BRPI0116329B1 - Método para determinar se amostra de sementes contém sementes que exibem traço - Google Patents

Abstract

"aparelho e método para análise e aperfeiçoamento de produtos agrícolas". a presente invenção refere-se a um dispositivo e método para analisar produtos agrícolas. mais particularmente, a presente invenção refere-se a um dispositivo e método para rápida análise não destrutiva das características físicas e químicas de uma ou mais sementes.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para MÉTODO PARA DETERMINAR SE AMOSTRA DE SEMENTES CONTÉM SEMENTES QUE EXIBEM TRAÇO.

Campo da Invenção [001] A presente invenção refere-se a dispositivos e métodos para análise de produtos agrícolas. Mais particularmente, a presente invenção refere-se a dispositivos e métodos para rápida análise não destrutiva das características física e química de uma ou mais sementes, e métodos para reproduzir plantas para produzir novas plantas com características física e química desejáveis.

Antecedentes da Invenção [002] A reprodução para produtos agrícolas aperfeiçoados na composição pode requerer a análise de um grande número de amostras de semente de plantas para identificar essas plantas com as propriedades de composição e agronômicas desejadas para uso ou avanço na próxima geração. A análise de lotes volumosos de semente para certos traços, tal como alto teor de óleo ou proteína, em uma única planta ou espiga, em conjunto com uma metodologia de reprodução apropriada tal como seleção recorrente, frequentemente permite a seleção e introdução de tais traços em uma população comercial. Embora a análise desses lotes de semente possa ser executada por várias técnicas, métodos que são rápidos, de pequeno custo e não destrutivos são os mais desejáveis.

[003] A geração de imagens com ressonância magnética (MRI) é baseada em uma técnica espectroscópica não-invasiva conhecida como ressonância magnética nuclear (RMN). RMN requer que a amostra sob investigação contenha átomos que exibem spin nuclear, uma qualidade intrínseca torna os núcleos atômicos magnéticos. O átomo mais comum com spin nuclear é o hidrogênio, cujo núcleo é um próton com spin de 1/2. Um experimento de RMN de próton típico (RMN

Petição 870190000106, de 02/01/2019, pág. 5/60

2/51 de 1H) envolve colocar uma amostra a ser estudada em um campo magnético homogêneo forte. O campo magnético forte causa o alinhamento preferencial dos prótons na amostra com o campo magnético, um fenômeno que é análogo a uma agulha de compasso magnética alinhando com o campo magnético da terra. Em um experimento moderno de RMN-pulsada simples, um outro campo magnético (o campo de radiofrequência ou RF) é aplicado de modo transitório na amostra, que tem o efeito de girar os prótons alinhados para um estado de energia maior, que é perpendicular ao campo magnético forte (isso é chamado um pulso de 90°). O s prótons reagem em taxas características quando eles realinham com o campo forte, assim induzindo uma corrente em um par de bobinas que servem como o detector. A corrente é medida nas bobinas de detecção como uma função do tempo, e a partir disso as taxas de precessão dos prótons na amostra são deduzidas. As taxas de precessão são determinadas primariamente pela intensidade do campo magnético forte (com campos mais fortes levando a maiores taxas de precessão), mas o único ambiente molecular experimentado por cada um dos prótons também tem um efeito na taxa de precessão. É o ambiente molecular único que é o objeto de estudo nos experimentos de RMN.

[004] Em um experimento de RMN pulsada moderno ligeiramente mais complicado, a complexidade dos sinais que surgem de ambientes moleculares múltiplos pode ser eliminada, deixando somente os sinais dos prótons em um subconjunto selecionado de ambientes moleculares. Essa tentativa, chamada o experimento de eco de spin, pode ser usada, por exemplo, em uma amostra compreendendo uma mistura de óleo e água para eliminar o sinal que surge dos prótons nas moléculas de água, e para deixar somente sinais que surgem dos prótons nas moléculas de óleo. Isso pode ser realizado pelo uso de uma série de pulsos de RF de 90^o e 180°, e instrumentos comerciais tipicamente vêm

Petição 870190000106, de 02/01/2019, pág. 6/60

3/51 com software que é útil para programar o instrumento para executar apropriadamente a sequência de pulso.

[005] Os métodos de RMN pulsada com campo pequeno contam com a diferenciação do óleo dos outros componentes na semente com base nas diferenças inerentes nas taxas de relaxamento nuclear longitudinal e spin-spin entre o óleo e outras espécies com próton. Os métodos de RMN usados para medir o óleo foram padronizados, eles são não destrutivos, robustos e eles produzem resultados tanto precisos quanto reproduzíveis. O método de MRI para medir o teor do óleo é baseado nos mesmos princípios físicos descritos nos estudos de RMN pulsada. A diferença é que a MRI produz sinais de RMN espacialmente codificados, proporcionando exibições de dados em um formato de imagem ao invés de um espectro de RMN convencional.

[006] Uma outra similaridade existe entre os estudos convencionais de RMN e o método de MRI para medir níveis de óleo em sementes únicas. Ambos os métodos proporcionam um teor de óleo relativo para sementes em uma base percentual (p/p) pela comparação dos resultados experimentais com padrões de calibragem do óleo, que é o método geralmente aceito e útil para comparar níveis de óleo em sementes únicas. Ver Tiwari et al., Rapid and nondestructive determination of seed oil by pulsed nuclear magnetic resonance technique, J. Am. Oil Chem. Soc. 51:104-109 (1974). Números relativos são obtidos porque uma pequena porção da intensidade do sinal de RMN é perdida durante os atrasos de sincronismos incorporados nos esquemas de aquisição de dados. Os números relativos podem ser corrigidos para números absolutos normalizando os dados usando uma medição de óleo independente para uma dada população de sementes, por exemplo, a média do valor do óleo medido para a população é ajustada para o valor do óleo determinado em uma medição do volume e todas as sementes individuais são ajustadas de acordo. Números de

Petição 870190000106, de 02/01/2019, pág. 7/60

4/51 óleo absolutos também podem ser obtidos usando espectroscopia de RMN e métodos de MRI pelo uso de padrões de semente na análise. Nesse caso, o teor de óleo de uma semente é determinado absolutamente desde que o padrão da semente mais intimamente iguala o relaxamento nuclear e o teor de cera da semente experimental. Entretanto, foi observado que números de óleo absolutos são menos precisos para comparar níveis de óleo relativos entre sementes. Ver G.Rubel, Simultaneous determination of oil and water contents in different oilseeds by pulsed nuclear magnetic resonance, J.Am. Oil Chem. Soc. 71:1057-1062 (1994).

[007] Embora os melhores instrumentos de RMN exijam campos magnéticos extremamente homogêneos, as máquinas de MRI propositadamente induzem gradientes de campo (variações na intensidade do campo magnético com relação à posição) usando três ímãs de gradiente. Os ímãs de gradiente são muito mais fracos do que o ímã forte, mas eles são suficientes para causar taxas de precessão do próton distinguíveis em partes diferentes da amostra. As máquinas de MRI modernas pulsam não somente o campo de RF, mas também os campos do gradiente, de modo a seletivamente girar e seletivamente detectar prótons em regiões particulares da amostra. A medição da intensidade do sinal dos vários componentes de frequência (taxas de precessão) indica a densidade e os tempos de relaxamento (o tempo que leva para que prótons particulares relaxem de volta para seu estado de pouca energia original e realinhem com o campo magnético forte, o tempo de relaxamento longitudinal e para reagir fora de fase, ou defasar devido ao relaxamento de spin-spin, com relação aos outros prótons) dos prótons em várias localizações na amostra.

[008] Os métodos de MRI proporcionam medições diretas de características tais como níveis de óleo, assim proporcionando um ensaio primário independente de um modelo quimiométrico. Assim, uma

Petição 870190000106, de 02/01/2019, pág. 8/60

5/51 imagem tridimensional pode ser construída onde as intensidades em vários pontos na imagem referem-se às densidades e tempos de relaxamento dos prótons nesses pontos na amostra. Além do mais, pelo fato de que diferentes ambientes moleculares resultam em frequências de precessão diferentes, o ambiente molecular em cada ponto na amostra pode ser determinado. Uma tal tentativa é chamada geração de imagem por mudança química (CSI).

[009] Uma alternativa para CSI á a geração de imagem por eco de spin (SEI). Nesse experimento, uma classe de prótons pode ser escolhida (com base nas suas taxas de defasagem), e os sinais de todos os outros prótons pode ser suprimido. Por exemplo, se uma amostra contém óleo e água espacialmente separados, e um experimento de SEI é direcionado para detectar o óleo, então a imagem resultante mostrará somente essas regiões da amostra nas quais o óleo é encontrado.

[0010] MRI é uma técnica radiológica não-invasiva bem conhecida geralmente usada na ciência médica. A radiação de comprimento de onda longo (onda de rádio) é universalmente considerada como menos prejudicial do que as formas de radiação usadas em outros tipos de técnicas radiológicas não-invasivas tais como varreduras de CAT (tomografia axial computadorizada) de raio X. Já no ano 1988, as técnicas de MRI estavam começando a ser aplicadas no estudo de plantas. Ver a seção de Introdução de Lakshminarayana et al., Spatial distribution of oil in groundnut and sunflower seeds by nuclear magnetic resonance imaging, J. Biosci. 17(1):87-93 (Março de 1992)(a seguir Lakschminarayana et al.) (descrevendo uma história até 1992 do uso de MRI no estudo de plantas, sementes e tecido de planta). Lakschminarayana et al. descrevem um experimento no qual MRI foi usada em sementes únicas para determinar a distribuição espacial do óleo e água em amostras de semente única. Eles usaram uma

Petição 870190000106, de 02/01/2019, pág. 9/60

6/51 sequência de pulso por eco de spin para seletivamente detectar somente os prótons que eram parte das moléculas de óleo. MRI foi também usada para estudar a absorção de água dos feijões de espécie seca por Heil et al., Magnetic resonance imaging and modeling of water up-take into dry beans, Lebensm.-Wiss.u.-Technol. 25:280 (1992). [0011] Ambas SEI e CSI MRI foram usadas para copiar lipídios em embriões de noz-pecã por Halloin et al., Proton magnetic resonance imaging of lipid in pecan embryos, J. Am. Oil Chemists' Soc. 70:1259 (1993). Esses experimentos estudaram as diferenças nas imagens dos embriões de noz-pecã que eram normais, infectados por fungos e danificados por insetos. O experimento de CSI MRI mostrou a distribuição dos lipídios e água dentro dos embriões de noz-pecã. [0012] Outras técnicas de MRI são conhecidas para esses versados na técnica. Um exemplo é a relaxografia ou mapeamento do tempo de relaxamento. Nessa técnica, regiões diferentes de uma amostra sendo copiada são distinguidas com base nas diferenças nos tempos de relaxamento dos prótons nas regiões diferentes.

[0013] Experimentos de MRI em sementes foram tradicionalmente conduzidos usando instrumentos de MRI de qualidade de pesquisa, por exemplo, o instrumento Bruker AMX-400 9,4 Tesla com um furo de diâmetro de 8,9 cm (Bruker Instruments Inc., Billerica, MA) ou o instrumento do sistema GE Omega 7,1 Tesla com um diâmetro de furo de 15 cm (General Electric, Milwaukee, WI). Esses instrumentos tipicamente têm um tamanho de furo de uns poucos centímetros, e consequentemente podem somente ser usados para estudar as amostras que são menores do que o diâmetro do furo. A vantagem da pequena escala desses instrumentos é que as bobinas de detecção ficam próximas da amostra sob investigação, e portanto sua sensibilidade é muito alta. Instrumentos de MRI de qualidade de pesquisa maiores também existem com tamanhos de furo e diâmetros

Petição 870190000106, de 02/01/2019, pág. 10/60

7/51 da bobina de detecção de 20-50 cm, por exemplo, o Bruker Biospec II 4,7 Tesla, com 40 cm de diâmetro de furo (Bruker Instruments, Inc., Billerica, MA). Esses instrumentos são úteis para copiar ratos e outros pequenos animais. Instrumentos de MRI clínicos, por outro lado, devem ter um tamanho de furo e bobinas de detecção que sejam grandes o suficiente para acomodar um corpo humano. Por exemplo, Siemens (Siemens AG, Erlangen, Alemanha) e GE Medical Systems (Milwaukee, WI) fabricam uma ampla faixa de instrumentos clínicos que podem acomodar objetos com diâmetros de 50 cm e maiores. Alguns sistemas mais novos com ímãs permanentes com campos magnéticos tão pequenos quanto 0,2 Tesla não são limitados pelo tamanho do furo, mas pelo diâmetro da bobina. Mas as bobinas de detecção de diâmetro maior nos instrumentos supercondutores tradicionais, bem como sistemas de ímã permanente mais recentes, tornam esses instrumentos clínicos inadequados para copiar amostras pequenas tais como sementes. A grande distância das bobinas de detecção de uma pequena amostra e o sinal inerentemente fraco que emana de uma pequena amostra conspiram para tornar as tentativas convencionais para geração de imagem quantitativa de amostras pequenas usando instrumentos de MRI clínicos não práticas. Mas os pequenos volumes de instrumentos de MRI de pesquisa de tamanho de furo pequeno não permitem a geração de imagem simultânea de tantas sementes quanto um instrumento de MRI clínico permitiria se os instrumentos de MRI maiores fossem receptivos para detectar sinais das amostras pequenas.

