BRPI0203246B1 - processo para isolar seletivamente anticorpos igy de gema de ovo de uma ave anseriforme e anticorpos igy obtidos do mesmo - Google Patents

Abstract

"processo para isolar seletivamente anticorpos igy de gema de ovo de uma ave anseriforme e anticorpos igy obtidos do mesmo". o qual refere-se, principalmente, a um processo para isolamento e purificação de anticorpos de gema a partir de gema de ovo de uma ave anseriforme, através de um procedimento cromatográfico de adsorção usando um absorvente insolúvel em água não carregado para executar a separação desejada de anticorpos de gema, e por um procedimento de precipitação de proteínas pela elevação da concentração salina que precipita, de forma diferencial, os anticorpos igy. a presente invenção também se refere aos anticorpos de gema produzidos aqui e aos vários usos destes anticorpos de gema.

Description

“PROCESSO PARA ISOLAR SELETIVAMENTE ANTICORPOS IGY DE GEMA DE OVO DE UMA AVE ANSERIFORME E ANTICORPOS IGY OBTIDOS DO MESMO” Campo da Invenção A presente invenção refere-se a um processo para o isolamento e purificação rápidos de anticorpos de gema de ovo, em especial anticorpo IgY, de gema de ovo de ave anseriforme, e os anticorpos de gema de ovo obtidos do mesmo. Mais especificamente, a presente invenção refere-se a um processo para isolamento e purificação de anticorpos de gema de ovo de ave anseriforme através de procedimento cromatográfico de adsorção usando um absorvente não carregado insolúvel em água para realizar a separação desejada de anticorpos de gema de ovo, e através de um procedimento de precipitação de proteínas pela elevação da concentração salina, o qual precipita, de forma diferencial os anticorpos IgY. A presente invenção também se refere aos usos dos anticorpos IgY em imunoensaio quantitativo ou qualitativo ou na preparação de composições farmacêuticas direcionadas para um agente etiológico de interesse.

Estado da Técnica Anticorpos são usados amplamente em muitas investigações biológicas e aplicações clínicas. Soros obtidos de mamíferos hiperimunizados são a fonte mais comum de anticorpos policlonais. Anticorpos derivados destes soros imunes pertencem a um grupo de proteínas denominadas “imunoglobulinas”, entre as quais a imunoglobulina G (IgG) é a mais abundante. A molécula IgG consiste de três domínios, isto é, duas regiões Fab e uma região Fc. A porção Fab envolve principalmente uma ligação de antígeno. A porção Fc, embora não possua a capacidade para ligar-se a um antígeno, governa várias atividades biológicas de um anticorpo, tal como fixação de complemento e ligação de receptor Fc.

Na técnica dos imunodiagnósticos, uma molécula IgG intacta não é adequada para uso em sistemas de detecção e análises imunológicas envolvendo soros de mamíferos, visto que a região Fc em uma molécula IgG é capaz de ligar-se a receptores Fc, ativando o sistema de complemento, e reagindo com fator reumatóide nos soros de mamíferos. A remoção da porção Fc de uma molécula IgG freqüentemente conduz a uma redução na interferência (E. Lamoyi, Methods in Enzymology 121:652-663, 1986).

Alguns dos usos sugeridos para os anticorpos em imunoterapia incluem o tratamento de pacientes com toxinas bacterianas intoxicadas ou venenos de serpente (veja, por exemplo, Patente Norte-americana 5,340,923 e Patente Norte-americana 5,601,823), e proteção de suínos neonatais contra colibacilose entérica fatal (veja, por exemplo, H. Brussow et ai, J. Clin. Microbiol. 25:982, 1987; e C. O. Tacket et al., New Eng. J. Med. 318:1240, 1988). Visto que o fragmento Fc de uma molécula de anticorpo é conhecido por ser a porção mais antigênica da imunoglobulina (E. M. Akita et ai, J. Immunol Methods. 162:155-164, 1993), a divagem da mesma, que resulta na formação do fragmento F(ab')2, reduzirá significativamente uma série de locais alergênicos potenciais na molécula de imunoglobulina e é, dessa maneira, benéfica a um ser humano ou animal que receber a imunoglobulina.

Recentemente, o fragmento de anticorpo F(ab')2 bivalente demonstrou ser mais útil nos testes de imunodiagnóstico (M.

Muratsugu et aí., J. Colloid Interface Sei 147:378, 1991); e J. L. Ortega-Vinuesa et ai, J. Immunol Methods 90:29, 1996) e mais adequado para desenvolvimento dos imunoensaios envolvendo soros de mamíferos do que o IgG mãe. O fragmento de anticorpo F(ab')2, entretanto, não encontrou uso amplo em ‘kits’ de imunodiagnósticos clínicos como se poderia esperar. Isto pode ser atribuído às dificuldades e ineficiência de custo de produção em grande escala dos fragmentos F(ab')2, que é convencionalmente feita pela digestão de pepsina de IgG e purificação subsequente através de cromatografia.

Patos e seus parentes filogeneticamente próximos e alguns répteis tais como as tartarugas, possuem três espécies de imunoglobulinas séricas: a imunoglobulina macromolecular IgM (800 kDa no pato), e duas isoformas de IgG de peso molecular baixo com coeficientes de sedimentação de 7,8 S (no pato, 180 kDa) e 5,7 S (no pato, 130 kDa), respectivamente. (E. R. Unanue et al, J. Exp. Med. 121:697-714, 1965; Η. M. Grey, J. Immunol 98:811-819, 1967); e B. Zimmerman et al., Biochemistry 10:482-448, 1971). IgG de aves é freqüentemente denominado IgY devido a sua existência na gema do ovo além de sua existência nos soros. O IgY 5,7 S, constituído com cadeias pesadas mais curtas, é estrutural e antigenicamente similar ao fragmento F(ab')2 do 7,8 S IgY (Figura 1), e este fato conduz à nomenclatura de IgY (equivalente a 7,8 S IgY) e IgY(AFc) (equivalente a 5,7 S IgY) para representar ambas as isoformas de IgY (K. E. Magor et al., J. Immunol. 149:2627-2633, 1992).

