BRPI0610055A2 - polimorfismos em gene para fator de transcrição mitocondrial a ("tfam") e suas associações com medidas de marmorização e profundidade de gordura subcutánea em gado de corte - Google Patents

Abstract

POLIMORFISMOS EM GENE PARA FATOR DE TRANSCRIçãO MITOCONDRIAL A ("TFAM") E SUAS ASSOCIAçõES COM MEDIDAS DE MARMORIZAçãO E PROFUNDIDADE DE GORDURA SUBCUTáNEA EM GADO DE CORTE. A presente invenção refere-se a regulação fisiológica de consumo, crescimento e divisão de energia em animais está sob o controle de múltiplos genes, que poderão ser importantes candidatos a desembaraçar a variação genética em ações economicamente relevantes na produção de carne. A presente invenção refere-se à identificação de polimorfismos simples em nucleotídeo (SNPs) no gene bovino que codifica fator de transcrição mitocondrial A (" TFAM') e suas associações com ações economicamente relevantes na produção de carne. A invenção abrange adicionalmente métodos e sistemas, incluindo processos baseados em rede, para administrar os dados de SNP e outros dados relativos a animais e manadas de animais específicos, cuidado veterinário, dados de diagnóstico e de controle de qualidade, e administração de criação que, com base em genotipificação, apresenta ações previsíveis de qualidade da carne, condições económicas, saúde do animal, informação sobre segurança alimentar, exame de processos existentes e dados originários de localizações de campo.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "POLIMOR-FISMOS EM GENE PARA FATOR DE TRANSCRIÇÃO MITOCONDRIAL A("TFAM") E SUAS ASSOCIAÇÕES COM MEDIDAS DE MARMORIZAÇÃOE PROFUNDIDADE DE GORDURA SUBCUTÂNEA EM GADO DE CORTE".

INCORPORAÇÃO COMO REFERÊNCIA

Este pedido reivindica benefício de pedido de patente provisórioEstados Unidos N9. de Série 60/685.213, depositado em 27 de maio de 2005.

Os pedidos precedentes, e todos os documentos citados nelesou durante sua execução ("documentos citados nos pedidos") e todos osdocumentos citados ou referidos nos documentos citados nos pedidos, etodos os documentos citados ou referidos neste relatório descritivo ("docu-mentos citados neste relatório descritivo") e todos os documentos citados oureferidos nos documentos citados neste relatório descritivo, juntamente comquaisquer instruções, descrições, especificações de produto e folhetos deproduto para quaisquer produtos mencionados neste relatório descritivo ouem qualquer documento incorporado como referência neste relatório descri-tivo, são incorporados neste relatório descritivo como referência, e poderãoser empregados na prática da invenção.

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se à identificação de polimorfismosem um único nucleotídeo (SNPs) nos genes de bovinos que codificam fatorde transcrição mitocondrial A {"TFAM') e suas associações com característi-cas economicamente relevantes na produção de carne. A invenção refere-seadicionalmente a métodos e sistemas, incluindo processos baseados emrede, para administrar os dados de SNP e outros dados relativos a animaisespecíficos e rebanhos de animais, cuidado veterinário, dados de diagnósti-co e de controle de qualidade e administração de criação que, com base emgenotipificação, apresentam características previsíveis de qualidade da car-ne, condições econômicas, saúde do animal, informação sobre segurançaalimentar, exame de processos existentes e dados originários de localiza-ções de campo.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Aperfeiçoamentos significativos no desempenho, eficiência ecarcaça do animal e qualidade da carne foram relizados através dos anospela aplicação de técnicas padrões de reprodução e seleção de animais.Entretanto, tais técnicas clássicas de reprodução animal exigem diversosanos de avaliação genética de registros de desempenho em animais indivi-duais e seus pais e são, portanto, muito caras. Outros esforços têm sido fei-tos para aperfeiçoar a produtividade e qualidade pela aplicação de práticasde administração tais como o uso de aditivos alimentares, implantes de hor-mônio animal e quimioterapêutica. No entanto, há significativa resistênciapolítica e regulatória à introdução e uso de tais metodologias. Essas metodo-logias não são também passíveis de serem herdadas e precisam ser aplica-das diferentemente em cada sistema de produção.

Há uma necessidade de métodos que permitam seleção e re-produção relativamente fáceis e mais eficientes de animais de fazenda comuma vantagem em relação a características não passíveis de serem herda-das de níveis circulantes de leptina, consumo de alimentação, taxa de cres-cimento, peso corporal, valor da carcaça e composição da carcaça. A signifi-cância econômica do uso de marcadores genéticos que são associados acaracterísticas específicas economicamente importantes (especialmente ca-racterísticas com baixa hereditariedade) em criação de animais por meio deseleção auxiliada por marcadores não pode, portanto, ser excessivamenteenfatizada.

A regulação fisiológica de consumo, crescimento e divisão deenergia em animais está sob o controle de múltiplos genes, que poderão serimportantes candidatos para elucidar a variação genética em característicaseconomicamente relevantes (ERT) na produção de carne. Polimorfismosnesses genes candidatos que mostram associação com ERT específico sãonucleotídeos com características quantitativas úteis para seleção auxiliadapor marcadores.

Fator de transcrição mitocondrial A ("TFAM'), um membro de umgrupo de famílias de proteínas de alta mobilidade e o primeiro fator de trans-crição mitocondrial identificado (Fisher e Clayton, Mol Cell Biol. 1988;8:3496-509), é essencial para manutenção e biogênese de DNA mitocondrial(mtDNA). Primeiro, TFAM desempenha um papel semelhante a histona emmitocôndrias, na medida em que está firmemente associado a mtDNA comprincipal componente do nucleóide (Kanki e outros, Mol Cell Biol. 2004;24:9823-34). Evidência tem mostrado que uma molécula de mtDNA é envol-vida por -900 moléculas de TFAM em média (Alam e outros, Nucleic AcidsRes. 2003; 31:1640-5), o que faz com que mtDNA não mais apareça desnu-da. Segundo, TFAM regula número de cópias de mtDNA em mamíferos.. In-vestigação usando uma combinação de camundongos com superexpressãode TFAMe knockoutde TFAM demonstrou que número de cópias de mtDNAé diretamente proporcional ao nível total de proteína de TFAM em embriõesde camundongos (Ekstrand e outros, Hum Mol Genet. 2004; 13:935-44). In-terferência da expressão endógena de TFAM no RNA de células HeLa tam-bém indicou que a quantidade de mtDNA correlaciona-se em paralelo com aquantidade de TFAM (Kanki e outros, Ann N Y Acad Sei. 2004; 1011:61-8).Terceiro, TFAM estimula transcrição de mtDNA. A proteína de TFAM possuidois domínios de grupos de alta mobilidade em tandem, o que faz comTFAM ligue, desenrole e duplique DNA sem especificidade de seqüências e,assim, facilita iniciação de transcrição de mtDNA (Gaspari e outros, 2004;1659:148-52). Evidência tem mostrado que importação de wt- TFAM em mi-tocôndrias de fígado de ratos com hipotireóide aumentou a síntese de RNAsignificativamente até 4 vezes (Garstka e outros, Nucleic Acids Res. 2003;31:5039-47).

Sabe-se há muitos anos que o tecido adiposo desempenha umpapel central na regulação e manipulação de metabolismos de energia pormeio do armazenamento e movimentação de triglicerídeos e pela secreçãode fatores que afetam a saciedade e utilização de combustível. No entanto,muitos aspectos-chave de adipogênese são acompanhados de estimulaçãode biogênese mitocondrial (Wilson-Fritch e outros, Mol Cell Biol. 2003;23:1085-94). Por exemplo, o principal sítio de p-oxidação de ácidos graxosocorre em mitocôndrias (Reichert e Neupert, Trends Genet. 2004; 20:555-62), o que poderá proporcionar intermediários-chave para a síntese de trigli-cerídeos via ação de piruvato carboxilase (Owen e outros, J Biol Chem.2002; 277:30409-12). Adicionalmente, uma massa mitocondrial relativamen-te grande é necessária para gerar acetil-CoA para ativação de ácidos graxosantes de esterificação em triglicerídeos. Todos esses estudos demonstraramo papel e função essenciais de mitocôndrias no metabolismo de lipídeos.

Para explorar adicionalmente o mecanismo de mitocôndrias en-volvidas em adipogênese, Wilson-Fritch e outros (Wilson-Fritch e outros, MolCell Biol. 2003; 23:1085-94 e Wilson-Fritch e outros, J Clin Invest. 2004;114:1281-9) estudaram a diferenciação de células 3T3-L1 (representante deadipócitos brancos) utilizando tanto abordagem proteômica quanto aborda-gem genômica. Análise proteômica revelou um aumento de 20 a 30 vezesna concentração de numerosas proteínas mitocondriais, enquanto análisegenômica com perfil de expressão de genes usando Affymetrix GeneChipsdetectou um aumento estatisticamente significativo na expressão de muitosgenes mitocondriais codificados no núcleo durante adipogênese. Em particu-lar, os autores verificaram uma profunda diminuição de aproximadamente50% nos níveis de transcritos de genes mitocondriais codificados no núcleoque acompanham o início de obesidade (Wilson-Fritch e outros, J Clin In-vest. 2004; 114:1281-9)r

Continua vantajoso proporcionar SNPs adicionais que poderãopredizer mais precisamente o fenótipo de qualidade da carne de um animal etambém um método de trabalho comercial que proporciona aumento de efi-ciência na produção de gado de corte, bem como proporcionar acesso a vá-rios registros dos animais e permitir comparações com metas esperadas oudesejadas com relação à qualidade e quantidade de animais produzidos.

Citação ou identificação de qualquer documento neste pedidonão é admissão de que esse documento está disponível como estado datécnica à presente invenção.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se à identificação de polimorfismossimples em nucleotídeo (SNPs) nos genes bovinos que codificam fator detranscrição mitocondrial A ("TFAM') e suas associações com característicaseconomicamente relevantes na produção de carne.

A invenção abrange um método para subagrupar animais de a-cordo com genótipo em que os animais de cada subgrupo apresentam umpolimorfismo similar em um gene para TFAM, o que poderá compreenderdeterminar o genótipo de cada animal a ser subagrupado mediante determi-nação da presença de um polimorfismo em um único nucleotídeo no genepara TFAM, e segregar animais individuais em subgrupos em que cada ani-mal em um subgrupo apresenta um polimorfismo similar no gene paraTFAM.

A invenção também abrange um método para subagrupar ani-mais de acordo com genótipo em que os animais de cada subgrupo apre-sentam um genótipo similar no gene para TFAM, o que poderá compreenderdeterminar o genótipo de cada animal a ser subagrupado mediante determi-nação da presença de polimorfismo(s) em um único nucleotídeo de interesseno gene para TFAM, e segregar animais individuais em subgrupos depen-dendo de se os animais apresentam ou não o(s) polimorfismo(s) em um úni-co nucleotídeo de interesse no gene para TFAM.

O(s) polimorfismo(s) em um único nucleotídeo de interesse po-derá(ão) ser selecionado(s) do grupo que consiste em uma substituição Aem C na posição do nucleotídeo -1220 no promotor do gene para TFAM,uma substituição T em C na posição -1212 no promotor do gene para TFAMe uma substituição T em C na posição -995 no promotor do gene paraTFAM.

A invenção refere-se adicionalmente a um método para suba-grupar animais de acordo com genótipo em que os animais de cada subgru-po apresentam um genótipo similar no gene para TFAM, o que poderá com-preender determinar o genótipo de cada animal a ser subagrupado mediantedeterminação da presença de qualquer um dos SNPs acima, e segregar a-nimais individuais em subgrupos dependendo de se os animais apresentamou não qualquer um dos SNPs acima no gene para TFAM.A invenção também se refere a método para identificação de umanimal que apresenta um fenótipo desejável em comparação com a popula-ção geral de animais dessa espécie, o que poderá compreender determinara presença de um polimorfismo em um único nucleotídeo no gene paraTFAM do animal, em que a presença do SNP é indicativa de um fenótipodesejável.

Em uma modalidade vantajosa, o animal poderá ser um bovino.Em uma outra modalidade, vantajosa, o gene para TFAM poderá ser um ge-ne bovino para TFAM.

A invenção também abrange métodos e sistemas auxiliados porcomputador para aperfeiçoar a eficiência de criação de gado que apresen-tam notável carne tenra utilizando dados múltiplos, e em particular o genóti-po dos animais na medida em que ele se relaciona com SNPs de TFAM.

Métodos da invenção abrangem obter uma amostra genética de cada animalem um rebanho de gado, determinar o genótipo de cada animal com relaçãoa características de qualidade específicas conforme definido por um painelde pelo menos dois polimorfismos em um único polinucleotídeo (SNPs), a-grupar animais com genótipos semelhantes e, opcionalmente, adicionalmen-te subagrupar animais com base em fenótipos semelhantes. Métodos dainvenção poderão também abranger obter e manter dados que se relacio-nam com os animais ou com rebanhos, suas condições econômicas.-cuida-do e condição de saúde e veterinária, histórico ou linhagem genética, e for-necer esses dados a outros sistemas diretos que se baseiam em rede, con-tidos em bancos de dados ou ligados ao próprio animal tal como por um mi-crochip implantado. Um aspecto vantajoso da presente invenção, portanto,refere-se a um sistema de computador e métodos auxiliados por computadorpara rastrear características de qualidade do gado que possuem predisposi-ções genéticas específicas.

A presente invenção abrange vantajosamente métodos e siste-mas auxiliados por computador para adquirir dados genéticos, particular-mente dados genéticos como definido pela ausência ou presença de umSNP no gene para TFAM relacionado com características de qualidade dacarne da linhagem de animal, e associar esses dados com outros dados so-bre o animal ou seu rebanho e manter esses dados de maneira que sejamaccessíveis. Um outro aspecto da invenção abrange um método auxiliadopor computador para predizer que animais possuem uma diferença biológicana qualidade da carne, e que poderá incluir as etapas de usar um sistema decomputador, por exemplo, um computador programado que compreende umprocessador, um sistema de armazenamento de dados, um dispositivo deentrada e um dispositivo de saída, as etapas de: (a) inserir no computadorprogramado, por meio do dispositivo de entrada, dados que incluem um ge-nótipo de um animal na medida em que ele se relaciona com qualquer umdos SNPs de TFAM descritos neste relatório, (b) correlacionar qualidade dacarne predita pelo genótipo de TFAM usando o processador e o sistema dearmazenamento de dados, e (c) sair pelo dispositivo de saída a qualidade decarne correlacionada com o genótipo de TFAM, predizendo desse modo queanimais possuem uma qualidade particular de carne.

Ainda um outro aspecto da invenção refere-se a um método detrabalho comercial para administrar criação de animais o qual compreendeproporcionar a um usuário sistema de computador para administrar criaçãode animais que compreendem características físicas e genótipos que cor-respondem a um ou mais animais, ou um dispositivo de leitura por computa-dor para administrar criação de animais que compreendem característicasfísicas e genótipos que correspondem a um ou mais animais ou característi-cas físicas e genótipos que correspondem a um ou mais animais, em queuma entrada de característica física, crescimento ou carcaça fazem jus agado de corte e o genótipo é um genótipo de TFAM.

Observa-se que neste relatório descritivo e particularmente nasreivindicações e/ou parágrafos, termos tais como "compreende", "compreen-dido", "compreendendo/que compreende" e similares podem ter o significadoatribuído a eles na Lei de Patentes dos Estados Unidos; por exemplo, elespodem significar "inclui", "incluído", "incluindo/que inclui" e similares; e quetermos tais como "consistindo/que consiste essencialmente em" e "consisteessencialmente em" têm o significado atribuído a eles na Lei de Patentesdos Estados Unidos; por exemplo, eles permitem elementos não explicita-mente enumerados, mas excluem elementos que são encontrados no estadoda técnica ou que afetam uma característica básica ou nova da invenção.

Essas e outras modalidades são descritas ou são óbvias a partirde e abrangidas pela Descrição Detalhada seguinte.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A descrição detalhada seguinte, dada à guisa de exemplo, masnão pretendendo limitar a invenção somente às modalidades específicasdescritas, poderá ser melhor entendida em conjunto com os desenhos a-companhantes, em que:

A figura 1 proporciona uma anotação esquemática de seqüên-cias de cDNA e de DNA genômico do gene bovino para TFAM usando umacombinação de abordagem in silico com amplificação da região-alvo por PCR.

A figura 2 proporciona uma seqüência de nucleotídeos da regiãoa montante do gene bovino para TFAM (ID SEQ NO: 1). Essa seqüênciacorresponde à região de flanqueamento 5' e éxon 1. A seqüência de codifi-cação está sombreada. O sítio de transcrição putativa foi numerado como+1. Seqüências de consenso para SP1, NRF1 e repressor de transcriçãopotenciais são mostrados por setas. Muitos loci potenciais de mCpG estãosublinhados. Um códon extra de AUG a montante de sítio de tradução nor-mal está em negrito e marcado. Ambas as substituições C/A e C/T são mar-cadas por setas e números.

A figura 3 proporciona uma demonstração de um SNP C/A e umSNP C/T SNP na região promotora de TFAM bovino. Esquerda: um homozi-goto com CC e CC; Direita: um homozigoto com AA e TT em duas posiçõesseparadas por 9 pb inclusive.

A figura 4 proporciona genotipificação de dois SNPs por PCR-RFLP no promotor bovino de TFAM. Faixas 1 e 8: degraus de 100 pb. Faixas2 - 7: um fragmento de 801 pb foi digerido com enzima de restrição Dpnll.Faixas 2 e 3, animais TT (55+68+135+241+302 pb); faixas 4 e 5, animais CT(55+68+135+241+302+543 pb); e faixas 6 e 7, animais CC (55+68+135+543pb). Faixas 9 - 14: um fragmento de 801 pb foi digerido com enzima de res-trição Haelll. Faixas 9 e 10, animais AA (152+187+462 pb); faixas 11 e 12,animais CA (83+104+152+187+462 pb); e faixas 13 e 14, animais CC(83+104+152+462 pb).

A figura 5 identifica polimorfismos genéticos nos genes bovinospara TFAM, TFB1M e TFB2M. A. Uma terceira mutação de substituição C/Tna região promotora de TFAM. B. Duas mutações detectadas no genebovino para TFB1M usando poolsóe DNA. C. Cinco mutações reveladas nogene bovino para TFB2M usando pooís de DNA.

A figura 6A proporciona uma seqüência de cDNA (2259 pb) (IDSEQ NO: 2) de TFAMóe gado.

A figura 6B proporciona uma seqüência de DNA genômico(16666bp) (ID SEQ NO: 3) de TFAM de gado. Éxons são sombreados, bemcomo sítios de mutação. Vide, por exemplo, Nos. de Acesso GenBankAAFC02110692 e AAFC02019444.

A figura 7 ilustra um fluxograma da entrada de dados e da saídade resultados a partir da análise e correlação dos dados pertencentes àshistórias de reprodução e veterinárias e exigências de desempenho de umgrupo de animais, tal como de um rebanho de vacas, e do fluxo interativo dedados do dispositivo auxiliado por computador para um corpo de estudantesque aprendem-o uso do método da invenção.

A figura 8 ilustra relações potenciais entre os elementos de da-dos a serem entrados no sistema. Setas unidirecionais indicam, por exem-plo, que um celeiro tipicamente pertence a apenas uma fazenda, conside-rando que uma fazenda poderá possuir diversos celeiros. Similarmente, umaprescrição poderá incluir produtos veterinários.

A figura 9A ilustra o fluxo de eventos no uso do sistema baseadoem computador portátil para entrada de dados sobre a reprodução e criaçãode um rebanho de vacas.

A figura 9B ilustra o fluxo de eventos por meio das sub-rotinasrelacionadas com entrada de dados concernentes a administração de fazenda.A figura 9C ilustra o fluxo de eventos por meio das sub-rotinasrelacionadas com entrada de dados concernentes a dados específicos auma empresa.

A figura 10 ilustra um fluxograma da entrada de dados e da saí-da de resultados a partir da análise e da correlação dos dados pertencentesàs histórias de reprodução e veterinárias e exigências de desempenho deum grupo de animais.

DESCRIÇÃO DETALHADA

A prática da presente invenção empregará, a não ser que indi-cado de outro modo, técnicas convencionais de biologia molecular, microbio-logia, tecnologia de DNA recombinante e imunologia, que estão dentro dacapacidade do estado da técnica. Tais técnicas são explicadas completa-mente na literatura. Vide, por exemplo, Sambrook e outros, (2001) MolecularCloning: A Laboratory Manual (Clonagem Molecular: Manual de Laboratório),3>- ed., Cold Spring Harbor Press; DNA Cloning (Clonagem de DNA), Vol. I eII (D. N. Glover ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis (Síntese de Oligonucle-otídeos) (M. J. Gait ed. 1984); Nucleic Acid Hybridization (Hibridização deÁcidos Nucléicos) (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); Animal Cell Cul-ture (Cultura de Células Animais) (R. K. Freshney ed. 1986); ImmobilizedCélulas and Enzymes (Células e Enzimas Imobilizadas) {IRL press, 1986);_ Perbal, B., A Practical Guide to Molecular Cloning (Guia Prático de Clona-gem Molecular) (1984); a série, Methods In Enzymology (Métodos em Enzi-mologia) (S. Colowick e N. Kaplan eds., Academic Press, Inc.); e Handbookof Experimental Immunology (Manual de Imunologia Experimental), Vol. I-IV(D. M. Weir e C. C. Blackwell eds., 1986, Blackwell Scientific Publications(Publicações Científicas Blackwell).

Antes de descrever a presente invenção em detalhes, deve-seentender que esta invenção não se limita a DNA particular; seqüências depolipeptídeos ou parâmetros de processo como tais poderão, naturalmente,variar. Deve-se também entender que a terminologia usada neste relatóriotem a finalidade de descrever modalidades particulares da invenção apenas,e não pretendem ser limitativas.A não ser que definido de outra maneira, todos os termos técni-cos e científicos usados neste relatório têm os mesmos significados comocomumente entendido por aquele versado no estado da técnica à qual a in-venção pertence. Embora vários métodos e materiais similares ou equivalen-tes àqueles descritos aqui possam ser utilizados na prática da presente in-venção, os materiais e métodos preferidos são descritos neste relatório.

Ao descrever a presente invenção, os termos seguintes serãoempregados e pretende-se que sejam definidos como indicado abaixo.