[0014] Técnicas com tempo intensivo para encontrar características desejáveis são especialmente desvantajosas para programas de reprodução de planta seletivos, onde muitas sementes únicas precisam ser selecionadas rapidamente de modo a permitir a seleção da semente antes da próxima geração da plantação. Atrasos no fornecimento para o cultivador dos resultados analíticos podem causar a perda de um ciclo

Petição 870190000106, de 02/01/2019, pág. 11/60

8/51 inteiro de reprodução.

[0015] Técnicas sem geração de imagens tais como espectroscopia de IR sofrem da desvantagem adicional de coletar informação de somente um subconjunto de uma amostra total pela amostragem por pontos somente de porções de somente umas poucas sementes entre centenas de sementes na amostra a granel. Além do mais, desde que a amostragem por pontos interroga porções arbitrárias da semente, tecidos diferentes das sementes nas amostras podem ser mal representados pelos dados analíticos. Desde que as qualidades como teor do óleo estão frequentemente presentes em quantidades diferentes em diferentes tecidos, técnicas sem geração de imagem podem falhar na avaliação precisa da qualidade desejada. Técnicas sem geração de imagem desconsideram a informação espacial, e assim não proporcionam informação para o cultivador da planta sobre o tamanho, forma, dano mecânico, infestação de inseto ou danos por fungo.

[0016] As técnicas convencionais de análise da semente também falham em proporcionar um método eficiente para a análise de semente única, o que pode grandemente acelerar a taxa de desenvolvimento relativa a certa variedade. A análise de semente única é necessária para diferenciar e selecionar sementes individuais da população heterogênea de sementes frequentemente encontradas nas populações de reprodução. A análise da semente única pode reduzir o número de gerações exigidas para a produção de uma planta com o traço desejado. A seleção de semente única também reduz o número de plantas individuais exigidas. No milho, por exemplo, a capacidade de identificar as sementes individuais com o traço desejado no nível de semente única ao invés de no nível de toda a espiga pode reduzir a exigência de sementeira por 100 vezes. Isso torna possível conduzir um número muito maior de projetos de reprodução com os mesmos recursos. [0017] Outras técnicas analíticas convencionais, tais como

Petição 870190000106, de 02/01/2019, pág. 12/60

9/51 cromatografia gasosa, também frequentemente falham em proporcionar um método eficiente para a análise de semente única. Por exemplo, o método convencional para análise de semente única de canola exige a excisão manual de uma metade de cada semente para análise do ácido graxo pela cromatografia gasosa, enquanto a outra metade é plantada. Por causa da preparação manual da amostra e a pequena produtividade dessa técnica analítica, somente um pequeno número de amostras pode ser executado por hora usando esse processo. Além do mais, essa técnica permite a possibilidade de destruir os potenciais de germinação das sementes analisadas em plantas maduras, de safra de semente. [0018] Embora a análise da semente única seja desejável, tentativas convencionais e métodos de amostragem não permitem o processamento eficiente de sementes únicas. Técnicas convencionais exigem a entrada manual extensiva, o que limita a taxa de desenvolvimento das plantas com características aperfeiçoadas.

[0019] As técnicas de análise espectroscópica convencionais não permitem a localização dos níveis de componente químico dentro de tecidos diferentes de sementes. As tentativas convencionais, tais como dissecação manual da semente seguido pela análise química pelas técnicas analíticas tradicionais, não são somente trabalhosas e destrutivas, elas também resultam na resolução inferior dos componentes e quantificação inferior, desde que o tamanho da amostra resultante da dissecação de sementes individuais fica abaixo do tamanho da amostra na qual a maioria das técnicas tradicionais produz resultados confiáveis.

[0020] São necessários na técnica dispositivos e métodos para análise rápida de sementes a granel e únicas que possam de maneira eficiente e não destrutiva analisar as características morfológicas e/ou químicas de sementes individuais, e que possam ser integrados em uma máquina de processamento agrícola. A presente invenção proporciona

Petição 870190000106, de 02/01/2019, pág. 13/60

10/51 tais dispositivos e métodos.

Sumário da Invenção [0021] Essa invenção proporciona dispositivos e métodos para rápida análise não destrutiva de qualquer amostra de modo a determinar a presença ou ausência de um traço de um espécime dentro dessa amostra pelo uso da geração de imagens por ressonância magnética em um espécime único, ou em uma pluralidade de espécimes, e para uso da informação obtida pela análise de MRI para selecionar indivíduos exibindo a característica de dentro de um grupo de candidatos potencialmente exibindo a característica.

[0022] Essa invenção adicionalmente proporciona dispositivos e métodos para rápida análise não destrutiva das características física e química de uma ou mais sementes ou tecidos de planta e para uso dessa análise para seletivamente reproduzir plantas com uma ou mais características desejadas. A análise é executada em uma amostra de uma ou mais sementes usando MRI para medir uma ou mais características da amostra. As sementes que exibem as características desejadas podem ser selecionadas para serem cultivadas dentre muitas sementes analisadas. A invenção é adicionalmente útil para observar a infestação de inseto ou de fungos, formas de sementes e danos nas sementes.

[0023] A presente invenção inclui e proporciona um método para determinar se uma semente exibe um traço, compreendendo: (A) prover a semente em um dispositivo de amostragem; (B) gerar uma imagem de ressonância magnética da semente, (C) analisar a imagem de ressonância magnética para o traço e (D) determinar se a semente exibe o traço com base na análise, onde a imagem de ressonância magnética é obtida usando um instrumento de geração de imagem por ressonância magnética com um tamanho de furo maior do que aproximadamente 20 cm.

Petição 870190000106, de 02/01/2019, pág. 14/60

11/51 [0024] A presente invenção inclui e proporciona um método para determinar se quaisquer sementes dentro de uma amostra compreendendo uma pluralidade de sementes exibe um traço, compreendendo: (A) prover a amostra em um dispositivo de amostragem, (B) gerar uma imagem de ressonância magnética da amostra, (C) analisar a imagem de ressonância magnética para sementes que exibem o traço e (D) determinar se as sementes na amostra exibem o traço com base na análise, onde a etapa de determinação compreende associar as sementes com elementos de volume de imagem correspondentes, e onde a imagem de ressonância magnética é obtida usando um instrumento de geração de imagem de ressonância magnética com um tamanho de furo maior do que 20 cm. [0025] A presente invenção inclui e proporciona métodos para seletivamente reproduzir plantas compreendendo copiar uma ou mais sementes usando um instrumento de geração de imagens por ressonância magnética, analisar a imagem da uma ou mais sementes de modo a determinar se qualquer uma da uma ou mais sementes exibe um traço ou traços, selecionar uma ou mais sementes com base em se elas exibem o traço ou traços, plantar uma ou mais sementes que exibem o traço ou traços, cultivar as plantas resultantes até a maturidade e fertilizar as plantas entre si ou com outras plantas.

[0026] A presente invenção inclui e proporciona um método para otimizar os parâmetros do campo de visão e gradientes em um instrumento de geração de imagem por ressonância magnética usado para medir características de uma amostra compreendendo sementes, compreendendo: (A) selecionar um campo de visão que cobre toda a amostra, (B) selecionar um número de camadas de imagem, (C) selecionar uma espessura da camada de imagem, (D) selecionar um número de pixels de imagem dentro de cada camada de imagem, onde o número de camadas de imagem multiplicado pela espessura da

Petição 870190000106, de 02/01/2019, pág. 15/60

12/51 camada de imagem é maior do que aproximadamente a altura da amostra a ser copiada, a espessura da camada de imagem é menor do que aproximadamente a espessura das sementes e o número de pixels da imagem é suficiente para evitar interferência entre pixels.

[0027] A presente invenção inclui e proporciona um dispositivo de amostragem para experimentos de geração de imagem por ressonância magnética compreendendo um espaçador e uma pluralidade de placas, onde cada placa é compreendida de uma pluralidade de cavidades e é empilhada e mantida de modo deslizável pelo espaçador, e onde o espaçador e a pluralidade de placas consistem em materiais que são receptivos aos experimentos de ressonância magnética.

[0028] A presente invenção inclui e proporciona um dispositivo para medir propriedades dos produtos agrícolas, compreendendo: um dispositivo de amostragem para prover a amostra e um instrumento de geração de imagem por ressonância magnética para copiar a amostra, onde o instrumento de geração de imagem por ressonância magnética tem um tamanho de furo maior do que aproximadamente 20 cm, onde a amostra exibe uma indutância que é substancialmente menor do que essa de um volume de água aproximadamente equivalente, e onde as bobinas de detecção e RF do instrumento de geração de imagem por ressonância magnética são carregadas ou novamente sintonizadas para ficarem sensíveis à amostra.

[0029] A presente invenção inclui e proporciona um dispositivo para medir propriedades dos produtos agrícolas, compreendendo: um dispositivo de processamento para produzir uma amostra, um dispositivo de amostragem para prover uma amostra, onde o dispositivo de amostragem é disposto para receber a amostra do dispositivo de processamento e um sistema de geração de imagem por ressonância magnética, onde o sistema é disposto para analisar a amostra no dispositivo de amostragem.

Petição 870190000106, de 02/01/2019, pág. 16/60

13/51 [0030] A presente invenção inclui e proporciona um dispositivo para medir propriedades dos produtos agrícolas, compreendendo: um dispositivo de amostragem para prover uma amostra; um sistema de geração de imagem por ressonância magnética, onde o sistema é disposto para analisar a amostra no dispositivo de amostragem; e um dispositivo de classificação para classificar a amostra em dois ou mais grupos diferentes, onde o dispositivo de classificação é disposto para receber a amostra do dispositivo de amostragem.

[0031] A presente invenção inclui e proporciona um dispositivo para medir propriedades dos produtos agrícolas, compreendendo: um dispositivo de processamento para produzir uma amostra; um dispositivo de amostragem para prover uma amostra, onde o dispositivo de amostragem é disposto para receber a amostra do dispositivo de processamento; um sistema de geração de imagem por ressonância magnética, onde o sistema é disposto para analisar a amostra no dispositivo de amostragem; e um dispositivo de classificação para classificar a amostra em dois ou mais grupos diferentes, onde o dispositivo de classificação é disposto para receber a amostra do dispositivo de amostragem.

DESCRIÇÕES DOS DESENHOS [0032] A figura 1 mostra imagens de MRI de alta resolução de quatro grãos de milho diferentes com níveis diferentes de teor de óleo. Essas imagens indicam que o grão A (18,4% de óleo por peso) tem um maior teor de óleo do que o grão B (7,8% de óleo por peso), que tem um maior teor de óleo do que o grão C (5,7% de óleo por peso), que tem um maior teor de óleo do que o grão D (2,8% de óleo por peso). Essas imagens usaram a sequência de pulso do eco de spin que copiou somente prótons que eram parte das moléculas de óleo. Assim, as regiões mais escuras indicam um maior teor de óleo, enquanto as regiões mais claras indicam um menor teor de óleo.

