BRPI0614919A2 - método para regenerar um sistema imune - Google Patents

Abstract

MéTODO PARA REGENERAR UM SISTEMA IMUNE. A presente invenção refere-se a uma linhagem de células isoladas e purificadas de células-tronco hematopoiéticas (HSG) que são incapazes de expressar o receptor CCR5 sobre a superfície da célula ("as células CCR5A32" são usadas para regenerar o sistema imune em um indivíduo em necessidade das mesmas e especialmente para tratar um indivíduo infectado com o vírus da imunodeficiência humana (HIV)). O método é realziado através do transplante de CCR5A32 para interior do indivíduo receptor. Devido ao fato que células imunes maduras derivadas de células CCR5A32 não podem expressar receptores CCR5 funcionais, elas serão resistentes à infecção por HIV e outros patógenos que usam o receptor CCR5 para infectar as células. Uma modalidade da invenção inclui a administração de um regime nutricional ao paciente que otimiza as condições para o transplante de células CCR5A32. Outra modalidade da invenção inclui o co-transplante de células mesenquimal junto com a HSC, de forma a aumentar o crescimento e desenvolvimento da HSC transplantada.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODOPARA REGENERAR UM SISTEMA IMUNE".

PEDIDOS DE PATENTE RELACIONADOS

Este pedido de patente reivindica o benefício da prioridade doPedido de Patente US número 60/703.073 protocolado em 28 de julho de2005, cujo conteúdo fica incorporado ao presente por referência.

CAMPO DA INVENÇÃO

Esta invenção refere-se à regeneração de um sistema imune eem especial à maneira de tratar um indivíduo infectado com o vírus da imu-nodeficiência humana (HIV - Human Immunodeficiency Virus), e uma linha-gem de células-tronco isoladas e purificadas para fazê-lo.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

O transplante de células-tronco hematopoiéticas (HSC - Hema-topoietic Stem Cells) alogênicas ou autólogas é um tratamento estabelecidopara diversas doenças hematológicas e distúrbios metabólicas. Após otransplante, as HSC se diferenciam em células imunitárias funcionais e re-generam ou reconstituem o sistema imune danificado anteriormente. Entre-tanto, o transplante de células-tronco é ineficaz para controlar doenças se ascélulas imunitárias regeneradas forem infectadas subseqüentemente peloorganismo causador da doença.

Por exemplo, o vírus da imunodeficiência humana (HIV) infectaprimordialmente as células do sistema imunológico, tais como as células T,macrófagos e células dendríticas. O vírus infecta as células através do re-ceptor CD4 e um co-receptor o qual, em uma infecção por HIV primária, é oreceptor CCR5. São necessários ambos os receptores para que o vírus pos-sa adentrar a célula, aonde depois irá se duplicar. Durante a fase primária dainfecção, o vírus se duplica rapidamente e infecta células por todo o corpo,especialmente nos órgão linfóides. A infecção estimula o sistema imune aatacar células infectadas e diminuir os níveis de HIV, mas o vírus faz rapi-damente uma mutação para evitar este ataque imunitário e assim a infecçãopor HIV permanece. Assim, uma pessoa infectada pode permanecer por a-nos em um estado assintomático latente, apesar da ininterrupta duplicaçãodo HIV nos órgãos infectados.

A latência pode ser interrompida se o sistema imune for estimu-lado, tal como durante uma infecção por um patógeno diferente ou por umaativação das células CD4+ T nos órgãos linfóides infectados. As células Tinfectadas por HIV conseqüentemente são destruídas uma vez que enormesquantidades de vírus são produzidos e liberados a partir das células. Sobcertas condições poderá ser induzido apoptose nas células T tanto infeccio-nadas como livres da infecção diminuindo assim ainda mais a população decélulas T. Conforme o número de células T funcionais rapidamente diminui,a função imunológica é comprometida e aparecem os sintomas da síndromeda imunodeficiência adquirida (AIDS - Acquired Immunodeficiency Syndrome).

O curso da AIDS é descrito de maneira característica como umamudança do equilíbrio entre a destruição e a produção de células CD4+ T.o curso da AIDS avança rapidamente conforme aumentam osníveis de HIV ("carga viral") na corrente sangüínea. As terapias enfocam asupressão da replicação do HIV através da administração de coquetéis demedicamentos direcionados para uma terapia antiretroviral fortemente ativa(HAART - Highly Active Anti-retroviral Therapy). Muito embora estas terapi-as possam atrasar ou paralisar temporariamente a doença, elas não conse-guem evitar a infecção adicional do sistema imune pelo HIV. Conforme adoença avança, tecidos linfóides como o timo, a medula óssea e os nóduloslinfáticos vão sendo infectados e danificados, diminuindo ainda mais a capa-cidade do sistema imune de produzir células imunitárias funcionais e de seregenerar em seguida à terapia HAART.

