BRPI0504945B1 - Método para a produção de flavivirus recombinante contendo sequências de nucleotídeos codificantes de uma proteína heteróloga, constructo de dna, flavivirus, e, composição vacinal para imunizar contra flavivirus e/ou outros patógenos - Google Patents

Abstract

MÉTODO PARA À PRODUÇÃO DE VÍRUS RECOMBINANTE CONTENDO SEQÜÊNCIAS DE NUCLEOTÍDEOS CODIFICANTES DO TODO OU PARTE DE PROTEÍNAS HETERÓLOGAS, CONSTRUCTOS DE DNA, VÍRUS RECOMBINANTES RESULTANTES E COMPOSIÇÕES VACINAIS CONTENDO TAIS VÍRUS RECOMBINANTES PARA IMUNIZAR CONTRA FLAVIVIRUS E/OU OUTROS PATÓGENOS. O objeto da presente invenção é a produção de vírus recombinante pela clonagem e expressão de seqüências de nucleotídeos codificantes do todo ou parte de proteínas heterólogas, através do seguinte método: a) Modificação de seqüências nucleotídicas heterólogas de forma que as mesmas, ao serem clonadas e expressas no vírus vetor, possuam, na sua porção 5', nucleotídeos presentes no extremo 5' do gene NS1 deste vírus vetor ou de outros vírus ou seqüências funcionalmente equivalentes, e na sua porção 3', a região genômica correspondente ao todo ou parte dos domínios de haste e ancora da proteína E deste vírus vetor ou de outros vírus ou seqüências funcionalmente equivalentes, e assim não comprometendo a estrutura e a replicação do dito vírus vetor; b) Inserção das seqüência heterólogas modificadas em (a) na região intergênica ao nível da proteína estrutural E e da não estrutural NS1 do vírus vetor; c) Obtenção de vírus recombinante não patogênico e detentor de propriedades imunológicas, contendo as seqüências heterólogas estavelmente integradas (...).

Description

[001] A presente invenção está relacionada à manipulação genética de vírus, incluindo, mas não limitado à, Flavivirus, preferencialmente o vírus amarílico vacinai cepa 17D ou seus derivados; resultando em vírus recombinantes contendo inserções de nucleotídeos heterólogos provenientes de outros patógenos entre os genes que codificam as proteínas virais E e NS1. Tais vírus recombinantes, em decorrência das suas características de atenuação, imunogenicidade e estabilidade genética, podem ser aplicados no desenvolvimento de vacinas vivas atenuadas para uso humano e animal, conferindo resposta imune não apenas em relação à Febre Amarela ou outra doença ocasionada por vírus, como também em relação às doenças provocadas pelos ditos outros patógenos.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[002] A família Flaviviridaeinclui três gêneros: Flavivirus, tendo como principais representantes o vírus da febre amarela, os vírus da dengue, o vírus da encefalite japonesa; o gênero Hepacivírus (vírus da hepatite C) e o gênero Pestivírus (vírus da diarréia bovina). Embora pertençam a diferentes gêneros, com propriedades biológicas distintas e sem apresentarem reatividade sorológica cruzada, os vírus dos 3 gêneros compartilham grande semelhança na morfologia virai, na organização genômica e na estratégia de replicação (Rice, C. M. 1996. Flaviviridae: the víruses and their replication., Third ed, vol. 1. Lippincott-Raven, Philadelphia, PA). O vírus da febre amarela é o protótipo do gênero Flavivírus da família Flaviviridae, que inclui cerca de 70 vírus. Os flavivírus são pequenos (40-60 nm), esféricos, envelopados, com genoma RNA de fita simples, sendo a maioria destes arbovírus assim denominados por serem transmitidos por vetores artrópodes ("arthropod-borne víruses"), como mosquitos ou carrapatos, causando importantes doenças em homens e animais.

[003] A Figura 1 apresenta a organização genômica dos Flavivírus (Chambers, T. J., C. S. Hahn, R. Galler, and C. M. Rice. 1990. Flavivírus genome organization, expression, and replication. Annu Rev Microbiol 44:649-88). O genoma é representado na parte superior, com a indicação das seqüências 5' e 3'não-traduzidas e a fase de leitura aberta de 10.862 nucleotídeos. Nesta fase de leitura estão codificadas, no sentido 5'-* 3', as três proteínas estruturais (C, prM e E) e os sete genes para as proteínas não- estruturais (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B e NS5). As setas indicam os sítios de clivagens proteolíticas efetuadas pela protease virai (NS2B/NS3); e os losangos, as clivagens pela signalase celular (ocorrem dentro do retículo endoplasmático rugoso). Os asteriscos indicam sítios de glicosilação ligados à asparagina.

[004] O vírus da febre amarela (Figura 1) tem um genoma constituído de uma única molécula de RNA com 10.862 nucleotídeos (nt), uma estrutura de CAP no seu extremo 5' (m7GpppG, para reconhecimento pelos ribossomos), uma região 5'não traduzida curta (118 nt) e uma extremidade 3'não-poliadenilada (511 nt). Tais dados foram obtidos a partir do primeiro seqüenciamento nucleotídico de um genoma de flavivírus - o do vírus vacinai 17D-204 (Rice, C. M., E. M. Lenches, S. R. Eddy, S. J. Shin, R. L. Sheets, and J. H. Strauss. 1985. Nucleotide sequence of yellow fever vírus: implications for flavivírus gene expression and evolution. Science 229:72633).

[005] No citoplasma da célula hospedeira, o ARN viral é utilizado como molde para a síntese de uma fita complementar negativa, a qual, por sua vez, servirá de molde para a síntese de mais fitas positivas a serem utilizadas na montagem de novas partículas virais. A replicação é um processo semiconservativo e envolve intermediários replicativos, bem como formas replicativas. A formação das partículas virais ocorre pelo envolvimento do nucleocapsídeo viral, com a proteína de envelope ancorada na membrana do Retículo Endoplasmático Rugosos (RER) celular. A montagem das partículas virais se dá em intima associação com o RER. As partículas virais são transportadas em vesículas e, dai, liberadas por exocitose através do sistema de Golgi.

[006] O ARN é também o mensageiro viral e a sua tradução em células infectadas resulta na síntese de uma poliproteína precursora de 3.411 aminoácidos, a qual, ao ser processada proteolíticamente, gera os 10 polipeptídeos virais. A partir da extremidade 5', a ordem dos genes é C; prM/M; E; NSI; NS2A; NS2B; NS3; NS4A; NS4B and NS5. Os primeiros 3 genes codificam as proteínas virais estruturais, isto é, as que formam o vírus juntamente com a molécula de RNA encapsulada, sendo denominadas como capsídeo (C, 12-14kDa), membrana (M de 8kDa, e o seu precursor prM de 18-22 kDa) e envelope (E, 52-54 kDa). Estes três genes encontram-se codificados no primeiro quarto do genoma. O restante do genoma codifica as proteínas não-estruturais (NS), numeradas de 1 a 5 (NS1 a NS5), de acordo com a ordem de síntese (Rice, C. M., E. M. Lenches, S. R. Eddy, S. J. Shin, R. L. Sheets, and J. H. Strauss. 1985. Nucleotide sequence of yellow fever vírus: implications for flavivírus gene expression and evolution. Science 229:726-33).

[007] Entre os diferentes Flavivírus, três grandes proteínas não- estruturais tem seqüências muito conservadas: NS1 (3841 kDa), NS3 (68-70 kDa) e NS5 (100-103 kDa).

[008] A primeira (NS1) tem função importante na replicação da fita negativa de RNA (Lindenbach, B. D., and C. M. Rice. 1999. Genetic interaction of flavivírus nonstructural proteins NS1 and NS4A as a determinant of replicase function. J Virol 73:4611-21; Lindenbach, B. D., and C. M. Rice. 1997. trans-Complementation of yellow fever vírus NS1 reveals a role in early RNA replication. J Virol 71:960817; Muylaert, I. R., T. J. Chambers, R. Galler, and C. M. Rice. 1996. Mutagenesis of the N-linked glycosylation sites of the yellow fever vírus NS1 protein: effects on vírus replication and mouse neurovirulence. Virology 222:159-68; Muylaert, I. R., R. Galler, and C. M. Rice. 1997. Genetic analysis of the yellow fever vírus NS1 protein: identification of a temperature-sensitive mutation which blocks RNA accumulation. J Virol 71:291-8). Liberada extracelularmente como estrutura hexamérica, pode se localizar na superfície celular. Anticorpos contra NS1 não neutralizam a infectividade viral, mas exercem imunidade protetora por mediação do complemento lisando células infectadas (Rice, C. M. 1996. Flaviviridae: the víruses and their replication., Third ed, vol. 1. Lippincott-Raven, Philadelphia, PA).

[009] A segunda, NS3, perfaz três atividades enzimáticas distintas: (1) protease, sendo responsável pelo processamento proteolítico da poliproteína viral em sítios que a protease celular não atua (Lee, E., C. E. Stocks, S. M. Amberg, C. M. Rice, and M. Lobigs. 2000. Mutagenesis of the signal sequente of yellow fever vírus prM protein: enhancement of signalase cleavage In vitro is lethal for vírus production. J Virol 74:24-32; Stocks, C. E., and M. Lobigs. 1995. Posttranslational signal peptidase cleavage at the flavivírus C-prM junction in vitro. J Virol 69:81236; Yamshchikov, V. F., and R. W. Compans. 1995. Formation of the flavivírus envelope: role of the viral NS2B-NS3 protease. J Virol 69:1995-2003; Yamshchikov, V. F., D. W. Trent, and R. W. Compans. 1997. Upregulation of signalase processing and induction of prM-E secretion by the flavivírus NS2B-NS3 protease: roles of protease components. J Virol 71:4364-71); (2) helicase e (3) nucleotídeo- trifosfatase (Gorbalenya, A. E., E. V. Koonin, A. P. Donchenko, and V. M. Blinov. 1989. Two related superfamilies of putative helicases involved in replication, recombination, repair and expression of DNA and RNA genomes. Nucleic Acids Res 17:4713-30; Wengler, G., and G. Wengler. 1993. The NS 3 nonstructural protein of flavivíruses contains an RNA triphosphatase activity. Virology 197:265-73; Wu, J., A. K. Bera, R. J. Kuhn, and J. L. Smith. 2005. Structure of the Flavivírus helicase: implications for catalytic activity, protein interactions, and proteolytic processing. J Virol 79:1026877). As duas últimas conferem a essa proteína papel importante também no processo de replicação do RNA virai.

[0010] A terceira, NS5, é a maior e a mais conservada das proteínas virais, constituindo-se na RNA polimerase viral, já que sua seqüência contém vários elementos estruturais próprios de RNA polimerases (Chambers, T. J., C. S. Hahn, R. Galler, and C. M. Rice. 1990. Flavivírus genome organization, expression, and replication. Annu Rev Microbiol 44:649-88) e exibe ainda atividade de RNA polimerase, dependente de RNA (Steffens, S., H. J. Thiel, and S. E. Behrens. 1999. The RNA-dependent RNA polymerases of different members of the family Flaviviridae exhibit similar properties in vitro. J Gen Virol 80 (Pt 10):258390).

[0011] As 4 pequenas proteínas NS2A, NS2B, NS4A e NS4B são pouco conservadas em sua seqüência de aminoácidos, mas não no seu padrão de múltiplos trechos hidrófobos. As mesmas foram relacionadas, até o momento, a alguns processos da propagação virai: NS2A parece ser necessária ao processamento correto da NS1 (Falgout, B., R. Chanock, and C. J. Lai. 1989. Proper processing of dengue vírus nonstructural glycoprotein NS1 requires the N-terminal hydrophobic signal sequence and the downstream nonstructural protein NS2a. J Virol 63:1852-60) e à montagem da partícula viral juntamente com NS3 (Kummerer, B. M., and C. M. Rice. 2002. Mutations in the yellow fever vírus nonstructural protein NS2A selectively block production of infectious particles. J Virol 76:4773-84); NS2B encontra-se associada com NS3, atuando como cofator do complexo proteolítico viral (Chambers, T. J., A. Nestorowicz, S. M. Amberg, and C. M. Rice. 1993. Mutagenesis of the yellow fever vírus NS2B protein: effects on proteolytic processing, NS2B-NS3 complex formation, and viral replication. J Virol 67:6797-807; Falgout, B., M. Pethel, Y. M. Zhang, and C. J. Lai. 1991. Both nonstructural proteins NS2B and NS3 are required for the proteolytic processing of dengue vírus nonstructural proteins. J Virol 65:2467-75; Jan, L. R., C. S. Yang, D. W. Trent, B. Falgout, and C. J. Lai. 1995. Processing of Japanese encephalitis vírus non-structural proteins: NS2B-NS3 complex and heterologous proteases. J Gen Virei 76 (Pt 3):573-80); NS4A interagiria com NS1, permitindo a sua integração no processo citoplasmático da replicação do RNA (Lindenbach, B. D., and C. M. Rice. 1999. Genetic interaction of flavivirus nonstructural proteins NS1 and NS4A as a determinant of replicase function. J Virol 73:4611-21). Considerando-se que a síntese de RNA viral ocorre no citoplasma celular em associação com membranas do RER, postula- se que estas proteínas hidrofóbicas virais estariam embebidas em membranas e, através de interações com NS3 e NS5, estariam participando com estas de complexos replicativos virais.

[0012] Elementos estruturais presentes nas extremidades 5' e 3'não traduzidas (NTR) também têm importância na replicação e empacotamento do RNA viral (Chambers, T. J., C. S. Hahn, R. Galler, and C. M. Rice. 1990. Flavivírus genome organization, expression, and replication. Annu Rev Microbiol 44:649-88; Cologna, R., and R. Rico-Hesse. 2003. American genotype structures decrease dengue vírus output from human monocytes and dendritic cells. J Virol 77:392938; Elghonemy, S., W. G. Davis, and M. A. Brinton. 2005. The majority of the nucleotides in the top loop of the genomic 3' terminal stem loop structure are cis-acting in a West Nile vírus infectious clone. Virology 331:238-46; Hanley, K. A., L. R. Manlucu, G. G. Manipon, C. T. Hanson, S. S. Whitehead, B. R. Murphy, and J. E. Blaney, Jr. 2004. Introduction of mutations into the non-structural genes or 3' untranslated region of an attenuated dengue vírus type 4 vaccine candidate further decreases replication in rhesus monkeys while retaining protective immunity. Vaccine 22:3440-8; Khromykh, A. A., H. Meka, K. J. Guyatt, and E. G. Westaway. 2001. Essential role of cyclization sequences in flavivírus RNA replication. J Virol 75:6719-28; Thurner, C., C. Witwer, I. L. Hofacker, and P. F. Stadler. 2004. Conserved RNA secondary structures in Flaviviridae genomes. J Gen Virol 85:1113-24; Tilgner, M., T. S. Deas, and P. Y. Shi. 2005. The flavivirus-conserved penta-nucleotide in the 3' stem-loop of the West Nile vírus genome requires a specific sequence and structure for RNA synthesis, but not for virai translation. Virology 331:375-86; Tilgner, M., and P. Y. Shi. 2004. Structure and function of the 3' terminal six nucleotides of the west nile vírus genome in viral replication. J Virol 78:8159-71; Yu, L., and L. Markoff. 2005. The topology of bulges in the long stem of the flavivirus 3' stem-loop is a major determinant of RNA replication competence. J Virol 79:2309-24).

[0013] A proteína C do capsídeo interage com o RNA viral, formando o nucleocapsídeo viral (Chambers, T. J., C. S. Hahn, R. Galler, and C. M. Rice. 1990. Flavivírus genome organization, expression, and replication. Annu Rev Microbiol 44:649-88). A proteína prM é um precursor glicosilado da proteína de membrana. Está presente na superfície de partículas virais imaturas, sendo clivada por proteases celulares do tipo furina no nível do complexo de Golgi, antes da liberação das partículas virais, de modo que os vírus maduros contenham a proteína M. A função da prM é de estabilizar a proteína E, impedindo a exposição prematura do peptídeo de fusão ao pH reduzido encontrado na via exocítica (Heinz, F. X., and S. L. Allison. 2003. Flavivírus structure and membrane fusion. Adv Vírus Res 59:63-97). A retenção da proteína prM pode afetar a conformação e antigenicidade da proteína E e reduzir a infectividade, inibindo a fusão ácido-dependente.

[0014] Na Figura 2, estão representadas as partículas virais imaturas (forma intracelular) e maduras (forma extracelular) dos Flavivírus. O capsídeo do vírus tem a simetria icosaédrica, mas a forma não é necessariamente a apresentada na Figura, que também mostra o genoma do vírus associado à face interna do capsídeo. Estão representadas as proteínas de envelope (E) e a sua forma dimérica, a proteína de membrana (M) e seu precursor (prM), o qual ainda está presente no envelope na forma extracelular. Ao contrário das partículas extracelulares, as partículas intracelulares não são infectivas (Chambers, T. J., C. S. Hahn, R. Galler, and C. M. Rice. 1990. Flavivírus genome organization, expression, and replication_ Annu Rev Microbiol 44:649-88).

[0015] A proteína E é o principal componente do envelope virai. Promove a ligação a receptores glicoprotéicos na superfície celular e a internalização por fusão dependente de pH, processos que desencadeiam a infecção viral. Esta proteína possui múltiplos determinantes antigênicos e é o principal alvo de resposta imuno-protetora do hospedeiro vertebrado. Portanto, desempenha papel chave na infecção celular, no tropismo virai, na virulência e na imunidade.

[0016] A elucidação da estrutura atômica tridimensional da proteína E da partícula viral matura do flavivírus TBE (tick-borne encephalitis vírus), revelou que esta proteína se encontra na forma de homodímeros, de cerca de 110 kDa, contendo três domínios definidos, ancorados pela parte hidrofóbica da extremidade carboxílica na superfície do envelope (Rey, F. A., F. X. Heinz, C. Mandl, C. Kunz, and S. C. Harrison. 1995. The envelope glycoprotein from tick-borne encephalitis vírus at 2 A resolution. Nature 375:2918). Este modelo tem sido aplicado a todos os Flavivírus, contribuindo principalmente para a detecção de marcadores antigênicos e o estudo das mutações ligadas ao aumento ou diminuição da virulência (Arroyo, J., F. Guirakhoo, S. Fenner, Z. X. Zhang, T. P. Monath, and T. J. Chambers. 2001. Molecular basis for attenuation of neurovirulence of a yellow fever Vírus/Japanese encephalitis vírus chimera vaccine (ChimeriVax-JE). J Virol 75:934-42; Guirakhoo, F., Z. Zhang, G. Myers, B. W. Johnson, K. Pugachev, R. Nichols, N. Brown, I. Levenbook, K. Draper, S. Cyrek, J. Lang, C. Fournier, B. Barrere, S. Delagrave, and T. P. Monath. 2004. A single amino acid substitution in the envelope protein of chimeric yellow fever-dengue 1 vaccine vírus reduces neurovirulence for suckling mice and viremia/viscerotropism for monkeys. J Virol 78:9998-10008; Halstead, S. B., F. X. Heinz, A. D. Barrett, and J. T. Roehrig. 2005. Dengue vírus: molecular basis of cell entry and pathogenesis, 2527 June 2003, Vienna, Austria. Vaccine 23:849-56; Hurrelbrink, R. J., and P. C. McMinn. 2003. Molecular determinants of virulence: the structural and functional basis for flavivírus attenuation. Adv Vírus Res 60:1-42; Kolaskar, A. S., and U. Kulkarni-Kale. 1999. Prediction of three-dimensional structure and mapping of conformational epitopes of envelope glycoprotein of Japanese encephalitis vírus. Virology 261:31-42; Lee, E., R. A. Hall, and M. Lobigs. 2004. Common E protein determinants for attenuation of glycosaminoglycan- binding variants of Japanese encephalitis and West Nile víruses. J Virol 78:8271-80; Lee, E., and M. Lobigs. 2000. Substitutions at the putative receptor-binding site of an encephalitic flavivírus alter virulence and host cell tropism and reveal a role for glycosaminoglycans in entry. J Virol 74:886775; Lee, E., C. E. Stocks, S. M. Amberg, C. M. Rice, and M. Lobigs. 2000. Mutagenesis of the signal sequence of yellow fever vírus prM protein: enhancement of signalase cleavage In nitro is lethal for vírus production. J Virol 74:24-32; Mandl, C. W., S. L. Allison, H. Holzmann, T. Meixner, and F. X. Heinz. 2000. Attenuation of tick-borne encephalitis vírus by structurebased site-specific mutagenesis of a putative flavivírus receptor binding site. J Virol 74:96019; Nickells, M., and T. J. Chambers. 2003. Neuroadapted yellow fever vírus 17D: determinante in the envelope protein govern neuroinvasiveness for SCID mice. J Virol 77:12232-42; Ryman, K. D., H. Xie, T. N. Ledger, G. A. Campbell, and A. D. Barrett. 1997. Antigenic variants of yellow fever vírus with an altered neurovirulence phenotype in mice. Virology 230:376-80; Shirato, K., H. Miyoshi, A. Goto, Y. Ako, T. Ueki, H. Kariwa, and I. Takashima. 2004. Viral envelope protein glycosylation is a molecular determinant of the neuroinvasiveness of the New York strain of West Nile vírus. J Gen Virol 85:3637-45).

[0017] A ligação da proteína E a receptores celulares induz à formação de vesículas endocíticas, recobertas por clatrina. Depois da internalização por endocitose mediada por receptor, os vírus são liberados no citoplasma através de mudanças conformacionais, induzidas por pH ácido que levam à exposição do peptídeo de fusão após a trimerização da proteína E (Bonaldo, M. C., R. C. Garratt, R. S. Marchevsky, E. S. Coutinho, A. V. Jabor, L. F. Almeida, A. M. Yamamura, A. S. Duarte, P. J. Oliveira, J. O. Lizeu, L. A. Camacho, M. S. Freire, and R. Galler. 2005. Attenuation of recombinant yellow fever 17D víruses expressing foreign protein epitopes at the surface. J Virol 79:8602-13; Bressanelli, S., K. Stiasny, S. L. Allison, E. A. Stura, S. Duquerroy, J. Lescar, F. X. Heinz, and F. A. Rey. 2004. Structure of a flavivírus envelope glycoprotein in its low-pH-induced membrane fusion conformation. Embo J 23:728-38; Heinz, F. X., and S. L. Allison. 2003. Flavivírus structure and membrane fusion. Adv Vírus Res 59:63-97; Stiasny, K., S. Bressanelli, J. Lepault, F. A. Rey, and F. X. Heinz. 2004. Characterization of a membrane-associated trimeric low-pH-induced Form of the class II viral fusion protein E from tick-borne encephalitis vírus and its crystallization. J Virol 78:3178-83).

[0018] Em 1927, foi isolado em macacos Rhesus (Macaca mulatta) o vírus causador da febre amarela, através da inoculação direta do sangue de um paciente africano chamado Asibi (Stokes A, B. J., Hudson NP. 1928, The transmission of yellow fever to Macacus rhesus. Rev Med Virol. 11:141148). Após o estabelecimento de um modelo animal suscetível ao vírus, novas perspectivas se abriram e a propagação viral e a avaliação clínica se tornaram possíveis. O vírus Asibi, a amostra mãe, é um dos mais virulentos dentre os vírus da febre amarela já estudados. Quando inoculado em macacos, pela via subcutânea, ele produz morte em 4 a 7 dias em 95% dos animais, e altas taxas de viremia são detectadas no sangue desses animais infectados.

[0019] A passagem seriada da cepa Asibi, em diferentes tipos de subcultivo, conforme descrito anteriormente, levou à produção da cepa parental 17D, na passagem 180, à 17DD na passagem 195, e à cepa 17D-204 na passagem 204. A cepa 17DD foi subcultivada posteriormente até a passagem 243 e sofreu 43 passagens adicionais em embrião de galinha (passagem 286). A cepa 17D-204, por sua vez, deu origem, por subcultivo, à cepa Colômbia 88, que, por sua vez, originou os diferentes lotes sementes em uso na França (I. Pasteur, passagem 235) e nos Estados Unidos (Connaught, passagem 234). Os vírus 17D-204 e 17DD são as duas sub-cêpas de vírus 17D utilizadas atualmente para produção de vacina no mundo, as quais acumularam diferenças genotípicas e fenotípicas devido às passagens seriadas independentes (Galler, R., P. R. Post, C. N. Santos, and Ferreira, II. 1998. Genetic variability among yellow fever vírus 17D substrains. Vaccine 16:1024-8; Marchevsky, R. S., M. S. Freire, E. S. Coutinho, and R. Galler. 2003. Neurovirulence of yellow fever 17DD vaccine vírus to rhesus monkeys. Virology 316:55-63; Post, P. R., R. de Carvalho, M. da Silva Freire, and R. Galler. 2001. The early use of yellow fever vírus strain 17D for vaccine production in Brazil--a review. Mem Inst Oswaldo Cruz 96:849-57). No entanto, ambas são igualmente imunogênicas e seguras para a vacinação humana (Camacho, L. A., S. G. Aguiar, M. D. Freire, M. D. Leal, J. P. Nascimento, T. Iguchi, J. A. Lozana, and R. H. Farias. 2005. Reactogenicity of yellow fever vaccines in a randomized, placebo-controlled trial. Rev Saude Publica 39:413-420; Camacho, L. A., S. Freire Mda, L. Leal Mda, S. G. Aguiar, J. P. Nascimento, T. Iguchi, A. Lozana Jde, and R. H. Farias. 2004. Immunogenicity of WHO-17D and Brazilian 17DD yellow fever vaccines: a randomized trial. Rev Saude Publica 38:671-8).

