BRPI0615429A2 - polinucleotìdeos eg8798 e eg9703 e seus usos - Google Patents

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Abstract

POLINUCLEOTIDEOS EG8798 E EG9703 E SEUS USOS. A presente invenção refere-se a processos para identificação de seqúências de polinucleotídeo e polipeptídeo que podem ser associadas com uma característica comercialmente relevante em plantas, especificamente, assim identificadas seqüências de polinucleotídeos e polipeptídeos para genes relacionados a rendimento EG9703 e EG8798 para arroz, milho, trigo, cevada, sorgo, e cana-de-açúcar. Seqúências assim identificadas são úteis em aperfeiçoamento de características comercialmente desejadas em plantas domesticadas ou plantas ancestrais selvagens, identificação de seqüências de polinucleotídeos relacionadas, genotipificação de uma planta, e marcador de cultivo auxiliado. Seqüências assim identificadas também podem ser usadas para gerarem DNA heterólogo, plantas transgênicas, e células hospedeiras transfectadas.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "POLINU-CLEOTÍDEOS EG8798 E EG9703 E SEUS USOS".
Campo da Invenção
A invenção refere-se a técnicas moleculares e evolucionáriaspara identificação de seqüências de polinucleotídeos e polipeptídeos corres-pondendo a características comercialmente relevantes, como rendimento,em plantas ancestrais e dòmesticadas, as seqüências de polinucleotídeo epolipeptídeo identificadas, e processos de uso de seqüências de polinucleo-tídeo e polipeptídeo identificadas.
Antecedentes da Invenção
Seres humanos têm criado animais e plantas por milhares deanos, selecionando para certas características estéticas e/ou comercialmen-te valiosas. Plantas dòmesticadas diferem de seu ancestral selvagem oumembros de família em características tais como rendimento, florescimentode comprimento de dia curto, teor de proteína e/ou óleo, facilidade de colhei-ta, sabor, resistência a doença e resistência a seca. Animais domesticadosdiferem de seus ancestrais selvagens ou membros de família em caracterís-ticas tais como teor de gordura e/ou proteína, produção de leite, docilidade,fecundidade e tempo para maturidade. Atualmente, maioria dos genes sub-jacentes às-diferenças acima não são conhecidos, nem, tão importantemen-te, são as específicas mudanças que evoluíram nestes genes para provi-mento destas capacidades. Entendimento das bases destas diferenças entreplantas e animais domesticados e seus membros de família ou ancestraisselvagens proverá informação útil para manutenção e aperfeiçoamento des-tas características. No caso de plantas de colheitas, identificação dos espe-cíficos genes que controla desejadas características permitirá direto e rápidoaperfeiçoamento em uma maneira anteriormente impossível.
A identificação em espécies dòmesticadas de genes que evoluí-ram para conferirem funções alteradas ou aperfeiçoadas, únicas, compara-dos a genes ancestrais homólogos pode ser usada para desenvolver agen-tes para modulação destas funções. A identificação dos subjacentes genesde espécies dòmesticadas e as específicas mudanças de nucleotídeos queevoluíram, e ainda a caracterização das mudanças físicas e bioquímicas nasproteínas codificadas por estes genes evoluídos, pode prover valiosa infor-mação sobre os mecanismos subjacentes à característica desejada. Estainformação valiosa pode ser aplicada a criação auxiliada com marcador deDNA ou seleção assistida com marcador de DNA. Alternativamente, estainformação pode ser usada no desenvolvimento de agentes que ainda aper-feiçoam a função das proteínas-alvo. Alternativamente, ainda a engenhariados genes responsáveis pode modificar ou aumentar a desejada caracterís-tica. Adicionalmente, os genes identificados podem ser verificados desem-penharem um papel em controle de características de interesse em outrasplantas domesticadas.
Seres humanos, através de seleção artificial, proporcionaram in-tensas pressões de seleção sobre plantas de colheitas. Esta pressão é refleti-da em significantes mudanças evolucionárias entre genes homólogos de or-ganismos domesticados e seus membros de família ou ancestrais selvagens.Foi verificado que somente uns poucos genes, por exemplo, 10-15 por espé-cie, controlam características de interesse comercial em plantas de colheitadomesticadas. Estes poucos genes têm sido difíceis em excesso para identifi-cação através de processos-padrão de biologia molecular de planta.
Processos para identificação de genes alterados devido a do--mesticação são descritos em patentes e pedidos de patente relacionadoslistados acima. Processos para criação assistida com marcador de DNA(MAB) e seleção assistida com marcador de DNA (MAS) são bem-conhecidos por aqueles versados na técnica e foram descritos em muitaspublicações (ver, por exemplo, Peleman e van der Voort, Breeding by De-sign, TRENDS in Plant Science 8(7):330-334). Tais processos podem tornarcriação de planta mais eficiente através de aumento de habilidade para sele-cionar e incorporar específicos alelos associados com um fenótipo desejadodurante o desenvolvimento de novas variedades de plantas. Um problemacom marcadores genericamente usados atualmente é que eles podem setornar separados de genes-alvo ou características através de recombinação(ver Holland in Proceedings of the 4,h International Crop Science Congress26 Sep - 1 Oct 2004, Brisbane, Austrália). De fato, Holland cita exemplosonde uso de marcadores foi melhor que criação convencional, e outros e-xemplos onde criação convencional rendeu melhores resultados que criaçãoassistida com marcador. Holland estabelece que "não é provável que mar-cadores sejam logo genericamente úteis para manipulação de característi-cas complexas como rendimento". O que é necessário para marcadores se-rem úteis para manipulação de características complexas como rendimentosão os específicos genes subjacentes a tais características complexas emvez de marcadores que são somente algumas vezes associados com taiscaracterísticas complexas.
Sumário da Invenção
Em uma modalidade, a presente invenção inclui um processopara identificação de uma seqüência de polinucleotídeo que é associadacom rendimento em uma plantas, compreendendo as etapas de: compara-ção de pelo menos uma porção da seqüência de polinucleotídeo de plantacom pelo menos um polinucleotídeo compreendendo pelo menos uma por-ção de um polinucleotídeo selecionado do grupo consistindo em seqüênciade polinucleotídeo EG8798 e uma seqüência de polinucleotídeo EG9703; eidentificação de pelo menos uma seqüência de polinucleotídeo na planta quecontém pelo menos uma mudança de nucleotídeo comparada ao polinucleo-tídeo com preendendo pelo menos uma porção do polinucleotídeo selecio-nado do grupo consistindo em uma seqüência de polinucleotídeo EG8798 euma seqüência de polinucleotídeo EG9703, onde a dita seqüência de poli-nucleotídeo identificada está associada com rendimento em uma planta.
Em outras modalidades, a presente invenção também provê se-qüências de polinucleotídeo e seqüências de polipeptídeo para EG8798 eEG9703 de O. rufipogon, O. sativa, T. aestivum, H. vlgare, Z. mays mays, P.typhoids, S. bicolor, e S. officiniarum, e inclui células hospedeiras transfecta-das, células de planta transfectadas, e plantas transgênicas contendo estasseqüências.
Em outras modalidades, a presente invenção inclui processos dedeterminação de se a planta tem um polinucleotídeo ou polipeptídeo particularEG8798 ou EG9703 que opcionalmente permite uma previsão de rendimentodaquela planta, e processos para criação assistida com marcador usando po-linucleotídeo ou polipeptídeos EG8798 ou EG9703 da presente invenção.Breve Descrição das Figuras
A Figura 1 mostra um modelo aditivo de fator simples corrigidopara efeitos de linha mostrando efeitos de alelo de EG9703 ou EG8798 so-bre características fenotípicas (R2 > 0,20 indica um principal efeito de gene).
A Figura 2 mostra o perfil de expressão de quatro genes sele-cionados positivamente incluindo EG9703 e EG8798.
Descrição Detalhada da Invenção
Com a presente invenção, os inventores identificaram genes,polinucleotídeos e polipeptídeos correspondendo a EG9703 (para O. sativa(arroz domesticado) e O.rufipogon (arroz ancestral)), e polinucleotídeos cor-respondendo a EG8798 (para O. sativa (arroz domesticado) e O. rufipogon(arroz ancestral), T. aestivum, H. vulgare, S. bicolor, Z. mays mays, P. ty-phoides, e S. officiniarum). Os polinucleotídeos e polipeptídeos da presenteinvenção são úteis em uma variedade de processos tal como o processopara identificar uma seqüência de polinucleotídeos que está associada comrendimento em uma planta; um processo de determinação de se uma plantatem uma ou mais de uma seqüência de polinucleotídeo compreendendo umaseqüência EG8798 ou EG9703; e um processo para geração assistida commarcador de plantas para uma particular seqüência EG8798 ou EG9703. Ospolinucleotídeos e polipeptídeos da presente invenção também são úteispara criação de células de plantas, materiais de propagação, plantas trans-gênicas, e células hospedeiras transfectadas.
Adicionalmente, os polinucleotídeos e polipeptídeos da presenteinvenção podem ser usados como marcadores para aperfeiçoada seleçãoassistida por marcador ou criação assistida por marcador. Além disso, taispolinucleotídeos e polipeptídeos podem ser usados para identificação degenes homólogos em outras espécies que compartilham um membro de fa-mília ou ancestral comum, para uso como marcadores na criação de taisoutras èspécies. Por exemplo, milho, arroz, trigo, painço, sorgo e outros cere-ais compartilham um membro de família ou ancestral comum, e genes identi-ficados em arroz podem conduzir diretamente a genes homólogos nestas ou-tras ervas. Da mesma maneira, tomates e batatas compartilham um membrode família ou ancestral comum, e genes identificados em tomates pelo pro-cesso objeto são esperados terem homólogos em batatas, e vice-versa.
A prática da presente invenção emprega, à menos que de outromodo indicado, técnicas convencionais de biologia molecular, genética eevolução molecular, que estão dentro do conhecimento da técnica. Tais téc-nicas são inteiramente explicadas na literatura, tal como: "Molecular Cloning:A Laboratory Manual", segunda edição (Sambrook et al., 1989); "Oligonucle-otide Synthesis" (M.J. Gait, ed., 1984); "Current Protocols in Molecular Bio-logy" (F.M. Ausubel et al., eds., 1987); "PCR: The Polymerase Chain Reacti-on"< (Mullis et al., eds., 1994); "Molecular Evolution", (Li, 1997).
Definições
É para ser notado que o termo "um" ou "uma" entidade refere-sea uma ou mais daquela entidade; por exemplo, um gene refere-se a um oumais genes ou pelo menos um gene. Como tais, os termos "um" (ou "uma"),"um ou mais" e "pelo menos um" podem ser usados aqui intercambiavelmen-te. Também é para ser notado que os termos "compreendendo", "incluindo",e "tendo" podem ser~usados intercambiavelmente,
Como aqui usado, um "polinucleotídeo" refere-se a uma formapolimérica de nucleotídeos de qualquer comprimento, tanto ribonucleotídeoscomo desoxirribonucleotídeos, ou seus análogos. Este termo refere-se à es-trutura primária da molécula, e assim inclui DNA de filamento simples e du-pio, assim como RNA de filamento dupla e simples. Ele também inclui poli-nucleotídeos modificados como polinucleotídeos metilados e/ou capeados,polinucleotídeos contendo bases modificadas, modificações de cadeia prin-cipal, e semelhantes. Os termos "polinucleotídeo" e "seqüência de nucleotí-deos" são usados intercambiavelmente.
Como aqui usado, um "gene" refere-se a um polinucleotídeo ouporção de um polinucleotídeo compreendendo uma seqüência que codificauma proteína. É bem entendido na técnica que um gene também compreen-de seqüências não-codificantes, tais como seqüências flanqueantes 5' e 3'(como seqüências promotoras, aperfeiçoadoras, repressoras, e outras regu-ladoras) assim como introns.
Os termos "polipeptídeo", "peptídeo", e "proteína" são aqui usa-dos intercambiavelmente para referirem-se a polímeros de aminoácidos dequalquer comprimento. Estes termos também incluem proteínas que sãopós-tradução modificadas através de reações que incluem glicosilação, ace-tilação e fosforilação.
O termo "organismo domesticado" refere-se a um organismovivo individual ou população dos mesmos, uma espécie, subespécie, varie-dade, cultivar ou linhagem, que foi submetida a pressão de seleção artificiale desenvolveu uma característica relevante comercialmente ou esteticamen-te. Em algumas modalidades preferidas, o organismo domesticado é umaplanta selecionada do grupo consistindo em milho, trigo, arroz, sorgo, tomateou batata, ou qualquer outra planta domesticada de interesse comercial, on-de um membro de família ou ancestral é conhecido. Uma "planta" é qualquerplanta em qualquer estágio de desenvolvimento, particularmente uma se-mente de planta.
O termo "membro de família ou ancestral selvagem" ou "membrode família ou ancestral" significa um organismo, espécie, subespécie, varie-dade, cultivar ou linhagem predecessor ou precursor, a partir do qual umorganismo, espécie, subespécie, variedade, cultivar ou linhagem domestica-da evoluiu. Um organismo domesticado pode ter um ou mais de um membrode família ou ancestral. Tipicamente, plantas domesticadas podem ter um ouuma pluralidade de membros de família ou ancestrais, enquanto animaisdomesticados usualmente têm somente um único membro de família ou an-cestral.
O termo "característica comercial ou esteticamente relevante" éaqui usado para referir-se a características que existem em organismos do-mesticados tais como plantas ou animais cuja análise pode prover informa-ção (por exemplo, dados físicos ou bioquímicos) relevantes para o desenvol-vimento de organismos aperfeiçoados ou de agentes que podem modular opolipeptídeo responsável pela característica, ou o respectivo polinucleotídeo.A característica comercial ou esteticamente relevante pode ser única, aper-feiçoada ou alterada em relação ao membro de família ou ancestral. Por "al-terada", é pretendido que a característica relevante difere qualitativa ouquantitativamente de características observadas no membro de família ouancestral. Uma característica comercial ou esteticamente relevante preferidaé rendimento.
O termo "processos tipo KA/KS" significa processos que avaliamdiferenças, freqüentemente (mas nem sempre) mostradas como uma razão,entre o número de substituições não-sinônimas e substituições sinônimasem genes homólogos (incluindo os processos mais rigorosos que determi-nam sítios não-sinônimos e sinônimos). Estes processos são designadosusando vários sistemas de nomenclatura, incluindo mas não limitado aKA/Ks, dN/ds, Dn/Ds.
Os termos "mudança evolucionariamente significante" e "mu-dança evolucionária adaptativa" referem-se a uma ou mais mudanças deseqüência de peptídeo ou nucleotídeo entre dois organismos, espécies,subespécies, variedades, cultivares e/ou linhagens que podem ser atribuídasa relaxamento de pressão seletiva ou pressão seletiva positiva. Um processopara determinação de presença de uma mudança evolucionariamente signi-ficante é aplicar um processo analítico tipo KA/KS, de modo a medir uma ra-zão Ka/Ks. Tipicamente, uma razão KA/Ks de 1,0 ou maior é considerada seruma mudança evolucionariamente significante.
Estritamente falando, razões KA/Ks de exatamente 1,0 são indi-cativas de relaxamento de pressão seletiva (evolução neutra), e razõesKA/Ks maiores que 1,0 são indicativas de seleção positiva. Entretanto, é co-mumente aceito que os ESTs em GenBank e outras bases de dados públi-cas freqüentemente sofrem de algum grau de erro de seqüenciamento, emesmo uns poucos nucleotídeos incorretos podem influenciar razões KaZKs.Por esta razão, polinucleotídeos com razões KA/Ks tão baixas como 0,75podem ser cuidadosamente re-seqüenciados e reavaliados para relaxamen-to de pressão seletiva (mudança evolucionária significante neutra), pressãode seleção positiva (mudança evolucionariamente significante positiva), oupressão seletiva negativa (mudança evolucionariamente conservativa).
O termo "mudança evolucionariamente significante positiva" sig-nifica uma mudança evolucionariamente significante em um particular orga-nismo, espécies, subespécies, variedade, cultivar, ou linhagem que resultaem uma mudança adaptativa que é positiva comparada a outros organismosrelacionados. Um exemplo de uma mudança evolucionariamente significantepositiva é uma mudança que resultou em aperfeiçoádo rendimento em plan-tas de colheitas. Como estabelecido acima, seleção positiva é indicada poruma razão KA/KS maior que 1,0. Com crescente preferência, o valor KA/Ks émaior que 1,25, 1,5 e 2,0.
O termo "mudança evolucionariamente significante neutra" refe-re-se a uma mudança de polinucleotídeo ou polipeptídeo que aparece emum organismo domesticado em relação a seu organismo ancestral, e quedesenvolveu sob condições neutras. Uma mudança evolucionária neutra éevidenciada por um valor KA/KS de entre cérca de 0,75-1,25, preferivelmenteentre cerca de 0,9 a 1,1, e mais preferivelmente igual a cerca de 1,0. Tam-bém, no caso de evolução neutra, não há "direcionalidade" a ser inferida. Ogene é livre para acumular mudanças sem restrição, de modo que ambas asversões ancestral e domesticada estão mudando.urna com relação a outra.
O termo "homólogo" ou "ortólogo" é conhecido e bem entendidona técnica e refere-se a seqüências relacionadas que compartilham ummembro de família ou ancestral comum e é determinado baseado no grau deidentidade de seqüência. Estes termos descrevem a relação entre um geneencontrado em uma espécie, subespécie, variedade, sultivar ou linhagem eo correspondente ou equivalente gene em outras espécies, subespécies,variedade, cultivar ou linhagem. Para propósitos desta invenção seqüênciashomólogas são comparadas. "Seqüências homólogas" ou "homólogos" ou"ortólogos" são pensadas, acreditadas ou conhecidas serem funcionalmenterelacionadas. Uma relação funcional pode ser indicada em qualquer um deum número de maneiras, incluindo, mas não limitado a, (a) grau de identida-de de seqüência; (b) mesma ou similar função biológica. Preferivelmente,ambos (a) e (b) são indicados. O grau de identidade de seqüência pode va-riar, mas é preferivelmente pelo menos 50% (quando usando programas dealinhamento de seqüência padrões conhecidos na técnica), mais preferivel-mente pelo menos 60%, mais preferivelmente pelo menos cerca de 75%,mais preferivelmente pelo menos cerca de 85%. Homologia pode ser deter-minada usando programas de software facilmente disponíveis na técnica,tais como aqueles discutidos em Current Protocols in Molecular Biology(F.M. Ausubel et al., eds., 1987) Supplement 30, section 7.718, Table 7.71.Programas de alinhamento preferidos são MacVector (Oxford Molecular Ltd.,Oxford, U.K.) e ALIGN Plus (Scientific and Educational Software, Pennsylva-nia). Um outro programa de alinhamento preferido é Sequencher (Gene Co-des, Ann Arbor, Michigan), usando parâmetros default.
O termo "mudança de nucleotídeo" refere-se a substituição, su-pressão e/ou inserção de nucleotídeo, como é bem entendido na técnica."Genes domésticos" é um termo bem entendido na técnica esignifica aqueles genes associados com função geral de célula, incluindomas não limitado a crescimento, divisão, estase, metabolismo e/ou morte.Genes "domésticos" genericamente realizam funções encontradas em maisde um tipo de célula. Em contraste, genes específicos de célula generica-mente desempenham funçõesjem um particular tipo e/ou classe de célula.
O termo "agente", como aqui usado, significa um composto bio-lógico ou químico tal como uma molécula orgânica ou inorgânica simples oucomplexa, um peptídeo, uma proteína, ou um oligonucleotídeo que modula afunção de um polinucleotídeo ou polipeptídeo. Um vasto arranjo de compos-tos pode ser sintetizado, por exemplo, oligômeros, tais como oligopeptídeose oligonucleotídeos, e compostos orgânicos e inorgânicos sintéticos basea-dos em várias estruturas de núcleo, e estes também são inclusos no termo"agente". Em adição, várias fontes naturais podem prover compostos paraseleção, tais como extratos de planta ou animal, e semelhantes. Compostospodem ser testados sozinhos ou em combinação uns com os outros.
O termo "para modular função" de um polinucleotídeo ou poli-peptídeo significa que a função do polinucleotídeo ou polipeptídeo é alteradaquando comparada a não adição de um agente. Modulação pode ocorrersobre qualquer nível que afete função. Uma função de polinucleotídeo oupolipeptídeo pode ser direta ou indireta, e medida diretamente ou indireta-mente.
Uma "função de um polinucleotídeo" inclui, mas não é limitada a,replicação; tradução; padrão de expressão. Uma função de polinucleotídeotambém inclui funções associadas com um polipeptídeo codificado dentro depolinucleotídeo. Por exemplo, um agente que atua sobre um polinucleotídeoe afeta expressão de proteína, conformação, dobra (ou outras característicasquímicas), ligação a outras metades (tais como ligantes), atividade (ou outrascaracterísticas funcionais), regulação e/ou outros aspectos de estrutura deproteína ou função é considerado ter modulado função de polinucleotídeo.
Uma "função de um polipeptídeo" inclui, mas não é limitada a,conformação, dobra (ou outras características físicas), ligação a outras me·tades (como ligantes), atividade (ou outras características funcionais), e/ououtros aspectos de estrutura ou funções de proteína. Por exemplo, um agen-te que atua sobre um polipeptídeo e afeta sua conformação, dobra (ou ou-tras características físicas), ligação a outras metades (tais como ligantes),atividade (ou outras características funcionais), e/ou outros aspectos de es-trutura ou funções de proteína é considerado ter modulado função de poli-peptídeo. Os modos em que um agente efetivo pode atuar para modular afunção de um polipeptídeo incluem, mas não são limitados a 1) mudança deconformação, dobra ou outras características físicas; 2) mudança de resis-tência de ligação a seu Iigante natural ou mudança de especificidade de Ii-gação a ligantes; e 3) alteração de atividade do polipeptídeo.
O termo "sítio-alvo" significa uma localização em um polipeptí-deo que pode ser um aminoácido simples e/ou é uma parte de, um motivoestrutural e/ou funcional, por exemplo, um sítio de ligação, um domínio dedimerização, ou um sítio catalítico ativo. Sítios-alvo podem ser úteis parainteração direta ou indireta com um agente, tal como um agnete terapêutico.
O termo "diferença molecular" inclui qualquer diferença estruturale/ou funcional. Processos para detectar tais diferenças, assim como exem-pios de tais diferenças, são aqui descritos.
Um "efeito funcional" é um termo bem-conhecido na técnica, esignifica qualquer efeito que é exibido sobre qualquer nível de atividade, sedireta ou indireta.
O termo "facilidade de colheita" refere-se a características deplantas que facilitam coleta manual ou automatizada de estruturas ou por-ções (por exemplo, fruto, folhas, raízes) para consumo ou outro processa-mento comercial.
O termo "rendimento" refere-se à quantidade de tecido de plantaou animal ou material que é disponível para uso por seres humanos paraalimentação, terapêutica, veterinária ou outros mercados.
O termo "produtividade econômica aperfeiçoada" refere-se à ha-bilidade para modular uma característica comercial ou esteticamente rele-vante de modo a aperfeiçoar características desejadas. Aumentado rendi-mento e aperfeiçoada resistência a tensão são dois exemplos de aperfeiço-ada produtividade econômica.
Procedimentos Gerais Conhecidos na Técnica
Para os propósitos desta invenção, a fonte do polinucleotídeo daplanta domesticada ou seu membro de família ou ancestral pode ser qual-quer fonte apropriada, por exemplo, seqüências genômicas ou seqüências—de ADNc. Preferivelmente, seqüências de ADNc são comparadas. Seqüên-cias codificando proteína podem ser obtidas de bases de dados privadas,públicas e/ou comerciais disponíveis tais como aquelas aqui descritas. Asbases de dados servem como repositórios dos dados de seqüência molecu-lar gerados por esforços de pesquisa em andamento. Alternativamente, se-qüências codificando proteína podem ser obtidas de, por exemplo, seqüen-ciamento de ADNc reverso transcrito de ARNm expresso em células, ou a-pós amplificação PCR, de acordo com processos bem-conhecidos na técni-ca. Alternativamente, seqüências genômicas podem ser usadas para compa-ração de seqüência. Seqüências genômicas podem ser obtidas de bases dedados públicas, privadas e/ou comerciais disponíveis ou de seqüenciamentode bibliotecas de DNA genômico ou de DNA genômico, após PCR.Em algumas modalidades, o ADNc é preparado a partir deARNm obtido de um tecido em um determinado estágio de desenvolvimento,ou um tecido obtido após o organismo ter sido submetido a certas condiçõesambientais. Bibliotecas de ADNc usadas para a comparação de seqüênciada presente invenção podem ser construídas usando técnicas de construçãode biblioteca de ADNc que são inteiramente explicadas na literatura da téc-nica. ARNm1S totais são usados como moldes para ADNc1S de transcriçãoreversa. ADNc1S transcritos são subclonados em apropriados vetores paraestabelecimento de uma biblioteca de ADNc. A biblioteca de ADNe estabele-cida pode ser maximizada para teores de ADNc de inteiro comprimento, em-bora ADNc1S de menos que comprimento total possam ser utilizados. Alémdisso, a freqüência de seqüência pode ser normalizada de acordo com, porexemplo, Bonaldo et al. (1996) Genome Research 6:791—806. Clones deADNc randomicamente selecionados a partir da biblioteca de ADNc podemser seqüenciados usando técnicas padrões de seqüenciamento automatiza-do. Preferivelmente, clones de ADNc de inteiro comprimento são usadospara seqüenciamento. Tanto a inteira ou uma grande porção de clones deADNc de uma biblioteca de ADNc podem ser seqüenciados, embora tam-bém seja possível praticar algumas modalidades da invenção através deseqüenciamento de tão pouco como um simples clone de-ADNc, ou váriosclones de ADNc.
Em uma modalidade preferida da presente invenção, clones deADNc a serem seqüenciados podem ser pré-selecionados de acordo comsua especificidade de expressão. De modo a selecionar ADNc1S correspon-dendo a genes ativos que são especificamente expressos, os ADNc1S podemser submetidos a hibridização de subtração usando ARNm1S obtidos de ou-tros órgãos, tecidos ou células do mesmo organismo. Sob certas condiçõesde hibridização com apropriada rigorosidade e concentração, aquelesADNc1S que hibridizam com ARNm1S específicos não-tecido e assim prova-velmente representam genes "domésticos" serão excluídos da reunião deADNc. Da mesma maneira, ADNc1S restantes a serem seqüenciados sãomais prováveis serem associados com funções específicas de tecido. Para opropósito de hibridização de subtração, ARNm1S específicos não-tecido po-dem ser obtidos a partir de um tecido, ou preferivelmente de uma combina-ção de diferentes tecidos e células. A quantidade de ARNm1S específicosnão-tecido é maximizada para saturar os ADNc1S específicos de tecido.
Alternativamente, informação de bases de dados podem ser u-sadas para seleção ou renderem prioridade para ADNc1S que são mais pro-váveis de serem associados com específicas funções. Por exemplo, os can-didatos ADNc ancestrais para seqüenciamento podem ser selecionados porPCR usando iniciadores desenhados de seqüências de ADNc de organismodomesticado candidato. Seqüências de ADNc de organismo domesticadocandidato são, por exemplo, aquelas que são somente encontradas em umaespecífica porção de uma planta, ou que correspondem a genes prováveisde serem importantes na específica função. Tais específicas seqüências deADNc podem ser obtidas através de pesquisa de bases de dados de se-qüências nas quais informação com relação ao perfil de expressão e/ou ati-vidade biológica para seqüências de ADNc podem ser especificada.
Seqüências de homólogo(s) ancestral para um gene de orga-nismo domesticado conhecido podem ser obtidas usando processos padrõesna técnica, tais como processos PCR (usando, por exemplo, GeneAmp PCRSystem 9700 thermocyclers (Applied Bicsystems, Inc.)). Por exemplo, candi-datos ADNc ancestrais para seqüenciamento podem ser selecionados porPCR usando iniciadores desenhados de seqüências de ADNc de organismodomesticado candidato. Para PCR, iniciadores podem ser obtidos a partir deseqüências de organismo domesticado usando processos padrões na técni-ca, incluindo programas de desenho de iniciador publicamente disponíveistais como PRIMER (Whitehead lnstitute). A seqüência ancestral amplificadaentão pode ser seqüenciada usando processos e equipamento padrões natécnica, tais como seqüenciadores automatizados (Applied Biosystems, Inc.).Da mesma maneira, imitações de gene de membros de família ou ancestralpodem ser usadas para obtenção de correspondentes genes em organismosdomesticados.
Identificação de Polinucleotídeos Selecionados Positivamente em Orqanis-mos Domesticados
Em uma modalidade preferida, os processos aqui descritos po-dem ser aplicados para identificar os genes que controlam características deinteresse em plantas domesticadas agriculturalmente importantes. Sereshumanos criaram plantas domesticadas por vários milhares de anos semconhecimento dos genes que controlam estas características. Conhecimentodos específicos mecanismos genéticos envolvidos pode permitir intervençãomuito mais rápida e direta no nível molecular para criar plantas com caracte-rísticas desejáveis ou aperfeiçoadas.
Seres humanos, através de seleção artificial, proveram intensaspressões de seleção sobre plantas de colheitas. Esta pressão é refletida emsignificantes mudanças evolucionárias entre genes homólogos de organis-mos domesticados e seus membros de família ou ancestrais selvagens. Foiverificado que somente uns poucos genes, por exemplo, 10-15 por espécie,controlam características de interesse comercial em plantas de colheita do-mesticadas. Estes poucos genes têm sido excedentemente difíceis de identi-ficar através de processos padrões de biologia molecular de planta. As aná-lises KA/Ks e relacionadas aqui descritas podem identificar os genes contro-lando características de interesse.
Para qualquer planta de colheita de interesse, bibliotecas deADNc podem ser construídas a partir de espécies ou subespécies domesti-cadas e seu membro de família ou ancestral. Como é descrito em USSN09/240 915, depositado em 29 de janeiro de 1999, as bibliotecas de ADNcde cada são "BLASTed" umas contra as outras para identificação de polinu-cleotídeos homólogos. Alternativamente, o técnico versado pode acessarbases de dados de ADNc ou genômico comercialmente e/ou publicamentedisponíveis antes que construindo bibliotecas de ADNc.
A seguir, uma análise KA/Ks ou relacionada pode ser conduzidapara identificar genes selecionados que rapidamente evoluíram sob pressãoseletiva. Estes genes são então avaliados usando processos padrões deplanta transgênica ou molecular para determinar se eles desempenham umpapel nas características de interesse comercial ou estética. Usando os pro-cessos da invenção, os inventores identificaram polinucleotídeos e polipeptí-deos correspondendo a genes EG8798 e EG9703, que são genes relaciona-dos com rendimento. Os genes de interesse podem ser manipulados atravésde, por exemplo, mutagênese randômica ou direcionada a sítio, para desen-volvimento de novas variedades, subespécies, linhagens ou cultivares.
Genericamente, em uma modalidade da presente invenção, se-qüências de nucleotídeos são obtidas de um organismo domesticado e ummembro de família ou ancestral selvagem. As seqüências de nucleotídeosde membro de família ou ancestral de organismo domesticado são compa-radas umas às outras para identificar seqüências que são homólogas. Asseqüências homólogas são analisadas para identificar aquelas que têm dife-renças de seqüência de ácido nucléico entre o organismo domesticado emembro de família ou ancestral. Então análise de evolução molecular é con-duzida para avaliar quantitativamente e qualitativamente a significância evo-lucionária das diferenças. Para genes que foram selecionados positivamen-te, análise fora de grupo pode ser feita para identificar aqueles genes queforam positivamente selecionados no organismo domesticado (ou no mem-bro de família ou ancestral). A seguir, a seqüência é caracterizada em ter-mos de identidade molecular/genética e função biológica. Finalmente, a in-formação pode ser usada para identificar agentes que podem modular a fun-ção biológica do polipeptídeo codificado pelo gene.
