BRPI0401621B1 - Composto de inclusão entre b-ciclodextrina e praziquantel para tratamento de esquistossomose - Google Patents

Abstract

COMPOSTO DE INCLUSÃO ENTRE (Beta)-CICLODEXTRINA E PRAZIQUANTEL PARA TRATAMENTO DE ESQUISTOSSOMOSE. Novo composto para tratamento de esquistossomose, o qual aumenta a solubilidade do Praziquantel comercial e, com isso, a biodisponibilidade desta anti-paratsitário, quando administrado por via nasogástrica em camundongos Mus musculus, permitindo que maior quantidade de fármaco esteja disponível na circulação, aumentando seu efeito farmacológico, também aumenta a eficácia e reduz o número de vermes vivos após o tratamento por via nasogástrica, constituindo-se em excelente opção à formulação comerciais de PZQ disponível no mercado, e ainda diminui a toxicidade sistêmica do PZQ, devido à liberação controlada da droga, que impede que altos níveis plasmáticos sejam atingidos.

Description

Trata o presente relatório da descrição detalhada acompanhada de desenhos, tabelas e figuras elucidativas de um novo composto para tratamento de esquistossomose, o qual aumenta a solubilidade do Praziquantel (PZQ) comercial, e com isso, a biodisponibilidade deste anti-parasitário, quando administrado por via nasogástrica em camundongos Mus musculns, permitindo que maior quantidade do fármaco esteja disponível na circulação, aumentando seu efeito farmacológico, também aumenta a eficácia e reduz o número de vermes vivos após tratamento por via nasogástrica, constituindo-se em excelente opção à formulação comercial de PZQ no mercado, e ainda diminui a toxicidade sistêmica do PZQ, devido à liberação controlada da droga, que impede que altos níveis plasmáticos sejam atingidos.

A esquistossomose continua sendo um dos principais problemas de saúde pública mundial, ficando somente atrás da malária em termos sócio-econômicos e de saúde pública. Cerca de 200 milhões de pessoas estão infectadas em todo o Mundo, sua grande maioria distribuída em países em desenvolvimento, como o Brasil. Desses, 20 milhões apresentam sérias consequências da doença. Em muitas áreas as crianças até 12 anos são os principais afetados (OMS, 1998). A Esquistossomose é uma parasitose causada pelos vermes trematoda da família Schistosomatidae. Sabe-se que pelo menos cinco espécies atingem o homem; Schistosoma haematobium, S. japonicum, S. intercalatum, S. mekongi e X mansoni e este útimo encontrado em toda a América, inclusive o Brasil, onde causa a esquistossomose mansônica.

A Superintendência de Controle de Endemias (SUCEN) estima que só no Brasil, haveriam seis milhões de casos. No estado de São Paulo a SUCEN relata a existência de casos assintomáticos, em que não são encontrados muitos ovos nas fezes. Duzentos mil casos foram notificados nos últimos dez anos e em sua maioria classificados como importados. As principais áreas de transmissão no Estado ficam no Vale do Ribeira e no Vale do Paraíba. Além dessas, também ocorre transmissão etn áreas da Grande São Paulo, na Baixada Santista, na região de Campinas, nas regiões de Araraquara e Assis (site da SUCEN, http://www.sucen.sp.gov.br/).

A dificuldade na profilaxia da esquistossomose se deve ao fato da doença possuir uma fase intermediária. Por outro lado, essa parasitose seria de fácil prevenção apenas com o controle dos caramujos, a higiene sanitária perfeita e o tratamento adequado da água. Como existem locais onde a higiene sanitária encontra-se em estado precário e o tratamento das águas não é adequado, a erradicação da doença fica prejudicada, pois está diretamente ligada às condições de vida que o indivíduo possua e indiretamente ligada às condições sociais.

