BRPI0007891B1

BRPI0007891B1 - processo para a produção de il-1ra em uma seringa para uso como um medicamento

Info

Publication number: BRPI0007891B1
Application number: BRPI0007891A
Authority: BR
Inventors: Hans Meijer; Julio Reinecke; Peter Wehling
Original assignee: Orthogen Ag
Priority date: 1999-02-01
Filing date: 2000-01-31
Publication date: 2016-11-29
Also published as: DE50005985C5; AU758385B2; EP1151004B1; DK1151004T3; PT1151004E; DE50005985D1; US6713246B1; KR100652534B1; CA2364386A1; AU2800200A; DE19903876B4; EP1151004A1; DE50005985C9; JP2007244875A; DE19903876A1; US6759188B2; JP2002540818A; BR0007891A; WO2000046249A1; ATE263782T1

Abstract

"processo para a produção de proteínas de efeito profilático ou terapêutico". a presente invenção se refere a um processo para a produção de uma proteína de efeito profilático ou terapêutico, sendo a seringa preenchida com um fluido corporal e incubada, formando-se em seguida no fluido corporal a proteína de efeito profilático ou terapêutico.

Description

PROCESSO PARA A PRODUÇÃO DE IL-lRA EM UMA SERINGA PARA USO

COMO UM MEDICAMENTO

[001] A presente invenção se refere a um processo para a produção de proteínas de efeito profilático ou terapêutico, assim como a meios, especialmente seringas, que são para tal fim empregados.

[002] Proteínas de efeito terapêutico, tais como, eritropoietina, insulina ou interferona, já são conhecidas há muito tempo. O uso destas proteínas como medicamento já é liberado, sendo elas portanto freqüentemente empregadas. Devido aos altos custos associados com o desenvolvimento e a liberação do uso destes medicamentos, continua havendo uma necessidade de alternativas simples e econômicas para a preparação de proteínas de efeito terapêutico. Além disso nem todas as proteínas de efeito terapêutico têm o seu uso liberado como medicamentos. Além disso freqüentemente ocorre a necessidade de se administrar estas proteínas ao paciente. Têm uma especial importância as proteínas autólogas, isto é, próprias do corpo, pois presume-se que sejam bem toleradas pelo corpo. Ao grupo destas proteínas pertence o antagonista do receptor de interleucina 1, interleucina 4, interleucina 10 e o receptor do fator de necrose de tumor do tipo I ou do tipo II. Além disso as proteínas autólogas têm a vantagem de já existirem as modificações naturais que ocorrem depois da tradução, tais como as glicosilações. Tal não ocorre no caso da maior parte das proteínas recombinantes geralmente obtidas, uma vez que estas são produzidas em hospedeiros procarióticos.

[003] A estimulação dos monócitos por imunoglobulina G aderente para a formação dos antagonistas do receptor de interleucina 1 foi descrita por Arend e Leung em Immunological Reviews (1994) 139, 71-78 e por Moore et al.r em Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. (1992) 6, 569-575. Andersen et al., em Autommunity (1995) 22, 127-133 esclarece que o efeito terapêutico da imunoglobulina G a ser observado in vivo não pode ser atribuído a uma formação mais acentuada do antagonista de receptor de interleucina 1, e que a formação in vitro dos antagonistas de receptor de interleucina 1 (IRAP, IL-lRa) ocorre através de monócitos em função dos componentes do soro e do plasma adsorvidos em polipropileno. 0 emprego terapêutico de componentes do soro e do plasma, adsorvidos para a estimulação da formação de proteínas, interessantes do ponto de vista terapêutico em terapias, não só é muito dispendioso, como carrega ainda o perigo de uma contaminação por partículas infecciosas, com as quais os componentes do soro e do plasma podem ser contaminados. Nos documentos citados acima não consta nenhum processo para a produção de IL-lRa que pudesse ser imediatamente empregado em uma terapia sem o emprego dos componentes do soro e plasma absorvidos.

[004] O problema técnico que serve de base à presente invenção consiste portanto no desenvolvimento de processo e de meios para a produção de IL-lRa que possam ser empregados como alternativa segura, econômica e de rápida execução e que servissem para a preparação de medicamentos convencionais.

