BRPI0518489B1 - Cloreto de (2R)-DOTAP enantiomericamente puro, seu uso, e composição farmacêutica - Google Patents

Cloreto de (2R)-DOTAP enantiomericamente puro, seu uso, e composição farmacêutica Download PDF

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Alfred Hedinger
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Abstract

modificações cristalinas estáveis de cloreto de dotap. a presente invenção refere-se a cloreto de dotap puro em termos enantioméricos e modificações cristalinas estáveis de cloreto de (2r,s)-, (2s)- e (2r)-dotap, um processo para a preparação destas modificações, e o uso deles como um constituinte para a preparação de medicamentos.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para CLORETO DE (2R)-DOTAP ENANTIOMERICAMENTE PURO, SEU USO, E COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA.
[0001] A presente invenção se refere ao cloreto de DOTAP puro em termos enantioméricos, e modificações dos cristais do cloreto de DOTAP racêmico e puro em termos enantioméricos, um processo para sua preparação, e o seu uso para a preparação de composições farmacêuticas.
[0002] O cloreto de DTPA acima e abaixo denota o cloreto de N,N,N-trimetil-2,3-bis-[[(9Z)-1-oxo-9-octadecenil]óxi]-1-propanamínio, também conhecido como cloreto de (Z,Z)-N,N,N-trimetil-2,3-bis-[(1oxo-9-octadecenil)óxi]-1-propanamínio ou cloreto de 1,2-dioleoilóxi-3trimetil-amônio-propano, e seus hidrates, o
Figure BRPI0518489B1_D0001
C42H80CINO4,
Peso Molecular 698,54
Números CAS: 132172-61-3 e 477274-39-8 (racemato), 197974-73-58 (racemato, monoidratado) 428506-51-8 (forma 2S), 328250-28-8 (forma 2R) [0003] Os lipossomas são vesículas sintéticas em múltiplas camadas (membranas esfericamente independentes), compreendendo substâncias ambifílicas, usualmente lipídeos naturais, dentro dos quais substâncias hidrofílicas podem ser encapsuladas dentro do interior aquoso, e também substâncias lipofílicas podem ser incorporadas dentro da membrana lipídica.
[0004] Eles são empregados particularmente em cosméticos e em medicina, especialmnte em dermatologia. Neste caso, vitaminas, coenzimas, agentes para tratamento da pele, e filtros solares, específi
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2/14 cos, são embutidos. Os liposssomas são aplicados geralmente por via tópica.
[0005] Entretanto, os lipossomas estão adquirindo crescentemente uma importância adicional na tecnologia farmacêutica, pois a aplicação parenteral dos lipossomas permite que seja conseguida uma distribuição para órgãos mais específica do que se os compostos fossem usados na forma livremente dissolvida.
[0006] Caso DNA, RNA ou proteínas sejam incorporados, são obtidos lipoplexos.
[0007] A adição de óleos e o uso de homogeneizadores de alta pressão permitem que a formação das assim denominadas nanopartículas (nanopartes) seja forçada a partir de lipossomas. Elas são partículas com um tamanho aproximadamente igual ao dos lipossomas, mas não têm uma fase aquosa, e em vez disso, uma fase oleosa em seu interior. Elas são particularmente apropriadas para a encapsulação de substâncias lipofílicas.
[0008] As microemulsões são sistemas monofásicos dispersados de forma coloidal, compreendendo componentes aquosos, componentes semelhantes a lipídeos e componentes tensoativos. Elas têm um tamanho de partícula de 1-500 nm e se comportam de uma maneira similar a líquidos.
[0009] Especialmente com relação a compostos peptídicos ativos, nucleotídeos, vacinas e outros produtos biofarmacêuticos, que normalmente têm baixa solubilidade, o efeito favorável à solubilização tem uma importância muito grande no caso das aplicações descritas acima.
[00010] Além disso, a degradação dos compostos ativos no corpo pode ser desacelerada e um efeito de liberação prolongada pode ser conseguido desta maneira.