Petição 870190000106, de 02/01/2019, pág. 17/60

14/51 [0033] A figura 2 é um diagrama em bloco detalhando as etapas da coleta dos dados iniciais de um cubo de amostra contendo múltiplas camadas de sementes para a produção de uma série detalhando o teor percentual de óleo por peso de cada uma das sementes dentro da amostra. Esse diagrama em bloco mostra as etapas que podem ser aplicadas nos dados brutos obtidos de um experimento de MRI para produzir a série de dados final para as sementes na forma de teor percentual de óleo por peso para cada semente dentro do cubo de amostra. Primeiro, um conjunto de dados tridimensional é coletado do cubo de amostra para produzir um cubo de dados de imagem tridimensional 101. (Ver Figura 3 para um exemplo de um cubo de dados de imagem). O software de análise de imagem tal como IDL (linguagem de dados interativa) é usado para combinar fatias 102 compreendendo o cubo de dados em um conjunto de imagens bidimensionais 103, onde cada uma das imagens bidimensionais resultantes corresponde a uma camada do cubo de amostra. (Ver Figura 4a para uma representação visual de uma tal imagem de camada.) Outro software de análise de imagem pode ser usado, e muitos exemplos de tal software são conhecidos para esses versados na técnica da análise de imagem. O software de análise da imagem é usado para aplicar um filtro de limiar 104 em cada uma das imagens de camada com base na razão de sinal para ruído calculada usando a primeira imagem de camada para produzir uma imagem de camada limpa. (Ver Figura 4b para uma representação de uma imagem de camada resultante da aplicação do filtro de limiar.) Outros filtros úteis para essa etapa são conhecidos para esses versados na técnica da análise de imagem. O software de análise de imagem é, a seguir, usado para localizar os limites de sementes individuais dentro de cada camada de imagem 106, usando um filtro de detecção de borda ou um outro filtro conhecido para esses versados na técnica da análise de imagem para localizar objetos em uma imagem,

Petição 870190000106, de 02/01/2019, pág. 18/60

15/51 para produzir imagens bidimensionais limpas de cada semente dentro de cada camada do cubo de amostra 107. A seguir, o software de análise de imagem é usado para integrar a intensidade da imagem de MRI para cada semente dentro de cada camada do cubo de amostra 108. As intensidades integradas são armazenadas como uma série de dados brutos onde cada elemento da série de dados brutos é a intensidade integrada correspondendo a cada semente no cubo de amostra 109. Finalmente, a informação armazenada na série de dados brutos é combinada com a informação sobre os pesos de cada semente dentro do cubo de amostra 110 para calcular o óleo percentual relativo por peso em cada semente dentro do cubo de amostra. Os resultados desse cálculo são armazenados em uma série de dados processados onde cada elemento da série dos dados processados corresponde ao óleo percentual relativo por peso em cada semente dentro da série de amostra 111, que não foi corrigido para imperfeições no campo magnético principal, gradiente de campo pulsado e bobina de detecção de RF não homogênea, coletivamente citados como defeitos de campo. Esses dados são adicionalmente processados pela incorporação da intensidade de MRI medida de um padrão de semente com teor de óleo conhecido de modo a corrigir os defeitos de campo e produzir uma série de dados contendo o teor de óleo relativo de cada semente dentro do cubo de amostra.

[0034] A figura 3 mostra os dados brutos de um cubo de amostra de 12 camadas de sementes de milho onde cada camada é compreendida de 12 placas, e cada placa tem 24 cavidades, para um total de 3456 sementes.

[0035] A figura 4a são os dados combinados de várias fatias do cubo de dados correspondendo a uma camada do cubo de amostra e mostrando os dados para 288 sementes.

[0036] A figura 4b é uma representação dos dados da figura 4a

Petição 870190000106, de 02/01/2019, pág. 19/60

16/51 depois da aplicação de um filtro de limiar.

[0037] A figura 5 mostra as etapas exigidas para configurar o experimento da triagem de MRI da invenção. As etapas fundamentais da preparação da amostra para pré-análise da amostra para um experimento de MRI de alta resolução são mostradas. Primeiro, placas individuais de múltiplas cavidades são carregadas com as sementes de interesse. Nos dois exemplos mostrados, grãos de milho são carregados em uma placa de 48 cavidades, e feijões de soja são carregados em uma placa de 96 cavidades. Espécimes menores podem ser carregados sobre placas de cavidade muito mais densas, por exemplo, sementes de canola podem ser carregadas sobre placas de 960 cavidades. A seguir, as placas são empilhadas em camadas para fazer um cubo de amostra. Nessa figura, existem dois conjuntos de quatro camadas, para um total de 8 placas de cavidades. Cubos de amostra muito maiores são possíveis (por exemplo, 12 ou mais camadas são possíveis), mas o tamanho da bobina de detecção é um fator limitador nesse exemplo particular. O cubo de amostra é acondicionado na bobina de RF, que é então carregada no ímã de MRI. O experimento está então pronto para ser colocado em funcionamento. [0038] A figura 6 é uma comparação do experimento de triagem de MRI de alta resolução da invenção (figura 6a) e o experimento de triagem de MRI de alta produtividade da invenção (figura 6b). Essa claramente ilustra como o instrumento de MRI clínico é mais receptivo a cubos de amostra maiores do que um instrumento de MRI de pesquisa. Na Figura 6a, a bobina de RF do instrumento de pesquisa limita o tamanho do cubo de amostra, nesse caso para 2 pilhas de 5 camadas de placas de 48 cavidades, para um total de 480 sementes. A intensidade mais alta do campo magnético do ímã de pesquisa (4,7 T) permite imagens com resolução maior, mas essas imagens de alta resolução também exigem tempos de aquisição mais longos (3 horas) e

Petição 870190000106, de 02/01/2019, pág. 20/60

17/51 tamanhos menores de amostra. Instrumentos clínicos tais como esse mostrado na Figura 6b, por outro lado, podem acomodar cubos de amostra muito maiores. Nesse exemplo existem 12 pilhas de 12 camadas de placas de 24 cavidades, para um total de 3456 sementes. Embora esse instrumento clínico não seja o melhor sistema para obter a geração de imagens de resolução mais alta comparado com o ímã de pesquisa, ele é melhor adequado para geração de imagem de alta produtividade. Não somente existe mais do que sete vezes o número de sementes copiadas simultaneamente quando comparado com o instrumento de pesquisa, o experimento de geração de imagem de resolução menor demora somente 18 minutos, um décimo da duração do tempo exigido pelo experimento de geração de imagem de resolução mais alta. Assim, nesse exemplo, mais do que 70 vezes o número de sementes que pode ser analisado em uma dada duração de tempo usando o instrumento de pesquisa pode ser analisado usando o instrumento clínico. Pela alteração dos parâmetros de aquisição de dados, imagens de alta resolução podem ser obtidas usando o instrumento clínico. Essa mudança consideravelmente aumentará a duração de tempo que leva para adquirir os dados.

[0039] A figura 7 mostra duas modalidades do dispositivo de amostragem da invenção. Essas modalidades são apenas dois dos vários projetos diferentes possíveis para os cubos de amostra de maior quantidade, cada um dos quais é preferivelmente usado em um instrumento de MRI clínico.

[0040] A figura 8 é um gráfico mostrando a correlação entre medições do teor de óleo usando MRI e usando espectroscopia infravermelha (IR).

[0041] A figura 9 é um gráfico mostrando comparações entre os resultados das análises de MRI do teor de óleo dos padrões de óleo das mesmas sementes em dois momentos diferentes no mesmo dia.

Petição 870190000106, de 02/01/2019, pág. 21/60

18/51 [0042] A figura 10 é um gráfico mostrando comparações entre os resultados das análises de MRI do teor de óleo dos padrões de óleo das mesmas sementes em dois dias diferentes.

[0043] A figura 11 é um gráfico mostrando comparações entre os resultados das análises de MRI do teor de óleo dos padrões de óleo das mesmas sementes usando dois instrumentos de MRI diferentes.

[0044] A figura 12 é um mapa do desvio padrão percentual relativo à média para cada posição da cavidade em cada uma das nove camadas de um cubo padrão de calibragem.

Descrição Detalhada da Invenção [0045] A presente invenção é um aperfeiçoamento sobre as técnicas de MRI existentes para medir características de sementes, e ela adicionalmente proporciona métodos para seletivamente reproduzir plantas de modo a melhorar as propriedades tais como teor de óleo da semente. A invenção proporciona um método para usar instrumentos de MRI clínicos (ou outro de furo grande) para analisar pequenas amostras tais como sementes. Ímãs de MRI de qualidade de pesquisa menores têm tamanhos de furo e diâmetros da bobina de RF e de detecção que são significativamente menores do que esses dos ímãs de MRI de qualidade de pesquisa maiores e de qualidade clínica. Essa diferença apresenta vantagens e desvantagens para determinar as características de pequenos espécimes tais como sementes. Uma vantagem dos instrumentos de qualidade de pesquisa é que as bobinas de detecção estão mais próximas do espécime sob investigação, então a sensibilidade do instrumento é maior, e consequentemente a razão de sinal para ruído é maior. Entretanto, uma desvantagem significativa é que o volume ativo é inerentemente menor em instrumentos de qualidade de pesquisa de furo pequeno. O volume ativo como usado aqui é definido como esse volume dentro do instrumento onde a amostra sob investigação pode ser colocada tal que uma imagem pode ser

Petição 870190000106, de 02/01/2019, pág. 22/60

19/51 obtida da amostra sem distorções significativas. O volume de geração de imagem é limitado, por exemplo, pela homogeneidade do campo magnético forte, linearidade dos gradientes de campo e a homogeneidade da bobina de detecção de RF. Não homogeneidades de campo magnético forte significativas, não linearidades do gradiente de campo e não homogeneidades da bobina de detecção de RF (coletivamente referidos aqui como defeitos de campo) em quaisquer regiões dentro do instrumento causam distorções nas imagens da amostra obtidas dessas regiões. Pequenas distorções desses tipos podem ser compensadas, por exemplo, corrigindo os defeitos de campo ou pela correção dos dados de aquisição depois da imagem, mas existirão invariavelmente regiões no instrumento onde as distorções são muito substanciais para corrigir, e os dados dessas regiões são inúteis. [0046] Instrumentos de qualidade clínica têm maiores volumes ativos do que os instrumentos de qualidade de pesquisa. Por exemplo, um instrumento de qualidade de pesquisa típico de furo pequeno (com, por exemplo, um tamanho de furo de 9 cm) pode ter um volume ativo definido por um cilindro, por exemplo, de 4 cm de diâmetro e 4 cm de comprimento, enquanto que um instrumento clínico, projetado para acomodar partes substanciais do corpo humano, pode ter um volume ativo definido por um cilindro de, por exemplo, 25 cm de diâmetro e 30 cm de comprimento. O maior volume ativo dos instrumentos de qualidade clínica pode, portanto, acomodar dispositivos de amostragem muito maiores. Por exemplo, a Figura 6a mostra um cubo de amostra projetado para um instrumento de qualidade de pesquisa de furo médio. Suas dimensões são aproximadamente 15 cm X 20 cm X 12 cm e ele mantém 480 sementes. A Figura 6b mostra um cubo de amostra projetado para um instrumento de qualidade clínica. Suas dimensões são aproximadamente 30 cm X 35 cm X 30 cm e ele mantém 3456 sementes. Todas as outras diferenças entre os instrumentos à parte, o

Petição 870190000106, de 02/01/2019, pág. 23/60

20/51 volume ativo somente proporciona um aperfeiçoamento de mais do que sete vezes o número de sementes que podem ser analisadas simultaneamente no instrumento de qualidade clínica.

[0047] Existem vários obstáculos que devem ser superados de modo a se beneficiar do maior volume ativo de instrumentos de qualidade clínica para analisar pequenos espécimes tais como sementes. Um tal obstáculo é superado pelo reconhecimento que as bobinas de detecção e RF devem ser carregadas, ou os circuitos de detecção e RF devem ser novamente sintonizados para considerar a diferença na indutância das bobinas de detecção entre quando a amostra da semente (fornecendo uma menor indutância) e a amostra humana (fornecendo uma maior indutância) está na bobina.