O termo "vaca" ou "gado" é usado geralmente para referir-se aum animal de origem bovina de qualquer idade. Termos intercambiáveis in-cluem "bovino", "bezerro", "boi", "touro", "novilho" e similares. Eles tambémincluem um animal individual em todos os estágios de desenvolvimento, in-cluindo estágios embrionários e fetais. Os animais como referidos neste rela-tório poderão também incluir indivíduos ou grupos de indivíduos que são cri-ados para produção de alimentos diferente, tais como, mas sem limitar aosmesmos, animais transgênicos para a produção de produtos biofarmacêuti-cos que incluem anticorpos e outras proteínas ou produtos protéicos.

Pelo termo "complementaridade" ou "complementar" entende-se,para os fins do relatório descritivo ou reivindicações, um número suficienteno oligonucleotídeo de pares de bases complementares em sua seqüênciapara interagir especificamente (hibridizar) com uma seqüêneia-alvo de áci-dos nucleicos do polimorfismo a ser amplificado ou detectado. Como sabidodaqueles versados no estado da técnica, um grau de complementaridademuito alto é necessário para especificidade e sensibilidade que envolvemhibridização, embora não precise ser 100%. Assim, por exemplo, um oligo-nucleotídeo que é idêntico em seqüência de nucleotídeos a um oligonucleo-tídeo aqui descrito, exceto por uma alteração ou substituição de base, pode-rá funcionar equivalentemente aos oligonucleotídeos descritos. Um genepara "DNA complementar" ou "cDNA" inclui genes recombinantes sintetiza-dos por transcrição inversa de RNA mensageiro ("mRNA").

Uma "reação mediada por polimerase cíclica" refere-se a umareação bioquímica em que uma molécula-padrão ou uma população de mo-léculas-padrão é periódica e repetidamente copiada para criar uma molécu-la-padrão complementar ou moléculas-padrões complementares, aumentan-do desse modo o número das moléculas-padrões com o tempo.

Pelo termo "porção detectável" entende-se, para os fins do rela-tório descritivo ou reivindicações, uma molécula marcada (isotópica ou não-isotópica) que é incorporada indireta ou diretamente em um oligonucleotí-deo, em que a molécula marcada facilita a detecção do oligonucleotídeo emque está incorporada, por exemplo quando o oligonucleotídeo é hibridizadocom seqüências polimórficas de genes amplificada. Assim, "porção detectá-vel" é usada sinonimamente com "molécula marcada". Síntese de oligonu-cleotídeos pode ser realizada por meio de um de diversos métodos conheci-dos daqueles versados no estado da técnica. Moléculas marcadas, conheci-das daqueles versados no estado da técnica como sendo úteis para detec-ção, incluem moléculas quimiluminescentes, fluorescentes ou luminescen-tes. São conhecidas no estado da técnica várias moléculas fluorescentesque são adequadas para uso para marcar um ácido nucléico no método dapresente invenção. O protocolo para tal incorporação poderá variar depen-dendo da molécula fluorescente usada. Tais protocolos são conhecidos noestado da técnica para a respectiva molécula fluorescente.

"Amplificação de DNA", conforme usado neste relatório, refere-se a qualquer processo que aumenta o número de cópias de uma seqüênciaespecífica de DNA amplificando enzimaticamente a seqüência de ácidosnucléicos. Uma variedade de processos é conhecida. Um dos mais comu-mente usados é o processo de reação em cadeia de polimerase (PCR) deMullis conforme descrito na Patente dos Estados Unidos N-s. 4.683.195 e4.683.202. Métodos, dispositivos e reagentes conforme descrito na Patentedos Estados Unidos N-s. 6.951.726; 6.927.024; 6.924.127; 6.893.863

6.887.6646.846.6316.794.1336.750.0226.696.277

6.881.5596.844.1586.790.9526.744.7896.664.080

6.855.5226.844.1556.783.9406.733.9996.664.064

6.855.5216.818.4376.773.9016.733.9726.664.044

6.849.4306.818.4026.770.4406.703.236RE38.352

6.849.4046.794.1776.767.7246.699.7136.650.7196.645.758; 6.645.720; 6.642.000; 6.638.716; 6.632.653; 6.617.107;

6.613.560; 6.610.487; 6.596.492; 6.586.250; 6.586.233; 6.569.678;

6.569.627; 6.566.103; 6.566.067; 6.566.052; 6.558.929; 6.558.909;

6.551.783; 6.544.782; 6.537.752; 6.524.830; 6.518.020; 6.514.750;

6.514.706; 6.503.750; 6.503.705; 6.493.640; 6.492.114; 6.485.907;

6.485.903; 6.482.588; 6.475.729; 6.468.743; 6.465.638; 6.465.637;

6.465.171; 6.448.014; 6.432.646; 6.428.987; 6.426.215; 6.423.499;

6.410.223; 6.403.341; 6.399.320; 6.395.518; 6.391.559; 6.383.755;

6.379.932; 6.372.484; 6.368.834; 6.365.375; 6.358.680; 6.355.422;

6.348.336; 6.346.384; 6.319.673; 6.316.195; 6.316.192; 6.312.930;

6.309.840; 6.309.837; 6.303.343; 6.300.073; 6.300.072; 6.287.781;

6.284.455; 6.277.605; 6.270.977; 6.270.966; 6.268.153; 6.268.143;

D445.907; 6.261.431; 6.258.570; 6.258.567; 6.258.537; 6.258.529;

6.251.607; 6.248.567; 6.235.468; 6.232.079; 6.225.093; 6.221.595;

D441.091; 6.218.153; 6.207.425; 6.183.999; 6.183.963; 6.180.372;

6.180.349; 6.174.670; 6.153.412; 6.146.834; 6.143.496; 6.140.613;

6.140.110; 6.103.468; 6.087.097; 6.072.369; 6.068.974; 6.063.563;

6.048.688; 6.046.039; 6.037.129; 6.033.854; 6.031.960; 6.017.699;

6.015.664; 6.015.534; 6.004.747; 6.001.612; 6.001.572; 5.985.619;

5.976.842; 5.972.602; 5.968.730; 5.958.686; 5.955.274; 5.952.200;

5.936.968; 5.909.468; -5.905.732; -5.888.740; 5.883.924; 5.876.978;

5.876.977; 5.874.221; 5.869.318; 5.863.772; 5.863.731; 5.861.251;

5.861.245; 5.858.725; 5.858.718; 5.856.086; 5.853.991; 5.849.497;

5.837.468; 5.830.663; 5.827.695; 5.827.661; 5.827.657; 5.824.516;

5.824.479; 5.817.797; 5.814.489; 5.814.453; 5.811.296; 5.804.383;

5.800.997; 5.780.271 ; 5.780.222; 5.776.686; 5.774.497; 5.766.889;

5.759.822; 5.750.347; 5.747.251; 5.741.656; 5.716.784; 5.712.125;

5.712.090; 5.710.381; 5.705.627; 5.702.884; 5.693.467; 5.691.146;

5.681.741; 5.674.717; 5.665.572; 5.665.539; 5.656.493; 5.656.461;

5.654.144; 5.652.102; 5.650.268; 5.643.765; 5.639.871; 5.639.611;

5.639.606; 5.631.128; 5.629.178; 5.627.054; 5.618.703; 5.618.702;

5.614.388; 5.610.017; 5.602.756; 5.599.674; 5.589.333; 5.585.238;5.565.340; 5.565.339; 5.556.774; 5.556.773; 5.538.871;

5.527.510; 5.514.568; 5.512.463; 5.512.462; 5.501.947;

5.491.225; 5.487.993; 5.487.985; 5.484.699; 5.476.774;

5.447.839; 5.437.975; 5.436.144; 5.426.026; 5.420.009;

5.393.657; 5.389.512; 5.364.790; 5.364.758; 5.340.728;

5.279.952; 5.254.469; 5.241.363; 5.232.829; 5.231.015;

5.224.778; 5.219.727; 5.213.961; 5.198.337; 5.187.060;

5.576.1975.527.8985.494.7955.475.6105.411.8765.283:1715.229.297

5.142.033; 5.091.310; 5.082.780; 5.066.584; 5.023.171 e 5.008.182 poderãotambém ser empregados na prática da presente invenção. PCR envolve ouso de uma DNA polimerase termoestável, seqüências conhecidas comoiniciadores e ciclos de aquecimento, que separam os filamentos de ácidodesoxirribonucléico replicante (DNA), e amplificam exponencialmente umgene de interesse. Qualquer tipo de PCR, tais como PCR quantitativo, RT-PCR, PCR de partida a quente, LAPCR, PCR multíplex, PCR "touchdown",etc, poderá ser usado. Vantajosamente, é utilizado PCR em tempo real. Emgeral, o processo de amplificação por PCR envolve uma reação de cadeiaenzimática cíclica para preparação de quantidades exponenciais de umaseqüência específica de ácidos nucléicos. Ele exige uma pequena quantida-de de uma seqüência para iniciar a reação em cadeia e iniciadores de oligo-nucleotídeo que hibridizarão com a seqüência. Em PCR, os iniciadores li-gam-se-com ácido nucléico desnaturado seguido de extensão com um agen-te de indução (enzima) e nucleotídeos. Isso resulta em produtos de extensãonova sintetizados. Uma vez que essas seqüências novas sintetizadas te-nham se tornado padrões para os iniciadores, ciclos repetidos de desnatura-ção, recozimento de iniciadores e extensão resultam em acumulação expo-nencial da seqüência específica que é amplificada. O produto de extensãoda reação em cadeia será um dúplex de ácidos nucléicos distintos com tér-minos que correspondem às extremidades dos iniciadores específicos em-pregados.

Pelos termos "amplificar enzimaticamente" ou "amplificar" enten-de-se, para os fins do relatório descritivo ou reivindicações, amplificação deDNA, isto é, um processo pelo qual seqüências de ácidos nucléicos são am-plificadas em número. Há diversos meios de amplificar enzimaticamente se-qüências de ácidos nucléicos. Correntemente, o método mais comumenteusado é a reação em cadeia de polimerase (PCR). Outros métodos de am-plificação incluem LCR (reação em cadeia de ligase), que utiliza DNA ligase,e uma sonda que consiste em duas metades de um segmento de DNA que écomplementar à seqüência do DNA a ser amplificado, enzima QB replicase eum padrão se seqüência de ácido ribonucléico (RNA) ligado a uma sondacomplementar ao DNA a ser copiado que é usado para produzir um padrãode DNA para produção exponencial de RNA complementar; amplificação pordeslocamento de filamento (SDA); amplificação por QB replicase (Q3RA);replicação auto-sustentada (3SR); e NASBA (amplificação baseada em se-qüência de ácidos nucléicos), que pode ser realizada em RNA ou DNA comoa seqüência de ácidos nucléicos a ser amplificada.

Um "fragmento" de uma molécula tal como uma proteína ou áci-do nucléico entende-se como referência a qualquer porção da seqüênciagenética aminoácidos ou nucleotídeos.

Como usado neste relatório, o termo "genoma" refer-se a todomaterial genético nos cromossomos de um organismo particular. Seu tama-nho é geralmente dado como seu número total de pares de bases. No ge-noma, o termo "gene" refere-se a uma seqüência ordenada de nucleotídeoslocalizados em uma posição particular em um cromossomo particular- quecodifica um produto funcional específico (por exemplo, uma proteína ou mo-lécula de RNA). Em geral, características genéticas de um animal, como de-finido pela seqüência de nucleotídeo de seu genoma, são conhecidas comoseu "genótipo", enquanto as características físicas do animal são descritascomo seu "fenótipo".

Por "heterozigótico" ou "polimorfismo heterozigótico" entende-seque os dois alelos de uma célula diploide ou organismo em um dado locussão diferentes, isto é, que eles apresentam um nucleotídeo diferente trocadopelo mesmo nucleotídeo no mesmo lugar em suas seqüências.

Por "homozigótico" ou "polimorfismo homozigótico" entende-seque os dois alelos de uma célula diploide ou organismo em um dado locussão idênticos, isto é, que eles apresentam o mesmo nucleotídeo para trocade nucleotídeo no mesmo lugar em suas seqüências.

Por "hibridização" ou "hibridizar", como usado neste relatório,entende-se a formação de pares de bases A-T e C-G entre a seqüência denucleotídeos de um fragmento de um segmento de um polinucleotídeo euma seqüência complementar de nucleotídeos de um oligonucleotídeo. Porcomplementar entende-se que no locus de cada A, C, G ou T (ou U em umribonucleotídeo) na seqüência do fragmento, a seqüência de oligonucleotí-deos apresenta um T, G, C ou A, respectivamente. O fragmento/oligonu-cleotídeo hibtidizado é chamado "dúplex".

Um "complexo de hibridização", tal como em um ensaio em san-duíche, significa um complexo de moléculas de ácido nucleico que incluempelo menos o ácido nucléico-alvo e uma sonda sensora. Ele poderá tambémincluir uma sonda âncora.

Como usado neste relatório, o termo "locus" ou "locf refere-seao sítio de um gene em um cromossomo. Pares de genes, conhecidos como"alelos", controlam a característica hereditária produzida pelo locus de umgene. Cada combinação particular de alelos de um animal é referida comoseu "genótipo". Onde ambos os alelos são idênticos, diz-se que o indivíduo éhomozigótico para a característica controlada por esse par de genes; ondeos alelos são diferentes, diz-se que o indivíduo é heíerozigótico para a ca-racterística.

Uma "temperatura de fusão" significa a temperatura em que dú-plices hibridizados desibridizam-se e retornam ao seu estado de filamentosimples. Igualmente, hibridização não ocorrerá em primeiro lugar entre doisoligonucleotídeos, ou, neste caso, um oligonucleotídeo e um fragmento, atemperaturas acima da temperatura de fusão do dúplex resultante. É presen-temente vantajoso que a diferença nas temperaturas de ponto de fusão dedúplices oligonucleotídeo-fragmento desta invenção seja de cerca de 1°C acerca de 10°C de modo a ser imediatamente detectável.

Como usado neste relatório, pretende-se que o termo "moléculade ácido nucleico" inclua moléculas de DNA (por exemplo, cDNA ou DNAgenômico), moléculas de RNA (por exemplo, mRNA), análogos do DNA ouRNA gerado usando análogos de nucleotídeos, e derivados, fragmentos ehomólogos dos mesmos. A molécula de ácido nucléico pode ser DNA defilamento simples ou de filamento duplo, mas vantajosamente é DNA de fi-lamento duplo. "DNA" refere-se à forma polimérica de desoxirribonucleotí-deos (adenina, guanina, timina ou citosina) em sua forma de filamento sim-ples ou uma hélice de filamento duplo. Esse termo refere-se somente às es-truturas primária e secundária da molécula, e não a limita a quaisquer for-mas terciárias particulares. Assim, esse termo inclui DNA de filamento duploencontrado em, entre outras, moléculas lineares de DNA (por exemplo,fragmentos de restrição), vírus, plasmídeos e cromossomos. Ao discutir aestrutura de moléculas particulares de DNA de filamento duplo, poderão serdescritas aqui seqüências de acordo com a convenção normal de fornecersomente a seqüência na direção 5' a 3' ao longo do filamento de DNA não-transcrito (isto é, o filamento que apresenta uma seqüência homóloga aomRNA). Uma molécula de ácido nucléico "isolada" é uma molécula que éseparada de outras moléculas de ácido nucléico que estão presente na fontenatural de ácido nucléico.

Um "nucleosídeo" refere-se a uma base ligada a um açúcar. Abase poderá ser adenina (A), guanina (G) (ou sua substituta, inosina (I)),citosina (C) ou timina (T) (ou sua -substituta, uracila (U)). O açúcar poderáser ribose (o açúcar de um nucleotídeo natural em RNA) ou 2-desoxirribose(o açúcar de um nucleotídeo natural em DNA). Um "nucleotídeo" refere-se aum nucleosídeo ligado a um único grupo fosfato.

Como usado neste relatório, o termo "oligonucleotídeo" refere-sea uma série de resíduos de nucleotídeo ligados, oligonucleotídeo este queapresenta um número suficiente de bases de nucleotídeos a serem usadasem uma reação PCR. Uma seqüência curta de oligonucleotídeos poderá ba-sear-se em ou ser projetada de uma seqüência genômica ou de cDNA e serusada para amplificar, confirmar ou revelar a presença de um DNA ou RNAidêntico, similar ou complementar em uma célula ou tecido particular. Oligo-nucleotídeos poderão ser quimicamente sintetizados e poderão ser usadoscomo iniciadores ou sondas. Oligonucleotídeo significa qualquer nucleotídeode mais de 3 bases de comprimento usado para facilitar detecção ou identifi-cação de um ácido nucléico-alvo, incluindo sondas e iniciadores.

Uma "polimerase" é uma enzima que catalisa a adição seqüen-cial de unidades monoméricas a uma cadeia polimérica ou liga duas ou maisunidades monoméricas para iniciar uma uma cadeia polimérica. A "polimera-se" funcionará adicionando unidades monoméricas cuja identidade é deter-minada por e é complementar a uma molécula-padrão de uma seqüênciaespecífica. Por exemplo, DNA polimerases tais como DNA pol 1 e Taq poli-merase adicionam desoxirribonucleotídeos à extremidade 3' de uma cadeiade polinucleotídeo de maneira dependente de padrão, sintetizando dessemodo um ácido nucléico que é complementar à moléculas-padrão. Polimera-ses poderão ser usadas para estender um iniciador uma vez, ou, repetitiva-mente, amplificar um polinucleotídeo mediante iniciação repetitiva de doisfilamentos complementares usando dois iniciadores. Uma "polimerase ter-moestável" refere-se a uma enzima DNA ou RNA polimerase que pode re-sistir a temperaturas extremamente altas, tais como aquelas que se aproxi-mam de 1009C. Freqüentemente, polimerases termoestáveis são derivadasde organismos que vivem sob temperaturas extremas, tal como Thermusaquaticus. Exemplos de polimerases termoestáveis incluem Taq, Tth, Pfu,Vent, deep vent, UITma e variações e derivados destes.

Um "polinucleotídeo" refere-se a uma cadeia linear de nucleotí-deos conectados por uma ligação fosfodiéster entre o grupo 3'-hidroxila deum nucleosídeo e o grupo 5'-hidroxila de um segundo nucleosídeo que, porsua vez, liga-se por meio de seu grupo 3'-hidroxila ao grupo 5'-hidroxila deum terceiro nucleosídeo e assim por diante para formar um polímero com-preendido de nucleosídeos ligados por uma cadeia principal de fosfodiéster.Um "polinucleotídeo modificado" refere-se a um polinucleotídeo em que umou mais nucleotídeos naturais foram parcial, substancial ou completamentesubstituídos por nucleotídeos modificados.

Um "iniciador" é um oligonucleotídeo, cuja seqüência de pelomenos porção é complementar a um segmento de um DNA padrão que deveser amplificado ou replicado. Tipicamente iniciadores são usados na realiza-ção da reação em cadeia de polimerase (PCR). Um iniciador hibridiza-secom (ou "recozinha-se" com) o DNA padrão e é utilizado nos usos da enzimapolimerase como ponto de partida no processo de replicação/amplificação.

Os iniciadores nesta invenção são selecionados para serem "substancial-mente" complementares a diferentes filamentos de uma seqüência particularde DNA-alvo. Isso significa que os iniciadores têm de ser suficientementecomplementares para hibridizar-se com seus respectivos filamentos. Portan-to, a seqüência de iniciador não precisa refletir a seqüência exata do padrão.

Por exemplo, um fragmento de nucleotídeo não-complementar poderá serligado à extremidade 5' do iniciador, com o restante da seqüência do inicia-dor sendo complementar ao filamento. Alternativamente, bases não-com-plementares ou seqüências mais longas podem ser intercaladas no iniciador,contanto que a seqüência de iniciadortenha suficiente complementaridadecom a seqüência do filamento para hibridizar-se com ele e desse modo for-mar o padrão para a síntese do produto de extensão.

"Sondas" referem-se a seqüências de ácidos nucléicos de oligo-nucleotídéos de comprimento variável, usadas na detecção de seqüênciasidênticas, similares ou complementares de ácidos nucléicos por meio de hi-bridização. Uma seqüência de oligonucleotídeos usada como sonda de de--tecção poderá ser marcada com uma porção detectável.

O que segue são exemplos não-limitativos de polinucleotídeos:um gene ou fragmento de gene, éxons, íntrons, mRNA, tRNA, rRNA, ribozi-mas, cDNA, polinucleotídeos recombinantes, polinucleotídeos ramificados,plasmídeos, vetores, DNA isolado de qualquer seqüência, RNA isolado dequalquer seqüência, sondas e iniciadores de ácidos nucléicos. Um polinu-cleotídeo poderá compreender nucleotídeos modificados, tais como nucleo-tídeos metilados e análogos de nucleotídeos, uracila, outros açúcares e gru-pos de ligação tais como fluorribose e tiolato, e ramificações nucleotídicas. Aseqüência de nucleotídeos poderá ser adicionalmente modificada após poli-merização, tal como por conjugação, com um componente de marcação.

Outros tipos de modificações incluídos nessa definição são remates, substi-tuição de um ou mais dos nucleotídeos que ocorrem naturalmente por umanálogo e introdução meios para ligar o polinucleotídeo a proteínas, íonsmetálicos, componentes de marcação, outros polinucleotídeos ou suportesólido.

Um polinucleotídeo ou polipeptídeo "isolado" é um polinucleotí-deo ou polipeptídeo que é substancialmente puro dos materiais com que éassociado em ambiente nativo. Por substancialmente livre, entende-se pelomenos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, vantajo-samente pelo menos 70%, pelo menos 75%, mais vantajosamente pelo me-nos 80%, pelp menos 85%, ainda mais vantajosamente pelo menos 90%,pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelomenos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, ainda mais vantajosamentepelo menos 98%, pelo menos 99%, pelo menos 99,5%, pelo menos 99,9%livre desses materiais.

Uma molécula de ácido nucléico "isolada" é uma molécula deácido nucléico separada e distinta de todo o organismo com que a moléculaé encontrada na natureza; ou uma molécula de ácido nucléico desprovida,no todo ou em parte, de seqüências normalmente associadas a ela na natu-reza; ou uma seqüência, tal como ela existe na natureza, mas apresentandoseqüências heterológas (como definido abaixo) em associação com ela.

O termo "polinucleotídeo que codifica uma proteína", como usa-do neste relatório, refere-se a um fragmento de DNA ou molécula de DNAisolada que codifica uma proteína, ou o filamento complementar aos mes-mos; mas, RNA não é excluído, como é entendido no estado da técnica quetimidina (T) em uma seqüência de DNA é considerada igual a uracila (U) emuma seqüência de RNA. Assim, seqüências de RNA para uso na invenção,por exemplo, para uso em vetores de RNA, podem ser derivadas de se-qüências de DNA, por timidina (T) na seqüência de DNA sendo consideradaigual a uracila (U) em seqüências de RNA.

