BRPI0301960B1

BRPI0301960B1 - L-leucine producing recombinant bacteria, and, method for the production of l-leucine

Info

Publication number: BRPI0301960B1
Application number: BRPI0301960-8A
Authority: BR
Inventors: Markovich Gusyatiner Mikhail; Borisovna Voroshilova Elvira; Georgievna Rostova Yulia; Valerievna Ivanovskaya Lirina; Grigorievna Lunts Maria; Moiseevich Khourges Evgeniy
Original assignee: Ajinomoto Co., Inc.
Priority date: 2002-06-25
Filing date: 2003-06-25
Publication date: 2017-11-07
Also published as: JP4314897B2; RU2243260C2; RU2002116773A; JP2004024259A; CN1293184C; CN1492049A; US20040091980A1; US7220572B2; EP1375655A1; BR0301960A

Abstract

"bactéria produtora da l-leucina, e, método para a produção da l-leucina". é fornecido um método para a produção de l-leucina usando bactéria que pertence ao gênero escherichia, que produz l-valina, lisoleucina e l-homoleucina em uma quantidade menor do que 1 % daquela da l-leucina produzida devido à inativação do gene ilve que codifica para aminoácido transaminase de cadeia ramificada e produz quantidade aumentada de l-leucina devido ao aumento da atividade da aminoácido transaminase aromática codificada pelo gene tyrb.

Description

“BACTÉRIA RECOMBINANTE PRODUTORA DA L-LEUCINA, E, MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DA L-LEUCINA” FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção diz respeito à indústria mtcrobiológica, especificamente a um método para a produção de aminoácidos. Mais especificamenie, a presente invenção diz respeito a um método para a produção de L-leucina usando bactéria que pertence ao gênero Escherichia em que a quantidade de L-valí na, L-isoleucina e L-homoleucina produzida é menor do que 1% daquela de L-leucina produzida, DESCRIÇÃO DA TÉCNICA RELACIONADA

Convenciona] mente os L-aminoãcidos têm sido industrial mente produzidos por um método de fermentação que utiliza cepas de microorganismos obtidos de fontes naturais ou mutantes dos mesmos especialmente modificados para aumentar a produtividade de L-aminoácídos. Várias cepas que pertencem ao gênero Escherichia usadas para a produção de L-leucina por fermentação são conhecidas, Existem cepas resistentes à L-leucina e seus análogos, tais como 4-azaIeucína ou 5,5,5-trifluoroleucina (Pateute U.S. número 5.744.331), β-2-tíenilalanina e β-hidroxileueina (Patente U.S. número 5.763.231), L-valina, 4-azaleucina, 3-hidroxileucina e L-leucina (Patente Russa RU 2140450); cepas que requerem ácido lipóico para o crescimento (Patente U.S. número 6.214.591); cepas com atividades aumentadas das enzimas envolvidas na biossíntese da L-leucina, tais como produto de gene iivE (Patente U.S, número 5,120.654); cepas com as enzimas alvos dessensibilizadas para a inibição da regeneração por L-leucina produzida, tais como sintase de isopropilmalato (Patente Européia no. EP1067191).

As cepas de produção de L-leucina mais conhecidas simultaneamente produzem L-valina e em pouco volume L-isoleucina. Por exemplo, cepa de E. coli AJ11478 (Patente U.S. número 5.763.231) produz simultaneamente 1,9 g/1 de L-leucina e 0,09 g/1 de L-valina (quantidade de L-valina é 4,7% da quantidade de L-leucina). As L-valina e L-isoleucina produzidas simultaneamente com a L-leucina transtornam a recuperação da L-leucina dos líquidos culturais. Além disso, a co-produção de L-valina e L-isoleucina diminui a produção de L-leucina visto que ambos aminoácidos se originam de um precursor comum, 2-cetoisovalerato.