[00011] O cloreto de DOTAP pertence à classe de lipídeos catiôni
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3/14 cos. Em contraste com os fosfolipídeos de ocorrência natural, eles não têm caráter bipolar. Os lipossomas que compreendem lipídeos catiônicos, seja isoladamente ou em combinação com fosfolipídeos ou outros compostos semelhantes a lipídeos, têm uma superfície positivamente carregada. Isto gera alta afinidade por células que têm uma superfície negativamente carregada no exterior, como por exemplo, as células endoteliais.
[00012] Particularmente importante, entretanto, é a capacidade de os lipossomas e lipoplexos à base de DOTAP e outros lipossomas e lipoplexos penetrarem dentro das células, e assim sendo, transportar os compostos ativos incorporados dentro deles para dentro do interior da célula (transfecção).
[00013] Todas essas propriedades tornam o cloreto de DOTAP muito interessante também para a terapia de câncer. Essas propriedades geram a possibilidade de aplicar agentes citostáticos convencionais incorporados em lipossomas catiônicos de DOTAP.
[00014] As propriedades de transfecção do cloreto de DOTAP e outros sais de DOTAP, tais como, por exemplo, o acetato, brometo, fosfato diácido, sulfato ácido, iodeto, mesilato, metil-sulfato, triflúoracetato, sulfato ou dissulfato e triflato, são adequadamente conhecidas através da literatura.
[00015] O fosfato diácido de DOTAP e o mesilato de DOTAP estão mencionados na literatura apenas como racemato. Todos os outros sais mencionados acima são mencionados como racematos e um enantiômero 2S, e além disso, são mencionados os enantiômeros 2R do cloreto e do metil-sulfato.
[00016] Em alguns estudos in vitro, outros sais, tais como, por exemplo, metil-sulfato de DOTAP, conseguiram taxas de transfecção melhores do que o cloreto de DOTAP.
[00017] Usada in vivo, entretanto, a troca aniônica na superfície dos
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4/14 lipossomas ocorre no corpo vivo, significando que as vantagens de outros sais não surgem neste caso. Especialmente em uso médico em seres-humanos, e particularmente para aplicação parenteral, os sais de DOTAP com ânions fisiologicamente aceitáveis, tais como, por exemplo, o cloreto ou o acetato correspondente, são, portanto, preferidos.
[00018] As aplicações médicas, e particularmente as aplicações parenterais, exigem os padrões mais altos de qualidade e pureza dos compostos ativos e adjuvantes usados. Existem, portanto, regras muito rígidas por parte das autoridades quanto à preparação, reprodutibilidade da preparação, e perfil dos subprodutos desses compostos. No caso de substâncias usadas por via parenteral, a contaminação microbiológica por microorganismos patogênicos e endotoxinas deve ser, além disso, estritamente evitada e controlada.
[00019] O cloreto de DOTAP e outros sais de DOTAP são extremamente instáveis e são, portanto, em si difíceis de preparar com uma pureza aceitável, de tal modo que eles sejam apropriados para uso para a preparação de uma formulação de medicamento.
[00020] Da mesma forma que todos lipídeos veículos de radicais de ácido oléico, tais como, por exemplo, os fosfolipídeos naturais DOPC e DOPE, todos sais de DOTAP são muito sensíveis à oxidação. Entretanto, os produtos da oxidação de derivados de ácidos graxos insaturados têm geralmente alta toxicidade.
[00021] Métodos apropriados de preparação e purificação são necessários neste caso. O acetato de DOTAP, por exemplo, existe na forma de um óleo com alto ponto de ebulição, e pode ser, portanto, obtido industrialmente apenas com grande dificuldade na qualidade adequada.