Estudos conduzidos nas aves infectadas ou experimentalmente imunizadas mostrou que anticorpos de patos são deficientes em uma série de funções biológicas de efetor, incluindo fixação de complemento e ligação de receptores Fc, sem sacrificar sua atividade de ligação aos antígenos correspondentes (G. W. Litman et ai, Immunochemistry 10:323, 1973; e T. E. Toth et ai, Avian Dis. 25:17-28, 1981). Isto pode resultar razoavelmente da falta aparente de região equivalente a Fc do anticorpo IgY(AFc) que constitui o componente quantitativamente principal de resposta de anticorpo de ave anseriforme. Dessa maneira, é considerado que o anticorpo IgY(AFc), que parece ser um análogo estrutural e funcional do fragmento F(ab')2, proveria vantagens magníficas aos usos imunológicos, se um processo promissor para fabricação de anticorpos pudesse ser descoberto, e se os requisitos físicos apropriados para esta atividade pudessem ser identificados.

Foi relatado que anticorpos de gema de ovo de aves exibem propriedades úteis tanto para pesquisa quanto para aplicações clínicas, assim como ocorre com os anticorpos de mamíferos (veja, por exemplo, a Patente Norte-americana 5,340,923; Patente Norte-americana 5,585,098; Patente Norte-americana 5,601,823; e Patente Norte-americana 5,976,519). Gemas de ovo derivadas de uma ave poedeira são de baixo custo e mais convenientes e seguras de manusear, se comparadas com soros de mamíferos hiperimunizados. Mais importante ainda, os anticorpos de gema de ovo são capazes de resistir ao escrutínio das modernas regulamentações de proteção aos animais (A. Poison et ai, Immunol. Commun. 9:475, 1980; e B. Gottstein et ai). Estes fatos sugerem um uso potencial de gema de ovo como uma fonte comercial de anticorpos.

Entretanto, teores elevados de substâncias lipídicas, tais como ácidos graxos, colesterol e lecitina, na gema de ovo, tornam o isolamento de anticorpos de gema uma tarefa incômoda e trabalhosa. Muitos esforços foram feitos neste sentido. Por exemplo, precipitantes solúveis em água, incluindo ágar, pectina (Patente Japonesa Kokai No. 64-38098 publicada em 8 de fevereiro de 1989), sulfato de dextrana (J. C. Jensenius et ai, J. Immunol. Methods 46:63, 1981), gomas naturais (H. Hatta et ai, J. Food Science 53:425, 1988) e polietilenoglicol (PEG) (A. Poison et al., Immunol. Invest. 14:323, 1985; veja também a Patente Norte-americana 4,550,019 emitida por A. Poison) foram usados para precipitar biomoléculas não aquosas, principalmente lipídeos e grânulos de gema para, então, coletar uma fase solúvel em água contendo anticorpos de gema abundantes da população inteira. A. Hassl et ai desenvolveu um processo cromatográfico de duas etapas, compreendidas de cromatografia de interação hidrofóbica e cromatografia exclusiva de tamanho, para isolamento adicional de anticorpos de gema de ovo da população inteira, de uma fração purificada por PEG (A. Hassl e H Aspock, J. Immunol. Methods 110:225, 1988). Akita et ai descreveu um método aprimorado para isolamento de IgY, no qual anticorpos de gema foram extraídos de ovos de galinha através da diluição de gemas de ovo com uma grande volume de água e submetendo o flutuante resultante à cromatografia exclusiva de tamanho e/ou cromatografia de troca de íon (E. M. Akita et ai, J. Immunol. Methods. 160:207, 1993; e E. M. Akita and S. Nakai, J. Food Sei. 57:629, 1993).

Entretanto, todos estes estudos e patentes estão focados no isolamento da população inteira de anticorpos de gema de ovo (que pelo menos inclui IgY presente ou ausente da região Fc) de ovos de aves, ao invés da purificação de anticorpos IgY(AFc) e anticorpos IgY seletivamente. Além do mais, visto que anticorpos IgY(AFc) estão presentes apenas em pássaros pertencendo à Ordem dos Anseriformes, incluindo patos e gansos, e visto que o teor de lipídeo na gema de ovo das aves anseriformes é relatado ser mais elevado que aquele de aves galiformes, tais como galinhas e perus, os métodos convencionais descritos acima não provêem sugestão para uma purificação bem sucedida de anticorpo IgY(AFc) Anticorpo IgY(AFc) foi purificado apenas pela co-precipitação com IgY de soro de pato (D. A. Higgins et ai, Veterinary Immunology and Immunopathology 41:169-180, 1995) com procedimentos complexos e de alto custo, mas nenhum anticorpo IgY(AFc) sozinho foi isolado seletivamente de gema de ovo.

Portanto, existe uma necessidade de um processo rápido, com custo efetivo e de alta produtividade, que proveja isolamento fácil do anticorpo IgY desejado, do grupo de anticorpos de ovos de aves anseriformes, mantendo a atividade do anticorpo IgY. O anticorpo IgY(AFc) substancialmente purificado pode agir como um novo tipo de anticorpo F(ab')2 para vários usos imunodiagnósticos e imunoterapêuticos.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Uma pesquisa extensa foi conduzida para preencher os requisitos industriais para anticorpos de gema conforme indicado acima. Foi inesperadamente descoberto que o isolamento bem sucedido de anticorpos de gema de gema de ovos de uma ave anseriforme pode ser prontamente obtido através de um procedimento cromatográfico de adsorção, usando um absorvente não carregado insolúvel em água e/ou através de um procedimento simples de precipitação de proteínas pela elevação da concentração salina que diferencia isoformas diferentes dos anticorpos de gema. De acordo com o processo da presente invenção, os anticorpos de gema altamente purificados, em especial o anticorpo IgY(AFc) altamente purificado, podem ser facilmente obtidos com um alto rendimento e de uma maneira econômica, e estão prontos para ampla variedade de usos imunológicos.

Consequentemente, um objetivo da presente invenção é prover um processo para seletivamente isolar anticorpos IgY de gema de ovo de uma ave anseriforme, que é caracterizado por: (a) absorver anticorpos de gema em uma fração miscível em água obtida de gema de ovo de uma ave anseriforme com um absorvente insolúvel em água não carregado selecionado do grupo consistindo de silicato, compostos de silício, carbonato, sulfato, fosfato, carbono, celulose e fibra sintética, cerâmicas, e óxido de metal, e onde o absorvente insolúvel em água não carregado está em uma quantidade efetiva para separar os anticorpos de gema da fração miscível em água; e (b) fazer fluir o absorvente insolúvel em água não carregado em um tampão para obter uma fração aquosa contendo os anticorpos de gema.