Os processos genéricos da invenção vinculam comparação deseqüências de nucleotídeos codificando proteína de organismos domestica-dos e ancestrais. Bioinformática é aplicada à comparação e seqüências sãoselecionadas que contêm uma mudança ou mudanças de nucleotídeo queé/são mudança(s) evolucionariamente significante. A invenção permite a i-dentificação de genes que evoluíram para conferir alguma vantagem evolu-cionária e a identificação das específicas mudanças evoluídas. Por exemplo,o organismo domesticado pode ser Oryza sativa e o membro de família ouancestral selvagem Oryza rufipogon. No caso da presente invenção, se-qüências de nucleotídeos codificando proteína foram obtidas de clones deplantas através de técnicas-padrão de seqüenciamento.Seqüências codificando proteína de um organismo domesticadoe sem membro de família ou ancestral são comparadas para identificação deseqüências homólogas. Qualquer mecanismo apropriado para completaresta comparação é contemplado por esta invenção. Alinhamento pode serrealizado manualmente ou através de software (exemplos de apropriadosprogramas de alinhamento são conhecidos na técnica). Preferivelmente, se-qüências codificando proteína de um membro de família ou ancestral sãocomparadas às seqüências de espécies domesticadas via buscas de basede dados, por exemplo, buscas BLAST. O alto escore de "acertos", isto é,seqüências que mostram uma significante similaridade após análise BLAST,serão recuperadas e analisadas. Seqüências mostrando uma significantesimilaridade podem ser aquelas tendo pelo menos cerca de 60%, pelo me-nos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, oupelo menos cerca de 90% de identidade de seqüência. Preferivelmente, se-qüências mostrando mais que cerca de 80% de identidade são ainda anali-sadas. As seqüências homólogas identificadas via pesquisa de base de da-dos podem ser alinhadas em sua totalidade usando processos de alinha-mento de seqüência e programas que são conhecidos e disponíveis na téc-nica, tal como o programa de alinhamento simples comumente usadoCLUSTAI V por Higgíns et al. (1992) CABIOS 8:189-191.
Como um exemplo, seqüências de nucleotídeos obtidas de O.rufipogon podem ser usadas como seqüências questões em uma busca deESTs de O. sativa em GenBankI para identificar seqüências homólogas. De-ve ser notado que uma seqüência de nucleotídeos codificando proteínacompleta não é requerida. Realmente, seqüências de ADNc parciais podemser comparadas. Uma vez seqüências de interesse sejam identificadas atra-vés de processos descritos abaixo, ainda processos de clonagem e/ou bioin-formática podem ser usados para obter a inteira seqüência codificante parao gene ou proteína de interesse.
Alternativamente, o seqüenciamento e comparação de homolo-gia de seqüências codificando proteína entre o organismo domesticado eseu ancestral ou membro de família pode ser realizada simultaneamenteatravés do uso de tecnologia de chip de seqüenciamento. Ver, por exemplo,Rava et al., patente US 5 545 531.
As seqüências de codificação de proteína alinhadas de organis-mo domesticado e ancestral ou membro de família são analisadas para iden-tificação de diferenças de seqüências de nucleotídeos em sítios particulares.Novamente, qualquer processo apropriado para obtenção desta análise écontemplado por esta invenção. Se não há diferenças de seqüências de nu-cleotídeos, a seqüência codificando proteína de ancestral ou membro defamília não é usualmente ainda analisada. As mudanças de seqüência de-tectadas são genericamente, e preferivelmente, inicialmente verificadas paraprecisão. Preferivelmente, a verificação inicial compreende modalidade deuma ou mais das seguintes etapas, qualquer e todas das quais são conheci-das na técnica: (a) encontro de pontos onde existem mudanças entre as se-qüências de organismo ancestral e domesticado; (b) verificação de fluoro-grama de seqüência (cromatograma) para determinar se as bases que pare-cem únicas para o organismo ancestral ou membro de família ou domestica-do correspondem a sinais fortes, claros, específicos para a base chamada;(c) verificação de acertos de organismo domesticado para ver se há mais deuma seqüência de organismo domesticado que corresponde a uma mudan-ça de seqüência. Múltiplas entradas de seqüência de organismo domestica-do para o mesmo gene que tem o mesmo nucleotídeo em uma posição ondehá um diferente nucleotídeo em uma seqüência de ancestral ou membro defamília provê suporte independente de que a seqüência domesticada é pre-cisa, e que a mudança é significante. Tais mudanças são examinadas usan-do informação de base de dados e o código genético para determinar se es-tas mudanças de seqüência de nucleotídeo resultam em uma mudança naseqüência de aminoácidos da proteína codificada. Como a definição de"mudança de nucleotídeo" torna claro, a presente invenção abrange pelomenos uma mudança de nucleotídeo, tanto uma substituição, uma supres-são ou uma inserção, em uma seqüência de polinucleotídeos de codificaçãode proteína de um organismo domesticado como comparada a uma corres-pondente seqüência do ancestral ou membro de família. Preferivelmente, amudança é uma substituição de nucleotídeo. Mais preferivelmente, mais deuma substituição está presente na seqüência identificada e é submetida aanálise de evolução molecular.
Em uma modalidade, a presente invenção inclui um processopara identificação de uma seqüência de polinucleotídeos que é associadacom rendimento em planta. Este processo inclui a etapa de comparação depelo menos uma porção de seqüência de polinucleotídeo de planta com pelomenos uma seqüência de polinucleotídeo EG8798 e/ou seqüência de poli-nucleotídeo EG9703. Este processo também inclui a etapa de identificaçãode pelo menos uma seqüência de polinucleotídeo na planta que contém pelomenos uma mudança de nucleotídeo comparada a um polinucleotídeo sele-cionado do grupo consistindo em uma seqüência de polinucleotídeo EG8798e uma seqüência de polinucleotídeo EG9703, onde a dita seqüência de poli-nucleotídeo identificada é associada com rendimento em uma planta. Se-qüências de polinucleotídeos de EG9703 e EG8798 preferidas incluem umaseqüência de polinucleotídeos compreendendo pelo menos uma porção deSEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 7;SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 11; SEQ ID NO: 13; SEQ IDNO: 14; SEQ ID NO: 15; SEQ ID NO: 16; SEQ ID NO: 17; SEQ ID NO: 18;SEQ ID NO: 19; SEQ ID NO: 20; SEQ ID NO: 21; SEQ ID NO: 22; SEQ IDNO: 23; SEQ ID NO: 24; SEQ ID NO: 25; SEQ ID NO: 26; SEQ ID NO: 27;SEQ ID NO: 28; SEQ ID NO: 29; SEQ ID NO: 30; SEQ ID NO: 31; SEQ IDNO: 32; SEQ ID NO: 33; SEQ ID NO: 34; SEQ ID NO: 35; SEQ ID NO: 36;SEQ ID NO: 37; SEQ ID NO: 38; SEQ ID NO: 39; SEQ ID NO: 40; SEQ IDNO: 41; e um polinucleotídeo tendo pelo menos cerca de 70% de identidadede seqüência para qualquer uma das SEQ ID NOs anteriores.
Seqüência de polinucleotídeo de planta preferida inclui seqüên-cia de planta que é derivada de DNA genômico ou derivada dos genes ex-pressos de uma planta, isto é, ADNc. Processos para assim fazer são co-nhecidos na técnica e são discutidos em outra parte no presente relatóriodescritivo.
Preferivelmente, a seqüência de polinucleotídeo EG9703 ouEG8798 é associada com aumentado rendimento em uma planta. Processospara determinar e quantificar rendimentos são conhecidos na técnica, e dis-cutidos em outras parte no presente relatório descritivo. Mais preferivelmen-te, rendimento pode ser quantificado através de determinação de se rendi-mento é aumentado em relação a uma segunda planta de um ancestral, gê-nero ou membro de família comum, mais preferivelmente a mesma espécie,mesmo mais preferivelmente o mesmo cultivar, tendo uma segunda seqüên-cia de polinucleotídeo EG9703 ou EG8798 com pelo menos uma mudançade nucleotídeo em relação à seqüência de polinucleotídeos de EG9703 ouEG8798 a partir da planta.
Em todas as modalidades da presente invenção, uma seqüênciade polinucleotídeos preferida inclui um polinucleotídeo tendo pelo menoscerca de 60% de identidade de seqüência a um polinucleotídeo EG9703 ouEG8798 da presente invenção e tem substancialmente o mesmo efeito sobrerendimento como uma SEQ ID NO aqui nomeada. Preferivelmente, um poli-nucleotídeo da presente invenção terá pelo menos 65% de identidade a, pe-lo menos cerca de 66% de identidade a, pelo menos cerca de 67% de iden-tidade a, pelo menos cerca de 68% de identidade, pelo menos cerca de 69%de identidade, pelo menos cerca de 70% de identidade, pelo menos cerca de71% de identidade, pelo menos cerca de 72% de identidade, pelo menoscerca de 73% de identidade, pelo menos cerca de 74% de identidade, pelomenos cerca de 75% de identidade, pelo menos cerca de 76% de identida-de, pelo menos cerca de 77% de identidade, pelo menos cerca de 78% deidentidade, pelo menos cerca de 79% de identidade, pelo menos cerca de80% de identidade, pelo menos cerca de 81% de identidade, pelo menoscerca de 82% de identidade, pelo menos cerca de 83% de identidade, pelomenos cerca de 84% de identidade, pelo menos cerca de 85% de identida-de, pelo menos cerca de 86% de identidade, pelo menos cerca de 87% deidentidade, pelo menos cerca de 88% de identidade, pelo menos cerca de89% de identidade, pelo menos cerca de 90% de identidade, pelo menoscerca de 91% de identidade, mais preferivelmente pelo menos cerca de 92%de identidade, pelo menos cerca de 93% de identidade, pelo menos cerca de94% de identidade, pelo menos cerca de 95% de identidade, e mesmo maispreferivelmente pelo menos cerca de 95,5% de identidade, pelo menos cer-ca de 96% de identidade, pelo menos cerca de 96,5% de identidade, pelomenos cerca de 97% de identidade, pelo menos cerca de 97,5% de identi-dade, pelo menos cerca de 98% de identidade, pelo menos cerca de 98,5%de identidade, pelo menos cerca de 99% de identidade, pelo menos cerca de99,5% de identidade, ou são idênticas a qualquer uma de uma seqüência depolinucleotídeos compreendendo pelo menos uma porção de SEQ ID NO: 1;SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 7; SEQ ID NO: 8;SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 11; SEQ ID NO: 13; SEQ ID NO: 14; SEQ IDNO: 15; SEQ ID NO: 16; SEQ ID NO: 17; SEQ ID NO: 18; SEQ ID NO: 19;SEQ ID NO: 20; SEQ ID NO: 21; SEQ ID NO: 22; SEQ ID NO: 23; SEQ IDNO: 24; SEQ ID NO: 25; SEQ ID NO: 26; SEQ ID NO: 27; SEQ ID NO: 28;SEQ ID NO: 29; SEQ ID NO: 30; SEQ ID NO: 31; SEQ ID NO: 32; SEQ IDNO: 33; SEQ ID NO: 34; SEQ ID NO: 35; SEQ ID NO: 36; SEQ ID NO: 37;SEQ ID NO: 38; SEQ ID NO: 39; SEQ ID NO: 40; e SEQ ID NO: 41.
Em todas as modalidades da presente invenção, uma seqüênciade polipeptídeos preferida inclui um polipeptídeo tendo pelo menos cerca de60% de identidade de seqüência a um polipeptídeo EG9703 ou EG8798 dapresente invenção e tem substancialmente o mesmo efeito sobre rendimentocomo uma SEQ ID NO aqui nomeada. Preferivelmente, um polipeptídeo dapresente invenção terá pelo menos cerca de 65% de identidade, pelo menoscerca de 66% de identidade, pelo menos cerca de 67% de identidade, pelomenos cerca de 68% de identidade, pelo menos cerca de 69% de identida-de, pelo menos cerca de 70% de identidade, pelo menos cerca de 71% deidentidade, pelo menos cerca de 72% de identidade, pelo menos cerca de73% de identidade, pelo menos cerca de 74% de identidade, pelo menoscerca de 75% de identidade, pelo menos cerca de 76% de identidade, pelomenos cerca de 77% de identidade, pelo menos cerca de 78% de identida-de, pelo menos cerca de 79% de identidade, pelo menos cerca de 80% deidentidade, pelo menos cerca de 81% de identidade, pelo menos cerca de82% de identidade, pelo menos cerca de 83% de identidade, pelo menoscerca de 84% de identidade, pelo menos cerca de 85% de identidade, pelomenos cerca de 86% de identidade, pelo menos cerca de 87% de identida-de, pelo menos cerca de 88% de identidade, pelo menos cerca de 89% deidentidade, pelo menos cerca de 90% de identidade, pelo menos cerca de91% de identidade, mais preferivelmente pelo menos cerca de 92% de iden-tidade, pelo menos cerca de 93% de identidade, pelo menos cerca de 94%de identidade, pelo menos cerca de 95% de identidade, e mesmo mais pre-ferivelmente pelo menos cerca de 95,5% de identidade, pelo menos cerca de96% de identidade, pelo menos cerca de 96,5% de identidade, pelo menoscerca de 97% de identidade, pelo menos cerca de 97,5% de identidade, pelomenos cerca de 98% de identidade, pelo menos cerca de 98,5% de identi-dade, pelo menos cerca de 99% de identidade, pelo menos cerca de 99,5%de identidade, ou são idênticas a qualquer uma de uma seqüência de poli-nucleotídeos compreendendo pelo menos uma porção de SEQ ID NOs: 3, 6,9 e 12.
Em todas as modalidades da presente invenção, as plantas do-mesticadas da presente invenção preferivelmente incluem Zea mays mays,Oryza sativa, Triticum aestivum, Hordeum vulgare, Saccharum officinarum,Sorghum bicolor, e Pennisetum typhoides. Em todas as modalidades da pre-sente invenção, as plantas de membro de família ou ancestral selvagem pre-ferivelmente incluem plantas de membro de família ou ancestral para umaplanta domesticada selecionada do grupo consistindo em Zea mays mays,Oryza sativa, Triticum aestivum, Hordeum vulgare, Saccharum officinarum,Sorghum bicolor, e Pennisetum typhoides. Uma planta membro de família ouancestral selvagem particularmente preferida é Oryza rufipogon. Qualquerpolipeptídeo EG9703 ou EG8798 de planta é um polipeptídeo apropriado dapresente invenção. Plantas apropriadas a partir das quais isolar polipeptí-deos EG9703 ou EG8798 (incluindo isolamento do polipeptídeo natural ouprodução do polipeptídeo através de técnicas recombinantes ou sintéticas)incluem milho, trigo, cevada, centeio, painço, grão-de-bico, lentilha, linho,oliva, figo, amêndoa, pistáche, noz, beterraba, pastinaga, frutas cítricas, in-cluindo, mas não limitado a, laranja, limão, lima, pomelo, tangerina, minneo-Ia, e tangelo, batata doce, feijão, ervilha, chicória, alface, repolho, couve-flor,brócolis, nabo, rabanete, espinafre, aspargos, cebola, alho, pimenta, aipo,abóbora, cânhamo, abobrinha, maçã, pêra, marmelo, melão, ameixa, cereja,pêssego, nectarina, damasco, morango, uva, framboesa, amora silvestre,abacaxi, abacate, papaia, manga, banana, soja, tomate, sorgo, cana-de-açúcar, beterraba sacarina, girassol, colza, trevo, tabaco, cenoura, algodão,alfafa, arroz, batata, berinjela, pepino, Arabidópsis, e plantas lenhosas comoárvores decíduas, com milho, sorgo, cana-de-açúcar, e trigo sendo especi-almente desejáveis.
Esta modalidade da presente invenção inclui processos paraidentificação de variantes alélicas das seqüências da presente invenção.Como aqui usado, "marcador" inclui referência a um local sobre um cromos-soma que serve para identificar uma posição única sobre o cromossoma.Um "marcador polimórifco" inclui referência a um marcador que aparece emmúltiplas formas (alelos) de modo que diferentes formas do marcador, quan-do eles estão presentes em um par homólogo, permitem transmissão de ca-da um dos cromossomos naquele par ser seguida. Um genótipo pode serdefinido através do uso de um ou uma pluralidade de marcadores.
A presente invenção também provê ácidos nucléicos isoladoscompreendendo polinucleotídeos de comprimento suficiente e complementa-ridade a um gene da presente invenção para uso como sondas ou iniciado-res de amplificação na deteção, quantificação, ou isolamento de transcritosde genes. Por exemplo, ácidos nucléicos isolados da presente invenção po-dem ser usados como sondas na deteção de deficiências no nível de ARNmem seleções para desejadas plantas transgências, para deteção de muta-ções no gene (por exemplo, substituições, supressões ou adições), paramonitoração de regulação ascendente de expressão ou mudanças em ativi-dade enzimática em ensaios de seleção de compostos, para deteção dequalquer número de variantes alélicas (polimorfismos) do gene, ou para usocomo marcadores moleculares em programas de geração de plantas.
Adicionalmente, a presente invenção ainda provê ácidos nucléi-cos isolados compreendendo polinucleotídeos codificando uma ou mais va-riantes polimórficas (alélicas) de polipeptídeos/polinucleotídeos. Variantespolimórifcas são freqüentemente usadas para permitir segregação de regi-ões cromossômicas em, por exemplo, processos de seleção assistidos pormarcador para aperfeiçoamento de colheita.
A presente invenção provê um processo de genotipificação deuma planta utilizando polinucleotídeos da presente invenção. Genotipificaçãoprovê um meio de distinção de homólogos de um par de cromossomas epode ser usada para diferenciar segregantes em uma população de plantas.Processos de marcador de plantas podem ser usados para estudos filogené-ticos, caracterização de relações genéticas entre variedades de colheitas,identificação de cruzamentos ou híbridos somáticos, localização de segmen-tos cromossomais afetando características monogênicas, clonagem baseadaem mapa, e o estudo de hereditariedade quantitativa. Ver, por exemplo, Pe-Ieman and Van Der Voort (2003) Trends in Plant Science Vol. 8(7):330-334 eHolland (2004) Proceedings of the 4th International Crop Science Congress26 Sep - 1 Oct 2004, Brisbane, Australia.
O processo particular de genotipificação na presente invençãopode empregar qualquer número de técnicas analíticas de marcador molecu-lar tais como, mas não limitado a, polimorfismos de comprimento de frag-mento de restrição (RFLPs). RFLPs são o produto de diferenças alélicas en-tre fragmentos de restrição de DNA causados por variabilidade de seqüênciade nucleotídeos. Como é bem-conhecido por aqueles versados na técnica,RFLPs são tipicamente detectados através de extração de DNA genômico edigestão com uma enzima de restrição. Genericamente, os resultantes frag-mentos são separados de acordo com tamanho e hibridizados com umasonda; sondas de cópia simples são apropriadas. Fragmentos de restriçãode cromossomas homólogos são descritos. Diferenças em tamanho defragmento entre alelos representam um RFLP. Assim, a presente invençãoainda provê um meio para seguir segregação de um gene ou ácido nucléicoda presente invenção assim como seqüências cromossômicas geneticamen-te ligadas a estes genes ou ácidos nucléicos usando técnicas como análisesde RFLP. Seqüências cromossômicas ligadas estão dentro de 50 centiMor-gans (cM), freqüentemente dentro de 40 ou 30 cM, em alguns casos dentrode 20 ou 10 cM, e em alguns casos dentro de 5, 3, 2 ou 1 cM de um gene dapresente invenção.
Na presente invenção, as sondas de ácido nucléico empregadaspara mapeamento de marcador molecular de genomas nucleares de plantahibridizam seletivamente, sob condições seletivas de hibridização, a um ge-ne codificando um polinucleotídeo da presente invenção. Em algumas moda-lidades, as sondas são selecionadas de polinucleotídeos da presente inven-ção. Tipicamente, estas sondas são sondas de ADNc ou clones genômicosPst I. O comprimento das sondas é discutido em maiores detalhes, supra,mas é tipicamente de pelo menos 15 bases em comprimento, e em algunscasos pelo menos 20, 25, 30, 35, 40, ou 50 bases em comprimento. Generi-camente, entretanto, as sondas são de menos que cerca 1 quilobase emcomprimento. Em algumas modalidades, as sondas são sondas de cópiasimples que hibridizam a um único Iocus em um complemento de cromos-soma haplóide. Algumas enzimas de restrição exemplares empregadas emmapeamento de RFLP são EcoRI, EcoRV1 e Sstl. Como aqui usado o termo"enzima de restrição" inclui referência a uma composição que reconhece e,sozinha ou em combinação com uma outra composição, cliva em uma espe-cífica seqüência de nucleotídeos.
O processo de deteção de um RFLP compreende as etapas de
(a) digestão de DNA genômico de uma planta com uma enzima de restrição;
(b) hibridização de uma sonda de ácido nucléico, sob condições de hibridi-zação a uma seqüência de um polinucleotídeo da presente invenção do ditoDNA genômico; (c) deteção a partir da mesma de um RFLP. Outros proces-sos de diferenciação de variantes polimórficas (alélicas) de polinucleotídeosda presente invenção podem ser obtidos através de utilização de técnicas demarcador molecular bem-conhecidas por aqueles versados na técnica inclu-indo técnicas tais como: 1) análises de conformação de filamento simples(SSCP); 2) eletroforese de gel de gradiente de desnaturação (DGGE); 3)ensaios de proteção RNase; 4) oligonucleotídeos específicos de alelo (A-SOs); 5) o uso de proteínas que reconhecem desemparelhamentos de nu-cleotídeos, tal como a proteína mutS de E. coli; e 6) PCR específica de alelo.Outras abordagens baseadas na deteção de desemparelhamento entre doisfilamentos de DNA complementares incluem eletroforese de gel desnaturan-te grampeados (CDGE); análises de heterodúplex (HÁ); e clivagem de de-semparelhamento químico (CMC).
Assim, a presente invenção ainda provê um processo de genoti-pificação compreendendo as etapas de contato, sob condições de hibridiza-ção rigorosas, de uma amostra suspeita de compreender um polinucleotídeoda presente invenção com uma sonda de ácido nucléico. Genericamente, aamostra é uma amostra de planta; uma amostra suspeita de compreenderum polinucleotídeo da presente invenção (por exemplo, um gene, ARNm, ouEST). A sonda de ácido nucléico hibridiza seletivamente, sob condições rigo-rosas, a uma seqüência de um polinucleotídeo da presente invenção com-preendendo um marcador polimórfico. Hibridização seletiva da sonda de áci-do nucléico à seqüência de ácido nucléico de marcador polimórfico rende umcomplexo de hibridização. Deteção do complexo de hibridização indica apresença daquele marcador polimórfico na amostra. Em algumas modalida-des, a sonda de ácido nucléico compreende um polinucleotídeo da presenteinvenção.
É visível para aqueles versados na técnica que variantes poli-mórficas podem ser identificadas para EG9703 e EG8798 através de se-qüenciamento destes genes.
É claro para aqueles versados na técnica que adicionais varian-tes polimórficas ou alelos de EG9703 e EG8798 podem ser identificadas porseqüenciamento de mais linhas de milho e híbridos, mais linhas de arroz ehíbridos, mais linhas de sorgo, cevada, linhas de trigo, painço, ou linhas decana-de-açúcar e testes de associação podem ser realizados para encontraros alelos de cada um destes dois genes que são associados com o melhorfenótipo para características de rendimento (tal como rendimento total, pesode grão, comprimento de grão, ou outras características relacionadas a ren-dimento) ou características de qualidade (como ASV, giz, ou outras caracte-rísticas de qualidade). Testes de associação com estes alelos adicionais po-dem indicar quais alelos são associados com desejados fenótipos para es-pecíficas características. Linhas inatas parentes prospectivas então podemser selecionadas para a presença dos alelos (ou porções dos desejados ale-los que são diagnósticos) associados com melhor desempenho para umacaracterística de rendimento (tal como rendimento total, peso de grão, com-primento de grão, grãos por planta, etc.) ou melhor desempenho para umacaracterística de qualidade (tal como ASV oü giz, etc.). Alelos associadoscom o melhor desempenho para uma característicá de rendimento ou umacaracterística de qualidade podem ser o "alelo desejado" para obtenção dodesejado fenótipo.
Em modalidades preferidas, a presente invenção provê proces-sos para identificação de alelos de EG9703 ou EG8798 em uma espécie decolheita; processos para determinação de se uma planta contém um alelopreferido de EG9703 ou EG8798, e processos para seleção de plantas paraalelos preferidos de EG9703 ou EG8798. Alelos de EG9703 ou EG8798 in-cluem, por exemplo, um polinucleotídeo compreendendo pelo menos umaporção de qualquer uma das seguintes seqüências: SEQ ID NO: 1; SEQ IDNO: 2; SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 7; SEQ ID NO: 8; SEQ IDNO: 10; SEQ ID NO: 11; SEQ ID NO: 13; SEQ ID NO: 14; SEQ ID NO: 15;SEQ ID NO: 16; SEQ ID NO: 17; SEQ ID NO: 18; SEQ ID NO: 19; SEQ IDNO: 20; SEQ ID NO: 21; SEQ ID NO: 22; SEQ ID NO: 23; SEQ ID NO: 24;SEQ ID NO: 25; SEQ ID NO: 26; SEQ ID NO: 27; SEQ ID NO: 28; SEQ IDNO: 29; SEQ ID NO: 30; SEQ ID NO: 31; SEQ ID NO: 32; SEQ ID NO: 33;SEQ ID NO: 34; SEQ ID NO: 35; SEQ ID NO: 36; SEQ ID NO: 37; SEQ IDNO: 38; SEQ ID NO: 39; SEQ ID NO: 40; SEQ ID NO: 41; e um polinucleotí-deo tendo pelo menos cerca de 70% de identidade de seqüência para qual-quer uma das SEQ ID NOS anteriores.
Para processos para identificação de outros alelos de EG9703ou EG8798, processos incluem em uma etapa, uso de pelo menos uma por-ção de qualquer seqüência das seqüências de polinucleotídeos da presenteinvenção para amplificar a correspondente seqüência EG9703 ou EG8798em uma ou mais plantas de uma espécie de colheita. Em uma outra etapa,estes processos incluem determinação de seqüência de nucleotídeos deseqüências amplificadas. Em uma outra etapa, estes processos incluemcomparação de seqüências amplificadas a seqüências de polinucleotídeosda presente invenção para identificar quaisquer alelos de EG9703 ouEG8798 nas plantas testadas das espécies de colheita.
Genericamente, estes processos também incluem processospara identificação ou determinação de alelos preferidos (por exemplo, alelosque são associados com uma desejada). Em uma etapa, uso de pelo menosuma porção de qualquer seqüência das seqüências de polinucleotídeos dapresente invenção para amplificar a seqüência EG9703 ou EG8798 corres-pondente em pelo menos duas plantas para as quais um particular parâme-tro para uma característica foi ou pode ser medido. Uma tal característicainclui rendimento, por exemplo. Em uma outra etapa, estes processos inclu-em determinação de seqüência de EG9703 ou EG8798 em cada planta. Emuma outra etapa, estes processos incluem identificação de alelos preferidosou seqüências de polinucleotídeos de EG9703 ou EG8798. Alelos preferidospodem ser identificados através de análises de genotipificação através dedeterminação de associação do alelo com a desejada característica. Exem-plos de tais análises de genotipificação podem ser encontrados aqui nos e-xemplos. . .
Genericamente, estes processos também incluem processospara seleção de plantas para alelos preferidos ou seqüências de polinucleo-tídeos. Tais processos incluem uso de pelo menos uma porção de um alelopreferido (por exemplo, alelos associados com uma desejada característica)para amplificar a correspondente seqüência EG9703 ou EG8798 em umaplanta, e selecionar aquelas plantas que contêm o alelo desejado (ou se-qüência de polinucleotídeo). A presente invenção também provê um proces-so de produção de um polipeptídeo EG9703 ou EG8798 compreendendo: a)provimento de uma célula transfectada com um polinucleotídeo codificandoum polipeptídeo EG9703 ou EG8798 posicionado para expressão na célula;b) cultura de célula transfectada sob condições para expressão de polinucle-otídeo; e c) isolamento de polipeptídeo EG9703 ou EG8798.A presente invenção também provê um processo de isolamentode um gene relacionado com rendimento a partir de uma biblioteca de célulade planta recombinante. O processo inclui provimento de uma preparação deDNA de célula de planta ou uma biblioteca de célula de planta recombinante;contato de preparação ou biblioteca de células de planta com um oligonucle-otídeo conservado EG9703 ou EG8798 detectavelmente marcado (geradode uma seqüência de polinucleotídeo EG97Ó3 ou EG8798 da presente in-venção, como aqui descrito em outra parte) sob condições de hibridizaçãoprovendo deteção de genes tendo 50% ou maior identidade de seqüência; eisolamento de um gene relacionado a rendimento através de sua associaçãocom o marcador detectável.
A presente invenção também provê um processo de isolamentode um gene relacionado com rendimento de um DNA de célula de planta. Oprocesso inclui provimento de uma amostra de DNA de célula de planta;provimento de um par de oligonucleotídeos tendo homologia de seqüênciapara uma região conservada de oligonucleotídeos de gene EG9703 ouEG8798 (gerados de uma seqüência de polinucleotídeo EG9703 ou EG8798da presente invenção, como descrito aqui em outra parte); combinação depar de oligonucleotídeos com a amostra de DNA de célula de planta sobcondições apropriadas para amplificação de DNA mediada por reação decadeia polimerase; e isolamento de gene relacionado a rendimento amplifi-cado ou seu fragmento.
As seqüências identificadas pelos processos aqui descritos po-dem ser usadas para identificação de agentes que são úteis em modulaçãode capacidades funcionais aperfeiçoadas ou alteradas, únicas de organismodomesticado e/ou correção de defeitos nestas capacidades usando estasseqüências. Estes processos empregam, por exemplo, técnicas de seleçãoconhecidas, tais como sistemas in vitro, sistemas de expressão baseadosem célula e animais e plantas transgênicos. A abordagem provida pela pre-sente invenção não somente identifica rapidamente genes evoluídos, masindica modulações que podem ser feitas para a proteína que não podem sermuito tóxicas porque elas existem em outras espécies.A presente invenção também provê um processo de produçãode um polipeptídeo EG97Ô3 ou EG8798. Etapas incluem provimento de umacélula transfectada com um polinucleotídeo codificando um polipeptídeoEG9703 ou EG8798 posicionado para expressão na célula; e cultura de cé-lula transfectada sob condições para expressão de polinucleotídeo; e c) iso-lamento de polipeptídeo EG9703 ou EG8798.
A presente invenção também provê um processo de deteção deum gene de aumento de rendimento ou uma variante alélica de aumento derendimento de um gene em uma célula de planta que inclui as seguintes e-tapas. Etapas incluem contato de um polinucleotídeo EG9703 ou EG8798 ouuma sua porção maior que 12 nucleotídeos, em alguns casos maior que 30nucleotídeos em comprimento com uma preparação de DNA genômico dacélula de planta sob condições de hibridização provendo deteção de se-qüências de molécula de ácido nucléico tendo cerca de 50% ou maior identi-dade de seqüência a um polinucleotídeo EG9703 ou EG8798 da presenteinvenção, tal como, por exemplo, um polinucleotídeo compreendendo pelomenos uma porção de um polinucleotídeo selecionado do grupo consistindoem SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 5; SEQ IDNO: 7; SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 11; SEQ ID NO: 13;,SEQ ID NO: 14; SEQ ID NO: 15; SEQ ID NO: 16; SEQ ID NO: 17; SEQ IDNO: 18; SEQ ID NO: 19; SEQ ID NO: 20; SEQ ID NO: 21; SEQ ID NO: 22;SEQ ID NO: 23; SEQ ID NO: 24; SEQ ID NO: 25; SEQ ID NO: 26; SEQ IDNO: 27; SEQ ID NO: 28; SEQ ID NO: 29; SEQ ID NO: 30; SEQ ID NO: 31;SEQ ID NO: 32; SEQ ID NO: 33; SEQ ID NO: 34; SEQ ID NO: 35; SEQ IDNO: 36; SEQ ID NO: 37; SEQ ID NO: 38; SEQ ID NO: 39; SEQ ID NO: 40;SEQ ID NO: 41; e um polinucleotídeo tendo pelo menos cerca de 70% deidentidade de seqüência a qualquer uma das SEQ ID NOs anteriores; e de-teção de hibridização, pelo que um gene aumentando rendimento pode seridentificado.
