BRPI0612833A2 - composição imunogênica, vacina, composição farmacêutica, polipeptìdeo de fusão e uso das três primeiras - Google Patents

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Abstract

COMPOSIçãO IMUNOGêNICA, VACINA, COMPOSIçãO FARMACEUTICA, POLIPEPTIDEO DE FUSãO E USO DAS TRêS PRIMEIRAS. A presente invenção refere-se a uma composição imunogênica, vacina ou composição farmacêutica para a prevenção, reforço ou tratamento de infecção causada por uma espécie do complexo de tuberculose (M. tuberculosis, M. bovis, M. africanum, M. microti). A composição imunogênica, vacina ou composição farmacêutica compreende um polipeptídeo de fusão, que compreende um ou mais antígenos de inanição de M. tuberculosis, as unidades do polipeptideo de fusão sendo antigenos de M. tuberculosis. Além disso, a invenção é relacionada ao uso de uma vacina que compreende uma seqUência de polipeptídeo de fusão ou uma seqüência de ácido nucléico da invenção fornecida ao mesmo tempo como BCG, misturada com BCG ou administrada separadamente em sítios ou vias diferentes para a preparação de dita composição imunogênica, vacina ou composição farmacêutica.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "COMPOSI-ÇÃO IMUNOGÊNICA, VACINA, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, POLI-PEPTÍDEO DE FUSÃO E USO DAS TRÊS PRIMEIRAS".
CAMPO DA INVENÇÃO
A presente invenção refere-se a antígenos induzidos por inanição ounovos polipeptídeos de fusão de polipeptídeos imunogênicos com base nos poli-peptídeos derivados de Mycobacterium tuberculosis induzidos durante a inanição,o uso de um ou mais dos polipeptídeos de fusão ou antígenos induzidos por inani-ção da invenção para a preparação de uma composição imunogênica, vacina oucomposição farmacêutica a ser usada para administração a uma pessoa / animal eas composições imunogênicas, vacinas ou composições farmacêuticas como tais.
ANTECEDENTES GERAIS
A tuberculose humana causada por Mycobacterium tuberculosis(M. tuberculosis) é um problema grave de saúde global, responsável por a-proximadamente 3 milhões de mortes anuais, de acordo com a WHO. A inci-dência mundial de novos casos de tuberculose (TB) foi decrescente duranteos anos de 60 e 70, mas durante os últimos anos esta tendência tem marca-damente se modificado em parte devido ao advento da AIDS e do surgimen-to de cepas resistentes a múltiplos fármacos de M. tuberculosis.
A única vacina atualmente disponível para uso clínico é a BCG,uma vacina cuja eficácia permanece uma matéria de controvérisa. A BCGgeralmente induz um nível elevado de resistência adquirida em modelos a-nimais de TB, e em seres humanos é protetora contra formas disseminadasde tuberculose tais como meningite e tuberculose miliar. Quando administra-da em crianças novas é protetiva contra a tuberculose durante anos, masdepois a eficácia se desvanece. A comparação de vários testes controladosrevelou que a eficácia de proteção da BCG em adultos variou dramaticamen-te com uma faixa de eficácia de ineficaz à 80 % de proteção. Isto torna odesenvolvimento de uma nova e melhorada vacina contra a M. tuberculosisum assunto urgente, que foi dada uma prioridade muito elevada pelo WHO.
Muitas tentativas de definir as substâncias micobacterianas pro-tetoras têm sido feitas, e diferentes investigadores têm relatado resistênciaaumentada após a vacinação experimental. A M. tuberculosis possui, assimcomo secreta, várias proteínas de relevância potencial para a geração deuma nova vacina de M. tuberculosis. A pesquisa de moléculas candidatastem principalmente focalizado sobre as proteínas liberadas de bactérias divi-soras. A despeito da caracterização de um grande número de tais proteínas,apenas algumas destas foram demonstradas de induzir uma resposta imuneprotetiva como vacinas de subunidade em modelos animais, mais notavel-mente ESAT-6 e Ag85 (Brandt et al 2000). No entanto, a demonstração deuma resposta imune protetiva a longo prazo específica com a potência deBCG ou a capacidade de reforço em uma pessoa vacinada com BCG aindanão foi alcançada. Na melhor das hipóteses, o reforço de BCG com BCGnão possui nenhum efeito [Colditz 1994], O reforço de BCG tem sido feitocom Ag85a (Brooks et al IAI 2001; WO 0204018) em uma cepa de camun-dongo congênita que leva a alguma proteção, embora comparado com aBCG isoladamente não foi significativamente melhor. Visto que a BCG ne-cessita dividir e secretar proteínas de modo a induzir uma resposta imuneprotetiva, a falta de efeito reforçador é principalmente devido à sensibilizaçãocom as micobactérias ambientais ou uma resposta imune residual da vaci-nação de BCG primária. Ambos os eventos levam a uma rápida respostaimune contra a BCG e, portanto, inibição rápida do desenvolvimento e elimi-nação da BCG.
O curso de uma infecção de M. tuberculosis segue essencial-mente através de 3 fases. Durante a fase aguda, as bactérias proliferam nosórgãos, até que a resposta imune aumenta. Os linfócitos CD4 T especifica-mente sensibilizados media o controle da infecção, e a molécula mediadoramais importante parece ser o interferon gama (INF-gama). As cargas bacte-rianas começam a declinar e uma fase latente é estabelecida onde a cargabacteriana é mantida estável em um nível baixo. Nesta fase a M. tuberculo-sis vai da multiplicação ativa à latência, essencialmente se tornando não-replicativa e permanecendo dentro do granuloma. Em alguns casos, a infec-ção vai até fase de reativação, onde as bactérias latentes começam a sereplicar novamente. Foi sugerido que a transição de M. tuberculosis da in-fecção primária até a latência é acompanhada por mudanças na expressãogenética (Honer zu Bentrup1 2001). É também provável que as mudanças naespecificidade de antígeno da resposta imune ocorram, quando as bactériasmodulam a expressão genética durante a sua transição de replicação ativa àlatência. A natureza completa de resposta imune que controla a infecçãolatente e os fatores que levam à reativação são grandemente desconheci-dos. No entanto, existe alguma evidência para uma mudança nos tipos celu-lares dominantes responsáveis. Embora as células CD4 T sejam essenciaise suficientes para o controle da infecção durante a fase aguda, estudos su-gerem que as respostas celulares CD8 T são mais importantes na fase la-tente.
Em 1998 Cole et al publicaram a seqüência do genoma comple-to de M. tuberculosis e prognosticou a presença de aproximadamente 4000estruturas de leitura abertas (Cole et al 1998) que apresentam seqüênciasde nucleotídeo e seqüências de proteína putativas. No entanto, de maneiraimportante, esta informação de seqüência não pode ser usada para predizerse o DNA é traduzido e expresso como proteínas in vivo. É sabido que al-guns genes de M. tuberculosis são supra-regulados sob condições que imi-tam a latência. Além do mais, como uma pessoa versada na técnica facil-mente observará, a expressão de um gene não é suficiente para produzir umbom candidato a vacina. O único meio de determinar se uma proteína é re-conhecida pelo sistema imune durante a infecção latente com M. tuberculo-sis é produzir a proteína dada e testá-la em um ensaio apropriado como aquidescrito. Várias proteínas são de importância particular e possuem potencialpara serem antígenos tardios (antígenos reconhecidos durante a infecçãolatente) visto que eles são principalmente expressos durante um tempo rela-tivamente longo após infecção onde o sistema imune monta a primeira defe-sa adaptável e o meio ambiente se torna mais hostil para as micobactérias.
As condições de cultura hipóxica in vitro, que imitam as condições de tensãode oxigênio baixa, foram anteriormente sugeridas como relevante a esterespeito e foram usadas para analisar as mudanças na expressão genética.Vários antígenos foram observados que são induzidos ou marcadamentesupra-regulados sob estas condições, por exemplo, o antígeno α-cristalino16 kDa (Sherman 2001), Rv2660c e Rv2659c (Betts, 2002). (nosso própriopedido) Outros estímulos ambientais que podem ser de interesse particular éa inanição designada para considerar que os nutrientes são restritos no gra-nuloma (o local da infecção latente) e que os produtos expressos por genessupra-regulados sob inanição portanto podem ser de interesse particularcomo alvos antígenos durante o estágio latente de infecção.
Dos mais que 200 centenas de antígenos conhecidos de seremexpressos durante a infecção primária, e testados como vacinas, menos doque uma meia dúzia têm demonstrado potencial significativo. Até agora ape-nas um antígeno foi mostrado de ter qualquer potencial como uma vacinaterapêutica (Lowrie, 1999). Entretanto, esta vacina somente opera se admi-nistrada como uma vacina de DNA e tem se mostrado controverso, com ou-tros grupos que reivindicam que a vacinação usando este protocolo induz aproteção não específica ou ainda piora a doença (Turner, 2000). Ao contrá-rio, os polipeptídeos de fusão descritos na invenção podem ser incorporadosem uma vacina que usa a tecnologia de vacinação bem-reconhecida, comodemonstrado nos exemplos fornecidos.
Além disso, visto que as vacinas de TB não resultam na esterili-zação da imunidade, mas de preferência controlam a infecção em um nívelsubclínico (desse modo resultando no subseqüente estabelecimento de in-fecção latente), uma vacina de múltiplas fases que combina componentescom atividade profilática e terapêutica é descrita nesta invenção. Após a va-cinação profilática convencional, a evasão da resposta imune primária e osubseqüente desenvolvimento de doença latente é provavelmente pelo me-nos em parte devido à mudança no perfil antigênico das bactérias invasoras.
Assim, a vacinação com antígenos associada com a TB latente deve impedirou reduzir o estabelecimento de infecção latente e, portanto, uma vacina queincorpora antígenos expressos pelas bactérias tanto na primeira fase decrescimento logarítmico quanto durante a doença latente deve melhorar aimunidade a longo prazo quando usada como uma vacina profilática. Uma talvacina de múltiplas fases obviamente também será eficiente como uma va-cina terapêutica, desse modo tratando o problema de que a maioria da popu-lação no terceiro mundo que receberia uma vacina de TB futura já estariaIatentemente infectada.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
A invenção é relacionada a uma composição imunogênica, vaci-na ou composição farmacêutica para a prevenção (incluindo vacinação re-forçadora e vacinas de múltiplas fases) e/ou tratamento de infecção causadapor uma espécie do complexo de M. tuberculosis (M. tuberculosis, M. bovis,M. africanum etc.), a composição imunogênica, a vacina ou a composiçãofarmacêutica compreendendo antígeno induzido por inanição ou um polipep-tídeo de fusão que compreende um ou mais antígenos de M. tuberculosisinduzidos por inanição, as unidades do polipeptídeo de fusão sendo antíge-nos de M. tuberculosis. Da mesma forma, a invenção se refere aos polipep-tídeos de fusão como tais e a uma seqüência de ácido nucléico que codificaum tal polipeptídeo de fusão. Além disso, a invenção se refere ao uso depeptídeo(s) de superposição ou não superposição curtos ou longos produzi-do) sinteticamente ou recombinante(s). Além disso, a invenção diz respeitoao uso de antígeno induzido por inanição ou uma seqüência de polipeptídeode fusão ou seqüência de ácido nucléico da invenção para a preparação dedita composição imunogênica, vacina, ou composição farmacêutica e a vaci-na ou composição farmacêutica produzida desta maneira. Ademais, a inven-ção diz respeito ao uso de uma vacina que compreende um antígeno induzi-do por inanição ou uma seqüência de polipeptídeo de fusão ou seqüência deácido nucléico da invenção dada ao mesmo tempo como BCG1 ou misturadacom BCG ou administrada separadamente em diferentes sítios ou vias paraa preparação de dita composição imunogênica, vacina ou composição far-macêutica. Ainda a invenção se refere ao uso de uma vacina compreenden-do um antígeno induzido por inanição ou uma seqüência de polipeptídeo defusão ou seqüência de ácido nucléico fornecida como um reforçador deBCG. Além disso, mediante a inclusão de antígenos que são expressos tan-to no início quanto no fim durante uma infecção natural a vacina levará auma resposta imune de duas etapas possibilitando que o sistema imunecombata o agente patológico com qualquer dos epítopos que sejam os maiseficientes em um certo ponto de tempo inclusive durante a latência.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
A presente invenção descreve composições imunogênicas, umavacina ou uma composição farmacêutica que compreende um antígeno in-duzido por inanição ou um polipeptídeo de fusão compreendendo um oumais antígenos induzidos por inanição.
As seqüências de aminoácido e ácido nucléico destes antígenosinduzidos por inanição (mais do que 6,5 vezes supra-reguladas durante ainanição ou geneticamente ligadas à um gene induzido por inanição) apare-cem da listagem de seqüência como se segue:
<table>table see original document page 7</column></row><table><table>table see original document page 8</column></row><table>
No presente contexto o polipeptídeo imunogênico individual combase em polipeptídeos derivados de M. tuberculosis é denominado uma "u-nidade" do polipeptídeo de fusão. A fusão pode compreender 2, 3, 4, 5, 6, 7,8, 9 ou mesmo 10 unidades diferentes.
A ordem das unidades do polipeptídeo de fusão pode ser qual-quer combinação. Em termos de ordem, os polipeptídeos de fusão de todosos antígenos acima em qualquer combinação estão dentro do escopo dapresente invenção. Os polipeptídeos de fusão da invenção são úteis para apreparação de uma composição imunogênica, vacina ou composição farma-cêutica, em particular uma vacina de reforço de BCG, como será descritocom detalhe no que segue.
As unidades de preparação dos polipeptídeos preferidos dospolipeptídeos de fusão juntamente com os polipeptídeos de inanição possu-em o seguinte número de identidade Sanger e seqüências de aminoácido:
<table>table see original document page 9</column></row><table><table>table see original document page 10</column></row><table>
As combinações preferidas de polipeptídeos de fusão compre-endem os seguintes polipeptídeos em várias combinações em ordem de u-nidades com um ou mais antígenos induzidos por inanição (X): ESAT6-Ag85A-X, ESAT6-Ag85B-X, Ag8A-X, Ag85B-X, TB10-Ag85A-X, TB10-Ag85B-X onde X é qualquer um dos antígenos induzidos por inanição e ondea ordem das unidades de antígenos pode ser de qualquer combinação, porexemplo, onde a ordem for invertida ou X é posicionado no centro etc.