O transplante das HSC em pacientes com AIDS é de utilidadelimitada, mesmo quando feito em conjunto com a HAART. Logo após seremtransplantadas, as HSC se transformam em células progenitoras hematopoi-éticas, as quais dão origem a vários tipos de células imunitárias. As célulasprogenitoras (ou células-mãe) que originam as células T migram para o timo,onde ocorre sua transformação em células T. Células T maduras que carre-gam os receptores CD4 e CCR5 são então liberadas a partir do timo. Destaforma, a saúde e a função do timo são de importância fundamental para aformação de células T maduras. Muito embora as HSC não possam ser in-fectadas pelo HIV1 estas células T maduras serão infectadas rapidamentepelo vírus. Os sintomas da AIDS são diminuídos temporariamente pelotransplante de HSC conforme são regeneradas as células imunitárias sau-dáveis, porém retornam à medida que as células regeneradas vão ficandoinfectadas.

Além disso, o sucesso do transplante de HSC depende altamen-te de uma rígida terapia imunossupressiva para evitar a rejeição imunológicadas células transplantadas. Tradicionalmente, terapias de radiação ou qui-mioterapia têm sido adotadas para destruir as células imunitárias do receptoranteriormente ao transplante de HSC. Assim sendo, uma pessoa cujo siste-ma imune já está enfraquecido pela infecção por HIV é submetida a trata-mentos que diminuem ainda mais a quantidade de células imunitárias e dei-xam o paciente sem nenhuma defesa contra infecções subseqüentes.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Para superar as limitações das técnicas anteriores, é fornecidoum novo método de regeneração do sistema imunológico. De acordo comuma modalidade gerai da invenção, um método para regenerar um sistemaimune em um indivíduo que necessite desta medida compreende transplan-tar no indivíduo uma grande quantidade de células-tronco hematopoiéticasisoladas e purificadas que sejam incapazes de expressar um receptor super-ficial CCR5 funcional, por intermédio do qual as células transplantadas sediferenciarão em células imunitárias maduras.

De acordo com outra modalidade da invenção, além da forma eexecução geral, um regime nutricional que compreenda um ou mais compos-tos que melhorem a condição nutricional do indivíduo e que sejam adminis-trados um ou mais compostos antimicrobianos para o indivíduo. O regimenutricional compreende adicionalmente um ou mais compostos antiinflamató-rios e um ou mais compostos que estimulem um ou ambos o crescimento eo funcionamento do timo do indivíduo, e que tais compostos sejam adminis-trados concorrentemente e posteriormente ao transplante das células-troncohematopoiéticas.

De acordo com outra modalidade da invenção, um método detratar um indivíduo infectado pelo HIV consiste em transplantar para o indiví-duo uma grande quantidade de células-tronco hematopoiéticas isoladas epurificadas que sejam incapazes de expressar um receptor superficial CCR5funcional e, por intermédio disto, que as células transferidas se diferenciarãoem células imunitárias maduras.

De acordo com outra modalidade da invenção, além da modali-dade geral da invenção ou do método para tratar um indivíduo infectado como HIV, o método consiste em transplantar uma grande quantidade de célu-las-tronco mesenquimais para o indivíduo.

Deve ficar entendido que ambas a descrição geral que constaacima e a descrição detalhada a seguir são exemplificativas, porém não res-tritivas, da invenção.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A invenção é direcionada para uma linhagem de células isoladase purificadas de células-tronco hematopoiéticas (HSC) que sejam incapazesde expressar um receptor CCR5 na superfície da célula ("as células C-CR5A32"). A invenção é direcionada adicionalmente a um método de rege-nerar o sistema imune em paciente que necessite de tal medida através dotransplante de CCR5A32 para o indivíduo recebedor. Devido ao fato de queas células imunitárias maduras obtidas através das CCR5A32 não podemexpressar receptores CCR5 funcionais, elas serão resistentes à infecção porHIV e outros patógenos que utilizam o receptor CCR5 para infectar as célu-las. (Agrawal et ai, Virology 78:2277-2287, 2004; McNichoII et ai, EmergingInfectious Diseases 3: 262-271, 1997, ambos incorporados ao presente porreferência). A diferenciação das células CCR5A32 regenerará o sistema i-mune que voltará a funcionar normalmente, e evitará a infecção subseqüen-te das células imunitárias por patógenos que utilizem o receptor CCR5 comovia para infectar células. Em uma incorporação, o método de regenerar osistema imune também inclui a administração para o paciente de um regimenutricional que melhore as condições para o transplante das células C-CR5A32.

Os principais termos utilizados nesta descrição são definidoscomo segue:

AIDS - Síndrome da imunodeficiência adquirida

Receptor CCR5 - Proteína da superfície da célula que é utiliza-da pelo HIV para infectar as células hospedeiras, freqüentemente referenci-ada como co-receptora porque o HIV também precisa de receptores CD4para infectar uma célula hospedeira.

Receptor CD4 - Proteína da superfície da célula utilizada peloHIV para infectar as células hospedeiras.

Diferenciação - Processo através do qual as células não especi-alizadas adquirem a sua forma e função maduras.

Expressar, expressão - Produção de uma proteína, ou seja, umacélula irá "expressar" uma proteína quando sintetizar aquela; uma proteína,tal como um receptor, é "expressa" quando é sintetizada por uma célula; e"expressão de receptor" é a síntese de uma proteína receptora.

Resposta do enxerto contra a hospedeira - A destruição de célu-las hospedeiras por células do doador que são transferidas para dentro dahospedeira.

HIV - Vírus da imunodeficiência adquiridaHSC - Células-tronco hematopoiéticas - Células-tronco forma-doras de sangue na medula óssea capazes de se diferenciarem em qualquertipo de célula imunitária. As células T e as células B surgem destas células-tronco.