Uma "seqüência de codificação" de DNA ou uma "seqüência denucleotídeos que codifica" uma proteína particular é uma seqüência de DNAque é transcrita e traduzida em um polipeptídeo in vitro ou in vivo quandocolocada sob o controle de elementos reguladores apropriados. Os limitesda seqüência de codificação são determinados por um códon de partida notérmino 5' (amino) e um códon de parada de tradução no término 3' (carbó-xi). Uma seqüência de codificação pode incluir, mas sem se limitar as mes-mas, seqüências procarióticas, cDNA de mRNA eucariótico, seqüências deDNA genômico de DNA eucariótico (por exemplo, mamífero) e, ainda, se-qüências de DNA sintético. Uma seqüência de terminação de transcriçãoserá usualmente localizada em 3' na seqüência de codificação.

"Homologia" refere-se ao porcentual de identidade entre duasporções de polinucleotídeos ou duas porções de polipeptídeos. Duas se- ,qüências de DNA ou duas seqüências de polipeptídeos são "substancial-mente homólogas" entre si quando as seqüências exibem pelo menos cercade 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, preferencial-mente pelo menos cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, e, ainda mais prefe-rencialmente, pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%,99,9% de identidade de seqüências em um comprimento definido das molé-culas. Como usado neste relatório, substancialmente homólogo também re-fere-se a seqüências que mostram completa identidade (100% identidade deseqüência) com a seqüência especificada de DNA ou de polipeptídeo.

Homologia pode ser determinada por hibridização de polinucleo-tídeos sob condições que formam dúplices estáveis entre regiões homólo-gas, seguido de digestão com nuclease(s) específica(s) a filamentos sim-ples, e determinação do tamanho dos fragmentos digeridos. Seqüências deDNA que são substancialmente homólogas podem ser identificadas em umexperimento de hibridização Southern sob, por exemplo, condições rigoro-sas, como definido para esse sistema particular. Definir condições de hibridi-zação apropriadas está dentro da capacidade do estado da técnica. Vide,por exemplo, Sambrook e outros, supra; DNA Cloning (Clonagem de DNA),supra; Nucleic Acid Hybridization (Hibrização de Ácidos Nucléicos), supra.

Dois fragmentos de ácidos nucléicos são considerados ser "sele-tivamente hibridizáveis" com um polinucleotídeo se eles são capazes de hi-bridizar especificamente com um ácido nucleico ou uma variante deste, ouespecificamente iniciar uma reação em cadeia de polimerase: (i) sob hibridi-zaçao típica e condições de lavagem, conforme descrito, por exemplo, inSambrook e outros, supra, e Nucleic Acid Hybridization (Hibrização de Áci-dos Nucléicos), supra, (ii) usando condições de lavagem rigorosas reduzidasque permitem no máximo cerca de 25-30% de combinações de pares debases, por exemplo: 2x SSC, SDS a 0,1%, temperatura ambiente duas ve-zes, 30 minutos cada; em seguida, 2x SSC, SDS a 0,1%, 37°C uma vez, 30minutos; em seguida, 2 x SSC a temperatura ambiente duas vezes, 10 minu-tos cada, ou (iii) selecionando iniciadores para uso em reações em cadeia depolimerase (PCR) típicas sob condições padrões (descritas,..por exemplo, inSaiki e outros, (1988) Science 239:487-491).

O termo "capaz de hibridizar sob condições rigorosas", comousado neste relatório, refere-se a recozer um primeiro ácido nucléico em umsegundo ácido nucléico sob condições rigorosas como definido abaixo. Con-dições rigorosas de hibridizaçao tipicamente permitem a hibridizaçao de mo-léculas de ácidos nucléicos que apresentam pelo menos 70% de identidadede seqüências de ácidos nucléicos com a molécula de ácido nucléico que éusada como sonda na reação de hibridizaçao. Por exemplo, o primeiro ácidonucléico poderá ser uma amostra ou sonda de teste, e o segundo ácido nu-cléico poderá ser o filamento sentido ou anti-sentido de um ácido nucléico ouum fragmento deste. Hibridizaçao dos primeiro e segundo ácidos nucléicospoderá ser conduzida sob condições rigorosas, por exemplo, alta temperatu-ra e/ou baixo teor de sal, que tendem a desfavorecer hibridizaçao de se-qüência dissimilar de nucleotídeos. Alternativamente, hibridizaçao dos pri-meiro e segundo ácidos nucléicos poderá ser conduzida sob conditions rigo-rosas reduzidas, por exemplo baixa temperatura e/ou alto teor de sal, quetendem a favorecer hibridizaçao de seqüência dissimilar de nucleotídeos.Condições de baixo rigor de hibridizaçao poderão ser seguidas de condiçõesde alto rigor ou condições de rigor intermediário médio para aumentar a sele-tividade da ligação dos primeiro e segundo ácidos nucléicos. As condiçõesde hibridizaçao poderão adicionalmente incluir reagentes tal como, mas semse limitar aos mesmos, sulfoxido de dimetila (DMSO) ou formamida paradesfavorecer ainda adicionalmente a hibridização de seqüência dissimilar denucleotídeos. Um protocolo adequado de hibridização poderá, por exemplo,envolver hibridização sob 6 x SSC (em que 1 x SSC compreende citrato desódio 0,015 M e cloreto de sódio 0,15 M), a 65° Celsius em uma solução a-quosa, seguida de lavagem com 1 x SSC a 65° C. Fórmulas para calcularcondições apropriadas de hibridização e de lavagem para obter hibridizaçãoque permitam 30% ou menos de combinações inadequadas entre duas mo-léculas de ácidos nucléicos são apresentadas, por exemplo, in Meinkoth eoutros, (1984) Anal. Biochem. 138: 267-284, cujo conteúdo é aqui incorpora-do em sua totalidade como referência. Protocolos para técnicas de hibridiza-ção são bem-conhecidos daqueles versados no estado da técnica e manuaispadrões de biologia molecular poderão ser consultados para selecionar umprotocolo adequado de hibridização sem experimentação indevida, vide, porexemplo, Sambrook e outros, (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manu-al (Clonagem Molecular: Manual de Laboratório), 3§ ed., Cold Spring HarborPress, cujo conteúdo é aqui incorporado em sua totalidade como referência.

Tipicamente, condições rigorosas serão aquelas em que a con-centração de sal é menor que cerca de 1,5 M de íons sódio, tipicamente cer-ca de 0,01 a 1,0 M de concentração de íons Na (ou outros sais), de cerca depH 7,0 a cerca de pH 8,3, e a temperatura é de pelo menos cerca de 30°Celsius para sondas curtas (por exemplo, 10 a 50 nucleotídeos) e de pelomenos cerca de 60°C para sondas longas (por exemplo, mais de 50 nucleo-tídeos). Condições rigorosas poderão também ser obtidas com a adição deagentes de desestabilizaçao tal como formamida. Condições de baixo rigorexemplares incluem hibridização com uma solução tampão de 30 a 35% deformamida, 1 M de NaCI, 1% de SDS (dodecil sulfato de sódio) a 37° Celsi-us, e uma lavagem sob 1-2 x SSC a 50 a 55° Celsius. Condições rigorosasmoderadas exemplares incluem hibridização em 40 a 45% de formamida, 1M de NaCI, 1% de SDS a 37° Celsius, e uma lavagem sob 0,5-1 x SSC a 55a 60° Celsius. Condições de alto rigor exemplares incluem hibridização sob50% de formamida, 1 M de NaCI, 1% de SDS a 37° Celsius, e uma lavagemsob 0,1 x SSC a 60 a 65° Celsius.Métodos e materiais da invenção poderão ser usados mais ge-ralmente para avaliar uma amostra de DNA de um animal, geneticamentetipo um animal individual, e detectar diferenças genéticas em animais. Emparticular, uma amostra de DNA genômico de um animal poderá ser avaliadapor referência a um ou mais controles para determinar se um SNP, ou grupode SNPs, em um gene está presente. Qualquer método para determinaçãode genótipo pode ser utilizado para determinar o genótipo na presente in-venção. Tais métodos incluem, mas sem se limitar aos mesmos, seqüenci-amento de amplímero, seqüenciamento de DNA, espectroscopia de flúores-cência, análise de hibridização baseada em transferência de energia porressonância de fluorescência (ou "FRET"), seleção por alta vazão, espec-troscopia de massa, análise por microssatélite, hibridização de ácidos nu-cléicos, reação em cadeia de polimerase (PCR), análise por RFLP e croma-tografia de tamanho (por exemplo, cromatografia capilar ou cromatografiaem gel), os quais são todos bem-conhecidos daquele versado no estado datécnica. Em particular, métodos para determinação de polimorfismos em nu-cleotídeo, particularmente polimorfismo em um único nucleotídeo, são des-critos in Patentes Estados Unidos NQs. 6.514.700; 6.503.710; 6.468.742;6.448.407; 6.410.231; 6.383.756; 6.358.679; 6.322.980; 6.316.230; e6.287.766 e revisados por Chen e Sullivan, Pharmacogenomics J2003;3(2):77-96, cujos conteúdos são incorporados em sua totalidade comoreferência. Dados genotípicos úteis nos métodos da invenção e métodospara a identificação e seleção de características animais são baseados napresença de SNPs.

Um "fragmento de restrição" refere-se a um fragmento de umpolinucleotídeo gerado por uma endonuclease de restrição (uma enzima quediva ligações fosfodiéster em uma cadeia de polinucleotídeo) que diva DNAem resposta a um sítio de reconhecimento no DNA. O sítio de reconheci-mento (sítio de restrição) consiste em uma seqüência específica de nucleotí-deos, tipicamente de cerca de 4-8 nucleotídeos de comprimento.

Um "polimorfismo em um único nucleotídeo" ou "SNP" refere-sea uma variação na seqüência de nucleotídeos de um polinucleotídeo quedifere de um outro polinucleotídeo por uma diferença em um único nucleotí-deo. Por exemplo, sem limitação, trocar um A por um C, G ou T em toda aseqüência de polinucleotídeo constitui um SNP. É possível ter mais de umSNP em um polinucleotídeo particular. Por exemplo, em uma posição em umpolinucleotídeo, um C poderá ser trocado por um T, em uma outra posiçãoum G poderá ser trocado por um A e assim por diante. Quando se refere aSNPs, o polinucleotídeo é mais freqüentemente DNA.

Como usado neste relatório, um "padrão" refere-se a um fila-mento de polinucleotídeo-alvo, por exemplo, sem limitação, um filamento deDNA.de ocorrência natural não-modificado, que uma polimerase usa comomeio de reconhecimento de que nucleotídeo deve em seguida incorporar-seem um filamento em crescimento para polimerizar o complemento do fila-mento de ocorrência natural. Tal filamento de DNA poderá se desenvolverem filamento simples ou poderá ser parte de um DNA de padrão filamentoduplo. Em aplicações da presente invenção que exigem ciclos repetidos depolimerização, por exemplo, a reação em cadeia de polimerase (PCR), opróprio filamento padrão poderá tornar-se modificado por incorporação denucleotídeos modificados, todavia funcionará ainda como padrão para umapolimerase sintetizar polinucleotídeos adicionais.

Uma "reação termocíclica" é uma reação multietapa em que pelomenos duas etapas são realizadas mudando a temperatura da reação:

Uma "variação" é uma diferença na seqüência de nucleotídeosentre polinucleotídeos afins. A diferença poderá ser a supressão de um oumais nucleotídeos da seqüência de um polinucleotídeo em comparação coma seqüência de um polinucleotídeo afim, a adição de um ou mais nucleotí-deos ou a substituição de um nucleotídeo por outro. Os termos "mutação","polimorfismo" e "variação" são usados intercambiavelmente neste relatório.Como usado neste relatório, o termo "variação" no singular deve ser consi-derado incluir variações múltiplas; isto é, duas ou mais adições, supressõese/ou substituições de nucleotídeos no mesmo polinucleotídeo. Uma "muta-ção pontual" refere-se a uma única substituição de um nucleotídeo por outro.

Como usado neste relatório, os termos "características", "carac-terísticas de qualidade" ou "características físicas" ou "fenótipos" referem-sea propriedades vantajosas do animal resultantes de genética. Característicasde qualidade incluem, mas sem se limitar a mesma, a capacidade genéticado animal em metabolizar eficientemente energia, produzir carne ou leite,adicionar godura intramuscular. Características físicas incluem, mas sem selimitar as mesmas, carnes marmorizadas, tenras ou magras. Os termos po-derão ser usados intercambiavelmente. ,

Um "sistema de computador" refere-se ao dispositivo de hardwa-re, dispositivo de software e dispositivo de armazenamento de dados usadopara compilar os dados da presente invenção. O dispositivo mínimo dehardware de sistemas baseados em computador da invenção poderá com-preender uma unidade de processamento central (CPU), dispositivo de en-trada, dispositivo de saída e dispositivo de armazenamento de dados. Demodo desejável, um monitor é proporcionado para visualizar dados estrutu-rais. O dispositivo de armazenamento de dados poderá ser RAM ou outrodispositivo para accessar mídia de leitura por computador da invenção. E-xemplos de tais sistemas são estações de trabalho de microcomputadoresdisponíveis a partir de Silicon Graphics Incorporated e Sun Microsystemsque rodam sistemas operacionais baseados em Unix, Linux, Windows NT,XP ou IBM OS/2.

"Mídia de leitura por computador" refere-se a qualquer mídia quepode ser lida e accessada diretamente por um computador, e inclui, massem se limitar aos mesmos: mídia de armazenamento magnético tais comodiscos flexíveis, mídia de armazenamento rígida e fita magnética; mídia dearmazenamento óptico tais como discos ópticos ou CD-ROM; mídia de ar-mazenamento elétrica tais como RAM e ROM; e híbridos dessas categorias,tal como mídia magnética/óptica. Ao proporcionar tais mídias de leitura porcomputador, os dados compilados sobre um animal particular podem serroutineiramente accessados por um usuário, por exemplo, um operador deconfinamento.

O termo "módulo de análise de dados" é definido aqui de modo aincluir qualquer pessoa ou máquina, individualmente ou que trabalham jun-tamente, que analisa a amostra e determina a informação genética contidanela. O termo poderá incluir uma pessoa ou máquina em uma instalação delaboratório.

Como usado neste relatório, o termo "módulo de coleta de da-dos" refere-se a qualquer pessoa, objeto ou sistema de obtenção de umaamostra de tecido de um animal ou embrião. Por exemplo e sem limitação, otermo poderá definir, individual ou coletivamente, a pessoa ou máquina emcontato físico com o animal à medida que a amostra é tomada, os recipien-tes que retêm as amostras de tecido, a embalagem utilizada para transportaras amostras e similares. Vantajosamente, o coletor de dados é uma pessoa.Mais vantajosamente, o coletor de dados é uma fazenda de gado, um cria-dor ou um veterinário.

O termo "interface de rede" é definido aqui de modo a incluirqualquer pessoa ou sistema de computador capaz de accessar dados, de-positar dados, combinar dados, analisar dados, buscar dados, transmitir da-dos ou armazenar dados. O termo é amplamente definido para incluir umapessoa que analisa os dados, os sistemas eletrônicos de hardware e softwa-re usados na análise, os bancos de dados que armazenam a análise de da-dos, e qualquer mídia de armazenamento capaz de armazenar os dados.

Exemplos não-limitativos de interfaces de rede incluem pessoas, equipa-mento de laboratório automatizado, computadores e redes de computadores,dispositivos de armazenamento de dados tais como, mas sem se limitar aosmesmos, discos, drives rígidos ou chips de memória.

O termo "história de reprodução" como usado neste relatório re-fere-se a um registro da vida de um animal ou grupo de animais, incluindo,mas sem se limitar aos mesmos, o local, reprodução, período de recolhimen-to, bem como uma história genética dos animais, incluindo ascendência edescendência, genótipo, fenótipo, história transgênica se relevante e similares.

O termo "condições econômicas" como usado neste relatóriorefere-se a parâmetros relativos à manutenção de animais, incluindo, massem se limitar aos mesmos, shed ou housing temperatura, mortalidade se-manai de um rebanho, consumo de água, consumo de alimentação, taxa equalidade da ventilação, condição de palha e similares.

O termo "história veterinária" como usado neste relatório refere-se a dados de vacina de um animal ou grupo de animais, incluindo, mas semse limitar aos mesmos, tipo(s) de vacina, número(s) de série do lote de vaci-na, dose administrada, antígeno-alvo, método de administração da vacinaao(s) animal(ais) recipientes, número de animais vacinados, idade dos ani-mais e o vacinador. Dados relativos a uma resposta sorológica ou imunoló-gica induzida pela vacina poderão também ser inclusos. "História veterinária"como usado neste relatório pretende inlcuir também as histórias de medica-ção do(s) animal(ais) alvo, incluindo, mas sem se limitar aos mesmos, fár-maco e/ou antibióticos administrados aos animais, incluindo tipo de medica-ção administrada, quantidade e taxas de dose, por quem e quando adminis-tradas, por meio de que rota, por exemplo, oral, subcutânea e similares, e aresposta à medicação, incluindo efeitos desejados e indesejáveis desta.

O termo "dados de diagnóstico" como usado neste relatório refe-re-se a dados relativos à saúde do(s) animal(ais) diferentes de dados quedetalham a história de vacinação ou medicação do(s) animal(ais). Por exem-plo, os dados de diagnóstico poderão ser um registro das infecções experi-mentadas pelo(s) animal(ais) e a resposta destes a medicações proporcio-nadas para tratar tais infecções. Dados sorológicos que incluem composiçãode anticorpos ou proteínas do soro ou outros biofluidos poderão também serdados de diagnóstico úteis para entrada nos métodos da invenção. Dadoscirúrgicos que pertencem ao(s) animal(ais) poderão ser incluídos, tais comoo tipo de manipulação cirúrgica, resultado da cirurgia e complicações quesurgem do procedimento cirúrgico. "Dados de diagnóstico" poderão tambémincluir medições de parâmetros tais como peso, morbidez e outras caracte-rísticas observadas por um serviço veterinário tal como a condição da pele,pés, etc.

O termo "dados de saúde" como usado neste relatório refere-seà acumulação coletiva de dados pertencentes a um animal ou grupo de ani-mais, incluindo, mas sem se limitar aos mesmos, uma história de reprodu-ção, uma história veterinária, um perfil de saúde, dados de diagnóstico, da-dos de controle de qualidade ou qualquer combinação destes.

O termo "perfil de saúde" como usado neste relatório refere-se aparâmetros tais como peso, densidade da carne, níveis de aglomeração emcercados de reprodução ou criação, comportamento psicológico do animal,taxa e qualidade do crescimento e similares.

O termo "controle de qualidade" como usado neste relatório refe-re-se às características desejadas do(s) animal(ais). Para animais não-domésticos tais como gado e carneiro, por exemplo, tais parâmetros incluemquantidade e densidade dos músculos, teor de gordura, maciez da carne,rendimento e qualidade do leite, capacidade de reprodução e similares.

O termo "parâmetros de desempenho" como usado neste relató-rio refere-se a fatores tais como rendimento da carne, rendimento reproduti-vo, forma de laticínios, qualidade e rendimento da carne, vida produtiva esimilares que poderão ser os as metas desejadas da reprodução e criaçãodo(s) animal(ais). Parâmetros de desempenho poderão ser gerados a partirdos próprios animais ou daqueles parâmetros desejados por um cliente oupelo mercado.

O termo "dados nutricionais" como usado neste relatório refere-se à composição, quantidade e freqüência de liberação de alimentação, in-cluindo água, proporcionada ao(s) animal(ais).

O termo "segurança alimentar" como usado neste relatório refe-re-se à qualidade da carne de um animal de criação, incluindo, mas sem li-mitar aos mesmos, tempo de preparação, lugar e maneira, armazenamentodo produto alimentício, rota de transporte, registros de inspeção, textura, cor,paladar, odor, teor bacteriano, teor parasítico e similares.

Será evidente àqueles versados no estado da técnica que osdados relativos à saúde e manutenção dos animais poderão ser diversamen-te agrupados dependendo da fonte ou intenção do coletor de dados e não sepretende, portanto, que qualquer um grupo neste relatório seja limitativo.

A menos que definido de outro modo, todos os termos técnicos ecientíficos usados neste relatório têm o mesmo significado como comumenteentendido por aquele versado no estado da técnica de biologia molecular.Embora métodos e materiais similares ou equivalentes àqueles descritosaqui possam ser usados na prática ou testes da presente invenção, métodose materiais adequados são descritos neste relatório.

Em uma modalidade em que o gene de interesse é TFAM bovi-no, a seqüência de nucleotídeos de TFAM bovino pode ser selecionada, massem se limitar aos mesmos, da seqüência que corresponde aos Nos. de A-cesso GenBank AAFC0211069 ou AAFC02019444 (ID SEQ NO: 3) ou umfragmento da mesma ou uma região do genoma bovino que compreendeessa seqüência.

A presente invenção, portanto, proporciona ácidos nucléicos iso-lados que poderão especificamente hibridizar com a seqüência de nucleotí-deos que corresponde ao No. de Acesso GenBank AFC0211069 ou A-AFC02019444 (ID SEQ NO: 3), ou com o complemento desta, e que com-preende o sítio polimórfico que corresponde às posições de nucleotídeos-1220,-1212 ou-995.

O(s) polimorfismo(s) em um único nucleotídeo de interesse po-derá(ão) ser selecionado(s) do grupo que consiste em uma substituição Aem C na posição do nucleotídeo -1220 no promotor do gene para TFAM,uma substituição T em C na posição -1212 no promotor do gene para TFAMe uma substituição T em C na posição -995 no promotor do gene paraTFAM.

O SNP vantajoso na presente invenção è associado a certascaracterísticas economicamente valiosas e herdáveis relativas à qualidadeda carne em bovinos. Portanto, é um objetivo da presente invenção determi-nar o genótipo de um dado animal de interesse como definido pelo SNP lo-cus TFAM de acordo com a presente invenção. Considera-se também que ogenótipo do(s) animal(ais) poderá ser definido por SNPs adicionais no genepara TFAM ou em outros genes identificados com características desejáveisou outras características, e em particular por um painel ou paneis de SNPs.

Há muitos métodos conhecidos no estado da técnica para de-terminar a seqüência de DNA em uma amostra e para identificar se uma da-da amostra de DNA conpõem um SNP particular. Qualquer técnica conheci-da no estado da técnica poderá ser usada na realização dos métodos dapresente invenção.

Os métodos da presente invenção permitem que animais comcertas características economicamente valiosas herdáveis sejam identifica-dos com base na presença de SN Ps em seus genomas e particularmentecom um SNP localizado no promotor do gene para TF AM. Os métodos adi-cionalmente permitem, por meio de métodos auxiliados por computador dainvenção, correlacionar as características associadas a SNP com outros da-dos pertinentes à saúde e capacidade produtiva dos animais, ou grupo deanimais.