O tratamento da parasitose seria ideal se iniciado logo após o indivíduo se infectar com o verme, pois depois de desenvolvida a doença ela pode causar lesões irreversíveis. A administração de drogas é importante, porém limitada, dependendo do estágio de desenvolvimento da doença. Mundialmente, duas drogas são de uso consagrado para o tratamento da esquistossomose: a Oxaminiq.uina_..e o- Praziquantel (PZQ) (fig. 1), sendo que o último tem sido mais utilizado nos últimos anos. A oxaminiquina tem um poder anti-hehníntico bastante grande, porém é efetiva somente contra a esquistossomose mansônica e sua administração oral era crianças pode causar tonturas, náuseas e, raramente, alucinações. Sua administração por via intramuscular, em adultos, tem efeitos indesejados como o edema, causando dor intensa no local da injeção que perdura por até semanas. Outro fator relevante é que estudos recentes mostram que camundongos tratados com a Oxaminiquina, realizados com a linhagem MAP de Schistosoma mansoni, mostraram que os venues já apresentam resistência considerável a droga (Magalhães, 1996; Arena, 1997). 0 PZQ tem um amplo espectro de atuação contra todas as espécies do gênero Schistosoma que atingem o homem e seus efeitos colaterais são passageiros e de pouca intensidade, ocorrendo principalmente, dores abdominais, cefaléia e sonolência (Melo & Coelho, 2000). No Brasil o PZQ vem sendo utilizado como segunda droga de escolha no tratamento medicamentoso da Esquistossomose (C AMARGO-NEVES). O 10 próprio Ministério da Saúde (Fiocruz) produz medicamento contendo PZQ, para o tratamento da esquistossomose mansoni, que é apresentado em forma de comprimidos contendo 600mg cada (Fiocruz).

A Organização Mundial de Saúde (OMS) adicionou o PZQ a Lista Modelo de Drogas Essenciais (Model List of Essential Drugs) considerando-o como 15 uma droga efetiva contra todas as formas de esquistossomose, com poucos e passageiros efeitos colaterais e de baixo custo.

O desenvolvimento de sistemas de liberação controlada tem sido alvo de pesquisas há pelo menos quatro décadas. Desde que foi sugerida sua aplicação na indústria farmacêutica, muitos resultados foram obtidos, especialmente no 20 desenvolvimento de novos carreadores e no estudo de suas interações com as drogas encapsuladas. Esses novos carreadores têm a vantagem de contornar propriedades fisico-quirnicas limitantes - como a solubilidade aquosa - das drogas encapsuladas, melhorando assim a farmacodinâmica (potencialização do efeito terapêutico), farmacocinética (controle da absorção e distribuição tecidual) e os efeitos toxicológicos (redução da toxicidade local e sistêmica) das mesmas. Entre os carreadores mais utilizados atualmente destacam-se as ciclodextrinas.

Dentre as ciclodextrinas naturais a beta-ciclodextrina (β-CD) é composta por sete unidades de D-(+)-glicopiranose, unidas entre si por ligações ocl,4, de modo a 5 formar um anel em cuja estrutura grupos hidroxil primários e secundários estão orientados para o exterior. Desta forma as β-ciclodextrinas possuem um exterior hidrofilico e uma cavidade interna relativamente hídrofóbica que lhe permite complexar-se com moléculas que apresentam dimensões compatíveis com a sua cavidade (ca. 6 angstrons), suficiente apara acomodar um anel aromático (Matioli, 10 2000). A complexação altera propriedades fisico-químicas como a solubilidade em agua, estabilidade e biodisponibilidade de drogas complexadas.

Em outros países o PZQ tem sido o medicamento mais utilizado nas últimas décadas para o tratamento de pessoas infectadas pelo trematoda causador da esquistossomose mansônica (que atinge toda América) principalmente por não 15 apresentar efeitos colaterais de grande significância. No entanto, suas características principais são: baixa solubilidade em água, o que permite classifica-lo como droga lipofihca e, para sua administração oral grandes doses são necessárias para que a droga desempenhe os efeitos desejados. A via oral é preferida pelo fato do PZQ ser pouco solúvel, e também por ele ser altamente absorvido pelo trato gastrintestinal.