Resposta da hospedeira versus enxerto - A destruição de célu-las do doador que são transferidas para dentro de uma hospedeira pelascélulas imunitárias da hospedeira.

Célula imunitária - Uma célula que é capaz de uma respostaimunitária

Resposta imunitária - Uma resposta que é feita pelo sistemaimune a uma substância estranha, inclui a rejeição de transplantes, produ-ção de anticorpos, inflamações e a resposta a antígenos de linfócitos especí-ficos para antígenos.

Sistema imune - O sistema corporal que protege o corpo desubstâncias, células e tecidos estranhos através da produção de uma res-posta imunitária e que inclui especialmente o timo, baço, nódulos linfáticos,depósitos especiais de tecidos linfóides (como no trato gastrointestinal e namedula óssea), linfócitos incluindo as células T1 as células B e os anticorpos.

Imunossupressão - Prevenção, diminuição ou atraso de umaresposta imunitária.

Célula imunitária madura - Célula do sistema imune que nãopode se diferenciar em outro tipo de célula.

MSC (Mesenchymal Stem Cell) - Célula-tronco mesenquimal -Células-tronco do estroma da medula óssea humana que são células proge-nitoras multipotenciais com a capacidade de gerar cartilagens, ossos, mús-culo, tendões, Iigamentos e tecidos gordurosos.

Nutracêutico - Um alimento ou complemento alimentar que ocor-re naturalmente que é considerado como tendo um efeito benéfico na saúdehumana.

Célula progenitora - Uma célula originada de uma célula-troncopor diferenciação e que é capaz de diferenciação adicional para se transfor-mar em outros tipos de células.

Regenerar - Substituir através da formação de novas células outecidos.

Célula-tronco - Célula indiferenciada que é capaz de propaga-ção contínua e capaz de se diferenciar e se transformar em outras células.

Célula T - Qualquer um dos linfócitos que amadurecem no timoe que são capazes de reconhecer antígenos peptídeos específicos por meiodos receptores nas suas superfícies celulares, também são chamados delinfócitos T.

Transplante - O processo de transferir uma célula do doadorpara um recebedor.

Carga viral - A concentração de vírus na corrente sangüínea.A LINHAGEM DE CÉLULAS CCR5A32A linhagem de células HSC, CCR5A32, é uma linhagem de célu-las-tronco hematopoiéticas humanas originadas de um feto humano e queostentam uma deleção na base de 32 pares no cromossoma 3 na região decodificação do gene CCR5. A deleção está descrita em McNichoII, et ai,Genes hospedeiros e o HIV: o papel do gene receptor de quimiocinas CCR5e do seu alelo (Δ32 CCR5 ), Emerging Infectious Diseases 3 : 261-271,1997, e na patente dos Estados Unidos 6.692.938, ambas incorporadas aopresente pedido de registro por referência.

As células CCR5A32 se diferenciam em células imunitárias fun-cionais que não possuem os receptores CCR5. Uma vez que as células nãopodem produzir o receptor CCR5, os patógenos, tais como o HIV e o vírusda varíola, que precisam do receptor CCR5 para infectar células não podeminvadir estas células e se replicarem dentro delas. Conseqüentemente, apósas HSC CCR5A32 serem transplantadas para um paciente infectado comHIV/AIDS, as células T que se diferenciarem a partir das HSC CCR5A32 se-rão resistentes à infecção por HIV. Com o tempo, as células T infectadas dopaciente irão ser substituídas por células T resistentes originadas das HSCCCR5A32 , reduzindo desta maneira a infecção por HIV e a replicação viral.À medida que o sistema imune regenerado se prolifera, as células imunitá-rias resistentes também ajudam a reparar e regenerar tecidos e órgãos, taiscomo o timo, a medula óssea e os tecidos linfóides, os quais havim sido da-nificados em conseqüência da infecção por HIV, fornecendo assim fontesininterruptas de células imunitárias saudáveis. Além disso, devido ao fato deque o sistema imune é originado das células do doador, transplantes subse-qüentes de HSC do mesmo doador não serão rejeitados pelo sistema imuneregenerado.

REGIME NUTRICIONAL

Em uma modalidade preferencial do método de tratamento, éadministrado um regime nutricional especializado para o recebedor antes,durante e depois dos transplantes de HSC para aperfeiçoar as condiçõesque ajudem a estabelecer as HSC CCR5A32 no recebedor, e para diminuir otrauma associado à imunossupressão. Em indivíduos infectados pelo HIV, oregime nutricional pode diminuir adicionalmente a carga viral. As etapas doregime são (1) administração de nutrientes para melhorar a situação nutri-cional do recebedor, de forma que as células saudáveis disponham de umambiente saudável no qual possam se estabelecer; (2) administração decompostos antimicrobiais para remover e evitar infecções para o recebedor;(3) Administração de nutracêuticos que diminuem a inflamação do recebedorpara realçar o estabelecimento das HSC transplantadas no recebedor; e (4)administração de compostos que estimulam o funcionamento e o tamanhodo timo para permitir a propagação e diferenciação ininterrupta das HSCtransplantadas.