Mais no início foi mostrado, que os aminoácidos não naturais, tais como norvalina, homoisoleucina e norleucina, podem ser formados pelas enzimas biossintéticas de L-leucina em Serratia marcescens a partir de a-cetobutirato, a-ceto-P-metilvalerato e α-cetovalerato, respectivamente (Kisumi M., Sugiura M. e Chibata I., J. Biochem. 1976, 80 (2) 333-9).

APRESENTAÇÃO DA INVENÇÃO

Um objetivo da presente invenção é obter uma bactéria produtora de L-leucina, que produza L-valina, L-isoleucina e L-homoleucina em uma quantidade de menos do que 1% daquele de L-leucina produzida.

Este objetivo foi alcançado pela inativação do gene ilvE, que codifica o aminoácido de cadeia ramificada aminotransferase. A inativação do gene ilvE diminui a produção de L-leucina, quando este aminotransferase participa na formação da L-leucina a partir de seu ceto-precursor, 2-ceto-metil-pentanoato. Outro aminotransferase, que pode participar na produção de L-leucina, é a aminoácido transaminase aromática codificada pelo gene tyrB. Portanto, para restaurar ou mesmo aumentar a produção de L-leucina quando o gene ilvE estiver inativado, o aumento da atividade da enzima, codificada pelo gene tyrB, foi executado, por exemplo, pela transformação da bactéria com um plasmídeo de múltiplas cópias contendo o gene tyrB.

Assim, a presente invenção foi completada.

Desta maneira, a presente invenção fornece uma bactéria produtora da L-leucina que pertence ao gênero Escherichia, que produz L-valina, L-isoleucina ou L-homoleucina em uma quantidade de menos do que 1% daquela da L-leucina produzida. Além disso, a presente invenção fornece uma bactéria produtora da L-leucina que pertence ao gênero Escherichia, que produz L-valina, L-isoleucina ou L-homoleucina em uma quantidade de menos do que 1% daquela da L-leucina produzida, e a produção de L-leucina é aumentada mediante o aumento da atividade da enzima, codificada pelo gene tyrB. A presente invenção ainda fornece um método para a produção de L-leucina por fermentação que compreende as etapas de cultivo da bactéria anteriormente mencionada em um meio de cultura para produzir e acumular a L-leucina no meio, e coletar a L-leucina do meio.

Assim, a presente invenção fornece: (1) Uma bactéria produtora de L-leucina que pertence ao gênero Escherichia, que produz L-valina, L-isoleucina e L-homoleucina em uma quantidade de menos do que 1% daquela da L-leucina produzida. (2) A bactéria de acordo com (1) em que a bactéria produz L-valina, L-isoleucina e L-homoleucina em uma quantidade menor do que 1% daquela da L-leucina produzida, devido à inativação do gene ilvE ou diminuição da atividade da proteína codificada pelo gene ilvE. (3) A bactéria de acordo com (2) em que a atividade da proteína codificada pelo gene tyrB é aumentada. (4) A bactéria de acordo com (3) em que a atividade da proteína codificada pelo gene tyrB é aumentada pela transformação da bactéria com um DNA contendo o gene tyrB. (5) A bactéria de acordo com (4) em que a transformação é executada usando um vetor de múltiplas cópias. (6) Um método para a produção de L-leucina, cujo método compreende as etapas de: - cultivar a bactéria de acordo com qualquer um de (1) a (5) em um meio para produzir e acumular a L-leucina no meio, e - coletar a L-leucina do meio. (7) O método de acordo com (6), em que a bactéria foi modificada para ter expressão acentuada de um gene da biossíntese de L-leucina. A presente invenção é descrita com detalhes abaixo.