O PZQ é absorvido pelo verme adulto por difusão simples e provoca no mesmo efeitos primários visualizados como contrações tetânicas, que são dependentes de cálcio. A absorção da droga via tegumento parece ser essencial para a atividade biológica. Acredita-se que a lipofilicidade do PZQ facilite sua incorporação no tegumento do verme Por isso outros vermes, como o Fasciola e o Paragonimus, por 25 apresentarem um tegumento mais refratário contra o PZQ, possuiriam maior resistência ao mesmo

Trabalhos mostram que ratos submetidos ao tratamento com PZQ obtiveram índices de 90% de sucesso (morte dos vermes). Uma vez no organismo de um mamífero, o PZQ será metabolizado principalmente pelo fígado, para ser eliminado 5 (Andrews, 1985). Os metabolites do PZQ são inativos, por isso considera-se apenas a droga intacta nos estudos que envolvem atividade. Por esse motivo são desejáveis estudos que levem a uma maior estabilidade da molécula, para que esta permaneça mais tempo ativa no organismo do paciente; o PZQ não metabolizado no corpo tem uma meia-vida de 1-1,5 h até sua eliminação, enquanto que seus metabolites têm uma meia- 10 vida de aproximadamente quatro horas. Esses dados foram encontrados em animais de laboratório e tem boa correlação com os dados encontrados em humanos.

A seguir faz-se referência às figuras que acompanham este relatório descritivo, para melhor entendimento e ilustração do mesmo, onde se vê:

A Figura 1 mostra, a fórmula estrutural do 2-(Ciclohexilcarbonil)- 15 1,2,3,6,7,-1 lb-hexahidro-4H-pirazino[2,l-a]jsoquinolina-4-ona (Praziquantel): CisE^NzOz-

A Figura 2 mostra uma representação esquemática da estrutura do composto de inclusão mais estável entre PZQ e β-CD.

A Figura 3, mostra o aumento da solubilidade do PZQ em função da 20 compJexação com β-CD. O gráfico mostra o experimento de cinética de formação do complexo, preparado de acordo com o método de Becket et al. (1999).

A figura 4 mostra, a viabilidade celular, avaliada pelo método do MTT, após tratamento com PZQ, β-CD e os complexos de inclusão 1:1 e 1:2 durante 24h.

A figura 5 mostra Teste de linfoproliferação, com células B estimuladas na presença de PZQ e complexo de inclusão. Diferenças estatísticas (Teste de Kruskal- Wallis, n=5/grupo) foram observadas em relação ao grupo controle.

A Tabela 1 relaciona as Entalpias de formação e Eafinidad« obtidas dos 5 cálculos de modelagem molecular, em água.

A Tabela 2 mostra o número de vermes coletados nos grupos controle, branco, praziquantel e complexo, em ensaios com camundongos infectados cada um com 70 cercarias da linhagem BH do Schistosoma mansoni.

O complexo de inclusão entre β-ciclodextrina e PZQ para tratamento de 10 esquistossomose, objeto da presente patente, trata de um complexo de inclusão entre a droga anti-esquistomose PZQ, caracterizada por baixa solubilidade aquosa e β- ciclodextrina, em solução aquosa na proporção mola 1:1 (PZQ/β-CD)

O Complexo Sólido foi obtido através da mistura do PZQ com a β-CD, na proporção molar 1.1, utilizando-se o protocolo adaptado de De Azevedo et al., (2000 15 a, b). O protocolo consiste na solubilização da droga em um solvente orgânico onde esta seja solúvel. Para o PZQ utilizamos a acetona, enquanto a β-CD foi preparada em meio aquoso. As soluções foram então misturadas e levadas a um evaporador rotatório até que todo o solvente fosse volatilizado. A amostra foi ressuspendida em água e liofdizada, para obtenção do complexo sólido, que foi estocado em freezer (-15°C).

A formulação do PZQ complexado com a β-ciclodextrina aumenta a biodisponibilidade do fármaco no organismo, aumentando a eficácia do tratamento. Além disso, esta formulação possibilita a liberação controlada do PZQ, diminuindo sua toxicidade. Em relação a complexação molecular PZQ/β-CD mostramos por modelagem molecular que a associação (1:1) è natural, por ser o estado de menor energia entre as duas moléculas, o que torna a formulação eficiente por aumentar a solubilidade do PZQ.

