (B, x2 e x 10). Vistas de potência mais elevada de B (C) mostram células espumantes com fragmentos nucleares sugerindo a ingestão de detritos apoptóticos em um alvéolo (painel esquerdo) e células gigantes multinucleadas (painel direito). Ao tempo da colheita final seis meses após o desafio, as contagens de ufc da Erdman foram mais baixas em recipientes de SD-BCG comparados aos recipientes de BCG (D). A linha dentro da caixa do gráfico representa a média, as bordas da caixa indicam o 25° e o 75° percentuais, e as linhas protuberantes representam o 9o e o 10° percentuais. A diferença entre os grupos foi estatisticamente significativa (P = 0,04, teste-t com duas amostras). Também nesse tempo, as médias de peso dos camundongos em cada grupo foram de 28,3 e 31,0 gramas, BCG (8 sobreviventes dentre os 12 camundongos originais, 4 sacrificados por problemas na pele) e SD-BCG (10 sobreviventes), respectivamente, P = 0,04, teste-t de duas amostras. Assim, a redução da produção de SodA pela BCG acentuou a sua eficácia como uma vacina.

A Fig. 6 mostra que a vacinação com SD-BCG-AS-SOD altera as reações de célülas-T de memória nos pulmões de camundongos após o exame por aerossol com M. tuberculosis virulenta. Os camundongos foram vacinados com 2 χ IO6 ufc por via subcutânea, com BCG, SD-BCG-AS-SOD, ou com solução salina tampão fosfato (não-vacinados), descansaram por 100 dias, e então foram desafiados com 300 ufc de Erdman por aerossol. Os valores representam o número de células que expressam os antígenos de superfície indicados (coluna esquerda) recuperados do pulmão direito de camundongos 4, 10 e 18 dias pós- desafio. Ambos os pulmões foram colhidos dos camundongos de controle. O grupo BCG-vacinado inclui camundongos que receberam BCG ou C-BCG. Os recipientes da SD-BCG exibiram números maiores de células CD44+/CD45RBhigh ao dia 4 pós-infecção. Estas células foram maiores do que outras populações de células-T por espalhamento direto e podem representar células que passam por expansão clonal. No 18o dia, maiores números de células- T efetoras CD4+ terminalmente-diferenciadas (CD44+/CD45RBneg)foram observados nos recipientes da SB-BCG do que nos da BCG. *P=0,02; J P<0,05, BCG versus SD-BCG, teste-t de duas amostras.

A Fig. 7 mostra a formação acelerada de lesões de Ghon em camundongos vacinados com SD-BCG-AS-SOD após desafio de aerossol com 300 ufc de um mutante acriflavina-R da linhagem Erdman virulenta da M tuberculosis. Fotomicrográfícos de baixa (x2) e de alta (x20) potência de pulmões esquerdos no dia 18 pós-desafio são mostrados. Entre o dia 10 e o dia 18 pós-desafio, os vacinados com SD-BCG desenvolveram numerosos pequenos agregados focais de células no parênquima pulmonar (painéis direitos). Tais mudanças entre os dias 10 e 18 foram menos aparentes em camundongos vacinados com BCG, e não foram observadas nos camundongos não-vacinados. Os agrupamentos de células focais em camundongos SD-BCG diferiam em aparência das áreas de inflamação granulomatosa nos camundongos vacinados com BCG, mostrando mais células mononucleares grandes com citoplasma pálido e mudanças espumosas primárias, com freqüência contendo fragmentos nucleares sugestivos de detritos de células apoptóticos.

A Fig. 8 mostra o mapa (A) e as características (B) do vetor que foi utilizado para inativar o sigH no cromossomo da BCG e construir a SIG-BCG (BCGAsigH).

A Figura 9 mostra contagens de ufc nos pulmões 6 meses após o desafio com aerossol. Camundongos foram testados por 100 dias após vacinação subcutânea com BCG ou BCGAsigH e então desafiados com 300 ufc de um mutante de acriflavina-R da linhagem Erdman virulenta da M. tuberculosis. A linha dentro dà caixa do gráfico representa a média, as bordas da caixa indicam o 25° e o 75° percentuais, e as linhas protuberantes representam o 9o e o 10° percentuais. A diferença entre os grupos foi estatisticamente significativa (P = 0,019, teste-t com duas amostras).

A Fig. 10 mostra fotomicrográfícos de seções pulmonares de camundongos: vacinados com placebo (solução salina), BCG, ou com BCGAsigH 6 meses pós-desafio com 300 ufc de um mutante de acriflavina-R da linhagem Erdman virulenta da M. tuberculosis. Os pulmões de dois camungondos de cada grupo foram inflados com formalina tamponada 10% e incrustados em parafina. Três fotomicrográfícos de baixa potência cobrindo aproximadamente 80% das seções de tecido pulmonar que aparecem na tela do microscópio são mostrados no e mostram pulmões menos doentes nos camundongos vacinados com BCG△sigH. As caixas indicam as regiões mostradas em ampliação de alta potência na Fig. 11.

A Fig. 11 mostra a formação e a evolução de lesões de Ghon (setas) em 22 dias, 2 meses, e 6 meses pós-desafio de aerossol em camundongos com 300 ufc de um mutante de acriflavina-R da linhagem Erdman virulenta da M. tuberculosis. Camundongos foram vacinados com placebo (solução salina), BCG, ou com BCGAsigH, subcutaneamente, e descansaram por 100 dias antes do desafio com aerossol. As lesões de Ghon se desenvolveram mais cedo nos camundongos: vacinados com BCGAsigH e evoluíram com menos inflamação granulomatosa, desse modo resultando em um dano mínimo aos pulmões. Em comparação, áreas de densa infiltração parenquimal por linfócitos e macrófagos se desenvolveram nos pulmões dos camundongos não-vacinados e nos BCG- vacinados. Os fotomicrográficos de 6 meses correspondem às regiões encaixotadas na Fig. 10.

A Fig. 12 mostra etapas seqüenciais na ativação imunológica, e mostra como antioxidantes microbianos podem interferir com a ativação da reação imunológica em seus primeiros estágios. A redução da atividade dos antioxidantes microbianos favorece a apoptose e outras funções imunológicas durante a vacinação. Isto leva a fortes reações de células-T de memória e à proteção acentuada.

A Fig. 13 mostra uma estratégia para combinar remoções de genes e mutações dóminante-negativas em múltiplos genes para dar progressivamente linhagens BCG pro-apoptóticas mais potentes para o uso como vacinas contra a tuberculose e como vetores para expressar antígenos exógenos. As linhagens de vacina pro-apoptóticas são construídas utilizando-se uma abordagem "de gerações", em que a Ia geração envolve a modificação da BCG para incluir uma única inativação de genes ou expressão de enzimas dóminante-negativas, a 2a geração combina duas modificações, a 3a geração combina três modificações, e a 4a geração combina quatro modificações.

A Fig. 14 mostra a atividade da SOD em sobrenadantes e lisatos da SIG-BCG e da SAD-SIG-BCG. A SIG-BCG (também chamada de "BCG com sigH removida", ou "BCG△sigH") é denominada BCGdSigH nesta figura. A SAD-SIG-BCG (também chamada de "BCGksigH [mut sodAJ" é denominada BCGdSigH H28H76 (painéis A e B) ou BCGdSigH E54 (painel C), dependendo de qual mutante dominante-negativo foi testado. "Sobre" é uma abreviação para sobrenadante.O ensaio é realizado utilizando-se diluições de 2-vezes em série de sobrenadante e lisato e monitorando-se a quantidade de citocromo C reduzida em um ponto fixo do tempo. Uma unidade de atividade de SOD inibe a redução de citocromo C -em 50% (da inibição máxima medida). A diluição que inibe a redução de citocromo C em 50% (valor IC50) para cada preparação é indicado por setas.

A Fig. 15 mostra resultados de hibridização Southern que verificam a construção da BCG-RD ("BCG de remoção dupla"), referida como "BCGAsigHAsecA2 ". O DNA cromossômico de quatro isolados foi digerido com DraIII, aplicado às colunas 1 a 4, e então hibridizado com sondas genéticas. As sondas genéticas foram direcionadas contra secA2, sigH, e hygR (o gene codificador de uma fita de resistência à higromicina utilizada na inativação por inserção do sigH). O gene de resistência à higromicina (hygR) tinha um local de restrição interno previsto para dar fragmentos 2,92 e 1,67 kb quando um evento de cruzamento duplo ("double-crossover ") entre o vetor e o cromossomo tivesse eliminado o sigH e portanto providenciado uma garantia adicional de sucesso (além da ausência de uma faixa de sigH). A seqüência de eventos na construção da BCG-RD incluía as seguintes etapas: Começando com a linhagem BCG Tice (Coluna 1), o gene secA2 na BCG Tice foi inativado através de métodos previamente utilizados para inativar o secA2 em uma linhagem de M. tuberculosis virulenta (Braunstein, M. e outros, 2002; Braunstein, M. e outros, 2003, aqui incorporados como referências por seus ensinamentos sobre métodos para inativar secA2), desse modo produzindo BCGAsecA2 (Coluna 2). O vetor de inativação alélica mostrado na Fig. 8 foi utilizado para inativar o sigH na BCG para dar BCGAsigH (Coluna 3) e também para remover o sigH na BCGAsecA2, desse modo dando BCGAsigHAsecA2 (Coluna 4, BCG-RD).

A Fig. 16 mostra a atividade de SOD em lisatos de BCG com sigH- secA2 removidos (BCGAsigHAsecA2, também chamada de BCG de remoção dupla ["BCGrRD"]) e linhagens da BCG-RD que expressam SodA mutante (ΔΕ54) ou SodA mutante (ΔΗ28ΔΗ76). Esses exemplos de linhagens 3D-BCG envolvem os ^vetores derivados do pMP399 e têm um sodA mutante inserido dentro do cromossomo (da BCG-RD). O painel (A) mostra resultados para os sobrenadantes e lisatos. Os sobrenadantes exibem menos atividade de SOD do que os lisatos por causa da inativação do secA2, que codifica o canal de segregação para a SodA e a catálise. Os panéis BaD mostram os resultados de atividades de SOD de três experimentos separados envolvendo lisatos preparados em dias diferentes utilizando-se culturas independentes de cada isolado. O ensaio é realizado utilizando-se diluições seriais de 2-vezes de sobrenadante e lisato, e monitorando-se a quantidade de citocromo C reduzida em um ponto fixo do tempo. A diluição em que se inibe a redução de citocromo C em 50% (valor IC50) para cada preparação é indicada por setas.

A Fig. 17 mostra SDS-PAGE e hibridização Western de lisatos da BCG-RD (coluna 3), 3D-BCGmutSodA(AE54) (coluna 4), e 3D-BCG- mutSodA(AH28AH76) (coluna 5). Esses exemplos de linhagens 3D-BCG têm um sodA mutante inserido dentro do cromossomo da BCG-RD. O gel de hibridização Western mostra quantidades comparáveis de SodA em lisatos da BCG-RD e em duas construções da 3D-BCG. Lisatos não-diluídos para o PAGE e o Western foram preparados como descrito nos métodos para os exemplos (abaixo). ASB = albumina de soro bovino, um componente proeminente em meios molhados. A SOD da E. coli (coluna 2) não reage com o anticorpo contra a SodA da M. tuberculosis. Os lisatos não-diluídos aplicados a esses géis são os mesmos lisados utilizados nos ensaios de atividade da SOD mostrados na Fig. 16D. Assim, embora a atividade da SOD seja marcantemente reduzida pela expressão dos genes sodA mutantes, as quantidades de proteína de SodA como mostradas no1 PAGE e no Western parecem comparáveis. Esses dados são congruentes com um efeito "dominante-negativo" causado pela expressão da SodA mutante.

A Fig. 18 mostra uma figura do anel hexamérico glnAl compreendido por seis monômeros. A figura foi baixada do servidor da web da NCBI:

(http://www.ncbi.nlm.nih. gov/entrez/querv.fcgi?db=Structure&itool=toolbar") e modificada para ilustrar recursos. Os monômeros glnAl formam dodecâmeros que compreendem dois anéis hexaméricos. Os quadrados indicam a posição dos locais ativos, que estão localizados entre monômeros adjacentes e são compreendidos por íons de manganês e loops catalíticos de monômeros adjacentes. Os aminoácidos removidos no glnAl mutante incluem um ácido aspártico no aminoácido 54 e ácido glutâmico no aminoácido 335 (GlnAl∆D54∆E335), que estão no local ativo e correspondem aos D50 e G327 da glutamina sintase da Salmonella.

A Fig. 19 fornece o mapa (A) e as características (B) do vetor plasmídeo pHV203-mut glnAl ΔD54ΔΕ335 que expressa a glnAl mutante dominante-negativo na BCG.

A Fig. 20 fornece o mapa (A) e as características (B) do vetor plasmídeo pMP349, e um mapa (C) e as características (D) do vetor de integração crdmossômica bacteriano pMP399 que expressa a SodA ΔΗ28ΔΗ76 e a glnA1∆AD54∆E335 na BCG.

A Fig. 21 mostra um exemplo de expressão de antígenos exógenos pela BCG pró-apoptótica. SDS-PAGE (painel superior) e hibridização Western (painel inferior) com um anticorpo anti-BLS verificam a expressão de lumazina sintase de Brucella recombinante (rLSB) por BCG-RD, que é vista como uma faixa de 18 KDa na coluna 5 sob condições de indução. A rLSB foi clonada atrás de um promotor aceA (icl). ASB = albumina de soro bovino, que estava presente em ambas as culturas, outras faixas nas colunas 4 a 6 representam proteínas de BCG-RD Oui da r-LSB. As colunas 5 e 6 representam a BCG-RDrLSB desenvolvida sob condições que induzem (+, adição de acetato) e que suprimem (-, adição de sucinato) o promotor aceA (icl) e portanto a produção de rLSB.

A Fig. 22 mostra o mapa (A) e as características (B) do vetor utilizado para inativar tioredoxina (trxC) e tioredoxina redutase (trxB2) no cromossomo da BCG.

A Fig. 23 mostra o mapa (A) e as características (B) do vetor utilizado para substituir os alelos do tipo selvagem para a tioredoxina (trxC) e tioredoxina redutase (trxB2) no cromossomo da BCG com alelos mutantes nos quais seis aminoácidos de cada enzima que correspondem aos locais ativos foram eliminados.

A Fig. 24 mostra o mapa (A) e as características (B) do vetor para inativar o sigE no cromossomo da BCG.

A Fig. 25 mostra a atividade de glutamina sintetase reduzida em linhagens de BCG modificadas que expressam o mutante Δ054ΔΕ335 dominante negativo da gínAl descrita no Exemplo 8. O Painel (A) mostra SDS-PAGE (em cima) e gráfico de hibridização Western (em baixo) de lisatos (L) da BCG, 3D- BCG e 4D-BCG, assim como lisatos parcialmente purificados em seguida à precipitação de sulfato de amônio (SA). A 4D-BCG foi construída por eletroporação do plasmídeo pHV203-mutGlnA 1 Δϋ54ΔΕ3 3 5 (Tabela 1) na 3D- BCG. O monômero GlnAl migra entre os marcadores de 50 e de 37 KDa e mostra quantidades comparáveis da GlnAl produzidas pela BCG, 3D-BCG, e 4D-BCG. O Painel (B) mostra a atividade de glutamina sintase nos lisatos tratados com AS da 3D-BCG e da 4D-BCG, representando as mesmas preparações de SA mostradas em (A). A reação foi seguida espectrofotometricamente pela monitoração da absorção ao longo do tempo. Lisato SA 3D-BCG: o, não diluído; □, diluição de 2-vezes; Δ, diluição de A- vezes; 0, diluição de 8-vezes. Lisato SA 3D-BCG: ·, não diluído; diluição de 2-vezes. Apesar das quantidades comparáveis de proteína da GlnAl como mostrado em -(A), a atividade enzimática mal foi detectada na 4D-BCG com a preparação de 4D-BCG não-diluída exibindo atividade comparável a uma diluição de 8-vezes da preparação de 3D-BCG. Isso demonstra que a expressão do monômero Δϋ54ΔΕ335 exerce um efeito dominante-negativo sobre a atividade enzimática. O Painel (C) mostra um ensaio de atividade enzimática de repetição envolvendo duas preparações de cultura da versão do pHV203- mutGlnA 1 Δϋ54ΔΕ335 da 4D-BCG. Adicionalmente, a versão do pMP399 da 4D-BCG não atinge uma redução tão potente da atividade de glutamina sintetase como o faz a versão da pHV203, provavelmentem em associação com um efeito de número dè cópias da expressão do mutante Δϋ54ΔΕ335 GlnAl a partir do cromossomo (isto é, uma cópia) versus um plasmídeo de múltiplas cópias, respectivamente. A Fig. 26 mostra a produção de IFN-γ e de IL-2 por células-T CD4+ em seguida à vacinação com vacinas BCG e paBCG. (A) O percentual de células-T CD4+ dos baços de camundongos C57B1/6 que produzem IFN-γ e IL- 2 foi posto em um gráfico em função dos dias após a vacinação IV com BCG, BCG-RD, 3DtBCG e 4D-BCG. Cada ponto de dados em cada painel representa um único camundongo e mostra o % de esplenócitos de CD4+ que produzem IFN-γ ou IL-2 após um re-estímulo em macrófagos não-infectados. A área sombreada mostra o valor médio ± 2 desvios padrões para esplenócitos de camundongos; vacinados com PBS (solução salina com tampão fosfato) analisado de forma semelhante, indicando muito pouca complementação com os ensaios de IFN-γ e uma complementação relativamente maior com IL-2. (B) Resumo do % INF-γ+ e % IL-2+ células-T CD4+ de camundongos vacinados com BCG versus paBCG, utilizando-se apenas o subconjunto de camundongos que tinha um valor de INF-γ > 0^5%. Isso eliminou resultados de camundongos colhidos antes do início da reação de células-T primária, assim como os resultados de recipientes das vacinas mais avançadas, 3D-BCG e 4D-BCG, em que a produção de citocina decaiu rapidamente quase até os valores de parâmetro em seguida à proliferação primária (painel A), mas então foi rapidamente relembrada durante a re-infecção (ver Fig. 27). Ds gráficos de dot mostram valores médios, de 25 a 75 percentuais, e de 10 a 90 percentuais (linhas protuberantes). Embora a BCG tipicamente tenha induzido mais produção de INF-γ, os valores de IL-2 foram significativamente mais altos em camundongos vacinados com as vacinas paBCG, P = 0,0024.

A Fig. 27 mostra reações de células-T à vacinação com BCG, BCG-RD e 3D-BCG no dia 25 e no dia 31 pós-vacinação. A produção de citocina BCG específica por esplenócitos de camundongos vacinados 25 e 31 dias antes. A dose da vacina foi de 5 χ IO5 ufc administradas por via intravenosa. Os esplenócitos foram incubados até o dia seguinte em macrófagos derivados da medula óssea não infectados tratados com IFN-γ (MDMOs) ou em MDMOs infectados com BCG tratados com IFN-γ. As células-T foram então avaliadas por citometria de fluxo para a produção de INF-gama e IL-2 por técnicas de marcação de citocina intracelular. O percentual de células-T CD4+ e CD8+ produtoras de IFN-γ e produtoras de IL-2 é mostrado dentro das áreas encaixotadas.; A produção de citocina foi determinada pelos valores não- estimulados (macrófagos não infectados). Obervação: Ao contrário dos dados mostrados na: Fig. 26A, os valores % mostrados aqui representam o % da população total de CD4 sem substrair o valor padrão (MDMOs não-infectados) do valor dos MDMOs infectados com BCG após o re-estímulo. Os dados brutos dessa análise foram convertidos para que fossem incorporados na Fig. 26A. Por exemplo, os pontos 0,73% (0,86-0,13) e 1,47% (1,52-0,5) para a produção de IFN-γ nos dia$ 25 e 31, respectivamente, e -0,3% (0,15-0,18) e 0,18% (0,28-0,10) para IL-2, respectivamente, são provenientes desse experimento.

A Fig. 28 mostra reações de células-T (de memória) secundárias em camundongos BCG-vacinados e camundongos 3DBCG-vacinados 5 dias pós- desafio intratraqueal com 4x10 ufc de BCG. Os camundongos foram vacinados subcutaneamente com 5 χ IO5 ufc da linhagem de vacina 3 meses antes e em 4 a 8 semanas pós-vacinação foram tratados com INH e rifampina para eliminar a linhagem de vacina. A produção de antígeno específico de IFN-γ foi de 1,35% (1,58-0,23) e 0,85% (2,09-1,24%) em dois camundongos vacinados com BCG, versus 7,88% (8,09-0,21) e 3,85% (4,09-00,24) em dois camundongos vacinados com 3DBCG. A co-produção de IFN-γ e IL-2 foi de 0,29% (0,29-0,0) e 0,10% (0,15-0,03) nos camundongos com BCG versus 2,01% (2,02-0,01) e 1,09% (1,15-0,06) em camundongos com 3DBCG.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO Deve-se notar que, como utilizadas no relatório e nas reivindicações anexas, as formas singulares "um", "uma" e "o", "a" incluem seus correspondentes plurais a não ser que o contexto indique claramente o contrário. Assim, por exemplo, a referência a "uma enzima" inclui múltiplas cópias da enzima, e podè incluir também mais de uma espécie particular de enzima.

Um método de modificação de um micróbio para acentuar a imunogenicidade do micróbio é fornecido, compreendendo a redução da atividade de uma enzima anti-apoptótica produzida pelo micróbio através da superexpressão de uma enzima mutante dominante-negativa e/ou a inativação de um gene regulador que controla a produção de enzimas anti-apoptóticas, onde a bactéria possui imunogenicidade acentuada em um sujeito. O mutante dominante-negativo de SodA ou de glutamina sintetase é uma enzima mutante que, quando expressa pela bactéria, reduz a SOD ou a glutamina sintetase total da bactéria. As bactérias modificadas podem conter também uma mutação em um gene regulador que reduza sua atividade ou que o desative. Como utilizada aqui, uma mutação que causa atividade reduzida (uma mutação de redução de atividade) abrange uma mutação de inativação. Assim, é também fornecido um micróbio intracelular, modificado para reduzir a atividade de uma enzima anti- apoptótica do micróbio.

A invenção também fornece um método de modificação de um micróbio atenuado para acentuar a imunogenicidade do micróbio atenuado, compreendendo a redução da atividade de uma enzima anti-apoptótica produzida pelo micróbio atenuado através da superexpressão de uma enzima mutante dominante-negativa de um gene regulador que controla a produção de enzimas anti-apoptóticàs, onde a bactéria atenuada acentua a imunogenicidade em um sujeito. Portanto, é também fornecido um micróbio intracelular atenuado, adicionalmente modificado para reduzir a atividade de uma enzima anti- apoptótica do micróbio.

Como assinalado acima, o micróbio pode ser qualquer micróbio descrito aqui. O micróbio pode ser um patógeno intracelular ou um patógeno intracelular obrigado. O micróbio atenuado pelos presentes métodos pode ser uma bactéria, um protozoário, vírus ou fungo. Quando o micróbio é uma bactéria, a báctéria pode ser, mas não se limita a, por exemplo, uma espécie Mycobacterium. Exemplos de espécies de Mycobacterium incluem, mas não se limitam a, M. tubereulosis, BCG da linhagem M. bovis incluindo sub-linhagens da BCG, M Avium, M. intraeellulare, M. afrieanum, M. kansasii, M. marinum, M. uleerans e M. paratubereulosis. Ele pode ser também uma espécie Noeardia, incluindo a Noeardia asteroides ou a Noeardia fareiniea. A construção de mutantes com SOD diminuída dessas espécies pode tanto alcançar a atenuação como também conferir a qualidade pro-apoptótica que acentua o desenvolvimento de fortes reações imunológicas celulares de uma maneira análoga à vacina BCG com SOD diminuída atual, uma vez que a secreção de SOD de ferro-manganês é um atributo comum e distinto de muitas das espécies patogênicas de mycobacterias (Raynaud e outros, 1998) e Nocardia. Sendo assim, esperai-se que as vacinas com SOD diminuída dessas outras espécies mycobacterianas e da Nocardia também sejam linhagens de vacinação altamente eficazes. Exemplos de outras espécies bacterianas intracelulares obrigadas e facultativas previstas dentro da presente invenção incluem, mas não se limitam a, Legionella pneumophila, outras espécies Legionella, Salmonella typhi, outras espécies Salmonella, Shigella species, histeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Baeteroides fragilis, outras espécies Baeteroides, ; Chlamydia pneumoniae, Chlamydia traehomatis, Chlamydia psittaci, Coxiella burnetii, outras espécies Riekettsial, e as espécies Ehrliehia.

Além disso, as bactérias que causam doenças em gado, animais e bichos de estimação podem ser os alvos da presente invenção. Exemplos de patógenos bacterianos veterinários incluem, mas não se limitam a, Brueella abortus e outras espécies Brueella, Yersinia Pestis, Pasteurella haemolytiea, Pasteurella multocida e outras espécies Pasteurella, Actinobacillus pleuropneumonia, Cowdria ruminantium, Mycobaeterium avium subespécies paratubereulosis, e histeria ivanovii.

Outros micróbios intracelulares tais como protozoários e fungos que exercem um efeito anti-apoptótico sobre suas células hospedeiras são bem passíveis de se tornar tanto atenuados quanto pró-apoptóticos, e portanto úteis como linhagens de vacinas, quando a atividade de uma enzima microbiana que medie principalmente o efeito anti-apoptótico for reduzida. Sendo assim, a invenção oferece um método de modificação de um protozoário para acentuar a imunogenicidàde do protozoário, compreendendo a redução da atividade de uma enzima anti-apoptótica produzida pelo protozoário, onde o protozoário possui imunogenicidàde acentuada em um sujeito, e um método para modificar um fungo para aumentar a imunogenicidàde do fungo, compreendendo a redução da atividade de uma enzima anti-apoptótica produzida pelo fungo, onde o fungo possui imunogenicidàde acentuada em um sujeito. Exemplos de espécies de fungos e de protozoários contempladas dentro da presente invenção incluem, mas não se limitam a, Plasmodium faleiparum, outras espécies Plasmodium, Toxoplasma gondii, Pneumoeystis earinii, Trypanosoma eruzi, outras espécies tripanossômicas, Leishmania donovani, outras espécies Leishmania, Theileria annulata, outras espécies Theileria, Eimeria tenella, outras espécies Eimeria, Histoplasma çapsulatwn, Cryptococcus neoformans, Blastomyees dermatitidis, Coceidioides immitis, Paracoeeidioides brasiliensis, Penicillium marneffei e a espécie Candida. Foram descritos métodos para criar mutantes recombinantes e atenuados de espécies de protozoários e de leveduras, e são conhecidos por um técnico no assunto. Por exemplo, técnicas de transfecção e vetores para mutagênese de inserção e a expressão de antígenos heterólogos foram descritos em Toxoplasma gondii (Chiang e outros, 1999; Charest e outros, 2000). Uma vez que uma SOD co-fatorada com ferro do Toxoplasma gondii foi descrita (Odberg- Ferragut e outros, 2000), tais vetores e métodos podem ser utilizados para reduzir a sua produção, ou a de outra enzima anti-apoptótica, utilizando-se inativação alélica, técnicas com antisense, atenuação incrementai direcionada, ou uma abordagem dominante/negativa. De forma semelhante, as espécies Trypanosoma e Leishmania; são suscetíveis de transformação e integração cromossômica de DNA (Brooks e outros, 2000; Dumas e outros, 1997), desse modo permitindo manipulações; similares. Métodos para realizar manipulações genéticas em patógenos de fungo também se tornaram disponíveis recentemente (Retallack e outros, 1999; Woods, Heinecke e Goldman, 1998; Varma e Kwon-Chung, 2000; Enloe, Diamond e Mitchell, 2000; Wilson e outros, 2000). Um protozoário feito de acordo com o método da invenção é fornecido, assim como um fungo feito de acordo com o método da invenção.

Portanto, uma modalidade específica da invenção fornece uma vacina viva contra a tuberculose, derivada através da diminuição da atividade da superóxido dismutase (SOD) de ferro-manganês em uma linhagem da M tuberculosis ou do bacilo de Calmette-Guérin (BCG) pela superexpressão de uma enzima da SOD mutante dominante-negativa.

À invenção oferece um método de preparação de uma vacina microbiana, compreendendo a redução da atividade de uma enzima anti- apoptótica produzida pelo micróbio, onde a redução na atividade da enzima anti- apoptótica atenua o micróbio, e uma vacina microbiana é produzida. A invenção oferece um método de preparação de uma vacina microbiana, compreendendo a redução em um micróbio atenuado da atividade de uma enzima ariti-apoptótica produzida pelo micróbio, onde a vacina microbiana é produzida.

À presente invenção fornece uma composição que compreende um micróbio compreendendo uma enzima modificada pelos métodos da presente invenção. Á composição pode compreender também um portador farmaceuticamente aceitável ou um adjuvante adequado. Tal composição pode ser utilizada cpmo uma vacina.

A bactéria modificada pode incluir um mutante dominante-negativo selecionado a partir do grupo que consiste em: a) SodA em que uma remoção, inserção e/ou substituição de nucleotídeos no ácido nucléico de ocorrência natural codifica uma molécula que reduz a atividade da SOD do organismo; e b) glutamina sintase em que uma remoção, inserção e/ou substituição de nucleotídeos no ácido nucléico de ocorrência natural codifica uma molécula que reduz a atividade da glutamina sintase do organismo. Em uma modalidade, a bactéria modificada pode ser a BCG. Portanto, um BCG modificado para expressar uma atividade da SOD reduzida é fornecida.

A bactéria modificada pode compreender mais uma modificação pró-apoptótica. A modificação pró-apoptótica adicional pode compreender uma ou mais modificações selecionadas a partir do grupo que consiste na inativação de SigH, inativação de sigE, inativação de SecA2, inativação de tioredoxina, inativação de tioredoxina redutase e inativação de glutaredoxina. Portanto, um BCG modificado para expressar uma atividade da SOD reduzida e uma atividade inativa ou reduzida de SigH é fornecido. Um BCG modificado para expressar uma atividade da SOD reduzida, atividade reduzida ou inativa de SigH e atividade reduzida ou inativa de SigE é fornecido. Um BCG modificado para expressar uma atividade da SOD reduzida, atividade reduzida ou inativa de SigH ou uma atividade reduzida ou inativa de SigE é fornecida e a atividade de SecA2 reduzida ou inativa é também fornecida.

Exemplos específicos de bactérias modificadas são descritos nos exemplos e ná Tabela 1. Por exemplo, a bactéria modificada pode compreender um SodA mutante possuindo remoções de histidina na posição 28 e de histidina na posição 76, um SodA mutante possuindo uma remoção de histidina na posição 28 ou uma remoção de histidina na posição 76, um SodA mutante possuindo uma remoção de ácido glutâmico na posição 54, um SodA mutante possuindo uma remoção de ácido glutâmico na posição 54 e a substituição de histidina por arginina na posição 28. Em outros exemplos, a bactéria modificada pode compreender modificações selecionadas a partir do grupo que consiste em um mutante de SodA e uma mutação redutora de atividade de SigH; um mutante de SodA e uma mutação redutora de atividade de secA2; um mutante de SodA, uma mutação redutora de atividade de SigH e uma mutação redutora de atividade de secA2; e um mutante de SodA, um mutante dominante negativo de glnA1, uma mutação redutora de atividade de SigH e uma mutação redutora de atividade de secA2.

Como mais outros exemplos de bactéria modificada, a bactéria pode compreender uma mutação de glnAl selecionada a partir do grupo que consiste em remoções de ácido aspártico no aminoácido 54 e de um ácido glutâmico no iaminoácido 335; e uma remoção de ácido aspártico no aminoácido 54 ou de um ácido glutâmico no aminoácido 335. A bactéria com atividade de glnAl reduzida pode compreender ainda uma mutação redutora de atividade de secA2. A bactéria com atividade de glnAl reduzida pode compreender ainda um mutante dominante-negativo de SodA. Na bactéria com atividade de glnAl reduzida e um mutante dominante-negativo de SodA, o SodA mutante pode compreender remoções de histidina na posição 28 e de histidina na posição 76. A bactéria com atividade de glnA1 reduzida pode compreender ainda uma mutação redutora de atividade de sigH e uma mutação redutora de atividade de secA2. A bactéria com atividade de glnA1 reduzida pode compreender ainda um mutante dominante-negativo de SodA e uma mutação redutora de atividade de SigH. Na bactéria com atividade de glnA1 reduzida e um mutante dominante-negativo de SodA, a bactéria pode compreender ainda e uma mutação redutora de atividade de secA2. Métodos para preparar as bactérias descritas no relatório, na Tabela 1, nos Exemplos e Desenhos são fornecidos. A bactéria modificada da invenção pode compreender uma mutação redutora de atividade de sigH. A bactéria modificada pode compreender uma mutação redutora de atividade de sigH. e uma mutação redutora de atividade de secA2.

A presente invenção oferece adicionalmente um método de produção de uma reação imunológica em um sujeito através da administração ao sujeito de qualquer uma das composições desta invenção, incluindo uma composição que compreenda um portador farmaceuticamente aceitável e um micróbio que !compreenda uma enzima necessária para a viabilidade in vivo que tenha sido modificado de acordo com os métodos da invenção. A composição pode compreender ainda um adjuvante adequado, como discutido aqui. O sujeito pode ser um mamífero, e é preferivelmente um ser humano.

A presente invenção oferece um método de prevenção de uma doença infecciosa em um sujeito, compreendendo a administração ao sujeito de uma quantidade eficaz de uma composição da presente invenção. Além de prevenir doenças bacterianas como, por exemplo, a tuberculose, é previsto que a presente invenção possa prevenir doenças infecciosas da etiologia dos fungos, vírus e dos protozoários. O sujeito pode ser um mamífero, e é preferivelmente um ser humano.

É previsto que as composições desta invenção descritas acima possam ser administradas a um sujeito ou a uma célula de um sujeito para gerar um benefício terapêutico ou uma imunidade para prevenir infecções. Portanto, a presente invenção oferece ainda um método de produção de uma reação imunológica em uma célula imunológica de um sujeito, compreendendo o contato da célula com uma composição da presente invenção, compreendendo um micróbio êm que uma enzima necessária para a viabilidade in vivo tenha sido modificada por qualquer um dos métodos ensinados aqui. A célula pode ser in vivo ou ex vivo, e pode ser, mas não se limita a, uma célula apresentando um antígeno expressor do MHC I, tal como uma célula dendrítica, um macrófago ou um monócito. Como utilizado aqui em toda a parte, por um "sujeito" quer-se dizer um indivíduo. Portanto, o "sujeito" pode incluir animais domesticados, tais como gatos, cachorros, etc., gado (por ex., vacas, cavalos, porcos, ovelhas, cabras, etc.), animais de laboratório (por ex., camundongo, coelho, rato, porquinho da índia, etc.) e pássaros. Preferivelmente, o sujeito é um mamífero, tal como um primata, ou, mais preferivelmente, um ser humano.

À invenção, portanto, oferece um método de acentuação da imunogenicidade de uma bactéria atenuada, compreendendo a redução da atividade de uma enzima anti-apoptótica produzida pela bactéria, onde a bactéria possui imunogenicidade acentuada em um sujeito. A bactéria modificada pela redução da atividade de uma enzima anti-apoptótica pode ser selecionada a partir do grupo que consiste em M. tuberculosis, M. bovis, M. avium, M. intracellulare, M. africanum, M. kansasii, M. marinum, M. ulcerans, M. paratuberculosis, Legionella pneumophila, outras espécies Legionella, Salmonella typhi, outras espécies Salmonella, espécie Shigella, Listeria monocytogenes, Nocardio asteroides, histeria ivanovii, Brucella abortus, outras espécies Brucella, e Cowdria ruminantium. Por exemplo, linhagens vivas atenuadas de Salmonella podem ser adicionalmente modificadas utilizando-se esta invenção para acentuar sua imunogenicidade e aumentar sua utilidade como vacinas contra infecções de Salmonella, e para acentuar sua capacidade de induzir reações imunológicas celulares protetoras para antígenos heterólogos, incluindo os antígenos de outros organismos infecciosos e antígenos de câncer.

É fornecido um método para facilitar a apresentação de antígenos através da construção de vacinas pro-apoptóticas feitas pela redução da produção de enzimas anti-apoptóticas microbianas, incluindo a SOD, tioredoxina, tioredoxina rédutase, glutamina sintetase, e outras enzimas relacionadas a redox, tais como a glutationa redutase (glutaredoxina), outras proteínas semelhantes à tioredoxina, outras proteínas semelhantes à tioredoxina redutase, outras proteínas semelhantes à glutaredoxina, outras tiol redutases, e outras dissulfeto oxiredutases de proteína. Muitas dessas enzimas são altamente conservadas em todas as formas de vida celular e muitas se confundem ou são idênticas às enzimas que desintoxicam intermediários de oxigênio reativos devido ao papel central das espécies de oxigênio reativas (EOR) como um gatilho para a apoptose. A premissa de se fazer vacinas pro-apoptóticas está relacionada à capacidade dá enzima do patógeno intracelular de bloquear a apoptose quando o patógeno estiver dentro da célula hospedeira, como é o caso com linhagens virulentas da M. tuberculosis (Balcewicz-Sablinska, Μ. K. e outros, 1998; Keane, J. e ostros, 2000). Por exemplo, o SodA produzido pela M. tuberculosis desintoxica o isuperóxido (O2 )5 que é um oxidante com efeitos biológicos pro- apoptóticos que é produzido pela fagócito oxidase (NADPH oxidase) de células imunológicas. Desta forma, ao reduzir a atividade do SodA e de outras enzimas microbianas que inativam os oxidantes produzidos por células imunológicas hospedeiras, :pode-se simultaneamente atenuar o micróbio e acentuar a apresentação de seus antígenos, enquanto as células dendríticas e outras células imunológicas processam os fagócitos apoptóticos (por ex., neutrófilos, monócitos e/ou macrófagos) que contêm antígenos microbianos.

Algumas enzimas microbianas anti-apoptóticas podem ser eliminadas ser afetar adversamente a habilidade de cultivar o micróbio como uma linhagem de' vacina, e, para tais enzimas, técnicas de genética molecular tradicionais podem ser utilizadas para construir o micróbio modificado. Contudo, algumas enzimas são absolutamente essenciais para a viabilidade do micróbio, de modo que elas não podem ser eliminadas totalmente. Para essas enzimas, técnicas de manipulação genética através das quais mutantes com uma redução parcial ao invés de completa na atividade da enzima anti-apoptótica são construídas. A superexpressão de RNA anti-senso (Coleman, J. e outros, 1984) é descrita em WO 02/062298 como uma dessas estratégias para construir linhagens mutantes com fenótipos parciais, e sua utilidade como uma ferramenta para buscar e identificar quais enzimas essenciais podem ser reduzidas para dar um fenótipo pro-ápoptótico foi também enfatizada.

A presente invenção delineia duas estratégias adicionais para alcançar uma redução parcial na atividade de enzimas microbianas anti- apoptóticas. A primeira estratégia envolve a superexpressão de mutantes dominantes-negativos da enzima. A segunda estratégia envolve a inativação alélica de um gene regulador que governe a expressão da enzima anti-apoptótica. Ambas as estratégias representam métodos adicionais para modificar de maneira estável um micróbio para obter um fenótipo parcial, nas quais o micróbio retém ou aumenta a imunogenicidade mas perde ou reduz a patogenicidade em um sujeito, compreendendo a redução, porém não a eliminação, da atividade de uma enzima produzida pelo micróbio, sendo que a redução da atividade da enzima atenua o micróbio ou atenua mais ainda o micróbio.

Os mutantes de enzima dominante-negativos podem compreender tanto mutações que levem a uma enzima modificada com atividade enzimática parcial como mutações que levem a uma enzima inerte completamente carente de atividade enzimática. Como o efeito da co-expressão da enzima mutante em uma célula que também expressa a enzima do tipo selvagem é tipicamente uma redução ao invés de uma completa eliminação, esta estratégia pode ser direcionada contra genes que sejam essenciais para a viabilidade do micróbio.

A estratégia de redução da atividade de enzimas anti-apoptóticas pela utilização de técnicas dominante-negativas pode ser empregada em linhagens bacterianas do tipo selvagem como um meio para tornar a linhagem parcialmente ou totalmente atenuada enquanto sua imunogenicidade é aumentada. Ela também pode ser aplicada a linhagens que já estejam atenuadas e/ou a linhagens de vacina atuais, por exemplo, para a imunogenicidade do Bacilo Calmette-Guerin (BCG), a atual vacina para a tuberculose.

Exemplos das construções fornecidas aqui e exemplos de construções utilizadas para preparar as presentes construções são fornecidos na Tabela 1.

Às composições da presente invenção podem ser administradas in vivo a um sujeito que precise delas por métodos empregados comumente para a administração de composições de um modo tal que ponha a composição em contato com a população de células. As composições da presente invenção podem ser administradas oralmente, parenteralmente, intramuscularmente, transdérmicamente, percutaneamente, subcutaneamente, extracorporalmente, topicamente, ou de outras formas, embora a administração oral ou a parenteral sejam tipicaniente preferidas. Elas também podem ser distribuídas através de introdução para dentro da circulação ou para dentro de cavidades corporais, por ingestão, ou por inalação. A linhagem de vacina é injetada ou distribuída de outra forma ao anirtial com um portador líquido farmaceuticamente aceitável, que seja aquoso ou parcialmente aquoso, compreendendo uma solução de água livre de pirogênios, salina, ou tamponada. Por exemplo, uma vacina de M. tuberculosis seria mais provavelmente administrada de forma semelhante aos métodos utilizados com a linhagem US Onco-BCG, percutaneamente, utilizando um disco de punção múltipla estéril.

A administração parenteral das composições da presente invenção, caso utilizada-, é geralmente caracterizada por injeção. Os injetáveis podem ser preparados em formas convencionais, seja como soluções ou suspensões líquidas, seja como formas sólidas adequadas para solução de suspensão em líquido antes da injeção, ou como emulsões. Como utilizado aqui, "administração parenteral" inclui as vias intradérmica, subcutânea, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, intra-articular e intratraqueal.

A dosagem da composição varia dependendo do peso, idade, sexo e método de administração. Em uma modalidade, a dosagem do composto é de 0,5 χ 10^2 unidades formadoras de colônia até 5 χ 10^7 unidades formadoras de colônia da linhagem microbiana viva-atenuada viável. Mais preferivelmente, o composto é administrado in vivo em uma quantidade de aproximadamente 1 χ 10^6 unidades formadoras de colônia até aproximadamente 5 χ 10^7 unidades formadoras de colônia da linhagem microbiana viva-atenuada viável. A dosagem pode também ser ajustada pelo médico individual conforme for com base nas circunstâncias particulares.

As composições podem ser administradas convencionalmente como vacinas que1 contenham a composição ativa como uma quantidade predeterminada de material ativo calculada para produzir o efeito terapêutico ou imunológico desejado em associação com o portador ou diluente farmaceuticamente aceitável (isto é, portador ou veículo). Por "farmaceuticamente aceitável", quer-se dizer um material que não seja indesejável biòlogicamente ou em outro aspecto, isto é, que o material possa ser administrado a um indivíduo junto com a composição selecionada sem causar quaisquer efeitos biológicos indesejáveis ou interagir de uma maneira prejudicial com qualquer um dos outros componentes da composição farmacêutica em que ele estiver contido. Embora os exemplos fornecidos abaixo envolvam modificações da BCG, a atual vacina contra a tuberculose, a invenção ensina como vacinas de outros patógenos intracelulares podem ser desenvolvidas através da expressão de mutantes dominantes-negativos de enzimas bacterianas anti-apoptóticas.