[0020] O vírus vivo atenuado vacinal da febre amarela (FA) cepa 17D, constitui-se numa das melhores e mais seguras vacinas disponíveis nos nossos dias, possuindo uma metodologia de produção bem estabelecida e um controle de qualidade rigoroso, incluindo o teste de neurovirulência em macacos. Além disso, promove imunidade duradoura (Monath, T. 2003. Yellow Fever Vaccine, 4th ed. W.B. Saunders Company, USA) e é capaz de induzir ambas as vias da resposta imune celular e humoral (Co, M. D., M. Terajima, J. Cruz, F. A. Ennis, and A. L. Rothman. 2002. Human cytotoxic T lymphocyte responses to live attenuated 17D yellow fever vaccine: identification of HLA-B35-restricted CTL epitopes on nonstructural proteins NS1, NS2b, NS3, and the structural protein E. Virology 293:151-63); além de ser barata e de dose única. Seu uso foi estimado em 400 milhões de doses.

[0021] Logo, estas características tornam propício o desenvolvimento do vírus 17D como um vetor vacinal de expressão de antígenos heterólogos.

[0022] Mas, para o desenvolvimento de flavivírus, expressando antígenos heterólogos, faz-se necessário: (a) o desenho de estratégias que permitam a introdução de antígenos heterólogos, sem o comprometimento da estrutura e replicação do vírus; (b) assegurar que a construção de cDNA (e os seus transcritos de RNA) gere um vírus não-patogênico e que a seqüência estranha, além disso, fique estavelmente integrada no genoma virai; e (c) garantir que o vírus FA recombinante, além de ser atenuado, retenha as suas propriedades imunológicas, expressando o antígeno heterólogo, inserido de modo que o mesmo induza uma resposta imune apropriada. Também é importante a manutenção da capacidade de replicação em culturas de células certificadas para a produção de vacinas.

[0023] O desenvolvimento da tecnologia do DNA recombinante possibilitou o avanço no estudo da estrutura e expressão do genoma do RNA viral. Para manipular o RNA genômico, é necessário que o DNA complementar esteja disponível. Modificações genéticas podem ser introduzidas em locais determinados do genoma viral.

[0024] O estudo pioneiro de David Baltimore (Racaniello, V. R., and D. Baltimore. 1981. Cloned poliovírus complementary DNA is infectious in mammalian cells. Science 214:916-9), foi o primeiro a demonstrar ser possível regenerar vírus a partir do DNA complementar do vírus da poliomielite. Com o desenvolvimento dos sistemas eficientes de transcrição in vitro, tornou-se possível à síntese completa do RNA vital in vitro com uma eficiência muito maior que a da transcrição do cDNA na célula. O desenvolvimento de métodos mais eficientes de transfecção de células com ácidos nucleicos, tais como eletroporação e uso de lipossomos catiônicos contribuíram para o aumento da eficiência da transfecção de culturas de células com RNA e regeneração vital. As bases da metodologia do clone infeccioso estão estabelecidas e têm sido utilizadas para obter clones infecciosos para vários vírus de fita positiva.

[0025] Os clones infecciosos podem ser usados para entender melhor as bases moleculares de diversos fenômenos biológicos como: a virulência, atenuação, mecanismo de penetração na célula, replicação, relação com o hospedeiro, mutantes condicionais e o desenho de mutantes para as funções requeridas (Bonaldo, M. C., P. S. Caufour, M. S. Freire, and R. Galler. 2000. The yellow fever 17D vaccine vírus as a vector for the expression of foreign proteins: development of new live flavivírus vaccines. Mem Inst Oswaldo Cruz 95 Suppl 1:215-23; Bonaldo, M. C., R. C. Garratt, P. S. Caufour, M. S. Freire, M. M. Rodrigues, R. S. Nussenzweig, and R. Galler. 2002. Surface expression of an immunodominant malaria protein B cell epitope by yellow fever vírus. J Mol Biol 315:873-85).

[0026] A construção de um molde completo do cDNA do vírus vacinal 17D, ou seja, que pode ser transcrito in vitro, produzindo RNA virai infectivo, foi descrita pela primeira vez por Rice e colaboradores (Rice, C. M., A. Grakoui, R. Galler, and T. J. Chambers. 1989. Transcription of infectious yellow fever RNA from full-length cDNA templates produced by in vitro ligation. New Biol 1:285-96). O vírus - obtido a partir do cDNA - foi indistinguível do vírus parental, a subcepa 17D-204, por vários critérios (Rice, C. M., A. Grakoui, R. Galler, and T. J. Chambers. 1989. Transcription of infectious yellow fever RNA from full-length cDNA templates produced by in vitro ligation. New Biol 1:285-96).

[0027] A obtenção de lotes sementes vacinais a partir de cDNA em condições de boas práticas de produção foi descrita pela primeira vez por Marchevsky e colaboradores (Marchevsky, R. S., J. Mariano, V. S. Ferreira, E. Almeida, M. J. Cerqueira, R. Carvalho, J. W. Pissurno, A. P. da Rosa, M. C. Simoes, and C. N. Santos. 1995. Phenotypic analysis of yellow fever vírus derived from complementary DNA. Am J Trop Med Hyg 52:75-80), e posteriormente por Galler e Freire (documentos de patente US 6,171,854 e US 6,859,522) e Freire e colaboradores (documento de patente BRPI 9804283). O processo de produção descrito por Freire e colaboradores (documento de patente BRPI 9804283) inclusive poderá vir a ser, em um futuro próximo, o modo de modernização de produção de vacina amarilica; possibilitando um aumento significativo na produção e melhoria na qualidade do produto (Freire, M. S., G. F. Mann, R. S. Marchevsky, A. M. Yamamura, L. F. Almeida, A. V. Jabor, J. M. Malachias, E. S. Coutinho, and R. Galler. 2005. Production of yellow fever 17DD vaccine vírus in primary culture of chicken embryo fibroblasts: yields, thermo and genetic stability, attenuation and immunogenicity. Vaccine 23:2501-12).

[0028] Este trabalho abriu a perspectiva de uso do vírus 17D como vetor de expressão para antígenos heterólogos. Há várias maneiras de se obter um vetor de expressão a partir de um vírus com genoma de RNA fita positiva, algumas das quais estão descritas em revisões publicadas pelo nosso grupo de pesquisa (Bonaldo, M. C., P. S. Caufour, M. S. Freire, and R. Galler. 2000. The yellow fever 17D vaccine vírus as a vector for the expression of foreign proteins: development of new live flavivírus vaccines. Mem Inst Oswaldo Cruz 95 Suppl 1:215-23; Galler, R., M. S. Freire, A. V. Jabor, and G. F. Mann. 1997. The yellow fever 17D vaccine vírus: molecular basis of viral attenuation and its use as an expression vector. Braz J Med Biol Res 30:15768).

[0029] Uma das alternativas na qual o nosso grupo de pesquisa tem trabalhado a algum tempo se refere à substituição das proteínas prM/E da febre amarela pelas proteínas equivalentes de vírus de dengue obtendo-se, desta maneira, um vírus quimérico. Esta abordagem tem a vantagem de que a imunidade prévia contra o vetor não seria limitante, uma vez que a proteína de envelope E contém todos os epítopos de neutralização viral.

[0030] A abordagem de troca de genes prM/E entre flavivírus foi descrita pela primeira vez nos documentos de patente US6,184,024 e US6,676,936, os quais descreveram novos vírus contendo os genes prM/E de dengue 1 ou 2 e o restante do genoma de vírus Den 4. O primeiro vírus quimérico do genoma 17D foi criado pela troca dos genes prM/E do vírus da encefalite japonesa (JE) (Chambers, T. J., A. Nestorowicz, P. W. Mason, and C. M. Rice. 1999. Yellow fever/Japanese encephalitis chimeric víruses: construction and biological properties. J Virol 73:3095-101). Esta quimera mostrou-se imunogênica e atenuada em macacos, de modo a promover uma proteção total a estes animais, frente a um desafio intra-cerebral (IC) com o vírus JE selvagem (Monath, T. P., I. Levenbook, K. Soike, Z. X. Zhang, M. Ratterree, K. Draper, A. D. Barrett, R. Nichols, R. Weltzin, J. Arroyo, and F. Guirakhoo. 2000. Chimeric yellow fever vírus 17D-Japanese encephalitis vírus vaccine: dose-response effectiveness and extended safety testing in rhesus monkeys. J Virol 74:174251). Recentemente, um estudo clínico em humanos demonstrou que a vacina quimérica FA/JE é segura e imunogênica no homem, em níveis semelhantes à da FA 17D, podendo ser utilizada potencialmente, no futuro, para a prevenção da encefalite japonesa em viajantes e residentes de áreas endêmicas (Monath, T. P. 2002. Japanese encephalitis vaccines: current vaccines and future prospects. Curr Top Microbiol Immunol 267:105-38; Monath, T. P., F. Guirakhoo, R. Nichols, S. Yoksan, R. Schrader, C. Murphy, P. Blum, S. Woodward, K. McCarthy, D. Mathis, C. Johnson, and P. Bedford. 2003. Chimeric live, attenuated vaccine against Japanese encephalitis (ChimeriVax-JE): phase 2 clinical trials for safety and immunogenicity, effect of vaccine dose and schedule, and memory response to challenge with inactivated Japanese encephalitis antigen. J Infect Dis 188:1213-30).

[0031] O nosso grupo de pesquisa construiu quatro quimeras virais contendo o cDNA de diferentes cepas de dengue 2, e uma destas construções foi selecionada para testes de imunogenicidade. Estes testes foram realizados em modelo murino, tendo os resultados sido publicados juntamente com a caracterização do crescimento e da atenuação viral (Caufour, P. S., M. C. Motta, A. M. Yamamura, S. Vazquez, Ferreira, II, A. V. Jabor, M. C. Bonaldo, M. S. Freire, and R. Galler. 2001. Construction, characterization and immunogenicity of recombinant yellow fever 17D-dengue type 2 víruses. Vírus Res 79:1-14).

[0032] Empregou-se esta mesma estratégia de criação de vírus quimérico FA 17D na criação de uma vacina tetravalente contra os diferentes sorotipos do vírus dengue (Guirakhoo, F., J. Arroyo, K. V. Pugachev, C. Miller, Z. X. Zhang, R. Weltzin, K. Georgakopoulos, J. Catalan, S. Ocran, K. Soike, M. Ratterree, and T. P. Monath. 2001. Construction, safety, and immunogenicity in nonhuman primates of a chimeric yellow fever-dengue vírus tetravalent vaccine. J Virol 75:7290-304; Guirakhoo, F., K. Pugachev, J. Arroyo, C. Miller, Z. X. Zhang, R. Weltzin, K. Georgakopoulos, J. Catalan, S. Ocran, K. Draper, and T. P. Monath. 2002. Viremia and immunogenicity in nonhuman primates of a tetravalent yellow fever-dengue chimeric vaccine: genetic reconstructions, dose adjustment, and antibody responses against wild-type dengue vírus isolates. Virology 298:14659; Guirakhoo, F., K. Pugachev, Z. Zhang, G. Myers, I. Levenbook, K. Draper, J. Lang, S. Ocran, F. Mitchell, M. Parsons, N. Brown, S. Brandler, C. Fournier, B. Barrere, F. Rizvi, A. Travassos, R. Nichols, D. Trent, and T. Monath. 2004. Safety and efficacy of chimeric yellow Fever-dengue vírus tetravalent vaccine formulations in nonhuman primates. J Virol 78:4761-75, Documentos de Patente US 6,696,281 e W00139802). Em cultura de tecidos, estas quimeras crescem em altos títulos, e foram imunogênicas em macacos inoculados com formulações individuais e tetravalentes destes recombinantes. Porém, pode-se evidenciar que ocorreu uma resposta imune mais alta contra um dos recombinantes, a quimera FA/den2, devido, provavelmente, a uma maior taxa de replicação deste vírus.

[0033] Uma vacina ideal contra os quatro sorotipos, além de induzir uma resposta duradoura, deve proteger o indivíduo contra os quatro sorotipos eficientemente, pois uma imunização incompleta poderia desencadear a doença na sua forma mais grave. Posteriormente, outras formulações foram testadas em macacos, com a intenção de reduzir a imunogenicidade dominante da quimera FA/Den2 (Guirakhoo, F., K. Pugachev, J. Arroyo, C. Miller, Z. X. Zhang, R. Weltzin, K. Georgakopoulos, J. Catalan, S. Ocran, K. Draper, and T. P. Monath. 2002. Viremia and immunogenicity in nonhuman primates of a tetravalent yellow fever-dengue chimeric vaccine: genetic reconstructions, dose adjustment, and antibody responses against wild-type dengue vírus isolates. Virology 298:146-59). No entanto, o ajuste de dose para a quimera den2 resultou, apesar de uma resposta mais balanceada contra os vírus quiméricos tipos 1, 2 e 3, em uma resposta mais acentuada contra a quimera tipo 4. Estes resultados indicam que o desenvolvimento de uma vacina tetravalente passa por testes de diferentes formulações, para que se possa obter um ajuste ideal a ser testado em macacos antes que se possa atingir uma formulação ótima a ser usada em testes de segurança e imunogenicidade em humanos em um estudo clínico fase I.

[0034] A segunda abordagem se refere à inserção de epítopos de proteínas no genoma do vírus 17D. Tais inserções podem ser feitas em proteínas muito imunogênicas do vírus amarílico, através da duplicação dos sinais de processamento da poliproteina virai pela protease virai e a criação de cassetes de expressão - como foi feito com um epítopo de ovalbumina, indutor de resposta de linfócito T citotóxico, que foi inserido entre os genes NS2B e NS3 (McAllister, A., A. E. Arbetman, S. Mandl, C. Pena-Rossi, and R. Andino. 2000. Recombinant yellow fever víruses are effective therapeutic vaccines for treatment of murine experimental solid tumors and pulmonary metastases. J Virol 74:9197-205), Documentos de Patente US6,589,531 e US20030157128). A imunização de camundongos com o vírus recombinante induziu proteção contra uma dose letal de células de melanoma maligno que expressavam o mesmo epítopo. É importante que os novos vírus sejam atenuados como o vacinal 17D, que sejam geneticamente estáveis e que retenham as propriedades imunogênicas do antígeno heterólogo, promovendo uma indução correta da resposta imune. Neste sentido, deve-se destacar a expressão de epítopo de Plasmodium yoeliiatravés de sua inserção entre os genes de NS2B-NS3 do vírus 17D (Tao, D., G. Barba-Spaeth, U. Rai, V. Nussenzweig, C. M. Rice, and R. S. Nussenzweig. 2005. Yellow fever 17D as a vaccine vector for microbial CTL epitopes: protection in a rodent mataria model. J Exp Med 201:201-9).

[0035] Tornou-se de interesse testar este sistema para a expressão de fragmentos gênicos maiores. Neste sentido, o nosso grupo de pesquisa optou por inserir o gene da fluorescência verde de algas (GFP). Este gene facilita o monitoramento da infecciosidade do ARN transcrito in vidro, a partir de moldes plasmidiais, por permitir a visualização direta de proteínas sintetizadas em culturas transfectadas através de microscopia de fluorescência.

[0036] A estratégia de inserção está descrita na Figura 3, na qual a parte superior representa a estrutura genômica e a expressão gênica. O genoma dos flavivírus é traduzido numa única poliproteína, a qual é clivada por proteases celulares ou viral (V). Barras negras verticais indicam domínios transmembrana hidrofóbicos, e os asteriscos indicam sítios de glicosilação ligados à asparagina. Áreas sombreadas em C e prM/E representam as proteínas estruturais presentes nos vírus maduros infecciosos. A parte inferior apresenta a estrutura genómica geral, as seqüências nos sítios de clivagens e as clivagens proteolíticas necessárias para a inserção de gene repórter entre NS2A e 2B. Tal estratégia se aplica aos outros sítios clivados pela protease virai, localizados entre C-prM, NS2B-3, NS3-4A, NS4A-4B e NS4B-5.

[0037] O gene de GFP foi inserido entre NS2A-2B e NS2B-NS3 sem a recuperação de vírus infeccioso, sugerindo que a inserção de fragmentos gênicos maiores no genoma do vírus 17D através desta abordagem não é possível (Bonaldo MC e Galler R, dados não publicados).

[0038] Uma outra maneira de desenvolver vírus amarílicos recombinantes tendo epítopos de patógenos diversos foi o de expressão de epítopos protéicos previamente caracterizados como importantes em algum tipo de resposta imune, seja humoral ou celular, por inserção direta na poliproteína viral. As diferentes proteínas virais contêm epítopos relacionados à indução de resposta celular (CTL) e humoral (formação de anticorpos), de modo que há diferentes possibilidades de otimização de expressão e imunogenicidade.

[0039] Uma nova versão do clone infeccioso de FA foi desenvolvida, contendo sítios de restrição no gene da proteína do envelope viral que permitem a inserção "in-frame" de epítopos heterólogos. Isto foi possível devido à disponibilidade da estrutura tridimensional da mesma, que permitiu uma análise de locais onde inserções seriam viáveis. Um sítio para a inserção de epítopos foi identificado nestas análises tridimensionais (alça f-g da proteína de envelope), e diversos epítopos de diferentes microorganismos já foram inseridos e expressos na alça f-g, incluindo epítopos de Plasmodium sp, dengue e arenavírus (Bonaldo, M. C., R. C. Garratt, M. S. Freire, and R. Galler. 2005. Novel Flavivírus vector useful for expressing heterologous antigens, comprises foreign gene sequences inserted at sites in the levei of its envelope protein. Great-Britain).

[0040] Com relação aos epítopos de Plasmodium sp, um total de 16 vírus novos foram criados, os quais expressam epítopos relacionados à resposta por células T CD4+ ou T CD8+ ou células B. Um epítopo humoral repetitivo da proteína CS de superfície da forma esporozoíta de P. falciparum foi inserido na alça fg e o vírus regenerado. Este vírus foi caracterizado em termos de crescimento em cultura de células, neutralização por soros contra febre amarela e monoclonal contra o epítopo, ensaio este que comprovou sua correta apresentação na superfície virai como esperado da modelagem tridimensional, e atenuação e imunogenicidade em camundongos (Bonaldo, M. C., R. C. Garratt, P. S. Caufour, M. S. Freire, M. M. Rodrigues, R. S. Nussenzweig, and R. Galler. 2002. Surface expression of an immunodominant malaria protein B cell epitope by yellow fever vírus. J Mol Biol 315:873-85).

[0041] Vírus 17D recombinante expressando um epítopo de célula T CD8 de P. yoelii,através da inserção na alça f-g, também foi construído. Este vírus não teve suas características de crescimento in vitro alteradas, mas mostrou-se mais atenuado no teste de virulência em camundongos do que o vírus vacina]. 17DD. Este epítopo foi corretamente apresentado na superfície virai e é imunogênico, baseando-se em resultados de imunização de camundongos e realização de testes de Elispot e desafio com esporozoítas de P.yoelii, desafio contra o qual foi observada proteção de 70%.

[0042] O nosso grupo de pesquisa também realizou uma avaliação mais detalhada da atenuação dos vírus quiméricos, expressando os epítopos humoral de P.falciparum e T CD8 de P.yoeliiatravés do teste de inoculação intracerebral em macacos rhesus, de acordo com os requerimentos estabelecidos pela Organização Mundial de Saúde para vírus amarílico vacinai. Os resultados sugerem que ambos os vírus são, no mínimo, tão atenuados quanto o vírus vacina' 17DD utilizado na vacinação humana. A análise comparativa do envelope dos vírus contendo as duas inserções mostrou que o "design" estrutural original de inserção, longe do domínio III envolvido na ligação ao receptor/ tropismo, foi o suficiente para não haver alteração na virulência virai, aspecto este fundamental na validação desta abordagem (Bonaldo, M. C., R. C. Garratt, R. S. Marchevsky, E. S. Coutinho, A. V. Jabor, L. F. Almeida, A. M. Yamamura, A. S. Duarte, P. J. Oliveira, J. O. Lizeu, L. A. Camacho, M. S. Freire, and R. Galler. 2005. Attenuation of recombinant yellow fever 17D víruses expressing foreign protein epitopes at the surface. J Virol 79:8602-13). Esta abordagem constitui-se em patente concedida recentemente (Bonaldo MC, Garrat RC, Freire MS & Galler R (2001) Use of flavivíruses for the expression of foreign protein epitopes and the development of new live attenuated vaccines for immunization against flavivíruses and other infectious agents, GB 0105877.5 e PCT PCT/BRO2/00036).

[0043] Uma quarta abordagem no uso do vírus 17D como vetor de expressão refere-se à inserção de genes na região 3'não traduzida (NTR). Esta abordagem foi realizada muito em função da variabilidade no comprimento desta região no vírus da FA (de Filippis, A_ M., R. M. Nogueira, H. G. Schatzmayr, D. S. Tavares, A. V. Jabor, S. C. Diniz, J. C. Oliveira, E. Moreira, M. P. Miagostovich, E. V. Costa, and R. Galler. 2002. Outbreak of jaundice and hemorrhagic fever in the Southeast of Brazil in 2001: detection and molecular characterization of yellow fever vírus. J Med Virol 68:6207; Mutebi, J. P., R. C. Rijnbrand, H. Wang, K. D. Ryman, E. Wang, L. D. Fulop, R. Titball, and A. D. Barrett. 2004. Genetic relationships and evolution of genotypes of yellow fever vírus and other members of the yellow fever vírus group within the Flavivírus genus based on the 3' noncoding region. J Virol 78:9652-65).

[0044] Esta metodologia foi descrita por Andino e colaboradores (Andino, P.R., Mcallister, M.N., 2002, Recombinant Bicistronic Flavivíruses and Methods of Use Thereof, WO 02/089840) e, basicamente, envolveu a criação de sítios de restrição para a inserção de módulos de expressão. Estes módulos, por sua vez, eram constituídos de uma seqüência derivada de enterovírus (Mengo ou poliovírus) ou de um Pestivírus (Vírus da Diarréia Bovina), a qual direciona a ligação das subunidades ribossomais de modo que a tradução do gene heterólogo possa acontecer praticamente na extremidade 3' NTR, sem que haja necessidade de início na região 5' NTR, como é característico de ARNs eucarióticos. Desta forma, o ARN viral atua como um mensageiro bi-cistrônico, permitindo a iniciação da síntese de proteínas a partir de 2 pontos do ARN, independentemente da síntese de proteína viral. Estas seqüências são conhecidas como sítios internos de entrada ribossomal (SIER). Tais módulos variam em comprimento, dependendo da origem da SIER e do gene heterólogo a ser expresso.

[0045] A Figura 4 representa a inserção de seqüências heterólogas na região 3' NTR do vírus 17D. As inserções da SIER dos enterovírus Mengo (569 nt) e pólio (663 nt) foram realizadas através de clonagem em sítios de restrição (AscI e NotI), os quais são adjacentes à seqüência do gene da proteína P24 (693 nt) do vírus da imunodeficiência humana 1 (através das enzimas NotI e PacI). O comprimento total das inserções variou de 1090 a 1356 nt. Os sítios de restrição foram inicialmente introduzidos, como um conjunto (AscI, NotI e PacI), exatamente 25 nucleotídeos após o códon de terminação (nucleotídeo 10379 a partir da extremidade 5').

[0046] A transfecção de células Vero em cultura com ARN transcrito in vitro, a partir de moldes de cADN, permitiu a regeneração viral referente às construções delineadas na Figura 3. A análise do genoma dos vírus resultantes, através do seqüenciamento nucleotídico dos produtos de amplificação desta região, mostraram a eliminação dos nucleotídeos. No caso da construção com o Sier de Mengo vírus, tornou-se evidente a instabilidade genética já na primeira passagem. Vírus 17D-SIER-P24 presente no sobrenadante da cultura, apresentando efeito citopático, havia perdido parte da região 3' NTR. O códon de terminação permaneceu assim como os primeiros 25 nucleotídeos, que se seguem até o sítio de AscI e mais os 22 nucleotídeos iniciais do SIER. A partir deste ponto, foram eliminados 1437 nucleotídeos, deixando somente os últimos 339 nucleotídeos (de 508) desta região do vírus 17D. No caso do vírus 17D-SIER-Polio-P24, a instabilidade genética foi demonstrada pelo seqüenciamento da região 3' NTR de vírus presente no sobrenadante da segunda passagem em células Vero. No genoma deste vírus, permaneceu intacto o códon de terminação e os primeiros 19 nucleotídeos após o mesmo, seguindo-se a eliminação de um total de 1398 nucleotídeos, incluindo o SIER e P24. Ficaram intactos os últimos 484 nucleotídeos da região 3'NTR original do vírus 17D. Estes dados demonstram a instabilidade de inserções mais longas nesta região do genoma.