Para determinar o genótipo de um dado animal de acordo comos métodos da presente invenção, é necessário obter uma amostra de DNAgenômico desse animal. Tipicamente, essa amostra de DNA genômico seráobtida de uma amostra de tecido ou células tomada desse animal. Umaamostra de tecido ou células poderá ser tomada de um animal a qualquertempo na existência de um animal, mas antes que a identidade da carcaçase perca. A amostra de tecido pode compreender pêlo, incluindo raízes, cou-ro, osso, amostras da cavidade bucal, sangue, saliva, leite, sêmen, embri-ões, músculo ou quaisquer órgãos internos. Nos métodos da presente in-venção, a fonte da amostra de tecido, e assim também a fonte da amostrade ácido nucléico de teste, não é crítica. Por exemplo, o ácido nucléico deteste pode ser obtido de células em um fluido corporal do animal, ou de célu-las que constituem um tecido corporal do animal. O fluido corporal particularde que células são obtidas não é também crítico na presente invenção. Porexemplo, o fluido coporal poderá ser selecionado do grupo que consiste emsangue, ascite, fluido pleural e fluido espinhal. Adicionalmentemore, o tecidocorporal particular de que células são obtidas não é também crítico na pre-sente invenção. Por exemplo, o tecido corporal poderá ser selecionado dogrupo que consiste em tecido cutâneo, endometrial, uterino e cervical. Tantotecidos normais como tecidos tumorais podem ser usados.

Tipicamente, a amostra de tecido é marcada com um número deidentificação ou outra indicação que relacione a amostra com o animal indi-vidual de que a amostra foi tomada. A identidade da amostra vantajosamen-te permanece constante através dos métodos e sistemas da invenção, ga-rantindo desse modo a integridade e continuidade da amostra durante extra-ção e análise. Alternativamente, a indicação poderá ser mudada de um mo-do regular que assegure que os dados, e quaisquer outros dados associa-dos, possam ser relacionados com o animal de que os dados foram obtidos.

A quantidade/tamanho de amostra exigido é sabida daquelesversados no estado da técnica e, por exemplo, pode ser determinado pelasetapas subseqüentes utilizadas no método e sistema da invenção e nos mé-todos específicos de análise usados. Idealmente, o tamanho/volume da a-mostra de tecido recuperada deve ser o mais consistente possível com o tipode amostra e a espécie de animal. Por exemplo, para gado, exemplos não-limitativos de tamanhos de amostra/métodos incluem carne sem gordura:0,0002 g-10,0 g; couro: 0,0004 g-10,0 g; raízes de pêlo: pelo menos uma evantajosamente mais de cinco; amostras da cavidade bucal: 15 a 20 segun-dos de esfregadura com modesta pressão na área entre o lábio externo e agengiva usando, por exemplo, uma escova de citologia; osso: 0,0002 g-10,0g; sangue: 30 |xl a 50 ml.

Geralmente, a amostra de tecido é colocada em um recipienteque é rotulado usando um sistema de numeração que transporta um códigoque corresponde ao animal, por exemplo, na aba da orelha do animal. Con-seqüentemente, o genótipo de um animal particular é facilmente tratávelsempre. O dispositivo e/ou recipiente de amostragem poderá ser fornecidopelo fazendeiro, um abatedouro ou varejista. O dispositivo de amostragemvantajosamente toma uma amostra consistente e reproduzível de animaisindividuais enquanto se evita simultaneamente qualquer contaminação cru-zada de tecido. Conseqüentemente, o tamanho e volume de tecidos de a-mostra derivados de animais individuais seriam consistentes.

DNA pode ser isolado do tecido/células por meio de técnicasconhecidas daqueles versados no estado da técnica (vide, por exemplo, Pa-tentes Estados Unidos N9s. 6.548.256 e 5.989.431; Hirota e outros, (1989)Jinrui Idengaku Zasshi. 34: 217-23; e John e outros, (1991) Nucleic AcidsRes. 19:408, cujas descrições são incorporadas em sua totalidade como re-ferência). Por exemplo, DNA de alto peso molecular poderá ser purificado decélulas ou tecido usando extração em proteinase K e precipitação em etanol.DNA, contudo, poderá ser extraído de um espécime animal utilizando quais-quer outros métodos adequados conhecidos no estado da técnica.

Em uma modalidade, a presença ou ausência do SNP de qual-quer um dos genes da presente invenção poderá ser determinada seqüenci-ando a região da amostra de DNA genômico amostra que cobre o locus po-limórfico. Muitos métodos de seqüenciamento de DNA genômico são conhe-cidos no estado da técnica, e qualquer desses métodos pode ser utilizado;vide, por exemplo, Sambrook e outros, (2001) Molecular Cloning: A Labora-tory Manual (Clonagem Molecular: Manual de Laboratório), 3- ed., Cold S-príng Harbor Press. Por exemplo, conforme descrito abaixo, um fragmentode DNA que cobre o local do SNP de interesse pode ser amplificado usandoa reação em cadeia de polimerase. A região amplificada da forma de DNApode então ser seqüenciada utilizando qualquer método conhecido no esta-do da técnica, por exemplo utilizando um seqüenciador automático de ácidosnucléicos. A detecção de um dado SNP pode, por conseguinte, ser realizadausando hibridização de sondas e ou usando métodos de amplificação base-ados em PCR. Tais métodos são descritos com mais detalhes abaixo.

Os métodos da presente invenção poderão usar oligonucleotí-deos úteis como iniciadores para amplificar seqüências específicas de áci-dos nucléicos do gene para TFAM, de forma vantajosa da região que abran-ge um SNP de TFAM SNP. Tais fragmentos devem ser de comprimento su-ficiente para permitir recozimento ou hibridização específico com a amostrade ácido nucléico. As seqüências tipicamente serão de cerca de 8 a cerca de44 nucleotídeos de comprimento. Seqüências mais longas, por exemplo, decerca de 14 a cerca de 50, poderão ser vantajosas para certas modalidades.

O projeto de iniciadores é bem-conhecido daquele versado no estado datécnica.

Moléculas de ácidos nucléicos inventivas incluem moléculas deácidos nucléicos que apresentam pelo menos 70% de identidade ou homo-logia ou similaridade com um gene para TFAM, ou sondas ou iniciadoresderivados delas tal como pelo menos 75% de identidade ou homologia ousimilaridade, preferencialmente pelo menos 80% de identidade ou homologiaou similaridade, mais preferencialmente pelo menos 85% de identidade ouhomologia ou similaridade tal como pelo menos 90% de identidade ou homo-logia ou similaridade, mais preferencialmente pelo menos 95% de identidadeou homologia ou similaridade tal como pelo menos 97% de identidade ouhomologia ou similaridade. A similaridade ou homologia ou identidade deseqüências de nucleotídeos pode ser determinada utilizando o programa"Align" de Myers e Miller, {"Optimal Alignments in Linear Space" ("Alinha-mentos Ótimos em Espaço Linear"), CABIOS 4, 11-17, 1988), e disponívelsob NCBI. Alternativa ou adicionalmente, pretende-se que os termos "simila-ridade" ou "identidade" ou "homologia", por exemplo, com respeito a umaseqüência de nucleotídeos, indiquem uma medida quantitativa de homologiaentre duas seqüências. A porcentagem de similaridade de seqüências podeser calculada como (Nreí - Nd,y)*100/Nre/, em que Ndif é o número total deresíduos não-idênticos nas duas seqüências quando alinhadas e em que Nrefé o número de resíduos em uma das seqüências. Portanto, a seqüência deDNA AGTCAGTC apresentará uma similaridade de seqüências de 75% coma seqüência AATCAATC (Nref = 8; Nrf,y=2). Alternativa ou adicionalmente,"similaridade" com relação a seqüências refere-se ao número de posiçõescom nucleotídeos idênticos dividido pelo número de nucleotídeos na maiscurta das duas seqüências em que alinhamento das duas seqüências podeser determinado de acordo com o algoritmo de Wilbur e Lipman (Wilbur eLipman, 1983 PNAS USA 80:726), por exemplo, usando um tamanho de ja-nela de 20 nucleotídeos, um comprimento de palavra de 4 nucleotídeos e um"gap penalty" de 4, e análise e interpretação auxiliada por computador dosdados das seqüências, incluindo alinhamento, podem ser convenientementerealizadas usando programas comercialmente disponíveis (por exemplo, In-telligenetics® Suite, Intelligenetics Inc., CA). Quando seqüências de RNAsão ditas serem similares, ou apresentarem um grau de identidade de se-qüências com seqüências de DNA, timidina (T) na seqüência de DNA é con-siderada igual a uracila (U) na seqüência de RNA.

Uma sonda ou iniciador pode ser qualquer extensão de pelomenos 8, preferencialmente pelo menos 10, mais preferencialmente pelomenos 12, 13, 14 ou 15, tal como pelo menos 20, por exemplo, pelo menos23 ou 25, por exemplo pelo menos 27 ou 30, nucleotídeos em um gene paraTFAM que são únicos em um gene para TFAM. Quando a iniciadores ousondas de PCR ou hibridização e comprimentos ótimos para os mesmos,referência é também feita a Kajimura e outros, GATA 7(4):71-79 (1990).

Seqüências de RNA no escopo da invenção são derivadas dasseqüências de DNA, timidina (T) na seqüência de DNA sendo consideradaigual a uracila (U) em seqüências de RNA.

Os oligonucleotídeos podem ser produzidos por um processo deprodução convencional para oligonucleotídeos gerais. Eles podem ser pro-duzidos, por exemplo, por um processo de síntese química ou por um pro-cesso microbiano que faz uso de um vetor de plasmídeo, um vetor de fagoou similares. Adicionalmente, é adequado usar um sintetizador de ácidosnucléicos.

Para marcar um oligonucleotídeo com o corante fluorescente,um dos métodos de marcação convencionalmente conhecidos pode ser u-sado (Tyagi & Kramer (1996) Nature Biotechnology 14: 303-308; Schofield eoutros, (1997) Appl. and Environ. Microbiol. 63: 1143-1147; Proudnikov &Mirzabekov (1996) Nucl. Acids Res. 24: 4532-4535). Alternativamente, o oli-gonucleotídeo poderá ser marcado com um radiomarcador, por exemplo, 3H,125l, 35S, 14C, 32P, etc. Métodos de marcação bem-conhecidos são descritos,por exemplo, in Sambrook e outros, (2001) Molecular Cloning: A LaboratoryManual (Clonagem Molecular: Manual de Laboratório), 3â ed., Cold SpringHarbor Press. O marcador acopla-se diretamente ou indiretamente a umcomponente do oligonucleotídeo de acordo com métodos bem-conhecidosno estado da técnica. Cromatografia de fase inversa ou similar usada paraproporcionar uma sonda de ácido nucléico para uso na presente invençãopode purificar o oligonucleotídeo sintetizado marcado com um marcador.Uma forma vantajosa de sonda é uma sonda marcada com um corante fluo-rescente na extremidade 3' ou 5' e contendo G ou C como base na extremi-dade marcada. Se a extremidade 5' é marcada e a extremidade 3' não émarcada, o grupo OH no átomo C na posição 3' da ribose ou desoxirriboseda extremidade 3' poderá ser modificado com um grupo fosfato ou similarembora sem se impor limitação nesse caso.

Durante a hibridização do ácido nucléico-alvo com as sondas,condições rigorosas poderão ser utilizadas, de maneira vantajosa juntamen-te com outras condições de afetação rigorosa, para ajudar na hibridização.

Detecção por ruptura diferencial é particularmente vantajosa para reduzir oueliminar hibridização com deslizamento entre sondas e alvo, e para promo-ver hibridização mais eficaz. Em um outro aspecto ainda, condições rigoro-sas poderão ser variadas durante a determinação de estabilidade do com-plexo de hibridização de modo a determinar mais precisa ou rapidamente seum SNP está presente na seqüência-alvo.

Um método para determinar o genótipo no locus do gene poli-mórfico abrange obter uma amostra de ácido nucléico, hibridizar a amostrade ácido nucléico com uma sonda e romper a hibridização para determinar onível de energia de ruptura exigida na qual a sonda tem uma energia de rup-tura diferente para um alelo em comparação com outro alelo. Em um exem-plo, pode haver uma energia menor de ruptura, por exemplo, temperatura defusão, para um alelo que abriga um resíduo de citosina em um locus polimór-fico, e uma energia maior exigida para um alelo com um resíduo diferentenesse locus polimórfico. Isso pode ser obtido onde a sonda apresenta 100%de homologia com um alelo (um sonda perfeitamente combinada), mas a-presenta uma única combinação imperfeita com o alelo alternativo. Uma vezque a sonda combinada perfeitamente liga-se mais firmemente ao DNA-alvodo que a sonda combinada imperfeitamente, ela exige mais energia paralevar a sonda de hibridizado a dissociar-se.

Em uma etapa adicional do método acima, uma segunda sonda("âncora") poderá ser utilizada. Geralmente, a sonda-âncora não é específi-ca a um ou outro alelo, mas hibridiza independentemente de que nucleotídeoestá presente no locus polimórfico. A sonda-âncora não afeta a energia deruptura exigida para desassociar o complexo de hibridização, mas, em vezdisso, contém um marcador complementar para uso com a primeira sonda("sensor").

A estabilidade de hibridização poderá ser influenciada por nume-rosos fatores, incluindo termorregulação, regulação química, bem como con-trole eletrônico rigoroso, seja isoladamente ou em combinação com os ou-tros fatores listados. Por meio do uso de condições rigorosas, em uma ououtra etapa ou tanto na etapa de hibridização alvo quanto na etapa rigorosade oligonucleotídeo sensor, conclusão rápida do processo poderá ser obtida.Isso é desejável para obter hibridização indexada apropriada do DNA-alvo afim de atingir o número máximo de moléculas em um sítio de teste com umcomplexo de hibridização preciso. À guisa de exemplo, com o uso de rigor, aetapa de hibridização inicial poderá ser completada em dez minutos ou me-nos, mais vantajosamente cinco minutos ou menos, e ainda mais vantajo-samente dois minutos ou menos. Em geral, o processo analítico poderá sercompletado em menos de meia hora.

Em uma modalidade, o complexo de hibridização é marcado e aatapa de determinação da quantidade de hibridização inclui detectar asquantidades de complexo de hibridização marcado nos sítios de teste. Odispositivo e método de detecção poderão incluir, mas sem se limitar aosmesmos, formação de imagem óptica, formação de imagem eletrônica, for-mação de imagem com uma câmara CCD, formação de imagem óptica inte-grada e espectrometria de massa. Adicionalmente, a quantidade de sondamarcada ou não-marcada ligada no alvo poderá ser quantificada. Tal quanti-ficação poderá incluir análise estatística. A porção marcada do complexopoderá ser o alvo, estabilizador, a sonda ou o complexo de hibridização notodo. A marcadação poderá ser efetuada por marcação fluorescente selecio-nada do grupo de, mas sem limitar aos mesmos, Cy3, Cy5, Bodipy TexasRed, Bodipy Far Red, Lucifer Yellow, Bodipy 630/650-X, Bodipy R6G-X e 5-CR 6G. Marcação colormétrica, marcação bioluminescente e/ou marcaçãoquimiluminescente poderão adicionalmente realizar marcação. A marcaçãoadicionalmente poderá incluir transferência de energia entre moléculas nocomplexo de hibridização por análise de perturbação, extinção, transporteeletrônico entre moléculas doadoras e receptoras, das quais estas últimaspoderão ser facilitadas por complexos de hibridização com combinação defilamentos duplos. Opcionalmente, se o complexo de hibridização é não-marcado, detecção poderá ser realizada por meio de medição de condutân-cia diferencial entre DNA de filamento duplo e DNA de filamento não-duplo.

Adicionalmente, detecção direta poderá ser obtida por meio de interferome-tria óptica baseada em silício poroso ou por espectrometria de massa. Aousar espectrometria de massa, não é necessário marcador fluorescente ououtro marcador. Preferencialmente, detecção é obtida por meio de níveisextremamente altos de decomposição de massa obtida por medição direta,por exemplo, por tempo de vôo (TOF) ou por ionização por pulverização deelétrons (ESI). Onde se contempla espectrometria de massa, sondas queapresentam uma seqüência de ácidos nucléicos de 50 bases ou menos sãovantajosas.

O marcador poderá ser amplificado e poderá incluir, por exem-plo, DNA ramificado ou dendrítico. Se o DNA-alvo é purificado, ele poderáser não-amplificado ou amplificado. Adicionalmente, se o alvo purificado éamplificado e a amplificação é um método exponencial, ele poderá ser, porexemplo, DNA amplificado por PCR ou DNA amplificado por amplificaçãocom deslocamento de filamento (SDA). Métodos lineares de amplificação deDNA tal como círculo rolante ou deslocamento de transcrição poderão tam-bém ser utilizados.

Onde se deseja amplificar um fragmento de DNA que compre-ende um SNP de acordo com a presente invenção, os iniciadores diretos einversos poderão apresentar extensões contíguas de cerca de 8, 9, 10, 11,12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 ouqualquer outro comprimento até e incluindo cerca de 50 nucleotídeos decomprimento. As seqüências com as quais os iniciadores diretos e inversosligam-se localizam-se vantajosamente de um ou outro lado da posição parti-cular do nucleotídeo que é substituído no SNP a ser amplificado.Um marcador detectável pode ser incorporado em um ácido nu-cléico durante pelo menos um ciclo de uma reação de amplificação. Disposi-tivo epectroscópico, fotoquímico, bioquímico, imunoquímico, elétrico, ópticoou químico pode detectar tais marcadores. Marcadores úteis na presenteinvenção incluem corantes fluorescentes (por exemplo, isotiocianato de fluo-resceína, vermelho Texas, rodamina e similares), radiomarcadores (por e-xemplo, 3H, 125l, 35S, 14C, 32P, etc), enzimas (por exemplo, peroxidase derabano silvestre, fosfatase alcalina, etc), marcadores colorimétricos tais co-mo ouro coloidal ou contas de vidro ou plástico coloridas (por exemplo, polie-tireno, polipropileno, látex, etc). O marcador acopla-se direta ou indireta-mente a um componente do ensaio de acordo com métodos bem-conhe-cidos no estado da técnica. Como indicado acima, uma ampla variedade demarcadores é utilizada, com a escolha do marcador dependendo da sensibi-lidade exigida, facilidade de conjugação com o composto, exigências de es-tabilidade, instrumentação disponível e provisões descartáveis. Marcadoresnão-radioativos são freqüentemente ligados por meios indiretos. Polimerasespodem também incorporar nucleotídeos fluorescentes durante síntese deácidos nucléicos.

Reagentes que permitem o seqüenciamento de produtos de rea-ção podem ser utilizados aqui. Por exemplo, nucleotídeos de terminação decadeia serão com freqüência incorporados em um produto de reação duran-te um ou mais ciclos de uma reação. Kits comerciais que contém os reagen-tes mais tipicamente usados nesses métodos de seqüenciamente de DNAsão disponíveis e amplamente usados. Métodos de digestão com exonucle-ase em PCR para seqüenciamento de DNA podem também ser utilizados.Muitos métodos de seqüenciamento de DNA genômico são conhecidos noestado da técnica, e qualquer desses métodos pode ser usado; vide, porexemplo, Sambrook e outros, (2001) Molecular Cioning: A Laboratory Manu-al (Clonagem Molecular: Manual de Laboratório), 3ã ed., Cold Spring HarborPress. Por exemplo, como descrito abaixo, um fragmento de DNA que cobreo local do SNP de interesse pode ser amplificado usando a reação em ca-deia de polimerase ou alguma outra reação de amplificação cíclica mediadapor polimerase. A região de DNA amplificada pode, então, ser sequenciadautilizando qualquer método conhecido no estado da técnica. Vantajosamen-te, o seqüenciamento de ácido nucléico é efetuado por métodos automatiza-dos (revisto por Meldrum, (2000) Genome Res. 10: 1288-303, cujo conteúdoé incorporado em sua totalidade como referência), por exemplo usando umSistema de Análise Genética Beckman CEQ 8000 (Beckman Coulter Instru-ments, Inc.). Métodos para seqüenciamento de ácidos nucléicos incluem,mas sem se limitar aos mesmos, seqüenciamento automatizado fluorescentede DNA (vide, por exemplo, Watts & MacBeath, (2001) Methods Mol Biol.167: 153-70, e MacBeath e outros, (2001) Methods Mol Biol. 167:119-52),eletroforese capilar (vide, por exemplo, Bosserhoff e outros, (2000) CombChem High Throughput Screen. 3: 455-66), chips de seqüenciamento deDNA (vide, por exemplo, Jain, (2000) Pharmacogenomics. 1: 289-307), es-pectrometria de massa (vide, por exemplo, Yates, (2000) Trends Genet. 16:5-8), pirosseqüenciamento (vide, por exemplo, Ronaghi, (2001) GenomeRes. 11: 3-11), e eletroforese em gel em camada ultrafina (vide, por exem-plo, Guttman & Ronai, (2000) Electrophoresis. 21: 3952-64), cujas descri-ções são incorporadas aqui em sua totalidade como referência. O seqüenci-amento pode também ser feito por uma empresa comercial. Exemplos detais empresas incluem, mas sem se limitar às mesmas, a University of Geór-gia Molecular Genetics Instrumentation Facility (Athens, Geórgia) ou Seq-Wright DNA Technologies Services {Houston, Texas).

Uma sonda específica a SNP pode também ser usada na detec-ção do SNP em seqüências específicas amplificadas de ácidos nucléicos dogene-alvo, tais como os produtos de PCR amplificados gerados usando osiniciadores descritos acima. Em certas modalidades, essas sondas específi-cas a SNP consistem em fragmentos de oligonucleotídeo. Vantajosamente,os fragmentos são de comprimento suficiente para proporcionar hibridizaçãoespecífica com a amostra de ácido nucléico. O uso de uma sonda de hibridi-zação entre 10 e 50 nucleotídeos de comprimento permite a formação deuma molécula dúplex que tanto estável quanto seletiva. Moléculas que apre-sentam seqüências complementares em extensões maiores que 12 basesde comprimento são geralmente vantajosas, a fim de aumentar a estabilida-de e seletividade do híbrido e, desse modo, aperfeiçoar a qualidade e o graude moléculas híbridas particulares obtidas. Preferir-se-á geralmente projetarmoléculas de ácidos nucléicos que apresentam extensões de 16 a 24 nucle-otídeos, ou mesmo mais longas onde desejado. Uma região de aba de nu-cleotídeos poderá ser incluída, como na extremidade 5' do iniciador que po-derá proporcionar um sítio em que um iniciador de seqüenciamento de oli-gonucleotídeo poderá hibridizar para facilitar o seqüenciamento de amostrasmúltiplas de PCR.