Mas o polipeptídeo de fusão pode ser construído de qualqueroutra combinação de um ou mais antígeno induzido por inanição com um oumais antígeno de M. tuberculosis.
Dentro do escopo da presente invenção está um análogo de umpolipeptídeo de fusão que possui uma seqüência de aminoácido com umaidentidade de seqüência de pelo menos 80 % de qualquer parte de qualquerum dos polipeptídeos de fusão da invenção e que é imunigênico, e uma se-qüência de ácido nucléico que codifica tal polipeptídeos. Tais análogos estãocompreendidos dentro do termo "polipeptídeo da invenção" ou "polipeptídeode fusão da invenção" cujos termos são usados de modo trocável em todo orelatório descritivo e reivindicações. Pelo termo "seqüência de ácido nucléicoda invenção" significa uma seqüência de ácido nucléico que codifica um talpolipeptídeo. Ainda dentro do escopo da presente invenção estão os peptí-deos curtos ou longos de superposição ou não superposição que possuiuma seqüência de aminoácido com uma identidade de seqüência de pelomenos 80 % a qualquer um dos polipeptídeos de fusão da invenção e que éimunogênico.
Uma modalidade atualmente preferida da invenção é uma vacinapara reforçar a imunidade da vacinação de BCG anterior, isto é, vacina éadministrada aos indivíduos anteriormente vacinados com BCG.
Este primeiro aspecto da invenção compreende uma variante doantígeno induzido por inanição ou polipeptídeo de fusão mencionado acimaque é submetido a lipídeo de modo a deixar um efeito auto-ajudante do poli-peptídeo.
A composição imunogênica, vacina ou composição farmacêuticada invenção pode ser administrada pela liberação mucosal, por exemplo,oral, nasal, bucal, ou tradicionalmente intramuscular, intradérmica, por inje-ção subcutânea ou transdermicamente ou qualquer outra via adequada, porexemplo, retalmente.
Em uma outra modalidade, a invenção descreve o uso de umantígeno induzido por inanição ou um polipeptídeo de fusão como definidoacima para a preparação de uma composição imunogênica, vacina o com-posição farmacêutica que pode ser usada para uma vacinação profiláticajuntamente com BCG, uma vacina reforçadora ou vacinação terapêutica con-tra uma infecção causada por uma micobactéria virulenta, por exemplo, porMicobacterium turberculosis, Micobacterium afrieanum, Mieobaeterium bovis,Mieobaeterium lepra ou Mieobaeterium uieerans.
Em um segundo aspecto, a invenção descreve uma composiçãoimunogênica, vacina ou composição farmacêutica que compreende uma se-qüência de nucleotídeo que codifica um antígeno induzido por inanição ouum polipeptídeo de fusão como definido acima, ou compreende uma se-qüência de ácido nucléico complementar a esta que é capaz de hibridizarcom a seqüência de ácido nucléico da invenção sob condições severas.
O fragmento de ácido nucléico é preferivelmente um fragmentode DNA. O fragmento pode ser usado como um produto farmacêutico comodebatido no que se segue.
Em uma modalidade, a invenção descreve uma composição i-munogênica, vacina ou composição farmacêutica que compreende um frag-mento de ácido nucléico de acordo com a invenção, opcionalmente inseridoem um vetor. A expressão in vivo resultante da vacina de antígeno por umanimal, incluindo um ser humano, a quem a vacina foi administrada, a quan-tidade de antígeno expresso sendo eficaz par conferir resistência substanci-almente aumentada à tuberculose causada por micobactérias virulentas, porexemplo, Micobacterium turbereulosis, Micobaeterium afrieanum, Mieobaete-rium bovis, Mieobaeterium lepra ou Mieobaeterium uleerans, em um animal,incluindo um ser humano.
Em uma outra modalidade, a invenção apresenta o uso de umacomposição imunogênica, vacina ou composição farmacêutica que compre-ende um fragmento de ácido nucléico de acordo com a invenção para a va-cinação terapêutica contra a tuberculose causada por uma micobactéria viru-lenta.
Em mais uma outra modalidade, a invenção descreve uma com-posição imunogênica, vacina ou composição farmacêutica que pode ser u-sada para a vacinação profilática juntamente com BCG ou como uma vacinareforçadora à uma pessoa anteriormente vacinada com BCG para imuniza-ção de um animal, incluindo um ser humano, contra a tuberculose causadapor uma micobactéria virulenta, por exemplo, Mieobaeterium turbereulosis,Mieobacterium afrieanum, Mieobaeterium bovis, Mieobaeterium lepra ou Mi-eobaeterium uleerans, compreendendo como o componente eficaz um mi-croorganismo não-patogênico, tal como vacínia, adenovírus ou Micobacteri-um bovis BCG, em que pelo menos uma cópia de um fragmento de DNAcompreendendo uma seqüência de DNA que codifica um polipeptídeo defusão como definido acima foi incorporado no microorganismo (por exemplo,colocado em um plasmídeo ou no genoma) em uma maneira que permite omicroorganismo se expressar e opcionalmente secretar o polipeptídeo defusão.
Em uma outra modalidade, a invenção descreve um vetor deexpressão infeccioso, tal como vacínia, adenovírus ou Micobacterium bovisBCG que compreende um fragmento de ácido nucléico de acordo com a in-venção, e uma célula transformada que abriga pelo menos um tal vetor.
Em um terceiro aspecto, a invenção apresenta um método paraa imunização e reforço da imunidade de um animal, incluindo um ser huma-no, contra a tuberculose causada por micobactérias virulentas, por exemplo,Micobacterium turberculosis, Micobacterium africanum, Micobacterium bovis,Mieobaeterium lepra ou Mieobaeterium uleerans, o método compreendendoa administração ao animal do polipeptídeo de fusão como definido acima, acomposição imunogênica de acordo com a invenção, ou a vacina de acordocom a invenção.
Em um quarto aspecto, a invenção descreve um método para otratamento de um animal, incluindo um ser humano, tendo tuberculose, ativaou latente, causada por micobactérias virulentas, por exemplo, por Micobac-terium turberculosis, Mieobaeterium africanum, Micobacterium bovis, Mico-bacterium lepra ou Micobacterium uleerans, o método compreendendo aadministração ao animal da composição imunogênica, vacina ou composiçãofarmacêutica como definido acima.
Em um quinto aspecto, a invenção apresenta o uso de um antí-geno induzido por inanição ou um polipeptídeo de fusão ou um fragmento deácido nucléico como definido acima para a preparação de uma composiçãoimunogênica, vacina ou composição farmacêutica em combinação com M.bovis BCG, por exemplo, para uma vacinação profilática (incluindo reforço)ou terapêutica contra uma infecção causada por uma micobactéria virulenta,por exemplo, por Micobacterium turberculosis, Micobacterium africanum,Micobacterium bovis, Micobacterium lepra ou Micobacterium uleerans.
A vacina, composição imunogênica, vacina e composição farma-cêutica de acordo com a invenção podem ser usadas profilaticamente emum indivíduo não-infectado com uma micobactéria virulenta ou em um indi-víduo anteriormente vacinado com M. tuberculosis BCG ou terapeuticamenteem um indivíduo infectado com uma micobactéria virulenta.
Deve ficar entendido que as modalidades do primeiro aspecto dainvenção, tais como os polipeptídeos imunogênicos descritos, também seaplicam a todos os outros aspectos da invenção; e vice versa.
Em todo este relatório descritivo, a não ser que o contexto re-queira de outra maneira, a palavra "compreendem" ou suas variações taiscomo "compreende" ou "compreendendo", será compreendido por implicar ainclusão de um elemento determinado ou a inteireza ou grupo de elementosou todos.
DEFINIÇÕES
Inanição
Pelo termo "inanição" é compreendido privar um organismo desua fonte de carbono, nitrogênio ou energia, qualquer combinação do acimaou mesmo todos eles.
Proteínas induzidas por inanição
Pelo termo "proteínas induzidas por inanição" é compreendidoqualquer proteína que no nível transcricional ou de proteína é induzida (au-mentada) pelo menos 6,5 vezes após estressar as micobactérias por inanição.
Combinação com M. bovis BCG
Pelo termo "combinação com M. bovis BCG" é compreendido aco-administração com qualquer cepa de M. bovis BCG incluindo, Pasteur,Phipps, Frappier, Connaught, Tice, Denmark, Glaxo, Prague, Birkhaug,Sweden, Japan, Moreau e Rússia em quantidades que leva a uma respostaimune específica aumentada significativa ou a uma proteção significativa emum modelo animal ou um ser humano juntamente com um ou mais dos poli-peptídeos de fusão definidos acima ou com um ou mais dos fragmentos deácido nucléico que os codificam, ou administrados ao mesmo tempo, masem sítios ou vias separadas.
Reforço de M. bovis BCG
Pelo termo "reforço de M. bovis BCG" é compreendido a admi-nistração de um ou mais polipeptídeos de fusão como definido acima ou umou mais fragmentos de ácido nucléico que os codificam em qualquer períodoapós a vacinação com qualquer cepa de M. bovis BCG incluindo, Pasteur,Phipps, Frappier, Connaught, Tice, Denmark1 Glaxo, Prague, Birkhaug,Sweden1 Japan1 Moreau e Rússia em quantidades que levam a uma respos-ta imune específica significativamente aumentada ou uma proteção significa-tivamente aumentada em um modelo animal ou um ser humano.
Polipeptídeo
Um polipeptídeo preferido a ser usado como uma unidade dospolipeptídeos de fusão da presente invenção é um polipeptídeo imunogênicode M. tuberculosis. Tal polipeptídeo pode, por exemplo, ser basado em umpolipeptídeo derivado da célula de M. tuberculosis e/ou filtrado da cultura deM. tuberculosis. O polipeptídeo normalmente será um polipeptídeo recombi-nante ou sintético e pode consistir do polipeptídeo imunogênico, uma parteimunogênica deste ou pode conter seqüências adicionais. As seqüênciasadicionais podem ser derivadas do antígeno de M. tuberculosis nativo ou serheterólogas e tais seqüências podem, mas não necessitam, ser imunogênicas.
Pelo termo "polipeptídeo de fusão" é entendido uma ordem alea-tória de dois ou mais polipeptídeos imunogênicos de M. tuberculosis ou seusanálogos fundidos juntamente com ou sem um espaçador de aminoácido decomprimento e seqüência abritárias.
A palavra "polipeptídeo" na presente invenção deve ter seu sig-nificado costumeiro. Isto é, uma cadeia de aminoácido de qualquer compri-mento, incluindo uma proteína de comprimento total, oligopeptídeo, peptídeocurto e fragmento destes e polipeptídeo de fusão, em que os resíduos deaminoácido são ligados pelas ligações de peptídeo covalentes.
O polipeptídeo pode ser quimicamente modificado por ser glico-silado, por ser submetido a lipídeo (por exemplo, lipidação química com suc-cinimida de palmitoilóxi como descrito por Mowat et al. 1991 ou com cloretode dodecanoíla como descrito por Lustig et al. 1976), por compreender gru-pos proféticos, ou por conter aminoácidos adicionais tais como, por exemplo,um his-tag ou um peptídeo de sinal.
Cada polipeptídeo imunogênico será caracterizado por aminoá-cidos específicos e será codificado por seqüências de ácido nucléico especí-ficas. Dentro do escopo da presente invenção são tais seqüências e análo-gos e variantes produzidas por métodos recombinantes ou sintéticos em quetais seqüências de polipeptídeo foram modificadas pela substituição, inser-ção, adição ou anulação de um ou mais resíduos de aminoácido no polipep-tídeo recombinante enquanto ainda são imunogênicas em qualquer um dosensaios biológicos aqui descritos.
As substituições são preferivelmente "conservativas". Estas sãodefinidas de acordo com a seguinte tabela. Os aminoácidos no mesmo blocona segunda coluna e preferivelmente na mesma linha na terceira coluna po-dem ser substituídos um com o outro. Os aminoácidos na terceira colunasão indicados em código de uma letra.
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Cada polipeptídeo é codificado por uma seqüência de ácido nu-cléico específica. Dentro do escopo da presente invenção estão os análogose tais seqüências de ácido nucléico que foram modificadas por substituição,inserção, adição ou anulação de um ou mais ácidos nucléicos. As substitui-ções são preferivelmente substituições silenciosas no uso de códon que nãolevarão a qualquer mudança na seqüência de aminoácido, mas podem serintroduzidas para intensificar a expressão da proteína.
Fragmento de ácido nucléico
Pelos termos "fragmento de ácido nucléico" e "seqüência de áci-do nucléico" são entendidos qualquer molécula de ácido nucléico incluindoDNA, RNA, LNA (ácidos nucléicos bloqueados), PNA, RNA, dsRNA e RNA-DNA-híbridos. Também incluídos estão as moléculas de ácido nucléicocompreendendo nucleosídeos de ocorrência não-natural. O termo inclui mo-léculs de ácido nucléico de qualquer comprimento, por exemplo, de 10 a10000 nucleotídeos, dependendo do uso. Quando a molécula de ácido nu-cléico for para uso como um produto farmacêutico, por exemplo, na terapiade DNA1 ou para uso em um método para a produção de um polipeptídeo deacordo com a invenção, uma molécula que codifica pelo menos um epítopoé preferivelmente usado, tendo um comprimento de cerca de 18 a cerca de1000 nucleotídeos, a molécula sendo opcionalmente inserida dentro de umvetor. Quando a molécula de ácido nucléico for usada como uma sonda,como um iniciador ou na terpaia anti-sentido, uma molécula tendo um com-primento de 10 a 100 é preferivelmente usada. De acordo com a invenção,outros comprimentos de molécula podem ser usados, por exemplo, uma mo-lécula tendo pelo menos 12,15,21, 24, 27, 30, 33, 36, 39, 42, 50, 60, 70, 80,90, 100, 200, 300, 400, 500 ou 1000 nucleotídeos (ou derivados de nucleotí-deo), ou uma molécula tendo no máximo 10000, 5000, 4000, 3000, 2000,1000, 700, 500, 400, 300, 200, 100, 50, 40, 30 ou 20 nucleotídeos (ou deri-vados de nucleotídeo).
