BRPI0609206A2 - inibiÇço mediada por rnai de proteÍna relacionada frizzled-1 para tratamento de glaucoma - Google Patents

Abstract

INIBIÇçO MEDIADA POR RNAi DE PROTEÍNA RELACIONADA FRIZZLED-1 PARA TRATAMENTO DE GLAUCOMA. Trata-se de uma interferência de RNA para a inibição de expressão de mRNA de Proteína Relacionada Frizzled-1, em particular, para tratar pacientes que possuem glaucoma ou em risco de desenvolver glaucoma.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "INIBIÇÃOMEDIADA POR RNAi DE PROTEÍNA RELACIONADA FRIZZLED-1 PARATRATAMENTO DE GLAUCOMA".

Campo da Invenção

A presente invenção refere-se ao campo de composições deRNA de interferência para tratamento de glaucoma por meio de inibição deexpressão de Proteína Relacionada Frizzled-1 (FRP-I).Antecedentes da Invenção

O glaucoma é um grupo heterogêneo de neuropatias ópticas quepartilham certas características clínicas. A perda de visão em glaucoma sedeve à morte seletiva de células do gânglio retiniano na retina neural que éclinicamente diagnosticada por alterações características no campo visual,defeitos na camada de fibras nervosas, e uma escavação progressiva dodisco óptico (ONH). Um dos principais fatores de risco do desenvolvimentode glaucoma é a presença de hipertensão ocular (pressão intra-ocular ele-vada, IOP). Uma pressão intra-ocular adequada é necessária para manter oformato do olho e para proporcionar um gradiente de pressão do olho e paraproporcionar um gradiente de pressão para permitir o fluxo de humor aquosoaté a córnea avascular e lente. Os níveis de IOP também podem estar en-volvidos na patogênese de glaucoma de tensão normal (NTG), como com-provado por pacientes que tiram vantagem de medicações para redução deIOP. Uma vez que os ajustes de espessura corneana central são feitos paraleituras de IOP em pacientes NTG, muitos destes pacientes podem ser con-siderados como hipertensos oculares.

A IOP elevada associada a glaucoma se deve à resistência aofluxo de humor aquoso elevada na rede trabecular (TM), um pequeno tecidoespecializado localizado no ângulo íris-corneano da câmara anterior ocular.As alterações glaucomatosas para a TM incluem uma perda em células daTM e o depósito e acúmulo de resíduos extracelulares que incluem materialtipo placa proteinácea. Ademais, também ocorrem alterações no ONH glau-comatoso. Em olhos glaucomatosos, ocorrem alterações morfologicas e demobilidade em células gliais de ONH. Em resposta à IOP elevada e/ouataques isquêmicos transitórios, ocorre uma alteração na composição damatriz extracelular de ONH e alterações nas morfologias de axônio celularde célula glial e de gânglio retiniano.

Os glaucomas primários resultam de distúrbios no fluxo de fluidointra-ocular que possui uma base anatômica ou fisiológica. Os glaucomassecundários ocorrem como um resultado de lesão ou trauma no olho ou umadoença pré-existente. O glaucoma primário de ângulo aberto (POAG), também conhecido como glaucoma crônico ou simples, representa noventa porcento de todos os glaucomas primários. POAG é caracterizado pela degeneração da rede trabecular, que resulta em resistência anormalmente alta àdrenagem de fluido a partir do olho. Uma conseqüência de tal resistência éum aumento na IOP que é requerido para conduzir o fluido normalmenteproduzido pelo olho através da resistência aumentada.

As terapias atuais antiglaucoma incluem redução de IOP atravésdo uso de supressores ou agentes de formação de humor aquoso que aumentam o fluxo uveoscleral, trabeculoplastia a laser, ou trabeculectomia, queé uma cirurgia de filtração para aperfeiçoar a drenagem. As abordagens farmacêuticas antiglaucoma apresentaram diversos efeitos colaterais indesejados. Por exemplo, mióticos tal como pilocarpina podem causar embaçamen-to da visão e outros efeitos colaterais visuais negativos. Os inibidores de anidrase carbônica sistemicamente administrados (CAIs) também podemcausar náusea, dispepsia, fatiga, e acidose metabólica. Ademais, certos beta-bloqueadores se tornaram progressivamente associados com efeitos colaterais pulmonares graves atribuíveis a seus efeitos sobre receptores beta-2em tecido pulmonar. Os simpatomiméticos causam taquicardia, arritmia ehipertensão. Tais efeitos colaterais negativos podem resultar em adaptaçãoao paciente reduzida ou em término de, terapia. Ademais, a eficácia de terapias de redução de IOP atuais é relativamente breve requerindo dosagemrepetida durante cada dia e, em alguns casos, a eficácia reduz com o tempo.

Devido à importância de glaucoma, e às inadequabilidades demétodos anteriores de tratamento, pode ser desejado proporcionar um método aperfeiçoado de tratamento.Sumário da Invenção

A presente invenção supera estas e outras desvantagens datécnica anterior ao proporcionar um tratamento altamente potente e eficaz,prevenção ou intervenção de condições relacionadas com glaucoma e pré-glaucoma. Em um aspecto, os métodos da invenção incluem tratar um indi-víduo que possui glaucoma ou está em risco de desenvolver glaucoma aoadministrar RNAs de interferência que silenciam a expressão de mRNA deFRP-I, desta maneira interferindo na via de sinalização do Wnt e prevenindouma sucessão de eventos relacionados com atividade celular de glaucoma epré-glaucoma.

O termo "glaucoma" como usado aqui, inclui condições de pré-glaucoma ocular, tais como hipertensão, e condições de glaucoma ocular, einclui aquelas alterações celulares que resultam da expressão de mRNA deFRP-I que resultam direta ou indiretamente em glaucoma e condições rela-cionados com glaucoma. O RNA de interferência proporcionado aqui estabe-lece o silenciamento enquanto evita efeitos colaterais tóxicos devido a agen-tes não-específicos.

A presente invenção se refere a RNAs de interferência que mar-cam mRNA de FRP-I e desse modo interferem na expressão de mRNA deFRP-I. Os RNAs de interferência da invenção são úteis para tratar pacientescom glaucoma ou com risco de desenvolver glaucoma.

Uma modalidade da invenção se trata de um método para ate-nuar a expressão de mRNA de Proteína Relacionada Frizzled-1 de um indi-víduo, sendo que o método compreende administrar no indivíduo uma com-posição que compreende uma quantidade eficaz de RNA de interferênciaque possui um comprimento de 19 a 49 nucleotídeos e um veículo farmaceu-ticamente aceitável. A expressão de mRNA de Proteína Relacionada Friz-zled-1 é atenuada desta forma.

Outra modalidade da invenção se trata de um método para tratarglaucoma em um indivíduo necessitado deste é uma modalidade da inven-ção. O método compreende administrar em um olho do indivíduo uma com-posição que compreende uma quantidade eficaz de RNA de interferênciaque possui um comprimento de 19 a 49 nucleotídeos, e um veículo farma-ceuticamente aceitável. O glaucoma é tratado desta forma. O indivíduo é umser humano e o ser humano possui glaucoma em uma modalidade da inven-ção. Em outra modalidade, o indivíduo é um ser humano e o ser humanoestá em risco de desenvolver glaucoma.

Nas modalidades citadas acima, o RNA de interferência com-preende uma região de pelo menos 13 nucleotídeos adjacentes que possu-em pelo menos 90% de complementaridade de seqüência a, ou pelo menos90% de identidade de seqüência com, os 13 penúltimos nucleotídeos da ex-tremidade 3' de um mRNA correspondente a qualquer uma entre SEQ EDNO:2, SEQ ID N9:8 - SEQ ID N5:190, e SEQ ID N2:192.

Em modalidades adicionais dos métodos citados acima, a com-posição compreende adicionalmente um segundo RNA de interferência quepossui um comprimento de 19 a 49 nucleotídeos e compreende uma regiãode pelo menos 13 nucleotídeos adjacentes que possuem pelo menos 90%de complementaridade de seqüência a, ou pelo menos 90% de identidadede seqüência com, os 13 penúltimos nucleotídeos da extremidade 3' de umsegundo mRNA correspondente a qualquer uma entre SEQ ID N9:2, SEQ IDNQ:8 - SEQ ID N9:190, e SEQ ID NQ:192.

Ainda em outra modalidade da invenção, um método para atenuar a expressão de mRNA de Proteína Relacionada Frizzled-1 de um indi-víduo compreende administrar no indivíduo uma composição que compreen-de uma quantidade eficaz de RNA de interferência que possui um compri-mento de 19 a 49 nucleotídeos e um veículo farmaceuticamente aceitável eo RNA de interferência compreende um filamento de nucleotídeo sentido, umfilamento de nucleotídeo anti-sentido, e uma região de complementaridadecontínua pelo menos quase perfeita de pelo menos 19 nucleotídeos onde ofilamento anti-sentido se hibridiza sob condições fisiológicas em uma partede mRNA que corresponde a SEQ ID N9:1 ou SEQ ID NQ: 191, e possui umaregião de complementaridade contínua pelo menos quase perfeita de pelomenos 19 nucleotídeos com a parte de hibridização de mRNA corresponden-te a SEQ ID N9:1 ou SEQ ID NQ: 191, respectivamente. A expressão de mR-NA de Proteína Relacionada Frizzled-1 é atenuada desta forma.

Um método para tratar glaucoma em um indivíduo necessitadodeste se trata de uma modalidade da invenção, sendo que o método com-preende administrar em um olho do indivíduo uma composição que compre-ende uma quantidade eficaz de RNA de interferência que possui um com-primento de 19 a 49 nucleotídeos, e um veículo farmaceuticamente aceitá-vel, sendo que o RNA de interferência compreende um filamento de nucleo-tídeo sentido, um filamento de nucleotídeo anti-sentido, e uma região decomplementaridade contínua pelo menos quase perfeita de pelo menos 19nucleotídeos; onde o filamento anti-sentido se hibridiza sob condições fisio-lógicas em uma parte de mRNA que corresponde a SEQ ID NQ:1 ou SEQ IDNQ: 191 e possui uma região de complementaridade contínua pelo menosquase perfeita de pelo menos 19 nucleotídeos com a parte de hibridizaçãode mRNA que corresponde a SEQ ID NQ:1 ou SEQ ID N9: 191, respectivamente. O glaucoma é tratado desta forma.

Nos métodos citados acima, o filamento anti-sentido do RNA deinterferência é designada para marcar um mRNA correspondente a SEQ IDNe:1 que compreende nucleotídeo 509, 521, 524, 767, 818, 843, 850, 872,881, 900, 959, 968, 971, 983, 986, 989, 1001, 1016, 1019, 1022, 1031, 1034,1052, 1088, 1121, 1127, 1207, 1360, 1445, 1450, 1478, 1487, 1524, 1535,1562, 1579, 1613, 1661, 1667, 1724, 1730, 1753, 1757, 1763, 1771, 1794,1800, 1813, 1887, 1893, 1916, 2001, 2006, 2106, 2117, 2135, 2142, 2152,2200, 2203, 2206, 2241, 2263, 2276, 2279, 2389, 2410, 2430, 2464, 2468,2482, 2502, 2506, 2572, 2645, 2666, 2681, 2697, 2715, 2734, 2760, 2770,2783, 2797, 2807, 2844, 2917, 2937, 2961, 3005, 3010, 3080, 3130, 3150,3156, 3179, 3185, 3196, 3244, 3281, 3345, 3350, 3365, 3372, 3403, 3410,3424, 3428, 3450, 3453, 3460, 3596, 3668, 3672, 3746, 3762, 3776, 3786,3789, 3826, 3835, 3844, 3847, 3867, 3912, 3924, 3958, 3976, 3981, 4012,4022, 4071, 4089, 4154, 4157, 4208, 4369, 4375, 4441, 966, 408, 409, 463,754, 862, 863, 864, 868, 874, 909, 913, 915, 956, 1118, 1135, 1634, 1637,1640, 1737, 1867, 1868, 2100, 2259, 2260, 2483, 2598, 2673, 2675, 2779,2985, 2986, 2987, 2988, 3055, 3062, 3161, 3217, 3355, 3623, 3648, 3665,3817, 4153, ou 4252. Em uma modalidade adicional, o filamento anti-sentido do RNA de interferência é designada para marcar um mRNA que corresponde a SEQ ID Ne: 191 que compreende nucleotídeo 3352.