A seguir demonstramos resultados obtidos que embasani o funcionamento e vantagens da formulação aqui tratada.

A modelagem molecular foi uma ferramenta teórica utilizada para se obter uma predição da relação entre a(s) molécula(s) host (β-CD) e a guest (PZQ). As moléculas foram montadas inicialmente no HyperChem™, as diferentes possibilidades de interação montadas foram então submetidas aos cálculos no MacroModel sob o campo de força MM2, os cálculos foram realizados no vácuo e na água. Com isso determinou-se as entalpias (ΔH) de formação do complexo e foi possível calcular as energias de ligação.

As associações foram estudadas através do cálculo das energias de afinidade (EAT,,, idade). A energia de afinidade (Balabai et al., 1998) foi calculada através da reação:

Onde, S é o soluto de interesse (PZQ). CD é o sistema macromolecular e S»CD é o complexo de inclusão formado. O abaixamento de energia total do sistema devido à formação do complexo de inclusão é a energia de afinidade entre as duas moléculas (Eafinidadc) de acordo com a equação:

A β-CD possui uma geometria molecular próxima a de um copo. Há duas extremidades que são de constituição e diâmetros diferentes. Uma delas, a coroa, possui o maior diâmetro e ali estão expostos grupamentos de hidroxilas secundárias (CH2-OH).

Na extremidade oposta, a borda, tem-se a face menor que é composta por hidroxilas primárias (-OH).

Foram realizados os cálculos para todas as possibilidades de associação entre as duas moléculas (PZQ e β-CD), nas estequiometrias 1:1 e 1:2, Na razão molar 5 1:1 existem quatro possibilidades possíveis e na razão molar 1:2 existem mais três possibilidades (Tabela 1). Testamos estas interações (PZQ/β-CD) para verificar quais seriam energeticamente viáveis e qual seria a de menor energia. Assim, pudemos inferir, no sistema, qual seria o tipo de interação mais provável entre estas moléculas.

Na Tabela 1 é possível observar que, para os cálculos realizados 10 considerando o meio aquoso, as interações entre a quinona e a cavidade são as de maior energia, sendo a inserção da região quinona e coroa onde foi obtida a maior energia de afinidade (-18 Kcal) o que torna essa conformação a mais provável de ser encontrada no sistema quando o equilíbrio estiver estabelecido.

Para a estequiometria 1:2 foi possível notar valores de E^udade muito próximos de 0 Kcal. Isso indica que essas possibilidades são instáveis, pois o abaixamento de energia gerado por essas interações toma-as facilmente desorganizáveis no sistema, ficando então a conformação 1:1, onde a quinona se insere na região de coroa da β-CD, como sendo energeticamente mais favorável. Tabela 1 - Entalpias e Eafhudade para cálculos, em água.

Para o complexo de inclusão PZQ/β-CD 1:1, foi obtida a maior EAfinidade a conformação de estequiometria 1:1, onde a quinona se insere na região de coroa da β- CD (Fig. 2). Este resultado teórico sugere que, por ser energeticamente mais favorável, esta seja a forma mais abundante encontrada no sistema.

Foi realizado o teste de solubilidade do PZQ quando complexado em β- CD, colocou-se uma quantidade fixa de PZQ (em excesso), no caso 3 mM. Enquanto que a concentração de β-CD foi mantida em 1 mM. A amostra foi mantida sob agitação, de aproximadamente 50 oscilações por minuto, por sete dias em temperatura controlada (30° ± 0,5°). Diariamente era retirada uma alíquota para acompanhamento do mecanismo de complexação (Becket et al., 1999) O mecanismo foi acompanhado diariamente na leitura da absorbância (262 nm), relativo a um dos picos do PZQ.