1. BACTÉRIA DA PRESENTE INVENÇÃO A bactéria da presente invenção é uma bactéria que pertence ao gênero Escherichia, que produz L-valina, L-isoleucina e L-homoleucina em uma quantidade menor do que 1% daquela da L-leucina produzida. A expressão “bactéria produtora da L-leucina” aqui usada significa uma bactéria, que é capaz de produzir e acumular L-leucina em um meio de cultura em uma quantidade maior do que um tipo selvagem ou cepa paterna de E. coli, tal como a cepa E. coli K-12, e preferivelmente significa que o microorganismo é capaz de produzir e acumular em um meio uma quantidade de não menos do que 0,5 g/1, mais preferivelmente não menos do que 1,0 g/1 de L-leucina. A expressão “uma bactéria que pertence ao gênero Escherichia" significa que a bactéria é classificada como o gênero Escherichia de acordo com a classificação conhecida a uma pessoa qualificada na microbiologia. Como exemplos do microorganismo que pertence ao gênero Escherichia usado na presente invenção, a Escherichia coli (E. coli) pode ser mencionada. A expressão “produzir L-valina, L-isoleucina e L-homoleucina em uma quantidade menor do que 1% daquela da L-leucina produzida” significa que a quantidade de L-valina, L-isoleucina e L-homoleucina, que está presente no meio de cultura após o completamente do cultivo da bactéria produtora de L-leucina, é significativamente menor comparada com a quantidade do produto principal, L-leucina. A quantidade de L-valina, L-isoleucina e L-homoleucina no meio de cultura é significativamente menor comparada com a quantidade de L-leucina quando, por exemplo, a quantidade de L-valina, L-isoleucina ou L-homoleucina cada uma é menor do que 1%, preferivelmente menor do que 0,5%, mais preferivelmente menor do que 0,1% da quantidade da L-leucina produzida. Preferivelmente significa que a quantidade de L-valina, L-isoleucina e L-homoleucina pode ser até não detectável por métodos convencionais, por exemplo, por cromatografia de camada fina (TLC) ou HPLC. A expressão “inativação do gene ilvE' significa que o gene alvo é modificado da maneira que o gene modificado codifique para a enzima mutante (enzima inativa) com o nível de sua atividade não detectável por métodos conhecidos, ou o gene modificado seja incapaz de expressar qualquer enzima. O gene ilvE codifica para a aminoácido transaminase de cadeia ramificada (309 resíduos de aminoácido), que é capaz de catalisar reações de aminação de ácidos α-cetocarboxílicos e seus sais. A aminoácido transaminase de cadeia ramificada, por exemplo, converte o a-cetocaproato em L-leucina, α-cetoisovalerato em L-valina, a-ceto-P-metilvalerato em L-isoleucina. O gene ilvE (números de 39501017 a 3951036 no número de acesso do GenBank NC 000913.1, gi: 16131628) está localizado entre os genes ilvM e ilvD. A inativação do gene pode ser executada por métodos convencionais, tais como tratamento de mutagênese usando irradiação UV ou tratamento de nitrosoguanidina (N-metil-N’-nitro-N-nitrosoguanidina), mutagênese direcionada ao sítio, disrupção do gene usando recombinação homóloga ou/e mutagênese de inserção-deleção (Datsenko K.A. e Wanner B. L., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 2000,97(12), 6640-6645). A expressão “diminuição da atividade da proteína codificada pelo gene ilvE’ significa que a seqüência de codificação da proteína do gene ilvE ou a seqüência de regulação da expressão do gene ilvE foi modificada para ter a atividade enzimática por célula diminuída. A diminuição da atividade da proteína também pode ser executada por métodos convencionais, tais como tratamento de mutagênese usando irradiação UV ou tratamento de nitrosoguanidina (N-metil-N’-nitro-N-nitiOsoguanidina), ou mutagênese direcionada ao sítio seguido por seleção da bactéria com o fenótipo desejado. Uma bactéria tendo a mutação “tipo permeável” na dita proteína também pode ser usada na presente invenção. A proteína tendo mutação tipo permeável é uma proteína mutante em que a mudança de seqüência não anula totalmente sua atividade (Lewin B., Genes VII, Oxford Press, 2000, p. 16).