Um segundo RNA de interferência que possui um comprimento de 19 a 49 nucleotídeos também poderia ser administrado no indivíduo; sendo que o segundo RNA de interferência compreende um filamento de nucleotídeo sentido, um filamento de nucleotídeo anti-sentido, e uma região de complementaridade pelo menos quase perfeita de pelo menos 19 nucleotídeos onde o filamento anti-sentido do segundo RNA de interferência se hibridiza sob condições fisiológicas em uma segunda parte de mRNA correspondente a SEQ ID NQ:1 ou SEQ ID NQ:191, e o filamento anti-sentido possui uma região de complementaridade contínua pelo menos quase perfeita de pelo menos 19 nucleotídeos com a segunda parte de hibridização de mRNA que corresponde a SEQ ID N9: 1 ou SEQ ID Ns: 191, respectivamente.

Um método para atenuar a expressão de mRNA de Proteína Relacionada Frizzled-1 de um indivíduo, que compreende administrar no indivíduo uma composição que compreende uma quantidade eficaz de um RNA de interferência de filamento simples que possui um comprimento de 19 a 49 20 nucleotídeos, e um veículo farmaceuticamente aceitável, onde o RNA de interferência de filamento simples se hibridiza sob condições fisiológicas em uma parte de mRNA que corresponde a SEQ ID NQ:1 ou SEQ ID N-: 191 que compreende os nucleotídeos identificados acima é uma modalidade adicional da invenção.

A invenção inclui como uma modalidade adicional uma composição que compreende um RNA de interferência que possui um comprimento de 19 a 49 nucleotídeos, e compreende uma seqüência de nucleotídeo que corresponde a qualquer uma entre SEQ ID NQ:2, SEQ ID NQ:8 - SEQ ID Ne:190, e SEQ ID Ng:192, ou um complemento desta, e um veículo farmaceuticamente aceitável.

O uso de qualquer modalidade como descrito aqui na preparação de um medicamento para atenuar a expressão de mRNA de FRP-I comoestabelecido aqui também é uma modalidade da presente invenção.

Breve Descrição dos Desenhos

O desenho mostra o efeito de um RNA de interferência sobre o nível de mRNA de FRP1 endógeno em células COS7 como medido por QP-CR. A inibição significativa de mRNA de FRP1 foi observada no dia 1 (22%, P=0,04) e dia 3 (32%, P=0,002) após a transfecção comparada com controles como descrito no Exemplo 1.

Descrição Detalhada da Invenção

A interferência de RNA (RNAi) é um processo por meio do qual o RNA de filamento duplo (dsRNA) é usado para silenciar a expressão genética. Embora sem se ater à teoria, RNAi começa com a clivagem de dsRNAs mais longos dentro de RNAs de interferência pequenos (siRNAs) através de uma enzima tipo RNaselll, dicer. SiRNAs são dsRNAs que possuem geralmente cerca de 19 a 28 nucleotídeos, ou 20 a 25 nucleotídeos, ou 21 a 22 nucleotídeos de comprimento e geralmente contêm protuberâncias 3' de 2-nucleotídeos, e fosfato 5' e terminações de hidroxila 3'. Um filamento do siRNA é incorporado dentro de um complexo de ribonucleoproteína conhecido como o complexo de silenciamento induzido por RNA (RISC). RISC utiliza este filamento de siRNA para identificar moléculas de mRNA que são pelo menos parcialmente complementares ao filamento de siRNA incorporado, e então diva estes mRNAs alvo ou inibe sua tradução. Portanto, o filamento de siRNA que é- incorporado dentro de RISC é conhecido como o filamento guia ou o filamento anti-sentido. O outro filamento de siRNA, conhecido como o filamento passageiro ou o filamento sentido, é eliminado do siRNA e é pelo menos parcialmente homólogo ao mRNA alvo. Os versados na técnica irão reconhecer, em princípio, que tanto o filamento de um siRNA pode ser incorporado dentro de RISC como funcionar como um filamento guia. Entretanto, o desenho de siRNA (por exemplo, estabilidade dúplex de siRNA reduzida na extremidade 5' do filamento anti-sentido) pode favorecer a incorporação do filamento anti-sentido dentro de RISC.

A clivagem mediada por RISC de mRNAs que possui uma seqüência pelo menos parcialmente complementar o filamento guia resulta emuma redução no nível de estado estacionário daquele mRNA e da proteína correspondente codificada por este mRNA. Alternativamente, RISC também pode reduzir a expressão da proteína correspondente através da regressão translacional sem clivagem do mRNA alvo. Outras moléculas de RNA e moléculas tipo RNA também podem interagir com RISC e silenciar a expressão genética. Exemplos de outras moléculas de RNA que podem interagir com RISC incluem pequeno "harpin" de RNAs (shRNAs), siRNAs de filamento simples, microRNAs (miRNAs), e dúplices dicer-substrato 27-mer. O termo "siRNA" como usado aqui se refere a um RNA de interferência de filamento duplo a menos que de outra maneira especificada. Exemplos de moléculas tipo RNA que podem interagir com RISC incluem moléculas de RNA que contêm um ou mais nucleotídeos quimicamente modificados, um ou mais desoxirribonucleotídeos, e/ou uma ou mais ligações de não-fosfodiéster. Para propósitos da presente discussão, todos os RNAs ou moléculas tipo RNA que podem interagir com RISC e participam nas alterações mediadas por RISC em expressão genética serão referidos como "RNAs de interferência". SiRNAs, shRNAs, miRNAs, e duplexes dicer-substrato 27-mer são, portanto, subconjuntos de "RNAs de interferência".

O RNA de interferência de modalidades da invenção surge para atuar de maneira catalítica para clivagem de mRNA alvo, ou seja, o RNA de interferência é capaz de efetuar a inibição de mRNA alvo em quantidades substoiquiométricas. Como comparado com terapias anti-sentido, RNA de interferência significativamente menor é requerido para proporcionar um efeito terapêutico sob tais condições de clivagem.

A presente invenção se refere ao uso de RNA de interferência para inibir a expressão de mRNA de Proteína Relacionada Frizzled-1 (FRP-I), desta maneira interferindo na via de sinalização do Wnt e prevenindo uma sucessão de eventos relacionados com atividade celular de glaucoma e pré-glaucoma. De acordo com a presente invenção, os RNAs de interferência proporcionados de forma exógena ou expressos de forma endógena são particularmente eficazes no silenciamento de mRNA de Proteína Relacionada Frizzled-1 (FRP-I) em tecido(s) ocular(es).As Proteínas Relacionadas Frizzled (FRP) são uma família de proteínas secretadas que antagonizam a via de sinalização do Wnt ao ligar Wnt extracelular e impedindo que o mesmo interaja com o receptor de proteína frizzled ligada por membrana ou ao formar um complexo não-funcional com o receptor encrespado (Bafico, et al. J. Biol. Chem., 274(23): 16180-16187 (1999)), dessa forma prevenindo uma sucessão de eventos relacionados com adesão diferencial de uma célula à outra bem como a uma matriz extracelular.

Os presentes inventores, juntamente com outros, como estabelecido por Pedido de Patente Publicado N9 U.S. 2004/0186159, Appl. N9 10/488,496, de Hellberg, et al. (incorporado por meio deste à guisa de referência em sua totalidade), determinaram que a proteína relacionada frizzled (FRP) é diferencialmente expressa em inúmeras linhas celulares de rede trabecular glaucomatosa. A perfusão de FRP-I através de segmentos anteriores oculares humanos perfundidos mantidos em cultura resultou em uma redução na taxa de fluxo e uma redução correspondente em níveis de proteína B-catenina no corpo ciliar e rede trabecular (TM). A taxa de fluxo reduzida nos segmentos anteriores cultivados apresenta um aumento na resistência de fluxo (aumento em pressão intra-ocular) no olho intacto.

Ademais, os presentes inventores, juntamente com outros, mostraram que a expressão de FRP-I está aumentada em tecidos e células de rede trabecular glaucomatosa (Pedido de Patente Publicado No. U.S. 2002/0049177, Appl. No. 09/796.008 de Clark et al, intitulado "Diagnostics and Therapeutics for Glaucoma" depositado em 28 de fevereiro de 2001, incorporado à guisa de referência em sua totalidade).

Estes resultados mostram que há uma via de sinalização do Wnt ativa na rede trabecular e corpo ciliar e sugerem que esta via seja responsável pelo menos em parte por manter o fluxo através da TM e dessa forma controlando a IOP.

As seqüências de ácido nucléico citadas aqui estão escritas em uma direção 5' a 3' a menos que indicado de outra maneira. O termo "ácido nucléico", como usado aqui, se refere tanto a DNA ou RNA como a uma for-ma modificada deste que compreende aa bases de purina ou pirimidina presentes no DNA (adenina "A", citosina"C", guanina "G", timina "T") ou em RNA (adenina "A", citosina "C", guanina "G", uracil "U"). Os RN As de interferência proporcionados aqui podem compreender bases "T", particularmente em extremidades 3', mesmo que as bases "T" não ocorram naturalmente em RNA. O "ácido nucléico" inclui os termos "oligonucleotídeo" e "polinucleotídeo" e podem se referir a uma molécula de filamento simples ou a uma molécula de filamento duplo. Uma molécula de filamento duplo é formada por pareamento de base Watson-Crick entre as bases A e T, bases C e G, e entre as bases A e U. Os filamentos de uma molécula de filamento duplo podem possuir complementaridade parcial, substancial ou total uma à outra e irão formar um híbrido duplex, cuja resistência de ligação é dependente da natureza e grau de complementaridade da seqüência de bases.

Uma seqüência de mRNA é facilmente deduzida a partir da seqüência da seqüência de DNA correspondente. Por exemplo, SEQ ID NQ:1 proporciona a seqüência de filamento sentido do DNA que corresponde ao mRNA de FRP-I. A seqüência de mRNA é idêntica à seqüência de filamento sentido de DNA com as bases "T" substituídas por bases "U".

Portanto, a seqüência de mRNA de FRP-I é conhecida a partir de SEQ ID Ng:1, e a seqüência de mRNA de um equivalente de FRP-I é conhecida a partir de SEQ ID NQ: 191.

mRNA de Proteína Relacionada Frizzled (FRP-I): O banco de dados GenBank proporciona a seqüência de DNA de FRP-I como o número de acesso AF056087, proporcionado na "Listagem de Seqüência" como SEQ ID Ns:1. A SEQ ID N-: 1 proporciona a seqüência de filamento sentido de DNA que corresponde ao mRNA que codifica FRP-I (com a exceção de bases "T" para bases "U"). A seqüência de codificação de FRP-I está entre os nucleotídeos 303-1244.

Os equivalentes da seqüência de mRNA de FRP-I citada acima são formas de junção, formas alélicas, isozimas alternativas, ou um cognato destas. Um cognato é um mRNA da Proteína Relacionada Frizzled-1 de outras espécies de mamífero que é homólogo à SEQ ID N9:1 (ou seja, um ortó-logo). As seqüências de ácido nucléico de FRP-I relacionadas à SEQ ID N9:1 incluem aquelas que possuem números de acesso GenBank NM_003012 (citado infra), BC036503, AF001900, BC004466, AF017987, e BT019677.