[0048] Existem três preocupações relacionadas que podem apresentar dificuldades quando magneticamente copiando amostras compreendendo espécimes tais como sementes. A primeira preocupação é que a suscetibilidade magnética do material orgânico é drasticamente diferente dessa do ar. Assim, as aberturas de ar entre sementes em uma amostra de muitas sementes e as aberturas de ar entre as sementes e o material plástico intermédiário do dispositivo de amostragem causam distorções no campo magnético de outra forma uniforme como resultado das variações espaciais abruptas nas linhas do campo magnético. Essas distorções no campo magnético forte causam variações na intensidade do campo magnético experimentado por diferentes regiões de uma amostra. Pelo fato de que regiões diferentes da amostra experimentam diferentes campos magnéticos, prótons de outra forma equivalentes nessas regiões diferentes reagem em taxas diferentes. Isso causa uma diminuição nos tempos de defasagem, o que resulta em uma perda mais rápida da intensidade do sinal do que na ausência das diferenças de suscetibilidade.

[0049] A segunda preocupação que pode apresentar dificuldades

Petição 870190000106, de 02/01/2019, pág. 24/60

21/51 quando magneticamente copiando amostras tais como sementes é as não linearidades nos gradientes de campo. As não linearidades no gradiente de campo criam dificuldades com o mapeamento das regiões reais na amostra para elementos de volume dentro de uma imagem da amostra. Em casos extremos, tais não linearidades podem tornar os dados da imagem intratáveis. Não linearidades do gradiente são de preocupação particular com amostras maiores porque os gradientes lineares são mais difíceis de manter através de distâncias mais longas. [0050] A terceira preocupação que pode apresentar dificuldades quando magneticamente copiando amostras tais como sementes é não homogeneidades nas bobinas de detecção de RF. As não homogeneidades da bobina de RF criam dificuldades com a quantificação das regiões reais na amostra para níveis do material detectado na amostra. Em casos extremos, tais não homogeneidades podem tornar os dados de imagem intratáveis. As não homogeneidades do detector de RF são de preocupação particular com amostras maiores porque os campos homogêneos são mais difíceis de manter através de distâncias mais longas.

Métodos para analisar sementes usando MRI [0051] É um aspecto da presente invenção proporcionar um método para determinar se uma semente exibe um traço ou se quaisquer sementes dentro de uma amostra de sementes exibem um traço. Nesse aspecto da invenção, um dispositivo de amostragem é usado para prover a semente ou a amostra de sementes para análise por um instrumento de MRI. O instrumento de MRI é usado para produzir uma imagem da semente ou da amostra de sementes. A imagem resultante é analisada, e a presença ou ausência do traço é determinada com base na análise.

Sementes [0052] Qualquer semente pode ser utilizada em um método ou

Petição 870190000106, de 02/01/2019, pág. 25/60

22/51 dispositivo da presente invenção. Em uma modalidade preferida, a semente é selecionada do grupo consistindo em semente de alfafa, semente de maçã, semente de banana, semente de cevada, semente de feijão, semente de brócolis, semente de mamona, semente de fruta cítrica, semente de trevo, semente de coco, semente de café, semente de milho, semente de algodão, semente de pepino, semente de abeto Douglas, semente de Eucalipto, semente de pinheiro Loblolly, semente de linhaça, semente de melão, semente de aveia, semente de azeitona, semente de palma, semente de ervilha, semente de amendoim, semente de pimenta, semente de álamo, semente de pinheiro Radiata, semente de colza, semente de arroz, semente de centeio, semente de sorgo, semente de pinheiro Meridional, semente de soja, semente de morango, semente de beterraba, semente de cana-de-açúcar, semente de girassol, semente de goma doce, semente de chá, semente de tabaco, semente de tomate, turfa, semente de trigo e semente Arabidopsis thaliana. Em uma modalidade mais preferida, a semente é selecionada do grupo consistindo em semente de algodão, semente de milho, semente de soja, semente de colza, semente de arroz e semente de trigo. Em uma modalidade ainda mais preferida, a semente é uma semente de milho.

Amostras [0053] Sementes individuais ou lotes de sementes podem ser utilizados com os métodos e dispositivos da presente invenção. Uma amostra de sementes é qualquer número de sementes, ou uma única semente. Em uma modalidade preferida, uma amostra de sementes é maior do que 10 sementes, mais preferivelmente maior do que 20, 50, 500, 1.000 ou 10.000 sementes. Em uma outra modalidade, a amostra das sementes pode ser classificada por sua origem, tal como sementes que são derivadas de uma única espiga, única planta ou único cruzamento de planta. Como usado aqui, amostra é um objeto ou

Petição 870190000106, de 02/01/2019, pág. 26/60

23/51 coleção de objetos que devem ser estudados usando uma técnica analítica tal como MRI. Uma amostra compreende um ou mais espécimes, que são os objetos de estudo dentro da amostra. Os espécimes preferidos da invenção são sementes.

[0054] As sementes individuais em uma amostra podem ser simultaneamente analisadas com um método da presente invenção. Como usado aqui, simultaneamente significa qualquer conjunto de dados que derivam de uma única análise. Uma única análise pode ser experimentos de MRI único, ou a média de múltiplos experimentos de MRI. Tal análise simultânea pode ser a análise simultânea de um lote de sementes para um ou mais traços. Tal análise simultânea pode também ser a análise simultânea de uma semente para múltiplos traços. Em uma modalidade, mais do que um traço pode ser analisado simultaneamente, por exemplo, ambos os teors de água e óleo podem ser analisados simultaneamente. Em uma modalidade alternativa, mais do que 3, 4, 5 ou 6 traços podem ser analisados simultaneamente. Em outras modalidades alternativas, entre 5 e 10 ou entre 10 e 20 traços podem ser analisados simultaneamente. Na modalidade preferida, o experimento de MRI é direcionado para determinar o teor de óleo das sementes.

Traços [0055] Os métodos da presente invenção podem ser usados para detectar qualquer traço que possa ser medido pela ressonância magnética. Em uma modalidade preferida, o traço é um traço bioquímico. Como usado aqui, um traço bioquímico é qualquer traço que afeta a composição química da amostra agrícola. Em uma modalidade o traço bioquímico é selecionado do grupo consistindo em teor de óleo, teor de proteína, teor de carboidrato, teor de amido, teor de fibra e teor de água. Como usado aqui teor refere-se a quantidade de um componente, por exemplo 5 miligramas (mg) de proteína por semente

Petição 870190000106, de 02/01/2019, pág. 27/60

24/51 ou 5 mg de proteína por 10 gramas de peso seco do tecido. Os traços preferidos são teor de óleo relativo e teor de água relativo. O traço mais preferido é teor de óleo relativo.

[0056] Danos causados aos grãos durante a colheita, secagem, elevação e movimento do grão através dos canais comerciais podem ser determinados com os métodos da presente invenção. O uso de técnicas de agricultura modernas, tal como o uso de segadoras colhedoras-descascadoras de campo, levou a um teor de umidade do grão muito maior em amostras do que se as amostras eram possibilitadas de secar na espiga. Alto teor de umidade exige o uso de secagem artificial em temperaturas acima de 80°C, o que pode levar a rachaduras por tensão e rompimento do grão. Os indicadores de rompimento do grão podem incluir, mas não são limitados a, a razão de endosperma vítreo em relação ao não vítreo, densidade do grão, peso médio do grão, quantidade e qualidade do pericarpo e tamanho e forma do grão. Os métodos da presente invenção podem ser usados na identificação do rompimento e suscetibilidade ao rompimento, e na identificação de traços químico e físico que podem minimizar esses problemas.

[0057] Em qualquer uma das modalidades de análise de semente única e semente múltipla fornecidas acima, a semente pode ser analisada para mais do que um traço de uma vez. Por exemplo, os traços correspondendo a mudanças químicas diferentes ou taxas de defasagem, ou faixas de mudanças químicas e taxas de defasagem e traços que têm um efeito cumulativo dentro da mesma faixa podem ser simultaneamente investigados. Também, tecidos diferentes de uma semente individual podem ser analisados separadamente. Usando modelagem espectral para diferenciar entre os dois tecidos, regiões dos elementos de volume de imagem contíguos podem ser associadas com qualquer porção de uma semente ou tecido de planta, tal como, por

Petição 870190000106, de 02/01/2019, pág. 28/60

25/51 exemplo, o germe e o endosperma. Os dados espectrais para as porções diferentes podem então ser usados para analisar, de modo diferencial, os diferentes tecidos da semente. Na modalidade preferida, as sementes são analisadas para teor de óleo relativo.

Dispositivos de amostragem [0058] Dispositivos de amostragem são usados para prover amostras. Como usado aqui, prover significa qualquer método usado para colocar uma amostra em um instrumento de MRI ou qualquer método usado para manter uma amostra enquanto ela está em um instrumento de MRI.

[0059] Em uma modalidade, as sementes de uma única fonte são providas juntas no dispositivo de amostragem. A única fonte pode ser qualquer fonte que proporcione sementes tendo um meio genético comum, tal como uma espiga de milho, uma única planta ou o produto de um cruzamento único. Usando esse método, sementes do lote são providas como um grupo aleatoriamente provido no dispositivo de amostragem. Como usado aqui, aleatoriamente prover um lote de sementes em um dispositivo de amostragem é uma maneira particular de prover as sementes as dispondo no dispositivo de amostragem sem considerar a orientação ou separação de sementes em um momento posterior. Por exemplo, um lote de 100 sementes que é derramado em uma placa grande de plexiglas única para análise é dito ser aleatoriamente provido.

[0060] Qualquer dispositivo de amostragem pode ser usado se esse dispositivo de amostragem não interfere significativamente com as medições da ressonância magnética. Dispositivos de amostragem incluem, mas não são limitados a, dispositivo tal como recipientes feitos de plexiglas tendo, por exemplo, 12, 24, 96 ou 384 cavidades nas quais as amostras da semente podem ser carregadas para análise. Outros materiais que podem ser usados para construção dos

Petição 870190000106, de 02/01/2019, pág. 29/60

26/51 dispositivos de amostragem são conhecidos para esses versados na técnica da geração de imagem por ressonância magnética. Dispositivos de amostragem particularmente preferidos são placas contendo múltiplas cavidades que são empilhadas em múltiplas camadas para produzir uma série tridimensional de espécimes a serem analisados de modo a maximizar o número de espécimes analisados em um experimento de geração de imagem.

[0061] Em uma modalidade preferida, as sementes em um lote são providas em um dispositivo de amostragem que é capaz de manter cada semente no seu próprio compartimento individual. Um compartimento individual como usado aqui pode ser qualquer coisa que possa posicionar cada semente de modo que a semente pode ser identificada como correspondendo a um elemento de volume particular dentro da imagem quando medido pela MRI. Em uma modalidade, o dispositivo de amostragem compreende uma superfície plana e é disposto horizontalmente, e os compartimentos individuais (cavidades) são porções designadas da superfície plana. Em uma outra modalidade, o dispositivo de amostragem compreende compartimentos individuais tendo um piso e quatro paredes dispostos em um padrão de quadrado no qual sementes individuais podem ser providas. Em ainda uma outra modalidade, o dispositivo de amostragem é uma superfície plana sobre a qual são posicionados de modo removível compartimentos individuais tendo somente quatro paredes. Nessa modalidade, tanto a superfície plana quanto os compartimentos individuais podem ser removidos para possibilitar a classificação das sementes. Em uma modalidade preferida, o dispositivo de amostragem compreende placas de cavidades múltiplas empilhadas de modo removível com alta densidade de cavidade para proporcionar um maior número de posições identificáveis em um menor volume.