EXPRESSÃO DE MUTANTES DOMINANTE-NEGATIVOS DE ENZIMAS ANTI-APOPTÓTICAS MICROBIANAS

À utilidade principal de uma abordagem dominante-negativa em relação à inativação alélica para reduzir a atividade de uma enzina microbiana anti-apoptótica surge quando o gene parece ser essencial para a sobrevivência do micróbio in vitro apesar das tentativas de enriquecer o meio em que o microorganismo é cultivado. Nessas circunstâncias, a inativação alélica interferiria com o cultivo da bactéria mutante e o tornaria inadequado como uma linhagem de vacina, e um método para fazer com que um fenótipo parcial com atividade redúzida da enzima essencial que ainda permita que o micróbio se desenvolva é favorecido. As técnicas antisenso e a atenuação por incrementos direcionada foram previamente descritas em WO 02/062298, e podem ser utilizadas para reduzir a atividade de uma enzima microbiana essencial. A expressão de mutantes de enzima dominante-negativos representa uma estratégia alternativa que compartilha muitos dos métodos descritos para pôr em prática a atenuação por incrementos direcionada, mas difere em alguns aspectos importantes.

Etapa 1 - Identificação de Enzimas Microbianas Anti- apoptóticas

Métodos detalhados para identificar enzimas microbianas essenciais e ánti-apoptóticas foram descritos em WO 02/062298. Para verificar que a redução da atividade da enzima microbiana leva a um efeito pró- apoptótico, a apoptose na célula hospedeira pode ser monitorada utilizando-se técnicas de cultivo de células in vitro (por ex., macrófagos infectados) ou a recuperação de células ou tecidos de animais infectados in vivo. Existe um grande número de técnicas utilizadas para monitorar a apoptose, incluindo a citometria de fluxo, manchas de TÚNEL, e ensaios de fragmentação de DNA que são bem conhecidos pelos técnicos no assunto (Otsuki, Y. e outros, 2003; Steensma, D. P. e outros, 2003).

Existem duas diferenças importantes associadas à seleção de enzimas anti-ãpoptóticas para pôr em prática uma estratégia dominante negativa em comparação com a atenuação por incrementos direcionada. Primeiro, para a abordagem dominante-negativa é melhor selecionar enzimas com estruturas multiméricas conhecidas, enquanto que isso não é importante para praticar a atenuação por incrementos direcionada. Isto é assim porque naquela acredita-se que o mecanismo de atividade enzimática reduzida é mediado pela interferência de monômeros de enzima mutantes na formação do multímero enzimaticamente ativo, ou na alteração da configuração terciária que afeta adversamente a atividade enzimática. Um conjunto de publicações na literatura demonstra que diversas enzimas bacterianas que inativam oxidantes derivados de hospedeiros, e portanto têm provavelmente efeitos anti-apoptóticos, são multímeros em suas formas biologicamente ativas:

• A superóxido dismutase co-fatorada com ferro da M. tuberculosis/bovis/BCG é tetramérica (Cooper, J. B. e outros, 1995).

• Em geral, a tioredoxina parece ser biologicamente ativa como um monômero; contudo, pode haver exceções e a formação de dímeros descritas em algumas espécies bacterianas (Rehse, Ρ. H. e outros, 2005).

• A tioredoxina redutase forma homodímeros em espécies mamíferas (Zhong, L. e outros, 2000) e em alguns microorganismos incluindo espécies do Plasmodium (Wang, P. F. e outros, 1999).

A glutamina sintase é dodecamérica (Eisenberg, D. e outros; Gill, H. S. e oütros, 1999).

• A glutaredoxina bacteriana (glutationa redutase) é monomérica na forma reduzida porém dimérica na forma oxidada (Kelley, J. J., III e outros, 1997).

Portanto, com cada uma dessas enzimas, pode-se reduzir a atividade enzimática utilizando-se uma abordagem dominante-negativa como ensinada na presente invenção. A redução da atividade do SodA através da utilização de técnicas anti-senso conforme descritas em WO 02/062298 resulta em reações imunológicas mais fortes do hospedeiro e maior proteção induzida por vacina cóntra a infecção (Kernodle, D. e outros, 2005; Kernodle, D. S. e outros, 2001); A redução da atividade do SodA por uma estratégia dominante- negativa tem um efeito semelhante.

Em segundo lugar, embora a prática da estratégia de dominante- negativo e de atenuação por incrementos direcionada não se limite a genes microbianos essenciais, esta é a principal razão pela qual se prefere a atenuação por incrementos direcionada à inativação alélica simples quando o gene for essencial. Em; contraste, há algumas vantagens em potencial do emprego de uma estratégia de dominante-negativo em comparação com a inativação alélica em alguns microorganismos, até mesmo para genes não-essenciais. Primeiramente, existem considerações de tempo e de facilidade das modificações genéticas que são especialmente verdadeiras para as espécies nas quais é difícil atingir a recombinação homóloga necessária para a inativação alélica, porém nas quais a superexpressãõ de um gene pode ser obtida em plasmídeos ou em outros vetores. Uma outra razão em se selecionar a superexpressãõ de um mutante de enzima dominante-negativo em detrimento da inativação alélica é no caso de a enzima ser ou poder -ser um antígeno importante. Nesta situação, pode ser importante permitir que a linhagem da vacina continue a produzir a enzima na medida em que possa sei um alvo para o qual uma reação imunológica seja direcionada. Portanto, quahdo o hospedeiro subseqüentemente se torna infectado com o patógeno, causando uma doença que a vacina deve prevenir, o hospedeiro tem um repertório mais completo de reações imunológicas a direcionar contra o patógeno. Esta consideração sobre o "repertório de antígenos" não é importante nas circunstâricias em que a linhagem da vacina atenuada viva pró-apoptótica for utilizada somente como um vetor para a expressão de antígenos exógenos, e quando a reação imunológica desejada for contra o antígeno exógeno. Isso será discutido em maiores detalhes no contexto de diferenças na natureza de uma vacina BCG pró-apoptóticas a ser utilizada para vacinação contra a tuberculose em comparação com uma vacina BCG pró-apoptótica a ser utilizada como um vetor para vacinação contra um antígeno exógeno. Dentre as enzimas microbacterianas com efeitos anti-apoptóticos conhecidos ou suspeitados listadas acima, a de SodA e a de GlnAl (glutamina sintase) parecem ser absolutamente essenciais para o crescimento bacteriano (Dussurget, O. e outros, 2001; Tullius, Μ. V. e outros, 2003). Portanto, elas não são boas candidatas para a inativação alélica com o propósito de fazer uma vacina, mas podem ser manipuladas para atingir uma redução parcial na atividade enzimática alcançada por técnicas antisenso, atenuação por incrementos direcionada, ou por uma abordagem dominante-negativo. Como tanto o SodA como o GlnAl foram implicados na evasão imunológica pela M. tuberculosis (Edwards, Κ. M. e outros, 2001; Miller, Β. H. e outros, 2000) e são também produzidos pela BCG, eles são alvos preferidos para acentuar a imunogenicidade da BCG. Os exemplos abaixo mostram que o fenótipo com SodA diminuído na BCG está também associado a uma eficácia acentuada da vacina.

Etapa 2 - Geração de Mutantes de Enzimas Anti-apoptóticas

Os métodos para gerar mutantes de enzimas anti-apoptóticas para pôr em prática a abordagem dominante-negativa incluem aqueles descritos em WO 02/062298, mas também envolvem uma importante diferença. Na estratégia de atenuação por incrementos direcionada, a enzima mutante é a única fonte de atividade enzimática. Esses mutantes podem exibir atividades enzimáticas que sejam de apenas, por exemplo, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 2%, etc. da atividade da enzima natural mãe. Uma série de enzimas mutantes pode ser produzida para que se tenha atividades que fiquem dentro da faixa de redução da atividade. Assim, para enzimas essenciais em que a prática da atenuação por incrementos direcionada tem sua maior utilidade, é esperado que a enzima mutante tenha alguma atividade.

Ao revés, na estratégia de dominante-negativo, a enzima mutante pode ficar completamente inerte, exibindo 0% de atividade. Isto é assim porque a estratégia de dominante-negativo é baseada na interferência entre monômeros de enzimas mutantes expressos e os monômeros de enzimas do tipo selvagem codificados pelo gene mãe. Esta interferência leva à redução da atividade enzimática total. Essa diferença tem implicações para a concepção de mutantes de enzima na prática da estratégia de dominante-negativo versus a atenuação por incrementos direcionada. Mais notavelmente, as enzimas mutantes utilizadas na estratégia de dominante-negativo são potencialmente mais fáceis de se projetar uma vez que;uma das estratégias é simplesmente desabilitar o local ativo da enzima. Como percebido a partir de WO 02/062298, dados cristalográficos de raios-X estão; disponíveis para muitas das enzimas bacterianas que inativam oxidantes hospedeiros, incluindo a identificação de resíduos de locais ativos. Portanto, há informação disponível para ajudar na construção de mutantes de enzima nos quais resíduos de locais ativos sejam eliminados ou substituídos. Esta estratégia foi empregada na construção de um mutante ΔΗ28ΔΗ76 de SodA, em que duas das histidinas que fazem a quelação do ferro de local ativo de SodA foram removidas (Fig. 2, Exemplo 1).

Além disso, nas enzimas multiméricas, por exemplo, a glutamina sintase que possui uma estrutura dodecamérica, o local ativo freqüentemente fica entre monômèros e é formado por componentes de mais de um monômero. Isto permite que enzimas mutantes sejam projetadas em que o monômero tenha remoções, inserções ou substituições de aminoácidos que afetam mais de um local ativo. Essa estratégia foi empregada na construção de um mutante ΔD54ΔΕ335 da glnAl, que codifica a glutamina sintáse primária da M tuberculosis e da BCG (Fig. 14).

Contudo, algumas das enzimas mutantes construídas para realizar atenuação por incrementos direcionada podem ser utilizadas também para praticar a estràtégia dominante-negativa. Por exemplo, alelos de mutante de SodA em PLou 1-mut-SodA (Tabela 1) foram colocados em BCG para construir BCG(pLou-lmut SodA) (Tabela 1) utilizando-se técnicas para o direcionamento por incrementos atenuado descrito em WO 02/062298 quando as linhagens de BCG recombinantes foram vistas reduzindo sua atividade de SOD (Exemplo 1).

Os genes que codificam enzimas mutantes com atividade enzimática reduzida podem ter diferenças singulares ou múltiplas em comparação Com o gene tipo selvagem, levando a remoções, inserções e/ou substituições Singulares ou múltiplas. As diferenças de nucleotídeos podem ser introduzidas utilizando-se o gene tipo selvagem como um substrato, e utilizando- se uma variedade de técnicas para alcançar a mutagênese de local direcionado conhecida pelòs técnicos no assunto na técnica que inclui métodos baseados em RCP (Ho, S. N- e outros, 1989). Alternativamente, o gene contendo as mutações desejadas pode ser sintetizado de novo.

Etapa 3: Expressão da Enzima Mutante pelo Micróbio

Èm seguida, o gene que codifica a enzima mutante é incorporado dentro de um Vetor que se integra dentro do cromossomo da bactéria ou que pode ser mantido de forma estável como um plasmídeo dentro da bactéria. Métodos para a expressão de DNA em BCG e em outras micro-bactérias estão disponíveis desde 1987 (Jacobs, W. R. e outros, 1987), são bem conhecidos pelos técnicos no assunto, e incluem as técnicas ensinadas por Bloom e outros (Patente US 5504005, microbactérias recombinantes), que são aqui incorporadas como referência em: suas totalidades por seus ensinamentos em relação a métodos para a expressão dé DNA.

Uma variedade de vetores baseados em fagos e plasmídeos, e recursos genéticos para ser incorporados dentro da bactéria no cromossomo ou nos plasmídeós está disponível e será descrita em maiores detalhes abaixo no contexto de séus usos específicos.

Etapa 4: Identificação de Bactérias Mutantes para Serem Utilizadas como uma Vacina ou como uma Linhagem Hospedeira para Expressar um Antígeno Heterólogo

Métodos para identificar bactérias mutantes para serem utilizadas como uma vácina são descritos em detalhes em WO 02/062298, e envolvem principalmente a observação de uma reação imunológica em um modelo animal que se correlacione com uma proteção induzida por vacina acentuada, por exemplo, reações imunológicas acentuadas.

Òutro método para avaliar linhagens bacterianas mutantes quanto às suas funções como uma linhagem de vacina ou como um vetor para distribuir antígenos exógenos envolve ensaios para determinar o grau de redução na atividade enzimática in vitro. A redução na atividade de uma enzima que normalmente gera um efeito anti-apoptótico sobre o hospedeiro deve resultar em apoptose da eélula hospedeira aumentada quando aquela bactéria for utilizada para vacinar um animal hospedeiro, e seria prevista como sendo uma vacina mais imunogênica do que a bactéria mãe. Assim, a medição da atividade enzimática em lisatos e/ou sobrenadantes da bactéria mãe e da bactéria mutante pode ser utilizada para indicar se a expressão dominante-negativa de uma enzima mutante específica produziu a redução desejada na atividade enzimática total. Se a atividade enzimática total for reduzida pela estratégia dominante-negativa e as observações ainteriores associem uma maior eficácia da vacina a uma atividade enzimática reduzida obtida por uma outra técnica, por exemplo, pelas técnicas antisenso, então espera-se que a bactéria com a redução de enzimas dominantes- negativas será de forma semelhante uma linhagem de vacina mais eficaz.

Eliminação de Fatores Sigma e de outros Genes Reguladores que Governam a Produção de Enzimas Anti-apoptóticas Microbianas

Êtapa 1 - Identificação de Genes Reguladores de Enzimas Mierobianas Anti-apoptóticas

A produção de algumas enzimas anti-apoptóticas microbianas está sob o controle de genes reguladores que incluem fatores sigma que governam a transcrição de genes múltiplos através de um efeito sobre regiões promotoras. Assim, a inativação alélica de tais genes representa um caminho adicional para reduzir a produção de enzimas microbianas anti-apoptóticas, com potencial para um efeito pleiotrópico em que a atividade de diversas enzimas anti-apoptóticas é reduzida por Uma única manipulação genética.

Os genes reguladores podem ser identificados por seus efeitos sobre a expressão de outros fatores microbianos, incluindo as enzimas anti-apoptóticas. A identificação de transposon e outros grupos de mutagênesis que resultem em apoptose acentuada de células infectadas não apenas dão mutantes com defeitos diretos em enzimas anti-apoptóticas como também identificam mutações em genes reguladores que influenciam a produção de enzimas microbianas anti- apoptóticas importantes. Há forte homologia entre fatores reguladores de espécies diferentes e alguns investigadores identificaram novos fatores sigma baseados em homologia para fatores sigma conhecidos por seqüenciamento de DNA ou de aminoácidos. À inativação alélica do gene que codifica o fator sigma H (sigH) da M. tuberculosis foi descrita (Kaushal, D. e outros, 2002; Manganelli, R. e outros, 2002; Ramanl S. e outros, 2001, incorporados aqui como referências por seus métodos para inativar o sigH. A inativação do sigH foi acompanhada por um efeito sobre ; diversas enzimas microbacterianas, incluindo a tioredoxina, tioredoxina redutase, e homólogo de glutaredoxina. Uma remoção do sigH foi introduzida dentro do cromossomo da BCG, como descrito abaixo. A eficácia acentuada da BCGAsigH como uma vacina é descrita abaixo.

Uma outra modificação que espera-se acentuar a eficácia da vacina BCG é a inativação do sigE. Isto pode ser feito sozinho ou adicionalmente à inativação do s/gH. A inativação do sigE também desempenha um papel na resistência da M tuberculosis para tensão oxidativa e métodos para a inativação do sigE foram descritos na M. tuberculosis (Manganelli, R. e outros, 2001; Manganelli, R. e outros, 2004b; Manganelli, R. e outros, 2004a; incorporados aqui como referências por seus ensinamentos sobre métodos para inativar o sigE).

Etapa 2 - Inativação de Genes Reguladores de Enzimas Microbianas Anti-apoptóticas

à inativação de genes regulares e de fator sigma pode ser realizada utilizando-se técnicas de inativação alélica que envolvam vetores plasmídeos suicidas (Berthet, F. e outros, 1998; Hinds, J. e outros, 1999; Jackson, M. e outros, 1999; Kaushal, D. e outros, 2002; Parish, T. e outros, 2000; Pavelka, M. S., Jr. e outros, 1999; Pelicic, V. e outros, 1997) ou ferramentas genéticas derivadas de microbacteriófagos que sejam capazes de replicarem-se como um plasmídeo na E. coli e lisogeinizar um hospedeiro micobacteriano (Bardarov, S. e outros, 1997; Braunstein, M. e outros, 2002) (também Bardarov, S. e outros, Patente US 6.271.034). Esses métodos e ferramentas são bem conhecidos pelos técnicos no assunto.

Métodos específicos para a inativação do sigH e sigE na M. tuberculosis já foram descritos por vários grupos de investigadores como assinalado acima. Os métodos empregados aqui na inativação alélica do s/gH na BCG são mostrados abaixo. Esses exemplos mostram a acentuação da imunogenicidade de bactérias pela inativação de genes reguladores, o que resulta na atividade reduzida de enzimas microbianas anti-apoptóticas.

Utilização de Linhagens da BCG para Expressar Antígenos Exógenos

A BCG pro-apoptótica e outras vacinas bacterianas pro-apoptóticas construídas pela utilização da estratégia de enzimas mutantes dominante- negativas, tanto sozinha como em combinação com modificações pro-apoptóticas de uma bactéria obtidas por inativação de um gene de fator sigma, técnicas antisenso, ou atenuação por incrementos direcionada podem ser utilizadas para expressar antígenos exógenos. O DNA estranho pode ser DNA de outros agentes infecciosos, por exemplo, DNA que codifique o Brucella lumazine synthase (BLS), que é um antígeno de célula-T imuno-dominante da Brucella abortus (Velikovsky, C. A. e outros, 2002). A construção da BCG-RDrBLS é descrita abaixo. O DNA estranho pode ser DNA que codifique antígenos do vírus da imunodeficiência humana (HIV), vírus do sarampo, outros vírus, espécies de bactérias, fungos ou protozoários. O DNA estranho pode ser um antígeno de câncer.

Para expressar o DNA estranho na BCG pro-apoptótica, o gene de interesse é incorporado em um vetor, que se integra dentro do cromossomo da bactéria, ou qüe pode ser mantido em forma estável como um plasmídeo dentro da bactéria. Métodos para expressar DNA estranho na BCG e outras micobactérias estão disponíveis desde 1987 (Jacobs, W.R., Jr. e outros, 1987), são bem conhecidos pelos técnicos no assunto, e incluem técnicas ensinadas por Bloom e outros (Patente US 5.504.005, Reeombinant myeobaeterial vaeeine\ Patente US 5.854.055 e Patente US 6.372.478, Reeombinant myeobaeteria, que são aqui incorporados como referências em suas totalidades).

Uma variedade de vetores baseados em fago e plasmídeos, e ferramentas genéticas que permitem que genes sejam incorporados dentro da bactéria no cromossomo ou nos plasmídeos estão disponíveis e serão descritos em maiores detalhes abaixo no contexto de seus usus específicos. Ao expressar o antígeno estranho em vacinas bacterianas pro- apoptóticas que facilitem a entrada em passagens de apresentação de antígenos iniciadores cruzados associados à apoptose, o antígeno estranho é introduzido nesta passagem de apresentação de antígenos. Além disso, ele é apresentado no contexto de sinais co-estimulatórios muito fortes provenientes do hospedeiro bacteriano qué influenciam a apresentação de antígenos pelas células dendríticas de uma maneira que promove reações protetoras ao invés de indução de tolerância. Assim, esta prática permite o desenvolvimento de reações de células- T adaptativas- muito fortes que incluem tanto células-T CD4 como CD8 e o auxílio de CD4 para reações de células-T de CD8, o que era difícil de obter utilizando-se vetores projetados para acessar passagens exógenas ou endógenas da apresentação de antígenos.

Exemplos dos micróbios feitos pela super-expressão de SOD mutante incluèm, mas não se limitam aos seguintes: um M. tuberculosis ou BCG mutante em que o ácido glutâmico é removido na posição 54 da superóxido dismutase; um M. tuberculosis ou BCG mutante em que o ácido glutâmico é removido na posição 54 e a histidina na posição 28 é substituída por arginina de superóxido dismutase; um M. tuberculosis ou BCG mutante em que a histidina é removida na posição 28 da superóxido dismutase; um M. tuberculosis ou BCG mutante em que a histidina é removida na posição 76 da superóxido dismutase; um M tuberculosis ou BCG mutante em que histidinas são removidas na posição 28 e na posição 76 da superóxido dismutase; um M. tuberculosis ou BCG mutante em que histidinas são removidas na posição 28 e na posição 76 da superóxido dismutase, e em que há uma substituição de glicerina para serina na carboxiterminal. Exemplos dos micróbios feitos pela superexpressão de glutamina sintetase (glnAl) incluem, mas não se limitam aos seguintes: : um M. tuberculosis óu BCG mutante em que ácido ácido aspártico é removido na posição 54 da superóxido dismutase; : um M. tuberculosis ou BCG mutante em que ácido glutâmico é removido na posição 335 da superóxido dismutase; : um M. tuberculosis ou BCG mutante em que ácido aspártico é removido na posição 54 e ácido glutâmico é removido na posição 335 da superóxido dismutase. À presente invenção fornece ainda os micróbios atenuados da invenção, expressando também um antígeno heterólogo. As bactérias atenuadas pro-apoptóticãs da presente invenção são opcionalmente capazes de expressar um ou mais antígenos heterólogos. Como um exemplo específico, os antígenos heterólogos são expressos na bactéria BCG com SOD diminuída da invenção. Vacinas atenuadas vivas têm o potencial de servir como vetores para a expressão de antígenos heterólogos a partir de outras espécies patogênicas (Dougan e outros, Pat. US N°. 5.980.907; Bloom e outros, Pat. US N°. 5.504.005). Portanto, os micróbios; da presente invenção tendo uma redução na expressão ou na atividade de uma enzima anti-apoptótica ou essencial podem ser adicionalmente modificados para expressar um antígeno de um micróbio diferente. Tais antígenos podem ser de microorganismos virais, bacterianos, protozoários ou de fungos. Os microorganismos pro-apoptóticos recombinantes formam então a base de uma vacina bi- ou multivalente. Desta maneira, múltiplos patógenos podem ser visados por uma única linhagem de vacina. A invenção fornece um método de preparação de uma vacina multivalente compreendendo a transformação do microorganismo pro-apoptótico da invenção com um ácido nucléico codificador de um antígeno heterólogo. Por exemplo, antígenos do vírus do sarampo contendo epitopos CD4+ e CD8+ podem ser expressos em BCG com SOD diminuída, com expressão obtida pela integração estável do DNA codificador do antígeno do sarampo de interesse em DNA genômico da BCG pro-apoptótica da invenção, utilizando-se técnicas ensinadas por Bloom e outros (Pat. US N0. 5.504.005, que é aqui incorporada em sua totalidade como referência). Alternativamente, o gene codificador do antígeno pode ser expresso em um vetor plasmídeo, por exemplo, atrás do promotor da proteína de choque térmico de 65 KDa de pHV203 ou atrás de um promotor aceA(icl) em qualquer integração cromossômicá ou vetor plasmídeo utilizando-se técnicas convencionais para a expressão de antígenos recombinantes que são bem conhecidas pelos versados na técnica. O antígeno não precisa consistir em todo o antígeno, mas sim representar peptídeos de uma proteína ou glicoproteína.

Uma vacina BCG pro-apoptótica que expresse antígenos do sarampo pode substituir a BCG convencional como uma vacina para administração após o parto em países em desenvolvimento com uma alta incidência de mortalidade infantil por sarampo. A vacina recombinante estimula reações imunológicas celulares aos antígenos do sarampo que protegeriam a criança nos primeiros anos de vida quando a mortalidade por sarampo é maior. A BCG pro-apoptótica recombinante que expressa antígenos do sarampo possui vantagens em relação às atuais vacinas do sarampo vivas atenuadas, na medida em que a presença dos anticorpos maternais interfere com a vacinação antes dos 6 meses de idade, deixando a criança suscetível ao sarampo durante um período da vida em que ela está em risco de morte por sarampo. Ao invés, a BCG pro- apoptótica recombinante que expresssa antígenos do sarampo não será inativada pelos anticorpos maternos, e podem produzir reações imunológicas protetoras em um estágio de vida mais primário. Os antígenos do vírus do sarampo heterólogos previstos por esta invenção incluem, mas não se limitam a, glicoproteína H (hemaglutinina), glicoproteína F, e proteína M.

Outros antígenos heterólogos de patógenos infecciosos previstos por esta invénção incluem, mas não se limitam a, esporozoítas da malária, antígenos de merozoítas da malária, antígenos do vírus da imunodeficiência humana, e antígenos de leishmania. Os antígenos da malária heterólogos previstos pela invenção incluem, mas não se limitam a, antígeno de circunsporozóíta, antígeno TRAP, antígenos de estágio do fígado (LSAl, LSA3), moléculas de estágio do sangue (MSP1, MSP2, MSP3), antígeno PfEMPl, SP166, EBA 175, AMAI, Pfs25, e Pfs45-48. Os antígenos do vírus da imunodefíciêricia humano heterólogo do tipo 1 (HIV 1) previstos por esta invenção incluem, mas não se limitam a, proteínas e glicoproteína codificadas pro env, gag e pol, incluindo gpl20, gp41, p24, pl7, p7, protease, integrase e transcriptase reversa, assim como produtos de genes acessórios, tais como tat, rev, tif, vpr, spu e nef. Os antígenos do HIV heterólogos inlcuem antígenos de diferentes Ciados do HIV. Os antígenos do HIV heterólogos também incluem os epitopos de escape de linfócitos-T citotóxicos (LTC) que não sejam encontrados no vírus natural do tipo selvagem mas que mostraram surgir sob a pressão seletiva do sistema imunológico. Desta maneira, a vacinação pode prevenir preemptoriamente as mutações que permitem que o vírus escape da contenção imunológica e que representam uma grande força motora da diversidade de seqüências do HIV. Os antígenos de Leishmania heterólogos incluem antígenos de quaisquer; espécies Leishmania, incluindo mas não se limitando a, L. donovani, L. infantum, L. chagasi, L. amazonensis, L. tropica, e L. major. Os antígenos de Leishmania heterólogos previstos por esta invenção incluem, mas não se limitam a, gp63, p36(LACK), a hidrolase nucleósida 36-KDa e outros componentes do antígeno de ligando Fucose-Manose (LFM), proteína reguladora de glicose 78, proteína ribossômica ácida PO, proteína-11 de membrana de Kinetoplasteaproteinases de cisteína tipo I a II, proteína Trp-Asp (WD), nuclease P4, papLe 22, TSA, LmSTI, e LeIF.

Outros antígenos heterólogos de patógenos de protozoários infecciosos previstos por esta invenção incluem, mas não se limitam a, os antígenos da espécie Trypanosoma, espécies Schistosoma, e Toxoplasma gondii. Os antígenos! de Trypanosoma heterólogos incluem antígenos de qualquer espécie Trypanosoma cruzi e Trypanosoma brucei. Os antígenos de Trypanosoma heterólogos previstos por esta invenção incluem, mas não se limitam a, proteínas de paraflagelar Rod (PFR), proteína associada a microtúbulos (MAP ρ 15), genes ASP-1, ASP-2 E TSA-I dos genes da família tans-sialidase, o antígeno de parasita de 75-77 KDa e as glicoproteínas de superfície variáveis. Os antígenos de Schistosoma heterólogos incluem antígenos de qualquer espécie Schistosoma, incluindo, mas não se limitando a, superóxido dismutase cistólica, proteína de membrana integral Sm23, a sub-unidade grande da calpaína (Sm-p80), triosefosfato isomerase, filamina, paramiosina, ECL, SM14, IRV5, e Sm37-GAPDH. Os antígenos de Toxoplasma heterólogos previstos por; esta invenção incluem, mas não se limitam a, GRA1, GRA3, GRA4, SAG1, SAG2, SRS1, ROP2, MIC3, HSP70, HSP30, P30, e o antígeno principal de 23 KDa segregado.

Outros antígenos heterólogos de patógenos virais infecciosos previstos por esta invenção incluem, mas não se limitam a, antígenos do vírus Influenza, Vírus da Hepatite C (VHC) e Flavivírus, incluindo o Vírus da Febre Amarela, o Vírus da Dengue, e o Vírus da Encefalite Japonesa. Os antígenos de Influenza heterólogos previstos por esta invenção incluem, mas não se limitam a, a hemaglutinina (HA), neuraminidase (NA), e proteína M, incluindo tipos subgênicos diferentes de HA e NA. Os antígenos do VHC heterólogos previstos por esta invenção incluem, mas não se limitam a, a proteína de núcleo (N) de 21 KDa, as glicoproteínas do envelope El e E2, e as proteínas não-estruturais NS2, NS 3, NS4 e NS 5. Os antígenos do VHC heterólogos incluem antígenos de diferentes genótipos do VHC. Os antígenos do Flavivírus previstos por esta invenção incluem a proteína de capsídeo (C), proteína do envelope (E), proteína de membrana (M), e as proteínas não-estruturais (NE).

Outros antígenos heterólogos de patógenos virais infecciosos previstos por esta invenção incluem, mas não se limitam a, proteínas e glicoproteínas estruturais e não-estruturais da Família do Vírus da Herpes, incluindo os Vírus da Herpes Simplex (VHS) 1 e 2, o Citamegalovírus (CMV), o Vírus da Catapora-Zóster (VCZ), e o Vírus de Epstein-Bacc (VEB). . Os antígenos da herpes heterólogos previstos por esta invenção incluem, mas não se limitam a, proteínas e glicoproteínas estruturais nos picos, no envelope, tegumento, nucleocapsídeo, e núcleo. São também previstas proteínas não- estruturais incluindo timidina quinases, DNA polimerase, ribonucleotídeos reductases, e exonucleases.

Outros antígenos heterólogos de patógenos virais infecciosos previstos por esta invenção incluem, mas não se limitam a, proteínas e glicoproteínas estruturais e não-estruturais do Rotavírus, Vírus Parainfluenza, Metapneumovírus Humano, Vírus da Caxumba, Vírus Sincidial Respiratório, Vírus da Raiva, Alfavírus, Vírus da Hepatite B, Parvovírus, Papilomavírus, Varíola, Vírus da Febre Hemorrágica incluindo o Marburg e o Ebola, Hantavírus, Poliovírus, Vírus da Hepatite A, e Coronavírus incluindo o agente da SRAG (síndrome respiratória aguda grave).

Outros antígenos heterólogos de patógenos virais infecciosos previstos por1 esta invenção incluem, mas não se limitam a, os antígenos da espécie Chlamydia e da espécie Mycoplasma, incluindo C. pneumoniae, C. psittici, C. trachomatis, M. penumonia e M. hyopneumoniae. Os antígenos Chlamydia heterógos previstos por esta invenção incluem, mas não se limitam a, proteína de membrana externa principal (MOMP), proteína de membrana externa A (OmpA), proteína de membrana externa 2 (Omp2), e pgp3. Os antígenos Mycoplasma previstos por esta invenção incluem, mas não se limitam à proteína de choque térmico P42.

Outros antígenos heterólogos de patógenos virais infecciosos previstos por esta invenção incluem, mas não se limitam a, antígenos da espécie Rickettsial, incluindo Coxiella burnetti, Rickettsia prowazekii, Rickettsia tsutsugamushi, e o Grupo da Febre Maculosa. Os antígenos Rickettsial heterólogos previstos por esta invenção incluem, mas não se limitam a, ompA, ompB, famíliá de genes virB, cap, tlyA, tlyC, a proteína de membrana externa de 56 KDa da Orientia tsutsugamushi, e a proteína recombinante de 47 KDa.

Outros antígenos heterólogos de patógenos virais infecciosos previstos por esta invenção incluem, mas não se limitam a, M. avium, M. intracellulare, M. africanum, M. kansasii, M. marinum, M. ulcerans, M. avium, subespécies paratubereulosis, Nocardia asteroides, outras espécies Noeardiai Legionella pneumophila, outras espécies Legionella, Salmonella typhi, outras espécies Salmonella, espécies Shigella, Yersinia pestis, Pasteurella haemolytiea, Pasteurella niultoeida, outras espécies Pasteurella, Actinobacillus pleuropneumoniae, histeria monoeytogenes, histeria ivanovii, Brueella abortus, outras espécies Brueella, Cowdria ruminantium, espécie Ehrliehia, Staphyloeoeeus aureus, Staphyloeoeeus epidermidis, Streptoeoeeus pyogenes, Streptoeoeeus agalaetiae, Bacillus anthraeis, Eseheriehia eoli, Vibrio eholerae, espécie Campylobaeter, Neiserria meningitidis, Neiserria gonorrhea, Pseudomonas, aeruginosa, outras espécies Pseudomonas, Haemophilus influenzae, Haemophilus ducreyi, outras espécies Hemophilus, Treponema pallidum, outras espécies Treponema, espécie heptospira, Borrelia speeies, Yersinia enterolitica, e outras espécies Yersinia.

Além disso, os micróbios da presente invenção podem ainda ser modificados para expressar antígenos de cânceres para uso em imunoterapias contra neuroplasmas malignos. Os antígenos de câncer heterólogos previstos por esta invenção incluem, mas não se limitam a, tirosinase, antígenos de câncer dos testículos, (MAGE-1, -2, -3, -12), G-250, p53, Her-2/neu, HSP105, ácido prostático fosfatase (AFF), oncoproteínas E6 e E7 do HPV 16, alanina-prolina 707 (AP-707) (Takahashi Τ, e outros Clin. Câncer Res. 1997 Aug; 3(8): 1363- 70); alfa a-fetoproteína (AFP) (N°. de Acesso CAA79592 (aminoácido), N0. de Acesso Z19532 (ácido nucléico)); antígeno de adenocarcinoma reconhecido por células-T 4 (ART-4) (N0. de Acesso BAA86961 (aminoácido), N°. de Acesso AB026125 (ácido nucléico)); antígeno B (BAGE) (N°. de Acesso NP 001178 (aminoácido),; N0. de Acesso NM 001187 (ácido nucléico)); b-catenina/de mutação (Robbins PF, e outros, A mutated beta-catenin gene encodes a melanoma-specific antigen recognized by tumor infiltrating lymphocytes. J Exp Med. 1996 Mar 1;183(3):1185-92.); BCR (breakpoint cluster region)-Abelson (Bcr-abi) (N0! de Acesso CAA10377 (aminoácido), N0. de Acesso AJ131467 (ácido nucléico)); antígeno em melanoma reconhecido por LTC (CAMEL) (N0. de Acesso CAAl0197 (aminoácido), N0. de Acesso AJOl2835 (ácido nucléico)); antígeno peptídeo-1 carcinoembriônico (CAP-I) (Tsang KY, Phenotypic stability of a cytotoxic T-cell Iine directed against an immunodominant epitope of human carcinoembryonic antigen. Clin Câncer Res. Dez 1997; 3(12 Pt l):2439-49); caspase-8 (N0·. de Acesso NP_001219 (aminoácido), N0. de Acesso NM 001228 (ácido nucléico)); ciclo de divisão celular 27 com mutação (CD27m); quinase 4 dependente de ciclina com mutação (CDK4/m); antígeno carcinoembriônico (CEA) (N0. de Acesso AAB59513 (aminoácido), N0. de Acesso M17303 (ácido nucléico); câncer/testis (antígeno) (CT); ciclofílina B (Cyp-B) (N0. de Acesso P23284 (aminoácido)); melanoma de antígeno de diferenciação (MAD) (os epitopos de DAM-6 e DAM-10 são equivalentes, mas as seqüência de genes são diferentes) (DAM-6/ MAGE-B2 - N0. de Acesso NP 002355 (aminoácido), N0. de Acesso (ácido nucléico)) (DAM-10/ MAGE-Bl - N°. de Acesso NP_002354 (aminoácido), N0. de Acesso NM_002363 (ácido nucléico)); fator de alongamento 2 com mutação (ELF2m); gene 6 da variante específica (Ets) transformadora E26/gene ETS da leucemia 1 mielóide (ETV6- AMLl); glicoproteína 250 (G250); antígeno G (GAGE) (N0. de Acesso AAA82744 (aminoácido)); N-acetilglicosaminiltransferase V (GnT-V); glicoproteína lOOk.D (Gp 100); antígeno de helicose (HAGE); receptor epidérmico humano- 2/neurológico (HER2/neu) (N°. de Acesso AAA58637 (aminoácido) e Ml 1730 (ácido nucléico); troca de arginina (R) para isoleucine (I) no resíduo 170 da hélice-a do domínio-a2 no gene HLA-A2 (HLA- A*0201-R170I); vírus do papiloma humano E7 (HPV-E7); proteína de choque térmico com mutação 70 - 2 (HSP70-2M); tumor em anel de sinete humano-2 (HST-2); telomerase transcriptase reversa humana (hTERT ou hTRT); esterase de carboxila intestinal (iCE); KIAÁ0205; antígeno L (LAGE); receptor de lipídios de baixa densidade/GPD-L-fucose (LDLR/FUT): b-D-galactosidase 2-a-L- fucosyltransferase; antígeno de melanoma (MAGE); antígeno de melanoma reconhecido por células-T 1/antígeno de Melanoma A (MART-1/Melan-A)(N°. de Acesso Q16655 (aminoácido) e BC014423 (ácido nucléico); receptir de melanocortina 1; Miosina/m; mucina 1 (MUCl) (N0. de Acesso CAA56734 (aminoácido) X80761 (nucleic acid)); melanoma com mutação em toda parte 1, 2, 3; (MUM-1, -2, -3); clone de NA cDNA de paciente M88 (NA88-A); Nova York - do esôfago 1 (NY-ESO-1); proteína 15 (P15); proteína de 190 KD bcr- abl; leucemia promielocítica/receptor de ácido retinóico a (Pml/RARa). antígeno preferencialmente expresso de melanoma (PRAME) (N0. de Acesso AAC51160 (aminoácido) e U65011 (ácido nucléico)); antígeno de próstata específico (APS) (N°. de Acesso AAA58802 (aminoácido) e X07730 (ácido nucléico)); antígeno de membrana de próstata específico ((PSM)(N°. de Acesso AAA60209 (aminoácido) e AF007544 (ácido nucléico)); antígeno renal (RAGE) (N0. de Acesso AAHS3536 (aminoácido) e NM 014226 (ácido nucléico)); renal ubíquo 1 ou 2 (RUI ou RU2) (RUI N0. de Acesso AAF19794 (aminoácido) e AF168132 (ácido nucléico) ou RU2 N0. de Acesso AAF23610 (aminoácido) AFl 81721 (ácido nucléico)); antígeno de sarcoma (SAGE)(N°. de Acesso NP_005424 (aminoácido) e NM 018666 (ácido nucléico)); antígeno escamoso reconhecido por células-T 1I ou 3 (SART-1 ou SART-3)(SART-1 N0. de Acesso BAA24056 (aminoácido) e NM_005146 (ácido nucléico) ou SART-3 N0. de Acesso BAA78384 (aminoácido) AB020880 (ácido nucléico)); translocação de leucemia da família-Ets/leucemia aguda mielóide 1 (TEL/AML1); triosefosfato isomerase com mutação (TPI/m); proteína associada à tirosinase 1 (TRP-I) (N0. de Acesso NP_000541 (aminoácido) e NM 000550 (ácido nucléico)); proteína associada à tirosinase 2 (TRP-2) (N0. de Acesso CAA04137 (aminoácido) e AJ000503 (ácido nucléico)); TRP-2/íntron 2; e gene do tumor de Wilms (WT1)(N°. de Acesso CAC39220 (aminoácido) e BC032861 (ácido nucléico)), sendo todos eles aqui incorporados como referências.

Os micróbios dos métodos e das composições reveladas podem ser construídos utilizando-se a abordagem de gerações revelada para a modificação bacteriana. Á lista abaixo mostra combinações adicionais das modificações preferidas para introduzir dentro da BCG o fenótipo pro-apoptótico associado a uma imunogenicidade mais acentuada.

la Geração:

a. SAD-BCG (também referida como: "SD-BCG [mut sodA]")

b. SIG-BCG (também referida como: "BCGAsigH")

c. SEC-BCG (também referida como: "BCGAsecA2")

d. GLAD-BCG (também referida como: "GSD-BCG [mut glnAl])

2a Geração:

a. SAD-SIG-BCG (também referida como: "BCGAsigH [mut sodAJ ")

b. SAD-SEC-BCG (também referida como: "BCGAsecA2 [mut sodA] ")

c. BCG-RD (também referida como: "BCGAsigH4secA2", "BCG de detecção

dupla")

d. GLAD-SIG-BCG (também referida como: "BCGAsigH [mut glnAl]")

e. GLAD-SEC-BCG (também referida como: "BCG4secA2 [mut glnAl]")

f. GLAD-SAD-BCG (também referida como: "BCG [mut sodA, mut ginA]])

3a Geração:

a. 3D-BCG (também referida como: "BCG4sigH4secA2 [mut sodA]", "BCG de 3a

geração"). Existem muitas linhagens consideradas da 3D-BCG baseadas na natureza do mutante SodA dominante-negativo que seja expresso para reduzir a atividade de SOD total. O gene SodA mutante dominante-negativo pode ser inserido dentro do cromossomo da BCG-RD ou expresso em um plasmídeo.

b. GLAD-BCG-RD (também referida como: "BCG4sigHAsecA2 [mut glnAl]")

c. GLAD-SAD-SIG-BCG (também referida como: "BCG4sigH [mut sodA, mut glnAl]")

d. GLAD-SAD-SEC-BCG (também referida como: "BCG4secA2 [mut sodA, mut glnAl]")

4a Geração: 4D-BCG (também referida como: "BCG4sigHAsecA2 [mut sodA, mut glnAl]", "BCG de 4a geração". Existem 4 tipos principais de 4D-BCG, Todos envolvem a adição de mutantes sodA e glnAl dominante-negativos à 4D-BCG, mas variam quanto a onde os genes são inseridos:

•Forma 1 — os alelos de sodA e glnAl mutantes são inseridos no cromossomo,

Forma 2 — os alelos de sodA e glnAl mutantes são expressos em um plasmídeo,

• Forma 3 — o alelo de sodA mutante é inserido dentro do cromossomo e o alelo de glnAl mutante é expresso em um plasmídeo,

• Forma 4 — o alelo de sodA mutante é expresso em um plasmídeo e o alelo de glnAl mutante é inserido dentro do cromossomo.

Como a inativação dos efeitos do sigH afeta a expressão de múltiplos fatores bacterianos, alguns dos quais sendo alvos importantes da reação imunológica, há vantagens em se substituir a inativação de sigH pela inativação (ou expressão de enzima mutante dominante-negativa) de um ou mais dos antioxidantes cuja expressão é controlada pelo sigH. Estes incluem a tioredoxina, a tioredoxina redutase, um homólogo de glutaredoxina, e as enzimas bio- sintéticas envolvidas na produção de micotiol (Kaushal, D. e outros, 2002; Manganelli, R. e outros, 2002; Raman, S. e outros, 2001), um pequeno agente redutor de peso molecular semelhante à glutationa mamífera. Esta manipulação pode possuir vantagens em relação à inativação do sigH quando a linhagem de BCG pro-apoptótica for utilizada para vacinar um hospedeiro contra a tuberculose, como o benefício de fazer com que o hospedeiro reaja aos fatores controlados por sigH, uma vez que os alvos imunológicos podem contrabalançar o benefício de se ter uma linhagem de vacina que seja menos apta a inibir a apoptose. Em contraste, as vacinas com sigH inativadas descritas aqui são vetores ideais para se utilizar na expressão de antígenos exógenos, na medida em que a presença de um repertório completo ou quase completo de antígenos da BCG não é importante quando a linhagem da BCG modificada é utilizada principalmentè para induzir uma reação imunológica contra um antígeno exógeno, por ex., para a imunização contra outros agentes infecciosos ou antígenos do câncer. Para ensinar mais como pôr em prática a substituição da inativação de genes anti-apoptóticos regulados por sigH ao invés da inativação de sigH, alelos mutantes projetados para inativar tioredoxina e tioredoxina redutase são mostrados na Fig. 22 e na Fig. 23. Esta abordagem é aplicável às linhagens da M. bovis que não a BCG.