Após determinarmos o coeficiente de absortividade do PZQ (S262nm“437 M'1) foi possível quantificar o PZQ solúvel em água (Fig. 3) e medir a variação da solubilidade do mesmo, quando se complexa com a β-CD. O aumento da solubilidade do PZQ deve-se a interação que ocorre entre o mesmo e a cavidade da β- CD. Observamos que a solubilidade aumentou de cerca de 1 mM, no primeiro dia, para aproximadamente 8 mM. Cabe notar que não foram necessários 7 dias para equilíbrio, como proposto por Becket et ai. (1999), a partir do 5° dia, notou-se que o máximo da solubilidade já foi atingido. Desta forma pudemos comprovar que a interação entre a molécula hóspede aumentou a solubilidade do PZQ, cerca de 8 vezes, e com isso tomaria a droga mais disponível ao organismo, como descrito por Loftsson & Brewster (1996) para o equilíbrio entre várias moléculas hóspede e ciclodextrina.

Também foram realizados testes de toxicidade in vitro-, efeito do PZQ na formulação sobre diferentes tipos celulares O primeiro teste in vitro realizado foi utilizando-se células de fibróblastos V79, de pulmão de hamster chinês os quais foram cultivadas em meio DMEM (Meio Eagle modificado por Dulbeco), contendo antibióticos (100 U/mL de penicilina G e 100 Ug/tnL de estreptomicina) e suplementadas com 10% de soro fetal bovino em uma atmosfera umedecida com 5% de CO2, a 37 °C. Para a avaliação da viabilidade destas células foi utilizado o teste de redução do MTT, que nos indica a função mitocondrial, baseado na redução enzimática do sal brometo de tetrazolium por desidrogenases mitocôndrias das células viáveis.

Os resultados obtidos através deste teste (Fig. 4) mostraram ausência de toxicidade nas concentrações testadas. Mais uma vez por uma limitação da solubilidade do PZQ, não foi possível atingir concentrações suficientemente altas para que a toxicidade fosse mostrada, entretanto esta análise utilizou concentrações farmacológicas da droga.

O segundo teste realizado objetivou verificar a ação do PZQ, livre ou complexado, sobre a linfoproliferação de células B. Esses experimentos foram 15 escolhidos como modelo de atividade (biomiméticos), uma vez que o PZQ não tem atividade imunossupressora importante, o que limitaria sua aplicação clínica. O teste objetivou tão somente demonstrar as vantagens das formulações, em relação à droga livre, em termos de biodisponibilização da droga.

Na Fig. 5 vemos a ação do PZQ e do complexo na proliferação de células 20 B estimuladas com lipopolissacarídeo de bactéria (LPS). Estas células eram estimuladas para se criar uma situação experimental modelo, para avaliarmos a atividade das drogas testadas (Dayan, 2003; Olds, 2003), Neste teste o grupo controle contém, além do meio de cultura, o LPS. Os grupos dos complexos 1:1 e 1:2 apresentaram uma ação inibitória na proliferação das células B (p<0,01 e p<0,05, respectivamente), que é significativa 25 quando comparada com o grupo controle. Como mostrado anteriormente, o complexo de inclusão tem a capacidade de aumentar a solubilidade do PZQ. Neste experimento notamos uma significativa diferença entre os grupos tratados com os complexos de inclusão (1:1, 1:2) e os demais grupos, o que pode ser interpretado como aumento da solubilidade do PZQ (complexado) capaz de interagir com as células B. Apesar de não 5 conseguirmos determinar ao certo o mecanismo pelo qual a droga desempenhou uma maior atividade no sistema testado, este teste foi usado como teste de toxicidade in vitro.

É importante ressaltar que todos os teste in vitro foram realizados na mesma concentração de droga (0,1 mM) que é a concentração terapêutica do PZQ 10 (Katzung, 1998); a concentração de carreador variou de acordo com as proporções. Para o tratamento apenas com β-CD também foi utilizado 0,1 mM da mesma.

Os teste in vivo foram realizados com camundongos (Mus muscullus) infectados com esquistossomos e divididos em quatro grupos de 15 animais. Os grupos foram divididos em: Controle, grupo apenas infectado com os vermes; Branco, tratado 15 apenas com β-CD; Praziquantel, grupo tratado com o PZQ e Complexo, grupo tratado com o complexo de inclusão O tratamento foi realizado no 55° dia após a infecção, com o intuito de atingir a fase adulta dos vermes. No 76° dia após a infecção os animais foram sacrificados e analisados. Os resultados obtidos encontram-se na tabela 2. Tabela 2 - Número de vermes coletados nos grupos controle, 20 branco, praziquantel e complexo de camundongos infectados com 70 cercarias da linhagem BH do Schistosoma mansoni.