[00022] Os métodos convencionais para superar a instabilidade, tais como, por exemplo, a adição de antioxidantes na forma de ácido
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5/14 ascórbico ou L-glutationa reduzida, restringem muito a possibilidade de utilizar geralmente o cloreto de DOTAP, pois as interações com os compostos ativos a serem embutidos posteriormente não podem ser excluídas. A exclusão completa de oxigênio durante a preparação, estocagem e uso é virtualmente impossível, ou pode apenas ser facilitada com esforço muito grande.
[00023] O cloreto de DOTAP está disponível comercialmente apenas como uma solução em clorofórmio ou como um sólido amorfo.
[00024] Além da sua sensibilidade à oxidação, o cloreto de DOTAP amorfo é também extremamente higroscópico e deliquesce dentro de um tempo extremamente curto em níveis normais de umidade atmosférica, para dar um filme grasso. Isto torna o manuseio deste composto muito mais difícil.
[00025] Assim sendo, o fabricante do cloreto de DOTAP amorfo recomenda geralmente a estocagem sob um gás protetor a -20 °C e garante apenas um prazo de validade de cerca de 6 meses.
[00026] A literatura revela apenas várias rotas de síntese para a preparação de cloreto de DOTAP amorfo racêmico:
[00027] Eibel e Unger, documento no DE 4013632A1, delineiam a síntese de cloreto de DOTAP a partir de brometo de DOTAP por troca iônica no sistema de solventes clorofórmio/metanol/solução aquosa de HCl, e em seguida, purificação por meio de cromatografia. O brometo de DOTAP é obtido previamente in situ a partir de 1-bromo-2,3dioleoilóxi-propano.
[00028] Leventis e Silvius, Biochim. Biophys. Acta, 1023:124-132 (1990), relatam a síntese de cloreto de DOTAP a partir de iodeto de DOTAP por troca iônica no sistema bifásico solvente/solução de NaCl. O iodeto de DOTAP é obtido previamente por metilação do composto dimetil-amino correspondente por meio de iodeto de metila.
[00029] Nantz et al., Biochim. Biophys. Acta, 1299:281-283 (1996),
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J. Med. Chem. 40:4069-4078 (1997), descrevem a síntese de cloreto de DOTAP por cromatografia não-aquosa trocadora de íons. O composto desejado é obtido por evaporação do eluído.
[00030] Felgner et al., patente no US 5.264.618, conduzem a metilação do composto dimetil-amino correspondente diretamente para cloreto de DOTAP por meio de cloreto de metila. Eles obtêm aparentemente uma cera amarela por cristalização em acetonitrila a -20 °C. Entretanto, o cloreto de DOTAP é virtualmente insolúvel em acetonitrila à temperatura ambiente. As tentativas para reproduzir esta assim denominada cristalização deram apenas o material amorfo através de solidificação da substância oleosa obtida a partir da solução quente após resfriamento. O fato de que isto não é uma cristalização também fica evidente a partir do fato de que os autores aparentemente não conseguiram um efeito de purificação e têm de purificar a substância por cromatografia.
[00031] Consequentemente, nenhuma das rotas de síntese para a preparação dos dois cloretos de DOTAP enantioméricos, nem suas propriedades, são conhecidas até agora. Embora o compêndio Chemical Abstracts tenha designado números para os dois enantiômeros, as publicações correspondentes descrevem exclusivamente o trabalho com cloreto de DOTAP racêmico.
[00032] Particularmente, se os compostos são intencionados para uso parenteral, uma preparação que inclui tratamento com resina trocadora de íons é extremamente problemática em virtude da possível contaminação microbiológica, pois as resinas correspondentes são um meio nutriente ideal para bactérias, e mesmo depois que elas tenham sido exterminadas, ainda permanece um risco de contaminação por endotoxinas.
[00033] O objeto da presente invenção é, portanto, fornecer sais cloreto de DOTAP e os hidratos com alta pureza e com adequada es
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7/14 tabilidade química e física. Um outro objeto da presente invenção é fornecer esses sais com longos prazos de validade, permitindo que eles sejam usados para a preparação de formulações farmacêuticas. Continua existindo uma alta demanda por um processo reprodutível para a preparação de formas estáveis de sais cloreto de DOTAP e hidratos, que pode ser conduzido em uma escala industrial.