O termo "severo" quando usado em conjunto com as condiçõesde hibridização é como definido na técnica, isto é, a hibridização é executa-da em uma temperatura de não mais do que 15-20 0C sob o ponto de fusãoTm, cf. Sambrook et al, 1989, pages 11.45-11.49. Preferivelmente, as condi-ções são "altamente severas", isto é, 5-10 0C sob o ponto de fusão Tm.Identidade de seqüência
O termo "identidade de seqüência" indica a medida quantitativado grau de homologia entre duas seqüências de aminoácido de comprimentosubstancialmente igual ou entre duas seqüências de ácido nucléico de com-primento substancialmente igual. As duas seqüências a serem comparadasdevem estar alinhadas no melhor ajuste possível com a inserção de abertu-ras ou alternativamente, mutilação nas extremidades das seqüências de pro-teína. A identidade de seqüência pode se calculada como ^"r^'00) em queNdit é o número total de resíduos não idênticos nas duas seqüências quandoalinhadas e em que Nref é o número de resíduos em uma das seqüências.
Em conseqüência, a seqüência de DNA AGTCAGTC terá uma identidade deseqüência de 75 % com a seqüência AATCAATC (Ndif= 2 and Nref= 8). Umaabertura é contada como sem identidade do(s) resíduo(s) específico(s), istoé, a seqüência de DNA AGTGTC terá uma identidade de seqüência de 75 %com a seqüência de DNA AGTCAGTC (Ndif = 2 e Nref = 8). A identidade deseqüência pode ser alternativamente calculada pelo programa BLAST, porexemplo, o programa BLASTP (Pearson W.R and D.J. Lipman(1988))(www.ncbi.nlm.nih.qov/cqi-bin/BLAST). Em uma modalidade da in-venção, o alinhamento é executado com o método de alinhamento de se-qüência CIustaIW com parâmetros de ausência como descrito por ThompsonJ., et al 1994, disponível na http://www2.ebi.ac.uk/clustalw/.
Uma porcentagem mínima preferida de identidade de seqüênciaé de pelo menos 8Q %, tal como pelo menos 85 %, pelò menos 90 %, pelomenos 91 %, pelo menos 92 %, pelo menos 93 %, pelo menos 94 %, pelomenos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, pelomenos 99 % e pelo menos 99,5 %. Preferivelmente, os números de substitu-ições, inserções, adições ou anulações de um ou mais resíduos de aminoá-cido no polipeptídeo de fusão são limitados, isto é, não mais do que 1, 2, 3,4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 substituições, não mais do que 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10inserções, não mais do que 1,2,3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 adições, e não mais do.que 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 anulações comparadas com as unidades depolipeptídeo imunogênico com base nos polipeptídeos derivados de M. tu-berculosis.
Parte imunoqênica
O polipeptídeo da invenção compreende uma parte imunogêni-ca, tal como um epítopo para uma célula B ou célula T.
A parte imunogênica de u polipeptídeo imunogênico é a parte dopolipeptídeo, que extrai uma resposta imune em um animal ou um ser hu-mano, e/ou em uma amostra biológica determinada por qualquer um dosensaios biológicos aqui descrito. A parte imunogênica de um polipeptídeopode ser um epítopo de célula T ou um epítopo de célula B. As partes imu-nogênicas podem ser relacionadas com uma ou algumas partes relativamen-te pequenas do polipeptídeo, elas podem ser dispersas através da seqüên-cia de polipeptídeo ou estar situadas em partes específicas do polipeptídeo.Para alguns polipeptídeos, os epítopos foram ainda demonstrados seremdispersos através do polipeptídeo que cobre a seqüência total (Ravn et al 1999).
De modo a identificar os epítopos de célula T relevantes que sãoreconhecidos durante uma resposta imune, é possível utilizar um método de"força bruta": Visto que os epítopos de célula T são lineares, os mutantes deanulação do polipeptídeo, se construídos sistematicamente, revelarão queas regiões do polipeptídeo são essenciais no reconhecimento imune, porexemplo, mediante a sujeição destes mutantes de anulação, por exemplo,ao ensaio INF-( aqui descrito. Um outro método utiliza a superposição deoligopeptídeos para a detecção de epítopos MHC classe II, preferivelmentesintéticos, tendo um comprimento de, por exemplo, 20 resíduos de aminoá-cido derivados do polipeptídeo. Estes peptídeos podem ser testados nosensaios biológicos (por exemplo, o ensaio IFN-( como aqui descrito) e algunsdestes fornecerão uma resposta positiva (e desse modo ser imunogênico)como evidência da presença de um epítopo de célula T no peptídeo. Para adetecção de epítopos MHC classe I é possível prognosticar peptídeos quese ligarão (Stryhn et al. 1996) e mais adiante produzir estes peptídeos sinte-ticamente e testá-los em ensaios biológicos relevantes, por exemplo, o en-saio IFN-( como aqui descrito. Os peptídeos preferivelmente tendo um com-primento de, por exemplo, 8 a 11 resíduos de aminoácido derivados do poli-peptídeo. Os epítopos de célula B podem ser determinados mediante a aná-lise do reconhecimento da célula B dos peptídeos de superposição que co-brem o polipeptídeo de interesse como, por exemplo, descrito em Harboe etal 1998.
As partes imunogênicas de polipeptídeos podem ser reconheci-das por uma parte ampla (alta freqüência) ou por uma parte menor (freqüên-cia baixa) da população humana geneticamente heterogênica. Alem disso,as partes imunogênicas induzem as respostas imunológicas elevadas (do-minante), enquanto outras induzem respostas mais baixas, mas ainda signi-ficativas (subdominante). A freqüência elevadaxfreqüência baixa podemser relacionadas na parte imunogênica que se ligaàs moléculas MHC am-plamente distribuídas (tipo HLA) ou ainda por múltiplas moléculas MHC (Kil-gus et al. 1991, Sinigaglia et al 1998).
Análogos
Um aspecto comum dos polipeptídeos de fusão da invenção ésua capacidade de induzir uma resposta imunológica como ilustrado nosexemplos. Fica entendido que dentro do escopo da presente invenção estãoos análogos de um polipeptídeo de fusão da invenção produzido por substi-tuição, inserção, adição ou anulação que é também imunogênico determina-do por qualquer um dos ensaios aqui descritos.
Substancialmente puro
No presente contexto o termo "polipeptídeo substancialmentepuro" significa uma preparação de polipeptídeo que contém no máximo 5 %e peso do outro material de polipeptídeo com o qual é associado natural-mente ou durante a produção recombinante ou sintética (porcentagens infe-riores de outro material de polipeptídeo são preferidas, por exemplo, no má-ximo 4 %, no máximo 3 %, no máximo 2 %, no máximo 1 %, e no máximo Vá%). É preferível que o polipeptídeo substancialmente puro é pelo menos 96% puro, isto é, que o polipeptídeo constitui pelo menos 96 % em peso dematerial de polipeptídeo total presente na preparação, e as porcentagensmais elevadas são preferidas, tais como pelo menos 97 %, pelo menos 98%, pelo menos 99 %, pelo menos 99,25 %, pelo menos 99,5 %, e pelo me-nos 99,75 %. É especialmente preferível que o polipeptídeo esteja na "formaessencialmente pura", isto é, que o polipeptídeo seja essencialmente livre dequalquer outro antígeno com o qual é naturalmente associado, isto é, livre dequalquer outro antígeno de bactérias que pertencem ao complexo de tuber-culose ou uma micobactéria virulenta. Isto pode ser efetuado mediante apreparação do polipeptídeo por meio de métodos recombinantes em umacélula hospedeira não micobacteriana como será descrito com detalhes a-baixo, ou mediante a sintetização do polipeptídeo pelos métodos bem-conhecidos de síntese de peptídeo de fase sólida ou líquida, por exemplo,pelo método descrito por Merrifield ou suas variações, e mediante o uso deprocedimentos de purificação apropriados bem-conhecidos do versado natécnica.Micobactéria virulenta, indivíduo correntemente infectado e indivíduo imune
Pelo termo "micobactéria virulenta" é compreendido uma bacté-ria capaz de causar a doença de tuberculose em um animal ou em um sehumano. Exemplos de micobactérias virulentas são Micobacterium turbercu-losis, Mieobacterium afrieanum, Mieobaeterium bovis, Mieobaeterium lepraou Mieobaeterium uieerans. Exemplos de animais relevantes são gado,gambás, texugos, búfalos, leões, kurus e cangurus.
Por "um animal ou ser humano correntemente infectado comuma micobactéria virulenta" é entendido um indivíduo com cultura ou infec-ção microscopicamente provada com micobactérias virulentas, e/ou um indi-víduo clinicamente diagnosticado com TB e que é responsivo à quimiotera-pia anti-TB. Cultura, microscopia e diagnóstico clínico de TB são bem-conhecidos por qualquer pessoa versada na técnica.
Um indivíduo imune é definido como uma pessoa ou um animal,que tem purificado ou controlado uma infecção com uma micobactéria viru-lenta ou tem recebido uma vacinação com M. bovis BCG.Imunoqênico
Um polipeptídeo imunogênico é definido como um polipeptídeoque induz uma resposta imune. A resposta imune pode ser monitorada porum dos seguintes métodos:
Uma resposta celular in vitro é determinada pela liberação deuma citocina relevante tal como IFN-(, de linfócitos retirados de um animalou ser humano corrente ou anteriormente infectado com micobactérias viru-lentas, o pela detecção da proliferação destas células Τ. A indução é execu-tada pela adição do polipeptídeo ou a parte imunogênica em uma suspensãocompreendendo de 1 χ 105 células a 3 χ 105 células per cavidade. As célu-las são isoladas do sangue, do baço, do fígado ou do pulmão e a adição dopolipeptídeo ou da parte imunogênica do polipeptídeo resulta em uma con-centração de não mais do que 20 (g per ml de suspensão) e o estímulo éefetuado a partir de dois a cinco dias. Para o monitoramento da proliferaçãocelular as células são pulsadas com Thymidine rotulado radioativo e após 16a 22 horas de incubação a proliferação é detectada pela contagem de cinti-lação líquida. Uma resposta positiva é uma resposta mais do que fundamen-tal acrescida de dois desvios padrão. A liberação de IFN-( pode ser determi-nada pelo método ELISA, que é bem-conhecido a uma pessoa versada natécnica. Uma resposta positiva é uma resposta mais do que fundamentalacrescida de dois desvios padrão. Outras citocinas que não IFN-( podem serrelevantes quando se monitora uma resposta imunológica para o polipeptí-deo, tal como IL-12, TNF-(, IL-4, IL-5, IL-10, IL-6, TGF-(. Um outro e maissensível método para determinar a presença de uma citocina (por exemplo,INF-() é o método ELISPOT onde as células isoladas do sangue, do fígadoou do pulmão são diluídas para uma concentração preferível de 1 ã 4 χ 106células /ml e incubadas durante 18 a 22 h na presença do polipeptídeo ou daparte imunogênica do polipeptídeos resultando em uma concentração denão mais do que 20 g per ml. As suspensões celulares são mais adiante di-luídas em 1 a 2 χ 106/ ml e transferidas para placas Maxisorp revestidascom anti-IFN-( e incubadas durante preferivelmente de 4 a 16 horas. As cé-lulas produtoras de IFN-( são determinadas pelo uso de anticorpo anti-IFNsecundário rotulado e um substrato relevante dando origem aos pontos, quepodem ser enumerados usando um microscópio de dissecação. É tambémuma possibilidade determinar a presença de mRNA que codifica a citocinarelevante mediante o uso da técnica de PCR. Geralmente, uma ou mais cito-cinas serão medidas utilizando, por exemplo, a PCR, ELISPOT ou ELISA.
Será observado por uma pessoa versada na técnica que um aumento oudiminuição significativa na quantidade de qualquer uma destas citocinas in-duzidas por um polipeptídeo específico pode ser usada na avaliação da ati-vidade imunológica do polipeptídeo.
Uma resposta celular in vitro pode também ser determinada pelouso de linhagens celulares T derivadas de um indivíduo imune ou uma pes-soa infectada por M. tuberculosis onde as linhagens celulares T foram con-duzidas com micobactérias vivas, extratos da célula bacteriana ou filtrado decultura durante 10 a 20 dias com a adição de IL-2. A indução é executadapela adição de não mais do que 20 g de polipeptídeo per ml de suspensãonas linhagens celulares T contendo de 1 χ 105 células a 3 χ 105 células percavidade e a incubação é executada de dois a seis dias. A indução de IFN-(ou liberação de uma outra citocina relevante é detectada por ELISA. O estí-mulo das células T podem também ser monitoradas pela detecção da prolife-ração celular usando Thymidine radioativamente rotulado como descrito a-cima. Para ambos os ensaios uma resposta positiva é uma resposta mais doque fundamental acrescida de dois desvios padrão.
Uma resposta celular in vivo pode ser determinada como umaresposta DTH positiva após a injeção intradérmica ou emplastro de aplica-ção local de no máximo 100 g do polipeptídeo ou da parte imunogênica a umindivíduo que é clínica ou subclinicamente infectado com uma Micobactériavirulenta, uma resposta positiva tendo um diâmetro d pelo menos 5 mm 72 a96 horas após a injeção ou aplicação.
Uma resposta humoral é determinada por uma resposta de anti-corpo específica em um indivíduo imune ou infectado. A presença de anti-corpos pode ser determinada por uma técnica de ELISA ou um Western blotonde o polipeptídeo ou a parte imunogênica é absorvida em uma membranade microcelulose ou uma superfície de poliestireno. O soro é preferivelmentediluído em PBS de 1:10 a 1 1:100 e adicionado ao polipeptídeo absorvido ea incubação sendo executada de 1 a 12 horas. Mediante o uso de anticorpossecundários rotulados a presença de anticorpos específicos pode ser deter-minada pela medição da presença ou ausência de um rótulo específico, porexemplo, por ELISA onde uma resposta positiva é uma resposta de mais doque fundamental acrescido de dois desvios padrão ou alternativamente umaresposta visual em um Western blot.