[0047] A instabilidade genética de inserções no genoma de flavivírus na região 3' NTR é ainda corroborada pelos dados de Pierson e colaboradores (Pierson, T. C., M. S. Diamond, A. A. Ahmed, L. E. Valentine, C. W. Davis, M. A. Samuel, S. L. Hanna, B. A. Puffer, and R. W. Doms. 2005. An infectious West Nile vírus that expresses a GFP reporter gene. Virology 334:28-40), ao obter a inserção de módulos de expressão semelhantes ao descrito acima, mas utilizando o gene de GFP como indicador de replicação viral. Diversos isolados virais, analisados após 2 passagens em células em cultura, levaram à perda dos nucleotídeos que compõem a SIER, assim como parte do gene que codifica GFP.

[0048] A sexta abordagem possível no uso do vírus FA 17D para expressão de antígenos heterólogos refere-se ao desenvolvimento de replicons. Estas moléculas correspondem a partes do genoma viral do qual foram removidos os genes estruturais necessários para a produção de partículas virais, embora mantenham todos os elementos necessários para a replicação do RNA em si. A amplificação do RNA no citoplasma de células transfectadas permite a expressão transitória de genes heterólogos, expressão esta que sugere a possibilidade de uso em vacinação (Harvey, T. J., W. J. Liu, X. J. Wang, R. Linedale, M. Jacobs, A. Davidson, T. T. Le, I. Anraku, A. Suhrbier, P. Y. Shi, and A. A. Khromykh. 2004. Tetracycline-inducible packaging cell line for production of flavivírus replicon particles. J Virol 78:531-8; Khromykh, A. A. 2000. Replicon-based vectors of positive strand RNA víruses. Curr Opin Mol Ther 2:555-69; Tannis, L. L., A. Gauthier, C. Evelegh, R. Parsons, D. Nyholt, A. Khromykh, and J. L. Bramson. 2005. Semliki forest vírus and Kunjin vírus RNA replicons elicit comparable cellular immunity but distinct humoral immunity. Vaccine 23:4189-94; Westaway, E. G., J. M. Mackenzie, and A. A. Khromykh. 2003. Kunjin RNA replication and applications of Kunjin replicons. Adv Vírus Res 59:99-140).

[0049] Jones e colaboradores (Jones, C. T., C. G. Patkar, and R. J. Kuhn. 2005. Construction and applications of yellow fever vírus replicons. Virology 331:247-59) descreveram recentemente uma série de replicons baseados no genoma do vírus 17D. Estes replicons consistem do genoma do vírus 17D desprovido da região estrutural, a qual codifica os genes das proteínas C-prM-E (nucleotídeos 179 a 2382). Somente os primeiros 21 aminoácidos de C e os últimos 24 resíduos de E foram mantidos. Três genes heterólogos foram inseridos e expressos nestes replicons de maneira dependente de replicação do RNA, substituindo as seqüências dos genes estruturais. No entanto, nenhuma evidência da estabilidade genética dos genes heterólogos, assim como estudos sobre a imunogenicidade dos produtos dos mesmos, foi abordada. Os níveis de expressão das proteínas heterólogas também não foram especificados, de modo que a utilização deste sistema para o desenvolvimento de novas vacinas não foi estabelecida. As aplicações principais deste sistema de expressão, baseado no genoma do vírus 17D, se limitam a estudos sobre mecanismos de replicação do ARN virai, empacotamento do ARN e formação de partículas virais.

[0050] É importante ressaltar que as diversas metodologias descritas até o momento neste documento, para a inserção e expressão de genes heterólogos em flavivírus recombinantes, assim como o objeto deste documento, são também abordagens com ampla aplicação na expressão, não somente do todo, mas de parte do genoma viral, em plasmídeos e replicons de DNA e RNA ou, até mesmo, em outros sistemas virais infectivos ou não (Khromykh, A.A., Westaway, E.G., 1997. Subgenomic replicons of the flavivirus Kunjin: construction and applications. J. Virol. 71 (2), 1497- 1505; Kofler, R.M., Aberle, J.H., Aberle, S.W., Allison, S.L., Heinz, F.X., Mandl, C.W., 2004. Mimicking live flavivirus immunization with a noninfectious RNA vaccine. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 1951-1956; Aberle, J.H., Aberle, S.W., Kofler, R.M., Mandl, C.W., 2005. Humoral and cellular imune response to RNA immunization with flavivirus replicons derived from tick- borne encephalitis virus. J. Virol. 79, 15107-15113; Aleshin, S.E., Timofeev, A.V., Khoretonenko, M.V., Zakharova, Pashvykina, G.V., Stephenson, J.R., Shneider, A.M., Altstein, A.D. 2005. Combined prime-boost vaccination against tick-borne encephalitis (TBE) using a recombinant vaccinia virus and a bacterial plasmid both expressing TBE virus non-structural NS1 protein. BMC Microbiology 5:45-49; Konishi, E., Kosugi, S., Imoto, J. 2006. Dengue tetravalent DNA vaccine inducing neutralizing antibody and an amnestic responses to focar serotypes in mire Vaccine 24: 2200-2207; Mason, P.W., Shustov, A.V., Frolov, I. 2006). Production and characterization of vaccines based on flaviviruses defective in replication. Virology 351 432-443.

[0051] A sétima e última abordagem possível até o momento, utilizando-se o vírus de FA 17D como vetor de expressão, refere-se ao objeto da presente invenção. Neste caso, dada a impossibilidade de se regenerar vírus 17D contendo inserções mais longas do que epítopos virais (> 36 aminoácidos), seja em regiões intergênicas clivadas pela protease viral ou na região 3"NTR, o nosso grupo estabeleceu uma nova abordagem para este fim. Esta alternativa é baseada na inserção de seqüências heterólogas - incluindo, mas não limitadas àquelas de 10 à 2.000 nucleotídeos - entre os genes que codificam as proteínas E e NS1 do vírus 17D. Esta abordagem é semelhante, teoricamente, à inserção entre genes que codificam proteínas clivadas pela protease viral. No entanto, a clivagem entre E e NS1 é realizada por enzima celular (signalase) presente no retículo endoplasmático, de modo que os sítios de clivagem e outros elementos estruturais necessários para a viabilidade viral são diferentes, constituindo-se na novidade desta metodologia.

[0052] O retículo endoplasmático serve como porta de entrada para as proteínas destinadas a todos os compartimentos da via secretora, isto é, para a membrana plasmática, o exterior celular e organelas endociticas. A maioria das proteínas de membrana e via secretora são co-traducionalmente integradas na membrana RE, ou passam por esta para o lúmen do RE via sítios específicos da membrana.

[0053] O endereçamento destas proteínas para o RE é promovido pela presença de seqüências sinais nestas proteínas. As seqüências sinais são altamente degeneradas e essencialmente, não carregadas, com predominância de resíduos hidrofóbicos, e com tamanho médio de 7 a 12 aminoácidos de proteínas (von Heijne, G. 1990. The signa]. peptide. J Membr Biol 115:195201).

[0054] Numa primeira etapa, a seqüência sinal é reconhecida, ao começar a emergir do túnel de saída do ribossomo durante o processo de tradução protéica, por uma partícula de reconhecimento do sinal, de natureza ribonucleoproteíca (SRP: "signal recognition particle); (Halic, M., and R. Beckmann. 2005. The signal recognition particle and its interactions during protein targeting. Curr Opin Struct Biol 15:116-25; Walter, P., and A. E. Johnson. 1994. Signal sequence recognition and protein targeting to the endoplasmic reticulum membrane. Annu Rev Cell Biol 10:87119). Ocorre, então, a ligação do motivo a uma fenda hidrofóbica composta por um grupo de metioninas na subunidade de 54 kDa da SRP (Keenan, R. J., D. M. Freymann, P. Walter, and R. M. Stroud. 1998. Crystal structure of the signal sequence binding subunit of the signal recognition particle. Cell 94:181-91; Lutcke, H., S. High, K. Romisch, A. J. Ashford, and B. Dobberstein. 1992. The methionine-rich domain of the 54 kDa subunit of signal recognition particle is sufficient for the interaction with signal sequences. Embo J 11:1543-51; Zopf, D., H. D. Bernstein, A. E. Johnson, and P. Walter. 1990. The methionine-rich domain of the 54 kd protein subunit of the signal recognition particle contains an RNA binding site and can be crosslinked to a signal sequence. Embo J 9:4511-7). Em eucariotos, esta associação acarreta em um retardo da elongação da síntese do polipeptídeo durante o processo de tradução. Este complexo liga-se à membrana do RE por um receptor especifico (Keenan, R. J., D. M. Freymann, R. M. Stroud, and P. Walter. 2001. The signal recognition particle. Annu Rev Biochem 70:755-75). Tanto o receptor do complexo SRP- peptideo sinal quanto SRP são GTPases (Egea, P. F., S. O. Shan, J. Napetschnig, D. F. Savage, P. Walter, and R. M. Stroud. 2004. Substrate twinning activates the signal recognition particle and its receptor. Nature 427:215-21; Focia, P. J., I. V. Shepotinovskaya, J. A. Seidler, and D. M. Freymann. 2004. Heterodimeric GTPase core of the SRP targeting complex. Science 303:373-7), que sofrem ativação recíproca, fazendo com que o peptídeo sinal seja liberado do complexo de endereçamento e levado ao alinhamento do túnel de saída ribossomo, como o canal aquoso de entrada da proteína no RE, ou translocon (Beckmann, R., C. M. Spahn, N. Eswar, J. Helmers, P. A. Penczek, A. Sali, J. Frank, and G. Blobel. 2001. Architecture of the protein-conducting channel associated with the translating 80S ribosome. Cell 107:361-72; Menetret, J. F., A. Neuhof, D. G. Morgan, K. Plath, M. Radermacher, T. A. Rapoport, and C. W. Akey. 2000. The structure of ribosome-channel complexas engaged in protein translocation. Mol Cell 6:1219-32).

[0055] Os tranlocons são compostos de várias proteínas da membrana RE, que se associam de maneira a formar um poro aquoso, através do qual proteínas secretadas e domínio do lúmen de proteínas de membrana passam do citosol para o RE (Johnson, A. E., and M_ A, van Waes. 1999. The translocon: a dynamic gateway at the ER membrane. Annu Rev Cell Dev Biol 15:799-842). O translocon tem um papel importante na integração de proteínas de membrana (Do, H., D. Falcone, J. Lin, D. W. Andrews, and A. E. Johnson. 1996. The cotranslational integration of membrane proteins into the phospholipid bilayer is a multistep process. Cell 85:36978; Heinrich, S. U., W. Mothes, J. Brunner, and T. A. Rapoport. 2000. The Sec6lp complex mediates the integration of a membrane protein by allowing lipid partitioning of the transmembrane domain. Cell 102:233-44; Higy, M., T. Junne, and M. Spiess. 2004. Topogenesis of membrane proteins at the endoplasmic reticulum. Biochemistry 43:12716-22; Martoglio, B., and B. Dobberstein. 1995. Protein insertion into the membrane of the endoplasmic reticulum: the architecture of the translocation cite. Cold Spring Harb Symp Quant Biol 60:41-5; Mothes, W., S. U. Heinrich, R. Graf, I. Nilsson, G. von Heijne, J. Brunner, and T. A. Rapoport. 1997. Molecular mechanism of membrane protein integration into the endoplasmic reticulum. Cell 89:52333), portanto na topologia destas proteínas. O mecanismo pelo qual a topologia de uma proteína é dirigida pela maquinaria celular de translocação é complexo. Assim, uma proteína com um único domínio de membrana precisa translocar certos domínios no lúmen do RE, deixar outros no citosol e orientar o segmento transmembranar e o mover do canal de translocação aquoso para bicamada lipídica. Características tais como tamanho e hidrofobicidade dos segmentos transmembranares, distribuição de cargas dos resíduos franqueadores e tamanho e estado de enovelamento dos resíduos flanqueadores podem afetar a topologia da proteína na membrana (Beltzer, J. P., K. Fiedler, C. Fuhrer, I. Geffen, C. Handschin, H. P. Wessels, and M. Spiess. 1991. Charged residues are major determinants of the transmembrane orientation of a signal-anchor sequence. J Biol Chem 266:973-8; Gafvelin, G., M. Sakaguchi, H. Andersson, and G. von Heijne. 1997. Topological rules for membrane protein assembly in eukaryotic cells. J Biol Chem 272:6119-27; Higy, M., T. Junne, and M. Spiess. 2004. Topogenesis of membrane proteins at the endoplasmic reticulum. Biochemistry 43:12716-22; Parks, G. D., and R. A. Lamb. 1991. Topology of eukaryotic type II membrane proteins: importance of N-terminal positively charged residues flanking the hydrophobic domain. Cell 64:777-87; Sakaguchi, M., R. Tomiyoshi, T. Kuroiwa, K. Mihara, and T. Omura. 1992. Functions of signal and signalanchor sequentes are determined by the balance between the hydrophobic segment and the N-terminal charge. Proc Natl Acad Sci U S A 89:16-9; Spiess, M. 1995. Heads or tails--what determines the orientation of proteins in the membrane. FEBS Lett 369:76-9; von Heijne, G. 1989. Control of topology and mode of assembly of a polytopic membrane protein by positively charged residues. Nature 341:456-8; Wahlberg, J. M., and M. Spiess. 1997. Multiple determinants direct the orientation of signal-anchor proteins: the topogenic role of the hydrophobic signal domain. J Cell Biol 137:555-62).

[0056] Na entrada no translocon, o peptideo sinal é orientado em relação à membrana para o inicio da translocação da sua seqüência N- ou C- terminal através da membrana. A fração hidrofilica do polipeptideo é transferida, então, pelo canal aquoso para o lúmen do RE, e o sinal liberado lateralmente na membrana lipídica. Por outro lado, outros segmentos da proteína podem parar ou reiniciar a sua transferência para o RE e se integrar à bicamada lipidica RE como domínios de transmembrana (TM), podendo gerar proteínas com múltiplas inserções de alfa hélices na bicamada lipídica (Higy, M., T. Junne, and M. Spiess. 2004. Topogenesis of membrane proteins at the endoplasmic reticulum. Biochemistry 43:12716-22). Os domínios TM que promovem a integração à membrana, geralmente consistem de 20 a 25 aminoácidos não polares, um tamanho suficiente para transpassar a bicamada lipídica da membrana.

[0057] A Figura 5 é referente ao processamento da poliproteína dos flavivírus por proteases celular e viral. Em (A), sítios de proteólise da poliproteína viral para geração das proteínas estruturais, componentes do envelope viral e não estruturais, envolvidas no processo de replicação virai. As estrelas (*) representam a glicosilação ligada à asparagina de certas proteínas virais, as setas cinza escuro destacam os sítios de clivagem pela peptidase sinal, e os triângulos cinza representam os sítios de proteólise do complexo proteolítico virai (NS2B/NS3). O símbolo ? representa o ponto de clivagem entre as proteínas virais NS1/NS2A, no qual atua uma protease celular ainda não determinada. A proteína prM é, posteriormente, processada pela protease furina na liberação da partícula viral da célula (Stadler, K., Allison, S.L., Schalich, J. and Heinz, F.X. 1997. Proteolytic activation of tick- borne encephalitis vírus by furin. J Virol. 71:8475-8481). Em (B), topologia de membrana das proteínas estruturais prM e E, as quais são translocadas para o RE celular e encontram-se associadas a sua membrana por meio de dois domínios de hélices transmembranares, que estão indicadas por cilindros. Os sítios de clivagem pela signalase e a protease virai NS2B/NS3 são assinalados conforme a nomenclatura abaixo da figura.

[0058] Em flavivírus, a poliproteína precursora virai das proteínas estruturais e não estruturais perpassa a membrana RE em vários pontos e é assim processada: no lado do lúmen da membrana RE, pelas enzimas celulares, signalases, e no lado citoplasmático, pelo complexo proteolitico viral, NS2B/NS3 (Figura 5A). O RE e o sitio de montagem da partícula viral, que são formadas através do transporte dos virions para o exterior celular, por meio da via exótica ou secretora (Mackenzie, J. M., and E. G. Westaway. 2001. Assembly and maturation of the flavivírus Kunjin vírus appear to occur in the rough endoplasmic reticulum and along the secretory pathway, respectively. J Virol 75:10787-99).

[0059] A clivagem da poliproteína nos sítios intergênicos C/prM, prM/E e E/NS1, realizadas pela signalase, geram as proteínas estruturais prM e E, que ficam ancoradas na face luminal da membrana do RE e formam o envelope virai dos flavivírus. As proteínas prM e E do envelope de flavivírus são proteínas de membrana do tipo I (Higy, M., T. Junne, and M. Spiess. 2004. Topogenesis of membrane proteins at the endoplasmic reticulum. Biochemistry 43:12716-22; Paetzel, M., A. Karla, N. C. Strynadka, and R. E. Dalbey. 2002. Signal peptidases. Chem Rev 102:4549-80); isto é, a translocação destas proteínas para o lúmen do RE é iniciada pela extremidade amino da cadeia polipeptídica, a qual se associa ao translocon, sofrendo clivagem pela signalase. Isto leva à remoção do peptídeo sinal e a conseqüente liberação do N-terminal processado da proteína para o lúmen RE (Figura 5 B). As proteínas prM e E são ancoradas pelo seu carboxi-terminal nas membranas celulares e virai. Estes domínios são compostos de dois trechos hidrofóbicos separados por um pequeno fragmento contendo pelo menos um resíduo hidrofóbico. Assim, no lado do lúmen do RE, prM e E formam um heterodímero estável que formara o envelope viral (Allison, S. L., K. Stadler, C. W. Mandl, C. Kunz, and F. X. Heinz. 1995. Synthesis and secretion of recombinant tick-borne encephalitis vírus protein E in soluble and particulate form. J Virol 69:5816-20; Konishi, E., and P. W. Mason. 1993. Proper maturation of the Japanese encephalitis vírus envelope glycoprotein requires cosynthesis with the premembrane protein. J Virol 67:16725; Lorenz, I. C., S. L. Allison, F. X. Heinz, and A. Helenius. 2002. Folding and dimerization of tick-borne encephalitis vírus envelope proteins prM and E in the endoplasmic reticulum. J Virol 76:5480-91). Assim, as proteínas do envelope virai prM e E possuem dois domínios transmembranares (TM1 e 2; Figura 5, painel B), os quais promovem a sua associação à bicamada lipídica, a primeira, no sentido amino para o carboxi terminal da cadeia polipeptídica, consiste de uma seqüência de parada de transferência da proteína para o lúmen do RE, e a segunda, da seqüência sinal para importação e processamento no RE.

[0060] Os dois domínios TM das proteínas E e prM formam alfa- hélices antiparalelas, sem contato entre si, as quais atravessam a membrana do lúmen do RE para o citoplasma e de novo o lúmen (Figura 5, painel E). Por sua vez, o fragmento de 4 a 6 aminoácidos, ricos em resíduos polares que serve de ligação entre estes dois domínios TM, parece estar associado à camada interna de grupos polares fosfolipídios da membrana (Allison, S. L., K. Stiasny, K. Stadler, C. W. Mandl, and F. X. Heinz. 1999. Mapping of functional elements in the stem-anchor region of tick-borne encephalitis vírus envelope protein E. J Virol 73:5605-12; Mukhopadhyay, S., R. J. Kuhn, and M. G. Rossmann. 2005. A structural perspective of the flavivírus life cycle. Nat Rev Microbial 3:13-22; Stiasny, K., S. L. Allison, A. Marchler-Bauer, C. Kunz, and F. X. Heinz. 1996. Structural requirements for low-pH-induced rearrangements in the envelope glycoprotein of tick-borne encephalitis vírus. J Virol 70:8142-7; Zhang, W., P. R. Chipman, J. Corver, P. R. Johnson, Y. Zhang, S. Mukhopadhyay, T. S. Baker, J. H. Strauss, M. G. Rossmann, and R. J. Kuhn. 2003. Visualization of membrane protein domains by cryo-electron microscopy of dengue vírus. Nat Struct Biol 10:907-12).

[0061] A proteína do capsideo (C) é separada da prM, proteína precursora da proteína de membrana ou M, por uma seqüência sinal que direciona a translocação de prM. No entanto, para que ocorra a clivagem do peptideo sinal e formação do término COOE da proteína C e o N-terminal de prM, é estritamente necessário que o complexo proteolítico NS2B/NS3 catalise primeiramente o término C0014 da proteína C no lado citoplasmático da membrana RE (Figura 5 B). Este é o único sítio da região da poliproteína contendo as proteínas estruturais que é processado por esta enzima (Amberg, S. M., A. Nestorowicz, D. W. McCourt, and C. M. Rice. 1994. NS2B-3 proteinase-mediated processing in the yellow fever vírus structural region: in vitro and in vivo studies. J Virol 68:3794-802; Lobigs, M. 1993. Flavivírus premembrane protein cleavage and spike heterodimer secretion require the function of the vira' proteinase NS3. Proc Natl Acad Sci U S A 90:6218-22; Yamshchikov, V. F., and R. W. Compans. 1993. Regulation of the late events in flavivírus protein processing and maturation. Virology 192:38-51). Somente após esta clivagem é que acontece a clivagem do peptídeo sinal pela peptidase sinal, provavelmente, devido à conversão do sítio de clivagem peptidase sinal de uma conformação críptica para uma acessível (Lobigs, M. 1993. Flavivírus premembrane protein cleavage and spike heterodimer secretion require the function of the virai proteinase NS3. Proc Natl Acad Sci U S A 90:6218-22). O processo de clivagem do peptídeo sinal da proteína prM pela peptidase sinal é modulado pela hidrólise inicial do C-terminal da proteína C pela protease virai. Assim, somente após a clivagem e geração da proteína C matura é que ocorre a hidrólise do peptídeo sinal, e a conseqüente liberação do N-terminal da proteína prM no lúmen do RE. Esta etapa é conservada entre os flavivírus, indicando a sua natureza reguladora durante o processamento da região estrutural da poliproteina (Amberg, S. M., and C. M. Rice. 1999. Mutagenesis of the NS2B-NS3-mediated cleavage site in the flavivírus capsid protein demonstrates a requirement for coordinated processing. J Virol 73:808394; Stocks, C. E., and M. Lobigs. 1998. Signal peptidase cleavage at the flavivirus C-prM junction: dependence on the viral NS2B-3 protease for efficient processing requires determinants in C, the signal peptide, and prM. J Virol 72:2141-9). Neste sentido, foi mostrado que este processamento coordenado é critico para a incorporação do nucleocapsídeo durante a formação de partículas virais no RE (Lee, E., C. E. Stocks, S. M. Amberg, C. M. Rice, and M. Lobigs. 2000. Mutagenesis of the signal sequente of yellow fever vírus prM protein: enhancement of signalase cleavage In vitro is lethal for vírus production. J Virol 74:24-32; Lobigs, M., and E. Lee. 2004. Inefficient signalase cleavage promotes efficient nucleocapsid incorporation into budding flavivírus membranes. J Virol 78:178-86; Stocks, C. E., and M. Lobigs. 1998. Signal peptidase cleavage at the flavivírus C-prM junction: dependence on the viral NS2B-3 protease for efficient processing requires determinants in C, the signa' peptide, and prM. J Virol 72:2141-9). Portanto, a coordenação das clivagens citosólicas, e do lúmen do RE na junção C/prM, é imprescindível para que ocorra uma incorporação eficiente do nucleocapsídeo às membranas contendo as proteínas do envelope virai, pois o brotamento de partículas subvirais, contendo somente as proteínas do envelope virai, independe da proteína C ou da montagem do nucleocapsídeo (Allison, S. L., K. Stadler, C. W. Mandl, C. Kunz, and F. X. Heinz. 1995. Synthesis and secretion of recombinant tick- borne encephalitis vírus protein E in soluble and particulate form. J Virol 69:581620; Lorenz, I. C., S. L. Allison, F. X. Heinz, and A. Helenius. 2002. Folding and dimerization of tick-borne encephalitis vírus envelope proteins prM and E in the endoplasmic reticulum. J Vital 76:5480-91).

