BRPI0617332A2 - marcadores asoociados ao diabetes e mÉtodos de uso dos mesmos - Google Patents

Abstract

MARCADORES ASSOCIADOS AO DIABETES E METODOS DE USO DOS MESMOS São revelados métodos para identificação de indivíduos com diabetes ou uma condição pré-diabética, os métodos para identificação de indivíduos em risco de desenvolver diabetes ou uma condição pré-diabética, métodos para diagnosticar diferentes doenças associadas ao diabetes ou a uma condição pré-diabética, a partir de outras doenças ou dentro de subclassificações do diabetes, métodos para avaliar o risco de progressão do diabetes ou uma condição pré-diabética em pacientes, métodos para avaliar a eficácia dos tratamentos em indivíduos com diabetes ou outra condição pré-diabética e métodos para seleção de terapias para tratamento do diabetes ou uma condição pré-diabética, empregando os biomarcadores.

Description

MARCADORES ASSOCIADOS AO DIABETES E MÉTODOS DE USO DOSMESMOSINCORPORAÇÃO COMO REFERÊNCIAEsse pedido reivindica prioridade do Pedido ProvisórioUS número de série 60/725.462, depositado em 11 de outubrode 2005.Cada um dos pedidos e patentes citados nesse texto,bem como cada documento ou referência citada em cada um dospedidos e patentes (incluindo durante o andamento de cadapatente emitida; "documentos citados no pedido") e cada umdos pedidos estrangeiros e dos Estados Unidos da América oupatentes correspondentes e/ou que reivindiquem prioridadede qualquer um desses pedidos e patentes e cada um dosdocumentos citados ou referidos em cada um dessesdocumentos citados no pedido são expressamente incorporadosaqui como referência. De modo geral, os documentos oureferências são citados nesse texto, tanto em uma Lista deReferências antes das reivindicações ou no textopropriamente, cada um desses documentos ou referências("referências citadas aqui"), bem como cada documento oureferência citada em cada uma das referências citadas aqui(incluindo quaisquer relatórios descritivos do fabricante,instruções, etc.) é expressamente incorporado aqui comoreferência. Os documentos citados como referência nessetexto podem ser empregados na prática da invenção.CAMPO DA INVENÇÃOA presente invenção se refere, de modo geral, àidentificação de marcadores biológicos associados a umrisco crescente de desenvolvimento do Diabetes, bem comométodos de emprego de tais marcadores biológicos nodiagnóstico e prognóstico do Diabetes.HISTÓRICO DA INVENÇÃO

0 Diabetes Melito descreve um transtorno metabólicocaracterizado por hiperglicemia crônica com distúrbios dometabolismo do carboidrato, gordura e proteína, queresultam dos defeitos na secreção da insulina, ação dainsulina ou ambos. Os efeitos do Diabetes Melito incluemlesão de longo tempo, disfunção e falência de váriosórgãos. O Diabetes pode estar presente com sintomascaracterísticos, tais como, sede, poliúria, turvação davisão, infecções crônicas, cura lenta de feridas e perda depeso. Em suas formas mais graves, cetoacidose ou um estadohiperosmolar não cetótico pode desenvolver e conduzir aoestupor, coma e na ausência de tratamento eficaz, à morte.Freqüentemente os sintomas não são graves, não sãoreconhecidos ou podem estar ausentes. Consequentemente, ahiperglicemia suficiente para causar lesões patológicas efuncionais pode estar presente por um longo tempo,ocasionalmente por até dez anos, antes de um diagnóstico ser feito, geralmente pela detecção de níveis altos deglicose na urina após jejum por toda a noite durante umexame médico de rotina. Os efeitos de longo tempo doDiabetes Melito incluem desenvolvimento progressivo dascomplicações, tais como, retinopatia com cegueira empotencial, nefropatia que pode conduzir a falência renal,neuropatia, alterações microvasculares e disfunçãoautonômica. As pessoas com Diabetes também correm um granderisco de doença cardiovascular, periférica vascular ecerebrovascular (em conjunto, doença "arteriovascular").Existe também um grande risco de câncer. Vários processospatogenéticos estão envolvidos no desenvolvimento doDiabetes. Esses incluem processos que destroem as célulasbeta do pâncreas que secretam insulina com conseqüentedeficiência de insulina e alterações no fígado e célulasmusculares lisas, o que resulta em resistência de absorçãode insulina. As anormalidades no metabolismo docarboidrato, gordura e proteína são devidas ã açãodeficiente da insulina nos tecidos alvo resultando dainsensibilidade à insulina ou falta de insulina.

Com relação à causa fundamentada, o Diabetes Melitoestá subdividido no Diabetes do Tipo 1 e Diabetes do Tipo2. O Diabetes do Tipo 1 resulta da destruição mediadaautoimune das células beta do pâncreas. A taxa dedestruição varia e a forma de progressão rápida égeralmente observada em crianças, porém pode também ocorrerem adultos. A forma de progressão lenta do diabetes do tipoI geralmente ocorre em adultos e é algumas vezes referidacomo um Diabetes autoimune latente nos adultos (LADA)Alguns pacientes, especificamente crianças e adolescentes,podem exibir cetoacidose como a primeira manifestação dadoença. Outros possuem hiperglicemia em jejum modesta quepode rapidamente mudar para hiperglicemia grave e/oucetoacidose na presença de infecção ou outros estresses.Ainda outros, especificamente adultos, podem manter afunção da célula beta residual o suficiente para prevenir acetoacidose por muitos anos. Os indivíduos com essa formade Diabetes do Tipo 1 freqüentemente ficam dependentes dainsulina para sobreviver e correm o risco de cetoacidose.Os pacientes com diabetes do tipo I exibem pouca ou nenhumasecreção de insulina, conforme manifestada por níveisbaixos ou não detectáveis de peptídeo C no plasma. Contudo,existem algumas formas de Diabetes do tipo I que nãopossuem etiologia conhecida, e alguns desses pacientespossuem insulinopenia permanente e são propensos àcetoacidose, porém não apresentam evidência deautoimunidade. Esses pacientes são referidos como"idiopáticos do tipo 1".

O diabetes do tipo 2 é a forma mais comum do Diabetese é caracterizada por transtornos da ação da insulina esecreção da insulina, cada uma podendo ser o aspectopredominante. Ambas estão presentes geralmente quando essaforma do Diabetes se manifesta clinicamente. Os pacientescom diabetes do tipo 1 são caracterizados com umadeficiência relativa ao invés de absoluta de insulina e sãoresistentes à ação da insulina. Pelo menos inicialmente efreqüentemente através de toda a sua vida, esses indivíduosnão precisam de tratamento com insulina para sobreviver. 0diabetes do tipo 2 é responsável por 90-95% de todos oscasos de Diabetes. Essa forma de Diabetes pode prosseguirnão diagnosticada por muitos anos em razão da hiperglicemiafreqüentemente não ser grave o suficiente para provocarsintomas claros do diabetes ou os sintomas simplesmente nãoserem reconhecidos. A maior parte dos pacientes comdiabetes do tipo 2 são obesos e a obesidade propriamentepode causar ou agravar a resistência à insulina. Muitos dospacientes que não são obesos por critérios de pesotradicionais podem ter uma porcentagem aumentada de gorduracorpórea distribuída predominantemente na região abdominal(gordura visceral). A cetoacidose não é freqüente nessetipo de Diabetes e geralmente surge em associação comestresse de outra enfermidade. Considerando-se que ospacientes com essa forma de Diabetes podem ter níveis deinsulina que parecem normais ou elevados, os altos níveisde glicose no sangue desses pacientes diabéticos poderiamresultar em valores de insulina mesmo mais altos, tendotido sua função de célula beta normal. Assim, a secreção deinsulina é freqüentemente defeituosa e insuficiente paracompensar a resistência à insulina. Por outro lado, algunsindivíduos hiperglicêmicos possuem ação de insulinaessencialmente normal, porém secreção de insulinamarcantemente comprometida.

A hiperglicemia diabética pode ser diminuída porredução do peso, aumento de atividade física e/outratamento farmacológico. Existem vários mecanismosbiológicos que estão associados à hiperglicemia, tais como,resistência à insulina, secreção da insulina egliconeogênese e existem fármacos oralmente ativosdisponíveis que atuam em um ou mais desses mecanismos. Coma intervenção do estilo de vida e/ou fármacosa, os níveisde glicose podem retornar aos níveis próximos do normal,porém isso é geralmente temporário. Com o passar do tempo,são freqüentemente necessários acréscimos de fármacos desegundo tipo adicionais na abordagem do tratamento.Freqüentemente com o passar do tempo, mesmo essasabordagens de múltiplos fármacos falham, quando então asinjeções de insulina são recomendadas.

Mais de 18 milhões de pessoas nos Estados Unidossofrem de diabetes do tipo 2, e dessas, cerca de 5 milhõesnão sabem que sofrem da doença. Essas pessoas quedesconhecem que sofrem da doença e que não exibem sintomasclássicos do Diabetes apresentam um desafio diagnóstico eterapêutico maior.

Existe um grupo maior nos Estados Unidos, quase 41milhões de pessoas, que correm risco significativo dedesenvolver o diabetes do tipo 2. Eles são amplamentereferidos na literatura como "pré-diabéticos". Um "pré-diabético" ou um indivíduo com pré-Diabetes representaqualquer pessoa ou população com um risco maior em relaçãoã ampla população para conversão no diabetes do tipo 2 em um dado período de tempo. O risco de desenvolver o diabetesdo tipo 2 aumenta com a idade, obesidade e falta deatividade física. Isso ocorre mais freqüentemente emmulheres com Diabetes gestacional anterior e nos indivíduoscom hipertensão e/ou dislipidemia. Isso freqüentemente varia nos subtipos étnicos diferentes. O diabetes do tipo 2está freqüentemente associado à predisposição familiarforte, provavelmente genética, contudo, as genéticas dessaforma do Diabetes são complexas e não são claramentedefinidas.

O pré-diabetes freqüentemente possui níveis de glicoseem jejum entre os níveis normais e diabéticos francos.Ocasionalmente em pesquisa, essas pessoas são testadasquanto a sua tolerância à glicose. A tolerância à glicoseanormal ou "tolerância à glicose comprometida" pode ser uma indicação de que um indivíduo está em vias de se tornardiabético; isso requer o uso de um teste de tolerância àglicose oral de duas horas para sua detecção. Contudo foidemonstrado que a tolerância à glicose comprometida éprópria e totalmente assintomática e não está associada aqualquer incapacidade funcional. Na realidade, a secreçãoda insulina é tipicamente maior em resposta a uma refeiçãomista que em resposta a uma carga de glicose pura; comoresultado, muitas pessoas com tolerância à glicosecomprometida são raramente, se são, hiperglicêmicas em suasvidas diárias, exceto quando elas passam por testes dediagnóstico de tolerância à glicose. Assim, a importânciada tolerância à glicose comprometida reside,exclusivamente, em sua capacidade de identificar pessoascom risco a aumentado de doença futura (Stern e outros,2002) . Nos estudos conduzidos por Stern e outros, as taxasde sensibilidade e falso-positivo de tolerância à glicosecomprometida como um previsor de conversão futura nodiabetes do tipo 2 foi de 50,9% e 10,2%, respectivamente,representando uma área sob a Curva CaracterísticaOperacional do Receptor de 77,5% e um valor ρ de 0,20.Devido ao seu custo, confiabilidade e inconveniência, oteste de tolerância à glicose oral caiu em desuso naprática da clínica de rotina. Além disso, os pacientes cujoDiabetes têm diagnóstico unicamente com base no teste detolerância à glicose oral possuem uma taxa alta de reversãopara normal no acompanhamento e podem de fato representardiagnósticos de falso-positivo. Stern e outros reportaramque tais casos foram quase cinco vezes mais prováveis dereversão para estado não diabético após 7 a 8 anos deacompanhamento, em comparação às pessoas que satisfazem osdiagnósticos clínicos ou de jejum convencionais. Claramenteexiste uma necessidade de métodos aperfeiçoados paraavaliação do risco de Diabetes futura.Freqüentemente será observado em uma pessoa comtolerância a glicose comprometida, que a mesma possui pelomenos um ou mais dos fatores de risco comuns a doençaarteriovascular. Esse agrupamento foi determinado "SindromeX" ou "Síndrome Metabólica" por alguns pesquisadores e podeindicar um estado pré-diabético. Sozinho, cada componentedo agrupamento representa risco de doença arteriovascular ediabética maior, porém em conjunto com uma combinação essesse tornam muito mais significativos. Isso significa que oacompanhamento das pessoas com hiperglicemia e outrosaspectos da Síndrome Metabólica deveria focar-se não apenasno controle da glicose no sangue, porém também incluirestratégias para redução de outros fatores de risco dedoença arteriovascular. Adicionalmente, tais fatores derisco não são específicos para diabetes ou pré-diabetes enão são propriamente uma base para um diagnóstico dodiabetes ou de estado diabético.

Deve ser observado, adicionalmente, que um riscoaumentado de conversão em Diabetes implica em um riscoaumentado de conversão em doença arteriovascular e eventos.O Diabetes propriamente é um dos fatores de risco simplesmais significativo para doença arteriovascular, e é, defato, freqüentemente denominado um "equivalente a doençacoronária do coração" propriamente, indicando mais de 20%de risco em dez anos de um evento arteriovascular, em umafaixa simples, com angina estável e imediatamente abaixodos fatores de risco independentes mais significativos,tais como, sobrevivência a um evento arteriovascularanterior. O mesmo é verdade para outra doençaarteriovascular, tal como, doença da artéria periférica oudoença cerebrovascular.

É bem documentado que o pré-Diabetes pode estarpresente em dez ou mais anos antes da detecção detranstornos glicêmicos como o Diabetes. 0 tratamento dospré-diabéticos com fármacos, tais como, acarbose,metiformina, trogitazona e rosiglitazona pode adiar ouprevenir o Diabetes; ainda que alguns pré-diabéticos sejamtratados. A razão maior é que, conforme indicado acima, nãoexistem testes laboratoriais simples que determinem o riscoreal de um indivíduo desenvolver Diabetes. Assim, existe anecessidade na técnica de métodos para identificação e diagnóstico desses indivíduos que não são ainda diabéticos,porém correm um risco significativo de desenvolverDiabetes.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção se refere, em parte, à descoberta de que determinados marcadores biológicos, tais comoproteínas, ácidos nucléicos, polimorfismos, metabólitos eoutros analisados, bem como determinadas condiçõesfisiológicas e estados estejam presentes em indivíduos comum risco acrescido de desenvolver Diabetes Melito ou uma condição pré-diabética, tal como, porém não limitado àSíndrome Metabólica (Síndrome X), condições caracterizadaspor regulação da glicose comprometida e/ou resistência âinsulina, tais como, Tolerância à Glicose Comprometida(IGT) e Glicemia em Jejum Comprometida (IFG), porém ondetais indivíduos não exibem algum ou todos os fatores derisco convencionais dessas condições ou indivíduos que sãoassintomáticos a essas condições.

Consequentemente, a invenção provê marcadoresbiológicos de Diabetes ou condições pré-diabéticas que podem ser usados para monitorar ou avaliar o risco dosindivíduos de experimentar tais condições diabéticas oupré-diabéticas, para diagnóstico ou identificação deindivíduos com uma condição diabética ou pré-diabética,para monitorar o risco de desenvolver uma condição diabética ou pré-diabética, para monitorar indivíduos quepassam por terapias para diabetes ou uma condição pré-diabética, para diagnosticar diferencialmente os estados dedoença associados ao diabetes ou uma condição pré-diabéticade outras doenças, ou dentro de subclassificações do Diabetes ou condições pré-diabéticas, para avaliar mudançasno risco do Diabetes ou condições pré-diabéticas, e paraselecionar terapias para uso no tratamento de indivíduoscom Diabetes ou condição pré-diabética ou para uso notratamento de indivíduos em risco de desenvolver diabetes ou uma condição pré-diabética. Preferivelmente, a presenteinvenção provê o emprego de marcadores biológicos, algunsdos quais não estão relacionados ao Diabetes ou não foramaté aqui identificados como estando relacionados aoDiabetes, porém estando relacionados às alteraçõesbiológicas anteriores que podem conduzir ao desenvolvimentodo Diabetes ou de uma condição pré-diabética, para detectare identificar indivíduos que não exibem sintomas doDiabete, isto é, que são assintomáticos ao Diabetes oucondições pré-diabéticas ou possuindo apenas indicações não específicas de condições pré-diabéticas em potencial, taiscomo, fatores de risco arteriovascular ou que não exibem ouexibem algum fator de risco convencional do Diabetes.Significativamente, muitos dos biomarcadores revelados aquimostraram pouco significado individual no diagnóstico do Diabetes, porém quando usados em conjunto (em "painéis")com outros marcadores revelados e combinados com osalgoritmos de classificação matemática revelados aqui, setornam discriminantes significados do paciente com pré-diabetes ou população de um que não seja pré-diabético.

Consequentemente, em um aspecto, a presente invençãoprovê um método com um nível predeterminado de prognósticopara avaliação de risco de desenvolver do Diabetes Melitoou uma condição pré-diabética em um indivíduocompreendendo: medição do nível de uma quantidade eficaz de um ou mais, pref erivelmente dois ou mais DBRISKMARKERSselecionados do grupo consistindo nos DBRISKMARKERS 1-260em uma amostra do indivíduo, e medição de uma alteraçãoclinicamente significativa no nível de um ou mais,preferivelmente dois ou mais DBRISKMARKERS na amostra, ondea alteração indica um risco aumentado de desenvolvimento doDiabetes Melito ou uma condição pré-diabética no indivíduo.

Em uma concretização, o Diabetes Melito compreendediabetes do tipo 1, diabetes do tipo 2, ou Diabetesgestacional. Em outras concretizações, a condição pré- diabética compreende IFG, IGT, Síndrome Metabólica ouSíndrome X.

O nível de DBRISKMARKERS pode ser medidoeletroforética ou imunoquimicamente. Quando a detecção forimunoquímica, a detecção pode ser obtida porradioimunoensaio, ensaio de imunofluorescência ou por umensaio imunosorvente ligado a enzima. A detecção podetambém ser obtida por hibridização de oligonucleotídeoespecífico.

Em algumas concretizações, o indivíduo não foi diagnosticado anteriormente ou identificado como sofrendodo Diabetes Melito ou a condição pré-diabética. Em outrasconcretizações, o indivíduo é assintomático ao DiabetesMelito ou a condição pré-diabética.A amostra conforme definida pela presente invençãopode ser soro, plasma sangüíneo, células sangüíneas,células endoteliais, biópsias de tecidos, fluido de ascite,medula óssea, fluido intersticial, saliva, ou urina.Em uma concretização da presente invenção, o nível deexpressão de cinco ou mais DBRISKMARKERS é medido, porémtambém pode englobar medição de dez ou mais, vinte e cincoou mais, ou cinqüenta ou mais DBRISKMARKERS.Em outro aspecto, é provido um método com um nívelpredeterminado de prognóstico para diagnóstico ouidentificação de um indivíduo sofrendo de Diabetes Melitoou uma condição pré-diabética compreendendo medição donível de uma quantidade eficaz de um ou mais,preferivelmente dois ou mais DBRISKMARKERS selecionados dogrupo consistindo nos DBRISKMARKERS 1-260 em uma amostra doindivíduo, e comparação do nível de quantidade eficaz de umou mais (ou dois ou mais) DBRISKMARKERS com relação a umvalor de referência.Em uma concretização, o valor de referência é um valorde índice. 0 valor de referência pode também ser derivadode um ou mais algoritmos de previsão de risco ou índicescomputados para o Diabetes ou condição pré-diabética.Outro aspecto da presente invenção provê um método comum nível predeterminado de prognóstico para avaliação derisco de tolerância à glicose comprometida em um indivíduocompreendendo medição do nível de uma quantidade eficaz deum ou mais, pref erivelmente dois ou mais DBRISKMARKERSselecionados do grupo consistindo nos DBRISKMARKERS 1-260em uma amostra do indivíduo, e medição de uma alteraçãoclinicamente significativa no nível de um ou mais (ou doisou mais) DBRISKMARKERS na amostra, onde a alteração indicaum risco aumentado de tolerância à glicose comprometida noindivíduo.

Em uma concretização, o indivíduo não foidiagnosticado anteriormente como sofrendo de tolerância àglicose comprometida. Em outra concretização, o indivíduo éassintomático com relação à tolerância à glicosecomprometida.

Em outro aspecto, é provido um método com um nívelpredeterminado de prognóstico para diagnóstico ouidentificação de um indivíduo sofrendo de tolerância à glicose comprometida, compreendendo medição do nível de umaquantidade eficaz de um ou mais, preferivelmente dois oumais DBRISKMARKERS selecionados do grupo consistindo nosDBRISKMARKERS 1-26 0 em uma amostra do indivíduo, ecomparação do nível de quantidade eficaz de um ou mais (preferivelmente dois ou mais) DBRISKMARKERS com relação aum valor de referência. 0 valor de referência pode ser umvalor de índice.

Alternativamente, o valor de referência pode serderivado de um ou mais algoritmos de previsão de risco ou índices computados para tolerância à glicose comprometida.

Outro aspecto da invenção provê um método com um nívelpredeterminado de prognóstico para avaliação da progressãodo Diabetes Melito ou uma condição pré-diabética em umindivíduo, compreendendo detecção do nível de uma quantidade eficaz de um ou mais, pref erivelmente dois oumais DBRISKMARKERS selecionados do grupo consistindo nosDBRISKMARKERS 1-260 em uma primeira amostra do indivíduo emum primeiro período de tempo; detecção do nível de umaquantidade eficaz de um ou mais, preferivelmente dois oumais DBRISKMARKERS em uma segunda amostra do indivíduo emum segundo período de tempo; e comparação do nível dequantidade eficaz de um ou mais (ou dois ou mais)DBRISKMARKERS detectados na etapa (a) com relação àquantidade detectada na etapa (b) , ou com relação a umvalor de referência.

Em uma concretização, o indivíduo foi diagnosticadoanteriormente ou identificado como sofrendo do DiabetesMelito ou a condição pré-diabética. Em outra concretização,,o indivíduo foi tratado anteriormente do Diabetes Melito ouda condição pré-diabética. Ainda em outra concretização, oindivíduo não foi diagnosticado anteriormente ouidentificado como sofrendo do Diabetes Melito ou dacondição pré-diabética. Em outras concretizações, oindivíduo é assintomático ao Diabetes Melito ou a condiçãopré-diabética.