[00034] O cloreto de DOTAP puro em termos enantioméricos pode ser obtido a partir de matérias-primas puras em termos enantioméricos de forma análoga aos processos descritos para o racemato, isto é via (R ou S)-1-cloro-2,3-dioleoilóxi-propano, via (R ou S)-1-LG-2,3dioleoilóxi-propano e troca iônica (LG = grupo de saída) ou via (R ou S)-1-dimetil-amino-2,3-dioleoilóxi-propano.
[00035] Um outro método de preparação que pode ser mencionado é a resolução do racemato do cloreto de DOTAP racêmico.
[00036] Por meio de experimentos, constatou-se agora, surpreendentemente, que o cloreto de DOTAP cristalino racêmico e também puro em termos enantioméricos pode ser obtido de uma maneira simples com alta pureza química e excelente estabilidade. Os produtos cristalinos obtidos desta maneira têm estabilidade virtualmente ilimitada à temperatura ambiente sob um gás protetor. Eles são, portanto, apropriados como constituintes ou como matérias-primas para a preparação de formas medicamentosas.
[00037] A presente invenção, consequentemente, se refere ao cloreto de DOTAP puro em termos enantioméricos e modificações cristalinas estáveis do cloreto de DOTAP racêmico e puro em termos enantioméricos.
[00038] As modificações cristalinas estáveis podem ser na forma cristalina e parcialmente cristalina. Elas têm uma pureza nunca atingida até agora de > 98%, junto com uma estabilidade nunca atingida até agora de > 98% em relação ao valor de partida depois da estocagem
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8/14 por 12 meses com exclusão de ar a 25 °C e 60% de umidade atmosférica relativa. (vide a este respeito a Tabela 1). As modificações cristalinas do cloreto de DOTAP têm um teor menor do que 1 equivalente de agia ou solvente de cristalização por equivalente de cloreto de DOTAP.
[00039] As modificações cristalinas do cloreto de DOTAP racêmico existem, por exemplo, em três modificações de cristais (tipo I, tipo II, e tipo III) e apresentam bandas moderadamente acentuadas em medições de difração de raios X de pó (vide a este respeito a Figura 1 até Figura 3 e tabela 2).
[00040] Os valores de 2 teta selecionados para as várias modificações cristalinas são 12,6, 19,5, 20,2, 21,5 e 25,2 (tipo I); ou 3,3, 4,9, 19,3, 20,0 e 23,5 (tipo II); ou 2,8, 5,8, 20,0, 21,2 e 25,1 (tipo III).
[00041] Os cloretos de DOTAP puros em termos enantioméricos são obtidos similarmente na forma cristalina. Os valores de 2 teta selecionados para a modificação cristalina encontrados são 12,8, 19,4, 19,8, 20,2, e 21,5 (tipo IV, vide, a este respeito, a Figura 4).
[00042] Os enantiômeros são opticamente ativos. Assim sendo, o cloreto de (2S)-DOTAP tem uma rotação óptica de -2.12°, o cloreto de (2R)-DOTAP tem uma rotação óptica de +2.12° ([«]d a 20 °C, solução a 1% em dicloro-metano).
[00043] A invenção se refere ainda a um processo para a preparação de modificações cristalinas do cloreto de DOTAP, que se caracteriza pelo fato de que o cloreto de DOTAP é cristalizado em um meio aprótico. O meio aprótico usado para este propósito pode ser solventes apróticos ou misturas deles.
[00044] O meio aprótico pode compreender solventes apróticos, tais como, por exemplo, água, em pequenas quantidades. Em casos excepcionais, 25% em peso de solventes apróticos também podem estar presentes sob condições apropriadas. A cristalização dos cloretos de
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DOTAP pode ser conduzida neste caso diretamente a partir da solução da reação sem purificação prévia. Similarmente, o cloreto de DOTAP cristalino pode ser obtido por recristalização do material amorfo, parcialmente cristalino ou cristalino.