Da mesma forma, a bactéria da presente invenção pode ser uma bactéria que pertence ao gênero Escherichia, que produz L-valina, L-isoleucina e L-homoleucina em uma quantidade de menos do que 1% daquela da L-leucina produzida, e a atividade da proteína codificada pelo gene tyrB é aumentada. A expressão “uma atividade de uma proteína codificada pelo gene tyrB é aumentada” significa que a quantidade de molécula da proteína em uma célula é aumentada, ou que a atividade de acordo com a própria proteína é aumentada. O gene tyrB codifica a aminoácido transaminase aromática (397 resíduos de aminoácido), a qual se catalisa, com o uso de glutamato como o doador de amino, uma transaminação dos α-cetoácidos tais como fenilpiruvato e 4-hidroxifenilpiruvato em aminoácidos tais como fenilalanina e tirosina, respectivamente. Não obstante, o termo “atividade” aqui significa a atividade para converter α-cetocaproato em L-leucina com glutamato como o doador de amino (.Escherichia coli and Salmonella, Second Edition, Editor in Chief: F. C. Neidhardt, ASM Press, Washington D.C., 1996). O gene tyrB (números de 4264693 a 4265886 no número de acesso do GenBank NC 000913.1, gi: 16131880) está localizado entre os genes alr e aphA.

As técnicas para aumentar a atividade da proteína, especialmente técnicas para aumentar a quantidade de molécula da proteína em uma célula, incluem o aumento do número de cópia do gene e alteração da seqüência de regulação da expressão ou seqüência realçadora de uma codificação de DNA para a proteína da presente invenção, mas não são limitadas a elas. A expressão “transformação de uma bactéria com um DNA contendo gene tyrB” significa a introdução do DNA na célula da bactéria, por exemplo, por métodos convencionais para aumentar o número de cópia do gene. O número de cópia do gene pode ser aumentado mediante a inserção de um gene em um vetor de múltiplas cópias para formar um DNA recombinante, seguido pela introdução do DNA recombinante no microorganismo. Os vetores usados para a introdução do DNA recombinante são exemplificados por vetores plasmídeos tais como pMW118, pBR322, pUC19, pET22b, pACYC184 ou coisa parecida, vetores fagos tais como 11059, 1BF101, M13mp9, Mu phage (Pedido de Patente Japonesa Aberta ao Público no. 2-109985) ou coisa parecida e transposon (Berg, D.E. and Berg, C.M., Bio/Technol., 1, 417 (1983)), tal como Mu, TnlO, Tn5 ou coisa parecida. É também possível aumentar o número de cópia de um gene mediante a integração do gene em um cromossoma por um método que utiliza um plasmídeo para a recombinação homóloga ou coisa parecida. A técnica de alteração de uma seqüência de regulação da expressão ou seqüência realçadora pode ser combinada com a técnica que se baseia na multiplicação das cópias do gene.

Para a procriação de um microorganismo que pertença ao gênero Escherichia e tendo uma quantidade de expressão aumentada do gene, as regiões necessárias do gene podem ser obtidas por PCR (reação da cadeia polimerase) principalmente com base na informação já disponível a cerca dos genes de E. coli. Por exemplo, o gene tyrB pode ser clonado a partir do DNA cromossômico de cepas de E. coli K12 ou E. coli MG1655 usando uma técnica de PCR. O DNA cromossômico usado para isto pode ser derivado de qualquer outra cepa de E. coli.

Uma alteração da seqüência de regulação da expressão de um DNA que codifica a proteína tyrB pode ser obtida pela localização do gene estrutural tyrB sob o controle de um promotor potente. Por exemplo, promotor lac, promotor trp, promotor trc, promotor PL de fago lambda são conhecidos como promotores potentes. Altemativamente, um promotor pode ser intensificado mediante, por exemplo, a introdução de uma mutação no promotor para aumentar um nível de transcrição de um gene localizado a jusante do promotor. Além disso, é sabido que a substituição de vários nucleotídeos no espaçador entre o sítio de ligação do ribossoma (RBS) e o códon de partida e especialmente as seqüências imediatamente a montante do códon de partida afetam a translabilidade do mRNA (Gold et al., Annu. Rev. Microbiol., 35, 365-403,1981; Hui et al., EMBO J., 3, 623-629,1984).