[005] A presente invenção soluciona este problema desenvolvendo um processo para a preparação de IL-lRa em uma seringa de vidro, quartzo ou de um material sintético, sendo a seringa enchida com um fluido corporal de um organismo, de um ser humano ou animal, por exemplo, incubada e sendo formado o IL-lRa.

[006] Em uma modalidade preferida da presente invenção é previsto fazer-se com que a estrutura interna da seringa consista em um material especial, especialmente vidro, material sintético, quartzo e/ou corundo, cuja superfície em uma modalidade especialmente preferida da invenção é modificada, especialmente com um agente cáustico, tal como um ácido ou uma lixívia, por exemplo, especialmente ácido cromo-sulfúrico, sendo a superfície da estrutura interna da seringa em seguida, depois da eliminação do agente cáustico e da lavagem da seringa, eventualmente, isto é, de um modo especialmente preferido, esterilizada, especialmente em autoclave. Em seguida a seringa é enchida com fluido de um paciente, incubada, no processo formando-se o IL-lRa. O fluido corporal enriquecido com a proteína pode então ser novamente injetado no paciente, em uma articulação doente, por exemplo. É preferível, no entanto, que, para elevar o grau de pureza do IL-lRa formado, o fluido corporal seja centrifugado e o resíduo filtrado e esterilizado, dividindo-se o mesmo em alíquotas e armazenando-se para um tratamento posterior. A presente invenção prevê, portanto, em uma modalidade preferida, que a superfície da estrutura interna da seringa em uma primeira etapa, seja modificada especialmente com a ajuda de um agente cáustico, tal como um ácido ou uma lixívia, especialmente ácido cromo-sulfúrico, e que em seguida, caso seja necessário, a superfície das estruturas internas seja esterilizada, especialmente em autoclave. Antes e/ou depois da esterilização pode ser prevista uma secagem. Depois da modificação e da eventual esterilização, enche-se a seringa em uma segunda etapa de processo com um fluido corporal, especialmente sangue, fluido linfático, saliva ou urina e incuba-se. É preferível que o fluido seja coletado diretamente do paciente com a seringa. A superfície da estrutura interna da seringa, de preferência modificada, induz no fluido corporal especificamente, dependendo do material empregado na estrutura da seringa, da estrutura interna da seringa, da modificação empregada, especialmente corrosão da estrutura interna, da esterilização empregada, especialmente em autoclave e do fluido corporal empregado, a formação, em quantidades variáveis, do IL-lRa, que consequentemente aumenta o seu teor ou se forma no fluido corporal na seringa. 0 fluido corporal deste modo enriquecido pode ser armazenado de modo esterilizado na seringa e, quando necessário, ser novamente administrado diretamente ao paciente sem outro tratamento ou de preferência depois de centrifugação e/ou filtração com esterilização.

[007] Portanto, a invenção se refere também a um processo para o tratamento profilático ou terapêutico do corpo humano ou animal, para o tratamento de reumatismo, artrose e/ou dores nas costas, por exemplo, sendo coletado do corpo humano ou animal um fluido corporal, sangue, por exemplo, por meio de uma seringa consoante a presente invenção, sendo este fluido incubado dentro da seringa e formando-se durante este processo IL-lRa ou tendo o seu teor aumentado, sendo o fluido novamente administrado por meio desta seringa ao mesmo corpo humano ou animal ou a um outro.

[008] O IL-lRa formado pode ser modificado de modo vantajoso, sendo, por exemplo por meio de glicose. Naturalmente a presente invenção abrange também a formação de outras modificações ou variantes de IL-lRa, tais como formas abreviadas, mutantes ou outros derivados.