Um outro parâmetro relevante é a medição da proteção em mo-delos animais induzidos após a vacina com o polipeptídeo em um adjuvanteou após a vacinação de DNA. Os modelos animais adequados incluem pri-matas, proquinhos-da-índia ou camundongos, que são provocados com umainfecção de uma Micobactéria virulenta. A leitura da proteção induzida podeser a diminuição da carga bacteriana nos órgãos alvos comparada com ani-mais não-vacinados, tempos de sobrevivência prolongados comparados comos animais não-vacinados e perda de peso reduzida ou patologia comparadacom animais não-vacinados.
Métodos de preparação
Em geral os polipeptídeos de fusão da invenção, e as seqüên-cias de DNA que codificam tais polipeptídeos de fusão, podem ser prepara-dos mediante o uso de qualquer um de uma variedade de procedimentos.
O polipeptídeo de fusão pode ser produzido recombinantementeusando uma seqüência de DNA que codifica o polipeptídeo, que foi inseridoem um vetor de expressão e expresso em um hospedeiro apropriado. E-xemplos de células hospedeiras são E. coli. Os polipeptídeos de fusão po-dem também ser produzidos sinteticamente tendo menos do que cerca de100 aminoácidos, e geralmente menos do que 50 aminoácidos e podem sergerados usando técnicas bem-conhecidas por aqueles versados na técnica,tais como as técnicas de fase sólida comercialmente disponíveis onde osaminoácidos são seqüencialmente adicionados a uma cadeia de aminoácidoem desenvolvimento.
Os polipeptídeos de fusão podem também ser produzidos comum par de fusão adicional, em cujos métodos as características superioresdo polipeptídeo da invenção podem ser alcançadas. Por exemplo, os paresde fusão que facilitam a exportação do polipeptídeo quando produzido re-combinantemente, os pares de fusão que facilitam a purificação do polipep-tídeo, e os pares de fusão que intensificam a imunogenicidade do polipeptí-deo da invenção são todos de interesse. A invenção em particular pertence aum polipeptídeo de fusão que compreende as fusões de dois ou mais poli-peptídeos ímunogênicos com base nos polipeptídeos derivado de M. tuber-culosis.
Outros pares de fusão, que podem intensificar a imunogeneici-dade do produto, são Iinfocinas tais como IFN-γ, IL-2 e IL-12. De modo a fa-cilitar a expressão e/ou a purificação, o par de fusão pode, por exemplo, seruma proteína fimbrial bacteriana, por exemplo, os componentes pilosos pili-na e papA; proteína A; o peptídeo ZZ (as fusões ZZ são vendidas por Phar-macia in Sweden). A proteína de ligação de maltose; glutationa S-transferase; (-galactosidase; ou polihistidina. As proteínas de fusão podemser produzidas recombinantemente em uma célula hospedeira, que pode serE. coli, e é uma possibilidade induzir uma região articuladora entre os paresde fusão diferentes. A região articuladora entre, por exemplo, as unidades depolipeptídeo imunogênicas individuais, pode compreender 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7,8, 9 ou 10 aminoácidos.
Os polipeptídeos de fusão de interesse são polipeptídeos da in-venção, que são submetidos a lipídeo de modo que o polipeptídeo imunogê-nico é apresentado em uma maneira adequada ao sistema imune. Este efei-to é, por exemplo, conhecido das vacinas com base no polipeptídeo Borreliaburgdorferi OspA como descrito em, por exemplo, WO 96/40718 A ou vaci-nas com base na lipoproteína Pseudomonas aeruginosa Oprl (Cote-Sierra J1998). Uma outra possibilidade é a fusão N-terminal de uma seqüência desinal conhecida e uma cisteína N-terminal ao polipeptídeo imunogênico.Umatal fusão resulta na lipidação do polipeptídeo de fusão imunogênico na ciste-ína N-terminal, quando produzido em um hospedeiro de produção adequado.
Vacina
Um aspecto importante da invenção pertence a uma composiçãode vacina que compreende um polipeptídeo de fusão de acordo com a in-venção. De modo a garantir o desempenho ideal de uma tal composição devacina é preferível que ela compreende um veículo ou adjuvante imunológi-ca e farmaceuticamente aceitável.
Uma vacina eficaz, em que um polipeptídeo de fusão da inven-ção é reconhecido pelo animal, em um modelo animal será capaz de diminu-ir a carga bacteriana no órgãos-alvo, prolongará os tempos de sobrevivênciae/ou diminuirá a perda de peso ou patologia após provocação com uma Mi-cobactéria virulenta, comparado com os animais não-vacinados.
Os veículos adequados são selecionados do grupo consistindoem um polímero em que o(s) polipeptídeo(s) é/são ligado(s) por interaçãonão covalente hidrofóbica, tal como um plástico, por exemplo, poliestireno,ou um polímero em que o(s) polipeptídeo(s) é/são covalentemente ligado(s),tais como um polissacarídeo,ou um polipeptídeo, por exemplo, albumina desoro bovino, ovalbumina ou hemocianina de lapa. Os veículos adequadossão selecionados do grupo consistindo em um diluente e um agente de sus-pensão. O adjuvante é preferivelmente selecionado do grupo consistindo embrometo de dimetiloctadecilamônio (DDA), brometo de dimetiloctadecenila-mônio (DODAC), Quil A, poli l:C, hidróxido de alumínio, adjuvante incomple-to de Freund, IFN-(, IL-2, IL-12, monofosforil lipídeo A (MPL), Dimicolato deTrealose (TDM), Dibeenato de Trealose e dipeptídeo de muramila (MDP) ouextrato de lipídeo micobacteriano, em particular extratos de lipídeo apolarescomo descrito na PCT/DK2004/000488.
A preparação de vacinas que contêm polipeptídeos como ingre-dientes ativos é geralmente bem-entendida na técnica, como exemplificadonas Patentes U.S. 4.608.251; 4.601.903; 4.599.231 e 4.599.230, todas aquiincorporadas por referência.
Outros métodos de obter efeito adjuvante para a vacina incluemo uso de agentes tais como hidróxido de alumínio ou fosfato (alum), políme-ros sintéticos de açúcares (Carbopol), agregação da proteína na vacina me-diante tratamento térmico, agregação mediante a reativação com anticorpostratados com pepsina (Fab) à albumina, mistura com células bacterianas taiscomo C. parvum ou endotoxinas ou componentes de lipopolicarídeo de bac-térias gram-negativas, emulsão em veículos de óleo fisiologicamente aceitá-veis tais como monooleato mannide (Aracel A) ou emulsão com solução a 20por cento de um perfluorocarbono (Fluosol-DA) usado como um substitutode bloco pode também ser empregada. Outras possibilidades envolvem ouso de substâncias moduladoras imunes tais como citocinas ou indutores deIFN-gama sintéticos tais como poli l:C em combinação com os adjuvantesacima mencionados.
Uma outra possibilidade interessante para obter efeito adjvante éempregar a técnica descrita em Gosselin et al., 1992 (que é por meio destaaqui incorporada por referência). Em resumo, um antígeno relevante tal co-mo um antígeno da presente invenção pode ser conjugado a um anticorpo(ou fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno) contra os receptores deFc nos monócitos/macrófagos.
Para melhorar a vacina BCG, um ou mais antígeno(s) relevan-te(s) tais como um ou mais polipeptídeos de fusão da presente invenção po-dem ser misturados com uma vacina BCG antes da administração e injeta-dos com a vacina BCG desse modo obtendo um efeito sinergístico que levaa uma melhor proteção. Outra possibilidade de interesse para obter um efei-to sinergístico é manter a vacina BCG e o(s) polipeptídeo(s) de fusão dapresente invenção separadas, mas usá-las ao mesmo tempo e administrá-las em diferentes sítios ou através de diferentes vias.
Para reforçar as vacinas BCG correntemente usadas um antíge-no relevante tal como um ou mais dos polipeptídeos de fusão da presenteinvenção pode ser administrado no momento onde as vacinas BCG tipica-mente começam a decair ou mesmo antes, tal como 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30,35, 40, 50, 55, 60, 65 ou 70 anos após a vacinação de BCG. Pode portantoser dado em intervalos regulares, tais como 1, 2, 3, 4, 5 ou 10 anos, por até5 vezes.
As vacinas são administradas em uma maneira compatível coma formulação de dosagem, e em tal quantidade como será profilático ou te-rapeuticamente eficaz e imunogênico. A quantidade a ser administrada de-pende do indivíduo a ser tratado, incluindo, por exemplo, a capacidade dosistema imune do indivíduo para sobrepor uma resposta imune, e o grau deproteção desejado. As faixas de dosagem adequadas são da ordem de vá-rias centenas de microgramas do polipeptídeo de fusão da invenção per va-cinação com uma faixa preferida de cerca de 0,1 μg a 1000 μg, tal como nafaixa de cerca de 1 μg a 300 μg) e especialmente na faixa de cerca de 10 μga 100 μ^. Os regimes adequados para a administração inicial e doses dereforço são também variáveis, mas são tipificados por uma administraçãoinicial seguida por inoculações subseqüentes ou outras administrações.
A maneira de aplicação pode ser variada amplamente. Qualquerum dos métodos convencionais para administração de uma vacina é aplicá-vel. Estes incluem aplicação oral, nasal ou mucosal em uma forma sólidacontendo os ingredientes ativos (tal como uma pílula, supositório ou cápsula)ou em uma dispersão fisiologicamente aceitável, tal como uma pulverização,pó ou líquido, ou parenteralmente, por injeção, por exemplo, subcutânea,intradérmica ou intramuscular ou transdermicamente aplicado. A dosagemda vacina dependerá da via de administração e variará de acordo com a ida-de da pessoa a ser vacinada e, em um grau menor, o tamanho da pessoa aser vacinada. Correntemente, a maioria das vacinas é administrada intra-muscularmente por injeção de agulha e isto é provável de continuar como avia padrão. No entanto, as formulações de vacina que induzem a imunidademucosal foram desenvolvidas, tipicamente por liberação oral ou nasal. Umdos sistemas de liberação mais amplamente estudados para indução de i-munidade mucosal contém toxina de cólera (CT) ou sua subunidade B. Estaproteína intensifica as respostas imunes mucosais e induz a produção deIgA quando administrada em formulações de vacina. Uma vantagem é a faci-lidade de liberação das vacinas orais ou nasais. As toxinas modificadas deoutras espécies microbianas, que possuem toxicidade reduzida, mas capa-cidade imunoestimuladora retida, tal como toxina instável ao calor modifica-da de bactérias Gram-negativas ou enterotoxinas estafilocócicas, podemtambém ser usadas para gerar um efeito similar. Estas moléculas são parti-cularmente adequadas para a administração mucosal.
As vacinas são convencionalmente administradas parenteral-mente, por injeção, por exemplo, subcutânea ou intramuscularmente. Asformulações adicionais que são adequadas para outros modos de adminis-tração incluem supositórios e, em alguns casos, formulações orais. Para ossupositórios, aglutinantes e veículos tradicionais podem incluir, por exemplo,polialcaleno glicóis ou triglicerídeos; tais supositórios podem ser formados demisturas contendo o ingrediente ativo na faixa de 0,5 % a 10 %, preferivel-mente de 1 a 2 %. As formulações orais incluem tais excipientes normalmen-te empregados como, por exemplo, graus farmacêuticos de manitol, lactose,amido, estearato de mgnésio, sacarina de sódio, celulose, carbonato demagnésio, e outros mais. Estas composições tomam a forma de soluções,suspensões, tabletes, pílulas, cápsulas, formulações de liberação controladaou pós e vantajosamente contêm de 10 a 95 % de ingrediente ativo, preferi-velmente de 25 a 70 %.
Em muitos exemplos, será necessário ter múltiplas administra-ções da vacina. Especialmente, as vacinas podem ser administradas paraprevenir uma infecção com micobactérias virulentas e/ou para tratar infecçãomicobacteriana estabelecida ou para reforçar uma pessoa vacinada comBCG anteriormente. Quando administrada para impedir uma infecção, a va-cina é dada profilaticamente, antes que os sinais ou sintomas clínicos defini-tivos de uma infecção estejam presentes.
Devido à variação genética, diferentes indivíduos podem reagircom as respostas imunes de intensidade variável ao mesmo polipeptídeo.Portanto, a vacina de acordo com a invenção pode compreendervários poli-peptídeos de fusão diferentes e/ou polipeptídeos de modo a aumentar a res-posta imune. A vacina pode compreender dois ou mais polipeptídeos de fu-são ou polipeptídeos induzidos por inanição ou partes imunogênicas destes,onde todos os antígenos induzidos por inanição ou polipeptídeos de fusãosão como definidos acima, ou alguns, mas nem todos, dos polipeptídeospodem ser derivados de micobactérias virulentas. No último exemplo, os po-lipeptídeos não necessariamente satisfazem os critérios apresentados acimacom relação aos polipeptídeos de fusão que podem atuar devido à sua pró-pria imunogeneicidade ou simplesmente atuar como adjuvantes.
A vacina pode compreender de 1 a 20, tal como de 2 a 20, oumesmo de 3 a 20 polipeptídeos diferentes ou polipeptídeos de fusão, taiscomo de 3 a 10 polipeptídeos diferentes ou polipeptídeos de fusão.
A invenção também pertence a um método para a imunizaçãode um animal, incluindo um ser humano, contra a TB causada por micobac-térias virulentas, compreendendo a administração ao animal do polipeptídeode fusão da invenção, ou uma composição de vacina da invenção comodescrito acima, ou uma vacina viva descrita acima. Em uma modalidade atu-almente preferida, o animal ou ser humano é um indivíduo imune como defi-nido acima.
A invenção também pertence a um método para a produção deuma composição imunogênica de acordo com a invenção, o método com-preendendo a preparação, sintetização ou isolamento de um polipeptídeo defusão de acordo com a invenção, e solubilização ou dispersão do polipeptí-deo de fusão em um meio para uma vacina, e opcionalmente adição de ou-tros antígenos de M. tuberculosis e/ou um veículo, e/ou substância adjuvante.
Os fragmentos de ácido nucléico da invenção podem ser usadospara efetuar a expressão in vivo de polipeptídeos imunogênicos, isto é, osfragmentos de ácido nucléico podem ser usados nas assim chamadas vaci-nas de DNA como revisto em Ulmer et al 1993, que é incluído por referência.