Aquisição e análise dos dados

Petição 870190000106, de 02/01/2019, pág. 30/60

27/51 [0062] Uma amostra contendo uma ou mais sementes é colocada em um instrumento de MRI, e um experimento de geração de imagens é executado usando técnicas padrão de aquisição de dados. Qualquer instrumento de geração de imagem de ressonância magnética pode ser usado nessa invenção, e qualquer experimento de MRI que é sensível ao traço ou característica de interesse, tal como CSI, SEI ou relaxometria pode ser usado. Instrumentos de MRI preferidos são esses que têm campos magnéticos homogêneos fortes maiores do que aproximadamente 0,2 Tesla. Também particularmente preferidos são instrumentos de MRI clínicos com a bobina de detecção embutida na inserção do gradiente tal que a bobina de detecção é muito maior do que nos instrumentos de qualidade de pesquisa, e portanto podem acomodar volumes de amostra muito maiores. Instrumentos de MRI particularmente preferidos são esses que têm um campo magnético forte maior do que aproximadamente 1 Tesla.

[0063] Pelo uso de um sistema de MRI com um ímã de grande furo, por exemplo, um instrumento de MRI de pesquisa maior ou clínico, a discriminação espacial dos sinais de RMN para sementes individuais é possível. Essa tentativa permite que grandes números de semente sejam analisados em um único experimento de MRI. Especificamente, os procedimentos descritos aqui possibilitam que 3456 grãos de milho sejam medidos simultaneamente em menos do que 30 minutos. Sementes de óleo preferidas tais como soja e cânola podem também ser examinadas usando métodos de MRI similares de alta produtividade. Em qualquer uma das modalidades acima para análise de amostra, o tempo para executar o método para todo o lote pode ser menor do que 30 minutos, preferivelmente menor do que 20 minutos. Esse tempo de amostragem curto resulta na rápida produtividade das amostras em relação à técnica anterior, e permite maior triagem das amostras de safra dentro de um ciclo de reprodução. Tamanhos de furo

Petição 870190000106, de 02/01/2019, pág. 31/60

28/51 preferidos são maiores do que 20 cm, 30 cm, 40 cm ou 50 cm.

[0064] Em geral, o tamanho da amostra (ou número de semente por cubo de amostra) para análise de MRI é ditado pelas limitações físicas e características de desempenho do scanner de MRI e do dispositivo de detecção de MRI (bobina de RF). Os fatores seguintes controlam a sensibilidade no experimento e consequentemente causam impacto na produtividade da amostra: (a) a intensidade do campo magnético principal, homogeneidade e tamanho do furo, (b) a qualidade do detector do sinal de MRI de RF, tamanho e características de resposta e (c) a intensidade do gradiente de geração de imagem, homogeneidade e linearidade.

[0065] Em uma modalidade preferida, a sequência de pulso para o experimento de MRI é uma sequência de eco de spin que permite a detecção preferencial dos prótons nas moléculas de hidrocarboneto (óleo). Nessa modalidade, a intensidade do sinal está relacionada com a quantidade de óleo. Assim, uma imagem particularmente forte de uma semente é indicativa de um alto teor de óleo nessa semente, enquanto uma imagem mais fraca é indicativa de menor teor de óleo. Em uma modalidade alternativa, a sequência de pulso para o experimento de MRI é uma sequência de geração de imagem de mudança química que permite a detecção do espectro de prótons de RMN completo nas moléculas de hidrocarboneto (óleo). Nessa modalidade, o espectro do sinal permite a inferência quanto ao tipo de óleo. Assim, a presença de tipos particulares de óleo tal como óleos poliinsaturados pode ser determinada.

[0066] Uma imagem da amostra é construída a partir dos dados usando software disponível, tal como software Varian ImageBrowser™ (Varian, Inc., Palo Alto, CA). Uma tal imagem contém intensidades de sinal de MRI para cada uma das sementes individuais (em um experimento estudando múltiplas sementes). Os dados de imagem

Petição 870190000106, de 02/01/2019, pág. 32/60

29/51 podem então ser adicionalmente processados de modo a quantificar o traço ou traços sendo estudados usando técnicas de análise de dados conhecidas para esses versados na técnica. O resultado de toda a análise pode ser exibido em uma maneira agradável para o usuário, mostrando a análise de quantificação do traço ou traços sendo estudados para cada semente individual em um lote de sementes sendo estudadas.

Dispositivos para análise de sementes [0067] É um aspecto da presente invenção proporcionar um método para usar instrumentos de MRI de furo maior na análise de amostras de pequena indutância, tal como amostras compreendendo sementes. Como detalhado acima, instrumentos de MRI de qualidade clínica têm circuitos de bobina de detecção e RF que são sintonizados para amostras tendo maiores indutâncias do que as amostras de sementes. Consequentemente, as bobinas devem ser carregadas, ou os circuitos devem ser novamente sintonizados para igualar as menores indutâncias das amostras de semente. A etapa de carregamento pode ser tão simples quanto colocar uma amostra fantasma dentro das bobinas de detecção, mas fora do volume que é copiado. Uma tal amostra fantasma pode ser, por exemplo, um volume de água para simular o tecido humano que o instrumento clínico é projetado para copiar. Amostras fantasmas estão disponíveis de fabricantes de instrumentos de MRI clínicos (por exemplo, Siemens AG, Erlangen, Alemanha; GE Medical Systems, Milwaukee, WI). A alternativa ao carregamento da bobina é sintonizar novamente os circuitos de detecção e RF do instrumento de modo que as bobinas sejam feitas para serem sensíveis à amostra dada sua menor indutância. Se as bobinas não são carregadas, ou alternativamente, se o circuito não é novamente sintonizado, então existirá uma perda dramática de sinal causada tanto pela rotação de magnetização ineficiente pela bobina de RF (isto é, um pulso de 90°

Petição 870190000106, de 02/01/2019, pág. 33/60

30/51 suposto girará a magnetização da amostra por menos do que 90°), quanto pela detecção ineficiente. Se a diferença entre a indutância em que o instrumento clínico é sintonizado e a indutância real dada uma amostra tal como várias sementes é grande o suficiente, nenhum sinal será observável.

[0068] É um aspecto da presente invenção superar as dificuldades associadas com copiar amostras tais como coleções de sementes usando instrumentos de MRI de qualidade clínica e de pesquisa de furo maior. Nesse aspecto da invenção, a intensidade do campo do gradiente é fixada de modo que: (1) o campo de visão (o volume ativo) cobre toda a amostra a ser copiada; (2) o número de camadas de imagem bidimensional (horizontal) é ajustado tal que o número de camadas de imagem multiplicado pela espessura (vertical) das fatias de amostra é aproximadamente igual à altura (vertical) da amostra; (3) o número de pixels dentro de cada camada de imagem é suficiente para decompor as sementes por pixels suficientes para evitar a interferência entre pixels. Esses três critérios são determinativos do gradiente do campo a ser usado para uma amostra arbitrária dentro de um instrumento de MRI arbitrário. Entretanto, esses devem ser particularmente escolhidos para instrumentos de MRI clínicos e de pesquisa de furo maior, cujos gradientes de campo não são apropriadamente ajustados para copiar amostras compreendendo espécimes tais como sementes. Cada um desses três critérios é discutido em mais detalhes abaixo.

[0069] Um primeiro critério para determinar os gradientes de campo apropriados é que o campo de visão instrumental deve cobrir toda a amostra a ser copiada. A finalidade desse critério é simplesmente garantir que todas as sementes na amostra sejam copiadas. Isso também determina as dimensões sobre as quais os gradientes de campo devem ser substancialmente lineares.

Petição 870190000106, de 02/01/2019, pág. 34/60

31/51 [0070] Um segundo critério para determinar os gradientes de campo apropriados é que o número de camadas de imagem bidimensional é ajustado tal que o número de camadas de imagem multiplicado pela espessura das fatias de amostra é aproximadamente igual à altura da amostra. Isso garante que toda a altura da amostra seja copiada. Surpreendentemente, a espessura ótima das camadas de imagem não corresponde geralmente com a espessura das sementes a serem copiadas. Menos fatias (correspondendo a maiores espessuras) exigem menos tempo de geração de imagem e menos tempo de processamento dos dados para uma quantidade de informação equivalente. A maior espessura prática deve ser a espessura de um espécime individual a ser copiado, isto é, a espessura de uma semente. Mas esse não é o caso; ao contrário, a espessura ótima das camadas de imagem é menor do que a espessura de uma única semente. Quando a espessura de uma camada de imagem é ajustada para ser igual a espessura de uma única semente, os resultados da geração da imagem são frequentemente anômalos e imprevisíveis. Em um exemplo, uma amostra de sementes com teores de óleo equivalentes forneceu resultados variando de sem sinal de modo algum de algumas das sementes, e máxima intensidade de sinal detectável de outras. Uma solução inesperada para esse problema foi encontrado aumentando a intensidade do gradiente de campo, assim causando uma diminuição na espessura da fatia e um aumento no número de fatias exigidas para copiar toda a altura da amostra. Essa solução foi contra intuitiva porque: (1) é de conhecimento comum que a geração de imagem de um menor volume (como é feito pela criação de imagem de uma fatia mais fina) resulta em sinais mais fracos porque existe menos material contribuindo para o sinal e (2) a geração de imagens de fatias mais finas exige a geração de imagens de mais fatias de modo a obter dados de imagem a partir do mesmo volume, e assim o experimento poderia demorar

Petição 870190000106, de 02/01/2019, pág. 35/60

32/51 mais.

[0071 ] A espessura ótima da fatia de imagem pode ser determinada rapidamente e facilmente por alguém versado na técnica seguindo essas etapas: (1) obtenção de uma amostra de sementes com teor de óleo conhecido; (2) seleção de uma espessura da fatia de imagem de partida; (3) obtenção de dados de MRI para a amostra de sementes com essa espessura da fatia de imagem; (4) comparação do teor de óleo relativo quando medido por MRI com o teor de óleo relativo conhecido das sementes e (5) se o teor de óleo de semente relativo medido não iguala o teor de óleo de semente relativo conhecido, redução da espessura da fatia de imagem e repetindo as etapas (3)-(5) até que o teor de óleo relativo quando medido por MRI iguale o teor de óleo relativo conhecido das sementes.

[0072] Um exemplo de como a espessura da fatia de imagem é ajustada para menos do que a espessura da semente é mostrado na figura 3. Nessa figura, fatias de imagem subsequentes são mostradas. Os quarto, quinto e sexto quadros da linha superior mostram dados adquiridos de uma única camada de sementes. Na análise final, esses quadros são combinados em uma única imagem (ver Figura 4a). Os dados analisados da imagem combinada refletem precisamente o teor de óleo relativo das sementes na mesma, enquanto que um experimento análogo que coleta os dados de toda a camada de sementes em uma imagem não. Na Figura 3, a espessura da fatia foi ajustada para ser aproximadamente 5 mm. Embora a espessura ótima da fatia geralmente dependa da espessura das sementes sendo copiadas, é geralmente considerado que a espessura ótima da fatia é menor do que aproximadamente 1 cm, preferivelmente cerca de 5 mm. A espessura ótima da fatia é menor do que aproximadamente 95% da espessura das sementes a serem copiadas, de preferência menor do que aproximadamente 80% da espessura da semente e mais

Petição 870190000106, de 02/01/2019, pág. 36/60

33/51 preferivelmente cerca de 75% da espessura da semente. A espessura da fatia teria que ser independentemente determinada com base nos tamanhos das sementes a serem copiadas. Um limite inferior poderia ser determinado onde uma redução a mais na espessura da fatia não seria necessária.

[0073] Um terceiro critério para determinar os gradientes de campo apropriados é que o número de pixels dentro de cada camada de imagem deve ser suficiente para decompor as sementes por pixels suficientes para evitar a interferência entre pixels. A interferência entre pixels ocorre quando um pixel de imagem contém dados derivados de sinais de mais do que uma semente. Os objetivos competidores para esse critério são minimizar o número de pixels exigidos para copiar uma camada, assim minimizando a duração do tempo exigida para adquirir dados de uma camada, mas ter um número suficiente de pixels para evitar a interferência entre pixels. Se o número de pixels é insuficiente para evitar a interferência entre pixels, então os dados para qualquer semente particular serão contaminados com dados correspondendo às sementes adjacentes, e assim a precisão é reduzida para medições das características tais como teor de óleo relativo. O número ótimo de pixels exigidos para copiar uma camada depende da densidade das sementes na camada e do tamanho das sementes, com maiores densidades e menores sementes exigindo mais pixels, e em um parâmetro relacionado, o espaçamento da semente. Se a distância entre sementes é aproximadamente igual ao tamanho das sementes, então um número ótimo de pixels proporcionaria aproximadamente quatro pixels entre as sementes, e assim dois pixels para representar uma dimensão da semente no plano da imagem (para um total de dois pixels para cada dimensão, ou quatro pixels). O número de pixels por camada de imagem deve ser suficiente para representar uma única semente por entre 1 e 40 pixels, de preferência entre 1 e 20 pixels, e mais preferivelmente

Petição 870190000106, de 02/01/2019, pág. 37/60

34/51 entre 4 e 10 pixels.