O banco de dados GenBank proporciona uma seqüência de DNA adicional de FRP-I como número de acesso NM_003012, proporcionado na "Listagem de Seqüência" como SEQ ID NQ:191, e considerado um e-quivalente à SEQ ID N9:1. A SEQ ID NQ:191 proporciona a seqüência de filamento sentido de DNA que corresponde ao mRNA que codifica FRP-I (com a exceção de bases "T" para bases "U"). A seqüência de codificação de FRP-I secretada está entre os nucleotídeos 303-1247.

Atenuação de expressão de um mRNA: A frase, "atenuação de expressão de um mRNA", como usada aqui, significa administrar ou expressar uma quantidade de RNA de interferência (por exemplo, um siRNA) para reduzir a tradução do mRNA alvo dentro da proteína, tanto através de clivagem de mRNA como através de inibição direta de tradução. A redução na expressão do mRNA alvo ou a proteína correspondente é comumente referida como "superexpressão e inativação", conhecida como "Knock-down" e é descrita com relação a níveis presentes após a administração ou expressão de um RNA de controle de não-marcação (por exemplo, um siRNA de controle de não-marcação). A superexpressão e inativação de expressão de uma quantidade inclusive e entre 50% e 100% é contemplada por modalidades no presente documento. Entretanto, não é necessário que tais níveis de superexpressão e inativação sejam atingidos para propósitos da presente invenção. Em uma modalidade, um único RNA de interferência que marca mRNA de FRP-1 é administrado. Em outras modalidades, dois ou mais RNAs de interferência que marcam mRNA de FRP-I são administrados.

A superexpressão e inativação é comumente avaliada ao medir os níveis de mRNA utilizando amplificação de reação em filamento da poli-merase quantitativa (qPCR) ou ao medir os níveis de proteína por análise de western blot ou ensaio imunossorvente ligado a enzima (ELISA). A análise do nível de proteína proporciona uma avaliação tanto da clivagem de mRNA bem como inibição de tradução. As técnicas adicionais para medir a super-expressão e inativação incluem hibridização de solução de RNA, proteção de nuclease, hibridização do norte, monitoramento de expressão de gene com um microarranjo, ligação de anticorpo, radioimunoensaio, e análise celular ativada por fluorescência.

A inibição de FRP-I também pode ser determinada in vitro ao examinar o nível de FRP-I, níveis de P-catenina ou taxa de fluxo em segmentos anteriores perfundidos de olhos humanos como estabelecido no pedido de patente publicado U.S. 2004/0186159 anteriormente incorporado à guisa de referência no presente documento. Brevemente, os segmentos anteriores oculares são perfundidos com meio de Eagle modificado por Dul-becco (DMEM) em uma pressão constante de 11 mm de Hg. A taxa de fluxo de cada olho é medida ao pesar seu reservatório em períodos especificados. Após um período de estabilização, os olhos são perfundidos tanto com um controle de veículo, um controle de seqüência de siRNA disperso, ou um siRNA como descrito aqui para atenuar FRP-I, e as taxas de fluxo do olho monitoradas durante 2-5 dias. A taxa de fluxo de humor aquoso é medida ao pesar seu reservatório em períodos específicos. Um aumento no fluxo como comparado com os valores de controle indica que o siRNA é eficaz para atenuar FRP-I.

A inibição de FRP-I também é inferida em um ser humano ou mamífero ao observar um progresso em um sintoma de glaucoma tal como progresso na pressão intra-ocular, progresso na perda de campo visual, ou progresso nas alterações de disco óptico, por exemplo.

RNA de interferência: Em uma modalidade da invenção, o RNA de interferência (por exemplo, siRNA) possui um filamento sentido e um filamento anti-sentido, e os filamentos sentido e anti-sentido compreendem uma região de complementaridade contínua pelo menos quase perfeita de pelo menos 19 nucleotídeos. Em uma modalidade adicional da invenção, o RNA de interferência compreende uma região de pelo menos 13, 14, 15, 16, 17, ou 18 nucleotídeos contínuos que possuem porcentagens de complementaridade de seqüência a ou, que possuem porcentagens de identidade de seqüência com, os penúltimos 13, 14, 15, 16, 17, ou 18 nucleotídeos,respectivamente, da extremidade 3' da seqüência alvo correspondente dentro de um mRNA.

O comprimento de cada filamento do RNA de interferência compreende 19 a 49 nucleotídeos, e pode compreender um comprimento de 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, ou 49 nucleotídeos.

O filamento anti-sentido de um siRNA é o agente de guia ativo do siRNA onde o filamento anti-sentido está incorporado dentro de RISC, desta maneira permitindo que RISC identifique os mRNAs alvo em complementaridade pelo menos parcial o filamento de siRNA anti-sentido para cli-vagem ou repressão translacional.

Em modalidades da presente invenção, as seqüências alvo de o RNA de interferência (por exemplo, seqüências alvo de siRNA) dentro de uma seqüência de mRNA alvo são selecionadas utilizando ferramentas de design disponíveis. Os RNAs de interferência que correspondem a uma seqüência alvo de FRP-I são então testados por transfecção de células que expressam o mRNA alvo seguido por avaliação de superexpressão e inati-vação como descrito acima.

Técnicas para selecionar seqüências alvo de siRNAs são pro-porcionadas por Tuschl, T. et ai, "The siRNA User Guide", revisado em 6 de maio de 2004, disponível no web site de Rockefeller University; por Techni-cal Bulletin #506, "siRNA Design Guidelines", Ambion Inc. at Ambion's web site; e por outras ferramentas de design baseadas na web, por exemplo, em Invitrogen, Dharmacon, Integrated DNA Technologies, Genscript, ou Proligo web sites. Os parâmetros de pesquisa iniciais podem incluir teores de G/C entre 35% e 55% e comprimentos de siRNA entre 19 e 27 nucleotídeos. A seqüência alvo pode ser localizada na região de codificação ou nas regiões 5' ou 3'não-traduzidas dos mRNAs.

Uma modalidade de uma seqüência alvo de DNA de 19 nucleotídeos de mRNA de FRP-I está presente em nucleotídeos 509 a 527 de SEQ ID NQ:1 :Um siRNA da invenção para marcar uma seqüência de mRNA correspondente de SEQ ID NQ:2 e que possui filamentos de 21 nucleotídeos e uma protuberância 3' de 2 nucleotídeos é:

5'- CGCTGGGCUACAAGAAGAUGNN -3' SEQ ID N0i3

3' -MHGCACCCGAOGÜÜCÜÜCK&C -5' SEQ TD HO:4.

Cada resíduo "N" pode ser qualquer nucleotídeo (A, C, G, U, T) ou nucleotídeo modificado. A extremidade 3' pode possuir um número de resíduos "N" entre e inclusive 1, 2, 3, 4, 5, e 6. Os resíduos "N" sobre cado filamento pode ser o mesmo resíduo (por exemplo, UU, AA, CC, GG, ou TT) 10 ou estes podem ser diferentes (por exemplo, AC, AG, AU, CA, CG, CU, GA, GC, GU, UA, UC, ou UG). As protuberâncias 3' podem ser iguais ou podem ser diferentes. Em, uma modalidade, ambos filamentos possuem uma protuberância 3'UU.

Um siRNA da invenção para marcar uma seqüência de mRNA 15 correspondente de SEQ ID NQ:2 e que possui filamentos de 21 nucleotídeos e uma protuberância 3'UU sobre cado filamento é:

5' - CGUGGGCUACAAGAAGAUG1TO -3' SEQ ID NO : 5

3' -OTJGCUiCCÇG&liePlíCüOCüAC -5' SEQ ID NO : 6.

O RNA de interferência também possui uma protuberância 5' de nucleotídeos ou pode possuir extremidades cegas. Um siRNA da invenção para marcar uma seqüência de mRNA correspondente de SEQ ID N9:2 e possui filamentos de 19 nucleotídeos e extremidades cegas é:

5'- CGUGG6CDACAAGAAGADG -3' SEQ ID NO : l93

3'~ QC&CCÇGXmüVCÜÜCUm -5' SEQ ID NO : l94.

Os filamentos de um RNA de interferência de filamento duplo (por exemplo, um siRNA) podem ser conectados para formar uma estrutura de "harpin" ou "stem-loop" (por exemplo, um shRNA). Um shRNA da invenção para marcar um mRNA correspondente de SEQ ID NQ:2 e que possui uma região "stem" de filamento duplo 19 bp e uma protuberância 3"UU é:<formula>formula see original document page 16</formula>

N é um nucleotídeo A, T, C, G, U, ou uma forma modificada conhecida por um versado na técnica. O número de nucleotídeos N no "loop" é um número entre e inclusive 3 a 23, ou 5 a 15, ou 7 a 13, ou 4 a 9, ou 9 a 11, ou o número de nucleotídeos N é 9. Alguns dos nucleotídeos no "loop" podem estar envolvidos em interações de base-par com outros nucleotídeos no "loop". Exemplos de seqüências de oligonucleotídeo que podem ser usados para formar o "loop" incluem 5'-UUCAAGAGA-3' (Brummelkamp, T.R. et ai (2002) Science 296: 550) e 5'-UUUGUGUAG-3' (Castanotto, D. et al (2002) RNA 8:1454). Será avaliado por um versado na técnica que o oligonucleotídeo de filamento simples resultante forma uma estrutura de "stem-loop" ou "harpin" que compreende uma região de filamento duplo capaz de interagir com o mecanismo de RNAi.

A seqüência alvo de siRNA identificada acima pode ser estendida na extremidade 3' para facilitar o desenho de dúplices dicer-substrato 27-mer. A extensão da seqüência alvo de DNA com 19 nucleotídeos (SEQ ID NQ:2) identificada na seqüência de DNA de FRP-I (SEQ ID N9:1) por 6 nucleotídeos produz uma seqüência alvo de DNA com 25 nucleotídeos presentes em nucleotídeos 509 a 533 de SEQ ID N9:1:

5'- cgtgggctacaagaagatggtgctg -3' seq id 110:195.

Um dúplex dicer-substrato 27-mer da invenção para marcar uma seqüência de mRNA correspondente de SEQ ID N9: 195 é:

s'- cgügggcuacaagaagauggugcog -3' seq id noi196 3' -UüGCACCCG&0GUOCOtrCT&CCACGAC -5' seq id no: 197 .

Os dois nucleotídeos na extremidade 3' do filamento sentido (ou seja, os nucleotídeos UG de SEQ ID N9: 196) podem ser desoxinucleotídeos (ou seja, TG) para processamento aumentado. O desenho de dúplices dicer-substrato 27-mer a partir de seqüências alvo com 19-21 nucleotídeos, tais como proporcionadas aqui, é adicionalmente discutido por Integrated DNATechnologies (IDT) website e por Kim, D.-H. et al., (February, 2005) Nature Biotechnology 23:2; 222-226.

Quando os RNAs de interferência forem produzidos por síntese química, a fosforilação na posição 5' do nucleotídeo na extremidade 5' de um ou ambos filamentos (quando presentes) pode aumentar a eficácia do siRNA e especificidade da ligação de complexo de RISC porém a mesma não é requerida uma vez que a fosforilação pode ocorrer de forma intracelular.

A Tabela 1 lista exemplos de seqüências alvo de DNA de FRP1 de SEQ ID N-:1 e SEQ ID Ne: 191 a partir da qual os siRNAs da presente invenção estão desenhados de maneira estabelecida acima. O FRP1 codifica a Proteína Relacionada Frizzled-1, como observado acima.Tabela 1. Seqüências Alvo de FRP1 para siRNAs

<table>table see original document page 18</column></row><table><table>table see original document page 19</column></row><table><table>table see original document page 20</column></row><table><table>table see original document page 21</column></row><table>Conforme citado nos exemplos acima, um versado na técnica é capaz de usar as informações de seqüência alvo proporcionadas na Tabela 1 para projetar os RNAs de interferência que possuem um comprimento mais curto ou mais longo do que a seqüência proporcionada na Tabela 1 ao fazer referência à posição de seqüência em SEQ ID N9.1 ou SEQ ID NQ: 191 e adicionar ou deletar os nucleotídeos complementares ou quase comple-mentares à SEQ ID NQ:1 ou SEQ ID NQ:191, respectivamente.