Na construção e preparação do DNA plasmídeo que codifica umpolipeptídeo de fusão a ser usado definido para vacinação de DNA, uma ce-pa hospedeira tal como E. coli pode ser usada. O DNA plasmídeo pode de-pois ser preparado durante a noite de culturas da cepa hospedeira que car-rega o plasmídeo de interesse, e purificado usando, por exemplo, o kit decoluna Qiagen Giga-Plasmid (Qiagen, Santa Clarita, CA, USA) incluindo umaetapa de remoção da endotoxina. É essencial que o DNA plasmídeo usadopara a vacinação de DNA seja livre de endotoxina.
Portanto, a invenção também se refere a uma vacina que com-preende um fragmento de ácido nucléico de acordo com a invenção, a vaci-na efetuando a expressão in vivo do polipeptídeo imunogênico em um ani-mal, incluindo um ser humano, à quem a vacina foi administrada, a quanti-dade de polipeptídeo expreso sendo eficaz para conferir resistência subs-tancialmente aumentada às infecções causadas por micobactérias virulentasem um animal, incluindo um ser humano.
A eficácia de uma tal vacina de DNA pode possivelmente serintensificada mediante a administração do gene que codifica o produto deexpressão juntamente com um fragmento de DNA que codifica um polipeptí-deo que possui a capacidade de modular uma resposta imune.
Uma possibilidade para eficazmente ativar uma resposta imunecelular pode ser obtida pela expressão do polipeptídeo imunogênico relevan-te em um microorganismo não patogênico ou vírus. Exemplos bem-conhecidos de tais microorganismos são Mycobacterium bovis BCG, Salmo-nela e Pseudomona e exemplos de vírus são Vírus Vacínia e Adenovírus.
Portanto, um outro aspecto importante da presente invenção éuma melhora da vacina BCG viva atualmente disponível, em que uma oumais cópias de uma seqüência de DNA que codifica um ou mais polipeptí-deos de fusão como definido acima foi incorporada no genoma do microor-ganismo em uma maneira que permite o microorganismo expressar e secre-tar o polipeptídeo de fusão. A incorporação de mais do que uma cópia deuma seqüência de ácido nucléico da invenção é contemplada para intensifi-car a resposta imune.
Outra possibilidade é integrar o DNA que codifica o polipeptídeode fusão de acordo com a invenção em um vírus enfraquecido tal como ovírus de vacínia ou Adenovírus (Rolph et al 1997). O vírus de vacínia recom-binante é capaz de entrar dentro do citoplasma ou núcleo da célula hospe-deira infectada e o polipeptídeo de fusão de interesse pode portanto induziruma resposta imune, que é visionada de induzir proteção contra a TB.
A invenção também se refere ao uso de um polipeptídeo de fu-são ou ácido nucléico da invenção para uso como vacinas terapêuticas co-mo foram descritas na literatura exemplificada por D. Lowry (Lowry et al1999). Os antígenos com propriedades terapêuticas podem ser identificadoscom base em sua capacidade em diminuir a gravidade da infecção de M.tuberculose em animais experimentais ou prevenir a reativação da infecçãoanterior, quando administrados como uma vacina. A composição usada paravacinas terapêuticas pode ser preparada como descrito acima para vacinas.
LEGENDAS DA FIGURA
Figura 1: Respostas de anticorpo à Rv2660c para pacientes deTB negativos a HIV (TB+/HIV-) e positivos a HIV (TB+/HIV+) da Uganda econtroles de sadios da Denmark (Controles). O corte foi baseado na análiseda curva ROC com um nível de especificidade de 97 %. A sensibilidade ob-servada é mostrada acima da apresentação gráfica dos dados.
Figura 2. : Imunogeneicidade of Rv2659c
Os grupos de camundongos F1(Balb/cxC57BL/6) foram subcu-taneamente vacinados três vezes em intervalos de duas semanas comRv2659c em DDA/MPL. Uma semana após a vacinação final, PBMCs foramanalisados por ELISA com relação secreção de ING-gama seguinte a esti-mulação com 5 microgramas/ml Rv2659c
Figura 3. : Rv2659c induz a proteção contra infecção com M.tuberculosis
Os grupos de camundongos Balb/c-C57BL76 foram subcutane-amente vacinados três vezes em intervalos de duas semanas com Rv2659ce a eficácia protetiva foi avaliada pela redução nas contagens de CFU nospulmões e comparada aos camundongos não-imunizados e imunizados comBCG 12 semanas após a vacinação. Os resultados são expressos como u-nidades de formação de colônia Iogio (CFU) no pulmão e são os resultadosmédios de 6 camundongos per grupo experimental.
Figura 4: Immunogeneicidade de Rv2660cCamundongos F1 (Balb/cxC57BL/6) foram subcutaneamente va-cinados três vezes em intervalos de duas semanas com proteína Rv2660crecombinante em DDA/MPL. (A) Uma semana após a vacinação final,PBMCs foram analizados por ELISA com relação liberação de IFN-gamaseguinte a estimulação com 0,2, 1 ou 5 microgramas/ml de Rv2660c. Trêssemanas após a vacinação final, células do baço (B) foram analisados porELISA com relação a secreção de ING-gama seguinte a estimulação com0,2, 1, ou 5 microgramas/ml de Rv2660c recombinante e PBMCs (C) foramanalisados com relação as respostas proliferativas após a estimulação com0,2, 1 ou 5 microgramas/ml de Rv2660c recombinante.
Figura 5: Proteção contra infecção com Mycobacterium tubercu-losis induzida por Rv2660c
Os grupos de camundongos Balb/c-C57BL76 foram subcutane-amente vacinados três vezes em intervalos de duas semanas com Rv2660c,e a eficácia protetiva foi avaliada por contagens de CFU nos pulmões ecomparada com camundongos não-imunizados e BCG imunizados 6 sema-nas após a infecção de aerossol. Os resultados são expressos como unida-des de formação de colônia Iogio (CFU) no pulmão e são os resultados mé-dios de 6 camundongos per grupo experimental. Como um controle positivo,uma dose única de BCG Danish 1331 (5 χ 104 bacilos/camundongo) foi inje-tado s.c. na base da cauda ao mesmo tempo como a primeira vacinação desubunidade; nenhuma injeção reforçadora foi administrada.
Figura 6: Imunogeneicidade de Hybrid56, HyVac21 e HyVac28.
Os grupos de camundongos F1 (Balb/cxC57BL/6) foram subcu-taneamente vacinados três vezes em intervalos de duas semanas com 5microgramas de Ag85b-ESAT6-Rv2660c (H56), Ag85a-TB10.4-Rv2660c(H21) ou Ag85b-TB10.4-Rv2660c (H28) em DDA/TDB (LipoVac). Uma se-mana após a vacinação final, PBMCs foram analisados por ELISA com rela-ção a liberação de IFN-gama seguinte a estimulação com 1 micrograma/mlda proteína de fusão usada com relação a imunização, Ag85b, TB10.4 ouRv2660c (figura 6A-C).
Três semanas após a vacinação final com Ag85b-ESAT6-Rv2660c, células do baço (D) foram analisadas por ELISA com relação asecreção de ING-gama seguinte a estimulação com 0,2, 1 ou 5 microgra-mas/ml de Ag85B recombinante, ESAT6 ou Rv2660c e PBMCs (E) foramanalisados com relação às respostas proliferativas contra os mesmos antí-genos em 1 micrograma/ml.
Figura 7.: Proteção forte contra a infecção de M. tuberculosisapós imunização com Hibrid56.
(A) Os grupos de camundongos Balb/c-C57BL/6 foram subcuta-neamente vacinados três vezes em intervalos de duas semanas com Ag85B-ESAT6-Rv2660c (Hybrid56), e a eficácia protetiva foi avaliada por contagensde CFU nos pulmões e comparada com os camundongos não-imunizados eimunizados com BCG 2, 6, 12 e 24 semanas após a infecção por aerossol.(B) Os grupos de camundongos B6 foram subcutaneamente vacinados trêsvezes em intervalos de duas semanas com Ag85b-ESAT6 (HybridI) ouAg85b-ESAT6-Rv2031c (Hybrid32) e a eficácia protetiva foi avaliada porcontagens de CFU nos pulmões e comparada com os camundongos não-imunizados e imunizados com BCG 7, 13, 24, 35 e 44 semanas após a in-fecção por aerossol. Os resultados são expressos como unidades de forma-ção da colônia log-ιο (CFU) no pulmão e são os resultados médios de 6 ca-mundongos per grupo experimental. Como um controle positivo, uma doseúnica de BCG Danish 1331 (5 χ 104 bacilos/camundongo) foi injetada s.c. nabase da cauda ao mesmo tempo como a primeira vacinação de subunidade;nenhuma injeção reforçadora foi administrada.
Figura 8.: Curvas de sobrevivência Kaplan-Meier (n = 7). Imuni-zação de proquinhos-da-índia com a proteína de fusão Ag85b-ESAT6-Rv2660c prolonga o tempo de sobrevivência até o nível de animais imuniza-dos com BCG após a provocação com de M. tuberculosis com aerossol emdose baixa.
Figura 9.: Imunogeneicidade e proteção induzidas por Hybrid56(Ag85b-ESAT6-Rv2660c).
Camundongos F1 (Balb/cxC57BL/6) foram subcutaneamente va-cinados três vezes em intervalos de duas semanas com Ag85b-ESAT6-Rv2660c (Hybrid56) em DDA/MPL. Dez semanas após a vacinação final, ascélulas do baço foram analisadas por ELISA com relação a secreção deING-gama seguinte a estimulação com 0,2, 1, ou 5 ug/ml de Ag85B, ESAT6,ou Rv2660c (como observado na figura 9A). A eficácia protetiva foi avaliadapela redução nas contagens de CFU nos pulmões comparada como os ca-mundongos imunizados com controle de adjuvante dez semanas após a va-cinação. Os resultados são expressos como unidades de formação de colô-nia Iogio (CFU) no pulmão de 12 camundongos per grupo experimental (figu-ra 9B).
EXEMPLOS
Materiais e métodos
Animais
Camundongos C57BLy6xBalb/C F1 or C57BU6 livres de patóge-no específico fêmeas, 8 a 16 semanas de idade, obtidos da Bomholtegaard,Denmark foram usados para análise de respostas imunes e estudos de pro-teção como avaliado pela análise CFU. Os estudos de infecção foram execu-tados nas instalações BSL3 no Statens Serum lnstitute. Os animais foramalojados em gaiolas isolantes e alimentados com água e alimento estéril adlibitum. Todos os animais foram deixados um período de repouso de 1 se-mana antes do início das experiências.Preparações de Antíqeno Recombinante
Ag85B-ESAT6 recombinante (HybridI) foi produzido como ante-riormente descrito (Olsen, van Pinxteren et al. 2001). Resumidamente, a pro-teína rotulada His foi expressa em Escherichia coliXL-1 Blue e purificada emuma coluna Talon seguido pela cromatografia de troca de ânion de proteínausando uma coluna HiTrap Q (Pharmacia, Uppsala, Sweden). A amostra foisubmetida a diálise contra 25 mM HEPES tamponante (pH 8,0)-0,15 M Na-Cl-10 % glicerol—0,01 % Tween 20 antes da diluição e armazenagem.
Rv2660c recombinante foi produzido pelo menos procedimentoanteriormente descrito para outra proteína micobacteriana pequena (Skjot,Oettinger et al. 2000). Resumidamente, o gene Rv2660c de comprimentototal foi amplificado por PCR a partir do DNA genômico de M. tuberculosis esubclonado no plasmídeo de expressão pDest17. A proteína recombinantefoi produzida em Escherichia coli BI21 azul e purificada pela cromatografiade íon de metal em uma coluna de Ni+ essencialmente como descrito ante-riormente (Theisen, Vuust et al. 1995) mas com tamponantes de fosfato con-tendo 8 M uréia, que foi removida após a purificação.
As proteínas de fusão Hybrid56 (Ag85B-ESAT6-Rv2660c), Hy-brid32 (Ag85b-ESAT6-Rv2031c), HyVac21 (Ag85a-TB10.4-Rv2660c) e Hy-Vac28 (Ag85b-TB10.4-Rv2660c) foram clonadas no vetor de expressãopDest17 (Invitrogen) pela recombinação específica do sítio de acordo com ofabricante.
As proteínas de fusão foram expressas na cepa de E.coli BL21após indução por IPTG. Todas as quatro proteínas de fusão recombinantesforam coletadas como corpos de inclusão após o rompimento das célulaspor detergente suave (B-PER, Sigma) e sonicação. Os corpos de inclusãolavados foram dissolvidos em 20mM NaOAc + 8 M uréia em pH 4,9 e passa-dos sobre uma coluna de separarose Q para capturar a endotoxina. O fluxoatravessante coletado foi diluído em tampão Bis-tris + 8 M uréia pH 6.5 e opH foi ajustado para pH 6,5. A proteína foi depois passada por uma CM sefa-rose para capturar as impurezas e depois capturada em uma coluna de Qsefarose. A coluna foi lavada com tampão bis-tris pH 6,5 + 3 M uréia. As pro-teínas ligadas foram eluídas com NaCI. A proteína foi depois trocada portampão em uma coluna Sephadex em 25 mM tris-HCI pH 8 e 10 % glicerol.Reconhecimento humano - sorologia
Todos os soros foram exauridos dos anticorpos reativos cruza-dos antes de usar em ELISA mediante a adição de 20 μΙ de extrato de E. coli(S3761, Promega1 Madison, Wl) para 200 μΙ de amostra de soro seguido porincubação durante 4 horas em temperatura ambiente enquanto se mistura.
Após a centrifugação (10.000 χ g, 10 min), 0,05 % azido de sódio foi adicio-nado ao sobrenadante. O ELISA foi executado como se segue, as placas demicrotítulo Maxisorp de 96 cavidades (Nunc, Roskilde, Denmark) foram re-vestidas durante a noite em 4 0C com antígeno a 1,0 μg/ml (100 μΙ per cavi-dade) em tampão de carbonato-bicarbonato (pH 9,6). As placas foram de-pois lavadas 3 vezes com PBS contendo 0,05 % Tween 20 (PBS-T). As a-mostras de soro foram diluídas 1:100 em PBS contendo 0,2 % Tween 20 e1,0 % (p/vol) albumina de soro bovino (tamponante de diluição), e 0,1 ml desoro diluído foi adicionado aos cavidades em duplicata, e incubado duranteuma hora em temperatura ambiente. Após lavagens 3x com PBS-T, as pla-cas foram incubadas durante uma hora com 100 ul de Ig anti-humano decoelho conjugado com Peroxidase (P212, DAKO, Glostrup, Denmark) diluído1:8000 em tamponante de diluição. As placas foram lavadas 3 vezes comPBS-T e incubadas com substrato de Tetrametilbenzidina (TMB plus, Kem-En-Tec1 ***, Denmark) durante 30 minutos, e o desenvolvimento foi inter-rompiddo mediante a adição de 1 M H2SO4. A densidade ótica em 405 nm(OD405) foi depois medida.