Métodos para Analisar e Classificar Sementes [0074] A análise da semente descrita acima pode ser coordenada com um dispositivo de classificação que classifica e/ou pesa cada semente individualmente. Nessa modalidade, o dispositivo de amostragem tem divisões para separar as sementes individuais em células. O fundo do dispositivo de amostragem compreende aberturas que podem ser abertas, de modo diferencial, para liberar qualquer uma ou todas as sementes, dependendo do critério de seleção programado. Alternativamente, o dispositivo de classificação pode compreender pás móveis controláveis de modo diferencial para cada célula no dispositivo de amostragem, dessa maneira permitindo a descarga simultânea das sementes no dispositivo de classificação.

Métodos para Analisar Múltiplos Traços [0075] A informação química quantitativa para a amostra pode ser extraída dos dados espectrais coletados em um experimento de MRI. É bem conhecido que os prótons nas moléculas orgânicas poliatômicas contidas em materiais biológicos exibem mudanças químicas características e divisões com base nos seus grupos funcionais locais e em prótons próximos. Pelo uso da geração de imagem com mudança química, um espectro de RMN completo pode ser medido para cada elemento de volume dentro da amostra. Tais medições proporcionam enormes quantidades de informação sobre cada semente dentro da amostra. Quando usada como um sistema de geração de imagem espectral, a presente invenção proporciona muitas vantagens. Pelo fato de que os dados espectrais podem ser coletados de cada unidade da amostra, dados mais precisos podem ser obtidos para amostras de grão a granel.

[0076] Embora as modalidades ilustradas da presente invenção incluam a geração de imagem com ressonância magnética na região do

Petição 870190000106, de 02/01/2019, pág. 38/60

35/51 espectro de radiofrequência, outras regiões espectrais poderiam ser usadas, tais como as regiões de micro-ondas, por exemplo, em um experimento de ressonância por spin do elétron. Além do mais, como é conhecido para esses versados na técnica, outros núcleos além dos prótons podem ser usados nos experimentos de ressonância magnética incluindo experimentos de geração de imagem por ressonância magnética. Tais núcleos incluem 13C, 14N, 15N, 17O, 19F, 31P e 35CI. [0077] Em uma modalidade alternativa da invenção, técnicas de geração de imagem por pulso múltiplo ou métodos de projeção atrasada conhecidos para esses versados na técnica da ressonância magnética do estado sólido podem ser usadas em um experimento de MRI para quantificar características diferentes do teor de óleo ou água. Nessa modalidade, componentes dos tecidos de planta incluindo, mas não limitados a, proteínas, carboidratos, lignina, celulose, fibra detergente ácida, fibra detergente neutra e amido hidratado podem ser medidos. [0078] Os métodos da presente invenção podem ser usados para detectar qualquer traço que pode ser medido pela ressonância magnética. Em uma modalidade preferida, o traço é um traço bioquímico. Como usado aqui, um traço bioquímico é qualquer traço que afeta a composição química da amostra agrícola. Em uma modalidade, o traço bioquímico é selecionado do grupo consistindo em teor de óleo, teor de proteína, teor de carboidrato, teor de amido, teor de fibra e teor de água. Como usado aqui, teor refere-se a quantidade de um componente, por exemplo, 5 miligramas (mg) por semente de proteína ou 5 mg de proteína por 10 gramas de peso seco do tecido. Em uma outra modalidade preferida, o traço bioquímico é selecionado do grupo consistindo em composição do óleo, composição da proteína, composição do carboidrato e composição da fibra. Como usado aqui, composição refere-se aos constituintes bioquímicos de uma amostra agrícola, por exemplo, a razão das proteínas de alto peso molecular em

Petição 870190000106, de 02/01/2019, pág. 39/60

36/51 relação às proteínas de pequeno peso molecular ou a razão dos óleo saturados em relação aos óleos não saturados. Características específicas tais como composição do óleo podem ser determinadas na presente invenção pelo uso do experimento de geração de imagem por mudança química (CSI), onde cada voxel da imagem tridimensional contém um espectro de ressonância magnética nuclear da matéria na região da amostra correspondendo a esse voxel. Assim, com base no espectro do RMN, o tipo particular de óleo pode ser determinado. O traço mais preferido a ser analisado pelos métodos da invenção é o teor de óleo relativo das sementes.

[0079] Em uma modalidade, os métodos da presente invenção são usados para diferenciar amostras de amido com fenótipos desejáveis. O amido da mossa normal ou milho duro é composto de aproximadamente 73% de amilopectina (a fração de amido com moléculas ramificadas) e 27% de amilose (a fração com moléculas lineares). O milho ceroso (tendo o gene wx) foi primeiro encontrado na China, mas mutações cerosas também foram encontradas nas variedades de cepas de mossas Americanas. O amido desse mutante é 100% de amilopectina. O prolongador de amilose (ae) mutante do endosperma aumenta a fração de amilose do amido para 50% e acima. O grão desse milho é caracterizado por uma aparência embaçada, translúcida e parcialmente cheia. Vários outros genes mutantes, sozinhos ou em combinação, afetam a composição do amido mudando a razão de amilose-amilopectina. O gel de amido opaco firme característico produzido pelo milho comum é atribuído para a fração de amilose. As propriedades do amido de milho ceroso são o resultado das soluções de amilopectina produzidas tendo uma forma de pasta translúcida mole característica. Essas diferenças nas características do gel de amido nativo continuam através dos processos de modificação do amido e são desejáveis em certas aplicações. Os métodos da

Petição 870190000106, de 02/01/2019, pág. 40/60

37/51 presente invenção podem facilmente discernir os tipos mutantes diferentes e podem ser usados como uma técnica de triagem não destrutiva de alta produtividade para eles.

[0080] Em uma outra modalidade, por exemplo, os métodos da presente invenção são usados para identificar amostras tendo traços de endosperma desejados. Por exemplo, vários mutantes de endosperma que alteram o equilíbrio dos aminoácidos foram identificados. Foi mostrado que as linhagens de mutante opaco-2(o2), farinhoso-2(fl2) e opaco-7(o7) têm zeínas reduzidas (a proteína no milho que carece de aminoácidos essenciais tais como lisina e triptofano) no endosperma e lisina aumentada. Os grãos com o gene opaco-2 são caracterizados por uma aparência não transparente, calcária, macia, com muito pouco endosperma vítreo duro. Os métodos da presente invenção podem ser usados para discernir os tipos mutantes diferentes e níveis de lisina, e portanto podem ser usados como uma técnica de triagem não destrutiva de alta produtividade para esse traço.

[0081] Em uma outra modalidade, o traço é um traço morfológico. Como usado aqui, um traço morfológico é qualquer traço estrutural. Traços morfológicos preferidos são tamanho do endosperma, tamanho do germe, forma da semente, tamanho da semente, cor da semente, textura da superfície da semente, peso da semente, densidade da semente e integridade da semente. A integridade da semente pode estar correlacionada com resistência ou suscetibilidade a doenças. A presença de furos em uma casca de semente é frequentemente indicativa da infeção por inseto.

[0082] A correlação de um estado de doença com uma mudança estrutural tal como furos pode ser estabelecida desafiando as amostras da semente a serem testadas com o organismo. Como usado aqui, uma amostra refere-se a qualquer material de planta que está sendo investigado por um método da presente invenção. Uma amostra pode

Petição 870190000106, de 02/01/2019, pág. 41/60

38/51 ser, por exemplo, uma fração de uma semente, uma semente total, mais do que uma semente, e outros tecidos de plantas, entre outros. Os controles podem incluir sementes conhecidas por serem suscetíveis e resistentes. A correlação da doença com uma mudança estrutural particular pode ser estabelecida por uma análise estatística apropriada. É entendido que os controles não precisam ser contra uma semente particular ou lote de semente uma vez que a correlação tenha sido estabelecida.

[0083] Um ou mais dos traços descritos acima ou qualquer outro traço que seja detectável usando geração de imagem por ressonância magnética podem ser simultaneamente analisados usando os métodos da presente invenção. Em uma modalidade, dois ou mais dos traços acima ou outros traços são simultaneamente analisados. Em uma outra modalidade, três, quatro, cinco ou mais dos traços acima ou outros traços mensuráveis por MRI são simultaneamente analisados.

Sistemas Analíticos [0084] A presente invenção proporciona um dispositivo para medir propriedades de produtos agrícolas, compreendendo: um dispositivo de processamento para produzir uma amostra; um dispositivo de amostragem para prover uma amostra, onde o dispositivo de amostragem é disposto para receber a amostra do dispositivo de processamento; e, um sistema de geração de imagem por ressonância magnética, onde o sistema é disposto para analisar a amostra no dispositivo de amostragem. A presente invenção também proporciona um dispositivo para medir propriedades de produtos agrícolas, compreendendo: um dispositivo de amostragem para prover uma amostra; um sistema de geração de imagem por ressonância magnética, onde o sistema é disposto para analisar a amostra no dispositivo de amostragem; e, um dispositivo de classificação para classificar a amostra em dois ou mais grupos diferentes, onde o

Petição 870190000106, de 02/01/2019, pág. 42/60

39/51 dispositivo de classificação é disposto para receber a amostra do dispositivo de amostragem. A presente invenção adicionalmente proporciona um dispositivo para medir as propriedades de produtos agrícolas, compreendendo: um dispositivo de processamento para produzir uma amostra; um dispositivo de amostragem para prover uma amostra, onde o dispositivo de amostragem é disposto para receber a amostra do dispositivo de processamento; um sistema de geração de imagem por ressonância magnética, onde o sistema é disposto para analisar a amostra no dispositivo de amostragem; e, um dispositivo de classificação para classificar a amostra em dois ou mais grupos diferentes, onde o dispositivo de classificação é disposto para receber a amostra do dispositivo de amostragem.

[0085] Uma amostra pode ser preparada para análise com um sistema de geração de imagem espectroscópico com um dispositivo de processamento. Como usado aqui, um dispositivo de processamento é qualquer dispositivo que seja capaz de separar a porção desejada de uma planta do resto da planta ou parte da planta. Em uma modalidade preferida, o dispositivo de processamento é um descascador, debulhador, ou uma combinação. O descascador pode ser, por exemplo, um descascador de espiga de milho única modificado Almaco (Almaco, 99 M Avenue, P.O. Box 296, Nevada, IA 50201). Como usado aqui, produzir uma amostra refere-se a qualquer método que um dispositivo de processamento possa usar para separar a porção desejada de uma planta do resto da planta ou parte da planta.

[0086] Outros tecidos de planta ou amostras agrícolas podem ser substituídos no lugar das sementes. Como usado aqui, tecidos de plantas incluem, mas não são limitados a, qualquer parte da planta tal como folha, flor, raiz e pétala. Como usado aqui, amostras agrícolas incluem, mas não são limitadas a, tecidos de planta tais como sementes, mas também incluem material com base sem planta tal como matéria

Petição 870190000106, de 02/01/2019, pág. 43/60

40/51 não orgânica ou matéria com base sem planta que ocorrem em um contexto agrícola. Amostras fungosas são um exemplo de uma amostra agrícola.

[0087] Outros espécimes além de tecidos de planta ou amostras agrícolas podem ser substituídos no lugar das sementes. A invenção é geralmente útil para analisar qualquer tipo de espécime que normalmente não seria receptivo à análise usando instrumentos de ressonância magnética de furo maior. Além do mais, a invenção é geralmente útil para análise de alta produtividade das amostras compreendendo qualquer tipo de espécime, quer ou não esse tipo de espécime fosse normalmente receptivo à análise usando instrumentos de ressonância magnética de furo maior. Em uma modalidade, espécimes têm volumes equivalentes a uma esfera com um diâmetro menor do que aproximadamente 50 cm. Em uma modalidade alternativa, espécimes têm volumes equivalentes a uma esfera com um diâmetro menor do que aproximadamente 25 cm, mais preferivelmente menor do que aproximadamente 10 cm e mais preferivelmente ainda menor do que aproximadamente 1 cm.