[0062] A porção C-terminal da proteína prM contém dois trechos hidrofóbicos adjacentes, interrompidos por um resíduo carregado; que agem, o primeiro trecho transmembranar, como um sinal de parada de transferência da prM, e o segundo, como uma seqüência sinal para a translocação da proteína E para o RE (Markoff, L. 1989. In vitro processing of dengue vírus structural proteins: cleavage of the pre-membrane protein. J Virol 63:3345-52; Ruiz-Linares, A., A. Cahour, P. Despres, M. Girard, and M. Bouloy. 1989. Processing of yellow fever vírus polyprotein: role of cellular proteases in maturation of the structural proteins. J Virol 63:4199-209). Duas seqüências transmembranares adjacentes atuam da mesma forma, mediando parada da translocação da proteína E e a entrada no RE da proteína NS1. De um modo geral, o processamento por peptidases sinais é importante para a importação das proteínas prM, E e NS1 para o RE, e para a geração do seu extremo N- terminal.

[0063] Cocquerel e colaboradores (Cocquerel, L., C. Wychowski, F. Minner, F. Penin, and J. Dubuisson. 2000. Charged residues in the transmembrane domains of hepatitis C vírus glycoproteins play a major role in the processing, subcellular localization, and assembly of these envelope proteins. J Virol 74:3623-33), ao analisarem as seqüências C-terminais das proteínas do envelope virai de flavivírus, puderam demonstrar que esta organização é muito similar a encontrada no vírus da Hepatite C e em outros membros da Família Flaviviridae. Pode-se determinar, também, que as seqüências que conectam os dois domínios TM, dentre os diferentes grupos, possuem padrões específicos relacionados a estes diferentes grupos de vírus; mas a presença de pelo menos um grupo positivamente carregado (R ou K) nesta região foi geral, indicando uma função importante. A comparação deste fragmento entre diferentes grupos de vírus da família Flaviviridae aponta para uma ampla variabilidade da seqüência de aminoácidos do segmento de conexão dos domínios TM entre estes diferentes grupos, indicando que estes devem estar relacionados a interações moleculares que ocorreriam especificamente dentro destes grupos (Cocquerel, L., C. Wychowski, F. Minner, F. Penin, and J. Dubuisson. 2000. Charged residues in the transmembrane domains of hepatitis C vírus glycoproteins play a major role in the processing, subcellular localization, and assembly of these envelope proteins. J Virol 74:3623-33). Notavelmente, os segmentos de conexão dos segmentos TM das proteínas estruturais em flavivírus são mais longos que os seus análogos em outros grupos, apresentando vários resíduos polareá conservados (N, Q, S e/ou T). Uma outra característica consiste no fato de que o segundo domínio TM dos flavivírus é nitidamente maior, com cerca de 19 resíduos, em relação aos outros grupos virais da família, com cerca de 12 a 13 resíduos. Mutações nos domínios TM de prM e E afetam a formação de partículas subvirais ou vírus efetivos, mas parecem não afetar a capacidade de heterodimerização das proteínas prM e E, indicando que estes domínios são sensíveis à mudança de sua seqüência de aminoácidos, e as interações entre as alfa hélices dos domínios têm um papel na formação do envelope virai (Op De Beeck, A., R. Molenkamp, M. Caron, A. Ben Younes, P. Bredenbeek, and J. Dubuisson. 2003. Role of the transmembrane domains of prM and E proteins in the formation of yellow fever vírus envelope. J Virol 77:81320). Recentemente, pôde-se estabelecer que proteínas quiméricas, expressando estes domínios transmembranares das proteínas prM e E de flavivírus, localizaram-se majoritariamente no RE, indicando que estes domínios contêm sinais de retenção no RE. É provável que ocorra o acúmulo destas proteínas no RE, levando à heterodimerização destas e o brotamento das partículas virais imaturas no lúmen do RE, a partir do qual se iniciaria a via de secreção dos virions para o meio extracelular.

[0064] Em relação à proteína E de flavivírus, estes domínios TM fazem parte de outros elementos estruturais localizados nos últimos cem resíduos de aminoácidos do C-terminal desta proteína, região denominada de haste-ancora (Allison, S. L., K. Stiasny, K. Stadler, C. W. Mandl, and F. X. Heinz. 1999. Mapping of functional elements in the stem-anchor region of tick-borne encephalitis vírus envelope protein E. J Virol 73:5605-12). Esta região não faz parte da estrutura tridimensional elucidada para o ectodomínio da proteína E de diferentes flavivírus, devido ao seu caráter hidrofóbico (Modis, Y., S. Ogata, D. Clements, and S. C. Harrison. 2003. A ligandbinding pocket in the dengue vírus envelope glycoprotein. Proc Nati Acad Sci U S A 100:6986-91; Rey, F. A., F. X. Heinz, C. Mandl, C. Kunz, and S. C. Harrison. 1995. The envelope glycoprotein from tick-borne encephalitis vírus at 2 A resolution. Nature 375:291-8). Na proteína E do vírus TBE, a região haste-ancora compreende os resíduos de 401 a 496 (Allison, S. L., K. Stiasny, K. Stadler, C. W. Mandl, and F. X. Heinz. 1999. Mapping of functional elements in the stem-anchor region of tick-borne encephalitis vírus envelope protein E. J Virol 73:5605-12; Stiasny, K., S. L. Allison, A. Marchler-Bauer, C. Kunz, and F. X. Heinz. 1996. Structural requirements for low-pH-induced rearrangements in the envelope glycoprotein of tick-borne encephalitis vírus. J Virol 70:8142-7)

[0065] A região haste conecta o ectodomínio da proteína E com a região transmembranar. Este domínio é composto de duas alfa-hélices, denominadas de Hl e H2, separadas por uma seqüência de conexão (CS) altamente conservada em flavivírus, ver a Figura 7A (Stiasny, K., Allison, S.L., Marchler-Bauer, A., Kunz, C. and F.X. Heinz. 1996. Structural requirements for low-pH-induced rearrangements in the envelope glycoprotein of tick-borne encephalitis vírus. J. Virol. 70: 8142-8147; Allison, S.L., Stiasny, K., Stadler, K., Mandl, C.W. and F.X. Heinz. 1999. Mapping of functional elements in the stem-anchor region of tick-borne encephalitis viras envelope protein E. J. Virol. 73, 56055612). A primeira hélice, Hl, forma uma angulo com a camada externa de lipídios da membrana e a segunda, H2 encontra-se pousada sobre o lado da membrana externa, com o lado hidrofóbico voltado para o centro hidrofóbico da membrana (Mukhopadhyay, S., R. J. Kuhn, and M. G. Rossmann. 2005. A structural perspective of the flavivírus life cycle. Nat Rev Microbiol 3:13-22; Zhang, W., P. R. Chipman, J. Corver, P. R. Johnson, Y. Zhang, S. Mukhopadhyay, T. S. Baker, J. H. Strauss, M. G. Rossmann, and R. J. Kuhn. 2003. Visualization of membrane protein domains by cryo-electron microscopy of dengue vírus. Nat Struct Biol 10:907-12). Postula-se que a região haste faça contato com o lado da proteína E mais próximo à membrana lipidica, neutralizando a repulsão eletrostática entre os radicais fosfolipídios da membrana lipidica externa e a superfície inferior do ectodomínio da proteína E (Zhang, Y., W. Zhang, S. Ogata, D. Clements, J. H. Strauss, T. S. Baker, R. J. Kuhn, and M. G. Rossmann. 2004. Conformational changes of the flavivírus E glycoprotein. Structure (Camb) 12:1607-18). A região H1 parece estar envolvida na formação de homotrímeros da proteína E durante o processo de fusão (Allison, S. L., K. Stiasny, K. Stadler, C. W. Mandl, and F. X. Heinz. 1999. Mapping of functional elements in the stem-anchor region of tick-borne encephalitis vírus envelope protein E. J Virol 73:5605-12). Assim, proteínas truncadas faltando os domínios haste-ancora são secretadas como dímeros, sofrem dissociação em pH acido, que dispara o processo de fusão, mas não conseguem formar trímeros. Por outro lado, proteínas truncadas imediatamente após H1 podem formar trímeros em pH baixo, indicando que esta região pode estar envolvida na conversão de monômeros a trímeros durante o processo de fusão a membrana endossomica. O segundo elemento da haste, CS, é altamente conservado em flavivírus (Stiasny, K., S. L. Allison, A. Marchler-Bauer, C. Kunz, and F. X. Heinz. 1996. Structural requirements for low-pH-induced rearrangements in the envelope glycoprotein of tick-borne encephalitis vírus. J Virol 70:8142-7), indicando uma importante função ainda não definida.

[0066] O segundo elemento antipático da haste - H2, juntamente com o primeiro domínio transmembranar (TM1), são importantes para a estabilidade do dímero prM/E e pode estar interagindo diretamente com prM.

[0067] Como foi discutido anteriormente, os dois elementos transmembranares TM1 e TM2 do C-terminal da prOteína E constituem uma ancora dupla de membrana. O domínio TM2 parece ser dispensável na formação de partículas subvirais (Allison, S. L., K. Stiasny, K. Stadler, C. W. Mandl, and F. X. Heinz. 1999. Mapping of functional elements in the stemanchor region of tick-borne encephalitis vírus envelope protein E. J Virai 73:5605-12), no entanto é um componente funcional importante na formação de partículas virais e infecção virai, pois funciona como peptídeo sinal para a translocação da proteína NS1 para o lúmen do RE.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0068] O objeto da presente invenção é o desenvolvimento de um vírus vacinai, em especial um flavivírus vacinai, obtido a partir de um cDNA virai elonado, possuindo características fenotípicas de atenuação e imunogenicidade, e que seja capaz de expressar e induzir resposta imune a proteínas ou fragmentos de proteínas heterólogas..

[0069] Uma primeira concretização da presente invenção está relacionada a um método para a produção de vírus recombinante contendo seqüências de nucleotídeos codificantes do todo ou parte de proteínas heterólogas, caracterizado pelas seguintes etapas: (a) Modificação de seqüências nucleotídicas heterólogas de forma que as mesmas, ao serem clonadas e expressas no vírus vetor, possuam, na sua porção 5', nucleotídeos presentes no extremo 5' do gene NS1 deste vírus vetor ou de outros vírus ou seqüências funcionalmente equivalentes, e na sua porção 3', a região genômica correspondente ao todo ou parte dos domínios de haste e ancora da proteína E deste vírus vetor ou de outros vírus ou seqüências funcionalmente equivalentes, e assim não comprometendo a estrutura e a replicação do dito vírus vetor; (b) Inserção das seqüências heterólogas modificadas em (a) na região intergênica ao nível da proteína estrutural E e da não estrutural NS1 do vírus vetor; (c) Obtenção de vírus recombinante não patogênico e detentor de propriedades imunológicas, contendo as seqüências heterólogas estavelmente integradas no genoma viral conforme inserção na região descrita em (b) e, assim, expressando o antígeno heterólogo de modo que o mesmo induza uma resposta imune apropriada.

[0070] Uma segunda concretização da presente invenção é referente a um constructo de DNA, o qual consiste essencialmente de (i) um vetor propriamente dito; (ii) um genoma de vírus geneticamente estável, no qual serão inseridas seqüências heterólogas modificadas; e (iii) as ditas seqüências heterólogas modificadas e introduzidas em um sítio de inserção na região intergênica ao nível da proteína estrutural E e da não estrutural NS1 viral durante a etapa (a) do método supracitado.

[0071] Uma terceira concretização desta invenção está associada ao vírus recombinante produzido conforme o método supracitado, o qual contém seqüências de nucleotídeos codificantes do todo ou parte de proteínas heterólogas modificadas de acordo com a etapa (a) do método da presente invenção, e inseridas na região intergênica ao nível da proteína estrutural E e da não estutural NS1 do'vírus vetor e estavelmente integradas no genoma virai; por não ser patogênico; por possuir propriedades imunológicas e por expressar o antígeno heterólogo de modo que o mesmo induza uma resposta imune apropriada, dirigida ao vírus vetor ou formas virulentas homólogas ao mesmo e à proteína exógena por ele expressa.

[0072] Uma quarta concretização da presente invenção corresponde à composição vacinai para imunizar contra o vírus vetor ou formas virulentas homólogas ao mesmo e/ou outros patógenos, dos quais o gene da proteína heteróloga, expressa pelo vírus recombinante se originou, a qual é constituída, principalmente, pelo dito vírus obtido conforme o método supracitado.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0073] Figura 1: Organização genômica dos Flavivirus.

[0074] Figura 2: Esquema da organização estrutural dos Flavivírus, representando a partícula virai em suas formas intracelular imatura e extracelular madura.

[0075] Figura 3: Estratégia de inserção de um gene repórter no genoma do vírus FA 17D nas regiões intergênicas processadas pela protease virai NS2B/NS3.

[0076] Figura 4: Inserção de seqüências heterólogas na região 3" NTR do vírus 17D.

[0077] Figura 5: Processamento da poliproteína dos flavivírus por proteases celular e virai.

[0078] Figura 6: Ponto de clivagem da peptidase sinal na região intergênica E e NS1 dos flavivírus.

[0079] Figura 7: Comparação da topologia da proteína E e EGFP, clonada e expressa na região intergênica entre as proteínas E e NS1, na membrana do RE em um flavivírus recombinante.

[0080] Figura 8: Regiões da proteína E e NS1, usadas na montagem do cassete de expressão da proteína EGFP, no clone infeccioso FA 17D.

[0081] Figura 9: Seqüência de aminoácidos prevista para a inserção heteróloga, contendo o gene da EGFP clonado na região intergênica E/NS1.

[0082] Figura 10: Mapa do plasmídeo recombinante T3 Esa EGFP.

[0083] Figura 11: Análise da cinética da infecção de monocamada de células Vero pelo vírus 17D/Esa/5.1glic por microscopia confocal.

[0084] Figura 12: Diagrama comparativo da região genômica, compreendida entre as proteínas prM e NS1, no vírus de fenótipo 17D vacinal e recombinante 17D/Esa/5.1glic, e as respectivas posições genômicas.

[0085] Figura 13: Propriedades de propagação do vírus FA recombinante 17D/Esa/5.1glic em comparação aos vacinais 17D/14 e 17DD monocamadas de células Vero.

[0086] Figura 14: Análise da cinética de expressão da proteína fluorescente EGFP pelo vírus recombinante 17D/Esa/5.1Ta, em células Vero e por citometria de fluxo.

[0087] Figura 15: Grau de proteção dado pela imunização de camundongos BABL/c com o vírus 17D/Esa/5.1glieT3, frente ao desafio por inoculação intracerebral com 6.000 PFU do vírus da febre amarela vacinai. cepa 17DD.

[0088] Figura 16: Análise por eletroforese em gel de agarose 0,8% dos fragmentos obtidos por reação de PCR dos plasmideos T3 e T3 Esa EGFP e de preparações de RNA virai do controle 17D/E200 e do recombinante 17D/Esa/5.lglic. Esquemas ilustrativos da síntese artefatual possível devido às repetições diretas de 288 nucleotídeos ocorrentes no genoma do vírus recombinante 17D/Esa/5.1glic.

[0089] Figura 17: Estabilidade genética do vírus 17D/Esa/5.1 glic após dez passagens seriadas em monocamadas de células Vero. Análise de duas séries independentes de passagens seriadas por RT-PCR e FACS.

[0090] Figura 18: Estabilidade genética do clone viral 6 purificado por isolamento de placa de lise do vírus 17D/Esa/5.1 glic, e submetido a 15 passagens seriadas em monocamadas de células Vero. Análise de amostras por RT-PCR e FACS.

[0091] Figura 19: Mapa físico do plasmídeo recombinante pNSK Den4/FA/Esa/EGFP de 14.498 pares de bases.

[0092] Figura 20: (A) Esquema da localização do cassete de expressão heteróloga entre o gene E do vírus Den4 e o gene da proteína NS1 do vírus FA. (B) Localização dos genes estruturais, do gene NS1 e dos diferentes domínios do cassete de expressão heteróloga no genoma virai 17D/Den4/FA/Esa/EGFP/6.

[0093] Figura 21: Propriedades cinéticas de propagação do vírus quimérico 17D/Den4/FA/Esa/EGFP/6 em monocamadas de células Vero.

[0094] Figura 22: Estabilidade genética do vírus 17D/Den4/FA/ Esa/EGFP/6 após cultivo seriado em monocamadas de células Vero (20 passagens totais).

[0095] Figura 23: Mapa físico do plasmídeo recombinante T3 Esatrun EGFP.

[0096] Figura 24: Análise por microscopia ótica de fluorescência de monocamadas de células Vero infectadas pelos vírus 17D/Esat run^ /4 -giic e vírus 17D/Esa/5.1gl1c em 72 h e 96 h pós-infecção.

[0097] Figura 25: Esquema da região do genoma viral compreendida entre o gene codante da proteína prM ao da proteína NS1 no vírus recombinante 17D/Esatrun/4g11c, com o detalhamento da seqüência de aminoácidos da região haste ancora truncada associada ao cassete de expressão heterólogo.

[0098] Figura 26: Gráfico da cinética de infecção de monocamada de células Vero pelo vírus 17D/Esatruni 4glic em moi de 0,02.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0099] Inicialmente, são apresentadas definições importantes para a perfeita compreensão do escopo da presente invenção, a saber: - Vírus vetor: vírus que pode ser obtido a partir de um molde de cDNA, cuja seqüência genômica foi modificada de modo a permitir a clonagem e expressão de seqüências nucleotídicas que codificam proteínas ou parte de proteínas heterólogas provenientes de outros patógenos, especificamente na região intergênica ao nível da proteína estrutural E e da não estrutural NS1. Este vírus pode ser, mas não está limitado à, um Flavivírus, em especial o vírus amarílico cepa 17D ou seus derivados. Adicionalmente, pode ser um vírus selvagem, atenuado ou geneticamente modificado.

[00100] - Vírus recombinante: vírus que contém, inserido no seu genoma, especificamente na região intergênica ao nível da proteína estrutural E e da não estrutural NS1, seqüências de nucleotídeos codificantes do todo ou parte de proteínas heterólogas provenientes de outros patógenos. Este vírus pode ser, mas não está limitado à, um Flavivirus, em especial o vírus amarílico cepa 17D ou seus derivados. Adicionalmente, pode ser um vírus selvagem, atenuado ou geneticamente modificado. Os flavivírus recombinantes podem também ser vírus quiméricos nos quais os genes prM/E de um flavivírus é substituído pelos genes homólogos de um outro flavivírus. Tais vírus tem utilidade no desenvolvimento de vacinas para uso humano e animal, conferindo resposta imune não apenas em relação à Febre Amarela ou outra doença ocasionada por vírus, como também em relação às doenças provocadas pelos ditos outros patógenos. E, no caso específico de tal aplicação vacinai, devem ser produzidos em ovos de galinha embrionados ou em cultura de células certificadas para a produção de vacinas de uso humano (tais como células Vero, MRC-5, culturas primárias de fibroblasto de embrião de pinto ou outras nas quais os vírus recombinantes se repliquem). E, posteriormente, poderão ser utilizados, em conjunto com, pelo menos, um veículo farmacêuticamente aceitável, em composições vacinais.

[00101] - Vírus atenuado: um vírus cuja capacidade de causar uma infecção acentuada e, conseqüentemente, produzir doença, é menor quando comparado ao vírus não atenuado ou selvagem.

[00102] - Vírus selvagem: vírus que pode ser encontrado ou isolado de seres vivos em seu ambiente natural, existente em forma de estoque laboratorial, cujas características de patogenicidade são mantidas apesar de sua manutenção em laboratório sem passagens intermediárias em seu hospedeiro natural. Este vírus selvagem pode existir também na forma de vírus recombinante selvagem após sofrer manipulação genética em laboratório.

[00103] Derivados do vírus amarílico cepa 17D: se constituem em ramificações, ou sub-cepas, da cepa vacinai_ do vírus da febre amarela 17D, que são obtidas a partir desta através de um histórico diferenciado de passagens em diferentes tipos de substratos celulares permissíveis à replicação viral. Atualmente as vacinas para uso humano são derivadas de duas subcepas distintas, a 17D-204 e 17DD.

[00104] Formas virulentas homólogas ao vírus vetor: constituem-se - como formas virulentas homólogas ao vírus vetor - um vírus mais patogênico, sendo homólogo ao atenuado e diferindo do mesmo em apenas algumas posições do genoma virai_ Por exemplo, no caso do vírus vacinai. da FA (17D), este difere do vírus selvagem virulento, do qual foi derivado por passagens seriadas em cultura (processo pelo qual se acumularam as mutações genéticas), em apenas 48 nucleotídeos no genoma virai de 10862 nucleotídeos (0,44% de diferença nucleotídica), representando cerca de apenas 22 alterações de aminoácidos ao longo dos 3411 aminoácidos da poliproteína virai (cerca de 0,65% de diferenças da seqüência de aminoácidos).

[00105] Seqüências Funcionalmente Equivalentes: seqüências podem ser denominadas equivalentes se desempenharem a mesma função, sem serem idênticas do ponto de vista da seqüência de aminoácidos ou nucleotídica, frente à utilização ou aplicação considerada. As seqüências equivalentes podem ser resultado da variabilidade, ou seja, qualquer modificação, espontânea ou induzida, em uma seqüência, seja ela substituição e/ou deleção e/ou inserção de nucleotídeos, e/ou extensão e/ou encurtamento da seqüência em uma de suas extremidades. Uma variabilidade não natural pode resultar de técnicas de engenharia genética.

[00106] - Seqüências nucleotídicas heterólogas (ou exógenas) modificadas: seqüências (incluindo, mas não limitadas àquelas de 10 à 2000 nucleotídeos) proveninentes de vírus ou outros patógenos, as quais são modificadas antes da inserção no vírus vetor. Tal modificação é realizada de forma que as mesmas, ao serem clonadas e expressas no vírus vetor, possuam, na sua porção 5', nucleotídeos presentes no extremo 5' do gene NS1 deste vírus vetor ou de outros vírus ou seqüências funcionalmente equivalentes, e na sua porção 3', a região genômica correspondente ao todo ou parte dos domínios de haste e ancora da proteína E deste vírus vetor ou de outros vírus ou seqüências funcionalmente equivalentes.

[00107] - Cassete heterólogo de expressão: construção gênita para expressão no genoma virai ou equivalentes funcionais, que são desenhadas de tal modo a possuir seqüências virais fusionadas ao gene heterólogo a ser expresso de tal modo que aumente a eficiência de sua expressão. Nesta matéria, o gene EGFP é fusionado em seu terminal rodante 5' aos 27 nucleotídeos correspondentes ao Nterminal da proteína NS1 e ao seu 3'codante à seqüência gênita completa, ou parte, dos domínios haste e ancora.

[00108] Desta forma, a presente invenção está relacionada à manipulação genética de vírus, incluindo, mas não limitado à, Flavivirus, preferencialmente o vírus amarílico vacinai cepa 17D (cuja seqüência é representada por SEQ ID No 15) ou seus derivados; visando sua utilização como vetor de expressão de antígenos heterólogos e o desenvolvimento de novas vacinas vivas atenuadas.

[00109] O seguinte método é um dos objetos da presente invenção, a saber: Método para a produção de vírus recombinante contendo seqüências de nucleotídeos codificantes do todo ou parte de proteínas heterólogas, caracterizado pelas seguintes etapas: a) Modificação de seqüências nucleotídicas heterólogas de forma que as mesmas, ao serem clonadas e expressas no vírus vetor, possuam, na sua porção 5', nucleotídeos presentes no extremo 5' do gene NS1 deste vírus vetor ou de outros vírus ou seqüências funcionalmente equivalentes, e na sua porção 3', a região genômica correspondente ao todo ou parte dos domínios de haste e ancora da proteína E deste vírus vetor ou de outros vírus ou seqüências funcionalmente equivalentes, e assim não comprometendo a estrutura e a replicação do dito vírus vetor; b) Inserção das seqüências heterólogas modificadas em (a) na região intergênica ao nível da proteína estrutural E e da não estrutural NS1 do vírus vetor; c) Obtenção de vírus recombinante não patogênico e detentor de propriedades imunológicas, contendo as seqüências heterólogas estavelmente integradas no genoma viral conforme inserção na região descrita em (b) e, assim, expressando o antígeno heterólogo de modo que o mesmo induza uma resposta imune apropriada.

[00110] Em uma concretização da presente invenção, o método supracitado é caracterizado pelo fato das seqüências nucleotídicas heterólogas serem modificadas em (a) de forma que as mesmas, ao serem clonadas e expressas no vírus, possuam, na sua porção 5', os nucleotídeos descritos em SEQ ID No. 1 (codificantes da SEQ ID No 5) ou suas seqüências funcionalmente equivalentes e, na sua porção 3', a região genômica correspondente aos domínios de haste e ancora da proteína E viral conforme descrita em SEQ ID No. 3 (codificantes da SEQ ID No 7) ou suas seqüências funcionalmente equivalentes.