Um outro aspecto da invenção é prover um processo para isolar seletivamente anticorpos IgY de gema de ovo de uma ave anseriforme, que seja caracterizado por primeiro efetuar um procedimento de precipitação de proteínas pela elevação da concentração salina, através da precipitação de uma fração aquosa contendo anticorpos de gema com (NH4)2S04 de uma primeira concentração variando de aproximadamente 15 % (p/v) a aproximadamente 24 % (p/v), e onde preferivelmente não mais que aproximadamente 21 % (p/v) com base no volume da fração aquosa, e então executar um segundo procedimento de precipitação de proteínas pela elevação da concentração salina através da precipitação da fração aquosa contendo os anticorpos de gema tratados no primeiro procedimento de precipitação com (NH4)2S04 de uma segunda concentração variando de aproximadamente 25% (p/v) a aproximadamente 40% (p/v), e onde preferivelmente não mais que aproximadamente 31% (p/v) com base no volume da fração aquosa tratada com a primeira precipitação.

Ainda um outro aspecto da invenção é prover um processo para isolar seletivamente anticorpos IgY de gema de ovo de uma ave anseriforme, que é caracterizado por: (a) absorver anticorpos de gema em uma fração miscível em água obtida da gema de ovo de uma ave anseriforme com um absorvente insolúvel em água não carregado selecionado do grupo consistindo de silicato, compostos de silício, carbonato, sulfato, fosfato, carbono, celulose e fibra sintética, cerâmicas, e óxido de metal, e onde o absorvente insolúvel em água não carregado está em uma quantidade efetiva para separar os anticorpos da fração miscível em água; (b) fazer fluir o absorvente insolúvel em água não carregado em um tampão para obter uma fração aquosa contendo os anticorpos de gema; (c) executar o procedimento de precipitação de proteínas pela elevação da concentração salina da fração aquosa contendo anticorpos de gema na etapa (b) com (NH4)2S04 de uma primeira concentração variando de aproximadamente 15% (p/v) a aproximadamente 24% (p/v), e onde preferivelmente não mais que aproximadamente 21% (p/v) com base no volume da fração aquosa; e (d) executar o procedimento de precipitação de proteínas pela elevação da concentração salina da fração aquosa contendo anticorpos de gema tratados na etapa (c) com (NH4)2S04 de uma segunda concentração variando de aproximadamente 25% (p/v) a aproximadamente 40% (p/v), e onde aproximadamente não mais que aproximadamente 31% (p/v) com base no volume da fração aquosa tratada na etapa (c).

De acordo com o processo desta invenção, uma quantidade abundante de uma isoforma selecionada de anticorpos de gema, em especial anticorpo IgY(AFc), disponível para várias aplicações industriais pode ser obtida de uma maneira econômica, eficiente e sem desperdício de tempo. É ainda um outro objetivo da invenção prover os usos clínicos e de pesquisa do anticorpo IgY assim produzido. Além da eficácia de custo e facilidade de preparação, o anticorpo IgY(AFc) de acordo com a presente invenção possui as vantagens de ser inativo ao sistema de complemento e a fatores reumatóides nos soros de mamíferos, e ter reatividade cruzada fraca à IgG de mamífero, e é, dessa maneira, especialmente adequado para uso em análises imunológicas envolvendo soros de mamíferos com interferência mínima. Seria apreciado por aqueles especializados na técnica, que o anticorpo IgY pudesse estar presente na forma de um reagente único para aplicações clínicas, de pesquisa e outras aplicações, ou incluído em um conjunto comercial como um componente ativo. É ainda um outro objetivo específico da invenção prover um reagente para imunoensaio de um agente etiológico de interesse, compreendendo um anticorpo de IgY obtido pelo processo de acordo com esta invenção.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Os objetivos e características acima e outros objetivos e características da presente invenção se tornarão aparentes com referência à descrição a seguir das configurações preferidas consideradas em conjunto com os desenhos anexos, nos quais: A Figura 1 ilustra uma análise SDS-PAGE comparando as capacidades de captura de anticorpo de quatro absorventes: linha 1, o extrato de anticorpo parcialmente purificado; linha 2, a solução fluindo através de sílica defumada a 2%; linha 3, a solução fluindo através de dióxido de sílica a 3%; linha 4, a solução fluindo através de diatomito Celite a 3%; linha 5, a solução fluindo através de diatomito Celite “hyflo-Cel” a 3%;e linha 6, a solução fluindo através de diatomito Celite “hyflo-Cel” a 5%; A Figura 2 ilustra os resultados de eletroforese dos anticorpos de gema purificados usando sílica defumada como o absorvente operando em um gel de SDS-poliacrilamida a 8%: linha 1, o extrato de anticorpo parcialmente purificado; linha 2, a solução fluindo através de sílica defumada a 2%; linha 3, o eluato da conta de sílica defumada; linha 4, o produto de anticorpo precipitado com sulfato de amônio a 21% (p/v) na primeira etapa de precipitação; e linha 5, o produto de anticorpo precipitado com 31% (p/v) de sulfato de amônio na segunda etapa de precipitação; A Figura 3 ilustra os resultados de eletroforese dos anticorpos de gema purificados usando diatomito Celite como o absorvente operando em um gel de SDS-poliacrilamida a 8%: linha 1, o extrato de anticorpo parcialmente purificado; linha 2, filtrado de diatomito Celite; linha 3, o produto de anticorpo precipitado com sulfato de amônio a 21% (p/v) na primeira etapa de precipitação; linha 4, o produto de anticorpo precipitado com sulfato de amônio a 31% (p/v) na segunda etapa de precipitação; e linha 5, o produto de anticorpo precipitado com sulfato de sódio a 16% (p/v) na segunda etapa de precipitação; e A Figura 4 ilustra os resultados de eletroforese dos anticorpos de gema purificados usando sílica defumada como o absorvente operando em um gel de SDS-poliacrilamida a 8%: M, marcador de peso molecular; linha 1, o extrato de anticorpo parcialmente purificado; linha 2, a solução fluindo através de sílica defumada a 2%; linha 3, o eluato da conta de sílica defumada; linha 4, o produto de anticorpo precipitado com sulfato de amônio a 21% (p/v); e linha 5, o produto de anticorpo purificado por cromatografia de afinidade. DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Os anticorpos de gema são abundantes no soro de aves e nos ovos postos pela ave. Entretanto, conforme descrito acima, a coleta do anticorpo do ovo é usualmente preferida devido ao custo. A ave poedeira transfere ambas as isoformas, IgY e IgY(AFc) do soro para a gema do ovo. Em princípio, cada ovo de pata contém soro para a gema do ovo. Em princípio, cada ovo de pata contém de aproximadamente 1 a aproximadamente 4 mg de IgY/ml e de aproximadamente 3 a aproximadamente 12 mg lgY(A Fc)/ml na gema e, portanto, estima-se que a quantidade total dos anticorpos contidos em um único ovo seja de 15 a 80 mg de IgY e de 45 a 240 mg de IgY(AFc). O grande volume de gema de ovo produzido excede o volume do soro que pode ser seguramente obtido das aves durante qualquer período dado. Além disso, a extração de anticorpos de gema pode ser executada em uma grande escala sem um investimento de alto custo. Preferivelmente, os anticorpos da presente invenção são obtidos de ovos de uma ave anseriforme imunizada com um antígeno específico.