A seqüência da sonda tem de cobrir a posição particular de nu-cleotídeos que poderá ser substituída no SNP particular a ser detectado.Vantajosamente, duas ou mais "sondas específicas a alelos" diferentes po-derão ser usadas para análise de um SNP, uma primeira sonda específica aalelos para detecção de um alelo e uma segunda sonda específica a alelospara a detecção do alelo alternativo.

Entender-se-á que esta invenção não se limita aos iniciadores esondas particulares descritos neste relatório e pretende-se abranger pelomenos seqüências de ácidos nucléicos que são hibridizáveis com a seqüên-cia de nucleotídeos descrita aqui, com o complemento ou um fragmento damesma, ou que são análogos funcionais da dessas seqüências. Considera-se também que uma característica particular de um animal poderá ser de-terminada usando um painel de SNPs associados a essa característica. Di-versas características economicamente relevantes poderão ser caracteriza-das pela presença ou ausência de um ou mais SNPs e por uma pluralidadede SNPs em diferentes genes. Um ou mais paneis de SNPs poderão serusados nos métodos da invenção para definir o perfil fenotípico do animalem questão.

Homólogos (isto é, ácidos nucléicos derivados de outras espé-cies) ou outras seqüências afins (por exemplo, parálogos) podem ser obtidossob condições padrões ou rigorosas de hibridização com toda ou uma por-ção da seqüência particular como sonda, utilizando métodos bem-conhecidos no estado da técnica para hibridização e clonagem de ácidosnucléicos.

Os marcadores genéticos, sondas destes, métodos e kits da in-venção são também úteis em um programa de reprodução para selecionarpara reprodução aqueles animais que apresentam fenótipos desejáveis paravárias características economicamente importantes, tais como qualidade erendimento da carne aperfeiçoados, em particular maciez da carne. Seleçãoe reprodução contínuas de animais, tal como gado, que são pelo menos he-terozigóticos e vantajosamente homozigóticos para alelos desejáveis do ge-ne para sítios polimórficos de TFAM associados a características economi-camente relevantes de crescimento, consumo de alimentação, eficiênciae/ou valor da carcaça, levariam a uma reprodução, linhagem ou populaçãoque apresenta maiores números de filhotes com características economica-mente relevantes de crescimento, consumo de alimentação, eficiência e va-lor da carcaça. Assim, os SNPs de TFAM da presente invenção podem serusados como ferramenta de seleção.

Fenótipos desejáveis incluem, mas sem se limitar aos mesmos,consumo de alimentação, taxa de crescimento, peso corporal, valor e com-posição da carcaça e rendimento do leite. Características específicas dacarcaça com fenótipos desejáveis incluem, mas sem se limitar aos mesmos,valor adicional da carcaça (valor adicional da carcaça, $), ganho médio diário(ADG, kg/d), espessura de gordura do lombo (BFAT, cm), peso vivo -calculado (Cale Lv Wt, kg), grau de rendimento calculado (cYG), dias sobalimentação (DOF, d), rendimento de carcaça (DP, %), consumo de matériaseca (DMI, kg), consumo de matéria seca por dia sob alimentação (DMI porDOF, kg/d), peso da carcaça quente (HCW, kg), valor do peso da carcaçaquente (valor HCW, $), teor de gordura intramuscular (IMF%, %), classi-ficação de marmorização (MBS, 10 a 99), classificação de marmorizaçãodividida por dias sob alimentação (MBS/DOF), grau de qualidade, menor ouigual a seleção versus maior ou igual a escolha (QG, < Se vs, > Ch), área deolho de lombo (REA, cm2), área de olho de lombo por cem de peso HCW(REA/cwt HCW, cm2/45 kg de peso da carcaça quente (HCW)) eprofundidade da gordura subeutânea (SFD).Um aspecto da presente invenção permite agrupar animais eproporciona métodos para administrar criação de gado, compreendendo a-grupar animais tal como gado de acordo com o genótipo conforme definidopor painéis de SNPs, cada painel compreendendo pelo menos um SNP, umou mais dos quais não são genes para TFAMúa presente invenção. OutrosSNPs que poderão ser incluídos em painéis de SNPs incluem, mas sem limi-tar aos mesmos, SNPs encontrados no gene para calpastatina.gene paraGHR, gene para FABP4, gene para grelina, gene para leptina, gene paraNPY, gene para ob, gene para UASMS1, gene para UASMS2, gene paraUASMS3e/ou o gene para UCP2. A seleção genética e os métodos de gru-pamento da presente invenção podem ser usados em conjunto com outrosmétodos convencionais de grupamento fenotípíco tal como grupamento deanimais por características visíveis tais como peso, tamanho da estrutura,características de reprodução e similares. Os métodos da presente invençãoproporcionam produzir gado que apresenta características de hereditarieda-de aperfeiçoadas e podem ser usados para otimizar o desempenho de reba-nhos de gado em áreas tais como reprodução, consumo de alimentação,qualidade da carcaça/carne e produção de leite. A presente invenção pro-porciona métodos de seleção de animais para determinar aqueles mais pro-váveis de desenvolver uma condição corporal desejada madiante identifica-ção da presença ou ausência de um ou mais polimorfismos-genétieos corre-lacionados com qualidade da carne.

Conforme descrito acima, e nos Exemplos, há várias caracterís-ticas fenotípicas com que os SNPs da presente invenção poderão ser asso-ciados. Cada uma das características fenotípicas e genéticas pode ser tes-tada usando os métodos descritos nos Exemplos, ou utilizando quaisquermétodos adequados conhecidos no estado da técnica. Usando os métodosda invenção, um fazendeiro, ou operador de confinamento, ou similares, po-de agrupar gado de acordo com cada propensão genética do animal parauma característica desejada tal como taxa de crescimento, consumo de ali-mentação ou comportamento alimentar, como determinado por genótipo deSNP. O gado é testado para determinar homozigosidade ou heterozigosida-de com relação aos alelos de um ou mais genes de SNP de modo que elepossa ser grupado tal que cada cercado contenha gado com genótipos se-melhantes. Cada cercado de animais é então alimentado e mantido de umamaneira diferente e por um tempo determinado pelo operador de confina-mento e em seguida abatido.

Os dados genotípicos individuais derivados de um painel ou pai-néis de SNPs para cada animal ou um rebanho de animais podem ser regis-trados e associados a vários outros dados do animal, por exemplo informa-ção sobre saúde, linhagem, condições econômicas, história de vacinação,registros do rebanho, dados subseqüentes de segurança alimentar e simila-res. Tal informação pode ser enviada a uma agência governamental paraproporcionar rastreabilidade de um animal ou produto carne, ou ela poderáservir como base para reprodução, alimentação e informação de mercado.

Uma vez que os dados tenham sido ou não associados a outros dados, osdados são armazenados em um banco de dados acessível, tais como, massem limitar aos mesmos, um banco de dados de computador ou um micro-chip implantado no animal. Os métodos da invenção poderão proporcionaruma análise dos dados de entrada que poderão ser comparados com parâ-metros desejados pelo operador. Esses parâmetros incluem, mas sem selimitar aos mesmos, parâmetros tais como metas de reprodução, locais deoviposição, níveis de vacinação de um rebanho. Se o desempenho ou pro-priedades dos animais desviam-se das metas desejadas, os métodos base-ados em computador poderão disparar um alerta para permitir que operadorajuste doses de vacinação, medicações, alimentação, etc, conseqüente-mente.

Os resultados da análise fornecem dados que são associadoscom o animal individual ou com o rebanho, no todo ou em parte, do qual aamostra foi tomada. Os dados são então mantidos em um banco de dadosacessível e poderão ou não ser associados a outros dados desse animalindividual particular ou de outros animais.

Dados obtidos de animais individuais poderão ser armazenadosem um banco de dados que pode ser integrado ou associado e/ou combina-do de forma cruzada com outros bancos de dados. O banco de dados jun-tamente com os dados associados permite informação acerca do animal in-dividual a ser conhecido através de cada estágio de sua vida, isto é, da con-cepção ao consumo do produto derivado do animal.

Os dados acumulados e a combinação dos dados genéticos comoutros tipos de dados do animal proporciona accesso a informação acercade linhagem, identificação de rebanho, informação sobre saúde, incluindovacinações, exposição a doenças, localização de confinamentos, dieta emudanças de propriedade. Informações tais como datas e resultados de di-agnóstico ou testes de rotina são facilmente armazenadas e obteníveis. Taisinformações seriam especialmente valiosas para empresas, particularmenteaquelas que buscam linhagens superiores para reprodução.

Cada animal poderá ser dotado de um identificador único. O a-nimal pode receber um brinco de identificação, como em programas tradicio- rnais de rastreio, ou ter chips de computador como implante proporcionandodados armazenados e de leitura, ou dotado de qualquer outro método deidentificação que associa o animal a seu identificdor único.

O banco de dados que contém os resultados genotípicos basea-dos em SNP de cada animal ou os dados de cada animal pode ser associa-do ou ligado a outros bancos de dados que contém dados que, por exemplo,poderão ser úteis na seleção de características para agrupar ou subguparum animal. Por exemplo, e não para limitação, dados que pertencem a ani-mais que apresentam protocolos particulares de vacinação ou medicaçãopodem opcionalmente ser adicionalmente ligados a dados que pertencem aanimais que têm alimento de certas fontes alimentares. A capacidade derefinar um grupo de animais é limitada somente pelas características busca-das e pelos bancos de dados que contêm informação relacionada com essascaracterísticas.

Bancos de dados que podem utilmente ser associados aos mé-todos da invenção incluem, mas sem se limitar aos mesmos, dados científi-cos específicos ou gerais. Dados específicos incluem, mas sem se limitaraos mesmos, linhagens de reprodução, machos, fêmeas e similares, genóti-pos de outros animais, incluindo se ou não outros animais específicos pos-suem genes específicos, incluindo elementos genéticos transgênicos, locali-zação de animais que compartilham características genéticas similares ouidênticas, e similares. Dados gerais incluem, mas sem se limitar aos mes-mos, dados científicos tais como genes que codificam características dequalidade específicas, dados de associação de reprodução, dados de ali-mentação, tendências de reprodução e similares.

Um método da presente invenção inclui dotar o proprietário deanimais ou cliente de equipamento de coleta de amostra, tais como amos-tras da cavidade bucal e etiquetas úteis para coletar amostras das quais da-dos genéticos poderão ser obtidos. Vantajosamente, a embalagem é codifi-cada com um rótulo com código de barras. As etiquetas são codificadas comas mesmas indicações de identificação, vantajosamente com um rótulo decódigo de barras combinado. Opcionalmente, a embalagem contém disposi-tivo para enviar as etiquetas a um laboratório para análise. A embalagemopcional é também codificada com indicações de identificação, vantajosa-mente com um rótulo de código de barras.

O método opcionalmente inclui um sistema em que uma contade banco de dados é estabelecida após ordenar o equipmento de amostra-gem. O identificador da conta de banco de dados corresponde às indicaçõesde identificação das etiquetas e da embalagem. Após expedição do equip-mento de amostragem em cumprimento das instruções, as indicações deidentificação são registradas em um banco de dados. Vantajosamente, oidentificador é um rótulo de código de barras que é escaneado quando asetiquetas são enviadas. Quando as etiquetas são retornadas à instalação detestes, o identificador é novamente registrado e combinado com a informa-ção previamente registrada no banco de dados durante expedição do frascoao cliente. Uma vez completada a genotipificação, a informação é registradano banco de dados e codificada com o identificador único. Resultados detestes são também proporcionados ao cliente ou proprietário de animais.

Os dados armazenados no banco de dados de genótipos podem ser inte-grados com ou comparados com outros dados ou bancos de dados com afinalidade de identificar animais com base em propensões genéticas. Outrosdados ou bancos de dados incluem, mas sem se limitar aos mesmos, aque-les que contêm informação relacionada com testes de DNA baseados emSNP, vacinação, programa de pré-condicionamento "Sure Health", cio e re-sultados de gravidez, níveis de hormônio, segurança/contaminação alimen-tar, contagens de células somáticas, ocorrência de mastite, resultados detestes de diagnóstico, níveis de proteína do leite, gordura do leite, status devacinas, registros de saúde, níveis minerais, níveis de traços de minerais,desempenho dos rebanhos e similares.

A presente invenção, portanto, cobre métodos auxiliados porcomputador para rastrear as histórias de reprodução e veterinárias de gadoos quais abrangem usar um sistema baseado em computador que compre-ende um computador programado que compreende um processador, umsistema de armazenamento de dados, um dispositivo de entrada e um dis-positivo de saída, e compreendem as etapas de gerar um perfil de animaisde criação mediante entrada no computador programado por meio do dispo-sitivo de entrada dados genotípicos do animal, em que o genótipo poderá serdefinido por um painel de pelo menos dois polimorfismos em um único nu-cleotídeo que predizem pelo menos uma característica física do animal, inse-rir no computador programado por meio do dispositivo de entrada dados desaúde do animal, correlacionar os dados de saúde entrados com o perfil fe-notípico do animal utilizando o processador e o sistema de armazenamentode dados, e sair um perfil do animal ou grupo de animais no dispositivo desaída.

Os bancos de dados e a sua análise serão accessíveis àquelesa quem accesso tenha sido proporcionado. Acesso pode ser proporcionadopor meio de direitos a accesso ou por subscrição de porções específicas dosdados. Por exemplo, o banco de dados pode ser accessado por proprietáriosdos animais, pelo local de teste, pela entidade que fornece a amostra ao lo-cal de teste, pessoal operador de confinamento e veterinários. Os dados po-dem ser fornecidos sob qualquer forma tais como accesso de uma website,fax, e-mail, correspondência por e-mail, telefone automatizado ou outros mé-todos de comunicação. Esses dados podem também ser codificados em umdispositivo de armazenamento portátil, tal como um microchip, que pode serimplantado no animal. Vantajosamente, informação pode ser lida e nova in-formação adicionada sem remover o microchip do animal.

A presente invenção compreende sistemas para realizar os mé-todos aqui descritos. Tais sistemas compreendem dispositivos, tais comocomputadores, conexões com a internet, servidores e dispositivos de arma-zenamento para dados. A presente invenção também proporciona um méto-do de transmissão de dados que compreende transmissão de informação apartir de métodos aqui discutidos ou etapas do mesmo, por exemplo, via te-lecomunicação, telefone, videoconferência, comunicação de massa, por e-xemplo, apresentação tal como apresentação por computador (por exemplo,POWERPOINT), internet, e-mail, comunicação por documentos tais comoprogramas de computador (por exemplo, WORD) e similares.

Sistemas da presente invenção poderão compreender um módu-lo de coleta de dados que inclui um coletor de dados para coletar dados deum animal ou embrião e transmitir os dados a um módulo de análise de da-dos, uma interface de rede para recever dados do módulo de análise de da-dos e opcional e adicionalmente adaptada para combinar dados múltiplos deum ou mais animais individuais e transmitir os dados via uma rede a outroslocais ou a um dispositivo de armazenamento.

Mais particularmente, sistemas da presente invenção compreen-dem um módulo de coleta de dados, um módulo de análise de dados, umainterface de rede para recever dados do módulo de análise de dados e op-cional e adicionalmente adaptada para combinar dados múltiplos de um oumais animais individuais e transmitir os dados via uma rede a outros locaisou a um dispositivo de armazenamento. Por exemplo, os dados coletadospelo módulo de coleta de dados leva a uma determinação da ausência oupresença de um SNP de um gene no animal ou embrião, e, por exemplo,esses dados são transmitidos quando o regime de alimentação do animal éplanejado.

Em uma modalidade em que os dados são implantados em ummicrochip em um animal particular, o fazendeiro pode otimizar a eficiência deadministração do rebanho porque o fazendeiro é capaz de identificar as pre-disposições genéticas de um animal individual, bem como pasto, tratamen-tos presentes e futuros (por exemplo, vacinações e visitas do veterinário). Ainvenção, portanto, também proporciona accesso a outros bancos de dados,por exemplo, dados de rebanhos relativos a testes genéticos e dados reali-zados por outros, mediante links de dados em outros sites. Portanto, dadosde outros bancos de dados podem ser transmitidos ao banco de dados cen-tral da presente invenção via uma interface de rede para recever dados domódulo de análise de dados dos outros bancos de dados.

A invenção refere-se a um sistema de computador e uma mídiade leitura por computador para compilar dados sobre um animal, o sistemacontendo dados entrados sobre esse animal, tais como, mas sem se limitaraos mesmos, histórias de vacinação e medicação, testes de DNA, testes detiroglobulina, leptina, MMI (Meta Morphix, Inc.), diagnose de encefalopatiaespongiforme bovina (BSE), vacinação contra brucelose, vacinação contraFMD (febre aftosa), vacinação contra BVD (diarréia viral bovina), programade pré-condicionamento "Sure Health", cio e resultados de gravidez, tubercu-lose, níveis de hormônio, segurança/contaminação alimentar, contagens decélulas somáticas, ocorrência de mastite, resultados de testes de diagnósti-co, níveis de proteína do leite, gordura do leite, status de vacinas, registrosde saúde, níveis minerais, níveis de traços de minerais, desempenho dosrebanhos e similares. Os dados do animal podem também incluir tratamen-tos anteriores, bem como tratamento sob medida sugerido dependendo dapredisposição genética desse animal para uma doença particular.

A invenção também proporciona um método auxiliado por com-putador para aperfeiçoar produção animal o qual compreende usar um sis-tema de computador, por exemplo, um computador programado que com-preende um processador, um sistema de armazenamento de dados, um dis-positivo de entrada e um dispositivo de saída, as etapas de inserir no com-putador programado, por meio do dispositivo de entrada, dados que com-preendem dados de reprodução, veterinários, de medicação, de diagnósticoe similares de um animal, correlacionar uma característica física predita pelogenótipo usando o processador e o sistema de armazenamento de dados,sair pelo dispositivo de saída a característica física correlacionada com ogenótipo e alimentar o animal com uma dieta com base na característica físi-ca, aperfeiçoando desse modo a criação de gado.

A invenção adicionalmente proporciona um método auxiliado porcomputador para otimizar eficiência de confinamentos para gado, métodoeste que compreende usar um sistema de computador, por exemplo, umcomputador programado que compreende um processador, um sistema dearmazenamento de dados, um dispositivo de entrada e um dispositivo desaída, e as etapas de inserir no computador programado, por meio do dispo-sitivo de entrada, dados que compreendem uma história de reprodução eveterinária de um animal, correlacionar as histórias de reprodução e veteri-nárias usando o processador e o sistema de armazenamento de dados, sairpelo dispositivo de saída a característica física correlacionada com o genóti-po e alimentar o animal com uma dieta com base na característica física,otimizando desse modo a eficiência de confinamentos para gado.

A invenção adicionalmente compreende métodos de trabalhocomercial ao proporcionar accesso a essa mídia de leitura por computadore/ou sistema de computadores e/ou dados coletados de animais para usuá-rios; por exemplo, a mídia e/ou dados sobre seqüências podem ser accessí-veis por um usuário, por exemplo com base em uma subscrição, via Internetou uma rede global de comunicação/computadores; ou o sistema de compu-tador pode ser disponível a um usuário, com base em uma subscrição.

Em uma modalidade, a invenção proporciona um sistema decomputador para administrar criação de animais o qual compreende caracte-rísticas físicas e bancos de dados que correspondem a um ou mais animais.

Em uma outra modalidade, a invenção proporciona mídia de leitura por com-putador para administrar criação de animais a qual compreende característi-cas físicas e histórias veterinárias que correspondem a um ou mais animais.

A invenção adicionalmente proporciona métodos de trabalho comercial paraadministrar criação de animais os quais compreendem proporcionar a umusuário o sistema de computador e mídia descritos acima ou característicasfísicas e histórias veterinárias que correspondem a um ou mais animais. Ainvenção adicionalmente abrange métodos de transmissão de informaçãoobtida em qualquer método ou etapa deste descritos neste relatório ou qual-quer informação descrita neste relatório, por exemplo, via telecomunicações,telefone, comunicação de massa, mídia de massa, apresentações, internet,e-mail, etc.

1A invenção adicionalmente abrange kits úteis para selecionarácido nucléico isolado de um ou mais indivíduos bovinos em relação a varia-ção alélica de qualquer um dos genes para fator de transcrição mitocondrial,e em particular para qualquer dos SNPs descritos neste relatório, em que oskits poderão compreender pelo menos um oligonucleotídeo que hibridizaseletivamente com um ácido nucléico que compreende qualquer uma dasseqüências descritas aqui, uma ou mais das quais são seqüências de TFAM,e instruções para usar o oligonucleotídeo para detectar variação no nucleotí-deo que corresponde ao SNP do ácido nucléico isolado.

Uma modalidade desse aspecto da invenção proporciona umoligonucleotídeo que hibridiza especificamente com a molécula de ácido nu-cléico isolda desse aspecto da invenção, e em que o oligonucleotídeo hibri-diza com uma porção da molécula de ácido nucléico isolada que compreen-- de qualquer um dos sítios polimorficos nas seqüências de TFAM descritasneste relatório.

Uma outra modalidade da invenção é um oligonucleotídeo quehibridiza especificamente sob condições de alto rigor com qualquer um dossítios polimorficos do gene para TFAM, em que o oligonucleotídeo situa-seentre cerca de 18 nucleotídeos e cerca de 50 nucleotídeos.

Em uma outra modalidade da invenção, o oligonucleotídeo com-preende um nucleotídeo central que hibridiza especificamente com um genepara sítio polimórfico de TFAM da porção da molécula de ácido nucléico.

Um outro aspecto da invenção é um método de identificação deum polimorfismo de TFAM em uma amostra de ácido nucléico que compre-ende isolar uma molécula de ácido nucléico que codifica TFAM ou um frag-mento deste e determinar o nucleotídeo no sítio polimórfico.

Um outro aspecto da invenção é um método de seleção de gadopara determinar aqueles bovinos que mais provavelmente exibem uma dife-rença biológica na qualidade da carne, método este que compreende as e-tapas de obter uma amostra de material genético de um bovino e ensaiar emrelação à presença de um genótipo no bovino que se associa a qualidade dacarne, o genótipo caracterizado por um polimorfismo em qualquer um dosgenes para fator de transcrição mitocondrial.

Em outras modalidades desse aspecto da invenção, a etapa deensaio é selecionada do grupo que consiste em: análise de polimorfismo nocomprimento do fragmento de restrição (RFLP), minisseqüenciamento,MALD-TOF, SINE, análise de heterodúplex, polimorfismo de conformação defilamento único (SSCP), eletroforese em gel com gradiente de desnaturação(DGGE) e eletroforese em gel com gradiente de temperatura (TGGE).