A reação de clivagem de RNA alvo guiada por siRNAs e outras formas de RNA de interferência é uma seqüência altamente específica. Em geral, o siRNA que contém um filamento de nucleotídeo sentido idêntica em seqüência a uma parte do mRNA alvo e um filamento de nucleotídeo anti-sentido exatamente complementar a uma parte do mRNA alvo são modalidades de siRNA para inibição de mRNAs citados aqui. Entretanto, 100% de complementaridade de seqüência entre o filamento de siRNA antisentido e o mRNA alvo, ou entre o filamento de siRNA anti-sentido e o filamento de siRNA sentido, não é requerida para praticar a presente invenção. Desta maneira, por exemplo, a invenção permite variações de seqüência que podem ser esperadas devido à mutação genética, polimorfismo de filamento, ou divergência evolutiva.

Em uma modalidade da invenção, o filamento anti-sentido do siRNA possui complementaridade contínua pelo menos quase perfeita de pelo menos 19 nucleotídeos com o mRNA alvo. "Quase perfeita", como usado aqui, significa que o filamento antIsentido do siRNA é "substancialmente complementar a", e o filamento sentido do siRNA é "substancialmente idêntica" a pelo menos uma parte do mRNA alvo. "Identidade", como conhecido por um versado na técnica, é o grau de afinidade de seqüência entre as seqüências de nucleotídeo como determinado ao combinar a ordem e a identidade de nucleotídeos entre as seqüências. Em uma modalidade, o filamento anti-sentido de um siRNA que possui 80% e entre 80% até 100% de complementaridade, por exemplo, 85%, 90% ou 95% de complementaridade, à seqüência de mRNA alvo é considerada de complementaridade quase perfeita e pode ser usada na presente invenção. Complementaridade continua"perfeita" é o pareamento de base de Watson-Crick padrão de pares de base adjacentes. Complementaridade contínua "pelo menos quase perfeita" como usado aqui. Os métodos de computador para determinar a identidade ou complementaridade são projetados para identificar o grau mais alto de combinação de seqüências de nucleotídeo, por exemplo, BLASTN (Altschul, S.F., eía/(1990) J. Mol. Biol. 215:403-410).

O termo "porcentagem de identidade" descreve a porcentagem de nucleotídeos adjacentes em uma primeira molécula de ácido nucléico que é a mesma que está em um conjunto de nucleotídeos adjacentes do mesmo comprimento em uma segunda molécula de ácido nucléico. O termo "porcentagem de complementaridade" descreve a porcentagem de nucleotídeos adjacentes em uma primeira molécula de ácido nucléico que pode ser conjugada por base no sentido Watson-Crick com um conjunto de nucleotídeos adjacentes em uma segunda molécula de ácido nucléico.

A relação entre um mRNA alvo (filamento sentido) e um filamento de um siRNA (o filamento sentido) é de identidade. O filamento sentido de um siRNA também é chamado de um filamento passageiro, se presente. A relação entre um mRNA alvo (filamento sentido) e o outro filamento de um siRNA (o filamento anti-sentido) é de complementaridade. O filamento antisentido de um siRNA também é chamado de um filamento guia.

A penúltima base em uma seqüência de ácido nucléico que está escrita em uma direção 5' a 3' é a que está próxima à última base, ou seja, próxima à base 3'. As penúltimas 13 bases de uma seqüência de ácido nucléico escritas em uma direção 5' a 3' são as últimas 13 bases de uma seqüência próxima à base 3' e não inclui a base 3'. Similarmente, as penúltimas 14, 15, 16, 17, ou 18 bases de uma seqüência de ácido nucléico escritas em uma direção 5' a 3' são as últimas 14, 15, 16, 17, ou 18 bases de uma seqüência, respectivamente, próximas à base 3' e não incluem a base 3'.

A frase "uma região de pelo menos 13 nucleotídeos adjacentes

que possui pelo menos 90% de complementaridade de seqüência a, ou pelo menos 90% de identidade de seqüência com, os penúltimos 13 nucleotídeosda extremidade 3' de um mRNA correspondente a qualquer (um identificador de seqüência)" permite uma substituição de nucleotídeo. Duas substituições de nucleotídeo (ou seja, 11/13 = 85% de identidade/complementaridade) não estão incluídas em tal frase.

Em uma modalidade da invenção, a região de nucleotídeos adjacentes de pelo menos 14 nucleotídeos adjacentes que possuem pelo menos 85% de complementaridade de seqüência a, ou pelo menos 85% de i-dentidade de seqüência com, os penúltimos 14 nucleotídeos da extremidade 3' de um mRNA correspondente à seqüência identificada por cada identificador de seqüência. Duas substituições de nucleotídeo (ou seja, 12/14 = 86% de identidade/complementaridade) estão incluídas em tal frase.

Em uma modalidade adicional da invenção, a região de nucleotídeos adjacentes é uma região de pelo menos 15, 16, 17, ou 18 nucleotídeos adjacentes que possuem pelo menos 80% de complementaridade de seqüência a, ou pelo menos 80% de identidade de seqüência com, os 14 penúltimos nucleotídeos da extremidade 3' de um mRNA correspondente à seqüência do identificador de seqüência. Três substituições de nucleotídeo estão incluídas em tal frase.

A seqüência alvo nos mRNAs correspondentes à SEQ ID NQ:1 ou SEQ ID N9:191 podem estar nas regiões 5' ou 3' não-traduzidas do mRNA bem como na região de codificação do mRNA.

Um ou ambos filamentos de RNA de interferência de filamento duplo pode possuir uma protuberância 3' a partir de 1 a 6 nucleotídeos, que podem ser ribonucleotídeos ou desoxirribonucleotídeos ou uma mistura destes. Os nucleotídeos da protuberância não estão conjugados por base. Em uma modalidade da invenção, o RNA de interferência compreende uma protuberância 3' de TT ou UU. Em outra modalidade da invenção, o RNA de interferência compreende pelo menos uma extremidade cega. As terminações geralmente possuem um grupo de fosfato 5' ou um grupo hidroxila 3'. Em outras modalidades, o filamento anti-sentido possui um grupo de fosfato 5', e o filamento sentido possui um grupo hidroxila 5'. Ainda em outras modalidades, as terminações são adicionalmente modificadas por adição covalen-te de outras moléculas ou grupos funcionais.

Os filamentos sentido e anti-sentido do siRNA de filamento duplo podem estar em uma formação dupla de dois filamentos simples como descrito acima ou podem ser uma única molécula onde as regiões de complementaridade estão conjugadas por base e estão covalentemente ligadas por um "loop" de "harpin" para formar um filamento simples. Acredita-se que o "harpin" seja clivado de forma intracelular por uma proteína chamada dicer para formar um RNA de interferência de duas moléculas de RNA conjugadas por base individuais.

Os RNAs de interferência podem se diferir do RNA naturalmente ocorrente através da adição, deleção, substituição ou modificação de um ou mais nucleotídeos. O material de não-nucleotídeo pode ser ligado ao RNA de interferência, tanto na extremidade 5', extremidade 3', como internamente. Tais modificações são geralmente designadas para aumentar a resistência à nuclease dos RNAs de interferência, para aperfeiçoar a absorção celular, para aumentar a marcação celular, para auxiliar o traçado do RNA de interferência, para aperfeiçoar adicionalmente a estabilidade, ou para reduzir o potencial de ativação da via de interferon. Por exemplo, os RNAs de interferência podem compreender uma purina nucleotídeo nas extremidades das protuberâncias. A conjugação de colesterol na extremidade 3' do filamento sentido de uma molécula de siRNA por meio de um ligante de pirrolidina, por exemplo, também proporciona estabilidade a um siRNA.

As modificações adicionais incluem uma molécula de biotina de terminal 3', um peptídeo conhecido por possuir propriedades de penetração celular, uma nanopartícula, um peptidomimético, um corante fluorescente, ou um dendrímero, por exemplo.

Os nucleotídeos podem ser modificados em sua parte de base, em sua parte de açúcar, ou uma parte de fosfato da molécula e funcionam em modalidades da presente invenção. As modificações incluem substituições com grupos alquila, alcóxi, amina, deaza, halo, hidroxila, tiol, ou uma combinação destes, por exemplo. Os nucleotídeos podem ser substituídos por análogos com maior estabilidade tal como substituindo um ribonucleotí-deo por um desoxirribonucleotídeo, ou fazendo modificações de açúcar tais como grupos OH 2' substituídos por grupos amina T, grupos 2' O-metila, grupos metoxietila 2', ou uma ponte de 2'-0, 4'-C metileno, por exemplo. Exemplos de um análogo de purina ou pirimidina de nucleotídeos incluem uma xantina, uma hipoxantina, uma azapurina, uma metiltioadenina, 7-deaza-adenosina e nucleotídeos modificados por O e N. O grupo de fosfato do nu-cleotídeo pode ser modificado ao substituir um ou mais dos oxigênios do grupo de fosfato por nitrogênio ou enxofre (fosforotioatos). As modificações são úteis, por exemplo, para aumentar a função, para aperfeiçoar a estabilidade ou permeabilidade, ou para localização direta ou marcação.

Pode haver região ou regiões do filamento de RNA de interferência anti-sentido que não é (são) complementar(es) a uma parte de SEQ ID Ng:1 ou SEQ ID N9: 191. As regiões não-complementares podem estar nas extremidades 3', 5' ou ambas extremidades de uma região complementar ou entre duas regiões complementares.

Os RNAs de interferência podem ser gerados de forma exógena por síntese química, por transcrição in vitro, ou por clivagem de RNA de filamento duplo mais longa com dicer ou outra nuclease apropriada com atividade similar. Os RNAs de interferência quimicamente sintetizados, produzidos a partir de ribonucleosídeo fosforamiditas protegidas que utilizam um sintetizador de DNA/RNA convencional, podem ser obtidos a partir de fornecedores comerciais tais como Ambion Inc. (Austin, TX), Invitrogen (Carlsbad, CA), ou Dharmacon (Lafayette, CO). Os RNAs de interferência são purificados por extração com um solvente ou resina, precipitação, eletroforese, cro-matografia, ou uma combinação destes, por exemplo. Alternativamente, o RNA de interferência pode ser usado com pouca se alguma purificação para evitar perdas devido ao processamento de amostra.

Os RNAs de interferência também podem ser expressos de forma endógena a partir vetores de expressão de plasmídeo ou virais ou a partir de cassetes de expressão mínima, por exemplo, fragmentos gerados por PCR que compreendem um ou mais promotores e um modelo ou modelos apropriado(s) para o RNA de interferência. Exemplos de vetores de expres-são baseados em plasmídeo comercialmente disponíveis para shRNA incluem elementos das séries pSilencer (Ambion, Austin, TX) e pCpG-siRNA (In-vivoGen, San Diego, CA). Os vetores virais para expressão de RNA de interferência podem ser derivados de uma variedade de vírus inclusive adenoví-rus, vírus adeno associado, lentivírus (por exemplo, HIV, FIV, e EIAV), e vírus herpes. Exemplos de vetores virais comercialmente disponíveis para expressão de shRNA incluem pSilencer adeno (Ambion, Austin, TX) e pLen-ti6/BLOCK-iT™-DEST (Invitrogen, Carlsbad, CA). A seleção de vetores virais, métodos para expressar o RNA de interferência a partir do vetor e métodos para entrega do vetor viral estão dentro da habilidade de um versado na técnica. Exemplos de kits para produção de cassetes de expressão de shRNA gerado por PCR incluem Silencer Express (Ambion, Austin, TX) e siXpress (Minis, Madison, Wl). Um primeiro RNA de interferência pode ser administrado através de expressão in vivo a partir de um primeiro vetor de expressão capaz de expressar o primeiro RNA de interferência e um segundo RNA de interferência pode ser administrado através de expressão in vivo a partir de um segundo vetor de expressão capaz e expressar o segundo RNA de interferência, ou ambos RNAs de interferência podem ser administrados através de expressão in vivo a partir de um único vetor de expressão capaz de expressar ambos RNAs de interferência.