No contexto da invenção, a primeira amostra pode serretirada do indivíduo antes de ser tratado do DiabetesMelito ou da condição pré-diabética. A segunda amostra podeser retirada do indivíduo após ser tratado do DiabetesMelito ou da condição pré-diabética. O valor de referênciapode ser derivado de um ou mais indivíduos que sofreram deDiabetes Melito ou de uma condição pré-diabética.

Em outro aspecto da presente invenção, é provido ummétodo com um nível predeterminado de prognóstico paraavaliação da progressão de tolerância à glicosecomprometida associada ao Diabetes Melito ou a uma condiçãopré-diabética em um indivíduo compreendendo detecção donível de uma quantidade eficaz de um ou mais,preferivelmente dois ou mais DBRISKMARKERS selecionados dogrupo consistindo nos DBRISKMARKERS 1-260 em uma primeiraamostra do indivíduo, em um primeiro período de tempo;detecção do nível de uma quantidade eficaz de um ou mais,preferivelmente dois ou mais DBRISKMARKERS em uma segundaamostra do indivíduo, em um segundo período de tempo; e comparação do nível de quantidade eficaz de um ou mais (oudois ou mais) DBRISKMARKERS detectados na etapa (a) comrelação à quantidade detectada na etapa (b), ou com relaçãoa um valor de referência.

O indivíduo pode ser um que tenha sido tratado anteriormente do Diabetes Melito ou da condição pré-diabética. 0 indivíduo pode também ser um que não foidiagnosticado anteriormente ou identificado como sofrendode tolerância à glicose comprometida ou sofrendo doDiabetes Melito ou da condição pré-diabética. Alternativamente, o indivíduo pode ser assintomático quantoa tolerância à glicose comprometida ou é assintomático aoDiabetes Melito ou a condição pré-diabética.

Ainda em outro aspecto, é provido um método com umnível predeterminado de prognóstico para monitoramento daeficácia do tratamento para Diabetes Melito ou uma condiçãopré-diabética compreendendo detecção do nível de umaquantidade eficaz de um ou mais, preferivelmente dois oumais DBRISKMARKERS selecionados do grupo consistindo nosDBRISKMARKERS 1-260 em uma primeira amostra do indivíduo,em um primeiro período de tempo; detecção do nível de umaquantidade eficaz de um ou mais, preferivelmente dois oumais DBRISKMARKERS em uma segunda amostra do indivíduo, emum segundo período de tempo; e comparação do nível dequantidade eficaz de um ou mais (ou dois ou mais)DBRISKMARKERS detectados na etapa (a) com relação àquantidade detectada na etapa (b) , ou com relação a umvalor de referência, onde a eficácia do tratamento émonitorada por uma alteração no nível de quantidade eficazde um ou mais, pref erivelmente dois ou mais DBRISKMARKERS do indivíduo.

Em uma concretização, o tratamento do Diabetes Melitoou da condição pré-diabética compreende regimes deexercício, suplementos da dieta, agentes terapêuticos,intervenção cirúrgica, e agentes profiláticos. Em outraconcretização, o valor de referência ê derivado de um oumais indivíduos que mostram uma melhora nos fatores derisco do Diabetes como resultado de um ou mais tratamentosdo Diabetes Melito ou da condição pré-diabética. A eficáciado tratamento pode ser adicionalmente monitorada pordetecção de alterações no índice de massa corpórea (BMI),níveis de insulina, níveis de glicose no sangue, Níveis deHDL, pressão sangüínea sistólica e/ou diastólica, oucombinações dos mesmos. As alterações nos níveis de glicoseno sangue pode ser detectadas por um teste oral detolerância à glicose.

Outro aspecto da presente invenção provê um método comum nível predeterminado de prognóstico para seleção de umregime de tratamento para um indivíduo diagnosticado ou emrisco de sofrer de Diabetes Melito ou uma condição pré-diabética compreendendo detecção do nível de uma quantidadeeficaz de um ou mais, pref erivelmente dois ou maisDBRISKMARKERS selecionados do grupo consistindo nosDBRISKMARKERS 1-260 em uma primeira amostra do indivíduo,em um primeiro período de tempo; opcionalmente detectando onível de uma quantidade eficaz de um ou mais,pref erivelmente dois ou mais DBRISKMARKERS, em uma segundaamostra do indivíduo, em um segundo período de tempo; ecomparação do nível de quantidade eficaz de um ou mais (oudois ou mais) DBRISKMARKERS detectados na etapa (a) comrelação a um valor de referência, ou opcionalmente, comrelação à quantidade detectada na etapa (b).

A presente invenção também provê um perfil deexpressão de referência do Diabetes Melito, compreendendoum padrão de níveis de marcador de uma quantidade eficaz deum ou mais, pref erivelmente dois ou mais marcadoresselecionados do grupo consistindo nos DBRISKMARKERS 1-260,retirados de um ou mais indivíduos que não sofrem de oDiabetes Melito.

Um perfil de expressão de referência de tolerância àglicose comprometida também é provido pela invenção,compreendendo um padrão de níveis de marcador de umaquantidade eficaz de um ou mais, pref erivelmente dois oumais marcadores selecionados do grupo consistindo nosDBRISKMARKERS 1-260, retirados de um ou mais indivíduos quenão sofrem de tolerância à glicose comprometida.

Em outro aspecto, é provido um perfil de expressão doindivíduo do Diabetes Melito, compreendendo um padrão deníveis de marcador de uma quantidade eficaz de um ou mais,preferivelmente dois ou mais marcadores selecionados dogrupo consistindo nos DBRISKMARKERS 1-260 retirados de umou mais indivíduos que sofrem do Diabetes Melito, correm orisco de desenvolver o Diabetes Melito, ou estão sendotratados do Diabetes Melito.Em outro aspecto, é provido um perfil de expressão doindivíduo de tolerância à glicose comprometida,compreendendo um padrão de níveis de marcador de umaquantidade eficaz de um ou mais, preferivelmente dois oumais marcadores selecionados do grupo consistindo nosDBRISKMARKERS 1-26 0 retirados de um ou mais indivíduos queapresentam tolerância à glicose comprometida, are correndorisco de desenvolver tolerância à glicose comprometida, ouestão sendo tratados da tolerância à glicose comprometida.A presente invenção também provê um kit compreendendovários reagentes de detecção de DBRISKMARKER que detectamos DBRISKMARKERS correspondentes selecionados do grupoconsistindo nos DBRISKMARKERS 1-260, suficientes para geraros perfis da invenção. Um reagente de detecção podecompreender um ou mais anticorpos ou fragmentos dos mesmos.Alternativa ou adicionalmente, um reagente de detecção podecompreender um ou mais oligonucleotídeos ou um ou maisaptâmeros.A presente invenção também provê, em outro aspecto, ameio que pode ser lido por máquina contendo um ou maisperfis de expressão de referência do Diabetes Melito deacordo com a invenção, ou um ou mais perfis de expressão doindivíduo do Diabetes Melito de acordo com a invenção, eopcionalmente, resultados de teste adicionais e informaçõesdo indivíduo.Também é contemplado um meio que pode ser lido pormáquina contendo um ou mais perfis de expressão dereferência de tolerância à glicose comprometida, de acordocom a invenção ou um ou mais perfis de expressão doindivíduo de tolerância à glicose comprometida de acordocom a invenção, e opcionalmente, resultados de testeadicionais e informações do indivíduo.

Em outro aspecto, é provido um painel de DBRISKMARKERcompreendendo um ou mais DBRISKMARKERS que são indicativosde uma via fisiológica e/ou bioquímica associada aoDiabetes Melito ou uma condição pré-diabética. Em umaconcretização, as vias fisiológicas e bioquímicascompreendem regulação autoimune, função de inflamação eendotelial (incluindo interações do receptor de citocina-citocina, moléculas de adesão celular (CAMs), adesõesfocais, migração transendotelial de leucócito,citotoxicidade mediada por célula Natural Killer, regulaçãodo citoesqueleto da actina, junções de aderência/firme/deintervalo, e interação de receptor de matriz extracelular(ECM)), desenvolvimento e manutenção de adipócito(incluindo adipocitocinas, ciclo celular, apoptose einteração de receptor de ligante neuroativo), bem comolinhagem celular hematopoiética, cascatas complementares ede coagulação, vias de sinalização celular intra eextracelular (incluindo mTOR, TGF-β, MAPK, insulina, GnRH,receptor semelhante a Toll, Jak-STAT, PPAR, receptor decélula T, receptor de célula B, FceRI, cálcio, Wnt e viasde sinalização VEGF e outros mecanismos de comunicaçãocelular) , além daquelas vias que são geralmente associadasao Diabetes Melito do tipo 1 e tipo 2.

Também é provido um painel de DBRISKMARKERcompreendendo um ou mais DBRISKMARKERS que são indicativosde um sítio associado ao Diabetes Melito ou uma condiçãopré-diabética, onde o sitio pode compreender células beta,células endoteliais, esqueletais e músculo liso ou artériasperiféricas, cardiovasculares ou cerebrovasculares.

Em outros aspectos, também é provido um painel deDBRISKMARKER compreendendo um ou mais DBRISKMARKERS que sãoindicativos da progressão do Diabetes Melito ou condiçãopré-diabética.

A presente invenção provê, adicionalmente, um painelde DBRISKMARKER compreendendo um ou mais DBRISKMARKERS quesão indicativos da velocidade de progressão do DiabetesMelito ou uma condição pré-diabética. A invenção também serefere a um painel de DBRISKMARKER compreendendo um ou maisDBRISKMARKERS que são específicos a um ou mais tipos doDiabetes Melito e um painel de DBRISKMARKER compreendendoum ou mais DBRISKMARKERS que são específicos a uma condiçãopré-diabética.

É provido um painel de DBRISKMARKER compreendendo umou mais DBRISKMARKERS selecionados de algoritmos declassificação matemática e abordagem de análise de fator,utilizando um coorte passado relevante de indivíduos ouíndices calculados que foram desenvolvidos em tais coortespassados. Especificamente, um painel de DBRISKMARKER de umou mais, preferivelmente dois ou mais DBRISKMARKERSselecionados de um subconjunto dos DBRISKMARKERS reveladoscompreendendo Leptina (LEP), Haptoglobina (HP), proteína 3de ligação do fator de crescimento semelhante a insulina(ILGFBP3) , Resistina (RETN) , Metalopeptidase de Matriz(MMP-2), enzima de conversão em Angiotensina I (peptidildipeptidase A) -I (ACE) , componente complementar 4A (gruposangüíneo de Rogers) (C4A) , molécula CD 14 (CD 14) ,selectina E (molécula de adesão endotelial)(SELE), fator 1de estimulação de colônia (macrófago) (CSFl), e fator decrescimento endotelial vascular (VEGF), proteína reativa c,(CRP) relacionado à pentraxina, Elemento IA da Superfamíliado Receptor de Fator de Necrose de Tumor (TNFRSFIA), RAGE(Receptor específico do produto final de glicosilaçãoavançada) [AGER]) , CD26 (dipeptidil peptidase 4; DPP4) , eseus equivalentes estatísticos e/ou funcionais dentro dosalgoritmos de classificação matemática usando um ou maisdesses DBRISKMARKERS.

Um método para tratamento de um ou mais indivíduoscorrendo risco de desenvolver Diabetes Melito ou umacondição pré-diabética também é contemplado pela presenteinvenção, compreendendo detecção da presença de níveisaumentados de pelo menos um, preferivelmente doisDBRISKMARKERS diferentes presentes em uma amostra de um oumais indivíduos; e tratamento de um ou mais indivíduos comum ou mais fármacos moduladores do diabetes até os níveisalterados de pelo menos um, pref erivelmente dos doisDBRISKMARKERS diferentes retornarem ao valor de linha debase medido em um ou mais indivíduos com risco baixo dedesenvolver Diabetes Melito ou a condição pré-diabética, ouum valor de linha de base medido em um ou mais indivíduosque mostram aperfeiçoamentos nos marcadores de risco dodiabetes como resultado do tratamento com um ou maisfármacos moduladores do diabetes.

Os fármacos moduladores do diabetes podem compreendersulfoniluréias; biguanidas; insulina, análogos de insulina;agonistas do receptor-γ ativados pelo proliferador deperoximsoma (PPAR-γ) ; agonistas de PPAR de ação dupla,secretogogos de insulina; análogos ao peptídeo-1 semelhanteao glucagon (GLP-I); inibidores de dipeptidil peptidase IV(DPP4); inibidores de lipase pancreática; inibidores de a-glicosidase; e combinações dos mesmos. Em umaconcretização, os aperfeiçoamentos nos marcadores de riscodo diabetes como resultado do tratamento com um ou maisfármacos moduladores do diabetes compreendem uma redução noíndice de massa corpórea (BMI), uma redução nos níveis deglicose no sangue, um aumento nos níveis de insulina, umaumento nos níveis de HDL, uma redução na pressão sangüíneasistólica e/ou diastólica, ou combinações dos mesmos.Em outro aspecto, é provido um método para avaliar asalterações no risco de tolerância à glicose comprometida emum indivíduo diagnosticado ou correndo risco de desenvolvera condição pré-diabética, compreendendo detecção do nívelde uma quantidade eficaz de um ou mais, pref erivelmentedois ou mais DBRISKMARKERS selecionados do grupoconsistindo nos DBRISKMARKERS 1-260 em uma primeira amostrado indivíduo, ' em um primeiro período de tempo;opcionalmente detectando o nível de uma quantidade eficazde um ou mais, pref erivelmente dois ou mais DBRISKMARKERSem uma segunda amostra do indivíduo, em um segundo períodode tempo; e comparação do nível de quantidade eficaz de umou mais (ou dois ou mais) DBRISKMARKERS detectados na etapa(a) com relação a um valor de referência, ou opcionalmente,a quantidade na etapa (b).A presente invenção provê, adicionalmente, um métodopara diagnosticar diferentemente os estados de doençaassociados ao Diabetes Melito ou uma condição pré-diabéticaem um indivíduo compreendendo detecção do nível de umaquantidade eficaz de um ou mais, preferivelmente dois oumais DBRISKMARKERS selecionados do grupo consistindo nosDBRISKMARKERS 1-260 em uma amostra do indivíduo; ecomparação do nível de quantidade eficaz de um ou mais (oudois ou mais) DBRISKMARKERS detectados na etapa (a) comrelação ao perfil de expressão do indivíduo da doençaDiabetes Melito da invenção, com relação ao perfil deexpressão do indivíduo de tolerância à glicose comprometidada invenção ou com relação a um valor de referência.

Adicionalmente, em um método de diagnóstico ouidentificação de um indivíduo correndo risco de desenvolverdiabetes ou uma condição pré-diabética por análise dosfatores de risco do Diabetes, a presente invenção prove umaperfeiçoamento compreendendo medição do nível de umaquantidade eficaz de um ou mais, preferivelmente dois oumais DBRISKMARKERS selecionados do grupo consistindo nosDBRISKMARKERS 1-260 em uma amostra do indivíduo, e mediçãode uma alteração clinicamente significativa no nível de umou mais (ou dois ou mais) DBRISKMARKERS na amostra, onde aalteração indica um risco aumentado de desenvolvimento doDiabetes Melito ou uma condição pré-diabética no indivíduo.

Ainda em outro aspecto da presente invenção, em ummétodo de diagnóstico ou identificação de um indivíduocorrendo risco de desenvolver diabetes ou uma condição pré-diabética por análise dos fatores de risco do Diabetes, apresente invenção provê um aperfeiçoamento compreendendo:medição do nível de uma quantidade eficaz de um ou maisDBRISKMARKERS selecionados do grupo consistindo em: Leptina(LEP), Haptoglobina (HP), proteína 3 de ligação de fator decrescimento semelhante à insulina (ILGFBP3), Resistina(RETN), Metalopeptidase de Matriz (MMP-2), enzima deconversão em Angiotensina I (peptidil dipeptidase A)-I(ACE), componente complementar 4A (C4A), molécula CD 14 (CD14) , selectina E (SELE) , fator 1 de estimulação de colônia(macrófago) (CSFl), e fator de crescimento endotelialvascular (VEGF) , proteína reativa c, (CRP) relacionado àpentraxina, Elemento IA da Superfamília do Receptor deFator de Necrose de Tumor (TNFRSFIA) , RAGE (Receptor específico do produto final de glicosilação avançada)[AGER]) e CD2 6 (dipeptidil peptidase 4; DPP4) e medição deuma alteração clinicamente significativa no nível de um oumais DBRISKMARKERS na amostra, onde a alteração indica umrisco aumentado de desenvolvimento do Diabetes Melito ouuma condição pré-diabética no indivíduo.

Em um método de diagnóstico ou identificação de umindivíduo correndo risco de desenvolver diabetes ou umacondição pré-diabética por análise dos fatores de risco dodiabetes, a presente invenção provê um aperfeiçoamento compreendendo: medição do nível de uma quantidade eficaz dedois ou mais DBRI SKMARKERS selecionados do grupoconsistindo em: Leptina (LEP), Haptoglobina (HP) , proteína3 de ligação de fator de crescimento semelhante à insulina(ILGFBP3) , Resistina (RETN), Metalopeptidase de Matriz(MMP-2) , enzima de conversão em Angiotensina I (peptidildipeptidase A) - I (ACE) , componente complementar 4A (C4A) ,molécula CD 14 (CD 14) , selectina E (SELE) , fator 1 deestimulação de colônia (macrófago) (CSFl), e fator decrescimento endotelial vascular (VEGF), proteína reativa c,(CRP) relacionado à pentraxina, Elemento IA da Superfamíliado Receptor de Fator de Necrose de Tumor (TNFRSFIA), RAGE(Receptor específico do produto final de glicosilaçãoavançada) [AGER]) e CD26 (dipeptidil peptidase 4; DPP4) emedição de uma alteração clinicamente significativa no nivel dos dois ou mais DBRISKMARKERS na amostra, onde aalteração indica um risco aumentado de desenvolvimento doDiabetes Melito ou uma condição pré-diabética no indivíduo.

A menos que de outra forma definido, todos os termostécnicos e científicos empregados aqui possuem o mesmosignificado conforme geralmente entendido por um versado natécnica a qual essa invenção se relaciona. Embora métodos emateriais semelhantes ou equivalentes aos descritos aquipossam ser usados na prática da presente invenção, métodose materiais apropriados são descritos a seguir. Todas publicações, pedidos de patente, patentes e outrasreferências mencionadas aqui são expressamente incorporadascomo referência em sua totalidade. Nos casos de conflito, opresente relatório descritivo incluindo definiçõesprevalecerá. Além disso, os materiais, métodos e exemplosdescritos aqui são apenas ilustrativos e não sãolimitantes.

Outros aspectos e vantagens da invenção ficarão clarose são englobados pela descrição detalhada e reivindicaçõesque se seguem.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A descrição detalhada que se segue, fornecida comoexemplo, não pretende limitar a invenção às concretizaçõesespecíficas descritas, podendo ser entendida em conjuntocom as figuras anexas, incorporadas aqui como referência,onde:A figura 1 é um fluxograma ilustrando viasfisiológicas e biológicas do DBRISKMARKER além decategorias no contexto de progressão da doença do normal aopré-diabetes para o diabetes.

A figura 2 é uma ilustração mostrando classes ecaracterísticas desejáveis dos DBRISKMARKERS, e mostrandovários padrões ilustrativos diferentes dos marcadores quesão úteis no diagnóstico dos indivíduos sofrendo de pré-diabetes e diabetes, em comparação aos normais.

As figuras 3A-3RR são ilustrações gráficas das viasKEGG ressaltando três ou mais DBRISKMARKERS em cada viamostrada.

A figura 3A ilustra interações de receptor-liganteneuroativo.

A figura 3B ilustra interações do receptor citocina-citocina.

A figura 3C ilustra a via de sinalização deadipocitocina.

A figura 3D mostra a via de sinalização de cinase daproteína ativada por mitógeno (MAPK).

A figura 3E mostra a via de sinalização de insulina.

A figura 3F mostra a via do Diabetes Melito do tipoII.

A figura 3G ilustra a via de sinalização de apoptose.

A figura 3H ilustra as cascadas de complemento e decoagulação.

A figura 31 ilustra a via de sinalização Jak-STAT.

A figura 3J é uma representação da linhagem de célulahematopoiética.

A figura 3K mostra a via de sinalização PPAR.A figura 3L é a via de sinalização do receptorsemelhante a Toll.

A figura 3M mostra a via de sinalização do receptor decélula T.

A figura 3N ilustra a via de sinalização de adesãofocai.

A figura 30 mostra a via do Diabetes Melito do tipo I.

A figura 3P mostra a via de sinalização do câncerpancreático.

A figura 3Q ilustra a via de sinalização de mTOR.

A figura 3R mostra a via de sinalização de TFG-β.

A figura 3S mostra a via de sinalização de cálcio.

A figura 3T mostra a via de citotoxicidade mediada porcélula Natural Killer.

A figura 3U mostra a via de sinalização do receptor decélula B.

A figura 3V mostra a via de sinalização FceRI.

A figura 3W ilustra a via de migração transendotelialdo leucócito.

A figura 3X ilustra a via metabólica do ácidoaraquidônico.

A figura 3Y ilustra a via de sinalização Wnt.

A figura 3Z mostra a via de sinalização VEGF.

A figura 3AA ilustra as interações da molécula deadesão celular.

A figura 3BB é um esquema mostrando a regulação docitoesqueleto da actina.

A figura 3CC ilustra as interações relacionadas aoglioma.

A figura 3DD ilustra nicotinato e metabolismo danicotinamida.

A figura 3EE mostra a via de sinalização das junçõesde aderência.

A figura 3 FF é um esquema mostrando a via desinalização das junções firmes.

A figura 3GG ilustra as interações relacionadas aoprocessamento e apresentação do antígeno.

A figura 3HH ilustra interações relacionadas àpotencialização de longo prazo.

A figura 311 mostra a via de sinalização de GnRH.

A figura 3JJ mostra as interações relacionadas aocâncer coloretal.

A figura 3KK mostra as interações nas junçõescelulares.

A figura 3LL é um esquema mostrando as vias envolvidasnos transtornos neurodegenerativos.

A figura 3MM ilustra a via de sinalização do ciclocelular.

A figura 3NN mostra as interações de ECM-receptor.

A figura 300 mostra as interações envolvidas nosritmos circadianos.