[00111] Porém, para o desenvolvimento do presente método e a conseqüente obtenção destes vírus recombinante, em especial de flavivírus, expressando antígenos heterólogos, foi necessário: (a) o desenho de estratégias que permitam a introdução de antígenos heterólogos, sem o comprometimento da estrutura e replicação do vírus vetor; (b) assegurar que a construção de cDNA (e os seus transcritos de RNA) gere um vírus recombinante não-patogênico e que a seqüência estranha, além disso, fique estavelmente integrada no genoma viral; e (c) garantir que o vírus recombinante resultante do método supracitado, além de ser atenuado, retenha as suas propriedades imunológicas, expressando o antígeno heterólogo, inserido de modo que o mesmo induza uma resposta imune apropriada (medida pela formação de anticorpos contra as proteínas virais e recombinantes),dirigida tanto ao virus vetor (ou formas virulentas homólogas ao mesmo) quanto ao antígeno heterólogo. Também é importante a manutenção da capacidade de replicação em culturas de células certificadas para a produção de vacinas.

[00112] Neste sentido, a presença de seqüências específicas (nucleotídeos presentes no extremo 5' do gene NS1 e a região genômica correspondente ao todo ou parte dos domínios de haste e ancora da proteína E) deste vírus vetor ou de outros vírus, em especial flavivírus, associadas à proteína exógena, visa minimizar ou eliminar potenciais efeitos negativos na replicação viral em função da inserção heteróloga na região intergênica E/NS1, pois: (1) o extremo 5' da proteína NS1 faz parte da região de reconhecimento da signalase celular para geração das proteínas E e NS1, de modo que a proteína exógena sofre o mesmo tipo de processamento, não perturbando a obtenção da proteína E, e permitindo que a proteína heteróloga seja corretamente processada pela signalase celular na membrana do retículo endoplasmático; (2) O todo ou parte dos domínios haste e ancora da proteína E, que são adicionados à proteína exógena, permitem que ocorra processamento normal da proteína virai NS1, dado que possui a seqüência sinal para processamento pela signalase da junção E/NS1.

[00113] Então, é prudente frisar que a capacidade de introduzir modificações genéticas nos vírus animais tem promovido o conhecimento sobre os mecanismos envolvidos na propagação viral, além de permitir que estes comecem a ser usados como vetores de expressão de proteínas heterólogas. Vírus de DNA - como SV40, vaccinia, e herpes - são exemplos de vetores virais para a expressão de inserções exógenas.

[00114] O avanço nas técnicas de clonagem molecular levou, mais recentemente, ao desenvolvimento dos vírus de RNA, fita positiva ou negativa, como vetores virais (Palese, P. 1998. RNA virus vectors: where are we and where do we need to go? Proc Natl Acad Sci U S A. 95:12.75012.752). Estes, potencialmente, são mais vantajosos que os vírus de DNA, pois não possuem uma fase de DNA e não são capazes de integração no genoma do hospedeiro.

[00115] Um dos mais promissores vetores virais de RNA fita positiva são os vírus do gênero Flavivírus. Dentre estes, está o vírus causador da febre amarela, para o qual existe a única vacina licenciada de vírus atenuado contra este grupo de patógenos humanos.

[00116] A vacina da febre amarela é composta pelo vírus vacina]. cepa 17D. Esta vacina é extremamente eficaz, promovendo cerca de 95 % de soroconversão e imunidade duradoura nos indivíduos vacinados; sendo possível a detecção de anticorpos neutralizantes, mesmo após períodos superiores a 30 anos da vacinação, como pode ser evidenciado em estudo feito por Poland e colaboradores (Poland, J. D., C. H. Calisher, T. P. Monath, W. G. Downs, and K. Murphy. 1981. Persistence of neutralizing antibody 3035 years after immunization with 17D yellow fever vaccine. Bull World Health Organ 59:895-900). Adicionalmente, a vacina da febre amarela possui outras propriedades atrativas que subsidiam o seu desenvolvimento como um vetor vacinal recombinante, as quais seriam: (i) uma metodologia de produção muito bem definida; (ii) consiste de uma vacina barata e de dose única;e (iii)o seu uso estimado é de cerca de 400 milhões de doses administradas, com ocorrência de poucos casos de efeitos adversos (Monath, T. P. 2001. Yellow fever: an update. Lancet Infect Dis 1:1120).

[00117] Devido a estas boas propriedades, a plataforma vacinai_ FA 170 está sendo utilizada no desenvolvimento de vacinas recombinantes humanas contra outros patógenos, para os quais, até o momento, não existem vacinas estabelecidas, a exemplos de algumas doenças causadas por flavivírus, como a encefalite japonesa (Chambers, T. J., A. Nestorowicz, P. W. Mason, and C. M. Rice. 1999. Yellow fever/Japanese encephalitis chimeric víruses: construction and biological properties. J Virol 73:3095-101; Monath, T. P., F. Guirakhoo, R. Nichols, S. Yoksan, R. Schrader, C. Murphy, P. Blum, S. Woodward, K. McCarthy, D. Mathis, C. Johnson, and P. Bedford. 2003. Chimeric live, attenuated vaccine against Japanese encephalitis (ChimeriVax-JE): phase 2 clinica' trials for safety and immunogenicity, effect of vaccine dose and schedule, and memory response to challenge with inactivated Japanese encephalitis antigen. J Infect Dis 188:1213-30) e a dengue (Guirakhoo, F., K. Pugachev, Z. Zhang, G. Myers, I. Levenbook, K. Draper, J. Lang, S. Ocran, F. Mitchell, M. Parsons, N. Brown, S. Brandler, C. Fournier, B. Barrere, F. Rizvi, A. Travassos, R. Nichols, D. Trent, and T. Monath. 2004. Safety and efficacy of chimeric yellow Fever-dengue vírus tetravalent vaccine formulations in nonhuman primates. J Virol 78:4761-75), a malaria (Bonaldo, M. C., R. C. Garratt, P. S. Caufour, M. S. Freire, M. M. Rodrigues, R. S. Nussenzweig, and R. Galler. 2002. Surface expression of an immunodominant inalaria protein B cell epitope by yellow fever vírus. J Mol Biol 315:873-85; Bonaldo, M. C., R. C. Garratt, R. S. Marchevsky, E. S. Coutinho, A. V. Jabor, L. F. Almeida, A. M. Yamamura, A. S. Duarte, P. J. Oliveira, J. O. Lizeu, L. A. Camacho, M. S. Freire, and R. Galler. 2005. Attenuation of recombinant yellow fever 17D víruses expressing foreign protein epitopes at the surface. J Virol 79:8602-13; Tao, D., G. Barba-Spaeth, U. Rai, V. Nussenzweig, C. M. Rice, and R. S. Nussenzweig. 2005. Yellow fever 17D as a vaccine vector for microbial CTL epitopes: protection in a rodent inalaria model. J Exp Med 201:201-9) e, até mesmo como pode ser visto em um estudo realizado em camundongos, dirigida a células de melanoma (McAllister, A., A. E. Arbetman, S. Mandl, C. Pena-Rossi, and R. Andino. 2000. Recombinant yellow fever víruses are effective therapeutic vaccines for treatment of murine experimental solid tumors and pulmonary metastases. J Virol 74:9197-205).

[00118] Considera-se que os vírus de RNA são mais resistentes à introdução de genes heterólogos, quando comparados aos vírus de DNA, o que pode ser constatado com os vetores bicistronicos do vírus da febre do Oeste do Nilo e o vírus da febre amarela, os quais continham sítios internos de entrada ribossomal (Documento de Patente W002089840; Pierson, T. C., M. S. Diamond, A. A. Ahmed, L. E. Valentine, C. W. Davis, M. A. Samuel, S. L. Hanna, B. A. Puffer, and R. W. Doms. 2005. An infectious West Nile vírus that expresses a GFP reporter gene. Virology 334:28-40). No entanto, deve ser considerado que estas modificações foram feitas na região 3'não traduzida do genoma dos flavivírus; região que, apesar de exibir certa variabilidade em tamanho no vírus da FA (de Filippis, A. M., R. M. Nogueira, H. G. Schatzmayr, D. S. Tavares, A. V. Jabor, S. C. Diniz, J. C. Oliveira, E. Moreira, M. P. Miagostovich, E. V. Costa, and R. Galler. 2002. Outbreak of jaundice and hemorrhagic fever in the Southeast of Brazil in 2001: detection and molecular characterization of yellow fever vírus. J Med Virol 68:6207; Mutebi, J. P., R. C. Rijnbrand, H. Wang, K. D. Ryman, E. Wang, L. D. Fulop, R. Titball, and A. D. Barrett. 2004. Genetic relationships and evolution of genotypes of yellow fever vírus and other members of the yellow fever vírus group within the Flavivírus genus based on the 3' noncoding region. J Virol 78:9652-65), apresenta-se altamente estruturada com regiões formando estruturas secundárias muito conservadas (Holden, K. L., and E. Harris. 2004. Enhancement of dengue vírus translation: role of the 3' untranslated region and the terminal 3' stem-loop domain. Virology 329:119-33; Thurner, C., C. Witwer, I. L. Hofacker, and P. F. Stadler. 2004. Conserved RNA secondary structures in Flaviviridae genomes. J Gen Virol 85:111324). Estas estão envolvidas no controle dos processos de tradução (Chiu, W. W., R. M. Kinney, and T. W. Dreher. 2005. Control of translation by the 5'- and 3'- terminal regions of the dengue vírus genome. J Virol 79:8303-15) e replicação viral (Tilgner, M., T. S. Deas, and P. Y. Shi. 2005. The flavivírus-conserved penta-nucleotide in the 3' stem-loop of the West Nile vírus genome requires a specific sequence and structure for RNA synthesis, but not for virai translation. Virology 331:375-86; You, S., B. Falgout, L. Markoff, and R. Padmanabhan. 2001. In vitro RNA synthesis from exogenous dengue viral RNA templates requires long range interactions between 5'- and 3'-terminal regions that influence RNA structure. J Biol Chem 276:15581-91; Yu, L., and L. Markoff. 2005. The topology of bulges in the long stem of the flavivírus 3' stem-loop is a major determinant of RNA replication competence. J Virol 79:2309-24). A inserção de seqüências do tipo SIER, que formam estruturas secundárias no extremo 3'não traduzido do genoma viral, poderia, então, interferir nestes processos essenciais para a viabilidade viral.

[00119] Na presente invenção, foi desenvolvida uma estratégia de inserção - de proteínas ou domínios protéicos exógenos - entre o gene codificador da proteína E e o da proteína NS1.

[00120] Este sítio de inserção representa, em primeiro lugar, um ponto vital no processo de multiplicação viral. O mesmo consiste na transição de um bloco gênico coficando as proteínas vireis constituintes da partícula virai (C, prM e E), e o outro codificando as proteínas não estruturais, que estão envolvidas no processo de replicação virai_ A inserção de uma seqüência heteróloga entre estes blocos poderia ser menos prejudicial à cascata de eventos moleculares que ocorre nesta região durante a replicação, pois estaria em uma região intergênica. E, nestas, à principio, não haveria necessidade de proximidade espacial entre as duas proteínas virais adjacentes na poliproteína recém traduzida; como, por exemplo, seria esperado entre as proteínas estruturais C, prM e E. As proteínas prM e E são translocadas seqüencialmente para o RE e interagem entre si, formando heterodímeros, os quais, por sua vez, farão parte da partícula viral. Outro exemplo seria entre as proteínas NS2B e NS3, onde a inserção de seqüências longas pode acarretar o afastamento considerável de NS2B, cofator de NS3, assim como a perda de atividade proteolítica e inibição do processamento da poliproteína viral após a sua síntese (Bonaldo, MC e Galler, R, informação não publicada).

[00121] Entretanto, para que se possa inserir genes estranhos nesta região, é necessário que sejam obedecidas certas restrições para que a poliproteína viral seja corretamente processada e o vírus seja viável. Em primeiro lugar, o ectodomínio da proteína E liga-se à membrana celular, ou do envelope viral, por meio de uma região denominada de haste e ancora. Esta região é conservada entre os diferentes membros dos flavivírus, indicando uma função importante (Cocquerel, L., C. Wychowski, F. Minner, F. Penin, and J. Dubuisson. 2000. Charged residues in the transmembrane domains of hepatitis C vírus glycoproteins play a major role in the processing, subcellular localization, and assembly of these envelope proteins. J Virol 74:3623-33; Stiasny, K., S. L. Allison, A. Marchler-Bauer, C. Kunz, and F. X. Heinz. 1996. Structural requirements for low-pH-induced rearrangements in the envelope glycoprotein of tick-borne encephalitis vírus. J Virol 70:8142-7). Tal seqüência é constituída por 96 resíduos de aminoácidos do extremo C- terminal da proteína (Allison, S. L., K. Stiasny, K. Stadler, C. W. Mandl, and F. X. Heinz. 1999. Mapping of functional elements in the stem-anchor region of tick-borne encephalitis vírus envelope protein E. J Virol 73:5605-12). O domínio haste é composto de duas alfa-hélices potenciais (H1 e H2) conectados por uma seqüência altamente conservada em flavivírus (CS), cuja função ainda não foi estabelecida. O segmento H1 parece estar envolvido no processo de conversão de monômeros a trímeros durante a fusão do envelope viral à membrana do endossoma. O segundo elemento anfipático da haste (H2), juntamente com o primeiro domínio transmembranar (TM1), são importantes para a estabilidade do dímero prM/E. O segundo trecho TM2 funciona como seqüência sinal para a importação de NS1 para o RE. Assim, a proteína E está ancorada para dentro do lúmen do RE, através de dois domínios transmembranares, TM1 e TM2, os quais promovem a sua associação à bicamada lipídica. Durante o processo de translocação da proteína E para o RE, TM1 tem a função de parar a transferência da proteína E para o lúmen do RE, além da associação à membrana RE. TM2 consiste em uma seqüência sinal, a qual promove, por sua vez, a translocação da NS1 para o lúmen do RE. O papel de cada um destes diferentes componentes da haste e ancora da proteína E não está ainda elucidado; mas, para a correta topologia da proteína E na membrana do RE, são necessárias duas seqüências iguais ou funcionalmente similares às seqüências de ancora TM1 e TM2. TM2 funciona como um peptídeo sinal, que, ao ser processado pela signalase, resulta na formação do carboxi-terminal da proteína E, além de promover a translocação da proteína NS1 para o RE.

[00122] Por estas razões, inicialmente, a tentativa de clonagem e expressão do gene da proteína autofluorescente EGFP - uma variante da proteína "Green Fluorescent Protein" ou GFP de Aquorea Victoria (Cormack, B. P., R. H. Valdivia, and S. Falkow. 1996. FACS-optimized mutants of the green fluorescent protein (GFP). Gene 173:33-8) - foi traçada em função de se flanquear este gene exógeno por estas sequências. Deste modo, não são provocados distúrbios consideráveis no endereçamento celular e processamento proteolítico das proteínas E e NS1. Outro importante aspecto a este respeito relaciona-se à existência da seqüência correta a ser clivada, pela peptidase sinal, na junção entre a seqüência ancora TM2 e o N-terminal da NS1. Pode-se constatar, na Figura 6, que o sítio - ao redor do ponto de hidrolise da ligação peptídica, para a geração dos extremos C-terminal da proteína E, e do extremo N-terminal da proteína NS1 - é muito conservado entre diferentes flavivírus. Este fato indica que os mesmos devem ser importantes para o reconhecimento e promoção da proteólise sítio especifica pela peptidase sinal na junção E-'NS1.

[00123] A Figura 6 está associada ao ponto de clivagem da peptidase sinal na região intergênica E e NS1 dos flavivírus. Em (A), alinhamento dos últimos sete resíduos do C-terminal da proteína E e os nove resíduos iniciais do N-terminal da proteína NS1 ao redor do ponto de clivagem pela signalase celular. Em (B), motivo consenso ao redor do ponto de hidrólise da ligação peptídica 4). As seqüências utilizadas no alinhamento são: vírus TBE (Genbank NC 001672), vírus da febre amarela (Genbank U17066), vírus da encefalite japonesa (JE; NC001437), da febre do Oeste do Nilo (WN; NC001563), da dengue 2 (Den 2; NC001474) e da dengue 4 (Den4; M14931). Resíduos conservados entre as espécies são indicados por sombreamento em cinza. X significa falta de conservação na posição. O alinhamento das seqüências foi realizado através do programa CLUSTAL W(1.82), que consiste em um método de alinhamento progressivo de seqüências múltiplas. Esta analise foi feita em http://www.ebi.ac.uk/clustalw/index.html.

[00124] Assim, para o correto processamento, tanto do C-terminal da proteína E quanto do N-terminal da proteína NS1, é necessário que a proteína exógena apresente, no seu N-terminal, uma seqüência de aminoácidos do N- terminal da NS1 e, no seu C-terminal, uma seqüência de aminoácidos correspondentes C-terminal da proteína E.

[00125] Portanto, a presente invenção está associada à metodologia de inserção de seqüências heterólogas entre os genes virais estruturais e não estruturais(incluindo, mas não limitado à, Flavivirus, preferencialmente o vírus amarílico vacinal cepa 17D ou seus derivados), pelo uso da estratégia de translocação e ancoramento em compartimentos celulares diversos das proteínas heterólogas através da fusão genética com as regiões denominadas haste e ancora de qualquer vírus ou de seqüências funcionalmente equivalentes.

[00126] Em uma concretização preferencial da presente invenção é empregado o vírus amarílico como vírus vetor. Logo, uma vez que o genoma do vírus amarílico é constituído de ARN, nesta invenção, qualquer manipulação do mesmo é feita ao nível do ADN complementar (cADN) clonado em plasmídeos bacterianos. Esta manipulação é realizada através da tecnologia de clones infecciosos, a qual consiste na capacidade de regenerar vírus a partir de ADN complementar clonado.

[00127] A presente invenção é descrita detalhadamente através dos exemplos apresentados abaixo. É necessário frisar que a invenção não está limitada a esses exemplos, mas que também inclui variações e modificações dentro dos limites nos quais ela funciona.

EXEMPLO 1: Desenho do cassete de expressão da proteína EGFP na região intergênica.

[00128] A seqüência gênica e de aminoácidos da EGFP é apresentada, respectivamente, na SEQ ID No. 2. e na SEQ ID No. 6.

[00129] Um dos possíveis desenhos teóricos da clonagem e expressão de uma proteína exógena na região intergênica - entre os genes codantes para as proteínas E e NS1 - consiste na inserção genômica desta seqüência heteróloga, flanqueada por seqüências genômicas dos flavivirus duplicadas nesta construção; de tal modo que isto não perturbe a translocação e localização celular das proteínas E e NS1. Neste sentido, a estratégia usada foi a de construir a inserção de forma que, no seu extremo 5' rodante, estivessem fusionados os 27 nucleotídeos correspondentes ao N-terminal da proteína NS1 e, à sua extremidade 3', a região gênica correspondente aos domínios haste e ancora do C-terminal da proteína E (Figura 7). Portanto, com estas regiões genômicas de flavivirus duplicadas flanqueando o inserto, há condições de processamento adequado da proteína E ancorada na membrana do RE - no caso, com a presença do domínio TM2 (o qual é uma seqüência sinal) e parte do extremo amino da NS1, o que permite o endereçamento ao RE e a clivagem sitio específica pela peptidase sinal da membrana do RE. Isto acarreta a formação do C-terminal da proteína E e a liberação do aminoterminal da proteína recombinante no lúmen do RE. Adicionalmente, a fusão do domínio haste e ancora, ao C-terminal da proteína exógena, promove o seu ancoramento à membrana do RE; além de possibilitar que a proteína NS1 seja translocada para o lúmen do RE, devido à presença do peptídeo sinal interno no domínio TM2.

[00130] A Figura 7 está associada a uma comparação da topologia da proteína E e EGFP - clonada e expressa, em um flavivírus recombinante, na região intergênica entre as proteínas E e NS1 na membrana do RE. Em (A), é apresentada, em uma célula infectada por um flavivírus não recombinante, a topologia de membrana esperada para a proteína E. A seta preta indica o ponto de processamento proteolítico, pela signalase, para formação do terminal carboxi desta proteína e do amino terminal da proteína NS1. Em (B), a expressão nos vírus recombinantes da proteína EGFP inserida entre as proteínas E e NS1. A proteína EGFP é fusionada, no seu amino-terminal com 9 resíduos do amino-terminal da proteína NS1 - SEQ ID No. 5 (linha preta), e a signalase celular cliva no ponto indicado (seta preta). Desta forma, há a formação do C-terminal da proteína E ancorado à membrana, liberando o amino-terminal da fusão NS1/EGFP no lúmen do RE. Este mesmo processamento seria realizado na região C-terminal do domínio haste ancora fusionado a EGFP, o que promoveria a associação da EGFP à membrana do RE e a liberação da proteína NS1 para o lúmen do RE. A seqüência prevista deste cassete de expressão contido na poliproteína viral é apresentada na SEQ ID No. 14, assim como, a seqüência de aminoácidos esperada da proteína recombinante após as etapas de processamento proteolítico (SEQ ID No. 8).

[00131] Na proteína E homologa do vírus da febre amarela, a determinação das regiões correspondentes aos domínios conservados da haste e ancora, previamente elucidados para a proteína E do vírus TBE (Allison, S. L., K. Stiasny, K. Stadler, C. W. Mandl, and F. X. Heinz. 1999. Mapping of functional elements in the stem-anchor region of tick-borne encephalitis vírus envelope protein E. J Virol 73:5605-12, Stiasny, K., S. L. Allison, A. Marchler-Bauer, C. Kunz, and F. X. Heinz. 1996. Structural requirements for low-pH-induced rearrangements in the envelope glycoprotein of tick-borne encephalitis vírus. J Virol 70:8142-7), foi efetuada através de alinhamento dos resíduos C-terminais de ambas as proteínas (Figura 8A). Após este alinhamento, as regiões correspondentes aos diferentes segmentos do domínio haste (H1,CS e H2) e ancora (TM1 e TM2) eram localizados na seqüência de resíduos da proteína E do vírus da febre amarela. Este alinhamento permitiu a definição dos segmentos de seqüências de aminoácidos a serem adicionados à proteína EGFP de acordo com a estratégia estabelecida. Uma cópia desta região inteira para o vírus da febre amarela, consistindo de 288 nucleotídeos (SEQ ID No. 3) correspondentes ao 96 resíduos de aminoácidos do final carboxi da proteína E (SEQ ID No. 7), foi fusionada à seqüência codificadora da proteína repórter autofluorescente EGFP na sua extremidade C-terminal correspondente, de modo a se reproduzir todos os motivos contidos nesta seqüência, e que são necessários para o correto endereçamento e processamento da proteína NS1, localizada posteriormente.

[00132] Um segundo tipo adicional de seqüência de aminoácidos, derivada do genoma do vírus da febre amarela, foi associada ao N-terminal da proteína EGFP. Esta seqüência representa os 9 resíduos do N-terminal da proteína NS1 (Figura 9B), os quais também são apresentados pela SEQ ID No. 5. Três em quatro aminoácidos do amino-terminal deste peptídeo são altamente conservados entre os flavivírus. Muito provavelmente, são importantes para o reconhecimento, e ligação ao centro ativo e clivagem proteolítica pela peptidase sinal associada à membrana do RE. O uso desta seqüência, fusionada à porção N-terminal da proteína heteróloga, ajuda a promover a correta clivagem entre esta e a proteína E, de modo a formar o C- terminal da proteína E matura e o N-terminal da proteína EGFP. A utilização de parte do N-terminal da proteína NS1 já foi relatada, em plasmídeos de expressão dos genes prM e E, para produção de partículas subvirais de TBE em cultura de células de eucarioto, como descrito por Allison e colaboradores (Allison, S. L., C. W. Mandl, C. Kunz, and F. X. Heinz. 1994. Expression of cloned envelope protein genes from the flavivírus tick-borne encephalitis vírus in mammalian cells and random mutagenesis by PCR. Vírus Genes 8:187-98). No trabalho destes pesquisadores, os 30 primeiros códons (120 nt) do gene da proteína NS1 foram utilizados - uma seqüência consideravelmente maior que a usada nesta construção, com o equivalente a 9 códons dos primeiros resíduos de aminoácidos do N-terminal da proteína NS1 do vírus da febre amarela (SEQ ID No. 5).

[00133] Desse modo, a clonagem deste tipo de cassete de expressão da EGFP, ou outra proteína exógena, na região intergênica F.-1%1S1 deveria promover a liberação do arnino terminal desta proteina no lúmen do RE e o ancoramento da sua extremidade carboxi à membrana RE, por meio dos domínios haste e ancora ou seqüências funcionalmente equivalentes.