Os RNAs de interferência podem ser expressos a partir de uma variedade de promotores eucarióticos conhecidos pelos versados na técnica, inclusive promotores pol III, tais como promotores U6 ou H1, ou promotores pol II, tal como aquele promotor citomegalovírus. Os versados na técnica irão reconhecer que estes promotores também podem ser adaptados para permitir a expressão induzível do RNA de interferência.

Hibridização sob Condições Fisiológicas: Em certas modalidades da presente invenção, um filamento anti-sentido de um RNA de interferência se hibridiza com um mRNA in vivo como parte do complexo RISC.

"Hibridização" se refere a um processo onde os ácidos nucléicos de filamento simples com seqüências de base complementares ou quase complementares interagem para formar complexos ligados por hidrogêniochamados híbridos. As reações de hibridização são sensíveis e seletivas. In vitro, a especificidade de hibridização (ou seja, severidade) é controlada pelas concentrações de sal ou formamida em soluções de pré-hibridização e hibridização, por exemplo, e através da temperatura de hibridização; tais procedimentos são bem conhecidos na técnica. Em particular, a severidade é aumentada ao reduzir a concentração de sal, aumentando a concentração de formamida, ou elevando a temperatura de hibridização.

Por exemplo, condições de alta severidade poderiam ocorrer em cerca de 50% de formamida a 37°C a 42°C. As condições de severidade reduzidas poderiam ocorrer em cerca de 35% a 25% de formamida a 30°C a 35°C. Exemplos de condições de severidade para hibridização são proporcionadas em Sambrook, J., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. Exemplos adicionais de condições de hibridização incluem 400 mM de NaCI, 40 mM de PIPES pH 6,4, 1 mM de EDTA, 50°C ou 70°C durante 12-16 horas seguidos por lavagem, ou hibridização a 70°C em IXSSC ou 50°C em IXSSC, 50% de formamida seguida por lavagem a 70°C em 0.3XSSC, ou hibridização a 70°C em 4XSSC ou 50°C em 4XSSC, 50% de formamida seguida por lavagem a 67°C em IXSSC. A temperatura para hibridização é cerca de 5-10°Cmenos do que a temperatura de fusão (Tm) do híbrido onde Tm é determinada por híbridos entre 19 e 49 pares de base de comprimento utilizando o seguinte cálculo: Tm <0>C = 81,5 + 16,6(logi0[Na+]) + 0,41 (% de G+C) -(600/N) onde N é o número de bases no híbrido, e [Na+] é a concentração de íons de sódio no tampão de hibridização.

O ensaio de hibridização in vitro descrito acima proporciona um método para prognosticar se a ligação entre um siRNA candidato e um alvo irá possuir especificidade. Entretanto, no contexto do complexo RISC, a cli-vagem específica de um alvo também pode ocorrer com um filamento anti-sentido que não demonstra alta severidade para hibridização in vitro.

RNA de interferência de filamento simples: Como citado acima,os RNAs de interferência funcionam essencialmente como filamentos simples. O RNA de interferência de filamento simples (ss) foi considerado paraefetuar o silenciamento de mRNA, embora menos eficientemente do que o RNA de filamento duplo. Portanto, as modalidades da presente invenção também proporcionam administração de um RNA de interferência ss que se hibridiza sob condições fisiológicas em uma parte de SEQ ID Ne:1 ou SEQ ID N9: 191 e possui uma região de complementaridade contínua pelo menos quase perfeita de pelo menos 19 nucleotídeos com a parte de hibridização de SEQ ID Ne:1 ou SEQ ID Ne: 191, respectivamente. O RNA de interferência ss possui um comprimento de 19 a 49 nucleotídeos como o RNA de interferência ds citado acima. O RNA de interferência ss possui um fosfato 5' ou é fosforilado in situ ou in vivo na posição 5'. O termo "5' fosforilado" é u-sado para descrever, por exemplo, polinucleotídeos ou oligonucleotídeos que possuem um grupo de fosfato ligado através de ligação de éster ao C5 hidroxila do açúcar (por exemplo, ribose, desoxirribose, ou um análogo deste) na extremidade 5' do polinucleotídeo ou oligonucleotídeo.

Os RNAs de interferência SS são quimicamente sintetizados ou por transcrição in vitro ou expressos de forma endógena a partir de vetores ou cassetes de expressão como os RNAs de interferência ds. Os grupos de fosfato 5' podem ser adicionados através de uma quinase, ou um fosfato 5' pode ser o resultado de clivagem de nuclease de um RNA. A entrega é conforme os RNAs de interferência ds. Em uma modalidade, os RNAs de interferência ss que possuem extremidades protegidas e modificações resistentes à nuclease são administrados para silenciamento. Os RNAs de interferência SS podem ser secos para armazenamento ou dissolvidos em uma solução aquosa. A solução pode conter tampões ou sais para inibir o anela-mento ou para estabilização.

"Harpin" de RNA de interferência: Um "harpin" de RNA de interferência é uma molécula simples (por exemplo, um filamento simples de oligonucleotídeo) que compreende tanto filamentos sentido como anti-sentido de um RNA de interferência em uma estrutura de "stem-loop" ou "harpin" (por exemplo, um shRNA). Por exemplo, os shRNAs podem ser expressos a partir de vetores de DNA onde os oligonucleotídeos de DNA que codificam um filamento de RNA de interferência sentido são ligados aos oligonucleotí-deos de DNA que codificam o filamento de RNA de interferência anti-sentido complementar por um espaçador curto. Se necessário para a seleção do vetor de expressão, o terminal 3' terminal T's e nucleotídeos que formam sítios de restrição podem ser adicionados. A transcrição de RNA resultante se dobra novamente sobre si mesma para formar uma estrutura de alça.

Modo de administração: O RNA de interferência pode ser entregue diretamente no olho por administração de tecido ocular tal como administração periocular, conjuntival, subtenoniana, intracameral, intravítrea, intra-ocular, sub-retinal, subconjuntival, retrobulbar, intracanalicular, ou supracoroi-dal; por injeção, por aplicação direta no olho utilizando um cateter ou outro dispositivo de colocação tal como um pélete retiniano, inserto intra-ocular, su-positório ou um implante que compreende um material poroso, não-poroso, ou gelatinoso; por gotas ou pomadas oculares tópicos; ou por um dispositivo de liberação lenta cul-de-sac ou implantados adjacentes à esclera (transescleral) ou dentro do olho. A injeção intracameral pode ser através da córnea dentro da câmara anterior para permitir que o agente atinja a rede trabecular. A injeção intracanalicular pode ser dentro dos canais coletores venosos que drenam o canal de Schlemm ou dentro do canal de Schlemm. A administração sistêmica ou parenteral é contemplada incluindo, porém sem caráter limitativo, entrega intravenosa, subcutânea, transdérmica, e oral.

Indivíduo: Um indivíduo necessitado de tratamento para glauco-ma ou em risco de desenvolver glaucoma é um ser humano ou outro mamífero que possui glaucoma ou em risco de desenvolver uma condição relacionada com glaucoma, tal como hipertensão, associada a expressão indeseja-da ou inapropriada ou atividade de FRP-I como citado aqui. As estruturas oculares associadas com tais distúrbios podem incluir o olho, retina, coróide, lente, córnea, rede trabecular, íris, nervo óptico, disco óptico, esclera, câmara aquosa, câmara vítrea, corpo ciliar, ou segmento posterior, por exemplo. Um indivíduo também pode ser uma célula ocular, cultura celular, órgão ou um órgão ex vivo ou tecido.

Formulações e Dosagem: As formulações farmacêuticas compreendem RNAs de interferência, ou sais destes, da invenção até 99% porpeso misturados com um meio veículo oftálmico fisiologicamente aceitável tal como água, tampão, solução salina, glicina, ácido hialurônico, manitol, e similares. Os RNAs de interferência da presente invenção são administrados como soluções, suspensões, ou emulsões. A seguir estão os exemplos de formulações possíveis incorporadas por esta invenção. <table>table see original document page 31</column></row><table><table>table see original document page 32</column></row><table>

Em geral, as doses de composições de combinação como pro-

porcionado aqui irão variar, porém estarão em uma quantidade eficaz, que se refere a uma quantidade de uma combinação de RN As de interferência que atua juntamente durante um intervalo prolongado de tempo, que inibe efetivamente ou causa regressão de neovascularização ou angiogênese, desse modo prevenindo ou tratando o edema retiniano, AMD, DR, seqüela associada com isquemia retiniana, ou PSNV, por exemplo, em um paciente humano.

Geralmente, uma quantidade eficaz dos RNAs de interferência de modalidades da invenção resulta em uma concentração extracelular na superfície da célula alvo a partir de 100 pM a 100 nM, ou a partir de 1 nM a 50 nM, ou a partir de 5 nM a cerca de 10 nM, ou cerca de 25 nM. A dose requerida para atingir esta concentração local irá variar dependendo de inúmeros fatores inclusive do método de entrega, do local de entrega, do número de camadas celulares entre o local de entrega e a célula ou tecido alvo, se a entrega for local ou sistêmica, etc. A concentração no local de entrega pode ser consideravelmente maior do que na superfície da célula ou tecido alvo. As composições tópicas são entregues na superfície do olho de uma a quatro vezes por dia, ou em programa de entrega prolongado tal como diariamente, semanalmente, quinzenalmente, mensalmente, ou por mais tempo, de acordo com o critério de rotina de um clínico especializado. O pH da formulação é cerca de pH 4-9, ou pH 4,5 a pH 7,4.

Espera-se que o tratamento terapêutico de pacientes com siR-NAs dirigido contra mRNA de FRP-I seja benéfico sobre gotas oculares tópicas de molécula pequena ao aumentar a duração de ação, desse modo permitindo dosagem menos freqüente e maior adaptação ao paciente.Embora o regime preciso seja fique ao critério do clínico, os RNAs de interferência podem ser administrados ao colocar uma gota em cada olho como orientado pelo clínico. Uma quantidade eficaz de uma formulação pode depender de fatores tais como a idade, raça, e sexo do indivíduo, a gravidade da hipertensão ocular, a taxa de renovação de transcrição/proteína genética alvo, a potência do RNA de interferência, e a estabilidade do RNA de interferência, por exemplo. Em uma modalidade, o RNA de interferência é entregue de forma tópica no olho e atinge a rede trabecular, retina, ou disco óptico em uma dose terapêutica desse modo melhorando um processo de doença glaucoma.

Veículos aceitáveis: Um veículo oftalmicamente aceitável se refere àqueles veículos que causam no máximo, pouca ou nenhuma irritação ocular, proporcionam preservação adequada se necessária, e entregam um ou mais RNAs de interferência da presente invenção em uma dose homogênea. Um veículo aceitável para administração de RNA de interferência de modalidades da presente invenção inclui reagentes de transfecção baseados em lipídeo catiônico TranslT®>-TKO (Minis Corporation, Madison, WT), Ll-POFECTIN®, Lipofectamine, OLIGOFECTAMINE® (Invitrogen, Carlsbad, CA), ou DHARMAFECT® (Dharmacon, Lafayette, CO); policátions tais como polietilenoimina; peptídeos catiônicos tais como Tat, poliarginina, ou Pene-tratin (Antp peptide); ou lipossomas. Lipossomas são formados a partir de lipídeos de formação de vesícula padrão e um esterol, tal como colesterol, e podem incluir uma molécula de marcação tal como um anticorpo monoclonal que possui afinidade de ligação para antígenos de superfície celular endote-lial, por exemplo. Ademais, os lipossomas podem ser lipossomas PEGuila-dos.