A figura 3PP é um esquema mostrando as interaçõesenvolvidas na depressão de longo prazo.

A figura 3QQ ilustra as interações relacionadas à doença de Huntington.

A figura 3RR mostra as vias de sinalização envolvidasna infecção por Helicobacter pylori.

As figuras 4A-4F são listagens das vias KEGG comapenas um ou dois DBRISKMARKES dentro das mesmas.

As figuras 5A-5E são exemplos das características dedesempenho para classificação do pré-diabetes deDBRISKMARKES individuais, selecionados, conforme mostradona análise ANOVA dos marcadores entre amostras de pacientedos coortes normal, pré-diabetes e diabetes.

A figura 6 é um exemplo em forma de tabela ilustrandoas características adicionais de desempenho de ROC dospares de DBRISKMARKES na classificação do pré-diabetes decoortes normais onde está ausente o algoritmo matemáticoindicando a relação de sensibilidade aumentada ao custo daespecificidade reduzida.

A figura 7 é um gráfico ilustrando a alteração nodesempenho do algoritmo de classificação, conforme medidopor R2 versus o Risco de Conversão em Diabetes deReferência com as adição de múltiplos DBRISKMARKESutilizando um algoritmo de seleção a frente.

A figura 8 é um gráfico ilustrando um rendimentotridimensional das características de desempenho de todo oconjunto de três combinações de marcadores possíveis de umgrupo de 50 DBRISKMARKERS, ressaltando as combinações dedesempenho superiores.

A figura 9 é um histograma ilustrando a distribuiçãodo desempenho através de todo o conjunto de trêscombinadores de marcadores possíveis mostradas na figura 6.

A figura 10 é um agrupamento matemático e árvore declassificação mostrando a distância padronizada Euclidianados DBRISKMARKES mostrados na figura 6.

A figura 11 apresenta tabelas de DBRISKMARKESselecionados por oito Categorias de Posição para aconstrução dos painéis selecionando DBRISKMARKES de acordocom o método revelado aqui.A figura 12 é uma listagem de 25 painéis deDBRISKMARKES de alto desempenho usando três DBRISKMARKESselecionados das Categorias de Posição de acordo com ométodo revelado aqui. Os algoritmos lógicos de regressãousando os painéis tinham valores RA2 calculados variando de0,300 a 0,329 quando empregados nas amostras, no exemplodescrito e coorte de paciente não diabético.

A figura 13 é uma listagem de 25 painéis deDBRISKMARKES de alto desempenho usando oito DBRISKMARKESselecionados das Categorias de Posição de acordo com ométodo revelado aqui. Os algoritmos lógicos de regressãousando os painéis tinham valores RA2 calculados variando de0,310 a 0,475 quando empregados nas amostras, no exemplodescrito e coorte de paciente não diabético.

A figura 14 é uma listagem de 25 painéis deDBRISKMARKES de alto desempenho usando 18 DBRISKMARKESselecionados das Categorias de Posição de acordo com ométodo revelado aqui. Os algoritmos lógicos de regressãousando os painéis tinham valores RA2 calculados variando de0,523 a 0,6105 quando empregados nas amostras, no exemplodescrito e coorte de paciente não diabético.

A figura 15 é uma curva ROC do gráfico e asestatísticas AUC para os três, oito e dezoito painéisDBRISKMARKERS de desempenho mais alto, respectivamente,quando empregados nas amostras, no exemplo descrito e nocoorte de paciente não diabético.

A figura 16 é uma curva ROC e estatísticas AUCindicando os três marcadores de DBRISKMARKERS individuaisde desempenho mais alto relativos quando empregados nasamostras, no exemplo descrito e no coorte de paciente nãodiabético.A figura 17 é uma curva padrão demonstrando umresultado típico dos métodos da presente invenção. Uma vezque uma curva padrão de operação é demonstrada, o ensaio étipicamente aplicado às 24 amostras de soro para determinara distribuição normal do analisado alvo através dasamostras clínicas.A figura 18 ilustra um gráfico exemplificando os dadosde detecção de molécula simples através de 92 amostras para25 biomarcadores.DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃOA presente invenção se refere à identificação dosbiomarcadores associados ao indivíduos sofrendo de diabetesou uma condição pré-diabética, ou que estão predispostos adesenvolverem diabetes ou uma condição pré-diabética.Consequentemente, a presente invenção caracteriza osmétodos para identificação dos indivíduos que têmpredisposição ao desenvolvimento do diabetes ou umacondição pré-diabética, incluindo aqueles indivíduos quesão assintomáticos ao diabetes ou uma condição pré-diabética por detecção dos biomarcadores revelados aqui.Esses biomarcadores também são úteis para monitoramento dosindivíduos sofrendo tratamentos e terapias para o diabetesou condições pré-diabéticas e para seleção das terapias etratamentos que seriam eficazes nos indivíduos sofrendo dediabetes ou uma condição pré-diabética, onde a seleção e ouso de tais tratamentos e terapias torna lenta a progressãodo diabetes ou condições pré-diabéticas, ou retarda ouimpede substancialmente seu começo."Diabetes Melito" no contexto da presente invençãoengloba diabetes do tipo 1, ambos autoimune e idiopático ediabetes do tipo 2 (em conjunto, "Diabetes") . A WorldHealth Organization define o valor do diagnóstico daconcentração de glicose no plasma em jejum em 7,0 mmol/1(126 mg/dL) e acima para Diabetes Melito (sangue integral6,1 mmol/1 ou 110 mg/dl), ou nível de glicose em 2 horas >11,1 mmol/L (>200 mg/dL). Outros valores sugestivos ou queindicam alto risco de Diabetes Melito incluem pressãoarterial elevada > 140/90 mm Hg; triglicerídeos elevados noplasma (> 1,7 mmol/L; 150 mg/dL) e/ou colesterol HDL baixo(< 0,9 mmol/L, 35 mg/dL para os homens; < 1,0 mmol/L, 39mg/dL para mulheres); obesidade central (homens: razão decintura para quadris > 0,90; mulheres: razão de cinturapara quadris > 0,85) e/ou índice de massa corpórea superiora 30 kg/m2; microalbuminuria, onde a taxa de excreção dealbumina urinária > 2 0 μg/min ou taxa dealbumina:creatinina > 30 mg/g).

"Condição pré-diabética" se refere a um estadometabólico que é intermediário entre homeostase de glicosenormal e metabolismo e estados vistos no Diabetes Melitofranco. As condições pré-diabéticas incluem, sem limitação,Síndrome Metabólica ("Síndrome X"), Tolerância à glicosecomprometida (IGT), e Glicemia em jejum comprometida (IFG).IGT se refere às anormalidades pós-prandiais da regulaçãoda glicose, enquanto IFG se refere às anormalidades que sãomedidas em um estado de jejum. A World Health Organizationdefine os valores para IGF como uma concentração de glicoseno plasma em jejum de 6,1 mmol/L (100 mg/dL) ou superior(sangue integral 5,6 mmol/L; 100 mg/dL), porém inferior a7,0 mmol/L (126 mg/dL)(sangue integral 6,1 mmol/L; 110mg/dL). Síndrome Metabólica de acordo com os critérios doNational Cholesterol Education Program (NCEP) é descritacomo possuindo pelo menos três dentre os que se seguem:pressão sangüínea > 130/85 mm Hg; glicose no plasma emjejum > 6,1 mmol/L; circunferência da cintura > 102 cm(homens) ou > 88 cm (mulheres); triglicerídeos > 1,7mmol/L; e colesterol HDL < 1,0 mmol/L (homens) ou 1,3mmol/L (mulheres).

"Pré-Diabetes" no contexto da presente invenção indicao estado fisiológico, em um indivíduo ou população, depossuir uma taxa esperada superior à normal de conversão dadoença para diabetes Melito tipo 2 franco. Tal taxaesperada absoluta de conversão para diabetes tipo 2 franconas populações pré-diabéticas pode ser de até 1 porcento ou mais ao ano, e pref erivelmente de 2 porcento ao ano oumais. Isso também pode ser declarado em termos de um riscorelativo do normal entre quartis de risco ou como uma razãode probabilidade entre o biomarcador diferente eclassificações de índice, incluindo aquelas que vêm da invenção. A menos que de outra forma indicado e semlimitação, quando um diagnóstico positivo categórico depré-diabetes é declarado aqui, ele é definidoexperimentalmente pelo grupo de pacientes com uma razão deconversão esperada em diabetes do tipo 2 de dois porcento(2%) ao ano em relação aos 7 anos e meio vindouros, ouquinze porcento (15%) daqueles testados em um valor delimite fornecido (o corte clínico de pré-diabetesselecionado) . Quando uma medida contínua de risco deconversão de pré-diabetes é produzida, possuindo uma "condição pré-diabética", ela engloba qualquer taxa anualesperada de conversão acima daquela vista em uma referênciade população normal ou geral de prevalência normal nãoselecionada.

"Tolerância à glicose comprometida" (IGT) é definidacomo possuindo um nível de glicose no sangue que é superiorao normal, porém não alto o suficiente para serclassificado como Diabetes Melito. Um indivíduo com IGTterá níveis de glicose de duas horas de 140 a 199 mg/dL(7,8 a 11,0 mmol) no teste oral de tolerância à glicose de 75-g. Esses níveis de glicose estão acima do normal, porémabaixo do nível que é diagnosticado para o diabetes. Osindivíduos com tolerância à glicose comprometida ou glicoseem jejum comprometida correm risco significativo dedesenvolver diabetes e assim são um grupo alvo importante para a prevenção primária.

"Resistência à insulina" se refere a condição na qualas células do corpo se tornam resistentes aos efeitos dainsulina, isto é, a resposta normal a uma dada quantidadede insulina é reduzida. Como resultado, níveis maiores de insulina são necessários, de modo que a insulina exerçaseus efeitos.

"Níveis normais de glicose" é usadointercambiavelmente com o termo "normoglicêmico" e serefere a uma concentração de glicose no plasma venoso em jejum inferior a 6,1 mmol/L (110 mg/dL). Embora essaquantidade seja arbitrária, tais valores vêm sendoobservados em indivíduos com tolerância a glicose normalprovada, embora alguns possam sofrer de IGT conforme medidopor teste de tolerância à glicose oral (OGTT).

Duzentos e sessenta biomarcadores foram identificadoscomo possuindo presença ou níveis de concentração alteradosou modificados nos indivíduos que sofrem de diabetes ou queexibem sintomas característicos de uma condição pré-diabética ou sofrem de pré-diabetes (conforme definidoaqui), tais como aqueles indivíduos que são resistentes àinsulina, possuem função de célula beta alterada ou corremo risco de desenvolver diabetes com base nos parâmetrosclínicos ou fatores de risco conhecidos, tais como,histórico familiar de diabetes, baixo nível de atividade, dieta pobre, excesso de peso corpóreo (especialmente aoredor da cintura), idade superior a 45 anos, pressãosangüínea alta, níveis altos de triglicerídeos, colesterolHDL inferior a 35, tolerância à glicose comprometidaidentificada anteriormente, diabetes anterior durante agravidez ("Diabetes Melito gestacional") ou dar a luz a umbebê pesando mais de 4 kg e etnia.

Os biomarcadores e métodos da presente invençãopermitem a um versado na técnica identificar, diagnosticarou de outra forma avaliar aqueles indivíduos que não exibemquaisquer sintomas de diabetes ou uma condição pré-diabética, porém que não obstante podem correr o risco dedesenvolver diabetes ou experimentar sintomascaracterísticos de uma condição pré-diabética.

o termo "biomarcador" no contexto da presente invençãoengloba, sem limitação, proteínas, ácido nucléicos,polimorfismos de proteínas e ácido nucléicos, elementos,metabólitos, e outros analisados. Os biomarcadores tambémpodem incluir proteínas , mutadas ou ácidos nucléicosmutados. O termo "analisado" conforme empregado aqui, podesignificar qualquer substância a ser medida e pode englobareletrólitos e elementos, tais como, cálcio. Finalmente, osbiomarcadores também podem se referir aos marcadoresfisiológicos do não analisado do estado de saúde englobandooutras características clínicas, tais como, sem limitação,idade, etnia, pressão sangüínea diastólica e sistólica,índice de massa corpórea e taxa de batidas do coração.

Proteínas, ácidos nucléicos, polimorfismos emetabólitos cujos níveis são alterados nos indivíduos quesofrem de diabetes ou condição pré-diabética ou sãopredispostos a desenvolver diabetes ou uma condição pré-diabética são resumidos na Tabela 1 e são coletivamentereferidos aqui, entre outros, como "Proteínas associadas aorisco de diabetes", "polipeptídeos de DBRISKMARKER" ou"proteínas de DBRISKMARKER". Os ácidos nucléicoscorrespondentes codificando os polipeptídeos são referidoscomo "ácidos nucléicos associados ao risco de diabetes","genes associados ao risco de diabetes", "ácidos nucléicosde DBRISKMARKER" ou "genes de DBRISKMARKER". A menos que deoutra forma indicado, "DBRISKMARKER", "proteínas associadasao risco de diabetes", "ácidos nucléicos associados aorisco de diabetes" significam qualquer uma das seqüênciasreveladas aqui. Os metabólitos correspondentes dasproteínas ou ácidos nucléicos do DBRISKMARKER também podemser medidos, bem como quaisquer metabólitos marcadores derisco convencionais mencionados anteriormente, incluindo,sem limitação, metabólitos, tais como, sulfato dedesidroepiandrosterona (DHEAS); peptídeo c; cortisol;vitamina D3; 5-hidroxitriptamina (5-HT; serotonina) ;oxintomodulina; estrogênio; estradiol; e fator semelhanteàigitalis, aqui referidos como "metabólitos doDBRISKMARKER". Marcadores fisiológicos de não analisado doestado de saúde (por exemplo, tais como, idade, etnia,pressão sangüínea diastólica ou sistólica, índice de massacorpórea e outras medições de não analisados geralmenteusadas como fatores de risco convencionais) são referidascomo "fisiologia do DBRISKMARKER". Os índices calculadoscriados a partir de medições de combinação matemática deuma ou mais, preferivelmente duas ou mais das classes deDBRISKMARKERS mencionadas anteriormente são referidos como"índices do DBRISKMARKER". Proteínas, ácidos nucléicos,polimorfismos, proteínas mutadas e ácidos nucléicos mutadose outros analisados são, bem como medições fisiológicascomuns e índices, construídos de qualquer uma da entidadesprecedentes e estão incluídos na categoria ampla dos"DBRISKMARKERS".Um "indivíduo" no contexto da presente invenção épreferivelmente um mamífero. O mamífero pode ser um serhumano, primata não humano, camundongo, rato, cachorro,,gato, cavalo ou boi, porém não limitado a esses exemplos.Os mamíferos diferentes dos humanos podem servantajosamente usados como indivíduos que representammodelos de animais do Diabetes Melito ou condições do pré-diabetes. Um indivíduo pode ser macho ou fêmea. Umindivíduo pode ser um que tenha sido diagnosticadoanteriormente ou identificado como sofrendo de diabetes ouuma condição pré-diabética e opcionalmente já tenha sofridotratamento para diabetes ou condição pré-diabética.Alternativamente, um indivíduo pode também ser um que nãotenha sido diagnosticado anteriormente como sofrendo dediabetes ou uma condição pré-diabética. Por exemplo, umindivíduo pode ser um que apresente um ou mais fatores derisco do diabetes ou uma condição pré-diabética, ou umindivíduo que não apresente fatores de risco de diabetes ouum indivíduo que seja assintomático ao diabetes ou pré- diabetes. Um indivíduo pode também ser um que estejasofrendo ou corra risco de desenvolver o diabetes ou umacondição pré-diabética.

Uma "amostra" no contexto da presente invenção é umaamostra biológica isolada de um indivíduo e pode incluir, por exemplo, soro, plasma sangüíneo, células sangüíneas,células endoteliais, biópsias de tecidos, fluido linfático,fluido de ascite, fluido intersticial (também conhecidocomo "fluido extracelular" e engloba o fluido encontradonos espaços entre as células, incluindo, entre outros, fluido do sulco gengival), medula óssea, saliva ou urina.

Um ou mais, preferivelmente dois ou mais DBRISKMARKERSpodem ser detectados na prática da presente invenção. Porexemplo, dois (2) , cinco (5) , dez (10) , quinze (15) , vinte(20) , quarenta (40), cinqüenta (50) , setenta e cinco (75) , cem (100), cento e vinte cinco (125), cento e cinqüenta(150), cento e setenta e cinco (175), duzentos (200),duzentos e dez (210), duzentos e vinte (220), duzentos etrinta (230), duzentos e quarenta (240), duzentos ecinqüenta (250) ou mais DBRISKMARKERS podem ser detectados. Em alguns aspectos, todos 260 DBRISKMARKERS revelados aquipodem ser detectados. Faixas preferidas das quais o númerode DBRISKMARKERS pode ser detectado incluem faixaslimitadas por qualquer mínimo selecionado entre um e 260,especificamente dois, cinco, dez, vinte, cinqüenta,setenta e cinco, cem, cento e vinte cinco, cento ecinqüenta, cento e setenta e cinco, duzentos, duzentos edez, duzentos e vinte, duzentos e trinta, duzentos equarenta, duzentos e cinqüenta, emparelhados com qualquermáximo até o total conhecido de DBRISKMARKERS,especificamente cinco, dez, vinte, cinqüenta e setenta ecinco. Especificamente faixas preferidas incluem dois acinco (2-5) , dois a dez (2-10) , dois a cinqüenta (2-50) ,dois a setenta e cinco (2-75) , dois a cem (2-100) , cinco adez (5-10), cinco a vinte (5-20), cinco a cinqüenta (5-50),cinco a setenta e cinco (5-75) , cinco a cem (5-100) , dez avinte (10-20) , dez a cinqüenta (10-50) , dez a setenta ecinco (10-75) , dez a cem (10-100) , vinte a cinqüenta (20-50), vinte a setenta e cinco (20-75) , vinte a cem (20-100),cinqüenta a setenta e cinco (50-75), cinqüenta a cem (50-100) , cem a cento e vinte cinco (100-125) , cento e vintecinco a cento e cinqüenta (125-150), cento e cinqüenta acento e setenta e cinco (150-175), cento e setenta e cincoa duzentos (175-200), duzentos a duzentos e dez (200-210),duzentos e dez a duzentos e vinte (210-220), duzentos evinte a duzentos e trinta (220-230), duzentos e trinta aduzentos e quarenta (230-240), duzentos e quarenta aduzentos e cinqüenta (240-250), e duzentos e cinqüenta amais de duzentos e cinqüenta (250+).

Diagnóstico e Métodos de PrognósticoO risco de desenvolver diabetes ou pré-diabetes podeser detectado com um "nível predeterminado de prognóstico"por exame de uma "quantidade eficaz" de proteínas, ácidosnucléicos, polimorfismos, metabólitos, e outros analisadosdo DBRISKMARKER em uma amostra de teste (por exemplo, umaamostra derivada de indivíduo) e comparação da quantidadeeficaz em relação aos valores de referência ou de índice,freqüentemente utilizando algoritmos matemáticos, a fim deconter as informações dos resultados de múltiplosDBRISKMARKERS individuais em uma medição simples ou índice.

Os indivíduos identificados como sofrendo de riscoaumentado de diabetes ou uma condição pré-diabética podemopcionalmente ser selecionados para receberem regimes detratamento, tais como, administração de compostosprofiláticos ou terapêuticos, tais como, "fármacos de modulação do diabetes" conforme definidos aqui ouimplementação de regimes de tratamento ou suplementos dedieta para prevenir ou retardar o início do diabetes oupré-diabetes. A amostra isolada do indivíduo podecompreender, por exemplo, sangue, plasma, célulassangüíneas, células endoteliais, biópsias de tecidos,fluido linfático, soro, medula óssea, fluido de ascite,fluido intersticial (incluindo, por exemplo, fluido dosulco gengival), urina, saliva, ou outros fluidoscorpóreos.

A quantidade da proteína, ácido nucléico,polimorfismo, metabólito ou outro analisado do DBRISKMARKERpode ser medida em uma amostra de teste e comparada aonível de controle normal. 0 termo "nível de controlenormal", significa o nível de uma proteína, ácido nucléico,polimorfismo, metabólito, ou outro analisado ou fisiologiaou índices do DBRISKMARKER, tipicamente encontrada em umindivíduo que não sofre de diabetes ou uma condição pré-diabética e não está propenso a sofrer de diabetes ou umacondição pré-diabética, por exemplo, em relação às amostrascoletadas de indivíduos jovens que foram monitorados até aidade avançada quando foi verificado que eles nãodesenvolveram diabetes ou uma condição pré-diabética.Alternativamente, o nível de controle normal podesignificar o nível de uma proteína, ácido nucléico,polimorfismo, metabólito ou outro analisado deDBRISKMARKER, tipicamente encontrado em um indivíduosofrendo de diabetes ou uma condição pré-diabética. O nívelde controle normal pode ser uma faixa ou um índice.Alternativamente, o nível de controle normal pode ser umabase de dados de padrão de indivíduos testadosanteriormente. Uma alteração do nível na amostra derivadado indivíduo de uma proteína, ácido nucléico, polimorfismo,metabólito ou outro analisado de DBRISKMARKER em comparaçãoao nível de controle normal pode indicar que o indivíduosofre ou corre o risco de desenvolver diabetes ou umacondição pré-diabética. Em contraste, quando os métodos sãoaplicados profilaticamente, um nível semelhante comparadoao nível de controle normal na amostra derivada doindivíduo de uma proteína, ácido nucléico, polimorfismo,metabólito ou outro analisado de um DBRISKMARKER podeindicar que o indivíduo não sofre ou não corre o risco ouum baixo risco de desenvolver diabetes ou uma condição pré-diabética .A diferença no nível de DBRISKMARKERS é preferível eestatisticamente significativa. "Estatisticamentesignificativa" significa que a alteração é maior que aesperada de acontecer por chance única. A estatísticasignificativa pode ser determinada por qualquer métodoconhecido na arte. Por exemplo, a estatística significativaapode ser determinada por valor de ρ. O valor de ρ é umamedida de probabilidade de que uma diferença entre osgrupos durante um experimento aconteça por chance. (P(z >observado)) . Por exemplo, um valor de ρ de 0,01 significaque existe uma chance de 1 em 100 do resultado ter ocorridopor chance. Quanto menor o valor de p, maior aprobabilidade de que a diferença entre os grupos tenha sidocausada pelo tratamento. Uma alteração é estatisticamentesignificativa se o valor de ρ for de pelo menos 0,05.Preferivelmente, o valor de ρ é de 0,04, 0,03, 0,02, 0,01,0,005, 0,001 ou menos. Conforme citado a seguir, e semqualquer limitação da invenção, a obtenção da estatísticasignificativa geralmente, porém nem sempre requer que ascombinações dos vários DBRISKMARKERS sejam empregadas emconjunto nos painéis e combinadas com algoritmos matemáticos a fim de obter um índice de DBRISKMARKERestatisticamente significativo.