[009] Em dependência com a presente invenção, uma estrutura interna de uma seringa significa qualquer região ou qualquer estrutura da seringa que se encontra no seu interior, isto é, que se encontra na região de coleta de amostra e que pode entrar em contato com o fluido a ser coletado. De um modo especialmente vantajoso a estrutura interna de uma seringa consiste na sua superfície interna, especialmente uma superfície com uma estruturação para aumentar a superfície Naturalmente a presente invenção pode também ser conduzida por meio de uma seringa convencional disponível no comércio e que não apresenta nenhuma configuração superficial especial no seu espaço interno. A estrutura interna em um tal caso é a superfície interna do cilindro de seringa e a parte do êmbolo que se encontra dentro do cilindro. A estrutura interna pode em uma modalidade especialmente preferida ser ainda formada por aplicação no espaço interno da seringa de objetos tais como partículas, esferas, pérolas, géis, lã de vidro, corundo, quartzo, areia, material sintético granulado ou vidro granulado, ou de pó de material sintético ou vidro ou semelhantes, a fim de aumentar a superfície interna da seringa e deste modo colocar à disposição uma superfície induzível maior. O material pelo qual a estrutura interna é constituída ou que está contido nela, pode ser um material diferente daquele que constitui o resto da seringa. A seringa, por exemplo, pode ser constituída por material sintético e partes de sua estrutura interna podem consistir em vidro granulado, por exemplo. Tais estruturas adicionais como, por exemplo, pérolas de vidro com um diâmetro de 1 a 5 mm devem, no entanto, consoante uma modalidade preferida da invenção, constituir não mais de 50% do volume interno da seringa empregada. As seringas empregadas podem ser seringas de 10 a 100 ml, por exemplo.

[010] Em conexão com a presente invenção deve-se considerar como uma superfície modificada de uma estrutura interna da seringa uma superfície tratada por um agente cáustico e que tem a condição de induzir e/ou intensificar a formação de IL-lRa em um fluido corporal de um ser humano ou animal. A superfície modificada pode ser caracterizada por um grau de pureza especialmente alto, isto é, uma ausência quase completa ou completa de contaminação e/ou uma alteração química/física das características superficiais e/ou estrutura superficial. É preferível se empregar para a produção da superfície modificada da estrutura interna uma lixívia ou um ácido, tal como o ácido cromo-sulfúrico, por exemplo, especialmente a 20 a 80%, sendo especialmente preferido o ácido cromo-sulfúrico a 50%. É preferível se incubar a seringa durante um período de 5 a 30 minutos com o agente cáustico, especialmente com o ácido cromo-sulfúrico.

[011] Depois da extração do agente pode se produzir, de preferência, uma ou mais etapas de lavagem assim como eventualmente, de preferência, uma esterilização, em autoclave, por exemplo, especialmente em autoclave a uma temperatura de 100°C a 150°C durante um período de 20 a 60 minutos sob uma pressão de 1 x 105 a 5 x 105 Pa. Depois da lavagem e antes e/ou depois da esterilização em autoclave pode eventualmente ser conduzida uma ou mais etapas de secagem a 60 a 150°C, de preferência 80°C, durante um período de 30 a 120 minutos, em uma estufa de secagem, por exemplo.

[012] Em uma modalidade especialmente vantajosa da presente invenção é previsto fazer-se com que a seringa, especialmente a estrutura interna da seringa, seja constituída de vidro, de vidro de quartzo, por exemplo, corundo, quartzo um material sintético como poliestireno, polietileno, cloreto de polivinila, polipropileno ou de um material análogo, isto é, ser constituída por materiais ou conter em quantidade substancial estes materiais ou suas misturas.

[013] Pôde ser mostrado de modo surpreendente dentro do quadro das instruções presentes que uma seringa constituída de vidro e/ou de uma estrutura interna de vidro, especialmente de vidro granulado, apresenta um efeito indutor especialmente forte.

[014] Em uma outra modalidade especialmente preferida, antes do tratamento, isto é antes da coleta do fluido corporal, emprega-se vidro aquecido, especialmente vidro aquecido a 100°C-210°C, especialmente a 170-200°C, de preferência a 180°C, sendo naturalmente o vidro resfriado antes do emprego de acordo com a presente invenção. Em uma modalidade especialmente preferida, o vidro pode ocorrer na forma de vidro em pó ou vidro granulado.

[015] As estruturas internas podem ser constituídas também de quartzo, pó de quartzo ou areia de quartzo, por exemplo e/ou corundo, na forma de uma suspensão em água, por exemplo, ou então elas podem conter tais materiais.

[016] Em uma modalidade especialmente preferida estes materiais apresentam, depois de modificação, eventualmente produzida, especialmente corrosão e depois da esterilização, eventualmente produzida, propriedades de indução de IL-lRa.