[00134] Na Figura 8, são apresentadas regiões da proteína E e NS1 usadas na montagem do cassete de expressão da proteína EGFP no clone infeccioso FA 17D. Particularmente, a Figura 8(A) é relativa ao domínio haste e ancora da proteína E do vírus da febre amarela; bem como ao alinhamento da seqüência de aminoácidos dos domínios haste e ancora da proteína E do vírus TBE (resíduos de 401 a 496; Genbank NO 001672) e do vírus da febre amarela (resíduos de 398 a 493; Genbank U17066). Os resíduos conservados entre as espécies são indicados por *, com substituição conservativa por ou menos conservativa por. (B) Alinhamento dos nove resíduos da extremidade amino-terminal da proteína NS1 de diferentes flavivírus. Os resíduos conservados estão destacados em cinza nas diferentes seqüências virais. As seqüências usadas no alinhamento são, em parte, as descritas na seção (A). As demais são as descritas para o vírus da encefalite japonesa (JE; NC001437), da febre do Oeste do Nilo (WN; NC001563), da dengue 2 (Den 2; NC001474) e da dengue 4 (Den4; M14931). O alinhamento de seqüências múltiplas foi feito pelo método do CLUSTAL W, disponível em http://www.ebi.ac.uk/cgi-biniclustalw/.

EXEMPLO 2: Síntese e clonagem do cassete de expressão da EGFP.

[00135] Para a obtenção de um cassete de expressão da proteína EGFP, foram inicialmente sintetizadoS por PCR dois fragmentos de DNA: (1) um fragmento de DNA de 783 pb contendo o gene da EGFP, utilizando-se o plasmídeo pEGFP-C2 (BD Biosciences Clontech) e os oligonucleotídeos sintéticos RG 328 (SEQ ID No. 9) e RG 329 (SEQ ID No. 10). O RG 328 (SEQ ID No. 9), de polaridade positiva, continha seqüencialmente às regiões gênicas de 15 nucleotídeos correspondentes ao carboxi-terminal da proteína E, 27 nucleotídeos correspondentes aos nove primeiros aminoácidos da proteína NS1; além de 20 nucleotídeos do 5'terminal do gene da EGFP. O RG 329 (SEQ.ID No. 10), de polaridade negativa, contém seqüencialmente às regiões gênicas de 24 nucleotídeos do 3'terminal do gene da EGFP, 15 nucleotídeos correspondentes ao N-terminal dos domínios haste e ancora da proteína E; (2) Um segundo fragmento de 339 pb foi obtido, utilizando-se o plasmídeo T3 e os oligonucleotídeos sintéticos RG 330 (SEQ ID No. 11) e RG 331 (SEQ ID No. 12), de modo a se conseguir um fragmento de DNA contendo: do sentido 5'para 3' da fita codante, os 24 nucleotídeos correspondentes ao carboxi-terminal da proteína EGFP, seguida da região gênica de 288 nucleotídeos (SEQ ID No. 3), correspondente aos domínios haste e ancora da proteína E (posição genômica FA de 2165 a 2452); seguida, finalmente, da região gênica de 27 nucleotídeos, correspondente aos 9 resíduos do amino-terminal da proteína NS1 (posição genômica FA de 2453 a 2479) conforme descrito em SEQ ID No. 5.

[00136] A fusão destes dois fragmentos de DNA, para geração do cassete de expressão da proteína EGFP a ser clonado no genoma do vírus da febre amarela, foi realizada por reação de PCR com quantidades equimolares dos fragmentos de 783 pb e 339 pb, na presença de 20 pM RG 328 (SEQ ID No. 9) e de RG 331 (SEQ ID No. 12). Todas as reações de PCR foram feitas com a enzima Platinum Pfx Polymerase (Invitrogen), segundo as recomendações do fabricante. Os produtos das reações foram analisados em eletroforese de gel de agarose a 1% e purificados, posteriormente, pelo sistema de purificação de produtos de PCR (Qiagen). A Figura 9B a seqüência do mostra o produto esperado, e decorrente desta estratégia de associação de seqüências de origem virai nos extremos amino- e carboxi- terminal da proteína EGFP.

[00137] O fragmento resultante de 1071 pb foi clonado no plasmídeo pGEM-T(Promega), segundo as especificações do fabricante. Bactérias competentes E. coli MC1061 foram transformadas com 10 ng da ligação e plaqueadas em meio seletivo (LB a 1,5 % ágar contendo 50 pg/mL de ampicilina). Preparações de DNA plasmidial dos clones bacterianos recombinantes foram obtidos e submetidos à digestão com a enzima Nar I, para confirmação da clonagem do cassete de DNA de 1029 pb (SEQ ID No. 4). Um dos clones bacterianos foi escolhido, e o DNA plasmidial foi purificado conforme descrito em uma das seções abaixo.

[00138] Assim, a Figura 9B exibe a seqüência de aminoácidos, que é prevista para a inserção heteróloga, e que contém o gene da EGFP clonado na região intergênica E/NS1. (A) Seqüência de aminoácidos na região intergênica entre o domínio TM2 da proteína E e o N-terminal da proteína NS1. (B) Esta mesma região intergênica contendo a inserção do cassete de expressão heterólogo. As setas cinzas indicam o sítio de clivagem pela peptidase sinal associada à membrana do RE.

[00139] Cerca de 10 pg do plasmídeo pGEM-T, contendo o cassete de expressão da proteína EGFP, foi digerido com 3U de Nar I (Promega). A amostra foi concentrada por precipitação com etanol e ressuspensa em tampão de amostra de eletroforese, além de ser submetida à eletroforese em gel de agarose a 1%. A banda de DNA de 1029 pb (SEQ ID No. 4) foi purificada do gel pelo sistema de purificação de DNA a partir de géis de agarose (Qiagen). O material foi quantificado por espectrofotometria a 260 nm e analisado em eletroforese de gel de agarose a 1%.

[00140] O fragmento de DNA de cerca de 1 kb, contendo as extremidades coesivas Nar I, foi ligado ao plasmídeo vetor T3. Este plasmídeo é um derivado do original pYFM5.2, contendo a região central do genoma 17D, e que contém um sítio de restrição Nar I justamente na junção entre os genes codantes para a proteína E e NS1. A ligação foi feita com o plasmídeo T3, previamente digerido com Nar I, em presença de um excesso molar de 20 vezes da inserção contendo o gene da EGFP, e da enzima T4 DNA ligase (Invitrogene). O correspondente ao 10 ng da ligação foi transformado em E.coli Sure (Stratagene), que foi plaqueada em meio seletivo LB 1,5% ágar contendo 50 pg/mL de ampicilina. Realizou-se mini preparações de DNA plasmidial, a partir das colônias bacterianas resistentes à ampicilina; e as preparações de DNA plasmidial, que apresentavam um tamanho superior ao controle pT3 nativo, eram submetidas à digestão com Nar I para confirmação da clonagem do cassete. A verificação do sentido correto da inserção foi realizada por seqüenciamento nucleotídico. Desse modo, foi obtido o plasmídeo recombinante pT3 Esa EGFP, conforme a Figura 10.

[00141] Na Figura 10, é apresentado o mapa físico do plasmídeo recombinante T3 Esa EGFP. O plasmídeo original pT3, que contém parte do cDNA viral clonado (da posição genômica de 1373 a 9428), foi usado para a clonagem do cassete de expressão da proteína EGFP no sítio de inserção Nar I. Este plasmídeo recombinante foi, posteriormente, utilizado para a montagem do molde de cDNA viral

EXEMPLO 3: Preparação do molde de cDNA viral.

[00142] O molde de cDNA, utilizado na obtenção do vírus FA 17D recombinante, foi obtido pelo sistema dois plasmídeos (Rire, C. M., A. Grakoui, R. Galler, and T. J. Chambers. 1989. Transcription of infectious yellow fever RNA from full-length cDNA templates produced by in vitro ligation. New Biol 1:285-96; Documento de Patente US 6.171.854). Neste, os plasmídeos originais, pYF5'3'IV - que contém parte do genoma clonado em forma de cDNA (as extremidades 5', posição de 1 a 2.276, e 3', posição de 8.275 a 10.862) - e pYFM5.2 - contendo a porção genômica central (nt de 1.373 a 9428)- são usados para a montagem do cDNA viral completo, por meio de uma série de reações enzimáticas de corte e ligação de fragmentos de DNA. Na criação do cassete de expressão da EGFP, foi usado um derivado do pYF5'3'IV, denominado de pE200glic, que apresenta mutações no nucleotídeo 1568, as quais acarretaram na criação de um sítio de EcoRV na posição do aminoácido 200 da proteína E. Tal fato leva à mudança de dois aminoácidos (E199 D e T200I), conforme descrito por Bonaldo e colaboradores (Bonaldo, M. C., R. C. Garratt, P. S. Caufour, M. S. Freire, M. M. Rodrigues, R. S. Nussenzweig, and R. Galler. 2002. Surface expression of an immunodominant malaria protein B cell epitope by yellow fever vírus. J Moi Biol 315:873-85), e a presença do motivo de N-glicosilacão na proteína E, nas posições do genoma 1436 e 1437. O segundo plasmídeo, no qual foi clonado o cassete de expressão da proteína exógena, foi um plasmídeo derivado do pYFM5.2, denominado plasmídeo pT3/Esa/EGFP. O molde de cDNA virai foi preparado pela clivagem dos plasmídeos com as enzimas de restrição Nsi I e Sal I (Promega), de acordo com as condições recomendadas pelo fabricante. Cerca de dez μg de cada plasmídeo foram digeridas com ambas enzimas. A clivagem foi monitorada pela análise de alíquotas equivalentes a 200 ng de DNA em eletroforese em gel de agarose a 0,8% em tampão TAE. Após a clivagem completa, as enzimas foram inativadas pelo calor. Os produtos de clivagem NSiI/SalI dos plasmídeos foram ligados com T4 DNA ligase (Epicentre Technologies) de acordo com as condições estabelecidas pelo fabricante. A linearização dos diferentes moldes de cDNA foi feita pelo uso da endonuclease de restrição Xho I nas condições estabelecidas pelo fabricante (Promega). Os produtos resultantes foram precipitados com etanol e ressuspensos em tampão Tris-EDTA, pH 7,5, livre de nucleases. Uma amostra de cada preparação foi analisada em eletroforese em gel de agarose para detecção do molde e sua quantificação. As preparações foram armazenadas a -20°C até a etapa de transcrição in vitro. Obtenção de vírus FA a partir de cDNA viral: etapas de transcrição e transfecção.

[00143] A partir dos moldes de cDNA representando o genoma completo, incluindo as seqüências dos plasmídeos pE200gijc e pT3/Esa/EGFP, foram obtidas preparações de RNA viral através do sistema de transcrição in vitro da SP6 RNA (AmpliScribe SP6; Epicentre Technologies). As preparações de RNA sintetizadas in vitro foram analisadas em eletroforese em gel de agarose 0,8% em TAE. Alíquotas das preparações de RNA foram transfectadas com Lipofectamina (Invitrogen Life Sciences) em monocamadas de células Vero, como descrito por Bonaldo e colaboradores (Bonaldo, M. C., R. C. Garratt, P. S. Caufour, M. S. Freire, M. M. Rodrigues, R. S. Nussenzweig, and R. Galler. 2002. Surface expression of an immunodominant malaria protein B cell epitope by yellow fever vírus. J Mol Biol 315:873-85). Transfecção do MIA viral sintetizado IN vitro

[00144] A etapa de transfecção foi executada de modo semelhante à descrita no documento de patente US 6,171,854. A transfecção do RNA virai sintetizado in vitro deu origem a um vírus recombinante, capaz de crescer em células Vero. Este novo vírus da febre amarela recombinante foi denominado de 17D/Esa/5.1guc. Sua detecção foi realizada pelo aparecimento de efeito citopático na monocamada celular por microscopia de contraste de fase. O acompanhamento cinético da expressão da proteína EGFP foi realizado nos intervalos de tempo de 24, 48, 72, 96 e 120 horas em monocamadas de células Vero infectadas com o vírus 17D/Esa/5.1glic com uma m.o.i de 0,02, e por microscopia de fluorescência a 488 nm para detecção da expressão da proteína autofluorescente EGFP.

[00145] Para se determinar a cinética de expressão da EGFP, células Vero foram infectadas com Vírus recombinantes expressando EGFP a uma MOI de 0,02. Nos diferentes tempos, as monocamadas celulares foram lavadas duas vezes com PBS, fixadas com paraformaldeído 4% em tampão fosfato dibásico 0,1M por 10 minutos, e lavadas uma vez com tampão fosfato dibásico 0,2M. Após a fixação, as células foram coradas por 5 minutos com Azul de Evans 1%, montadas em lâminas - utilizando-se Slow Fade contendo DAPI (Slow Fade Gold reagent with DAPI - Molecular Probes) - e observadas em microscópio confocal de fluorescência Zeiss.

[00146] A Figura 11 mostra a cinética de infecção de monocamada de células Vero pelo vírus 17D/Esa/5.lgiic. Foram analisadas preparações de 24 h, 48 h, 72 h, 96 h e 120 h pós-infecção. A marcação fluorescente verde indica a presença da proteína exógena EGFP, esta majoritariamente associada ao RE celular. Para comparação, foi colocada uma das preparações da condição controle, células não infectadas, que consiste no tempo de 96 horas pós- infecção (Figura 11).

[00147] Um estoque virai foi preparado, infectando-se monocamadas de células Vero com o sobrenadante pos-transfecção em uma m.o.i de 0,1. Este estoque apresentou um título de 6,0 log10 PFU;mL e foi usado em todas as etapas de caracterização viral.

[00148] A Figura 12 apresenta um diagrama comparativo das regiões genõmicas compreendidas entre as proteínas prM e NS1 do vírus 17D vacinal (A), e do recombinante 17D/Esa/5.1guc (B). A seqüência genõmica do vírus 17D/Esa/5.1glicé mostrada na SEQ ID No. 13.

EXEMPLO 4: Característica de propagação viral: determinação da cinética de crescimento viral e fenótipo de placa de lise em monocamadas de células Vero.

[00149] A capacidade de crescimento do vírus FA recombinante obtido foi analisada, em comparação com os vírus FA vacinais 17DD e 17D/14, pela infecção em monocamadas de células Vero. Foram realizados três experimentos independentes de cinética de propagação viral em monocamadas de células Vero (62.500 células/cm2), em uma multiplicidade (m.o.i) de infecção de 0,02. Alíquotas do sobrenadante celular dos tempos pós-infecção (p.i.) de 24 h, 48 h, 72 h, 96 h, 120 h e 144 h foram coletadas e tituladas.

[00150] Nestes experimentos, foram usados dois vírus FA 17D de fenótipo vacinal como vírus controles. O vírus vacinal experimental FA17D/14 foi obtido a partir de um molde de cDNA com a seqüência da sublinhagem 17D/204, na qual foram introduzidas algumas modificações genéticas baseadas na seqüência da sublinhagem 17DD (Documento de Patente US 6.171.854). O vírus FA17D/14 possui placa de lise grande e propriedades de crescimento parecidas com o vírus vacinal 17DD. O segundo vírus trata-se de um estoque da cepa vacinal 17DD, que é a cepa utilizada na fabricação da vacina da febre amarela no Brasil, que possui fenótipo de placa grande também.

[00151] Pode-se verificar que os dois vírus vacinais experimentais - 17D/14 e o 17DD - apresentaram os picos de crescimento virai em 72 horas pós-infecção, com valores de 7,08 e 6,97 log10 PFU/mL, respectivamente. Ao se comparar os perfis cinéticos destes dois vírus controles com o vírus recombinante 17D/Esa/5.1glic, pode-se constatar que este exibe um crescimento menos pronunciado que os dos vacinais, que possuem perfis de crescimento em monocamadas de células Vero muito parecidos. No entanto, o vírus recombinante 17D/Esa/5.191i, apresenta um pico de crescimento virai de 6,63 loglOPFU/mL em 120 horas.

[00152] Apesar do vírus recombinante 17D/Esa/5.1gii, mostrar um menor potencial de propagação em monocamadas de células Vero, os títulos obtidas ainda são apropriados para a escala de produção vacinal.

[00153] A Figura 13. mostra a capacidade de replicação do vírus FA recombinante 17D/Esa/5.1Tu„ em comparação aos vacinais 17D/14 e 17DD , em monocamadas de células Vero. Estas células vêm sendo utilizadas na produção de vacinas para uso humano (Montagnon, B.J., J.C. Vincent- Falquet. 1998. Experience with the Vero cell line. Dev Biol Stand. 93:119223; Handa R., S. Teo, R. Booy. 2004. Influenza: current evidence and informed predictions. Expert Rev Vaccines. 2004 3(4):443-451; Monath, T.P., J.R. Caldwell, W. Mundt, J. Fusco, C.S. Johnson, M. Buller, J. Liu, B. Gardner, G. Downing, P.S. Blum, T. Kemp, R. Nichols, R. Weltzin. 2004. ACAM2000 clonal Vero cell culture vaccinia vírus (New York City Board of Health strain)-a second-generation smallpox vaccine for biological defense. Int J Infect Dis. 8 Suppl 2:S31-44).

EXEMPLO 5: Determinação do fenótipo de placa de lise.

[00154] A determinação morfológica de placa de lise dos vírus foi feita pelo plaqueamento em monocamadas de células Vero, crescidas à 62.500 células/ cm2em placas de 6 poços com uma cobertura de 3 mL de 0,5% agarose de baixo ponto de fusão (Promega) em meio 199 suplementado com 5 % soro fetal bovino. Neste experimento, foram usados dois vírus FA 17D de fenótipo vacinal como vírus controles. O vírus FA17D/E200 foi criado e recuperado a partir de um clone infeccioso contendo mutações no nucleotídeo 1568, criando um sitio de EcoRV na posição do aminoácido 200 da proteína E, que leva a mudança de dois aminoácidos (E199 D e T200I),o qual apresenta um fenótipo de placa intermediária, conforme descrito por Bonaldo e colaboradores (Bonaldo, M. C., R. C. Garratt, P. S. Caufour, M. S. Freire, M. M. Rodrigues, R. S. Nussenzweig, and R. Galler. 2002. Surface expression of an immunodominant malaria protein B cell epitope by yellow fever vírus. J Mol Biol 315:873-885). Utilizou-se também, como controle de placa de lise grande, o vírus 17D/14, o qual foi descrito acima. Para visualização das placas de lise foi adicionada uma solução de 10% formaldeído para fixação e a subseqüente coloração em 0,01% cristal violeta. Os valores aferidos forma obtidos através de dois experimentos independentes, nos quais foram medidas cerca de 20 placas/vírus/experimento. Os valores determinados são mostrados na Tabela 1. Tabela 1. Analise fenotipica do tamanho de placa de lise do vírus em relação a dois diferentes vírus vacinais experimentais, 17D/14 e 17D/E200.

EXEMPLO 6: Análise da expressão da proteína exógena EGFP por citometria de fluxo de células Vero infectadas pelo vírusl7D/Esa/5 - iglic.

[00155] Ao longo da infecção viral, a expressão da proteína autofluorescente EGFP em monocamadas de células Vero foi medida por citometria de fluxo em um equipamento FACScalibur (Becton Dickison; 15 mW laser de argônio, 488 nm) com um filtro FL-1, analisando-se 10.000 eventos por amostra. As células foram infectadas numa moi de 0,02 e foram preparadas nos tempos pós-infecção de 24 h, 48 h, 72 h, 96 h e 120 h pós- infecção. Células Vero foram removidas da monocamada celular por tripsinização, após lavagem da monocamada com PBS. A células foram ressuspensas e lavadas duas vezes em PBS suplementado com 4 mg/mL BSA,contadas e ajustadas para a densidade de 2,0 x 105células /mL em 1% paraformaldeído para posterior análise por citometria.

[00156] Na Figura 14, pode-se constatar que a expressão da EGFP é específica das células Vero infectadas com o vírus 17D/Esa/5.1glic, e que a sua detecção é maior nos tempos de 72 a 120 horas de infecção. A barra de 41,2 % indica, na Figura 14B, o percentual de células expressando EGFP com 120 horas de infecção. Estes resultados comprovam que o vírus recombinante 17D/Esa/5.1g.uc é capaz de promover uma expressão significativa da proteína heteróloga, mesmo em monocamadas celulares infectadas com uma moi reduzida, e que os pontos máximos de expressão são detectados a partir de 72 horas de incubação. O uso de uma moi reduzida, juntamente com o alto percentual de células fluorescentes, atestam a capacidade do vírus em replicar e disseminar para as células adjacentes.

[00157] A Figura 14 exibe a análise da cinética de expressão da proteína fluorescente EGFP pelo vírus recombinante 17D/Esa/5.1gac, em células Vero e por citometria de fluxo. (A) Células vero infectadas por vírus da febre amarela controle, 17D/E200T3, que não expressa a proteína EGFP. (B) vírus da febre amarela recombinante 17D/Esa/5.1glic T3, que expressa a proteína exógena autofluorescente EGFP clonada na região intergênica E/NS1.

EXEMPLO 7: Determinação da atenuação do vírus recombinante 17D/Esa/5.1glic em camundongos.

[00158] Como um primeiro passo para se demonstrar que o vírus recombinante 17D/Esa/5.1un, não ultrapassa o vírus vacinal 17D, em relação à característica fenotípica de neurovirulência, foram realizados testes em camundongos.

[00159] Nestes, grupos de 10 camundongos Swiss Webster (com três semanas de idade) foram inoculados, pela via intracerebral, com 3.0 logro PFU do controle vacinai 17DD e os demais vírus. O inoculo viral, estimado em 1.000 PFU em 30 μL, é aferido por titulação em monocamadas de células Vero para determinação da dose viral, e os animais são acompanhados por 21 dias. Os resultados, contidos na Tabela 2, representam a média de 3 a 5 experimentos independentes, dependendo da amostra viral. Tabela 2 Estudo da atenuação viral por teste de neurovirulência em camundongos Swiss Webster de quatro semanas.

[00160] Como pode ser evidenciado na T abela 2, o vírus da febre amarela 17D recombinante, expressando a proteína heteróloga EGFP na região intergênica E/NS1(17D/Esa/5.lglic), apresenta-se mais atenuado quando comparado aos controles 17DD e do vírus parental 17D/E200giic. O vírus vacinal 17DD promoveu 98% de mortalidade nos animais inoculados - com um tempo médio de sobrevida de 11,2 dias - e o vírus parental 17D/E200giicr 85,0% em um tempo médio de sobrevida de 11,8 dias, a inoculação intracerebral com o vírus recombinante 17D/Esa/5.1glic não acarreta em morte nos 21 dias de observação.

[00161] Estes resultados indicam que as alterações ocasionadas pela clonagem e expressão da proteína EGFP modificada, de cerca de 400 resíduos de aminoácidos, provocam um aumento do grau de atenuação viral.

EXEMPLO 8: Estudo da imunogenicidade do vírus recombinante 17D/Esa/5.1g11r

[00162] A imunogenicidade do vírus 17D/Esa/5.1guc foi aferida em camundongos. Grupo de camundongos BABL/c de 4 semanas de idade foram imunizados com cerca de 2 doses de 50.000 PFU, aplicadas, por via subcutânea,no coxim plantar em intervalos de 15 dias. Trinta dias após a ultima dose, amostras de sangue dos camundongos foram obtidas por sangria intraorbital. A resposta imune humoral de anticorpos neutralizantes, dirigidos ao vírus da febre amarela 17D, foi avaliada pelo ensaio de teste de neutralização viral por redução de plaqueamento em monocamadas de células Vero (PRNT do inglês, "Plaque Reduction Neutralization Test"). Os títulos de anticorpos neutralizantes são dados em função da maior diluição sérica capaz de inibir 50% do número de placas de lise.

[00163] Como se pode verificar na Tabela 3, os vírus FA 17D recombinantes foram capazes de induzir resposta por anticorpos neutralizantes específicos em índices comparáveis ao vírus 17DD vacinal. Ocorreu a soroconversão para o vírus da FA em 100% dos animais, que foram vacinados com o vírus recombinante 17D/Esa/5.1gric T3. E, este regime de imunização acarretou em título de anticorpos neutralizantes, dirigidos ao vírus da febre amarela , de 1:65 a > 1:520, que estão em uma faixa equiparável à determinada para o vírus controle vacinal 17DD, de 1:85 - >1:1.260. Tabela 3. Imunogenicidade do vírus 17D/E200giicT3 em camundongos BALB/c.

*Valor recíproco da maior diluição do soro de animal imunizado com cada vírus que tenha resultado em 50% de inibição de placas de lise

[00164] Após 30 dias da ultima dose, estes animais e um outro conjunto experimental independente, vacinado com o mesmo regime de doses, foram desafiados por inoculação intracerebral com uma dose media de 6.000 PFU do vírus da febre amarela vacinai 17DD. A Figura 15 mostra os valores médios de proteção provenientes de dois ensaios de imunização e desafio. Os animais foram acompanhados por 21 dias, para notificação das mortes e dias de ocorrência. Pode-se constatar, na Figura 15, que o vírus parental 17D/E200giicT3 e o recombinante 17D/Esa/5.1glicT3 promovem a proteção de 60 e 50%, respectivamente, dos animais desafiados por via intracerebral pelo vírus vacinai 17DD (com inóculo médio de 6.000 PFU), enquanto que o vírus vacinal apresenta uma taxa de proteção de cerca de 90 %.