[0088] Depois que a amostra é preparada com o dispositivo de processamento, ela é analisada pela geração de imagem por ressonância magnética. Depois da análise de MRI, a amostra pode ser automaticamente classificada com um dispositivo de classificação. [0089] Como usado aqui, um dispositivo de classificação é qualquer dispositivo que seja capaz de separar a amostra em pelo menos dois receptáculos diferentes dependendo dos resultados da análise. Um dispositivo de classificação pode ser, por exemplo, uma única pá móvel que direciona a amostra em uma de duas direções. Em uma modalidade preferida, um dispositivo de classificação é capaz de independentemente classificar 10,20,50 ou 100 sementes individuais. Como usado aqui, um receptáculo é qualquer dispositivo que possa

Petição 870190000106, de 02/01/2019, pág. 44/60

41/51 manter uma porção de uma amostra separada das outras porções. [0090] Em uma modalidade preferida, o dispositivo de classificação é capaz de classificar um único lote de sementes em um de um múltiplo de reservatórios. Esse tipo de classificação é mais útil se mais do que um único traço está sendo examinado durante a análise.

[0091] Em uma modalidade preferida, um dispositivo de processamento e um dispositivo de classificação são acoplados em um dispositivo de amostragem e um sistema de geração de imagem espectroscópico para proporcionar um dispositivo para automaticamente prover uma amostra, analisar uma amostra e classificar uma amostra. Em uma modalidade preferida, a amostra pode ser provida, analisada e classificada mais rápido do que a cada 5 minutos, mais preferivelmente mais rápido do que uma vez a cada minuto.

Métodos de Reprodução Seletiva Com Base nos Traços Analisados [0092] A presente invenção proporciona métodos analíticos para analisar sementes tendo um traço desejado. Em um aspecto da invenção, os métodos analíticos permitem que porções discretas ou atributos de uma única semente sejam analisados. Além do mais, em um outro aspecto da presente invenção, os métodos analíticos permitem que sementes individuais sejam analisadas que estão presentes em um lote ou uma amostra a granel tal que a distribuição de uma característica pode ser determinada. De particular interesse é o uso da presente invenção para analisar o teor de óleo das sementes.

[0093] Métodos e dispositivos da presente invenção podem ser usados em um programa de reprodução para selecionar plantas ou sementes tendo um traço desejado. Em um aspecto, a presente invenção proporciona um método para selecionar uma semente tendo um traço, compreendendo: (A) prover a semente em um dispositivo de amostragem; (B) obter uma imagem de ressonância magnética da

Petição 870190000106, de 02/01/2019, pág. 45/60

42/51 semente; (C) analisar os dados dentro da imagem e (D) determinar se a semente exibe cada um dos traços com base nos dados analisados; (E) cultivar uma planta fértil a partir da semente e (F) utilizar a planta fértil como uma origem fêmea ou uma origem macho em um cruzamento com uma segunda planta.

[0094] Um outro aspecto da presente invenção proporciona um método de introduzir um traço em uma planta, compreendendo: (A) prover a semente em um dispositivo de amostragem; (B) obter uma imagem de ressonância magnética da semente; (C) analisar os dados dentro da imagem; (D) selecionar a semente tendo o traço com base nos dados analisados; (E) cultivar uma planta fértil a partir da semente e (F) utilizar a planta fértil como uma origem fêmea ou uma origem macho em um cruzamento com uma segunda planta.

[0095] Os métodos de introdução e seleção da presente invenção podem ser usados em combinação com qualquer metodologia de reprodução e podem ser usados para selecionar uma única geração ou para selecionar múltiplas gerações. A escolha do método de reprodução depende do modo de reprodução da planta, a hereditariedade do(s) traço(s) sendo aperfeiçoada, e o tipo de cultivar usado comercialmente (por exemplo, cultivar híbrido F1, cultivar linhagem pura, etc.). Tentativas selecionadas não limitadoras, para reproduzir as plantas da presente invenção são demonstradas abaixo. É adicionalmente entendido que quaisquer cultivares comerciais e não comerciais podem ser utilizados em um programa de reprodução. Fatores tais como, por exemplo, vigor de emergência, vigor vegetativo, tolerância à tensão, resistência à doença, ramificação, floração, muda da semente, tamanho da semente, densidade da semente, capacidade de defesa e capacidade de debulhar, etc. geralmente comandarão a escolha. Para traços altamente hereditários, a escolha de plantas individuais superiores avaliadas em uma única localização será efetiva, enquanto

Petição 870190000106, de 02/01/2019, pág. 46/60

43/51 que para traços com pequena hereditariedade, a seleção deve ser baseada nos valores médios obtidos de avaliações copiadas de famílias de plantas relacionadas. Métodos de seleção populares geralmente incluem, mas não são limitados a, seleção da linhagem, seleção da linhagem modificada, seleção de massa e a seleção recorrente. Em uma modalidade preferida, um cruzamento de retorno ou um programa de reprodução recorrente é adotado.

[0096] A complexidade da herança influencia a escolha do método de reprodução. A reprodução com cruzamento de retorno pode ser usada para transferir um ou uns poucos genes favoráveis para um traço altamente hereditário em um cultivar desejável. Essa tentativa foi usada extensivamente para reproduzir cultivares resistentes à doença. Várias técnicas de seleção recorrentes são usadas para melhorar traços quantitativamente herdados controlados por numerosos genes. O uso da seleção recorrente na auto-polinização das safras depende da facilidade de polinização, da frequência dos híbridos bem-sucedidos de cada polinização e do número da descendência híbrida de cada cruzamento bem-sucedido.

[0097] As linhagens de reprodução podem ser testadas e comparadas com padrões apropriados em ambientes representativos da(s) área(s) alvo(s) comercial(is) para duas ou mais gerações. As melhores linhagens são candidatas para novos cultivares comerciais; essas ainda deficientes nos traços podem ser usadas como origens para produzir novas populações para a seleção adicional.

[0098] Um método para identificar uma planta superior é observar o seu desempenho relativo a outras plantas experimentais e a um cultivar padrão amplamente cultivado. Se uma única observação não é conclusiva, observações dobradas podem proporcionar uma melhor estimativa da sua importância genética. Um cultivador pode selecionar e cruzar duas ou mais linhas parentais, seguido pela natureza repetida

Petição 870190000106, de 02/01/2019, pág. 47/60

44/51 e seleção, produzindo muitas novas combinações genéticas.

[0099] O desenvolvimento de novos cultivares de soja acarreta o desenvolvimento e seleção de variedades de soja, o cruzamento dessas variedades e seleção de cruzamentos híbridos superiores. A semente híbrida pode ser produzida por cruzamentos manuais entre origens férteis macho selecionadas ou pelo uso de sistemas de esterilidade de macho. Híbridos são selecionados para certos traços de genes únicos tais como cor da vagem, cor da flor, rendimento da semente, cor da pubescência ou resistência ao herbicida que indicam que a semente é verdadeiramente um híbrido. Dados adicionais sobre as linhagens parentais, bem como o fenótipo do híbrido, influenciam a decisão do cultivador se continuar com o cruzamento híbrido específico.

[00100] Métodos de reprodução de linhagem e reprodução de seleção recorrente podem ser usados para desenvolver cultivares de populações de reprodução. Os programas de reprodução combinam traços desejáveis de dois ou mais cultivares ou várias fontes com base ampla em combinações de reprodução das quais os cultivares são desenvolvidos pela natureza e seleção dos fenótipos desejados. Novos cultivares podem ser avaliados para determinar qual tem potencial comercial.

[00101] A reprodução da linhagem é usada geralmente para o aperfeiçoamento das safras de auto polinização. Duas origens que possuem traços complementares favoráveis são cruzadas para produzir um F1. Uma população F2 é produzida pela mistura da natureza de um ou vários F1's. A seleção dos melhores indivíduos nas melhores famílias é selecionada. O teste duplicado das famílias pode começar na geração F4 para melhorar a efetividade da seleção para traços com pequena hereditariedade. Em um estágio avançado de procriação endogâmica (isto é, F6 e F7), as melhores linhagens ou misturas de linhagens com fenótipo similar são testadas para a liberação potencial como novos

Petição 870190000106, de 02/01/2019, pág. 48/60

45/51 cultivares.

[00102] A reprodução por retrocruzamento tem sido usada para transferir genes para um traço simplesmente herdado, altamente hereditário em um cultivar homozigoto desejável ou linhagem procriada endogâmica, que é a origem recorrente. A fonte do traço a ser transferido é chamada a origem doadora. Espera-se que a planta resultante tenha os atributos da origem recorrente (por exemplo, cultivar) e o traço desejável transferido da origem doadora. Depois do cruzamento inicial, indivíduos possuindo o fenótipo da origem doadora são selecionados e repetidamente cruzados (cruzados de retorno) com a origem recorrente. Espera-se que a origem resultante tenha os atributos da origem recorrente (por exemplo, cultivar) e o traço desejável transferido da origem doadora.

[00103] O procedimento de descendência da semente única referese a plantar uma população de segregação, colher uma amostra de uma semente por planta e usar a amostra de uma semente para plantar a próxima geração. Quando a população tiver sido avançada de F2 para o nível desejado de procriação endogâmica, as plantas das quais as linhagens são derivadas irão seguir cada uma para indivíduos F2 diferentes. O número de plantas em uma população diminui a cada geração devido à falta de germinação de algumas sementes ou de produção de algumas plantas de pelo menos uma semente. Como resultado, nem todas as plantas F2 originalmente amostradas na população serão representadas por um progênie quando o avanço da geração é concluído.

[00104] Em um procedimento de semente múltipla, por exemplo, cultivadores de soja geralmente colhem uma ou mais vagens de cada planta em uma população e as debulham juntas para formar um volume. Parte do volume é usado para plantar a próxima geração e parte é colocado em reserva. O procedimento foi referido como técnica de

Petição 870190000106, de 02/01/2019, pág. 49/60

46/51 descendência de semente única modificado ou volume de vagem. [00105] O procedimento de semente múltipla tem sido usado para economizar trabalho na colheita. É consideravelmente mais rápido debulhar vagens com uma máquina do que remover uma semente de cada manualmente para o procedimento de semente única. O procedimento de múltiplas sementes também torna possível plantar o mesmo número de semente de uma população a cada geração de procriação endogâmica.

[00106] Em uma modalidade, a presente invenção é usada para diferenciar amostras haploides de amostras não haploides. O uso de plantas haploides aumenta a eficiência da seleção recorrente nos programas de reprodução da planta proporcionando uma maneira para produzir linhagens completamente homozigotas de linhagens haploides duplas. Pelo fato de que os haploides são hemizigotos, isto é, somente um alelo por posição, eles são úteis para estudos de mutação e seleção contra alelos recessivos indesejáveis. Métodos da presente invenção podem ser usados para discriminar amostras haploides dos outros tipos de amostras, tais como diploides. Qualquer traço haploide que produz um fenótipo que produz luz refletida ou transmitida que tem uma composição espectral diferente do que uma amostra não haploide pode ser determinado com os métodos da presente invenção. Por exemplo, algumas linhagens parentais transportam genes marcadores tais como R-nj, que possibilitam que os haploides sejam identificados no estágio de sementes maduras pela coloração antocianina do topo do endosperma e a falta de coloração no embrião. Métodos da presente invenção podem facilmente discernir a presença ou ausência desses fenótipos na localização exigida na semente.

[00107] Descrições de outros métodos de reprodução que são geralmente usados para diferentes traços e safras podem ser encontradas em um dos vários livros de referência. Ver, por exemplo,

Petição 870190000106, de 02/01/2019, pág. 50/60

47/51

Fehr, Principies of Cultivar Development Vol. 1, pp 2-3 (1987).