Preparação de vacina e procedimento de imunização
Os camundongos foram imunizados com 5 micro g de vacinarecombinante (Rv2659c, Rv2660c, Hybrid56, HyVac21, HyVac28 ou Hy-brid32) liberados em 25 pg de lipídeo monofosforila A (MPL, Corixa, WA,USA) emulsificados em brometo de dioctadecilamônio (DDA, 250 pg/dose,Eastman Kodak, Inc., Rochester, N.Y.) em um volume total de 200 μΙ, comorecentemente descrito (Olsen, van Pinxteren et al. 2001). As vacinas (0,2ml/camundongo) foram injetadas três vezes subcutaneamente (s.c.) no dor-so com intervalos de 2 semanas. Uma dose única de BCG Danish 1331 (5 χ104 bacilos/camundongo) foi injetada s.c. na base da cauda ao mesmo tem-po como a primeira vacinação de subunidade; nenhuma injeção reforçadorafoi administrada. A imunidade de pré-provocação foi tipicamente avaliadacom linfócitos sangüíneos 5 e 7 semanas após a primeira vacinação e es-plenócitos 7 semanas após a primeira vacinação.Infecções experimentais e enumeração bacteriana nos órgãos.
Para avaliar o nível de proteção, os camundongos foram provo-cados 10 semanas após a primeira imunização pela via de aerossol em umsistema de exposição de inalação Glas-Col, calibrado para liberar aproxima-damente 100 CFU de M. tuberculosis Erdman per pulmão. Os camundongosforam sacrificados 2, 6, 12 ou 24 semanas mais tarde (Hybrid56), ou 7, 13,24, 35 ou 44 semanas mais tarde (Hybrid32), e os pulmões e os baços foramremovidos para a enumeração bacteriana. Os órgãos foram homogeneiza-dos separadamente em salina estéril, e diluições seriais foram plaqueadasem ágar Middlebrook 7H11 suplementado com 2 mg de hidrazida de ácido 2-tiofeno-carboxílico per ml para seletivamente inibir o desenvolvimento deBCG residual nos órgãos de teste. As colônias foram contadas após 2 a 3semanas de incubação a 37 0C.
Culturas de Linfócito
Os órgãos foram homogeneizados por maceração através deuma peneira de aço inoxidável de malha fina em RPMI completo (GIBCO,Grand lsland, NY1 incluindo 2 mM glutamina, 100 U/ml cada de penicilina 6-potássio e sulfato de estreptomicina, 10 % FCS e 50 mM 2-ME). Os linfócitossangüíneos foram purificados em um linfócito com gradiente de densidade(Cedarlane, Hornby, Ontario, Canada). As células foram reunidas de cincocamundongos em cada grupo e cultivadas em triplicata em cavidades demicrotítulo de fundo redondo (96 cavidades; Nunc, Roskilde, Denmark) con-tendo 2 χ 105 células em um volume de 200 microl de metio RPMI 1640 su-plementado com 5 χ 10"5 M 2-mercaptoetanol, 1 mM glutamina, penicilina-estreptomicina 5 % (vol/vol) soro de bezerro fetal. Os antígenos micobacteri-anos foram usados em concentrações variando de 5 a 0,2 mg/ml. As cultu-ras foram incubadas a 37 0C em 10 % C02 durante 3 dias, antes da remo-ção de 100 μΙ de sobrenadante para interferon gama (determinação de IFN-gama por ensaio imunoabsorvente ligado a enzima (ELISA) como descritoabaixo.
Ensaio Imunoabsorvente Ligado a Enzima (ELISA) para IFN-gama
Um método ELISA sanduíche duplo foi usado para quantificar osníveis de IFN-gama em titulações duplicatas de sobrenadantes de cultura,usando um kit comercial para ensaio de IFN-gama, de acordo com as instru-ções do fabricante (Mabtech, AB. Sweden). As concentrações de IFN- gamanas amostras foram calculadas usando a curva padrão gerada de IFN- gamarecombinante (Life Technologies) e os resultados são expressos em pg/ml. Adiferença entre os cavidades em duplicata foi consistentemente menor doque 10 % da média.
Infeccão experimental e avaliação da eficácia de vacina no modelo de pro-quinho-da-índia
Proquinhos-da-índia Hartley fêmeas de criação adquiridos deCharles River Laboratories (North Wilmington, Mass.) foram administradosBCG intradermicamente em uma dose de 103 CFU uma vez ou 20 pg ofAg85b-ESAT6 ou Ag85b-ESAT6-Rv2660c emulsificados em DDA/MPL trêsvezes com um período de repouso de 3 semanas entre as imunizações. Seissemanas após a terceira imunização uma provocação de aerossol MTB foifornecida usando um dispositivo (Glas-Col, Terre Haute1 Ind.) calibrado paraliberar aproximadamente 20 bacilos em cada pulmão de proquinho-da-índia.Os tempos de sobrevivência para os proquinhos-da-índia infectados foramdeterminados pela observação dos animais em uma base diária para mu-danças no consumo de alimentação, evidência de respiração sofrida, e mu-danças de comportamento. Além disso, os animais foram pesados em umabase semanal até que uma queda sustentada em peso foi observada duran-te vários dias, indicando doença.
Exemplo 1
Reconhecimento humano de um antíqeno induzido por inanição
Rv2660c foi avaliado com relação ao reconhecimento humanoem um painel de paciente de TB pulmonar de Uganda fornecido pelo WHOTuberculosis Specimen Bank. Pacientes com estados de infecção por HIVtanto negativo quanto positivo foram incluídos (N = 94 e N = 73, respectiva-mente). O grupo de controle consistia de uma centena de doadores residen-tes Danish saudáveis com uma cobertura de BCG estimada de > 90 %.
As placas de microtítulo foram revestidas com 1,0 μg/ml (100 μΙper cavidade) de proteína Rv2660c incubadas com 100 χ amostras de sorodiluídas e desenvolvidas usando Ig anti-humano de coelho conjugado comperoxidase e tetrametilbenzidina como substrato (resultados na Figura 1).
Conclusão
Neste estudo, o reconhecimento de uma proteína induzida porinanição foi testado. Baseado em um corte determinado do grupo de controleusando uma sensibilidade de 97 % se foi possível confirmar a infecção deTB em 45 % do HIV - casos e 61 % do HIV + casos. Claramente indicandoque a proteína RV2660c é expressa e reconhecida pelo sistema imune du-rante uma infecção de MTB.
Exemplo 2
Imunoqenicidade e prevenção da reativação mediante a administração pós-exposição de um antíqeno induzido por inanição (Rv2659c)
Os camundongos foram infectados com M. tuberculosis e trata-dos com antibióticos para reduzir a carga bacteriana e entrar um estágio deinfecção latente com uma carga bacteriana próxima ao nível de detecção.Durante o estágio latente de infecção os camundongos foram vacinados trêsvezes em intervalos de duas semanas com Rv2659c em adjuvante (por e-xemplo, DDA/MPL). Uma semana após a vacinação final, as células sangüí-neas são analisadas por ELISA com relação a secreção de INF-gama se-guinte ao estímulo com Rv2659c (figura 2).
A capacidade da proteína induzida por inanição Rv2659c de induzir a prote-ção contra a reativação de M. tuberculosis
Grupos de camundongos com M. tuberculosis latente foram sub-cutaneamente vacinados três vezes em intervalos de duas semanas comRv2659c formulado em adjuvante (por exemplo, DDA/MPL) e a eficácia pro-tetiva foi avaliada pela redução nas unidades de formação de colônia (CFU)dos pulmões e baços quando comparada com camundongos não-vacinados(latentemente infectados). A proteção contra a reativação foi avaliada trêsmeses após a vacinação. Rv2659c induziu uma redução de 3 a 90 vezesnos níveis de bactérias pulmonar comparado com os camundongos reativa-dos não-imunizados latentemente infectados (figura 3). Para avaliar a influ-ência da vacinação de Rv2659c sobre o possível desenvolvimento de pato-logia nos camundongos latentemente infectados, o tecido pulmonar foi tiradodos camundongos vacinados latentemente infectados para exame histopato-lógico. Nenhum caso significativo de necrose, fibrose ou mineralização foidetectado nas lesões e nenhuma infiltração intensificada de células inflama-tórias foi vista.
Conclusão
Neste estudo, o potencial de uma proteína induzida por inanição,Rv2659c como uma vacina terapêutica foi testada. Quando a proteínaRv2659c foi administrada aos camundongos na combinação adjuvante lipí-deo de dimetildioctadecilamônio brometo-monofosforila A, uma resposta i-mune forte foi induzida / reforçada. A imunização resultou em redução de0,5-1,0 Iog na carga bacteriana no pulmão. Assim nossos estudos sugeremque a vacinação pós-exposição reduz ou retarda a reativação de M. Tuber-culosis sem o disparo da imunopatologia pulmonar.
Exemplo 3
Imunogenicidade e proteção contra a infecção por M. tuberculosis de aeros-sol pelo antígeno induzido por inanição Rv2660c
Os camundongos foram vacinados três vezes em intervalos deduas semanas com Rv2660c em adjuvante (por exemplo, DDA/MPL). Umasemana após a vacinação final, as células sangüíneas são analisadas porELISA com relação a secreção de INF-gama seguinte ao estímulo comRv2660c (figura 4A). Três semanas após a vacinação final as células de ba-ço são analisadas com relação a secreção de IFN gama seguinte ao estímu-lo com Rv2660c (figura 4B) e as células sangüíneas são analisadas comrelação às respostas proliferativas específicas do antígeno (figura 4C).Grupos de camundongos subcutaneamente vacinados três ve-zes em intervalos de duas semanas com Rv2660c formulado em adjuvante(por exemplo, DDA/MPL) foram provocados por infecção de aerossol com M.tuberculosis e a eficácia protetiva foi avaliada pela redução nas unidades deformação de colônia (CFU) isoladas dos pulmões quando comparada comcamundongos não-vacinados. A proteção foi avaliada 12 semanas após avacinação. Rv2660c induziu a redução de Vz. Iog(IO) nos níveis de bactériaspulmonar comparado com os camundongos não-imunizados infectados (figura 5).
Conclusão
Neste estudo, o potencial de uma proteína induzida por inanição,Rv2660c como um antígeno de vacina foi testado. Quando a proteínaRv2660c foi administrada aos camundongos na combinação adjuvante lipí-deo de dimetildioctadecilamônio brometo-monofosforila A, uma resposta i-mune forte foi induzida. A imunização resultou em redução de aproximada-mente 0,5 Iog na carga bacteriana no pulmão.
Exemplo 4
Fusão de antígenos induzidos por inanição às vacinas preventivas (Vacinade múltiplas fases)
Respostas imunolóqicas após a imunização com proteínas de fusão tripla
Grupos de camundongos são subcutaneamente vacinados duasvezes em intervalos de duas semanas com os polipeptídeos de fusão Hy-brid56, HyVac21 ou HyVac28 em adjuvante (por exemplo, DDA/MPL). Umasemana após a vacinação final, as células sangüíneas são analisadas comrelação a secreção de INF-gama seguinte ao estímulo com 1 micrograma/mlde proteína de fusão de imunização ou aos componentes únicos nas proteí-nas de fusão (figure 6A-C). Três semaas após a vacinação final com Hy-brid56, as células de baço são analisadas por ELISA com relação a secre-ção de INF-gama seguinte ao estímulo com 0,2, 1, ou 5 microgramas/ml doscomponentes únicos na proteína de fusão (figura 6D). As células sangüíneassão analisadas com relação as respostas proliferativas específicas do antí-geno três semanas após a vacinação final (Figura 6E).A capacidade de três polipeptídeos de fusão de induzir proteção contra ainfeccão com M. tuberculosis em camundongos
Grupos de camundongos são subcutaneamente vacinados trêsvezes em intervalos de duas semanas com os polipeptídeos de fusão Hy-bridl, Hybrid56 e Hybrid32 em adjuvante (DDA/MPL) e a eficácia protetiva éavaliada mediante a redução nas unidades de formação de colônia (CFU)dos pulmões e baços quando comparado com camundongos cândidos (não-vacinados) após a infecção de aerossol. Como um controle positivo para aproteção, uma dose única de BCG Danish 1331 (5 χ 104 baci-los/camundongo) é injetada s.c. na base da cauda ao mesmo tempo como aprimeira vacinação de subunidade (Figura 7 A e B).
Capacidade protetiva do polipeptídeo Hybrid56 (Aq85b-ESAT6-Rv2660c)contra uma infecção de M. tuberculosis com aerossol em proquinhos-da-índia
Grupos de proquinhos-da-índia são subcutaneamente vacinadostrês vezes em intervalos de três semanas com os polipeptídeos de fusão emadjuvante (DDA/MPL) e a eficácia protetiva é principalmente avaliada medi-ante a medição de cada peso de animal em uma base semanal. Como umcontrole positivo para a proteção, uma dose única de BCG Danish 1331 (5 χ104 bacilos/camundongo) é injetada i.d. ao mesmo tempo como a primeiravacinação de subunidade. Os resultados são apresentados como curvas desobrevivência na figura 8.