Além disso, para aumentar o nível de transcrição do gene, um intensificador pode ser novamente introduzido. A introdução de DNA contendo ou o gene ou o promotor no DNA cromossômico é descrita na, por exemplo, Publicação da Patente Internacional WO 00/18935 e Pedido de Patente Japonesa Aberta ao Público No. 1-215280. A bactéria da presente invenção pode ser ainda melhorada mediante a intensificação da expressão de um ou mais genes envolvidos na biossíntese de L-leucina. Tais genes são exemplificados por um gene entre o operon de L-leucina, isto é, operon leu, que preferivelmente compreende um gene que codifica para sintase de isopropilmalato (gene leuA, número de 81958 a 83529 no número de acesso do GenBank NC 000913.1, gi: 16128068) da qual a inibição da regeneração por L-leucina é dessensibilizada (patente Européia EP 1067191). O operon de L-leucina também compreende os genes leuB (gi: 16128067), leuC (gi: 16128066) e leuD (gi: 16128065) (números de 80867 a 81961; de 79464 a 80864; e 78848 a 79453 no número de acesso do GenBank NC 000913.1, respectivamente).

Como uma cepa parental, que é para ser inativada na atividade das aminoácidos transaminases de cadeia ramificada codificadas pelo gene ilvE e realçadas na atividade da aminoácido transaminase aromática codificada pelo gene tyrb, as bactérias que pertencem ao gênero Escherichia tal como cepa de E. coli Kl 2, cepa de E. coli W1660 e outras mais podem ser usadas. Também é possível usar como uma cepa parental as bactérias produtoras da L-leucina que pertencem ao gênero Escherichia tal como cepas de E. coli H-9068 (ATCC 21530), H-9070 (FERM BP-4704) e H-9072 (FERM BP-4706) resistentes à 4-azaleucina ou 5,5,5-trifluoroleucina (Patente U.S. número 5.744.331), cepas de E. coli em que a inibição da regeneração de sintase de isopropilmalato por L-leucina é dessensibilizada (patente Européia número EP 1067191), cepa de E. coli AJ11478 resistente à β-2-tienilalanina e β-hidroxileucina (Patente U.S. número 5.763.231) e outras mais.

Os métodos para a preparação de DNA plasmídeo, extração e ligação de DNA, transformação, seleção de um oligonucleotídeo como um preparador e outros mais podem ser métodos costumeiros bem conhecidos para uma pessoa qualificada na técnica. Estes métodos são descritos, por exemplo, em Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, T., “Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition”, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989).

2. MÉTODO DA PRESENTE INVENÇÃO O método da presente invenção é um método para a produção da L-leucina, cujo método compreende as etapas de cultivo da bactéria da presente invenção em um meio de cultura para produzir e acumular a L-leucina no meio, e coletar a L-leucina do meio.

Na presente invenção, o cultivo, a coleção e a purificação de L-aminoácido a partir do meio e outros mais podem ser executados em uma maneira similar ao método de fermentação convencional em que um aminoácido é produzido usando uma bactéria.

Um meio usado para a cultura pode ser ou um meio sintético ou um meio natural, contanto que o meio inclua uma fonte de carbono e uma fonte de nitrogênio e minerais e, se necessário, quantidades apropriadas de nutrientes que a bactéria requeira para o crescimento. A fonte de carbono pode incluir vários carboidratos tais como glicose e sacarose, e vários ácidos orgânicos. Dependendo do modo de assimilação do microorganismo usado, álcool incluindo etanol e glicerol pode ser usado. Como a fonte de nitrogênio, vários sais de amônio tais como amônia e sulfato de amônio, outros compostos de nitrogênio tais como aminas, uma fonte de nitrogênio natural tal como peptona, hidrolisato de feijão de soja, e microorganismo fermentativo digerido são usados. Como minerais, potássio, monofosfato, sulfato de magnésio, cloreto de sódio, sulfato ferroso, sulfato de manganês, cloreto de cálcio, e outros mais são usados. Como vitaminas, tiamina, extrato de levedura e outros mais são usados. O cultivo é executado preferivelmente sob condições aeróbicas tais como um cultivo em agitação, e agitação da cultura com aeração, em uma temperatura de 20 a 40°C, preferivelmente de 30 a 38°C. O pH da cultura é geralmente entre 5 e 9, preferivelmente entre 6,5 e 7,2. O pH da cultura pode ser ajustado com amônia, carbonato de cálcio, vários ácidos, várias bases, e tamponantes. Geralmente, um cultivo de 1 a 5 dias leva ao acúmulo do L-aminoácido alvo no meio líquido.