A presente invenção também provê um processo de deteção deum gene de aumento de rendimento ou uma variante alélica específica au-mentando rendimento de um gene em uma célula de planta. Este processoinclui contato de genes de aumento de rendimento EG9703 ou EG8798 ouuma porção de qualquer um destes genes maior que 12 nucleotídeos, emalguns casos maior que 30 nucleotídeos em comprimento com uma prepara-ção de DNA genômico da célula de planta sob condições de hibridizaçãoprovendo deteção de seqüências de molécula de ácido nucléico tendo cercade 50% ou mais de identidade de seqüência a um polinucleotídeo da presen-te invenção como descrito aqui em outra parte; e deteção de hibridização,pelo que um gene de aumento de rendimento ou uma específica variantealélica de aumento de rendimento de um gene pode ser identificada.
As seqüências identificadas pelos processos aqui descritos po-dem ser usadas para identificar agentes que são úteis em modulação decapacidades funcionais alteradas ou aperfeiçoadas, únicas de organismodomesticado e/ou correção de defeitos nestas capacidades usando estasseqüências. Estes processos empregam, por exemplo, técnicas de seleçãoconhecidas, tais como sistemas in vitro, sistemas de expressão baseadosem célula e animais plantas transgênicos. A abordagem provida pela presen-te invenção não somente identifica rapidamente genes evoluídos, mas indicamodulações que podem ser feitas para a proteína que podem não ser muitotóxicas porque elas existem em outras espécies.
Em uma modalidade, a presente invenção inclui um processo dedeterminação de se uma planta tem uma particular seqüência de polinucleo-tídeo compreendendo uma seqüência EG9703. Este processo inclui as se-guintes etapas. Uma etapa inclui comparação de pelo menos cerca de umaporção de seqüência de nucleotídeo codificando polipeptídèo da dita plantacom pelo menos uma porção de uma seqüência de um polinucleotídeoEG9703 da presente invenção, tal como, por exemplo, aquelas compreen-dendo pelo menos uma porção de um polinucleotídeo selecionado do grupoconsistindo em (i) um polinucleotídeo selecionado do grupo consistindo emSEQ ID NOs: 1, 2, 4 e 5; e (ii) um polinucleotídeo tendo pelo menos 70% deidentidade de seqüência a um polinucleotídeo de (i) e que confere substan-cialmente o mesmo rendimento como um polinucleotídeo de (i). Um dos po-linucleotídeos enumerados acima pode ser selecionado como o particularpolinucleotídeo (isto é, o polinucleotídeo de interesse, para a determinaçãode se a planta contém aquele polinucleotídeo ou um relacionado). Em umaoutra etapa, o processo inclui identificação de se a planta contém o particularpolinucleotídeo. Preferivelmente, a seqüência de polinucleotídeo de planta éDNA genômico ou ADNc.
Em uma outra modalidade, a presente invenção inclui um pro-cesso de determinação de se uma planta tem uma particular seqüência depolinucleotídeo compreendendo uma seqüência EG8798. Este processo in-clui as etapas de comparação de pelo menos cerca de uma porção da se-qüência de polinucleotídeo da dita planta com pelo menos uma porção deuma seqüência de polinucleotídeo EG8798 da presente invenção, tal como,por exemplo, um polinucleotídeo compreendendo um polinucleotídeo sele-cionado do grupo consistindo em (i) um polinucleotídeo compreendendo pelomenos uma porção de um polinucleotídeo selecionado do grupo consistindoem SEQ ID NO: 7; SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 11; SEQ IDNO: 13; SEQ ID NO: 14; SEQ ID NO: 15; SEQ ID NO: 16; SEQ ID NO: 17;SEQ ID NO: 18; SEQ ID NO: 19; SEQ ID NO: 20; SEQ ID NO: 21; SEQ IDNO: 22; SEQ ID NO: 23; SEQ ID NO: 24; SEQ ID NO: 25; SEQ ID NO: 26;SEQ ID NO: 27; SEQ ID NO: 28; SEQ ID NO: 29; SEQ ID NO: 30; SEQ IDNO: 31; SEQ ID NO: 32; SEQ ID NO: 33; SEQ ID NO: 34; SEQ ID NO: 35;SEQ ID NO: 36; SEQ ID NO: 37; SEQ ID NO: 38; SEQ ID NO: 39; SEQ IDNO: 40; SEQ ID NO: 41; e (ii) pelo menos uma porção de um polinucleotídeotendo pelo menos cerca de 70% de identidade de seqüência a um polinucle-otídeo de (i) e que confere substancialmente o mesmo rendimento como umpolinucleotídeo de (i). Um dos polinucleotídeos enumerados acima pode serselecionado como o particular polinucleotídeo (isto é, o polinucleotídeo deinteresse, para a determinação de se a planta contém aquele polinucleotídeoou um-relacionado). Em uma outra etapa, o proesso inclui identificação de sea planta contém o particular polinucleotídeo.
Preferivelmente, a seqüência de polinucleotídeos de planta éDNA genômico ou ADNc. Preferivelmente, a seqüência de polinucleotídeoEG9703 ou EG8798 está associada com aumentado rendimento em umaplanta. Processos para determinação e quantificação de rendimentos sãoconhecidos na técnica, e discutidos em outra parte no presente relatóriodescritivo. Por exemplo, aumentado rendimento pode ser rendimento au-mentado em relação a uma segunda planta de uma planta de membro defamília ou gênero, ancestral, comum tendo uma segunda seqüência de poli-nucleotídeo EG9703 com pelo menos uma mudança de nucleotídeo em re-lação à seqüência de polinucleotídeo EG9703 a partir da planta.
A presente invenção também provê processos de modificaçãode freqüência de um gene de rendimento de grão em uma população deplantas, e processos para geração assistida com marcador ou seleção assis-tida com marcador que inclui as seguintes etapas. Uma etapa inclui seleçãode uma pluralidade de plantas usando um oligonucleotídeo como um marca-dor para determinar a presença ou ausência de um gene de enchimento degrão em uma planta individual, o oligonucleotídeo consistindo em não maisque 300 bases de uma seqüência de polinucleotídeo compreendendo pelomenos uma porção de uma seqüência de polinucleotídeo selecionada dogrupo consistindo em SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 4; SEQ IDNO: 5; SEQ ID NO: 7; SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: TO; SEQ ID NO: 11; SEQID NO: 13; SEQ ID NO: 14; SEQ ID NO: 15; SEQ ID NO: 16; SEQ ID NO:17; SEQ ID NO: 18; SEQ JD NO: 19; SEQ ID NO: 20; SEQ ID NO: 21; SEQID NO: 22; SEQ ID NO: 23; SEQ ID NO: 24; SEQ ID NO: 25; SEQ ID NO:26; SEQ ID NO: 27; SEQ ID NO: 28; SEQ ID NO: 29; SEQ ID NO: 30; SEQID NO: 31; SEQ ID NO: 32; SEQ ID NO: 33; SEQ ID NO: 34; SEQ ID NO:35; SEQ ID NO: 36; SEQ ID NO: 37; SEQ ID NO: 38; SEQ ID NO: 39; SEQID NO: 40; SEQ ID NO: 41, e pelo menos uma porção de um polinucleotídeotendo pelo menos cerca de 70% de identidade de seqüência a uma SEQ IDNO precedente. Uma outra etapa inclui seleção de pelo menos uma plantaindividual para geração baseado na presença ou ausência do gene de ren-dimento de grão; e uma outra etapa inclui geração de pelo menos uma plan-ta assim selecionada para produzir uma população de plantas tendo umafreqüência modificada do gene de rendimento de grão.
Em uma modalidade, processos para geração assistida commarcador incluem um processo de geração assistida com marcador de plan-tas para uma particular seqüência de polinucleotídeo EG8798. Esta modali-dade inclui as seguintes etapas. Uma etapa inclui comparação, para pelomenos uma planta, de pelo menos uma porção da seqüência de nucleotí-deos das ditas plantas com uma particular seqüência de polinucleotídeosEG8798 da presente invenção, tal como, por exemplo, pelo menos uma por-ção daquelas selecionadas do grupo consistindo em (i) um polinucleotídeocompreendendo um polinucleotídeo selecionado do grupo consistindo emSEQ ID NO: 7; SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 11; SEQ ID NO:13; SEQ ID NO: 14; SEQ ID NO: 15; SEQ ID NO: 16; SEQ ID NO: 17; SEQID NO: 18; SEQ ID NO: 19; SEQ ID NO: 20; SEQ ID NO: 21; SEQ ID NO:22; SEQ ID NO: 23; SEQ ID NO: 24; SEQ ID NO: 25; SEQ ID NO: 26; SEQID NO: 27; SEQ ID NO: 28; SEQ ID NO: 29; SEQ ID NO: 30; SEQ ID NO:31; SEQ ID NO: 32; SEQ ID NO: 33; SEQ ID NO: 34; SEQ ID NO: 35; SEQID NO: 36; SEQ ID NO: 37; SEQ ID NO: 38; SEQ ID NO: 39; SEQ ID NO:40; SEQ ID NO: 41; et (ii) um polinucleotídeo tendo pelo menos cerca de70% de identidade de seqüência a um polinucleotídeo de (i) e que conferesubstancialmente o mesmo rendimento como um polipeptídeo de (i). Esteprocesso também inclui a etapa de identificação de se a planta compreendea particular seqüência de polinucleotídeo; e a etapa de geração de umaplanta compreendendo a particular seqüência de polinucleotídeo para pro-duzir progênie.
Processos para geração assistida com marcador também inclu-em um processo de geração de plantas assistida com marcador para umaparticular seqüência de polinucleotídeo EG9703. Etapas incluem compara-ção, para pelo menos uma planta, de pelo menos uma porção da seqüênciade nucleotídeos das ditas plantas com um particular EG9703 da presenteinvenção, tal como, por exemplo, pelo menos uma porção de uma seqüênciade polinucleotídeos selecionada do grupo consistindo em (i) um polinucleotí-deo compreendendo um polinucleotídeo selecionado do grupo consistindoem SE ID NOs: 1, 2, 4 e 5; e (ii) um polinucleotídeo tendo pelo menos cercade 70% de identidade de seqüência a um polinucleotídeo de (i) e que confe-re substancialmente o mesmo rendimento como um polipeptídeo de (i), iden-tificação de se a planta compreende a particular seqüência de polinucleotí-deo; e geração de uma planta compreendendo a particular seqüência depolinucleotídeo para produzir progênie.
Estes processos de geração assistidos com marcador incluemum processo para seleção de plantas, por exemplo, cereais (incluindo, masnão limitado a, milho, trigo, cevada e outros membros da família de gramí-neas) ou legumes (por exemplo, soja), tendo um rendimento alterado com-preendendo obtenção de moléculas de ácido nucléico a partir das plantas aserem selecionadas, contato de moléculas de ácido nucléico com uma oumais sondas que seletivamente hibridizam sob condições rigorosas ou alta-mente rigorosas a uma seqüência de ácido nucléico compreendendo os po-linucleotídeos EG9703 e EG8798 da presente invenção; deteção de hibridi-zação de uma ou mais sondas para as seqüências de ácido nucléico onde apresença da hibridização indica a presença de um gene associado com ren-dimento alterado; e seleção de plantas nas bases da presença ou ausênciade tal hibridização. Em uma modalidade, seleção assistida com marcador érealizada em arroz. Em uma outra modalidade, seleção assistida com mar-cador é realizada em trigo usando uma ou mais sondas que hibridizam sele-tivamente sob condições rigorosas ou altamente rigorosas a seqüêneiascompreendendo os polinucleotídeos EG9703 e EG8798 da presente inven-ção. Ainda em uma outra modalidade, seleção assistida por marcador é rea-lizada em milho usando uma ou mais sondas que hibridizam seletivamentesob condições rigorosas ou altamente rigorosas a polinucleotídeos compre-endendo os polinucleotídeos EG9703 e EG8798 da presente invenção. Ain-da em uma outra modalidade, seleção assistida por marcador é realizada emsorgo usando uma ou mais sondas que hibridizam seletivamente sob condi-ções rigorosas ou altamente rigorosas a seqüências compreendendo os po-linucleotídeos EG9703 e EG8798 da presente invenção. Ainda em uma outramodalidade, seleção assistida por marcador é realizada em cevada usandouma ou mais sondas que hibridizam seletivamente sob condições rigorosasou altamente rigorosas a seqüências compreendendo os polinucleotídeosEG9703 e EG8798 da presente invenção. Em cada caso seleção assistidacom marcador pode ser realizada usando uma sonda ou sondas para umaseqüência simples ou seqüências múltiplas. Se seqüências múltiplas sãousadas elas podem ser usadas simultaneamente ou seqüencialmente.
Marcadores moleculares também podem ser usados durante oprocesso de geração para a seleção de características qualitativas. Por e-xemplo, marcadores ligados de perto a alelos ou marcadores contendo se-qüências dentro de alelos real de interesse podem ser usados para selecio-nar plantas que contêm os alelos de interesse durante um programa de ge-ração de retrocruzamento. Os marcadores também podem ser usados paraseleção do genoma do parente recorrente e contra os marcadores do paren-te doador. Uso deste procedimento pode minimizar a quantidade de genomaa partir do parente doador de permanece nas plantas selecionadas. Ele tam-bém pode ser usado para reduzir o número de cruzamentos de volta para oparente recorrente necessários em um programa de retrocruzamento. O usode marcadores moleculares no processo de seleção é frqüentemente cha-mado Seleção Aperfeiçoada de Marcador Genético.
Em uma outra modalidade, a presente invenção inclui um poli-nucleotídeo isolado que compreende um polinucleotídeo que inclui um oumais dos seguintes polinucleotídeos: SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 2; SEQ IDNO: 4; SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 7; SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 10; SEQID NO: 11; SEQ ID NO: 13; SEQ ID NO: 14; SEQ ID NO: 15; SEQ ID NO:16; SEQ ID NO: 17; SEQ ID NO: 18; SEQ ID NO: 19; SEQ ID NO: 20; SEQID NO: 21; SEQ ID NO: 22; SEQ ID NO: 23; SEQ ID NO: 24; SEQ ID NO:25; SEQ ID NO: 26; SEQ ID NO: 27; SEQ ID NO: 28; SEQ ID NO: 29; SEQID NO: 30; SEQ ID NO: 31; SEQ ID NO: 32; SEQ ID NO: 33; SEQ ID NO:34; SEQ ID NO: 35; SEQ ID NO: 36; SEQ ID NO: 37; SEQ ID NO: 38; SEQID NO: 39; SEQ ID NO: 40; SEQ ID NO: 41; e um polinucleotídeo tendo pelomenos cerca de 70% de identidade de seqüência a (isto é, qualquer) se-qüência de polinucleotídeo enumerada acima e confere substancialmente omesmo rendimento como qualquer seqüência de polinucleotídeo enumeradaacima.Uma modalidade da presente invenção é um polinucleotídeo deplanta isolado que hibridiza sob condições rigorosas de hibridização compelo menos uma porção de pelo menos um dos seguintes genes: um geneEG9703 ou EG8798. As características de identificação de tais genes sãodescritas anteriormente. Um polinucleotídeo da presente invenção pode in-cluir um gene EG9703 ou EG8798 de planta natural isolado ou um seu ho-mólogo, o último dos quais é descrito em mais detalhes abaixo. Um polinu-cleotídeo da presente invenção pode incluir uma ou mais regiões regulado-ras, regiões codificantes parciais ou de inteiro comprimento, ou suas combi-nações. O tamanho mínimo de um polinucleotídeo da presente invenção é otamanho mínimo que pode formar um híbrido estável com um dos genesmencionados anteriormente sob condições de hibridização rigorosas. Plan-tas apropriadas são mostradas acima.
De acordo com a presente invenção, um polinucleotídeo isoladoé um polinucleotídeo que foi removido de seu meio natural (isto é, que foisubmetido a manipulação humana). Como tal, "isolado" não reflete a exten-são na qual o polinucleotídeo foi purificado. Um polinucleotídeo isolado podeincluir DNA, RNA, ou derivados de DNA ou RNA.
Um polinucleotídeo EG9703 ou EG8798 de planta isolado dapresente invenção pode ser obtido de .sua fonte natural como um gene intei-ro (isto é, completo) ou uma sua porção capaz de formar um híbrido estávelcom aquele gene. Um polinucleotídeo EG9703 ou EG8798 de planta isoladotambém pode ser produzido usando tecnologia de DNA recombinante (porexemplo, amplificação de reação de cadeia polimerase (PCR), clonagem) ousíntese química. Polinucleotídeos EG9703 ou EG8798 de planta isoladosincluem polinucleotídeos naturais e seus homólogos, incluindo, mas não limi-tado a, variantes alélicas naturais e polinucleotídeos modificados nos quaisnucleotídeos foram inseridos, suprimidos, substituídos e/ou invertidos emuma maneira tal que modificações não interferem substancialmente com ahabilidade de polinucleotídeo codificar um polipeptídeo EG9703 ou EG8798da presente invenção ou para formar híbridos estáveis sob condições rigoro-sas com isolados de gene natural.Uma vez que o DNA desejado tenha sido isolado, ele pode serseqüenciado através de processos conhecidos. É reconhecido na técnicaque tais processos são sujeitos a erros, de modo que seqüenciamento múlti-plo da mesma região é rotina e será esperado conduzir a taxas mensuráveisde erros na resultante seqüência deduzida, particularmente em regiões ten-do domínios repetidos, extensiva estrutura secundária, ou incomuns compo-sições de base, tais como regiões com alto teor de base GC. Quando sur-gem discrepâncias, re-seqüenciamento pode ser feito e pode empregar pro-cessos especiais. Processos especiais podem incluir alteração de condiçõesde seqüênciamento através de uso: de diferentes temperaturas; diferentesenzimas; proteínas que alteram a habilidade de oligonucleotídeos para for-mar estruturas de maior ordem; nucleotídeos alterados como ITP ou dGTPmetilado; diferentes composições de gel, por exemplo adicionando formami-da; diferentes iniciadores ou iniciadores localizados em diferentes distânciasa partir de região problema; ou diferentes moldes tais como ADNs de fila-mento simples. Seqüenciamento de ARNm também pode ser empregado.
Um homólogo de polinucleotídeo EG9703 ou EG8798 de plantapode ser produzido usando um número de processos conhecidos por aque-les versados na técnica (ver, por exemplo, Sambrook et al., ibid.). Por exem-pio, polinucleotídeos podem ser modificados usando uma variedade de téc-nicas incluindo, mas não limitado a, técnicas clássicas de mutagênese e téc-nicas de DNA recombinante, como mutagênese direcionada a sítio, trata-mento químico de um polinucleotídeo para induzir mutações, clivagem comenzima de restrição de um fragmento de ácido nucléico, ligação de fragmen-tos de ácido nucléico, amplificação de reação de cadeia polimerase (PCR)e/ou mutagênese de regiões selecionadas de uma seqüência de ácido nu-cléico, síntese de misturas de oligonucleotídeos e ligação de grupos de mis-turas para "construir" uma mistura de polinucleotídeos e suas combinações.
Homólogos de polinucleotídeos podem ser selecionados de uma mistura deácidos nucléicos modificados através de seleção para a função do polipeptí-deo codificado pelo ácido nucléico (por exemplo, habilidade para elicitar umaresposta imune contra pelo menos um epítopo de um polipeptídeo EG9703ou EG8798, habilidade para aumentar rendimento em uma planta transgêni-ca contendo um gene EG9703 ou EG8798) e/ou através de hibridizçaão comum gene EG9703 ou EG8798.
Um polinucleotídeo isolado da presente invenção pode incluiruma seqüência de ácido nucléico que codifica pelo menos um polipeptídeoEG9703 ou EG8798 de planta da presente invenção, exemplos de tais poli-peptídeos sendo aqui mostrados. Embora a frase "polinucleotídeo" refira-seprimariamente ao polinucleotídeo físico e a frase "seqüência de ácido nucléi-co" refira-se primariamente à seqüência de nucleotídeos sobre o polinucleo-tídeo, as duas frases podem ser usadas intercambiavelmente, especialmen-te com relação a um polinucleotídeo, ou uma seqüência de ácido nucléico,sendo capaz de codificar um polipeptídeo EG9703 ou EG8798. Como discu-tido anteriormente, polipeptídeos EG9703 ou EG8798 de planta da presenteinvenção incluem, mas não são limitados a, polipeptídeos tendo regiões co-dificantes de EG9703 ou EG8798 de planta de inteiro comprimento, polipep-tídeos tendo regiões codificantes de EG9703 ou EG8798 de planta parciais,polipeptídeos de fusão, polipeptídeos protetores multivalentes e suas combi-nações.
Pelo menos certos polinucleotídeos da presente invenção codifi-cam polipeptídeos que podem se ligar seletivamente a soro imune derivadode um animal que foi imunizado com um polipeptídeo EG9703 ou EG8798do qual o polipeptídeo foi isolado.
Um polinucleotídeo compreendendo um polinucleotídeo da pre-sente invenção, quando expresso em uma planta apropriada, é capaz deaumentar o rendimento da planta. Como será mostrado em mais detalhesabaixo, um tal polinucleotídeo pode ser, ou codificar, um RNA anti-sentido,uma molécula capaz de formação de hélice tripla, uma ribozima, ou outrocomposto baseado em ácido nucléico.
Uma modalidade da presente invenção é um polinucleotídeoEG9703 ou EG8798 de planta que hibridiza sob condições rigorosas de hi-bridização a um polinucleotídeo EG9703 ou EG8798 da presente invenção,ou a um homólogo de um tal polinucleotídeo EG9703 ou EG8798, ou aocomplemento de um tal polinucleotídeo. Um complemento de polinucleotídeode qualquer seqüência de ácido nucléico da presente invenção refere-se àseqüência de ácido nucléico do polinucleotídeo que é complementar o (istoé, pode formar uma hélice dupla completa com) filamento para o qual a se-qüência é citada. É para ser notado que uma molécula de ácido nucléico defilamento dupla da presente invenção para o qual uma seqüência de ácidonucléico foi determinada para um filamento, que é representado por um SEQID NO, também compreende um filamento complementar tendo uma se-qüência que é um complemento daquela SEQ ID NO. Como tal, polinucleotí-deos da presente invenção, que podem ser de filamento duplo ou filamentosimples, incluem aqueles polinucleotídeos que formam híbridos estáveis sobcondições rigorosas de hibridização com uma dada SEQ ID NO aqui repre-sentada e/ou com o complemento daquela SEQ ID NO, que pode ou não seraqui representado. Processos para dedução de uma seqüência complemen-tar são conhecidos por aqueles versados na técnica. Em algumas modalida-des um polinucleotídeo EG9703 ou EG8798 é capaz de codificar pelo menosuma porção de um polipeptídeo EG9703 ou EG8798 que está naturalmentepresente em plantas.
Em algumas modalidades, polinucleotídeos EG9703 ou EG8798da presente invenção hibridizam sob condições rigorosas de hibridizaçãocom pelo menos uma porção de pelo menos um dos seguintes polinucleotí-deos: SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 5; SEQ IDNO: 7; SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 11; SEQ ID NO: 13;SEQ ID NO: 14; SEQ ID NO: 15; SEQ ID NO: 16; SEQ ID NO: 17; SEQ IDNO: 18; SEQ ID NO: 19; SEQ ID NO: 20; SEQ ID NO: 21; SEQ ID NO: 22;SEQ ID NO: 23; SEQ ID NO: 24; SEQ ID NO: 25; SEQ ID NO: 26; SEQ IDNO: 27; SEQ ID NO: 28; SEQ ID NO: 29; SEQ ID NO: 30; SEQ ID NO: 31;SEQ ID NO: 32; SEQ ID NO: 33; SEQ ID NO: 34; SEQ ID NO: 35; SEQ IDNO: 36; SEQ ID NO: 37; SEQ ID NO: 38; SEQ ID NO: 39; SEQ ID NO: 40;SEQ ID NO: 41; e um polinucleotídeo tendo pelo menos cerca de 70% deidentidade de seqüência para qualquer SEQ ID NOs precedentes, ou paraum homólogo ou complemento de tal polinucleotídeo.Conhecimento de seqüências de ácido nucléico de certos poli-nucleotídeos EG9703 ou EG8798 de planta da presente invenção permiteaqueles versados na técnica, por exemplo, (a) obter cópias daqueles polinu-cleotídeos, (b) obter polinucleotídeos incluindo pelo menos uma porção detais polinucleotídeos (por exemplo, polinucleotídeos incluindo genes de intei-ro comprimento, regiões codificantes de inteiro comprimento, seqüênciascontroles reguladoras, regiões codificantes truricadas), e (c) obter polinucleo-tídeos EG9703 ou EG8798 para outras plantas. Tais polinucleotídeos podemser obtidos várias maneiras incluindo seleção de bibliotecas de expressãoapropriadas com anticorpos da presente invenção; tradicionais técnicas declonagem usando sondas oligonucleotídeos da presente invenção para sele-cionar apropriadas bibliotecas ou DNA; e amplificação PCR de apropriadasbibliotecas ou DNA usando iniciadores oligonucleotídeos da presente inven-ção. Bibliotecas apropriadas para seleção ou a partir das quais amplificarpolinucleotídeos incluem bibliotecas tais como bibliotecas de DNA genômico,bibliotecas BAC, bibliotecas YAC, bibliotecas de ADNc preparadas a partirde tecidos de planta isolados, incluindo, mas não limitado a, caules, estrutu-ras/tecidos reprodutivos, folhas, raízes, e rebentos; e bibliotecas construídasde ADNc1S reunidos a partir de qualquer ou todos os tecidos listados acima.No caso de arroz e milho, bibliotecas BAC, disponíveis de Clemson Univer-sity podem ser usadas. Similarmente, fontes de DNA para seleção ou dasquais amplificar polinucleotídeos incluem DNA genômico de planta. Técnicaspara clonar e amplificar genes são mostradas, por exemplo, em Sambrook etal., ibid. e em Galun & Breiman, Transgenic Plants, Imperial College Press,1997.
A presente invenção também inclui polinucleotídeos que são oli-gonucleotídeos capazes de hibridizarem, sob condições rigorosas de hibridi-zação, com regiões complementares de outros polinucleotídeos algumasvezes maiores da presente invenção tais como aqueles compreendendo ge-nes EG9703 ou EG8798 de planta ou outros polinucleotídeos EG9703 ouEG8798 de planta. Oligonucleotídeos da presente invenção podem ser RNA,DNA, ou derivados de qualquer deles. O tamanho mínimo de tais oligonucle-otídeos é o tamanho requerido para formar um híbrido estável entre um dadooligonucleotídeo e a seqüência complementar ou um outro polinucleotídeoda presente invenção. Características de tamanho mínimo são aqui mostra-das. O tamanho do oligonucleotídeo também tem de ser suficiente para ouso do oligonucleotídeo de acordo com a presente invenção. Oligonucleotí-deos da presente invenção podem ser usados em uma variedade de aplica-ções incluindo, mas não limitado a, como sondas para identificar adicionaispolinucleotídeos, como iniciadores para amplificação ou extensão de polinu-cleotídeos, como alvos para análise de expressão, como candidatos paramutagênese alvejada e/ou recuperação, ou em aplicações agriculturais paraalteração de produção ou atividade de polipeptídeo EG9703 ou EG8798.
Tais aplicações agriculturais incluem o uso de tais oligonucleotídeos em, porexemplo, tecnologias baseadas em droga RNA e/ou ribozima, formação detriplex, anti-sentido. A presente invenção, por isso, inclui tais oligonucleotí-deos e processos para aperfeiçoar produtividade econômica em uma plantaatravés do uso de uma ou mais tais tecnologias.
A presente invenção também inclui um polipeptídeo isolado quecompreende (inclui) pelo menos uma porção de um ou mais de um polipep-tídeo codificado pelos polinucleotídeos SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 2; SEQID NO: 4; SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 7; SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 10;SEQ ID NO: 11; SEQ ID NO: 13; SEQ ID NO: 14; SEQ ID NO: 15; SEQ IDNO: 16; SEQ ID NO: 17; SEQ ID NO: 18; SEQ ID NO: 19; SEQ ID NO: 20;SEQ ID NO: 21; SEQ ID NO: 22; SEQ ID NO: 23; SEQ ID NO: 24; SEQ IDNO: 25; SEQ ID NO: 26; SEQ ID NO: 27; SEQ ID NO: 28; SEQ ID NO: 29;SEQ ID NO: 30; SEQ ID NO: 31; SEQ ID NO: 32; SEQ ID NO: 33; SEQ IDNO: 34; SEQ ID NO: 35; SEQ ID NO: 36; SEQ ID NO: 37; SEQ ID NO: 38;SEQ ID NO: 39; SEQ ID NO: 40; SEQ ID NO: 41; e um polinucleotídeo tendopelo menos cerca de 70% de identidade de seqüência para qualquer umadas SEQ ID NOs precedentes; e um polipeptídeo codificado por um polinu-cleotídeo tendo pelo menos 70% de identidade de seqüência a um polinu-cleotídeo enumerado acima e confere substancialmente o mesmo rendimen-to como um polinucleotídeo enumerado acima. Polipeptídeos isolados dapresente invenção também incluem SEQ ID NOs: 3, 6, 9 e 12; e um polipep-tídeo tendo pelo menos cerca de 75% de identidade de seqüência a qual-quer polipeptídeo enumerado acima e confere substancialmente o mesmorendimento como qualquer dos polipeptídeos enumerados acima.
De acordo com a presente invenção, um polipeptídeo isolado, oubiologicamente puro, é um polipeptídeo que foi removido de seu meio natu-ral. Como tal, "isolado" e "biologicamente puro" não reflete necessariamentea extensão na qual o polipeptídeo foi purificado. Um polipeptídeo EG9703 ouEG8798 isolado da presente invenção pode ser obtido a partir de sua fontenatural, pode ser produzido usando tecnologia DNA recombinante ou podeser produzido através de síntese química. Um polipeptídeo EG9703 ouEG8798 da presente invenção pode ser identificado por sua habilidade pararealizar a função de EG9703 ou EG8798 natural em um ensaio funcional.Por "polipeptídeo EG9703 ou EG8798 natural", é pretendido o polipeptídeoEG9703 ou EG8798 de inteiro comprimento. A frase "capaz de realizar afunção de um EG9703 ou EG8798 natural em um ensaio funcional" significaque o polipeptídeo tem pelo menos cerca de 10% da atividade do polipeptí-deo natural no ensaio funcional. Em outras modalidades, o polipeptídeoEG9703 ou EG8798 tem pelo menos cerca de 20% da atividade do polipep-tideo-naturaL.no ensaio funcional. Em outras modalidades, o polipeptídeoEG9703 ou EG8798 tem pelo menos cerca de 30% da atividade do polipep-tídeo natural no ensaio funcional. Em outras modalidades, o polipeptídeoEG9703 pu EG8798 tem pelo menos cerca de 40% da atividade do polipep-tídeo natural no ensaio funcional. Em outras modalidades, o polipeptídeoEG9703 pu EG8798 tem pelo menos cerca de 50% da atividade do polipep-tídeo natural no ensaio funcional. Em outras modalidades, o polipeptídeotem pelo menos cerca de 60% da atividade do polipeptídeo natural no ensaiofuncional. Em outras modalidades, o polipeptídeo tem pelo menos cerca de70% da atividade do polipeptídeo natural no ensaio funcional. Em outrasmodalidades, o polipeptídeo tem pelo menos cerca de 80% da atividade dopolipeptídeo natural no ensaio funcional. Em outras modalidades, o polipep-tídeo tem pelo menos cerca de 90% da atividade do polipeptídeo natural noensaio funcional. Exemplos de ensaios funcionais incluem ensaios de liga-ção de anticorpo, ou ensaios de aumento de rendimento, como detalhadoem outro local neste relatório descritivo.