Conclusão
Neste estudo o potencial imunológico de três proteínas de fusão(Hybrid56, HyVac21 e HyVac28) foi investigado. Quando as proteínas defusão forem administrados aos camundongos na combinação adjuvante lipí-deo de dimetil dioctadecilamônio brometo-monofosforila A, uma respostaimune dependente da dose forte foi induzida a todos os três componentes deproteína única indicando seu potencial como uma vacina de múltiplas fases.Selecionar Hybrid56 como um exemplo das respostas imunes induzidas foiacompanhado por níveis elevados de imunidade protetiva que aumentamcom o tempo, alcançando um nível que estava claramente acima do nível deproteção alcançado com Mycobacterium bovis BCG1 a vacina MTB clássica.Além disso, uma proteína de fusão tripla similar contendo o antígeno de Ia-tência de MTB clássico Rv2031c (Ag85b-ESAT6-Rv2031c) substituindoRv2660c, não mostrou proteção melhorada durante um tempo. Finalmente, onível elevado de proteção para Hybrid56 foi confirmado no modelo de pro-quinho-da-índia muito mais suscetível.
Exemplo 5
Atividade de uma fusão de um antígeno induzido por inanição e uma vacinapeventiva (vacina de múltiplas fases) administrado pós-exposicão (terapeuti-camente)
Os camundongos foram infectados com M. tuberculosis e trata-dos com antibióticos para reduzir a carga bacteriana e entrar um estágio deinfecção latente com uma carga bacteriana baixa. Durante o estágio latentede infecção os camundongos foram vacinados três vezes em intervalos deduas semanas com o polipeptídeo de fusão em adjuvante (por exemplo,DDA/MPL). Quinze semanas após a vacinação final, as células sangüíneassão analisadas por ELISA com relação a secreção de INF-gama seguinte aoestímulo com 0,2, 1 ou 5 μς de componentes únicos da proteína de fusão(figura 9A).
A capacidade do polipeptídeo de fusão de induzir a proteção contra a reati-vação de M. tuberculosis
Grupos de camundongos com M. tuberculosis latente foram sub-cutaneamente vacinados três vezes em intervalos de duas semanas com opolipeptídeo de fusão formulado em adjuvante (por exemplo, DDA/MPL) e aeficácia protetiva foi avaliada pela redução nas unidades de formação decolônia (CFU) dos pulmões quando comparada com camundongos não-vacinados (latentemente infectados). A proteção contra a reativação foi ava-liada três meses após a vacinação. O polipeptídeo de fusão induziu uma re-dução significativa de reativação resultando em níveis de bactérias pulmonarcomparado com os camundongos reativados não-imunizados latentementeinfectados (figura 9B).Conclusão
Neste estudo, o potencial de uma vacina de subunidade de tu-berculose com base em uma proteína de fusão dos antígenos Rv2660c, E-SAT6 (Rv3875) e antígeno 85B (Rv1886c) como uma vacina terapêutica foiinvestigado. Quando a proteína de fusão foi administrada aos camundongosna combinação adjuvante lipídeo de dimetildioctadecilamônio brometo-monofosforila A, uma resposta imune forte foi induzida / reforçada. A imuni-zação resultou em redução na carga bacteriana no pulmão durante a reati-vação da infecção latente. Assim nossos estudos sugerem que a vacinaçãopós-exposição com fusão de um antígeno induzido por inanição e uma vaci-na preventiva (vacina de múltiplas fases) reduz ou retarda a reativação de M.Tuberculosis.
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<120> VACINAS PARA TUBERCULOSE (TB) COM PROTEÍNAS DE FUSÃO
<130> 15018dkl
<210> 1<211> 960
<212> DNA
<400> 1
atggctgaca tcccctacgg ccgtgactat cccgacccga tctggtgtga cgaggacggc 60
cagccgatgc cgccggtcgg cgccgaattg ctcgacgaca ttagggcatt cttgcggcgg 120
ttcgtagtct atccaagcga ccatgaactg atcgcgcaca ccctctggat tgcgcattgc 180
15 tggtttatgg aggcgtggga ctcaacgccc cgaatcgctt ttttgtcacc ggaacccggc 240
tctggcaaga gccgcgcact cgaagtcacg gaaccgctag tgccccggcc ggtgcatgcc 300
atcaactgca caccggccta cctgttccgt cgggtggccg atccggtcgg gcggccgacc 3 60
gtcctgtacg acgagtgtga caccctgttt ggcccgaaag ctaaagaaca cgaggaaatt 420
cgcggcgtga tcaacgccgg ccaccgcaag ggagccgtcg cgggccgctg cgtcatccgc 480
20 ggcaagatcg ttgagaccga ggaactgcca gcgtactgtg cggtcgcctt ggccggcctc 540
gacgacctgc ccgacaccat catgtctcgg tcgatcgtgg tgaggatgcg caggagggca 600
ccaaccgaac ccgtggagcc gtggcgcccc cgcgtcaacg gccccgaggc cgagaagctg 660
cacgaccggt tggcgaactg ggcggccgcc attaacccgc tggaaagcgg ttggccggcg 720
atgccggacg gggtgaccga ccggcgcgcc gacgtctggg agtccctggt tgcggttgct 780
25 gacaccgcgg gcgggcactg gcccaaaacc gcccgtgcaa ccgcagaaac ggatgcaacc 840
gcaaatcgag gagccaagcc cagcataggc gtgctgctgc tgcgggatat ccgtcgagtc 900
ttcagcgacc gggaccggat gcgcaccagc gacatcctga ccggactgaa ccggatggag 960<210> 2<211> 47530 <212> PRT
<400> 2Met Ala Asp Ile Pro Tyr Gly Arg Asp Tyr Pro Asp Pro Ile Trp Cys1 5 10 15
Asp Glu Asp Gly Gln Pro Met Pro Pro Val Gly Ala Glu Leu Leu Asp
20 25 30
Asp Ile Arg Ala Phe Leu Arg Arg Phe Val Val Tyr Pro Ser Asp His
35 40 45
Glu Leu Ile Ala His Thr Leu Trp Ile Ala His Cys Trp Phe Met Glu
50 55 60
Ala Trp Asp Ser Thr Pro Arg Ile Ala Phe Leu Ser Pro Glu Pro Gly65 70 75 80
Ser Gly Lys Ser Arg Ala Leu Glu Val Thr Glu Pro Leu Val Pro Arg
85 90 95
Pro Val His Ala Ile Asn Cys Thr Pro Ala Tyr Leu Phe Arg Arg Val
100 105 110
Ala Asp Pro Val Gly Arg Pro Thr Val Leu Tyr Asp Glu Cys Asp Thr
115 120 125
Leu Phe Gly Pro Lys Ala Lys Glu His Glu Glu Ile Arg Gly Val Ile
130 135 140
Asn Ala Gly His Arg Lys Gly Ala Val Ala Gly Arg Cys Val Ile Arg145 150 155 160
Gly Lys Ile Val Glu Thr Glu Glu Leu Pro Ala Tyr Cys Ala Val Ala
165 170 175
Leu Ala Gly Leu Asp Asp Leu Pro Asp Thr Ile Met Ser Arg Ser Ile
180 185 190
Val Val Arg Met Arg Arg Arg Ala Pro Thr Glu Pro Val Glu Pro Trp
195 200 205
Arg Pro Arg Val Asn Gly Pro Glu Ala Glu Lys Leu His Asp Arg Leu
210 215 220
Ala Asn Trp Ala Ala Ala Ile Asn Pro Leu Glu Ser Gly Trp Pro Ala225 230 235 240
Met Pro Asp Gly Val Thr Asp Arg Arg Ala Asp Val Trp Glu Ser Leu245 250 255Val Ala Val Ala Asp Thr Ala Gly Gly His Trp Pro Lys Thr Ala Arg
260 265 270
Ala Thr Ala Glu Thr Asp Ala Thr Ala Asn Arg Gly Ala Lys Pro Ser
275 280 285
Ile Gly Val Leu Leu Leu Arg Asp Ile Arg Arg Val Phe Ser Asp Arg
290 295 300
Asp Arg Met Arg Thr Ser Asp Ile Leu Thr Gly Leu Asn Arg Met Glu305 310 315 320
Glu Gly Pro Trp Gly Ser Ile Arg Arg Gly Asp Pro Leu Asp Ala Arg
325 330 335
Gly Leu Ala Thr Arg Leu Gly Arg Tyr Gly Ile Gly Pro Lys Phe Gln
340 345 350
His Ser Gly Gly Glu Pro Pro Tyr Lys Gly Tyr Ser Arg Thr Gln Phe
355 360 365
Glu Asp Ala Trp Ser Arg Tyr Leu Ser Ala Asp Asp Glu Thr Pro Glu
370 375 380
Glu Arg Asp Leu Ser Val Ser Ala Val Ser Ala Val Ser Pro Pro Val385 390 395 400
Gly Asp Pro Gly Asp Ala Thr Gly Ala Thr Asp Ala Thr Asp Leu Pro
405 410 415
Glu Ala Gly Asp Leu Pro Tyr Glu Pro Pro Ala Pro Asn Gly His Pro
420 425 430
Asn Gly Asp Ala Pro Leu Cys Ser Gly Pro Gly Cys Pro Asn Lys Leu
435 440 445
Leu Ser Thr Glu. Ala Lys Ala Ala Gly Lys Cys Arg Pro Cys Arg Gly
450 455 460
Arg Ala Ala Ala Ser Ala Arg Asp Gly Ala Arg465 470 475
<210> 3
<211> 393
<212> DNA
<213> Mycobacterium tuberculosis<400> 3
atgaccgccg tcggcgggtc gccgccgacg cgacgatgcc cggccacaga ggaccgggca 60cccgcgacag tcgccacacc gtctagcacc gatcctaccg cgtcccgcgc cgtgtcgtgg 120
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ggcaccccgg cgtggtgcga cctcgacgac accgacccgg tcaaatgggc cgcgatctgc 240
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tcacgtgacg tatccgccgc cgccgactgg ccggcggtct ctcgggagat ccagcgtcgg 360
cgtgacgcct acattcggcg ggtggtggtc tga 393<210> 4
<211> 130
<212> PRT
<213> Mycobacterium tuberculosis
<400> 4
Met Thr Ala Val Gly Gly Ser Pro Pro Thr Arg Arg Cys Pro Ala Thr
1 5 10 15
Glu Asp Arg Ala Pro Ala Thr Val Ala Thr Pro Ser Ser Thr Asp Pro
20 25 30
Thr Ala Ser Arg Ala Val Ser Trp Trp Ser Val His Glu Tyr Val Ala35 40 45
Pro Thr Leu Ala Ala Ala Val Glu Trp Pro Met Ala Gly Thr Pro Ala50 55 60
Trp Cys Asp Leu Asp Asp Thr Asp Pro Val Lys Trp Ala Ala Ile Cys65 70 75 80
Asp Ala Ala Arg His Trp Ala Leu Arg Val Glu Thr Cys Gln Ala Ala
85 90 95
Ser Ala Glu Ala Ser Arg Asp Val Ser Ala Ala Ala Asp Trp Pro Ala
100 105 110
Val Ser Arg Glu Ile Gln Arg Arg Arg Asp Ala Tyr Ile Arg Arg Val115 120 125
Val Val130
<210> 5<211> 261<212> DNA
<213> Mycobacterium tuberculosis
<400> 5
atgtgcgcgt tcccgtcgcc gagtctcggg tggacggtct ctcacgagac cgaaaggccc 60ggcatggcag acgctccccc gttgtcacgg cggtacatca cgatcagtga ggccgccgaa 120tatctagcgg tcaccgaccg cacggtccgc cagatgatcg ccgacggccg cctacgcgga 180taccgctccg gcacccgcct cgtccgtctg cgccgcgatg aggtcgacgg cgccatgcac 240ccgttcggtg gtgccgcatg a 261
<210> 6<211> 86<212> PRT
<213> Mycobacterium tuberculosis
<400> 6
Met Cys Ala Phe Pro Ser Pro Ser Leu Gly Trp Thr Val Ser His Glu1 5 10 15
Thr Glu Arg Pro Gly Met Ala Asp Ala Pro Pro Leu Ser Arg Arg Tyr
20 25 30
Ile Thr Ile Ser Glu Ala Ala Glu Tyr Leu Ala Val Thr Asp Arg Thr35 40 45
Val Arg Gln Met Ile Ala Asp Gly Arg Leu Arg Gly Tyr Arg Ser Gly
50 55 60
Thr Arg Leu Val Arg Leu Arg Arg Asp Glu Val Asp Gly Ala Met His65 70 75 80
Pro Phe Gly Gly Ala Ala
85
<210> 7
<211> 363
<212> DNA
<213> Mycobacterium tuberculosis
<400> 7
atggccgatg cggttaagta cgtagttatg tgcaactgcg acgacgaacc gggagcgctc 60atcatcgcct ggatcgacga cgaacgaccc gccggcgggc acatacagat gcggtcgaac 120acccgcttca ccgaaacaca gtggggccgc catatcgagt ggaaactcga atgccgggca 180tgeegaaagt atgcgccgat atccgagatg accgccgcgg cgatcctcga cggtttcggg 240gcgaagcttc acgagctgag aacgtcgacc atccccgacg ctgacgatcc atcaatagca 300gaggcgcgac acgtaattcc gttcagcgca ttatgcttgc gcttgagcca gctaggcggg 360taa 363
<210> 8<211> 120<212> PRT
<213> Mycobacterixim tuberculosis
<400> 8
Met Ala Asp Ala Val Lys Tyr Val Val Met Cys Asn Cys Asp Asp Glu1 5 10 15
Pro Gly Ala Leu Ile Ile Ala Trp Ile Asp Asp Glu Arg Pro Ala Gly
20 25 30
Gly His Ile Gln Met Arg Ser Asn Thr Arg Phe Thr Glu Thr Gln Trp
35 40 45
Gly Arg His Ile Glu Trp Lys Leu Glu Cys Arg Ala Cys Arg Lys Tyr
50 55 60
Ala Pro Ile Ser Glu Met Thr Ala Ala Ala Ile Leu Asp Gly Phe Gly
65 70 75 80
Ala Lys Leu His Glu Leu Arg Thr Ser Thr Ile Pro Asp Ala Asp Asp
85 90 95
Pro Ser Ile Ala Glu Ala Arg His Val Ile Pro Phe Ser Ala Leu Cys
100 105 110
Leu Arg Leu Ser Gln Leu Gly Gly115 120
<210> 9
<211> 1128<212> DNA
<213> Myeobaeterium tuberculosis
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caactatggt ccccggcatc gggtcaggaa gaccgccccg gagccccatt cggtgagtac 240
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ttcaaggtga cgacaccgaa aagcgatgcg ggagtgcgcg acataagtat cccgccacat 780
ctgatacccg ccatcgaaga ccaccttcac aaacacgtca accccggccg ggagtccctg 840
ctgttcccat cggtcaacga ccccaaccgt cacctagcac cctcggcgct gtaccgcatg 900
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Gln Phe Asn Ser Gly Arg Trp Gln Ala Ser Tyr Thr Gly Pro Asp Gly
25 30
Arg Val Tyr Ile Ala Pro Lys Thr Phe Asn Ala Lys Ile Asp Ala Glu
35 40 45
Ala Trp Leu Thr Asp Arg Arg Arg Glu Ile Asp Arg Gln Leu Trp SerPro Ala Ser Gly Gln Glu Asp Arg Pro Gly Ala Pro Phe Gly Glu Tyr65 70 75 80
Ala Glu Gly Trp Leu Lys Gln Arg Gly Ile Lys Asp Arg Thr Arg Ala
85 90 95
His Tyr Arg Lys Leu Leu Asp Asn His Ile Leu Ala Thr Phe Ala Asp
100 105 110
Thr Asp Leu Arg Asp Ile Thr Pro Ala Ala Val Arg Arg Trp Tyr Ala