O regime nutricional tem três partes: a fase pré-transplante, osdias de transplante das HSC e a fase pós-transplante. Na fase pré-transplante e nos dias de transplante das HSC, o regime nutricional fica en-focado nas etapas (1) e (2); melhorar o estado nutricional do recebedor dotransplante e eliminar quaisquer infecções que o recebedor tiver. Os com-postos nutrientes administrados para a etapa (1) poderá incluir antioxidantes,tais como o Acetil-1-carnitina, ácido alfalipóico; enzimas tais como a Coen-zima Q10; vitaminas CeE; extrato da tireóide e nutracêuticos, tais comoproteína de soro de leite inalterada, extrato de mirtilo e resveratrol. Os com-postos antimicrobiais administrados para a etapa (2) incluem agentes antimi-crobiais naturais, tais como a substância Alicina, oregabiótico, prata coloidal,óleo de orégano, Artemesia com extrato de sementes cítricas e ozônio.

Na fase pós-transplante, o regime nutricional inclui todas as qua-tro etapas e é administrado a intervalos escolhidos de aproximadamente 30dias por pelo menos quatro meses até um ano após a realização do trans-plante. Durante a fase pós-transplante, os compostos listados acima para asetapas (1) e (2) são novamente administrados e são complementados comcompostos que estimulam o timo e suprimem a inflamação (etapas 3 e 4).Os compostos que estimulam o crescimento e funcionamento do timo incluios ácidos graxos, tais como o ácido linoléico alfa e gama, ácido eicosapen-taenóico (EPA), ácido docosaexaenóico (DHA) e o ácido linoléico; fosfatidil-colina; glutationa; carotenóides; metilcobalamina; agentes estimulantes datireóide, tais como hormônio tiroidal e extratos de tireóide; vitaminas AeD;minerais, tais como zinco, cálcio, magnésio, potássio,cromo, selê-nio.germânio, rubídio; hormônio de crescimento humano; aminoácidos; mo·nofosfato de adenosina; e alquilgliceróis, tais como o óleo de fígado de tuba-rão. Os compostos antiinflamatórios incluem a butrina, casca de canela, cur-cumin, kaprex, RPR, quercitin, ácidos graxos essenciais e vitaminas CeE.

As quantidades terapêuticas de cada um dos compostos dadossão conhecidas por aqueles com qualificação ordinária nesta técnica, e paracada estágio, a quantidade, o composto específico, o método e os horáriosde administração de cada composto poderão ser aperfeiçoados para o rece-bedor.

FASE PRÉ-TRANSPLANTE E FASE DO TRANSPLANTE

Em uma modalidade do regime nutricional, a fase pré-transplante começa dois dias antes do primeiro procedimento de transplante.O mesmo regime também é administrado no dia ou nos dias de transplante.Na fase pré-transplante e na fase de transplante, os compostos a seguir sãoadministrados diariamente para o recebedor por meio de infusão intraveno-sa:

Vitamina C, 50.000 mg por dia

Metocarbamol, 750 mg por dia

Vitamina E, 1.000 unidades por dia

Coenzima Q10, 400 mg por dia

Acetil-1 -carnitina, 3 g por dia

Ácido alfa lipóico, 1.000 mg por dia

Ozônio, 20 ml três vezes por dia

Proteína de prata suave ou proteína coloidal, 5-10 ml adminis-trados em 5% de dextrose em água

Os seguintes compostos são administrados por via oral todos osdias:

Alicina, 450 mg, 3 - 4 vezes por dia

Artemesia, 150 mg por dia

Oregabiótico, 500 mg, 1 - 4 vezes por diaResveratol, 50 - 100 mg por dia

ARMOUR® TIREÓIDE, 0,5 a 1 grão (Forest Pharmaceuticals,Inc.) que seja maior do que 2 mu/ml.FASE PÓS-TRANSPLANTE

Em uma modalidade da fase pós-transplante, cada um doscompostos seguintes é administrado a 20, 29, 61, 90, 118 e 365 dias após otransplante para estimular o timo:

Vitamina C, 50.000 mg por via intravenosaSuper Immune1 500 ml em água intravenosamente. Inclui 25.000mg de vitamina C, 200 mg de B6, 1 cc de complexo B, 10 cc de gluconato decálcio a 10%, 2.000 mg de sulfato de magnésio, 750 mg de ácido pantotêni-co, 15 mg de ácido fólico, 400 pg de selênio, 2 cc de monofosfato de adeno-sina ou 7 cc de Glycyrrhizin1 10 cc de glutationa, 10 cc de taurina 50mg/ml, 2cc de hidroxicobalamina ou metilcobalamina, 2 cc de minerais multi-traços e5 cc de zinco.