Os RNAs de interferência podem ser entregues em solução, em suspensão, ou em dispositivos de entrega não-bioerodível. Os RNAs de interferência podem ser entregues sozinhos ou como componentes de conjugados definidos, covalentes. Os RNAs de interferência também podem ser complexados com lipídeos catiônicos, peptídeos catiônicos, ou polímeros catiônicos; complexados com proteínas, proteínas de fusão, ou domínios deproteína com propriedades de ligação de ácido nucléico (por exemplo, pro-tamina); ou encapsulados em nanopartículas. A entrega específica de tecido ou célula pode ser realizada através da inclusão de uma porção de marcação apropriada tal como um anticorpo ou fragmento de anticorpo.

Para entrega oftálmica, um RNA de interferência pode ser combinado com conservantes oftalmologicamente aceitáveis, co-solventes, ten-soativos, intensificadores de viscosidade, intensificadores de penetração, tampões, cloreto de sódio, ou água para formar uma suspensão ou solução oftálmica aquosa, estéril. As formulações de solução oftálmica podem serpreparadas ao dissolver o RNA de interferência em um tampão aquoso iso-tônico fisiologicamente aceitável. Ademais, a solução oftálmica pode incluir um tensoativo oftalmologicamente aceitável para ajudar a dissolver o inibidor. Os agentes de formação de viscosidade, tais como celulose de hidroxi-metila, celulose de hidroxietila, metilcelulose, polivinilpirrolidona, ou similares podem ser adicionados às composições da presente invenção para aperfeiçoar a retenção do composto.

Para preparar uma formulação de pomada oftálmica estéril, o RNA de interferência é combinado com um conservante em um veículo a-propriado, tal como óleo mineral, lanolina líquida, ou petrolato branco. As formulações em gel oftálmico estéreis podem ser preparadas ao suspender o RNA de interferência em uma base hidrofílica preparada a partir da combinação de, por exemplo, CARBOPOL®-940 (BF Goodrich, Charlotte, NC), ou similar, de acordo com os métodos conhecidos na técnica para outras formulações oftálmicas. VISCOAT® (Alcon Laboratories, Inc., Fort Worth, TX) pode ser usado para injeção intra-ocular, por exemplo. Outras composições da presente invenção podem conter agentes de aumento de penetração tais como cremephor e TWEEN® 80 (monolaurato de sorbitano polioxietileno, Sigma Aldrich, St. Louis, MO), no caso de o RNA de interferência ser menos penetrante no olho.

Kits: As modalidades da presente invenção proporcionam um kit que inclui reagentes para atenuar a expressão de um mRNA como citado aqui em uma célula. O kit contém um vetor de expressão de siRNA ou umshRNA. Para vetores de expressão de siRNAs e shRNA não-virais o kit também pode conter um reagente de transfecção ou outro veículo de entrega adequado. Para vetores de expressão de shRNA virais, o kit pode conter o vetor viral e/ou os componentes necessários para produção de vetor viral (por exemplo, uma linha celular de empacotamento bem como um vetor que compreende o modelo de vetor viral e vetores auxiliares adicionais para empacotamento). O kit também pode conter vetores de expressão de siRNAs ou shRNA de controle positivo e negativo (por exemplo, um siRNA de controle de não-marcação ou um siRNA que marca um mRNA não-relacionado). O kit também pode conter reagentes para avaliar a superexpressão e inati-vação do gene alvo almejado (por exemplo, iniciadores e sondas para PCR quantitativo para detectar o mRNA alvo e/ou anticorpos contra a proteína correspondente para western blots). Alternativamente, o kit pode compreender uma seqüência de siRNA ou uma seqüência de shRNA e as instruções e materiais necessários para gerar o siRNA através de transcrição in vitro ou para construir um vetor de expressão de shRNA.

Uma combinação farmacêutica em forma de kit é adicionalmente proporcionada esta inclui, em combinação empacotada, um meio veículo adaptado para receber um meio de recipiente em estreito confinamento com este e um primeiro meio de recipiente que inclui uma composição de RNA de interferência e um veículo oftalmicamente aceitável. Tais kits podem incluir adicionalmente, se desejado, um ou mais entre vários componentes de kit farmacêuticos convencionais, tais como, por exemplo, recipientes com um ou mais veículos farmaceuticamente aceitáveis, recipientes adicionais, etc, como será avaliado por um versado na técnica. As instruções impressas, tanto como insertos como conforme rótulos, que indicam quantidades dos componentes que serão administradas, diretrizes para administração, e/ou diretrizes para misturar os componentes, também podem ser incluídas no kit.

A capacidade de RNA de interferência de FRP-I de produzir o efeito de superexpressão e inativação dos níveis de expressão de FRP-I en-dógena em, por exemplo, células da rede trabecular humana (TM) é realizada como se segue. A transfecção de uma linha celular TM humana transfor-mada designada GTM3 ou HTM-3 (ver Pang, LH. et al.,. 1994. Curr. Eye Res. 13:51-63) é realizada utilizando concentrações in vitro padrão de RNA de interferência de FRP-I (100 nM) como citado aqui e LIPOFECTAMINE™ 2000 (Invitrogen, Carlsbad, Califórnia) em uma proporção de 1:1 (w/v). siR-NA disperso e lamina A/C (Dharmacon) são usados como controles. Os ini-ciadores QPCR TAQMAN® direto e reverso e um conjunto de sonda que a-brange o local alvo são usados para avaliar o grau de clivagem de mRNA. Tais conjuntos de primer/sonda podem ser sintetizados por ABI (Applied Bi-osystems, Foster City, CA), por exemplo. Para reduzir a chance de efeitos não almejados não-específicos, a menor concentração de siRNA possível para inibir a expressão de mRNA de FRP-I é determinada para um siRNA. O "knock-down" de mRNA de FRP-I é avaliado por amplificação QPCR utilizando um conjunto de primer/sonda apropriado. Uma resposta de dose de siRNA de FRP-I em células GTM3 é observada em células GTM3 após um tratamento de 24 horas com faixa de dose de 0, 1, 3, 10, 30, e 100 nM de siRNA, por exemplo. Os dados são ajustados utilizando software GraphPad Prism 4 (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA) com uma inclinação variável, algoritmo de resposta de dose sigmóide e uma restrição superior de 100%. Um IC50 é obtido pelo siRNA particular testado.

Exemplo 1

RNA de interferência para Silenciamento de FRP1

O presente estudo examina a capacidade de RNA de interferência de FRP1 de superexpressão e inativação dos níveis de mRNA de FRP1 endógenos em células COS.

As células COS-7 foram semeadas a -20% de confluência em placas de 12 cavidades no dia antes da transfecção. No momento de trans-fecção, as células pareciam estar 50-70% confluentes. As células foram colhidas 1 e 3 dias após a transfecção. A transfecção de um siRNA de FRP1 de filamento duplo que possui uma seqüência de filamento sentido 5' AA-GAAGAUUGUCCCCAAGAAG 3' (SEQ ID NQ:146, que é SEQ ID Ne:18 com um 5'AA adicionado; adquirida a partir de Dharmacon, Lafayette, Colorado) foi realizada utilizando OLIGOFECTAMINE® (Invitrogen, Carlsbad, CA) e 100nmole de siRNA para cada placa de 12 cavidades em triplicata. O controle ésem siRNA. A extração de RNA foi através de RNAqueous® para PCR (Ambion, Austin, TX) e cDNA foi sintetizado com agentes de transcrição reversa TAQMAN® (PE Biosystems (Applied Biosystems, Foster City, CA)). O QPCRfoi realizado utilizando master mix PCR universal TAQMAN® e 7700 SDS(PE Biosystems) em triplicata. RNA ribossomal (18s, PE Biosystems) foi usado como um controle de normalização no QPCR multiplex. Os dados de QPCR são proporcionados na Figura 1 e mostram inibição significativa demRNA de FRP1 no dia 1 (22%, P=0,04) e no dia 3 (32%, P=0,002) após a transfecção como comparada com controles.

As referências citadas aqui, na medida em que proporcionamdetalhes procedurais exemplificativos ou outros detalhes suplementares àqueles estabelecidos aqui, estão especificamente incorporadas à guisa de referência.

Os versados na técnica, em consideração à presente descrição, irão avaliar que modificações óbvias das modalidades descritas aqui podem ser feitas sem que se abandone o espírito e escopo da invenção. Todas asmodalidades descritas aqui podem ser feitas e executadas sem experimentação indevida em consideração à presente descrição. O escopo total da invenção está especificado na descrição e modalidades equivalentes deste.O relatório descritivo não deve ser interpretado como indevidamente limitativo do escopo total de proteção ao qual a presente invenção está designada.

Como usado aqui e a menos que de outra maneira indicada, osartigos indefinidos "um" e "uma" são considerados como "um", "pelo menos um" ou "um ou mais".Listagem de Seqüência

<110> ÂLCÓN, INC.

<120> Inibição mediada por rnai de proteína relacionada Frizzled-1 paratratamento de glaucoma

<130> 45263-P01OWO

<150> 60/660,556

<151> 2005-03-11

<150> 60/688*633

<151> 2005-06-08

<160> 197

<170> Versão Patentln 3.3

<210> 1

<211> 4469

<212> ONA

<213>- Horao sapiens

<400> 1 cctgcagcct ccggagtcag tgccgcgcgc çcgccgcccc gcgccttcct gctcgccgca 60

cctccgggag ccggggcgca cccagcccgc agcgccgcct ccccgcccgc gccgcctccg 120

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ccgggcaacg ctggggactg cgccttttgt ccccggaggt ccctggaagt ttgcggcagg 240

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atctctgtgc cagcgagttt gcactgagga tgaaaataaa agaagtgaaa aaagaaaatg 960

gcgacaagaa gattgtcccc aagaagaaga agcccctgaa gttggggccc atcaagaaga 1020

aggâcctgaa gaagcttgtg ctgtacctga agaatggggc tgactgtccc tgccaccagc 1080

tggacaacct cagccaccac ttcctcatca tgggccgcaa ggtgaagagc cagtacttgc 1140<table>table see original document page 39</column></row><table>ctctgacctt tcatcgtaaa gtgctgggga ccttaagtga tttgcctgta attttggatg 3120

attaaaaaat gtgtatatat attagctaat tagaaatatt ctacttctct gttgtcaaac 3180

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<210> 2

<211> 19

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<223> Seqüência alva

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<220>

<221> misc_RNA

<222> CD . . C19)<table>table see original document page 41</column></row><table><table>table see original document page 42</column></row><table><table>table see original document page 43</column></row><table><table>table see original document page 44</column></row><table><table>table see original document page 45</column></row><table><table>table see original document page 46</column></row><table><220>

<223> Seqüência alvo

<400> 34

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<210> 35

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<213> Artificial

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<223> Seqüência alvo

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<223> Seqüência alvo

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<210> 61

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<223> Seqüência alvo

<400> 67

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<210> 68

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<210> 69

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<223> Seqüência alvo

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<210> 72

<211> 19

<212> DNA

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<223> Seqüência alvo

<400> 83

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<210> 85

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<223> Seqüência alvo

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<210> 96

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<210> 99

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<210> 127

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<210> 129

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gtgggtcaca cacacgcact gcgcctgtca gtagtggaca ttgtaatcca gtcggcttgt 1380