De acordo com a presente invenção, ela provê um processo para eficientemente isolar anticorpos de gema de ovo, no qual a assim denominada “cromatografia de adsorção” ou “procedimento de precipitação de proteínas pela elevação da concentração salina diferencial”, os quais podem ser usados sozinhos ou em combinação um com o outro, agindo como etapas críticas no isolamento.

Conforme usado aqui, o termo “cromatografia de adsorção” é direcionado para um tipo de método de separação, envolvendo o uso de uma fase estacionária, para seletivamente absorver e concentrar os solutos desejados de uma fase móvel. De acordo com um aspecto da presente invenção, um absorvente insolúvel em água não carregado age como o constituinte ativo na fase estacionária para separar os anticorpos de gema através de adsorção dos anticorpos de gema no absorvente insolúvel em água não carregado acompanhado pelo aprisionamento de impurezas lipídicas miscíveis em água normalmente presentes na gema de ovo.

Em uma configuração preferida da presente invenção, a gema é primeiramente separada da clara de ovo, e então lavada com água destilada para remover tanta albumina quanto possível. A membrana vitelina encapsulando a gema é perfurada, e a fração de gema separada é, então, diluída com uma quantidade efetiva de um tampão aquoso ou água, para formar uma suspensão da gema de ovo. Preferivelmente, a gema de ovo coletada é diluída com uma solução tampão aquosa ou água destilada variando de aproximadamente 2 partes a aproximadamente 40 partes em volume, mais preferivelmente de aproximadamente 5 partes a aproximadamente 30 partes em volume, por 1 parte da gema de ovo. O valor do pH é relatado como sendo um fator crítico durante o estágio de purificação parcial (E. M. Akita e S. Nakai, J. Food Sei. 57:629, 1993). Para a melhor recuperação de anticorpos de gema, o pH é preferivelmente definido dentro de uma faixa de aproximadamente 5 a aproximadamente 7. Desejavelmente, a temperatura nesta etapa está dentro da uma faixa de aproximadamente 0°C a aproximadamente 60°C. A suspensão da gema de ovo é gentilmente agitada para formar uma mistura homogênea, e então deixada descansar durante um período suficiente para formar as fases aquosa e não aquosa. Os materiais insolúveis em água, incluindo as biomoléculas não aquosas, tais como lipoproteínas, fosfolipídeos, esteróis e similares, são, então, removidos da suspensão de gema aquosa através de centrifugação. O flutuante contendo o anticorpo resultante pode, então, ser separado do precipitante viscoso através de decantação, aspiração, ou outros métodos similares conhecidos na técnica.

Em geral, o teor de lipídeo da fração miscível em água assim obtida é ainda muito elevada, de modo que é adversa à subseqüente manipulação. De acordo com a presente invenção, uma fase estacionária contendo um absorvente insolúvel em água não carregado é incubada com a fração miscível em água em uma quantidade suficiente para absorver os anticorpos de gema e para adsorver a maioria das substâncias lipídicas miscíveis em água remanescentes na fração miscível em água. Os absorventes adequados incluem, mas não se limitam a silicato, composto de silício, carbonato, sulfato, fosfato, carbono, celulose e fibra sintética, cerâmicas, e óxido de metal, e onde o silicato inclui argilas sintéticas ou naturais, caulim, talco, e silicato de cálcio; o composto de silício inclui sílica defumada, sílica amorfa, dióxido de sílica, sílica gel, silicatos, terra diatomácea, e terra de Fuller; carbonato inclui carbonato de cálcio e carbonato de bário; sulfato inclui sulfato de cálcio; fosfato inclui fosfato de cálcio; carbono inclui carbono ativado e fibra de carbono, celulose e fibra sintética incluem pó de celulose; cerâmica inclui cerâmica de porosidade; e óxido de metal inclui óxido de alumínio e óxido de titânio. Absorventes especialmente preferidos são sílica defumada, dióxido de sílica e terra diatomácea. A proporção de trabalho do absorvente para a fração miscível em água pode variar em uma ampla faixa dependendo das propriedades do absorvente escolhido. Quando sílica defumada é usada neste processo, ela é preferivelmente adicionada em uma concentração igual ou maior que aproximadamente 0,1% em peso, e mais preferivelmente variando entre aproximadamente 0,3 e aproximadamente 5,0% em peso, com base no volume da fração miscível em água a ser tratado. Quando o absorvente é dióxido de sílica ou terra diatomácea, a cromatografia de adsorção de acordo com esta invenção é preferivelmente executada em mais que aproximadamente 1% em peso, e mais preferivelmente em uma faixa de aproximadamente 3 a aproximadamente 20% em peso, do absorvente com base no volume da fração miscível em água a ser tratada. A cromatografia de adsorção de acordo com esta invenção pode ser efetuada de qualquer maneira convencional, tal como tratamento por lote da fração miscível em água com um absorvente ou fazendo fluir a fração miscível em água sobre uma coluna cromatográfica empacotada com o absorvente, contanto que a quantidade dos anticorpos retida nas superfícies do absorvente seja satisfatória. Os tempos de reação e de temperatura durante o tratamento não são críticos para os resultados, e uma temperatura de reação de aproximadamente 4 a aproximadamente 30°C e um tempo de reação de aproximadamente 10 a aproximadamente 60 minutos são usuaimente possíveis. Embora o procedimento de adsorção possa ser repetido várias vezes, cada um com um absorvente fresco, se necessário, normalmente uma única operação é suficiente. Através deste procedimento, os lipídeos e a maioria das substâncias não lipídicas podem ser separados de forma adequada em duas fases imiscíveis enquanto anticorpos de gema podem também ser absorvidos.