A "acurácia do diagnóstico" de um teste, ensaio oumétodo que se refere à capacidade do teste, ensaio oumétodo de distinguir entre os indivíduos sofrendo de diabetes ou uma condição pré-diabética ou correndo o riscode sofrer de diabetes ou uma condição pré-diabética, sebaseia no fato dos indivíduos apresentarem uma "presençaclinicamente significativa" ou uma "alteração clinicamentesignificativa" nos níveis de um DBRISKMARKER. "Presença clinicamente significativa" ou "alteração clinicamentesignificativa", significa que a presença do DBRISKMARKER(por exemplo, massa, tais como miligramas, nanogramas, oumassa por volume, tais como, miligramas por decilitro ounúmero de cópia de uma transcrição por volume unitário) ou uma alteração na presença do DBRISKMARKER no indivíduo(tipicamente em uma amostra do indivíduo) é maior que oponto de corte predeterminado (ou valor limite) para aqueleDBRISKMARKER e portanto, indica que o indivíduo sobre dediabetes ou uma condição pré-diabética, para a qual apresença suficientemente alta daquela proteína, ácidonucléico, polimorfismo, metabõlito ou analisado representaum marcador.

A presente invenção pode ser empregada para fabricarmedições categóricas ou contínuas do risco de conversão nodiabetes do tipo 2, assim diagnosticando uma categoria deindivíduos definidos como pré-diabéticos.

No cenário categórico, os métodos da presente invençãopodem ser usados para discriminar entre os coortes doindivíduo normais e pré-diabéticos. Nesse uso categórico dainvenção, os termos "alto grau de acurácia do diagnóstico"e "grau muito alto de acurácia do diagnóstico" se referemao teste ou ensaio para aquele DBRISKMARKER (ou índice deDBRISKMARKER; onde o valor do DBRISKMARKER engloba qualquermedição individual, se de um DBRISKMARKER simples ouderivada de um índice de DBRISKMARKERS) com um ponto decorte corretamente predeterminado (acuradamente) indicandoa presença ou ausência do pré-diabetes. Um teste perfeitoteria acurácia perfeita. Assim, para indivíduos que sofremde pré-diabetes, o teste indicaria apenas resultados deteste positivo e não reportaria aqueles indivíduos comosendo "negativos" (não haveriam "falsos negativos"). Emoutras palavras, a "sensibilidade" do teste (a razão deverdadeiro positivo) seria de 100%. Por outro lado, paraindivíduos que não sofrem de pré-diabetes, o testeindicaria apenas resultados de teste negativo e nãoreportaria qualquer daqueles indivíduos como sendo"positivos" (não haveriam "falsos positivos"). Em outraspalavras, a "especificidade" (a razão de verdadeironegativo) seria de 100%. Vide, por exemplo, O1Marcaigh AS,Jacobson RM, "Estimating The Predictive Value of aDiagnostic Test, How to Prevent Misleading or ConfusingResults," Clin. Ped. 1993, 32 (8) :485-491, que discute aespecificidade, sensibilidade e valores previsíveispositivos e negativos de um teste, por exemplo, um teste diagnóstico clínico. Em outras concretizações, a presenteinvenção pode ser empregada, de modo a discriminar o pré-diabetes do diabetes ou o diabetes do normal. Tal empregopode requerer um painel de DBRISKMARKER diferente,algoritmo matemático e/ou ponto de corte, porém estandosujeito às mesmas medições mencionadas anteriormente deacurácia de diagnóstico para o uso pretendido.

No diagnóstico categórico de uma doença, a alteraçãodo ponto de corte ou valor limite de um teste (ou ensaio)geralmente altera a sensibilidade e especificidade, porém em uma relação qualitativamente inversa. Por exemplo, se oponto de corte for diminuído, mais indivíduos na populaçãotestada terão, tipicamente os resultados de testesuperiores ao ponto de corte ou valor limite. Uma vez queos indivíduos com resultados de teste acima do ponto de corte são reportados como sofrendo da doença, condição ousíndrome para a qual o teste é conduzido, a diminuição doponto de corte fará com que mais indivíduos sejamreportados como possuindo resultados positivos (porexemplo, como se eles sofressem de diabetes, pré-diabetesou uma condição pré-diabética). Assim, uma proporção maiordaqueles indivíduos seria diagnosticada, pelo teste, comosofrendo de diabetes ou pré-diabetes. Consequentemente, aomesmo tempo, haverão mais falsos positivos uma vez que amaior parte das pessoas que não sofrem da doença, condiçãoou slndrome (por exemplo, pessoas que são verdadeiros"negativos") serão indicadas pelo teste como possuindovalores de DBRISKMARKER acima do ponto de corte e,portanto, serão reportados como positivos (por exemplo,como sofrendo da doença, condição ou síndrome) ao invés deserem corretamente indicados pelo teste como sendonegativos. Consequentemente, a especificidade (razão deverdadeiro negativo) do teste será diminuída. De modosemelhante, a elevação do ponto de corte tenderá a diminuira sensibilidade e aumentar a especificidade. Portanto, naavaliação da acurácia e utilidade de um teste medidoproposto, ensaio ou método para avaliar uma condição doindivíduo, deve-se levar sempre em consideração asensibilidade e a especificidade e ter em mente o que oponto de corte é, no qual a sensibilidade e a especificidade estão sendo reportadas porque asensibilidade e a especificidade podem variarsignificativamente acima da faixa dos pontos de corte.

Existe, contudo, um indicador que permite arepresentação da sensibilidade e especificidade de um teste, ensaio ou método em relação a toda a faixa de pontosde corte do teste (ou ensaio) com apenas um valor simples.Aquele indicador é derivado de uma curva dasCaracterísticas Operacionais do Receptor ("ROC") para oteste, ensaio ou método em questão. Vide, por exemplo, Shultz, "Clinicai Interpretation of Laboratory Procedures,"capítulo 14 em Teitz, Fundamentais of Clinicai Chemistry,Burtis and Ashwood (eds.), 4a edição 1996, W.B. SaundersCompany, páginas 192-199; e Zweig e outros, "ROC CurveAnalysis: An Example Showing The Relationships Among SoroLipid And Apolipoprotein Concentrations In IdentifyingSubjects With Coronory Artery Disease," Clin. Chem., 1992,38(8): 1425-1428.

Uma curva ROC é um gráfico x-y da sensibilidade noeixo geométrico y, em uma escala de zero a um (por exemplo,100%), contra um valor igual a um mínimo da especificidadeno eixo geométrico x, em uma escala de zero a um (porexemplo, 100%) . Em outras palavras, esse é um gráfico dataxa de verdadeiro positivo contra a taxa de falso positivopara aquele teste, ensaio ou método. Para construir a curvaROC para o teste, ensaio ou método em questão, osindivíduos podem ser avaliados usando um métodoperfeitamente acurado ou "padrão ouro" que sejaindependente do teste, ensaio ou método em questão, paradeterminar se os indivíduos são verdadeiramente positivosou negativos para a doença, condição ou síndrome (porexemplo, angiografia coronária é um bom teste de padrãoouro para a presença de aterosclerose coronária). Osindivíduos podem também ser testados usando o teste, ensaioou método em questão e para variação dos pontos de corte,os indivíduos sendo reportados como sendo positivos ounegativos de acordo com o teste, ensaio ou método. Asensibilidade (taxa de verdadeiro positivo) e o valor iguala um mínimo da especificidade (o valor se igualando aofalso positivo) são determinados para cada ponto de corte ecada par de valores x-y é colocado em gráfico como um pontosimples no diagrama x-y. A "curva" conectando aquelespontos é a curva ROC.A curva ROC é freqüentemente usada a fim de determinaro corte clínico simples ótimo ou valor de limite detratamento, onde a sensibilidade e a especificidade sãomaximizadas; tal situação representa o ponto na curva ROCque descreve o canto esquerdo superior do retângulo maiorsimples que pode ser desejado sob a curva.A área total sob a curva ("AUC") é o indicador de quepermite a representação da sensibilidade e especificidadede um teste, ensaio ou método em relação à faixa total depontos de corte com um valor simples. A máxima AUC é uma(um teste perfeito) e a área mínima é uma metade (porexemplo, a área onde não existe discriminação da doençaversus normal) . Quanto mais próximo a AUC estiver de um,melhor a acurácia do teste. Deve ser observado queimplícita em toda ROC e AUC está a definição da doença e ohorizonte de tempo pós teste de interesse.Um "alto grau de acurácia diagnostica" significa umteste ou ensaio (tal como o teste da invenção paradeterminar a presença clinicamente significativa dosDBRISKMARKERS, pelo que indicando a presença do diabetes ouuma condição pré-diabética) onde a AUC (área sob a curvaROC para o teste ou ensaio) ê pelo menos de 0,70,desejavelmente pelo menos 0,75, mais desejavelmente pelomenos 0,80, preferivelmente pelo menos 0,85, maispref erivelmente pelo menos 0,90 e mais pref erivelmente pelomenos 0,95.Um "grau muito alto de acurácia diagnostica" significaum teste ou ensaio, onde a AUC (área sob a curva ROC para oteste ou ensaio) é pelo menos de 0,80, desejavelmente pelomenos 0,85, mais desejavelmente pelo menos 0,875,preferivelmente pelo menos de 0,90, mais preferivelmentepelo menos 0,925 e mais preferivelmente de pelo menos 0,95.

Alternativamente, em populações testadas ondeprevalece uma baixa incidência da doença (definidas comoaquelas com menos de 1% de taxa de ocorrências por ano) ,ROC e AUC podem ser mal conduzidas como de utilidadeclínica para um teste e taxas de risco absolutas ourelativas, conforme definidas aqui nessa revelação, podemser empregadas para determinar o grau de acuráciadiagnostica. As populações de indivíduos a serem testadastambém podem ser categorizadas em quartis, onde o quartilsuperior (25% da população) compreende o grupo deindivíduos com o risco relativo mais alto de desenvolver ousofrer de diabetes ou uma condição pré-diabética e oquartil inferior compreendendo o grupo de indivíduospossuindo o risco relativo mais baixo de desenvolverdiabetes ou uma condição pré-diabética. De modo geral, osvalores derivados dos testes ou ensaios possuindo mais de 2vezes e meia o risco relativo do quartil superior para oinferior em uma população com baixa incidência sãoconsiderados como tendo um "alto grau de acuráciadiagnostica" e aqueles com cinco a sete vezes o riscorelativo para cada quartil são considerados como tendo umgrau muito alto de acurácia diagnostica. Não obstante, osvalores derivados dos testes ou ensaios possuindo apenas1,2 ou 2 e meia vezes o risco relativo para cada quartil,permanecem clinicamente úteis sendo amplamente usados emfatores de risco para uma doença; esse é o caso comcolesterol total e para muitos marcadores inflamatórios comrelação a sua previsão de eventos cardiovasculares futuros.

0 valor previsto de qualquer teste depende dasensibilidade e especificidade do teste e da prevalência dacondição da população sendo testada. Essa noção, com baseno teorema de Bayes, provê que, quanto maior aprobabilidade daquela condição a ser classificada estiverpresente em um indivíduo ou na população (probabilidade dopré-teste) , maior a validade de um teste positivo e maior aprobabilidade de que o resultado seja um verdadeiropositivo. Assim, o problema com o emprego de um teste emqualquer população onde exista uma baixa probabilidade dacondição estar presente é que um resultado positivo possuivalor limitado (isto é, mais provável de ser um falsopositivo) . De modo semelhante, nas populações com um riscomuito alto, um resultado de teste negativo é mais provávelde ser um falso negativo. Quando se define o grau deacurácia diagnostica, isto é, pontos de corte em uma curvaROC7 se define um valor de AUC aceitável e se determina asfaixas aceitáveis na concentração relativa do que constituiuma quantidade eficaz dos DBRISKMARKERS da invenção, issopermite que um versado na técnica empregue os DBRISKMARKERSpara diagnosticar ou identificar os indivíduos com um nívelpredeterminado de previsibilidade.

Métodos alternativos para determinar a acuráciadiagnótica devem ser empregados com medições de riscocontínuas, que são geralmente empregadas quanto umacategoria de doença ou categoria de risco (tal como, pré-diabetes) ainda não foi claramente definida pelas sociedades médicas relevantes e prática da medicina."Risco" no contexto da presente invenção podesignificar risco "absoluto", que se refere àquelaporcentagem de probabilidade de um evento ocorrer por umperíodo de tempo específico. Risco absoluto pode ser medido com referência à cada observação real pós-medição para ocoorte de tempo relevante ou com referência aos valores deíndice desenvolvidos de coortes históricos estatisticamenteválidos que foram desenvolvidos por um período de temporelevante. Risco "relativo" se refere à razão de riscos absolutos de um risco de indivíduo, comparado a cada um doscoortes de risco baixo ou risco médio na população, quepode variar de acordo com os fatores de isco clínicos sendoavaliados. Taxas ímpares, a proporção de eventos positivospara eventos negativos para um dado resultado de teste, são também, de modo geral, usadas (ímpares estão de acordo coma fórmula p/(1-p) onde ρ é a probabilidade do evento e (1-p) é a probabilidade de não evento) para não conversão.Medidas contínuas alternativas que podem ser avaliadas nocontexto da presente invenção incluem tempo para conversão do diabetes e taxas terapêuticas de redução de risco deconversão em diabetes.

Para tais medições contínuas, as medições de acuráciade diagnóstico para um índice calculado se baseiam,tipicamente, nos ajustes da curva de regressão linear entreo valor contínuo previsto e os valores observados atuais(ou valor calculado de índice histórico) e utilizammedidas, tais como, R quadrado, valores ρ e intervalos deconfiança. Não é incomum para valores previstos usando taisalgoritmos serem reportados incluindo um intervalo de confiança (geralmente 90% ou 95% Cl) , com base nasprevisões históricas de coorte observadas, como no testepara risco de recorrência de câncer de mama no futurocomercializado pela Genomic Health (Redwood City,Califórnia).

O determinante final e o padrão ouro do riscoverdadeiro de conversão em diabetes é uma conversão real emuma população suficientemente grande e observado peloperíodo de tempo reivindicado. Contudo, isso representa umproblema, uma vez que é necessariamente um ponto de vistaretrospectivo, que surge após qualquer oportunidade paraintervenções preventivas. Como resultado, os indivíduossofrendo ou que correm o risco de desenvolver diabetes ouuma condição pré-diabética são geralmente diagnosticados ouidentificados por métodos conhecidos na arte, e o riscofuturo é estimado com base no histórico de experiências eestudos de registro. Tais métodos incluem, porém não estãolimitados à medição da pressão sistólica e diastólica,medições do índice de massa corpórea, determinação in vitrodo colesterol total, LDL, HDL, insulina e níveis de glicosedas amostras sangüíneas, testes orais de tolerância àglicose, testes de estresse, medição da proteína reativa Cno soro humano (hsCRP) , eletrocardiograma (ECG) , níveis depeptídeo c, anticorpos antiinsulina, anticorpos anticélulasbeta e hemoglobina glicosilada (HbAic) . Adicionalmente,qualquer um dos métodos mencionados anteriormente pode serusado separadamente ou em combinação para avaliar se umindivíduo mostrou "aperfeiçoamento os fatores de risco dodiabetes". Tais aperfeiçoamentos incluem, sem limitação,uma redução no índice de massa corpórea (BMI), uma reduçãonos níveis de glicose no sangue, um aumento nos níveis deHDL, uma redução na pressão sistólica e/ou diastólica, umaumento nos níveis de insulina ou combinações dos mesmos.

0 teste oral de tolerância à glicose (OGTT) éempregado principalmente para diagnóstico do DiabetesMelito ou condições pré-diabéticas, quando os níveis deglicose no sangue são equívocos, durante a gravidez ou emestudos de epidemiologia (Definição, Diagnóstico eClassificação do Diabetes Melito e suas Complicações, Parte1, World Health Organization, 1999) . O OGTT seriaadministrado pela manhã, após pelo menos 3 dias de dietanão restrita (mais de 15 0 g de carboidratos diariamente) eatividade física comum. Uma refeição contendo um teor decarboidratos razoável (30-50 g) seria consumida na noiteanterior ao teste. 0 teste seria precedido por um jejum de8-14 horas durante a noite, quando água pode ser consumida.Após a coleta da amostra de sangue em jejum, o indivíduobeberia 75 g de glicose anidra ou 82,5 g de monoidrato deglicose em 250-300 mL de água por um período de 5 minutos.Para as crianças, a carga de teste seria de 1,75 g deglicose por kg de peso corpóreo até um total de 75 g deglicose. 0 período de tempo do teste é contato a partir docomeço da ingestão. As amostras de sangue devem sercoletadas 2 horas após a carga do teste. Conforme observadoanteriormente, um diagnóstico de tolerância à glicose comprometida (IGT) seria observado como sendo apenas 50%sensível, com uma taxa de >10% de falso positivo, para umaconversão em diabetes em 7 anos e meio, quando usado nospontos de corte WHO. Isso representa um problemasignificativo para a utilidade clínica do teste, uma vez que mesmo grupos étnicos com risco relativamente altopossuem apenas uma taxa de 10% de conversão em diabetes emtal período de tempo, a menos que de outra formaenriquecidos por outros fatores de risco; em uma populaçãogeral não selecionada, a taxa de conversão em tais períodossendo estimada tipicamente em 5-6% ou menos de 1%anualmente.

Outros métodos para medir a glicose no sangue incluemmétodos reduciométricos conhecidos na técnica, tais como,porém não limitados ao método de Somogyi-Nelson, métodosempregando hexocinase e glicose desidrogenase, elétrodosimobilizados de glicose oxidase, o método de o-toluidina, ométodo de ferricianeto e o método auto-analisador deneocuprina. Os valores de glicose integral no sangue sãogeralmente cerca de 15% inferiores aos valores no plasmacorrespondentes em pacientes com uma leitura de hematócritonormal e valores arteriais são geralmente 7% maiores emrelação aos valores venosos correspondentes. Os indivíduosque usam insulina são freqüentemente solicitados a realizarum "perfil glicêmico" por medição própria da glicose nosangue em períodos de tempo específicos do dia. Um "perfilde ponto 7" é útil, com amostras retiradas antes e 90minutos após cada refeição, e imediatamente antes dedormir.

Um indivíduo que sofre ou corre o risco de desenvolverdiabetes ou uma condição pré-diabética pode também sofrerou correr o risco de desenvolver doença arteriovascular,hipertensão ou obesidade. 0 diabetes do tipo 2especificamente e a doença arteriovascular possuem muitosfatores de risco em comum, e muitos desses fatores de riscoestão geralmente relacionados entre si. As relações entreesses fatores de risco podem ser atribuídas a um pequenonúmero de fenômenos fisiológicos, talvez mesmo um fenômenosimples. Os indivíduos que sofrem ou correm o risco dedesenvolver diabetes, doença arteriovascular, hipertensãoou obesidade são indicados pelos métodos conhecidos naarte. Por exemplo, o diabetes é freqüentementediagnosticado por medição dos níveis de glicose ou insulinano sangue em jejum. Os níveis de glicose em adultos normaissão 60-126 mg/dl. Os níveis de insulina normais são de 7 mU/mL ± 3 mU. 0 risco de doença arteriovascular pode tambémser diagnosticado por medição dos níveis de colesterol. Porexemplo, o colesterol LDL acima de 137 ou o colesteroltotal acima de 200 é indicativo de um risco maior de doençaarteriovascular. A obesidade é diagnosticada, por exemplo, por índice de massa corpórea. O índice de massa corpórea(BMI) é medido (kg/m2 (ou libra/polegada2 χ 704,5)).Alternativamente, a circunferência da cintura (estima adistribuição da gordura), razão de cintura para quadril(estima a distribuição da gordura), espessura da dobra da pele (se medida em vários sítios, estima a distribuição dagordura) , ou bioimpedância (com base no princípio de quemassa magra conduz melhor corrente em relação à massa gorda(isto é, a massa de gordura impede a corrente), estima aporcentagem de gordura) é medida. Os parâmetros paraindivíduos normais, acima do peso ou obesos são como sesegue: abaixo do peso: BMI < 18,5; Normais BMI de 18,5 a24,9; acima do peso: BMI = 25 a 29,9. Os indivíduos acimado peso são caracterizados como possuindo umacircunferência de cintura > 94 cm para os homens ou > 8 0 cm para mulheres e razões de cintura para quadris de > 0,95 emhomens e > 0,8 0 nas mulheres. Indivíduos obesos sãocaracterizados como possuindo um BMI de 30 a 34,9, sendosuperior a 2 0% acima do peso "normal" para altura,possuindo uma porcentagem de gordura corpórea > 3 0% paramulheres e 25% para os homens e com uma circunferência decintura > 102 cm para os homens ou 88 cm para mulheres.Indivíduos com obesidade grave ou mórbida sãocaracterizados como possuindo um BMI > 35. Em razão dainter-relação entre o diabetes e doença arteriovascular,alguns ou todos os DBRISKMARKERS individuais e painéisDBRISKMARKER da presente invenção podem sobrepor ou seremenglobados pelos biomarcadores de doença arteriovascular ena realidade, podem ser úteis no diagnóstico do risco dedoença arteriovascular.