As vacinas paBCG reveladas aqui são mais imunogênicas do que a vacina BCG; mãe. Além disso, cada geração da vacina exibe aumentos progressivos em imunogenicidade. Em comparação com a BCG, elas apresentam as seguintes características:

1) Elas induzem um padrão qualitativa ou quantitativamente diferente de reações de células-T CD4+ durante a primeira vacinação com picos mais altos na produção de IL-2 e liberação menos prolongada de IFN-γ (Exemplo 3, Figuras 26 e 27). Ambas essas diferenças podem ser importantes na geração de células-T de memória. Em primeiro lugar, a IL-2 acentua a sobrevivência das células-T de antígeno específico, e é necessária para a geração de reações secundárias sólidas. Em segundo, embora a IFN-γ seja uma função efetora comumente medida das células-T efetoras que ativam M-Os, ela promove a apoptose de células-T durante a fase de contração da proliferação primária.

2) Elas induzem reações de células-T de memórias mais rápidas para uma segunda exposição. Fortes reações de células-T são detectadas dentro de 5 dias pós-desafio em camundongos previamente subQ-vacinados com 3DBCG (Exemplo 14, Figura 28). Isso se compara favoravelmente com as reações de memória em camundongos vacinados com BCG que têm seus picos nos dias 11 a 14.

Resumidamente, os resultados mostram que a BCG modificada induz uma melhor reação imunológica à vacinação.

A presente invenção é mais particularmente descrita nos exemplos a seguir, que são dados a título de ilustração apenas, uma vez que numerosas modificações è variações aí serão aparentes para os técnicos no assunto.

Os métodos, isolamentos bacterianos, plasmídeos, e outras ferramentas para realizar manipulações genéticas descritas em WO 02/062298 são aqui incorporados em suas totalidades como referências, por seus ensinamentos sobre estas composições e estes métodos. EXEMPLOS

Métodos Gerais

Isolamentos bacterianos, plasmídeos, compostos químicos, e meios de cultura: Os isolamentos bacterianos e plasmídeos utilizados são mostrados na: Tabela 1. A linhagem TOP 10 da E. coli foi utilizada como o hospedeiro paira a clonagem dos produtos de RCP, e a linhagem DH5a da E. coli foi utilizada como o hospedeiro para outras manipulações genéticas moleculares, a não ser quando especificado contrariamente aqui. As linhagens da E. coli foram desenvolvidas em meios LB (Gibco/BRL, Gaithersburg, Maryland, EUA). A Tice de BCG foi desenvolvida em meios líquidos Middlebrook 7H9 (Difco Laboratories, Detroit, Michigan, EUA) suplementados com glicerol 0,2%, enriquecimento de OADC em Middlebrook 10% (Becton Dickinson & Co., Cockeysville, Maryland, EUA), Tween80 0,5%. Alternativamente, elas foram desenvolvidas em ágar de Middlebrook 7H10 (Difco) suplementado com glicerol e OADC. Kánamicina em uma concentração de 50 μg/ml ou de 25 μg/ml, apramicina em uma concentração de 50 μg/ml, ou higromicina em uma concentração de 100 μg/ml ou de 50 μg/ml foi utilizada na E. coli DH5a ou na BCG para selecionar plasmídeos contendo transformadores ou vetores de integração cromossômica.

Mutação Genética: Os genes para a superóxido dismutase (sodA) co-fatorada com ferro e para a glutamina sintase (glnAl) foram amplificados por RCP a partir de DNA cromossômico da linhagem H37RV da M. tuberculosis, e clonados em plasmídeos que se replicam na E. coli. Os dados de seqüência de DNA armazenados no servidor da web da TubercuList (http://genolist.pasteur.fr/TubercuList/site), também armazenados no GeneBank, foram utilizados para orientar a construção de primers de DNA. Mutagênese de local direcionado utilizando os métodos de extensão de sobreposição de primers baseados em RCP (Ho, S. N. e outros, 1989) ou outros métodos são empregados para eliminar, substituir ou adicionar nucleotídeos. Isso produz genes mutantes que codificam enzimas mutantes com remoções, substituições ou adições de aminoácidos. A seqüência de genes é confirmadapor seqüenciamento de DNA. Alternativamente, técnicas de síntese de genes podem ser utilizadas para produzir os genes com ias seqüências desejadas.

Expressão de genes de enzimas mutantes na BCG: Genes codificadores de enzimas mutantes foram ligados em um ou mais dos seguintes vetores: pMH94, pHV202, pMP349 e pMP399. Outros vetores também podem ser utilizados jpara pôr em prática esta invenção. A expressão de SodA mutante no vetor pLoul de integração foi atingida utilizando-se o promotor de sodA tipo selvagem cloriado como parte de uma estratégia alternativa para pôr em prática a atenuação incrementai como descrita em WO 02/062298. Esta estratégia alternativa envolveu primeiramente a inserção do alelo do sodA mutante codificador de uma enzima exibindo atividade de SOS diminuída em local de integração do fago attB no cromossomo micobacteriano. Os transformadores de pMH94-mut sodA cresceram mais lentamente do que a linhagem BCG mãe. O desenvolvimento lento dessas linhagens foi semelhante ao fenótipo de crescimento lento observado na M. tuberculosis e em linhagens BCG em que as técnicas de super-expressão anti-senso haviam sido utilizadas para reduzir a atividade da SOD. Levando-se em conta que isso representava um efeito dominante-negativo da expressão da SodA mutante, a SodA mutante foi então expressa em pMP349 e pMP399. Nessas construções, o promotor de sodA foi eliminado e a: fase aberta de leitura da SodA mutante foi colocada atrás de uma região de paridade de 350+ bases que inclui o promotor para o aceA (também chamado icl) (Graham, J. E. e outros, 1999; McKinney, J. D. e outros, 2000; McKinney, J. D. e outros, 2000). Um local de restrição da kpnlfoi utilizado em ligação e a seqüência completa da fase de leitura da SodA do promotor de kpnl é mostrada no Exemplo 1. O promotor aceA é indutível por macrófago e a expressão tanibém pode ser regulada in vitro, sendo este um recurso que oferece potenciais vantagens se o gene a ser expresso interfere com o crescimento das bactérias. Os resultados envolvendo a SodA mutante expressa no pMP399 são mostrados nos exemplos e nas figuras. A expressão de glnAl mutante no pMP349 e no pMP399 foi realizada utilizando-se o promotor de glnAl clonado.

Os vetores foram eletroporados em BCG Tice utilizando-se métodos convencionais (Hondalus, Μ. K. e outros, 2000) com a exceção de que quando a A60O das culturas micobacterianas atingiu 0,6 eles foram incubados a 37°C e 5% de CO2 com glicina 1,5% e 50 μg/ml de m-fluoro-DL-fenilalanina (MFP) por 48;horas para acentuar a eficiência da eletroporação. As micobactérias foram lavadas duas vezes e re-suspensas em glicerol 10% gelado. O aparelho Gene Pulser òom o acessório Pulse Controller (Bio-Rad Laboratories, Hercules, Califórnia, EUA) foi usado para todas as eletroporações a 25F e 2,5 KV com o controlador dè pulsos ajustado em 1000 ohms. Após a eletroporação, 1 ml de meio Middlebrook 7H9 foi adicionado às amostras, e os transformantes foram deixados em incubação a 37°C e CO2 5% por 24 horas. Os transformantes foram postos em placa de ágar de Middlebrook 7H10 contendo kanamicina, apramicina ou higromicina, conforme preciso. A transformação bem sucedida foi confirmada por RCP ou por DNA único do vetor construído.

Enzaios de quantidades e atividades de enzimas: A estratégia de enzima mutante dominante-negativa envolve a expressão de monômeros de enzima mutantes na bactéria que interagem com os próprios monômeros de enzima do tipo selvagem codificados cromossomicamente da bactéria, de uma maneira que reduz a atividade total da enzima produzida pela bactéria. Assim, para obter as informações que confirmem o sucesso da estratégia dominante- negativa, um ensaio não-enzimático para medir a quantidade de enzimas (por ex., hibridização Western), assim como um ensaio de atividade enzimática foram realizados. O resultado é que, em comparação à linhagem BCG mãe, as linhagens BCG mutantes demonstraram quantidades de enzimas comparáveis ou elevadas (Fig. 17) porém atividades enzimáticas diminuídas (Fig. 16).

Para preparar os sobrenadantes e lisatos para os ensaios de atividade enzimática, uma cultura fresca de cada linhagem BCG foi preparada re- suspendendo-se uma bola de céluals lavadas em 25 ml de caldo 7H9 contendo OADC para atingir um valor A600 de 0,5. O caldo se desenvolveu sem agitação por 72 horas. A cultura em caldo foi centrifugada e os sobrenadantes foram separados da bola de células. Sobrenadantes concentrados para as determinações de atividade enzimática foram preparados através da concentração do sobrenadante de 25 ml para 1,0 ml utilizando-se um dispositivo de separação baseado em centrifugação com uma membrana de 10.000 KDa. Os lisatos para testar a atividade enzimática foram preparados pela re-suspensão da bola de células em 1 ml de solução salina tamponada por fosfato e lisando-se com um aparelho de batidas com micro-contas. Lisatos de diferentes linhagens foram ajustados para um valor A280 padrão para comparação.

A hibridização Western foi utilizada para quantificar a quantidade de SOD. As amostras consistindo em lisatos de células não-diluídos como preparadas acima foram ajustadas para valores A280 padrão, aplicados e eletroporados em um gel PAGE 12%, e transferidos para membranas de nitro- celulose HybOnd ECL (Amersham, Arlington Heights, IL EUA). As membranas foram hibridizadas com anti-soros policlonais de coelho levantados contra a SodA recombinante purificada com PAGE expressa na E. coli conforme descrito previamente (Lakey, D. L. e outros, 2000). A SodA recombinante utilizada para gerar anticorpos foi purificada por cromatografia de coluna de afinidade com níquel. As meinbranas de nitro-celulose foram incubadas primeiro com anti-soros nas diluições mencionadas acima seguida por incubação com uma diluição 1:1000 de anticorpos anti-coelho de cabra conjugados com peroxidase de raiz- forte (Boehririger Mannheim, Indianapolis, Indiana EUA). Os imunoblots foram desenvolvidos com agentes de detecção de Wester Blot ECL (Amersham Pharmacia, Arlington Heights, Illinois EUA).

Á atividade da SOD foi medida espectrofotometricamente quanto à sua capacidade de interferir na redução de citocromo C por superóxido utilizando-se um kit comercial que utiliza superóxido gerado por xantina oxidase e com base nos métodos de McCord e Fridovich (McCord, J. M. e outros, 1969; Beyer, W. F; e outros, 1987). Uma unidade de SOD foi definida como a quantidade de SodA que inibia a redução de citocromo C em 50% (valor IC50).

A atividade da glutamina sintase foi medida espectrofotometricamente utilizando-se os métodos de Woolfolk e outros (Woolfolk, C. A. e outros, 1966).

Estudos de Proteção por Desafio In vivo: Para preparar inóculos de linhagens de vacina para injeção em camundongos C57BL/6, as linhagens BCG Tice e BCG pro-apoptótica foram desenvolvidas em molho de Middlebrook 7H10 (formulação de ágar de 7H10 com malaquita verde e ágar removidos) contendo OADC 10% (Difco). As suspensões foram diluídas para atingir uma leitura de 10 Klett (aproximadamente 5 x 107 ufc/ml) em um Colorímetro de Klett-Summerson (Klett Manufacturing, Brooklyn, NY). Alíquotas dos inóculos foram diluídas em série e diretamente postas em placa de ágar e 7H10 contendo OADC 10% para contagens regressivas para determinar o tamanho preciso do inóculo.

Camungongos C57BL/6 fêmeas com 5 a 6 semanas de idade foram adquiridos através da Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine EUA. Os camundongos: de controle infectados e não-infectados foram mantidos em uma unidade de Biosegurança de Nível 3 em no Syracuse VA Medicai Center, EUA. Os experimentos com animais foram aprovados pelo Sub-comitê em Estudos com Animais do Syracuse VAMC, e realizados em uma unidade aprovada pela AALAC.

A não ser quando dito o contrário, o projeto experimental para os experimentos de desafios por vacina envolvia a inoculação subcutânea de 5 x IO6 ufc da linhagem de vacina, descanso por 100 dias, e então desafio com um inóculo de aerossol de 300 ufc da linhagem Erdman ou da acR-Erdman. As eutanásias foram obtidas por inalação de CO2. Os baços e os pulmões direitos foram removidos assépticamente, os tecidos foram colocados em um conjunto de trituração vedado (IdeaWorks! Laboratory Products, Syracuse NY EUA) ligado e um homogeneizador Glas-Col (Terre Haute, IN EUA) e homogeneizados. As contagens de células viáveis foram determinadas por titulação em placas de ágar 7H10 contendo OADC 10%.

Avaliação Histopatológica: Pulmões esquerdos foram colhidos de camundongos e fixados em formalina 10% (Accustain, Sigma). Os pulmões foram incrustados em parafina, cortados em seções de 4 μπι e manchados com hematoxilina è eosina.

Citometria de fluxo e manchas de tecido: Populações de células foram analisadas em um citômetro de fluxo FACScalibur Becton-Dickinson com uma Mac. Workstation. Os dados foram coletados em modo de listagem e análises offline foram feitas utilizando-se o software PC platform Winlist (Verity Sfoftware House, Topsham Maine, EUA). Os anticorpos para a citometria de fluxo foram adquiridos da BD Pharmingen (San Diego, CA, EUA). As amostras foram incubadas com o clone 2.4G2 de Rato Anti-Camundongo Anti- CD16/CD32 (Fc Block, BD Pharmingen) por 15 minutos para reduzir as atividades secundárias. Um total de 10.000 eventos confinados em cada espécime foi coletado e as janelas ("gates") de análise incluíam uma janela de linfócitos e uma janela não-linfócita com base no tamanho e na granularidade das células, com as dimensões de janela mantidas constantes entre os experimentos.

Exemplo 1: Construção da SAD-BCG ΔΗ28ΔΗ76 [também referida como "BCG (mut sodA ΔΗ28ΔΗ76)", ou "BCG com SodA diminuída que expressa a SodA mutante ΔΗ28ΔΗ76 dominante-negativa"] e documentação de SOD reduzida in vitro

Para construir a SAD-BCG ΔΗ28ΔΗ76, um mutante de sodA ΔΗ28ΔΗ76 em pCR2.1-TOPO foi feito realizando-se mutagênese de local direcionado baseado em RCP no alelo sodA tipo selvagem que havia sido amplificado pòr RCP a partir de DNA cromossômico da M. tuberculosis H37Rv. A fase de leitura aberta do alelo sodA mutante ΔΗ28ΔΗ76 é mostrada abaixo. Os códons de início e final estão em negrito, e — mostra a posição dos dois códons CAC (codificadores de histisdina) removidos correspondendo ao aminoácido 78 da enzima. SEQIDNOrl

1 - gtg gcc gaa tac acc ttg cca gac ctg gac 31 - tgg gac tac gga gca ctg gaa ccg cac ate 61 - tcg ggt cag ate aac gag ctt cac — age 91 - aag cac cac gcc acc tac gta aag ggc gcc 121 - aat gac gcc gtc gcc aaa ctc gaa gag gcg 151 - cgc gcc aag gaa gat cac tca gcg ate ttg 181 - ctg aac gaa aag aat cta gct ttc aac ctc 211 - gcc ggc cac gtc aat — acc ate tgg tgg 241 - aag aac ctg tcg cct aac ggt ggt gac aag 271 - ccc acc ggc gaa ctc gcc gca gcc ate gcc 301 - gac gcg ttc ggt tcg ttc gac aag ttc cgt 331 - gcg cag ttc cac gcg gcc gct acc acc gtg 361 - cag ggg tcg ggc tgg gcg gca ctg ggc tgg 391 - gac aca ctc ggc aac aag ctg ctg ata ttc 421 - cag gtt tac gac cac cag acg aac ttc ccg 451 - cta ggc att gtt ccg ctg ctg ctg ctc gac

481 - atg tgg gaa cac gcc ttc tac ctg cag tac 511 - aag aac gtc aaa gtc gac ttt gcc aag gcg 541 -ttt tgg aac gtc gtg aac tgg gcc gat gtg 571 - cag tca cgg tat gcg gcc gcg acc tcg cag 601 - acc aag ggg ttg ata ttc ggc tga

As posições dessas remoções de aminoácidos no contexto das alfas hélices principais, filamentos-beta e local ativo Fe(III) do monômero da SodA são mostrados na Fig. 1.

Uma consulta BLASTN desta seqüência de DNA contra a seqüência de nucleotídeos da seqüência completa da M. tuberculosis H37Rv foi realizada utilizando-se o servidor BLAST do site da Tuberculist (http://genolist.pasteur.fr/TubercuList/), documentando a remoção dos dois códons CAC (histidina)

≥M. tuberculosis H37Rv|null M. tuberculis H37RV (4411532 bp)

Lengih = 4411532 Score =1181 bits (596), Expect = 0.0 Identities = 618/624 (99%), Gaps - 6/624 (0%) Strand = Plus / Plus

Query: 1 gtggccgaatacaccttgccagacctggactgggactacggagcactggaaccgcacatc 60

11111111 Il Il 111111 111111111111111 1111 11111111 11

Sbjct: 4320704 gtggccgaatacaccttgccagacctggactgggactacggagcactggaaccgcacatc 4320763

Query: 61 tcgggtcagatcaacgagcttcacagcaagcaccacgccacctacgtaaagggcgcc 117

Il 1111 Il 111 Il 111 Il11111 IlllllillllllllllllllllllIMIIIII

Sbjct: 4320764 tcgggtcagatcaacgagcttcaccacagcaagcaccacgccacctacgtaaagggcgcc 4320823 Query. 118 aatgacgccgtcgccaaactcgaagaggcgcgcgccaaggaagatcactcagcgatcttg 177

M 1111111111111111111111 Il 11111111111111111111 Il 111111 Il 11111

Sbjct: 4320824: aatgacgccgtcgccaaactcgaagaggcgcgcgccaaggaagatcactcagcgatcttg 4320883

Query: 178. ctgaacgaaaagaatctagctttcaacctcgccggccacgtcaat----accatctggtgg 234

111111 Il 111111111111111111111111111111111111 11 Il I Il 11111

Sbjct: 4320884- ctgaacgaaaagaatctagctttcaacctcgccggccacgtcaatcacaccatctggtgg 4320943

Query: 235 aagaacctgtcgcctaacggtggtgacaagcccaccggcgaactcgccgcagccatcgcc 294

11111111111111111111111111111111111111111111111111111111 Il 11

Sbjct: 4320944 aagaacctgtcgcctaacggtggtgacaagcccaccggcgaactcgccgcagccatcgcc 4321003 Query: 29S gacgcgttcggttcgttcgãòâagttccgtgcgcagttecacgcggccgctaccaccgtg 354

1111IJ11111111111111M I í 1111111 Il 111111111 Il 111 (111 Il 111111

Sbjct: 4 321,0 04 gacgcgttcggttcgttggacaagttccgtgcgcagttccacgcggccgctaccaccgtg 4321063 Qusry: 355 caggggtcgggctgggcggcactgggetgggacacaetcggeaaeaagctgctgatafctc 414

IHlllllllllllllMllllllMlllllllllllillllllllNllllllIIIIlI

Sbjcti 4321064 caggggtcgggefcgggcggcactgggctggçracaeãctcggcaacaagc tgctgatafctc 4321123

Query= 415 caggtttacgaceaccagacgaacttcccgctaggcattgttccgcfcgctgctgctcgac 474

IMlllliniMlllMlMllllllMMllllllllllMlllisilllIIIiniI

Sbjct: 4321124 caggtttacgaccaccagacgaacttcccgctagrgcattgttccgctgctgctgctcgac 4321183

Query: 475 atgigg-gaacacgccttctacctgcagitacaagaacgtcaaagfccgaçtttçfccaaggcg 534

I M IMl Il Ill Il Il I Ml Il IIIIM III Iil MM II) I IIlI Il III Il IM Ill I

sbjct: 4321184 atgtgggaacacgccttctacctgç3gt&eaag&ç«;gtcaaagtcgactttgccciaggcg 4321243

ttttggaacgtcgtgaactgggccgatgtgcagtcacggtatgcggccgcgacctcgcag 594

IMllMaMllMlllMMillllllMMlMllMMllMlllllllliIlIlII

ttttggaacgfccgtgaactgggGcgatgtgcagtcacggtatgcggccgcgacctcgcag 43213 03 accaaggggttgatattcggctga 618 (SEQ XD NO:2)

Il I Il Il Il I Il IIH I Illl Il I

accaaggggttgatattcggctga 4321327 (,SEQ ID NO: 3)

Uma consulta TBLASTN também foi feita em confronto com os dados de seqüências de nucleotídeos traduzidas no site da TubercuList BLAST (http://genolist.pasteur.fr/TubercuList/), mostrando as posições das histidinas removidas.

M. tuberculosis H37Rv|null M. tuberculis H37RV (4411532 bp) Lenglh = 4411532

Score = 418 bits (1075), Expeot = e-118

Identities = 205/207 (99%), Positives = 205/207 (99%), Gaps = 2/207 (0%) Frame = +2

Queryj 535 Sbj ctí 432:1244

Query: 595 SbjCt: 4321304 Query: 1 ; VAEYTLpDliDsTOYGALBpHisGQxNELH-SKHHATYvKGAHDAvjuajEEARAKEDHSAXL 59

Sbjct: 4320704 VAEYTLPDLDWDYGAIíBPHISGQIOTLHHSKHHATYVKGANDAVAKLEEARAKEDHSAIL 4320883

Query: 60 LNBKNIAFNIAGHVN-TIVIWK^SPNGGDKPTGEIiAAAIADAFGSFDK 118

SbjCt: 4320884 LNEKNLAPNIAGH^llTIWWKl^SPI^DKPTGELAAAIADAFGSFDK^ 4221063

Query: 119 QGCGWAAI^WDTIX!KKIjL3PQV^T3HQTNPPI^XVPLLia.DMWBHAF^'IiQYí^IVK\'DFAXA 178

Sbjct: 4321064 QGSGWAM&mTLGNKLLlPQVYDHQTNFPLGIVPLLLLDmBHAÍ-YLQYKNVKirDFAKA 4321243

Query: 179 PWNWNWADVQSRYAAATSQTKGLIFG 205 (SEQ ID NO:4)

Sbjct: 4321244 FWIIWNWADVQSRYAAATSQTKGLXFG 4321324 (SEQ ID NO: 5)

Consultas BLASTN e TBLASTN também foram feitas contra dados de seqüência de nucleotídeos no servidor M. bovis BLAST da Sanger Centre (http://www.sanger.ac.Uk/cgi-bin/blast/submitblast/m bovis). A Sanger Centre está seqüenciando a Micobactéria bovis BCG Pasteur, a construção da BCG M. bovis preliminar foi utilizada. Os resultados (abaixo) mostram que além das duas remoções de códons CAC, na BCG há uma diferença adicional de nucleotídeos T-C que leva a uma substituição de aminoácidos I —* T na posição 203.

Resultados BLASTN

>BCG79c08.slk ISl 51 bp, 160 reads, 36.25 AT [PulI Sequence] Length= 19,151 Plus Strand HSPs:

Score = 3021 (459.3 bits), Expect = 6.4e-132, P = 6.4e-132

Identities = 617/624 <98%), Positives = 617/624 (98%), Strand = Plus / PLus

[HSP Seauencel GTGGÇCXS^TACACCTTQCCAGACCTGGACTGGGACTACGGAGCACTGGAACCGCACATC 60

ΜΜΓΙΙΙΜΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΜΙΙΙΙΙΙΙΜΙΙΜΙΙΙΙΙΙΙΙΙΜΙΙΜΜΙΙΙΙΙΙ

GTGGCCGAATACACCTTGCCAGACCTGGACTGGGA.CTACGGAGCAGTGGAACCGCACATO 11215 TCGGGTCAGATCAACGAGCTTCAC---AGCAAGCACCACG CCACCTACGTAAAGGGCGCC 117 I Il 1111111Π 111111111 IlllllinilllllMMllllllilIIIIII

TC G(^TCAGATCAACGAGCTTCACCACAGGAAGCACCACXJCCACCmCGTAAAGGGCGCC 11275 Query: 118 AATGACGCCGTCGCCAAACTCGAAGAGGCGCGCGCCAAGGAAGATCACTCAGCGATC1TG 177

ΙΙΙΜΙΜΙΙΜΙΙΙΙΙΙΜΙΙΙΙΙΙΙΙΙΜΙΙΙΙΙΙΗΙΙΙΙΙΜΜΙΜΜΙΜΜΜ

Sbj ct: 112 7S AAT^^CGCCGSCGCOUU^CTCGAAGAGGCGCGCGCCAAGGAAGATCACTCAGCGATCTTG 11335 Query: 178 CTGAACGAAAAGAATCTAGCTTTCAACCTCGCCGGCCACGTCAAT---ACCATCTGGTGG 234

IllllfMlllMMllMllIIIIIfMMI IΙΜΙΙΙΜΜΠ IIiiMlIIiII

SbjCt.: 11336 CTGAACGAAAAGftATCTAGCTTTCAACCTCGCCGGCCACGTCAATCACACCATCTGGTGG 11395 Que:ry: 235 AAGAACCTGTCGCCTAACGGTGGTGACAAGCCCACCGGCGAACTCGCCGCAGCCATCGCC 294

IllllilMlllllMlllMllllllilNlMlllllllllllMlllIIIMMIlIi

Sbj-Ct: 113 96 AAGAACCTGTCGCCTAACGGTGGTGACAAGCCCACCGGCGAACTCGCCGCAGCCArCGCC 114 55 Query: 295 (mCeTOTTCGGTTCGTTCGACAAGrTCCGTGCGCA.GTTCOVCGCGGCCGCTACCACCGTG 354

ΙΜΜΙΙΙΙΙΙΜΜΜΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΜΙΜΙΙΜΙΜΙΙΜΜΙΙΙΙΙΜΙΜΙΜ

SbjCt: 11455 GACGGGTTCGGTTCGTTCGACAAGTTCCGTGCGCAGTTCCACGCGGCCGCTACCACCGTG 11315 Ôuery: 3 55 CAGGGGTCGGGCTGGGCGGCACTGGGCTGGGACACACTCGGCAACAAGCTGCTGATATTC 414

11IMII Illll Il Mll Ill 11IIIII Il Il MMillllllllllllllIIIMIII I

Sbjct: IlS 16 ÇAG<^TCGGGCTGGGCGGCACTGGGCTGGGACACACTCGGCAACAAGCTGCTCATATTC 11575 Query: 415 CAGGTTTACGACCACCAGACGAACTTCCCGCTAGGCATTGTTCCGCTGCTGCTGCTCGAC 474

M IiiIMMI Iilll MiIMMII Il Iliil M Ill I Ml I Ii MiIIIi M IIiMi

Sibj Ct: 11576 CAGGTTTACGACCACCAGACGAACTTCCCGCTAGGCATTGTrCCGCTGCTGCTGCTCGAC 11635 Query: 4;75 ATGTGGGAACACGCCTTCTACCTGCAGTACAAGAACGTCAAAGTCGACTTTGCCAAGGCG 534

illilll IMliMMflMlMllMllllMMllMMlllMMllMIIIIlIM

SbjCt: 11636 ATGrGGGAACACGCCTTCTACCTGCAGTACAAGAACGTCAAAGTCGACTTTGCCAAGGOG 1169S

Query: 1

Sbj Ct: 111.56

Query: 61 SbjCt: 11216

Query: Sbjct:

535 TTrTGGAACGTCGTGAACTGGGCCGATGTGCAGTCACGGTATGCGGCCGCGACCTCGCÃG 594

IllllllllllllllirilllllllllllllllMilllMlllllllMIIIMMIII

11696 TTrTGGAACGTCGTGAACTGGGCCGATGTGCAGTCACGGTATGCGGCCGCGACCTCGCAG 1175 5 Query: 595 ACCAAGGGGTrGATATTCGGCiPGA 618 (SEQ ID NO: S!

1111111111111111111111111

Sbjct: 11756 ACCAAGGGGTTGACAITCGGCTGA 11779 (SEQ ID NO: 7)

Resultados TBLASTN:

>BCG79c08.slk 19151 bp, 160 reads, 36.25 AT [Full Sequence] Length = 19,151 Plus Stiand HSPs:

Score = 1076 (383.8 bits), Expect = 3.6e-109: P = 3.6e-109 Identities - 204/207 (98%), Positives = 204/207 (98%), Frame = +2 [HSP Sequence]

Query: 1 VAEYTLPDLDWDYGALEPHISGQINELH- SKHHATYVKGANDAVAKLEEARAKEDHSAIL 59

SbjCt: 11156 VABYTbPDLDWDYGALSPHISQQINEmiHSKHHATYVKGANDAVAKLEEARAKEDHSAIL 11335

Query: 60 Lnekniiapnlaghvn-Tiwwknlspnggdkptgelaaaiadafgsfdkfraqfhaaattv lie

Sbjct: 11336 LNtDKNLAFNLAGHVNHTIWWKNLSPNGGDKPTGELAfiAIADAFGSFDKFRAQFHAAATTV 11515

Query: 119 QGSGWAALGWDTLGNKLLIFQVYDHQTNFPLGXVPI1LLLDMVfEHAFYLQYKN1ZKVDFAKA 17B Sbjct: 11516 QGSGWAALGWDTLGNKLLIFQVYDHQTNFPLGIVPLLLLDMWEHAFYLQYKNVKVDFAKA 11695

Query: 179 FWNVVNWADVQSRYAAATSQTKGLIFG 205 (SEQ ID NO; 8)

SbjCt: 11696 ÍTOíWNWADVQSRYAAATSQTKGLTFG 11776 (SEQ ID NO: 9)

Em seguida, o alelo sodA mutante foi ligado dentro do vetor de integração cromossômica pMP399 e do vetor plasmídeo pMP349 atrás de um promotor aceA(icl) para dar pMP399-mut SodA ΔΗ28Δ76 (Tabela 1). Os mapas de plasmídeos são mostrados na Fig. 2 e as seqüência de nucleotídeos completas dessas construções estão incluídas nas observações da Tabela 1. A seqüência mostrada abaixo enfatiza a seqüência de nucleotídeos do promotor aceA (icl) através da fase aberta de leitura de sodA mutante. As caracterítsicas importantes são: [a] a seqüência que codifica o promotor associado ao AceA(icl) (base 5044 até base 5385), [b] a fase aberta de leitura para o mutante sodA(ΔH28Δ76) (base 9 até base 626), e [c] um local de restrição Kpnl (base 1 a base 8) utilizado para conectar [a] e [b]:

SEQ ID NO: 10

5041 ctgttac aacgctcaca tatgtggttg gcgacgagcc caaggcagtc gcctcgctgt 5101 tcaatctgtg accggatccg caggacgtcg atccgtgggt ttacctgcgg atttgtcgtt 5161 actggcgggt agcttctgaa acggttcagt ttttgggcga cttcgcaaaa tttgcaaaaa 5221 gtccgcaggc cgttgccgaa attcgcaagt gaaatgggtg gaccagcgtt gacaegctgt 5281 gccatggtcg agttagcaca ccagtgaagc tgcgccgttg acaccgcctg gacgacggta 5341 gggcgtcagc gttttcggca atgaaagacc gttaaggagt tgtct 1 ggtaccccgt ggccgaatac accttgccag acctggactg ggactacgga gcactggaac 61 cgcacatctc ggglcagatc aacgagcttc acagcaagca ccacgccacc tacgtaaagg 121 gcgccaatga cgccgtcgcc aaactcgaag aggcgcgogc caaggaagat cactcagcga 181 tcttgctgaa cgaaaagaat ctagctttca acctcgccgg ccacgttaat accatctggt 241 ggaagàacct gtcgcctaac ggtggtgaca agcccaccgg cgaactcgcc gcagceateg 301 ccgacgcgtt CggttCgttC gacaagttcc gtgogcagtt ccacgcggcc gctaccaccg 361 tgcaggggtc gggctgggcg gcactgggct gggacacact cggcaacaag ctgctgatat 421 tccaggttta cgaccaccag acgaacttcc cgctaggcat tgttccgctg ctgctgctcg 481 acatgtggga acacgccttc tacctgcagt acaagaacgt caaagtcgac tttgccaagg 541 cgttttggaa ogtcgtgaac tgggccgatg tgcagtcacg gtatgcggcc gcgacctcgc 601 agaccaaggg gttgatattc agctga

Em seguida, o pMP399-mut SodA ΔΗ28ΔΗ76 foi eletroporado na BCG Tice para produzir a SAD-BCG ΔΗ28ΔΗ76 (BCG com SodA diminuída, também chamada de BCG (mut sodA ΔΗ28ΔΗ76). Os transformantes foram selecionados em ágar contendo apramicina. RCP de DNA cromossômico utililizando seqüência de nucleotídeos únicas ao vetor pMP399 foi utilizada para verificar o sucesso da integração do vetor dentro do cromossomo da BCG.

Para determinar o efeito da expressão de SodA ΔΗ28ΔΗ76 sobre a atividade de SOD de toda a bactéria, sobrenadantes de lisatos de BCG e de SAD- BCG ΔΗ28ΔΗ76 foram preparados como descrito acima e comparados quanto às suas atividades de SOD monitorando-se a interferência (pela SOD) com a redução de citocromo C por superóxido (02-) gerado por xantina oxidase. Os resultados são mostrados na Fig. 3 e demonstram que a maior parte da atividade pode ser encontrada no sobrenadante, e que a estratégia dominante-negativa resulta em uma redução de aproximadamente 8 a 16 vezes na redução da atividade de SOD.

Exemplo 2: Construção de SAD-BCG ΔΕ54 (também conhecida como BCG (mut sodA ΔΕ54), ou BCG com SodA diminuída que expressa SodA mutante ΔΕ54 dominante-negativa) e documentação de atividade de SOD reduzida in vitro

Úm mutante adicional de sodA dominante negativo com uma remoção ΔΕ54 foi construído utilizando-se as técnicas descritas. A posição desta remoção de aminoácidos no contexto das hélices alfa principais, filamentos-beta, e o local ativo de Fe(III) do monômero da SodA são mostrados na Fig. 1. O seqüenciamento de DNA do gene em pCR2.1-TOPO identificou uma substituição adicional de nucleotídeos que introduziu uma substituição de histidina —* arginina na posição 28.

O alelo de sodA ΔΕ54 mutante foi ligado dentro do vetor de integração cromossômica pMP399 e do vetor plasmídeo pMP349 atrás de um promotor aceA(icl) para dar pMP399 mut SodA ΔΕ54 e pMP349-mut SodA (Tabela 1). As seqüência de nucleotídeos completas dessas construções estão incluídas nas anotações da Tabela 1. O pMP399 mut SodA ΔΕ54 foi eletroporado na BCG Tice para produzir a SAD-BCG ΔΕ54 (BCG com SodA diminuída, também chamada de BCG (mut sodA ΔΕ54).

Para determinar o efeito da expressão da SodA ΔΕ54 mutante sobre a atividade de SOD de toda a bactéria, sobrenadantes e lisatos da BCG e da SAD-BCG ΔΕ54 foram preparados como descrito acima e comparados quanto à sua atividade de SOD. Os resultados são mostrados na Fig. 4 e demonstram uma redução menos marcante na atividade total de SOD do que a observada com a SAD-BCG ΔΗ28ΔΗ76.

Exemplo 3: A eficácia da vacina de SD-BCG-AS-SOD — implicações com relação à utilidade de linhagens da BCG com Sod diminuída dòminante-negativas

Para quantificar a melhora na eficácia da vacina que ocorre em conseqüência da redução da produção de SodA, a BCG, BCG e a SD-BCG-AS- SOD (BCG com SodA diminuída construída utilizando-se técnicas anti-senso conforme anteriormente descrito em WO 02/062298) foram comparadas. Os detalhes experimentais e os resultados são mostrados na Fig. 5 e indicam que os camundongos; C57B1/6 vacinados com SD-BCG-AS-SOD tinham contagens menores de ufc nos pulmões e menos danos aos pulmões do que os camundongos vacinados com BCG seis meses depois do desafio de aerossol com M. tuberculosis virulenta.

Em um experimento de vacinação-desafio separado, camundongos C57B1/6 foram vacinados subcutaneamente, descansaram por 100 dias, e foram colhidos para a análise das reações de células-T no pulmão em 4, 10 e 18 dias após o desafio de aerossol com M. tuberculosis virulenta. Comparados com os camundongos; vacinados com a BCG, os camundongos vacinados com a SD- BCG-AS-SOD ixibiram maiores números de células-T CD4+ e CD8+ que eram CD44+/CD45RBhigh 4 dias após o desafio, e números maiores de células-T CD4+ que foram CD44+/CD45RBneg em 18 dias (Fig. 6). Estas diferenças nas reações de células-T eram associadas a uma diferença na aparência histopatológica dos pulmões após o desafio, incluindo um desenvolvimento mais rápido de lesões de Ghon (Fig. 7).

Com base nesses resultados e em resultados relatados aqui em outras partes, uma acenturação comparável da eficácia da vacina é esperada com as linhagens SAD-BCG construídas utilizando-se a expressão de SodA mutante dominante-negativa como descrito acima. Exemplo 4: Construção e avaliação da vacinação da SIG-BCG (também referida como: BCGAsigH)

Ò efeito da diminuição de outros antioxidantes produzidos pela BCG sobre a eficácia da vacinação foi avaliado. Como discutido acima, o sigH é um fator sigma envolvido na reação bacteriana ao stress oxidativo, e regula a produção de tioredoxina, tioredoxina redutase, e um homólogo da glutaredoxina.

O sigH no cromossomo da BCG Tice foi inativado pela utilização do sistema dt Phasmatodea de Williams Jacobs, Jr. do Albert Einstein College of Medicine, utilizando-se métodos publicados para a aplicação desse sistema a genes inativados nas microbactérias (Braunstein, M. e outros, 2002). As regiões superiores e inferiores do sigH foram clonadas no pYUB854 para construir o vetor de inativação alélica—a seqüência de DNA de pYUB854-sigH é mostrada nas anotações da Tabela 1, e o mapa e as características desse vetor são mostradas na Fig. 8.

Uma estratégia alternativa para construir a SIG-BCG (BCGAsigH) envolveo uso de vetores plasmídeos suicidas como descrito e referido aqui acima, cujo uso é bem conhecido pelos versados na técnica.

A SIG-BCG foi testada como vacina. Camundongos C57B1/6 foram vacinados subcutaneamente com a BCG ou com a SIG-BCG, descansaram por 100 dias, e então foram desafiados por aerossol com a linhagem AcrR- Erdman da M. tuberculosis virulenta. Em seis meses após o desafio, os camundongos; vacinados com a SIG-BCG tinham contagens menores de ufc da M. tuberculosis virulenta nos pulmões (Fig. 9), e menos danos aos pulmões (Fig. 10) do que os camundongos vacinados com a BCG. A aparência histopatológica ao longo do tempo dos pulmões dos camundongos vacinados com a SIG-BCG desafiados còm a M. tuberculosis virulenta mostrou similaridades com os resultados mostrados acima para os camundongos vacinados com a SD-BCG- AS-SOD (exemplo 3)—e mais notável foi o desenvolvimento das lesões de Ghon nos camundongos vacinados com a SIG-BCG e sua resolução aparente ao longo do tempo (Fig. 11) que correspondeu às baixas contagens de ufc nos pulmões. Exemplo 5 - Construção da SAD-SIG-BCG, uma "vacina BCG pro-apoptótiea de segunda geração", e documentação de atividade de SOD reduzida

À eficácia de vacinação aumentada de duas vacinas BCG pro- apoptóticas diferentes (SD-BCG-AS-SOD e SIG-BCG) como exemplificado nos exemplos 3 e :4 mostra que os oxidantes gerados pelos hospedeiros têm íunções importantes no sistema imunológico dos hospedeiros. Os anti-oxidantes microbianos interferem nessas funções importantes dos oxidantes (Fig. 12), e desse modo; prejudicam a sinalização prematura necessária para o desenvolvimento de uma forte reação imunológica protetora.

As observações dos exemplos 3 e 4 que envolvem duas vacinas BCG pro-apoptóticas, cada uma com uma única modificação genética, indicam que a introdução de dois ou mais defeitos na produção de antioxidantes pela BCG leva ia uma vacina mais potente. Como discutido acima, os microorganismos produzem um arranjo variado de enzimas anti-apoptóticas, muitas das quais estão envolvidas na inativação de oxidantes do hospedeiro. A Fig. 13 mostra uma estratégia para combinar modificações genéticas na BCG (e na M. tuberculosis) para introduzir uma, duas, três ou quatro manipulações genéticas que reduzem a produção de antioxidantes, dando, respectivamente, as vacinas pro-apoptóticas de Ia, 2a, 3a e 4a geração.

Para produzir vacinas BCG pro-apoptóticas "de 2a geração", os vetores de expressão de sodA mutante dominante-negativa (pMP399-mut SodA ΔΗ28ΔΗ76; pMP349 mut SodA ΔΗ28ΔΗ76; pMP399 mut SodA ΔΕ54; e pMP349 mut SodA ΔΕ54) foram eletroporados na SIG-BCG para dar a SAD- SIG-BCG. Oà resultados dos ensaios de atividade de SOD sobre lisatos e sobrenadantes dessas linhagens são mostrados na Fig. 14 e demonstram reduções semelhantes na atividade de SOD às mostradas para as vacinas SAD-BCG de Ia geração. A super-expressão do mutante de sodA ΔΗ28ΔΗ76 dominante-negativo resultou em Uma maior redução na atividade de SOD (de aproximadamente 8- vezes) do que a super-expressão do mutante de sodA ΔΕ54 (de aproximadamente 4-vezes). Exemplo 6 - Construção da BCG-RD (também conhecida como: BCGAsigHAsecA2)

Uma outra vacina BCG pro-apoptótica "de 2a geração" foi produzida utilizando-se os métodos delineados no exemplo 4 para inativar o sigH no cromossomo da SEC-BCG (também referida como: "BCGAsecA2") para produzir a BCG-RD, que é uma abreviação de "BCG com remoção dupla". A Fig. 15 mostra uma membrana de hibridização Southern que documenta a construção bem sucedida da BCG-RD.

Exemplo 7 - Construção da 3D-BCG e documentação da atividade de SOD reduzida in vitro Para produzir vacinas BCG pro-apoptóticas "de terceira geração", os vetores de expressão de sodA mutante dominante-negativa (pMP399-mut SodA AH28AH76; pMP349 mut SodA AH28AH76; pMP399 mut SodA ΔΕ54; e e pMP349 mut SodA ΔΕ54) foram eletroporados na BCG-RD para dar a 3D- BCG.