[00108] Em uma modalidade preferida, o traço de reprodução de interesse são níveis ou composição de óleo. Em uma modalidade até mesmo mais preferida, a planta que é submetida a um programa de reprodução é uma planta de milho e o traço de interesse é níveis de óleo.

[00109] Os exemplos seguintes são ilustrativos somente. Não é planejado que a presente invenção seja limitada às modalidades ilustrativas.

EXEMPLO 1 [00110] Imagens de grãos de milho são obtidas usando um scanner MR Vision Magnetom® 1,5 tesla (Siemens, Erlangen) usando o ressonador de corpo total padrão. A intensidade do gradiente é ajustada para 25 mT/m em todos os eixos. Com o impulsionador do gradiente, o tempo de subida da intensidade total foi 312 ms. As capacidades do gradiente total do ajuste do gradiente não são usadas na sequência de geração de imagem da semente. Uma sequência de eco de spin é usada (tr/te = 1920/17 ms) com um ângulo de excitação de 90°e ângulo de refoco de 180°. A largura da banda do receptor é 130 Hz/pixel. O campo de visão é ajustado para 450 x 450 mm. A matriz de dados obtida é 256 x 256. As imagens obtidas de cada cubo de amostra consistem em 50 fatias de coroa contíguas, adquiridas usando a opção intercalada, posicionada de modo que existe pelo menos uma fatia de suporte sem amostras entre cada camada de amostras no cubo. Para os padrões de calibragem do óleo de milho, duas varreduras são obtidas, com o ganho do receptor ajustado para 97,98 dB, e o fator da escala FFT ajustado para 0,1. Para as amostras de semente de milho, quatro varreduras são obtidas, com o ganho do receptor ajustado para 116,98 dB e o fator de escala FFT ajustado para 0,007114.

[00111] Os cubos de amostra para análise de MRI da semente de

Petição 870190000106, de 02/01/2019, pág. 51/60

48/51 milho nesses experimentos contêm 108 placas de 24 cavidades. Essas são dispostas em 9 camadas de 12 placas cada. Essa disposição proporciona uma capacidade analítica total de 2592 sementes de milho única por cubo de amostra.

Análise do Erro [00112] A exatidão e precisão para a análise de alta produtividade do teor de óleo usando MRI são resumidas e podem ser acompanhadas usando os gráficos das Figuras 8-12. Em geral, os métodos de MRI são mais úteis para sementes de óleo contendo mais do que 1 % de óleo em peso, embora esses métodos também sejam úteis para sementes de óleo contendo menos do que 1 % de óleo em peso. Sementes com níveis menores de óleo geram menores intensidades de sinal. A sensibilidade da técnica pode ser melhorada para detectar menores teors de óleo, por exemplo, diminuindo o limite do limiar, aumentando os tempos de amostragem dos dados (ou sensibilidade) ou de outra forma melhorando o desempenho do scanner de MRI.

[00113] Comparação com medições a granel. A média do teor de óleo em um grande grupo de sementes determinado usando MRI deve se correlacionar com o teor de óleo a granel para as sementes medidas usando uma técnica alternada, por exemplo, espectroscopia com IR. Essa correlação é ilustrada na Figura 8, que mostra uma forte concordância entre os dois métodos: y = 1,0322x + 1,9726; R1 = 0,9232. Pelo fato de que os resultados do óleo de MRI são relatados como números relativos, esses valores são menores (por uma equivalência constante) do que os resultados obtidos da medição do óleo a granel. Os menores números de MRI relativos são esperados devido à perda do sinal atribuída aos processos de relaxamento que sabe-se que ocorrem no experimento de MRI.

[00114] As comparações durante o dia e entre dias nas medições de óleo de MRI. Os dados obtidos usando métodos de MRI devem se

Petição 870190000106, de 02/01/2019, pág. 52/60

49/51 correlacionar para diferentes períodos da mesma amostra, quer os dados sejam adquiridos no mesmo dia ou em dias diferentes. Essas comparações do mesmo dia e dia diferente para um padrão de calibragem de óleo de milho são mostradas nas Figuras 9 e 10, respectivamente. Esses dados mostram boa correlação para múltiplos períodos da mesma amostra em ambos os casos (mesmo dia: y = 1,0007x, R2 = 0,9267; dia diferente: y = 0,9992x; R2 = 0,8435).

[00115] Variação na medição de MRI usando instrumentação diferente. A bobina de detecção de RF do sinal de MRI é o componente principal do hardware que afeta a sensibilidade ou a razão de sinal para ruído no experimento de MRI. Cada bobina de RF possui um perfil de desempenho que é característico da sua construção e geometria física. Os resultados obtidos em dois dispositivos diferentes podem ser comparados para confirmar a capacidade de reprodução entre duas disposições de hardware. Uma tal comparação é mostrada na Figura 11 para uma bobina de detecção de MRI Varian (Varian, Inc., Palo Alto, CA) e Monsanto (Monsanto, St. Louis, MO) usando uma amostra de óleo padrão. Ambos os detectores produzem resultados essencialmente idênticos para a intensidade do sinal de MRI integrado (y = 1,0413x 0,1725; R2 = 0,9452) em uma quantidade medida de óleo de milho na amostra padrão.

[00116] Coeficiente de variação para métodos de MRI. O coeficiente de variação para os dados de MRI medidos para cada camada em um cubo de amostra proporciona uma estimativa razoável do erro na medição de MRI. Um mapa para cada uma das nove camadas em um dos cubos padrões de calibragem é mostrado na Figura 12, que marca o desvio padrão percentual (N=8) relativo à média para cada posição de cavidade no cubo. Aproximadamente 90% das posições da cavidade na maioria das camadas mostram menos do que 5% de erro, e as posições restantes mostram 5-10%. Um par de posições, por exemplo, o canto

Petição 870190000106, de 02/01/2019, pág. 53/60

50/51 esquerdo superior na camada 1, mostra um erro maior do que 10%. Erros maiores podem ser esperados perto dos cantos do cubo relativo ao centro do cubo, onde a homogeneidade do campo magnético e a resposta do sinal de MRI é degradada.

EXEMPLO 2 [00117] Bandejas de amostra com 48 cavidades são carregadas com sementes de óleo incluindo milho, soja e canola. Duas pilhas de 5 placas contendo sementes individuais são colocadas em suportes de amostras de plexiglas para fazer uma série compreendendo um total de 480 sementes. Uma série de sementes é inserida em uma bobina de detecção de MRI comercialmente disponível que é grande o suficiente para acomodar o suporte da amostra. Uma bobina de MRI contendo as sementes é inserida no ímã de MRI para coleta dos dados usando técnicas padrão de aquisição de dados não patenteadas. Os dados de MRI são enviados para um computador, onde eles são processados usando uma macropersonalizada no software Varian ImageBrowser® (Varian, Inc., Palo Alto, CA) para obter as intensidades do sinal de MRI para cada um dos grãos individuais de milho na amostra. Os dados resultantes são usados para calcular a porcentagem do óleo por peso em cada uma das 480 sementes dentro da amostra.

EXEMPLO 3 [00118] Um scanner de MRI de qualidade clínica de 1,5 tesla é usado para analisar uma amostra de 3456 sementes organizadas em 12 camadas de 12 bandejas de 24 cavidades. O experimento é conduzido de acordo com o protocolo representado no Exemplo 2, acima. EXEMPLO 4 [00119] O teor de óleo dos grãos de milho quando determinado pelo protocolo descrito acima é usado para reproduzir plantas de milho com maior teor de óleo. LH185(2) x BHO é o material fonte para a geração 1. Essa semente foi plantada e a planta resultante é usada como fêmea

Petição 870190000106, de 02/01/2019, pág. 54/60

51/51 no programa de reprodução. Essa planta foi cruzada por estoque de indução haploides incluindo estoque 6 e KHI1. A semente produzida é colhida e seca. Com a ajuda de um sistema marcador para identificar grãos haploides supostos (sistema R-Navajo), as sementes haploides são isoladas da semente produzida. Essa semente é então analisada usando o método representado acima no Exemplo 1 para identificar as sementes com o maior teor de óleo. Somente as sementes com o maior teor de óleo são avançadas para a próxima geração. Na geração 2, esses grãos são plantados e tratados com um agente de duplicação de cromossomo para produzir linhagens procriadas endogâmicas dihaploides.

EXEMPLO 5 [00120] As sementes das plantas resultantes do Exemplo 4 são plantadas e as plantas resultantes foram polinizadas com KHI1. Depois da colheita e secagem, grãos haploides supostos são selecionados usando o sistema marcador selecionável R-Navajo. Esses grãos são colocados em placas de 24 cavidades e analisados usando MRI como no Exemplo 1 para determinar o teor de óleo. Os grãos com o maior teor de óleo são selecionados e plantados. As plantas resultantes são tratadas com um agente de duplicação e autopolinizadas para criar linhagens procriadas endogâmicas dihaploides.

[00121] Todos os artigos, patentes e pedidos de patente citados aqui são incorporados por referência na sua integridade.

Claims (19)

1. reivindicações

   1. Método para determinar se uma amostra compreendendo uma pluralidade de sementes contém sementes que exibem um traço, caracterizado pelo fato de que compreende:

   5 (A) proporcionar a dita amostra a um dispositivo de amostragem, o dito dispositivo de amostragem compreendendo uma pluralidade de bandejas de amostras empilhadas, cada bandeja de amostra contendo uma pluralidade de cavidades, cada cavidade contendo uma semente a ser exibida como imagem;

   10 (B) gerar uma imagem de ressonância magnética da dita amostra;

   (C) analisar a dita imagem de ressonância magnética para o dito traço;

   (D) determinar se sementes na dita amostra exibem o dito 15 traço com base na dita análise, em que a dita etapa determinante compreende associar as ditas sementes com elementos de volume de imagem correspondentes; e (E) classificar as sementes para separar a(s) semente(s) individual(ais) que exibe(m) o dito traço.

   20
2. 2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a dita imagem de ressonância magnética é obtida usando um instrumento de formação de imagem de ressonância magnética com um tamanho do diâmetro do furo maior do que 20 cm, ou preferivelmente maior do que 30 cm.

   25
3. 3. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o tamanho do diâmetro do furo é maior do que 40 cm.
4. 4. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o tamanho do diâmetro do furo é maior do que 50 cm.
5. 5. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo

   30 fato de que o dito traço é uma quantidade de teor de óleo dentro de cada semente.
6. 6. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo

   Petição 870180071755, de 16/08/2018, pág. 8/13 fato de que o dito traço é uma composição de óleo dentro de cada semente.
7. 7. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que proporcionar a dita amostra em um dispositivo de amostragem compreende proporcionar cada uma das ditas sementes em um

   5 compartimento individual do dispositivo de amostragem.
8. 8. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a dita amostra compreende mais de 10 sementes.
9. 9. Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a dita amostra compreende mais de 20 sementes.
10. 10 10. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a dita amostra compreende mais de 50 sementes.
11. 11. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dito método é completado em menos de 30 minutos.
12. 12. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo 15 fato de que o dito método é completado em menos de 20 minutos.
13. 13. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que determinar se as sementes na dita amostra exibem o dito traço compreende determinar uma quantidade quantificada de um componente presente em cada semente com base na dita análise.

    20
14. 14. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o detectado traço é óleo, e compreende ainda:

    medir um peso de cada semente na pluralidade de sementes; e calcular uma porcentagem relativa de óleo por peso de 25 semente medido para cada semente.
15. 15. Método de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que compreende:

    processar uma amostra de semente padrão com teor de óleo conhecido conforme as etapas de procedimento para determinar um fator de

    30 correção; e usar o fator de correção para corrigir a porcentagem relativa calculada da quantidade detectada de óleo por peso de semente.

    Petição 870180071755, de 16/08/2018, pág. 9/13
16. 16. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dito dispositivo de amostragem compreende uma bandeja de amostra contendo uma pluralidade de cavidades, cada cavidade contendo uma semente a ser exibida como imagem.
17. 17. Método de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que a pluralidade de cavidades excede cinquenta em número.
18. 18. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a pluralidade de cavidades em cada bandeja excede cinquenta em número.
19. 19. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as sementes compreendem mais de cinquenta sementes individuais.