A previsão de risco de Diabetes Melito ou uma condiçãopré-diabética pode também englobar algoritmos de previsãode risco e índices computados que avaliam e estimam o riscoabsoluto do indivíduo de desenvolver diabetes ou umacondição pré-diabética com referência a um coorte dehistórico. A avaliação do risco empregando tais algoritmosmatemáticos previstos e índices computados vem sendoincorporada crescentemente aos índices para diagnóstico deteste e tratamento e englobam índices obtidos e validados,entre outros, com amostras de múltiplos estágios,estratifiçadas de uma população representativa. Váriosfatores de risco de diabetes convencionais são incorporadasaos modelos de previsão. Um exemplo notável de taisalgoritmos inclui o Framingham Heart Study (Kannel, W.B., eoutros, (1976) Am. J. Cardiol. 38: 46-51) e modificações doEstudo de Framingham, tais como o National CholesterolEducation Program Expert Panei on Detection, Evaluation,and Treatment of High Blood Cholesterol in Adults (AdultTreatment Panei III), também conhecido como NCEP/ATP III,que incorpora a idade do paciente, concentração total docolesterol, concentração do colesterol HDL, estado defumante e pressão sistólica do sangue para estimar o riscode desenvolver doença arteriovascular em 10 anos em umapessoa, que é geralmente encontrado em indivíduos de sofremou que correm o risco de desenvolver Diabetes Melito ou umacondição pré-diabética. Foi verificado que o mesmoalgoritmo de Framingham prevê, modestamente, o risco dedesenvolver Diabetes Melito ou uma condição pré-diabética.Outros algoritmos de previsão de risco do diabetesincluem, sem limitação, San Antonio Heart Study (Stern,M. P. e outros, (1984) Am. J. Epidemiol. 120: 834-851;Stern, M.P. e outros, (1993) Diabetes 42:706-714; Burke,J.P. e outros, (1999) Arch. Intern. Med. 159: 1450-1456),Archimedes (Eddy, D.M. and Schlessinger, L. (2003) DiabetesCare 26(11): 3093-3101; Eddy, D.M. and Schlessinger, L.(2003) Diabetes Care 26(11): 3102-3110), o Finnish-basedDiabetes Risk Score (Lindstrom, J. and Tuomilehto, J.(2003) Diabetes Care 26(3): 725-731), e o Ely Study(Griffin, SJ. e outros, (2000) Diabetes Metab. Res. Rev.16: 164-171), o conteúdo dos mesmos sendo expressamenteincorporado aqui como referência.Arquimedes é um modelo matemático de diabetes quesimula o estado de doença pessoa-a-pessoa, objeto-a-objetoe compreende detalhes biológicos que são contínuos narealidade, tais como, sistemas de órgão pertinente, mais de50 variáveis biológicas interagindo continuamente e ossintomas maiores, testes, tratamentos e resultadosgeralmente associados ao diabetes.

Arquimedes inclui simultânea e interativamente muitasdoenças em uma fisiologia integrada e simples, permitindocorrelação aos aspectos, tais como, co-morbidez, síndromes,tratamentos e outros múltiplos efeitos. O modelo Arquimedesinclui diabetes e suas complicações, tais como, doença dasartérias coronárias, falência cardíaca congestiva e asma. 0modelo é escrito em equações diferenciais, empregando programação orientada por objeto e uma construçãodenominada "aspectos". O modelo compreende a anatomia de umindivíduo (todos os indivíduos simulados possuem órgãos,tais como, corações, fígados, pâncreas, tratosgastrointestinais, gordura, músculos, rins, olhos, membros, sistemas circulatórios, cérebros, pele e sistema nervosoperiférico) , os "aspectos" que determinam o curso da doençae representando fenômeno físico real (por exemplo, o númerode miligramas de glicose em um decilitro de plasma,fenômeno comportamental ou fenômeno conceituai (porexemplo, "progressão" do doença), fatores de risco,incidência e progressão da doença, metabolismo da glicose,sinais e testes, diagnóstico, sintomas, conseqüências dasaúde do metabolismo de glicose, tratamentos, complicações,mortes por diabetes e suas complicações, mortes por outrascausas, processos de cuidado e recursos do sistema médico.Para uma aplicação típica do modelo, existem milhares deindivíduos simulados, cada um com anatomia e fisiologiasimuladas, que obterão doenças simuladas, podendo cuidardas doenças em instalações de cuidado de saúde simuladas,sendo cuidadas por pessoal de saúde simulado em instalaçõessimuladas, fornecendo testes e tratados simulados e obtendoresultados simulados. Como na realidade, cada um dospacientes simulados é diferente, com características,fisiologias, comportamentos e respostas ao tratamento diferentes, tudo projetado para combinar com as variaçõesindividuais vistas na realidade.

O modelo é construído por desenvolvimento de umadescrição não quantitativa ou conceituai da biologia epatologia pertinentes - as variáveis e correlações,conforme elas são melhores entendidas com informaçõesatuais. Os estudos são então identificados, os mesmospertencendo às variáveis e relações e tipicamentecompreendem pesquisa básica, estudos epidemiológicos eestudos clínicos que os versados no campo identificam como as fundações de seu próprio entendimento da doença. Essasinformações são empregadas para desenvolver equaçõesdiferenciais que se relacionam às variáveis. Odesenvolvimento de qualquer equação especifica no modelo deArquimedes envolve a obtenção da forma e dos coeficientesque melhor se ajustam às informações disponíveis a cercadas variáveis, após o que as equações são programadas emuma linguagem orientada pelo objeto. Isso é seguido por umasérie de exercícios nos quais as partes do modelo sãotestadas e limpas, primeiro uma por vez e então em combinações apropriadas, usando entradas que possuem saídasconhecidas. Todo o modelo pode então ser usado para simularum experimento complexo, que demonstra não apenas as partesindividuais do modelo, porém também as conexões entre todasas partes. Os cálculos de Arquimedes são realizados usandotécnicas de computação distribuídas. Arquimedes foivalidado como uma representação realista da anatomia,patofisologia, tratamentos e resultados pertinentes aodiabetes e suas complicações (Eddy, D.M. and Schlessinger,L. (2003) Diabetes Care 26(11) 3102-3110).

A Classificação de Risco do Diabetes com Base na

Finlândia é projetada como uma ferramenta de classificaçãopara identificar os indivíduos que correm alto risco napopulação e para certificação crescente dos fatores derisco modificáveis e estudo de vida saudável. AClassificação de Risco do Diabetes foi determinada de umaamostra de população aleatória de homens e mulheresfinlandeses de 35 a 64 anos sem tratamento com fármacosanti-diabéticos na linha de base, e acompanhados por 10anos. Os coeficientes do modelo de regressão logísticomultivariado foram usados para avaliar cada categoriavariável de classificação. A Classificação de Risco doDiabetes compreende a soma dessas classificaçõesindividuais e é validada em um exame de populaçãoindependente realizado em 1992 com um acompanhamentoprospectivo por 5 anos. A idade, BMI, circunferência dacintura, histórico de tratamento anti-hipertensivo comfármaco e altos níveis de glicose no sangue, atividadefísica e consumo diário de frutas, bagas ou vegetais foramselecionados como variáveis categóricas.

Os valores de Classificação de Risco do Diabetes com

Base na Finlândia são derivados dos coeficientes do modelologístico por classificação dos mesmos em cinco categorias.A probabilidade estimada (p) do diabetes tratado comfármaco em relação a um período de. 10 anos para qualquercombinação de fatores de risco pode ser calculada dosseguintes coeficientes:

<formula>formula see original document page 61</formula>

onde β0 é a interseção e β1, β2 e assim por diante,representam os coeficientes de regressão das váriascategorias dos fatores de risco Xi, x2 e assim por diante.

A sensibilidade se refere à probabilidade daqueleteste ser positivo para indivíduos que se tornarãodiabéticos com tratamento com fãrmaco no futuro e aespecificidade reflete a probabilidade aquele teste sernegativo para indivíduos sem diabetes tratada com fármaco.A sensibilidade e a especificidade com intervalo deconfiança de 95% (CI) foram calculadas para cada nível deClassificação de Risco de Diabetes na diferenciação dosindivíduos que desenvolveram diabetes tratado com fármacodaqueles que não desenvolveram. As curvas de ROC foramcolocadas em gráfico para a classificação de Risco deDiabetes, a sensibilidade foi colocada em gráfico no eixogeométrico y e a taxa de falso-positivo (especificidade 1)foi colocada em gráfico no eixo geométrico x. Quanto maisacuradamente discriminatório o teste, mais escalonada aporção ascendente da curva ROC e maior a AUC, o ponto decorte ótimo sendo a máxima da curva.

Previsores estatisticamente significativos de diabetestratada com fármaco no futuro na Classificação de Risco deDiabetes são a idade, BMI, circunferência da cintura,terapia fármacosa anti-hipertensiva e histórico de níveisaltos de glicose no sangue. O modelo de Classificação deRisco de Diabetes compreende um modelo conciso que incluiapenas variáveis estatisticamente significativas e ummodelo pleno, que inclui atividade física e consumo defrutas e vegetais.

0 Estudo do Coração de Santo Antonio é um estudo deobservação a longo prazo, prospectivo com base na comunidade, do diabetes e doença arteriovascular nosmexicanos americanos e caucasianos não hispânicos. O estudoinicialmente envolveu 3.301 mexicanos americanos e 1.857caucasianos não hispânicos entre homens e mulheres nãográvidas em duas fases entre 1979 e 1988. Os participantestinham 25-64 anos de idade quando entraram no estudo eforam selecionados aleatoriamente dos habitantes de baixa,média e alta renda em Santo Antonio, Texas. Um exame deacompanhamento de 7-8 anos foi realizado em aproximadamente73% dos indivíduos sobreviventes inicialmente envolvidos no estudo. As características de' linha de base, tais como,histórico medido de diabetes, idade, sexo, etnia, BMI,pressão sangüínea sistólica e diastólica e níveis deglicose no plasma em jejum e de duas horas, colesteroltotal no soro em jejum, níveis de colesterol LDL e HDL, bem como níveis de triglicerídeos, foram compilados eavaliados. Um modelo de regressão logística múltiplo comincidência de diabetes como a variável dependente e ascaracterísticas de linha de base mencionadas anteriormenteforam aplicadas como variáveis independentes. Usando essemodelo, as taxas ímpares invariáveis podem ser computadaspara cada fator de risco em potencial para homens emulheres separadamente e para ambos os sexos combinados.Para fatores de risco contínuo, as taxas ímpares podem serapresentadas para um incremento de 1-SD. Um modelo deprevisão multivariado com ambos os sexos combinados podeser desenvolvido usando um procedimento de regressãologística escalonado, onde as variáveis que haviam mostradotaxas ímpares estatisticamente significativas quandoexaminadas individualmente tiveram permissão para entrar nomodelo. Esse modelo multivariável é então analisado porcurvas de ROC e CIs a 95% das áreas sob as curvas de ROCestimados por algoritmos não paramétricos, tais comoaqueles descritos por DeLong (DeLong E.R. e outros, (1988)Biometrics 44:837-45). 0 resultados do Estudo do Coração deSanto Antonio indicam que os indivíduos pré-diabéticospossuem um padrão aterogênico de fatores de risco(possivelmente causados por obesidade, hiperglicemia eespecialmente hiperinsulinemia), que podem estar presentespor muitos anos e podem contribuir para o risco de doençamacrovascular, tanto quanto a duração do diabetes clínicopropriamente.A despeito dos vários estudos e algoritmos que foramempregados para avaliar o risco do diabetes oü uma condiçãopré-diabética, a abordagem da avaliação de fator de riscomúltiplo, com base na evidência é apenas moderadamenteacurada para a previsão de manifestação de risco dediabetes a curto e longo prazo ou uma condição pré-diabética em indivíduos assintomáticos ou de outra formasaudáveis. Tais algoritmos de previsão de risco podem serempregados vantajosamente em combinação com osDBRISKMARKERS da presente invenção para distinguir, entreos indivíduos em uma população de interesse, de modo adeterminar o risco de estratificação do desenvolvimento dodiabetes ou uma condição pré-diabética. Os DBRISKMARKERS emétodos de uso revelados aqui fornecem ferramentas quepodem ser empregadas em combinação com tais algoritmos deprevisão de risco para avaliar, identificar ou diagnosticarindivíduos que são assintomáticos e não exibem os fatoresde risco convencionais.

Os dados derivados dos algoritmos de previsão de riscoe dos métodos da presente invenção podem ser comparados porregressão linear. A análise de regressão linear modela arelação entre duas variáveis por ajuste de uma equaçãolinear em relação aos dados observados. Uma variável é considerada como sendo uma variável explanatória e a outraé considerada como sendo uma variável dependente. Porexemplo, os valores obtidos da análise de Arquimedes ou doCoração de Santo Antonio podem ser usados como uma variáveldependente e analisados contra níveis de um ou maisDBRISKMARKERS como as variáveis explanatórias em umesforço muito mais completo para definir a implicidadebiológica subjacente na classificação de algoritmocalculada (vide Exemplos). Alternativamente, taisalgoritmos de previsão de risco ou suas entradas individuais, que são geralmente DBRISKMARKES propriamente,podem ser diretamente incorporados na prática da presenteinvenção, com o algoritmo combinado comparado aosresultados atuais observados em um coorte histórico.

Uma linha de regressão linear possui uma equação daforma Y = a = bX, onde X é a variável explanatória e Y é avariável dependente. A inclinação da curva é b e a é aintercessão (o valor de y quando χ = 0) . Uma medidanumérica de associação entre duas variáveis é o"coeficiente de correlação", ou R, que é um valor entre 1 e 1 indicando a resistência da associação dos dados observadapara as duas variáveis. Isso também é freqüentementereportado como o quadrado do coeficiente de correlação,como o "coeficiente de determinação" ou R2; nessa forma é aproporção da variação total em Y explicada pelo ajuste da linha. 0 método mais comum para ajuste da linha deregressão é o método dos quadrados mínimos. Esse métodocalcula a melhor linha de ajuste para os dados observadospor minimizar a soma dos quadrados dos desvios verticais apartir de cada ponto de dados para a linha (se um ponto repousar exatamente na linha ajustada, então seu desviovertical será 0) . Uma vez que os desvios são primeirotransformados em quadrados e então somados, não existemcancelamentos entre os valores positivos e negativos.

Após uma linha de regressão ter sido computada para um grupo de dados, um ponto que repousa longe da linha (eassim possui um valor residual grande) é conhecido comofora da linha. Tais pontos podem representar dados errôneosou podem indicar uma linha de regressão de ajuste fraco. Seum ponto repousar longe do outro dado na direçãohorizontal, ele é conhecido como uma observação deinfluência. A razão para essa distinção é que esses pontospodem ter tido um impacto significativo na inclinação dalinha de regressão. Uma vez que um modelo de regressãotenha sido ajustado para um grupo de dados, o exame dos resíduos (os desvios da linha ajustada para aos valoresobservados) permite que um versado na técnica investigue avalidade da presunção de que a relação linear existe. Acolocação dos resíduos em gráfico, no eixo geométrico ycontra a variável explanatória no eixo geométrico χ revelaqualquer relação não linear possível entre as variáveis, oupode alertar o versado na técnica a investigar "variáveisescondidas". Uma "variável escondida" existe quando arelação entre duas variáveis é significativamente afetadapela presença de uma terceira variável que não foi incluída no esforço de modelagem.

A análise de regressão linear pode ser empregada,entre outros, para prever o risco de desenvolver diabetesou uma condição pré-diabética com base na correlação dosníveis de DBRISKMARKERS em uma amostra de um indivíduo para aqueles resultados clínicos reais observados no indivíduoou em combinação, por exemplo, com as classificações derisco de Arquimedes, classificações de risco do Coração deSanto Antonio calculadas ou outros métodos conhecidos dediagnóstico ou prevenção da prevalência do diabetes ou umacondição pré-diabética. Entretanto, são de uso especificoas equações não lineares e análises para determinar arelação entre os modelos previsíveis de diabetes conhecidose níveis de DBRISKMARKERS detectados em uma amostra doindivíduo. São de interesse específico os algoritmos estruturais e de classificação sináptica e os métodos deconstrução de índice de risco, utilizando aspectos dereconhecido de padrão incluindo técnicas estabelecidas,tais como, Kth-Nearest Neighbor, Boosting, Decision Trees,Neural Networks, Bayesian Networks, Support Vector Machines e Hidden Markov Models. Os algoritmos de classificaçãousando regressão logística são os mais empregados, os quaissão a base para as classificações de risco de Framingham,Finlandesa e do Coração de Santo Antonio. Adicionalmente, aaplicação de tais técnicas aos painéis de DBRISKMARKERS múltiplos é englobada ou se encontra dentro do âmbito dapresente invenção, assim como o emprego de tal combinaçãopara criar "índices de. risco" numéricos simples ou"classificações de risco" englobando informações demúltiplas entradas de DBRISKMARKER. Um exemplo empregandoregressão logística é descrito aqui nos Exemplos.

A análise do fator é uma técnica matemática pela qualum grande número de variáveis correlacionadas (tais como,fatores de risco do diabetes) pode ser reduzido a alguns"fatores" que representam atributos distintos responsáveis por uma proporção maior da variação nas variáveis originais(Hanson, R. L. e outros, (2002) Diabetes 51: 3120-3127).Assim, a análise do fator é bem apropriada para identificaros componentes do Diabetes Melito e condições pré-diabéticas, tais como, IGT, IFG e Síndrome Metabõlica. Estudos epidemiológicos de "classificações" de fatordaquelas análises podem determinar, adicionalmente, asrelações entre os componentes da síndrome metabólica eincidência do diabetes. A premissa subjacente à análise dofator é que as correlações observadas entre um conjunto de variáveis podem ser explicadas por um pequeno número devariáveis não medidas únicas ou "fatores". A análise dofator envolve dois procedimentos: 1) extração do fator paraestimar o número de fatores e 2) rotação do fator paradeterminar os constituintes de cada fator em termos de variáveis originais.

A extração do fator pode ser conduzida pelo método doscomponentes principais. Esses componentes são combinaçõeslineares de variáveis originais que são construídas, demodo que cada componente tenha uma correlação de zero comcada um dos outros componentes. Cada componente principal éassociado a um "valor próprio" que representa a variaçãonas variáveis originais explicadas por aquele componente(com cada variável original padronizada para ter umavariação de 1) . O número de componentes principais que podeser construído é igual ao número de variáveis originais. Naanálise do fator, o número de fatores é rotineiramentedeterminado pela retenção apenas daqueles componentes quesão responsáveis pela maioria da variação total em relaçãoa qualquer variável original simples (isto é, aquelescomponentes com valores próprio > 1).

Uma vez que o número de fatores tenha sidoestabelecido, então a rotação do fator é conduzida paradeterminar a composição de fatores que possui ainterpretação mais parcimoniosa em termos de variáveisoriginais. Na rotação do fator, "cargas de fator" querepresentam correlações de cada fator com as variáveisoriginais são alteradas, de modo que essas cargas de fatorsejam constituídas como tão próximas de 0 ou 1 quantopossível (com a restrição de que a quantidade total devariação explicada pelos fatores permanece inalterada).Vários métodos para rotação de fator foram desenvolvidos epodem ser distinguidos pelo fato de serem realmentenecessários ao ajuste final dos fatores para permaneceremnão correlacionados entre si (também conhecidos como"métodos ortogonais") ou pelo fato se realmente elespermitem que vários fatores sejam correlacionados "métodosoblíquos"). Na interpretação da análise de fator, o padrãode cargas do fator é examinado para determinar quaisvariáveis originais representam constituintes primários decada fator. Convencionalmente, as variáveis que possuem umacarga de fator de > 0,4 (ou menos de -0,4) com um fatorespecífico são consideradas como sendo seus constituintesmaiores. A análise do fator pode ser muito útil naconstrução dos painéis DBRISKMARKER a partir de seus componentes constituintes e nos agrupamento dos gruposapropriados dos marcadores.

Os níveis de uma quantidade eficaz de proteínas,ácidos nucléicos, polimorfismos, metabólitos ou outrosanalisados do DBRISKMARKER também permitem que o curso dotratamento do diabetes ou uma condição pré-diabética sejamonitorada. Nesse método, uma amostra biológica pode serprovida de um indivíduo que sofre regimes de tratamento,por exemplo, tratamentos com fármacos para o diabetes. Taisregimes de tratamento podem incluir, porém não estãolimitados aos regimes de tratamento, suplementação dadieta, intervenção cirúrgica e tratamento com substânciasterapêuticas ou profiláticas empregadas em indivíduosdiagnosticados ou identificados como sofrendo de diabetesou uma condição pré-diabética. Caso desejado, as amostras biológicas são obtidas do indivíduo em vários pontos detempo, antes, durante ou após o tratamento. Os níveis deuma quantidade eficaz de proteínas, ácidos nucléicos,polimorfismos, metabólitos ou outros analisados doDBRISKMARKER podem então ser determinados e comparados a um valor de referência, por exemplo, um indivíduo ou populaçãode controle, cujo estado diabético é conhecido ou um valorde índice ou valor de linha de base. A amostra dereferência ou o valor de índice ou valor de linha de basepodem ser tomados ou derivados de um ou mais indivíduos que tenham sido expostos ao tratamento ou podem ser tomados ouderivados de um ou mais indivíduos que correm o risco dedesenvolver diabetes ou uma condição pré-diabética, oupodem ser tomados ou derivados de indivíduos que apresentamaperfeiçoamentos mostrados nos fatores de risco de diabetescomo resultado da exposição ao tratamento.Alternativamente, qualquer amostra de referência ou valorde índice ou valor de linha de base pode ser tomado ouderivado de um ou mais indivíduos que não tenham sidoexpostos ao tratamento. Por exemplo, as amostras podem sercoletadas de indivíduos que tenham recebido tratamentoinicial para o diabetes ou uma condição pré-diabética etratamento subsequente para o diabetes ou uma condição pré-diabética, para monitorar o progresso do tratamento. Umvalor de referência pode também compreender um valorderivado dos algoritmos de previsão de risco ou índicescomputados de estudos da população, tais como aquelesrevelados aqui.Os DBRISKMARKERS da presente invenção podem assim serempregados para gerar um "perfil de expressão dereferência" daqueles indivíduos que não sofrem de diabetesou uma condição pré-diabética, tal como tolerância àglicose comprometida, e não seria esperado quedesenvolvessem o diabetes ou uma condição pré-diabética. OsDBRISKMARKERS revelados aqui pode também ser empregadospara gerar um "perfil de expressão do indivíduo", tomadodos indivíduos que sofrem de diabetes ou uma condição pré-diabética, como tolerância à glicose comprometida. Osperfis de expressão de indivíduo podem ser comparados aoperfil de expressão de referência para diagnosticar ouidentificar indivíduos correndo risco de desenvolverdiabetes ou uma condição pré-diabética, de modo a monitorara progressão da doença, bem como a taxa de progressão dadoença e para monitorar a eficácia das modalidades detratamento para o diabetes ou pré-diabetes. Os perfis dereferência e expressão do indivíduo da presente invençãopodem estar contidos em um meio que pode ser lido pormáquina, tal como, porém não limitado às fitas análogas,como aquelas que podem ser lidas por meios flash VCR, CD-ROM, DVD-ROM, USB flash entre outros. Tais meios que podemser lidos por máquina podem também conter resultados deteste adicionais, tais como, sem limitação, medições dosfatores de risco convencionais do diabetes, tais comopressão sangüínea sistólica e diastólica, níveis de glicoseno sangue, níveis de insulina, índices de BMI, e níveis decolesterol (LDL e HDL) . Alternativa ou adicionalmente, osmeios que podem ser lidos por máquina podem tambémcompreender informações do indivíduo, tais como, históricomédico e qualquer histórico familiar relevante. Os meiosque podem ser lidos por máquina também podem conterinformações relacionadas aos outros algoritmos de risco dodiabetes e índices computados, tais como aqueles descritosaqui.