Vitamina A, 50.000 u.i., via intramuscularcarotenóides misturados, zinco, 150 mg, via oralfosfatil colina, 500 mg en administração i.v. lenta com 150 mg deglutationa

hormônio de crescimento humano, via subcutâneamonofosfato de adenosina, 40 mg, via intravenosadipiridamole, 50 mg, 2 - 3 vezes por dia, via oralN-acetil citeína, 8.000 mg por dia, via oralbutrina, 3 vezes por dia, via oral

Proteína de soro de leite inalterada, uma colher de sopa, 2 vezespor dia, via oral

L-glutamina, 5g, 3 vezes por dia, via oralL-arginina, 6g, via oralVitamina D3, 10.000 u.i., via intramuscularÁcidos graxos essenciais misturados, 1.000 mg, 3 vezes por dia,via oral

ARMOUR® TIREÓIDE (extrato de tireóide) (Forest Pharmaceuti-cais, Inc.) 1 grão em concentração que seja maior do que 2 mu/ml, via oral

metilcobalamina, 5 mg, 4 vezes por dia, via oral

ácido fólico, 15, mg, via oral

Vitamina E, 1.000 u.i., via oral

Alquilgliceróis, (óleo de fígado de tubarão) 400 mg nos dias 90,118 e 365, via oral

quercitina, 3 vezes por dia, via oral

Kaprex® (Metagenics), 1 tablete, 3 vezes por dia, via oral

Casca de árvore de canela, 3 vezes por dia, via oral

Curcumin, 3 vezes por dia, via oral

IMUNOSSUPRESSÁO

Muito embora seja improvável uma resposta do enxerto contra ohospedeiro em um transplante de HSC que não contenha células T reativas,é possível que haja uma rejeição pelo hospedeiro das células HSC do doa-dor. A rejeição pelo hospedeiro de células transplantadas pode ocorrer emqualquer enxerto alogênico não-combinado. Portanto, é necessário suprimiras células imunitárias do hospedeiro anteriormente ao transplante das HSC.Os recebedores de transplantes da medula óssea geralmente são submeti-dos a métodos tóxicos de imunossupressão tais como a quimioterapia e aradiação para destruir as células hematopoiéticas próprias do recebedor.Estes procedimentos podem causar uma anemia, neutropenia e uma susce-tibilidade maior à infecção. A infecção subseqüente a uma imunossupressãograve pode resultar na morte do recebedor.

Podem ser usados meios menos radicais de imunossupressãoque permitirão o enxerto das células do doador, mas que não destruirão to-das as células hematopoiéticas próprias do recipiente. Sob estas condiçõesde menor gravidade, o recebedor do transplante desenvolve um "quimerismomisto", no qual as HSC do recebedor coexistem com as HSC do doador. Noquimerismo misto, tanto as HSC do doador como as HSC do recebedor sediferenciam no timo e formam células dendríticas que destroem quaisquercélulas T que não reconheçam as HSC do doador como "próprias". Conse-qüentemente, as células T recém formadas são tolerantes aos antígenos deambos o doador e recebedor nas células imunitárias, as células imunitáriasdo indivíduo recebedor não destruirão as células do doador, e os transplan-tes subseqüentes de células da mesma fonte doadora não necessitarão deimunossupressão adicional. (Shizuru, J.A., etal., Purified hematopoietic stemcell grafts induce tolerance to alloantigens and can mediate positive and ne-gative T cell selection (Enxertos de célula-tronco hematopoiética pufiricasinduz a tolerância a aloantígenos e podem mediar a seleção de células Tpositivas e negativa). P.N.A.S USA 97: 9555-9560, 2000; Nikolic, B. et aiMixed hematopoietic chimerism allows cure of autoimmune diabetes throughallogenic tolerance and reversal of autoimmunity (Chimerismo hematopoiéti-co misto permite a cura de diabetes auto-imunes através da tolerância alo-gênica e reversão da auto-imunidade). Diabetes 53:376-383, 2004; Donkier,V., et al., Donor stem cell infusion after non-myeloablative conditioning fortolerance induction to HLA mismatched adult living-donor Iiver graft (Infusãoda célula-tronco do doador após condicionamento não-mieloablativo paraindução da tolerância ao enxerto de fígado de doador vivo adulto de HLAnão compatíveis). TranspL Immunol. 13:139-146, 2004, todas as quais sãoincorporadas ao presente pedido de patente por referência).

Portanto, embora a imunossupressão possa ser alcançada porqualquer método conhecido daqueles que dominam as técnicas, os proce-dimentos menos traumáticos são os preferidos parà incentivar o quimerismomisto e para minimizar o trauma para o recebedor do transplante. Um méto-do de imunossupressão preferido que também suporta o crescimento e de-senvolvimento das células HSC transplantadas é o tratamento de curto pra-zo com micofenolato mofetil em conjunto com a aplicação de Vitamina Deoco-transplante das HSC com células-tronco mesenquimais (MSC). Nestamodalidade, uma dose de 1 - 3 g de micofenolato mofetil é administrada norecebedor por via intravenosa por um período de 2 - 4 horas anteriormenteao transplante em cada dia no qual o transplante das HSC for realizado. A-pós o procedimento final de transplante, é administrada uma dose diária de 1- 3 g de MMF no recebedor por 13 dias. A vitamina D também é administra-da a 50.000 Ul, por via oral todos os dias nos quais o MMF for administrado.As MSC possuem atividade imunossupressiva e parece reforçaro estabelecimento das células HSC do doador no recebedor. Veja K. LeBlanc, et ai, Mesenchymal stem cells inhibit and stimulate mixed Iymphocytecultures and mitogenic responses independently of the major histocompatibi-lity complex. Scandinavian J. Immunol. 57: 11-20, 2003; em A. Bacigalupo,mesenchymal stem cells and hematopoietic transplantation. Best Practice &Research Clinicai Haematology 17: 387-399, 2004; W. E. Fibbe andW.A.Noort, Mesenchymal stem cells and hematopoietic stem cell transplan-tation. Ann. N.Y. Acad, Sei. 996:235-244 (2003), todas as quais são incorpo-radas ao presente pedido de patente por referência.