A taxa de redução de venues foi obtida através da equação (Eq. 1) a seguir:

Após a análise dos 15 indivíduos de cada grupo, as respectivas taxas de 5 redução de vermes foram calculadas. Obviamente essa análise não foi realizada com os grupos Controle e Branco, uma vez que em nenhum deles foram encontrados vermes mortos. Já para os grupo do PZQ foi obtida uma taxa de 78% de redução dos vermes e para o grupo do complexo essa taxa foi de 98%. Esses resultados m vivo são de extrema importância para a avaliação da eficiência do complexo, frente aos resultados obtidos 10 com testes prévios (in vitro).

Outro parâmetro importante realizado nesse teste in vivo foi o estudo do oograma, onde é avaliada a ação da droga contra a oviposição dos vermes. O complexo de inclusão manteve a característica do PZQ comercial, de reduzir a oviposição dos vermes. Esse resultado tem sua importância no fato de que uma das principais 15 debilitações causadas pela doença são os granulomas, causados pelos ovos que não conseguem atingir o meio extemo ao hospedeiro e que são isolados pelo organismo na forma de granuloma fibroso.

O Complexo Sólido é obtido através da mistura do PZQ com a β-CD, em proporções apropriadas, utilizando-se o protocolo adaptado de De Azevedo etal, (2000 20 a, b). O protocolo consiste na solubilização da droga em um solvente orgânico onde esta seja solúvel. Para o PZQ utilizamos a acetona, enquanto a β-CD foi preparada em meio aquoso. As soluções foram então misturadas e levadas a um evaporador rotatório até que todo o solvente fosse volatilizado, a 50° C. A amostra é ressuspendida em água e liofilizada, para obtenção do complexo sólido, que foi estocado ent freezer (-15°C). As formulações foram então preparadas pelo método de liofilização que, de acordo com a literatura, apresenta vantagens em relação ao método de co-precipitação (Kurozumi et al., 1975, Becket etal., 1999).

A adaptação do método de metodologia de preparo de De Azevedo et al., (2000 a, b) possibilitou que a preparação do complexo seja realizada em apenas um dia, o que apresenta uma significativa vantagem quanto ao método proposto por por Becket et al., (1999) onde eram necessários 7 (sete) dias para a obtenção do complexo.

A principal vantagem do invento está no aumento da eficácia terapêutica de um medicamento de uso comercial que é o praziquantel - droga de escolha para tratamento da esquistossomose no mundo. Na formulação PZQ/β-CD, a concentração comercial do anti-parasitário induz maior mortalidade de vermes do que o PZQ comercial, não complexado. Além disso, o veículo utilizado na formulação (β-CD) tem baixo custo e boa estabilidade de prateleira, o que constitui vantagem adicional, pois não irá representar alto custo, quando do preparo em escala industrial, desta formulação. É importante ressaltar que o PZQ é a segunda droga de escolha para o tratamento da esquistossomose no Brasil. Isso toma-se importante, visto que, estudos mostram que a linhagens brasileiras do parasita já apresentam considerável resistência à oxaminiquina (Magalhães, 1996; Arena, 1997).

Claims (1)

1 - “PROCESSO DE OBTENÇÃO DO COMPOSTO DE INCLUSÃO ENTRE β-CICLODEXTRINA E PRAZIQUANTEL PARA TRATAMENTO DE ESQUISTOSSOMOSE” caracterizado por consistir nas etapas: - solubilização de β-CD em meio aquoso; - solubilização da droga PZQ em acetona; - as soluções na proporção molar 1:1 (PZQ/β-CD) são misturadas e levadas a um evaporador rotatório, até que todo solvente seja volatilizado, o composto é então ressuspendido em água e liofilizado, para obtenção do complexo sólido, sendo que o complexo é obtido em 1 dia e pode ser estocado em freezer à -15°C.

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