Após o cultivo, os sólidos tais como as células podem ser removidos do meio líquido por centrifugação ou filtração de membrana, e depois a L-leucina pode ser reunida e purificada por métodos de troca de íon, concentração e cristalização. BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A figura 1 mostra as vias metabólicas de L-leucina e L-valina.

EXEMPLOS A presente invenção será mais concretamente explicada abaixo com referência aos Exemplos.

EXEMPLO 1. PREPARAÇÃO DA BACTÉRIA PRODUTORA DA L-LEUCINA QUE PERTENCE AO GÊNERO ESCHERICHIA

As células de cepa tipo selvagem de E. coli Kl2 (VKPM B-7) foram tratadas com um mutageno, N-metil-N’-nitro-N-nitrosoguanidina (0,05 mg/ml), por 20 min em 37°C, lavadas 4 vezes com solução fisiológica e laminadas junto com o meio de ágar mínimo M9 suplementado com 4,0 mg/ml de DL-4-azaleucina. As lâminas foram incubadas por 5 dias em 37°C. As colônias que apareceram sobre as lâminas foram recolhidas e purificadas por fotopsia nas lâminas de L-ágar. O melhor mutante obtido resistente à DL- 4-azaleucina, o mutante 55, produziu 2,1 g/1 de L-leucina e 0,8 g/1 de L-valina (Tabela 1, ver abaixo). Esta cepa de E. coli 55 foi selecionada e foi usada para a indução de auxotrofia dupla de L-isoleucina e L-valina. As numerosas quantidades de auxótrofos duplos, requerendo L-isoleucina e L-valina para o crescimento, foram obtidas. Entre os auxotrófos duplos obtidos, o melhor produtor de L-leucina, cepa 505 que produz 1,3 g/1 de L-leucina, foi selecionado. A cepa não produziu qualquer quantidade e L-valina e L-isoleucina, mas os auxótrofos duplos levaram à diminuição da produção de L-leucina. A auxotrofia dupla de L-isoleucina e L-valina foi motivada pela mutação no gene ilvE. Foi comprovado pelo fato de que a introdução do plasmídeo contendo gene ilvE (patente US 5.120.654) dentro da cepa 505 complementou a auxotrofia dupla de L-isoleucina e L-valina. Além do mais, a medição da atividade enzimática do aminoácido de cadeia ramificada aminotransferase codificado pelo gene ilvE na cepa 505 usando 2-cetoisovalerato como substrato apresentou ausência de sua atividade. A condição para a medição da atividade enzimática descrita por Coller R.H. e Kohlhaw G. (sem identidade do aspartato e dos componentes de aminotransferase aromático de transaminase A em £ coli. J. Bacteriology, 1972,112(1), p. 365-371). A cepa de E. coli 505 foi depositada na Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM) (Rússia 113545, Moscow, 1 Dorozhny proezd, 1) em 14 de maio de 2001 sob o número de acesso VKPM B-8124. EXEMPLO 2. CLONAGEM DO GENE tvrB DE E. COLI NO PLASMÍDEO PACYC184. O fragmento cromossômico da cepa de E. coli Kl2 (VKPM-7), contendo o gene tyrB foi amplificado pelo método PCR, usando dois preparadores: preparador 1 (SEQ ID NO:l) e preparador 2 (SEQ ID NO:2) mostrados nas Listagem das Seqüências. Os preparadores 1 e 2 (24-mers) contêm seqüência incluindo os sítios BamRl e Hindlll, respectivamente, rotulados nas extremidades 5’. Depois, o fragmento BamHl-Hindlll de 1,7 kb foi ligado nos sítios correspondentes do plasmídeo pACYC184 (Chang, A.C.Y. e Cohen, S.N., Construction and characterization of amplifiable multicopy DNA cloning vehicles derived from the P15A cryptic miniplasmid, J. Bacteriol., 134, 1141-1156, 1978. Rose, R.E., The nucletide sequence of pACYC184, Nucleic Acids Res., 16, 355, 1988), produzindo o plasmídeo pACYC-tyrB. O plasmídeo pACYC-tyrB foi introduzido nas células da cepa E. coli 505 por transformação, e a cepa 505/pACYC-tyrB foi formada. EXEMPLO 3. EFEITO DA AMPLIFICAÇÃO DO GENE tvrB SOBRE A PRODUÇÃO DE L-LEUCINA, Cada uma das cepas 55, 505, 505/ pACYC-tyrB foi transferida por um circuito de cultura em tubos de teste de 20 ml com caldo de L e foi incubada durante a note com aeração em 32°C. O 0,1 ml de cada cultura noturna foi transferido em tubos de teste de 20 ml (diâmetro interno de 22 mm), colocado em suspensão em 2 ml de meio para fermentação e cultivado em 32°C por 48 horas com agitador rotativo. O meio para fermentação continha 60 g/1 de glicose, 25 g/1 de sulfato de amônio, 2 g/1 de KH2PO4, 1 g/1 de MgS04, 0,1 mg/1 de tiamina, 5 g/1 de extrato de levedura Difco e 25 g/1 de giz (pH 7,2). A glicose e 0 giz foram esterilizados separadamente.