Como aqui usado, um polipeptídeo EG9703 ou EG8798 de plan-ta isolado pode ser um polipeptídeo de inteiro comprimento ou qualquer ho-mólogo de um tal polipeptídeo. Exemplos de homólogos de EG9703 ouEG8798 incluem polipeptídeos EG9703 ou EG8798 nos quais aminoácidosforam suprimidos (por exemplo, um versão truncada do polipeptídeo, tal co-mo um peptídeo), inseridos, invertidos, substituídos e/ou derivados (por e-xemplo, através de glicosilação, fosforilação, acetilação, miristilação, prenila-ção, palmitoilação, amidação e/ou adição de glicerofosfatidil inositol) de mo-do que o homólogo tem atividade EG9703 ou EG8798 natural.
Em uma modalidade, quando o homólogo é administrado a umanimal como um imunógeno, usando técnicas conhecidas por aqueles ver-sados, o animal produzirá uma resposta humoral e/ou celular imune contrapelo menos um epítopo de um polipeptídeo EG9703 ou EG8798. Homólogosde EG9703 ou EG8798 também podem ser selecionados por sua habilidadepara desempenhar a função de EG9703 ou EG8798 em um ensaio funcional.
Homólogos de polipeptídeo EG9703 ou EG8798 de planta po-dem ser o resultado de variação alélica natural ou mutação natural. Homólo-gos de polipeptídeo EG9703 ou EG8798 da presente invenção também po-dem ser produzidos usando técnicas conhecidas incluindo, mas não limitadoa, modificações diretas para o polipeptídeo ou modificações para o gene co-dificando o polipeptídeo usando, por exemplo, técnicas de DNA recombinan-te ou clássicas para efetuar mutagênese randômica ou alvejada.
De acordo com a presente invenção, um mimetopo refere-se aqualquer composto que é capaz de imitar a habilidade de um polipeptídeoEG9703 ou EG8798 de planta isolado da presente invenção para realizar afunção de polipeptídeo EG9703 ou EG8798 da presente invenção em umensaio funcional. Exemplos de mimetopos incluem, mas não são limitados a,anticorpos anti-idiotípicos ou seus fragmentos, que incluem pelo menos umsítio de ligação que imita um ou mais epítopos de um polipeptídeo isolado dapresente invenção; porções imunogênicas não-polipeptidáceas de um poli-peptídeo isolado (por exemplo, estruturas carboidrato); e moléculas orgâni-cas sintéticas ou naturais, incluindo ácidos nucléicos, que têm uma estruturasimilar a pelo menos um epítopo de um polipeptídeo isolado da presenteinvenção. Tais mimetopos podem ser desenhados usando estruturas de po-lipeptídeos da presente invenção geradas em computador. Mimetopos tam-bém podem ser obtidos através de geração dé amostras randômicas de mo-léculas, tais como oligonucleotídeos, peptídeos ou outras moléculas orgâni-cas, e selecionando tais amostras através de técnicas de cromatografia deafinidade usando o correspondente parceiro de ligação.
O tamanho mínimo de um homólogo de polipeptídeo EG9703 ouEG8798 da presente invenção é um tamanho suficiente para ser codificadopor um polinucleotídeo capaz de formar um híbrido estável com a seqüênciacomplementar de um polinucleotídeo codificando o correspondente polipep-tídeo natural. Como tal, o tamanho do polinucleotídeo codificando um talhomólogo polipeptídeo é dependente de composição de ácido nucléico eporcentagem de homologia entre o polinucleotídeo e seqüência complemen-tar assim como com condições de hibridização per se (por exemplo, tempe-ratura, concentração de sal, e concentração de formamida). Também deveser notado que a extensão de homologia requerida para iormar um híbridoestável pode variar dependendo de se as seqüências homólogas são entre-meadas por todos os polinucleotídeos ou são cachos (isto é, localizadas) emdistintas regiões sobre os polinucleotídeos. O tamanho mínimo de tais poli-nucleotídeos é tipicamente pelo menos cerca de 12 a cerca de 15 nucleotí-deos em comprimento se os polinucleotídeos são ricos em GC e pelo menoscerca de 15 a cerca de 17 bases em comprimento se eles são ricos em AT.
Em algumas modalidades, o polinucleotídeo é de pelo menos 12 bases emcomprimento. Um polipeptídeo EG9703 ou EG8798 de planta da presenteinvenção é um composto que quando expresso ou modulado em uma planta,é capaz de aumentar o rendimento da planta.
Uma modalidade da presente invenção é um polipeptídeo defusão que inclui domínio contendo polipeptídeo EG9703 ou EG8798 ligado aum segmento de fusão. Inclusão de um segmento de fusão como parte deum polipeptídeo EG9703 ou EG8798 da presente invenção pode aperfeiçoara estabilidade de polipeptídeo durante produção, estocagem e/ou uso. De-pendendo das características de segmento, um segmento de fusão tambémpode atuar como um imuno-potencializador para aperfeiçoar a resposta imu-no montada por um animal imunizado com um polipeptídeo EG9703 ouEG8798 contendo um tal segmento de fusão. Além disso, um segmento defusão pode funcionar como uma ferramenta para simplificar purificação deum polipeptídeo EG9703 ou EG8798, de modo a permitir purificação do re-sultante polipeptídeo de fusão usando cromatografia de afinidade. Um seg-mento de fusão apropriado pode ser um domínio de qualquer tamanho quetem a função desejada (por exemplo, proporciona estabilidade aumentada,proporciona imunogenicidade aumentada a um polipeptídeo, e/ou purificaçãosimplificada de um polipeptídeo). Está dentro do escopo da presente inven-ção usar um ou mais segmentos de fusão. Segmentos de fusão podem serligados aos termini amino e/ou domínio carboxilado contendo EG9703 ouEG8798do polipeptídeo. Ligações entre segmentos de fusão e domínioscontendo EG9703 ou EG8798 de polipeptídeos de fusão podem ser suscetí-veis a clivagem de modo a permitir recuperação simples dos domínios con-tendo EG9703 ou EG8798 de tais polipeptídeos. Polipeptídeos de fusão sãoproduzidos em algumas modalidades através de cultura de uma célula re-combinante transformada com um polinucleotídeo de fusão que codifica umpolipeptídeo incluindo o segmento de fusão ligado a extremidade terminalcarboxila e/ou amino de um domínio contendo EG9703 ou EG8798.
Alguns segmentos de fusão para uso na presente invenção in-cluem um domínio de ligação glutationa; um domínio de ligação de metal, talcomo um segmento poli histidina capaz de ligação a um íon de metal diva-lente; um domínio de ligação de imunoglobulina, tal como Polipeptídeo A,Polipeptídeo G, célula T, célula B, receptor de Fc ou domínios de ligação deanticorpo de polipeptídeo complemento; um domínio de ligação de açúcar talcomo um domínio de ligação de maltose a partir de um polipeptídeo de liga-ção de maltose; e/ou um domínio "tag" (por exmeplo, pelo menos uma por-ção de β-galactosidase, um peptídeo etiqueta strep, outros domínios quepodem ser purificados usando compostos que se ligam ao domínio, tais co-mo anticorpos monoclonais). Outros segmentos de fusão incluem domíniosde ligação de metal, como um segmento poli histidina; um domínio de Iiga-ção de maltose; um peptídeo etiqueta strep.
Como aqui usado, "pelo menos uma porção" de um polinucleotí-deo ou polipeptídeo significa uma porção tendo as características de tama-nho mínimo de tais seqüências, como descrito acimá, ou qualquer fragmentomaior da molécula de comprimento inteiro, até e incluindo o inteiro compri-mento da molécula. Por exemplo, uma porção de um polinucleotídeo podeser 12 nucleotídeos, 13 nucleotídeos, 14 nucleotídeos, 15 nucleotídeos, eassim por diante, indo até o inteiro comprimento de polinucleotídeo. Similar-mente, uma porção de um polipeptídeo pode ser de 4 aminoácidos, 5 ami-noácidos, 6 aminoácidos, 7 aminoácidos, e assim por diante, indo até o intei-ro comprimento de polipeptídeo. O comprimento da porção a ser usada de-penderá da particular aplciação. Como discutido acima, uma porção de umpolinucleotídeo útil como sonda de hibridização pode ser tão curta como 12nucleotídeos. Uma porção de um polipeptídeo útil como um epítopo pode sertão curta como 4 aminoácidos. Uma porção de um polipeptídeo que desem-penha a função do polipeptídeo de inteiro comprimento genericamente podeser mais longa que 4 aminoácidos.
Outros polipeptídeos EG9703 ou EG8798 de planta da presenteinvenção são polipeptídeos que incluem mas não são limitados aos polipep-tídeos codificados, polipeptídeos de inteiro comprimento, polipeptídeos pro-cessados, polipeptídeos de fusão e seus polipeptídeos multivalentes assimcomo polipeptídeos que são homólogos truncados de polipeptídeos que in-cluem pelo menos porções das SEQ ID NOs mencionadas anteriormente.
As seqüências nomeadas da presente invenção são discutidasna Tabela I. A Tabela I mostra o número de identificação de seqüência, ogene, as espécies das quais ele foi isolado. Todas as seqüências nomeadasno presente pedido de patente são genes relacionados com rendimento esão capazes de alterarem o rendimento de uma planta, por exemplo, as se-qüências nomeadas são capazes de aumentarem o rendimento de umaplanta e/ou diminuírem o rendimento de uma planta. Processos para avalia-ção de rendimento são descritos aqui em uma outra parte.
Tabela I.
<table>table see original document page 48</column></row><table>Com relação a EG9703 ou EG8798, algumas células recombi-nantes são células de planta. Por "célula de planta" é pretendido qualquercélula autopropagando ligada por uma membrana semi-permeável e con-tendo um plastídeo. Uma tal célula também requer uma parede célula seainda propagação é desejada. Célula de planta, como aqui usado inclui, semlimitação, algas, cianobactérias, sementes, culturas em suspensão, embri-ões, regiões merismáticãs, tecido de calo, folhas, raízes, brotos, gametófitos,esporófitos, pólen, e microesporos. Características de células recombinantese plantas transgênicas e apropriados processos são descritos em WO03/062382, assim como patente US 6 040 497, ambas as quais são incorpo-radas por referência em sua totalidade. Por exemplo, expressão de genesem milho é conhecida na técnica e apropriados promotores são conhecidose podem ser selecionados pelo técnico versado. Por exemplo, vetores deexpressão em plantas podem ser construídos usando conhecidos vetores deexpressão em milho, tais como aqueles que podem ser obtidos de RhonePoulenc Agrochimie. Processos para construção de construções de expres-são e vetores de transformação incluem recombinação e manipulação in vi-tro padrão. Ver, por exemplo, as técnicas descritas em Weissbach andWeissbach, 1988, Methods For Plant Molecular Biology, Academic Press,Capítulos 26-28. Os vetores de transformação da invenção podem -ser de-senvolvidos a partir de qualquer vetor de transformação de planta conhecidona técnica, mas não são limitados a, família bem-conhecida de plasmídeosTi de Agrobacterium e seus derivados, incluindo ambos vetores integrantes ebinários, e incluindo mas não limitado a pBIB-KAN, pGA471, pEND4K,pGV38SO, e pMONSOS. Também são inclusos DNA e RNA de vírus deplanta, incluindo mas não limitado a CaMV, geminivírus, vírus mosaico detabaco, e derivados engenheirados dos mesmos, qualquer um dos quaispode servir eficazmente como vetores para transferência de uma seqüênciacodificante, ou seu equivalente funcional, com associados elementos regula-dores, em célula de planta e/ou autonomamente mantêm a seqüência trans-ferida. Em adição, elementos transponíveis podem ser utilizados em conjun-ção com qualquer vetor para transferir a seqüência codificante e seqüênciareguladora em uma célula de planta.
Para auxiliar na seleção de transformantes e transfectantes, osvetores de transformação podem ser preferivelmente modificados para com-preenderem uma seqüência codificante para um produto de gene repórter oumarcador selecionável. Uma tal seqüência codificante para um marcadorselecionável ou repórter preferivelmente deve estar em associação operativacom a seqüência codificante de elemento regulador descrita supra.
Genes repórteres que podem ser úteis na invenção incluem masnão são limitados ao gene 3'-glucuronidase (GUS) (Jefferson et al., Proc.Natl. Acad. Sei. USA1 83:8447 (1986)), e o gene Iuciferase (Ow et al., Scien-ce 234:856 (1986)). Seqüências codificantes que codificam marcadores se-lecionáveis que podem ser úteis na invenção incluem mas não são limitadosàquelas seqüências que codificam produtos de gene conferindo resistência aantibióticos, antimetabólitos ou herbicidas, incluindo mas não limitado a ca-namicina, higromicina, estreptomicina, fosfinotricina, gentamicina, metotrexa-to, glifosato e herbicidas sulfonil uréia, e incluem mas não são limitados aseqüências codificantes que codificam enzimas como neomicina fosfo trans-ferase Il (NPTlI)j cloranfenicol acetil transferase (CAT)1 e higromicina fosfotransferase (HPT, HYG).
Uma variedade de sistemas de expressão em planta pode serutilizada para expressar a seqüência codificante ou seu equivalente funcio-nal. Particulares espécies de plantas podem ser selcionadas a partir dequaisquer espécies de dicotiledôneas, monocotiledôneas, gimnospermas,planta vascular inferior ou não-vascular, incluindo qualquer colheita de cerealou outra colheita agriculturalmente importante. Tais plantas incluem, masnão são limitadas a, alfafa, Arabidopsis, aspargos, trigo, cana-de-açúcar,painço pérola, cevada, repolho, cenoura, aipo, milho, algodão, pepino, linho,alface, colza de semnte de óleo, pêra, ervilhas, petúnia, álamo, batata, arroz,beterraba, girassol, tabaco, tomate, trigo e trevo branco. Processos atravésdos quais plantas podem ser transformadas ou transfectadas são bem-conhecidos por aqueles versados na técnica. Ver, por exemplo, Plant Biote-chnology, 1989, Kung & Arntzen, eds., Butterworth Publishers, ch. 1, 2.Exemplos de processos de transformação que podem ser eficazmente usa-dos na invenção incluem mas não são limitados a transformação mediadapor Agrobacterium de discos de folhas ou outros tecidos de planta, microin-jeção de DNA diretamente em células de plantas, eletroporação de DNA emprotoplastos de célula de planta, Iipossoma ou fusão de esferoplasto, bom-bardeio com microprojétil, e a transfecção de células ou tecidos de plantacom vírus de planta apropriadamente engenhéirados. Procedimentos de cul-tura de tecido de planta necessários para prática da invenção são bem-conhecidos por aqueles versados na técnica. Ver, por exemplo, Dixon1 1985,Plant Cell Culture: A Practical Approach, IRL Press. Aqueles procedimentosde cultura de tecido que podem ser usados eficazmente para prática da in-venção incluem a produção e cultura de protoplastos de planta e suspen-sões de células, propagação de cultura estéril de discos de folhas ou outrostecidos de planta sobre meios contendo linhagens engenheiradas de agen-tes transformantes tais como, por exemplo, Agrobacterium ou linhagens devírus de planta e a regeneração de plantas transformadas inteiras a partir deprotoplastos, suspensões de células e tecidos de calos. A invenção pode serpraticada através de transformação ou transfecção de uma planta ou célulade planta com um vetor de transformação contendo uma construção de ex-pressão compreendendo uma-seqüência codificante para a seqüência e se-lecionando para transformantes ou transfectantes que expressam a seqüên-cia. Células e tecidos de planta transformada ou transfectada podem ser se-lecionados através de técnicas bem-conhecidas por aqueles versados, inclu-indo mas não limitado a detecção de produtos de gene repórter ou seleçãobaseada na presença de um dos marcadores selecionáveis descritos supra.As células ou tecido de planta transformada ou transfectada descritos supra.As células ou tecidos de planta transformada ou transfectada são entãocrescidas e plantas integrais regeneradas das mesmas. Integração e manu-tenção da seqüência codificante no genoma de planta podem ser confirma-dos através de técnicas padrões, por exemplo, por análises de hibridizaçãoSouthern, análises PCR, incluindo transcriptase reversa - PCR (RT-PCR) ouensaios imunológicos para os esperados produtos proteína. Uma vez taltransformante ou transfectante de planta seja identificado, uma modalidadenão-limitante da invenção envolve a expansão clonal e uso daquele trans-formante ou transfectante na produção de uma seqüência.
Elementos reguladores que podem ser usados nas construçõesde expressão incluem promotores que podem ser heterólogos ou homólogospara a célula de planta. O promotor pode ser um promotor de planta ou umpromotor não-planta que seja capaz de dirigir altos níveis de transcrição deuma seqüência ligada em células de planta e plantas. Exemplos não-limitantes de promotores de planta que podem ser usados eficazmente naprática da invenção incluem vírus mosaico de couve-flor (CaMV) 19S òu35S, rbcS, o promotor para a proteína de ligação a/b clorofila, Adhl, NOS eHMG2, ou suas modificações ou derivados. O promotor pode ser constitutivoou induzível. Por exemplo, e não a título de limitação, um promotor induzívelpode ser um promotor que promove expressão ou expressão aumentadados polinucleotídeos da presente invenção após ativação mecânica de gene(MGA) da planta, tecido de planta ou célula de planta. Um exemplo não-limitante de um tal promotor de planta induzível com MGA é MeGA.
As construções de expressão podem ser adicionalmente modifi-cadas de acordo com processos conhecidos por aqueles versados na técni-ca para aperfeiçoar ou otimizar expressão de gene heterólogo em plantas ecélulas de planta. Tais modificações incluem mas não são limitadas a muta-ção de elementos reguladores de DNA para aumentar resistência de promo-tor ou para alterar a própria seqüência codificante. Outras modificações in-cluem supressão de seqüências intron ou excesso de seqüências não-codificantes a partir das extremidades 5' e/ou 3' da seqüência codificante demodo a minimizar efeitos negativos associados com seqüência ou distânciasobre expressão de proteínas, por exemplo, através de minimização ou eli-minação de mensagem desestabilizando seqüências.
As construções de expressão ainda podem ser modificadas deacordo com processos conhecidos por aqueles versados na técnica paraadicionar, remover, ou de outro modo modificar seqüências sinais peptídeospara alterar clivagem de peptídeo sinal ou para aumentar ou mudar o alve-jamento dos polipeptídeos expressos através de sistema de endomembranade planta. Por exemplo, mas não a título de limitação, a construção de ex-pressão pode ser especificamente engenheirada para alvejar o polipeptídeopara secreção, ou localização vacuolar, ou retenção no retículo endoplásmi-co (ER).
A presente invenção também inclui anticorpos isolados capazesde seletivamente ligarem-se a pelo menos uma porção de um polipeptídeoEG9703 ou EG8798 da presente invenção ou a um seu mimetopo. Caracte-rísticas de células recombinantes e plantas transgênicas, e processos apro-priados são descritos em WO 03/062382.
A presente invenção também inclui células de planta, que com-preendem DNA heterólogo codificando pelo menos uma porção de um poli-peptídeo EG8798 ou EG9703. Tais polipeptídeos são capazes de alteraremo rendimento de uma planta. Por exemplo, mais preferivelmente o polipeptí-deo é capaz de aumentar o rendimento de uma planta, e menos preferivel-mente o polipeptídeo é capaz de diminuir o rendimento de uma planta. Ascélulas de planta incluem os polipeptídeos da presente invenção como des-crito aqui em outra parte. Adicionalmente, a presente invenção inclui um ma-terial de propagação de uma planta transgênica compreendendo a célula deplanta transgênica descrita acima.
A presente invenção também inclui plantas transgênicas conten-do DNA heterólogo que codifica um polipeptídeo EG8798 ou EG9703 que éexpresso em tecido de planta. Tais polipeptídeos são capazes de alteraremo rendimento de uma planta. As plantas transgênicas incluem os polipeptí-deos da presente invenção como aqui descrito em outra parte.
A presente invenção também inclui um polinucleotídeo isoladoque inclui um promotor ligado operavelmente a um polinucleotídeo que codi-fica pelo menos uma porção de um polipeptídeo EG8798 ou EG9703 emtecido de planta. Tais polipeptídeos são capazes de alterarem o rendimentode uma planta. As plantas transgênicas incluem os polipeptídeos da presen-te invenção como aqui descrito em outra parte.
O polinucleotídeo pode ser um polinucleotídeo recombinante, epode incluir qualquer promotor, incluindo um promotor nativo para um geneEG8798 ou EG9703.
A presente invenção também inclui uma célula hospedeira trans-fectada compreendendo uma célula hospedeira transfectada com uma cons-trução compreendendo um promotor, aperfeiçoador ou polinucleotídeo introna partir de um polinucleotídeo EG8798 ou EG9703 ou qualquer sua combi-nação, operavelmente ligado a um polinucleotídeos codificando uma proteí-na repórter. Tais construções são capazes de de alterarem o rendimento deuma planta. As plantas transgênicas incluem os polipeptídeos da presenteinvenção como aqui descrito em outra parte.
A presente invenção também inclui um vetor recombinante, queinclui pelo menos uma porção de pelo menos um polinucleotídeo EG9703 ouEG8798 de planta da presente invenção, inserido em qualquer vetor capazde liberar o polinucleotídeo em uma célula hospedeira. Características demoléculas recombinantes e apropriados processos são descritos em WO03/062382. Apropriados polinucleotídeos para inclusão em vetores recombi-nantes da presente invenção são como mostrado aqui para apropriados po-linucleotídeos EG9703 ou EG8798 per se. Polinucleotídeos para inclusão emvetores recombinantes, e particularmente em moléculas recombinantes, dapresente invenção incluem os polinucleotídeos EG9703 e EG8798 da pre-sente invenção.
Como aqui usado, condições rigorosas de hibridização refere-sea condições padrões de hibridização sob as quais polinucleotídeos, incluindooligonucleotídeos, são usados para identificação de moléculas tendo se-qüências de ácidos nucléicos similares. Tais condições padrões são mostra-das, por exemplo, em Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Ma-nual, Cold Spring Harbor Labs Press, 1989. Exemplos de tais condições sãoprovidos na seção de Exemplos do presente pedido de patente.
Como aqui usado, um gene EG9703 ou EG8798 de uma particu-lar espécie de planta inclui todas as seqüências de ácido nucléico relaciona-das a um gene EG9703 ou EG8798 natural como regiões reguladoras quecontrolam produção do polipeptídeo EG9703 ou EG8798 codificado por a-quele gene (tal como, mas não limitado a, regiões de controle de transcrição,tradução ou pós-tradução) assim como a própria região codificante. Em umamodalidade, um gene EG9703 ou EG8798 inclui pelo menos uma porção deum polinucleotídeo tal como SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 4;SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 7; SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO:11; SEQ ID NO: 13; SEQ ID NO: 14; SEQ ID NO: 15; SEQ ID NO: 16; SEQID NO: 17; SEQ ID NO: 18; SEQ ID NO: 19; SEQ ID NO: 20; SEQ ID NO:21; SEQ ID NO: 22; SEQ ID NO: 23; SEQ ID NO: 24; SEQ ID NO: 25; SEQID NO: 26; SEQ ID NO: 27; SEQ ID NO: 28; SEQ ID NO: 29; SEQ ID NO:30; SEQ ID NO: 31; SEQ ID NO: 32; SEQ ID NO: 33; SEQ ID NO: 34; SEQID NO: 35; SEQ ID NO: 36; SEQ ID NO: 37; SEQ ID NO: 38; SEQ ID NO:39; SEQ ID NO: 40; SEQ ID NO: 41; e um polinucleotídeo tendo pelo menoscerca de 70% de identidade de seqüência a qualquer das SEQ ID NOs ante-riores.
Em uma outra modalidade, um gene EG9703 ou EG8798 podeser uma variante alélica que inclui uma seqüência similar mas não idêntica aum EG9703 ou EG8798 da presente invenção, em um Iocus (ou loci) no ge-noma cuja atividade está relacionada com os mesmos processos bioquími-cos ou desenvolvimentais, e/ou um gene que ocorre em essencialmente omesmo Iocus como os genes incluindo urrvgene EG9703 ou EG8798 da pre-sente invenção, mas que, devido a variações naturais causadas, por exem-plo, por mutação ou recombinação, tem uma seqüência similar mas não i-dêntica. Devido genomas poderem sofrer rearranjo, o rearranjo físico de ale-los não é sempre o mesmo. Variantes alélicas tipicamente codificam polipep-tídeos tendo atividade similar àquela do polipeptídeo codificado pelo gene aoqual elas estão sendo comparadas. Variantes alélicas também podem com-preender alterações nas regiões não-traduzidas 51 ou 3' do gene (por exem-plo, em regiões controles reguladoras). Variantes alélicas são bem-conhecidas por aqueles versados na técnica e podem ser esperados seremencontrados dentro de um dado cultivar ou linhagem uma vez que o genomaé multiplóide e/ou entre uma população compreendendo dois ou mais culti-vares ou linhagens. Um alelo pode ser definido como uma seqüência de po-linucleotídeos EG8798 ou EG9703 tendo pelo menos uma mudança de nu-cleotídeo comparada a uma segunda seqüência de polinucleotídeo EG8798ou EG9703.
Como tal, o tamanho mínimo de um polinucleotídeo usado paracodificar um homólogo de polipeptídeo EG9703 ou EG8798 da presente in-venção é de cerca de 12 a cerca de 18 nucleotídeos em comprimento. Nãohá limite, outro que não um limite prático, sobre o tamanho máximo de um talpolinucleotídeo em que o polinucleotídeo pode incluir uma porção de um ge-ne, um gene inteiro, ou múltiplos genes, ou suas porções. Similarmente, otamanho mínimo de um homólogo de polipeptídeo EG9703 ou EG8798 dapresente invenção é de cerca de 4 a cerca de 6 aminoácidos em comprimen-to, com os tamanhos desejados dependendo de se porções funcionais oumultivalentes, de fusão, de inteiro comprimento de tais polipeptídeos sãodesejadas. Em algumas modalidades, o polipeptídeo é de pelo menos 30aminoácidos em comprimento.
Como aqui usado, um gene EG9703 ou EG8798 inclui todas asseqüências de ácido nucléico relacionadas a um gene EG9703 ou EG8798natural tais como regiões reguladoras que controlam produção do polipeptí-deo EG9703 ou EG8798 codificado por aquele gene (tal como, mas não Iimi-tado a, regiões de controle de transcrição, tradução ou pós-tradução) assimcomo a própria região codificante. Em uma modalidade, um gene EG9703ou EG8798 inclui os polinucleotídeos EG9703 ou EG8798 da presente in-venção. Em uma outra modalidade, um gene EG9703 ou EG8798 de milhopode ser uma variante alélica que inclui uma seqüência similar mas não i-dêntica aos polinucleotídeos EG9703 ou EG8798. da presente invenção.
Como aqui usado, um gene EG9703 ou EG8798 inclui todas asseqüências de ácido nucléico relacionadas a um gene EG9703 ou EG8798natural tais como regiões reguladoras que controlam produção do polipeptí-deo EG9703 ou EG8798 codificado por aquele gene (tal como, mas não Iimi-tado a, regiões de controle de transcrição, tradução ou pós-tradução) assimcomo a própria região codificante. Um gene EG9703 ou EG8798 preferivel-mente pode incluir os polinucleotídeos EG9703 ou EG8798 da presente in-venção. Adicionais objetos, vantagens e novas características desta inven-ção tornar-se-ão aparentes para aqueles versados na técnica com exame deseus seguintes exemplos, que não são pretendidos serem limitantes.
Exemplo 1. Descoberta de EG9703
Uma biblioteca de ADNc foi preparada a partir de tecidos deARNm de O. rufipogon. ADNcs randômicos foram seqüenciados em umamaneira de alta produtividade usando sistemas de seqüenciamento Amer-sham 4000. ESTs deste esforço de seqüenciamento foram BLASTed contraseqüências de DNA de O. sativa em bases de dados publicamente disponí-veis, tal como GenBank. Comparações emparelhadas usando análisesKa/Ks como descrito mais inteiramente na patente US 6 274 319 foram con-duzidas. Um par homólogo, clone EST de O. rufipogon número 9703 e O.sativa em uma base de dados conhecida foram verificados terem uma razãoKa/Ks de 1,5, indicando seleção positiva. A seqüência codificando polinucle-otídeo correspondendo a clone de O. rufipogon número 9703 é seqüência deácido nucléico SEQ ID NO: 1 e é chamada polinucleotídeo EG9703 de O.rufipogon e também é chamada o alelo ancestral de EG9703. A seqüênciacodificando polinucleotídeo do polinucleotídeo de O. sativa homólogo é se-qüência de ácido nucléico SEQ ID NO: 2 e é chamada um polinucleotíeo deO. sativa e é também chamada o alelo derivado ou domesticado de EG9703nos Exemplos abaixo e em outras partes neste pedido de patente. A se-qüência de polipeptídeo prevista codificada por SEQ ID NO: 1 é polipeptídeode SEQ ID NO: 3 e o polipeptídeo de O. sativa homólogo é polipeptídeoSEQ ID NO: 6. EST de milho parcial encontrado em GenBank é mostradocomo SEQ ID NO: 41.
Exemplo 2. Descoberta de EG8798
Um outro par homólogo de seqüências identificadas como positi-vamente selecionadas como descrito no Exemplo 1 é EST de O. rufipogonclone número 8798 e O. sativa em uma base de dados conhecida, que foramverificadas terem uma razão Ka/Ks de 3,7. A seqüência codificando polinu-cleotídeo correspondendo a um gene parcial de clone de O. rufipogon núme-ro 8798 é seqüência de ácido nucléico SEQ ID NO: 7 e é chamada um poli-nucleotídeo EG8798 de O. rufipogon e é também referida como o alelo an-cestral nos Exemplos abaixo. A seqüência codificante foi verificada ser SEQID NO: 8 e o correspondente polipeptídeo é SEQ ID NO: 9. A seqüência co-dificando polinucleotídeo do polinucleotídeo de O. sativa homólogo é se-qüência de ácidos nucléicos SEQ ID NO: 10 e é chamada um polinucleotí-deo EG8798 de O. sativa e é também referida como o alelo derivado ou do-mesticado nos Exemplos abaixo e em outras partes neste pedido de patente.
A seqüência codificante correspondendo a SEQ ID NO: 10 é SEQ ID NO: 11e o correspondente peptídeo é polipeptídeo SEQ ID NO: 12.
Exemplo 3. BLAST para identificar adicionais homólogos
Polinucleotídeos EG8798 de O. rufipogon e O. sativa foram usa-dos para ainda BLAST GenBank para identificar genes homólogos em outrasplantas. Desta maneira, um gene EG8798 de T. aestivum, um gene EG8798de H. vulgare, um gene EG8798 de S. bicolor, um gene EG8798 de S. offici-narum, e um gene EG8798 de P. typhoides foram identificados.
Exemplo 4. Genotipificacão de EG9703 e EG8798 em linhas de arroz e hí-bridos e análise estatística
Polinucleotídeos EG9703 e EG8798 foram amplificados por PCRa partir de linhas de arroz e híbridos e suas seqüências de ácido nucléicoforam determinadas. Genericamente, as linhas e híbridos de maiores, rendi-mentos foram verificados terem o alelo derivado de EG9703 e as linhas ehíbridos de menores rendimentos foram verificados terem o alelo ancestralde EG9703. Todas as linhas e híbridos analisados foram verificados terem oalelo derivado de EG8798, indicando que este alelo foi fixado em linhas do-mésticas e híbridos de arroz. De fato, a única espécie de arroz outras quenão O. rufipogon que nós verificamos possuir o alelo ancestral é O. glaber-rima, que foi domesticada na África, independentemente da domestificaçãode O. sativa baseada na Ásia.