Dependendo da capacidade do absorvente selecionado para capturar imunoglobulinas, os anticorpos de gema podem ser recuperados tanto de um eluato eluído da fase estacionária ou da “solução filtrada” (“flow-through solution”) que, conforme usado aqui, possui a intenção de representar a solução passando através da fase estacionária. Conforme mostrado nas configurações preferidas providas no texto, os anticorpos de gema estão principalmente presentes na fase estacionária quando sílica defumada ou dióxido de sílica é usado como o absorvente, enquanto terra diatomácea deixa mais que aproximadamente 60% dos anticorpos na solução filtrada. A escolha de um método específico para obter anticorpos de gema pode ser determinada por um técnico especializado. Tipicamente, os anticorpos de gema são obtidos em uma fração aquosa através do fluxo de absorvente insolúvel em água não carregado em um tampão, e onde o tampão está a um pH menor que aproximadamente 4 ou maior que aproximadamente 8, ou contendo um agente caotrópico (SIC) pode ser utilizado na presente invenção para obter os anticorpos de gema a partir da fase estacionária sem substancialmente dissociar as substâncias lipídicas da fase estacionária, de modo que um eluato contendo anticorpo é formado. Conforme usado aqui, o termo “eluato” é direcionado para uma solução contendo as substâncias desejadas desligadas pelo eluente da fase estacionária. O termo “agente caotrópico” ou “caotropo” é direcionado para uma substância capaz de induzir uma alteração de conformação em uma molécula de proteína, tal como uma molécula de anticorpo, que é, portanto, freqüentemente conhecido como um agente de desnaturação de proteína. De acordo com a invenção, a maioria dos anticorpos ligada pode ser eluídos de forma bem sucedida com qualquer tampão neutro contendo concentração moderada (> 1 M) de um agente caotrópico. Na maioria dos casos, a remoção do caotropo após eluição irá recuperara estrutura da proteína nativa. O tampão útil inclui, mas não se limita a glicina-HCI 0,1 M, pH 2,3; glicina-HCI 0,1 M, pH 10,0; guanidina-HCI 3 M a 6 M, pH 3,0; cloreto de potássio 3,0 M; iodeto de potássio 5 M; cloreto de magnésio 3,5 M; tiocianato de potássio/sódio/amônio 1-3 M e uréia 6 M. Com relação à atividade dos anticorpos recuperados, entretanto, uma resistência iônica moderada, contendo caotropo, tampão de pH neutro, tal como tiocianato de sódio 3 M tamponado em tampão MES 20 mM (pH 5,8) ou Tris(hidroximetil)-aminometano 20mM(pH 7,5), é mais adequado para a prática da invenção. O estado ativo dos anticorpos coletados pode ser facilmente recuperado, por exemplo, através de diálise extensiva contra uma resistência iônica baixa, não contendo caotropo, e tampão fracamente ácido.

De acordo com um aspecto da presente invenção, a fração aquosa incluindo o eluato ou a solução filtrada, enriquecida com anticorpos, pode ser subseqüentemente submetida a um procedimento de precipitação de proteínas pela elevação da concentração salina diferencial para separar isoformas de anticorpo de gema. O termo ‘procedimento de precipitação de proteínas pela elevação da concentração salina” conforme usado aqui possui seu significado comum na técnica da química de proteínas e está direcionado à adição de um sal ou sais não-desnaturantes a uma mistura ou lote de produção para diminuir a solubilidade de proteínas, o que conduz à precipitação ou coagulação das proteínas. Pelo termo “procedimento de precipitação de proteínas pela elevação da concentração salina diferencial” entende-se um processo de precipitação de proteínas pela elevação da concentração salina que precipita ou coagula de forma diferencial duas ou mais proteínas de uma mistura através da variação da concentração do sal ou sais adicionados. Na presente invenção, as proteínas que visam ser precipitadas de forma diferencial são as isoformas de anticorpos de gema, isto é, IgY e IgY(AFc). Exemplos de sais não desnaturantes úteis para precipitação dos anticorpos de gema incluem, mas não se limitam a NaCI, Na2S04, (NH4)2S04, KCI, CaCI2, e MgS04. Preferivelmente, o sal não desnaturante é Na2S04 ou (NH4)2S04, e (NH4)2S04 é o mais preferido. A concentração de sal para precipitação diferencial de isoformas de anticorpo de gema depende do tipo do sal e pode ser determinada por um técnico especializado através de testes simples. De acordo com uma configuração preferida da presente invenção, na qual é empregado (NH4)2S04, IgY é primeiramente submetido a um procedimento de precipitação de proteínas pela elevação da concentração salina a uma concentração variando de aproximadamente 15 % (p/v) a aproximadamente 24% (p/v), e onde preferivelmente é igual ou menor que aproximadamente 21% (p/v), do sal com base no volume tratado da fração aquosa, enquanto IgY(AFc) é precipitado como a concentração do sal variando de aproximadamente 25% (p/v) a aproximadamente 40% (p/v), e onde preferivelmente é aproximadamente 31% (p/v) com base no volume tratado da fração aquosa. Deve ser observado que a seqüência de precipitação das duas isoformas de anticorpo poderia também ser variável dependendo do sal escolhido. O uso combinado de dois ou mais sais neste procedimento, por exemplo, primeiramente precipitando uma primeira isoforma com um sal seguido pela precipitação de uma segunda isoforma com um outro sal, é também possível. O procedimento de precipitação de proteínas pela elevação da concentração salina diferencial de acordo com a presente invenção dramaticamente realiza o objetivo principal da presente invenção, isto é, separação seletivamente essencial do IgY desejado compreendendo anticorpos IgY e IgY(AFc) da população total de anticorpos de gema constituída por ambos, IgY e IgY(AFc).

Se a obtenção de anticorpos com uma pureza mais elevada for desejada, os anticorpos precipitados podem ser redissolvidos em um sistema tampão adequado e submetidos a procedimentos de purificação adicionais, tais como cromatografia de exclusão de tamanho, cromatografia de interação hidrofóbica, cromatografia de troca iônica e cromatografia de imuno-afinidade.

Conforme usado aqui, o termo “purificação de imuno-afinidade” ou “cromatografia de imuno-afinidade” é direcionado para um tipo de método de separação baseado nas características de ligação de anticorpos para um antígeno específico. Isto é, os anticorpos que se ligam a um antígeno específico sob uma condição específica são separados dos anticorpos não ligados sob aquela condição. A presente invenção considera o uso de purificação de imuno-afinidade para eliminar proteínas irrelevantes, em especial as imunoglobulinas não ligadas a antígeno.

De acordo com a presente invenção, a purificação de imuno-afinidade é conduzida através do uso de uma “matriz de antígeno” compreendida de antígeno imobilizado em um suporte insolúvel. O tipo do suporte não é crítico para a purificação de imuno-afinidade da invenção. Qualquer material de suporte convencional, adequado para a ligação co-valente de um antígeno e inerte para a interação entre o anticorpo desejado e o antígeno imobilizado no mesmo, é útil. Usualmente, o suporte é feito de agarose reticulada ou dextrana reticulada, tal como o Sepharose 4B CNBr-ativado, comercialmente disponível pela Pharmacia.