Após 0 cultivo, a estabilidade do plasmídeo foi determinada por método convencional. A quantidade de L-leucina acumulada no meio foi determinada por TLC. A composição de fase líquida para TLC foi como se segue: isopropanol - 80 ml, etilacetato - 80 ml, NH4OH (30%) - 25 ml, H20 -50 ml. ______ TABELA 1 __ Como é visto da Tabela 1, as cepas 505 e 505/pACYC-tyrB não produziram qualquer quantidade de L-valina, L-isoleucina e L-homoleucina. A inativação do gene ilvE efetuou a diminuição da produção de L-leucina. E a amplificação do gene tyrB melhorou 0 acúmulo de L-leucina pela cepa de produção de L-leucina 505.

REIVINDICAÇÕES

Claims

1. Bactéria recombinante produtora da L-leucina, caracterizada pelo fato de que pertence ao gênero Escherichia, que produz L-valina, L-isoleucina ou L-homoleucina em uma quantidade menor do que 1 % daquela da L-leucina produzida em que a sequência codificadora da proteína do gene ilvE ou a sequência reguladora de expressão do gene ilvE foi modificada para diminuir a atividade enzímática na proteína por célula em comparação com a cepa não modificada, e em que a bactéria foi transformada com um DNA contendo o gene tyrB ou foi modificada para aumentar o número de cópias do gene ou alterar a expressão da sequência reguladora de expressão ou sequência realçadora do gene.

2. Bactéria recombinante de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a bactéria é transformada usando um vetor de múltiplas cópias.

3. Método para a produção da L-leucina, cujo método caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: - cultivar a bactéria recombinante como definida na reivindicação 1 ou 2 em um meio para produzir e acumular a L-leucina no meio, e - coletar a L-leucina do meio.

4. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a bactéria recombinante foi modificada para ter expressão acentuada de um gene da biossíntesc de L-leucina pelo aumento do número de cópias do gene ou posicionando o gene sob controle de um promotor potente, em que o gene é selecionado a partir do grupo consistindo de gene leuA cuja inibição por retroalimentação por L-lisina é dessensibilizada, gene leuB, gene leuC e gene ieuD.