Exemplo 5. Cálculos estatísticos
Calculou-se R2, a proporção de variação explicada pelo modeloaditivo de fator simples corrigido para efeitos de linha. Para os principais e-feitos plus, R2 variou de 60% para rendimento, 46% para altura, 37% pararesidência, 45% para moagem integral, 34% para peso de grão descascado,18% para largura, 30% para ASV (valor de espalhamento alcalino, quandocombinado com % de amilase, rende o índice de amido), e 22% para giz.
Isto adiciona à evidencia de que EG9703 influencia rendimento,isto é, que ele é um assim-chamado gene de "rendimento".
Exemplo 6. Identificação de EG8798 em trigo, cevada, sorgo, painco pérolae cana-de-açúcar
Pesquisa de seqüências de genoma de trigo, cevada, sorgo, ecana-de-açúcar em GenBank através de BLAST usando seqüências deEG8798 de arroz identificou pelo menos sete ESTs de trigo (incluindo núme-ro de acesso CA742308, AL827514, CV762022, CA655855, CA 689037,CA681856 e CA734626), vários ESTs de cevada (incluindo números de a-cesso CD057439, BI950276, CA007363, e BE216284), seis ESTs de sorgo(incluindo números de acesso CF431925, BM323835, BG605827,CD428819, C429277, e BG412520), um EST de painço pérola (número deacesso CD725289) e cinco ESTs de cana-de-açúcar (números de acessoCA268008, CA181888, CA281730, CA264659m e CA275998) que parecemser homólogos. Iniciadores foram desenhados através de processos padrõesque permitiram amplificação bem sucedida dos homólogos de trigo, cevada,sorgo, e cana-de-açúcar. Seqüências de homólogos de trigo, cevada, sorgo,cana-de-açúcar e milho são providas como ; SEQ ID NO: 13; SEQ ID NO:14; SEQ ID NO: 15; SEQ ID NO: 16; SEQ ID NO: 17; SEQ ID NO: 18; SEQID NO: 19; SEQ ID NO: 20; SEQ ID NO: 21; SEQ ID NO: 22; SEQ ID NO:23; SEQ ID NO: 24; SEQ ID NO: 25; SEQ ID NO: 26; SEQ ID NO: 27; SEQID NO: 28; SEQ ID NO: 29; SEQ ID NO: 30; SEQ ID NO: 31; SEQ ID NO:32; SEQ ID NO: 33; SEQ ID NO: 34; SEQ ID NO: 35; SEQ ID NO: 36; SEQID NO: 37; SEQ ID NO: 38; SEQ ID NO: 39; SEQ ID NO: 40; e SEQ ID NO:41. Trigo de pão moderno é um hexaplóide, consistindo em três genomas,de modo que mais de uma cópia expressa de EG8798 pode ser detectada.
Exemplo 7. Formação de perfil de expressão
Usando RT PCR, mediu-se níveis de ARNm corresponendo aEG9703, EG8798, EG307, e EG1117 em amostras de folhas de plantas dearroz coletadas em 22 pontos de tempo durante crescimento. A Figura 1mostra que um número de características positivas são associadas comEG9703 e EG8798, tais como rendimento, altura, residência, moagem inte-gral, peso de grão, ASV, amilase, giz, largura, anetese, L/W. A Figura 2 mos-tra que expressão destes genes é coordenadamente aumentada durante afase de iniciação de panícula de crescimento, quando grãos estão sendoformados. Figura 2. Perfil de expressão para quatro genes selecionados po-sitivamente. Na Figura 2, o eixo χ representa estágios de crescimento deplanta (V = vegetativo, Pl = iniciação de panículo, ou estágios reprodutivos).O eixo y representa nível de expressão relativo. Expressão destes quatrogenes selecionados positivamente é mais alta durante estágios reprodutivos,quando grãos estão sendo formados. Esta verificação é consistente comestes genes sendo estatisticamente associados com rendimento de grão, eque eles são genes de rendimento.
Exemplo 8. Genotipificacão de EG9703 e EG8798 em linhas de arroz e hí-bridos e análise estatística
Polinucleotídeós EG9703 e EG8798 foram amplificados por PCRa partir de linhas de arroz e híbridos e suas seqüências de ácidos nucléicosforam determinadas. Genericamente, as linhas e híbridos de maior rendi-mento foram verificados terem o alelo derivado de EG9703 e as linhas e hí-bridos de menor rendimento foram verificados terem o alelo ancestral deEG9703. Todas as linhas e híbridos analisados foram verificados terem oalelo derivado de EG8798, indicando que este alelo foi fixado em linhas do-mesticadas e híbridos de arroz. De fato, a única espécie de arroz outra quenão O. rufipogon que nós verificamos possuir o alelo ancestral é O. glaber-rima, que foi domesticada na África, independentemente da domestificaçãode O. sativa baseada na Ásia. Os dados são mostrados na Tabela II. As se-guintes abreviaturas são usadas na Tabela II:
<table>table see original document page 60</column></row><table>Tilnop número de rebentos/planta Pancltil panícula/rebento Wtsd peso de semente Fillsd % de semente enchida SdwtIOOO peso de semente de 1000 grãos Totsd semente total Pctsd contagem de semente/panícula Plength comprimento de panícula sdlOOOdh peso de semente de 1000 grãos (descascados) altura altura de planta adjyield rendimento ajustado totwgt peso total tomilyld rendimento moído total wmilyld rendimento moído total ERGT refere-se a designação de linhagem de arroz.
Exemplo 9. Validação de confirmação de genes candidatos rendimento:Análises de associação em arroz, (experimento de campo réplica)Como descrito em Exemplo 17 de WO 03/062382, análises deassociação envolve seqüenciamento de cada gene candidato em um grandenúmero de linhagens de arroz bem caracterizadas para aprender se certosalelos dos genes são associados com características fenotípicas. Os quatrogenes EG307, EG1117, EG9703, e EG8798 foram genotipificados em 104linhas de arroz. Todas as 104 linhas de arroz e híbridos foram crescidas emtriplicata em um campo e uma estação de crescimento, submetidas às mes-mas condições de clima e crescimento. As plantas foram colhidas mecani-camente. Os valores R2 foram calculados através de processos estatísticospadrões para determinar associação de particulares alelos de cada genecom características. Os dados são mostrados na Tabela II.Exemplo 10. Uso de qenótipo como marcadores para geração assistida commarcador
Em cruzamentos usando linhas Iandrace para tentar obter me-lhor resistência a seca ou resistência a peste em um híbrido elite, mas nãoperder rendimento, plântulas de tal cruzamento são selecionadas e somenteaquelas plântulas que contêm o melhor alelo de EG8798 ou EG9703 sãoselecionadas. Em cruzamentos de uma inata de menor rendimento e umainata de maior rendimento - plântulas de tais cruzamentos são selecionadase somente aquelas plântulas que contêm o melhor alelo de EG8798, EG9703 são selecionadas.<table>table see original document page 63</column></row><table><table>table see original document page 64</column></row><table><table>table see original document page 65</column></row><table><table>table see original document page 66</column></row><table><table>table see original document page 67</column></row><table><table>table see original document page 68</column></row><table><table>table see original document page 69</column></row><table><table>table see original document page 70</column></row><table>Tabela II
<table>table see original document page 71</column></row><table>Tabela II
<table>table see original document page 72</column></row><table>Tabela Il
<table>table see original document page 73</column></row><table>Tabela II
<table>table see original document page 74</column></row><table>Tabela II
<table>table see original document page 75</column></row><table>Tabela II
<table>table see original document page 76</column></row><table>Tabela Il
<table>table see original document page 77</column></row><table>Tabela II
<table>table see original document page 78</column></row><table>
Legendas da Tabela Il
Entrada N°
Chalk
Antese
Altura
Residência
Rendimento LBS
Moinho total
Moinho integralLISTAGEM DE SEQÜÊNCIA<110> Evolutionary Genomics LLC
Messier, Walter<120> P0LINUCLE0TÍDE0S EG8798 E EG9703 E SEUS USOS<130> GENO200.1.9/PCT<150> 60/714,142<151> 2005-09-02<150> 60/774,939<151> 2006-02-17<160> 41
<170> Patentln version 3.3<210> 1<211> 2646<212> DNA<213> Oryza rufipogon<400> 1
atgtctcgcc gccgggacgc tgcgccgacg gcgcgcgagg gcgagaggga tctcgtcgtg 60aaggtaaaat tcggtggcac tcttaagcgg ttcactgctt ttgtgaatgg tccgcacttt 120gatcttaatc tggctgctct tcggtcaaag attgcgagtg cttttaagtt caatccagat 180actgagtttg tactcaccta tactgatgag gatggggatg ttgtcatact ggatgatgat 240agtgatttat gtgatgctgc cattagtcag agactgaacc ctcttaggat taatgttgag 300ttgaagagca gcagtgatgg ggtacatcag acaaaacagc aggtattgga ttccatatct 360gtaatgtcca ctgctctgga agatcaattg gctcaggtga aattagctat cgatgaagct 420ttaaaatttg taccagaaca agttcccact gtccttgcaa aaatatcaca tgacttgcgt 480tctaaagctg catcatcagc gccatcattg gctgatttgc tggaccggct tgctaaactg 540atggcaccaa agagcaaaat gcagtcttcc agtggttctg ctgatggttc atctggctcc 600tctagtggta ggggacaaac twtgggaagk ttgaatatta aaaatgacac tgagctcatg 660gctgtttcag cttcgaaccc tctggatatg cataactctg gatcaactaa atcacttggt 720cttaagggtg tgcttcttga tgacatcaaa gctcaagctg aacatgtatc gggatatcct 780tattatgtgg ataccctttc aggctgggta aaagttgata acaarggaag taccaatgcc 840caaagtaask gcaagtctgt tacatcctct gctgtgccac aagttactag cattggtcat 900ggtgcaccta ctgttcattc tgctcctgct tcagattgca gtgaagggtt aagaagtgat 960cttttctgga cacaactagg CCtttCttCt ggtgatttga actcgacatg ccctcctcca ctccgagctg ataaaagcag ttacaagggt agtaacacat ctaagccaga gaatctctcc agaagcttta agggtggtcg ctatttccct ccagataatc tttcaccagt cggtctttat aggtgcccat acagggatct cagtgataag agatggatgc agtgcgatga ctgtggggtc aatattaaag atgattatga tttatgcagc gaatatacca gaatagacag accatctttt aaccagatgc tctttccaca tcttcgacag actgtccctg atggcacagt aatggcacca cataacaatg gatcttccat gtggccatat ctatttgcac gcaacagctc agttaaatta caagagatcg atgttggtgt ttattttgtc tactggagat tggcatcacc cactggccag caggtggaac acccgggcaa aaccagtagc atacccccag aaggaagcaa cacagaatgg gcagatattg tggatgaata ctctggaagc taccatgaag ccaccaaacc gatggaacct cctagagcat ttgaatcagt gctagtgcca gctgaaaagg ctttgaagcc tgctgccgtg ccaaaacctg ttagcattcc tgcatctgga gctgcaccta tcggagctgc tgctgctcct attggaatgc cctctgcaac tgctcgtgct gatcacatca gtgccgtgga ggacaacatg caagtcgacc tgaacaagga aataattagg gatgaactct gtggcatcct cgaatgggat atctga <210> 2 <211> 2646 <212> DNA
gagccctttg ggcctaatgg caagattgct 1020ccactgtttc cccgttatcc acttcagtct 1080ggttcctctt accctccatg catctgcaaa 1140cattatccag ttcagtccct ccaagctgac 1200ccatgcacct gcaaaaataa cacatctaag 1260ggaccttatt ctgaaggcag cagctgtaat 1320cacgagagta tggcacagca cacactgcat 1380acacctatcg ctggttctcg ctacaagtca 1440acctgttttt ctcgaatggg caatgtgaat 1500gggagtagac gatttagaga cctcaaccag 1560ctacatgatt gctgcttcat taaggatrtt 1620tcaaccccat ttacgaagat ttggcgcata 1680gggacgtgtc ttacctgggt tggcggacat 1740gggatctcgg tggatggttt ccctattgat 1800acacctgcaa agcctggtgg gtacgtgtcg 1860atgtttggtc agcgagtttg ggtttttatt 1920aacaagcaga gtgctgctat aaacttgaac 1980aagcattctg ttgatacgaa tattcagtct 2040accataactg atcgtcttgc acatacacta 2100gagcttgttt caagtggcgc accttctgta 2160gctactgatc tcctcacttc atctgctgga 2220cctgcacctg cacctcaagc cattcccctg 2280cctgcgcctg ctcctgttag tgcgactacc 2340atcagtgagc ccaccgcacc tgctgctgcc 2400gcttctcgcc tgcctaccga gccttcatct 2460ctgagagagc tggggcagat gggctttggg 2520cggaacgagt ataacctgga gcaatccatt 2580gcactccatg atgaactgca cgaactgggc 2640 2646<213> Oryza rufipogon <220> <221> CDS <222> (1). .(2646) <400> 2 atg tct cgc cgc cgg gac gct gcg ccg acg gcg cgc gag ggc gag agg 48 Met Ser Arg Arg Arg Asp Ala Ala Pro Thr Ala Arg Glu Gly Glu Arg 1 5 10 15 gat CtC gtc gtg aag gta aaa ttc ggt ggc act Ctt aag cgg ttc act 96 Asp Leu vai Val 20 Lys Val Lys Phe Gly 25 Gly Thr Leu Lys Arg 30 Phe Thr gct ttt gtg aat ggt ccg cac ttt gat Ctt aat ctg gct gct Ctt cgg 144 ATa Phe Val 35 Asn Gly Pro HiS Phe 40 Asp Leu Asn Leu Ala 45 Ala Leu Arg tca aag att gcg agt gct ttt aag ttc aat cca gat act gag ttt gta 192 Ser Lys Ile Ala Ser Ala Phe Lys Phe Asn Pro Asp Thr Glu Phe vai 50 55 60 CtC acc tat act gat gag gat ggg gat gtt gtc ata ctg gat gat gat 240 Leu Thr Tyr Thr Asp Glu Asp Gly Asp vai vai Ile Leu Asp Asp Asp 65 70 75-· 80 agt gat tta tgt gat gct gcc att agt cag aga ctg aac CCt Ctt agg 288 Ser Asp Leu Cys Asp Ala Ala Ile Ser Gln Arg Leu Asn Pro Leu Arg 85 90 95 att aat gtt gag ttg aag age age agt gat ggg gta cat cag aca aaa 336 He Asn Val Glu Leu Lys Ser Ser Ser Asp Gly vai His Gln Thr Lys 100 105 110 cag cag gta ttg gat tcc ata tct gta atg tcc act gct ctg gaa gat 384 Gln Gln Val 115 Leu Asp Ser Ile ser 120 vai Met Ser Thr Ala 125 Leu Glu ASp caa ttg gct cag gtg aaa tta gct ate gat gaa gct tta aaa ttt gta 432 Gln Leu Ala Gln Val Lys Leu Ala Ile Asp Glu Ala Leu Lys Phe vai 130 135 140cca gaa caa gtt ccc act gtc ctt gca aaa ata tca cat gac ttg cgt 480
Pro Glu Gln vai Pro Thr Val Leu Ala Lys Ile Ser His Asp Leu Arg145 150 155 160
tct aaa gct gca tca tca gcg cca tca ttg gct gat ttg ctg gac cgg 528
Ser Lys Ala Ala Ser Ser Ala Pro Ser Leu Ala Asp Leu Leu Asp Arg
165 170 175
ctt gct aaa ctg atg gca cca aag age aaa atg cag tct tcc agt ggt 576
Leu Ala Lys Leu Met Ala Pro Lys Ser Lys Met Gln ser ser ser Gly180 185 190
tct gct gat ggt tca tct ggc tcc tct agt ggt agg gga caa act wtg 624
Ser Ala Asp Gly Ser Ser Gly Ser Ser Ser Gly Arg Gly Gln Thr Xaa
195 200 205
gga agk ttg aat att aaa aat gac act gag ctc atg gct gtt tca gct 672
Gly Xaa Leu Asn Ile Lys Asn Asp Thr Glu Leu Met Ala Val Ser Ala210 215 220
tcg aac cct ctg gat atg cat aac tct gga tca act aaa tca ctt ggt 720
Ser Asn Pro Leu Asp Met His Asn Ser Gly Ser Thr Lys Ser Leu Gly225 230 235 240
ctt aag ggt gtg ctt ctt gat gac ate aaa gct caa gct gaa cat gta 768
Leu Lys Gly vai Leu Leu Asp-Asp Ile Lys Ala Gln Ala Glu His vai
245 250 255
tcg gga tat cct tat tat gtg gat acc ctt tca ggc tgg gta aaa gtt 816
Ser Gly Tyr Pro Tyr Tyr Val Asp Thr Leu Ser Gly Trp Val Lys Val260 265 270
gat aac aar gga agt acc aat gcc caa agt aas kgc aag tct gtt aca 864
Asp Asn Lys Gly Ser Thr Asn Ala Gln Ser Xaa Xaa Lys Ser vai Thr
275 280 285
tcc tct gct gtg cca caa gtt act age att ggt cat ggt gca cct act 912
Ser Ser Ala Val Pro Gln Val Thr Ser Ile Gly His Gly Ala Pro Thr290 295 300
gtt cat tct gct cct gct tca gat tgc agt gaa ggg tta aga agt gat 960
Val His Ser Ala Pro Ala Ser Asp Cys ser Glu Gly Leu Arg ser Asp305 310 315 320
ctt ttc tgg aca caa cta ggc ctt tct tct gag ccc ttt ggg cct aat 1008Leu Phe Trp Thr Gln Leu Gly Leu Ser Ser Glu Pro Phe Gly Pro Asn325 330 335
ggc aag att gct ggt gat ttg aac tcg aca tgc cct cct cca cca ctg 1056Gly Lys lie Ala Gly Asp Leu Asn ser Thr Cys Pro Pro Pro Pro Leu
340 345 350
ttt ccc cgt tat cca ctt cag tct ctc cga gct gat aaa age agt tac 1104
Phe Pro Arg Tyr Pro Leu Gln Ser Leu Arg Ála Asp Lys Ser Ser Tyr355 360 365
aag ggt ggt tcc tct tac cct cca tgc ate tgc aaa agt aac aca tct 1152
Lys Gly Gly Ser Ser Tyr Pro Pro Cys Ile Cys Lys Ser Asn Thr Ser
370 375 380
aag cca gag aat ctc tcc cat tat cca gtt cag tcc ctc caa gct gac 1200
Lys Pro Glu Asn Leu Ser His Tyr Pro vai Gln ser Leu Gln Ala Asp385 390 395 400
aga age ttt aag ggt ggt cgc tat ttc cct cca tgc acc tgc aaa aat 1248
Arg Ser Phe Lys Gly Gly Arg Tyr Phe Pro Pro Cys Thr Cys Lys Asn405 410 415
aac aca £ct aag cca gat aat ctt tca cca gtc ggt ctt tat gga cct 1296
Asn Thr ser Lys Pro Asp Asn Leu Ser Pro vai Gly Leu Tyr Gly Pro
420 425 430
tat tct gaa ggc age age tgt aat agg tgc cca tac agg gat ctc agt 1344
Tyr Ser Glu Gly Ser ser Cys Asn Arg Cys Pro Tyr Arg Asp Leu Ser435 440 445
gat aag cac gag agt atg gea cag cac aca ctg cat aga tgg atg cag 1392
Asp Lys His Glu ser Met Ala Gln His Thr Leu His Arg Trp Met Gln
450 455 460
tgc gat gac tgt ggg gtc aca cct ate gct ggt tct cgc tac aag tca 1440
Cys Asp Asp Cys Gly Val Thr Pro Ile Ala Gly Ser Arg Tyr Lys Ser465 470 475 480
aat att aaa gat gat tat gat tta tgc age acc tgt ttt tct cga atg 1488Asn Ile Lys Asp Asp Tyr Asp Leu Cys Ser Thr Cys Phe Ser Arg Met
485 490 495
ggc aat gtg aat gaa tat acc aga ata gac aga cca tct ttt ggg agt 1536Gly Asn vai Asn Glu Tyr Thr Arg lie Asp Arg Pro Ser Phe Gly Ser 500 505 510
aga cga ttt aga gac ctc aac cag aac cag atg ctc ttt cca cat ctt 1584Arg Arg Phe Arg Asp Leu Asn Gln Asn Gln Met Leu Phe Pro His Leu
515 520 525
cga cag cta cat gat tgc tgc ttc att aag gat rtt act gtc cct gat 1632Arg Gln Leu His Asp Cys Cys Phe lie Lys Asp Xaa Thr vai Pro Asp530 535 540
ggc aca gta atg gca cca tca acc cca ttt acg aag att tgg cgc ata 1680Gly Thr vai Met Ala Pro Ser Thr Pro Phe Thr Lys Ile Trp Arg Ile545 550 555 560
cat aac aat gga tct tcc atg tgg cca tat ggg acg tgt ctt acc tgg 1728His Asn Asn Gly Ser Ser Met Trp Pro Tyr Gly Thr Cys Leu Thr Trp
565 570 575
gtt ggc gga cat cta ttt gca cgc aac age tca gtt aaa tta ggg ate 1776Val Gly Gly His Leu Phe Ala Arg Asn Ser Ser Val Lys Leu Gly Ile580 585 590
tcg gtg gat ggt ttc cct att gat caa gag ate gat gtt ggt gtt tat 1824Ser Val Asp Gly Phe Pro Ile Asp Gln Glu Ile Asp vai Gly vai Tyr
595 600 605
ttt gtc aca cct gca aag cct ggt ggg tac gtg tcg tac tgg aga ttg 1872Phe Val Thr Pro Ala Lys Pro Gly Gly Tyr Val Ser Tyr Trp Arg Leu610 615 620
gca tca ccc act ggc cag atg ttt ggt cag cga gtt tgg gtt ttt att 1920Ala Ser Pro Thr Gly Gln Met Phe Gly Gln Arg Val Trp Val Phe Ile625 630 635 640
cag gtg gaa cac ccg ggc aaa acc agt age aac aag cag agt gct gct 1968Gln vai Glu His Pro Gly Lys Thr ser ser Asn Lys Gln Ser Ala Ala645 650 655ata aaclie Asn
tct gttSer vai
gga ageGly Ser690acc aaaThr Lys705
cct agaPro Arg
tca tctSer ser
cct geaPro Ala
tct ggaSer Gly770gga gctGly Ala785
att ggaIle Gly
gag cctGlu Pro
ttg aacLeu Asn660gat acgAsp Thr675
acc ataThr Ile
ccg atgPro Met
gea tttAla Phe
gct ggaAla Gly740cct caaPro Gln755
cct gcgPro Ala
gct gctAla Ala
atg cccMet Pro
tca tctSer Ser
ata cccIle Pro
aat attAsn Ile
act gatThr Asp
gaa cctGlu Pro710gaa tcaGlu ser725
gct gaaAla Glu
gcc attAla Ile
cct gctPro Ala
gct cctAla Pro790tct geaSer Ala805
gat cacAsp His
cca gaaPro Glu
cag tct
Gln Ser680
cgt ctt
Arg Leu695
gag ctt
Glu Leu
gtg ctavai Leu
aag gctLys Ala
ccc ctgPro Leu760cct gttPro vai775
ate agtIle Ser
act gctThr Ala
ate agtIle Ser
gga ageGly Ser665
gea gatAla Asp
gea catAla His
gtt tcavai Ser
gtg ccavai Pro730ttg aagLeu Lys745
cca aaaPro-Uys
agt gcgSer Ala
gag cccGlu Pro
cgt gctArg Ala810gcc gtgAla vai
aac acaAsn Thr
att gtgIle vai
aca ctaThr Leu700agt ggcSer Gly715
gct actAla Thr
cct gctPro Ala
cct gttPro vai
act accThr Thr780acc geaThr Ala795
gct tctAla ser
gag gacGlu Asp
gaa tgg aag catGlu Trp Lys His670
gat gaa tac tctAsp Glu Tyr Ser685
tac cat gaa gccTyr His Glu Ala
2016
gea cctAla Pro
gat etcAsp Leu
gcc gtgAla vai750age attSer Ile765
gct geaAla Ala
tct gtaSer vai720ctc actLeu Thr735
cct geaPro Ala
cct geaPro Ala
cct atePro Ile
cct gct gct gccPro Ala Ala Ala800
cgc ctg cct accArg Leu Pro Thr815
aac atg ctg agaAsn Met Leu Arg
2064
2112
2160
2208
2256
2304
2352
2400
2448
2496820 825 830
gag ctg ggg cag atg ggc ttt ggg caa gtc gac ctg aac aag gaa ata 2544Glu Leu Gly Gln Met Gly Phe Gly Gln Val Asp Leu Asn Lys Glu Ile835 840 845
att agg cgg aac gag tat aac ctg gag caa tcc att gat gaa ctc tgt 2592Ile Arg Arg Asn Glu Tyr Asn Leu Glu Gln Ser Ile Asp Glu Leu Cys
850 855 860
ggc ate ctc gaa tgg gat gea ctc cat gat gaa ctg cac gaa ctg ggc 2640Gly lie Leu Glu Trp Asp Ala Leu His Asp Glu Leu His Glu Leu Gly 865 870 875 880
ate tga 2646
Ile
<210> 3<211> 881<212> PRT
<213> Oryza rufipogon<220>
<221> característica mista<222> (208)..(208)<223> O 'Xaa'- na posição 208 significa Met, ou Leu.<220>
<221> característica mista<222> (210)..(210)
<223> O 1Xaa' na posição 210 significa Arg1 ou Ser.<220>
<221> característica mista<222> (283)..(283)
<223> O 1Xaa' na posição 283 significa Lys, ou Asn.<220>
<221> característica mista<222> (284)..(284)
<223> o 'xaa' na posição 284 significa Gly1 ou Cys.<220>
<221> característica mista<222> (540)..(540)
<223> O 'Xaa' na posição 540 significa vai, ou lie.<400> 3
Met Ser Arg Arg Arg Asp Ala Ala Pro Thr Ala Arg Glu Gly Glu Arg1 5 10' 15
Asp Leu Val Val Lys vai Lys Phe Gly Gly Thr Leu Lys Arg Phe Thr 25 30
Ala Phe vai Asn Gly Pro His Phe Asp Leu Asn Leu Ala Ala Leu Arg35 40 45
Ser Lys Ile Ala Ser Ala Phe Lys Phe Asn Pro Asp Thr Glu Phe Val
50 55 60
Leu Thr Tyr Thr Asp Glu Asp Gly Asp vai Val Ile Leu Asp Asp Asp65 70 75 80
Ser Asp Leu Cys Asp Ala Ala Ile Ser Gln Arg Leu Asn Pro Leu Arg
85 90 95
Ile Asn Val Glu Leu Lys Ser Ser Ser Asp Gly Val His Gln Thr Lys100 105 110
Gln Gln vai Leu Asp Ser Ile Ser vai Met Ser Thr Ala Leu Glu Asp115 120 125
Gln Leu Ala Gln Val Lys Leu Ala Ile Asp Glu Ala Leu Lys Phe vai
130 135 140
Pro Glu Gln vai Pro Thr Val Leu Ala Lys Ile Ser His Asp Leu Arg145 150 155 160
Ser Lys Ala Ala Ser Ser Ala Pro Ser Leu Ala Asp Leu Leu Asp Arg
165 170 175
Leu Ala Lys Leu Met Ala Pro Lys ser Lys Met Gln ser ser Ser Gly180 185 190
Ser Ala Asp Gly ser ser Gly Ser Ser ser Gly Arg Gly Gln Thr Xaa195 200 205
Gly Xaa Leu Asn Ile Lys Asn Asp Thr Glu Leu Met Ala vai Ser Ala210 215 220
Ser Asn Pro Leu Asp Met His Asn ser Gly Ser Thr Lys Ser Leu Gly225 230 235 240
Leu Lys Gly Val Leu Leu Asp Asp Ile Lys Ala Gln Ala Glu His Val245 250 255
Ser Gly Tyr Pro Tyr Tyr Val Asp Thr Leu Ser Gly Trp Val Lys vai
260 265 270
Asp Asn Lys Gly ser Thr Asn Ala Gln Ser Xaa Xaa Lys Ser Val Thr275 280 285
Ser Ser Ala Val Pro Gln Val Thr Ser Ile Gly His Gly Ala Pro Thr290 295 300
Val His Ser Ala Pro Ala Ser Asp Cys ser Glu Gly Leu Arg ser Asp305 310 315 320
Leu Phe Trp Thr Gln Leu Gly Leu ser ser Glu Pro Phe Gly Pro Asn325 330 335
Gly Lys Ile Ala Gly Asp Leu Asn Ser Thr Cys Pro Pro Pro Pro Leu
340 345 350
Phe Pro Arg Tyr Pro Leu Gln Ser Leu Arg Ala Asp Lys Ser Ser Tyr355 360 365
Lys Gly Gly ser ser Tyr Pro Pro Cys Ile Cys Lys Ser Asn-Thr ser370 375 380
Lys Pro Glu Asn Leu Ser His Tyr Pro Val Gln Ser Leu Gln Ala Asp385 390 395 400
Arg Ser Phe Lys Gly Gly Arg Tyr Phe Pro Pro Cys Thr Cys Lys Asn405 410 415
Asn Thr Ser Lys Pro Asp Asn Leu ser Pro Val Gly Leu Tyr Gly Pro
420 425 430
Tyr Ser Glu Gly ser Ser Cys Asn Arg Cys Pro Tyr Arg Asp Leu Ser435 440 445
Asp Lys His Glu Ser Met Ala Gln His Thr Leu His Arg Trp Met Gln450 455 460
Cys Asp Asp Cys Gly Val Thr Pro lie Ala Gly Ser Arg Tyr Lys Ser465 470 475 480
Asn Ile Lys Asp Asp Tyr Asp Leu Cys Ser Thr Cys Phe Ser Arg Met
485 490 495
Gly Asn Val Asn Glu Tyr Thr Arg Ile Asp Arg Pro Ser Phe Gly Ser 500 505 510
Arg Arg Phe Arg Asp Leu Asn Gln Asn Gln Met Leu Phe Pro His Leu
515 520 525
Arg Gln Leu His Asp Cys Cys Phe Ile Lys Asp Xaa Thr Val Pro Asp530 535 540
Gly Thr Val Met Ala Pro ser Thr Pro Phe Thr Lys Ile Trp Arg Ile545 550 555 560
His Asn Asn Gly ser Ser Met Trp Pro Tyr Gly Thr Cys Leu Thr Trp
565 570 575
Val Gly Gly His Leu Phe Ala Arg Asn ser ser Val Lys Leu Gly Ile 580 585 590
Ser Val Asp Gly Phe Pro Ile Asp Gln Glu Ile Asp vai Gly vai Tyr
595 600 605
Phe Val Thr pro Ala Lys Pro Gly Gly Tyr vai Ser Tyr Trp Arg Leu610 615 620
Ala ser Pro Thr Gly Gln Met Phe Gly Gln Arg Val Trp Val Phe Ile625 630 635 640
Gln Val Glu His Pro Gly Lys Thr Ser Ser Asn Lys Gln Ser Ala Ala
645 650 655
Ile Asn Leu Asn Ile Pro Pro Glu Gly Ser Asn Thr Glu Trp Lys His 660 665 670
Ser Val Asp Thr Asn Ile Gln Ser Ala Asp Ile Val Asp Glu Tyr Ser
675 680 685
Gly Ser Thr Ile Thr Asp Arg Leu Ala His Thr Leu Tyr His Glu Ala690 695 700
Thr Lys Pro Met Glu Pro Glu Leu Val Ser Ser Gly Ala Pro Ser vai705 710 715 720
Pro Arg Ala Phe Glu Ser vai Leu Val Pro Ala Thr Asp Leu Leu Thr725 730 735
Ser ser Ala Gly Ala Glu Lys Ala Leu Lys Pro Ala Ala vai Pro Ala
740 745 750
Pro Ala Pro Gln Ala Ile Pro Leu Pro Lys Pro Val Ser Ile Pro Ala755 760 765
Ser Gly Pro Ala Pro Ala Pro Val ser Ala Thr Thr Ala Ala Pro Ile
770 775 780
Gly Ala Ala Ala Ala Pro Ile Ser Glu Pro Thr Ala Pro Ala Ala Ala785 790 795 800
Ile Gly Met Pro Ser Ala Thr Ala Arg Ala Ala Ser Arg Leu Pro Thr
805 810 815
Glu Pro Ser ser Asp His Ile Ser Ala Val Glu Asp Asn Met Leu Arg
820 825 830
Glu Leu Gly Gln Met Gly Phe Gly Gln Val Asp Leu Asn Lys Glu Ile835 840 845
Ile Arg Arg Asn Glu Tyr Asn Leu Glu Gln Ser Ile Asp Glu Leu Cys
850 855 860
Gly Ile Leu Glu Trp Asp Ala Leu His Asp Glu Leu His Glu Leu Gly865 870 875 880
Ile
<210> 4<211> 2646<212> DNA<213> Oryza sativa<400> 4