Nesta modalidade, a MSC pode ser isolada da medula ósseahumana adulta, propagada em cultura e preparada para transplante, confor-me descrito, por exemplo, em K. Le Blanc, et al., Mesenchymal stem cellsinhibit and stimulate mixed Iymphocyte cultures and mitogenic responsesindependently of the major histocompatibility complex (Células-tronco me-senquimais inibem e estimulam as culturas de linfócitos mistas e respostasmitogênicas independentemente do complexo de histo-compatibilidade prin-cipal). Scandinavian J. Immunol. 57: 11-20, 2003; O.N. Koç, et al, Allogeneicmesenchymal stem cell infusion for treatment of metachromatic Ieukodystro-phy (MLD) (Infusão alogênica da célula-tronco mesenquimal para tratamentode Ieucodistrofia metacromática (MLD) e da Síndrome de Hurler (MPS01H).Bone Marrow Transplantation (Transplante da Medula Óssea) 30: 215-222,2002; Kern, S. et al., Comparative Analysis of mesenchymal stem cells frombone marrow, umbilical cord blood or adipose tissue. (Análise comparativadas células-tronco mesenquimais da medula óssea, sangue do cordão umbi-lical ou tecido adiposo). Stem Cells (Células-tronco) 24: 1294 -1301, 2006; erevisado em A. Bacigalupo, Mesenchymal stem cells e haematopoietic stemcell transplantation (Transplante de células-tronco mesenquimais e células-tronco hematopoiéticas). Best Practice & Research Clinicai Haematology(Melhor Prática e Hematologia Clínica de Pesquisa) 17: 387- 399, 2004. AMSC também está disponível comercialmente para pesquisa de transplanteatravés de bancos de células-troncos, tais como o Cambrex Bio ScienceRockland1 Inc., Rockland, Maine.

Outros métodos de imunossupressão que podem ser usadosincluem mas não estão limitados a: radiação, administração de agentes qui-mioterapêuticos tais como a ciclosporina, busulfan, ciclofosfamida, metotre-xato e administração de alemtuzumab ou outros anticorpos. Preferencial-mente, os métodos da presente invenção são realizados de uma forma quereduza ou elimine a necessidade do uso de qualquer radiação no indivíduo.

TRANSPLANTE DE CCR5A32 HSC

O CCR5A32 HSC pode ser transferido por qualquer método a-dequado conhecido na técnica, tal como perifericamente; pela injeção intra-medula óssea (ex: Castello et al., Intrabone marrow injection of bone marrowand cord blood cells: An alternative way of transplantation associated with ahigher seeding efficiency. (Injeção intramedula óssea de células da medulaóssea e do sangue do cordão: uma forma alternativa de transplante associa-da com uma eficiência de semeadura maior). Experimental Hematology(Hematologia Experimental) 32: 782-787, 2004, por qualquer método padrãode injeção intratecal, por injeção intratímica (ex: Trani et al, CD25+ immunor-regulatory CD4 T Cells mediate aquired central transplantation tolerance (To-lerância imunológica central adquirida mediada por células TCD4 + CD25+).J. Immunology MO: 279 - 286, 2003); por injeção direta no órgão ou por ou-tro método adequado. Combinações de diversos métodos podem ser usadaspara transplantes sucessivos para aumentar a probabilidade de que o HSCconsiga se estabelecer no recebedor.

Serão realizados transplantes seriais de CCR5A32 HSC paraaumentar a probabilidade do estabelecimento das células transplantadas eregeneração do sistema imune do recebedor. Será necessária imunossu-pressão para os primeiros transplantes seriais de CCR5A32 HSC para pro-mover o quimerismo, mas ela pode não ser exigida para os transplantes pos-teriores de CCR5A32 HSC. Em uma forma e execução, o CCR5A32 HSCserá transplantado a cada dia durante três dias consecutivos e podem serempregados diferentes métodos de transplante em cada dia de transplante.Por exemplo, os transplantes periféricos e IBMI podem ser realizados nomesmo dia, ou o IBMI pode ser usado para o primeiro transplante, e a inje-ção intratímica ou o transplante periférico pode ser usado para o segundo eterceiro transplantes.

Os transplantes posteriores de CCR5A32 HSC podem, maisuma vez, serem feitos um ano depois, se necessário. A quantidade de trans-plantes e a forma de administração do CCR5A32 HSC podem ser aperfeiço-adas para cada recebedor.

TRANSPLANTE DE CCR5A32 HSC NA MEDULA ÓSSEA (IBMI)

Em uma forma e execução, o transplante de CCR5A32 HSC po-de ser realizado todos os dias durante três dias consecutivos. Pelo menosum dos três transplantes de CCR5A32 HSC é realizado na medula óssea. Orecebedor é anestesiado usando tanto a infiltração local e procedimentos deanalgésico / anestesia geral leves. Uma cânula da medula óssea é usadapara penetrar a medula óssea através do esterno ou outro local da medulaóssea. Aproximadamente 4 χ 105 a 1 χ 106 CCR5A32 HSC em 1 ml de umasolução de PBS a 95% + DMSO a 5% são injetados na medula óssea.