Os anticorpos purificados pelo procedimento de precipitação de proteínas pela elevação da concentração salina diferencial são dissolvidos em um “tampão de ligação” e aplicados na matriz de antígeno, de modo que os complexos imunológicos do antígeno imobilizado e os anticorpos de gema são formados. Qualquer sistema de tampão inerte em relação à interação de antígeno-anticorpo e efetivo para manter a condição de ligação desejada é útil na presente invenção. Preferivelmente, o tampão de ligação é selecionado do grupo consistindo de um tampão de fosfato, um tampão MES (2-[N-morfolino]ácido etanossulfônico) e tampão bis-Tri, entre os quais um tampão MES a uma concentração de 20 mM é o mais preferido.

Preferivelmente, a purificação de imuno-afinidade é conduzida em um ambiente de ácido fraco e resistência iônica baixa, isto é, em um pH dentro da faixa de aproximadamente 4 a aproximadamente 7 e sob uma resistência iônica menor que aproximadamente 50 mM. Mais preferivelmente, os anticorpos puderam interagir com o antígeno imobilizado a um pH dentro de uma faixa de aproximadamente 5 a aproximadamente 6 e mais preferivelmente dentro de uma faixa de aproximadamente 5,6 a aproximadamente 5,8. Os anticorpos de gema podem ser dissociados da matriz de antígeno por um sal caotrópico, ou a um pH menor que aproximadamente 4 ou maior que aproximadamente 8. A atividade dos anticorpos coletados pode ser recuperada, por exemplo, por diálise extensiva contra um tampão de resistência iônica baixa, não contendo caotropo, e fracamente ácido. O IgY(AFc) purificado de acordo com o processo da invenção, nem ativa o sistema de complemento nem se liga ao fator reumatóide dos soros de mamíferos. A reatividade cruzada imunológica entre IgY(AFc) e o IgG de mamífero não é significativa. Dessa maneira, a invenção também provê um novo tipo de anticorpo adequado para usos clínicos e de pesquisa. A invenção também provê uma ampla variedade de usos clínicos e de pesquisa do anticorpo IgY preparado de acordo com a invenção.

Por exemplo, a presente invenção provê uma composição farmacêutica para tratamento ou profilaxia de um animal (que inclui aves comestíveis domésticas, gado e animais de companhia) ou paciente humano, compreendendo uma quantidade terapêutica do anticorpo IgY da presente invenção para proteção ou profilaxia deles em relação a diversos agentes etiológicos, incluindo microorganismos, tais como bactérias, vírus nativo, recombinante ou peptídeo-sintético, vírus, fungos, protozoários, nematódeos e similares, e substâncias proteináceas ou não proteináceas, tais como alérgenos nativo, recombinante ou peptídeo-sintético, toxinas, venenos, hormônios ou qualquer outro imunógeno capaz de fazer surgir uma resposta imunológica. Preferivelmente, o anticorpo IgY purificado é aplicado em combinação com um veículo farmaceuticamente aceitável tal como água, solução salina e similares. A composição farmacêutica pode ser administrada através de meios compreendendo administração oral, por injeção, administração externa, e tratamento imunizante. O anticorpo IgY da presente invenção é também útil para detectar um agente etiológico de interesse, incluindo, por exemplo, um organismo patogênico ou não patogênico, tal como Escherichia coli, Salmonella enterititis, outros organismos bacterianos, hormônio peptídeo-sintético ou recombinante tal como estrogênio e progesterona, tireoxina e similares; um antígeno de histocompatibilidade complexa principal e similares; um marcador de tumor nativo, recombinante ou peptídeo-sintético tal como alfa-fetoproteína, antígeno específico da próstata e similares; um marcador de estado de doença tal como proteína C-reativa, ferritina e similares; um acúmulo ou resíduos de materiais estranhos tais como drogas de Teofilina e digoxina; em uma amostra corporal tal como um fluido, tecido, extrato de célula e similares, que seja derivada do ser humano ou do animal. De modo a obter anticorpos específicos apenas aos agentes etiológicos, o agente etiológico pode ser injetado nos patos como antígenos para induzir a produção de anticorpos desejados, e onde os antígenos compreendem antígenos naturalmente purificados, antígenos recombinantes, antígenos peptídeo-sintético, e DNA de plasmídeo. Usando o anticorpo IgY obtido de acordo com esta invenção, um agente etiológico de interesse pode ser quantitativa ou qualitativamente detectado por qualquer método convencional conhecido na técnica, tal como os métodos de Ouchterlony (MO), o método de imunodifusão radial única (SRID), o método de imunoeletroforese (IEP), o método de radioimunoensaio (RIA), o ensaio imunosorvente ligado à enzima (ELISA), o método da mancha Ocidental (WB), o método de imunoensaio turbidimétrico (TIA), o método de imunoensaio turbidimétrico de partícula aumentada, um imunoensaio enzimático, um imunoensaio nefelométrico, um imunoensaio quimioluminescente, um ensaio imunogênico de ouro, ou um ensaio de imunocromatografia. O anticorpo IgY da presente invenção é também adaptado para uso em ‘biochips’ e biossensores.

Os Exemplos a seguir são dados apenas com o objetivo de ilustração e não pretendem limitar o escopo da presente invenção. Exemplo 1: Procedimento de Imunização para Estimulação de Produção de Anticorpo Específico Doze patas domésticas com 16 semanas de idade (Anas platyrhynchos var. domestica) foram individualmente alojados para produção de anticorpos e ovos. As patas receberam uma injeção subcutânea de 1-5 mg/ml de proteína humana C-reativa (CRP; purificada de ascites humanos) em tampão de fosfato, pH 7,5, emulsificado com um volume igual de adjuvante de Freund completo. A concentração do antígeno usado estava geralmente na faixa de 1 a 5 mg/ml. Após a injeção inicial, fêmeas jovens receberam três injeções adicionais de 1-5 mg de antígeno a cada duas semanas. Uma semana mais tarde, os ovos começaram a ser coletados, rotulados e armazenados a 4°C até serem processados para extração e purificação de anticorpos. O procedimento de reforço foi repetido a cada quatro semanas durante o experimento. Sangue foi coletado no sétimo dia após cada injeção de reforço. Cada amostra de sangue foi centrifugada e o soro resultante foi coletado.