Os resultados dos ensaios de atividade de SOD sobre lisatos e sobrenadantes dessas linhagens são mostrados na Fig. 16. Ao contrário dos resultados que envolvem a SAD-BCG e a SAD-SIG-BCG, em que a atividade de SOD se deu predominantemente no sobrenadante (Figs. 3, 4, 14), os resultados na Fig. 16A mostram que a atividade de SOD na BCG-RD e na 3D-BCG estavam predominantemente nos lisatos de células. Esta inversão ocorre porque a inativação de secA2 na BCG destrói o canal de segregação para a SodA, fazendo com que esta seja retida pela bactéria ao invés de secretada extracelularmente.

Essa localização da SodA nos lisatos dessas linhagens facilita o uso de oturas técnicas para quantificar a quantidade de SodA. A Fig. 17 mostra resultados da SDS-PAGE e hibridização Western comparando a quantidade de SodA conforme determinada pela observação direta da faixa de SodA de 23 KDa em SDS-PAGE e após a hibridização com anticorpos policlonais de SodA de coelho (Western). Esses resultados indicam que apesar da redução marcante na atividade da SOD exibida pelos isolados de 3D-BCG em que os mutantes de SodA ΔΗ28ΔΗ76 e ΔΕ54 haviam sido super-expressos, há uma quantidade comparável dè proteína da SodA. Isso indica que a super-expressão dos mutantes de SodA ΔΗ28ΔΗ76 e ΔΕ54 induz um efeito dominante-negativo, interferindo na atividade biológica da SodA apesar das quantidades comparáveis do total de proteínas da SodA (tipo selvagem mais mutante).

Esses resultados também indicam que pode haver uma vantagem em se praticar a estratégia de SodA mutante dominante-negativa em combinação com a inativação alélica de secA2. Parece haver uma maior redução global na atividade total de SOD nas linhagens com a remoção de secA2 em comparação com as linhagens sem esta remoção. Por exemplo, enquanto os isolados da SAD- BCG e da SAD-SIG-BCG com mutantes de SodA ΔΗ28ΔΗ76 dominante negativos exibiram uma redução de 8 a 16-vezes na atividade de SOD total (Figs. 3 e 14), a reação pareceu ser de 32-vezes ou mais quando o mutante de SodA ΔΗ28ΔΗ76 foi adicionado à BCG-RD (Fig. 16). De forma semelhante, uma maior redução em atividade de SOD foi alcançada quando o mutante de SodA ΔΕ54 foi posto dentro da BCG-RD (Fig. 16; redução de 16-vezes) do que na BCG ou na SIG-BCG (Figs. 4 e 14; redução de 2- a 4-vezes).

Exemplo 8 - Adição de glutamina sintase dominante-negativa à 3D-BCG parà dar vacinas 4D-BCG

Ó glutamato e a glutamina exercem efeitos pro- e anti-apoptóticos, respectivamente, sobre células mamíferas. A glutamina sintase (também chamada "glutamina sintetase") catalisa a reação entre glutamato e amônia para dar glutamina. A M. tuberculosis e a BCG têm diversos alelos em seus cromossomos que codificam glutamina sintase ou momólogos. Um desses, glnAl, é produzido em grandes quantidades e segregada extra-celularmente.

Para construir a 4D-BCG, um mutante da glnAl dominante- negativo em PCR2.1-TOPO foi construído realizando-se mutagênese de local direcionado baseado em RCP no alelo da glnAl tipo selvagem que havia sido amplificado por RCP a partir de DNA cromossômico da M. tuberculosis H37Rv. A fase de leitura aberta do alelo da glnAl mutante Δϋ54ΔΕ335 é mostrada abaixo. Os códons de início e final estão em negrito, e — mostra a posição dos dois códons rèmovidos correspondendo ao aminoácido 54 e ao aminoácido 335 da enzima. SEQ ID NO: 11

1 - gtg acg gaa aag acg ccc gac gac gtc ttc 31 - aaa ctt gcc aag gac gag aag gtc gaa tat 61 - gtc gac gtc cgg ttc tgt gac ctg cct ggc 91 - ate atg cag cac ttc acg att ccg gct tcg 121 - gcc ttt gac aag age gtg ttt gac gac ggc 151 - ttg gcc ttt — ggc tcg tcg att cgc ggg

181 - ttc cag tcg ate cac gaa tcc gac atg ttg 211 - ctt ctt ccc gat ccc gag acg gcg cgc ate 241 - gac ccg ttc cgc gcg gcc aag acg ctg aat 271 - ate aac ttc ttt gtg cac gac ccg ttc acc 301 - ctg gag ccg tac tcc cgc gac ccg cgc aac 331 - ate gcc cgc aag gcc gag aac tac ctg ate 361 - age act ggc ate gcc gac acc gea tac ttc 391 - ggc gcc gag gcc gag ttc tac att ttc gat 421 - tcg gtg age ttc gac tcg cgc gcc aac ggc

451 - tcc ttc tac gag gtg gac gcc ate tcg ggg 481 - tgg tgg aac acc ggc gcg gcg acc gag gcc 511 - gac ggc agt ccc aac cgg ggc tac aag gtc 541 - cgc cac aag ggc ggg tat ttc cca gtg gcc 571 - ccc aac gac caa tac gtc gac ctg cgc gac

601 - aag atg ctg acc aac ctg ate aac tcc ggc 631 - ttc ate ctg gag aag ggc cac cac gag gtg 661 - ggc age ggc gga cag gcc gag ate aac tac

691 - cag ttc aat tcg ctg ctg cac gcc gcc gac 721 - gac atg cag ttg tac aag tac ate ate aag 751 - aac acc gcc tgg cag aac ggc aaa acg gtc 781 - acg Itc atg ccc aag ccg ctg ttc ggc gac 811 - aac ggg tcc ggc atg cac tgt cat cag tcg 841 - ctg tgg aag gac ggg gcc ccg ctg atg tac 871 - gac gag acg ggt tat gcc ggt ctg tcg gac 901 - acg gcc cgt cat tac ate ggc ggc ctg tta 931 - cac cac gcg ccg tcg ctg ctg gcc ttc acc 961 - aac ccg acg gtg aac tcc tac aag cgg ctg 991 - gtt ccc ggt tac — gcc ccg ate aac ctg 1021 - gtc tat age cag cgc aac cgg tcg gea tgc 1051 - gtg cgc ate ccg ate acc ggc age aac ccg 1081 - aag gcc aag cgg ctg gag ttc cga age ccc 1111 - gac tcg tcg ggc aac ccg tat ctg gcg ttc 1141 - tcg gcc atg ctg atg gea ggc ctg gac ggt 1171 - ate aag aac aag ate gag ccg cag gcg ccc

1201 - gtc gac aag gat ctc tac gag ctg ccg ccg 1231 - gaa gag gcc gcg agt ate ccg cag act ccg 1261 - acc cag ctg tca gat gtg ate gac cgt ctc 1291 - gag gcc gac cac gaa tac ctc acc gaa gga 1321 - ggg gtg ttc aca aac gac ctg ate gag acg 1351 - tgg ate agt ttc aag cgc gaa aac gag ate 1381 - gag ccg gtc aac ate cgg ccg cat ccc tac 1411 - gaa ttc gcg ctg tac tac gac gtt taa

As posições dessas remoções de aminoácidos no contexto dos íons de manganês do anel de glnAl hexamérico são mostrados na Fig. 18. Como o D54 e o E335 de monômeros adjacentes estão envolvidos na formação de locais ativos, que se encontram entre monômeros, a introdução de ambas as remoções em um único monômero destroem os locais ativos em cada lado do monômero à medida que este se estrutura em anéis como monômeros do tipo selvagem. Portanto, elas induzem um efeito dominante-negativo.

Uma consulta ao BLASTN desta seqüência de DNA contra a seqüência de nucleotídeos da seqüência completa da M. tuberculosis H37Rv foi realizada utilizando-se o servidor BLAST do site da Tuberculist (http://genolist.pasteur.fr/TubercuList/), documentando a remoção de dois códons.

>M. tuberculosis H37Rv|null M. tuberculis H37RV (4411532 bp) Length = 4411532 Score - 2793 bits (1409), Expect = 0.0 Identities = 1431/1437 (99%), Gaps = 6/1437 (0%) Strand = Plus / Plus

Queryt η gt-.gacggaaaagacgcccgacgacgtcttcaaacttgccaaggacgagaaggtcgaatat 60

IItI I Illll Il Illll 11II! Ill III Ill Illl Hlll IIIiniII Il 11 Ill Il Il

Sbjct: 2487615 gtgacggaaaagacgcoceacgacgtcttcaaacttccoaaggacgagasggtccaatat 2487674

Query: 61 : gtcgacgtccggctctgcgacctgcctggcatcacgcagcactccacgatcccggcctcg 120

MIl I Il 11IIII Il Ill Iiii I Il Ill Ml Il Ii I Il Il Ill Ii I Il I Il Il I Il IlIl

Sbjct: 2487675 gtcgacgtccggttctgtgacctgcctggcatcatgcagcacttcacgattccggcttcg 2487734

Query: 121 gcctttgacaagagcgtgtttgacgacggcttggccttt---ggctcgtcgattcgcggg 177

!MIMIlI ΙΙΠΜ! IIMIMIMMM1MUiM 111111111111111111

Sbjet: 2487735 gcctttgacaagaycgtgtttgacgacggcttggcctttgacggctçgtcgattcgcggg 2487794

Query: 178 . ttcsagtcgatccacgaatcciiacatgttgcttcttcccgatcccgagacggcgcgcatc 237

IllllllllillliuilllllMillllllillilllllMlllllirMllIIIIII

Sbjct: 2487795 ttccaçtcgatccacgaatccjacatgttgcttcttccogatccogíígarggr.gcgc^hf! 24f?7«5<l

Quety: 238 gacccçUtccgcgcggccaagac$ctgaatatcaacttctttgtgcacgacccgttc»cc 297

IllllllMlltlllirilliniinillllllllllliIIIIilI MIhIMII

S£>3et: 2487855 gacccgctccgcgcggccaagacgctgaatatcaacttecccgtgcacgacccgttcacc 2487914 Query: 298 : ctggagccgtactcccgcgacccgcgcaacatcgcccgcaaggccgagaactacctgatc 357

Sbjct: 2487915 ctggagccgtactcccgcgacccgcgcaacatcgcccgcaaggccgagaactacctgatc 2487974

Query: 358 agcactggcatcgccgacaccgcatacttcggcgccgaggccgagttctacafctttcgat 417

Sbjct: 2487975 agcactggcatcgccgacaccgcatacttcggcgccgaggccgagttctacatcttcgat 2488034

Query: 418 ; tcggtgsgçttegaçtcgcgçgcçaacggctccttctacgaggtggacgccatctcgggg 477

Sbjct: 248803 tcggtgagcttcgactegcgcgccaacggctccttctacgaggtggacgccatctcgggg 2488094

Query: 478 tggtggaacaccggcgcggcgaccgaggccgacggcagtcccaaccggggctacaaggtc 537

Sbjct; 2488095 tggtggaacaccggcgcggcgaccgaggccgacggcagtcccaaccggggctacaaggtc 2488154

Query; 538 cgccacaagggcgggtatttcccagtggcccccaacgaccaatacgtcgacctgcgcgac 597

Sbjct: 2488155 cgccacaagggcgggtafcttçccagtggcccccaacgaccaatacgtcgacctgcgcgrac 2488214

Query: 598 aagatgctgaccaacctgatcaactccggcttcatcctggagaagggccaccacgaggtg 657

Sbjct: 2488215 aagatgctgaccaacctgatcaactccggcttcatcctggagaagggccaccacgaggtg 2488274

Query: 658 ggcagcggcggacaggccgagatcaactaccagttcaattcgctgctgcacgccgccgac 717

Sbjct: 2488275 ggcagcggcggacaggccgagatcaactaccagttcaattcgctgctgcacgccgccgac 2488334

Query·. 718 : gacatgcagttgtacaagtaca.tcatcaagaacaccgcctggcagaacggcaaaacggtc 777

Sbjct: 2488335 gacatgcagttgtacaagtacatcatcaagaacaccgcctggcagaacggcaaaacggtc 2488394

Query: 778 acgttcatgcccaagccgctgttcggcgacaacgggtccggcatgcactgtcatcagtcg 837

Sbjct: 2488395 acgttcatgcccaagccgctgttcggcgacaacgggtccggcatgcactgtcatcagtcg 24BB454 Query: 838 : ctgtggaaggacggggccccgctgatgtacgacgagacgggttatgccggtctgtcggac 897

; í 11 í Il 111! 111! 111111Ilf!11IlíI Π Ilί 11 Π11! í 111 j 11 í f I j í j I ί j! i

Sbjct: 2488455 ctgtggaaggacggggccccgctgatgtacgaegagacgggttatgccggtctgtcggac 2488514

Query: 898 ; acggcccgtcattacatcggcggcctgttacaccacgcgccgtcgctgctggccttcacc 957

MllllllllllllllMllliMlllllllllllllllllliMMllllllllIIIIII

Sbjct: 2488515 acggcccgtcattacatcggcggcctgttacaccacgcgccgtcgctgctggccttcacc 2488574

Cuery: 958 : aacccgacggtgaactcctacaagcggctggttcccggttac---gccccgatcaacctg 1014

; M 11 Il 111111 Il 11 Il I Il III M11 Il 111111111111 11 M 1111111 Il 11

Sbjct: 2488575 aacccgacggtgaactcctacaaqcggctggttcccggttacgaggccccgatcaacctg 2488634

Cuery: 1015 gfcctatagccagcgcaaccggtcggcatgcgtgcgcatcccgatcaccggcagcaacccg 1074

M Il 11 Il I ί Il 111 i Il 11 Il Il 1111111 Il 11111 Il 11111111111 Il IM 1111

Sbjct: 2488635 gtctatagccagcgcaaccggtcggcatgcgtgcgcatcccgatcaccggcagcaacccg 24B8694

Çuery: 1075 : aaggccaagcggctggagttccgaagccccgactcgtcgggcaacccgtatctggcgttc 1134

i 1 Ill MMMll IIMIIII Ill Illl Illl I Illi Ill 11 Ill IIII1III Ill 11 Ill

Sbjct: 2488695 aaggccaagcggctggagttccgaagecccgactcgtcgggcaacccgtatctggcgttc 2488754

Query: 1135 tcggccatgctgatggcaggcctggacggtatcaagaacaagatcgagccgcaggcgccc 1194

1111111 Il 1111 Il 1111 Il 111111111 Il 1111 Il Il 11 Il 11 Il 11 Il 111 Il I Il

Sbjct: 2488755' tcggccatgctgatggcaggcctggacggtatcaagaacaagatcgagccgcaggcgccc 2488814

Cuery-- 1195 gtcgaeaaggatcfcctacgagctgccgccggaagaggccgcgagtatcccgcagactccg 1254

111 M 111Il I Il I Il 111111 Il I Il 1111 M I Il 11 Il Il Il 11 Il 11 Il 1111 Il Il

Sbjct: 2488815 gtcgacaaggatctctacgagctgccgccggaagaggccgcgagtatcccgcagactccg 2488874 Query: 12S5 acccagstctcagatgtgatcgaccgtctcgaggccgaccacgaatacctcaccgaagga 1314

IirilllllillllHlllllMlMMllllMlllMlllMlllllllllIIIIII

Sbjct: 2488875 'acccagctçtcagatgtgatcgaccgtctcgaggccgaccacgaatacctcaccgaagga 248B934

Query: 1315 ggggtgttcacaaacgaccbgetcgagacgtggatcagtttcaagcgcgaaa£cgagatc 1374

Ill IllllllMllKllllllllllMlllllllliMllllllllllllIIIIIMI

sb^ct= 2488935 ggggtgttcacaaacgacctgatcgagacgtggatcagtttcaagcgcgaaaacgagatc 2488994 Query: 1375 gagccggtcaacatccggccgcatccctacgaattcgcgctgtactacgacgtttaa 1431 {SEQ ID NO:12)

∣∣∣∣∣∣∣∣∣∣∣∣∣∣∣∣∣∣∣∣∣∣∣∣∣∣∣∣∣∣∣∣∣∣∣∣∣∣∣∣∣∣∣∣∣∣∣∣∣∣∣∣∣∣∣∣∣∣∣∣∣∣∣∣∣∣∣∣∣∣∣∣∣∣∣∣∣∣∣∣∣∣∣∣∣∣∣∣∣∣∣∣∣∣∣∣∣∣

Sbjct: 2488995 gagccggtcaacatccggccgcatccctacgaattcgcgctgtactacgacgtttaa 2489051 (SEQ ID NO:13)

Uma consulta de TBLASTN também foi realizada em confronto com dados de seqüências de nucleotídeos traduzidos no site da TubercuList BLAST (http:7/genolist.pasteur.fr/TubercuList/), mostrando as posições do ácido aspártico e do ácido glutâmico removidos.

>M tuberculosis H37Rv|null M. tuberculis H37RV (4411532 bp) Length = 4411532

Score = 973 bits (2515), Expeot = 0.0

Identities = 476/478 (99%), Positives = 476/478 (99%), Gaps = 2/478 (0%)

Frame = +3

Query: 1 VTEKTPDDVFKIiAKDEKVEyTOVRFCDLPGIMQHFriPASAFDKSVFDDGIjAP-GSSIRG 59 VTEKTPDDVFKIAKDEKVEWDVRFCDLPGIMQHFTIPASAFDKS VFDDG LAF GSSIRG SbjCt: 2487615 VTEKTPDDVFKliAKDEKVEYVDVRFOLPGI MQHFTIPASAFDKSVFDDGLAFDGSK1KQ 2407794

Query: 60 FQSIHESO^LLPDPETARIDPPRAAKTLNINFFVHDPFTLEPYSRDPRNIARKAENYLI 119

FQSIHESMLLLPDPETARIDPFRAAKTLNINFFVHBPFrLB?YSRDPRNIARKABNYLI SbjCt: 2487795 FQSIHBSDMLLLPDPETARIDPFRAAKTLNIN FFVHDPFTLEPYS RDPRNIARKAENYLI 2487974

Query: 120 STGIADTAY FGAEAE FYIFDSVS FDSRANGS FYE VDAISGWWNTGAATEADGE PNRGYKV 179

STGIADTAYFGAEAEFYIFDSVS FDSRANGSFYEVDAISGWWNTGAATEADGEPNRGYKV SbjCt: 2487975 S1H3IADTAYFGABAEFYIFDSVSFDSRANGSPYEVDAISGWWNTGAATEADGSPNRGYKV 24 88154

Query: 18Q , RHKC^YFPVAPITOCYVDLRDKMLTNLINSGFILEKGHHEVGSGGOAEllWOFiNSU^HAAD 239

RHKGGY PFVAPNI^YVUtRD ICMLTNlINGGFItE KGHH ET>/GS GGQAEIN YQ PNSLLHAAD SbjCt: 2488155 RHKGGYFpvApNDQYvcLRDKKljTOTlNsGFlLBKGHHEvGSGGQAEIirv-QFNSIjLHAAD 2488334

Queryi 240 DMOLYKYIimTAWONGKTVTFMPKPLFGDWGSGWHCHOSLWKDGAPLMYDSTSyAGLSD 229

DMQLYKY.T .TKHTAWQNGKTVTPMPXPLFGDNGSGMHCHQSLWKEK3APLMYDETGYAGLSD Sbjct: 24B833S DMQLYKYIIKCTTAWQNGKTV^FMPKPLFâDHGSGMHCHQSLWKMAPLMYDETGYAGLSD 2438514 Query: 300 TARHYIGGIiHT^PSLI^TNPTVNSYKRLVPGY-APXNLVYSQRNRSACVRIPITGSNP 3S8

TARHYIGGLLHHAPSLLAFTNPTVNSYTCRLVPGY APXNLVYSQRNRSACVRXPITGSNP SbjCt: 248B53-5 TARHYIGGLLHHAPSLLAFTNPTVNSYKRLVPGYEAPXNLVYSQRNRSACVRIPXTGSNP 2488694

Query: 359 KAKRLEFRSPDSSGNPYIiAFSAI^MAGLDGIKNKISPOAPVDKDLYELPPEEAASIPOTP. 418

KAKRIiEFRSPDSSGNPYLAPSAMLMAGLDGIKNKXEPQAPVDKDXiYELPPEEAASIPQTP Sbj Ct: 2488695 KAKRliEPRSPDSSGNPYIiAPSAMLMAGZiDGIKNKXEPOAPVDKDLYELPPEEAASIPOT? 2488874

Query: 419 TQLSDVIDRLEADHEYLTEGGVFTHDLIETWISFKRENEIEPVNIRPHPYEFALYYDV 476 (SBQ ID

NO:14)

TQXjSDVIDRLEADHSYliTEGGVPTNDLIETWIS?KRENEIEPVNIRPHFYEFALYYDV (SEQ ID

NO:14)

Sbjct: 2488875 TQLSDVXDRLEADHEYLTEGGVFTNDLIETWISFKREINEIEPVNIRPHPYEFAIiYYDV 2489048 (SEQ tD NO:15)

Consultas de BLASTN E TBLASTN também foram feitas contra dados de seqüências de nucleotídeos no servidor BLAST da M. bovis da Sanger Centre (http://www.sanger.ac.uk/cgi-bin/blast/submitblast/m_bovis'). A Sanger Centre está seqüenciando a Micobactéria bovis BCG Pasteur, a construção da BCG M. bovis preliminar foi utilizada. Os resultados mostram que a seqüência de nucleotídeos da glnAl na BCG Pasteur é idêntica à seqüência de nucleotídeos da glnAl na M. tuberculosis H37Rv.

Resultados BLASTN:

>BCG260cl 1 .qlk 3891 bp, 23 reads, 35.42 AT [Full Sequcnce] Length = 3891 Minus Strand HSPs :

Score - 7095 (1070.6 bits), Expect - 0., P = 0.

Identities = 1431/1437 (99%), Positives ® 1431/1437 (99%), Strand = Minus /Plus [HSP Sequence] Query: 1431 TTAAAOGTCGTAGTACAGCGCGAATTCGTAGGGATGCGGCCGGATGTTGACOGGCTCGAT 1372

: illlllllllllllllllllllllllllllllllllll!li!ill!l!ll!![ltll!ll SbjCt: 376 TTAAACGTCGTAGTAC^GCGCGAATTCGTAGGGATGCGGCCGGATGTTGACCGGCTCGAT 435

Query: 1371 CTCGTTTTCGCGCTTGAÃACTGATCCACGrCTCGATCAGGTCGTTTGTGAACACCCCTCC 1312

: Il !IMII11 IMIlllllMlllllllllinil! Ill Ill ΙΙΜΙΠΙΙΜΜΠΙΙ!

SbjCt: 43;6 CTCGTTTTCGCGCTTGAAACTGATCCACGTCTCGATCAGGTCGTTTGTGAACACCCCTCC 495 Query: 1311 TTCGGTGAGGTATTCGTGGTCGGCCTCGAGACGGTCGATCACATCTGACAGCTGGGTCGG 1252

; Illllllll ΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙ!Ι!ΙΜΙΙΙί[ΙΜ!ΜΙΙΙΙΙΙΙΙΙΜίίΙΙΙΙΜΙίΙΙΙ

SbjCt: 496 TTCGGTGAGGTATTCGTGGTCGGCCTCGAGACGGTCGATCAC^TCTGACAGCTGGGTCGG 555 Query: 1251 AGTCTGCGGGATACTCGCGGCCTCTTCCGGCGGCAGCTCGTAGAGATCCTTGTCGACGGG 1192

IMllllllllllilMllilMllllliuillllllllllllMMlllIIiIIMII

Sbjct: 556 AGTCTGCGGGATACTCGCGGCCTCTTCCGGCGGCAGCTCGTAGAGATCCTTGTCGACGGG 615 Query: 1191 CGCCTGCGGCTCGATCTTGTTCTTGATACCGTCCAGGCCTGCCATCAGCATGGCCGAGAA 1132

Mi ItMIMMIlMIMiiIMH IlIMllMIItM MMIliMII IiniIMl

Sbjet: 616 CGCCTGCGGCTCGATCTTGTTCTTGATACCGTCCAGGCCTGCCATCAGCATGGCCGAGAA 675 Query: 1131 CGCCAGATACGGGTTGCCCGACGAGTCGGGGCCTCGGAACTCCAGCOGCTTGGCCTTCGG 1072

i I M I Il M Il 11 MM 111 Il M M I Il I Il 11 U Il Il 11 Il Il 11 M M Il Il I M I Il

SbjCt Í 67S CGCCAGATACGGGTTGCCCGACGAGTCGGGGCTTCGGAACTCCAGCCGCTTGGCCTTCGG 735 Queryi 1071 GTTGCTGCCGGTGATCGGGATGCGCACGCATGCCGACCGGTTGCGCTGGCTATAGACCAG 1012

111111111 Il 11 Il 111111111! 111 Il 1111111111111! I M I M I Il 11111 Il

Sbjcc: 73S GTTGCTGCCGGTGATCGGGATGCGCACGCATGCCGACCGGrrGCGCTGGCTATAGACCAG 795 Query: IOll GTTGATCGGGGC---GTAACCGGGAACCAGCCGCTTGTAGGAGTTCACCGTCGGGTTGGT 955

Itlli Illlin IlllllilllllMlllllilllllllllMlMMllllMill

Sbjet: 79S GTTGATCGGGGCCTCGTAACCGGGAACCAGCCGCTTGTAGGAGTTCACCGTCGGGTTGGT 855 Query: 954 GAAGGCCAGCAGCGACGGCGCGTGGTGTAACAGGCCGCCGATGTAATGACGGGCCGTGTC 8 95

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Sbj Ct: 976 CTGATGACAGTGCATGCCGGACCCGTTGTCGCCGAACAGCGGCTTGGGCATGAACGTGAC 1035 Query: 774 CGTrrTCCCGTTCTGCCAGGOTGTGTTCTTGATCATGTACTTGTRCAACTGCATGTCGTC 715 ΠΙ Ill IlI Ill Iill Ill Illini Ill lllllll !Il IMJNI Ill Ill I IMIl Il

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Sbjct : 1636 GCGAATCGACGAGCCGTCAAAGGCCAAGCCGTCGTCAAACACGCTCTTGTCAAAGGCCGA 1695 Query : 117 AGCX)GGAATCGTGAAGTGCTGCATGATGCCAGGCAGGTCACAJ3 AACCGGACGTCGACArA 58

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Sbjct: 1696 AGCCGGAATCGTGAAGTGCTGCATGATGCCAGGCAGGTCACAGAACCGGACGTCGACATA 1755 Query: S 7 TTCGACCTTCTCGTCCTTGGCAAGTTTGAAGACGTCGTCGGGCGTCTTTTCCGTCAC 1 (SBQ ID

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60 FQSIHBSDMLLLPDPETARIDPFRAAKTLNINFFVHDPPTLEPySRDPRNIARKAENYLI 119 FCSaHBSDKLLLPDFBTiyiIDPFRAAKTluNINFFVHDPFTLEPYSRDPRNIARKAEHYLI 1S32 PQSIHBSDMLLLPDPETARIDPFRAAKTLNINFFVHDPFTLEPySRDPRNIARKAENYlI 14.53

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RHKGGYFpvApNDQYvDKiRDKMLTNLlNSGFILEKGHHEvGSGGQAEimfQFNSLLHAAD 239 RHKGGYFP VAPNDQ YVDSJUJKMLTKLINSGPILEKGHHEVGSGGQABIKTYQiFNSLLHAAD RHKGGYFP VAPNDQ YVDLRDKI^ILTWLINSGFILEKGHHEVGSGGOAEIIIYOFNSLLiHAAD 1093 Query: 240 DMQLYiCYIIKl^AVIONGXTVTFMPKPLFGDMGSGffflCHQSLWKDGAPL[«tYDETGYAGIjSD 299

DMOLYKYIIKOTAWONGKTVTFMPKPLFGDNGSGMHCHOSLWKDGAPLtVTYDETGYAGLSD Sibj ct: 1092 DMQLYKyIIKOTAWONGKTVTFMPKPLFGDNGSGMHCHOSLVfKDGAPLMiYDETGYAGLSD 913

Query: 300 Tarhyiggllhhapsliaftnptvisisykrlvpgy-Apinlvysqrnrsa-Cvripxtgsnp 358 tarhyiggllhhapsllaptnptvnsykrlvpgy apinlvysqrnrsacvripitg3np

sbjct: 912 τarhυiggklhhapsllafi^ptvnsykrlvpgykapinlvysqrisirsacvriPIi1GSHP 733

Query: 359 KAKRLEFRSPDSSGNPYLAFSAMLMAGLDGIKNKIEPQAPVDKDLYELPPEEAASIPQTP 418

KAKRLEFRSPDSSGNPYLAFSAMLMAGLDGIKNKIEPOAPVDKDLYBLPPEEAAS IPQTP Sbjct: 732 XAKRLEFRSPDSSGffPYIAFSAMLMAGLDGIKNKIEPQAPVDKDLYELPPEEAASIPQTP 553

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TQLSDVIDRLEADHEYLTKGGVFTNDLIETWISFKRENE1EPVNXRPHPYEPALYYDV (S3Q ID HO: 18) Sbjct: 552 TQLSDVIDRLEADHEYLTBGGVFTNDLXETWISFKRENEIEPVNIRPHPYEFALYYDV 379 (SEQ ID NO:19)

Em seguida, o alelo glnAl mutante incluindo sua própria região promotora foi ligado em um local spel no pHV203 para dar pHV203-mut glnAl ΔD54ΔΕ335 e também dentro do vetor de integração cromossômica pMP399 e o promotor do vetor plasmídeo pMP349 para dar pMP399-mut glnAl Δϋ54ΔΕ335 e pMP349-mut glnAl Δϋ54ΔΕ335 (Tabela 1). O mapa do plasmídeo pHV203- mut glnAl Δϋ54ΔΕ335 é mostrado na Fig. 19 e as seqüências completas de nucleotídeos de cada umd esses plasmídeos estão incluídas nas anotações da Tabela 1. O plasmídeo pHV203-mut glnAl ΔΌ54ΔΕ335 foi eletroporado dentro das vacinas 3ÍD-BCG para dar as vacinas 4D-BCG. Esses vetores podem ser introduzidos dentro da BCG assim também como vacinas BCG pro-apoptóticas de 1a, 2a e 3a geração para dar, respectivamente, vacinas de 1a, 2a, 3a e 4a geração.

Plasmídeos e vetores de integração cromossômicos adicionais foram construídos combinando um alelo de sodA mutante e um alelo de glnAl mutante no mesmo vetor. Esses incluíam o pMP399-mut SodA ΔΗ28ΔΗ76 mut glnAl ΔD54ΔΕ335 (Fig. 20), pMP399-mut SodA ΔΕ54 mut glnAl Δϋ54ΔΕ335, pMP349-mut iSodA ΔΗ28ΔΗ76 mut glnAl Δϋ54ΔΕ335 (Fig. 20), e pMP349- mut SodA ΔΕ54 mut glnAl ΔD54ΔΕ335 (Tabela 1). Esses vetores foram introduzidos na BCG assim como vacinas BCG pro-apoptóticas de Ia e 2a geração para dar, respectivamente, as vacinas de 2a, 3a e 4a geração.

Exemplo 9 - Expressão de um antígeno exógeno por BCG pro- apoptótica

As vacinas BCG pro-apoptóticas descritas acima podem ser utilizadas para expressar antígenos exógenos, incluindo antígenos de outros agentes infecciosos e antígenos de câncer.

A BCG-RDrBLS foi construída, na qual lumazina sintase recombinante; de Brucella, um antígeno de células-T imunodominante da Brucella abortus (Velikovsky, C. A. e outros, 2002), é expressa pela BCG-RD. O gene bis foi ligado atrás de um promotor aceA(icl) no pMP349 para produzir pMP349-rBLS (Tabela 1). Esse plasmídeo foi eletroporado dentro da BCG-RD para dar a BCG-RDrBLS. A expressão de rBLS pela BCG-RDrBLS é mostrada na Fig. 21.

Esses resultados demonstram que antígenos estranhos podem ser expressos na BCG pro-apoptótica. Essa capacidade permite a construção de uma nova geração de vacinas que induzem fortes reações de células-T utilizando-se bactérias intracelulares pro-apoptóticas como um veículo para acessar caminhos de primers cruzados associados à apoptose da apresentação de antígenos. Desta forma, os antígenos exógenos podem ser distribuídos em células dendríticas para induzir fortes reações de células-T CD4 e CD8. Por exemplo, a linhagem BCG- RDrBLS mostrada aqui, ou outras vacinas bacterianas intracelulares pro- apoptóticas expressando antígenos de Brucella recombinantes podem ser utilizados para imunizar gado ou outros hospedeiros mamíferos. Esta tecnologia pode ser utilizada simultaneamente para proteger o gado contra a tuberculose bovina e a brúcellose (brucellosis).

Devido às diferenças no uso de códons entre diferentes espécies, pode ser útil aperfeiçoar códons em genes estranhos para a expressão em micobactérias. Isso pode ser feito rotineiramente utilizando-se mutagênese de local específico para alterar o gene ou construindo-se genes sintéticos que seguem as preferências de uso de códons das micobactérias. Tais alterações são bem conhecidas pelos técnicos no assunto. Exemplo 10 - Uma alternativa à remoção do sigH compreendendo a inativação alélica de tioredoxina, tioredoxina redutase e glutaredoxiná

A inativação do sigH afeta a produção de múltiplos fatores microbianos, alguns dos quais podem ser alvos importantes para a reação imunológica hospedeira. No presente isso é uma preocupação hipotética e os dados atuais sustentam a proposição de que os níveis baixos de proteínas reguladas pelo sigH expressas por um mutante de remoção do sigH sejam suficientes para induzir fortes reações de células-T contra essas proteínas. Contudo, como uma alternativa à inativação do sigH para as vacinas BCG pro- apoptóticas utilizadas para induzir proteção contra a tuberculose, pode haver uma vantagem para reduzir diretamente a atividade de enzimas anti-apoptóticas críticas sob o controle do sigH para minimizar os efeitos sobre o proteoma associado ao stress. Sob circunstâncias em que a vacina BCG pro-apoptótica é utilizada principalmente para expressar antígenos exógenos de outros agentes infecciosos ou antígenos de câncer, a remoção do sigH é preferida e oferece um mecanismo pára reduzir a produção de múltiplos antioxidantes anti-apoptóticos.

A tioredoxina (trxC, também trx, MPT46) e a tioredoxina redutase (trxB2, também trxr) são genes regulados por sigH que são uma parte importante da reação bacteriana ao stress oxidativo. Eles estão localizados adjacentes um ao outro no cromossomo da M. tuberculosis/BCG (trxB2 nas bases 4,404,728- 4,402,735 e trxC em 4,402,732-4,403,082 no cromossomo H37Rv, por seqüência completa de genomas no servidor da web da TubercuList). Um vetor baseado em Phasmatodea (pYUB854-trx-trxr) para derrubar a trxB2 e a trxC simultaneamente foi construído, e os dados da seqüência são fornecidos na Tabela 1. O mapa e as características deste vetor são mostrados na Fig. 22.

Uma estratégia alternativa para construir a TRX-TRXR-BCG (BCGAtrxCAtrxB2) envolve o uso de vetores plasmídeos suicidas como descrito e referido acima, cujo uso é bem conhecido pelos técnicos no assunto. Uma potencial vantagem do sistema baseado em plasmídeos é a maior facilidade em se atingir remoções não-marcadas em que o alelo seja substituído por um mutante inativo ao invés de interrompido com um determinante de resistência antibiótica. Os locais ativos de tioredoxina, tioredoxina redutase, e muitas outras enzimas de reparo por redox contêm cisternas ativas que formam uma ponte dissulfeto quando oxidados. O "motif de local ativo de tioredoxina" é uma seqüência C-X- X-C, onde C = cisteína e X = quaisquer aminoácidos. Esta assinatura torna rotineira a identificação do local ativo de enzimas de redox ativas. O gene pode ser então mutagenizado ou sintetizado para eliminar o local ativo.

As seguintes seqüências de aminoácidos de tioredoxina e tioredoxina redutase mostram os motifs CXXC em negrito, nos resíduos 37 a 40 e 145 a 148, respectivamente:

>M. tuberculosis H37Rv)Rv3914|TrxC: 116 aa - THÍOREDOXIN TRXC (TRX) (MPT46) 1 - MTDSEKSATl K.VTDASFATD VLSSNKPVLV DFWATWCGPC KMVAPVLEEIATERATDLTV 61 - AKLDVDTOPE TARNFQVVSIPTLJLFKDGQ PVKRIVGAKG KAALLRELSD V\'PNLH (SEQ ID N0:20)

>M. tuberculosis H37Rv|Rv3913|TrxB2: 335 aa - PROBABLE THÍOREDOXIN REDUCTASE TRXB2 (TRXR) (TR) 1 - MTAPP VHDRA HHPVRDVIVI GSGPAGYTAA LYAARAQLAP LVFEGTSFGG ALMTTTDVEN 6) - YPGFRNGITG P ELMDEMREQ ALRFGADLRM EDVESVSLHG PLXSVVTADG QTHRARAVIL 121 - AMGAAARYLQ VPGEQELLGR GVSSCATCDG FFFRDQDIAV IGGGDSAMEE ATFLTRFARS 181 - VTLVHRRDEF HASiaMLDRA RNNDKIRFLT NHTVVAVDGD TTVTGLRVRD TNTGAETTLP 241 - VTGVFVAIGH EPRSGLVREA 1DVDPDGYVL VQGRTTSTSL PGVFAAGDLV DRTYRQAVTA 10 301 - AGSGCAAAÍD AER WLAEHAA TGEA DSTDAL ÍGAQR (SEQ ID NÓ:2 ] )

Utilizando-se técnicas de mutação genética baseadas em RCP envolvendo primers sobrepostos, genes que codificavam mutantes inativos foram construídos. O alelo trxC codifica um mutante de tioredoxina inativo que não tem o local ativo "WCGPCK", e o alelo trxB2 codifica uma seqüência de tioredoxina 15 redutase inativa que não tem o local ativo "SCATCD". Esses alelos mutantes foram incorporados dentro do vetor de inativação alélica p2NIL-pGOAL19 descrito por Parish e Stoker (Parish, T. e outros, 2000) para introduzir sem marcação (isto é, o construído final não tem genes de resistência antibiótica) para produzir p2NIL/GOAL19-mut trxC-mut trxB2 (Fig. 23 e Tabela 1). 20 Essa estratégia também pode ser aplicada a outros genes regulados

por sigH. Por exemplo, o RV2466c é regulado pelo sigH, é um homólogo de glutaredoxina, e possui um motif C-X-X-C: >M. tuberculosis H37Rv]Rv2466clRv2466c: 207 aa - COKSERVED HYPOTHETICAL PROTEIN 1 - MLEKAPQKSV ADFWFDPLCP VVCWITSRWIL EVAKVRDIEV NFHVMSLAIL NENRDDLPEQ 61 - YREGMARAWG PVRVAIAAEQ AHGAKVLDPL YTAMGNRIHN QGNHELDEVI TQSLADAGLP

121 - AELAKÀATSD AYDNALRKSH HAGtvíDAVGED VGTPTIHVNG VAFFGP VLSK IPRGEEAGKL 161 - 1ATJASVTi ASY PIIFFELKRTR TEPPQFD (SEQ ID NO:22)

Exemplo 11 - Remoção do fator sigma E (sigE) para reduzir ainda mais a produção de enzimas microbianas anti-apoptóticas por BCG

Como observado acima, outros fatores sigma regulam a produção de fatores miçrobianos importantes para a reação a estímulos de tensão. O fator sigma E (sigE) demonstrou possui rum efeito sobre a produção de SodA e glnAl (Manganelli, R. e outros, 2001). Portanto, a inativação do sigE introduz um defeito na produção de enzimas anti-apoptóticas microbianas análogo a outros defeitos descritos acima, e portanto pode ser utilizada sozinha ou em combinação com outras mutações para tornar uma linhagem da BCG pro-apoptótica mais potente.

Ura vetor baseado em plasmídeo (pYUB854-sigE) para inativar o sigE foi construído, e os dados da seqüência são fornecidos na Tabela 1. O mapa e as características deste vetor são mostrados na Fig. 24.

Exemplo 12 - Documentação de atividade de glutamina sintase reduzida por 4D-BCG in viíro

Para determinar o efeito da expressão da GlnAl Δϋ55ΔΕ335 sobre a atividade de glutamina sintetase de toda a bactéria, lisatos de BCG-RD, 3D- BCG e de duas versões da 4D-BCG envolvendo a expressão plasmídica ou cromossômica da GlnAl Δϋ55ΔΕ335 foram preparados e comparados quanto à atividade de glutamina sintetase. Ensaios de atividade foram realizados utilizando-se a reação de transferência descrita por Woolfolk e outros, monitorando-se a absorção em 540 nm para detectar a formação de hidroximato de ácido glutâmico-gama. Os resultados são mostrados na Fig. 25 e demonstram que a estratégia dominante-negativa resulta em uma redução de 4 a 8 vezes na atividade da glutamina sintase. Exemplo 13 - Esplenócitos de camundongos vacinados com BCG-RD, 3D-BCG e 4D-BCG exibem produção de IL-2 acentuada em comparação com camundongos vacinados com a linhagem BCG mãe

Para avaliar reações imunológicas para vacinas BCG (paBCG) pro- apoptóticas selecionadas e a linhagem de vacina BCG Tice mãe, um modelo de vacinação IV em camundongos C57B/6 foi utilizado, compreendendo a administração; de aproximadamente 5 x 105 ufc da linhagem de vacina em uma única dose. Os baços são colhidos e os esplenócitos são re-estimulados por um dia em macrófagos derivados de medula óssea não-infectados ou infectados com BCG (MDMOs) dessas linhagens de camundongos que foram estimuladas com IFN-gama para promover a apresentação de antígenos bacterianos. Portanto, este é um ensaio muito fisiológico na medida em que os linfócitos são colhidos de camundongos vacinados e então testados quanto à sua capacidade de fazer citocinas em reação a um modelo de infecção macrófaga in vitro que tem muitas similaridades com a infecção in vivo. Marcação de citocina intracelular (MCI) é realizada com anticorpos de superfície anti-CD3, anti-CD4, e anti-CD8, e anticorpos intracelulares anti-IFNgama, anti-IL2 e anti-TNFalfa. Os espécimes são então analisados em um citômetro FACSaria. As reações à BCG de antígeno específico são determinadas por comparação da produção de IFN-γ, IL-2 e ocasionalmente TNF-α por esplenócitos re-estimulados por um dia em MDMOs infectados com BCG versus a produção de citocina incubada por um dia em MDMOs não-infectados.

Para determinar as reações imunológicas, múltiplos experimentos foram realizados comparando a BCG, BCG-RD, 3D-BCG e a 4D-BCG (Fig. 26). Após vacinação com BCG e BCG-RD, uma produção constante de citocina foi observada. Aproximadamente 0,7% das células-T CD4 nos baços dos camundongos foram capazes de produzir IFN-γ em reação a estímulos antigênicos no dia 70 pós-vacinação. 259 dias depois da vacinação, 0,30% e 0,27% das células CD4 esplênicas ainda faziam IFN-γ em vacinas BCG e BCG- RD, respectivamente (dados não mostrados na Figura). Esses resultados se correlacionarrí com a sobrevivência prolongada tanto da BCG quanto da BCG- RD nos baços de camundongos C57B1/6, uma linhagem bem conhecida por sua "suscetibilidade à BCG" relacionada a um lócus Nrampl mutante (Govoni, G. e outros, 1996)J

Diferenças na produção de citocinas específicas também foram observadas. Os camoundongos BCG-vacinados exibiram uma reação com EFN-γ predominante e a produção de IL-2 em camundongos BCG-vacinados não ficou confiavelmente acima da viabilidade natural no ensaio (isto é, a faixa de valores de IL-2 observada em camundongos vacinados com solução salina tamponada por fosfato (controles de vacinas falsas) como indicado pela área sombreada). Quando a produção de IL-2 foi observada em camundongos vacinados com BCG, ela estava em níveis baixos e foi detectada em torno do momento de pico da reação de células-T primária após 4 semanas. Em comparação, os camundongos vacinados com BCG-RD tinham menos células CD4 produtoras de IFN-γ em relação aos camundongos vacinados com BCG, porém mais células produtoras de IL-2. O % de células-T CD4+ produtoras de IL-2 correspondeu mais ou menos à "geração" da vacina paBCG sob avaliação, e a indução de reações de células-T IL-2+ CD4+ foi maior para 4D-BCG > 3D-BCG > BCG- RD > BCG (Fig. 26A, painel inferior). Esses resultados mostram que as modificações pro-apoptóticas têm um efeito adicional, e que quando combinadas produzem acentuações progressivas na produção de IL-2 durante a vacinação primária.