115 120 125
Thr Thr Ala Val Gly Thr Pro Thr Met Arg Ala His Ser Tyr Ser Leu
130 135 140
Leu Arg Ala Ile Met Gln Thr Ala Leu Ala Asp Asp Leu Ile Asp Ser145 150 155 160
Asn Pro Cys Arg Ile Ser Gly Ala Ser Thr Ala Arg Arg Val His Lys
165 170 175
Ile Arg Pro Ala Thr Leu Asp Glu Leu Glu Thr Ile Thr Lys Ala Met
180 185 190
Pro Asp Pro Tyr Gln Ala Phe Val Leu Met Ala Ala Trp Leu Ala Met
195 200 205
Arg Tyr Gly Glu Leu Thr Glu Leu Arg Arg Lys Asp Ile Asp Leu His
210 215 220
Gly Glu Val Ala Arg Val Arg Arg Ala Val Val Arg Val Gly Glu Gly225 230 235 240
Phe Lys Val Thr Thr Pro Lys Ser Asp Ala Gly Val Arg Asp Ile Ser
245 250 255
Ile Pro Pro His Leu Ile Pro Ala Ile Glu Asp His Leu His Lys His
260 265 270
Val Asn Pro Gly Arg Glu Ser Leu Leu Phe Pro Ser Val Asn Asp Pro
275 280 285
Asn Arg His Leu Ala Pro Ser Ala Leu Tyr Arg Met Phe Tyr Lys Ala
290 295 300
Arg Lys Ala Ala Gly Arg Pro Asp Leu Arg Val His Asp Leu Arg His305 310 315 320Ser Gly Ala Val Leu Ala Ala Ser Thr Gly Ala Thr Leu Ala Glu Leu
325 330 335
Met Gln Arg Leu Gly His Ser Thr Ala Gly Ala Ala Leu Arg Tyr Gln
340 345 350
His Ala Ala Lys Gly Arg Asp Arg Glu Ile Ala Ala Leu Leu Ser Lys
355 360 365
Leu Ala Glu Asn Gln Glu Met370 375
<210> 11<211> 228<212> DNA
<213> Mycobacterium tuberculosis
<400> 11
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<212> PRT
<213> Mycobacterium tuberculosis
<400> 12
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Gly Thr Glu Gln Arg Asn Leu Ser Val Val Ala Pro Ser Gln Phe Thr
35 40 45
Phe Ser Ser Arg Ser Pro Asp Phe Val Asp Glu Thr Ala Gly Gln Ser
50 55 60
Trp Cys Ala Ile Leu Gly Leu Asn Gln Phe His65 70 75<210> 13
<211> 390
<212> DNA
<213> Mycobacterium tuberculosis
<400> 13
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<210> 14
<211> 129
<212> PRT
<213> Mycobacterium tuberculosis
<400> 14
Met Arg Ala Arg Ser Asp Ala Gly Gly Gln Ser Val Lys1 5 10
Ser Asn Arg Ser Arg Ser Ser Arg Arg Ser Arg Val Arg
20 25
Ser Ala Leu Val Asp Asn Pro Gln Ala Arg Pro Arg Glu
35 40 45
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50 55 60
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Ser Arg Ser Gln Lys Ala Ser Ala Val Val Ile Ser Ser100 105
Val Ala Arg Val Arg Arg Ala Ser Val Ser Ser Val Asp
Ser Arg Thr15
Ser Ser Ile30
Leu Pro Val
Glu Phe Val
Pro Ala Ala80
Thr Val Cys95
Val Ser Ser110
Ala Thr Thr115 120 125
Ala
<210> 15
<211> 273
<212> DNA
<213> Mycobacterium tuberculosis
<400> 15
atggatgacc tgacgcggct ccggcgcgag cttctggacc gattcgacgt gcgggacttc 60
acagactggc ctccagcatc gctgcgagcc ctcatcgcga cctacgaccc ctggatcgac 120atgacggcca gcccgccaca gcctgtatcg cccggagggc ctcgactccg actcgtgcga 180ttaaccacca acccatccgc gagagcagcc cctatcggaa acggtgggga ctcttctgtt 240tgcgctggtg agaaacagtg ccgcccaccg tag 273
<210> 16<211> 90
<212> PRT
<213> Mycobacterium tuberculosis
<400> 16
Met Asp Asp Leu Thr Arg Leu Arg Arg Glu Leu Leu Asp Arg Phe Asp1 5 10 15
Val Arg Asp Phe Thr Asp Trp Pro Pro Ala Ser Leu Arg Ala Leu Ile20 25 30
Ala Thr Tyr Asp Pro Trp Ile Asp Met Thr Ala Ser Pro Pro Gln Pro
35 40 45
Val Ser Pro Gly Gly Pro Arg Leu Arg Leu Val Arg Leu Thr Thr Asn
50 55 60
Pro Ser Ala Arg Ala Ala Pro Ile Gly Asn Gly Gly Asp Ser Ser Val65 70 75 80
Cys Ala Gly Glu Lys Gln Cys Arg Pro Pro85 90
<210> 17
<211> 234
<212> DNA<213> Mycobacterium tuberculosis
<400> 17
gtggaggtga gggctagcgc ccgcaagcac ggcatcaacg acgacgccat gctccacgca 60
taccgcaacg cgctgcgcta cgtcgaactg gaataccacg gcgaagttca actgctggtg 120atcggccccg accaaaccgg gcgcctttta gagctggtca tcccagcaga cgaaccaccc 180cggattatcc acgccaacgt actacgcccg aagttctacg actacctgag gtga 234
<210> 18<211> 77
<212> PRT
<213> Mycobacterixam tuberculosis
<400> 18
Val Glu Val Arg Ala Ser Ala Arg Lys His1 5 10
Met Leu His Ala Tyr Arg Asn Ala Leu Arg20 25
His Gly Glu Val Gln Leu Leu Val Ile Gly
35 40
Leu Leu Glu Leu Val Ile Pro Ala Asp Glu50 55
20 Ala Asn Val Leu Arg Pro Lys Phe Tyr Asp65 70
Gly Ile Asn Asp Asp Ala
Tyr Val Glu Leu Glu Tyr30
Pro Asp Gln Thr Gly Arg45
Pro Pro Arg Ile Ile His60
Tyr Leu Arg75

Claims (22)

1. Composição imunogênica, vacina ou composição farmacêuti-ca, caracterizada pelo fato de que compreende:(i) um polipeptídeo de fusão compreendendo um ou mais antígenosinduzidos por inanição ou um ou mais fragmentos de polipeptídeos selecio-nados da SEQ ID NO. 2, 4, ,6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30,-32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70,-72, 74, 76, 78, 80, 82, 84 e 86; ou(ii) um ou mias fragmentos dos referidos polipeptídeos
2. Composição imunogênica, vacina ou composição farmacêuti-ca, caracterizada pelo fato de que compreende um polipeptídeo de fusão deacordo com a reivindicação 1, onde os polipeptídeos induzidos por inaniçãoou fragmentos de polipeptídeos são fundidos em ESAT6, Ag85B, TB10.4e/ou Ag85A, ou seus análogos, e em qualquer combinação e ordem de posição.
3. Composição imunogênica, vacina ou composição farmacêuti-ca de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 2, caracterizadapelo fato de que é para uso profilático, uso terapêutico, uma vacina de múlti-plas fases, ou para ser usada para reforçar a imunidade da vacinação deBCG anterior.
4. Composição imunogênica, vacina ou composição farmacêuti-ca de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 3, caracterizadapelo fato de que deve ser administrada intradérmica, transdérmica, subcutâ-nea, intramuscular ou mucosalmente.
5. Composição imunogênica, vacina ou composição farmacêuti-ca de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que o poli-peptídeo de fusão compreende 2 diferentes polipeptídeos imunogênicos ouseus análogos.
6. Composição imunogênica, vacina ou composição farmacêuti-ca de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que o poli-peptídeo de fusão compreende 3 diferentes polipeptídeos imunogênicos ouseus análogos.
7. Composição imunogênica, vacina ou composição farmacêuti-ca de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que o poli-peptídeo de fusão compreende 4 diferentes polipeptídeos imunogênicos ouseus análogos.
8. Composição imunogênica, vacina ou composição farmacêuti-ca de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelofato de que compreende polipeptídeos de fusão com combinações de E-SAT6-Ag85A-X, ESAT6-Ag85B-X, Ag8A-X, Ag85B-X, TB10-Ag85A-X, TB10-Ag85B-X onde X é qualquer um dos antígenos induzidos por inanição e ondea ordem das unidades de antígeno pode ser de qualquer combinação, porexemplo, onde a ordem é invertida ou X é posicionado no centro.
9. Composição imunogênica, vacina ou composição farmacêuti-ca de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que compre-ende uma seqüência de aminoácido, selecionada das seqüências de amino-ácido que codificam os seguintes polipeptídeos de fusão:Ag85B-ESAT6-Rv2660c;Ag85B-ESAT6-Rv2659c;Ag85B-TB10.4-Rv2660c;Ag85B-TB10.4-Rv2659c;Ag85B-Rv2660c;Ag85B-Rv2659c;Ag85A-Rv2660c;Ag85A-Rv2659cAg85A-ESAT6-Rv2660c;Ag85A-ESAT6-Rv2659c;Ag85A-TB10.4-Rv2660c;Ag85A-TB10.4-Rv2659c;Rv2660c-Rv2659c;Ag85B-ESAT6-Rv2660c-Rv2659c;em qualquer ordem das unidades de polipeptídeo, ou seus análogos.
10. Polipeptídeo de fusão, caracterizado pelo fato de ser tal co-mo definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8.
11. Vacina ou composição farmacêutica, caracterizada pelo fatode que compreende um fragmento de ácido nucléico compreendendo umaseqüência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo de fusão de acordocom qualquer uma das reivindicações 1 a 9.
12. Vacina ou composição farmacêutica como definida na reivin-dicação 11, caracterizada pelo fato de ser formulada para uso profilático, usoterapêutico ou ambos, uma vacina de múltiplas fases, ou a ser usada parareforçar a imunidade da vacinação de BCG anterior.
13. Composição imunogênica, vacina ou composição farmacêu-tica, caracterizada pelo fato de que compreende:(i) um ou mais antígenos induzidos por inanição selecionados dogrupo constituído de SEQ ID NO. 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26,-28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66,-68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84 e 86; ou(ii) um ou mias fragmentos dos referidos antígenos.
14. Composição imunogênica, vacina ou composição farmacêu-tica de acordo com a reivindicação 15, caracterizada pelo fato de ser formu-lada para uso profilático, uso terapêutico, uma vacina de múltiplas fases, oupara ser usada para reforçar a imunidade da vacinação de BCG anterior.
15. Composição imunogênica, vacina ou composição farmacêu-tica de acordo com a reivindicação 13 ou 14, caracterizada pelo fato de queser formulada para ser administrada intradérmica, transdérmica, subcutânea,intramuscular ou mucosalmente.
16. Vacina ou composição farmacêutica, caracterizada pelo fatode que compreende um fragmento de ácido nucléico, que compreende umaseqüência de nucleotídeo que codifica um antígeno induzido por inanição oufragmento deste.
17. Uso da composição imunogênica, vacina ou composiçãofarmacêutica como definidas em qualquer uma das reivindicações 1 a 9 e 11a 16, caracterizado pelo fato de que é para produção de um medicamentopara tratar tuberculose ativa ou latente causada por uma micobactéria viru-Ienta ou para reforçar a imunidade da vacinação de BCG anterior.
18. Uso da composição imunogênica, vacina ou composiçãofarmacêutica como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 9 e 11a 16, caracterizado pelo fato de que é para produção de um medicamentopara profilaxia contra uma infecção por micobactéria virulenta.
19. Uso de acordo com a reivindicação 17 ou 18, caracterizadopelo fato de que a micobactéria é selecionada de M. tuberculosis, M. bovis,M. afrícanum, Mycobacterium lepra ou Mycobacterium uíeerans.
20. Uso da composição imunogênica, vacina ou composiçãofarmacêutica como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 9 e 11a 16, caracterizado pelo fato de que é para produção de uma composiçãopara administração intradérmica, transdérmica, subcutânea, intramuscularou mucosalmente.
21. Uso da composição imunogênica, vacina ou composiçãofarmacêutica como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 9 e 11a 16, caracterizado pelo fato de que é para produção de uma composiçãopara vacinação profilaxia, vacinação reforçadora, vacinas de múltiplas fasesou vacinação terapêutica contra micobactéria.
22. Uso de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelofato de que a micobactéria é selecionada de Myeobaeterium tuberculosis,Mycobaeterium afrícanum, Mycobacterium bovis, Mycobacterium lepra ouMyeobaeterium virulent.
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B08F Application dismissed because of non-payment of annual fees [chapter 8.6 patent gazette]

Free format text: REFERENTE A 15A ANUIDADE.

B08K Patent lapsed as no evidence of payment of the annual fee has been furnished to inpi [chapter 8.11 patent gazette]

Free format text: REFERENTE AO DESPACHO 8.6 PUBLICADO NA RPI 2624 DE 20/04/2021.