[00045] Os solventes apróticos apropriados são, particularmente, éteres, tais como, por exemplo, tetraidrofurano, metiltetraidrofurano, dioxano, dietil éter, dipropil éter, diisopropil éter e metil-t-butil-éter, cetonas, tais como, por exemplo, acetona e 2-butanona, metil-isobutilcetona, metil-isopropil-cetona,nitrilas, tais como, por exemplo, acetonitrila, e ésteres, tais como, por exemplo, formiato de etila, acetato de metila, acetato de etila, acetato de propila, acetato de isopropila, acetato de butila, acetato de isobutila, carbonato de dimetila, carbonato de dietila, e 1,3-dioxolidin-2-ona.
[00046] Estes solventes podem ser, em cada caso, usados na forma pura ou na forma de uma mistura; isto é, é possível usar os vários solventes apróticos em um grupo na forma de uma mistura e também empregar tipos de solventes apróticos na forma de uma mistura deles. Como já indicado acima, adições de solventes próticos podem estar presentes no solvente aprótico ou na mistura de solventes apróticos usada.
[00047] As adições de solventes próticos deste tipo podem consistir essencialmente nos seguintes solventes:
álcoois, tais como, por exemplo, metanol, etanol, n-propanol, isopropanol, n-butanol, isobutanol, 2-butanol, t-butanol, 3-metil-1-butanol e etilenoglicol, metóxi-etanol, etóxi-etanol, ou água. [00048] As adições de solventes próticos podem ser, por sua vez, adições de solventes puros ou de misturas desses solventes próticos. [00049] A cristalização das modificações do cloreto de DOTAP é realizada de forma geral especificamente pelo resfriamento lento da solução preparada até temperaturas abaixo de 30 °C. A formação dos
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10/14 cristais é conduzida espontaneamente ou por inoculação com a modificação cristalina correspondente do cloreto de DOTAP.
[00050] As várias modificações cristalinas do cloreto de DOTAP podem ser convertidas umas nas outras. As conversões podem ser realizadas por tratamentos térmicos das modificações cristalinas isoladas em temperatura elevada ou por agitação prolongada de suas suspensões sob condições de cristalização.
[00051] O uso de cloreto de DOTAP amorfo ou parcialmente cristalino como material de partida para a recristalização dá, pelo processo descrito, cloretos de DOTAP essencialmente cristalinos com uma pureza nunca conseguida até agora, junto com uma estabilidade nunca conseguida até agora.
[00052] A invenção se refere também ao uso de cloretos de DOTAP cristalinos para a preparação de formulações de medicamentos, pois os cloretos de DOTAP cristalinos têm excelente estabilidade na forma sólida sob as condições mencionadas e têm qualidade constante e muito boa por um tempo virtualmente ilimitado.
[00053] Além disso, os cloretos de DOTAP puros em termos enantioméricos têm propriedades físicas diferentes do racemato, particularmente em combinação com compostos quirais, tais como fosfolipídeos ou colesterol.
[00054] As propriedades inusitadas encontradas para os cloretos de DOTAP puros em termos enantioméricos podem ser utilizadas vantajosamente, sozinhas ou em combinação com fosfolipídeos apropriados, colesterol e seus derivados, para produzir graus inusitados de lipossomas, os quais, em comparação com as formas convencionais, por um lado, representam recheios mais compactos dos lipídeos e, por outro lado, têm uma estrutura mais uniforme. Assim sendo, os lipossomas preparados a partir de enantiômeros puros apresentam uma temperatura de transição de fase principal 5 °C mais alta em compara
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11/14 ção com os lipossomas que compreendem cloreto de DOTAP racêmico. Isso é uma medida da densidade da compactação do recheio. Os lipossomas que compreendem enantiômeros do cloreto de DOTAP têm também, portanto, vazamento reduzido do composto incorporado neles.