Em várias modalidades da invenção, o método poderá adicio-nalmente compreendee a etapa de amplificar uma região do gene paraTFAM ou uma porção deste que contém o polimorfismo. Em outras modali-dades da invenção, a amplificação poderá incluir a etapa de selecionar uminiciador com seqüência direta ou inversa capaz de amplificar uma região dogene para TFAM.

Um outro aspecto da invenção é um método auxiliado por com-putador for predizer que animais possuem uma diferença biológica na quali-dade da carne, método este que compreende: usar um sistema de computa-dor, por exemplo, um computador programado que compreende um proces-sador, um sistema de armazenamento de dados, um dispositivo de entrada eum dispositivo de saída, as etapas de: (a) inserir no computador programa-do, por meio do dispositivo de entrada, dados que compreendem um genóti-po de TFAM de um animal, (b) correlacionar crescimento, consumo de ali-mentação, eficiência ou qualidade da carcaça em termos de valor preditospelo genótipo de TFAM utilizando o processador e o sistema de armazena-mento de dados e (c) sair pelo dispositivo de saída a qualidade da carne cor-relacionada com o genótipo de TFAM, predizendo desse modo que animaispossuem um nível de crescimento particular, consumo de alimentação, efici-ência ou qualidade da carcaça em termos de valor.

Ainda um outro aspecto da invenção é um método de trabalhocomercial para administrar criação de animais o qual compreende proporcio-nar a um usuário sistema de computador para administrar criação de ani-mais, sistema este que compreende características físicas e genótipos quecorrespondem a um ou mais animais ou uma mídia de leitura por computa-dor para administrar criação de animais que compreendem característicasfísicas e genótipos que correspondem a um ou mais animais ou característi-cas físicas e genótipos que correspondem a um ou mais animais.

A invenção será agora adicionalmente descrita à guisa dos exemplosseguintes não-limitativos.

EXEMPLOS

Exemplo 1

Este Exemplo proporciona seqüências de DNA, polimorfismosgenéticos e associações singificativas com marmorização e profundidade degordura subcutânea nos cruzamentos Wagyu x Limousin F2 para o gene pa-ra fator de transcrição mitocondrial A (TFAM) bovino.

Fator de transcrição mitocondrial A {TFAM), uma proteína codifi-cada no núcleo, desempenha um importante papel na iniciação de transcri-ção e replicação de DNA mitocondrial (mtDNA). Expressão reduzida em ge-nes mitocondriais codificados no núcleo tem sido associada a início de obe-sidade em camundongos. Portanto, estabeleceu-se a hipótese de que vari-antes genéticas em gene para TFAM influenciam biogênese mitocondrial,conseqüentemente afetando deposição de gordura corporal e metabolismode energia. No presente estudo, tanto seqüências de cDNA (2259 bp) quan-to seqüências de DNA genômico (16,666 bp) foram geradas para o genebovino para TFAM usando uma combination de clonagem in silico com am-plificação por PCR da região-alvo. Alinhamento de ambas as seqüências decDNA e de DNA genômico levaram à determinação de organização e carac-terização genômicas da região promotora do gene bovino para TFAM. Infe-lizmente, nenhum polimorfismo foi detectado na região de codificação, masdois polimorfismos em um único nucleotídeo (SNPs) A/C e C/T estreitamenteligados foram verificados no promotor de TFAM bovino. Esses dois SNPsforam genotipificados em animais Wagyu x Limousin 237 F2 com fenótiposregistrados para marmorização e profundidade de gordura subcutânea(SFD). Análise estatística demonstrou que ambos os SNPs eram associadosa marmorização (P = 0,0153 para A/C e P = 0,0026 para C/T) e SFD (P =0,0200 para A/C e P = 0,0039 para C/T), respectivamente. Uma busca emrelação a elementos reguladores de transcrição usando Matlnspector indicouque ambos os SNPs conduzem a um ganho/perda de seis sítios de ligaçãoputativos para genes correspondentes a deposição de gordura e metabolis-mo de energia. Comparado com registros anteriores sobre genes para tiro-globulina, leptina e diacilglicerol O-aciltranferase, o gene para TFAM apre-sentou os maiores efeitos tanto sobre marmorização quanto sobre SFD nes-sa população, indicando seu potencial como novo alvo para seleção auxilia-da por marcador na indústria de carne bovina.

Fator de transcrição mitocondrial A (TFAM), um membro de umgrupo de famílias de proteínas de alta mobilidade e o primeiro fator de trans-crição mitocondrial identificado (Fisher e Clayton, 1988), é essencial paramanutenção e biogenêse de mtDNA. Primeiro, TFAM desempenha um papelsemelhante a histona em mitocôndrias, na medida em que é rigorosamenteassociado a mtDNA como-principal componente do nucleóide (Kanki e ou-tros, 2004a). A evidência mostrou que uma molécula de mtDNA é embaladacom -900 moléculas de TFAM em média (Alam e outros, 2003), o que tornamtDNA não mais despido. Segundo, TFAM regula número de cópias demtDNA em mamíferos. Investigação usando uma combinação de camun-dongos com superexpressão de TFAMe knockoutde TFAM demonstrou queo número de cópias de mtDNA é diretamente proporcional ao nível total deproteína de TFAM em embriões de camundongos (Ekstrand e outros, 2004).

Interferência da expressão endógena de TFAM em RNA em células HeLatambém indicou que a quantidade de mtDNA correlaciona-se em paralelocom a quantidade de TFAM (Kanki e outros, 2004b). terceiro, TFAM estimu-la transcrição de mtDNA. A proteína de TFAM possui dois domínios em tan-dem em grupo de alta mobidade, o que torna TF AM ligue, desenrole e dupli-que DNA sem especificifade de seqüências e, assim, facilita iniciação detranscrição de mtDNA (Gaspari e outros, 2004). Evidência mostra que impor-tação de vA-TFAM para mitocôndrias do fígado de ratos com hipotireóideaumentou a síntese de RNA significativamente até 4 vezes (Garstka e ou-tros, 2003).

Sabe-se há muitos anos que tecido adiposo desempenha umpapel central na regulação e manipulação de metabolismos de energia pormeio do armazenamento e renovação de triglicerídeos e por meio da secre-ção de fatores que afetam saciedade e utilização de combustível. Entretanto,muitos aspectos-chave de adipogênese são acompanhados de estimulaçãode biogênese mitocondrial (Wilson-Fritch e outros, 2003). Por exemplo, oprincipal sítio de B-oxidação de ácidos graxos ocorre em mitocôndrias (Rei-chert e Neupert, 2004), o que poderá proporcionar intermediários-chave paraa síntese de triglicerídeos via ação de piruvato carboxilase (Owen e outros,2002). Adicionalmente, uma massa mitocondrial relativamente grande é ne-cessária para gerar acetil-CoA para ativação de ácidos graxos antes de este-rificação em triglicerídeos. Todos esses estudos demonstraram o papel efunção essenciais de mitocôndrias no metabolismo de lipídeos.

Para explorar adicionalmente o mecanismo de mitocôndrias en-volvidas-em adipogênese, Wilson-Fritch e colegas (2003 e 2004) estudarama diferenciação de células 3T3-L1 (representante de adipócitos brancos) u-sando abordagens tanto proteômicas quanto genômicas. Análise proteômi-cas revelaram aumento de 20 a 30 vezes na concentração de numerosasproteínas mitocondriais, enquanto análise genômica com perfil de expressãode genes usando Affymetrix GeneChips detectou um aumento estatistica-mente significativo na expressão de muitos genes mitocondriais codificadosno núcleo durante adipogênese. Em particular, os autores verificaram umaprofunda diminuição de aproximadamente 50% nos níveis de transcritos pa-ra genes mitocondriais codificados no núcleo que acompanham o início deobesidade (Wilson-Fritch e outros, 2004). Como TFAM é um dos genes mi-tocondriais codificados no núcleo, estabeleceu-se a hipótese de que ele de-sempenha um importante papel em lipogênese ou deposição de gordura viaseu papel em biogênese mitocondrial. Aqui, apresenta-se evidência que sus-tenta a hipótese mediante registro de significativas associações de polimor-fismos em promotores de TFAM bovino com classificações de marmorizaçãoe medições de SFD em cruzamentos de raças Wagyux Limousin.

Uma geração de um cruzamento Wagyu x Limousin foi de-senvolvida na Universidade do Estado de Washington e transferida para oFort Keogh Livestock and Range Research Laboratory (Laboratório de Pes-quisa de Gado e Pastagens Naturais Fort Keogh), ARS, USDA, no outono de1998, incluindo 6 touros Ft e 113 fêmeas. Acasalamento entre si desses a-nimais Fi produziram 71 progênies F2em 2000, 90 em 2001 e 109 em 2003,respectivamente. Cada bezerro foi pesado dentro de 24 h após aniversário enovamente no desmame quando os bezerros atingiram a média de aproxi-madamente 180 d de idade. Após desmame, os bezerros foram retornados apastos naturais nativos e suplementados com 0,7 kg por bezerro por dia tan-to de torta de cevada quanto de péletes de alfalfa. Em meados de janeiro, osbezerros foram retirados da pastagem e alimentados com forragem e fenocortado para obter ganhos antecipados de 0,5 a 0,8 kg por dia. Eles foramentão colocados sob dieta final por aproximadamente 150 dias seguida deabate. Dados de taxa de crescimento e de qualidade da carcaça e da carneforam coletados de todos os bezerros F2. As classificações de marmorizaçãovariaram de 4 = Ligeiro0 a 9,5 = Moderadamente Abundante50 (SD = 1,00) emedições de SFD, 0,25 a 3,30 cm (0,1 a 1,3 polegada) (SD = 0,18) nessapopulação F2. Marmorização foi uma medida subjetiva da quantidade degordura intramuscular no músculo longuíssimo, com base em padrões USDA(http://www.ams.usda.gov/). SFD foi medido na interface da 12-13- costelaperpendicular à superfície externa em um ponto três-quartos do comprimen-to do músculo longuíssimo a partir da exteremidade de sua coluna vertebral.DNA foi extraído de amostras de sangue. Com base na disponibilidade tantode dados quanto de amostras de DNA, 246 observações foram usadas nopresente estudo.

Infelizmente, tanto seqüências de cDNA quanto seqüências deDNA genômico não eram disponíveis para o gene bovino para TFAMquando oprojeto foi iniciado. Contudo, o projeto de mapeamento do genoma bovino a-vançou significativamente em anos recentes. Em particular, mais de 500.000ESTs bovinos (abas de seqüências expressas) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) e3X seqüências de genoma bovino (http://www.hgsc.bcm.tmc.edu/proiects/ bovi-no/) foram liberados aos bancos de dados públicos. Portanto, uma combina-ção de uma clonagem comparativa in silico com uma abordagem de clona-gem-alvo por PCR foi desenvolvida e utilizada para determinar tanto se-qüências de cDNA quanto seqüências de DNA genômico do gene bovino(figura 1). O procedimento incluiu três etapas: 1), buscas de BLAST contraos bancos de dados públicos usando uma seqüência de comprimento totalde cDNA do gene humano para TFAM como referência para recuperação detodas as seqüências bovinas que são ortólogas ao gene humano; 2), anota-ção tanto de ESTs quanto de seqüências de DNA genômico a fim de projetariniciadores para a amplificação de região-alvo fechar intervalos se houver; e3); alinhamento de seqüências de cDNA e seqüências de DNA genômicopara determinar a seqüência de cDNA de comprimento completo e organiza-ção genômica do gene bovino para TFAM.

Dois pares de iniciadores foram projetados para fechar dois in-tervalos da seqüência de DNA genômico do gene bovino para TFAM (Tabela1). Reações de PCR foram realizadas usando 25 ng de DNA genômico bovi-no como padrão em um volume final de 10 jj.L contendo 12,5 ng de cada ini-ciador, 200 ^iM de dNTPs, 1,5 - 3 mM de MgCI2, 50 mM de KCI, 20 mM deTris-HCI e 0,2 U de Platina Taq polimerase (Invitrogen, Carlsbad, CA). Ascondições de PCR foram realizadas como segue: 94°C por 2 min, 32 ciclosde 94°C por 30 s, 63°C por 30 s e 72°C por 30 s, seguido de uma extensãoadicional de 5 min a 72°C. Produtos de PCR foram então examinados porelectroforese através de um gel de agarose a 1,5% com 1X tampão de TBEpara determinar a qualidade e quantidade de seqüenciamento de DNA. Se-qüenciamento foi realizado em seqüenciador ABI 3730 no Laboratório deBiotecnologia e Bioanálise (Universidade do Estado de Washington). Se-qüências desses dois produtos amplificados por PCR que cobrem as regiõesde intervalos e três contigs de seqüências genômicas derivadas do projetode seqüências de genoma de gado foram então montadas para formar umaseqüência completa de DNA genômico do gene bovino para TFAM.Tabela 1. Iniciadores projetados para fechamento de intervalos genômicos e detecção de mutação no gene bovinopara TFAM.

<table>table see original document page 60</column></row><table>Iniciadores foram projetados para atingir a região promotora etodas as regiões de codificação a fim de selecionar polimorfismos genéticosno gene bovino para TFAM (Tabela 1). Quatro pools de DNA foram forma-dos, um de todos os seis touros Fi, um de 30 fêmeas Fi aleatoraimente se-lecionados, um de 30 progênies F2 de alta marmorização e um de 30 progê-nies F2 de baixa marmorização. Produtos de PCR para cada par de iniciado-res foram amplificados nesses quatro pools de DNA e diretamente sequen-ciados em sequenciador ABI 3730 como descrito acima. Polimorfismos emnucleotídeo foram identificados por comparação de padrões de seqüênciasentre esses quatro pools de DNA.Jnfelizmente, nenhum polimorfismo foi de-tectado nas seqüências de codificação, mas dois SNPs, isto é, substituiçãoC/A e substituição C/T foram verificadas na região promotora de TFAM bovi-no.

Esses dois SNPs na região promotora bovina foram então geno-tipificados em animais Wagyu x Limousin F2 que apresentam tanto amostrasde DNA amostras quanto dados de desempenho para classificação de mar-morização e medições de SFD. Usando a abordagem de PCR-RFLP (poli-morfismo em comprimento de fragmento de restrição), essas duas mutaçõesforam reveladas por digestão a 37°C por três horas de amplicons de PCRcom 2U de Haelll para a substituição C/A e 2U de Dpn\ para a substituiçãoC/T, seguido de análise sobre géis de agarose a 4%. Os dados fenotípicospara classificações de marmorização e medições de SFD foram ajustadospara efeitos de anos, gênero e idade sob coleta (linear) antes de avaliaçãodos efeitos dos genótipos usando o procedimento GLM (modelo linear geral)de SAS v9.1 {SAS institute, Inc., Gary, NC) para avaliar os efeitos de grupocontemporâneo e genótipo no locus do gene para TFAM.

As buscas de BLAST usando o cDNA humano de TFAM(NM_003201) como referência recuperou oito seqüências de EST ortólogobovino dos ESTs de outros bancos de dados no National Center for Biotech-nology Informatics (NCBI) (Centro Nacional de Informática de Biotecnologia)e três contigs genômicos da montagem de genoma de gado 3X na BaylorCollege Medicine. Três ESTs (DN286575, DN285251 e CN793484) foramescolhidos para formar uma seqüência inicial de cDNA de consentido do ge-ne bovino para TFAM, mas eles deixaram um intervalo em 3'UTR (regiãonão-traduzida) (figura 1). No entanto, alinhamento inicial dessas seqüênciasde EST com a seqüência de DNA genômico revelou que o intervalo na se-qüência de cDNA podia ser facilmente fechado usando a seqüência de DNAgenômico que corresponde à região 3'UTR. O comprimento total da seqüên-cia de mRNA montada é de 2.259 pb para o gene bovino para TFAM. Trêscontigs óe DNA genômico (conf/gf45319, contig729099 e conf/pl 38856) apa-rentemente não apresentaram superposição. Orientação desses três contigsgenômico em uma direção 5' - 3' que corresponde à seqüência de mRNAtornou possível projetar iniciadores para fechar dois intervalos entre eles (fi-gura 1). Dois produtos de PCR de 222 pb e 736 pb (Tabela 1) foram amplifi-cados e sequênciados. Montagem dos três contigs genômicos e desses doisprodutos de PCR tornaram possível para formar uma seqüência de DNA ge-nômico de 16.666 pb para o gene bovino para TFAM (figura 1).

Todos os oito ESTs bovinos que são ortólogos ao gene humanopara TFAM são 99 - 100% idênticos à seqüência de consentido montada demRNA. A seqüência completa de codificação putativa do gene bovino paraTFAM é 741 pb de comprimento, que é idêntica àquela em humano(NM_003201, D'Errico e outros, Gene 362, 125-132 (2005)), mas de 6 pb e 9- pb mais longa do que em rato (NM_031326, Piantadosi e Suliman, J. Biol.Chem. 281 (1), 324-333 (2006)) e camundongo (NM_009360, Noack e ou-tros, Biochim. Biophys. Acta 1760 (2), 141-150 (2006)), e 48 pb mais curtado que em galinha (NM_204100, Caldwell e outros, Genome Biol. 6 (1), R6(2005)), respectivamente. A seqüência de aminoácidos traduzida codificadapelo gene bovino para TFAM mostrou 91% de identidade com porco(AY923074), 71% com humano (NM_003201), 65% com rato (NM_031326),63% com camundongo (NM_009360) e 43% com galinha (NM_204100),respectivamente. A estrutura geral do gene bovino para TFAM foi determi-nada comparando a seqüência de DNA genômico com a seqüência comple-ta de cDNA determinada no estudo (figura 1). Como ocorre em humano, ca-mundongo, rato e galinha, a organização genômico do gene bovino paraTFAM consiste em sete éxons e seis íntrons (figura 1).

Estima-se que o genoma bovino seja similar em tamanho aosgenomas de humanos e outros mamíferos, contendo aproximadamente 3bilhões de pares de bases de DNA. Seqüenciamento do genoma bovino co-meçou em dezembro de 2003 e a montagem inicial com base em cobertura3,3 vezes do genoma bovino foi liberada em 6 de outubro de 2004, que podeagora ser accessado através do GenBank (www.ncbi.nih.gov/Genbank) emNCBI. Adicionalmente, mais de 500.000 ESTs bovinos foram também libera-dos ao público e podem ser accessados através do GenBank em NCBI. Tan-to ESTs bovinos quanto seqüências de genoma proporcionam-nos valiososrecursos para revolucionar a pesquisa de genoma em gado. No presenteestudo, uma ferramenta que combina uma clonagem comparativa in silicocom uma abordagem de clonagem-alvo por PCR foi desenvolvida e utilizadapara clonar tanto seqüências de cDNA quanto seqüências de DNA genômicodo gene bovino para TFAM. Essa abordagem é muito direta, simples, rápidae econômica. Portanto, essa abordagem poderá servir como uma das ferra-mentas-modelo na identificação, mapeamento e compreensão da função degenes em gado, o que avançará adicionalmente a pesquisa básica em biolo-gia.

A figura 2 mostra a seqüência de nucleotídeos para a região 5' amontante e todo o éxon 1 do gene bovino para TFAM. Análise usando o pro-grama Matlnspector (Quandt e outros, 1995) revelou um fator respiratórionuclear potencial 1 (NRF1) e um sítio de ligação com proteína de estimula-ção 1 (SP1) na região promotora de TFAM bovino (figura 2). Entretanto, opromotor de TFAM bovino carece dos sítios de ligação putativos para fatorrespiratório nuclear 2 (NRF2). Na região promotora de TFAM humano, sítiosde ligação tanto de NRF1 quanto de NRF2 foram verificados, enquanto so-mente sítios de ligação de NRF2 existiam nos promotores de TFAM de ratose camundongos (Scarpulla, 2002). Todos os promotores de TFAM em hu-mano, rato e camundongo apresentam os sítios de ligação de SP1. NRF1,NRF2 e SP1 são os fatores mais prevalentes associados a genes respirató-rios (Scarpulla, 2002). Além dos sítios de ligação de NRF1 e SP1, o promo-tor de TFAM bovino contém um sítio de ligação de repressor de transcriçãoprovisório, que se liga a elementos encontrados predominantemente em ge-nes que participam do metabolismo lipídico (figura 2). Embora ele seja não-nuclear se as ilhas CpG são metiladas in vivo, muitos loci CpG metiladospotenciais estão presentes no promotor de TF AM bovino (figura 2).

De modo muito interessante, o promotor de TF AM bovino poderáser um dos poucos promotores que contêm códon AUG de ocorrência natu-ral a montante do sítio de partida de tradução normal (figura 2). Esse códonAUG extra foi também confirmado por seqüenciamento com iniciadores quecobrem promotor parcial, éxon 1 inteiro e íntron 1 parcial (vide descrição a-baixo) no estudo. A regra geral de Kozak é aquela em que na maioria doscasos o códon AUG mais próximo da extremidade 5'é o sítio único de inicia-ção de tradução, porque esse "efeito de posição" é visto em casos em queuma mutação cria um códon AUG a montante do sítio de partida normal edesloca a tradução para o sítio a montante (Kozak, 2002). No entanto, essaprimeira regra pode ser rejeitada quando o tripleto proximal AUG em 5' éseguido imediaramente de um códon terminador, que torna possível a reini-ciação em um códon AUG a jusante (Kozak, 1995). Observa-se que essecódon AUG extra no promotor de TFAM bovino não está em estrutura (figura2). Se ele traduzisse, geraria logo um peptídeo de 12 aminoácidos comoMQWRFSGAYGAC (ID SEQ-NO: 22). Se e como esse tripleto proximal AUGem 5' interfere na tradução normal, permanece desconhecido. Portanto, ogene bovino para TFAM poderia ser um gene-modelo natural para investiga-ção de mecanismos envolvidos em iniciação de tradução de genes em ma-míferos.

Um total de oito pares de iniciadores foi projetado e usado paraselecionar polimorfismos genéticos no gene bovino para TFAM. Um par deiniciadores atinge a região promotora e os iniciadores restantes amplificamsete éxons com um par de iniciadores por éxon. Contudo, o último par inicia-dores foi usado tanto para fechamento de intervalo quanto para amplificaçãode éxon 7 (Tabela 1). A fim de ter cada região de éxons completamente am-plificada e sequênciada, pelo menos 100 pb de seqüências de cada lado deflanqueamento foram incluídas nos produtos. Nenhum polimorfismo foi verifi-cado em todas as seqüências de codificação do gene bovino para TFAM,embora a população de referência inclua duas reças de gado divergente-mente reproduzidas: uma de origem aiática, Wagyu, e outra de origem euro-péia, Limousin, que apresentam características que são bastante diferentesuma da outra. Entretanto, dois SNPs foram detectados na região promotora(figura 2 e figura 3). Esses dois SNPs localizam-se exatamente 9 pb separa-dos, uma substituição C/A e uma outra substituição C/T. Ambos os SNPsforam revelados por digestão com Hae\\\ e DpnU, respectivamente, em umfragmento de 801 pb (figura 4).