Exemplo 2: Extração de Anticorpos de Gemas de Ovos de Pata As gemas coletadas de ovos postos pelas patas hiperimunizadas do Exemplo 1 foram extensivamente lavadas por um jato fraco de água destilada, para, dessa maneira, remover a albumina. O volume de gema foi medido e então misturado extensivamente com água destilada em uma quantidade de dez vezes a quantidade medida de gema. A mistura foi, então, mantida durante pelo menos duas horas sob 4°C, e subseqüentemente centrifugada a 10.000 rpm em uma centrífuga Hitachi CR-22F durante uma hora. Uma camada de flutuante pálida e uma camada semi-sólida flexível foram formadas nos tubos da centrífuga. Exemplo 3: Tratamento com Absorventes Ao extrato bruto preparado no Exemplo 2 foram adicionados com um dos absorventes: 2% (p/v) de sílica defumada (adquirida da Sigma), 3% (p/v) de dióxido de sílica (Sigma), 3% (p/v) de diatomito Celite (adquirido da Celite Corporation), e 3 ou 5% (p/v) de diatomito Celite “hyflo-Cel” (Celite Corporation). As suspensões resultantes foram incubadas a 4°C durante 60 minutos com agitação suave. Após término da incubação, os absorventes foram precipitados a 4°C a 20.000 rpm em uma centrífuga Hitachi CR-22F, e os flutuantes e contas foram coletados separadamente. Amostras de dez μΙ tomadas de cada flutuante foram submetidas a eletroforese de gel de dodecilsulfato de sódio poliacrilamida não redutor (SDS-PAGE).

Conforme mostrado na Figura 1, em termos da quantidade dos anticorpos adsorvidos pelos absorventes, sílica defumada possui a melhor atividade adsorvente e quase nenhum anticorpo foi deixado na solução filtrada.

Dióxido de sílica apresenta uma afinidade ligeiramente mais fraca a imunoglobulinas, que talvez resulte de sua porosidade mais baixa (e assim compreendendo uma área superficial menos extensa) do que sílica defumada. Por outro lado, menos de 10% dos anticorpos de gema foram capturados por ambos os tipos de terras diatomáceas.

Exemplo 4: Procedimento de Precipitação de Proteínas de Anticorpos de Gema pela Elevação da Concentração Salina A conta de sílica defumada obtida no Exemplo 3 foi tratada com tiocianato de sódio a 2,5 M (pH 7,5) para eluir os anticorpos ligados a ela. O eluato resultante foi primeiramente precipitado com sulfato de amônio a uma concentração de aproximadamente 21% (p/v) com base no volume do eluato, seguido por uma segunda precipitação com adição de sulfato de amônio a aproximadamente 31% (p/v). Os produtos de anticorpo precipitados foram redissolvidos em solução salina de tampão de fosfato (PBS). SDS-PAGE analítica foi executada em um gel de acrilamida não redutor a 8%, no qual 2.237 μg do extrato bruto do exemplo 2 (linha 1), 10 μΙ do filtrado colhido no Exemplo 3 (linha 2), 1.122,25 μg do eluato da conta de sílica defumada (linha 3), e 153 μg e 372,85 μg dos produtos de anticorpo obtidos nas primeira e segunda etapas de precipitação (linha 4 e linha 5, respectivamente) foram carregados. O resultado é mostrado na Figura 2. As porcentagens de recuperação e a pureza foram determinadas por densitometria de varredura do gel e resumidas na Tabela 1.

Tabela 1 Conforme ilustrado na Tabela 1, os anticorpos IgY(AFc) resultantes são recuperados com aproximadamente 76% de rendimentos (72,05 mg/119,86 mg x 100%) com mais que 96% de pureza. Mais importante ainda, este esquema de purificação conduz de forma vantajosa para a separação essencial dos anticorpos IgY(AFc) desejados da população total de anticorpos de gema constituídos principalmente por ambos, IgY e IgY(AFc). Exemplo 5: IqY(AFc) Parcialmente Purificado com Diatomito Celite Aproveitando a capacidade da terra diatomácea para atrair lipídeos e repelir anticorpos, o extrato bruto preparado no Exemplo 2 foi colocado em uma coluna de filtração empacotada com 10% em peso de diatomito Celite, com base no volume colocado do extrato. A solução fluindo através da coluna foi coletada e submetida a uma primeira precipitação com 21% (p/v) de sulfato de amônio com base no volume de solução filtrada. Os anticorpos precipitados foram coletados e o flutuante foi dividido em duas partes. Uma parte do flutuante foi precipitada com sulfato de amônio a uma concentração de aproximadamente 31% (p/v), enquanto a outra parte foi precipitada com 16% (p/v) de sulfato de sódio. Os produtos de anticorpo precipitados foram redissolvidos em PBS. SDS-PAGE analítica foi executada em um gel de acrilamida não redutor a 8%, no qual 2.012,5 pg do extrato bruto do Exemplo 2 (linha 1), 1.678 μg do filtrado coletado pela filtração de diatomito Celite (linha 2), 94,9 μg do eluato obtido na primeira etapa de precipitação (linha 3), e 169,65 μg e 357,75 μg dos produtos de anticorpo obtidos na segunda etapa de precipitação por 31% de sulfato de amônio e 16% de sulfato de sódio (linhas 4-5) foram carregados. O resultado é mostrado na Figura 3. As porcentagens de recuperação e pureza foram determinadas por densitometria de varredura do gel e resumidas na Tabela 2.

Tabela 2 Conforme ilustrado na Tabela 2, os anticorpos IgY(AFc) resultantes são recuperados em aproximadamente 77% (quando sulfato de sódio é usado na segunda etapa de precipitação) e 69% de pureza (quando sulfato de amônio é usado na segunda etapa de precipitação), respectivamente, com altos rendimentos.

Exemplo 6: Purificação por Imuno-afinidade de Anticorpos de Gema Uma solução de proteína C-reativa (CRP) foi preparada em tampão de carbonato a 0,1 M, pH 8,5 a uma concentração 5 mg/ml.

Sepharose 4B ativada por CNBr adquirida da Pharmacia foi lavada inicialmente com HCI frio a 1 mM em uma quantidade de dez vezes o volume da matriz e deixada reagir com a solução CRP em uma quantidade de duas vezes o volume da matriz de (SIC) a 4°C durante uma noite. A matriz de antígeno foi suspensa em uma solução de etanolamina em Tris-HCI a 20 mM (pH 8,5) em uma proporção de 1:1 (v/v) durante duas horas a 4 °C, para bloquear os locais reativos a proteína remanescentes. A matriz de antígeno foi, então, lavada com PBS contendo azida de sódio a 0,02% e armazenada a 4°C.