VIAS ALTERNATIVAS DO TRANSPLANTE DE CCR5A32 HSC

Em outra forma e execução, pode-se usar a injeção tímica comométodo alternativo de transplante para CCR5A32 HSC. O recebedor é pre-parado conforme descrito para IBMI. Usa-se ultra-som para guiar uma agu-" lha no timo, e aproximadamente 1-10 χ 106 CCR5A32 HSC é injetado dire-tamente no timo. Durante este procedimento cirúrgico, 2-10 χ 106 MSC em 1ml de uma solução de PBS a 95% + DMSO a 5% são transplantados intra-venosamente no recebedor.

O CCR5A32 HSC também pode ser transplantado periferica-mente de acordo com os métodos conhecidos. Para este procedimento, cé-lulas 7-9 χ 106 CCR5A32 HSC são administradas intravenosamente.

CO-TRANSPLANTE DE MSC

Em uma forma e execução preferencial, as MSC são transplan-tadas ao mesmo tempo em que as células CCR5A32 HSC. Durante esteprocedimento cirúrgico, 3 χ 106 MSC são suspensas em 100 ml de salinanormal a 0,9% e transplantados intravenosamente no recebedor.MONITORAMENTO DO RESULTADO

A análise do polimorfismo de nucleotídeo único (SNP - SingleNucleotide Polymorphism) pode ser usada para monitorar a taxa das célulassangüíneas do doador:recebedor após o transplante de HSC para verificar aformação de quimerismo, ou seja, que hajam células imunitárias tanto nodoador quanto no recebedor. A análise de SNP pode ser realizada de acordocom Harries L., et al., Analysis of haematoipoetic chimaerism by quantitativereal-time polymerase chain reaction. (Análise de quimerismo hematopoéticopela resposta quantitativa em tempo real da cadeia de polimerase) BoneMarrow Transplantation (Transplante de Medula Óssea) 35: 283 - 290,2005. A diferenciação da HSC do doador pode ser monitorada pela citome-tria de fluxo objetivando os receptores CD8, CD4 e CD45RA. Um aumentorelativo nos receptores de CD4 e CD45RA indica diferenciação de HSC. Oresultado da célula T tímica pode ser medido pela quantificação de TREC -T cell Receptor Excision Circles (círculos de excisão do Receptor da célulaT), conforme descrito, por exemplo, em Weinberg, K. et al., Factors affectingthymic function after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (Fato-res que afetam a função tímica após o transplante alogênico de células-troncos hematopoiéticas). Transplantation (Transplante) 97: 1458 -1466,2001.

Espera-se que um sistema imune funcional seja regenerado apartir de CCR5A32 HSC e seja mantido. A saúde do recebedor melhorará eos sintomas da AIDS/HIV devem diminuir. Embora o recebedor ainda tenhao HIV1 a carga viral deve diminuir suficientemente para impedir sintomas de-bilitadores.

Embora o transplante de CCR5A32 HSC esteja sendo usadopara tratar pacientes com AIDS, as células também podem ser úteis nocombate a doenças causadas por outros patogênicos que usam o receptorCCR5 para invadir as células. Por exemplo, ratos com deficiência de CCR-5não desenvolvem a tuberculose quando infectados por Mycobacterium tu-berculosis, ao contrário, eles produzem uma resposta imunitária protetora àinfecção que impede o desenvolvimento da doença. (Algood, H.M.S. e Flynn,J.L., CCR5-deficient mice control Mycobactereium tuberculosis infectiondespite increased pulmonary Iymphocytic infiltration [Ratos com deficiênciade CCR-5 controlam a infecção por Mycobacterium tuberculosis apesar dainfiltração Iinfocitica pulmonar]. J. Immunol. 173: 3287- 3296. 2004, aqui in-corporado por referência). Além disso, acredita-se que a mutação de C-CR5A32 evoluiu como um mecanismo protetor contra a varíola. (Galvani,A.P. e Slatkin, M. Evaluating plague e smallpox as historical selective pres-sures for the CCR5A32 HlV-resistance allele (Avaliação de praga e varíolacomo pressões seletivas históricas para o alelo resistente ao HIV C-CR5A32). P.N.A.S. USA 100: 15276 -15279, 2003, aqui incorporado por re-ferência).

EXEMPLOS

1. DESENVOLVIMENTO E MANUTENÇÃO DA LINHAGEM DA CÉLULACCR5A32

De acordo com um método para isolar e purificar a linhagem dacélula, ela pode ser isolada, purificada e expandida a partir do tecido do fí-gado fetal que é homozigoto para a deleção do par de bases 32 no genereceptor do CCR5. Usando este método e técnicas de isolamento de célulapadrão, o tecido do fígado fetal foi pressionado através de uma peneira demalha de fios para separar as células que, então, foram colocadas em cultu-ra. As HSC foram purificadas das células do fígado pela cultura e expansãono meio seletivo em duas a três passagens, usando técnicas de cultura detecido padrões. O meio seletivo ("meio CCR5A32") compreendeu o meio deEagle modificado de Dulbecco 1X com glicose e L-glutamina, 29,4% de sorobovino fetal (FBS), penicilina/estreptomicina, fator inibidor de linfócito (LIF)20 ng/ml, fator de crescimento de fibroblastos básico (FGF) 100 ng/ml, e fa-tor da célula-tronco (SCF) 4 ng/ml. O meio é complementado com 4,2% deaminoácidos não essenciais, 2,34 mg/ml L-glutamina, 2,22 mg/ml 2-mercaptoetanol e 0,22 mg/ml piruvato de sódio. O pH do meio foi mantidosubstancialmente em 7.4.