Diferenças na constituição genética dos indivíduospodem resultar em diferenças em suas capacidades relativasem metabolizar vários fármacos que podem modular ossintomas dos fatores de risco de diabetes ou uma condiçãopré-diabética. Indivíduos que sofrem de diabetes ou umacondição pré-diabética ou correndo risco de desenvolverdiabetes ou uma condição pré-diabética pode variar emidade, etnia, índice de massa corpórea (BMI), níveis decolesterol total, níveis de glicose no sangue, pressãosangüínea, níveis de LDL e de HDL e outros parâmetros.Consequentemente, o uso dos DBRISKMARKERS revelados aquipermite que um nível pré-determinado de previsibilidade queuma substância terapêutica putativa ou profilática a sertestada em um indivíduo selecionado seja apropriado paratratar ou prevenir o diabetes ou uma condição pré-diabéticaem um indivíduo.

De modo a identificar as substâncias terapêuticas oufármacos que são apropriados para um indivíduo específico,uma amostra de teste do indivíduo pode ser exposta a umagente terapêutico ou fármaco e o nível de uma ou mais dasproteínas, ácidos nucléicos, polimorfismos, metabólitos ououtros analisados do DBRISKMARKER pode ser determinado. 0nível de um ou mais DBRISKMARKERS pode ser comparado àamostra derivada do indivíduo, antes e após o tratamento ouexposição a um agente terapêutico ou fármaco, ou pode sercomparado às amostras derivadas de um ou mais indivíduosque mostraram aperfeiçoamentos nos fatores de risco dodiabetes ou condição pré-diabética, como resultado de taltratamento ou exposição. Exemplos de tais substânciasterapêuticas ou fármacos freqüentemente usados notratamento do diabetes e que podem modular os sintomas oufatores de risco do diabetes incluem, porém não estãolimitados as sulfoniluréias, tais como, glimepirida,gliburida (também conhecida na técnica como glibenclamida),glipizida, gliclazida, biguanidas, tais como, metiformina,insulina (incluindo formulações inaladas, tais como,Exubera) e análogos da insulina, tais como, lispro insulina(Humalog), glargina insulina (Lantus), detemir insulina eglulisina insulina; agonistas do receptor-γ ativado porproliferador de peroxisoma (PPAR-γ), tais como,tiazolidinadionas incluindo troglitazona (Rezulina),pioglitazona (Actos), rosiglitazona (Avandia) e isaglitzona(também conhecida como netglitazona); agonistas PPAR deação dupla, tais como, BMS-298585 e tesaglitazar;secretagogos da insulina incluindo meglitinidas, tais como,repaglinida e nateglinida; análogos do peptldeo 1semelhante ao glucagon (GLP-1), tais como, exenatida (AC-2993) e liraglutida (insulinotropina); inibidos de dipeptilpeptidase IV como LAF-237; inibidores de lipasepancreática, tais como, orlistat; inibidores de a-glicosidase, tais como, ascarbose, migitol e voglibose; ecombinações dos mesmos, especificamente metiformina egliburida (Glucovance) , metiformina e rosiglitazona(Avandament) e metiformina e glipizida (Metaglip). Taissubstâncias terapêuticas ou fármacos foram prescritos paraindivíduos diagnosticados como sofrendo de diabetes ou umacondição pré-diabética e podem modular os sintomas oufatores de risco do diabetes ou condição pré-diabética.

Uma amostra de indivíduo pode ser incubada na presençade um agente conjugado e o padrão da expressão doDBRISKMARKER na amostra de teste é medido e comparado a umperfil de referência, por exemplo, um perfil de expressãode referência do diabetes ou um perfil de expressão dereferência de não diabetes ou um valor de índice ou valorde linha de base. 0 agente de teste pode ser qualquercomposto, composição ou combinação do mesmo. Por exemplo,os agentes de teste são agentes freqüentemente usados nosregimes de tratamento do diabetes e são descritos aqui.A tabela 1 compreende duzentos e sessenta (260)DBRISKMARKERS da presente invenção. Um versado na técnicareconhecerá que os DBRISKMARKERS apresentados aqui englobamtodas as formas e variantes, incluindo porém não limitadoaos polimorfismos, isoformas, mutantes, derivados,precursores incluindo ácido nucléicos, receptores(incluindo receptores solúveis e transmembrana), ligantes,variantes modificadas pós-translacionalmente, bem comoquaisquer estruturas de ácido nucléico, proteína eglicoproteína de múltiplas unidades compreendidas dequalquer um dos DBRISKMARKERS como subunidadesconstituintes da estrutura completamente montada.

Tabela 1: DBRISKMARKERS

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Um versado na técnica observará que os DBRISKMARKERSlisados acima vêm de um conjunto diverso de viasfisiológicas e biológicas, incluindo muitos dos quais quenão são geralmente aceitos como estando relacionados ao diabetes. Para conveniência e facilidade de análise, umsubconjunto representativo de aproximadamente cinqüenta dosDBRISKMARKERS revelados foi estudado em profundidade, a fimde elucidar as vias mais importantes. A figura 1 é umamatriz ilustrando vias fisiológicas e biológicas deDBRISKMARKER e as categorias, com referência aos números edescrições de via da Kyoto University Encyclopedia of Genesand Genomes (KEGG) . Essas questões de base de dados paraKEGG (e pesquisas de literatura subsequentes para atualizaaquela base de dados) foram combinadas com trabalhoexperimental interrogando amostras de soro humano atuais decoortes de populações relevantes, conforme detalhado abaixona seção de Exemplos. Isso foi realizado a fim dedeterminar os níveis reais de expressão, translação epresença no soro sangüíneo desse grupo representativo deDBRISKMARKERSf de modo a calibrar os resultados doDBRISKMARKER com relação aos coortes Normal, Pré-diabetes eDiabetes.

Na figura 1, as fileiras horizontais ressaltadas damatriz indicam os sinais biomarcadores mais significativose contribuintes de algoritmo para os painéis DBRISKMARKERque constituem a invenção. As colunas verticais ressaltadas,indicam os números das vias KEGG e suas descrições quepossuem representação pelos DBRISKMARKERS maisestatisticamente significativos para a classificação dosindivíduos ou coortes com Pré-diabetes ou condições pré-diabéticas, a partir daqueles dentro das populações nãodiabéticas Normais. As contagens totais na fileira inferiorda figura indicam menções apenas devido aos DBRISKMARKERSressaltados. Embora existam representação ampla geralatravés da maior parte das vias listadas por um ou outroDBRISKMARKERS, uma concentração diferente de vias apareceevidente nos DBRISKMARKERS estatisticamente maissignificativos versus DBRISKMARKERS menos significativos.Conforme será descrito a seguir, aqueles grupamentos deDBRISKMARKERS diferentes, mesmo dentro daqueles segmentosde alto significado podem pressagiar sinais diferentes doestágio ou razão de progressão da doença.

O sinal mais forte vem dos marcadores inflamatóriosconcentrados nas vias de sinalização de receptor decitocinaa-citocina e adipocitocina, e significativamente avia de sinalização Jak-STAT, que está concentrada em umgrupo de marcadores incluindo LEP (Leptina) e HP(Haptoglobina). Outro sinal de sobreposição também converteMAPK e vias de sinalização de insulina e, de formainteressante, a via de sinalização mTOR, vindo dosDBRISKMARKERS incluindo ILGFBP3 (proteína 3 de ligação dofator do crescimento semelhante à insulina) e taisDBRISKMARKERS como VEGF. Esse grupo também possui oenvolvimento de sobreposição das vias de interação doreceptor de ECM e da molécula de adesão celular (CAMs), emconjunto com as cascadas de complemento e coagulação elinhagens celulares hematopoiéticas e vias de receptorsemelhante a toll, talvez indicando alterações endoteliaise vasculares, e é adicionalmente representado por CD14 eCSF1 (M-CSF). Um sinal final, envolvendo os DBRISKMARKERStais como, VEGF e SELE (E-Selectina) , está concentrado naadesão focai, ECM e outras vias relacionadas à remodelaçãovascular e endotelial. A cinética dessa expressão emrelação ao estado de risco pré-diabético permanece comosendo correto e validado, porém acredita-se que tal padrãodistinto possa permitir um sinal mais biologicamentedetalhado e clinicamente útil dos DBRISKMARKERS, bem comooportunidades para reconhecimento de padrão dentro dosalgoritmos de painel do DBRISKMARKERS combinando os sinaisdo biomarcador.

A discussão acima por conveniência, foca umsubconjunto de DBRISKMARKERS; outros DBRISKMARKERS e mesmobiomarcadores que não foram listados na tabela cima, porémque estão relacionados às vias fisiológica e biológicapodem provar a sua utilidade fornecendo o sinal e asinformações providas desses estudos. À medida que outrosparticipantes dentro da lista total dos DBRISKMARKERS são também participantes de via relevantes no pré-diabetes,eles podem ser equivalentes funcionais para osbiomarcadores já revelados. DBRISKMARKERS forneceram aosmesmos, adicionalmente, determinadas característicasdefinidas de um bom biomarcador, o que incluiria ambos, esse envolvimento no processo biológico e tambémcaracterísticas analiticamente importantes, tais como,biodisponibilidade dos marcadores em uma razão de sinalpara ruído útil, e em uma matriz de amostra útil, tal como,soro sangüíneo. Tais requisitos tipicamente limitam autilidade de muitos elementos de uma via KEGG biológica, o

que provavelmente de modo geral não seria o caso, efreqüentemente ocorrendo apenas nos elementos de via queconstituem substâncias secretoras, aqueles acessíveis àsmembranas plasmáticas das células, bem como aqueles que sãoliberados no soro quando da morte celular, devido àapoptose ou por outras razões, tais como, remodelagemendotelial ou outra renovação celular ou processosnecróticos celulares, se ou não o mesmo está relacionado àprogressão da doença do pré-diabetes e diabetes. Contudo,os biomarcadores remanescentes e futuros que satisfazemesse alto padrão para DBRISKMARKERS são provavelmente muitovaliosos. Nossa invenção engloba tais equivalentesfuncionais e estatísticos com relação aos DBRISKMARKERSrelacionados anteriormente. Adicionalmente, a utilidade estatística de tais DBRISKMARKERS depende substancialmenteda correlação cruzada entre os marcadores e novosmarcadores sendo freqüentemente necessários para operaçãodentro de um painel, a fim de elaborar o significado dabiologia subjacente.

Conforme mostrado na figura 2, muitos DBRISKMARKERSdentro do conjunto de cinqüenta (50) representativosmencionados anteriormente, estão proximamente relacionadose agrupados em grupos que assim surgem ou se desfazem emsua concentração um com o outro (ou em direções opostasentre si). Embora isso possa oferecer múltiplasoportunidades para novos e úteis DBRISKMARKERS dentro dasvias biológicas conhecidas e reveladas anteriormente, nossainvenção antecipa e reivindica tais biomarcadores úteis,que são funcionais ou estatisticamente equivalentes aoslistados, e tais correlações e concentrações deDBRISKMARKERS que são reveladas e referidas aqui, como sãoas identidades em potencial de outros elementos da viabiológica.

A figura 2 também ilustra vários padrões diferentes demarcadores que são úteis no diagnóstico de indivíduos quesofrem de pré-diabetes, diabetes e normais; váriosagrupamentos específicos de marcadores são claramenteobservados dos dados de amostra humana mencionadosanteriormente e na figura. Conforme mencionadoanteriormente, DBRISKMARKERS individuais fornecem via einformações fisiológicas diferentes e um aspecto dainvenção se refere aos métodos de se chegar aos painéisDBRISKMARKER que fornecem informações suficientes paraaperfeiçoamentos o desempenho em relação as técnicas deavaliação de risco adicionais. As figuras 3 e 4 englobam alistagem das vias KEGG com três ou mais (no caso da figura3) ou apenas um ou dois (no caso da figura 4) dosDBRISKMARKERS listados acima respectivamente ressaltadosdentro das vias relevantes como ícones coloridos.Foi previamente observado que muitos dos marcadoresindividuais listados, quando usados sozinhos e não como umelemento de um painel de múltiplos marcadores deDBRISKMARKERS, possuem pouca ou nenhuma diferençaestatisticamente significativa em seus níveis deconcentração entre populações normais, pré-diabéticas ediabéticas, e assim não são confiáveis para serem usadossozinhos na classificação de qualquer paciente entreaqueles três estados (normal, pré-diabetes ou diabetes).Também conforme previamente mencionado, uma medida comum designificado estatístico é o valor p, que indica aprobabilidade de uma observação surgir por chance ao invésde correlação ou causa; preferivelmente, tais valores ρ sãode 0,05 ou menos, representando uma chance de 95% daobservação de interesse surgir de outro modo diferente dechance. A figura 5 detalha tal análise estatística paranossa lista representativa total de cinqüentaDBRISKMARKERS, revelando as concentrações de DBRISKMARKER eestudando as variações entre e dentro das amostras depaciente através de todas as três populações de indivíduos,com base nas técnicas estatísticas estabelecidas de umfator ANOVA (análise de variação). É especificamenteressaltado que apenas um (IL-18) dos cinqüentaDBRISKMARKERS estudados possui um valor ρ inferior a 0,05,indicando utilidade confiável quanto a classificação dadoença; em muitos casos os valores ρ indicam ímpares muitosignificativos de chance aleatória tendo tido um papelpredominante na descrição das variações de concentraçãoobservadas entre e dentro das populações de indivíduos.Pode ser concluído que, quando tomados individualmente,tais DBRISKMARKERS são de uso limitado no diagnóstico dodiabetes ou pré-diabetes.

A despeito desse desempenho individual do marcador, ématéria da nossa invenção que determinadas combinaçõesespecíficas de dois ou mais DBRISKMARKERS da invençãopossam ser usadas como painéis de múltiplos marcadorescompreendendo combinações de DBRISKMARKERS que sãoconhecidos como estando envolvidos em uma ou mais viasfisiológicas ou biológicas, e que tais informações possamser combinadas e tornadas clinicamente úteis através do usode vários algoritmos de classificação estatística,incluindo aqueles geralmente usados, tais como regressãologística. De fato, é a matéria detalhada adicional dainvenção, tal como os algoritmos que, quando otimizados porseu desempenho de classificação clínica melhor (conformemedido por estatísticas de ajuste, tais como R2) através deum grupo razoavelmente grande de DBRISKMARKERS compotencial de contribuição, como medições contínuas de riscode conversão no diabetes do tipo 2, que compartilhará demodo geral um de um número separado de motivos decomponentes de multimarcador e combinações. Esses incluem,unicamente dentro do grupo representativo de DBRISKMARKERSanteriormente ensaiados, grupamentos ao redor fortementesignificativos do marcador LEPTINA (LEP) e especificamenteas várias permutações e combinações de componentes deLEPTINA, HAPTOGLOBINA (HP) , PROTEÍNA 3 DE LIGAÇÃO DO FATORDE CRESCIMENTO SEMELHANTE A INSULINA (igfbp3), e RESISTINA(RETN) incluindo, sem limitação, os vários subconjuntos dedois ou mais de cada um dos marcadores precedentes e acombinação desses conjuntos com marcadores adicionais. Umaestratégia geral alternativa para aquela de emprego deLEPTINA e seu agrupamento de suporte de marcadoresparceiros envolve o uso de TNFRl e CD2 6, tipicamente emconjunto tal como um agrupamento, porém tanto sozinhoquanto com outros marcadores (incluindo com o uso deLEPTINA e qualquer da outra família mencionadaindividualmente de marcadores nos painéis de três ou maisDBRISKMARKERS). Uma terceira estratégia de realização,geralmente inferior, em relação aquela do LEP é o empregode marcadores de inflamação mais generalizados, tais como,

PROTEÍNA REATIVA C (CRP), RECEPTOR PARA PRODUTOS FINAIS DEGLICOSILAÇÃO AVANÇADA (RAGE, agora AGER) e citocinasgerais, adipocitocinas, complementos e elementos em cascatade coagulação, tais como, IL-18, ADIPONECTINA (ADIPOQ),ADIPISINA (FATOR DE COMPLEMENTO aka D OU CFD) e PAI-I(SERPINAl), entre os outros revelados, em números grandesou em combinação com DBRISKMARKERS mais específicos.

O conceito geral de como dois biomarcadores menosespecíficos ou de menor desempenho são combinados em duasou mais novas combinações úteis para a finalidade dediagnóstico de PRÉ-DIABETES, em um indivíduo e aspectochave da invenção. Em um exemplo ilustrativo a figura 6,representa o desempenho do marcador individual para LEPTINAe HAPTOGLOBINA nos dois painéis de topo mostrando cadamarcador sozinho. No painel à esquerda, inferior, são mostrados dois testes usado em conjunto e combinados em umpapel de classificação clinica simples, onde o indivíduotestado é considerado como um teste de painel positivo paradoença, se cada marcador estiver acima de seu nível decorte clínico definido por ROC individual (aquele usado nospainéis anteriores). Esse tipo de papel "tanto A quanto B"é muito encontrado na medicina; por exemplo, um paciente éconsiderado dislipidêmico se qualquer uma das três mediçõesde colesterol total, HDL ou triglicerídeos estiver acima dedeterminados cortes individuais para cada teste.

Conforme o painel à esquerda e abaixo indica, embora oteste tenha mantido sua sensibilidade (um coorte depaciente maior pode mostrar um aperfeiçoamento, porémLEPTINA possui excelente desempenho de partida, e apenas umfalso negativo permanece). Contudo, a especificidadedeclinou dramaticamente, a um nível pior que o de cadamarcador sozinho, devido ao alto número de falsos positivosdenominados (58 em conjunto versus 2 9 para LEPTINA sozinhaou 45 para HAPTOGLOBINA sozinha). Mais tipicamente, éesperado um aperfeiçoamento na sensibilidade ao custo deuma queda na especificidade, quando dois marcadores sãousados desse modo e em conjunto.

Em contraste, no painel à direita e abaixo, os mesmosdois marcadores são testados em conjunto quando combinandoo emprego de um algoritmo de regressão logístico padrão.Nesse cenário, a sensibilidade permanece mantida, porém aespecificidade aumentou para um nível maior que o que cadamarcador seria capaz sozinho. 0 cenário do algoritmologístico é mostrado através de todos os cortes na curvaROC que se segue e possui AUC maior que cada marcadorsozinho (infelizmente, novamente devido ao pequeno tamanhoda amostra do coorte da doença, essa diferença de AUC nãotem significado estatístico; contudo, fica claro da análisede categoria precedente, que a combinação é um testesuperior, com uma taxa de falso positivo e falso negativo menor).

Esse exemplo ilustrou vários conceitos. 0 primeiro éque múltiplos marcadores podem render freqüentemente melhordesempenho que os componentes individuais, quandoalgoritmos matemático e clínicos apropriados são empregados; isso sendo freqüentemente evidente em ambassensibilidade e especificidade e resulta em AUC maior. Osegundo conceito chave é que existem freqüentemente novasinformações não percebidas nos marcadores existentes, emrelação às necessárias a fim de se obter o novo nível de especificidade combinado do algoritmo. 0 conceito final éque essas informações ocultas possam se manter verdadeirasmesmo para marcadores que são geralmente considerados comopossuindo desempenho clínico inferior ao ótimopropriamente, como a HAPTOGLOBINA no exemplo, em apenas 62,5% de sensibilidade e 41,5% de especificidade, aconclusão que não seria óbvia antes do teste dos doismarcadores juntos com um algoritmo. De fato, o desempenhoinferior ao ótimo em termos de taxas de falso positivoaltas no teste individual pode muito bem ser o indicador deque alguma informação adicional importante está contidadentro dos resultados de teste - informação que não seriaelucidada fora a combinação com um segundo marcador e umalgoritmo matemático. 0 exemplo na figura 6 foi mostradoempregando dados de marcador de paciente atuais eresultados de risco de diabetes calculados.

A figura 7 é uma demonstração adicional da sinergia eos benefícios freqüentemente não previstos e impactos daabordagem do múltiplos marcadores. Isso demonstra que ummarcador que é percebido como uma determinante valiosa e depeso alto quando usado sozinho ou mesmo com um ou váriosoutros marcadores, pode significativamente alterar em suacontribuição com a adição de novas informações na forma debiomarcadores adicionais. O gráfico ilustra a alteração nocoeficiente de regressão logística (ou carga de marcador)para o primeiro marcador como um segundo ao quadragésimooitavo marcadores são adicionados. Isso indica que o pesodo marcador alterou com a provisão de mais marcadores emais informações ao algoritmo reotimizado. Isso acontecenovamente usando um exemplo real de como os inventores desenvolveram várias abordagens de múltiplos marcadoresrevelados aqui por emprego de um algoritmo de pesquisa quebusca o melhor marcador adicional do grupo de cinqüentapara adicionar ao algoritmo em cada etapa, provendo a saídado algoritmo ou medição de índice clínico com cada marcadoradicional. A figura 8 apresenta o mesmo desempenhoaperfeiçoado em cada adição de DBRISKMARKER, conformemedido por R2 versus a curva de taxa de conversão esperadado diabetes de referência calculada, através da adição demúltiplos DBRISKMARKERS etapa a etapa, utilizando umalgoritmo de "seleção a frente" comparando todas as adiçõesremanescentes possíveis ao painel em cada tamanho de paineldado, e então escolhendo um com o aperfeiçoamento mais altono desempenho.