Os anticorpos de pato precipitados com sulfato de amônio a 21% (p/v) no Exemplo 4 e a matriz de antígeno preparada acima foram usados. Um ml da matriz de antígeno foi empacotado em uma coluna convencional e embebido em tampão MES (2-[N-morfolino]ácido etanossulfônico) a 20 mM (pH 5,8). A matriz de antígeno foi deixada reagir com 0,25 ml dos anticorpos formulados no mesmo tampão de ligação. A matriz de antígeno foi lavada com o tampão de ligação até o efluente estar substancialmente livre de proteína. Anticorpos ligados foram eluídos imediatamente com guanidina-HCI 6 M, e a densidade ótica dos mesmos foi medida a 280 nm após uma diálise completa. A análise de SDS-PAGE mostrada na Figura 4 indica que os anticorpos purificados por afinidade são constituídos principalmente por anticorpo IgY(AFc) que é representado por uma única faixa no gel.

Todas as patentes e referências de literatura citadas na presente especificação são incorporadas aqui por referência em sua inteireza. Em caso de conflito, a presente descrição, incluindo definições, prevalecerá.

Embora configurações da presente invenção tenham sido ilustradas e descritas, várias modificações e melhoramentos podem ser feitos por pessoas especializadas na técnica. As configurações da presente invenção são, portanto, descritas em um sentido ilustrativo e não restritivo. Pretende-se que a presente invenção não seja limitada às formas específicas conforme ilustrado e que todas as modificações que não se afastem do espírito e escopo da presente invenção estejam dentro do escopo conforme definidos nas reivindicações em anexo.

REIVINDICAÇÕES

Claims (12)

1. PROCESSO PARA ISOLAR SELETIVAMENTE ANTICORPOS IGY DE GEMA DE OVO DE UMA AVE ANSERIFORME E ANTICORPOS IGY OBTIDOS DO MESMO, caracterizado pelo fato de executar um primeiro procedimento de precipitação de proteínas pela elevação da concentração salina através da precipitação de uma fração aquosa contendo anticorpos de gema com (NH4)2S04 de uma primeira concentração variando de 15% (p/v) a 24% (p/v), e onde preferivelmente não mais que 21% (p/v) com base no volume da fração aquosa, e então executar um segundo procedimento de precipitação de proteínas pela elevação da concentração salina através da precipitação da fração aquosa contendo anticorpos de gema tratados na primeira precipitação de proteínas pela elevação da concentração salina com (NH4)2S04 de uma segunda concentração variando de 25% (p/v) a 40% (p/v), e onde preferivelmente não mais que 31% (p/v) com base no volume da fração aquosa tratado na primeira precipitação de proteínas pela elevação da concentração salina.

2. PROCESSO, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado pelo fato da ave anseriforme ser um pato ou um ganso.

3. PROCESSO, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado pelo fato de ser útil para fabricação de anticorpos.

4. PROCESSO, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado pelo fato de compreender ainda uma etapa de purificação por uma cromatografia de imuno-afinidade a um valor de pH variando de 4 a 7, e onde, preferivelmente, o valor de pH varia de 5 a 6, e onde, mais preferivelmente, o valor de pH varia de 5,6 a 5,8 sob uma resistência iônica mais baixa que aproximadamente 50 mM.

5. PROCESSO, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado pelo fato dos anticorpos IgY compreenderem anticorpos com regiões Fc e anticorpos isentos de regiões Fc.

6. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de compreender as seguintes etapas: (a) separar a gema do ovo de uma ave anseriforme de uma clara de um anseriforme; (b) diluir a gema de ovo separada na etapa (a) e suspender a gema de ovo para formar uma mistura homogenia para então possibilitar a mistura homogenia para formar as fases aquosas e não aquosas; (c) remover a fase não aquosa da etapa (b) para obter uma fração miscível em água; (d) absorver anticorpos de gema em uma fração miscível em água da etapa (c) com um absorvente insolúvel em água não carregado selecionado do grupo consistindo de sílica defumada, dióxido de sílica e terra diatomáceas onde o absorvente insolúvel em água não carregado está numa concentração igual ou superior a 0,1% em peso com base no volume da fração miscível em água quando o adsorvente é sílica defumada; o absorvente insolúvel em água não carregado está numa concentração superior a 1% em peso com base no volume da fração miscível em água quando o absorvente é dióxido de sílica ou terra diatomáceas; (e) fazer fluir o absorvente insolúvel em água não carregado com um tampão para obter uma fração aquosa contendo os anticorpos de gema e onde o tampão compreende um sal caotrópico, e onde preferivelmente o sal caotrótipo compreende guanidina-HCI 3 M à 6 M ou tiocianato de sódio 1 M a 3 M; (f) executar o procedimento de precipitação de proteínas pela elevação da concentração salina da fração aquosa contendo anticorpos de gema na etapa (e) com (NhUhSC^de uma primeira concentração variando de 15 % (p/v) a 24 % (p/v), e onde preferivelmente não mais que 21 % (p/v) com base no volume da fração aquosa; e (g) executar o procedimento de precipitação de proteínas pela elevação da concentração salina da fração aquosa contendo anticorpos de gema na etapa (f) com (NH^SC^de uma segunda concentração variando de 25% (p/v) a 40% (p/v), e onde não mais que 31% (p/v) com base no volume da fração aquosa tratada na etapa (f).

7. PROCESSO, de acordo com a Reivindicação 6, caracterizado pelo fato da ave anseriforme ser um pato ou um ganso.

8. PROCESSO, de acordo com a Reivindicação 6, caracterizado pelo fato de ser útil para fabricação de anticorpos.

9. PROCESSO, de acordo com a Reivindicação 6, caracterizado pelo fato de compreender ainda uma etapa de purificação por uma cromatografia de imuno-afinidade a um valor de pH variando de 4 a 7, e onde, preferivelmente, o valor de pH varia de 5 a 6, e onde, mais preferivelmente, o valor de pH varia de 5,6 a 5,8 sob uma resistência iônica mais baixa que 50 mM.

10. PROCESSO, de acordo com a Reivindicação 6, caracterizado pelo fato da fração aquosa contendo os anticorpos de gema na etapa (e) ser uma solução filtrada que passou através de absorvente insolúvel em água não carregado.

11. PROCESSO, de acordo com a Reivindicação 6, caracterizado pelo fato da fração aquosa contendo os anticorpos de gema na etapa (e) ser um eluato eluído do absorvente insolúvel em água não carregado.

12. PROCESSO, de acordo com a Reivindicação 6, caracterizado pelo fato dos anticorpos IgY compreenderem anticorpos com regiões Fc e anticorpos isentos de regiões Fc.