[017] Em uma outra modalidade preferida da invenção é previsto se dotar a estrutura interna de uma seringa com um revestimento que pode ser modificado e esterilizado, e em seguida se proceder à modificação e eventualmente também à esterilização.

[018] A presente invenção é vantajosa na medida em que é proposto um processo de simples execução com o qual pode ser produzido por indução, especialmente por indução de superfície, um IL-lRa autólogo e em tal forma produzido, isto é, juntamente com outros componentes do fluido que se encontram na seringa, o IL-lRa pode ser administrado novamente diretamente ao paciente, isto é, sem outra manipulação, tal como por exemplo uma transferência para um outro recipiente. Em uma modalidade preferida, pode ser prevista, para a separação dos componentes sólidos, uma centrifugação e/ou filtração com esterilização antes de se administrar o IL-lRa formado. Torna-se desnecessário o emprego de medicamentos disponíveis no comércio e freqüentemente caros. Finalmente a presente invenção apresenta a vantagem de ser evitado todo tipo de contaminação, poluição, infecção ou semelhantes do IL-lRa, que se deve a uma produção de medicamentos fora do paciente.

[019] A presente invenção prevê, portanto, em uma modalidade especialmente preferida, um processo para a produção do antagonista do receptor de interleucina-1 consistindo as estruturas internas da seringa em um material especialmente tratado, especialmente vidro, quartzo ou material sintético, sendo a superfície das estruturas internas da seringa modificada, especialmente com a ajuda de um agente cáustico, especialmente ácido cromo-sulfúrico, sendo em seguida a superfície das estruturas internas da seringa eventualmente esterilizada, especialmente em autoclave, e sendo a seringa preenchida com um fluido corporal, de preferência sangue, incubada e sendo produzido o IL-lRa no fluido corporal ou aumentado o seu teor. Dentre outras causas, devido à modificação especial da superfície das estruturas internas da seringa, especialmente à corrosão, e à esterilização especial da superfície, especialmente em autoclave, a seringa de acordo com a presente invenção tem a possibilidade de estimular os monócitos que existem no sangue a produzir o IL-lRa, de modo que este tem o seu teor aumentado no sangue. 0 sangue que se encontra na seringa, em uma modalidade da presente invenção, pode, depois da incubação, isto é, depois do aumento do teor de IL-lRa, ser diretamente administrado novamente ao paciente sem outra manipulação, tal como por exemplo transferência para outro recipiente, sendo este paciente aquele do qual foi extraído o sangue que enche a seringa.

[020] Em uma modalidade especialmente preferida da presente invenção pode ser vantajoso para a separação de componentes sólidos, tais como células, submeter o sangue que se encontra na seringa a uma centrifugação e/ou filtração com esterilização. Em seguida distribui-se eventualmente o material em alíquotas. A presente invenção também prevê que o sangue seja coletado do paciente através de uma seringa que é dotada com uma superfície especialmente modificada e esterilizada, especialmente em autoclave, das estruturas internas, podendo ser o sangue incubado e depois da formação de IL-lRa ser administrado novamente ao mesmo paciente ou a um outro, com a mesma seringa. Um tal procedimento é especialmente vantajoso no campo da neuro-ortopedia, por exemplo, isto é no caso de dores de costas de causa neurológica, por exemplo. Para o tratamento de tal tipo de dores, cogitava-se até agora somente em operação dos discos intervertebrais, tratamento com cortisona, enxágües com solução de cloreto de sódio ou semelhante. A proposição consoante a presente invenção do IL-lRa da presente invenção, isto é, especialmente do IL-lRa autólogo, permite também um tratamento especialmente simples, econômico e eficaz de reumatismo e artrose.

[021] A presente invenção prevê em uma outra modalidade que a estrutura interna da seringa seja revestida ainda com anticoagulantes, especialmente heparina, citrato, EDTA, CPDM ou CPDA. Evidenciou-se com surpresa dentro do âmbito das instruções do presente, que, com o emprego de heparina como anti-coagulante, obtém-se uma indução boa e direcionada. Consoante a presente invenção foi também previsto que os coagulantes não sejam empregados como revestimento e sim que sejam empregados livres dentro do recipiente, sendo introduzidos na seringa em estado liofilizado ou liquido, por exemplo.