A razão de células CD4 produtoras de IFN-γ para produtoras de IL- 2 no mesmo baço era tipicamente em média de aproximadamente 10:1 e 3:1 para recipientes das vacinas BCG e paBCG, respectivamente (Fig. 26B, na qual os valores parâmetro de MDMOs não-infectados foram subtraídos). Esta observação, combinada com algumas outras diferenças mostradas abaixo, demonstram que há uma acentuação qualitativa na reação imunológica induzida pelas vacinas paBCG em comparação com a reação imunológica induzida pela BCG.

As diferenças na produção de citocina são mais bem ilustradas por comparação de resultados em torno do pico da reação de células-T primária. A Fig. 27 mostra os resultados do dia 25 e do dia 32 pós-vacinação em um experimento que comparava BCG, BCG-RD, e 3D-BCG. Além das diferenças na produção de IFN-γ por células-T CD4 (BCG » BCG-RD > 3D-BCG) e das diferenças na; produção de IL-2 por células-T D4 (3D-BCG » BCG-RD > BCG), os resultados também mostraram produção de IFN-γ aumentada por células-T CD8+ no camundongo vacinado com 3D-BCG no dia 25 (0,30%).

Embora os percentuais de células CD4 e CD8 produtoras de IFN-γ tenham sido idênticos, esse camundongo teve um número maior de células CD8 circulantes, então, em termos absolutos, o número de células CD8+ IFN-γ+ foi maior do que o número de células CD4 IFN-γ+ no dia 25. As diferenças nos valores associados à BCG-RD versus a 3D-BCG sugerem novamente que cada modificação pro- apoptótica tem um efeito adicional na acentuação da imunogenicidade da BCG.

Resumidamente, o padrão de citocinas efetoras de células-T induzido pelas vacinas paBCG durante a vacinação primária é diferente do padrão de citocinas efetoras de células-T induzido pela BCG. Como mostrado abaixo em estudos adicionais realizados no contexto de experimentos de desafio com vacinas, essas diferenças durante a vacinação primária facilitam o desenvolvimento de reações de memória que permitam que o hospedeiro vacinado reaja rapidamente à infecção. A maior indução da produção de IL-2 pelas linhagens de vacina paBCG deve promover o crescimento de células-T, na medida em que a presença de IL-2 durante a fase de contração da reação de células-T primária acentua a sobrevivência de células-T de antígeno específico (Blattman, J. N. e outros, 2003).

Exemplo 14 - Reações de lembrança de células-T acentuadas após desafio intratraqueal de camundongos vacinados com 3D-BCG em comparação com camundongos previamente vacinados com a BCG

O objetivo da vacinação é gerar uma população de linfócitos de memória no hospedeiro imunizado que seja direcionada contra o agente infeccioso e possa reagir prontamente à infecção. Para determinar a cinética e a magnitude das reações de lembrança de células-T, os camundongos foram vacinados subcutaneamente com 5 χ IO5 ufc de BCG ou de 3D-BCG. Os camundongos de controle foram falsamente vacinados com solução de tampão fosfato (STF). Trinta dias após a vacinação, os camundongos foram tratados com antibióticos pára erradicar quaisquer bacilos de vacina persistentes. Embora os dados preliminares indiquem que as vacinas 3D-BCG e 4D-BCG sejam eliminadas à medida que a reação imunológica adaptativa de desenvolve, a BCG persiste indefinidamente em camundongos C57B1/6 e no baço por ao menos 5 meses após a vacinação subcutânea (Olsen, A. W. e outros, 2004). Assim, para se evitar interferências pela persistência da BCG, as linhagens de vacina foram eliminadas através do tratamento de todos os camundongos com isoniazida e rifampina na água potável começando um mês pós-vacinação. Isso se mostrou eficaz na redução do número de BCG no baço para abaixo dos limites inferiores de detecção. Após um mês de tratamento e mais quatro semanas de descanso, os camundongos receberam um desafio intratraqueal de 4 χ IO7 ufc de BCG (todos os grupos de camundongos, independentemente da linhagem de vacina inicial). Os números base (dia 0) de citocinas + células T antes do desafio foram baixos (não mostrados). Cinco dias após o desafio, os camundongos foram sacrificados e os pulmões foram colhidos para determinar as reações de células-T. Os resultados são mostrados na Fig. 28 e mostram reações de células-T CD4+ muito mais fortes nos camundongos vacinados com 3D-BCG em comparação com os camundongos vacinados com BCG. O percentual dez vezes mais elevado de células-T IL-2+ CD4+ dos camundongos vacinados com 3D-BCG em relação aos vacinados com BCG relembra a maior produção de IL-2 vista durante a vacinação primária (Figuras 26 e 27). Embora a dosagem do desafio utilizada neste experimento tenha sido alta/não-fisiológica para a infecção da TB, o projeto permite que avaliemos da rapidez das reações de células-T secundárias sob as condições de uma carga de antígenos relativamente elevada. Portanto, os resultados dão suporte à função de vetor da paBCG para distribuir antígenos de agentes infecciosos que possam surgir em altos títulos logo depois da inoculação (por ex., patógenos virais, malária). Resumidamente, as reações de células-T secundárias observadas após o desafio de camundongos vacinados com 3D-BCG são mais fortes do que as reações de células-T secundárias observadas em camundongos vacinados com BCG. Os resultados mostram que a paBCG é melhor do que a BCG na indução de uma população de células-T de memória que possam reagir rapidamente ao desafio durante uma reação (lembrança) secundária. Era combinação com uma maior atenuação e sua capacidade de induzir proteção maior contra a tuberculose do que a atual vacina BCG, os estudos de imunologia enfatizam o uso da paBCG como uma tecnologia de plataforma para distribuir antígenos exógenos contra outras doenças infecciosas importantes e -para visar ao câncer.

Tabela 5 - Linhagens bacterianas, ferramentas para manipulações genéticas, e construções genéticas

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"Observação: os termos pHV202 e pHV203 são utilizados como sinônimos. O pHV203 foi derivado do pHV202 pela reparação de uma mutação na região promotora da proteína de choque térmico de 65 KDa utilizada para controlar a expressão de DNA anti-senso, e a inclusão de uma região superior de DNA maior para acentuar a estabilidade.

Anotações de Seqüência

(A) pMP349-mut SodA ΔΕ54 (SEQ ID NO: 23)

Seqüência completa de nucleotídeos do vetor plasmídeo pMP349-mut SodA ΔΕ54 utilizado para expressar o sodA mutante na BCG para criar a SAD-BCGAE54 (expressa por plasmídeos). Ela também pode ser adicionada aos mutantes de Γ, 2a e 3a geração da BCG pro-apoptótica para dar, respectivamente, vacinas BCG pro-apoptóticas de 2a, 3a e 4a geração.

1 ctagttccac tgagcgtcag accccgtaga aaagatcaaa ggatcttctt gagatccttt 61 ttttctgcgc gtaatctgct gcttgcaaac aaaaaaacca ccgctaccag cggtggtttg 121 tttgccggat caagagctac caactclltt tccgaaggta actggcttca gcagagcgca 181 gataccaaat actgtccttc tagtgtagcc gtagttaggc caccacttca agaactctgt 241 agcaccgcct acatacctcg ctctgctaat cctgttacca gtggctgctg ccagtggcga 301 taagtcgtgt cttaccgggt tggactcaag acgatagtta ccggataagg cgcagcggtc 361 gggctgaacg gggggttcgt gcacacagcc cagcttggag cgaacgacct acaccgaact 421 gagataçcta cagegtgage attgagaaag cgccacgctt cccgaaggga gaaaggcgga 481 caggtatccg gtaagcggca gggtcggaac aggagagcgc acgagggagc ttccaggggg 541 aaacgcetgg tatctttata gtcctgtcgg gtttcgccac ctctgacttg agcgtcgatt 601 tttgtgatgc tcgtcagggg ggcggagcct atggaaaaac gccagcaacg cggcctatt 661 acggttectg gccttttgct ggcctttlgc tcacatgttc tttcctgcgt tatcccctga 721 ttctgtggat aaccgtatta ccgcctttga gtgagctgat accgctcgcc gcagccgaac 781 gaccgagcgc aacgcgtgag cccaccagct ccgtaagttc gggtgctgtg tggctcgtac 841 ccgcgcàttc 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tccgtcaggt tgtgggccta tcttcccgcc ctcatgcgga tctacctgcc 1741 gacccggaac gtggacggac tcggccgcgc gatctatgcc gagtgccacg cgcgaaacgc 1801 cgaatttccg tgcaacgacg tgtgtcccgg accgctaccg gacagcgagg tccgcgccat 1861 cgccaacagc atttggcgtt ggatcacaac caagtcgcgc atttgggcgg acgggatcgt 1921 ggtctacgag gccacactca gtgcgcgcca tgcggccatc tcgcggaagg gcgcagcagc 1981 gcgcacggcg gcgagcacag ttgcgcggcg cgcaaagtcc gcgtcagcca tggaggcatt 2041 gctatgágeg acggctacag cgacggctac agcgacggct acaactggca gccgactgtc 2101 cgcaaaâagc ggcgcgtgac cgccgccgaa ggcgctcgaa tcaccggact atccgaacgc 2161 cacgtcgtcc ggctcgtggc gcaggaacgc agcgagtggt tcgccgagca ggctgcacgc 2221 cgcgaacgca tccgcgccta tcacgacgac gagggccact cttggccgca aacggccaaa 2281 catttcgggc tgcatctgga caccgttaag cgactcggct atcgggcgag gaaagagcgt 2341 gcggcagaac aggaagcggc tcaaaaggcc cacaacgaag ccgacaatcc accgctgttc 2401 taacgcãatt ggggagcggg tgtcgcgggg gttccgtggg gggttccgtt gcaacgggtc 2461 ggacaggtaa aagtcctggt agacgctagt tttctggttt gggccatgcc tgtctcgttg 2521 cgtgtttcgt tgcgtccgtt ttgaatacca gccagacgag acggggttct acgaatcttg 2581 gtcgatacca agccatttcc gctgaatatc gtggagctca ccgccagaat cggtggttgt 2641 ggtgatgtac gtggcgaact ccgttgtagt gcttgtggtg gcatccgtgg cgcggccgcg 2701 gtaccccatg gtgatgcgcg actccggaat actgagcccg acgcttgcgg cagcggggtc 2761 agctgaatat caaccccttg gtctgcgagg tcgcggccgc ataccgtgac tgcacatcgg 2821 cccagttcac gacgttccaa aacgccttgg caaagtcgac tttgacgttc ttgtactgca 2881 ggtagaaggc gtgttcccac atgtcgagca gcagcagcgg aacaatgcc agcgggaagt 2941 tcgtctggtg gtcgtaaacc tggaatatca gcagcttgtt gccgagtgtg tcccagccca 3001 gtgccgccca gcccgacccc tgcacggtgg tagcggccgc gtggaactgc gcacggaac 3061 tgtcgaacga accgaacgcg tcggcgatgg ctgcggcgag ttcgccggtg ggcttgtcac 3121 caccgttàgg cgacaggttc ttccaccaga tggtgtgatt aacgtggccg gcgaggttga 3181 aagctagatt CttttCgttC agcatgatcg ctgagtgatc cttggcgcgc gcctcttcga 3241 gtttggcgac ggcgtcattg gcgcccttta cgtaggtggc gtggtgcttg ctgtggcgaa 3301 gctegttgat ctgacccgag atgtgcggtt ccagtgctcc gtagtcccag tccaggtctg 3361 gcaaggtgta 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Seqüência completa de nucleotídeos do vetor plasmídeo pMP349-mut SodA ΔΗ28ΔΗ76 utilizado para expressar o sodA mutante na BCG para criar a SAD-BCGAH28AH76 (expressa por plásmídeos). Ela também pode ser adicionada aos mutantes de Ia, 2a e 3a geração da BCG pro-apoptótica para dar, respectivamente, vacinas BCG pro-apoptóticas de 2a, 3a e 4a geração.

1 ctagttccac tgagcgtcag accccgtaga aaagatcaaa ggatcttctt 51 gagatccttt ttttctgcgc gtaatctgct gcttgcaaac aaaaaaacca 101 ccgctaccag Cggtggtttg tttgccggat caagagctac caactctttt 151 tccgaaggta actggcttca gcagagcgca gataccaaat actgtccttc 201 tagtgtagcc gtagttaggc caccacttca agaactctgt agcaccgcct 251 acatacctcg ctctgctaat cctgttacca gtggctgctg ccagtggcga 301 taagtcgtgt cttaccgggt tggactcaag acgatagtta ccggataagg 351 Ggcagcggtc gggctgaacg gggggttcgt gcacacagcc cagcttggag 401 egaacgacct acaccgaact gagataccta cagcgtgagc attgagaaag 451 cgccacgctt cccgaaggga gaaaggcgga caggtatccg gtaagcggca 501 gggtcggaac aggagagcgc acgagggagc ttccaggggg aaacgcctgg 551 tatctttata gtcctgtcgg gtttcgccac ctctgacttg agcgtcgatt 601 tttgtgatgc tcgtcagggg ggcggagcct atggaaaaac gccagcaacg 651 cggccittlt acggttcctg gccttttgct ggccttttgc tcacatgttc 701 tttcctgcgt tatcccctga ttctgtggat aaccgtatta ccgcctttga 751 gtgagctgat accgctcgcc gcagccgaac gaccgagcgc aacgcgtgag 801 eccaccagct ccgtaagttc gggtgctgtg tggctcgtac ccgcgcattc 851 ággcggcagg gggtctaacg ggtctaaggc ggcgtgtacg gccgccacag 901 cggctcttag cggcccggaa acgtcctcga aacgacgcat gtgttcctcc 951 tggttggtac aggtggttgg gggtgctcgg ctgtcgctgg tgtttcatca 1001 tcagggctcg acgggagagc gggggagtgt gcagttgtgg ggtggcccct 1051 eagcgaaata tctgacttgg agctcgtgtc ggaccataca ccggtgatta 1101 atcgtggttt attatcaagc gtgagccacg tcgccgacga atttgagcag 1151 ctctggctgc cgtactggtc cctggcaagc gacgatctgc tcgaggggat 1201 ctaccgccaa agccgcgcgt cggccctagg ccgccggtac atcgaggcga 1251 acccaacagc gctggcaaac CtgCtggtCg tggacgtaga ccatccagac 1301 gcagcgctcc gagcgctcag cgcccggggg tcccatccgc tgcccaacgc 1351 gatcgtgggc aatcgcgcca acggccacgc acacgcagtg tgggcactca 1401 acgcccctgt tccacgcacc gaatacgcgc ggcgtaagcc gctcgcatac 1451 atggcggcgt gcgccgaagg ccttcggcgc gccgtcgatg gcgaccgcag 1501 ttactcaggc ctcatgacca aaaaccccgg ccacatcgcc tgggaaacgg 1551 ãatggctcca ctcagatctc tacacactca gccacatcga ggccgagctc 1601 ggcgcgaaca tgccaccgcc gcgctggcgt cagcagacca cgtacaaagc 1651 ggctccgacg ccgctagggc ggaattgcgc 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atttgcagta ccagcgtacg gcccacagaa 4201 tgatgtcacg ctgaaaatgc cggcctttga atgggttcat gtgcagctcc 4251 atcagcaaaa ggggatgata agtttatcac caccgactat ttgcaacagt 4301 jgccgttgatc gtgctatgat cgactgatgt catcagcggt ggagtgcaat 4351 gtcgtgcaat acgaatggcg aaaagccgag ctcatcggtc agcttctcaa 4401 CCttggggtt acccccggcg gtgtgctgct ggtccacagc tccttccgta 4451 gcgtccggcc cctcgaagat gggcccactt ggactgatcg aggccctgcg 4501 tgctacgctg ggtccgggag ggacgctcgt catgccctcg tggtcaggtc 4551 tggacgacga gccgttcgat cctgccacgt cgcccgttac accggacctt 4601 ggagttgtct ctgacacatt ctggcgcctg ccaaatgtaa agcgcagcgc 4651 'ccatccattt gcctttgcgg cagcggggcc acaggcagag cagatcatct 4701 ctgatccatt gcccctgcca ccttactcgc ctgcaagccc ggtcgcccgt 4751 gtccatgaac tcgatgggca ggtacttctc ctcggcgtgg gacacgatgc 4801 caacacgacg ctgcatcttg ccgagttgat ggcaaaggtt ccctatgggg 4851 tgccgagaca ctgcaccatt cttcaggatg gcaagttggt acgcgtcgat 4901 taíctcgaga atgaccactg ctgtgagcgc tttgccttgg cgggacaggt 4951 ggctcaagga gaagagcctt cagaaggaag gtccagtcgg tcatgccttt 5001 gctcggttga tccgctcccg cgacattgtg gcgacagccc tgggtcaact 5051 gggccgagat ccgttgatct tcctgcatcc gccagagggc gggatgcgaa 5101 gaatgcgatg ccgctcgcca gtcgattggc tgagctcatg agcggagaac 5151 gagatgacgt tggaggggca aggtcgcgct gattgctggg gcaacacggg 5201 ggatcca

(C) pMP349-mut glnAl ΔΌ54ΔΕ335 (SEQ ID NO: 25)

Seqüência completa de nucleotídeos do vetor plasmídeo pMP349-mut SodA Δϋ54ΔΕ335 utilizado para expressar o glnAl mutante na BCG para criar a GLAD-BCG (expressa por plásmídeos). Ela também pode ser adicionada a mutantes de Ia, 2a e 3a geração da BCG pro-apoptótica para dar, respectivamente, vacinas BCG pro-apoptóticas de 2a, 3a e 4a geração.

1 ctagttccac tgagcgtcag accccgtaga aaagatcaaa ggatcttctt 51 gaga-Watt ttttctgcgc gtaatctgct gcttgcaaac aaaaaaacca 101 ccgctaccag cggtggtttg tttgccggat caagagctac caactctttt 151 tccgaaggta actggcttca gcagagcgca gataccaaat actgtccttc 201 tagtgtagcc gtagttaggc caccacttca agaactctgt agcaccgcct 251 acatacctcg ctctgctaat cctgttacca gtggctgctg ccagtggcga 301 taagtcgtgt cttaccgggt tggactcaag acgatagtta ccggataagg 351 cgcagcggtc gggctgaacg gggggttcgt gcacacagcc cagcttggag 401 cgaacgacct acaccgaact gagataccta cagcgtgagc attgagaaag 451 cgccacgctt cccgaaggga gaaaggcgga caggtatccg gtaagcggca 501 gggtcggaac aggagagcgc acgagggagc ttccaggggg aaacgcctgg 551 tatctttata gtcctgtcgg gtttcgccac ctctgacttg agcgtcgatt 601 tttgtgatgc tcgtcagggg ggcggagcct atggaaaaac gccagcaacg 651 cggccttttt acggttcctg gccttttgct ggccttllgc tcacatgttc 701 tttcctgcgt tatcccctga ttctgtggat aaccgtatta ccgcctttga 751

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gtgagctgat çccaccagct aggcggcagg çggctcttag tggttggtac tcagggctcg cagcgaaata atcgtggttt ctctggctgc ctaccgccaa acccaacagc gcagcgctcc gatcgtgggc acgcccctgt atggcggcgt ttactcaggc áatggctcca ggcgcgaaca ggctccgacg tgtgggccta gtggacggac cgaatttccg tecgcgccat atttgggcgg tgcggccatc ttgcgcggcg ácggctacag cgcaaaaagc átccgaacgc tcgccgagca gagggccact caccgttaag aggaagcggc taacgcaatt

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(D) pMP349-mut SodA ΔΗ28ΔΗ76, mut glnAl Δϋ54ΔΕ335 (SEQ ID

NO: 26)

Seqüência completa de nucleotídeos do vetor plasmídeo pMP349-mut SodA ΔΗ28ΔΗ76, mut glnAl Δϋ54ΔΕ335 utilizado para expressar simultaneamente o sodA mutante ΔΗ28ΔΗ76 e o mutante glnAl ΔΌ54ΔΕ335 na BCG para criar a GLAD-SAD- BCG (expressa por plasmídeos). Ela também pode ser adicionada a mutantes de Ia e de 2a geração da BCG pro-apoptótica para dar, respectivamente, vacinas BCG pro-apoptóticas de 3a e 4a geração.

1 ctagttccac tgagcgtcag accccgtaga aaagatcaaa ggatcttctt 51 gagatccttt ttllctgcgc gtaatctgct gcttgcaaac aaaaaaacca 101 ccgctaccag cggtggtttg tttgccggat caagagctac caactctttt 151 tccgaaggta actggcttca gcagagcgca gataccaaat actgtccttc 201 tagtgtagcc gtagttaggc caccacttca agaactctgt agcaccgcct 251 acatacctcg ctctgctaat cctgttacca gtggctgctg ccagtggcga 301 taagtcgtgt cttaccgggt tggactcaag acgatagtta ccggataagg 351 cgcagcggtc gggctgaacg gggggttcgt gcacacagcc cagcttggag 401 cgaacgacct acaccgaact gagataccta cagcgtgagc attgagaaag 451

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cgccacgctt cccgaaggga gaaaggcgga caggtatccg gtaagcggca gggtcggaac aggagagcgc acgagggagc ttccaggggg aaacgcctgg tatctttata gtcctgtcgg gtttcgccac ctctgacttg agcgtcgatt tttgtgatgc tcgtcagggg ggcggagcct atggaaaaac gccagcaacg CggCCttttt acggttcctg gccattgct ggcctlttgc tcacatgttc tttcctgcgt tatcccctga ttctgtggat aaccgtatta ccgcctttga gtgagctgat accgctcgcc gcagccgaac gaccgagcgc aacgcgtgag Çccaccagct ccgtaagttc gggtgctgtg tggctcgtac ccgcgcattc aggcggcagg gggtctaacg ggtctaaggc ggcgtgtacg gccgccacag cggctcttag cggcccggaa acgtcctcga aacgacgcat gtgttcctcc tggttggtac aggtggttgg gggtgctcgg ctgtcgctgg tgtttcatca tcagggctcg acgggagagc gggggagtgt gcagttgtgg ggtggcccct cagcgaaata tctgacttgg agctcgtgtc ggaccataca ccggtgatta atcgtggttt attatcaagc gtgagccacg tcgccgacga atttgagcag ctctggctgc cgtactggtc cctggcaagc gacgatctgc tcgaggggat ctaccgccaa agccgcgcgt cggccctagg ccgccggtac atcgaggcga àcccaacagc gctggcaaac ctgctggtcg tggacgtaga ccatccagac gcagcgctcc gagcgctcag cgcccggggg tcccatccgc tgcccaacgc gatcgtgggc aatcgcgcca acggccacgc acacgcagtg tgggcactca acgeccctgt tccacgcacc gaatacgcgc ggcgtaagcc gctcgcatac atggcggcgt gcgccgaagg ccttcggcgc gccgtcgatg gcgaccgcag ttactcaggc ctcatgacca aaaaccccgg ccacatcgcc tgggaaacgg aatggctcca ctcagatctc tacacactca gccacatcga ggccgagctc ggcgcgaaca tgccaccgcc gcgctggcgt cagcagacca cgtacaaagc ggctccgacg ccgctagggc ggaattgcgc actgttcgat tccgtcaggt tgtgggccta tcttcccgcc ctcatgcgga tctacctgcc gacccggaac gtggacggac tcggccgcgc gatctatgcc gagtgccacg cgcgaaacgc cgaatttccg tgcaacgacg tgtgtcccgg accgctaccg gacagcgagg tccgcgccat cgccaacagc atttggcgtt ggatcacaac caagtcgcgc atttgggcgg acgggatcgt ggtctacgag gccacactca gtgegcgcca tgcggccatc tcgcggaagg gcgcagcagc gcgcacggcg gcgagcacag ttgcgcggcg cgcaaagtcc gcgtcagcca tggaggcatt gctatgagcg acggctacag cgacggctac agcgacggct acaactggca gccgactgtc cgcaaaaagc ggcgcgtgac cgccgccgaa ggcgctcgaa tcaccggact 2151

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atccgaacgc cacgtcgtcc ggctcgtggc gcaggaacgc agcgagtggt tcgccgagca ggctgcacgc cgcgaacgca tccgcgccta tcacgacgac gagggccact cttggccgca aacggccaaa catttcgggc tgcatctgga caccgttaag cgactcggct atcgggcgag gaaagagcgt gcggcagaac aggaagcggc tcaaaaggcc cacaacgaag ccgacaatcc accgctgttc taacgcaatt ggggagcggg tgtcgcgggg gttccgtggg gggttccgtt gcaacgggtc ggacaggtaa aagtcctggt agacgctagt tttctggttt gggccatgcc tgtctcgttg cgtgtttcgt tgcgtccgtt ttgaatacca gccagacgag acggggttct acgaatcttg gtcgatacca agccatttcc gctgaatatc gtggagctca ccgccagaat cggtggttgt ggtgatgtac gtggcgaact ccgttgtagt gcttgtggtg gcatccgtgg cgcggccgcg gtaccccatg gtgatgcgcg actccggaat actgagcccg acgcttgcgg cagcggggtc agctgaatat caaccccttg gtctgcgagg tcgcggccgc ataccgtgac tgcacatcgg cccagttcac gacgttccaa aacgccttgg caaagtcgac tttgacgttc ttgtactgca ggtagaaggc gtgttcccac àtgtcgagca gcagcagcgg aacaatgcct agcgggaagt tcgtctggtg gtcgtaaacc tggaatatca gcagcttgtt gccgagtgtg tcccagccca gtgccgccca gcccgacccc tgcacggtgg tagcggccgc gtggaactgc gcacggaact tgtcgaacga accgaacgcg tcggcgatgg ctgcggcgag ttcgccggtg ggcttgtcac caccgttagg cgacaggttc ttccaccaga tggtattaac gtggccggcg aggttgaaag ctagattctt ttcgttcagc àagatcgctg agtgatcttc cttggcgcgc gcctcttcga gtttggcgac ggcgtcattg gcgcccttta cgtaggtggc gtggtgcttg ctgtgaagct cgttgatctg acccgagatg tgcggttcca gtgctccgta gtcccagtcc aggtctggca aggtgtattc ggccacgggg taccccagac aactccttaa cggtctttca ttgccgaaaa cgctgacgcc ctaccgtcgt ccaggcggtg tcaacggcgc agcttcactg gtgtgctaac tcgaccatgg cacagcgtgt caacgctggt ccacccattt cacttgcgaa tttcggcaac ggcctgcgga ctttttgcaa attttgcgaa gtcgcccaaa aactgaaccg tttcagaagc tacccgccag taacgacaaa tccgcaggta aacccacgga tcgacgtcct gcggatccgg tcacagattg aacagcgagg cgactgcctt gggctcgtcg ccaaccacat atgtgagcgt tgtaacatct agaggtgacc acaacgacgc gcccgctttg atcggggacg tctgcggccg accatttacg ggtcttgttg tcgttggcgg tcatgggccg aacatactca cccggatcgg agggccgagg 3851 acaaggtcga acgaggggca tgacccggtg cggggcttct tgcactcggc 3901 ataggcgagt gctaagaata acgttggcac tcgcgaccgg tgagtcgtag 3951 gtcgggacgg tgaggccagg cccgtcgtcg cagcgagtgg cagcgaggac 4001 aacttgagcc gtccgtcgcg ggcactgcgc ccggccagcg taagtagcgg 4051 ggttgccgtc acccggtgac ccccggtttc atccccgatc cggaggaatc 4101 acttcgcaat ggccaagaca attgcggatc cagctgcaga attcctgcag 4151 ctcacggtaa ctgatgccgt atttgcagta ccagcgtacg gcccacagaa 4201 tgatgtcacg ctgaaaatgc cggcctttga atgggttcat gtgcagctcc 4251 atcagcaaaa ggggatgata agtttatcac caccgactat ttgcaacagt 4301 gccgttgatc gtgctatgat cgactgatgt catcagcggt ggagtgcaat 4351 gtcgtgcaat acgaatggcg aaaagccgag ctcatcggtc agcttctcaa 4401 CCttggggtt acceccggcg gtgtgctgct ggtccacagc tccttccgta 4451 gcgtccggcc cctcgaagat gggcccactt ggactgatcg aggccctgcg 4501 tgctacgctg ggtccgggag ggacgctcgt catgccctcg tggtcaggtc 4551 tggacgacga gccgttcgat cctgccacgt cgcccgttac accggacctt 4601 ggagttgtct ctgacacatt ctggcgcctg ccaaatgtaa agcgcagcgc 4651 • ccatccattt gcctttgcgg cagcggggcc acaggcagag cagatcatct 4701 ctgatccatt gcccctgcca ccttactcgc ctgcaagccc ggtcgcccgt 4751 gtccatgaac tcgatgggca ggtacttctc ctcggegtgg gacacgatgc 4801 çaacacgacg ctgcatcttg ccgagttgat ggcaaaggtt ccctatgggg 4851 tgccgagaca ctgcaccatt cttcaggatg gcaagttggt acgcgtcgat 4901 tatctcgaga atgaccactg ctgtgagcgc tttgccttgg cgggacaggt 4951 ggctcaagga gaagagcctt cagaaggaag gtccagtcgg tcatgccttt 5001 gctcggttga tccgctcccg cgacattgtg gcgacagccc tgggtcaact 5051 gggccgagat ccgttgatct tcctgcatcc gccagagggc gggatgcgaa 5101 gaatgcgatg ccgctcgcca gtcgattggc tgagctcatg agcggagaac 5151 gagatgacgt tggaggggca aggtcgcgct gattgctggg gcaacacggg 5201 ggatccacta gtccaccacc agacggccga tccccaccgg ccgccggcca 5251 òccactgcca ccacgaccag acccagcatc aactgcccgg gtgtgaatcc 5301 gaacaagcgg accgccgcca ccccgagcag cagccaaatc accaggacaa 5351 ccgtcgacag catcggggtc gaccaaacac cgaattccac gcccagcaac 5401 gccagaccgt aggcgatcag ccagtcgatc agcagagccg ccagccggcg 5451 ccccatcgga gccagcgaac ccggtccggt gtccggcaag cccagcgtct 5501 tgccgggata gtcgggcggc gatttcgccg tcatcgggca gacccgataa 5551 ccaggttccc 5601 ccacaatagg 5651 taacgtctgc 5701 cgtcggccgc 5751 gacgacgtct 5801 ccggttctgt 5851 cggcetttga 5901 attcgcgggt 5951 tcccgagacg 6001 tcaacttctt 6051 ccgcgcaaca 6101 cgccgacacc 6151 cggtgagctt 6201 atctcggggt 6251 caaccggggc 6301 òcaacgacca 6351 aactccggct 6401 acaggccgag 6451 acatgcagtt 6501 aaaacggtca 6551 catgcactgt 6601 acgagacggg 6651 iggcctgttac 6701 gaactcctac 6751 atagccagcg 6801 aacccgaagg 6851 cccgtatctg 6901 agaacaagat 6951 ccgceggaag 7001 tgtgatcgac 7051 tgttcacaaa 7101 jgagatcgagc 7151 ctaegacgtt 7201 ga

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ggtgtagagg gagcggcgtg (E) pHV203-mut glnAl Δϋ54ΔΕ335 (SEQ ID NO: 27)

Seqüência completa de nucleotídeos do vetor plasmídeo pHV203-mut glnAl Δϋ54ΔΕ335 !utilizado para expressar o glnAl mutante na BCG para criar a GLAD- BCGAD54AE335 (expressa por plasmídeos). Ela também pode ser adicionada a mutantes de Ia, 2a e 3a geração da BCG pro-apoptótica para dar, respectivamente, vacinas BCG pro- apoptóticas de 2a, 3a e 4a geração.

1 aagctttaat gcggtagttt atcacagtta aattgetaac gcagtcaggc accgtgtatg 61 aaatctaaca atgcgctcat cgtcatcctc ggcaccgtca ccctggatgc tgtaggcata 121 ggcttggtta tgccggtact gccgggcctc ttgcgggata tcgagccgag aacgttatcg 181 aagttggtca tgtgtaatcc cctcgtttga actttggatt aagcgtagat acacccttgg 241 acaagccagt tggattcgga gacaagcaaa ttcagcctta aaaagggcga ggccctgcgg 301 tggtggaaca ccgcagggcc tctaaccgct cgacgcgctg caccaaecag cccgcgaacg 361 gctggcagcc agcgtaaggc gcggctcatc gggeggcgtt cgceaegatg tcctgcactt 421 cgagccaagc ctcgaacacc tgctggtgtg cacgacteac ccggttgttg acaccgcgcg 481 CggCCgtgCg ggctcggtgg ggcggctctg tcgcccttgc cagcgtgagt agcgcgtacc 541 tcacctcgcc caacaggtcg cacacagccg attcgtacgc cataaagcca ggtgagccca 601 ccagctccgt aagttcgggc gctgtgtggc tcgtacccgc gcattcagge ggcagggggt 661 ctaacgggtc taaggcggcg tgtacgcggc cacagcggct ctcagcggcc cggaaacgtc 721 ctcgaaacga cgcatgtgtt cctcctggtt ggtacaggtg gttgggggtg ctcggctgtc 781 gcggttgttc caccaccagg gctcgacggg agagcggggg agtgtgcagt tgtggggtgg 841 cccctcagcg aaatatctga cttggagctc gtgtcggacc atacaccggt gattaatcgt 901 ggtctactac caagcgtgag ccacgtcgcc gacgaatttg agcagctctg gctgccgtac 961 tggccgctgg caagcgacga tctgetcgag gggatctacc gccaaagccg cgcgtcggcc 1021 ctaggccgcc ggtacatcga ggcgaaccca acagcgctgg caaacctgct ggtcgtggac 1081 gtagaccatc cagacgcagc gctccgagcg ctcagcgccc gggggtccca tccgctgccc 1141 aacgcgatcg tgggcaatcg cgccaacggc cacgcacacg cagtgtgggc actcaacgcc 1201 cctgttccac gcaccgaata CgCgCggCgt aagecgctcg catacatggc ggcgtgcgcc 1261 gaaggcbttc ggeggccgtc gacggcgacc gcagttactc aggcctcatg accaaaaacc 1321 ccggccacat cgcctgggaa acggaatggc tccactcaga tctctacaca ctcagccaca 1381 tcgaggccga gctcggcgcg aacatgccac cgccgcgctg gcgtcagcag accacgtaca 1441 aagcggétcc gacgccgcta gggcggaatt gcgcactgtt cgattccgtc aggttgtggg 1501 cctatcgtcc cgccctcatg cggatctacc tgccgacccg gaacgtggac ggactcggcc 1561 gcgcgatcta tgccgagtgc cacgcgcgaa acgccgaatt cccgtgcaac gacgtgtgtc 1621 ccggacegct accggacagc gaggtccgcg ccatcgccaa cagcatttgg cgttggatca 1681 caaccaàgtc gcgcatttgg gcggacggga tcgtggtcta cgaggccaca ctcagtgcgc 1741 gccagtcggc catctcgcgg aagggcgcag cagcgcgcac ggcggcgagc acagttgcgc 1801 ggcgcgçaaa gtccgcgtca gccatggagg cattgctatg agcgacggct acagcgacgg 1861 ctacagcgac ggctacaacc ggcagccgac tgtccgcaaa aagccgtgac gcgccgaagg 1921 cgctcgaatc accggactat ccgaacgcca cgtcgtccgg CtCgtggCgC aggaacgcag 1981 cgagtggctc gcegagcagg ctgcacgcgc gcgaagcatc cgcgcctatc acgacgacga 2041 gggccactct tggccgcaaa cggccaaaca tttcgggctg catctggaca ccgttaagcg 2101 actcggctat cgggcgagga aagagcgtgc ggcagaacag gaagcggctc aaaaggccca 2161 caacgaagcc gacaatccac cgctgttcta acgcaattgg ggacgggtgt CgCgggggtt 2221 CCgtgggggg ttccgttgca acgggtcgga caggtaaaag tcctggtaga cgctagtttt 2281 Ctggtttggg ccatgcctgt CtCgttgCgt ggttcgttgc gccgttttga ataccagcca 2341 gacgagacgg ggttctacga atcttggtcg ataccaagcc atttccgctg aatatcgggg 2401 agctcaccgc cagaatcggt ggttgtggtg atgtacgtgg cgaactccgt tgtagtgcct 2461 gtggtggcat gtggtggcat ccgtggccac tctcgttgca CggttCgttg tgccgttaca 2521 acagctcacc gaacgtagtt aaaacatgct ggtcaaacta ggtttaccaa cgatacgagt 2581 cagctcatct agggccagtt ctaggcgttg ttcgttgcgc ggttcgttgc gcatgttteg 2641 tgtggttgct agatggctcc gcaaccacac gcttcgaggt tgagtgcttc cageacgggc 2701 gcgatccaga agaacttcgt cgtgcgactg tcctcgttat cgtccattcc gacagcateg 2761 ccagtcacta tggcgtgctg ctagcgctat atgcgttgat gcaatttcta tgcgcacccg 2821 ttctcggagc actgtccgac CgCtttggCC gccgcccagt cctgctcgct tcgctacttg 2881 gagccactat cgactacgcg ateatggega ccacacccgt cctgtggatc cactagtcca 2941 cgccgctccc tctacacccg gactgcgaag agtccttaaa cgtcgtagta cagcgcgaat 3001 tcgtagggat gcggccggat gttgaccggc tcgatctcgt tttcgcgctt gaaactgatc 3061 cacgtctcga tcaggtcgtt tgtgaacacc cctecttegg tgaggtattc gtggtcggcc 3121 tcgagacggt cgatcacatc tgacagctgg gtcggagtct gcgggatact CgCggCCtCt 3181 tccggeggca gctcgtagag atccttgtcg acgggcgcct gcggctcgat CttgttCttg 3241 atacegtcca ggcctgccat cagcatggcc gagaacgcca gatacgggtt gcccgacgag 3301 tcggggèttc ggaactccag ccgcttggcc ttcgggttgc tgccggtgat cgggatgcgc 3361 acgcatgccg accggttgcg ctggctatag accaggttga tcggggcgta accgggaacc 3421 agccgcttgt aggagttcac CgtCgggttg gtgaaggcca gcagcgacgg CgCgtggtgt 3481 aacaggccgc cgatgtaatg acgggccgtg tccgacagac cggcataacc CgtCtCgtCg 3541 tacatcagcg gggccccgtc cttccacagc gactgatgac agtgcatgcc ggacccgttg 3601 tcgccgáaca gcggcttggg catgaacgtg accgattgc cgttctgcca ggcggtgttc 3661 ttgatgatgt acttgtacaa ctgcatgtcg tcggcggcgt gcagcagcga attgaactgg 3721 tagttgátct cggcctgtcc gccgctgccc acctcgtggt ggcccttctc caggatgaag 3781 ccggagttga tcaggttggt cagcatcttg tcgcgcaggt cgacgtattg gtcgttgggg 3841 gccactggga aatacccgcc cttgtggcgg accttgtagc CCCggttggg actgccgtcg 3901 gcctcggtcg ccgcgccggt gttccaccac cccgagatgg cgtccacctc gtagaaggag 3961 ccgttggcgc gcgagtcgaa gctcaccgaa tcgaaaatgt agaactcggc CtCggCgCCg 4021 aagtatgcgg tgtcggcgat gccagtgctg atcaggtagt tctcggcctt gcgggcgatg 4081 ttgcgcgggt cgcgggagta cggctccagg gtgaacgggt cgtgcacaaa gaagttgata 4141 ttcagcgtct tggccgcgcg gaacgggtcg atgcgcgccg tctcgggatc gggaagaagc 4201 aacatgtcgg attcgtggat cgactggaac ccgcgaatcg acgagccaaa ggccaagccg 4261 tcgtcaaaca cgctcttgtc aaaggccgaa gccggaatcg tgaagtgctg catgatgcca 4321 ggcaggtcac agaaccggac gtcgacatat tcgaccttct cgtccttggc aagtttgaag 4381 acgtcgtcgg gcgtcttttc cgtcacagaa tgctccttta ctgtatccgc ggccgacgct 4441 atggagccga tattgcccgt cagtcaaccc cgtgttgcgc agacgttact gaccgtgccg 4501 cccaccactg acgccgggtc tccccggccc tattgtgggg ccatggtcgg caagatcgta 4561 accggtggca tgccgaacgg gaacctggtt atcgggtctg cccgatgacg gcgaaatcgc 4621 cgcccgãcta tcccggcaag acgctgggct tgccggacac cggaccgggt tcgctggctc 4681 cgatggggcg ccggctggcg gctctgctga tcgactggct gatcgcctac ggtctggcgt 4741 tgctgggcgt ggaattcggt gtttggtcga ccccgatgct gtcgacggtt gtcctggtga 4801 tttggctgct gctcggggtg gcggcggtcc gcttgttcgg attcacaccc gggcagttga 4861 tgctgggtct ggtcgtggtg gcagtgggtg gccggcggcc ggtggggatc ggccgtctgg 4921 tggtggacta gttctagaga cgggcctctt cgtcgtacgc aattgtcttg gccattgcga 4981 agtgattcct ccggatcggg gatgaaacgg gggtcaccgg gtgacggcaa ccccgctact 5041 tacgctggcc gggcgcagtg cccgcgacgg acggctcaag ttgtcctcgc tgccactcgc 5101 tgcgacgacg ggcctggcct caccgtcccg acctagcact caccggtcgc gagtgccaac 5161 gttattctta gcactcgcct atgccgagtg caagaagccc cgcaccgggt catgcccctc 5221 gttcgaccgt gtcctcggcc ctccgatccg ggtgagtatg ttcggcccat gaccgccaac 5281 gacaacaaga cccgtaaatg gtcggccgca gacgtccccg atcaaagcgg gcgcgtcgtt 5341 gtggtcaccg gcgccaacac cggcatcggc taccacaccg CCgCCgtgtt tgccgaccgc 5401 ggtgcacacg tagtgttggc cgtccgcaat ctcgagaagg gcaacgccgc ccgggcccgc 5461 atcatgcggc cgccaccgcg gtggagctcc agcltttgtt ccctttagtg agggttaatt 5521 gcgcgcttgg cgtaatcatg gtcatagctg tttcctgtgt gaaattgtta tccgctcaca 5581 attccacaca acatacgagc cggaagcata aagtgtaaag cctggggtgc ctaatgagtg 5641 agctaactca cattaattgc gttgcgctca ctgcccgctt tccagtcggg aaacctgtcg 5701 tgccagctgc attaatgaat cggccaacgc gcggggagag gcggtttgcg tattgggcgc 5761 tcttccgctt cctcgctcac tgactcgctg cgctcggtcg ttcggctgcg gcgagcggta 5821 tcagctcact caaaggcggt aatacggtta tccacagaat caggggataa cgcaggaaag 5881 aacatgtgag caaaaggcca gcaaaaggcc aggaaccgta aaaaggccgc gttgctggcg 5941 tttaccáta ggctccgccc ccctgacgag catcacaaaa atcgacgctc aagtcagagg 6001 tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac caggcgtttc cccctggaag ctccctcgtg 6061 cgctctqctg ttccgaccct gccgcttacc ggatacctgt ccgcctttct cccttcggga 6121 agcgtggcgc tttctcatag ctcacgctgt aggtatctca gttcggtgta ggtcgttcgc 6181 tccaagctgg gctgtgtgca cgaacccccc gttcagcccg accgctgcgc cttatccggt 6241 aactatcgtc ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat cgccactggc agcagccact 6301 ggtaacagga ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta cagagttctt gaagtggtgg 6361 cctaactacg gctacactag aaggacagta tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt 6421 accttcggaa aaagagttgg tagctcttga tccggcaaac aaaccaccgc tggtagcggt 6481 ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa aaggatctca agaagatcct 6541 ttgatctttt ctacggggtc tgacgctcag tggaacgaaa actcacgtta agggattttg 6601 gtcatgagat tatcaaaaag gatcttcacc tagatccttt tcgaccgaat aaatacctgt 6661 gacggaagat cacttcgcag aataaataaa tcctggtgtc cctgttgata ccgggaagcc 6721 cígggccaac ttaggcgaa aatgagacgt tgatcggcac gtaagaggtt ccaactttca 6781 ccataatgaa ataagatcac taccgggcgt attttttgag ttgtcgagat tttcaggagc 6841 taaggaagct aaaatggaga aaaaaatcac tggatatacc accgttgata tatcccaatg 6901 gcatcgtaaa gaacattttg aggcatttca gtcagttgct caatgtacct ataaccagac 6961 cgttcagctg gatattacgg cctttttaaa gaccgtaaag aaaaataagc acaagtttta 7021 tccggccttt attcacattc ttgcccgcct gatgaatgct catccggaat tacgtatggc 7081 aatgaaagac ggtgagctgg tgatatggga tagtgttcac ccttgttaca ccgttttcca 7141 tgagcaaact gaaacgtttt catcgctctg gagtgaatac cacgacgatt tccggcagtt 7201 tctacacata tattcgcaag atgtggcgtg ttacggtgaa aacctggcct atttccctaa 7261 agggtttatt gagaatatgt ttttcgtctc agccaatccc tgggtgagtt tcaccagttt 7321 tgatttaàac gtggccaata tggacaactt cttcgccccc gttttcacca tgggcaaata 7381 ttatacgcaa ggcgacaagg tgctgatgcc gctggcgatt caggttcatc atgccgtttg 7441 tgatggcttc catgtcggca gaatgcttaa tgaattacaa cagtactgcg atgagtggca 7501 gggcggggcg taattttttt aaggcagtta ttggtgccct taaacgcctg gttgctacgc 7561 ctgaataagt gataataagc ggatgaatgg cagaaattcg aaagcaaatt cgacccggtc 7621 gtcggttcag ggcagggtcg ttaaatagcc gcttatgtct attgctggtt taccggttta 7681 ttgactaccg gaagcagtgt gaccgtgtgc ttctcaaatg cctgaggcca gtttgctcag 7741 gctctccccg tggaggtaat aattgacgat atgatccttt ttttctgatc aaaagtgctc 7801 atcattggaa aacgttcttc ggggcgaaaa ctctcaagga tcttaccgct gttgagatcc 7861 agttcgatgt aacccactcg tgcacccaac tgatcttcag catcttttac tttcaccagc 7921 gtttctgggt gagcaaaaac aggaaggcaa aatgccgcaa aaaagggaat aagggcgaca 7981 cggaaatgtt gaatactcat actcttcctt tttcaatatt attgaagcat ttatcaaggg 8041 ttattgt etc atgagcggat acata tttga atgtatttag aaaaataaac aaataggggt 8101 tccgcgcaca tttccccgaa aagtgccacc taaattgtaa gcgttaatat tttgttaaaa 8161 ttcgcgftaa atllttgtta aatcagctca ttttttaacc aataggccga aatcggcaaa 8221 atcccttata aatcaaaaga atagaccgag atagggttga gtgttgttcc agtttggaac 8281 aagagtccac tattaaagaa cgtggactcc aacgtcaaag ggcgaaaaac cgtctatcag 8341 ggcgatggcc cactacgtga accatcaccc taatcaagtt ttttggggtc gaggtgccgt 8401 aaagcactaa atcggaaccc taaagggagc ccccgattta gagcttgacg gggaaagccg 8461 gcgaacgtgg cgagaaagga agggaagaaa gcgaaaggag cgggcgctag ggcgctggca 8521 agtgtagcgg teacgctgcg cgtaaccacc acacccgccg cgcttaatgc gccgctacag 8581 ggcgcgtccc attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc 8641 tatcgctat tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta 8701 acgccagggt tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgagcg cgcgtaatac 8761 gactcaòtat agggcgaatt gggtaccggg ccccccctcg aggtcgacgg tatcgataag 8821 cttagcaaaa gttcgattta ttcaacaaag ccgccgtccc gtcaagtcag cgtaatgctc 8881 tgccagtgtt acaaccaatt aaccaattct gattagaaaa actcatcgag catcaaatga 8941 aactgcaatt tattcatatc aggattatca ataccatatt tttgaaaaag CCgtttCtgt 9001 aatgaaggag aaaactcacc gaggcagttc cataggatgg caagatcctg gtatcggtct 9061 gcgattcega ctcgtecaac atcaatacaa cctattaatt tcccctcgtc aaaaataagg 9121 ttatcaagtg agaaatcacc atgagtgacg actgaatccg gtgagaatgg caaaagatta 9181 tgcatttctt tccagacttg tteaacaggc cagccattac gctcgtcatc aaaatcactc 9241 gcatcaacca aaccgttatt cattcgtgat tgcgcctgag cgagacgaaa tacgcgatcg 9301 ctgttaaaag gacaattaca aacaggaatc gaatgcaacc ggcgcaggaa cactgccagc 9361 gcatcaaicaa tattttcacc tgaatcagga tattatcta atacctggaa tgctgttttc 9421 ccggggâtcg cagtggtgag taaccatgca tcatcaggag tacggataaa atgcttgatg 9481 gtcggaágag gcataaattc cgtcagccag tttagtctga ccatctcatc tgtaacatca 9541 ttggcaaògc tacctttgcc atgtttcaga aacaactctg gcgcatgggg cttcccatac 9601 aagcgataga ttgtcgcacc tgattgcccg acaftatcgc gagcccattt atacccatat 9661 aaatcagcat ccatgttgga atttaatcgc ggcctcgagc aagacgtttc ccgttgaata 9721 tggctcãtaa cacccatgt attactgttt atgtaagcag acagttttat tgttcatgat 9781 gatataftft tatettgtgc aatgtaacat cagagattlt gagacacaac gtcgctttgt 9841 tggctagctc acacaaccgg tcgtgacttt tagggctccg agagaagctc ctcgatgtcg 9901 tctggccacg accagaggag ttcaccctcg gcggtgaggt tggtgtgctc gttcacccgg 9961 atcaggagat atcaggagat cgtcatcctc gatgcctcgg tgaacccgcc gccggccata 10021 CCttCgt