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ctcataccac acttacaatt aaggtcaagc ccagaaagtg ataagtgcag ggaggaaaag 1800

tgcaagtcca ttatgtaata gtgacagcaa agggaccagg ggagaggcat tgccttctct 1860

gcccacagtc tttccgtgtg attgtctttg aatctgaatc agccagtctc agatgcccca 1920

aagtttcggt tcctatgagc ccggggcatg atctgatccc caagacatgt ggaggggcag 1980

cctgtgcctg cctttgtgtc agaaaaagga aaccacagtg agcctgagag agacggcgat 2040

tttegggetg agaaggcagt agttttcaaa acacatagtt aaaaaagaaa caaatgaaaa 2100

aaattttaga acagtccagc aaattgctag tcagggtgaa ttgtgaaatt gggtgaagag 2160

cttaggattc taatctcatg ttttttcctt ttcacatttt taaaagaaca atgacaaaca 2220

cccacttatt tttcaaggtt ttaaaacagt ctacattgag catttgaaag gtgtgctaga 2280

acaaggtctc ctgatccgtc egaggctgct tcccagagga gcagctcçcc ccaggcattt 2340

gccaagggag gcggatttcc ctggtagtgt agctgtgtgg ctttccttcc tgaagagtcc 2400

gtggttgccc tagaacctaa caccccctag caaaactcac agagctttcc gtttttttct 2460

ttcctgtaaa gaaacatttc ctttgaactt gattgcctat ggatcaaaga aattcagaac 2520

agcctgcctg tccccccgca ctttttacat atatttgttt catttctgca gatggaaagt 2580

tgacatgggt ggggtgtccc catccagcga gagagtttca aaagcaaaac atctctgcag 2640

tttttcccaa gtaccetgag atacttccca aagcccttat gtttaatcag cgatgtatat 2700

aagccagttc acttagacaa ctttaccctt cttgtccaat gtacaggaag tagttctaaa 2760

aaaaatgcat attaatttct tcccccaaag ccggattctt aattctctgc aacactttga 2820

ggacâtttat gattgtccct ctgggccaat gcttataccc agtgaggatg ctgcagtgag 2880<table>table see original document page 78</column></row><table><table>table see original document page 79</column></row><table>

Claims (47)

1. Método para atenuar a expressão de mRNA de Proteína Relacionada Frizzled-1 de um indivíduo, que compreende:administrar no indivíduo uma composição que compreende umaquantidade eficaz de RNA de interferência que possui um comprimento de19 a 49 nucleotídeos e um veículo farmaceuticamente aceitável, sendo queo RNA de interferência compreende:uma região de pelo menos 13 nucleotídeos contínuos que possuem pelo menos 90% de complementaridade de seqüência a, ou pelo menos 90% de identidade de seqüência com, os 13 penúltimos nucleotídeos da extremidade 3' de um mRNA correspondente a qualquer uma entre SEQ ID N9: 2, SEQ ID N-: 8- SEQ ID N9: 190, e SEQ ID N-: 192,onde a expressão de mRNA de Proteína Relacionada Frizzled-1é atenuada dessa forma.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, onde a composiçãocompreende adicionalmente um segundo RNA de interferência que possuium comprimento de 19 a 49 nucleotídeos e compreende uma região de pelomenos 13 nucleotídeos contínuos que possuem pelo menos 90% de complementaridade de seqüência a, ou pelo menos 90% de identidade de seqüência com, os 13 penúltimos nucleotídeos da extremidade 3' de um segundo mRNA correspondente a qualquer uma entre SEQ ID NQ: 2, SEQ IDN9: 8- SEQ ID N9: 190, e SEQ ID N9: 192.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1, onde o RNA de interferência compreende uma região de pelo menos 14 nucleotídeos contínuos que possuem pelo menos 85% de complementaridade de seqüência a,ou pelo menos 85% de identidade de seqüência com, os 14 penúltimos nucleotídeos da extremidade 3' de um mRNA correspondente a qualquer uma entre SEQ ID N9: 2, SEQ ID N9: 8- SEQ ID N9: 190, e SEQ ID N9: 192.

4. Método, de acordo com a reivindicação 1, onde o RNA de interferência compreende uma região de pelo menos 15, 16, 17, ou 18 nucleotídeos contínuos que possuem pelo menos 80% de complementaridade deseqüência a, ou pelo menos 80% de identidade de seqüência com, os 15,-16, 17, ou 18 penúltimos nucleotídeos, respectivamente, da extremidade 3'de um mRNA correspondente a qualquer uma entre SEQ ID N-: 2, SEQ IDN9: 8- SEQ ID N9: 190, e SEQ ID N9: 192.

5. Método, de acordo com a reivindicação 1, onde o RNA de in-terferência é um shRNA.

6. Método, de acordo com a reivindicação 1, onde a composiçãoé administrada através de uma via tópica, intravítrea, transcleral, periocular,conjuntival, subtenoniana, intracameral, sub-retinal, subconjuntival, retrobul-bar, intracanalicular, ou supracoroidal.

7. Método, de acordo com a reivindicação 1, onde o RNA de in-terferência é administrado através de expressão in vivo a partir de um vetorde expressão capaz de expressar o RNA de interferência.

8. Método, de acordo com a reivindicação 1, onde o RNA de in-terferência é um miRNA.

9. Método, de acordo com a reivindicação 1, onde o RNA de in-terferência é um siRNA.

10. Uso, na preparação de um medicamento para o tratamentode glaucoma em um indivíduo, de uma composição que compreende umaquantidade eficaz de RNA de interferência que possui um comprimento de 19 a 49 nucleotídeos e um veículo farmaceuticamente aceitável, sendo queo RNA de interferência compreende:uma região de pelo menos 13 nucleotídeos contínuos que possuipelo menos 90% de complementaridade de seqüência a, ou pelo menos90% de identidade de seqüência com, os 13 penúltimos nucleotídeos da ex-tremidade 3' de um mRNA correspondente a qualquer uma entre SEQ ID N9:-2, SEQ ID N9: 8 - SEQ ID N9: 190, e SEQ ID N9: 192.

11. Uso, de acordo com a reivindicação 10, onde a composiçãocompreende adicionalmente um segundo RNA de interferência que possuium comprimento de 19 a 49 nucleotídeos e compreende uma região de pelomenos 13 nucleotídeos contínuos que possui pelo menos 90% de comple-mentaridade de seqüência a, ou pelo menos 90% de identidade de seqüên-cia com, os 13 penúltimos nucleotídeos da extremidade 3' de um mRNA cor-respondente a qualquer uma entre SEQ ID N9: 2, SEQ ID N9: 8 - SEQ ID N9: 190, eSEQ IDN9: 192.

12. Uso, de acordo com a reivindicação 10, onde o RNA de inter-ferência compreende uma região de pelo menos 14 nucleotídeos contínuosque possui pelo menos 85% de complementaridade de seqüência a, ou pelomenos 85% de identidade de seqüência com, os 14 penúltimos nucleotídeosda extremidade 3' de um mRNA correspondente a qualquer uma entre SEQID N9: 2, SEQ ID NQ: 8 - SEQ ID N9: 190, e SEQ ID N9: 192.

13. Uso, de acordo com a reivindicação 10, onde o RNA de inter-ferência compreende uma região de pelo menos 15, 16, 17, ou 18 nucleotí-deos contínuos que possui pelo menos 80% de complementaridade de se-qüência a, ou pelo menos 80% de identidade de seqüência com, os 15, 16, 17, ou 18 penúltimos nucleotídeos, respectivamente, da extremidade 3' deum mRNA correspondente a qualquer uma entre SEQ ID N9: 2, SEQ ID N9: 8- SEQ ID N9: 190, e SEQ IDN9: 192.

14. Uso, de acordo com a reivindicação 10, onde o RNA de inter-ferência é um shRNA.

15. Uso, de acordo com a reivindicação 10, onde a composiçãoé preparada para administração tópica, intravítrea, transcleral, periocular,conjuntival, subtenoniana, intracameral, sub-retinal, subconjuntival, retrobul-bar, intracanalicular, ou supracoroidal.

16. Uso, de acordo com a reivindicação 10, onde a composiçãoé preparada para administração via expressão in vivo a partir de um vetor deexpressão capaz de expressar o RNA de interferência.

17. Uso, de acordo com a reivindicação 10, onde o RNA de inter-ferência é um miRNA.

18. Uso, de acordo com a reivindicação 10, onde o RNA de inter-ferência é um siRNA.

19. Uso, de acordo com a reivindicação 10, onde a região depelo menos 13 nucleotídeos contínuos possui pelo menos 90% de comple-mentaridade de seqüência a, ou pelo menos 90% de identidade de seqüên-cia com, os 13 penúltimos nucleotídeos da extremidade 3' de um mRNA cor-respondente a qualquer uma entre SEQ ID N9: 2, SEQ ID Ne: 8 - SEQ ID N9: 190.

20. Uso, de acordo com a reivindicação 10, onde a região depelo menos 13 nucleotídeos contínuos possui pelo menos 90% de comple-mentaridade de seqüência a, ou pelo menos 90% de identidade de seqüên-cia com, os 13 penúltimos nucleotídeos da extremidade 3' de um mRNA cor-respondente a qualquer uma entre SEQ ID N9: 192.

21. Método para atenuar a expressão de mRNA de Proteína Re-lacionada Frizzled-1 de um indivíduo, que compreende:administrar no indivíduo uma composição que compreende umaquantidade eficaz de RNA de interferência que possui um comprimento de 19 a 49 nucleotídeos e um veículo farmaceuticamente aceitável, sendo queo RNA de interferência compreende:um filamento de nucleotídeo sentido, um filamento de nucleotí-deo anti-sentido, e uma região de complementaridade contínua pelo menosquase perfeita de pelo menos 19 nucleotídeos;onde o filamento anti-sentido se hibridiza sob condições fisioló-gicas em uma parte de mRNA correspondente à SEQ ID N9: 1 ou SEQ IDN9: 191, e possui uma região de complementaridade contínua pelo menosquase perfeita de pelo menos 19 nucleotídeos com a parte hibridizante deum mRNA correspondente à SEQ ID N9: 1 ou SEQ ID N9: 191, respectiva-mente.onde a expressão de mRNA de Proteína Relacionada Frizzled-1é atenuada dessa forma.

22. Método, de acordo com a reivindicação 21, onde o filamentoanti-sentido se hibridiza sob condições fisiológicas em uma parte de mRNAcorrespondente à SEQ ID NQ: 1, e possui uma região de complementaridadecontínua pelo menos quase perfeita de pelo menos 19 nucleotídeos com aparte hibridizante de um mRNA correspondente à SEQ ID N9: 1.

23. Método, de acordo com a reivindicação 21, onde o filamentoanti-sentido se hibridiza sob condições fisiológicas em uma parte de mRNAcorrespondente à SEQ ID N9: 191, e possui uma região de complementari-dade contínua pelo menos quase perfeita de pelo menos 19 nucleotídeoscom a parte hibridizante de um mRNA correspondente à SEQ ID N9: 191.

24. Método, de acordo com a reivindicação 21, onde o filamentoanti-sentido do RNA de interferência é designada para marcar um mRNAcorrespondente à SEQ ID N9: 1 que compreende o nucleotídeo 509, 521,-524, 767, 818, 843, 850, 872, 881, 900, 959, 968, 971, 983, 986, 989, 1001,-1016, 1019, 1022, 1031, 1034, 1052, 1088, 1121, 1127, 1207, 1360, 1445,-1450, 1478, 1487, 1524, 1535, 1562, 1579, 1613, 1661, 1667, 1724, 1730,-1753, 1757, 1763, 1771, 1794, 1800, 1813, 1887, 1893, 1916, 2001, 2006,-2106, 2117, 2135, 2142, 2152, 2200, 2203, 2206, 2241, 2263, 2276, 2279,-2389, 2410, 2430, 2464, 2468, 2482, 2502, 2506, 2572, 2645, 2666, 2681,-2697, 2715, 2734, 2760, 2770, 2783, 2797, 2807, 2844, 2917, 2937, 2961,-3005, 3010, 3080, 3130, 3150, 3156, 3179, 3185, 3196, 3244, 3281, 3345,-3350, 3365, 3372, 3403, 3410, 3424, 3428, 3450, 3453, 3460, 3596, 3668,-3672, 3746, 3762, 3776, 3786, 3789, 3826, 3835, 3844, 3847, 3867, 3912,-3924, 3958, 3976, 3981, 4012, 4022, 4071, 4089, 4154, 4157, 4208, 4369,-4375, 4441, 966, 408, 409, 463, 754, 862, 863, 864, 868, 874, 909, 913, 915,-956, 1118, 1135, 1634, 1637, 1640, 1737, 1867, 1868, 2100, 2259, 2260,-2483, 2598, 2673, 2675, 2779, 2985, 2986, 2987, 2988, 3055, 3062, 3161,-3217, 3355, 3623, 3648, 3665, 3817, 4153, ou 4252.