[00055] Isto tem a consequência de que os lipossomas carregados compostos farmaceuticamente ativos liberarão os compostos ativos de uma maneira retardada em interação com o metabolismo do corpo humano ou animal. Particularmente, os compostos ativos sensíveis podem ser assim vantajosamente transportados de uma maneira mais específica para o local ou órgão desejado, onde a ação do medicamento é desejada.
[00056] Os enantiômeros do cloreto de DOTAP apresentam também, particularmente em combinação com lipídeos quirais, tais como fosfolipídeos, colesterol e seus derivados, propriedades de transfecção que diferem especificamente para a linhagem de células.
[00057] Para a preparação desses lipossomas inusitados, é possível para os versados nessas técnicas selecionarem especificamente uma forma ou uma certa proporção de mistura dos cloretos de DOTAP assim produzidos para preparar lipossomas que têm certas propriedades inusitadas.
[00058] A invenção, consequentemente, se refere também ainda a composições farmacêuticas resultantes do uso das formas de cloretos de DOTAP reivindicadas. As composições farmacêuticas deste tipo podem compreender modificações cristalinas de (2R,S)-, (2S)- e (2R)cloreto de DOTAP, junto com outros compostos farmacêuticos ativos e adjuvantes conhecidos empregados usualmente em preparações de medicamentos, bem como um ou mais solventes.
[00059] Estas composições farmacêuticas podem estar, por exemplo, na forma de lipossomas, lipoplexos, microemulsões e nanopartícu
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12/14 las, e incluem, por exemplo, um composto ativo do grupo dos peptídeos, nucleotídeos, vacinas ou agentes citostáticos.
[00060] A presente descrição permite que os versados nessas técnicas apliquem a invenção de uma maneira abrangente. Além disso, os exemplos que se seguem servem compreende melhor a invenção e para ilustrar possíveis variações da invenção. Esses exemplos não devem ser de forma alguma tidos como restritivos.
[00061] Todas temperaturas mencionadas nos exemplos que se seguem estão indicadas em graus Celsius. A menos que diferentemente indicado, os dados de teores são fornecidos como % em peso. Exemplos Ilustrativos da Invenção
Exemplo 1 Estabilidades [00062] Para determinar a estabilidade dos cloretos de DOTAP cristalinos, as substâncias são estocadas junto com amostras comparativas a 25 °C e 60% de umidade relativa com exclusão de ar. O teor remanescente de cloreto de DOTAP é medido em intervalos periódicos e comparado com o valor inicial.
[00063] A pureza e o teor de cloreto de DOTAP são determinados por meio de HPLC. Para o tipo I, os seguintes valores são encontrados:
[00064] A determinação da estabilidade pode ser repetida em qualquer tempo desejado; os valores indicados na Tabela 1 são reprodutíveis.
Tabela 1
Cloreto de (R,S)DOTAP cristalino tipo I Tempo de Exposição em Meses
2
Área % 00% 00,0% 00,0% 00,0% 00,0% 00,0%
% em peso 8,6% 7% 7,9% 7,2% 8,2% 8,7%
Exemplo 2 [Diagramas de Raios X de Pó] [00065] Para a caracterização das propriedades estruturais (modifi
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13/14 cações cristalinas) dos cloretos de DOTAP cristalinos, os diagramas de raios X de pós (espectros de difração) destas substâncias são registrados.
[00066] Os cloretos de DOTAP cristalinos deram espectros com bandas moderadamente pronunciadas que têm resolução relativamente boa para lipídeos. Os espectros indicam altos teores cristalinos. Nenhuma fração amorfa é visível sob o microscópio polarizador.
[00067] Os exemplos de espectros estão ilustrados na Figura 1 (tipo I), Figura 2 (tipo II), Figura 3 (tipo III) e Figura 4 (tipo IV ).
[00068] Para comparação, um espectro de uma amostra amorfa disponível comercialmente está ilustrado na Figura 5 (amorfo).