(F) pMV399-mut SodA ΔΕ54 (SEQ ID NO: 28)

Seqüência completa de nucleotídeos do vetor de integração cromossômica pMV399-mut SodA ΔΕ54 utilizado para expressar o sodA mutante na BCG para criar a SAD- BCGAE54 (expressa por cromossomos). Ela também pode ser adicionada a mutantes de Ia, 2a e 3a geração da BCG pro-apoptótica para dar, respectivamente, vacinas BCG pro-apoptóticas de 2a, 3a e 4a geração.

1 ggtaccccgt ggccgaatac accttgccag acctggactg ggactacgga 51 gcactggaac cgcacatctc gggtcagatc aacgagcttc gccacagcaa 101 igcaccacgcc acctacgtaa agggcgccaa tgacgccgtc gccaaactcg 151 aagaggcgcg cgccaaggat cactcagcga tcatgctgaa cgaaaagaat 201 ctagctttca acctcgccgg ccacgttaat cacaccatct ggtggaagaa 251 i cctgtcgcct aacggtggtg acaagcccac cggcgaactc gccgcagcca 301 tcgccgacgc gttcggttcg ttcgacaagt tccgtgcgca gttccacgcg 351 gccgctacca ccgtgcaggg gtcgggctgg gcggcactgg gctgggacac 401 actcggcaac aagctgctga tattccaggt ttacgaccac cagacgaact 451 tcccgctagg cattgttccg ctgctgctgc tcgacatgtg ggaacacgcc 501 ttctacctgc agtacaagaa cgtcaaagtc gactttgcca aggcgttttg 551 ; gaacgtcgtg aactgggccg atgtgcagtc acggtatgcg gccgcgacct 601 cgcagaccaa ggggttgata ttcagctgac cccgctgccg caagcgtcgg 651 gctcagtatt ccggagtcgc gcatcaccat ggggtacctc tagagtcgac 701 caccaagggc accatctctg cttgggccac cccgttggcc gcagccagct 751 cgctgagagc cgtgaacgac agggcgaacg ccagcccgcc gacggcgagg 801 gttccgaccg ctgcaactcc cggtgcaacc ttgtcccggt ctattctctt 851 cactgcacca gctecaatct ggtgtgaatg cccctcgtct gttcgcgcag 901 gcggggggct ctattcgttt gtcagcatcg aaagtagcca gatcagggat 951 gcgttgcaac cgcgtatgec caggtcagaa gagtcgcaca agagttgcag 1001 acccctggaa agaaaaatgg ccagagggcg aaaacaccct ctgaccagcg 1051 ;gagcgggcga cgggaatcga acccgcgtag ctagtttgga agaatgggtg 1101 : tctgccgacc acatatgggc cggtcaagat aggtttttac cccctctcgg 1151 ctgcatcctc taagtggaaa gaaattgcag gtcgtagaag cgcgttgaag 1201 : cctgagagtt gcacaggagt tgcaacccgg tagccttgtt cacgacgaga 1251 iggagacctag ttggcacgtc gcggatgggg atcgctgaag actcagcgca 1301 gcgggaggat ccaagcctca tacgtcaacc cgcaggacgg tgtgaggtac 1351 tacgcgctgc agacctacga caacaagatg gacgccgaag CCtggCtCgC 1401 igggcgagaag cggcteatcg agatggagac ctggacccct ccaeaggacc 1501 aagtggctcg tggagcgcga cctcgcagac ggcaccaggg atctgtacag 1551 cgggcacgcg gagcgccgca tctacccggt gctaggtgaa gtggcggtca 1601 cagagatgac gccagctctg gtgcgtgcgt ggtgggccgg gatgggtagg 1651 aagcacccga ctgcccgccg gcatgcctac aacgtectec gggcggtgat 1701 gaacacagcg gtcgaggaca agctgatcgc agagaacccg tgccggatcg 1751 agcagaaggc agccgatgag cgcgacgtag aggcgctgac gcctgaggag 1801 ctggacatcg tcgccgctga gatcttcgag cactaccgga tcgcggcata 1851 catcctggcg tggacgagcc tccggttcgg agagctgatc gagcttcgcc 1901 gcaaggacat cgtggacgac ggcatgacga tgaagctccg ggtgcgccgt 1951 ggcgcttccc gcgtggggaa caagatcgtc gttggcaacg ccaagaccgt 2001 ecggtcgaag cgtcctgtga cggtteegcc tcacgtcgcg gagatgatcc 2051 gagcgcacat gaaggaccgt acgaagatga acaagggccc cgaggcattc 2101 ctggtgacca cgacgeaggg caaccggctg tcgaagtccg cgttcaccaa 2151 gtcgctgaag cgtggctacg ccaagatcgg tcggccggaa ctccgcatcc 2201 acgacctccg cgctgtcggc gctacgttcg ccgctcaggc aggtgcgacg 2251 accaaggagc tgatggcccg tctcggtcac acgactccta ggatggcgat 2301 gaagtaccag atggcgtctg aggcccgcga cgaggctatc gctgaggcga 2351 tgtccaagct ggccaagacc tcctgaaacg caaaaagccc ccctcccaag 2401 gacactgagt cctaaagagg ggggtttctt gtcagtacgc gaagaaccac 2451 gcctggccgc gagcgccagc accgccgctc tgtgcggaga cctgggcacc 2501 agccccgccg ccgccaggag cattgccgtt cccgccagaa atctagaggt 2551 gaccacaacg acgcgcccgc tttgatcggg gacgtctgcg gccgaccatt 2601 tacgggtctt gttgtcgttg gcggtcatgg gccgaacata ctcacccgga 2651 tcggagggcc gaggacaagg tcgaacgagg ggcatgaccc ggtgcggggc 2701 ttatgcact cggcataggc gagtgctaag aataacgttg gcactcgcga 2751 ccggtgagtc gtaggeggg a cggtgaggc caggcccgtc gtcgcagcga 2801 gtggcagcga ggacaacttg agccgtccgt cgcgggcact gcgcccggcc 2851 agcgtaagta gcggggttgc cgtcacccgg tgacccccgg tttcatcccc 2901 gatccggagg aatcacttcg caatggccaa gacaattgcg gatccagctg 2951 cagaattcga agcttatcga tgtcgacgta gttaactagc gtacgatcga 3001 ctgccaggca tcaaataaaa cgaaaggctc agtcgaaaga ctgggccttt 3001 ctgccaggca tcaaataaaa cgaaaggctc agtcgaaaga ctgggccttt 3051 cgtittatct gttgtttgtc cggccatcat ggccgcggtg atcagctage 3101 caacaaagcg acgttgtgtc tcaaaatctc tgatgttaca ttgcacaaga 3151 taaaaatata tcatcatgat cgaattcctg cagctcacgg taactgatgc 3201 cgtatttgca gtaccagcgt acggcccaca gaatgatgtc acgctgaaaa 3251 tgccggcctt tgaatgggtt catgtgcagc tccatcagca aaaggggatg 3301 ataagtttat caccaccgac tatttgcaac agtgccgttg atcgtgctat 3351 gatcgactga tgtcatcagc ggtggagtgc aatgtcgtgc aatacgaatg 3401 gcgaaaagcc gagctcatcg gteagatct c aaccttggg gttacccccg 3451 geggtgtget gctggtccac agctccttcc gtagcgtccg gcccctcgaa 3501 gatgggccac ttggactgat cgaggccctg cgtgctacgc tgggtccggg 3551 agggacgctc gtcatgccct cgtggtcagg tctggacgac gagccgttcg 3601 atcctgccac gtcgcccgtt acaccggacc ttggagttgt ctctgacaca 3651 ttetggcgcc tgccaaatgt aaagcgcagc gcccatccat ttgcctttgc 3701 ggcagcgggg ccacaggcag agcagatcat ctctgatcca ttgcccctgc 3751 caccttactc gcctgcaagc ccggtcgccc gtgtccatga actcgatggg 3801 caggtacttc tcctcggcgt gggacacgat gccaacacga cgctgcatct 3851 tgccgagttg atggcaaagg ttccctatgg ggtgccgaga cactgcacca 3901 ttcttcagga tggcaagttg gtacgcgtcg attatctcga gaatgaccac 3951 tgctgtgagc gattgcat ggcggacagg tggctcaagg agaagagcct 4001 tcagaaggaa ggtccagtcg gtcatgcctt tgctcggttg atccgctccc 4051 gegacattgt ggcgacagcc ctgggtcaac tgggccgaga tccgttgatc 4101 ttcctgcatc cgccagaggc gggatgcgaa gaatgcgatg ccgctcgcca 4151 gtcgattggc tgagctcatg agcggagaac gagatgacgt tggaggggca 4201 aggtcgcgct gattgctggg gcaacacggg ggatccacta gttccactga 4251 gcgtcagacc ccgtagaaaa gatcaaagga tcttcttgag atcctttttt 4301 tctgcgcgta atctgctgct tgcaaacaaa aaaaccaccg ctaccagcgg 4351 tggtttgttt gccggatcaa gagctaccaa ctattttcc gaaggtaact 4401 ggcttcagca gagcgcagat accaaatact gtccttctag tgtagccgta 4451 gttaggccac cacttcaaga actctgtagc accgcctaca tacctcgctc 4501 tgctaatcct gttaccagtg gctgctgcca gtggcgataa gtcgtgtctt 4551 accgggttgg actcaagacg atagttaccg gataaggcgc agcggtcggg 4601 ctgaacgggg ggttcgtgca cacagcccag cttggagcga acgacctaca 4651 ccgaactgag atacctacag cgtgagcatt gagaaagcgc cacgcttccc 4701 gaagggagaa aggcggacag gtatccggta agcggcaggg tcggaacagg 4751 agagcgcacg agggagcttc cagggggaaa cgcctggtat ctttatagtc 4801 CtgtCgggtt tcgccacctc tgacttgagc gtcgattttt gtgatgctcg 4851 tcaggggggc ggagcctatg gaaaaacgcc agcaacgcgg cctattacg 4901 gttcctggcc ttttgctggc cttttgctca catgttcttt cctgcgttat 4951 cccctgattc tgtggataac cgtattaccg cctttgagtg agctgatacc 5001 gctcgccgca gccgaacgac cgagcgcaac gcgtgcggcc gctaaactgt 5051 tacaacgctc acatatgtgg ttggcgacga gcccaaggca gtcgcctcgc 5101 tgttcaatct gtgaccggat ccgcaggacg tcgatccgtg ggtttacctg 5151 cggatttgtc gttactggcg ggtagcttct gaaacggttc agtttttggg 5201 cgacttcgca aaatttgcaa aaagtccgca ggccgttgcc gaaattcgca 5251 agtgaaatgg gtggaccagc gttgacacgc tgtgccatgg tcgagttagc 5301 acaccagtga agctgcgccg ttgacaccgc ctggacgacg gtagggcgtc 5351 agcgtalcg gcaatgaaag accgttaagg agttgtct

(G) pMP399-mut SodA ΔΗ28ΔΗ76 (SEQ ID NO: 29)

Seqüência completa de nucleotídeos do vetor de integração cromossômica pMP399-mut SodA ΔΗ28ΔΗ76 utilizado para expressar o sodA mutante na BCG para criar a SAD-BCGAH28AH76 (expressa por cromossomos). Ela também pode ser adicionada a mutantes de 1a, 2a e 3a geração da BCG pro-apoptótica para dar, respectivamente, vacinas BCG pro-apoptóticas de 2a, 3a e 4a geração.

1 ggtaccccgt ggccgaatac accttgccag acctggactg ggactacgga

51 gcactggaac cgcacatctc gggtcagatc aacgagcttc acagcaagca

101 ccacgccacc tacgtaaagg gcgccaatga cgccgtcgcc aaactcgaag

151 aggcgcgcgc caaggaagat cactcagcga tcttgctgaa cgaaaagaat 201 ctagctttca acctcgccgg ccacgttaat accatctggt ggaagaacct 251 gtcgcctaac ggtggtgaca agcccaccgg cgaactcgcc gcagccatcg 301 ccgacgcgtt cggttcgttc gacaagttcc gtgcgcagtt ccacgcggcc 351 gctaccaccg tgcaggggtc gggctgggcg gcactgggct gggacacact 401 cggcaacaag ctgctgatat tccaggttta cgaccaccag acgaacttcc 451 cgctaggcat tgttccgctg CtgCtgCtCg acatgtggga acacgccttc 501 tacctgcagt acaagaacgt caaagtcgac tttgccaagg cgttttggaa 551 cgtcgtgaac tgggccgatg tgcagtcacg gtatgcggcc gcgacctcgc 601 agaccaaggg gttgatattc agctgacccc gctgccgcaa gcgtcgggct 651 cagtattccg gagtcgcgca tcaccatggg gtacctctag agtcgaccac 701 caagggcacc atctctgctt gggccacccc gttggccgca gccagctcgc 751 tgagagccgt gaacgacagg gcgaacgcca gcccgccgac ggcgagggtt 801 ccgaccgctg caactcccgg tgcaaccttg tcccggtcta ttctcttcac 851 tgcaccagct ccaatctggt gtgaatgccc ctcgtctgtt cgcgcaggcg 901 gggggctcta ttcgtttgtc agcatcgaaa gtagccagat cagggatgcg 951 ttgcaaccgc gtatgcccag gtcagaagag tcgcacaaga gttgcagacc 1001 cctggaaaga aaaatggcca gagggcgaaa acaccctctg accagcggag 1051 cgggcgacgg gaatcgaacc cgcgtagcta gtttggaaga atgggtgtct 1101 gccgaccaca tatgggccgg tcaagatagg tttttacccc ctctcggctg 1151 catcctctaa gtggaaagaa attgcaggtc gtagaagcgc gttgaagcct 1201 gagagttgca caggagttgc aacccggtag ccttgttcac gacgagagga 1251 gacctagttg gcacgtcgcg gatggggatc gctgaagact cagcgcagcg 1301 ggaggatcca agcctcatac gtcaacccgc aggacggtgt gaggtactac 1351 gcgctgcaga cctacgacaa caagatggac gccgaagcct ggctcgcggg 1401 cgagaagcgg ctcatcgaga tggagacctg gacccctcca caggaccggg 1451 cgaagaaggc agccgccagc gccatcacgc tggaggagta cacccggaag 1501 tggctcgtgg agcgcgacct cgcagacggc accagggatc tgtacagcgg 1551 gcacgcggag cgccgcatct acccggtgct aggtgaagtg gcggtcacag 1601 agatgacgcc agctctggtg cgtgcgtggt gggccgggat gggtaggaag 1651 cacccgactg cccgccggca tgcctacaac gtcctccggg cggtgatgaa 1701 cacagcggtc gaggacaagc tgatcgcaga gaacccgtgc cggatcgagc 1751 agaaggcagc cgatgagcgc gacgtagagg cgctgacgcc tgaggagctg 1801 gacatcgtcg ccgctgagat cttcgagcac taccggatcg cggcatacat 1851 CCtggCgtgg acgagcctcc ggttcggaga gctgatcgag cttcgccgca 1901 aggacatcgt ggacgacggc atgacgatga agctccgggt gcgccgtggc 1951 gcttcccgcg tggggaacaa gatcgtcgtt ggcaacgcca agaccgtccg 2001 gtcgaagcgt cctgtgacgg ttccgcctca cgtcgcggag atgatccgag 2051 cgcacatgaa ggaccgtacg aagatgaaca agggccccga ggcattcctg 2101 gtgaccacga cgcagggcaa ccggctgtcg aagtccgcgt tcaccaagtc 2151 gctgaagcgt ggctacgcca agatcggtcg gccggaactc cgcatccacg 2201 acctccgcgc tgtcggcgct acgttcgccg ctcaggcagg tgcgacgacc 2251 aaggagctga tggcccgtct cggtcacacg actcctagga tggcgatgaa 2301 gtaccagatg gcgtctgagg cccgcgacga ggctatcgct gaggcgatgt 2351 ccaagctggc caagacctcc tgaaacgcaa aaagcccccc tcccaaggac 2401 actgagtcct aaagaggggg gtttcttgtc agtacgcgaa gaaccacgcc 2451 tggccgcgag cgccagcacc gccgctctgt gcggagacct gggcaccagc 2501 CCCgCCgCCg ccaggagcat tgccgttecc gccagaaatc tagaggtgac 2551 cacaacgacg CgCCCgCttt gatcggggac gtctgcggcc gaccatttac 2601 gggtcttgtt gtcgttggcg gtcatgggcc gaacatactc acccggatcg 2651 gagggccgag gacaaggtcg aacgaggggc atgacccggt gcggggcttc 2701 ttgcactcgg cataggcgag tgctaagaat aacgttggca ctcgcgaccg 2751 gtgagtcgta ggtcgggacg gtgaggccag gcccgtcgtc gcagcgagtg 2801 gcagcgagga caacttgagc cgtccgtcgc gggcactgcg cccggccagc 2851 gtaagtagcg gggttgccgt cacccggtga cccccggttt catccccgat 2901 ccggaggaat cacttcgcaa tggccaagac aattgcggat ccagctgcag 2951 aattcgaagc ttategatgt cgacgtagtt aactagcgta cgatcgactg 3001 ccaggcatca aataaaacga aaggctcagt cgaaagactg ggcctttegt 3051 tttatctgtt gtttgtccgg ccatcatggc cgcggtgatc agctagccaa 3101 caaagcgacg ttgtgtctca aaatctctga tgttacattg cacaagataa 3151 aaatatatca tcatgatcga attcctgcag ctcacggtaa ctgatgccgt 3201 atttgcagta ccagcgtacg gcccacagaa tgatgtcacg ctgaaaatgc 3251 cggcctttga atgggttcat gtgcagctcc atcagcaaaa ggggatgata 3301 agtttatcac caccgactat ttgcaacagt gccgttgatc gtgctatgat 3351 cgactgatgt catcagcggt ggagtgcaat gtcgtgcaat acgaatggcg 3401 aaaagccgag ctcatcggtc agcttctcaa CCttggggtt acccccggcg 3451 gtgtgctgct ggtccacagc tccttccgta gcgtccggcc cctcgaagat 3501 gggccacttg gactgatcga ggccctgcgt gctacgctgg gtccgggagg 3551 gacgctcgtc atgccctcgt ggtcaggtct ggacgacgag ccgttcgatc 3601 ctgccacgtc gcccgttaca ccggaccttg gagttgtctc tgacacattc 3651 tggcgcctgc caaatgtaaa gcgcagcgcc catccatttg cctttgcggc 3701 agcggggcca caggcagagc agatcatctc tgatccattg cccctgccac 3751 cttactcgcc tgcaagcccg gtcgcccgtg tccatgaact cgatgggcag 3801 gtacttctcc tcggcgtggg acacgatgcc aacacgacgc tgcatcttgc 3851 ; cgagttgatg geaaaggttc cctatggggt gccgagacac tgcaccattc 3901 j ttcaggatgg caagttggta cgcgtcgatt atctcgagaa tgaccactgc 3951 ; tgtgagcgct ttgccttggc ggacaggtgg ctcaaggaga agagccttca 4001 ígaaggaaggt ccagtcggtc atgcctttgc tcggttgatc cgctcccgcg 4051 ; acattgtggc gacagccctg ggtcaactgg gccgagatcc gttgatcttc 4101 ctgcatccgc cagaggcggg atgcgaagaa tgcgatgccg ctcgccagtc 4151 gattggctga gcteatgagc ggagaacgag atgacgttgg aggggcaagg 4201 tcgcgctgat tgctggggca acacggggga tccactagtt ccactgagcg 4251 tcagaccccg tagaaaagat caaaggatct tcttgagatc CtttttttCt 4301 gcgcgtaatc tgctgcttgc aaacaaaaaa accaccgcta ccagcggtgg 4351 tttgtttgcc ggatcaagag ctaccaactc tttttccgaa ggtaactggc 4401 ttcagcagag cgcagatacc aaatactgtc cttctagtgt agccgtagtt 4451 aggccaccac ttcaagaact ctgtagcacc gcctacatac ctcgctctgc 4501 taatcctgtt accagtggct gctgccagtg gcgataagtc gtgtcttacc 4551 gggttggact caagacgata gttaccggat aaggcgcagc ggtcgggctg 4601 aacggggggt tcgtgcacac agcccagctt ggagcgaacg acctacaccg 4651 aactgagata cctacagcgt gagcattgag aaagcgccac gcttcccgaa 4701 gggagaaagg cggacaggta tccggtaagc ggcagggtcg gaacaggaga 4751 gcgcacgagg gagcttccag ggggaaacgc ctggtatctt tatagtcctg 4801 tcgggtttcg ccacctctga cttgagcgtc gatttttgtg atgctcgtca 4851 ggggggcgga gcctatggaa aaacgccagc aacgcggcct ttttacggtt 4901 CCtggCCttt tgctggcctt ttgctcacat gttctttcct gcgttatccc 4951 ctgattctgt ggataaccgt attaccgcct ttgagtgage tgataccgct 5001 cgccgcagcc gaacgaccga gcgcaacgcg tgcggccgct aaactgttac 5051 aacgctcaca tatgtggttg gcgacgagcc caaggcagtc gcctcgctgt 5101 tcaatctgtg accggatccg caggacgtcg atccgtgggt ttacctgcgg 5151 atttgtcgtt actggcgggt agcttctgaa acggttcagt ttttgggcga 5201 cttcgcaaaa tttgcaaaaa gtccgcaggc cgttgccgaa attcgcaagt 5251 gaaatgggtg gaccagcgtt gacacgctgt gccatggtcg agttagcaca 5301 5351

ccagtgaagc tgcgccgttg acaccgcctg gacgacggta gggcgtcagc gttttcggca atgaaagacc gttaaggagt tgtct

(H) pMP399-mut glnAl Δϋ54ΔΕ335 (SEQ ID NO: 30)

Seqüência completa de nucleotídeos do vetor de integração cromossômica pMP399-mut glnAl Δϋ54ΔΕ335 utilizado para expressar o glnAl mutante na BCG para criar a GLAD-BCG (expressa por cromossomos). Ela também pode ser adicionada a mutantes de Ia, 2a e 3a geração da BCG pro-apoptótica para dar, respectivamente, vacinas BCG pro-apoptóticas de 2a, 3a e 4a geração.

1 gctagccaac aaagcgacgt tgtgtctcaa aatctctgat gttacattgc acaagataaa 61 aatatatcat catgatcgaa ttcctgcagc tcacggtaac tgatgccgta tttgcagtac 121 cagcgtacgg cccacagaat gatgtcacgc tgaaaatgcc ggcctttgaa tgggttcatg 181 tgcagctcca tcagcaaaag gggatgataa gtttatcacc accgactatt tgcaacagtg 241 ccgttgatcg tgctatgatc gactgatgtc atcagcggtg gagtgcaatg tcgtgcaata 301 cgaatggcga aaagccgagc tcatcggtca gcttctcaac cttggggtta cccccggcgg 361 tgtgctgctg gtccacagct ccttccgtag cgtccggccc ctcgaagatg ggccacttgg 421 actgatcgag gccctgcgtg ctacgctggg tccgggaggg acgctcgtca tgccctcgtg 481 gtcaggtctg gacgacgagc cgttcgatcc tgccacgtcg cccgttacac cggaccttgg 541 agttgtctct gacacattct ggcgcctgcc aaatgtaaag cgcagcgccc atccatttgc 601 ctttgcggca gcggggccac aggcagagca gatcatctct gatccattgc ccctgccacc 661 ttactcgcct gcaagcccgg tcgcccgtgt ccatgaactc gatgggcagg tacttctcct 721 cggcgtggga cacgatgcca acacgacgct gcatcttgcc gagttgatgg caaaggttcc 781 ctatggggtg ccgagacact gcaccattct tcaggatggc aagttggtac gcgtcgatta 841 tctcgagaat gaccactgct gtgagcgctt tgccttggcg gacaggtggc tcaaggagaa 901 gagccttcag aaggaaggtc cagtcggtca tgcctttgct cggttgatcc gctcccgcga 961 cattgtggcg acagccctgg gtcaactggg ccgagatccg ttgatcttcc tgcatccgcc 1021 agaggcggga tgcgaagaat gcgatgccgc tcgccagtcg attggctgag ctcatgagcg 1081 gagaacgaga tgacgttgga ggggcaaggt cgcgctgatt gctggggcaa cacgggggat 1141 ccactágtcc accaccagac ggccgatccc caccggccgc cggccaccca ctgccaccac 1201 gaccagaccc agcatcaact gcccgggtgt gaatccgaac aagcggaccg ccgccacccc 1261 gagcagcagc caaatcacca ggacaaccgt cgacagcatc ggggtcgacc aaacaccgaa 1321 ttccacgccc agcaacgcca gaccgtaggc gatcagccag tcgatcagca gagccgccag 1381 CCggCgCCCC atcggagcca gcgaacccgg tccggtgtcc ggcaagccca gcgtcttgcc 1441 gggatagtcg ggcggcgatt tcgccgtcat cgggcagacc cgataaccag gttcccgttc 1501 ggcatgccac cggttacgat cttgccgacc atggccccac aatagggccg gggagacccg 1561 gcgtcagtgg tgggcggcac ggtcagtaac gtctgcgcaa cacggggttg actgacgggc 1621 aatatcggct ccatagcgtc ggccgcggat acagtaaagg agcattctgt gacggaaaag 1681 acgcccgacg acgtcttcaa acttgccaag gacgagaagg tcgaatatgt cgacgtccgg 1741 ttctgtgacc tgcctggcat catgcagcac ttcacgattc CggCttCggC ctttgacaag 1801 agcgtgtttg acgacggctt ggcctttggc tcgtcgattc gcgggttcca gtcgatccac 1861 gaatcçgaca tgttgcttct tcccgatccc gagacggcgc gcatcgaccc gttccgcgcg 1921 gccaagacgc tgaatatcaa CttCtttgtg cacgacccgt tcaccctgga gccgtactcc 1981 cgcgacccgc gcaacatcgc ccgcaaggcc gagaactacc tgatcagcac tggcatcgcc 2041 gacaccgcat acttcggcgc cgaggccgag ttctacattt tcgattcggt gagcttcgac 2101 tcgcgcgcca acggctcctt ctacgaggtg gacgccatct Cggggtggtg gaacaccggc 2161 gcggcgaccg aggccgacgg cagtcccaac cggggctaca aggtccgcca caagggcggg 2221 tatttcbcag tggcccccaa cgaccaatac gtcgacctgc gcgacaagat gctgaccaac 2281 ctgatcaact ccggcttcat cctggagaag ggccaccacg aggtgggcag cggcggacag 2341 gccgagatca actaccagtt caattcgctg ctgcacgccg ccgacgacat gcagttgtac 2401 aagtacatca tcaagaacac cgcctggcag aacggcaaaa cggtcacgtt catgcccaag 2461 CCgCtgttCg gcgacaacgg gtccggcatg cactgtcatc agtcgctgtg gaaggacggg 2521 gccccgctga tgtacgacga gacgggttat gccggtctgt cggacacggc ccgtcattac 2581 atcggcggcc tgttacacca cgcgccgtcg CtgCtggCCt tcaccaaccc gacggtgaac 2641 tcctacaagc ggctggttcc cggttacgcc ccgatcaacc tggtctatag ccagcgcaac 2701 cggtcggcat gcgtgcgcat cccgatcacc ggcagcaacc cgaaggccaa gcggctggag 2761 ttccgaagcc ccgactcgtc gggcaacccg tatctggcgt tctcggccat gctgatggca 2821 ggcctggacg gtatcaagaa caagatcgag ccgcaggcgc ccgtcgacaa ggatctctac 2881 gagctgccgc cggaagaggc cgcgagtatc ccgcagactc cgacccagct gtcagatgtg 2941 atcgaecgtc tcgaggccga ccacgaatac ctcaccgaag gaggggtgtt cacaaacgac 3001 ctgatcgaga cgtggatcag tttcaagcgc gaaaacgaga tcgagccggt caacatccgg 3061 ccgcatccct acgaattcgc gctgtactac gacgtttaag gactcttcgc agtccgggtg 3121 tagagggagc ggcgtggact agttccactg agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg 3181 atcttcttga gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc 3241 gctaccagcg gtggtttgtt tgccggatca agagctacca actctttttc cgaaggtaac 3301 tggcttcagc agagcgcaga taccaaatac tgtccttcta gtgtagccgt agttaggcca 3361 ccacttcaag aactctgtag caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt 3421 ggctgctgcc agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac gatagttacc 3481 ggataaggcg cageggtegg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg 3541 aacgacctac accgaactga gatacctaca gcgtgagcat tgagaaagcg ccacgcttcc 3601 cgaagggaga aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac 3661 gagggagctt ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct 3721 ctgacttgag cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc 3781 cagcaacgcg gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc acatgttctt 3841 tcctgcgtta tcccctgatt ctgtggataa ccgtattacc gcctttgagt gagctgatac 3901 CgCtCgCCgC agccgaacga ccgagcgcaa cgcgtgcggc cgcggtaccc ggggatcctc 3961 cgctgagagc cgtgaacgac agggcgaacg ccagcccgcc gacggcgagg gttccgaccg 4081 ctgcaactcc cggtgcaacc ttgtcccggt ctattctcft cactgcacca gctccaatct 4141 ggtgtgaatg cccctcgtct gttcgcgcag gcggggggct ctattcgttt gtcagcatcg 4201 aaagtagcca gatcagggat gcgttgcaac cgcgtatgcc caggtcagaa gagtcgcaca 4261 agagttgcag 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tcgcggcata catcctggcg tggacgagcc tccggttcgg agagctgatc 5161 gagcttcgcc gcaaggacat cgtggacgac ggcatgacga tgaagctccg ggtgcgccgt 5221 ggcgcttccc gcgtggggaa caagatcgtc gttggcaacg ccaagaccgt ccggtcgaag 5281 cgtcctgtga cggttccgcc tcacgtcgcg gagatgatcc gagcgcacat gaaggaccgt 5341 acgaagatga acaagggccc cgaggcattc ctggtgacca cgacgcaggg caaccggctg 5401 tcgaagtccg cgttcaccaa gtcgctgaag cgtggctacg ccaagatcgg tcggccggaa 5461 ctccgcatcc acgacctccg cgctgteggc gctacgttcg ccgctcaggc aggtgcgacg 5521 accaaggagc tgatggcccg tctcggtcac acgactccta ggatggcgat gaagtaccag 5581 atggcgtctg aggcccgcga cgaggctatc gctgaggcga tgtccaagct ggccaagacc 5641 tcctgaaacg caaaaagccc ccctcccaag gacactgagt cctaaagagg ggggtttctt 5701 gtcagçacgc gaagaaccac gcctggccgc gagcgccagc accgccgctc tgtgcggaga 5761 cctgggcacc agccccgccg ccgccaggag cattgccgtt cccgccagaa atctagaggt 5821 gaccaòaacg acgcgcccgc tttgatcggg gacgtctgcg gccgaccatt tacgggtctt 5881 gttgtcgttg gcggtcatgg gccgaacata ctcacccgga tCggagggcc gaggacaagg 5941 tcgaacgagg ggcatgaccc ggtgcggggc ttettgcact cggcataggc gagtgctaag 6001 aataacgttg gcactcgcga ccggtgagtc gtaggtcggg acggtgaggc caggcccgtc 6061 gtcgcagcga gtggcagcga ggacaacttg agccgtccgt cgcgggcact gcgcccggcc 6121 agcgtaagta gcggggttgc cgtcacccgg tgacccccgg tttcatcccc gatccggagg 6181 aatcacttcg caatggccaa gacaattgcg gatccagctg cagaattcga agcttatcga 6241 tgtcgacgta gttaactagc gtacgatcga ctgccaggca tcaaataaaa cgaaaggctc 6301 agtcgaaaga CtgggCCttt cgttttatct gttgtttgtc cggccatcat ggccgcggtg 6361 atca

(I) pMP399-mut SodA ΔΕ54, mut glnAl Δϋ54ΔΕ335 (SEQ ID NO:

31)

Seqüência completa de nucleotídeos do vetor plasmídeo pMP399-mut SodA ΔΕ54, mut glnAl Δϋ54ΔΕ335 utilizado para expressar simultaneamente o sodA mutante ΔΕ54 e o glnAl mutante Δϋ54ΔΕ335 na BCG para criar a GLAD-SAD-BCG ΔΕ54 (expressa por cromossomos). Ele também pode ser adicionado a mutantes de 1a e de 2a geração da BCG pro-apoptótica para dar, respectivamente, vacinas BCG pro-apoptóticas de 3a e 4a geração.