[00165] A Figura 15 mostra o grau de proteção dado pela imunização de camundongos BABL/c com o vírus 17D/Esa/5.191i,T3, frente ao desafio por inoculação intracerebral com 6.000 PFU do vírus da febre amarela vacinal cepa 17DD. Acima da figura, é mostrado o histograma com as taxas de mortalidade no desafio de animais imunizados com vírus de fenótipo vacinal (17DD e E200glicT3), pelo vírus teste (17D/Esa/5.1glicT3) e pelo controle negativo (imunização com meio de cultura). Na parte de baixo da figura, são exibidos os valores obtidos por grupo em relação à percentagem de mortalidade, o tempo médio de sobrevida, número de animais por grupo de análise e a dose média empregada no regime de vacinação.

Exemplo 9. Estabilidade genética do vírus 17D/Esa/5.lglic

[00166] A estabilidade genética da inserção do vírus 17D/Esa/5.1glic foi aferida por meio de duas séries de dez passagens independentes em monocamadas de células Vero. Assim, ao se obter o RNA viral sintetizado in vitro, conforme descrito no exemplo 3, este foi transfectado em monocamadas de células Vero gerando partículas virais recombinantes. Esta preparação foi denominada de amostra de primeira passagem celular ou 1P, sendo, então, utilizada para a infecção de monocamadas de células Vero em garrafas T-175 cm2para o estabelecimento de um lote de amostras virais que foram empregadas na maior parte das análises efetuadas com o vírus 17D/Esa/5.1 glic. Após o aparecimento de efeito citopático, o sobrenadante virai, denominado de segunda passagem em monocamada celular ou 2P, foi coletado, aliquotado e armazenado a -70*C. Aferiu-se o título viral de amostras 2P, assim como, com a intenção de se verificar a integridade da inserção heteróloga, se procedeu à extração do RNA viral desta preparação pelo método do Trizol LS (Invitrogen, Life Technologies) e em seguida, ao procedimento de RT-PCR, pelo uso da enzima M-MLV (Promega Corporation) para a síntese do cDNA fita simples e da enzima Taq polimerase para a reação de PCR (Promega Corporation), segundo as especificações do fabricante. No caso da reação de PCR realizada em amostras de DNA plasmidial, a enzima Taq polimerase (Promega Corporation) foi também usada, segundo as especificações do fabricante. Utilizaram-se os oligonucleotídeos RG 174 (SEQ ID 16), sentido positivo e correspondente, à região genõmica 1639 a 1659 de FA e RG 19 (SEQ ID 17), sentido negativo e correspondente à região genõmica 2619 a 2639 para a obtenção de um fragmento de DNA de tamanho previsto de 2030 pares de base (pb), o qual contém toda a região heteróloga. Assim, os produtos de PCR, obtidos a partir do DNA dos plasmídeos T3 e T3 Esa EGFP, e de RT-PCR, obtidos a partir de preparações de RNA viral, foram analisados em gel de agarose 1% em tampão acetato-EDTA.

[00167] A geração de produtos de diferentes tamanhos nos experimentos de PCR em amostras do plasmídeo T3 Esa EGFP e do vírus 17D/Esa/5.1 glic pode ser justificada pela presença das repetições diretas de 288 nucleotídeos correspondentes às regiões gênicas dos domínios haste e ancora. O processo de síntese bidirecional da reação de PCR é promovido pelo pareamento dos oligonucleotídeos RG17.4 (SEQ ID 16) fita positiva, complementar à região cerca de 800 nucleotídeos que antecede o inicio 5' do cassete heterólogo de expressão da EGFP (N-terminal da NSI, gene EGFP e os domínios haste ancora da proteína E) - e RG 19 (SEQ ID 17) fita negativa, o qual pareia, na região codante da proteína NS1 posterior, 187 nucleotídeos após o término deste cassete. É possível que, durante a etapa de pareamento na reação de PCR, ocorra à associação da região gênica haste ancora do cassete heterólogo com a região homóloga, localizada na fita negativa complementar, correspondente à região génica haste ancora da proteína E (Figura 16C). O produto gerado seria mais curto, de 1001 pb, pois não conteria o cassete de inserção, e assim, igual à região genômica do vírus vetor. Por outro lado, também poderia ocorrer a situação inversa, na qual há o pareamento dos 288 nucleotídeos da região codante dos domínios haste ancora da proteína E com o homólogo complementar, fita negativa, do cassete heterólogo de expressão. Desse modo, seria originado um fragmento de PCR maior, com 3059 pb, contendo o gene EGFP duplicado (Figura 16D), que, por sua vez, também é detectado (Figura 16 A), mas em menor escala por ser sua síntese menos eficiente em função de seu comprimento mais longo. Devido a este tipo de pareamento e à síntese destes fragmentos, estes originam outros produtos secundários, como pode ser evidenciado na Figura 16, faixas 4 e 6.

[00168] Estas evidências iniciais tornaram obrigatória a análise destas amostras por outra técnica comprobatória da estabilidade genética virai, pois a utilização somente do RT-PCR não seria suficiente para sua comprovação. Assim, as amostras correspondentes às diferentes passagens seriadas foram analisadas pela técnica de citometria de fluxo, a qual permitiria a detecção simultãnea do antígeno virai e da EGFP. A relação direta do sinal entre ambas, tendo como denominador comum o número de células infectadas, indicaria a presença e funcionalidade do cassete heterólogo de expressão. Monocamadas com cerca de 106células Vero foram infectadas com vírus controle e recombinante. Após 72 horas de infecção virai (moi de 0,02), as monocamadas foram lavadas duas vezes com lmL de PBS/ 1 mM EDTA, removidas por tripsinização celular e submetidas à centrifugação a 2.000 g por 7 minutos a 4°C. As células foram então ressuspensas em paraformaldeído a 2%, e incubadas por 20 minutos a 4°C. Adicionou-se 0,5 mL de solução de PBS/ 1 mg/mL BSA, contendo saponina a 15%, e as células foram centrifugadas a 2.000 g por 7 minutos a 4°C. Adicionou-se 1 mL de PBS/BSA/saponina 15%, as células foram incubadas por 10 minutos a 4°C e centrifugadas a 2.000g por 7 minutos. A suspensão celular foi tratada com 20 pL de anticorpo anti-febre amarela (yellow fever 17D hyperirnmune ascitic fluid - mouse - NIAID, código V525701-562) diluído a 1:80 em PBS/BSA/saponina 15% por 1 hora a 4°C. Adicionou-se então 1 mL de PBS/BSA/saponina 15%, seguindo-se uma centrifugação a 2.000 g por 7 minutos e a incubação das células com 20 gL de anticorpo anti-camundongo conjugado a Ficoeritrina (DAKO; diluído a 1:40 em PBS/BSA/saponina 15%) por 30 minutos a 4°C. Adicionou-se 1 mL de PBS/BSA/saponina 15%, as células foram centrifugadas a 2.000 g por 7 minutos, o sobrenadante foi desprezado e as células foram suspensas em 0,3 mL de paraformaldeído a 2%. Para a aquisição dos dados, as células foram centrifugadas a 2000 g por 7 minutos e suspensas em 0,3mL de PBS e analisadas no citômetro de fluxo FACScalibur (Becton e Dickinson, EUA). Os dados gerados pelo citômetro foram analisados com o Programa FlowJo (TreeStar Inc, EUA).

[00169] Para determinação da estabilidade genética do vírus 17D/Esa/5.1 glic, foram realizados cultivos contínuos deste vírus em monocamadas de células Vero. No painel A da Figura 17, é apresentado o esquema ilustrativo da regeneração viral e passagens subseqüentes (10) do vírus obtido após a transfecção e no painel B, o percentual de células Vero apresentando fluorescência para os antígenos vacinais e EGFP após a infecção com vírus 17D/Esa/5.1 glic recombinante ou o vírus vetor somente. Estes resultados consistem de duas séries independentes de passagens seriadas; amostras 5P1 e 10P1, correspondentes a uma das séries e amostras 5P2 e 10P2, correspondentes ao outro experimento independente.

[00170] Na análise por citometria de fluxo (Figura 17B), foi calculado um índice percentual para cada amostra, o qual consistia na relação entre células infectadas que apresentavam dupla marcação, isto é, EGFP e antígenos virais, pelo total de células infectadas; isto é, as células com dupla marcação, EGFP e antígenos virais, mais as que somente apresentavam antígenos virais, sem fluorescência na faixa de detecção da EGFP. Portanto, este valor representa o percentual de células infectadas pelo vírus FA 17D/Esa/5.1 glic que expressam a proteína EGFP. Estas amostras foram caracterizadas também por análise por eletroforese em gel de agarose 0,8% dos fragmentos obtidos por reação de RT-PCR com os iniciadores (RG174 - SEQ ID 16 e RG19 - SEQ ID 17) a partir de RNA virai (Figura 17C). Os vírus correspondentes às passagens mostradas no painel A, e presentes no sobrenadante das culturas utilizadas para a obtenção dos dados de citometria (painel B), foram utilizados para a extração de RNA. Faixa 1, vírus vetor E200 regenerado a partir do plasmídeo pT3. Faixa 2-7, produtos de RT-PCR amplificados a partir de RNA dos vírus 17D/Esa/5.1 glic em diferentes níveis de passagem. Faixas 2 e 3, RT-PCR a partir de RNAs de estoques virais obtidos a partir de uma (1P) ou duas passagens (2P) de vírus resultante de transfecção, respectivamente. Faixas 4 - 5 e 6-7 representam os produtos de RT-PCR, os quais foram obtidos a partir de RNA de vírus na quinta e décima passagem em duas linhagens independentes (5P1 e 5P2; 10P1 e 10P2, respectivamente).

[00171] A análise simultânea das amostras virais por RT-PCR e citometria de fluxo foi realizada para as passagens seriadas 1P, 2P, das amostras das duas séries independentes de passagens seriadas - (5P1 e 10P1; 5P2 e 10P2), como pode ser visto na Figura 17.

[00172] A análise por citometria de fluxo revelou que o percentual de células positivas para antígenos virais e EGFP, após a infecção com o vírus 17D/Esa/5.lglic, variou de 76% a 92 % (Figura 17B, amostra 2P e 1P, respectivamente). Isto inclui as passagens, com valores de 85% células duplo marcadas em relação à média. O vírus FA controle 17D/E200T3 apresentou um valor basal de 0,8% de células duplo-marcadas (Figura 17B). Estes resultados sugerem que nas células, positivas quanto à presença de antígeno viral, há também EGFP. Esta conclusão é corroborada pela análise dos produtos de RT-PCR, empregando-se os oligonucleotídeos RG 174 (SEQ ID 16) e RG19 (SEQ ID 17), devido à presença da banda de 2,0 kb, indicativa da presença do cassete heterólogo de expressão em monocamadas de células Vero infectadas com o vírus FA 17D/Esa/5.1 glic até a décima passagem consecutiva (Figura 17C). A banda de 1 kb, evidenciada em todas as reações de RT-PCR a partir do RNA do vírus 17D/Esa/5.lglic detectado ao longo das passagens, estaria associada ao artefato descrito na Figura 16. Confirmando esta interpretação, a Figura 18 apresenta este mesmo tipo de estudo empregando uma população virai clonada. O sobrenadante de transfecção do vírus 17D/Esa/5.lglic 1P foi plaqueado em monocamada de células Vero, na presença de uma cobertura de agarose 0,5 % em meio 199 Earle's suplementado com 5% de soro fetal bovino (segunda passagem celular ou 2P). Após 4 dias de incubação a 37°C, foi aplicada a esta cobertura meio E 199 Earle's contendo 0,1 % de vermelho neutro, de modo a permitir a visualização de placas de lise e o seu isolamento por meio da perfuração da cobertura com uma pipeta Pasteur, da liberação do material em PBS estéril e plaqueamento de cerca de 100 pL desta suspensão em poços de placas de 24 poços contendo cerca de 100.000 células por poço. Este plaqueamento corresponderia a uma terceira passagem celular, porém cada placa de lise corresponde a um clone da população original do vírus 17D/Esa/5.lglic.

[00173] Um destes clones foi selecionado arbitrariamente para a análise da estabilidade genética e foi denominado clone 6 (Figura 18). Amostras virais do clone 6 foram obtidas até a décima quinta passagem contínua em monocamadas de células Vero e analisadas por RT-PCR e FACS (Figura 18), com exceção da amostra clonal inicial 3P, que foi somente analisada por RT-PCR, devido ao pouco volume de amostra obtido (Figura 18 C). Nos painéis da Figura 17 de A a E, são exibidos os perfis eletroforéticos da amplificação do RNA por RT-PCR e de distribuição de fluorescência de vírus 17D/Esa/5.1 glic, obtido após a transfecção na passagem 1 (painel A) e passagem 2 (painel B), e passagens 5 e do clone 6 (painéis D e E, respectivamente). No painel C, é mostrado o perfil eletroforético da amplificação do RNA por RT-PCR do estoque original do clone 6 do vírus 17D/Esa/5.1 glic, o qual foi utilizado para as passagens seriadas mostradas nos painéis D e E, e no painel F, o percentual de células Vero apresentando fluorescência para os antígenos vacinais e EGFP após a infecção com vírus 17D/Esa/5.1 glic da passagem 1 (1P) ou dois (2P) de vírus resultante de transfecção, e do clone 6 nas passagens 5 (5P) e 15 (15P).

[00174] Em todas as amostras analisadas, foi possível a disponibilizadas pelo Dr. F. Liprandi (IVIC, Venezuela). A quimera viral foi construída usando o sistema de 2 plasmídeos do clone infeccioso de FA (Rice, C. M., A. Grakoul, R. Galler, and T. J. Chambers. 1989. Transcription of infectious yellow fever RNA from full-length cDNA templates produced by in vitro ligation. New Biol 1:28596).

[00175] Os genes prM/E do vírus dengue 4 foram amplificados a partir de RNA extraído de células infectadas com oligonucleotídeos sintéticos complementares em parte ao extremo 5-do gene prM do vírus Den 4 (RG 295: 5'-GCTTGATTCCCACCGGTATGGCGTTTTCCCTCAGCACAAGAGAT GGC 3'; SEQ ID No. 18) e a região 5' do gene E (RG 296: 5' GGGCAGAATGCATGGCTCC 3'; SEQ ID No. 19), os quais codificam os sítios de AgeI e NsiI, respectivamente. Este fragmento foi clonado no plasmídeo pGl/2 (Galler, R. e Freire, M.S. 2003. Vaccines against infections caused by YF vírus; infectious cDNA, method for producing a recombinant YF vírus from the YF infectious cDNA and plasmids to assemble the infectious cDNA. Patente US 6,589,522) para criar o plasmídeo pG1/2 DEN4. A fusão entre o gene C de FA e o prM de dengue foi feita ao nível do sítio de clivagem pela signalase (Caufour, P. S., M. C. Motta, A. M. Yamamura, S. Vazquez, Ferreira, II, A. V. Jabor, M. C. Bonaldo, M. S. Freire, and R. Galler. 2001. Construction, characterization and immunogenicity of recombinant yellow fever 17D-dengue type 2 víruses. Vírus Res 79:1-14). O restante do gene E de dengue 4 foi clonado após a amplificação com os oligonucleotideos RG 297 (5' GGAGCCATGCATTCTGCCC 3', contendo o sítio NsiI; SEQ ID No. 20) e RG 298 (5' GACGCCACACAACCCATGTCGGCGCCAACT GTGAAGCCCAGAAACAGAG 3", contendo o sítio NarI; SEQ ID No. 21) no plasmideo pYFMT3 (Galler, R. e Freire, M.S. 2003. Vaccines against infections caused by YF vírus; infectious cDNA, method for producing a recombinant YF vírus from the YF infectious cDNA and plasmids to assemble the infectious cDNA. Patente US 6,589,522), o qual contém um sitio de NarI entre E e NS1, gerando o plasmídeo pT3D4Ven88. O cDNA contendo o genoma completo 17D/DEN4 foi construído a partir de uma ligação de 3 pedaços: NotI-NsiI derivado pGl/2DEN4 (com o promotor SP6, a região 5' NTR -C de FA e prM-2/3 E de DEN4), NsiI-MluI, derivado do pT3D4Ven88 (codificando o 3' do gene E de DEN4 e o gene NS1 de FA), MluI-NotI derivado do clone FA 17D/DEN1 (o qual contém o restante do qenoma de FA clonado no vetor de baixo número de cópias pACNR1180; Mateu, C.P. R.S. Marchevsky, F. Liprandi, M.C. Bonaldo, E.S.F. Coutinho, M. Dieudonné, E. Caride, A.V. Jabor, M.S. Freire, R. Galler. 2006. Construction and biological properties of Yellow Fever 17D/ Dengue type 1 recombinant vírus. Trans R Soc Trop Med Hyg, no prelo; Bonaldo, M. C., R. C. Garratt, P. S. Caufour, M. S. Freire, M. M. Rodrigues, R. S. Nussenzweig, and R. Galler. 2002. Surface expression of an immunodominant mataria protein B cell epitope by yellow fever vírus. J Mol Biol 315:873-85). Todos os plasmídeos foram propagados em E.coli XL-1 Blue.

[00176] Muitos transformastes foram obtidos e 10 clones completos foram identificados após a transformação de cada uma das linhagens, sugerindo a estabilidade genética da construção. Quatro foram selecionados por apresentarem o mapa físico correto, linearizados com XhoI e utilizados para a transcrição in vitro. O RNA foi utilizado para a regeneração virai por eletroporação de células Vero. Evidência da viabilidade virai foi visualizada inicialmente pelo efeito citopático. Os 4 clones identificados deram origem a vírus 17D/DEN4 (clones 1, 2, 4 e 5), 5-7 dias após eletroporação. RNA foi extraído das monocamadas e usado para reações de RT-PCR. Análise de restrição e sequenciamento nucleotídico dos amplicons confirmaram a estrutura quimérica do vírus. Foi realizada uma nova passagem, a partir da qual foram produzidos estoques virais de trabalho (título em torno de 6.0 1og10PFU/m1). Para as etapas posteriores de trabalho, envolvendo a clonagem molecular do cassete de expressão da proteína EGFP no genoma do vírus quimérico Den4/Fa, foi selecionado o clone de número 5 e denominado de plasmídeo pNSK Den4/FA. Clonagem molecular do cassete de expressão da proteína EGFP no genoma do vírus quimérico prM-E 17D/D4

[00177] Cerca de 10 pg do plasmideo pGEM-T, obtido conforme descrito no exemplo 2 deste documento, contendo o cassete de expressão da proteína EGFP, foi digerido com 3U de Nar I (Promega). A amostra foi concentrada por precipitação com etanol e ressuspensa em tampão de amostra de eletroforese, além de ser submetida à eletroforese em gel de agarose a 1%. A banda de DNA de 1029 pb (SEQ ID No. 4) foi purificada do gel pelo sistema de purificação de DNA a partir de géis de agarose (Qiagen). O material foi quantificado por espectrofotometria a 260 nm e analisado em eletroforese de gel de agarose a 1%.

[00178] O fragmento de DNA de cerca de 1 kb, contendo as extremidades coesivas Nar I, foi ligado ao plasmídeo pNSK Den4/FA, previamente linearizado com a enzima de restrição Nar I. Conforme foi anteriormente descrito, este sítio localiza-se neste plasmídeo justamente na junção entre os genes codantes para a proteína E do vírus dengue 4 e NS1 do vírus da febre amarela. A ligação foi feita com o plasmídeo pNSK Den4/FA, digerido com Nar I, em presença de um excesso molar de 20 vezes da inserção contendo o gene da EGFP e da enzima T4 DNA ligase (Invitrogen). O correspondente a 10 ng da ligação foi transformado em E.coli DH5a (Stratagene), que foi plaqueada em meio seletivo LB 1,5% ágar contendo 25 pg/mL de ampicilina. Realizou-se mini preparações de DNA plasmidial, a partir das colônias bacterianas resistentes à ampicilina; e as preparações de DNA plasmidial, eram submetidas à digestão com Nar I para confirmação da clonagem do cassete. A verificação do sentido correto da inserção foi realizada por seqüenciamento nucleotídico pelo uso do oligonucleotídeo sintético RG 19 (SEQ ID No. 17). Desse modo, foi obtido o plasmídeo recombinante pNSK Den4/FA/Esa/EGFP, com tamanho de 14.498 pares de bases, conforme esquematizado no mapa apresentado na Figura 19 e detalhado na seqüência SEQ ID 22, na qual cDNA genômico virai está compreendido entre a posição nucleotídica 639 e 12.543, correspondente a um genoma viral de 11.905 nucleotídeos, de acordo coma SEQ ID 23. As posições no genoma do vírus 17D/FA/Den4/Esa/EGFP/6 das seqüências dos genes C, prM e E e das seqüências componentes do cassete de expressão da proteína EGFP - os 27 nucleotídeos codantes do N-terminal da proteína NS1, o gene EGFP e os 288 nucleotídeos da porção haste ancora - são mostradas na Figura 20B. Nota-se que a inserção heteráloga é franqueada pelos sítios Nar I empregados na clonagem molecular no genoma do flavivírus, assim como por duas regiões haste-ancora: a primeira, localizada na porção 5"do gene EGFP, refere-se à porção haste ancora componente do gene codante da proteína E do vírus dengue 4, e a segunda, à porção haste ancora componente do gene que codifica a proteína E do vírus da febre amarela, a qual faz parte do cassete de expressão heterólogo (Figura 20A). Obtenção do vírus quimérico 17D/Den4/FA/Esa/EGFP

[00179] O plasmídeo pNSK Den4/FA/Esa/EGFP foi digerido com a enzima Xho I, segundo as especificações do fabricante (Promega) e a preparação de molde de cDNA resultante foi precipitada com etanol e ressuspensa em tampão Tris-EDTA, pH 7,5, livre de nucleases. A amostra da preparação foi analisada em eletroforese em gel de agarose para detecção do molde e sua quantificação. O equivalente a 100 ng de molde linearizado foi utilizado para a etapa de transcrição in vitro do RNA virai com a enzima SP6 RNA polimerase (Ampliscribe, Epicentre Technologies), de acordo com os protocolos previamente estabelecidos (Galler, R. e Freire, M.S. 2003. Vaccines against infections caused by YF vírus; infectious cDNA, method for producing a recombinant YF vírus from the YF infectious cDNA and plasmids to assemble the infectious cDNA. Patente US 6.589.522). A integridade dos transcritos de RNA foi verificada por eletroforese em gel de agarose a 0,8%/TAE. O RNA viral foi transfectado em monocamadas de células Vero na presença de Lipofectamina (Invitrogen) na concentração de 20 pg/mL em PBS. O sobrenadante da cultura foi coletado após o estabelecimento de efeito citopático e utilizado para a obtenção de estoques virais.

Determinação da cinética de crescimento viral do vírus 17D/Den4/FA/Esa/EGFP em monocamadas de células Vero.

[00180] A capacidade de crescimento do vírus 17D/Den4/FA/Esa/EGFP recombinante obtido foi analisada, em comparação com ao vírus vacinai FA17DD e ao vírus quimérico parental 17D/Den4/FA, pela infecção em monocamadas de células Vero_ Foram realizados três experimentos independentes de cinética de propagação viral em monocamadas de células Vero (62.500 células/cm2), em uma multiplicidade (m.o.i) de infecção de 0,02. Alíquotas do sobrenadante celular dos tempos pós-infecção (p.i.) de 24 h, 48 h, 72 h, 96 h, 120 h e 144 h foram coletadas e tituladas (Figura 21).

[00181] Os vírus FA 17DD e 17D/Den4/FA apresentaram os picos de crescimento viral em 72 horas pós-infecção, com valores de 7,17 e 6,69 log10 PFU/mL, respectivamente. Ao se comparar os perfis cinéticos destes dois vírus controles com o vírus recombinante 17D/Den4/FA/Esa/EGFP, pode-se constatar que este apresenta um crescimento menos pronunciado, com pico de produtividade viral de 6,31 log10 PFU/mL em 96 horas pós-infecção (Figura 21).

Estabilidade genética do vírus 17D/Den4/FA/Esa/EGFP em passagens seriadas em monocamadas de células Vero.

[00182] A estabilidade genética da inserção do vírus quimérico 17D/Den4/FA/Esa/EGFP foi aferida por meio de duas séries de vinte passagens independentes em monocamadas de células Vero. Após a transfecção do RNA virai sintetizado in vitro e do aparecimento de efeito citopático, o sobrenadante vital foi coletado e a preparação das partículas virais obtidas foi denominada de primeira passagem celular ou 1P, sendo, então, utilizada para a posterior infecção- de monocamadas de células Vero numa densidade de 62.500 células/cm2. O sobrenadante virai deste segundo ciclo de infecção foi denominado de segunda passagem em monocamada celular ou 2P, o qual foi coletado, aliquotado e armazenado a -70°C, após o aparecimento do efeito citopático em torno de 96 horas pós-infecção. O título da suspensão foi aferido para que se pudesse proceder à próxima infecção seriada numa moi de 0,02. A partir deste ponto em diante foram estabelecidas as duas séries de infecções virais consecutivas em monocamadas de células Vero, denominadas de P1 e P2. Estes procedimentos foram repetidos até se chegar à vigésima passagem seriada.