atgtctcgcc gccgggacgc tgcgccgacg gcgcgcgagg gcgagaggga tctcgtcgtg 60aaggtaaaat tcggtggcac tcttaagcgg ttcactgctt ttgtgaatgg tccgcacttt 120gatcttaatc tggctgctct tcggtcaaag attgcgagtg cttttaagtt caatccagat 180actgagtttg tactcaccta tactgatgag gatggggatg ttgtcatact ggatgatgat 240agtgatttat gtgatgctgc cattagtcag agactgaacc ctcttaggat taatgttgag 300ttgaagagca gcagtgatgg ggtacatcag acaaaacagc aggtattgga ttccatatct 360gtaatgtcca ctgctctgga agatcaattg gctcaggtga aattagctat cgatgaagct 420ttaaaatttg taccagaaca agttcccacttctaaagctg catcatcagc gccatcattgatggcaccaa agagcaaaat gcagtcttcctctagtggta ggggacaaac tttgggaagtgctgtttcag cttcgaaccc tctggatatgcttaagggtg tgcttcttga tgacatcaaatattatgtgg ataccctttc aggctgggtacaaagtaagg gcaagtctgt tacatcctctggtgcaccta ctgttcattc tgctcctgctcttttctgga cacaactagg cctttcttctggtgatttga actcgacatg ccctcctccactccgagctg ataaaagcag tatcaagggtagtagcacat ctaagcctga gaatctctccagaagcctaa agggtggtca ctatttccctccagataatc tctcaccagt cggtctttataggtgcccat acagggatct aagtgataagagatggatac agtgcgatgg ctgtggggtcaatattaaag atgattatga tttatgcaatgaatatacca gaatagacag accatcttttaaccagatgc tctttccaca tcttcgacagactgtccctg atggaacagt aatggcaccacataacaatg gatcttccat gtggccatatctatttgcac gcaacagctc agttaaattacaagagatcg atgttggtgt tgattttgtctactggagat tggcatcacc cactggccagcaggtggagc acccggtcaa aaccagtagcatgcccccag aaggaagcaa cacagaatgggcagatattg tgggtaaata ctctggaagctaccatgaag ccaccaaacc gatggaacctcctagagcat ttgaatcagt gctagtgccagctgaaaagg cttcgaagcc tgctgccacgccaaaacctg ttagcattcc tgcatctgga
gtccttgcaa aaatatcaca tgacttgcgt 480gctgatttgc tggaccggct tgctaaactg 540agtggttctg ctgatggttc atctggctcc 600ttgaatatta aaaatgacac tgagctcatg 660cataactctg gatcaactaa atcacttggt 720gctcaagctg aacatgtatc gggatatcct 780aaagttgata acaagggaag taccaatgcc 840gctgtgccac aagttactag cattggtcat 900tcagattgcg gtgaagggtt aagaagtgat 960gagtcctttg ggcctaatgg ccagattggt 1020ccactgtttc cccgttaccc acttcagtct 1080ggttgctctt accctccgtg catctgcaaa 1140cattacccag ttcagtccct ccaagctgac 1200ccatgcacct gcaaaagtaa cacatccaag 1260ggaccttatt ctgaaggcag cagctgtaat 1320cacgagagca tggcgcagca cacactgcat 1380actcctatcg ctggttctcg ctacaagtca 1440acctgttttt ctcgaatggg caatgtgaat 1500gggagtagac gatgtagaga cctcaatcag 1560ctacatgatt gccgcttcat taaggatgtt 1620tcaaccccat ttacaaagat ttggcgcata 1680gggacatgtc ttacctgggt tggcggacat 1740gggatctcgg tggatggttt ccctattgat 1800acacctgcaa agcctggtgg gtacgtgtcg 1860atgtttggtc agcgagtttg ggtttttatt 1920aacaagcaga gtgctgctat aaacttgaac 1980aagcattctg ttgatgcaaa tattcagtct 2040accataactg atcctcttgc acatgcacta 2100gagcttgttt caagtgccgt accttctgta 2160gctactgatc tcctcacttc atctgctgga 2220cctggacctg cacctcaagc cgttcccctg 2280cctgcgcctg ctcctgttag tgcgactacc 2340gctgcacctg tcggagctgc tgctgctcct atcagtgagcattggaatgc cctctgcaac tgctcgcgct gcttcttgccgatcacatca gtgccgtgga ggacaacatg ctgagagagccaagtcgacc tgaacaagga aataattagg cggaacgagtgatgaactct gtggcatcct cgaatgggat gcactccatgatctga
2646DNA
Oryza sativa
ccactgcacc tgctgctgcc 2400tgcctaccga gccttcatct 2460tggggcagat gggcttcggg 2520acaacctgga gcagtccatt 2580atgaactgca cgaactgggc 2640
2646
<210><211><212><213><220><221><222><400>
CDS
(1)..(2646)
5
atg tct cgc cgc cgg gac gct gcg ccg acg gcgMet Ser Arg Arg Arg Asp Ala Ala Pro Thr Ala1 5 10
gat ctc gtc gtg aag gta aaa ttc ggt ggc actAsp Leu vai vai Lys vai Lys Phe Gly Gly Thr
20 25
gct ttt gtg aat ggt ccg cac ttt gat ctt aatAla Phe vai Asn Gly Pro His Phe Asp Leu Asn
35 40
tca aag att gcg agt gct ttt aag ttc aat ccaSer Lys Ile Ala Ser Ala Phe Lys Phe Asn Pro
50 55
ctc acc tat act gat gag gat ggg gat gtt gtcLeu Thr Tyr Thr Asp Glu Asp Gly Asp vai vai65 70 75
agt gat tta tgt gat gct gcc att agt cag agaSer Asp Leu Cys Asp Ala Ala Ile Ser Gln Arg85 90
cgc gagArg Glu
ctt aagLeu Lys
ctg gctLeu Ala
45gat actAsp Thr60
ata ctgIle Leu
ctg aacLeu Asn
ggc gag aggGly Glu Arg15
cgg ttc actArg Phe Thr30
gct ctt cggAla Leu Arg
gag ttt gtaGlu Phe vai
gat gat gatAsp Asp Asp80
cct ctt aggPro Leu Arg95
48
96
144
192
240
288att aat gtt gag ttg aag age age agt gat ggg gta cat cag aca aaa 336lie Asn vai Glu Leu Lys Ser Ser ser Asp Gly vai His Gln Thr Lys
100 105 110
cag cag gta ttg gat tcc ata tet gta atg tcc act gct ctg gaa gat 384Gln Gln Val Leu Asp ser lie Ser Val Met ser Thr Ala Leu Glu Asp115 120 125
caa ttg gct cag gtg aaa tta gct ate gat gaa gct tta aaa ttt gta 432Gln Leu Ala Gln Val Lys Leu Ala Ile Asp Glu Ala Leu Lys Phe Val130 135 140
cca gaa caa gtt ccc act gtc ctt gea aaa ata tca cat gac ttg cgt 480Pro Glu Gln Val Pro Thr Val Leu Ala Lys Ile ser His Asp Leu Arg145 150 155 160
tet aaa gct gea tca tca gcg cca tca ttg gct gat ttg ctg gac cgg 528Ser Lys Ala Ala Ser Ser Ala Pro ser Leu Ala Asp Leu Leu Asp Arg 165 170 175
ctt gct aaa ctg atg gea cca aag age aaa atg cag tet tcc agt ggt 576Leu Ala Lys Leu Met Ala Pro Lys Ser Lys Met Gln ser ser ser Gly
180 185 190
tet gct gat ggt tca tet ggc tcc tet agt ggt agg gga caa act ttg 624Ser Ala Asp Gly Ser ser Gly Ser ser Ser Gly Arg Gly Glrp Thr Leu195 200 205
gga agt ttg aat att aaa aat gac act gag etc atg gct gtt tca gct 672Gly Ser Leu Asn Ile Lys Asn Asp Thr Glu Leu Met Ala Val Ser Ala210 215 220
tcg aac cct ctg gat atg cat aac tet gga tca act aaa tca ctt ggt 720Ser Asn Pro Leu Asp Met His Asn Ser Gly Ser Thr Lys Ser Leu Gly225 230 235 240
ctt aag ggt gtg ctt ctt gat gac ate aaa gct caa gct gaa cat gta 768Leu Lys Gly Val Leu Leu Asp Asp Ile Lys Ala Gln Ala Glu His Val 245 250 255
tcg gga tat cct tat tat gtg gat aec ctt tca ggc tgg gta aaa gtt 816Ser Gly Tyr Pro Tyr Tyr Val Asp Thr Leu Ser Gly Trp Val Lys vaigat aac aagAsp Asn Lys275
tcc tct gctser ser Ala
290gtt cat tctvai His Ser305
ctt ttc tggLeu Phe Trp
ggc cag attGly Gln Ile
ttt ccc cgtPhe Pro Arg355
aag ggt ggtLys Gly Gly
370aag cct gagLys Pro Glu385
aga age ctaArg Ser Leu
260
gga agtGly Ser
gtg ccavai Pro
gct cctAla Pro
aca caaThr Gln325ggt ggtGly Gly340
tac ccaTyr Pro
tgc tctCys Ser
aat ctcAsn Leu
acc aat gccThr Asn Ala280
caa gtt actGln vai Thr
295gct tca gatAla Ser Asp310
cta ggc cttLeu Gly Leu
gat ttg aacAsp Leu Asn
ctt cag tctLeu Gln Ser360
tac cct ccgTyr Pro Pro
375tcc cat tacser His Tyr390
ggt cac tatGly His Tyr
aag ggtLys Gly405
aac aca tcc aag cca gat aat ctcAsn Thr Ser Lys Pro Asp Asn Leu420
tat tct gaa ggc age age tgt aat
265
caa agtGln Ser
age attSer Ile
tgc ggtCys Gly
tct tctSer Ser330tcg acaSer Thr345
ctc egaLeu Arg
tgc ateCys Ile
cca gttPro vai
ttc cctPhe Pro410tca ccaser Pro425
agg tgc
aag ggcLys Gly
ggt catGly His300gaa gggGlu Gly315
gag tccGlu Ser
tgc cctCys Pro
gct gatAla Asp
tgc aaaCys Lys380cag tccGln Ser395
cca tgcPro Cys
270
aag tct gtt acaLys Ser vai Thr285
ggt gea cct actGly Ala Pro Thr
864
tta agaLeu Arg
ttt gggPhe Gly
cct ccaPro Pro350aaa ageLys Ser365
agt ageSer Ser
ctc caaLeu Gln
acc tgcThr Cys
agt gatSer Asp320cct aatPro Asn335
cca ctgPro Leu
agt ateSer Ile
aca tctThr Ser
gct gacAla Asp400aaa agtLys Ser415
gga cctGly Pro
912
960
1008
1056
1104
1152
1200
1248
1296
gtc ggt ctt tatvai Gly Leu Tyr430
cca tac agg gat cta agt 1344Tyr ser Glu Gly ser435
gat aag cac gag ageAsp Lys His Glu ser 450
tgc gat ggc tgt gggCys Asp Gly Cys Gly465
aat att aaa gat gatAsn Ile Lys Asp Asp
485
ggc aat gtg aat gaaGly Asn vai Asn Glu500
aga cga tgt aga gacArg Arg Cys Arg Asp515
cga cag cta cat gatArg Gln Leu His Asp 530
gga aca gta atg geaGly Thr Val Met Ala545
cat aac aat gga tetHis Asn Asn Gly Ser
565
gtt ggc gga cat ctaVal Gly Gly His Leu580
tcg gtg gat ggt ttcSer vai Asp Gly Phe595
Ser Cys Asn Arg Cys Pro440
atg gcg cag cac aca ctgMet Ala Gln His Thr Leu455
gtc act cct ate gct ggtvai Thr Pro Ile Ala Gly470 475
tat gat tta tgc aat accTyr Asp Leu Cys Asn Thr490
tat acc aga ata gac agaTyr Thr Arg Ile Asp Arg505
ctc aat cag aac cag atgLeu Asn Gln Asn Gln Met520
tgc cgc ttc att aag gatCys Arg Phe Ile Lys Asp535
cca tca acc cca ttt acaPro Ser Thr Pro Phe Thr550 555
tcc atg tgg cca tat gggSer Met Trp Pro Tyr Gly570
ttt gea cgc aac age tcaPhe Ala Arg Asn ser Ser585
cct att gat caa gag atePro Ile Asp Gln Glu Ile600
Tyr Arg Asp Leu Ser445
cat aga tgg ata cag 1392
His Arg Trp Ile Gln
460
tet cgc tac aag tca 1440Ser Arg Tyr Lys Ser480
tgt ttt tet cga atg 1488Cys Phe Ser Arg Met495
cca tet ttt ggg agt 1536Pro Ser Phe Gly Ser510
ctc ttt cca cat ctt 1584Leu Phe Pro His Leu525
gtt act gtc cct gat 1632
vai Thr Val Pro Asp
540
aag att tgg cgc ata 1680Lys Ile Trp Arg Ile560
aca tgt ctt acc tgg 1728Thr Cys Leu Thr Trp575
gtt aaa tta ggg ate 1776Val Lys Leu Gly Ile590
gat gtt ggt gtt gat 1824Asp vai Gly Val Asp605ttt gtcPhe vai610gca tcaAla Ser625
cag gtgGln vai
ata aacIle Asn
tct gttSer vai
gga ageGly Ser690acc aaaThr-Lys705
cct agaPro Arg
tca tctSer Ser
cct gcaPro Ala
tct ggaSer Gly
aca cct gcaThr Pro Ala
ccc act ggcPro Thr Gly
gag cac ccgGlu His Pro645
ttg aac atgLeu Asn Met660gat gca aatAsp Ala Asn675
acc ata actThr Ile Thr
ccg atg gaaPro Met Glu
gca ttt gaaAla Phe Glu725
gct gga gctAla Gly Ala
740cct caa gccPro Gln Ala755
cct gcg cctPro Ala Pro
aag cctLys Pro615cag atgGln Met630
gtc aaavai Lys
ccc ccaPro Pro
att cagIle Gln
gat cctAsp Pro695cct gagPro Glu710
tca gtgSer vai
gaa aagGlu Lys
gtt cccvai Pro
gct cctAla Pro
ggt gggGly Gly
ttt ggtPhe Gly
acc agtThr ser
gaa ggaGlu Gly665tct gcaser Ala680
ctt gcaLeu Ala
ctt gttLeu vai
cta gtgLeu vai
gct tcgAla Ser745ctg ccaLeu Pro760
gtt agtvai Ser
tac gtgTyr Val
cag cgaGln Arg635age aacSer Asn650
age aacSer Asn
gat attAsp Ile
cat gcaHis Ala
tca agtSer ser715cca gctPro Ala730
aag cctLys Pro
aaa cctLys Pro
gcg actAla Thr
tcg tacSer Tyr620
gtt tggvai Trp
aag cagLys Gln
aca gaaThr Glu
gtg ggtVal Gly685cta tacLeu Tyr700
gcc gtaAla vai
act gatThr Asp
gct gccAla Ala
gtt agevai ser765acc gctThr Ala
tgg aga ttgTrp Arg Leu
gtt ttt attvai Phe Ile640
agt gct gctSer Ala Ala
655tgg aag catTrp Lys His670
aaa tac tctLys Tyr Ser
cat gaa gccHis Glu Ala
cct tct gtaPro Ser Val720
ctc ctc actLeu Leu Thr
735acg cct ggaThr Pro Gly750
att cct gcaIle Pro Ala
gca cct gtcAla Pro vai
1872
1920
1968
2016
2064
2112
2160
2208
2256
2304
2352770 775 780
gga gct gct gct gct cct ate agt gag ccc act gea cct gct gct gcc 2400Gly Ala Ala Ala Ala Pro Ile ser Glu Pro Thr Ala Pro Ala Ala Ala785 790 795 800
att gga atg ccc tet gea act gct cgc gct gct tet tgc ctg cct acc 2448Ile Gly Met Pro Ser Ala Thr Ala Arg Ala Ala Ser Cys Leu Pro Thr
805 810 815
gag cct tca tet gat cac ate agt gcc gtg gag gac aac atg ctg aga 2496Glu Pro Ser Ser Asp His lie Ser Ala Val Glu Asp Asn Met Leu Arg 820 825 830
gag ctg ggg cag atg ggc ttc ggg caa gtc gac ctg aac aag gaa ata 2544Glu Leu Gly Gln Met Gly Phe Gly Gln Val Asp Leu Asn Lys Glu Ile
835 840 845
att agg cgg aac gag tac aac ctg gag cag tcc att gat gaa ctc tgt 2592Ile Arg Arg Asn Glu Tyr Asn Leu Glu Gln Ser Ile Asp Glu Leu Cys850 855 860
ggc ate ctc gaa tgg gat gea ctc cat gat gaa ctg cac gaa ctg ggc 2640Gly Ile Leu Glu Trp Asp Ala Leu His Asp Glu Leu His Glu Leu Gly865 870 875 880
ate tga -2646
Ile
<210> 6<211> 881<212> PRT<213> Oryza sativa<400> 6
Met Ser Arg Arg Arg Asp Ala Ala Pro Thr Ala Arg Glu Gly Glu Arg15 10 15
Asp Leu Val vai Lys Val Lys Phe Gly Gly Thr Leu Lys Arg Phe Thr 20 25 30
Ala Phe vai Asn Gly Pro His Phe Asp Leu Asn Leu Ala Ala Leu Arg35 40 45Ser Lys Ile Ala Ser Ala Phe Lys Phe Asn Pro Asp Thr Glu Phe Val
50 55 60
Leu Thr Tyr Thr Asp Glu Asp Gly Asp Val vai Ile Leu Asp Asp Asp65 70 75 80
Ser Asp Leu Cys Asp Ala Ala Ile ser Gln Arg Leu Asn Pro Leu Arg
85 90 95
Ile Asn Val Glu Leu Lys Ser Ser Ser Asp Gly Val His Gln Thr Lys
100 105 110
Gln Gln vai Leu Asp Ser Ile Ser vai Met Ser Thr Ala Leu Glu Asp115 120 125
Gln Leu Ala Gln Val Lys Leu Ala Ile Asp Glu Ala Leu Lys Phe Val
130 135 140
Pro Glu Gln vai Pro Thr vai Leu Ala Lys Ile ser His Asp Leu Arg145 150 155 160
Ser Lys Ala Ala Ser ser Ala Pro ser Leu Ala Asp Leu Leu Asp Arg
165 170 175
Leu Ala Lys Leu Met Ala Pro Lys Ser Lys Met Gln ser Ser Ser Gly
180 185 190
Ser Ala Asp Gly Ser Ser Gly Ser ser ser Gly Arg Gly Gln Thr Leu
195 200 ,..... 205
Gly Ser Leu Asn Ile Lys Asn Asp Thr Glu Leu Met Ala Val Ser Ala
210 215 220
Ser Asn Pro Leu Asp Met His Asn Ser Gly Ser Thr Lys Ser Leu Gly225 230 235 240
Leu Lys Gly Val Leu Leu Asp Asp Ile Lys Ala Gln Ala Glu His Val
245 250 255
Ser Gly Tyr Pro Tyr Tyr Val Asp Thr Leu Ser Gly Trp Val Lys Val
260 265 270
Asp Asn Lys Gly Ser Thr Asn Ala Gln Ser Lys Gly Lys Ser Val Thr275 280 285
Ser Ser Ala Val Pro Gln vai Thr ser Ile Gly His Gly Ala Pro Thr290 295 300Val His ser Ala Pro Ala Ser Asp Cys Gly Glu Gly Leu Arg Ser Asp305 310 315 320
Leu Phe Trp Thr Gln Leu Gly Leu Ser Ser Glu Ser Phe Gly Pro Asn325 330 335
Gly Gln Ile Gly Gly Asp Leu Asn Ser Thr Cys Pro Pro Pro Pro Leu340 345 350
Phe Pro Arg Tyr Pro Leu Gln Ser Leu Arg Ala Asp Lys Ser Ser Ile
355 360 365
Lys Gly Gly Cys Ser Tyr Pro Pro Cys Ile Cys Lys Ser Ser Thr Ser 370 375 380
Lys Pro Glu Asn Leu ser His Tyr Pro Val Gln ser Leu Gln Ala Asp385 390 395 400
Arg Ser Leu Lys Gly Gly His Tyr Phe Pro Pro Cys Thr Cys Lys Ser405 410 415
Asn Thr Ser Lys Pro Asp Asn Leu Ser Pro vai Gly Leu Tyr Gly Pro
420 425 430
Tyr Ser Glu Gly ser ser Cys Asn Arg Cys Pro Tyr Arg Asp Leu Ser
435 440 445
Asp Lys His Glu Ser Met Ala Gln His Thr Leu His Arg Trp Ile Gln 450 455 · 460
Cys Asp Gly Cys Gly Val Thr Pro Ile Ala Gly Ser Arg Tyr Lys ser465 470 475 480
Asn Ile Lys Asp Asp Tyr Asp Leu Cys Asn Thr Cys Phe Ser Arg Met485 490 495
Gly Asn Val Asn Glu Tyr Thr Arg Ile Asp Arg Pro Ser Phe Gly Ser
500 505 510
Arg Arg Cys Arg Asp Leu Asn Gln Asn Gln Met Leu Phe Pro His Leu
515 520 525
Arg Gln Leu His Asp Cys Arg Phe Ile Lys Asp Val Thr Val Pro Asp 530 535 540
Gly Thr Val Met Ala Pro ser Thr Pro Phe Thr Lys Ile Trp Arg Ile545 550 555 560His Asn Asn Gly Ser Ser Met Trp Pro Tyr Gly Thr Cys Leu Thr Trp
565 570 575
Val Gly Gly His Leu Phe Ala Arg Asn Ser Ser Val Lys Leu Gly Ile580 585 590
Ser Val Asp Gly Phe Pro Ile Asp Gln Glu Ile Asp Val Gly Val Asp595 600 605
Phe Val Thr Pro Ala Lys Pro Gly Gly Tyr Val Ser Tyr Trp Arg Leu
610 615 620
Ala Ser Pro Thr Gly Gln Met Phe Gly Gln Arg vai Trp Val Phe Ile625 630 635 640
Gln vai Glu His Pro vai Lys Thr Ser Ser Asn Lys Gln Ser Ala Ala
645 650 655
Ile Asn Leu Asn Met Pro Pro Glu Gly Ser Asn Thr Glu Trp Lys His660 665 670
Ser Val Asp Ala Asn Ile Gln Ser Ala Asp Ile Val Gly Lys Tyr ser675 680 685
Gly Ser Thr Ile Thr Asp Pro Leu Ala His Ala Leu Tyr His Glu Ala
690 695 700
Thr Lys Pro Met Glu Pro Glu Leu Val ser Ser Ala Val Pro ser Val705 710 715 720
Pro Arg Ala Phe Glu Ser Val Leu Val Pro Ala Thr Asp Leu Leu Thr
725 730 735
Ser Ser Ala Gly Ala Glu Lys Ala Ser Lys Pro Ala Ala Thr Pro Gly740 745 750
Pro Ala Pro Gln Ala vai Pro Leu Pro Lys Pro Val ser Ile Pro Ala755 760 765
Ser Gly Pro Ala Pro Ala Pro Val ser Ala Thr Thr Ala Ala Pro Val
770 775 780
Gly Ala Ala Ala Ala Pro Ile ser Glu Pro Thr Ala Pro Ala Ala Ala785 790 795 800
Ile Gly Met Pro Ser Ala Thr Ala Arg Ala Ala Ser Cys Leu Pro Thr805 810 815Glu Pro Ser ser Asp His Ile Ser Ala Val Glu Asp Asn Met Leu Arg
820 825 8B0
Glu Leu Gly Gln Met Gly Phe Gly Gln Val Asp Leu Asn Lys Glu Ile835 840 845
Ile Arg Arg Asn Glu Tyr Asn Leu Glu Gln ser Ile Asp Glu Leu Cys850 855 860
Gly Ile Leu Glu Trp Asp Ala Leu His Asp Glu Leu His Glu Leu Gly865 870 875 880
<210> 7<211> 617<212> DNA<213> Oryza rufipogon<400> 7
caatgctaca tttgtggaag ataactcgtt gccatcgttc tcaagggctg ttaatcagcg 60ggatgctgac ctggtttact tctggcagaa gtacçgcaaa ttggctgaga gttctcctga 120gaaaaacgaa gctcggaagc aattgcttga aatgatggca cacagatctc atgttgacaa 180cagtgttgag ctgatcggaa accttctctt tggctctgag gaaggcccaa gggttctaaa 240ggctgttcgt gcaactggcg aacctcttgt tgatgactgg agctgtctca agtctatggt 300acgcgctttc gaagcacaat gcggctcgct agcgcagtat ggaatgaagc atacgcgttc 360ctttgcaaac atctgcaatg ctggcatctc tgctgaagcg atggcaaagg ttgctgcgca 420ggcttgcacc agcattccct ccaacccctg gagttccacc cataggggtt ttagtgctta 480aatcataggt gaagaaaact tagcaaatat tctcagctcc tgcaatatac ccaagttatc 540tttttctctt gcccctgtag tttgatgatc gattgggcgc agtagtgctt gaaccgtagg 600tgaagtctga agaactg 617
<210> 8<211> 481<212> DNA<213> Oryza rufipogon<220>
<221> CDS<222> (2)..(481)<400> 8
c aat gct aca ttt gtg gaa gat aac tcg ttg cca tcg ttc tca agg gct 49Asn Ala Thr Phe vai Glu Asp Asn Ser Leu Pro Ser Phe ser Arg Ala1 5 10 15
gtt aat cag cgg gat gct gac ctg gtt tac ttc tgg cag aag tac cgc 97vai Asn Gln Arg Asp Ala Asp Leu Val Tyr Phe Trp Gln Lys Tyr Arg
20 25 30
aaa ttg gct gag agt tct cct gag aaa aac gaa gct cgg aag caa ttg 145Lys Leu Ala Glu Ser ser Pro Glu Lys Asn Glu Ala Arg Lys Gln Leu 35 40 45
ctt gaa atg atg gca cac aga tct cat gtt gac aac agt gtt gag ctg 193Leu Glu Met Met Ala His Arg Ser His Val Asp Asn Ser vai Glu Leu
50 55 60
ate gga aac ctt ctc ttt ggc tct gag gaa ggc cca agg gtt cta aag 241lie Gly Asn Leu Leu Phe Gly Ser Glu Glu Gly Pro Arg vai Leu Lys65 70 75 80
gct gtt cgt gca act ggc gaa cct ctt gtt gat gac tgg age tgt ctc 289Ala vai Arg Ala Thr Gly Glu Pro Leu Val Asp Asp Trp Ser Cys Leu85 90 95
aag tct atg gta cgc gct ttc gaa gca caa tgc ggc tcg cta gcg cag 337Lys Ser Met vai Arg Ala Phe Glu Ala Gln Cys Gly Ser Leu Ala Gln
100 105 110
tat gga atg aag cat acg cgt tcc ttt gca aac ate tgc aat gct ggc 385Tyr Gly Met Lys His Thr Arg Ser Phe Ala Asn Ile Cys Asn Ala Gly 115 120 125
ate tct gct gaa gcg atg gca aag gtt gct gcg cag gct tgc acc age 433Ile Ser Ala Glu Ala Met Ala Lys vai Ala Ala Gln Ala Cys Thr ser
130 135 140
att ccc tcc aac ccc tgg agt tcc acc cat agg ggt ttt agt gct taa 481Ile Pro Ser Asn Pro Trp ser Ser Thr His Arg Gly Phe Ser Ala .145 150 155
<210> 9<211> 159<212> PRT<213> Oryza rufipogon<400> 9
Asn Ala Thr Phe Val Glu Asp Asn Ser Leu Pro Ser Phe Ser Arg Ala1 5 10 15
Val Asn Gln Arg Asp Ala Asp Leu Val Tyr Phe Trp Gln Lys Tyr Arg
20 25 BO
Lys Leu Ala Glu Ser Ser Pro Glu Lys Asn Glu Ala Arg Lys Gln Leu35 40 45
Leu Glu Met Met Ala His Arg Ser His Val Asp Asn Ser Val Glu Leu
50 55 60
Ile Gly Asn Leu Leu Phe Gly Ser Glu Glu Gly Pro Arg Val Leu Lys65 70 75 80
Ala Val Arg Ala Thr Gly Glu Pro Leu Val Asp Asp Trp Ser Cys Leu
85 90 95
Lys Ser Met Val Arg Ala Phe Glu Ala Gln Cys Gly Ser Leu Ala Gln
100 105 110
Tyr Gly Met Lys His Thr Arg Ser Phe Ala Asn Ile Cys Asn Ala Gly115 120 125
Ile Ser Ala Glu Ala Met Ala Lys Val Ala Ala Gln Ala Cys Thr Ser
130 135 140
Ile Pro Ser Asn Pro Trp Ser Ser Thr His Arg Gly Phe Ser Ala145 150 155
<210> 10<211> 510<212> DNA<213> Oryza sativa<400> 10
atgtacatgg gttccaatcc ggctaacgac aatgctacat ttgtggaaga taactcgttg 60ccatcgttct caagggctgt taatcagcgg gatgctgacc tggtttactt ctggcagaag 120taccgcaaat tgcctgagag ttctcctgag aaaaacgaag ctcggaagca attgcttgaa 180atgatggcac acagatctca tgttgacaac agtgttgagc tgatcggaaa ccttctcttt 240ggctctgagg aaggcccaag ggttctaaag gctgttcgtg caactggcga acctcttgtt BOOgatgactgga gttgtctcaa gtctatggta cgcactttcg aagcacaatg cggctcgcta 360gcgcagtatg gaatgaagca tatgcgttcc tttgcaaaca tctgcaatgc tggcatctct 420gctgaagcga tggcaaaggt tgctgcgcag gcttgcacca gcattccctc caacccctgg 480agttccaccc ataggggttt tagtgcttaa 510
<210> 11<211> 510<212> DNA<213> Oryza sativa<220>
<221> CDS<222> (1)..(510)<400> 11
atg tac atg ggt tcc aat ccg gct aac gac aat gct aca ttt gtg gaa48
Met Tyr Met Gly Ser Asn Pro Ala Asn Asp Asn Ala Thr Phe Val Glu1 5 10 15
gat aac tcg ttg cca tcg ttc tca agg gct gtt aat cag cgg gat gct 96
Asp Asn Ser Leu Pro Ser Phe Ser Arg Ala Val Asn Gln Arg Asp Ala
20 25 30
gac ctg gtt tac ttc tgg cag aag tac cgc aaa ttg cct gag agt tct144
Asp Leu Val Tyr Phe Trp Gln Lys Tyr Arg Lys Leu Pro Glu ser Ser35 40 45
cct gag aaa aac gaa gct cgg aag caa ttg ctt gaa atg atg gca cac192
Pro Glu Lys Asn Glu Ala Arg Lys Gln Leu Leu Glu Met Met Ala His 50 55 60
aga tct cat gtt gac aac agt gtt gag ctg ate gga aac ctt ctc ttt240Arg Ser His Val Asp Asn Ser Val Glu Leu lie Gly Asn Leu Leu Phe65 70 75 80
ggc tct gag gaa ggc cca agg gtt cta aag gct gtt cgt gca act ggc288
Gly Ser Glu Glu Gly Pro Arg Val Leu Lys Ala Val Arg Ala Thr Gly
85 90 95
gaa cct ctt gtt gat gac tgg agt tgt ctc aag tct atg gta cgc act336
Glu Pro Leu Val Asp Asp Trp Ser Cys Leu Lys ser Met Val Arg Thr 100 105 110
ttc gaa gca caa tgc ggc tcg cta gcg cag tat gga atg aag cat atg384
Phe Glu Ala Gln Cys Gly Ser Leu Ala Gln Tyr Gly Met Lys His Met115 120 125
cgt tcc ttt gca aac ate tgc aat gct ggc ate tct gct gaa gcg atg432
Arg ser Phe Ala Asn Ile Cys Asn Ala Gly Ile Ser Ala Glu Ala Met
130 135 140
gca aag gtt gct gcg cag gct tgc acc age att ccc tcc aac ccc tgg 480
Ala Lys Val Ala Ala Gln Ala Cys Thr Ser Ile Pro Ser Asn Pro Trp
145 150 155 160
agt tcc acc cat agg ggt ttt agt gct taa 510Ser ser Thr His Arg Gly Phe Ser Ala 165 <210> 12 <211> 169 <212> PRT <213> Oryza sativa <400> 12
Met Tyr Met Gly Ser Asn Pro Ala Asn Asp Asn Ala Thr Phe vai Glu1 5 10 15Asp Asn Ser Leu Pro Ser Phe ser Arg Ala Val Asn Gln Arg Asp Ala
20 25 30
Asp Leu Val Tyr Phe Trp Gln Lys Tyr Arg Lys Leu Pro Glu Ser Ser35 40 45
Pro Glu Lys Asn Glu Ala Arg Lys Gln Leu Leu Glu Met Met Ala His50 55 60
Arg Ser His Val Asp Asn Ser Val Glu Leu Ile Gly Asn Leu Leu Phe65 70 75 80
Gly Ser Glu Glu Gly Pro Arg Val Leu Lys Ala Val Arg Ala Thr Gly 85 90 95
Glu Pro Leu Val Asp Asp Trp Ser Cys Leu Lys Ser Met vai Arg Thr
100 105 110
Phe Glu Ala Gln Cys Gly Ser Leu Ala Gln Tyr Gly Met Lys His Met115 120 125
Arg Ser Phe Ala Asn Ile Cys Asn Ala Gly Ile ser Ala Glu Ala Met130 135 140
Ala Lys Val Ala Ala Gln Ala Cys Thr Ser Ile Pro Ser Asn Pro Trp145 150 155 160
Ser Ser Thr His Arg Gly Phe Ser Ala 165
<210> 13 <211> 551 <212> DNA <213> Triticum aestivum <220> <221> característica mista <222> (529)..(531) <223> η é a, c, g, ou t <400> 13 tttaccttga agcctgcgaa tctgggagca tctttgaggg acttctgccg aatgacatcg 60gtgtctatgc gaccaccgca tcgaacgcag aggaaagcag ttggggaacg tattgccccg 120gcgagtaccc gagccctccg ccggaatatg acacttgctt gggcgacctg tacagcattt 180cttggatgga agacagtgat gtccacaacc tgagaactga atctctcaag cagcagtata 240 acctggtcaa gaagagaaca gcagctcagg actcatacag ctatggttcc catgtgatgc 300 aatatggttc tttggacctg aatgctgaac atttgttctc gtacattggg tcaaaccctg 360 ctaacgagaa cactacattt gttgaagata acgcactgcc atcattctca agagctgtta 420 atcagaggga tgctgatctt gtttatttct ggcagaagta ccggaaattg gctgagagct 480 ccctgagaaa aagatgctcg gaagcattgc ttgaaatgat gggtcatann nctcatattg 540 acaacagcgt C 551 <210> 14 <211> 516 <212> DNA <213> Triticum aesti Viim <220> <221> característica mista <222> (241)..(241) <22 3> η é a, c, g, ou t <400> 14 aaggactaca ctggaaagga ggttatgtca agaacttctt tgctgtcctg ctcggtaata 60 gaaccgctgt gagtggtggg agcggcaaag tcgtggacag tggccctaat gatcacattt 120 ttgtgtttta cagtgaccat gggggtcctg gggtccttgg gatgcctacc tatccatacc 180 tttacggtga cgatcttgta gatgtcctga agaaaaagca cgctgctgga acctacaaaa 240 ngcctgggta ttttaccttg aagcctgcga atctgggagc atctttgagg gacttctgcc 300 gaatgacatc ggtgtctatg cgaccaccgc atcgaacgca gaggaaagca gttggggaac 360 gtattgcccc ggcgagtacc cgagccctcc gccggaatat gacacttgct tgggcgacct 420 gtacagcatt tcttggatgg aagacagtga tgtccacaac ctgagaactg aatctctcaa 480 gcagcagtat aacctggtca agaagagaac agcagc 516 <210> 15 <211> 847 <212> DNA <213> Triticum aesti vum <220> <221> característica mista <222> (278)..(278)<223> η é a, c, g, ou t<220>
<221> característica mista<222> (673)..(673)<223> η é a, c, g, ou t<400> 15
acgcttgacc ttaggcctat ttaggtgaca ctatagaaca agtttgtaca aaaaagcagg 60ctggtaccgg tccggaattc ccgggatatc gtcgacccac gcgtccgggc agaagtaccg 120gaaattggcc gagagctccc ctgagaaaaa cgatgctcgg aagcaattgc ttgaaatgat 180gggtcataaa tctcatattg acaacagcgt cgagctgatt ggaaaccttc tgtttggttc 240tgcgggtggt ccgatggttc taaaggctgt tcgcccangc tggtgaacct cttgttgatg 300actggagttg tctcaagtct acggtgcgta cttttgaatc acaatgtggc tcgctggcgc 360aatatggaat gaagcacatg cggtcctttg caaacatctg caatgccggc attgttcctg 420aagcgatggc aaaggttgct gctcaggcgt gcacgagcat cccaaccaac ccctggagtg 480ccacacacaa gggttttagt gcttaaacct gaggtgaagc aacttggtcc ctatctcagc 540tattgtacca tataccaaag tcctttccta ttcacacagg gttagtagtg cttgaaccaa 600cgaaccttag atgaataaga attatgccat tacttcagct attccacaca ccaaattacc 660ttggctgtgt ccnacttata atgtacatat acccgtagta gaaaggtgat ttcctgtgat 720tgctgtacat actcgtgata gtttgtgatc agatgtgtag ctcgcatttc catataagag 780aatgcaatcg ctgctatttg tgcgtgaaaa-aaaaaaaaag ggcgccgctc taaatatccc 840tcgaggg 847
<210> 16<211> 603<212> DNA<213> Triticum aestivum<220>