1 ggtaccccgt ggccgaatac accttgccag acctggactg ggactacgga gcactggaac 61 cgcacatctc gggtcagatc aacgagcttc gccacagcaa gcaccacgcc acctacgtaa 121 agggcgccaa tgacgccgtc gccaaactcg aagaggcgcg cgccaaggat cactcagcga 181 tcatgctgaa cgaaaagaat ctagctttca acctcgccgg ccacgttaat cacaccatct 241 ggtggaagaa cctgtcgcct aacggtggtg acaagcccac cggcgaactc gccgcagcca 301 tcgccgacgc gttcggttcg ttcgacaagt tccgtgcgca gttccacgcg gccgctacca 361 ccgtgcaggg gtcgggctgg gcggcactgg gctgggacac actcggcaac aagctgctga 421 tattccaggt ttacgaccac cagacgaact tcccgctagg cattgttccg ctgctgctgc 481 tcgacaígtg ggaacacgcc ttctacctgc agtacaagaa cgtcaaagtc gactttgcca 541 aggcgttttg gaacgtcgtg aactgggccg atgtgcagtc acggtatgcg gccgcgacct 601 ccggagtcgc gcatcaccat ggggtacctc tagagtcgac caccaagggc accatctctg 721 cttgggccac CCCgttggCC gcagccagct cgctgagagc cgtgaacgac agggcgaacg 781 ccagccégcc gacggcgagg gttccgaccg ctgcaactcc cggtgcaacc ttgtcccggt 841 gcggggggct ctattcgttt gtcagcatcg aaagtagcca gatcagggat gcgttgcaac 961 cgcgtatgcc caggtcagaa gagtcgcaca agagttgcag acccctggaa agaaaaatgg 1021 ccagagggcg aaaacaccct ctgaccagcg gagcgggcga cgggaatcga acccgcgtag 1081 ctagtttgga agaatgggtg tctgccgacc acatatgggc cggtcaagat aggtttttac 1141 cccctctcgg ctgcatcctc taagtggaaa gaaattgcag gtcgtagaag cgcgttgaag 1201 cctgagagtt gcacaggagt tgcaacccgg tagccttgtt cacgacgaga ggagacctag 1261 ttggcacgtc gcggatgggg atcgctgaag actcagcgca gcgggaggat ccaagcctca 1321 tacgtcaacc cgcaggacgg tgtgaggtac tacgcgctgc agacctacga caacaagatg 1381 gacgccgaag cctggctcgc gggcgagaag cggctcatcg agatggagac ctggacccct 1441 ccacaggacc gggcgaagaa ggcagccgcc agcgccatca cgctggagga gtacacccgg 1501 aagtggctcg tggagcgcga cctcgcagac ggcaccaggg atctgtacag cgggcacgcg 1561 gagcgcògca tctacccggt gctaggtgaa gtggcggtca cagagatgac gccagctctg 1621 gtgcgtgcgt ggtgggccgg gatgggtagg aagcacccga ctgcccgccg gcatgcctac 1681 aacgtcctcc gggcggtgat gaacacagcg gtcgaggaca agctgatcgc agagaacccg 1741 tgccggatcg agcagaaggc agccgatgag cgcgacgtag aggcgctgac gcctgaggag 1801 ctggacãtcg tcgccgctga gatcttcgag cactaccgga tcgcggcata eatcctggcg 1861 tggacgagcc tccggttcgg agagctgatc gagcttcgcc gcaaggacat cgtggaegac 1921 ggcatgacga tgaagctccg ggtgcgccgt ggcgcttccc gcgtggggaa caagatcgtc 1981 gttggcaacg ccaagaccgt ccggtcgaag cgtcctgtga cggttccgcc tcacgtcgcg 2041 gagatgátcc gagcgcacat gaaggaccgt acgaagatga acaagggccc cgaggcattc 2101 ctggtgacca cgacgcaggg caaccggctg tcgaagtccg cgttcaccaa gtcgctgaag 2161 cgtggctacg ccaagatcgg tcggccggaa ctccgcatcc acgacctccg cgctgtcggc 2221 gctacgttcg ccgctcaggc aggtgcgacg accaaggagc tgatggcccg tctcggtcac 2281 acgactccta ggatggcgat gaagtaccag atggcgtctg aggcccgcga cgaggetatc 2341 gctgaggcga tgtccaagct ggccaagacc tcctgaaacg caaaaagecc ccctcccaag 2401 gacactgagt cctaaagagg ggggtttctt gtcagtacgc gaagaaccac gcctggccgc 2461 gagcgccagc accgccgctc tgtgcggaga cctgggcacc agccccgccg ccgeeaggag 2521 cattgccgtt cccgccagaa atctagaggt gaccacaacg acgcgcccgc tttgatcggg 2581 gacgtctgcg gccgaccatt tacgggtctt gttgtcgttg gcggtcatgg gccgaacata 2641 ctcacccgga tcggagggcc gaggacaagg tcgaacgagg ggcatgaccc ggtgcggggc 2701 ttcttgcact cggcataggc gagtgctaag aataacgttg gcactcgcga ccggtgagtc 2761 gtaggtcggg acggtgaggc caggcccgtc gtcgcagcga gtggcagcga ggacaacttg 2821 agccgtccgt cgcgggcact gcgcccggcc agcgtaagta gcggggttgc cgtcacccgg 2881 tgacccecgg tttcatcccc gatccggagg aatcacttcg caatggccaa gacaattgcg 2941 gatccagctg cagaattcga agcttatcga tgtcgacgta gttaactagc gtacgatcga 3001 ctgccaggca tcaaataaaa cgaaaggctc agtcgaaaga ctgggccttt cgttttatct 3061 gttgtttgtc cggccatcat ggccgcggtg atcagctagc caacaaagcg acgttgtgtc 3121 tcaaaaictc tgatgttaca ttgcacaaga taaaaatata tcatcatgat cgaattcctg 3181 cagctcacgg taactgatgc cgtatttgca gtaccagcgt acggcccaca gaatgatgtc 3241 acgctgaaaa tgccggcctt tgaatgggtt catgtgcagc tccatcagca aaaggggatg 3301 ataagtttat caccaccgac tatttgcaac agtgccgttg atcgtgctat gatcgactga 3361 tgtcatcagc ggtggagtgc aatgtcgtgc aatacgaatg gcgaaaagcc gagctcatcg 3421 gtcagcttct caaccttggg gttacccccg gcggtgtgct gctggtceae agctccttcc 3481 gtagcgtccg gcccctcgaa gatgggccac ttggactgat cgaggccctg cgtgctacgc 3541 tgggtccggg agggacgctc gtcatgccct cgtggtcagg tctggacgac gagccgttcg 3601 atcctgccac gtcgcccgtt acaccggacc ttggagttgt ctctgacaca ttctggcgcc 3661 tgccaaatgt aaagcgcagc gcccatccat ttgcctttgc ggcagcgggg ccacaggcag 3721 agcagatcat ctctgatcca ttgcccctgc caccttactc gcctgcaagc ccggtcgccc 3781 gtgtccátga actcgatggg caggtacttc tecteggcgt gggacacgat gccaacacga 3841 cgctgcatct tgccgagttg atggcaaagg ttccctatgg ggtgccgaga cactgcacca 3901 ttatcagga tggcaagttg gtacgcgtcg attatctcga gaatgaccac tgctgtgagc 3961 gctttgcctt ggeggacagg tggctcaagg agaagagcct tcagaaggaa ggtccagtcg 4021 gtcatgcctt tgctcggttg atccgctccc gcgacattgt ggcgacagcc ctgggtcaac 4081 tgggccgaga tccgttgatc ttcctgcatc cgccagaggc gggatgcgaa gaatgcgatg 4141 ccgctcgcca gtcgattggc tgagctcatg agcggagaac gagatgacgt tggaggggca 4201 aggtcgcgct gattgctggg gcaacacggg ggatccacta gtccaccacc agacggcega 4261 tccecaccgg ccgccggcca cccactgcca ccacgaccag acccagcatc aactgcccgg 4321 gtgtgaâtcc gaacaagcgg accgccgcca ccccgagcag cagccaaatc accaggacaa 4381 ccgtcgacag catcggggtc gaccaaacac cgaattccac gcccagcaac gccagaccgt 4441 aggcgatcag ccagtcgatc agcagagccg ccagccggcg ccccatcgga gccagcgaac 4501 ccggtcòggt gtccggcaag cccagcgtct tgccgggata gtcgggcggc gatttcgccg 4561 tcatcgggca gacccgataa ccaggttccc gttcggcatg ccaccggtta cgatcttgcc 4621 gaccatggcc ccacaatagg gccggggaga cceggcgtca gtggtgggcg gcacggtcag 4681 taacgtctgc gcaacacggg gttgactgac gggcaatatc ggetccatag Cgtcggccgc 4741 ggatacàgta aaggagcatt ctgtgacgga aaagacgccc gacgacgtct teaaacttgc 4801 caaggacgag aaggtcgaat atgtcgacgt ccggttctgt gacctgcctg gcatcatgca 4861 gcacttçacg attccggctt cggcctttga caagagcgtg tttgacgacg gcttggcctt 4921 tggctcgtcg attcgcgggt tccagtcgat ccacgaatee gacatgttgc ttctteccga 4981 tcccgagacg gcgcgcatcg acccgttceg cgcggccaag acgctgaata tcaacttctt 5041 tgtgcaçgac ccgttcaccc tggagccgta ctcccgcgac ccgcgcaaca tcgcccgcaa 5101 ggccgagaac tacctgatca gcactggcat cgccgacacc gcatacttcg gcgccgagge 5161 cgagttetac attltcgatt cggtgagett cgactcgcgc gccaacggct ccttctacga 5221 ggtggacgcc atctcggggt ggtggaacac cggcgcggeg accgaggccg acggcagtcc 5281 caaccggggc tacaaggtcc gccacaaggg egggtatttc ccagtggccc ccaacgacca 5341 atacgtcgac ctgcgcgaca agatgctgac caacctgatc aactccggct tcatectgga 5401 gaagggccac cacgaggtgg gcagcggcgg acaggccgag atcaactacc agttcaattc 5461 gctgctgcac gccgccgacg acatgcagtt gtacaagtac atcatcaaga acaccgcctg 5521 gcagaaeggc aaaacggtca cgttcatgcc caagccgctg ttcggcgaca acgggtccgg 5581 catgcactgt catcagtcgc tgtggaagga CggggCCCCg ctgatgtacg acgagacggg 5641 ttatgccggt ctgtcggaca Cggccegtca ttacatcgge ggcctgttac accacgcgcc 5701 gtcgctgctg gccttcacca acccgacggt gaactcctac aagcggctgg ttcccggtta 5761 cgccccgatc aacctggtct atagccagcg caaccggtcg gcatgcgtgc gcatcccgat 5821 caccggcagc aacccgaagg ccaagcggct ggagttccga agccccgact cgtcgggcaa 5881 cccgtatctg gcgttctcgg ccatgctgat ggcaggcctg gacggtatca agaacaagat 5941 cgagccgcag gcgcccgtcg acaaggatct ctacgagctg ccgccggaag aggccgcgag 6001 tatcccgcag 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ggggcggagc ctatggaaaa acgccagcaa cgcggccttt ttacggttcc 6901 tggccittig ctggcctttt gctcacatgt tctttcctgc gttatcccct gattctgtgg 6961 ataaccgtat taccgccttt gagtgagctg ataccgctcg ccgcagccga acgaccgagc 7021 gcaacgcgtg cggccgctaa actgttacaa cgctcacata tgtggttggc gacgagccca 7081 aggcagjtcgc ctcgctgttc aatctgtgac cggatccgca ggacgtcgat CCgtgggttt 7141 acctgcggat ttgtcgttac tggcgggtag cttctgaaac ggttcagttt ttgggcgact 7201 tcgcaaaatt tgcaaaaagt ccgcaggccg ttgccgaaat tcgcaagtga aatgggtgga 7261 ccagcgttga cacgctgtgc catggtcgag ttagcacacc agtgaagctg cgccgttgac 7321 accgcctgga cgacggtagg gcgtcagcgt tttcggcaat gaaagaccgt taaggagttg 7381 tct

(J) pMP399-mut SodA ΔΗ28ΔΗ76, mut glnAl Δϋ54ΔΕ335 (SEQ ID NO: 32)

Seqüência completa de nucleotídeos do vetor plasmídeo pMP399-mut SodA ΔΗ28ΔΗ76, mut glnAl Δϋ54ΔΕ335 utilizado para expressar simultaneamente o sodA mutante ΔΗ28ΔΗ76 e o glnAl mutante ΔΏ54ΔΕ335 na BCG para criar a GLAD-SAD- BCG ΔΗ28ΔΗ76 (expressa por cromossomos). Ela também pode ser adicionada a mutantes de 1a e de 2a geração da BCG pro-apoptótica para dar, respectivamente, vacinas BCG pro- apoptóticas de 3a e 4a geração.

1 ggtaccccgt ggccgaatac accttgccag acctggactg ggactacgga 51 igcactggaac cgcacatctc gggtcagatc aacgagcttc acagcaagca 101 ccacgccacc tacgtaaagg gcgccaatga CgCCgtCgCC aaactcgaag 151 aggcgcgcgc caaggaagat cactcagcga tettgctgaa cgaaaagaat 201 ctagctttca acctcgccgg ccacgttaat accatctggt ggaagaacct 251 gtcgcctaac ggtggtgaca agcccaccgg cgaactcgcc gcagccatcg 301 ccgacgcgtt cggttcgttc gacaagttcc gtgcgcagtt ccacgcggcc 351 gctaccaccg tgcaggggtc gggctgggcg gcactgggct gggacacact 401 cggcaacaag ctgctgatat tccaggttta cgaccaccag acgaacttcc 451 cgctaggcat tgttccgctg etgctgctcg acatgtggga acacgccttc 501 tacctgcagt acaagaacgt caaagtcgac tttgccaagg cgttttggaa 551 cgtcgtgaac tgggccgatg tgcagtcacg gtatgcggcc gcgacctcgc 601 agaccaaggg gttgatattc agetgacccc gctgccgcaa gcgtcgggct 651 cagtattccg gagtcgcgca tcaccatggg gtacctctag agtcgaccac 701 caagggcacc atctctgctt gggccacccc gttggccgca gccagctcgc 751 tgagagccgt gaacgacagg gcgaacgcca gcccgccgac ggcgagggtt 801 ccgaccgctg caactcccgg tgcaaccttg tcccggtcta ttctcttcac 851 tgcaccagct ccaatctggt gtgaatgccc CtCgtCtgtt cgcgcaggcg 901 gggggctcta ttcgtttgtc agcatcgaaa gtagccagat cagggatgcg 951 ttgcaaccgc gtatgcccag gtcagaagag tcgcacaaga gttgcagacc 1001 cctggaaaga aaaatggcca gagggcgaaa acaccctctg accagcggag 1051 cgggcgacgg gaatcgaacc cgegtagcta gtttggaaga atgggtgtct 1101 gccgaccaca tatgggccgg tcaagatagg tttttacccc ctctcggctg 1151 catcctctaa gtggaaagaa attgcaggtc gtagaagcgc gttgaagcct 1201 gagagttgca caggagttgc aacccggtag ccttgttcac gacgagagga 1251 gacctagttg gcacgtcgcg gatggggatc gctgaagact cagcgcagcg 1301 ggaggatcca agcctcatac gtcaacccgc aggacggtgt gaggtactac 1351 gcgctgcaga cctacgacaa caagatggac gccgaagcct ggctcgcggg 1401 cgagaagcgg ctcatcgaga tggagacctg gacccctcca caggaccggg 1451 cgaagaaggc agccgccagc gccatcacgc tggaggagta cacccggaag 1501 tggctcgtgg agcgcgacct cgcagacggc accagggatc tgtacagcgg 1551 gcacgcggag cgccgcatct acccggtgct aggtgaagtg gcggtcacag 1601 agatgacgcc agctctggtg CgtgCgtggt gggccgggat gggtaggaag 1651 cacccgactg cccgccggca tgcctacaac gtcctccggg cggtgatgaa 1701 cacagcggtc gaggacaagc tgatcgcaga gaacccgtgc cggatcgagc 1751 agaaggcagc cgatgagcgc gacgtagagg cgctgacgcc tgaggagctg 1801 gacatcgtcg ccgctgagat cttcgagcac taccggatcg cggcatacat 1851 cctggcgtgg acgagcctcc ggttcggaga gctgatcgag cttcgccgca 1901 aggacatcgt ggacgacggc atgacgatga agctccgggt gcgccgtggc 1951 gcttcccgcg tggggaacaa gatcgtcgtt ggcaacgcca agaccgtccg 2001 gtcgaagcgt cctgtgacgg ttccgcctca cgtcgcggag atgatccgag 2051 cgcacatgaa ggaccgtacg aagatgaaca agggccccga ggcattcctg 2101 gtgaccacga cgcagggcaa ccggctgtcg aagtccgcgt tcaccaagtc 2151 gctgaagcgt ggctacgcca agatcggtcg gccggaactc cgcatccacg 2201 acctccgcgc tgtcggcgct acgttcgccg ctcaggcagg tgcgacgacc 2251 aaggagctga tggcccgtct cggtcacacg actcctagga tggcgatgaa 2301 gtaccagatg gcgtctgagg cccgcgacga ggctatcgct gaggcgatgt 2351 ccaagctggc caagacctcc tgaaacgcaa aaagcccccc tcccaaggac 2401 actgagtcct aaagaggggg gtttcttgtc agtacgcgaa gaaccacgcc 2451 tggccgcgag cgccagcacc gccgctctgt gcggagacct gggcaccagc 2501 cccgccgccg ccaggagcat tgccgttccc gccagaaatc tagaggtgac 2551 cacaacgacg cgcccgcttt gatcggggac gtctgcggcc gaccatttac 2601 gggtcttgtt gtcgttggeg gtcatgggcc gaacatactc acccggatcg 2651 gagggccgag gacaaggtcg aacgaggggc atgacccggt gcggggcttc 2701 ttgcactcgg cataggcgag tgctaagaat aacgttggca ctcgcgaccg 2751 gtgagtcgta ggtcgggacg gtgaggccag gcccgtcgtc gcagcgagtg 2801 gcagcgagga caacttgagc cgtccgtcgc gggcactgcg cccggccagc 2851 gtaagtagcg gggttgccgt cacccggtga cccccggttt catccccgat 2901 ccggaggaat cacttcgcaa tggccaagac aattgcggat ccagctgcag 2951 aattcgaagc ttatcgatgt cgacgtagtt aactagcgta cgatcgactg 3001 ccaggcatca aataaaacga aaggctcagt cgaaagactg ggcctttcgt 3051 tttatctgtt gtttgtccgg ccatcatggc cgcggtgatc agctagccaa 3101 caaagcgacg ttgtgtctca aaatctctga tgttacattg cacaagataa 3151 aaatatatca tcatgatcga attcctgcag ctcacggtaa ctgatgccgt 3201 atttgcagta ccagcgtacg gcccacagaa tgatgtcacg ctgaaaatgc 3251 cggcctttga atgggttcat gtgcagctcc atcagcaaaa ggggatgata 3301 agtttatcac caccgactat ttgcaacagt gccgttgatc gtgctatgat 3351 cgactgatgt catcagcggt ggagtgcaat gtcgtgcaat acgaatggcg 3401 aaaagccgag ctcatcggtc agcttctcaa CCttggggtt acccccggcg 3451 gtgtgctgct ggtccacagc tccttccgta gcgtccggcc cctcgaagat 3501 gggccacttg gactgatcga ggccctgcgt gctacgctgg gtccgggagg 3551 gacgctcgtc atgccctcgt ggtcaggtct ggacgacgag ccgttcgatc 3601 ctgccacgtc gcccgttaca ccggaccttg gagttgtctc tgacacattc 3651 tggcgcctgc caaatgtaaa gcgcagcgcc catccatttg cctttgcggc 3701 agcggggcca caggcagagc agatcatctc tgatccattg cccctgccac 3751 cttactcgcc tgcaagcccg gtcgcccgtg tccatgaact cgatgggcag 3801 gtacttctcc tcggcgtggg acacgatgcc aacacgacgc tgcatcttgc 3851 cgagttgatg gcaaaggttc cctatggggt gccgagacac tgcaccattc 3901 ttcaggatgg 3951 tgtgagcgct 4001 gaaggaaggt 4051 acattgtggc 4101 ctgcatccgc 4151 ; gattggctga 4201 tcgcgctgat 4251 cggccgatcc 4301 cagcatcaac 4351 Icgagcagcag 4401 caaacaccga 4451 gtcgatcagc 4501 gtccggtgtc 4551 ttcgccgtca 4601 ccggttacga 4651 ggcgtcagtg 4701 gactgacggg 4751 gagcattctg 4801 ggacgagaag 4851 tcatgcagca 4901 gacgacggct 4951 cgaatccgac 5001 cgttccgcgc 5051 ttcaccctgg 5101 cgagaactac 5151 ccgaggccga 5201 aacggctcct 5251 cgcggcgacc 5301 acaagggcgg 5351 cgcgacaaga 5401 gggccaccac 5451 tcaattcgct 5501 atcaagaaca 5551 gccgctgttc

caagttggta cgcgtcgatt

ttgccttggc ggacaggtgg

ccagtcggtc atgcctttgc

gacagccctg ggtcaactgg

cagaggcggg atgcgaagaa

gctcatgagc ggagaacgag

tgcíggggca acacggggga

ccaccggccg ccggccaccc

tgcccgggtg tgaatccgaa

ccaaatcacc aggacaaccg

attccacgcc cagcaacgcc

agagccgcca gccggcgccc

cggcaagccc agcgtcttgc

tcgggcagac ccgataacca

tcttgccgac catggcccca

gtgggcggca cggtcagtaa

caatatcggc tccatagcgt

tgacggaaaa gacgcccgac

gtcgaatatg tcgacgtccg

cttcacgatt ccggcttcgg

tggcctttgg ctcgtcgatt

atgttgcttc ttcccgatcc

ggccaagacg ctgaatatca

agccgtactc ccgcgacccg

ctgatcagca ctggcatcgc

gttctacatt ttcgattcgg

tctacgaggt ggacgccatc

gaggccgacg gcagtcccaa

gtatttccca gtggccccca

tgctgaccaa cctgatcaac

gaggtgggca gcggcggaca

gctgcacgcc gccgacgaca

ccgcctggca gaacggcaaa

ggcgacaacg ggtccggcat

atctcgagaa tgaccactgc

ctcaaggaga agagccttca

tcggttgatc cgctcccgcg

gccgagatcc gttgatcttc

tgcgatgccg ctcgccagtc

atgacgttgg aggggcaagg

tccactagtc caccaccaga

actgccacca cgaccagacc

caagcggacc gccgccaccc

tcgacagcat cggggtcgac

agaccgtagg cgatcagcca

catcggagcc agcgaacccg

cgggatagtc gggcggcgat

ggttcccgtt cggcatgcca

caatagggcc ggggagaccc

cgtctgcgca acacggggtt

cggccgcgga tacagtaaag

gacgtcttca aacttgccaa

gttctgtgac ctgcctggca

cctttgacaa gagcgtgttt

cgcgggttcc agtcgatcca

cgagacggcg cgcatcgacc

acttctttgt gcacgacccg

cgcaacatcg cccgcaaggc

cgacaccgca tacttcggcg

tgagcttcga ctcgcgcgcc

tcggggtggt ggaacaccgg

ccggggctac aaggtccgcc

acgaccaata cgtcgacctg

tccggcttca tcctggagaa

ggccgagatc aactaccagt

tgcagttgta caagtacatc

acggtcacgt tcatgcccaa

gcactgtcat cagtcgctgt 5601

5651

5701

5751

5801

5851

5901

5951

6001

6051

6101

6151

6201

6251

6301

6351

6401

6451

6501

6551

6601

6651

6701

6751

6801

6851

6901

6951

7001

7051

7101

7151

7201

7251

126/155

ggaaggacgg ggccccgctg atgtacgacg agacgggtta tgccggtctg tcggacacgg cccgtcatta catcggcggc ctgttacacc acgcgccgtc gctgctggcc ttcaccaacc egacggtgaa ctcctacaag cggctggttc ccggttacgc cccgatcaac ctggtctata gccagcgcaa ccggtcggca tgcgtgcgca tcccgatcac cggcagcaac ccgaaggcca agcggctgga gttccgaagc cccgactcgt cgggcaaccc gtatctggcg ttctcggcca tgctgatggc aggcctggac ggtatcaaga acaagatcga gccgcaggcg cccgtcgaca aggatctcta cgagctgccg ccggaagagg ccgcgagtat cccgcagact ccgacccagc tgtcagatgt gatcgaccgt ctcgaggccg accacgaata cctcaccgaa ggaggggtgt tcacaaacga cctgatcgag acgtggatca gtttcaagcg cgaaaacgag atcgagccgg tcaacatccg gccgcatccc tacgaattcg cgctgtacta cgacgtttaa ggactcttcg cagtccgggt gtagagggag cggcgtggac tagttccact gagcgtcaga ccccgtagaa aagatcaaag gatcttcttg agatcctttt tttetgegcg taatctgctg cttgcaaaca aaaaaaceac cgctaccagc ggtggtttgt ttgccggatc aagagctacc aactcttllt ccgaaggtaa ctggcttcag cagagcgcag ataccaaata ctgtccttct agtgtagccg tagttaggcc accacttcaa gaactctgta gcaccgccta catacctcgc tctgctaatc ctgttaccag tggctgctgc cagtggcgat aagtcgtgtc ttaccgggtt ggactcaaga cgatagttac cggataaggc gcagcggtcg ggctgaacgg ggggttcgtg cacacagccc agcttggagc gaacgaccta caccgaactg agatacctac agcgtgagca ttgagaaage gccacgcttc ccgaagggag aaaggcggac aggtatccgg taagcggcag ggtcggaaca ggagagcgca cgagggagct tccaggggga aacgcctggt atctttatag tcctgtcggg tttcgccacc tctgacttga gcgtcgattt ttgtgatgct cgteaggggg gcggagccta tggaaaaacg ccagcaacgc ggccltttta cggttcctgg ccttttgctg gcclttlgct cacatgttct ttcctgcgtt atcccctgat tctgtggata accgtattac cgcctttgag tgagctgata ccgctcgccg cagccgaacg accgagcgca acgcgtgcgg ccgctaaact gttacaacgc tcacatatgt ggttggcgac gagcccaagg cagtcgcctc gctgttcaat ctgtgaccgg atccgcagga cgtcgatccg tgggtttace tgcggatttg tcgttactgg cgggtagctt ctgaaacggt tcagtttttg ggcgacttcg caaaatttgc aaaaagtccg caggccgttg ccgaaattcg caagtgaaat gggtggacca gcgttgacac gctgtgccat ggtcgagtta gcacaccagt 7301 gaagctgcgc cgttgacacc gcctggacga cggtagggcg tcagcgtttt 7351 cggcaatgaa agaccgttaa ggagttgtct

(K) pYUB854-sigH (SEQ ID NO: 33)

Vetor para a inativação do sigH utilizando-se o sistema de Phasmatodea, adicionado à BCG para construir BCGASigH e à BCGAsecA2 para construir a BCG- RD. Ele também pode ser utilizado para modificar vacinas BCG pro-apoptóticas de Ia, 2a e 3a geração, respectivamente, para vacinas BCG pro-apoptóticas de 2a, 3a e 4a geração.

1 ggatcctgat caggcgcctt aattaagatc cctatagtga gtcgtattat 51 gcggccgcga attctcatgt ttgaccgctt atcatcgata agctctgctt 101 tttgttgact tccattgttc attccacgga caaaaacaga gaaaggaaac 151 gacagaggcc aaaaagctcg ctttcagcac ctgtcgtttc CtttCttttC 201 agagggtatt ttaaataaaa acattaagtt atgacgaaga agaacggaaa 251 cgccttaaac cggaaaattt tcataaatag cgaaaacccg cgaggtcgcc 301 gccccgtaac aaggcggatc gceggaaagg acccgcaaat gataataatt 351 atcaattcgc gaacttgttt attgcagctt ataatggtta caaataaagc 401 aatagcatca caaatttcac aaataaagca tattttcac tgcattctag 451 1 ttgtggtttg tccaaactca tcaatgtatc ttatcatgtc tggatctgac 501 gggtgcgcat gatcgtgctc ctgtcgttga ggacccggct aggctggcgg 551 ggttgcctta ctggttagca gaatgaatca ccgatacgcg agcgaacgtg 601 aagcgactgc tgctgcaaaa cgtctgegac ctgagcaaca acatgaatgg 651 tcttcggttt CCgtgtttCg taaagtctgg aaacgcggaa gtcagcgctc 701 ttccgcttcc tcgctcactg actcgctgcg ctcggtcgtt cggctgcggc 751 gagcggtatc agctcactca aaggcggtaa tacggttatc cacagaatca 801 ggggataacg caggaaagaa catgtgagca aaaggccagc aaaaggccag 851 caaaaggcca ggaaccgtaa aaaggccgcg ttgctggcgt ltltccatag 901 gctccgcccc cctgacgagc atcacaaaaa tcgacgctca agtcagaggt 1001 tccctcgtgc gctctcctgt tccgaccctg ccgcttaccg gatacctgtc 1051 cgcctttctc ccttcgggaa gcgtggcgct ttctcatagc tcacgctgta 1101 ggtatctcag ttcggtgtag gtcgttcgct ccaagctggg ctgtgtgcac 1151 gaaccccccg ttcagcccga ccgctgcgcc ttatccggta actatcgtct 1201 tgagtccaac ccggtaagac acgacttatc gccactggca gcagccactg 1251 gtaacaggat tagcagagcg aggtatgtag gcggtgctac agagttcttg 1301 j aagtggtggc ctaactacgg ctacactaga aggacagtat ttggtatctg 1351 cgctctgctg aagccagtta ccttcggaaa aagagttggt agctcttgat 1401 ccggcaaaca aaccaccgct ggtagcggtg gtttttttgt ttgcaagcag 1451 cagattacgc gcagaaaaaa aggatctcaa gaagatcctt tgataffítc 1501 tacggggtct gacgctcagt cgaacgaaaa ctcacgttaa gggattttgg 1551 tcatggtaat acgactcact agttcacggc ctttcatatg gggaatgcac 1601 gcttgggata ctgcgtaggt gccacgcacc tggatgccgt tcatcaggtc 1651 gaaacgcttc attggcacct cggtgatgga ccctaagttg atcgccgagg 1701 cattgttgac gcagatatcg atgcccccga actgctccac ggtggtggcc 1751 accgcggacg cgaccgcatc cgggtcgcgg atatccccga cgatcggcag 1801 tgcctggccg ccggcttcct cgagttcctt ggcggccgtg aacaccgtgc 1851 ctggcagctt tggatgcggc tcggcggtct tggcgatcaa ggcaatgttg 1901 gcgccgtcgc gcgcggcccg cttggcgatc gcaaggccga taccgcgact 1951 ggcgccagag atgaacatgg tcttgccgtt gagtgacatg gcgtcaccct 2001 aacgccctgc tcgattccac cggactgcgg gacaggccgc atgcgattca 2051 gcgctggaaa taacccgctg gcgaacacgg ttgattggtt cggttcctgc 2101 agccacgtgg ctggccagac cggtgcagac agtgtcggtc gcggcctcta 2151 cattgggacg aggggagtct ggtgtcaacg gcgacgagcc tgttgggtga 2201 gaagcggttg gctcgcatgc tcgcacgtcc ggtgtccgcg ccggtgctgt 2251 ccggcgacac cgcaaacgaa gggacccagt taagatcttc gaatgcatcg 2301 cgcgcaccgt acgtctcgag gaattcctgc aggatatctg gatccacgaa 2351 gcttcccatg gtgcgcgtgc tagcaaccgt ccgaaatatt ataaattatc 2401 acacacataa aaacagtgct gttaatgtgt ctattaagtc gattttttgt 2451 tataacagac actgcttgtc cgatatctga tttaggatac atttntagcc 2501 acctgggggc gtcaggcgcc gggggeggtg tccggcggcc cccagaggaa 2551 ctgcgccagt tcctccggat cggtgaagcc ggagagatcc agcggggtct 2601 cctcgaacac ctcgaagtcg tgcaggaagg tgaaggcgag cagttcgcgg 2651 gcgaagtcct cggtccgctt ccactgcgcc ccgtcgagca gcgcggccag 2701 gatctcgcgg tcgccccgga aggcgttgag atgcagttgc accaggctgt 2751 agcgggagtc tcccgcatag acgtcggtga agtcgacgat cccggtgacc 2801 tcggtcgcgg ccaggtccac gaagatgttg gtcccgtgca ggtcgccgtg 2851 gacgaaccgg ggttcgcggc cggccagcag cgtgtccacg tccggcagcc 2901 agtcctccag gcggtccagc agccggggcg agaggtagcc ccacccgcgg 2951 tggtcctcga cggtcgccgc gcggcgttcc cgcagcagtt ccgggaagac 3001 ctcggaatgg ggggtgagca CggtgttCCC ggtcagcggc accctgtgca 3051 gccggccgag cacccggccg agttcgcggg ccagggcgag cagcgcgttc 3101 cggtcggtcg tgccgtccat cgcggaccgc caggtggtgc cggtcatccg 3151 gctcatcacc aggtagggcc acggccaggc tccggtgccg ggccgcagct 3201 cgccgcggcc gaggaggcgg ggcaccggca ccggggcgtc cgccaggacc 3251 gcgtacgcct ccgactccga cgcgaggctc tccggaccgc accagtgctc 3301 gccgaacagc ttgatgaccg ggtcgggctc gccgaccagt acggggttgg 3351 tgctctcgcc gggcacccgc agcaccggcg gcaccggcag cccgagctcc 3401 tccagggctc ggcgggccag cggctcccag aattcctggt cgttccgcag 3501 cttgtgtcac agcggacctc tattcacagg gtacgggccg gettaattce 3551 gcacggccgg tcgcgacacg gcctgtccgc accgcggtca ggcgttgacg 3601 atgacgggct ggtcggccac gtcggggacg ttctcggtgg tgctgcggtc 3651 gggatcgcca atctctacgg gccgaccgag gcgacggtgt acgccaccgc 3701 ctggttctgc gacggcgagg cgccgccagg ccccgccgat ccccgtcecc 3751 cgcgtcgtcg agcgcggtgc cgacgacacc gccgcgtggc tcgtcacgga 3801 ggccgtcccc ggcgtcgcgg cggccgagga gtggcccgag caccagcggt 3851 tcgccgtggt cgaggcgatg geggagctgg cccgcgccct ccacgagctg 3901 cccgtggagg actgcccctc cgaccggcgc ctcgacgcgg cggtcgccga 3951 ggcccggcgg aacgtcgccg agggcttggt ggacctcgac gacctgcagg 4001 catgcaagct caggatgtcc acctacaaca aagctctcac caaccgtggc 4051 tccctcactt tctggctgga tgatggggcg attcangcct ggtatgantc 4101 agcaacacct tcttcacgan gcagacctca ctagcaaccg tccgaaatat 4151 tataaattat cgcacacata aaaacagtgc tgttaatgtg tctattaagt 4201 cgattttttg ttataacaga cactgcttgt ccgatatttg atttaggata 4251 cacgcgcacc ggttctagac cgagcagatc accgattggc aactggcgtc 4301 caacgccgag cattcctcga CCgggCtgCg ctcggctgaa gtcgaagcgt 4351 tagaagcgtt gccggacacc gagatcaaag aggcgctgca ggcattgccg 4401 gaagagttcc ggatggcggt ctactacgcc gatgtcgaag gtttccccta 4451 caaggagatc gccgagatca tggatactcc gatcggcacc gtgatgtcga 4501 ggcttcatcg cggccgacgt cagttgcgcg gtcattagc cgatgtggcc 4551 agggatcggg ggtttgccag gggcgagcag gcgcacgagg gggtgtcgtc 4601 atgagcagcc cggtgtcaag ccgccgtttg gcgaacttgg tcaaggagag 4651 cctgcagggc tcggtgttgg gtggggtcgt aagcgatgcc gtcttgccag 4701 cggtgtcaga tgacgtaaag ccaggcgcgg gcgaggatgc gtaccgegtg 4751 CCggtggtCg tggccgcggg ctcgggtgcg gttgtgcagg tcggcggect 4801 agaggttggc tcggcggctg tcgccggcga agtcgcagac aeegttgegg 4851 agttgtttgt ctgccgccca accgaacccg acgtgggtga ctttgtegga 4901 ctagccggtg gagcgggcga cgccggccaa gcaggccagc aattcgggct 4951 gggcgtcggc gtgcggggcg agtcgttcgg cgctcgtcgg egcttggccc 5001 tgtcgacggt cggcgcgtcc ggggcaaccg ccggactceg caaaacteat 5051 gatggacatc acggctgtca agettaagtg agtcgtatta cggactggga 5101 gtcaggcaac tatggatgaa cgaaatagac agategetga gataggtgcc 5151 tcactgatta agcattggta actgtcagac caagtttact catatatact 5201 ttagattgat ttaccccggt tgataatcag aaaageecca aaaaeaggaa 5251 gattgtataa gcaaatattt catgacatta acctataaaa ataggcgtat 5301 eacgaggccc tttcgtcttc aagaattcgc ggccgcaatt aaceetcact 5351 aaaggatctt aattaa

(L) pYUB854-trx-trxr (SEQID NO: 34)

Vetor para a inativação de tioredoxina (trxC, também trx) e tioredoxina redutase (trxB2, também trx) utilizando-se o sistema de Phasmatodea. Ele pode ser eletroporado dentro da BCG para construir a BCGAtrxAtrxr. Ele também pode ser utilizado para modificar vacinas BCG pro-apoptóticas de 1a, 2a e 3a geração, respectivamente, para vacinas BCG pro-apoptóticas de 2a, 3a e 4a geração.

1 ggatcctgat caggcgcctt aattaagatc cetatagtga gtcgtattat gcggccgcga 61 attctcatgt ttgaccgctt atcatcgata agctctgctt tttgttgact tccattgttc 121 attccacgga caaaaacaga gaaaggaaac gacagaggcc aaaaagctcg ctttcageac 181 ctgtegtttc ctttcttttc agagggtatt ttaaataaaa acattaagtt atgaegaaga 301 gccccgtaac aaggcggatc gccggaaagg accegcaaat gataataatt atcaattcgc 361 gaacttgttt attgcagctt ataatggtta caaataaagc aatagcatca caaatttcac 421 aaataaagca ttlttttcac tgcattetag ttgtggtttg tccaaactca teaatgtatc 481 ttatcatgtc tggatctgac gggtgcgcat gatcgtgctc ctgtcgttga ggacecggct 541 aggctggcgg ggttgcctta ctggttagea gaatgaatca ccgatacgcg agcgaacgtg 601 aagegactgc tgctgeaaaa cgtctgcgac ctgagcaaca acatgaatgg tcttcggttt 661 ccgtgtttcg taaagtctgg aaacgcggaa gtcagcgctc ttccgcttec tegctcactg 721 actegetgcg ctcggtcgtt cggctgcggc gagcggtatc agctcactca aaggcggtaa 781 tacggttatc cacagaatca ggggataacg caggaaagaa catgtgagca aaaggccagc 841 aaaaggccag caaaaggcca ggaaccgtaa aaaggccgcg ttgctggcgt ttttccatag 901 gctccgcccc cctgacgagc atcacaaaaa tcgacgctca agtcagaggt ggcgaaaccc 961 gacaggacta taaagatacc aggcgtttcc ccctggaagc tccctcgtgc gctctcctgt 1021 tccgaccctg ccgcttaccg gatacctgtc cgcctttctc ccttcgggaa gcgtggcgct 1081 ttctcatagc tcacgctgta ggtatctcag ttcggtgtag gtcgttcgct ccaagctggg 1141 ctgtgtgcac gaaccccccg ttcagcccga ccgctgcgcc ttatccggta actatcgtct 1201 tgagtccaac ccggtaagac acgacttatc gccactggca gcagccactg gtaacaggat 1261 tagcagagcg aggtatgtag gcggtgctac agagttcttg aagtggtggc ctaactacgg 1321 ctacactaga aggacagtat ttggtatctg cgctctgctg aagccagtta ccttcggaaa 1381 aagagttggt agctcttgat ccggcaaaca aaccaccgct ggtagcggtg gtttttttgt 1441 ttgcaagcag cagattacgc gcagaaaaaa aggatctcaa gaagatcctt tgatattttc 1501 tacggggtct gacgctcagt cgaacgaaaa ctcacgttaa gggallttgg tcatggtaat 1561 acgactcact agtagacccg caggctcagc aaatcctgcg cgcgttgaac cgggtacgcc 1621 gcgatgtcgc cgcgatgggt gccgaccccg cttgggggcc agctgctcgc ccagcggtcg 1681 tcgacagcat ttcggcggcc ttacggtcgg cgcgcccgaa cagctcaccc ggcgccgctc 1741 acgccgcccg tccgcacgtc caccccgtcc gaatgatcgc cggcgcggcc ggattgtgcg 1801 ccgtggccac agcgatcggt gtcggcgccg tggtcgatgc accgccaccc gcaccgagtg 1861 caccgacaac cgcgcagcac atcacggtgt caaaacctgc cccggtgatt ccgctgtctc 1921 ggccgcaggt tctcgacctg cttcaccaca ccccggacta tggcccaccc ggaggcccgc 1981 tgggcgatcc gtcccggcgt acgtcctgcc tgagcggcct cggctatccg gcgtccacgc 2041 CggtgCtggg cgcgcagccg atcgatatcg acgctcggcc cgccgtactg ctggtgatac 2101 ccgcggacac gcccgacaaa CtggCCgttt ttgcggtcgc gccgcactgc agcgccgccg 2161 ataccgggtt gttggctagc accgtggtcc cccgcgcatg atgggtctgg gtgctgtcgc 2221 tcgcctgcgg gaacagcagt gcctacgctg gcgttcgttg tctttcgaat gcatcgcgcg 2281 caccgtacgt ctcgaggaat tcctgcagga tatctggatc cacgaagctt cccatggtgc 2341 gcgtgctagc aaccgtccga aatattataa attatcacac acataaaaac agtgctgtta 2401 atgtgtctat taagtcgatt ttttgttata acagacactg cttgtccgat atctgattta 2461 ggatacattt ntagccacct gggggcgtca ggcgccgggg gcggtgtccg gcggccccca 2521 gaggaactgc gccagttcct ccggatcggt gaagccggag agatccagcg gggtctcctc 2581 gaacacctcg aagtcgtgca ggaaggtgaa ggcgagcagt tcgcgggcga agtcctcggt 2641 ccgcttccac tgcgccccgt cgagcagcgc ggccaggatc tcgcggtcgc cccggaaggc 2701 gttgagatgc agttgcacca ggctgtagcg ggagtctccc gcatagacgt cggtgaagte 2761 gacgatcccg gtgacctcgg tcgcggccag gtccacgaag atgttggtcc cgtgcaggtc 2821 gccgtggacg aaccggggtt cgcggccggc cagcagcgtg tccacgtccg gcagccagtc 2881 ctccaggcgg tccagcagcc ggggcgagag gtagccccac ccgcggtggt cctcgacggt 2941 CgCCgGgCgg cgttcccgca gcagttccgg gaagacctcg gaatgggggg tgageacggt 3001 gttcccggtc agcggcaccc tgtgcagccg gccgagcacc cggccgagtt cgcgggccag 3061 ggcgagcagc gcgttccggt cggtcgtgcc gtccatcgcg gaccgccagg tggtgccggt 3121 catccggctc atcaccaggt agggccacgg ccaggctccg gtgccgggcc gcagctcgcc 3181 gcggccgagg aggcggggca ccggcaccgg ggcgtccgcc aggaccgcgt acgcctccga 3241 ctccgácgcg aggetctccg gaccgcacca gtgctcgccg aacagcttga tgaccgggtc 3301 gggctcgccg accagtacgg ggttggtgct ctcgccgggc acccgcagca ccggcggcac 3361 cggcagcccg agctcctcca gggctcggcg ggccagcggc tcccagaatt CCtggtCgtt 3421 ccgcaggctc gcgtaggaat catccgaatc aatacggtcg agaagtaaca gggattcttg 3481 tgteacagcg gacctctatt cacagggtac gggccggctt aattccgcac ggccggtcgc 3541 gacacggcct gtccgcaccg cggtcaggcg ttgacgatga cgggctggtc ggccacgtcg 3601 gggacgttct CggtggtgCt gcggtcggga tcgccaatct ctacgggccg accgaggcga 3661 cggtgtacgc caccgcctgg ttctgcgacg gcgaggcgcc gccaggcccc gccgatcccc 3721 gtcccccgcg tcgtcgagcg cggtgccgae gacaccgccg cgtggctcgt cacggaggcc 3781 gtccccggcg tcgcggcggc cgaggagtgg cccgagcacc agcggttcgc cgtggtcgag 3841 gcgatggcgg agctggcccg cgccctccac gagctgcccg tggaggactg cccctccgac 3901 cggcgcctcg acgcggcggt cgccgaggcc cggcggaacg tcgccgaggg cttggtggac 3961 ctcgaçgacc tgcaggcatg caagctcagg atgtccacct acaacaaagc tctcaccaac 4021 cgtggaccc t cactttctg gctggatgat ggggcgattc angcctggta tgantcagca 4081 acaccttctt cacgangcag acctcactag caaccgtccg aaatattata aattatcgca 4141 cacataaaaa cagtgctgtt aatgtgtcta ttaagtcgat tttttgttat aacagacact 4201 gcttgtccga tatttgattt aggatacacg cgcaccggtt ctagacegaa atcggcaagg 4261 atctgcgaca ataccggttg gctggtccgc attgtcaacg atgtgagcta atcccggagg 4321 gccettggta tgccgagtcc gcgccgcgaa gacggcgatg Cgetgegetg tggcgaccgc 4381 agtgcggccg tcaccgagat ccgggctgcg ctgaccgcgt tagggatgct ggatcatcag 4441 gaagaagacc tgacgacggg ccgtaacgtc gcccttgagt tgttegacge gcagctcgac 4501 caggcggtcc gtgccttcca acagcatcgc ggcctgctgg tggacggcat cgtcggtgag 4561 gccacctacc gcgcgttgaa agaagcctcc taccggctcg gggcccgcac gctgtaccac 4621 caattcggcg ccccgctcta cggggacgac gtcgctacac tgcaggcccg gctgcaggat 4681 cttggtttct acaccgggct ggtcgacggt catttcgggt tgcagaccca caatgcgttg 4741 atgtcctatc agcgtgagta cggacttgcc gcagacggta tctgcggccc agaaacgttg 4801 cgctccttgt actttctaag ttcgcgagtc agcggtggct cgccacatgc gattcgcgaa 4861 gaagagctgg tccgcagctc ggggccgaag ctgtctggca aacggatcat cattgatccc 4921 ggtcgcggcg gcgtggacca cggacttatc gcgcaaggtc cggctgggcc catcagcgaa 4981 gcagacttga ggccttaagt gagtcgtatt acggactggg agtcaggcaa ctatggatga 5041 acgaaàtaga cagatcgctg agataggtgc ctcactgatt aagcattggt aactgtcaga 5101 ccaagtttac tcatatatac tttagattga tttaccccgg ttgataatca gaaaagcccc 5161 aaaaacagga agattgtata agcaaatatt tcatgacatt aacctataaa aataggcgta 5221 tcacgággcc ctttcgtctt caagaattcg cggccgcaat taaccctcac taaaggatct 5281 taattaa

(M) pYUB854-sigE (SEQ ID NO: 35)

Vetor para a inativação do sigE utilizando-se o sistema de Phasmatodea. Ele pode ser eletroporado na BCG para construir a BCGAsigE. Ele também pode ser utilizado para modificar vacinas BCG pro-apoptóticas para torná-las mais imunogênicas, ·:

1 ggatcctgat caggcgcctt aattaagatc cctatagtga gtcgtattat gcggccgcga 61 attctèatgt ttgaccgctt atcatcgata agctctgctt tttgttgact tccattgttc 121 attccacgga caaaaacaga gaaaggaaac gacagaggcc aaaaagctcg ctttcagcac 181 ctgtcgtttc attcattc agagggtatt ttaaataaaa acattaagtt atgacgaaga 241 agaacggaaa cgccttaaac cggaaaattt tcataaatag cgaaaacccg cgaggtcgcc 301 gccccgtaac aaggcggatc gccggaaagg acccgcaaat gataataatt atcaattcgc 361 gaacttgttt attgcagctt ataatggtta caaataaagc aatagcatca caaatttcac 421 aaataáagca ItUtttcac tgcattctag ttgtggtttg tccaaactca tcaatgtatc 481 ttatcatgtc tggatctgac gggtgcgcat gatcgtgctc ctgtcgftga ggacccggct 541 aggctggcgg ggttgcctta ctggttagca gaatgaatca ccgatacgcg agcgaacgtg 601 aagcgactgc tgctgcaaaa cgtctgcgac ctgagcaaca acatgaatgg tcttcggttt 661 CCgtgtttCg taaagtctgg aaacgcggaa gtcagcgctc ttccgcttcc tcgctcactg 721 actcgctgcg ctcggtcgtt cggctgcggc gagcggtatc agctcactca aaggcggtaa 781 tacggttatc cacagaatca ggggataacg caggaaagaa catgtgagca aaaggccagc 841 aaaaggccag caaaaggcca ggaaccgtaa aaaggccgcg ttgctggcgt ttttccatag 901 gctccgcccc cctgacgagc atcacaaaaa tcgacgctca agtcagaggt ggcgaaaccc 961 gacaggacta taaagatacc aggcgtttcc ccctggaagc tccctcgtgc gctctcctgt 1021 tccgaccctg ccgcttaccg gatacctgtc cgcctttctc ccttcgggaa gcgtggcgct 1081 ttctcãtagc tcacgctgta ggtatctcag ttcggtgtag gtegttcgct ccaagctggg 1141 ctgtgtgcac gaaccccccg ttcagcccga cegctgegcc ttatceggta actatcgtct 1201 tgagtçcaac ccggtaagac acgacttatc geeactggca gcagccactg gtaacaggat 1261 tagcagagcg aggtatgtag gcggtgctac agagttcttg aagtggtggc ctaactacgg 1321 ctacaetaga aggacagtat ttggtatctg cgetctgctg aagccagtta ccttcggaaa 1381 aagagttggt agctcttgat ccggcaaaca aaecaccget ggtageggtg gtttttttgt 1441 ttgcaagcag cagattacgc gcagaaaaaa aggatctcaa gaagatcctt tgatatate 1501 tacggggtct gacgctcagt cgaacgaaaa etcacgttaa gggattttgg tcatggtaat 1561 acgactcact agtccgtcgc gcgccccggg atcaceggcc cgacegccca gcgccgcccg 1621 gtgcaegacg atgaccccgc cggatcgcag cagccgcaee ccctcggcga cgtaatetgg 1681 ctggtcgatc gggtcggcgt cgatgaatac caggtcgtag gatgcgtcgg cgagcegggt 1741 cagcacctct tgggcgcggc cgctgatcag cetggtaegc gacggcccga tgcccgcctc 1801 ggcaaaggcc tgcctggcaa ggcgtagatg ctcgggetcg atatcgatgg tggtcaagac 1861 gccgtcgtcg cgcatgcccg acaacagcca caggccgctg acgccggccc cggtacccac 1921 ttcggccacc gccttgcctc cgctgagctt ggccagcaag cacagcaacg cacccaccgc 1981 cggtgttacc gccccggccc cgatgtcggt tgcgcgctcg cgggcgccgg ccaggatcac 2041 gtcttòagat attgacccct eggcgtgcgc ccagagtgat tcgcctcggc tgggggccgg 2101 ctggcçaggc atgtcgtcgt gtccgggggt gccgtccatg cccgcagcgt atgtccaatt 2161 ggcgacgccg tcgggcaggc gcgcctggtt Cgaaegccgg ccgageaceg agctggacgc 2221 ttgcggctgt acccgacacg CCCggCgtgC cggacgcgac gaaggtcact ttgactcgat 2281 attccctgga cagcgcaggt aacggtatgg tttctaagcc aaagctcaga ttgctcatat 2341 atggcccata cgccggtacg cgacggtaat tcccgctcga ggaattcctg caggatatct 2401 ggatccacga agcttcccat ggtgcgcgtg ctagcaaccg tccgaaatat tataaattat 2461 cacacacata aaaacagtgc tgttaatgtg tctattaagt cgattattg ttataaeaga 2521 cactgcttgt ccgatatctg atttaggata catttntagc cacctggggg Cgtcaggcge 2581 CgggggCggt gtccggcggc ceeeagagga actgcgecag ttcctccgga tcggtgaagc 2641 cggagagatc cagcggggtc tcctcgaaca cctcgaagtc gtgcaggaag gtgaaggcga 2701 gcagttcgcg ggcgaagtcc tcggtccgct tceactgegc cccgtcgagc agcgcggcca 2761 ggatctcgcg gtcgccccgg aaggcgttga gatgcagttg caccaggctg tagcgggagt 2821 ctcccgcata gacgtcggtg aagtcgacga tcccggtgae ctcggtcgeg gccaggtcca 2881 cgaagatgtt ggtcccgtgc aggtcgccgt ggacgaaccg gggttcgcgg ccggccagca 2941 gcgtgtccac gtccggcagc cagtcctcea ggcggtccag cagccggggc gagaggtagc 3001 cccacccgcg gtggtcctcg acggtcgccg Cgcggcgttc ccgcagcagt tccgggaaga 3061 cctcggaatg gggggtgagc acggtgttcc cggtcagcgg caccctgtgc agccggccga 3121 gcacccggcc gagttcgcgg gccagggcga gcagcgcgtt CCggtCggtC gtgccgtcca 3181 tcgcggaccg ccaggtggtg ccggtcatcc ggctcatcac caggtagggc cacggccagg 3241 ctccggtgcc gggccgcagc tcgccgcggc cgaggaggcg gggcaccggc accggggcgt 3301 ccgccâggac cgcgtacgcc tccgactccg acgcgaggct ctccggaccg caccagtgct 3361 cgccgaacag cttgatgacc gggtcgggct cgccgaccag tacggggttg gtgctctcgc 3421 cgggcacccg cagcaccggc ggcaccggca gcccgagctc ctccagggct cggcgggcca 3481 gcggctccca gaattcctgg tcgttccgca ggctcgcgta ggaatcatcc gaatcaatac 3541 ggtcgagaag taacagggat tcttgtgtca cagcggacct ctattcacag ggtacgggcc 3601 ggcttaattc cgcacggccg gtcgcgaeac ggcctgtccg caccgcggtc aggcgttgac 3661 gatgaçggge tggtcggcca cgtcggggac gttctcggtg gtgctgcggt cgggatcgcc 3721 aatctctacg ggccgaccga ggcgacggtg tacgccaccg cctggttctg Cgacggcgag 3781 gcgccgccag gccccgccga tccccgtccc ccgcgtcgtc gagcgcggtg ccgacgacac 3841 CgCCgCgtgg ctcgtcacgg aggccgtccc cggcgtcgcg gcggccgagg agtggcccga 3901 gcaccagcgg ttcgccgtgg tcgaggcgat ggcggagctg gcccgcgccc tccacgagct 3961 gcccgtggag gactgcccct ccgaccggcg cctcgacgcg gcggtcgccg aggcccggcg 4021 gaacgicgcc gagggcttgg tggacctcga cgacctgcag gcatgcaagc tcaggatgtc 4081 cacctacaac aaagctctca ccaaccgtgg ctccctcact ttctggctgg atgatggggc 4141 gattcángcc tggtatgant cagcaacacc ttcttcacga ngcagacctc actagcaacc 4201 gtccgaaata ttataaatta tcgcacacat aaaaacagtg ctgttaatgt gtctattaag 4261 tcgatlltlt gttataacag acactgcttg tccgatattt gatttaggat acacgcgeae 4321 cggttctaga gcgactactc aacggccgcc gagcgcgtcg gttcggctac cgcatggttg 4381 ccaatcggtc ccgaatcctg gggttttacc ggctggcgat ggttttccgg caccgcgccg 4441 cgctaòattc gagataccgg tggctcgcta ggtggcggaa ggaggtggtg atggccgacc 4501 ccggaagcgt gggacatgtg ttccggcgcg cgttttcctg gctcccggcg cagttcgcct 4561 cccagagtga cgcgccggtc ggcgcgccgc ggcagttccg ttccaccgag cacctgteaa 4621 tcgaggccat CgCggCtttC gtcgacggcg agctgcggat gaacgcgcac ttgcgggccg 4681 cgcatòacct ttcgctgtgt gcccaatgcg cggccgaagt ggacgaccaa agtcgtgccc 4741 gcgccgctct gcgcgattcc cacccgatcc gcatccccag cacgttgctc ggattactgt 4801 ccgagàtccc gcgttgtcca cctgaaggtc catctaaagg ttcgtctgga ggttcatccc 4861 agggcccgcc cgacggggct gcggcaggct tcggcgaccg cttcgctgac ggcgatggcg 4921 ggaatcgggg ccggcaatcg CgggtgCgtC gctagccggt gagccacttg tcgcagcgca 4981 tggcggggtt gctgcgagtt catggcgagt ggtcgcgatc cgtggatact agggtggaca 5041 cggacaacgc gatgcctgca cgtfttagcg cccagattca gaatgaggat gaggtgacct 5101 ccgaccaagg caacaacggc ggcccgaacg gcgggggtac cctctagtca aggccttaag 5161 tgagtcgtat tacggactgg gagtcaggca actatggatg aacgaaatag acagatcgct 5221 gagataggtg cctcactgat taagcattgg taactgtcag accaagttta ctcatatata 5281 ctttagattg atttaccccg gttgataatc agaaaagccc caaaaacagg aagattgtat 5341 aagcãaatat ttcatgacat taacctataa aaataggcgt atcacgaggc cctttcgtct 5401 tcaagàattc gcggccgcaa ttaaccctca ctaaaggatc ttaattaa

(N) p2NIL/GOAL19-mut trxC-mut trxB2 (SEQ ID NO: 36)

O vetor para inativar os locais ativos de tioredoxina (trxC, também trx) e tioredoxina redutase (trxB2, também trxr) sem deixar resistência antibiótica residual. Ele pode ser eletroporado dentro da BCG para construir a BCGAtrxAtrxr. Ele também pode ser utilizado para modificar vacinas BCG pro-apoptóticas de Ia, 2a e 3a geração, respectivamente, para vacinas BCG pro-apoptóticas de 2a, 3a e 4a geração.

1 taagcggccg cggtacccaa aaaaagcccg ctcattaggc gggctaattc gcctcgaggt 61 ggcttatcga aattaatacg actcactata gggagaccgg aagcttcacg tggtcgacgg 121 tatcgataag cttgatatcg aattcctgca gcccggggga tcgaaaaggt taggaatacg 181 gttagccatt tgcctgatt tatatagtta tatgggattc acctttatgt tgataagaaa 241 taaaagãaaa tgccaatagg atnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 301 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 421 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 481 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 541 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 601 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 661 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 721 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnatcggcat tttcttttgc 781 gtttttattt gttaactgtt aattgtcctt gttcaaggat gctgtctttg acaacagatg 841 attcttgcc tttgatgttc agcaggaagc ttggcgcaaa cgttgattgt ttgtctgcgt 901 agaatectct gtttgtcata tagcttgtaa tcacgacatt gtttcctttc gcttgaggta 961 cagcgaâgtg tgagtaagta aaggttacat cgttaggatc aagatccatt tttaacacaa 1021 ggccagttft gttcagcggc ttgtatgggc cagttaaaga attagaaaca taaccaagca 1081 tgtaaatatc gttagacgta atgccgtcaa tcgtcatttt tgatccgcgg gagtcagtga 1141 acaggtácca tttgccgttc attttaaaga cgttcgcgcg ttcaatttca tctgttactg 1201 tgttagatgc aatcagcggt ttcatcactt ttttcagtgt gtaatcatcg tttagctcaa 1261 tcataccgag agcgccgttt gctaactcag CCgtgCgttt tttatcgctt tgcagaagtt 1321 tttgactttc ttgacggaag aatgatgtgc ttftgccata gtatgctttg ttaaataaag 1381 attcttcgcc ttggtagcca tcttcagttc cagtgtttgc ttcaaatact aagtatttgt 1441 ggcctttatc ttctacgtag tgaggatctc tcagcgtatg gttgtcgcct gagctgtagt 1501 tgccttçatc gatgaactgc tgtacatttt gatacgtftt tccgtcaccg tcaaagattg 1561 atttataatc ctctacaccg ttgatgttca aagagctgtc tgatgctgat acgttaactt 1621 gtgcagttgt cagtgtttgt ttgccgtaat gtttaccgga gaaatcagtg tagaataaac 1681 ggatttftcc gtcagatgta aatgtggctg aacctgacca ttcttgtgtt tggtctttta 1741 ggatagaatc atttgcatcg aatttgtcgc tgtctttaaa gacgcggcca gcgtttttcc 1801 agctgtcaat agaagtttcg ccgacttttt gatagaacat gtaaatcgat gtgtcatccg 1861 catttttagg atctccggct aatgcaaaga cgatgtggta gccgtgatag tttgcgacag 1921 tgccgtcagc gttttgtaat ggccagctgt cccaaacgtc caggcctttt gcagaagaga 1981 tatttttaat tgtggacgaa tcgaattcag gaacttgata ttlttcattt ttttgctgtt 2041 cagggatttg cagcatatca tggcgtgtaa tatgggaaat gccgtatgtt tccttatatg 2101 gcttttggtt CgtttCtttC atatgcgcaa acgcttgagt tgcgcctcct gccagcagtg 2161 cggtagtaaa ggttaatact gttgcttgtt ttgcaaactt tttgatgttc atcgttcatg 2221 tctccttttt tatgtactgt gttagcggtc tgcttcttcc agccctcctg tttgaagatg 2281 gcaagttagt tacgcacaat aaaaaaagac ctaaaatatg taaggggtga cgccaaagta 2341 tcgacctcga gtcaccgggt gacggcaacc ccgctactta cgctggccgg gcgcagtgcc 2401 cgcgacggac ggctcaagtt gtcctcgctg ccactcgctg cgacgacggg cctggcctca 2461 ccgtcccgac ctacgactca ccggtcgcga gtgccaacgt tattcttagc actcgcctat 2521 gccgagtgca agaagccccg caccgggtca tgcccctcgt tcgaccttgt CCtCggCCCt 2581 ccgatccggg tgagtatgtt cggcccatga ccgccaacga caacaagacc cgtaaatggt 2641 cggccgeaga cgtccccgat caaagcgggc gcgtcgttgt ggtcactcga ggggggatcc 2701 cccctgCccg gttattatta ttatgacac cagaccaact ggtaatggta gcgaccggcg 2761 ctcagctgga attccgccga tactgacggg ctccaggagt cgtcgccacc aatccccata 2821 tggaaaecgt cgatattcag ccatgtgcct tcttccgcgt gcagcagatg gcgatggctg 2881 gtttccatca gttgctgttg actgtagcgg ctgatgttga actggaagtc gccgcgccac 2941 tggtgtgggc cataattcaa ttcgcgcgtc ccgcagcgca gaccgttttc gctcgggaag 3001 acgtacgggg tatacatgtc tgacaatggc agatcccagc ggtcaaaaca ggcggcagta 3061 aggcggtcgg gatagttttc ttgcggccct aatccgagcc agtttacccg ctctgctacc 3121 tgcgccàgct ggcagttcag gccaatccgc gccggatgcg gtgtatcgct cgccacttca 3181 acatcaacgg taatcgccat ttgaccacta ccatcaatcc ggtaggtttt ccggctgata 3241 aataaggttt tcccctgatg ctgccacgcg tgagcggtcg taatcagcac cgcatcagca 3301 agtgtatctg ccgtgcactg caacaacgct gcttcggcct ggtaatggcc cgccgccttc 3421 tccagcggtg cacgggtgaa ctgatcgcgc agcggcgtca gcagttgttt tttatcgcca 3481 atccacatct gtgaaagaaa 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cgggcgggaa ggatcgacag atttgatcca gcgatacagc 4381 gcgtcgtgat tagcgccgtg gcctgattca ttccccagcg accagatgat cacactcggg 4441 tgattacgat cgcgctgcac cattcgcgtt acgcgttcgc tcatcgccgg tagccagcgc 4501 ggatcatcgg tcagacgatt cattggcacc atgccgtggg tttcaatatt ggcttcatcc 4561 accacataca ggccgtagcg gtcgcacagc gtgtaccaca gcggatggtt cggataatgc 4621 gaacagcgca cggcgttaaa gttgttctgc ttcatcagca ggatatcctg caccatcgtc 4681 tgctcatcca tgacctgacc atgcagagga tgatgctcgt gacggttaac gcctcgaatc 4741 agcaacggct tgccgttcag cagcagcaga ccattttcaa tccgcacctc gcggaaaccg 4801 acatcgcagg cttctgcttc aatcagcgtg ccgtcggcgg tgtgcagttc aaccaccgca 4861 cgatagágat tcgggatttc ggcgctccac agtttcgggt tttcgacgtt cagacgtagt 4921 gtgacgégat cggcataacc accacgctca tcgataattt caccgccgaa aggcgcggtg 4981 ccgctggcga cctgcgtttc accctgccat aaagaaactg ttacccgtag gtagtcacgc 5041 aactcgdcgc acatctgaac ttcagcctcc agtacagcgc ggctgaaatc atcattaaag 5101 cgagtggcaa catggaaatc gctgatttgt gtagtcggtt tatgcagcaa cgagacgtca 5161 cggaaaatgc cgctcatccg ccacatatcc tgatcttcca gataactgcc gtcactccaa 5221 cgcagcàcca tcaccgcgag gcggttttct ccggcgcgta aaaatgcgct caggtcaaat 5281 tcagacggca aacgactgtc ctggccgtaa ccgacccagc gcccgttgca ccacagatga 5341 aacgccgagt taacgccatc aaaaataatt cgcgtctggc cttcctgtag ccagctttca 5401 tcaacattaa atgtgagcga gtaacaaccc gtcggattct ccgtgggaac aaacggcgga 5461 ttgaccgtaa tgggataggt tacgttggtg tagatgggcg catcgtaacc gtgcatctgc 5521 cagtttgagg ggacgacgac agtatcggcc tcaggaagat cgcactccag ccagctttcc 5581 ggcaccgctt CtggtgCCgg aaaccaggca aagcgccatt cgccattcag gctgcgcaac 5641 tgttgggaag ggcgatcggt gcgggcctct tcgctattac gccagctggc gaaaggggga 5701 tgtgctgcaa ggcgattaag ttgggtaacg ccagggtttt cccagtcacg acgttgtaaa 5761 acgacgggat ccattcttgc ttccctcatc ctcatctcaa cgcatccatg catgtttggg 5821 cgcatcótga attaggtcag actgcaggcg ctgggcccgg cagtgctcgt gtagtcaacc 5881 acaacttegg gcgtccaccc gcatcaagcg caccgccgaa acccttatcc ggcggtcgtt 5941 cacggccaat tcgggaccga cgcgacggcc tgaaggtggc atttccgcag tgtctgggca 6001 tgtgtcgtct agagcggccg ccaccgcggt ggagctcagc cagatcctat gtattctata 6061 gtgtcaccta aatcgtatgt gtatgataca taaggttatg tattaattgt agccgcgttc 6121 taacgacaat atgtacaagc ctaattgtgt agcatctggc ttactgaagc agaccctatc 6181 atctctctcg taaactgccg tcagagtcgg tttggttgga cgaaccttct gagtttctgg 6241 taacgccgtc ccgcacccgg aaatggtcag cgaaccaatc agcagggtca tcgctagaaa 6301 tcatccttag cgaaagctaa ggatatttt tatctgaatt ggtaccgcgg ccgccggggg 6361 CCgggggCgg cgccgggcgg cccggggcgt caggcgccgg gggcggtgtc cggcggcccc 6421 cagaggáact gcgccagttc ctccggatcg gtgaagccgg agagatccag cggggtctcc 6481 tcgaacãcct cgaagtcgtg caggaaggtg aaggcgagca gttcgcgggc gaagtcctcg 6541 gtccgcttcc actgcgcccc gtcgagcagc gcggccagga tctcgcggtc gccccggaag 6601 gcgttgagat gcagttgcac caggctgtag cgggagtctc ccgcatagac gtcggtgaag 6661 tcgacgátcc cggtgacctc ggtcgcggcc aggtccacga agatgttggt cccgtgcagg 6721 tcgccgtgga cgaacegggg ttcgcggccg gccagcagcg tgtccacgtc cggcagecag 6781 tcctccaggc ggtccagcag ccggggcgag aggtagcccc acccgcggtg gtcctcgacg 6841 gtcgccgcgc ggcgtteccg cagcagttcc gggaagacct cggaatgggg ggtgagcacg 6901 gtgttcccgg tcagcggcac cctgtgcagc cggccgagca cccggccgag ttcgcgggcc 6961 agggcgagca gcgcgttccg gtcggtcgtg ccgtccatcg cggaccgcca ggtggtgccg 7021 gtcatccggc tcatcaccag gtagggccac ggccaggctc CggtgCCggg ccgcagctcg 7081 ccgcggecga ggaggegggg caccggcacc ggggcgtccg ccaggaccgc gtacgcctcc 7141 gactccgacg cgaggctcte cggaccgcac cagtgctcgc cgaacagctt gatcaccggg 7201 tcgggctcgc cgaccagtac ggggttggtg ctctcgccgg gcacccgcag caccggcggc 7261 accggcàgcc cgagctcctc cagggctcgg cgggceagcg gctcccagaa ttcctggtcg 7321 ttccgcaggc tcgcgtagga atcatccgaa tcaatacggt cgagaagtaa cagggattct 7381 tgtgtcaeag cggacctcta ttcacagggt acgggccggc ttaattccgc acggccggtc 7441 gcgacacggc ctgtccgcac cgcggtcagg cgttgacgat gacgggctgg tcggccacgt 7501 cggggacgtt ctcggtggtg ctgcggtcgg gatcgccaat ctctacgggc cgaccgaggc 7561 gacggtgtac gccaccgcct ggttctgcga cggcgaggcg ccgccaggcc ccgccgatcn 7621 ηηηηηηηηηη ηηηηηηηηηη ηηηηηηηηηη ηηηηηηηηηη ηηηηηηηηηη ηηηηηηηηηη 7681 ηηηηηηηηηη ηηηηηηηηηη 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cgcttaatgc gccgctacag ggcgcgtact atggttgctt 8581 tgacgagcac gtataacgtg ctttcctcgt tagaatcaga gcgggagcta aacaggaggc 8641 cgattaaagg gattttagac aggaacggta cgccagaatc ctgagaagtg tttttataat 8701 cagtgaggcc accgagcaaa agagtctgtc catcacgcaa attaaccgtt gtcgcaatac 8761 ttctttgàtt agtaataaca tcacttgcct gagtagaaga actcaaacta tcggccttgc 8821 tggtaatatc cagaacaatc ctgaatcgcc ccatcatcca gccagaaagt gagggagcca 8881 cggttgatga gagctttgtt gtaggtggac cagttggtga ttttgaactt ttgctttgcc 8941 acggaaeggt ctgcgttgtc gggaagatgc gtgatctgat ccttcaactc agcaaaagtt 9001 cgatttattc aacaaagccg ccgtcccgtc aagtcagcgt aatgctctgc cagtgttaca 9061 accaattaac caattctgat tagaaaaact catcgagcat caaatgaaac tgcaatttat 9121 tcatatcagg attatcaata ccatattttt gaaaaagccg tttctgtaat gaaggagaaa 9181 actcaccgag gcagttccat aggatggcaa gatcctggta tcggtctgcg attccgactc 9241 gtccaaéatc aatacaacct attaatttcc cctcgtcaaa aataaggtta tcaagtgaga 9301 aatcacòatg agtgacgact gaatccggtg agaatggcaa aaacttatgc atttctttcc 9421 cgttattcat tcgtgattgc 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gtgctcatca ttggaaaacg ttcttcgggg cgaaaactct caaggatctt accgctgttg 12121 agatccagtt cgatgtaacc cactcgtgca cccaactgat cttcagcatc ttttactttc 12181 accagcgttt ctgggtgacg cagatcccgc aagaggcccg gcagtaccgg cataaccaag 12241 cctatgccta cagcatccag ggtgacggtg ccgaggatga cgatgagcgc attgttagat 12301 ttcatacacg gtgcctgact gcgttagcaa tttaactgtg ataaactacc gcattaaagc 12361 ttgggctagt tgaggttggg aaccacgtct gagagctcgc gcagcaaege agccttaccc 12421 ttggcgccaa cgattcgttt caccggctgg ccgtccttga acaagatcag ggtagggatc 12481 gagacgacct ggaagttgcg ggcggtctcc gggttggtgt ccacgtcgag cttggcgacg 12541 gtgaggtctg ttgcgcgctc ggtggcgatt tcctcgagaa cgggcgctac cattgtcgcc 12601 caaaagtcaa ccagcacagg cttgttgctg gatagcacgt cggtggcaaa ggatgcgtcg 12661 gtaactttga tggtggcgga cttctcggaa tcggtcatcg ttgtgctcct atcaatgcgt 12721 cggtactgtc agcttctccg gttgctgcgt gctcggcgag ccagcgctcg gcgtcgatag 12781 ccgcggegca gccactgccc gctgcggtaa ccgcctggcg ataggtgcga tccaccaggt 12841 cgccggèagc gaacacgccc ggcagtgagg tgctggtggt acgcccctgc accaacacgt 12901 agccgtccgg gtcgacgtcg atggcctcgc gcaccaagcc cgaccgcggc tcgtggccga 12961 tcgcgacgaa aacaccggtt accggcaggg tggtttcggc accggtgttg gtgtcgcgta 13021 cccgcaagcc ggtcactgtg gtgtccccgt ccaccgcgac cacggtgtgg ttggtgagga 13081 accgtatctt gtcgttgttg cgggcgcgat cgagcatgat tttggaagcc cggaactcgt 13141 cgcggcgatg caccagcgtc acactgcgag cgaatcgggt caggaaggta gcttcctcca 13201 ttgccgagtc accgccgccg atgacggcga tgtcctgatc gcggaagaag aacgagctca 13261 ccccgcgccc gagcaattcc tgttcgccgg gcacctgcag atagcgtgcc gctgcgccca 13321 ttgccaggat cacggctcgg gcccggtggg tctgtccgtc ggcggtgacg accgatttca 13381 gcggcccgtg aagtgatacc gactcgacgt cttccatacg caggtccgcg ccgaatcgca 13441 gcgcctgttc ccgcatctca tccatcaact ctggaccggt gatgccgttg cgaaatcccg 13501 ggtagttctc cacgtcggtg gtggtcatca gcgcgccgcc gaaagacgtg ccctcgaaga 13561 ccagcggcgc cagctgggca cgggcggcgt agagcgccgc agtgtacccc gcgggaccgg 13621 agccgataac gatcacgtcg cgaacggggt ggtgtgcgcg gtcatggaca ggcggggcgg 13681 tcatgcggga tcctatgtat tctatagtgt cacctaaatc gtatgtgtat gatacataag 13741 gttatgtatt aattgtagcc gcgttctaac gacaatatgt acaagcctaa ttgtgtagca 13801 tctggcttac tgaagcagac cctatcatct ctctcgtaaa ctgccgtcag agtcggtttg 13861 gttggacgaa ccttctgagt ttctggtaac gccgtcccgc acccggaaat ggtcagcgaa 13921 ccaatcagca gggtcatcgc tagaaatcat ccttagcgaa agctaaggat tttftttatc 13981 tgaattggta ccgcggccgc ttaat

(O) pMP349-rBLS (SEQ ID NO: 37)

pMP349 com lumazina sintase de Brucella recombinante atrás do promotor aceA(icl) utilizado para criar a BCG-RDrBLS (expressa por plasmídeos). Ele pode ser adicionado a vacinas BCG pro-apoptóticas de Ia, 2a, 3a ou 4a geração que acentuem a apresentação de antígenos através de trajetórias de priming cruzadas associadas à apoptose.

1 ètagttccac tgagcgtcag accccgtaga aaagatcaaa ggatcttctt 51 gagatccttt ttttctgcgc gtaatctgct gcttgcaaac aaaaaaacca 101 çcgctaccag Cggtggtttg tttgccggat caagagctac caactattt 151 tccgaaggta actggcttca gcagagcgca gataccaaat actgtccttc 201 tagtgtagcc gtagttaggc caccacttca agaactctgt agcaccgcct 251 acatacctcg ctctgctaat cctgttacca gtggctgctg ccagtggcga 301 taagtcgtgt cttaccgggt tggactcaag acgatagtta ccggataagg 351 cgcagcggtc gggctgaacg gggggttcgt gcacacagcc cagcttggag 401 cgaacgacct acaccgaact gagataccta cagcgtgagc attgagaaag 451 cgccacgctt cccgaaggga gaaaggcgga caggtatccg gtaagcggca 501 gggtcggaac aggagagcgc acgagggagc ttccaggggg aaacgcctgg 551 tatctttata gtcctgtcgg gtttcgccac ctctgacttg agcgtcgatt 601 tftgtgatgc tcgtcagggg ggcggagcct atggaaaaac gccagcaacg 651 cggccttttt acggttcctg gccattgct ggccttttgc tcacatgttc 701 tttcctgcgt tatcccctga ttctgtggat aaccgtatta ccgcctttga 751 gtgagctgat accgctcgcc gcagccgaac gaccgagcgc aacgcgtgag 801 cccaccagct ccgtaagttc gggtgctgtg tggctcgtac ccgcgcattc 851 âggcggcagg gggtctaacg ggtctaaggc ggcgtgtacg gccgccacag 901 cggctcttag cggcccggaa acgtcctcga aacgacgcat gtgttcctcc 951 tggttggtac aggtggttgg gggtgctcgg ctgtcgctgg tgtttcatca 1001

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Ao longo deste pedido, várias publicações são referidas. As divulgações dessas publicações em suas totalidades são aqui incorporadas por referência neste pedido para descrever mais completamente o estado da técnica ao qual esta invenção se refere.

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Será evidente para os técnicos no assunto que várias modificações e variações podem ser feitas na presente invenção sem sair do escopo ou espírito da invenção. Outras modalidades da invenção serão aparentes para os técnicos no assunto a partir da consideração do relatório e da prática da invenção revelada aqui. E pretendido que o relatório e os exemplos sejam considerados como exemplificativos apenas, sendo o verdadeiro escopo e espírito da invenção indicado pelas reivindicações a seguir.

Claims (62)

1. Método de modificação para acentuar a imunogenicidade da bactéria, caracterizado por compreender a alteração genética da bactéria para expressar um mutante dominante-negativo de uma enzima anti-apoptótica, sendo que a bactéria possui imunogenicidade acentuada em um sujeito.

2. Bactéria modificada caracterizada por ser feita de acordo com o método da reivindicação 1.

3. Composição imunogênica caracterizada por compreender a bactéria modificada da reivindicação 2.

4. Método de modificação de uma bactéria atenuada para acentuar a imunogenicidade da bactéria modificada, caracterizado por compreender a alteração genética da bactéria para expressar um mutante dominante-negativo de uma enzima anti-apoptótica, em que a bactéria possui imunogenicidade acentuada em um sujeito.

5. Método de acordo com as reivindicações 1 e 4, caracterizado pela bactéria ser selecionada a partir do grupo que consiste em M tuberculosis, Mbovis1 linhagem BCG M bovis, sub-linhagens da BCG, M avium, M intracellulare, M africanum, M kansasii, M. marinum, M ulcerans, sub- espécie M avium paratuberculosis, Nocardia asteroides, outras espécies Nocardia, Legionella pneumophila, outras espécies Legionella, Salmonella typhi, outras espécies Salmonella, espécie Shigella, Yersinia pestis, Pasteurella haemolytica, Pasteurella multocida, outras espécies Pasteurella, Actinobacillus pleuropneumòniae, Listeria monoeytogenes, Listeria ivanovii, Brueella abortus, outras espécies Brueella, Cowdria ruminantium, Chlaniydia pneumoniae, Chlainydia traehomatis, Chlamydia psittaei, Coxiella burnetti, outras espécies Riekettsial, espécie Ehrlichia, Staphylocoeeus aureus, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus pyogenes, Streptoeoeeus agalaetiae, Bacillus anthraeis, Eseheriehia eoli, Vibrio eholerae, espécies Canzpylobaeter, Neiserria meningitidis, Neiserria gonorrhea, Pseudomonas aeruginosa, outras espécies Pseudomonas, Haemophilus influenzae, Haemophilus duereyi, outras espécies Hemophilia, Yersinia enterolitica, e outras espécies Yersinia.

6. Método de acordo com as reivindicações 1 e 4, caracterizado pelo mutante dominante-negativo ser um mutante dominante negativo de SodA em que uma remoção, inserção e/ou substituição de nucleotídeos no ácido nucléico de ocorrência natural codifica uma molécula que interfira com a atividade de SOD do organismo.

7. Método de acordo com as reivindicações 1 e 4, caracterizado pelo mutante dominante-negativo ser um mutante dominante negativo de sintase de glutamina em que uma remoção, inserção e/ou substituição dé nucleotídeos no ácido nucléico de ocorrência natural codifica uma molécula que interfere com a atividade de sintase de glutamina do organismo.

8. Método de acordo com as reivindicações 6 e 7, caracterizado pela bactéria ser BCG.

9. Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por compreender uma modificação pró-apoptótica adicional.

10. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pela modificação pró-apoptótica adicional uma ou mais modificações selecionadas a partir do grupo que consiste na desativação de SigH, desativação de SigE, desativação de SecA2, desativação de tioredoxina, desativação de reductase de tioredoxina e desativação de glutaredoxina.

11. Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo mutante dominante-negativo ser um mutante de SodA que tem remoções de histidina na posição 28 e de histidina na posição 76.

12. Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo mutante dominante-negativo ser um mutante de SodA que tem que tem uma remoção de histidina na posição 28 ou de histidina na posição 76.

13. Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo mutante dominante-negativo ser um mutante de SodA que tem que tem uma remoção de ácido glutâmico na posição 54.

14. Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo mutante dominante-negativo ser um mutante de SodA que tem que tem uma remoção de ácido glutâmico na posição 54 e a substituição de histidina por arginina na posição 28.

15. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações IOa -14, caracterizado pela bactéria compreender um mutante dominante-negativo de SodA e uma mutação redutora de atividade de sigH.

16. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações IOa -14, caracterizado pela bactéria compreender um mutante dominante-negativo de SodA e uma mutação redutora de atividade de secA2.

17. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações IOa -14, caracterizado pela bactéria compreender um mutante dominante-negativo de SodA, uma mutação redutora de atividade de sigH, e uma mutação redutora de atividade de secA 2.

18. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações IOa -14, caracterizado pela bactéria compreender um mutante dominante-negativo SodA, um mutante dominante-negativo s/gH e uma mutação redutora de atividade de sècA2.

19. Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pela bactéria compreender uma mutação dominante negativa de glnAl.

20. Método de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo mutante dominante-negativo de sintase de glutamina compreender remoções de ácido aspártico no aminoácido 54 e de ácido glutâmico no aminoácido 335.

21. Método de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo mutante dominante-negativo de sintase de glutamina compreender uma remoção de ácido aspártico no aminoácido 54 ou de ácido glutâmico no aminoácido 335.

22. Método de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pela bactéria compreender ainda uma mutação redutora de atividade de secA2.

23. Método de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pela bactéria compreender ainda um mutante dominante-negativo de SodA.

24. Método de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo mutante dominante-negativo de SodA ser um mutante de SodA que tem remoções de Histidina na posição 28 e de histidina na posição 76.

25. Método de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pela bactéria compreender ainda uma mutação redutora de atividade de sigH uma mutação redutora de atividade de secA2.

26. Método de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pela bactéria compreender ainda um mutante dominante-negativo de SodA e uma mutação redutora de atividade de sigH.

27. Método de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo mutante dominante-negativo ser um mutante de SodA que tem uma remoção de ácido glutâmico na posição 54.

28. Método de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo mutante dominante-negativo de SodA ser um mutante de SodA que tem remoções de histidina na posição 28 e de histidina na posição 76.

29. Método de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pela bactéria compreender ainda um mutante dominante-negativo de SodA que tem uma mutação redutora de atividade de secA2.

30. Método de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo mutante dominante-negativo ser um mutante de SodA que tem uma remoção de ácido glutâmico na posição 54.

31. Método de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo mutante dominante-negativo ser um mutante de SodA que tem remoções de histidina na posição 28 e de histidina na posição 76.

32. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pela bactéria compreender uma mutação redutora de atividade de sigH.

33. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pela bactéria compreender uma mutação redutora de atividade de sigH e uma mutação redutora de atividade de secA2.

34. Bactéria modificada de acordo com a reivindicação 2, caracterizada por ser atenuada.

35. Bactéria modificada de acordo com a reivindicação 2, caracterizada por ser selecionada a partir do grupo que consiste em M tuberculosis, M bovis, linhagem BCG M bovis, sub-linhagens da BCG, M avium, M intracellulare, M africanum, M kansasii, M. marinum, M ulcerans, sub- espécie M avium paratuberculosis, Nocardia asteroides, outras espécies Nocardia, Legionella pneumophila, outras espécies Legionella, Salmonella typhi, outras espécies Salmonella, espécie Shigella, Yersinia pestis, Pasteurella haemolytica, Pasteurella multocida, outras espécies Pasteurella, Actinobacillus pleuropneumoniae, Listeria monocytogenes, Listeria ivanovii, Brucella abortus, outras espécies Brucella, Cowdria ruminantium, Chlaniydia pneumoniae, Chlainydia trachomatis, Chlamydia psittaci, Coxiella burnetti, outras espécies Riekettsial, espécie Ehrliehia, Staphylocoeeus aureus, Staphylocoeeus epidermidis, Streptoeoceus pyogenes, Streptoeoceus agalaetiae, Bacillus anthracis, Eseherichia eoli, Vibrio eholerae, espécies Canzpylobaeter, Neiserria meningitidis, Neiserria gonorrhea, Pseudomonas aeruginosa, outras espécies Pseudomonas, Haemophilus influenzae, Haemophilus ducreyi, outras espécies Hemophilia, Yersinia enterolitica, e outras espécies Yersinia.

36. Bactéria modificada de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo mutante dominante-negativo ser um mutante dominante- negativo selecionado a partir do grupo que consiste em: a) SodA em que uma remoção, inserção e/ou substituição de nucleotídeos rio ácido nucléico de ocorrência natural codifica uma molécula que reduz a atividade de SOD do organismo; e b) sintase de glutamina em que uma remoção, inserção e/ou substituição de nucleotídeos no ácido nucléico de ocorrência natural codifica uma molécula que reduz a atividade de sintase de glutamina do organismo.

37. Bactéria modificada de acordo com a reivindicação 36, caracterizada por ser a BCG.

38. Bactéria modificada de acordo com a reivindicação 37, caracterizada por compreender ainda uma modificação pró-apoptótica.

39. Bactéria modificada de acordo com a reivindicação 38, caracterizada pela modificação pró-apoptótica compreender uma ou mais modificações selecionadas a partir do grupo que consiste em desativação de SigH, desativação de SigE, desativação de secA2, desativação de tioredoxina, desativação de reductase de tioredoxina e desativação de glutaredoxina.

40. Bactéria modificada de acordo com a reivindicação 37, caracterizada pelo mutante dominante-negativo ser um mutante de SodA que tem remoções de histidina na posição 28 e de histidina na posição 76.

41. Bactéria modificada de acordo com a reivindicação 37, caracterizada pelo mutante dominante-negativo ser um mutante de SodA que tem uma remoção de histidina na posição 28 e uma de histidina na posição 76.

42. Bactéria modificada de acordo com a reivindicação 37, caracterizada pelo mutante dominante-negativo ser um mutante de SodA que tem uma remoção de ácido glutâmico na posição 54.

43. Bactéria modificada de acordo com a reivindicação 37, caracterizada pelo mutante dominante-negativo ser um mutante de SodA que tem uma remoção de ácido glutâmico na posição 54 e a substituição de histidina por arginina na posição posição 28.

44. Bactéria modificada de acordo com a reivindicação 39, caracterizada por compreender um mutante dominante-negativo de SodA e uma mutação redutora de atividade de sigH.

45. Bactéria modificada de acordo com a reivindicação 39, caracterizada por compreender um mutante dominante-negativo de SodA e uma mutação redutora de atividade de secA2.

46. Bactéria modificada de acordo com a reivindicação 39, caracterizada por compreender um mutante dominante-negativo de SodA, uma mutação redutora de atividade de sigH e uma mutação redutora de atividade de secA2.

47. Bactéria modificada de acordo com a reivindicação 39, caracterizada por compreender um mutante dominante-negativo de SodA, uma mutação dominante negativa de glnAl, uma mutação redutora de atividade de sigH e uma mutação redutora de atividade de secA2.

48. Bactéria modificada de acordo com a reivindicação 39, caracterizada por compreender uma mutação dominante negativa de glnAl.

49. Bactéria modificada de acordo com a reivindicação 48, caracterizada pelo mutante dominante-negativo de sintase de glutamina compreender remoções de ácido aspártico no aminoácido 54 e de ácido glutâmico no aminoácido 335.

50. Bactéria modificada de acordo com a reivindicação 48, caracterizada pelo mutante dominante-negativo de sintase de glutamina compreender uma remoção de ácido aspártico no aminoácido 54 ou de um ácido glutâmico no aminoácido 335.

51. Bactéria modificada de acordo com a reivindicação 49, caracterizada por compreender ainda uma atividade redutora de mutação de secA2.

52. Bactéria modificada de acordo com a reivindicação 51, caracterizada por compreender ainda um mutante dominante-negativo de SodA.

53. Bactéria modificada de acordo com a reivindicação 52, caracterizada pelo mutante dominante-negativo de SodA ser um mutante de SodA que tenha remoções de histidina na posição 28 e de histidina na posição 76.

54. Bactéria modificada de acordo com a reivindicação 49, caracterizada por compreender uma mutação redutora de atividade de sigH e uma mutação redutora de atividade de secA2.

55. Bactéria modificada de acordo com a reivindicação 49, caracterizada por compreender ainda um mutante dominante negativo de SodA e uma mutação redutora de atividade de SigH.

56. Bactéria modificada de acordo com a reivindicação 55, caracterizada pelo mutante dominante-negativo ser um mutante de SodA que tenha uma remoção de ácido glutâmico na posição 54.

57. Bactéria modificada de acordo com a reivindicação 55, caracterizada pelo mutante dominante-negativo ser um mutante de SodA que tenha remoções de histidina na posição 28 e de histidina na posição 76.

58. Bactéria modificada de acordo com a reivindicação -49, caracterizada por compreender ainda um mutante dominante-negativo de SodA e uma mutação redutora de atividade de secA2.

59. Bactéria modificada de acordo com a reivindicação 58, caracterizada pelo mutante dominante-negativo ser um mutante de SodA que tem uma remoção de ácido glutâmico na posição 54.

60. Bactéria modificada de acordo com a reivindicação 58, caracterizada pelo mutante dominante-negativo ser um mutante de SodA que tem remoções de histidina na posição 28 e de histidina na posição 76.

61. Bactéria modificada de acordo com a reivindicação 2, caracterizada por compreender uma mutação redutora de atividade de sigH.

62. Bactéria modificada de acordo com a reivindicação 2, caracterizada por compreender uma mutação redutora de atividade de sigH e uma mutação redutora de atividade de secA2.