25. Método, de acordo com a reivindicação 21, onde o filamentoanti-sentido do RNA de interferência é designado para marcar um mRNAcorrespondente à SEQ ID NQ: 191 que compreende o nucleotídeo 3352.

26. Método, de acordo com a reivindicação 21, que compreendeadicionalmente administrar no indivíduo um segundo RNA de interferênciaque possui um comprimento de 19 a 49 nucleotídeos e compreende:um filamento de nucleotídeo sentido, um filamento de nucleotí-deo anti-sentido, e uma região de complementaridade pelo menos quaseperfeita de pelo menos 19 nucleotídeos;onde o filamento anti-sentido do segundo RNA de interferênciase hibridiza sob condições fisiológicas em uma segunda parte de mRNA cor-respondente à SEQ ID N9: 1 ou SEQ ID N9: 191, e o filamento anti-sentidopossui uma região de complementaridade contínua pelo menos quase per-feita de pelo menos 19 nucleotídeos com a segunda parte hibridizante demRNA correspondente à SEQ ID N9: 1 ou SEQ ID N9:191, respectivamente.

27. Método, de acordo com a reivindicação 21, onde o filamentode nucleotídeo sentido e o filamento de nucleotídeo anti-sentido são conec-tados por um filamento de nucleotídeo tipo alça.

28. Método, de acordo com a reivindicação 21, onde a composi-ção é administrada através de uma via tópica, intravítrea, transcleral, perio-cular, conjuntival, subtenoniana, intracameral, sub-retinal, subconjuntival,retrobulbar, intracanalicular, ou supracoroidal.

29. Método, de acordo com a reivindicação 21, onde o RNA deinterferência é administrado através de expressão in vivo a partir de um vetorde expressão capaz de expressar o RNA de interferência.

30. Uso, na preparação de um medicamento para o tratamentode glaucoma em um indivíduo, de uma composição que compreende umaquantidade eficaz de RNA de interferência que possui um comprimento de19 a 49 nucleotídeos e um veículo farmaceuticamente aceitável, sendo queo RNA de interferência compreende:um filamento de nucleotídeo sentido, e um filamento de nucleotí-deo anti-sentido, e uma região de complementaridade contínua pelo menosquase perfeita de pelo menos 19 nucleotídeos;onde o filamento anti-sentido se hibridiza sob condições fisioló-gicas em uma parte de mRNA correspondente à SEQ ID N9: 1 ou SEQ IDN9: 191 e possui uma região de complementaridade contínua pelo menosquase perfeita de pelo menos 19 nucleotídeos com a parte hibridizante deum mRNA correspondente à SEQ ID N9: 1 ou SEQ ID N9: 191, respectiva-mente.

31. Uso, de acordo com a reivindicação 30, onde o filamento an-ti-sentido se hibridiza sob condições fisiológicas em uma parte de mRNAcorrespondente à SEQ ID N9: 1, e possui uma região de complementaridadecontínua pelo menos quase perfeita de pelo menos 19 nucleotídeos com aparte hibridizante de um mRNA correspondente à SEQ ID N9: 1.

32. Uso, de acordo com a reivindicação 30, onde o filamento anti-sentido se hibridiza sob condições fisiológicas em uma parte de mRNAcorrespondente à SEQ ID N9: 191, e possui uma região de complementaridade contínua pelo menos quase perfeita de pelo menos 19 nucleotídeoscom a parte hibridizante de um mRNA correspondente à SEQ ID Ns: 191.

33. Uso, de acordo com a reivindicação 30, onde o filamento anti-sentido do RNA de interferência é designado para marcar um mRNA correspondente à SEQ ID N9: 1 que compreende o nucleotídeo 509, 521, 524,-767, 818, 843, 850, 872, 881, 900, 959, 968, 971, 983, 986, 989, 1001, 1016,-1019, 1022, 1031, 1034, 1052, 1088, 1121, 1127, 1207, 1360, 1445, 1450,-1478, 1487, 1524, 1535, 1562, 1579, 1613, 1661, 1667, 1724, 1730, 1753,-1757, 1763, 1771, 1794, 1800, 1813, 1887, 1893, 1916, 2001, 2006, 2106,-2117, 2135, 2142, 2152, 2200, 2203, 2206, 2241, 2263, 2276, 2279, 2389,-2410, 2430, 2464, 2468, 2482, 2502, 2506, 2572, 2645, 2666, 2681, 2697,-2715, 2734, 2760, 2770, 2783, 2797, 2807, 2844, 2917, 2937, 2961, 3005,-3010, 3080, 3130, 3150, 3156, 3179, 3185, 3196, 3244, 3281, 3345, 3350,-3365, 3372, 3403, 3410, 3424, 3428, 3450, 3453, 3460, 3596, 3668, 3672,-3746, 3762, 3776, 3786, 3789, 3826, 3835, 3844, 3847, 3867, 3912, 3924,-3958, 3976, 3981, 4012, 4022, 4071, 4089, 4154, 4157, 4208, 4369, 4375,-4441, 966, 408, 409, 463, 754, 862, 863, 864, 868, 874, 909, 913, 915, 956,-1118, 1135, 1634, 1637, 1640, 1737, 1867, 1868, 2100, 2259, 2260, 2483,-2598, 2673, 2675, 2779, 2985, 2986, 2987, 2988, 3055, 3062, 3161, 3217,-3355, 3623, 3648, 3665, 3817, 4153, ou 4252.

34. Uso, de acordo com a reivindicação 30, onde o filamento anti-sentido do RNA de interferência é designado para marcar um mRNA correspondente à SEQ ID N9: 191 que compreende o nucleotídeo 3352.

35. Uso, de acordo com a reivindicação 30, que compreendeadicionalmente administrar no indivíduo um segundo RNA de interferênciaque possui um comprimento de 19 a 49 nucleotídeos e compreende:um filamento de nucleotídeo sentido, um filamento de nucleotídeo anti-sentido, e uma região de complementaridade pelo menos quaseperfeita de pelo menos 19 nucleotídeos;onde o filamento anti-sentido do segundo RNA de interferênciase hibridiza sob condições fisiológicas em uma segunda parte de mRNA correspondente à SEQ ID Ne: 1 ou SEQ ID N9: 191, e o filamento anti-sentido possui uma região de complementaridade contínua pelo menos quase perfeita de pelo menos 19 nucleotídeos com a segunda parte hibridizante de mRNA correspondente à SEQ ID NQ: 1 ou SEQ ID Ng: 191, respectivamente.

36. Uso, de acordo com a reivindicação 30, onde o filamento denucleotídeo sentido e o filamento de nucleotídeo anti-sentido são conectadospor um filamento de nucleotídeo tipo "loop".

37. Uso, de acordo com a reivindicação 30, onde a composiçãoé preparada para administração tópica, intravítrea, transcleral, periocular,conjuntival, subtenoniana, intracameral, sub-retinal, subconjuntival, retrobulbar, intracanalicular, ou supracoroidal.

38. Uso, de acordo com a reivindicação 30, onde a composiçãoé preparada para administração via expressão in vivo a partir de um vetor deexpressão capaz de expressar o RNA de interferência.

39. Método para atenuar a expressão de mRNA de Proteína Relacionada Frizzled-1 de um indivíduo, que compreende:administrar no indivíduo uma composição que compreende umaquantidade eficaz de RNA de interferência de um RNA de interferência defilamento simples que possui um comprimento de 19 a 49 nucleotídeos, eum veículo farmaceuticamente aceitável,onde o RNA de interferência de filamento simples se hibridizasob condições fisiológicas em uma parte de mRNA correspondente à SEQID N-: 1 que compreende o nucleotídeo 509, 521, 524, 767, 818, 843, 850,-872, 881, 900, 959, 968, 971, 983, 986, 989, 1001, 1016, 1019, 1022, 1031,-1034, 1052, 1088, 1121, 1127, 1207, 1360, 1445, 1450, 1478, 1487, 1524,-1535, 1562, 1579, 1613, 1661, 1667, 1724, 1730, 1753, 1757, 1763, 1771,-1794, 1800, 1813, 1887, 1893, 1916, 2001, 2006, 2106, 2117, 2135, 2142,-2152, 2200, 2203, 2206, 2241, 2263, 2276, 2279, 2389, 2410, 2430, 2464,-2468, 2482, 2502, 2506, 2572, 2645, 2666, 2681, 2697, 2715, 2734, 2760,-2770, 2783, 2797, 2807, 2844, 2917, 2937, 2961, 3005, 3010, 3080, 3130,-3150, 3156, 3179, 3185, 3196, 3244, 3281, 3345, 3350, 3365, 3372, 3403,-3410, 3424, 3428, 3450, 3453, 3460, 3596, 3668, 3672, 3746, 3762, 3776,-3786, 3789, 3826, 3835, 3844, 3847, 3867, 3912, 3924, 3958, 3976, 3981,-4012, 4022, 4071, 4089, 4154, 4157, 4208, 4369, 4375, 4441, 966, 408, 409,-463, 754, 862, 863, 864, 868, 874, 909, 913, 915, 956, 1118, 1135, 1634,-1637, 1640, 1737, 1867, 1868, 2100, 2259, 2260, 2483, 2598, 2673, 2675,-2779, 2985, 2986, 2987, 2988, 3055, 3062, 3161, 3217, 3355, 3623, 3648,-3665, 3817, 4153, ou 4252, e o RNA de interferência possui uma região decomplementaridade contínua pelo menos quase perfeita de pelo menos 19nucleotídeos com a parte hibridizante de mRNA correspondente à SEQ IDN9:1;ouonde o RNA de interferência de filamento simples se hibridizasob condições fisiológicas em uma parte de mRNA correspondente à SEQ 15 ID Ne: 191 que compreende o nucleotídeo 3352, e o RNA de interferênciapossui uma região de complementaridade contínua pelo menos quase per-feita de pelo menos 19 nucleotídeos com a parte hibridizante de mRNA cor-respondente à SEQ ID NQ: 191;onde a expressão de mRNA de Proteína Relacionada Frizzled éatenuada dessa forma.

40. Método, de acordo com a reivindicação 39, onde a composi-ção é administrada através de uma via tópica, intravítrea, transcleral, perio-cular, conjuntival, subtenoniana, intracameral, sub-retinal, subconjuntival,retrobulbar, intracanalicular, ou supracoroidal.

41. Método, de acordo com a reivindicação 39, onde o RNA deinterferência é administrado em expressão in vivo a partir de um vetor deexpressão capaz de expressar o RNA de interferência.

42. Uso, de acordo com a reivindicação 39, onde o RNA de inter-ferência é um miRNA.

43. Uso, de acordo com a reivindicação 39, onde o RNA de inter-ferência é um siRNA.

44. Composição que compreende um RNA de interferência quepossui um comprimento de 19 a 49 nucleotídeos, e compreende uma se-qüência de nucleotídeo correspondente à qualquer uma entre SEQ ID N9: 2,SEQ ID N9: 8- SEQ ID N9: 190, e SEQ ID N9: 192, ou um complemento des-ta; e um veículo farmaceuticamente aceitável.

45. Composição, de acordo com a reivindicação 44, onde o RNAde interferência é um shRNA.

46. Composição, de acordo com a reivindicação 44, onde o RNAde interferência é um siRNA.

47. Composição, de acordo com a reivindicação 44, onde o RNAde interferência é um miRNA.