[00183] Amostras das passagens 1P, 2P, 5P1, 5P2, 10P1, 10P2, 15P1, 15P2, 20P1 e 20P2 foram submetidas à extração do RNA virai pelo método do Trizol LS (Invitrogen) e em seguida, ao procedimento de RT-PCR, pelo uso da enzima M-MLV (Promega Corporation) para a síntese do cDNA fita simples e da enzima Taq polimerase para a reação de PCR (Promega Corporation), segundo as especificações do fabricante, com o intuito de se verificar a integridade da inserção heteróloga.

[00184] Utilizaram-se os oligonucleotideos RG 367 (SEQ ID 24), sentido positivo e correspondente, à região genômica 15941612 do vírus dengue 4 e RG 19 (SEQ ID 17), sentido negativo e correspondente à região genômica 2619 a 2639 do vírus da febre amarela. No genoma do vírus 17D/Den4/FA/Esa/EGFP estes oligonucleotídeos correspondem às regiões genômicas 2276-2294 e 4301-4321, respectivamente. O tamanho previsto do fragmento de DNA contendo o cassete de expressão heteróloga da EGFP seria de 2046 pares de base (pb), enquanto a mesma região no vírus parental 17D/Den4/FA, isto é sem inserção EGFP, teria um tamanho de 1017 pb. Conforme pode ser observado na Figura 22, a banda contendo a inserção heteróloga é mantida até a vigésima passagem das duas séries de propagação independentes, indicando a estabilidade da construção expressa pelo flavivírus recombinante. Quantidades mínimas da banda de 1.017 pb podem ser observados refletindo a amplificação espúria detalhada no exemplo 9.

EXEMPLO 11: Expressão de proteína heteróloga fusionada à região genômica correspondente à parte dos domínios de haste e ancora da proteína E

[00185] Seqüências nucleotídicas heterólogas podem também ser clonadas e expressas no vírus da febre amarela vetor, de modo que a sua porção 5' mantenha nucleotídeos presentes no extremo 5' do gene NS1 deste ou de outros vírus ou seqüências funcionalmente equivalentes, e na sua porção 3', a região genômica correspondente à parte dos domínios de haste e ancora da proteína E deste vírus vetor. Assim, foi obtido o vírus da febre amarela 17D, no qual foi clonado o gene que codifica a proteína repórter EGFP (SEQ ID 2) entre os genes codantes para as proteínas E e NS1, de tal modo que no seu extremo 5' codante, estivessem fusionados os 27 nucleotídeos correspondentes ao N-terminal da proteína NS1 (SEQ ID No. 1) e, à sua extremidade 3', a região gênica de 198 nucleotídeos (SEQ ID No. 25) correspondente à parte do domínio haste, somente a região H2, seguida da região ancora contendo as duas regiões transmembranares, perfazendo um total de 66 aminoácidos (SEQ ID No. 26), resultando em um gene heterólogo de 939 pb (SEQ ID No. 29), correspondendo a uma proteína com 313 aminoácidos (SEQ ID No.30). A poliproteína precursora resultante deste vírus FA recombinante seria corretamente clivada nas regiões que flanqueiam a proteína heteróloga, devido à presença de seqüências sinais expressas no C- terminal da proteína E e da proteína heteróloga, de maneira análoga ao descrito no exemplo 2.

Síntese e clonagem do cassete de expressão da EGFP

[00186] Para a obtenção de um cassete de expressão da proteína EGFP, foram inicialmente sintetizados, por PCR, dois fragmentos de DNA: (1) um fragmento de DNA de 784 pb, contendo o gene da EGFP, utilizando-se o plasmideo pEGFP-C2 (BD Biosciences Clontech) e os oligonucleotídeos sintéticos RG 328 (SEQ ID No. 9) e RG 332 (SEQ ID No. 27). O RG 328 (SEQ ID No. 9), de polaridade positiva, continha seqüencialmente ás regiões gênicas de 15 nucleotídeos correspondentes ao carboxiterminal da proteína E, 27 nucleotídeos correspondentes aos nove primeiros aminoácidos da proteína NS1; além de 20 nucleotídeos do 5"terminal do gene da EGFP. O RG 332 (SEQ ID No. 27), de polaridade negativa, contém seqüencialmente às regiões gênicas de 22 nucleotídeos do 3'terminal do gene da EGFP, 26 nucleotídeos correspondentes ao N-terminal da região H2 dos domínios haste e ancora da proteína E.

[00187] (2) Um segundo fragmento de 247 pb foi obtido, utilizando-se o plasmídeo T3 e os oligonucleotideos sintéticos RG 333, polaridade positiva (SEQ ID No. 28) de 50 nucleotídeos correspondentes a uma região de 22 nucleotídeos codantes do C-terminal da proteína EGFP e 28 nucleotídeos correspondentes a região N-terminal de H2 do domínio haste e RG 331 (SEQ ID No. 12), senso reverso, correspondente aos 19 nucleotídeos que codificam o terminal carboxi de TM2 seguido dos 27 nucleotídeos codantes do N- terminal da proteína NS1. O fragmento de DNA resultante consiste, sentido 5' para 3' da fita codante, dos 22 nucleotídeos correspondentes ao carboxi- terminal da proteína EGFP, seguida da região gênica de 198 nucleotídeos (SEQ ID No. 25), codificadora de 66 resíduos de aminoácidos (SEQ ID No. 26), correspondente aos domínios haste truncada (somente a região H2) e da ancora da proteína E (posição genômica FA de 2255 a 2452); seguida, finalmente, da região gênica de 27 nucleotídeos, correspondente aos 9 resíduos do amino-terminal da proteína NS1 (posição genômica FA de 2453 a 2479).

[00188] A fusão destes dois fragmentos de DNA, para geração do cassete de expressão da proteína EGFP a ser clonado no genoma do vírus da febre amarela, foi realizada por reação de POR com quantidades equimolares dos fragmentos de 784 pb e 247 pb, na presença de 20 pM RG 328 (SEQ ID No. 9) e de RG 331 (SEQ ID No. 12). Todas as reações de PCR foram feitas com a enzima Platinum Pfx Polymerase (Invitrogen), segundo as recomendações do fabricante. Os produtos das reações foram analisados em eletroforese de gel de agarose a 1% e purificados, posteriormente, pelo sistema de purificação de produtos de PCR (Qiagen).

[00189] O fragmento resultante de 939 pb foi clorado no plasmídeo pGEM-T(Promega), segundo as especificações do fabricante. Bactérias competentes E. coli MC1061 foram transformadas com 10 ng da ligação e plaqueadas em meio seletivo (LB a 1,5 % ágar contendo 50 pg/ml, de ampicilina). Preparações de DNA plasmidial dos clones bacterianos recombinantes foram obtidas e submetidas à digestão com a enzima Nar I, para confirmação da clonagem do cassete de DNA de 939 pb (SEQ ID No. 29) codificando uma proteína de 313 resíduos de aminoácidos (SEQ ID No. 30). Um dos clones bacterianos foi escolhido, e o DNA plasmidial foi seqüenciado para confirmação da orientação e integridade da inserção.

[00190] Cerca de 10 pg do plasmídeo pGEM-T, contendo o cassete de expressão da proteína EGFP, foi digerido com 3U de Nar I (Promega). A amostra foi concentrada por precipitação com etanol e ressuspensa em tampão de amostra de eletroforese, além de ser submetida à eletroforese em gel de agarose a 1%. A banda de DNA de 939 pb (SEQ ID No. 29) foi purificada do gel pelo sistema de purificação de DNA a partir de géis de agarose (Qiagen). O material foi quantificado por espectrofotometria a 260 nm, e analisado em eletroforese de gel de agarose a 1%.

[00191] O fragmento de DNA de cerca de 1 kb, contendo as extremidades coesivas Nar I, foi ligado ao plasmídeo vetor T3, que contém parte do cDNA viral clonado (da posição genômica de 1373 a 9428), previamente digerido com Nar I, em presença de um excesso molar de 20 vezes da inserção contendo o gene da EGFP e da enzima T4 DNA ligase (Invitrogen). O correspondente a 10 ng da ligação foi transformado em E.coli Sure (Stratagene), que foi plaqueada em meio seletivo LB 1,5% ágar contendo 50 pg/mL de ampicilina. Realizou-se mini preparações de DNA plasmidial, a partir das colônias bacterianas resistentes à ampicilina; e as preparações de DNA plasmidial, que apresentavam um tamanho superior ao controle pT3 nativo, eram submetidas à digestão com Nar I para confirmação da clonagem do cassete. A verificação do sentido correto da inserção foi realizada por seqüenciamento nucleotidico. Desse modo, foi obtido o plasmídeo recombinante pT3 Esatrun EGFP. Na Figura 23, é apresentado o mapa físico do plasmídeo recombinante T3 Esatrun EGFP.

Preparação do molde de cDNA virai

[00192] O molde de cDNA, utilizado na obtenção do vírus FA 17D recombinante, foi obtido através da mesma metodologia descrita no Exemplo 3 deste documento. Desse modo, os plasmideos pT3/Esatrun/EGFP e pF200g1ic foram clivados com as enzimas de restrição Nsi I e Sal I (Promega), de acordo com as condições recomendadas pelo fabricante. Cerca de 10 μg de cada plasmídeo foram digeridas com ambas enzimas. A clivagem foi monitorada pela análise de alíquotas equivalentes a 200 ng de DNA em eletroforese em gel de agarose a 0,8% em tampão TAE. Após a clivagem completa, as enzimas foram inativadas pelo calor.

[00193] Os produtos de clivagem NsiI/SalI dos plasmideos foram ligados com T4 DNA ligase (Epicentre Technologies), de acordo com as condições estabelecidas pelo fabricante. A linearização dos diferentes moldes de cDNA foi feita pelo uso da endonuclease de restrição Xho I, nas condições estabelecidas pelo fabricante (Promega). Os produtos resultantes foram precipitados com etanol e ressuspensos em tampão Tris-EDTA pH 7,5 livre de nucleares. Uma amostra de cada preparação foi analisada em eletroforese em gel de agarose para detecção do molde e sua quantificação. As preparações foram armazenadas a -20°C até a etapa de transcrição in vitro. Obtenção de vírus FA a partir de cDNA viral: etapas de transcrição e transfecção

[00194] A partir dos moldes de cDNA representando o genoma completo, incluindo as seqüências dos plasmídeos pE200glic e pT3/Esat run /EGFP, foram obtidas preparações de RNA viral através do sistema de transcrição in vitro da SP6 RNA (AmpliScribe SP6; Epicentre Technologies). As preparações de RNA sintetizadas in vitro foram analisadas em eletroforese em gel de agarose 0,8% em TAE. Alíquotas das preparações de RNA foram transfectadas com Lipofectamina (Invitrogen Life Sciences) em monocamadas de células Vero, como descrito por Bonaldo e colaboradores (Bonaldo, M. C., R. C. Garratt, P. S. Caufour, M. S. Freire, M. M. Rodrigues, R. S. Nussenzweig, and R. Galler. 2002. Surface expression of-an immunodominant malaria protein B cell epitope by yellow fever vírus. J Mol Biol 315:873-85). Transfecção do RNA viral sintetizado In VITRO

[00195] A etapa de transfecção foi executada de modo semelhante à descrita no documento de patente US 6,171,854. A transfecção do RNA virai sintetizado in vitro deu origem a um vírus recombinante, capaz de crescer em células Vero. Este novo vírus da febre amarela recombinante foi denominado de 17D/Esatruni • Sua detecção foi realizada pelo aparecimento de efeito citopático na monocamada celular por microscopia de contraste de fase. A detecção da expressão da proteína EGFP por este vírus foi realizada nos intervalos de tempo de 24, 48, 72, 96 e 120 horas em monocamadas de células Vero infectadas com o vírus 17D/Esatruni4glic com uma m.o.i de 0,1 por microscopia de fluorescência a 488 nm.

[00196] As monocamadas celulares foram lavadas duas vezes com PBS, fixadas com paraformaldeído 4% em tampão fosfato dibásico 0,1M por 10 minutos, e lavadas uma vez com tampão fosfato dibásico 0,2M. Após a fixação, foram montadas em lâminas e observadas em microscópio Nikon (modelo eclipse E600). A detecção máxima de fluorescência da proteína EGFP expressa pelo vírus 17D/Esatrun^ - /4 glic foi nos tempos de 72h e 96h pós-infecção, de modo semelhante ao vírus 17D/Esa/5.1glic, que possui a região haste ancora completa fusionada ao carboxiterminal desta proteína heteróloga (Figura 24).

[00197] A Figura 25 apresenta esquematizada a região do genoma viral, compreendida entre o gene codante da proteína prM ao da proteína NS1 no vírus recombinante 17D/Esatrun/4glic, com o detalhamento da seqüência de aminoácidos da região haste ancora truncada associada ao cassete de expressão heterólogo, assim como os sítios da enzima de restrição Nar I que flanqueam esta região, os quais foram utilizados na clonagem molecular deste cassete no clone infeccioso do vírus de FA 17D. A localização no genoma do vírus recombinante 17D/Esatrun/4glic dos genes prM, E, do cassete heterólogo - com os seus respectivos domínios (27 nucleotídeos do gene NS1, gene EGFP e haste e ancora truncado)- e do gene NS1 é também mostrada na Figura 25. Característica de propagação viral: determinação da cinética de crescimento viral em monocamadas de células Vero

[00198] A capacidade de crescimento do vírus FA recombinante 17D/Esatrun/4glic foi comparada com a do vírus recombinante 17D/Esa/5.1gu, e com a dos vírus controles 17DD - vírus vacinal usado na imunização humana - e vírus vacinal experimental 17D/E200T3 por infecção de monocamadas de células Vero (62.500 células/cm2) em uma moi de 0,02. Foram realizados pelo menos três experimentos independentes de cinética de propagação viral nestas condições. Alíquotas do sobrenadante celular dos tempos pós-infecção (p.i.) de 24h, 48h, 72h, 96h, 120h e 144h foram coletadas e tituladas.

[00199] A Figura 26 exibe o gráfico da cinética de infecção de monocamada de células Vero.

[00200] Pode-se verificar que, enquanto o vírus vacina FA 17DD exibiu um pico de crescimento viral em 72 horas pós-infecção, com 6,88 log10 PFU/mL, tanto o vírus vacinal experimental 17D/E200T3 quanto os vírus recombinantes que expressam EGFP - 17D/Esatrun/ 4glic e 17D/Esa/5.1glic - apresentaram perfis cinéticos muito semelhantes com picos de produção viral em 96h, com valores de cerca de 6,40 log10 PFU/mL.

[00201] A boa propagação em monocamadas de células Vero dos vírus recombinantes 17D/Esatrun/4glic e 17D/Esa/5.1glic, sugere que a produção de vírus vacinal 17D recombinantes, possuindo inserções entre E e NS1 em escala industrial, é factível.

EXEMPLO 12: Indução de anticorpos específicos ao vírus FA e à proteína EGFP pela imunização com o vírus 17D/Esa/5.lgiic

[00202] A capacidade do vírus 17D/Esa/5.1glic de induzir resposta imune humoral dirigida ao vírus da febre amarela e à proteína heteróloga EGFP foi avaliada em camundongos BALB/c. Grupos de camundongos BABL/c de 4 semanas de idade foram imunizados com cerca de 2 doses de 100 pL com 100.000 PFU, administradas por via subcutânea ou intraperitoneal em intervalos de 15 dias. Trinta dias após a ultima dose, amostras de sangue dos camundongos foram obtidas por sangria intra-orbital. A resposta imune humoral de anticorpos neutralizantes, dirigida ao vírus da febre amarela 17D, foi estimada pelo ensaio de teste de neutralização viral por redução de plaqueamento em monocamadas de células Vero (PRNT do inglês "Plaque Reduction Neutralization Test"), de acordo com a metodologia previamente descrita (Stefano, I., H. K. Sato, C. S. Pannuti, T. M. Omoto, G. Mann, M. S. Freire, A. M. Yamamura, P. F. Vasconcelos, G. W. Oselka, L. W. Weckx, M. F.Salgado, L. F. Noale, and V. A. Souza. 1999. Recent immunization against measles does not interfere with the sero-response to yellow fever vaccine.Vaccine 17:1042-1046; Bonaldo, M. C., Garratt, R. C., Marchevsky, R. S., Coutinho, E. S., Jabor, A. V., Almeida, L. F., Yamamura, A. M., Duarte, A. S., Oliveira, P. J., Lizeu, J. O., Camacho, L. A., Freire, M. S., and Galler, R. (2005b). Attenuation of recombinant yellow fever 17D viruses expressing foreign protein epitopes at the surface. J Virol 79(13), 86028613). Os títulos de anticorpos neutralizantes são fornecidos em função da maior diluição sérica capaz de inibir 50% do número de placas de lise em monocamadas de células Vero (Tabela 4)

[00203] Como se pode verificar na Tabela 4, o vírus FA 17D/Esa/5.1glic induziu resposta por anticorpos neutralizantes específicos em índices comparáveis ao vírus 17DD vacinal. Em ambas as vias de inoculação empregadas para este vírus, subcutânea e intraperitoneal, ocorreram taxas de 100% de soroconversão, isto é, presença de anticorpos neutralizantes dirigidos ao vírus da FA em todos os animais vacinados (Tabela 4). Os soros de animais imunizados com o vírus recombinante pela via subcutânea apresentaram títulos variando de 1:41 a 1: 211, com a média de 1:94, e os imunizados pela via intraperitoneal de 1:22 a 1:177, com média de 1:79 (Tabela 4). Este mesmo regime de imunização com o vírus controle vacinal 17DD, acarretou em um titulo médio de 1:169, com uma faixa de resposta de 1:142 a 1: 224 de anticorpos neutralizantes anti- vírus da febre amarela (Tabela 4). Animais vacinados com meio 199 Earle's, utilizado para o cultivo celular, apresentaram-se negativos para anticorpos neutralizantes anti-vírus FA (<1:10). Tabela 4. Indução de anticorpos neutralizantes específicos ao vírus FA após imunização com o vírus recombinante 17D/Esa/5.1giicem camundongos BALB/c.

* Via de inoculação: se, subcutânea; ip, intraperitoneal; **Titulo de anticorpos neutralizantes corresponde ao valor da maior diluição sérica de animal imunizado que tenha resultado em 50% de inibição de placas de lise em monocamadas de células Vero; *** Titulo dado pelo recíproco da maior diluição que apresentou uma absorbância ótica maior ou igual a 0,1 em 492nm.

[00204] A análise dos níveis séricos de anticorpos anti-EGFP foi feita pelo método de ELISA. Assim, microplacas de 96 cavidades (Costar, Cambridge, MD) foram sensibilizadas com a proteína GFP de Aequoria victoria recombinante expressa em E.coli (Clontech Laboratories). A proteína GFP foi diluída em tampão carbonato 0,05M, pH 9.6, a uma concentração final de 200 ng/ml, e aplicada aos poços das microplacas (50 μl/poço), as quais foram incubadas a temperatura ambiente durante a noite. Após terem sido lavadas 3 vezes com PBS-Tween 0,05%, as placas foram tratadas com PBS suplementado com 5% leite desnatado e 2% albumina sérica bovina, pH 7,2 por duas horas a temperatura ambiente. As mostras séricas dos diferentes grupos de animais imunizados foram previamente diluídas a 1:10 e adicionadas às placas (100 gl), onde foram efetuadas diluições seriadas - correspondentes de 1:20 até 1:2560 - em tampão de bloqueio. Após 1 h de incubação à temperatura ambiente, as placas foram lavadas cinco vezes e cada poço recebeu 50 μ1 de uma amostra de anticorpos de cabra anti-IgG de camundongo, conjugados à enzima peroxidase (Kierkegard and Perry), diluídos 1:500 em Tampão de Bloqueio. Nova incubação por 1 h, à temperatura ambiente e as placas foram, mais uma vez, lavadas cinco vezes. A reação foi revelada a partir da adição da solução reveladora, contendo 1 μg/ml do substrato o-phelinenodiamina (SIGMA) e 1 gL/m1 H202(Merck). O desdobramento de cor na reação foi interrompido, 15 min depois, pela adição de uma solução de H2SO4 a 2M; e a leitura foi realizada em espectrofotômetro de placas suportam o conceito do uso do vírus FA 17D na expressão de antígenos relevantes no desenvolvimento de novas linhas de vacinas virais.

[00205] Apesar de ilustrada e descrita aqui com referência a determinadas representações específicas, a presente invenção não tem, no entanto, a intenção de estar limitada aos detalhes mostrados. Várias modificações podem ser feitas nos detalhes dentro do ãmbito e alcance de equivalentes sem se afastar do espírito da invenção.

Claims (12)

1. Método para a produção de Flavivirus recombinante contendo seqüências de nucleotídeos codificantes de uma proteína heteróloga, caracterizadopelas seguintes etapas: a) Modificação de seqüências nucleotídicas heterólogas de forma que as mesmas, ao serem clonadas no genoma de Flavivirus, apresentem na sua extremidade 5', nucleotídeos presentes na extremidade 5' do gene NS1 deste vírus codificando a sequência sinal NS1, e na sua extremidade 3' nucleotídeos codificando domínios de haste e ancora da proteína E deste vírus em que as referidas modificações não comprometem a estrutura e a replicação do dito Flavivirus; b) Inserção das seqüências heterólogas modificadas em (a) na região intergênica entre os genes que codificam a proteína estrutura E e a proteína não estrutural NS1 do Flavivirus; c) Regeneração de Flavivirus recombinante não patogênico, tendo as sequências heterólogas integradas de maneira estável no genoma viral no ponto de inserção descrito em (b) e expressando a sequência heteróloga de tal maneira que a proteína correspondente possa provocar uma resposta imune apropriada.

2. Método de acordo com a reivindicação 1 caracterizado pelo fato do Flavivirus ser o virus da Febre Amarela correspondente à cepa 17D ou seus derivados.

3. Método de acordo com a reivindicação 1 caracterizado pelo fato do Flavivírus ser o vírus quimérico da Febre Amarela, o qual contém os genes prM e E do vírus dengue 1,2,3 e 4 ou qualquer outro flavivírus quimérico obtido pela substituição dos genes prM e E.

4. Método de acordo com a reivindicação 1 caracterizado pelo fato das seqüências nucleotídicas heterólogas serem modificadas em (a) de forma que as mesmas, ao serem clonadas e expressas pelo Flavivirus, possuam, na sua extremidade 5', os nucleotídeos descritos na SEQ ID No. 1 ou na sua extremidade 3’, a região genômica correspondente aos domínios de haste e ancora da proteína E viral conforme descrita na SEQ ID No. 3.

5. Constructo de DNA caracterizado por ser formado essencialmente por uma sequência de vetor, um genoma de um Flavivírus geneticamente estável e modificado como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, e seqüências heterólogas introduzidas na região intergênica entre os genes que codifica a proteína estrutural E e a proteína não estrutural NS1 viral como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4.

6. Constructo de DNA de acordo com a reivindicação 5 caracterizado pelo fato de conter um genoma de vírus geneticamente estável, correspondente ao genoma do vírus da Febre Amarela 17D conforme apresentado na SEQ ID No. 15, no qual as ditas seqüências heterólogas modificadas foram inseridas.

7. Flavivirus contendo uma seqüência de nucleotideos modificada codificante de proteínas heterólogas caracterizado por conter as ditas seqüências nucleotídicas modificadas como definida na reivindicação 1 e inseridas de forma estável na região intergênica entre os genes codificando a proteína estrutural E e a proteína não estrutural NS1 no genoma viral, em que o referido vírus não é patogênico e em que o referido vírus expresse o antígeno heterólogo de modo que o mesmo induza uma resposta imune apropriada.

8. Vírus de acordo com a reivindicação 7 caracterizado por ser um vírus da Febre Amarela correspondente à cepa 17D.

9. Vírus de acordo com a reivindicação 8 caracterizado por possuir a sequência do genoma conforme apresentado na SEQ ID No. 13 ou por ter uma sequência genômica como apresentada na SEQ ID NO: 13 em que a seqüência nucleotídica do gene EGFP, foi substituída por outra seqüência heteróloga codificando uma proteína heteróloga.

10. Composição vacinal para imunizar contra Flavivirus e/ou outros patógenos caracterizadapor compreender Flavivírus obtido como definido em qualquer uma das reinvindicações 7 a 9.

11. Composição vacinal para imunizar contra Flavivirus e outros patógenos caracterizadapelo fato de compreender um Flavivírus como definido em qualquer uma das reivindicações 7 a 9, em que o o Flavivirus é o vírus da Febre Amarela correspondente à cepa 17D.

12. Composição vacinal de acordo com a reivindicação 10 ou 11 caracterizadapelo fato de compreender uma quantidade suficiente de vírus e, pelo menos, um veículo farmacêuticamente aceitável.

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