<221> característica mista<222> (225)..(225)<223> η é a, c, g, ou t<220>
<221> característica mista<222> (249)..(249)<223> η é a, c, g, ou t<220>
<221> característica mista
<222> (374)..(374)
<223> η é a, c, g, ou t<220>
<221> característica mista
<222> (452)..(452)
<223> η é a, c, g, ou t<220>
<221> característica mista
<222> (477)..(477)
<223> η é a, c, g, ou t<220>
<221> característica mista
<222> (531)..(531)
<223> η é a, c, g, ou t<220>
<221> característica mista
<222> (536)..(536)
<223> η e a, c, g, ou t<220>
<221> característica mista
<222> (543)..(543)
<223> η é a, c, g, ou t<220>
<221> característica mista
<222> (549)..(549)
<223> η é a, c, g, ou t<220>
<221> característica mista
<222> (574)..(574)<223> η é a, c, g, ou t <220> <221> característica mista <222> (582)..(582) <223> <400> η é a, c, 16 g, ou t ggacagtggc cctaatgatc acatttttgt gttttacagt gaccatgggg gtcctggggt 60 ccttgggatg cctacctatc cataccttta cggtgacgat cttgtagatg tcctgaagaa 120 aaagcacgct gctggaacct acaaaãgcct gggtatttta ccttgaagcc tgcgaatctg 180 ggagcatctt tgagggactt ctgccgaatg acatcggtgt ctatncgacc accgcatcga 240 acgccagang aaacagttgg ggaacgtatg cccccgcgag taccgaaccc tcccgccgga 300 atatgacact tgcttgggcg actgtacaca tttcttggat ggaagacagt gatgtccaca 360 actgagaact gatnccccaa acacagtata actggtcaag aagagaacac actcaggacc 420 atacactatg gtccatgtga gcaatatggt cnttggactg aagctgaaat tgtcccntac 480 atgggtcaaa cctgctàaca gaaccacatt gttgaaatac cacgcacatc ncaaancgta 540 acnaagganc gtctgtattc gcaaatccga atgntgaacc cnaaaaagtc cgacatgcta 600 ata 603 <210> 17 <211> 492 <212> <213> <400> DNA Triticum j 17 aestivum ggctgcaggt tttgaatcac aatgtgggct cgctggcgca gtatggaatg aagcacatgc 60 ggtcctttgc aaacatctgc aatgtcggca ttgttcctga agcgatggca aaggttgctg 120 ctcaggcgtg cacgagcatc ccaaccaacc cctggagtgc cacacacaag ggttttagtg 180 cttaaaccag aggtgaagca acttggtccc tatctcagct attgtaccat ataccaaagt 240 cccttcctat tcacacaggg ttagtagtgc ttgaaccaac gaaccttaga tgaataagaa 300 ttatgccatt atttcagcta ttccaccaca ccaaattacc ttggctgtgt ccaacttata 360 atgtacatat acccgtagta gaaaggtgat ttcctgtgat tgctgtacat actccgtgat 420 agtttgtgat aaaaaaaaaa <210> caagatgtgt aa 18 agctcacaat tccatataag aatgcaatca ctgctaaaaa 480 492<211> 669<212> DNA
<213> Triticum aestivum<220>
<221> característica mista<222> (597)..(597)<223> η é a, c, g, ou t<220>
<221> característica mista<222> (621)..(621)
<223> η é a, c, g, ou t<220>
<221> característica mista<222> (628)..(628)<223> η é a, c, g, ou t<220>
<221> característica mista<222> (647)..(647)<223> η é a, c, g, ou t<400> 18
agcagcgatt gcattcttct tatatggaat tgcgagctac acatctgatc acaaactatc 60acgagtatgt acagcaatca caggaaatca cctttctact acgggtatat gtacattata 120agttggacac agccaaggta atttggtgtg gtggaatagc tgaagtaatg gcataattct 180tattcatcta aggttcgttg gttcaagcac tactaaccct gtgtgaatag gaaaggactt 240tgggtatatg gtacaatagc tgagataggg accaagttgc ttcacctcag gtttaagcac 300taaaaccctt gtgtgtggca ctccaggggt tgggttggga tgctccgtgc acgcctgaag 360cagcaacctt tgccatcgct tcaggaacaa tgccggcatt gcagatgttt gcaaaggacg 420catgtgctca atccatattg cgccagcgag ccacattgtg atcaaaagta ccaccgtaga 480ctgagacaac tccatcatca acaagaggtc acaactgggc gaacagcctt agaacatcgg 540acaaccgcag aacaacagaa ggttcaatca actcgacctg ttgcaaatag atcatgncca 600cattcagcaa tgctcgacat nttttcangg agcccggcaa ttcggantcg caaataacag 660ttaaacccc 669<210> 19
<211> 542
<212> DNA
<21Β> Triticum aestivum<220>
<221> característica mista
<222> (278)..(278)
<223> η é a, c, g, ou t<220>
<221> característica mista
<222> (380)..(380)
<223> η é a, c, g, ou t<220>
<221> característica mista
<222> (425)..(425)
<223> η é a, c, g, ou t<220>
<221> característica mista
<222> (428)..(428)
<223> η é a, c, g, ou t<220>
<221> característica mista
<222> (443)..(443)
<223> η é a, c, g, ou t<220>
<221> característica mista
<222> (448)..(448)
<223> η é a, c, g, ou t<220>
<221> característica mista
<222> (453)..(453)
<223> η é a, c, g, ou t<220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><22Β><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><400>ccgaggtactgtcgcatagagcttcaaggtatctacaagacccatggtcagctcccaacataacctcctt
característica mista(480)..(481)η é a, c, g, ou t
característica mista(495)..(495)η é a, c, g, ou t
característica mista(499)..(499)η é a, c, g, ou t
característica mista(509)..(509)η é a, c, g, ou t
característica mista(520)..(520)η é a, c, g, -ou t
característica mista(529)..(529)η é a, c, g, ou t19
cgccggggca atacgttccc caactgctttcaccgatgtc attcggcaga agtccctcaaaaaataccag gcttttgtag gttccaagcatcgtcaccgt aaaggtatgg ataggtaggcctgtaaaaca caaaaatgtg atcattanggatcaaaagcg gttctattaa cgagcaagactccaatgttn tccttaagga acccaacaaa
cctctgcgttagatgctcccgcgtgcttttatcccaaggaccactgtccaaacaaagaagaacatctcca
cgatgcggtg 60
agattcgcag 120
tcttcaggac 180
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cgactttgcc 300
ttcttgacaa 360
acctgggggt 420gggtnatnaa taacccccgg gcnccggntc ccnaagggtg tgcgcaatgt catcctaacn 480 ngcccggggg ggccnaaanc aaattcccnc cgggccccan tggggggcng gaacaatgca 540 at 542 <210> 20 <211> <212> 634 DNA <213> Hordeum vulgare <400> 20 aagctggagc tcaccgcggt ggcggccgct ctagaacagt ggatcccccg ggctgtttga 60 gtgcggcacg aggaaaaagc atgctgctgg aacctacaaa agcctggtct tttaccttga 120 agcctgtgaa tctgggagca tctttgaggg gcttctgccg aatgatatcg gtgtctacgc 180 gaccaccgca tcaaacgcag aggaaagcag ttggggaacg tattgccccg gcgagtaccc 240 gagccctccg ccggaatatg acacttgctt gggcgacctg tacagcattt cttggatgga 300 agacagtgat gtccacaacc tgaggactga atctctcaag cagcagtata acctggtcaa 360 gaagagaacg gcagctcagg actcatacag ctatggttcc catgtgatgc aatacggttc 420 tttggacctc aatgctgaac atttgttctc gtacattggg tcaaatcctg ctaacgagaa 480 cactacattt gttgaagata atgcattgcc gtcgttatca agagctgtta atcagaggga 540 tgctgatctt gtttatttct ggcagaagta ccggaaattg gctgagagct cccctgcgaa 600 aaacaatgct cgtaagcaat tgctcgaaat gatg 634 <210> . . <211> <212> 21 570 DNA <213> Hordeum vulgare <220> <221> característica mista <222> (285)..(285) <223> η é a, c, g, ou t <220> <221> característica mista <222> (320)..(320) <223> η é a, c, g, ou t <220><221> característica mista <222> (336)..(336) <223> η é a, c, g, ou t <220> <221> característica mista <222> (376)..(376) <223> η é a, c, g, ou t <400> 21 aagaacctgt ttgctgtcct gctcggtaat aaaaccgctg tgagtggtgg gagcggcgga 60 gtcctggaca gtggccctaa tgatcacatt tttgtgtgtt atagtgacca tgggggtcct 120 ggggtcattg ggatgcctac ctatccatac atttacagtg acgatcttgt agacgtcctg 180 aagaaaaagc acgctgctgg aacctacaga agccgtggat tgtacctcga accctgtgaa 240 gcctggagtg tcttttatgg gcttttgcct aacgacattg gtgtntgctc atccacctca 300 tcaaacgcag aggatacctn ttggggagcg tattgncctt gcgagtaccc tatcccttcg 360 actgaataag acactngctt ggacaaccta tacagtgttt cttggatgga agattgtgat 420 gggtaacaac ctggcaaccg aatatctcaa ggagcgatat gatcctgtga aaactagaag 480 cgcatggtta ggactcatcc agatgccgtt cctcatgaga tgccatatgg ttaattggac 540 tctgatgctc aaagtctctt tttgctcacg 570 <210> 22 <211> <212> 525 DNA <213> Hordeum vulgare <400> 22 cggcacgagg cataccttta tggtgacgat cttgtagatg tcctgaagaa aaagcatgct 60 gctggaacct acaaaagcct ggtcttttac cttgaagcct gtgaatctgg gagcatcttt 120 gaggggcttc tgccgaatga tatcggtgtc tacgcgacca ccgcatcaaa cgcagaggaa 180 agcagttggg gaacgtattg ccccggcgag tacccgagcc ctccgccgga atatgacact 240 tgcttgggcg acctgtacag catttcttgg atggaagaca gtgatgtcca caacctgagg 300 actgaatctc tcaagcagca gtataacctg gtcaagaaga gaacggcagc tcaggactca 360 tacagctatg gttcccatgt gatgcaatac ggttctttgg acctcaatgc tgaacatttg 420 ttctcgtaca ttgggtcaaa tcctgctaac gagaacacta catttgttga agataatgca 480 ttgccgtcgt tatcaagagc tgttaatcag agggatgctg atctt 525<210> 23
<211> 915
<212> DNA
<213> Hordeum vulgare<220>
<221> característica mista
<222> (576)..(576)
<223> η é a, c, g, ou t
<400> 23
ctcgtgcgaa ttcggcacga ggtcttttac cttgaagcct gtgaatctgg gagcatcttt 60 gaggggcttc tgccgaatga tatcggtgtc tacgcgacca ccgcatcaaa cgcagaggaa 120 agcagttggg gaacgtattg ccccggcgag tacccgagcc ctccgccgga atatgacact 180 tgcttgggcg acctgtacag catttcttgg atggaagaca gtgatgtcca caacctgagg 240 actgaatctc tcaagcagca gtataacctg gtcaagaaga gaacggcagc tcaggactca 300 tacagctatg gttcccatgt gatgcaatac ggttctttgg acctcaatgc tgaacatttg 360 ttctcgtaca ttgggtcaaa tcctgctaac gagaacacta catttgttga agataatgca 420 ttgccgtcgt tatcaagagc tgttaatcag agggatgctg atcttgttta tttctggcag 480 aagtaccgga aattggctga gagctcccct gcgaaaaaca atgctcgtaa gcaattgctc 540 gaaatgatgg gtcatagatc tcatattgac agcagncgtg agctgattgg aaccttctgt 600 ttggtctgcg gtgggtcaat ggttctaaga ctggtcgcca actgtgagcc tcttgggatg 660 actggaggtt gctcaagcta cgtgcgtact tttgaatccc atgtggctcg tggcgcatat 720 ggaatgacac atgcggtctt tgcaactggg aatgccggat tgttcttaac atggcaagtt 780 gttgttaggg gccaaacttc caccacccgg gtggccacaa aggtttaggc taaccgggga 840 gaagcacgat CCttttCCtt tggacatcca caacctctat caagggtgag ggtgacaact 900 taggaaaaaa ttctt 915 <210> 24 <211> 657 <212> DNA <213> Zea mays tiays <400> 24 gacctcgtag atgtcctgaa gaagaagcat gctgccggga cctacaaaag cctggtcttt 60 tatcttgaag catgcgaatc tgggagcatc tttgagggcc tcctgccgaa tgacataaat 120gtgtatgcga ccaccgcgtc aaatgcagag gagagtagct gggggacgta ctgccctggc 180
gagttcccga gccctccacc ggagtatgac acttgcttgg gagacctgta tagtgttgct 240
tggatggaag acagtgattt ccacaatctg cgaactgaat ctctcaagca gcaatacaac 300
ttggtcaagg ataggacagc ggttcaggat acattcagct atggctccca tgtgatgcaa 360
tatggttcat tggagttgaa tgttaagcat ctgttttcgt acattggcac aaaccctgct 420
aacgatgaca acacgtttat agaagacaac tcgttgccat cgttctcaaa ggctgttaat 480
cagcgcgacg ctgaccttgt ctacttctgg cagaagtacc ggaaattggc agacagctca 540
cctgagaaaa atgaagctcg gaaggagttg cttgaagtga tggcccacag gtctcatgtt 600
gacagcagtg ttgagctcat tggaagcctt ctctttggct ctgaggacgg tccaagg 657
<210> 25<211> 581<212> DNA<213> Zea mays mays<400> 25
gaagacagtg atttccacaa tctgcgaact gaatctctca agcagcaata caacttggtc 60
aaggatagga cagcggttca ggatacattc agctatggct cccatgtgat gcaatatggt 120
tcattggagt tgaatgttaa gcatctgttt tcgtacattg gcacaaaccc tgctaacgat 180
gacaacacgt ttatagaaga caactcgttg ccatcattct caaaggctgt taatcagcgc 240
gacgctgacc ttgtctactt ctggcagaag taccggaaat tggcagacag ctcacctgag 300
aaaaatgaag ctcggaggga tttgcttgaa gtgatggccc acaggtctca tgttgacagc 360
agtgttgagc tcattggaag ccttctcttt ggctctgagg acggtccaag ggttctgaaa 420
gccgtccgtg cagctggtga gcctctggtc gatgattgga gctgtctcaa gtccacggtt 480
cgtacttttg aggcgcaatg tgggtcgttg gcgcagtatg ggatgaagca catgcggtcc 540
ttcgcaaaca tctgcaacgc tggcatcctt cctgaggcag t 581<210> 26<211> 451<212> DNA<21Β> Zea mays mays<400> 26
tacgtccccc agctactctc ctctgcattt gacgcggtgg tcgcatacac attgatgtca 60
ttcggcagga ggccctcaaa gatgctccca gattcgcacg cttcaaggta aaagaccagg 120
cttttgtagg tcccggcagc atgcttcttc ttcaggacat ctacgaggtc atcaccatag 180agatatggat acgtaggcat tccaaggacaaatatatgat cattggggcc actgtccacattgttgccaa gcagaacagc gaagaaattgtttggcaccc cagcatagac gtcgccacccggattttccg ggctatgcgc gatgtcatcg<210> 27<211> 352<212> DNA<21Β> Zea mays mays<400> 27
gcacgagatg acatcgcgca tagcactggatccccagggt ggcgacgtct atgctggggtcgtcgacaat ttcttcgctg tactgcttggcaaggttgtg gacagtggcc tcaatgaccatcctggcgtc cttggaatgc ctacgtatcccctgaagaag aagcatgcag ctgggacata<210> 28<211> 562<212> DNA<213> Zea mays mays<400> 28
gaggacgtac tgccctggcg agttcccgagagacctgtat agtgttgctt ggatggaagatctcaagcag caatacaact tggtcaaggatggctcccat gtgatgcaat atggttcattcattggcaca aaccctgcta acgatgacaagttctcaaag gctgttaatc agcgcgacgcgaaattggca gacagctcac ctgagaaaaaggcccacagg tctcatgttg acagcagtgttgaggacggt ccaagggttc tgaaagccgtttggagctgt ctcaagtcca cg<210> 29
117
ccaggacccc catggtcact gtagaaaaca 240accttgccgc tcccacccct gagagcagtt 300tcgacgttga cctctcgccc agtgtaatcc 360tggggatgat ttatgatgac accaggcctc 420t 451aaatccgagg cctggtgtca tcataaatca 60gccaaaggat tacactgggc gagaggtcaa 120catcaaaact gctctcaggg gtgggagcgg 180tatatttgtt ttctacagtg accatggggg 240atatctctat ggtgatgacc tcgtacatgt 300caaaagcctg gtcttttatc tt 352ccctccaccg gagtatgaca cttgcttggg 60cagtgatttc cacaatctgc gaactgaatc 120taggacagcg gttcaggata cattcagcta 180ggagttgaat gttaagcatc tgttttcgta 240cacgtttata gaagacaact cgttgccatc 300tgaccttgtc tacttctggc agaagtaccg 360tgaagctcgg aaggagttgc ttgaagtgat 420tgagctcatt ggaagccttc tctttggctc 480ccgtgcagct ggtgagcctc tggtcgatga 540 562<211> 605<212> DNA
<213> Pennisetum typhoides<220>
<221> característica mista<222> (34)..(34)<223> η é a, c, g, ou t<220>
<221> característica mista<222> (582)..(582)
<223> η é a, c, g, ou t<400> 29
tttaagcacg aggctgccga acgacatcaa tgtntgcgac cactgcttca aatgcagatg 60agagcagctg gggcacgtac tgccctggcg aggtcccgag ccctccgcca gagtatgaca 120cctgcttggg agacttgtat agtgtttctt ggatggaaga cagtgatttc cacaatctgc 180gaactgagtc tctcaagcag caatacactt tggtaaagga taggacatcg atgcacaaca 240cattcaccta tggttcccat gtgatgcaat atggttcact gaacctgaat gtgcagcagt 300tgttctcgta cattggcaca aacccagcta acgatggcaa caagtttgtg gaaggcaatt 360cattgccatc attcacaaga gctgttaacc agcgcgatgc tgatcttgtt tacttctggc 420agaagtatcg gaaattggct gagggctcac ctgggaaaaa cgatgcccgg aaggaattgc 480ttgaagtgat gtcccacaga tctcatgttg acaacagtgt tgagctgatt ggaagccttt 540ctctttggct cagaggatgg tcctagaggt tctgaacgct gntcgtgccg ctggtgaacc 600ttggg 605
<210> 30<211> 617<212> DNA<213> Sorgo bicolor<400> 30
atctttgttt tctacagtga ccatggaggt cctggtgtcc ttggaatgcc tacgtacccg 60tatctctacg gtgatgacct cgtagatgtc ctgaagaaga agcatgctgc tgggacctac 120aaaagcctgg tcttttacct tgaagcatgc gaatctggga gcatctttga gggcctcctg 180ccggatgaca tcaatgtgta tgccaccacc gcgtcaaatg cagaggagag cagttggggg 240acgtactgcc ctggagaatt cccaagccct ccaccggagt atgacacatg cttgggagac 300ctgtatagtg tttcttggat ggaagacagt gatttccaca atctgcgaac tgaatctctc 360aagcagcagt acaagttggt caaggatagg acagcagttc aggatacatt cagctatggc 420tcccatgtga tgcaatatgg ctcattggag ttgaatgttc agaaattgtt ttcgtacatt 480ggcacaaacc ctgctaacga tggcaacaca tttgtagaag ataactcatt gccatcattt 540tcaaaagctg gtaatcagcg tgatgctgat cttgtctact tctggcagaa gtaccggaaa 600ttggctgatg actcatc 617<210> 31 <211> 588 <212> DNA <213> Sorgo bicolor <400> 31 gcacgaggtg aagaagggag gactcaagga cgagaacatc attgtcttca tgtacgatga 60catcgcacat agcccggaga atccgaggcc aggtgtcctc attaaccatc cccagggtgg 120cgatgtctat gctggggttc caaaggatta cactgggcga gaggtcagtg tcaacaattt 180cttcgctgtt ctgcttggca acaaaactgc tctgaaaggt gggagcggca aggttgtgga 240cagtggcccc aatgatcata tctttgtttt ctacagtgac catggaggtc ctggtgtcct 300tggaatgcct acgtatccgt atctctacgg tgatgacctc gtagatgtcc tgaagaagaa 360gcatgctgct gggacctaca aaagcctggt cttttacctt gaagcatgcg aatctgggag 420catctttgag ggcctcctgc cggatgacat caatgtgtat gccaccaccg cgtcaaatgc 480agaggagagc agttggggga cgtactgccc tggagaatcc caagccctcc accggagtat 540gacacatgct tgggagacct gtatagtgtt tctttggatg gaagacag 588<210> 32 <211> 759 <212> DNA <213> Sorgo bicolor <400> 32 ctcattgcca tcattttcaa aagctgttaa tcagcgtgat gctgatcttg tctacttctg 60gcagaagtac cggaaattgg ctgatgactc atctaagaaa aatgaagctc ggaaggaatt 120gcttgaagtg atggcccacc ggtctcatgt tgacaacagt gttgagctca ttggaagcct 180tctctttggc tctgaggacg gtccaagggt tctgaaagcc gtccgtgcag ctggtgaacc 240tctggttgat gattggagtt gtctcaagtc catggttcgt acttttgagg cacaatgtgg 300gtcattggcg cagtatggga tgaagcacat gcgatccttc gcaaacatct gcaatgctgg Β60
catccttcct gaagcagtgt caaaggtcgc cgctcaggct tgcaccagca ttccttccaa 420
cccctggagc tctatcgaca agggttttag cgcctaaaag ccacaggtga ggcgaaatat 480
tacagcagct ccaccacacc gaactccatt acattacggt actcaggggg tcttagttct 540
tgaaacatag gtgaagcaga cttataccat tattatagct gttccaccgt accagattac 600
gtagccatgc ccaatttccg gtgtacatac atatacatag tcggaaagtt atttggcaat 660
tgtattggcc gttggtgtat atattcccta tagtttgtta gcagaatgtg tagtttgtaa 720
ttccataaat gaagagcatt gctgctattt ctatatagc 759
<210> 33<211> 768<212> DNA<213> Sorgo bicolor<400> 33
atttgtagaa gataactcat tgccatcatt tcaaaaagct gttaatcagc gtgatgctga 60tcttgtctac ttctggcaga agtaccggaa attggctgat gactcatcta agaaaaatga 120
agctcggaag gaattgcttg aagtgatggc ccaccggtct catgttgaca acagtgttga 180
gctcattgga agccttctct ttggctctga ggacggtcca agggttctga aagccgtccg 240
tgcagctggt gaacctctgg ttgatgattg gagttgtctc aagtccatgg ttcgtacttt 300
tgaggcacaa tgtgggtcat tggcgcagta tgggatgaag cacatgcgat ccttcgcaaa 360
catctgcaat gctggcatcc ttcctgaagc agtgtcaaag -gtcgccgctc aggcttgcac 420
cagcattcct tccaacccct ggagctctat cgacaagggt tttagcgcct aaaagccaca 480
ggtgagggcg aaatattaca gcagctccac cacaccgaac tccattacat tacggtactc 540
agggggtctt agttcttgaa acataggtga agcagactta taccattatt atagctgttc 600
caccgtacca gattacgtag ccatgcccaa tttccggtgt acatacatat acatagtcgg 660
aaggttattt ggcaattgta ttggccgttg gtgtatatat tccctatagt ttgttagcag 720
atgtgtagtt tgtaattcca taaatgaaga gcattgctgc tatttcta 768
<210> 34<211> 780<212> DNA<213> Sorgo bicolor<400> 34
gcgcccacgc ctcgagccca ccatccgcct gccgtccgac cgcgcggacg acgccgtcgg 60gacacgctgg gccgtgctcg tcgccggttc caatggctac tacaactacc gccaccaggc 120ggacatctgc catgcgtacc aaatcatgaa gaagggagga ctcaaggacg agaacatcat 180tgtcttcatg tacgatgaca tcgcacatag cccggagaat ccgaggccag gtgtcctcat 240taaccatccc cagggtggcg atgtctatgc tggggttcca aaggattaca ctgggcgaga 300ggtcagtgtc aacaatttct tcgctgttct gcttggcaac aaaactgctc tgaaaggtgg 360gagcggcaag gttgtggaca gtggccccaa tgatcatatc tttgttttct acagtgacca 420tggaggtcct ggtgtccttg gaatgcctac gtatccgtat ctctacggtg atgacctcgt 480agatgtcctg aagaagaagc atgctgctgg gacctacaaa agcctggtct tttaccttga 540agcatgcgaa tctgggagca tctttgaggg cctcctgccg gatgacatca atgtgtatgc 600caccaccgcg tcaaatgcag aggagagcag ttgggggacg tactgccctg gagaattccc 660aagccctcca ccggagtatg acacatgctt gggagacctg tatagtgttt cttggatgga 720agacagtgat ttccacatct gcgaactgaa tctctcaagc agcagtacaa gttggtcaag 780<210> 35 <211> 656 <212> DNA <213> Sorgo bicolor <220> <221> característica mista <222> (634)..(634) <223> η é a, c, g, ou t <400> 35 catctaagaa aaatgaagct cggaaggaat tgcttgaagt gatggcccac cggtctcatg 60ttgacaacag tgttgagctc attggaagcc ttctctttgg ctctgaggac ggtccaaggg 120ttctgaaagc cgtccgtgca gctggtgaac ctctggttga tgattggagt tgtctcaagt 180ccatggttcg tacttttgag gcacaatgtg ggtcattggc gcagtatggg atgaagcaca 240tgcgatcctt cgcaaacatc tgcaatgctg gcatccttcc tgaagcagtg tcaaaggtcg 300ccgctcaggc ttgcaccagc attccttcca acccctggag ctctatcgac aagggtttta 360gcgcctaaaa gccacaggtg aggcgaaata ttacagcagc tccaccacac cgaactccat 420tacattacgg tactcagggg gtcttagttc ttgaaacata ggtgaagcag acttatacca 480ttattatagc tgttccaccg taccagatta cgtagccatg cccaatttcc ggtgtacata 540catatacata gtcggaaagt tatttggcaa ttgtattggc cgttggtgta tatattccct 600aatagtttgt tagcagatgt gtagtttgta attnccataa atgaagagca ttgctg 656<210> 36 <211> 703 <212> DNA <213> Saccharum offieinarum <400> 36 ctcggtccgg aattcccgga acgacttccg cgtccgggca aggttgtgga cagtggcccc 60 aatgatcata tctttgtttt ctacagtgac catggaggtc ctggtgtcct tggaatgcct 120 acgtatccat atctctacgg tgatgacctc gtagacgtcc tgaagaagaa gcatgctgct 180 gggacctaca aaagcctggt cttttacctt gaagcatgcg aatctgggag catctttgag 240 ggcctcctgc cagatgacat caatgtgtat gcgaccaccg cgtcaaatgc agaggagagc 300 agctggggga cgtactgccc tggcgagttc ccgagccctc caccggagta tgacacttgc 360 ttgggagacc tgtatagtgt ttcttggatg gaagacagtg atttccacaa tctgcgaacg 420 gaatctctca agcagcagta caagttggtc aaggatagga cagcggttca ggatacattc 480 agctatggtt cccatgtgat gcaatatggt tcattggagt tgaatgttca gaaattgttt 540 tcgtacattg gcacaaaccc tgctaacgat ggcaacacat ttgtagaaga taactcattg 600 ccatcatttt caaaagctgg taatcagcgg gatgctgatc ttgtctactt ctggcagaag 660 taccggaaat tggctgatgg ctcatctaaa aaaaatgaaa act 703 <210> 37 <211> 661 <212> .... DNA <21Β> Saccharum offieinarum <400> 37 tggaattaca aactacacat cggctaacaa actatgtagg gaatatatac accaaagacc 60 aatacaagcg ccaaataact ttgcgactat gtatgtacac cggaaattgg gcatagctac 120 gtaatctggt atggtggaac agctataata atggtataag tctgcttcac ctatggttca 180 agaactaaga ccccctgagt actgtaatgt aatggagttc ggtgtggtgg agcggctgta 240 atatgtcgcc tcacctatgg cttttaggcg ctaaaaccct tgtcgataga gctccagggg 300 ttggaaggaa tgctggtgca agcctgagcg gcaacctttg acactgcttc aggaaggatg 360 ccagcgttgc agatgtttgc gaaggttctc atgtgcttca tcccatactg cgccaacgac 420 ccacattgcg cctcaaaagt acgaaccatg gactttgagg cactccatca tcaaccaaag 480 gttcaccagc tgcacggacc ggttccagaa cccttggacc gtcctcagag ccaaagaaaa 540 aggttccaat gatttcaaca ctgttggtca acatgagaac ggtggggaca tcacttcaag 600caattccttt cgaagcttca tttttcctta aatggagcca tcagcccaat ttccggttac 660 t 661 <210> 38 <211> 515 <212> DNA <213> Saccharum officinarum <400> 38 ctggtgaacc tctggttgat gattggtagt tgtctcaagt ccatggttcg tacttttgag 60 gcgcaatgtg ggtcgttggc gcagtatggg atgaagcaca tgagatcctt cgcaaacatc 120 tgcaacgctg gcatccttcc tgaagcagtg tcaaaggttg ccgctcaggc ttgcaccagc 180 attccttcca acccctggag ctctatcgac aagggtttta gcgcctaaaa gccataggtg 240 aggcgaaata ttacagccgc tccaccacac cgaactccat tacattacag tactcagggg 300 gtcttagttc ttgaaccata ggtgaagcag acttatacca ttattatagc tgttccaccg 360 taccagatta cgtagctatg cccaatttcc ggtgtacata catagtcgga aagttatttg 420 gcgattgtat tggtcattgg tgtatatatt ccctatatag tttgttagca gatgtgtagt 480 ttgtaattcc ataaatgaag aacgcattgc tgctt 515 <210> 39 <211> 717 <212> DNA <213> Saccharum offi ci narum <400> 39 cgtatccata tctctacggt gatgacctcg tagatgtcct gaagaagaag catgctgctg 60 ggacctacaa aagcctggtc ttttaccttg aagcatgcga atctgggagc atctttgagg 120 gcctcctgcc agatgacatc aatgtgtatg cgaccaccgc gtcaaatgca gaggagagca 180 gctgggggac gtactgccct ggcgagttcc caagccctcc accggagtat gacacttgct 240 tgggagacct gtatagtgtt tcttggatgg aagacagtga tttccacaat ctgcgaactg 300 aatctctcaa gcagcagtac aagttggtca aggataggac agcggctcag gatacattca 360 gctatggttc ccatgtgatg caatatggtt cattggagtt gaatgttcag aaattgtttt 420 cgtacattgg cacaaaccct gctaacgatg gcaacacatt tgtagaagat aactcattgc 480 catcattttc aaaagctgtt aatcagcgtg atgctgatct tgtctacttc tggcagaagt 540 accggaaatt ggctgatggc tcatctaaga aaaatgaagc tcggaaggaa ttgcttgaag 600 tgatgtccca ccggtctcat gtgtgacaca gtgttgaact cattggaagc cttctctttg 660gctctgagga cggtcaaagg ttctgaaaac cgtccgtgca gctggtgaac ctctggt 717<210> 40<211> 718<212> DNA<213> Saccharum officinarum<400> 40
ctctcatgaa gtaccggaaa ttggctgatg gctcatctaa gaaaaatgaa gctcggaagg 60
aattgcttga agtgatgtcc caccggtctc atgttgacaa cagtgttgaa ctcattggaa 120
gccttctctt tggctctgag gacggtccaa gggttctgaa agccgtccgt gcagctggtg 180
aacctctggt tgatgattgg agttgcctca agtccatggt tcgtactttt gaggcgcatg 240
gtgggtcgtt gccccatttt ggaatgaaca ccatgaaacc tttggaaaca ttttgcacgg 300
cttgcatcct tcttgagcaa tggtcaaagg ttgccgctca ggcttgcacc agcattcctt 360
ccaacccctg gagctctatc gacaagggtt ttagcgccta aaagccatag gtgaggcgaa 420
atattacagc cgctccacca caccgaactc cattacatta cagtactcag ggggtcttag 480
ttcttgaacc ataggtgaag cagacttata ccattattat agtggtcccc ataccagatt 540
acgtagcttt gcccattttc cggtgacaaa catagccgga aaggttttgg cgaatgaatg 600
gccattggga gaatatttcc ctaaaagttt ggtaaccaaa gggaggtttg aattcccata 660
aagaaaaaac ccttggtttt caaaaaaaaa aaagaagaga ggtccgccct tagctggc 718
<210> 41<211> 446<212> DNA<213> Zea mays<400> 41
cagtttcagc atcaaattcc ccagacatgc aaaatcccga gacacctgaa aatggtctta 60
agagtgtgct attggaaaat cccgctgcta aaaaagatca ggtgtcatta tgtccttcag 120
ttgaggatgc actggttttt actagcttag gtggaaggaa atctgaaccc aaacggaatg 180
ctgataatga aacagagata aaattggatg ctcgcagtaa aggtaaatct gtcatgtcct 240
ctgtgctgcc tgcttccacc acatctcatg gtgcttctca taacgacctg ttcatgtgcc 300
atcaatgcgc gaaaacaaac taatatatgg aacaacccct acctatactt cctgtgaatc 360
caatgggaca gctcatggta gtttgcagtc gatattccct cttccacatg tagtcttccc 420
tccttgctca ccagtttccc cccctt 446

Claims (46)

1. Processo para identificação de uma seqüência de polinucleo-tídeo que está associada com rendimento em uma planta, compreendendoas etapas de:a) comparação de pelo menos uma porção da seqüência de po-linucleotídeo de planta com pelo menos um polinucleotídeo compreendendopelo menos uma porção de um polinucleotídeo selecionado do grupo consis-tindo em uma seqüência de polinucleotídeo EG8798 e uma seqüência depolinucleotídeo EG9703; eb) identificação de pelo menos uma seqüência de polinucleotí-deo na planta que contém pelo menos uma alteração como comparada a umpolinucleotídeo compreendendo pelo menos uma porção do polinucleotídeoselecionado do grupo consistindo em uma seqüência de polinucleotídeoEG8798 e uma seqüência de polinucleotídeo EG9703, onde a dita seqüênciade polinucleotídeo identificada é associada com rendimento em uma planta.
2. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que a seqüên-cia de polinucleotídeo EG8798 e seqüência de polinucleotídeo EG9703 sãoselecionadas do grupo consistindo ema) SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 5;SEQ ID NO: 7; SEQ ID NO: 8; SEQ ID .NO: 10; SEQ ID NO: 11; SEQ ID NO:-13; SEQ ID NO: 14; SEQ ID NO: 15; SEQ ID NO: 16; SEQ ID NO: 17; SEQID NO: 18; SEQ ID NO: 19; SEQ ID NO: 20; SEQ ID NO: 21; SEQ ID NO:-22; SEQ ID NO: 23; SEQ ID NO: 24; SEQ ID NO: 25; SEQ ID NO: 26; SEQID NO: 27; SEQ ID NO: 28; SEQ ID NO: 29; SEQ ID NO: 30; SEQ ID NO:-31; SEQ ID NO: 32; SEQ ID NO: 33; SEQ ID NO: 34; SEQ ID NO: 35; SEQID NO: 36; SEQ ID NO: 37; SEQ ID NO: 38; SEQ ID NO: 39; SEQ ID NO:40; SEQ ID NO: 41; eb) um polinucleotídeo tendo pelo menos cerca de 70% de identi-dade de seqüência a um polinucleotídeo em a).
3. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que a seqüên-cia de polinucleotídeo de planta é DNA genômico.
4. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que a seqüên-cia de polinucleotídeo de planta é ADNc.
5. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que a seqüên-cia de polinucleotídeo EG9703 ou EG8798 está associada com rendimentoaumentado em uma planta.
6. Processo de acordo com a reivindicação 5, em que rendimen-to aumentado é rendimento aumentado em relação a uma segunda plantado mesmo gênero tendo uma segunda seqüência de polinucleotídeoEG9703 ou EG8798 com pelo menos uma mudança de nucleotídeo em rela-ção à seqüência de polinucleotídeo EG9703 ou EG8798 da planta.
7. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que a planta éselecionada do grupo consistindo em Zea mays, Oryza sativa, Triticum aes-tivum, Hordeum vulgare, Saccharum officinarum, Sorgo bicolor, e Pennise-tum typhoides.
8. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que a planta éselecionada do grupo consistindo em uma planta ancestral selvagem parauma planta domesticada selecionada do grupo consistindo em Zea mays,Oryza sativa, Triticum aestivum, Hordeum vulgare, Saccharum officinarum,Sorgo bicolor, e Pennisetum typhoides.
9. Processo de acordo com a reivindicação 8, em que a planta éoryza rufipogon.
10. Polinucleotídeo isolado selecionado do grupo consistindoem:a) um polinucleotídeo compreendendo pelo menos uma porçãode um polinucleotídeo selecionado do grupo consistindo em a) SEQ ID NO:-1; SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 7; SEQ ID NO:-8; SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 11; SEQ ID NO: 13; SEQ ID NO: 14; SEQ IDNO: 15; SEQ ID NO: 16; SEQ ID NO: 17; SEQ ID NO: 18; SEQ ID NO: 19;SEQ ID NO: 20; SEQ ID NO: 21; SEQ ID NO: 22; SEQ ID NO: 23; SEQ IDNO: 24; SEQ ID NO: 25; SEQ ID NO: 26; SEQ ID NO: 27; SEQ ID NO: 28;SEQ ID NO: 29; SEQ ID NO: 30; SEQ ID NO: 31; SEQ ID NO: 32; SEQ IDNO: 33; SEQ ID NO: 34; SEQ ID NO: 35; SEQ ID NO: 36; SEQ ID NO: 37;SEQ ID NO: 38; SEQ ID NO: 39; SEQ ID NO: 40; SEQ ID NO: 41; eb) um polinucleotídeo tendo pelo menos cerca de 70% de homo-logia a um polinucleotídeo de a), e confere substancialmente o mesmo ren-dimento como um polinucleotídeo de a).
11. Polipeptídeo isolado selecionado do grupo consistindo em:a) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo compreendendo pelomenos uma porção de um polinucleotídeo selecionado do grupo consistindoema) SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 5;SEQ ID NO: 7; SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 11; SEQ ID NO:-13; SEQ ID NO: 14; SEQ ID NO: 15; SEQ ID NO: 16; SEQ ID NO: 17; SEQID NO: 18; SEQ ID NO: 19; SEQ ID NO: 20; SEQ ID NO: 21; SEQ ID NO:-22; SEQ ID NO: 23; SEQ ID NO: 24; SEQ ID NO: 25; SEQ ID NO: 26; SEQID NO: 27; SEQ ID NO: 28; SEQ ID NO: 29; SEQ ID NO: 30; SEQ ID NO:-31; SEQ ID NO: 32; SEQ ID NO: 33; SEQ ID NO: 34; SEQ ID NO: 35; SEQID NO: 36; SEQ ID NO: 37; SEQ ID NO: 38; SEQ ID NO: 39; SEQ ID NO:-40; SEQ ID NO: 41 ;b) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo tendo pelomenos cerca de 70% de identidade de seqüência a pelo menos uma porçãode um polinucleotídeo em a) e confere substancialmente o mesmo rendi-mento como um polinucleotídeo de a);c) um polipeptídeo compreendendo pelo menos uma porção deum polipeptídeo selecionado do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 3, 6, 9,e 12; ed) um polipeptídeo compreendendo pelo menos uma porção deum polipeptídeo tendo pelo menos cerca de 75% de identidade de seqüênciaa um polipeptídeo de c) e confere substancialmente o mesmo rendimentocomo um polipeptídeo de c).
12. Células de plantas, compreendendo DNA heterólogo codifi-cando um polipeptídeo EG8798 ou EG9703 onde o dito polipeptídeo é capazde aumentar o rendimento de uma planta, onde o dito polipeptídeo é sele-cionado do grupo consistindo em:a) um polipeptídeo compreendendo pelo menos uma porção deum polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo selecionado do grupoconsistindo em SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 5;SEQ ID NO: 7; SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 11; SEQ ID NO:-13; SEQ ID NO: 14; SEQ ID NO: 15; SEQ ID NO: 16; SEQ ID NO: 17; SEQID NO: 18; SEQ ID NO: 19; SEQ ID NO: 20; SEQ ID NO: 21; SEQ ID NO:-22; SEQ ID NO: 23; SEQ ID NO: 24; SEQ ID NO: 25; SEQ ID NO: 26; SEQID NO: 27; SEQ ID NO: 28; SEQ ID NO: 29; SEQ ID NO: 30; SEQ ID NO:-31; SEQ ID NO: 32; SEQ ID NO: 33; SEQ ID NO: 34; SEQ ID NO: 35; SEQID NO: 36; SEQ ID NO: 37; SEQ ID NO: 38; SEQ ID NO: 39; SEQ ID NO:-40; SEQ ID NO: 41;b) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo tendo pelomenos cerca de 70% de identidade de seqüência a pelo menos uma porçãode um polinucleotídeo em a);c) um polipeptídeo compreendendo pelo menos uma porção deum polipeptídeo selecionado do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 3, 6, 9 e-12; ed) um polipeptídeo compreendendo um polipeptídeo tendo pelomenos cerca de 75% de identidade de seqüência a pelo menos uma porçãode um polipeptídeo de c).
13. Material de propagação de uma planta transgênica compre-endendo a célula de planta transgênica como definido na reivindicação 12.
14. Planta transgênica contendo DNA heterólogo que codificaum polipeptídeo EG8798 ou EG9703 que é expresso em tecido de planta,onde o dito polipeptídeo é capaz de aumentar o rendimento da planta, ondeo dito polipeptídeo é selecionado do grupo consistindo em:a) um polipeptídeo compreendendo pelo menos uma porção deum polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo selecionado do grupoconsistindo em SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 5;SEQ ID NO: 7; SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 11; SEQ ID NO:-13; SEQ ID NO: 14; SEQ ID NO: 15; SEQ ID NO: 16; SEQ ID NO: 17; SEQID NO: 18; SEQ ID NO: 19; SEQ ID NO: 20; SEQ ID NO: 21; SEQ ID NO:-22; SEQ ID NO: 23; SEQ ID NO: 24; SEQ ID NO: 25; SEQ ID NO: 26; SEQID NO: 27; SEQ ID NO: 28; SEO ID NO: 29; SEQ ID NO: 30; SEQ ID NO:-31; SEQ ID NO: 32; SEQ ID NO: 33; SEQ ID NO: 34; SEQ ID NO: 35; SEQID NO: 36; SEQ ID NO: 37; SEQ ID NO: 38; SEQ ID NO: 39; SEQ ID NO:-40; SEQ ID NO: 41;b) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo tendo pelomenos cerca de 70% de identidade de seqüência a pelo menos uma porçãode um polinucleotídeo em á);c) um polipeptídeo compreendendo pelo menos uma porção deum polipeptídeo selecionado do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 3, 6, 9 e-12; ed) um polipeptídeo compreendendo um polipeptídeo tendo pelomenos cerca de 75% de identidade de seqüência a pelo menos uma porçãode um polipeptídeo de c).
15. Polinucleotídeo isolado que inclui um promotor ligado opera-velmente a um polinucleotídeo que codifica um gene EG8798 ou EG9703em um tecido de planta onde o dito polinucleotídeo é capaz de aumentar orendimento de uma planta, onde o dito polinucleotídeo é selecionado do gru-po consistindo em:a) um polinucleotídeo compreendendo pelo menos uma porçãode um polinucleotídeo selecionado do grupo consistindo em SEQ ID NO: 1;SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 7; SEQ ID NO: 8;SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 11; SEQ ID NO: 13; SEQ ID NO: 14; SEQ IDNO: 15; SEQ ID NO: 16; SEQ ID NO: 17; SEQ ID NO: 18; SEQ ID NO: 19;SEQ ID NO: 20; SEQ ID NO: 21; SEQ ID NO: 22; SEQ ID NO: 23; SEQ IDNO: 24; SEQ ID NO: 25; SEQ ID NO: 26; SEQ ID NO: 27; SEQ ID NO: 28;SEQ ID NO: 29; SEQ ID NO: 30; SEQ ID NO: 31; SEQ ID NO: 32; SEQ IDNO: 33; SEQ ID NO: 34; SEQ ID NO: 35; SEQ ID NO: 36; SEQ ID NO: 37;SEQ ID NO: 38; SEQ ID NO: 39; SEQ ID NO: 40; SEQ ID NO: 41; eb) um polinucleotídeo tendo pelo menos cerca de 70% de identi-dade de seqüência a pelo menos uma porção de um polinucleotídeo em a).
16. Polinucleotídeo isolado de acordo com a reivindicação 15,em que o dito polinucleotídeo é um polinucleotídeo recombinante.
17. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 16, aindacompreendendo um promotor nativo para um gene EG8798 ou EG9703.
18. Célula hospedeira transfectada compreendendo uma célulahospdeira transfectada com uma construção compreendendo um polinucleo-tídeo promotor, aperfeiçoador ou intron de um polinucleotídeo EG8798 ouEG9703 ou qualquer combinação dos mesmos, operavelmente ligado a umpolinucleotídeo codificando uma proteína repórter, onde o dito polinucleotí-deo EG8798 ou EG9703 é capaz de aumentar o rendimento de uma planta,onde o dito polinucleotídeo EG8798 ou EG9703 é selecionado do grupoconsistindo em:a) um polinucleotídeo compreendendo pelo menos uma porçãode um polinucleotídeo selecionado do grupo consistindo em SEQ ID NO: 1;SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 7; SEQ ID NO: 8;SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 11; SEQ ID NO: 13; SEQ ID NO: 14; SEQ IDNO: 15; SEQ ID NO: 16; SEQ ID NO: 17; SEQ ID NO: 18; SEQ ID NO: 19;SEQ ID NO: 20; SEQ ID NO: 21; SEQ ID NO: 22; SEQ ID NO: 23; SEQ IDNO: 24; SEQ ID NO: 25; SEQ ID NO: 26; SEQ ID NO: 27; SEQ ID NO: 28;SEQ ID NO: 29; SEQ ID NO: 30; SEQ ID NO: 31; SEQ ID NO: 32; SEQ IDNO: 33; SEQ ID NO: 34; SEQ ID NO: 35; SEQ ID NO: 36; SEQ ID NO: 37;SEQ ID NO: 38; SEQ ID NO: 39; SEQ ID NO: 40; SEQ ID NO: 41; eb) um polinucleotídeo tendo pelo menos cerca de 70% de identi-dade de seqüência a pelo menos uma porção de um polinucleotídeo em a).
19. Processo de determinação de se uma planta tem uma parti-cular seqüência de polinucleotídeo compreendendo uma seqüência EG8798,compreendendo as etapas de:a) comparação de pelo menos uma porção da seqüência de po-linucleotídeos da dita planta com um polinucleotídeo compreendendo umpolinucleotídeo selecionado do grupo consistindo em (i) um polinucleotídeocompreendendo pelo menos uma porção de um polinucleotídeo selecionadodo grupo consistindo em SEQ ID NO: 7; SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 10;SEQ ID NO: 11; SEQ ID NO: 13; SEQ ID NO: 14; SEQ ID NO: 15; SEQ IDNO: 16; SEQ ID NO: 17; SEQ ID NO: 18; SEQ ID NO: 19; SEQ ID NO: 20;SEQ ID NO: 21; SEQ ID NO: 22; SEQ ID NO: 23; SEQ ID NO: 24; SEQ IDNO: 25; SEQ ID NO: 26; SEQ ID NO: 27; SEQ ID NO: 28; SEQ ID NO: 29;SEQ ID NO: 30; SEQ ID NO: 31; SEQ ID NO: 32; SEQ ID NO: 33; SEQ IDNO: 34; SEQ ID NO: 35; SEQ ID NO: 36; SEQ ID NO: 37; SEQ ID NO: 38;SEQ ID NO: 39; SEQ ID NO: 40; SEQ ID NO: 41; e (ii) um polinucleotídeocompreendendo um polinucleotídeo tendo pelo menos cerca de 70% de i-dentidade de seqüência a pelo menos uma porção de um polinucleotídeo de(i) e que confere substancialmente o mesmo rendimento como um polinucle-otídeo de (i), onde um ou mais dos polinucleotídeos de a) são o polinucleotí-deo particular; eb) identificação de se a planta contém o polinucleotídeo particu-lar.
20. Processo de acordo com a reivindicação 19, em que a se-qüência de polinucleotídeo de planta é DNA genômico.
21. Processo de acordo com a reivindicação 19, em que a se-qüência de polinucleotídeo de planta é ADNc.
22. Processo de acordo com a reivindicação 19, em que a se-qüência de polinucleotídeo EG8798 é associada com aumentado rendimentoem uma planta.
23. Processo de acordo com a reivindicação 22, em que o ren-dimento aumentado é rendimento aumentado em relação a uma segundaplanta do mesmo gênero tendo uma segunda seqüência de polinucleotídeoEG8798 com pelo menos uma mudança de nucleotídeo em relação à se-qüência de polinucleotídeo EG8798 da planta.
24. Processo de acordo com a reivindicação 22, em que a plantaé selecionada do grupo consistindo em Zea mays, Oryza sativa, Triticumaestivum, Hordeum vulgare, Saccharum officinarum, Sorgo bicolor, e Penni-setum typhoides.
25. Processo de acordo com a reivindicação 23, em que a se-gunda planta é selecionada do grupo consistindo em uma planta ancestralselvagem para uma planta domesticada selecionada do grupo consistindoem Zea mays, Oryza sativa, Triticum aestivum, Hordeum vulgare, Saecha-rum officinarum, Sorgo bicolor, e Pennisetum typhoides.
26. Processo de determinação de se uma planta tem uma parti-cular seqüência de nucleotídeo compreendendo uma seqüência EG9703,compreendendo as etapas de:a) comparação de pelo menos cerca de uma porção de uma se-qüência de nucleotídeo codificando polipeptídeo da dita planta com uma se-qüência de polinucleotídeo selecionada do grupo consistindo em (i) um poli-nucleotídeo compreendendo pelo menos uma porção de um polinucleotídeoselecionado do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 1, 2, 4, 5; e (ii) um poli-nucleotídeo tendo pelo menos cerca de 70% de identidade de seqüência apelo menos uma porção de um polinucleotídeo de (i) e que confere substan-cialmente o mesmo rendimento como um polinucleotídeo de (i), para obter aparticular seqüência de polinucleotídeo; eb) identificando se a planta contém o polinucleotídeo particular.
27.Processo de acordo com a reivindicação 26, em que a se-qüência de polinucleotídeo de planta é DNA genômico.
28. Processo de acordo com a reivindicação 26, em que a se-qüência de polinucleotídeos de planta é ADNc.
29. Processo de acordo com a reivindicação 26, em que a se-qüência de polinucleotídeo EG9703 é associada com aumentado rendimento -em uma planta.
30. Processo de acordo com a reivindicação 29, em que rendi-mento aumentado é rendimento aumentado em relação a uma segundaplanta do mesmo gênero tendo uma segunda seqüência de polinucleotídeoEG9703 com pelo menos uma mudança de nucleotídeo em relação à se-qüência de polinucleotídeo EG9703 da planta.
31. Processo de acordo com a reivindicação 26, em que a plantaé selecionada do grupo consistindo em Zea mays, Oryza sativa, Triticumaestivum, Hordeum vulgare, Saccharum officinarum, Sorgo bicolor, e Penni-setum typhoides.
32. Processo de acordo com a reivindicação 31, em que a se-gunda planta é selecionada do grupo consistindo em uma planta ancestralselvagem para uma planta domesticada selecionada do grupo consistindoem Zea mays, Oryza sativa, Triticum aestivum, Hordeum vulgare, Saccha-rum officinarum, Sorgo bicolor, e Pennisetum typhoides.
33. Processo de cultivo auxiliado por marcador de plantas parauma particular seqüência de polinucleotídeo EG8798, compreendendo asetapas de:a) comparação, para pelo menos uma planta, pelo menos umaporção da seqüência de nucleotídeo das ditas plantas com pelo menos umaporção da particular seqüência de polinucleotídeo EG8798 compreendendouma seqüência de polinucleotídeos selecionada do grupo consistindo em (i)um polinucleotídeo selecionado do grupo consistindo em SEQ ID NO: 7;SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 11; SEQ ID NO: 13; SEQ IDNO: 14; SEQ ID NO: 15; SEQ ID NO: 16; SEQ ID NO: 17; SEQ ID NO: 18;SEQ ID NO: 19; SEQ ID NO: 20; SEQ ID NO: 21; SEQ ID NO: 22; SEQ IDNO: 23; SEQ ID NO: 24; SEQ ID NO: 25; SEQ ID NO: 26; SEQ ID NO: 27;SEQ ID NO: 28; SEQ ID NO: 29; SEQ ID NO: 30; SEQ ID NO: 31; SEQ IDNO: 32; SEQ ID NO: 33; SEQ ID NO: 34; SEQ ID NO: 35; SEQ ID NO: 36;SEQ ID NO: 37; SEQ ID NO: 38; SEQ ID NO: 39; SEQ ID NO: 40; SEQ IDNO: 41; e (ii) um polinucleotídeo tendo pelo menos cerca de 70% de identi-dade de seqüência a um polinucleotídeo de (i) e que confere substancial-mente o mesmo rendimento como um polipeptídeo de (i);b) identificação de se a planta compreende a particular seqüên-cia de polinucleotídeo; ec) cultivo de uma planta compreendendo a particular seqüênciade polinucleotídeo para produzir progênie.
34. Processo de acordo com a reivindicação 33, em que a se-qüência de polinucleotídeo de planta é DNA genômico.
35. Processo de acordo com a reivindicação 33, em que a se-qüência de polinucleotídeo de planta é ADNc.
36. Processo de acordo com a reivindicação 33, em que a se-qüência de polinucleotídeo EG8798 é associada com aumentado rendimentoem uma planta.
37. Processo de acordo com a reivindicação 36, em que rendi-mento aumentado é rendimento aumentado em relação a uma segundaplanta do mesmo gênero tendo uma segunda seqüência de polinucleotídeoEG8798 com pelo menos uma mudança de nucleotídeo em relação à se-qüência de polinucleotídeo EG8798 da planta.
38. Processo de acordo com a reivindicação 33, em que a plantaé selecionada do grupo consistindo em Zea mays, Oryza sativa, Triticumaestivum, Hordeum vulgare, Saccharum officinarum, Sorgo bicolor, e Penní-setum typhoides.
39. Processo de acordo com a reivindicação 37, em que a se-gunda planta é selecionada do grupo consistindo em uma planta ancestralselvagem para uma planta domesticada selecionada do grupo consistindoem Zea mays, Oryza sativa, Triticum aestivum, Hordeum vulgare, Saceha-rum officinarum, Sorgo bicolor, e Pennisetum typhoides.
40. Processo de cultivo de plantas auxiliado por marcador parauma particular seqüência de polinucleotídeo EG9703, compreendendo asetapas de:a) comparação, para pelo menos uma planta, de pelo menosuma porção da seqüência de nucleotídeo das ditas plantas com pelo menosuma porção de uma particular seqüência . de polinucleotídeo EG9703 sele-cionada do grupo consistindo em (i) um polinucleotídeo compreendendo umpolivnucleotídeo selecionado do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 1, 2, 4,e 5; e (ii) um polinucleotídeo tendo pelo menos cerca de 70% de identidadede seqüência a um polinucleotídeo de (i) e que confere substancialmente omesmo rendimento como um polipeptídeo de (i);b) identificação de se a planta compreende a particular seqüên-cia de polinucleotídeo; ec) cultivo de uma planta compreendendo a seqüência de polinu-cleotídeo particular para produzir progênie.
41. Processo de acordo com a reivindicação 38, em que a se-qüência de polinucleotídeo de planta é DNA genômico.
42. Processo de acordo com a reivindicação 38, em que a se-qüência de polinucleotídeo de planta é ADNc.
43. Processo de acordo com a reivindicação 38, em que a se-qüência de polinucleotídeo EG9703 é associada com aumentado rendimentoem uma planta.
44. Processo de acordo com a reivindicação 41, em que rendi-mento aumentado é rendimento aumentado em relação a uma segundaplanta do mesmo gênero tendo uma segunda seqüência de polinucleotídeoEG9703 com pelo menos uma mudança de nucleotídeo em relação à se-qüência de polinucleotídeo EG9703 da planta.
45. Processo de acordo com a reivindicação 38, em que a plantaé selecionada do grupo consistindo em Zea mays, Oryza sativa, Triticumaestivum, Hordeum vulgare, Saccharum officinarum, Sorgo bicolor, e Penni-setum typhoides.
46. Processo de acordo com a reivindicação 44, em que a se-gunda planta é selecionada do grupo consistindo em uma planta ancestralselvagem para uma planta domesticada selecionada do grupo consistindoem Zea mays, Oryza sativa, Triticum aestivum, Hordeum vulgare, Saccha-rum officinarum, Sorgo bicolor, e Pennisetum typhoides.
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