As desvantagens de tais técnicas de seleção a frentesão a possibilidade de soluções não escalonadas, ondeinformações sinergísticas podem ser obtidas também porteste de "etapa atrás", a fim de reavaliar cadacontribuição remanescente do marcador existente (conformeobservado, os coeficientes beta promovem a alteração) epara testar tais sinergias que possam ser impedidas pelasetapas hereditárias tomadas para obter o tamanho do painelcorrente. Essa técnica a frente e atrás pode ser combinadacom um fator de equilíbrio provendo entrada como quando acomplexidade adicional de mais marcadores supera o ganhoincrementai para acréscimos de marcadores adicionais, umatécnica de pesquisa geralmente denominada um algoritmo depesquisa de "escalonamento". Fica claro do gráfico R2 nafigura 8, que o retorno para os marcadores adicionaisdiminui com o tempo se cada etapa for tomada de uma maneiraótima - eventualmente, não existem mais informaçõesclínicas relevantes a serem adicionadas ao algoritmo e osmarcadores adicionais trazem grande complexidade einformações redundantes, diminuindo a utilização econfiabilidade do algoritmo.

Várias técnicas podem ser empregadas para gerar taisalgoritmos de adição de marcador melhores, constituindo asadições ótimas de DBRISKMARKER em cada etapa. A figura 9 éuma ilustração de uma etapa não escalonada - enumeraçãototal de TODAS as possibilidades, que é crescentementepossível, dado aos avanços na computação - porém nãotipicamente empregada para problemas de determinado tamanhoe complexidade. O gráfico ilustra um cubo tridimensionalcom uma lista de todos os marcadores em cada um dos eixosgeométricos, χ e y. As combinações de marcadores sãoilustradas por cubos internos dentro do cubo de base; umainterface interativa do usuário permite que o visualizadorressalte os algoritmos com elementos específicos ou níveisde desempenho. 0 cubo ilustrado representou um total demais de 200.000 cálculos de regressão logística individuaiscobrindo todas as possíveis combinações de aproximadamentesessenta DBRISKMARKERS, cada um com interseção,coeficientes e R2 calculados. As "barras" suspensas dentrodo cubo representam os marcadores de alta contribuição,tais como, LEPTINA, TNFRl e CD26, que para um ou maissegundos parceiros do marcador possuem um desempenho muitomaior que a média do algoritmo, independente de seusterceiros parceiros, assim descrevendo uma linha retaatravés do cubo. Tal técnica, que é uma parte inerente dainvenção, compreende um mecanismo para seleção da melhorcombinação de DBRISKMARKER, possui o benefício adicional depermitir que tendências completas sejam vistas através detodo o espaço das probabilidades - tendências que podemcontinuar em painéis maiores e que permitem penetração maisprofunda nas intercorrelações do marcador e biologia, deforma final e permitindo eficácia melhor na construção dopainel DBRISKMARKER.

A figura 10 é um histograma ilustrando a distribuiçãoda medida de desempenho R2 através de todo o conjunto depossíveis três combinações de marcadores mostradoanteriormente na figura 9. Existe, claramente, uma divisãoda minoria relativamente pequena de algoritmos de altodesempenho, independente da técnica usada na construção dopainel.

Outras ferramentas estatísticas, tais como, fator eanálise de correlação cruzada do marcador/covariaçãopermite abordagens mais razoáveis em relação ã construçãodo painel. A figura 11 é um agrupamento matemático e árvorede classificação mostrando a distância padronizadaEuclidiana entre os DBRISKMARKERS conforme mostrado nasfiguras 1 e 2. Embora tal agrupamento possa ou não fornecerpenetração direta na biologia e nos alvos de teorinformacional desejados para algoritmos de pré-diabetesideais, é o resultado de um método de análise de fatordestinado a agrupar as coleções de marcadores com teor deinformação semelhante (vide Exemplos a seguir quanto a maistécnicas estatísticas geralmente empregadas).

A figura 12 apresenta tabelas de DBRISKMARKERSselecionados dividindo os mesmos em duas classes chave deMarcadores Chave Individuais e Marcadores Chave deCombinação, úteis na construção das várias categorias depainéis de DBRISKMARKERS. Conforme previamente observado, aposição do DBRISKMARKER individual em cada painel estáproximamente relacionada a sua provisão de teor deinformações adicionais para o algoritmo, assim a ordem dacontribuição depende muito dos outros DBRISKMARKERS queconstituem o painel.

Um painel de DBRISKMARKER é compreendido de uma sériede componentes de DBRISKMARKER individuais. Dentro do nossoestudo empregando 50 DBRISKMARKERS representativos, existemtrês abordagens de marcador de núcleo que podem ser usadasindependentemente ou quando se deseja painéis maiores, emcombinação, a fim de obter alto desempenho em um painel deDBRISKMARKER; o primeiro, que nos denominamos a abordagemde Marcador Chave Individual na figura 11, centra primeirona LEPTINA com o marcador de núcleo com a contribuiçãoindividual mais alta para R2 e continua através de umaordenação de classificação de outras posições de MarcadorChave Individual, tais como, HAPTOGLOBINA, ILGFBP,RESISTINA, MMP2, ACE, C0MPC4 e CD14. Embora seja possívelsubstituição nessa abordagem, vários algoritmos de pesquisaa frente demonstraram e confirmaram a ordem dos marcadoresde núcleo mostrados a seguir como uma contribuição relativamais alta para R2 nas populações representativas paradiagnóstico de pré-diabetes a partir do normal. Em geral,para painéis menores, os painéis de maior desempenho sãogeralmente escolhidos primeiro do marcador de núcleolistado sob os Marcadores Chave Individuais, com níveismais altos de desempenho, quando cada uma das oito posiçõesdo marcador está ocupada. As posições anteriores, taiscomo, Posição 1 de Marcador (LEPTINA) possuem tipicamente opotencial para as contribuições maiores.

Uma segunda abordagem alternativa é começar aconstrução de um painel de DBRISKMARKER empregando o quenós definimos na figura 11 como Marcadores Chave deCombinação, que obtêm um alto desempenho primário atravésde sua interação próxima em conjuntos, mais especificamenteo emparelhamento TNFR1-CD26, porém também emparelhando esustentando vários elementos dos Marcadores ChaveIndividuais, onde eles são identificados como estratégiasde substituição comum que ainda surgem no desempenho altototal do painel de DBRISKMARKER. De fato, como um grupo,algumas substituições dos Marcadores Chave Individuais paraMarcadores Chave de Combinação são benéficas para ospainéis com relação a um determinado tamanho,especificamente quando a substituição do Marcador Chave játenha ocorrido, ou quando o tamanho do painel está além dasoito posições de núcleo do Marcador Chave.Os Marcadores de Combinação Chave não possuem umaordem de conjunto hierárquica ou ordem além doemparelhamento frontal superior comum de TNFRl e CD26 e dosvários outros elementos com Marcadores Chave Individuais,notavelmente E-Selectina, MCSF e VEGF. Freqüentemente, osMarcadores de Combinação Chave são adicionados mais tardeem uma abordagem de construção de painel de DBRISKMARKER emrelação a quando o fator e as informações redundantestornam-se múltiplos, estatisticamente semelhantes àssoluções de alto desempenho para o possível painel de.DBRISKMARKER ótimo.Um terceira abordagem e final é trabalhar dentro dogrupo de marcadores de citocina de inflamação maisgeneralizada, adipocina e coagulação, incluindo CRP, RAGE,IL-18, ADIPONECTINA, ACTIVIN_A e ADIPISINA. Essa é umaestratégia de preenchimento comum para as abordagenscomeçarem com os Marcadores Chave Individual ou Chave deCombinação, uma vez que o teor de informações mais geral eamplo de alguns desses marcadores multipotentes (tais como,CRP e RAGE especificamente) torna os mesmos receptíveispara serem adicionados a muitas combinações de painéisdiferentes, sem criar redundante de informações.Exemplos de construções de painel de DBRISKMARKERespecíficas usando as técnicas gerais acima são tambémrevelados aqui, sem limitação do precedente, de nossastécnicas de construção do painel marcador, ou daaplicabilidade dos DBRISKMARKERS alternativos oubiomarcadores de classes funcionalmente equivalentes quenão estão envolvidos nas mesmas vias fisiológicas ebiológicas constituintes.

Marcadores Chave Individuais

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A figura 12 é uma listagem de 25 painéis deDBRISKMARKER de alto desempenho usando três DBRISKMARKERSselecionados das Categorias de Posição de acordo com ométodo revelado aqui. Algoritmos lógicos de regressãoempregando os painéis calcularam os valores RA2 variando de0,300 a 0,329 quando empregados nas amostras no exemplodescrito e coorte de paciente não diabético.

A figura 13 é uma listagem de 25 painéis deDBRISKMARKER de alto desempenho usando oito DBRISKMARKERSselecionados das Categorias de Posição de acordo com ométodo revelado aqui, empregando substituição de marcadorsimples de um conjunto de base de marcadores reunidosusando um algoritmo de procura atrás com um laço deretroalimentação de AIC (vide métodos a seguir). Algoritmoslógicos de regressão usando os painéis calcularam osvalores R2 variando de 0,310 a 0,475, quando empregados nasamostras no exemplo descrito e coorte de paciente nãodiabético.

A figura 14 é uma vista de 55 painéis de DBRISKMAKERde alto desempenho empregando dezoito DBRISKMAKERSselecionados das Categorias de Posição de acordo com ométodo revelado aqui, empregando substituição de marcadorsimples com três opções começando de um grupo de marcadorespreviamente reunidos usando algoritmo de procura atrás comum laço de retroalimentação de AIC (vidè métodos a seguir) .Algoritmos lógicos de regressão usando os painéiscalcularam os valores R2 variando de 0,523 a 0,6105, quandoempregados nas amostras no exemplo descrito e coorte depaciente não diabético.

Os níveis de DBRISKMAKERS podem ser determinados aonível de proteína ou ácido nucléico usando qualquer métodoconhecido na arte. Por exemplo ao nível do ácido nucléico,análises de hibridização Northern e Southern, bem comoensaios de proteção de ribonuclease usando sondas quereconhecem especificamente uma ou mais dessas seqüênciaspodem ser usadas para determinar a expressão gênica. Alternativamente, a expressão pode ser medida usandoensaios de PCR com base na transcrição inversa (RT-PCR),por exemplo, empregando iniciadores específicos ao nível daproteína, por exemplo, por medição dos níveis de peptídeoscodificados pelos produtos de gene descritos aqui, ou atividades dos mesmos. Tais métodos são bem conhecidos natécnica e incluem, por exemplo, imunoensaios com base nosanticorpos para proteínas codificadas pelos genes,aptâmeros ou impressões moleculares. Qualquer materialbiológico pode ser empregado para a detecção/quantificação da proteína ou sua atividade. Alternativamente, um métodoapropriado pode ser selecionado para determinar a atividadedas proteínas codificadas pelos genes marcadores de acordocom a atividade de cada proteína analisada.

As proteínas, polipeptídeos, mutações e polimorfismos do DBRISKMAKER podem ser detectadas de qualquer modoapropriado, porém são tipicamente detectadas por contato daamostra do indivíduo com um anticorpo que se liga àproteína, polipeptídeo, mutação ou polimorfismo doDBRISKMAKER e então detectando a presença ou ausência de um produto de reação. 0 anticorpo pode ser monoclonal,policlonal, quimérico ou um fragmento do precedente,conforme discutido em detalhes acima e a etapa de detecçãodo produto de reação pode ser realizada com qualquerimunoensaio apropriado. A amostra do indivíduo étipicamente um fluido biológico conforme descrito acima epode ser a mesma amostra de fluido biológico usada paraconduzir o método descrito acima.

Os imunoensaios realizados de acordo com a presenteinvenção podem ser ensaios homogêneos ou ensaios heterogêneos. Em um ensaio homogêneo, a reação imunológicageralmente envolve o anticorpo específico (por exemplo,anticorpo de proteína anti-DBRISKMARKER), um analisadorotulado e a amostra de interesse. 0 sinal que surge dorótulo é modificado, direta ou indiretamente, quando daligação o anticorpo ao analisado rotulado. Ambas a reaçãoimunológica e a detecção da extensão da mesma podem serrealizadas em uma solução homogênea. Rótulos imunoquímicosque podem ser empregados incluem radicais livres,radioisótopos, corantes fluorescentes, enzimas,bacteriófagos ou coenzimas.

Em uma abordagem de ensaio heterogêneo, os reagentessão geralmente a amostra, o anticorpo e meios para produçãode um sinal detectável. As amostras descritas acima podemser empregadas. 0 anticorpo pode ser imobilizado em umsuporte, tal como uma microesfera (tal como, microesferasde proteína A e proteína G agarose), placa ou slide, econtatado com o espécime suspeito de conter o antígeno emuma fase líquida. 0 suporte é então separado da faselíquida e tanto a fase de suporte quanto a fase líquida sãoexaminadas quanto a um sinal detectável empregando meiospara produção de tal sinal. O sinal está relacionado àpresença do analisado na amostra. Meios para produção de umsinal detectável incluem o emprego de rótulos radioativos,rótulos fluorescentes ou rótulos de enzimas. Por exemplo,se o antígeno a ser detectado contiver um segundo sítio deligação, um anticorpo que se liga aquele sítio pode serconjugado a um grupo detectável e adicionado ã solução dereação de fase líquida antes da etapa de separação. Apresença do grupo detectável no suporte sólido indica apresença do antígeno na amostra de teste. Exemplos deimunoensaios apropriados são oligonucleotídeos,imunoblotting, métodos de imunofluorescência, métodosquimioluminescentes, imunoensaios deeletroquimiluminescência ou ligados a enzima.

Os versados na técnica estão familiarizados com osinúmeros formados de imunoensaio específicos e variaçõesdos mesmos que podem ser úteis para realização do métodorevelado aqui. Vide, de modo geral, E. Maggio, Enzyme-Immunoassay, (1980) (CRC Press, Inc., Boca Raton, Fla.);vide também Patente US número 4.727.022 de Skold e outros,intitulada "Methods for Modulating Ligand-ReceptorInteractions and their Application," Patente US número4.659.678 de Forrest e outros, intitulada "Immunoassay ofAntigens," Patente US número 4.376.110 de David e outros,intitulada "Immunometric Assays Using MonoclonalAnticorpos," Patente US número 4.275.149 de Litman eoutros, intitulada "Macromolecular Environment Control inSpecific Receptor Assays," Patente US número 4.233.402 deMaggio e outros, intitulada "Reagents and Method EmployingChanneling" e Patente US número 4.230.767 de Boguslaski eoutros, intitulada "Heterogenous Specific Binding AssayEmploying a Coenzyme as Label."

Os anticorpos podem ser conjugados em um suportesólido apropriado para um ensaio de diagnóstico (porexemplo, microesferas, tais como, de proteína A ou proteínaG agarose, microesferas, placas, slides ou poços formadosde materiais, tais como, látex ou poliestireno) de acordocom técnicas conhecidas, tais como ligação passiva.Anticorpos conforme descritos aqui podem provavelmente serconjugados em rótulos detectáveis ou grupos, tais como,radiorótulos (por exemplo, 35S, 1251, 1311), rótulos deenzima (por exemplo, peroxidase de rábano silvestre,fosfatase alcalina) e rótulos fluorescentes (por exemplo,fluoresceína, Alexia, proteína fluorescente verde) deacordo com técnicas conhecidas.

Os anticorpos podem também ser úteis para detectarmodificações pós-translacionais de proteínas,polipeptídeos, mutações e polimorfismos de DBRISKMAKERS,tais como, fosforilação da tirosna, fosforilação datreonina, fosforilação da serina, glicosilação (porexemplo, O-GlcNAc) . Tais anticorpos detectam,especificamente, os aminoácidos fosforilados em umaproteína ou proteínas de interesse e podem ser usados noimunoblotting, imunofluorescência e ensaios ELISA descritosaqui. Esses anticorpos são bem conhecidos dos versados natécnica estando comercialmente disponíveis. As modificaçõespós-translacionais podem também ser determinadas usandoíons metastáveis em tempo de ionização de desorção a laserauxiliado por matriz refletora de espectrometria de massafIiht (MALDI-TOF) (Wirth, U. e outros, (2002) Proteomics2(10): 1445-51).

Para proteínas, polipeptídeos, mutações e

polimorfismos de DBRISKMAKER conhecidos como possuindoatividade enzimática, as atividades podem ser determinadasin vitro usando ensaios de enzima conhecidos na arte. Taisensaios incluem, sem limitação, ensaios de cinase, ensaiosde fosfatase, ensaios de reductase, entre muitos outros. Amodulação da cinética das atividades da enzima pode serdeterminada por medição da constante de tciXci Km usandoalgoritmos conhecidos, tais como o gráfico Hill, equação deMiachelis-Menten, gráficos de regressão linear, tais como,análise de Linewaver-Burk e gráfico de Scatchard.

Empregando-se as informações da seqüência fornecidaspelas entradas da base de dados para as seqüências deDBRISKMAKER, a expressão das seqüências de DBRISKMAKER podeser detectada (caso presente) e medida usando técnicas bemconhecidas de um versado na técnica. Por exemplo, asseqüências dentro das entradas de base de dados daseqüência correspondendo às seqüências de DBRISKMAKER ou

dentro das seqüências reveladas aqui, podem ser usadas paraconstruir sondas para detectar as seqüências de RNA deDBRISKMAKER, por exemplo, nas análises de hibridizaçãoNorthern blot ou métodos que especifica e preferivelmente,ampliam quantitativamente as seqüências de ácido nucléico específicas. Como outro exemplo, as seqüências podem serusadas para construir iniciadores para ampliarespecificamente as seqüências de DBRISKMAKER, por exemplo,nos métodos de detecção com base na ampliação, tais como,reação da cadeia da polimerase com base na transiçãoinversa (RT-PCR). Quando as alterações na expressão gênicaestão associadas à ampliação do gene, deleção,polimorfismos e mutações, as comparações de seqüência noteste e populações de referência podem ser feitas porcomparação com as quantidades relativas das seqüências deDNA examinadas no teste e populações de célula dereferência.

A expressão dos genes revelados aqui pode ser medidano nível de RNA usando qualquer método conhecido na arte.Por exemplo, a análise de hibridização Northern usandosondas que reconhecem especificamente uma ou mais dessasseqüências pode ser empregada para determinar a expressãogênica. Alternativamente, a expressão pode ser medidausando ensaios PCR à base de transcrição inversa (RT-PCR),por exemplo, usando iniciadores específicos para asseqüências diferencialmente expressas.

Alternativamente, a proteína do DBRISKMAKERS emetabólitos do ácido nucléico podem ser medidos. O termo"metabólito" inclui qualquer produto químico ou bioquímicode um processo metabólico, tal como qualquer compostoproduzido pelo processamento, clivagem ou consumo de umamolécula biológica (por exemplo, proteína, ácido nucléico,carboidrato ou lipídeo). Os metabólitos podem serdetectados por vários modos conhecidos de um versado naarte, incluindo a espectroscopia de índice de refração(RI), espectroscopia ultravioleta (UV), análise defluorescência, análise radioquímica, espectroscopia próximoao infravermelho (próximo ao IR) , espectroscopia deressonância magnética nuclear (NMR), análise de difusão deluz (LS), espectrometria de massa, espectrometria de massaem pirrólise, nefelometria, espectroscopia de Ramandispersiva, cromatografia do gás combinada coraespectrometria de massa, cromatografia líquida combinadacom espectrometria de massa, tempo flight em ionização dedesorção a laser associada à matriz (MALDI-TOF) combinadacom espectrometria de massa, espectroscopia de spraycombinada com espectrometria de massa, eletroforesecapilar, NMR e detecção por IR. (Vide, WO 04/056456 e WO04/088309, cada um dos quais estando incorporado aqui comoreferência em sua totalidade). Com relação a isso, outrosanalisados de DBRISKMARKER podem ser medidos usando osmodos de detecção mencionados acima, ou outros modosconhecidos do versado na técnica.

Kits

A invenção também inclui um reagente de detecção deDBRISKMARKER, por exemplo, ácidos nucléicos queidentificam especificamente um ou mais ácidos nucléicos deDBRISKMARKER por terem seqüências de ácido nucléicohomólogas, tais como, seqüências de oligonucleotídeo,complementares a uma porção dos ácidos nucléicos deDBRISKMARKER ou anticorpos para proteínas codificados pelosácidos nucléicos do DBRISKMARKER embalados em conjunto paraformar um kit. Os oligonucleotídeos podem ser fragmentosdos genes do DBRISKMARKER. Por exemplo, osoligonucleotídeos podem ter 200, 150, 100, 50, 25, 10 oumenos nucleotídeos de comprimento. O kit pode conter, emrecipientes separados, um ácido nucléico ou anticorpo(tanto já ligado a uma matriz sólida quanto embaladoseparadamente com reagentes para ligar os mesmos à matriz),formulações de controle (positivo e/ou negativo) e/ourótulo detectável. Instruções (por exemplo, por escrito, emfita, VCR, CD-ROM, etc.) para realização do ensaio podemser incluídas no kit. 0 ensaio pode estar, por exemplo, naforma de hibridização Northern ou um ELISA intercalado,conforme conhecido na arte.Por exemplo, os reagentes de detecção do DBRISKMARKERpodem ser imobilizados em uma matriz sólida, tal como umatira porosa para formar, pelo menos, um sítio de detecçãode DBRISKMARKER. A região de medição ou detecção da tiraporosa pode incluir vários sítios contendo um ácidonucléico. Uma tira de teste pode também conter sítios paracontroles negativos e/ou positivos. Alternativamente, ossítios de controle podem estar localizados em uma tiraseparada da tira de teste. Opcionalmente, os sítios de.detecção diferentes podem conter quantidades diferentes deácidos nucléicos imobilizados, por exemplo, uma quantidademaior no primeiro sítio de detecção e quantidades menoresnos sítios subsequentes. Quando da adição da amostra deteste, o número de sítios revelando um sinal detectávelprove uma indicação quantitativa da quantidade deDBRISKMARKERS presentes na amostra. Os sítios de detecçãopodem ser configurados em qualquer forma apropriadamentedetectável e estão tipicamente na forma de uma barra ouponto no vão da largura de uma tira de teste.Alternativamente, o kit compreende uma fileira desubstratos de ácido nucléico compreendendo uma ou maisseqüências de ácido nucléico. Os ácidos nucléicos nafileira identificam, especificamente, uma ou maisseqüências de ácido nucléico representadas pelosDBRISKMARKERS 1-260. Em várias concretizações, a expressãode 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 40, 50, 100,125, 150, 175, 200, 210, 220, 230, 240 ou mais dasseqüências representadas pelos DBRISKMARKERS 1-260 pode seridentificada em virtude da ligação à fileira. A fileira desubstrato pode estar sobre, por exemplo, um substratosólido, por exemplo uma "lasca" conforme descrito naPatente US número 5.744.305. Alternativamente, a fileira desubstrato pode ser uma fileira de solução, por exemplo,xMAP (Luminex, Austin, TX) , Cyvera (Illumina, San Diego,CA) , CellCard (Vitra Bioscience, Mountain View, CA) eQuantum Dots1 Mosaic (Invitrogen, Carlsbad, CA).