[00069] A Tabela 2 lista os valores de 2 tetas selecionados para as várias modificações cristalinas de cloretos de DOTAP racêmico e puro em termos enantiomérico:
Tabela 2
Tipo Valores de 2 teta Selecionados
Tipo I Tipo II Tipo III racêmico 12,6, 19,5, 20,2, 21,5 e 25,2 3,3, 4,9, 19,3, 20,0 e 23,5 2,8, 5,8, 20,0, 21,2 e 25,1
Tipo IV puro em termos enantioméricos 12,8, 19,4, 19,8, 20,2, e 21,5
Exemplo 3 Temperaturas de transição de fase principal [00070] Medições de calorimetria de varredura diferencial (DSC) são conduzidas em lipossomas multilamelares em água. Os lipossomas são preparados pelo método de película fina a partir de quantidades calculadas de cloreto de DOTAP racêmico ou puro em termos enantioméricos. A concentração de lipídeo neste experimento, em cada caso, é de 0,1 g/mL. Quantidades apropriadas dessas dispersões são então introduzidas em cadinhos de alumínio e medidas usando um calorímetro Phoenix 204 (Netzsch, Selb, Alemanha). Em cada caso, foram conduzidas três corridas sucessivas de aquecimento/resfriamento entre -50 °C e +20 °C a 1 °C/min.
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14/14 [00071] Para todas três variantes de cloreto de DOTAP, as temperaturas de transição de fase abaixo de 0 °C são encontradas. Para os ciclos de resfriamento, elas são, em cada caso, entre -23 °C e -24 °C. As diferenças entre cloreto de DOTAP racêmico e puro em termos enantioméricos são, em cada caso, evidentes nos ciclos de aquecimento. O (2R)-cloreto de DOTAP e cloreto de (2S)-DOTAP apresentam uma transição de fase endotérmica ao redor de -12.5 °C, enquanto que a transição de fase para o racemato é a -17.5 °C (vide Figura
6).
Exemplo 4 Propriedades de Transfecção em Células COS-7 [00072] O cloreto de DOTAP racêmico e puro em termos enantioméricos e o metil-sulfato de DOTAP racêmico são dispersados com a mesma quantidade de colesterol no meio de transfecção e tratados com ultra-som. Os lipossomas e a solução de plasmídeo GFP são misturados e incubados por 15 minutos; quantidades por 6 cavidades: 2 pg de plasmídeo/8 pg de lipídeo.
[00073] Depois da incubação por 5 h, o sobrenadante é removido das células por sucção a 37 °C/5% de CO2, 2 mL de meio fresco são adicionados, e a mistura é incubada por mais 20 h. Depois da elaboração, a análise FACS indica transfecção eficiente para todos lipoplexos. Uma diferença significativa entre as taxas de transfecção para as misturas de lipídeos individuais fica evidente:
Complexo de cloreto de (R)-DOTAP/colesterol: 32,4%
Complexo de cloreto de (S)-DOTAP/colesterol: 11,0%
Complexo de cloreto de (R,S)-DOTAP/colesterol: 25,9%
Complexo de metil-sulfato de (R,S)-DOTAP/colesterol: 20,2%

Claims (5)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Composto, caracterizado pelo fato de que consiste em cloreto de (2R)-1,2-dioleoilóxi-3-trimetilamôniopropano (cloreto de (2R)-DOTAP) enantiomericamente puro.
  2. 2. Uso de um composto, como definido na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é como um constituinte para a preparação de medicamentos.
  3. 3. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende um composto, como definido na reivindicação 1, junto com compostos farmacêuticos ativos, adjuvantes ou um solvente, com a condição de que a composição é substancialmente isenta de cloreto de (2S)-DOTAP.
  4. 4. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um ou mais peptídeos, nucleotídeos, vacinas ou agentes citostáticos, ou uma mistura dos mesmos.
  5. 5. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um ou mais lipossomas, lipoplexos, nanopartículas ou microemulsões, ou uma mistura dos mesmos.
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