Como o fragmento possui três sítios de restrição Hae\\\, a diges-tão produz duas faixas invariáveis de 152 pb e 462 pb e uma faixa de 187pb, que podem ser, dependendo do nucleotídeo na posição -1220 (figura 2),adicionalmente clivadas em duas faixas de 83 pb e 104 pb (figura 4). Por-tanto, animais homozigóticos com alelo A apresentam dois sítios Haelll erevelam após digestão completa três faixas: de 152 pb, 187 pb e 462 pb;animais homozigóticos com alelo C ganharam um sítio adicional Haelll nes-sa posição e resultaram em quatro faixas (de 83 pb, 104 pb, 152 pb e 462pb) após digestão completa. Contudo, animais heterozigóticos mostraramcinco faixas após digestão com Haelll (figura 4). Esses dois sítios comunsHaelll forarrt considerados como controles internos da digestão enzimática.

Em comparação, o fragmento contém quatro sítios de restiçãoDpnll, incluindo um sítio polimórfico. Portanto, digestão com Dpnll produztrês faixas invariáveis de 55 pb, 68 pb e 135 pb, e três faixas polimórficas de241 pb, 302 pb e 543 pb, respectivamente (figura 4). Animais homozigóticoscom alelo T apresentam todos os quatro sítios Dpnll e revelam após diges-tão completa cinco faixas: de 55 pb, 68pb, 135 pb, 241 pb e 302 pb, enquan-to animais homozigóticos com alelo C apresentam perda de um sítio Dpnllna posição -1212 (figura 2) e resultam em quatro faixas (de 55 pb, 68 pb,135 pb e 543 pb) após digestão completa. No entanto, animais heterozigóti-cos mostraram seis faixas após digestão com Dpnll (figura 4). Esses trêssítios comuns Dpnll também serviram como controles internos da digestãoenzimática.

Genotipificação de 237 animais F2 em relação tanto a SNPs C/Aquanto a SNPs C/T revelaram 75 animais homozigóticos CC, 45 animaishomozigóticos AA e 117 animais heterozigóticos CA para o primeiro SNP e84 animais homozigóticos CC, 33 animais homozigóticos TT e 120 animaisheterozigóticos CT para o último SNP (Tabela 2). Em relação a substituiçãoC/A, as freqüências de alelo C e alelo A na população foram de 0,56 e 0,44,respectivamente. A freqüência de alelo C aumentou ligeiramente para 0,61para a substituição C/T. Entretanto, ambas as distribuições de genótipos es-tavam em equilíbrio Hardy-Weinberg.

Análise de modelo linear geral indicou claramente que o efeitode genótipo em SNP atingiu significância estatística (para substituição C/A,P = 0,0019 para classificação de marmorização e P = 0,0200 para mediçãode SFD; e para substituição C/T, P = 0,0011 para classificação de marmori-zação e P = 0,0039 para medição de SFD) (Table 2). Para substituição C/A,o gado com o genótipo homozigótico (CC) apresentou 0,12 cm (0,047 pole-gada) adicional de gordura subcutânea e classificação de marmorização de0,482 em comparação com os homozigotos AA (P < 0,05). Contudo, as dife-renças entre dois homozigotos CC e TT ampliaram-se adicionalmente para asubstituição C/T. A espessura de gordura subcutânea foi 0,18 cm (0,073 po-legada) mais espessa e a classificação de marmorização foi 0,634 maior emgado com o genótipo homozigótico (CC) do que os homozigotos TT (P <0,05) (Tabela 2).

Somente cinco haplótipos entre esses dois polimorfismos empromotor foram observados em 237 animais Wagyu x Limousin F2, incluindo75 CCCC, 108 CACT, 33 AATT, 12 AACT e 9 CACC, respectivamente. Devidoa relativamente poucas amostras, ambos os haplótipos AACT e CACC foramexcluídos em análise estatística adicional. Como indicado na Tabela 2, haplóti-pos apresentaram efeitos significativos tanto em marmorização quanto em SFDna população de referência (P = 0,0004 para marmorização e P = 0,0029 paraSFD). A classificação de marmorização foi 0,655 diferente entre animais CCCCe AATT e 0,518 diferente entre animais CCCC e CACT (P < 0,05). Para me-dições de SFD, o gado com haplótipo CCCC apresentou 0,20 e 0,18 cm(0,079 e 0,073 polegadas) de gordura subcutânea em comparação com osanimais CACT e AATT (P < 0,05), respectivamente. O haplótipo CCCC pa-rece estar associado a um aumento da deposição de gordura em todo o cor-po em gado.

Tabela 2. Associações do promotor de SNPs em TFAM bovino com marmo-rização e SFD em cruzamentos Wagyu x Limousin F2*.

<table>table see original document page 67</column></row><table>

* Média em uma coluna com diferentes sobrescritos são significativamentediferentes (P < 0,05).

Esforços anteriores identificaram genes candidatos responsáveispor marmorização e/ou SFD em carne bovina. Barendse e colegas (1997)identificaram um polimorfismo TG5 que ocorre na região promotora 5' dogene para tiroglobulina (TG). Esse marcador apresentou uma associaçãogenotípica com classificação de marmorização em gado longamente alimen-tado. Leptina é uma proteína de 16 quilodáltons produzida pelo gene paraobesidade (ofc>). Mutações no gene para leptina (LEP) levou gado de corte aatingir peso para abate mais cedo e a desenvolver mais marmorização nacarcaça (Buchanan e outros, 2002). Uma substituição não-conservativaK232A no gene para DGAT1 (diacilglicerol O-aciltransferase ) tem mostradoafetar deposição de gordura intramuscular (marmorização) em carne bovina(Thaller e outros, 2003). Genotipificação de um SNP C/T no gene para TG,uma mutação C/T no gene para LEP e um polimorfismo A/C no gene paraDGAT1 foi também realizada nessa população de cruzamento Wagyu x Li-mousin (De e outros, 2004 e Wu e outros, 2005, no prelo). Análise de varia-ção usando um modelo linear generalizado não mostrou quaisquer diferen-ças significativas entre genótipos no gene para LEP. Entretanto, o gene paraDGAT1 apresentou um efeito aditivo significativo sobre SFD (P= 0,036), en-quanto o gene para TG mostrou um efeito dominante sobre marmorizaçãoque se aproximou da significância (P = 0,061).

De e colegas (2004) observaram que no gene para TG, as dife-renças genotípicas entre homozigotos CC e TT foram classificação de -0,074± 0,093 para marmorização e -0,002 ± 0,015 polegada para SFD (P > 0,05para ambas as características), enquanto no gene para DGAT1, animaishomozigóticos AA foram superiores a animais homozigóticos CC em ..tornode 0,092 ± 0,095 de classificação para marmorização (P > 0,05) e de (0,813± 0,381 (0,032 ± 0,015 polegada) para SFD (P < 0,05), respectivamente. Nogene para LEP, as mesmas figuras para diferenças genotípicas entre ani-mais CC e TT tiveram classificação de 0,075 ±0,116 para marmorização e0,483 ± 0,457 (0,019 ± 0,018 polegada) para SFD (P > 0,05 para ambas ascaracterísticas), respectivamente. Obviamente, o presente estudo sobre ogene bovino para TFAM indicou que as diferenças genotípicas entre doishomozigotos em qualquer posição excedeu quaisquer diferenças observa-das no gene bovino para TG, DGAT1 e LEP, respectivamente. Em particular,as diferenças genotípicas entre homozigotos CC e TT no gene bovino paraTFAM foram responsáveis por desvio padrão de 0,634 em marmorização edesvio padrão de 0,402 em SFD na medida em que esses animais Wagyu xLimousin F2 apresentaram um desvio padrão de 1 na classificação de mar-morização e um desvio padrão de 4,57 (0,18 polegada) para SFD. Portanto,entre esses quatro genes candidatos estudados até aqui na população dereferência, os resultados mostraram que o gene para TFAM teve os maioresefeitos tanto em marmorização quanto em SFD, indicando um importantegene para ambas as características.

Uma busca de elementos reguladores de transcrição usandoMatlnspector (http://www.gsf.de/) indicou que ambos os SNPs no promotorde TFAM bovino juntamente ou separadamente levaram a um ganho/perdade seis sítios de ligação putativos para 1), heterodímero tal-1alpha/E47; 2),proteína de ligação 1 com elemento responsivo a cAMP; 3), heterodímerosdos fatores de transcrição HAND2 (Thing2) e E12 de bHLH; 4), fator nuclear1; 5), receptor órfão alphal relacionado com RAR e 6), proteína digital RP58(ZNF238) com zinco, que é associada preferencialmente a heterocromatina.Reusch e Klemm (2002) relataram que a proteína de ligação com elemento(CREB) responsivo a fator de transcrição cAMP participa em adipogênese,com formas constitutivamente ativas de CREB que induzem diferenciação deadipócitos e formas negativas dominantes de CREB que bloqueiam esseprocesso. Evidência tem mostrado que fator nuclear 1 é essencial à expres-são de gene para estearoil-CoA desaturase 1 durante, diferenciação de pré-adipócitos (Singh e Ntambi, 1998). O receptor órfão alphal, ou RORocl, re-lacionado com RAR, forma uma parte dos mecanismos reguladores multifa-toriais que controlam expressão do gene para PPARgama, que foi ampla-mente estudado na década passada principalmente devido ao seu papelcentral na promoção e manutenção do fenótipo de adipócito (Sundvold eLien, 2001).-No entanto, como esses dois SNPs no promotor de TFAM bovi-no afetam a eficiência de ligação desses genes, como essas alterações deligação regulam o gene subseqüente para padrões de expressão de TFAM ecomo esses padrões de expressão estimulam biogênese mitocondrial dife-rentemente e, assim, conduzem às diferenças na deposição de gordura enos metabolismos de-energia precisam ser adicionalmente explorados.Referências:

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Wu e outros, Genética. Setembro de 2005;125(1):103-13.Exemplo 2

Este Exemplo descreve genes de transcrição mitocondrial basalcodificados no núcleo e qualidade da carne em gado de corte.

Evidência tem mostrado que a maquinaria de transcrição mito-condrial basal dirige a biogênese mitocondrial e expressão genética, e, des-se modo, ela poderá desempenhar um importante papel na deposição degordura no corpo e no metabolismo de energia. Aqui, relatamos compilaçãode seqüências, desenvolvimento de marcadores genéticos e análise de as-soicações de genes para TF AM, TFBIMe TFB2M com marmorização e pro-fundidade de gordura subcutânea (SFD) em gado usando uma população dereferência de cruzamentos Wagyu x Limousin F2. Análise estatística revelouque o gene bovino para TFAM era significativamente associado a marmori-zação (F = 3,84, P = 0,0229) e SFD (F = 3,56, P = 0,0301). Os marcadoresgenéticos desenvolvidos no estudo podem ser usados para adicionalmentedeterminar como esse complexo mitocondrial é importante para aperfeiçoarqualidade da carne na indústria de carne bovina.

Devido à sua capacidade limitada de codificar proteína, a inicia-ção e regulação de expressão de genes em DNA mitocondrial (mtDNA) de-pende maciçamente de um conjunto relativamente pequeno de proteínasmitocondriais reguladoras codificadas no núcleo (Gleyzer e outros, 2005). Amaquinaria básica de transcrição mitocondrial consiste em RNA poümerasemitocondrial (POLRMT) e fatores de transcrição mitocondrial A (TFAM), B1(TFB1M) e B2 (TFB2M). TFAM, um membro de um grupo de famílias de pro-teínas de alta mobilidade e o primeiro fator de transcrição mitocondrial identi-ficado, é essencial para manutenção e biogênese de mtDNA (Fisher e Clay-ton, 1988). Tanto TFB1M quanto TFB2M são fatores de transcrição mitocon-drial recentemente identificados e interagem diretamente com POLRMT paraformar um heterodímero (Falkenberg e outros, 2002). Por outro lado, mito-côndrias realizam um grande número de reações em células eucarióticas,incluindo a p-oxidação de ácidos graxos, o que proporciona intermediários-chave para a síntese de triglicerídeos via ação de piruvato carboxylase (O-wen e outros, 2002). Como a maquinaria básica de transcrição mitocondrialdirige a biogênese mitocondrial e expressão genética, considera-se que amaquinaria poderá desempenhar um importante papel na deposição de gor-dura no corpo e no metabolismo de energia. Aqui, compilação de seqüên-cias, desenvolvimento de marcadores genéticos e análise de assoicações degenes para TF AM, TFB1M e TFB2M com marmorização e profundidade degordura subcutânea (SFD) usando uma população de referência de cruza-mentos Wagyu x Limousin F2 são relatados.

Os procedimentos de bioinformática utilizados para recuperartanto seqüências de cDNA quanto de DNA genômico desses três genes bo-vinos empregaram uma abordagem de três etapas. Primeiro, seqüências decDNA dos ortólogos humanos foram usadas como referências para recupe-rar os ESTs ortólogos contra o banco de dados "est_others" de GenBankcom uma opção de espécies limitada a Bos taurus. Segundo, diversos ESTsforam escolhidos e montados para formar uma seqüência primária de cDNApara cada gene de gado, que foi então usada para realizar uma busca deESTs específicos a espécies contra o mesmo banco de dados a fim de ex-pandir a seqüência primária em uma seqüência de comprimento completo decDNA. Finalmente, a seqüência de comprimento completo de cDNA foi usa-da para buscar seqüências de DNA genômico do mesmo gene contra o ban-co de dados de seqüências de genomas bovinos 6X e, assim, determinarsua organização genômica. . -

Iniciadores foram projetados para atingir regiões promotoras etodos os éxons de codificação de todos os três genes bovinos com base nasseqüências de DNA genômico. Para assegurar que cada região de éxonsestava completamente amplificada e sequenciada, pelo menos 100 pb deseqüências de flanqueamento foram incluídas nos produtos. Para facilitardescoberta de polimorfismos genéticos nesses genes, dois pools de DNAforam formados: um de 6 machos de Wagyu x Limousin Fi e um de 113 fê-meas de Wagyu x Limousin Fi. Reações de PCR foram realizadas nessesdois pools de DNA e sequenciadas em um seqüenciador ABI 3730 no Labo-ratório de Biotecnologia e Bioanálise (Universidade do Estado de Washing-ton) usando um protocolo padrão. Polimorfismos em nucleotídeo foram iden-tificados por comparação de padrões de seqüências entre esses dois poolsde DNA. Um total de dez polimorfismos em um único nucleotídeo (SNPs) foidetectado, incluindo 3 em gene para TF AM, 2 em gene para TFBIMe 5 emgene para TFB2M.

Apenas um SNP em TFAM, dois SNPs em TFBIMe um SNP nogene bovino para TFB2M foram escolhidos para genotipificação usando téc-nicas de PCR-RFLP e Bi-PASA. Animais usados no estudo foram progênieF2 de acasalamento entre si de 6 machos de Wagyu x Limousin e 113fêmeas de Wagyu x Limousin Fi conforme descrito acima. Classificações demarmorização variaram de 4 = Ligeiro0 a 9,5 = Moderadamente Abundante50(SD = 1,00). SFD foi medido na interface da 12-13ã costela perpendicular àsuperfície externa em um ponto três-quartos do comprimento do músculolonguíssimo a partir da exteremidade de sua coluna vertebral, que variou de0,25 a 3,30 cm (0,1 a 1,3 polegada) (SD = 0,18) nessa população F2. Os da-dos fenotípicos para classificações de marmorização e SFD foram analisa-dos com um modelo linear misto usando o módulo PROC MIXED em SASv9.1. A fonte de variação incluiu ano de nascimento, gênero, idade na coletae genótipo de cada marcador genético como efeitos fixos e um efeito aleató-rio para responder por base poligenética. A estrutura de co-variação do efei-to poligenético foi definida por uma relação numérica calculada a partir depedigree usando SAS macro LQRG. O efeito residual foi admitido apresentardistribuição idêntica independente com variação desconhecida. Os compo-nentes de variação genética aditiva e de variação residual foram estimadosusando o algoritmo de Newton-Raphson estabilizado por cristas para estima-tiva de semelhança máxima restrita (REML). Testes de efeitos do marcadorforam realizados utilizando o método de Kenward-Roger para calcular grausde liberdade do denominator. Esse método usa um estimator de matriz deco-variação ajustado para reduzir pequenos desvios na amostra. Compara-ções aos pares de médias dos mínimos quadrados foram efetuadas usandoprocedimento de teste t de diferenças menos significativas protegidas deFisher.

A busca de BLAST com base em ortólogo humano recuperoumais de 20 ESTs de cada TFAM, TFBIMe TFB2M bovinos do banco de da-dos "est_others" de GenBank. Diversos ESTs de superposição foram esco-lhidos e montados para formar seqüências primárias de cDNA desses ge-nes. As seqüências primárias de cDNA foram então usadas como referênciapara buscar ESTs do mesmo gene, em particular para sua expansão de se-qüências de flanqueamento 5' e 3', que não foram alcançadas pela busca deortólogo humano devido a baixa similaridade de seqüências nessas regiões.A montagem final produziu uma seqüência de comprimento completo decDNA de 2.259 pb para o gene bovino para TFAM, 2.617 pb para o genebovino para TFBIMe 1.991 pb para o gene bovino para TFB2M, respecti-vamente. Usando essas seqüências de comprimento completo de cDNAcomo referências, buscas de BLAST contra o banco de dados de seqüênciasgenônimas de gado 6x recuperaram três contigs genômicos de 16.666 pbpara TFAM, quatro contigs genômicos de 108.966 pb para TFBIMe um con-tig genômico de 53.542 pb para TFB2M, respectivamente. Do mesmo modoque em humano, cão, camundongo e rato, tanto genes bovinos para TFAMquanto genes bovinos para TFB1M consistem em sete éxons, enquanto oTFB2M bovino contém oito éxons.

Além de dois SNPs estreitamente ligados de A/C e C/T descritosno Exemplo 1, uma terceira mutação com uma transição C/T foi também de-tectada na região promotora TFAM bovino (figura 5A). Um ensaio Bi-PASAfoi desenvolvido para genotipificar esse marcador em indivíduos. Seqüenci-amento direto de produtos de PCR em dois pools de DNA revelou duas mu-tações no gene para_IFS7M (figura 5B) e cinco mutações no gene paraTFB2M (figura 5C), respectivamente. Os amplicons de PCR foram digeridoscom 2U de Msp\ e Baríi para genotipificar SNPs de T/G e G/C no gene bovi-no para TFB1M. Genotipificação inicial de 48 amostras usando três dos cin-co polimorfismos no gene bovino para TFB2M revelou que eles são fixos emdois haplótipos. Portanto, somente um SNP foi escolhido para genotipificardigestão com enzima de restrição Aci\.

Análise estatística revelou que o gene bovino para TFAM erasignificativamente associado a marmorização (F = 3,84, P = 0,0229) e SFD(F = 3,56, P = 0,0301). Contudo, nenhum dos marcadores em um ou outrode TFB1M e TFB2M afetou significativamente as características medidas(F < 1,70, P > 0,1842). Os efeitos aditivos e de predominância de cada mar-cador foram estimados e são listados na Tabela 3. Apenas o efeito aditivo dogene bovino para TFAM sobre marmorização atingiu um nível significativo (P= 0,0059) e os efeitos aditivos de TFAM e TFB2M sobre SFD aproximou-sede significância (P = 0,0651 para TFAM e P = 0,1118 para TFB2M) (Tabela3). Os resultados indicam que envolvimento desses três genes na promoçãode iniciação de transcrição do genoma mitocondrial poderá ser específico ourelevante a tecido. Isto é,,_TFAM contribuiu significativamente tanto paramarmorização quanto para SFD, enquanto TFB1M não apresentou efeito emuma ou outra característica. Entretanto, TFB2M contribuiu mais para SFD,mas quase nada para marmorização.

Tabela 3. Efeitos aditivos e de predominância dos marcadoresbovinos TFAM, TFBIMe TFB2Msobre marmorização e SFD.

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Tanto marmorização quanto SFD atraem uma grande quantida-de de publicidade e interesse há muitos anos, uma vez que são duas impor-tantes características quantitativas que afetam qualidade da carcaça e efici-ência de produção em gado de corte. Os marcadores genéticos desenvolvi-dos no estudo podem ser usados para determinar adicionalmente como essecomplexo mitocondrial é importante para aperfeiçoar qualidade da carne naindústria de carne bovina.

Referências:

Falkenberg e outros, (2002) Nat Genet. 31:289-94.

Fisher e Clayton (1988) MolCelIBiol. 8 :3496-3509.

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277(34):30409-12.

Exemplo 3

Este Exemplo proporciona associações entre marcadores deTFAM-], TFAM-2, e FABP4 e características de carcaça em novilhos enovilhas de confinamentos comerciais.

Os seguintes marcadores foram avaliados: (1) uma substituiçãoC em A na posição do nucleotídeo 1220 no promotor de gene para fator detranscrição mitocondrial A (7F/4M-1), (2) uma substituição C em T naposição do nucleotídeo 1212 no promotor de TFAM-2 e (3) uma substituiçãoG em C na posição do nucleotídeo 7516 do gene para proteína de ligação 4com ácido graxo (FABP4). Resultados anteriores indicam que osmarcadores afetam marmorização e gordura do lombo.

Inicialmente, havia 1.589 registros de novilhos e novilhas. Oobjetivo alvo eram 12,2 mm de gordura do lombo. A data de coleta foi oponto final econômico ótimo predito por animal. Grupos contemporâneosincluíram fonte e sexo. Admitiu-se que o tipo de raça confundiu-se com afonte. O conjunto final de dados incluiu o número de registros com base emfenótipos e genótipos disponíveis para cada característica.

As características testadas são: peso da carcaça quente (HCW,kg), área de olho de lombo (REA, cm2), área de olho de lombo por cem depeso HCW (REA/cwt HCW, cm2/45 kg de peso da carcaça quente (HCW)),valor do peso da carcaça quente (valor HCW, $), peso vivo calculado (CaleLv Wt, kg), consumo de matéria seca (DMI, kg), dias sob alimentação (DOF,d), consumo de matéria seca por dia sob alimentação (DMI por DOF, kg/d),ganho médio diário (ADG, kg/d), rendimento de carcaça (DP, %), espessurade gordura do lombo (BFAT, cm), grau de rendimento calculado (cYG), graude qualidade, menor ou igual a seleção versus maior ou igual a escolha (QG,< Se vs, > Ch), teor de gordura intramuscular (IMF%, %), classificação demarmorização (MBS, 10 a 99), classificação de marmorização dividida pordias sob alimentação (MBS/DOF), valor adicional da carcaça (valor adicionalda carcaça, $), retorno líquido ajustado - custos totais removidos (retornolíquido ajustado - custos totais removidos, $) e retorno líquido ajustado -valor inicial do animal não removido (retorno líquido ajustado - valor inicial doanimal não removido, $).