0 versado na técnica pode fabricar rotineiramenteanticorpos, sondas de ácido nucléico, por exemplo,oligonucleotídeos, aptâmeros, siRNAs, oligonucleotídeos deanti-sentido, contra qualquer um dos DBRISKMARKERS natabela 1.

EXEMPLOS

Exemplo 1

Os painéis de biomarcadores de proteína foram,determinados por análise de 64 proteínas em amostras desoro humano, derivadas de um grupo de 96 pessoas normais,pré-diabéticas e diabéticas.

Reagentes da pesquisa: um grupo amplo e diverso defornecedores foi empregado para obtenção dos imunoreagentesda pesquisa como um ponto de partida para o desenvolvimento do ensaio, tais como, porém não limitado a Abazyme, Abnova,Affinity Biologicals, AntibodyShop, Biogenesis, BiosenseLaboratories, Calbiochem, Cell Sciences, ChemiconInternational, Chemokine, Clontech, Cytolab, DAKO,Diagnostic BioSystems, eBioscience, Endocrine Technologies,Enzo Biochem, Eurogentec, Fusion Anticorpos, GenesisBiotech, GloboZymes, Haematologic Technologies,

Immunodetect, Immunodiagnostik, Immunometrics, Immunostar,Immunovision, Biogenex, Invitrogen, Jackson ImmunoResearehLaboratory, KMI Diagnosties, Koma Biotech, LabFrontier LifeScience Institute, Lee Laboratories, Lifescreen, MaineBiotechnology Services, Mediclone, MicroPharm Ltd.,ModiQuest, Molecular Innovations, Molecular Probes,Neoclone, Neuromics, New England Biolabs, Novocastra, NovusBiologicals, Oncogene Research Products, Orbigen, Oxford

Biotechnology, Panvera, PerkinElmer Life Sciences,Pharmingen, Phoenix Pharmaceuticals, Pierce ChemicalCompany, Polymun Scientific, Polysiences, Inc., PromegaCorporation, Proteogenix, Protos Immunoresearch, QEDBiosciences, Inc., R&D Systems, Repligen, Research

Diagnosties, Roboscreen, Santa Cruz Biotechnology,Seikagaku America, Serological Corporation, Serotec,SigmaAldrich, StemCell Technologies, Synaptic Systems GmbH,Technopharm, Terra Nova Biotechnology, TiterMax, TrilliumDiagnosties, Upstate Biotechnology, US Biological, Vector

Laboratories, Wako Pure Chemical Industries e Zeptometrix.

Uma pesquisa para anticorpos de captura, anticorpos dedetecção e analisados foi realizada para configurar umimunoensaio intercalado de trabalho. Os reagentes forampedidos e recebidos no almoxarifado.

Os imunoensaios foram desenvolvidos em três etapas:Prototipagem, Validação e Liberação de Kit. A prototipagemfoi conduzida usando formatos ELISA padrão, quando os doisanticorpos usados no ensaio eram de espécies de hospedeirodiferentes. Empregando as condições padrão, os anticorpossecundários anti-hospedeiro conjugados com peroxidase derábano silvestre foram avaliados em uma curva padrão. Seuma boa curva padrão fosse detectada, o ensaio prosseguiriapara a próxima etapa. Os ensaios que haviam tido os mesmosanticorpos de hospedeiro foram diretamente para a próximaetapa (por exemplo, ensaios intercalados monoclonais decamundongo).

A validação de um ensaio de trabalho foi realizadausando plataforma de detecção Zeptosense da Singulex, Inc.(St. Louis, MO) . O anticorpo de detecção foi primeiroconjugado ao corante fluorescente Alexa 647. As conjugaçõesusaram a química do éster NHS padrão, por exemplo de acordocom o fabricante. Uma vez que o anticorpo tenha sidorotulado, o ensaio foi testado em um formato de ensaiointercalado usando condições padrão. Cada poço de ensaiofoi solubilizado em um tampão de desnaturação e o materialfoi lido na plataforma Zeptosense.

A figura 1 mostra um resultado típico para uma curvapadrão de trabalho. Uma vez que uma curva padrão detrabalho foi demonstrada, o ensaio foi tipicamente aplicadoa 24 amostras de soro para determinar a distribuição normaldo analisado alvo através das amostras clínicas. Aquantidade de soro necessária para medir o biomarcadordentro da faixa dinâmica linear do ensaio foi determinada,e o ensaio prosseguiu para a liberação do kit. Para os 39ensaios validados iniciais, 0,004 microlitros foram usadospor poço em média.

Cada componente do kit incluindo fabricante, númerosde catálogo, números de lote, estoque e concentrações detrabalho, curva padrão e requisitos do soro foramcompilados nos procedimentos operacionais padrão para cadaensaio de biomarcador. Esse kit foi então liberado para usopara testar amostras clínicas.

As amostras foram coletadas de várias fontes. Em todosos casos, anotações clínicas suficientes estavamdisponíveis para calcular os fatores de risco usando omodelo desenvolvido por Stern e outros (2002) . Tipicamente,um mínimo das anotações clínicas que se seguem estavadisponível de cada estudo: data da coleta, idade, sexo,altura, peso, cintura, BMI, etnia, histórico familiar,pressão sangüínea diastólica e sistólica, níveis de glicoseem jejum, colesterol. As amostras foram coletadas usandoprotocolos padrão e foram armazenadas a -8OC a partir dahora da coleta.

As amostras clínicas chegaram congeladas em gelo seco, e cada amostra foi armazenada a -80C. Cada amostra tinhatipicamente muitas anotações clínicas com a mesma. Asanotações clínicas associadas a cada conjunto de amostraforam colocadas em uma nomenclatura padronizada antes daimportação. Todas as anotações clínicas associadas a cada amostra foram então importadas para a base de dadosrelacionada.

As alíquotas congeladas de amostras clínicas foramdescongeladas e aliquotadas para uso no laboratório. Cadaamostra clínica foi descongelada e as alíquotas foram dispensadas em tubos com códigos de barra (tubosderivados) . Cada tubo derivado foi armazenado a -8OC atéele ser necessário para os imunoensaios. Os tubos derivadosforam então dispostos em fileira dentro das placas deamostra. Cada tubo derivado com código de barra a ser analisado foi colocado em fileira em placas de 96 ou 384poços (placas de amostra) . 0 tubo derivado para mapeamentodo poço da placa de amostra foi rastreado pela base dedados correlata.

Cada placa de amostra foi preparada para análise de imunoensaio. As placas de ensaio com código de barras de3 84 poços foram separadas para um biomarcador por placa.Tipicamente, as placas de 4-12 ensaios foram derivadas decada placa de amostra, dependendo da quantidade de soronecessária para cada ensaio. A placa de amostra passou por uma série de diluições para garantir que as amostrasclínicas estivessem na diluição apropriada para cadaimunoensaio. As amostras clínicas foram então depositadasnos poços das placas de ensaio em triplicata para cada.marcador. Novamente, o rastreamento de cada poço da placa de amostra para ensaiar o poço da placa foi rastreado nabase de dados correlata. Os ensaios foram então processadosusando procedimentos de imunoensaio padrão e a placa deensaio foi lida no instrumento Zeptosense. Cada operaçãocontinha dados para um biomarcador através de cerca de 3 84 amostras clínicas. Os arquivos de dados resultantes foramentão importados de volta para a base de dados correlata,onde as curvas padrão foram calculadas e os valores deconcentração para cada biomarcador, para cada amostra foramcalculadas. A figura 2 mostra um exemplo de dados de detecção de molécula simples através de 92 amostras para 25biomarcadores.

Os valores de biomarcador avaliados para cada amostraclínica foram reassociados com a anotações clínicasoriginais. Os dados de biomarcador quantitativos foram correlacionados às anotações clínicas associadas a cadaamostra. 0 risco do diabetes em 7 anos e meio foi calculadousando o modelo desenvolvido por Stern e outros (2 002) . Omodelo clinico é da forma de uma equação logística:

<formula>formula see original document page 156</formula>

onde

χ = -13,415 + 0,028(idade) + 0,661(sexo) + 0,412(MA) +0,079(FG) + 0,018(SBP)-0,039(HDL) + 0,070(BMI) + 0,481(histórico familiar).

Nessa equação, ρ = à probabilidade de desenvolver oDiabetes no período de acompanhamento de 7 anos e meio; aidade é em anos; sexo = 1 se mulher, 0 se homem; MA = 1 seamericano mexicano, 0 se branco não hispânico; FG = glicoseem jejum em mg/dL; SBP = pressão sangüínea sistólica emmmHg; HDL = nível de colesterol de lipoproteína de altadensidade em mg/dL; BMI = índice de massa corpórea emkg/m2 ; e histórico familiar = 1 se pelo menos um pai ouparente possuir diabetes ou 0 se não (Stern e outros,2002) .

De modo a estimar o risco para amostras de pacientecom coorte, as modificações que se seguem foram feitas paraesses parâmetros. Primeiro, americanos africanos ehispânicos foram incluídos no grupo de alto risco com osamericanos mexicanos e foi pressuposto que pacientes com umdiagnóstico de hipertensão tinham um SBP = 150 e pacientessem um SBP = 125. O restante dos dados estavam disponíveisno registro clínico. Os dados de concentração bruta paracada marcador foram transformados em Iogi0 e usados comoentradas para vários modelos de regressão linear natransformação de risco lógico (x na equação acima).

A regressão linear de χ na concentração do biomarcadorlogio em cada base de univariado, bivariado e trivariadopor conjuntos de marcadores foi realizada através de umapesquisa completa de todas as combinações. A qualidade dosmodelos foi julgada com base no coeficiente dedeterminação, R2.Modelos com mais de três marcadores foramdesenvolvidos usando seleção a frente, atrás e escalonada,com base no Critério de Informação de Akaike (AIC) . Asalternativas para esses conjuntos de marcadores foramidentificadas por eliminação de cada marcador e busca doconjunto remanescente para a melhor substituição, onde"melhor" é o marcador com o valor R2 maior.Um modelo completo foi também criado por adição de umavariável simples ao modelo nulo um por um até todos osmarcadores serem usados. Cada marcador foi selecionado combase no coeficiente de determinação do conjunto marcadorcompleto sendo usado até aquele ponto. Ajustes selecionadosdesses modelos foram usados para calcular sensibilidade eespecificidade de qualquer modelo individual.A excepcionalidade/similaridade das concentrações dobiomarcador foram investigadas usando análise decomponentes principais (PCA), agrupamento hierárquico ecorrelação simples. Os resultados da PCA foram avaliadosgraficamente usando gráficos scree, gráficos bidimensionaise projeções de amostra para quantificar quanta variaçãoindependente existiu entre esses marcadores. 0 agrupamentohierárquico usando as concentrações padronizada (média = 0,sd = 1) teve como base a distância euclidiana como umadistância métrica e o método de Ward como a média deaglomeração. Os agrupamentos foram usados para identificarmarcadores com semelhança de comportamento.

0 que se segue é um exemplo ilustrativo de um métodoque foi empregado para desenvolver testes de biomarcador deproteína de acordo com a invenção.

Analisado do ensaio: proteína reativa C

Tabela 2: Componentes

<table>table see original document page158</column></row><table>

Cada poço individual em uma placa de 3 84 poços NUNCMaxisorp foi revestido com 20 μΐϋ de anticorpo de capturadiluído no tampão de revestimento (0,05 M carbonato, pH9,6; diluído para 1 μg/mL e preparado imediatamente antesdo uso) e incubado por toda a noite a temperatura ambiente.A placa foi então lavada três vezes em 100 μΐ] de tampão AWash (PBS com 0,1% Tween 20) e bloqueado em 3 0 μ!· de tampãoPBS contendo BSA a 1%, sacarose a 5%, 0,05% NaN3 paracaptura de analisado por pelo menos duas horas atemperatura ambiente. Após incubação, o tampão de bloqueiofoi removido e as placas bloqueadas secas ao ar por pelomenos 5 horas a temperatura ambiente e preparadas paraarmazenamento a 40C ou para ensaio Zeptosense.

As amostras foram diluídas 1:400 no Tampão de Ensaio(Tampão BS contendo BSA a 1%, Triton X-IOO a 0,1%. A placaseca e bloqueada foram adicionados 2 0 μL/poço de amostraspadrão e diluídas não conhecidas e deixadas incubar portoda a noite a temperatura ambiente. Após incubação, aplaca foi lavada cinco vezes em tampão B de lavagem (tampãoBS com Triton X-IOO a 0,02% e BSA a 0,0001%), anticorpo dedetecção A647 foi diluído para 50 ng/mL em tampão de ensaioe foi adicionado aos poços em uma quantidade de 2 0 μΐι/poço.O anticorpo de detecção foi deixado se ligar por 2 horas atemperatura ambiente, após o que a placa foi lavada cincovezes em 100 μΐι de tampão B de lavagem. Uma curva padrãofoi gerada usando um controle diluído para 100 ng/mL em umcalibrador. Diluições em série de 100 ng/mL a 0,01 pg/mL nodiluente calibrador (tampão de ensaio + BSA a 5) forampreparadas. A figura 1 é uma curva padrão representativausando antagonista de receptor IL-I. 0 tampão de eluição(4M uréia, 1 χ BS com Triton X-100 a 0,02% e BSA a 0,001%)foi adicionado em uma quantidade de 2 0 μL/poço e incubadopor meia hora a temperatura ambiente, após o que asamostras foram analisadas em um instrumento Zeptosense.

Fica entendido que embora a invenção tenha sidodescrita em conjunto com a descrição detalhada da mesma, adescrição precedente pretende ilustrar e não limitar oescopo da invenção, que é definido pelo escopo dasreivindicações apensas. Outros aspectos, vantagens emodificações se encontram dentro do escopo dasreivindicações.

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Claims (31)

1. Perfil de expressão com referência ao diabetesmelito, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende um padrãode níveis marcadores de uma quantidade eficaz de dois ou mais marcadores selecionados do grupo consistindo emDBRISKMARKERS 1-260, retirados de um ou mais indivíduos quenão estão com o diabetes melito.

2. Perfil, de acordo com a reivindicação 1,CARACTERIZADO pelo fato de que o diabetes melito compreendediabetes do tipo 1, diabetes do tipo 2 ou diabetesgestacional.

3. Perfil de expressão com referência à tolerânciaà glicose comprometida, CARACTERIZADO pelo fato de quecompreende um padrão de níveis marcadores de uma quantidade eficaz de dois ou mais marcadores selecionados do grupoconsistindo em DBRISKMARKERS 1-260, retirados de um ou maisindivíduos que não possuem tolerância à glicosecomprometida.

4. Perfil de expressão de indivíduo com diabetes melito, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende um padrãode níveis marcadores de uma quantidade eficaz de dois oumais marcadores selecionados do grupo consistindo emDBRISKMARKERS 1-260 retirados de um ou mais indivíduos como diabetes melito, correm o risco de desenvolverem o diabetes melito ou estão sendo tratados do diabetes melito.

5. Perfil, de acordo com a reivindicação 4,CARACTERIZADO pelo fato de que o diabetes melito compreendediabetes do tipo 1, diabetes do tipo 2 ou diabetesgestacional.

6. Perfil de expressão de indivíduo com tolerânçiaà glicose comprometida, CARACTERIZADO pelo fato de quecompreende um padrão de níveis marcadores de uma quantidadeeficaz de dois ou mais marcadores selecionados do grupoconsistindo em DBRISKMARKERS 1-260 retirados de um ou maisindivíduos que possuem tolerância à glicose comprometida,correm o risco de desenvolverem tolerância à glicosecomprometida ou estão sendo tratados da tolerância àglicose comprometida.

7. Kit, CARACTERIZADO pelo fato de que compreendevários reagentes de detecção DBRISKMARKER, que detectam osDBRISKMARKERS correspondentes, selecionados do grupoconsistindo em DBRISKMARKERS 1-260, suficientes para geraros perfis das reivindicações 1, 3, 4 ou 6.

8. Kit, de açordo com a reivindicação 7,CARACTERI ZADO pelo fato de que o reagente de detecçãocompreende um ou mais anticorpos ou fragmentos dos mesmos.

9. Kit, de acordo com a reivindicação 7,CARACTERI ZADO pelo fato de que o reagente de detecçãocompreende um ou mais oligonucleotídeos.

10. Kit, de acordo com a reivindicação 7,CARACTERI ZADO pelo fato de que o reagente de detecçãocompreende um ou mais aptâmeros.

11. Meios que podem ser lidos por máquina,CARACTERIZADOS pelo fato de que contêm contendo um ou maisperfis de expressão com referência ao diabetes melito, deacordo com a reivindicação 1 ou um ou mais perfis deexpressão do indivíduo para diabetes melito, de acordo coma reivindicação 4 e opcionalmente, resultados de testeadicionais e informações do indivíduo.

12. Meios que podem ser lidos por máquina,CARACTERIZADOS pelo fato de que contêm um ou mais perfis deexpressão com referência à tolerância à glicosecomprometida, de acordo com a reivindicação 3 ou um ou maisperfis de expressão de indivíduo para tolerância à glicosecomprometida, de acordo com a reivindicação 6 eopcionalmente, resultados de teste adicionais e informaçõesdo indivíduo.

13. Painel DBRISKMARKER, CARACTERIZADO pelo fato deque compreende um ou mais DBRISKMARKERS que são indicativosde uma via fisiológica ou bioquímica associada ao diabetesmelito ou a uma condição pré-diabética.

14. Painel, de acordo com a reivindicação 13,CARACTERIZADO pelo fato de que a via fisiológica oubioquímica compreende regulação autoimune, função deinflamação e endotelial, adesões focais, migraçãotransendotelial de leucócitos, çitotoxicidade mediada porcélula exterminadora natural, regulação do citoesqueleto daactina, aderência/junções herméticas/de abertura einteração matriz extracelular-receptor, desenvolvimento emanutenção de adipócito, linhagem de célula hematopoiética,cascatas de complemento e coagulação, vias de sinalizaçãode células intra e extracelulares.

15. Painel, de acordo com a reivindicação 13,CARACTERIZADO pelo fato de que o diabetes melito compreendediabetes do tipo 1, diabetes do tipo 2 ou diabetesgestacional.

16. Painel, de acordo com a reivindicação 13,CARACTERIZADO pelo fato de que a condição pré-diabéticacompreende IFG, IGT, síndrome metabólica ou síndrome X.

17. Painel DBRISKMARKER, CARACTERIZADO pelo fato deque compreende um ou mais DBRISKMARKERS que são indicativosde um sítio associado ao diabetes melito ou a uma condiçãopré-diabética.

18. Painel, de acordo com a reivindicação 16,CARACTERIZADO pelo fato de que o sítio compreende célulasbeta, células endoteliais, artérias esqueletais e domúsculo liso ou periféricas, cardiovasculares oucerebrovasculares.

19. Painel, de acordo com a reivindicação 16,CARACTERIZADO pelo fato de que o diabetes melito compreendediabetes do tipo 1, diabetes do tipo 2 ou diabetesgestacional.

20. Painel, de acordo com a reivindicação 16,CARACTERIZADO pelo fato de que a condição pré-diabéticacompreende IFG, IGT, síndrome metabólica ou síndrome X.

21. Painel DBRISKMARKER, CARACTERIZADO pelo fato deque compreende um ou mais DBRISKMARKERS que são indicativosda progressão do diabetes melito ou de uma condição pré-diabética .

22. Painel, de acordo com a reivindicação 21,CARACTERIZADO pelo fato de que o diabetes melito compreendediabetes do tipo 1, diabetes do tipo 2 ou diabetesgestacional.

23. Painel, de acordo com a reivindicação 21,CARACTERI ZADO pelo fato de que a condição pré-diabéticacompreende IFG, IGT, síndrome metabólica ou síndrome X.

24. Painel DBRISKMARKER, CARACTERIZADO pelo fato deque compreende um ou mais DBRISKMARKERS que são indicativosda velocidade de progressão do diabetes melito ou de umacondição pré-diabética.

25. Painel, de acordo com a reivindicação 24,CARACTERIZADO pelo fato de que o diabetes melito compreendediabetes do tipo 1, diabetes do tipo 2 ou diabetesgestacional.

26. Painel, de acordo com a reivindicação 24,CARACTERIZADO pelo fato de que a condição pré-diabéticacompreende IFG, IGT, síndrome metabólica ou síndrome X.

27. Painel DBRISKMARKER, CARACTERIZADO pelo fato deque compreende um ou mais DBRISKMARKERS que são específicospara um ou mais tipos de diabetes melito.

28. Painel, de acordo com a reivindicação 27,CARACTERIZADO pelo fato de que o diabetes melito compreendediabetes do tipo 1, diabetes do tipo 2 ou diabetesgestacional.

29. Painel DBRISKMARKER, CARACTERIZADO pelo fato deque compreende um ou mais DBRISKMARKERS que são específicospara a condição pré-diabética.

30. Painel, de acordo com a reivindicação 29,CARACTERIZADO pelo fato de que a condição pré-diabéticacompreende IFG, IGT, síndrome metabólica ou síndrome X.

31. Painel DBRISKMARKER, CARACTERIZADO pelo fato deque compreende dois ou mais DBRISKMARKERS selecionados dogrupo consistindo em: Leptina (LEP) , Haptoglobina (HP) ,Proteína 3 ligando o fator do crescimento semelhante àinsulina (ILGFBP3), Resistina (RETN), Metalopeptidase 2 deMatriz (MMP-2), Enzima de conversão da angiotensina I(peptidil dipeptidase A) -I (ACE), componente 4A decomplemento (C4A), Molécula CD 14 (CD 14) , selectina E(SELE), fator 1 estimulante da colônia (macrófago; CSF1) efator do crescimento endotelial vascular (VEGF), proteínareativa-c (relacionada à pentraxina; CRP), Membro IA daSuperfamília do Receptor do Fator de Necrose de Tumor(TNFRSFIA) , RAGE (Receptor específico para produto final deglicosilação avançada [AGER] ) e CD26 (dipeptidil peptidase 4; DPP4).