O meio CCR5A32 também foi usado para a propagação das cé-lulas CCR5A32. Usando técnicas de cultura de células bem conhecidas, ascélulas foram laminadas em 1,8 χ 105 células/cm2 em um frasco de 75 cm2com uma tampa de ventilação de micrômetro de 0,2. As culturas foram man-tidas a 37°C em uma incubadora umidificada contendo 95% de ar e 5% CO2e teve a subcultura realizada antes da confluência.

As células foram extraídas do meio por diálise para uso ou paraarmazenamento. O meio contendo as células foi colocado em um tubo dediálise de 250.000 MWCO e a diálise foi realizada contra uma solução salinatamponada com fosfato (PBS). Para o armazenamento de longo prazo, ascélulas são congeladas em 95% PBS / 5% DMSO e armazenadas em nitro-gênio líquido.

Embora ilustrada e descrita aqui com referência a determinadascorporificações específicas, esta invenção não pretende, porém, se limitaraos detalhes apresentados. Ao contrário, podem ser feitas diversas modifi-cações nos detalhes dentro do escopo e variação de equivalentes das rei-vindicações e sem se desviar dos princípios da invenção.

Claims (16)

1. Linhagem de células-troncos hematopoiéticas purificada e iso-lada compreendendo células-troncos hematopoiéticas incapazes de expres-sar um receptor CCR5 de superfície da célula funcional.

2. Método de regenerar um sistema imune em um indivíduo ne-cessitado de regeneração, compreendendo o transplante para o indivíduo deuma grande quantidade de células-troncos hematopoiéticas isoladas e purifi-cadas incapazes de expressar um receptor de superfície CCR5 funcional.

3. Método de regenerar um sistema imune em um indivíduo ne-cessitado de regeneração, compreendendo o transplante para o indivíduo decélulas-troncos hematopoiéticas como definido na reivindicação 1, em queas células transplantadas se diferenciam em células imunes maduras.

4. Método de acordo com a reivindicação 2 ainda compreenden-do a administração, para o indivíduo, de um regime nutricional compreen-dendo um ou mais compostos que melhoram a condição nutricional do indi-víduo e um ou mais compostos antimicrobianos.

5. Método de acordo com a reivindicação 2, 3 ou 4 ainda com-preendendo a administração para o indivíduo, após a etapa de transplante,de um regime nutricional compreendendo um ou mais compostos que me-lhoram a condição nutricional do indivíduo, um ou mais compostos antimi-crobianos, um ou mais compostos antiinflamatórios e um ou mais compostosque estimulam um ou ambos o crescimento e função em um timo do indiví-duo.

6. Método de tratar um indivíduo infectado com HIV, compreen-dendo o transplante, para o indivíduo, de uma grande quantidade de células-troncos hematopoiéticas isoladas e purificadas incapazes de expressaremum receptor de superfície CCR5 funcional, em que as células transferidas sediferenciam em células imunitárias maduras.

7. Método de regenerar um sistema imune em um indivíduo in-fectado com o HIV, compreendendo o transplante, para o indivíduo, de célu-las-troncos hematopoiéticas como definidas na reivindicação 1, em que ascélulas transplantadas se diferenciam em células imunitárias maduras.

8. Método de acordo com a reivindicação 6, ainda compreen-dendo a administração para o indivíduo de um regime nutricional que com-preende um ou mais compostos que melhoram a condição nutricional doindivíduo e um ou mais compostos antimicrobianos.

9. Método de acordo com as reivindicações 6, 7 ou 8, aindacompreendendo a administração para o indivíduo, após a etapa de trans-plante, de um regime nutricional que compreende um ou mais compostosque melhoram a condição nutricional do indivíduo, um ou mais compostosantimicrobianos, um ou mais compostos antiinflamatórios e um ou maiscompostos que estimulam um ou ambos dentre o crescimento e o funciona-mento do timo de um indivíduo.

10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de-2 a 4 compreendendo adicionalmente a etapa de tratar o indivíduo com umagente imunossupressor ou com um regime de radiação.

11. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de-2 a 4, compreendendo adicionalmente a etapa de tratar o indivíduo com umagente imunossupressor consistindo de micofenolato mofetil ou ciclosporinaA.

12. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de-2 a 4, no qual o transplante é realizado por um procedimento escolhido den-tre o grupo consistindo em administração periférica, injeção intramedular,injeção intratímica e injeção intratecal.

13. Método de acordo com a reivindicação 2 ou 4, no qual ascélulas-tronco hematopoiéticas são células CCR5A32.

14. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de-2 a 4, compreendendo adicionalmente o transplante de uma grande quanti-dade de células-tronco mesenquimais para o indivíduo.

15. Método de acordo com a reivindicação 14, no qual as célu-las-tronco mesenquimais são originadas da medula óssea ou do sangue dõcordão umbilical.

16. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de-2 a 4, compreendendo adicionalmente o monitoramento da diferenciação