Os modelos de análise foram genótipo, em que genótipos foramestabelecidos como efeitos fixos e substituição aditiva ou de alelos, o quemostrou regressão no número de alelos (0, 1, 2). Ambos os modelosconcordam com combinações de 2 marcadores. Um outro modelo de análiseé haplótipo, que mostra regressão (esperada) em haplótipos quando sefixam marcadores múltiplos de TFAM. Associações significativas demarcadores simples são apresentadas na Tabela 4 e combinaçõessignificativas de 2 marcadores são apresentadas na Tabela 5.Tabela 4: Análise de Marcadores Simples Para TFAM-1, TFAM-2 & FABP4

<table>table see original document page 78</column></row><table>

Marcadores fixados para substituição de alelos: A para TFAMJ\; C para TFAM2 & FABP4;Faixa de classificações de marmorização de 10 a 99; 10 = PD0 = Std, 99 = A90 = Prime;QG Ch(1,2,5,9,20) implica Ch ou melhor - inclui Prime, Ch, CAB, Sterling Silverü. Angus Pride;Alternativa incluiu Se, Sem Roll, Darkcutter& HardboneTabela 5: Análise de Dois Marcadores Para TFAM^, TFAM-2 & FABP4

<table>table see original document page 79</column></row><table>Exemplo 4

A figura 7 mostra um fluxograma da entrada de dados e da saídade resultados a partir da análise e correlação dos dados pertencentes àshistórias de reprodução e veterinárias e exigências de desempenho de umgrupo de animais tal como de bovinos. O fluxograma ilustrado na figura 7indica adicionalmente o fluxo interativo de dados do dispositivo auxiliado porcomputador para um corpo de estudantes que aprendem o uso do métododa invenção e a correlação de tais dados interativos para apresentar umasaída como um gráfico circular que indica o progresso da classe. O fluxo-grama indica adicionalmente modificações do método da invenção de acordocom a informação recebida dos estudantes para avaçar no processo de a-prendizagem ou otimizar o método satisfazer as necessidades dos estudan-tes.

A figura 8 ilustra relações potenciais entre os elementos de da-dos a serem entrados no sistema. Setas unidirecionais indicam, por exem-plo, que um celeiro tipicamente pertence somente a uma fazenda, conside-rando que uma fazenda poderá possuir diversos celeiros. Similarmente, umaprescrição poderá incluir produtos veterinários.

A figura 9A ilustra o fluxo de eventos no uso do sistema baseadoem computador portátil para entrada de dados sobre a reprodução e criaçãode um rebanho de vacas. A figura 9B ilustra o fluxo de eventos através dassub-rotinas relacionadas com entrada de dados concernentes a administra-ção de fazenda. A figura 9C ilustra o fluxo de eventos através das sub-rotinas relacionadas com entrada de dados concernentes a dados específi-cos a uma empresa.

A figura 10 ilustra um fluxograma da entrada de dados e da saí-da de resultados a partir da análise e correlação dos dados pertencentes àshistórias de reprodução e veterinárias e exigências de desempenho de umgrupo de animais.

A invenção é adicionalmente descrita pelos seguintes parágrafosnumerados:

1. Método para subagrupar animais de acordo com o genótipo,no qual os animais de cada subgrupo apresentam um polimorfismo similarem um gene para fator de transcrição mitocondrial A ("TFAM"), compreen-dendo esse método:

(a) determinar o genótipo de cada animal a ser subagrupadomediante determinação da presença de um único polimor-fismo em nucleotídeo no gene para TFAM, e

(b) segregar animais individuais em subgrupos em que cadaanimal em um subgrupo apresenta um polimorfismo similarno gene para TFAM.

2. Método para subagrupar animais de acordo com o genótipo, noqual os animais de cada subgrupo apresentam um genótipo similar no geneTFAM, compreendendo esse método:

(a) determinar o genótipo de cada animal a ser subagrupadomediante determinação da presença de polimorfismo(s) emúnico nucleotídeo de interesse no gene para TFAM, e

(b) segregar animais individuais em subgrupos dependendo dese os animais apresentam ou não o(s) polimorfismo(s) emum único nucleotídeo de interesse no gene para TFAM.

3. Método dos parágrafos 1 ou 2, no qual o(s) polimorfismo(s)em um único nucleotídeo de interesse é(são) selecionado(s) do grupo queconsiste em uma substituição A em C na posição do nucleotídeo -1220 nopromotor do gene para TFAM, uma substituição T em C na posição -1212 nopromotor do gene para TFAM e uma substituição T em C na posição -995 nopromotor do gene para TFAM.

4. Método para subagrupar animais de acordo com o genótipo,no qual os animais de cada subgrupo apresentam um genótipo similar nogene TFAM, compreendendo esse método:

(a) determinar o genótipo de cada animal a ser subagrupadomediante determinação da presença de uma substituição Aem C na posição do nucleotídeo -1220 no promotor do ge-ne para TFAM, uma substituição T em C na posição -1212no promotor do gene para TFAM e uma substituição T emC na posição -995 no promotor do gene para TFAM, e(b) segregar animais individuais em subgrupos dependendo dese os animais apresentam ou não uma substituição A em Cna posição do nucleotídeo -1220 no promotor do gene paraTFAM, uma substituição T em C na posição -1212 no pro-motor do gene para TFAM e uma substituição T em C naposição -995 no promotor do gene para TFAM.

5. Método para identificação de um animal que apresenta umfenótipo desejável em comparação com a população geral de animais dessaespécie, método este que compreende determinar a presença de um poli-morfismo em um único nucleotídeo no gene TFAM do animal, em que o po-limorfismo é selecionado do grupo que consiste em uma substituição A em Cna posição do nucleotídeo -1220 no promotor do gene para TFAM, umasubstituição T em C na posição -1212 no promotor do gene para TFAM euma substituição T em C na posição -995 no promotor do gene para TFAM,em que o polimorfismo em um único nucleotídeo é indicativo de um fenótipodesejável.

6. Método do parágrafo 5, no qual o fenótipo desejável é consu-mo de alimentação, taxa de crescimento, peso corporal, valor e composiçãoda carcaça, rendimento do leite ou qualquer combinação destes.

7. Método do parágrafo 5 ou 6, no qual o fenótipo desejável évalor adicional da carcaça (valor adicional da carcaça, $), ganho médio diário(ADG, kg/d), espessura de gordura do lombo (BFAT, cm), peso vivocalculado (Cale Lv Wt, kg), grau de rendimento calculado (cYG), dias sobalimentação (DOF, d), rendimento de carcaça (DP, %), consumo de matériaseca (DMI, kg), consumo de matéria seca por dia sob alimentação (DMI porDOF, kg/d), peso da carcaça quente (HCW, kg), valor do peso da carcaçaquente (valor HCW, $), teor de gordura intramuscular (IMF%, %),classificação de marmorização (MBS, 10 a 99), classificação demarmorização dividida por dias sob alimentação (MBS/DOF), grau dequalidade, menor ou igual a seleção versus maior ou igual a escolha (QG, <Se vs, > Ch), área de olho de lombo (REA, cm2), área de olho de lombo porcem de peso HCW (REA/cwt HCW, cm2/45 kg de peso da carcaça quente(HCW)), profundidade da gordura subcutânea (SFD) ou qualquer combina-ção destes.

8. Método de qualquer um dos parágrafos 1 a 7, no qual o ani-mal é um bovino.

9. Método de qualquer um dos parágrafos 1 a 8, no qual o genepara TFAMé um gene para TF AM bovino.

10. Método interativo auxiliado por computador para rastrear acriação de gado bovino, método este que compreende, usando um sistemade computador que compreende um computador programado que compre-ende um processador, um sistema de armazenamento de dados, um dispo-sitivo de entrada, um dispositivo de saída e um dispositivo interativo, as eta-pas de: (a) inserir no computador programado por meio do dispositivo deentrada dados que compreendem uma história de reprodução de um bovinoou rebanho de bovinos, (b) inserir no computador programado por meio dodispositivo de entrada dados que compreendem uma história veterinária deum bovino ou rebanho de bovinos, (c) correlacionar os dados veterinárioscom a história de reprodução do bovino ou rebanho de bovinos usando oprocessador e o sistema de armazenamento de dados, e (d) sair pelo dispo-sitivo de saída a história de reprodução e a história veterinária do bovino ourebanho de bovinos.

11. Método, de acordo com o parágrafo 10, no qual o sistema decomputador é um sistema interativo por meio do qual modificações na saídado método auxiliado por computador poderão ser correlacionadas de acordocom a entrada do dispositivo interativo.

12. Método, de acordo com o parágrafo 10 ou 11, o qual com-preende adicionalmente as etapas de inserir no computador programadodados de diagnóstico relacionados com a saúde da vaca ou rebanho de va-cas; e correlacionar os dados de diagnóstico com as histórias de reproduçãoe veterinárias da vaca ou rebanho de vacas.

13. Método, de acordo com qualquer um dos parágrafos 10 a 12,no qual os dados veterinários compreendem um registro de vacinação deuma vaca ou rebanho de vacas.

14. Método, de acordo com qualquer um dos parágrafos 10 a 13,no qual os dados de saúde são selecionados do grupo que consiste em da-dos de condição agropecuária, história do rebanho e dados de segurançaalimentar.

15. Método, de acordo com qualquer um dos parágrafos 10 a 14,o qual compreende adicionalmente pelo menos uma etapa adicional selecio-nada do grupo que consiste em inserir no computador programado dadosrelacionados com o controle de qualidade do bovino ou rebanho de bovinose correlacionar os dados de controle de qualidade com as histórias de repro-dução e veterinárias da vaca ou rebanho de vacas, inserir no computadorprogramado parâmetros de desempenho da vaca ou rebanho de vacas; ecorrelacionar os parâmetros de desempenho exigidos do bovino ou rebanhode bovinos com uma exigência de desempenho específica de um cliente,correlacionar os dados de vacina com os parâmetros de desempenho dobovino ou rebanho de bovinos, correlacionar rebanho com os parâmetros dedesempenho do bovino ou rebanho de bovinos, correlacionar os dados desegurança alimentar com os parâmetros de desempenho do bovino ou reba-nho de bovinos, correlacionar com os dados de condição agropecuária comos parâmetros de desempenho do bovino ou rebanho de bovinos, inserir no_ computador- programado dados relacionados com os dados nutricionais dobovino ou rebanho de bovinos; e correlacionar os dados nutricionais com osparâmetros de desempenho do bovino ou rebanho de bovinos, e alertar paraalterações indesejáveis nos os parâmetros de desempenho do bovino ourebanho de bovinos.

16. Método, de acordo com qualquer um dos parágrafos 10 a 15,o qual compreende adicionalmente as etapas de inserir no computador pro-gramado, por meio do dispositivo de entrada, dados que compreendem umgenotipo de um bovino; correlacionar uma característica física predita pelogenotipo usando o processador e o sistema de armazenamento de dados; esair pelo dispositivo de saída a característica física correlacionada com ogenotipo de um bovino ou população de bovinos, e alimentar o(s) animal(ais)com uma dieta com base na característica física, aperfeiçoando desse modoa produção de bovinos.

17. Método auxiliado por computador, de acordo com qualquerum dos parágrafos 10 a 16, para otimizar eficiência de confinamentos paragado, método este que compreende sair pelo dispositivo de saída a históriade reprodução e veterinária do bovino ou rebanho de bovinos e alimentaro(s) animal(ais) com uma dieta com base em suas histórias de reprodução eveterinárias, otimizando desse modo a eficiência de confinamentos para obovino ou rebanho de bovinos.

18. Método de transmissão de dados, o qual compreende trans-missão de informação a partir de métodos de acordo com qualquer um dosparágrafos 10 a 16, selecionada do grupo que consiste em telecomunicação,telefone, videoconferência, comunicação de massa, uma apresentação, umaapresentação por computador, uma apresentação por POWERPOINT®, in-ternet, e-maile comunicação documentária.

19. Sistema de computador interativo, de acordo com qualquerdos parágrafos 10 a 16, para rastrear histórias de reprodução e saúde devacas, o qual compreende dados de reprodução e veterinários correspon-dentes a um bovino ou rebanho de bovinos, e no qual o sistema de compu-tador é configurado para permitir ao operador trocar dados com o dispositivoou um banco de dados remoto.

20. Sistema de computador interativo, de acordo com o parágra-fo 19, no qual os dispositivos de entrada e saída são um computador digitalpessoal auxiliar ou um computador de bolso.

21. Método de trabalho comercial para rastrear históricos de re-

produção e saúde de gado, as quais compreendem dados de reprodução eveterinários correspondentes a um ou mais animais, método este que com-preende proporcionar a um usuário o sistema de computador do parágrafo 19.

22. Método de trabalho comercial para rastrear históricos de re-produção e saúde de gado, as quais compreendem dados de reprodução eveterinários correspondentes a um ou mais animais, método este que com-preende proporcionar a um usuário o sistema de computador do parágrafo 20.

23. Método de trabalho comercial, de acordo com o parágrafo21, o qual compreende adicionalmente proporcionar ao proprietário de ani-mais ou cliente dispositivo de coleta de amostra, tais como cotonetes e eti-quetas úteis para coletar amostras de que dados genéticos poderão ser ob-tidos, e em que as etiquetas são opcionalmente acondicionadas em um reci-piente que é codificado com indicações de identificação.

24. Método de trabalho comercial, de acordo com qualquer umdos parágrafos 10 a 16, no qual o sistema de computador compreende adi-cionalmente uma pluralidade de dispositivos interativos e em que o métodocompreende adicionalmente as etapas de receber dados dos dispositivosinterativos, compilar os dados, sair os dados para indicar a resposta de umestudante ou classe de estudantes a uma pergunta relativa à operação dométodo auxiliado por computador e, opcionalmente, modificar a operação dométodo auxiliado por computador de acordo com a indicação da resposta.

25. Método de qualquer um dos parágrafos 8 a 24, no qual osdados compreendem presença ou ausência de um ou mais polimorfismosem um único nucleotídeo de interesse no gene para TFAM.

26. Método do parágrafo 25, no qual o(s) polimorfismo(s) em umúnico nucleotídeo de interesse é selecionado do grupo que consiste em umasubstituição A em C na posição do nucleotídeo -1220 no promotor do genepara TFAM, uma substituição T em C na posição -1212 no promotor do genepara TFAM e uma substituição T em C na posição -995 no promotor do genepara TFAM.

* * *

Tendo assim descrito em detalhes modalidades preferidas dapresente invenção, deve-se entender que a invenção definida pelos parágra-fos acima não se limita a detalhes particulares apresentados na descriçãoacima, como muitas variações evidentes dela são possíveis sem se afastardo espírito ou escopo da presente invenção.

Claims (19)

1. Método para identificação de um animal que apresenta pro-fundidade de gordura subcutânea com aparência marmórea desejável, ouuma combinação, em comparação com a população geral de animais dessaespécie, método este que compreende determinar a presença de um poli-morfismo simples em nucleotídeo em um gene para fator de transcrição mi-tocondrial A ("TFAM'), a presença de um polimorfismo simples em nucleotí-deo no gene para TFAM do animal, em que o polimorfismo simples em nu-cleotídeo é indicativo de profundidade de gordura subcutânea com aparênciamarmórea desejável, ou uma combinação do mesmo.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, o qual compreendeadicionalmente subagrupar animais de acordo com o genótipo, em que osanimais de cada subgrupo apresentam um polimorfismo similar no gene paraTFAM, compreendendo esse método:(a) determinar o genótipo de cada animal a ser subagrupadomediante determinação da presença de um polimorfismosimples em nucleotídeo no gene para TFAM, e(b) segregar animais individuais em subgrupos dependendo dese os animais apresentam ou não o polimorfismo simplesem nucleotídeo de interesse no gene para TFAM.

3. Método, de-acordo com a reivindicação 1, no qual o(s) poli-morfismo(s) simples em nucleotídeo de interesse é(são) selecionado(s) dogrupo que consiste em uma substituição A em C na posição do nucleotídeo --1220 no promotor do gene para TFAM, uma substituição T em C na posição --1212 no promotor do gene para TFAM e uma substituição T em C na posi-ção -995 no promotor do gene para TFAM.

4. Método, de acordo com a reivindicação 1, no qual o animal éum bovino.

5. Método, de acordo com a reivindicação 1, no qual o gene paraTFAMé um gene para TFAM bovino.

6. Método interativo auxiliado por computador para rastrear acriação de gado bovino, método este que compreende, usando um sistemade computador que compreende um computador programado que compre-ende um processador, um sistema de armazenamento de dados, um dispo-sitivo de entrada, um dispositivo de saída e um dispositivo interativo, as eta-pas de: (a) inserir no computador programado por meio do dispositivo deentrada dados que compreendem uma história de reprodução de um bovinoou manada de bovinos e um genótipo de um bovino; correlacionar uma ca-racterística física predita pelo genótipo usando o processador e o sistema dearmazenamento de dados, (b) inserir no computador programado por meiodo dispositivo de entrada dados que compreendem uma história veterináriade um bovino ou manada de bovinos, (c) correlacionar os dados veterinárioscom a história de reprodução do bovino ou manada de bovinos usando oprocessador e o sistema de armazenamento de dados, e (d) sair pelo dispo-sitivo de saída o histórico de reprodução, o histórico veterinário do bovino oumanada de bovinos e a característica física correlacionada com o genótipode um bovino ou população de bovinos,em que a característica física é profundidade de gordura subcu-tânea com aparência marmórea desejável, ou uma combinação, em compa-ração com a população geral de bovinos, e o genótipo é um polimorfismosimples em nucleotídeo em um gene para TFAM.

7. Método, de acordo com a reivindicação 6, no qual o sistemade computador é um sistema interativo por meio do qual modificações nasaída do método auxiliado por computador poderão ser correlacionados deacordo com a entrada do dispositivo interativo.

8. Método, de acordo com a reivindicação 6, o qual compreendeadicionalmente as etapas de inserir no computador programado, dados dediagnóstico relacionados com a saúde da vaca ou manada de vacas; e cor-relacionar os dados de diagnóstico com as histórias de reprodução e veteri-nária da vaca ou manada de vacas.

9. Método, de acordo com a reivindicação 6, no qual os dadosveterinários compreendem um registro de vacinação de uma vaca ou mana-da de vacas.

10. Método, de acordo com a reivindicação 6, no qual os dadosde saúde são selecionados do grupo que consiste em dados de condiçãoeconômica, histórico da manada e dados de segurança alimentar.

11. Método, de acordo com a reivindicação 6, o qual compreen-de adicionalmente pelo menos uma etapa adicional selecionada do grupoque consiste em inserir no computador programado dados relacionados como controle de qualidade do bovino ou manada de bovinos e correlacionar osdados de controle de qualidade com os históricos de reprodução e veteriná-ria da vaca ou manada de vacas, inserir no computador programado parâ-metros de desempenho da vaca ou manada de vacas; e correlacionar osparâmetros de desempenho exigidos do bovino ou manada de bovinos comuma exigência de desempenho específica de um cliente, correlacionar osdados de vacina com os parâmetros de desempenho do bovino ou manadade bovinos, correlacionar manada com os parâmetros de desempenho dobovino ou manada de bovinos, correlacionar os dados de segurança alimen-tar com os parâmetros de desempenho do bovino ou manada de bovinos,correlacionar com os dados de condição econômica com os parâmetros dedesempenho do bovino ou manada de bovinos, inserir no computador pro-gramado dados relacionados com os dados de nutricionais do bovino oumanada de bovinos; e correlacionar os dados de nutricionais com os parâ-metros de desempenho do bovino ou manada de bovinos, e alertar para alte-rações indesejáveis nos os parâmetros de desempenho do bovino ou mana-da de bovinos.

12. Método, de acordo com a reivindicação 6, no qual o(s) poli-morfismo(s) simples em nucleotídeo de interesse é(são) selecionados dogrupo que consiste em uma substituição de A em C na posição do nucleotí-deo -1220 no promotor do gene para TFAM, uma substituição T em C na posi-ção -1212 no promotor do gene para TFAM e uma substituição T em C naposição -995 no promotor do gene para TFAM.

13. Método de transmissão de dados, o qual compreende trans-missão de informação a partir de métodos de acordo com a reivindicação 6,selecionada do grupo que consiste em telecomunicação, telefone, videocon-ferência, comunicação de massa, uma apresentação, uma apresentação porcomputador, uma apresentação por POWERPOINT®, internet, e-mail e co-municação documentária.

14. Sistema de computador interativo, como definido na reivindi-cação 6, para rastrear histórias de reprodução e saúde de vacas, o quaicompreende dados de reprodução e veterinários correspondentes a um bo-vino ou manada de bovinos, e no qual o sistema de computador é configura-do para permitir ao operador trocar dados com o dispositivo ou um banco dedados remoto.

15. Sistema de computador interativo, de acordo com a reivindi-cação 14, no qual os dispositivos de entrada e saída são um computadordigital pessoal auxiliar ou um computador de bolso.

16. Método de trabalho para rastrear histórias de reprodução esaúde de criação, as quais compreendem dados de reprodução e veteriná-rios correspondentes a um ou mais animais de criação, método este quecompreende proporcionar a um usuário o sistema de computador como defi-nido na reivindicação 14.

17. Método de trabalho para rastrear histórias de reprodução esaúde de criação, as quais compreendem dados de reprodução e veteriná-rios correspondentes a um ou mais animais de criação, método este quecompreende proporcionar a um usuário o sistema de computador como defi-nido na reivindicação 14.

18. Método de trabalho, de acordo com a reivindicação 16, oqual compreende adicionalmente proporcionar ao proprietário de animais oucliente dispositivo de coleta de amostra, tais como cotonetes e etiquetas ú-teis para coletar amostras de que dados genéticos poderão ser obtidos, eem que as etiquetas são opcionalmente acondicionadas em um recipienteque é codificado com indicações de identificação.

19. Método de trabalho, de acordo com a reivindicação 16, noqual o sistema de computador compreende adicionalmente uma pluralidadede dispositivos interativos e em que o método compreende adicionalmenteas etapas de receber dados dos dispositivos interativos, compilar os dados,sair com os dados para indicar a resposta de um estudante ou classe de es-tudantes a uma questão relativa à operação do método auxiliado por compu-tador e, opcionalmente, modificar a operação do método auxiliado por com-putador de acordo com a indicação da resposta.