[022] Em uma modalidade especialmente preferida da presente invenção não se utiliza, no entanto, na seringa, nenhum anti-coagulante, principalmente nenhuma heparina. Isto leva a uma incubação ainda melhor.

[023] A invenção prevê em uma outra modalidade preferida conduzir-se a incubação do fluido corporal na seringa durante um período de tempo de 12 a 72 horas, de preferência de 24 horas, de preferência à temperatura ambiente, portanto a uma temperatura ambiente de 20°C a 41°C, especialmente a 37°C.

[024] A presente invenção prevê ainda em uma modalidade da invenção que, depois da formação da proteína de efeito terapêutico ou profilático no fluido corporal, o fluido corporal seja ainda submetido a um outro tratamento, tendo-se em vista, por exemplo separar-se dele determinados componentes, tais como plasma sangüíneo ou plaquetas sangüíneas. Esta separação pode ser conduzida na modalidade preferida da invenção por centrifugação ou filtração.

[025] A presente invenção se refere, em uma outra modalidade, a um processo para a produção de uma seringa adequada para a indução in vitro de proteínas de efeito profilático ou terapêutico, especialmente do antagonista do receptor de interleucina 1 caracterizando-se a seringa pelo material especialmente tratado da estrutura interna da seringa, especialmente material sintético ou vidro. É especialmente previsto de acordo com a invenção provocar-se a corrosão da superfície da estrutura interna da seringa por meio de um agente cáustico especialmente de uma lixívia ou de um ácido, especialmente por meio do ácido cromo-sulfúrico. Depois da extração do agente cáustico e da lavagem da seringa pode ser previsto se esterilizar a superfície da estrutura interna, especialmente em autoclave. É preferível que possa ser também previsto se aquecer uma seringa, que é fabricada de preferência de vidro, antes do seu emprego a uma temperatura de 100°C a 210°C, por exemplo, especialmente a 170°C-200°C.

[026] A presente invenção se refere, naturalmente, a uma seringa deste modo produzida, que, em uma modalidade especialmente preferida consiste, em vidro, quartzo ou material sintético, especialmente em poliestireno, cloreto de polivinila, polietileno ou polipropileno, sendo a seringa caracterizada pelo tratamento da superfície da estrutura interna da seringa, fabricada especialmente de vidro, quartzo ou material sintético, que é produzido por meio do efeito do agente cáustico. Em um modo preferido, a seringa é aquecida antes do seu emprego, de preferência a uma temperatura de 100°C-210°C, de 170°C-200°C, por exemplo.

[027] A presente invenção se refere também ao emprego de lixívia ou ácido, especialmente do ácido cromo-sulfúrico para modificar a superfície das estruturas internas das seringas da presente invenção, constituídas de preferência de poliestireno, cloreto de polivinila, polietileno, polipropileno, quartzo ou vidro, para a indução in vitro de proteínas de efeito profilático ou terapêutico, de preferência do antagonista do receptor de interleucina 1.

[028] A presente invenção se refere também ao emprego de dispositivos, mais exatamente substâncias, que aumentam a superfície tais como vidro em pó, vidro granulado, quartzo em pó, areia de quartzo, corundo, micro-esferas, pérolas, areia, etc. para emprego em um dos processos citados acima, isto é, especialmente para emprego como indutor para a formação de IL-lRa em um recipiente, em uma seringa, por exemplo.

[029] Outras modalidades vantajosas da presente invenção serão evidentes das reivindicações secundárias.

[030] A invenção será agora descrita com mais detalhes em conjunto com as figuras e os exemplos de concretização.

Nas figuras: [031] A figura 1 mostra esquematicamente uma seringa de acordo com a invenção.

[032] As figuras 2 a 12 mostram a formação do IL-lRa em uma seringa empregada de acordo com a invenção em diversas condições.

[033] As figuras 13 e 14 mostram que por lavagem da seringa o agente cáustico empregado é completamente eliminado.

[034] Exemplo 1: produção e emprego de uma seringa de vidro com granulado [035] A figura 1 mostra uma seringa 1 de 50 ml fabricada de vidro (Fortuna Optima, Best. Nr 7.102.-44, caso não declarado em contrário, esta foi a seringa empregada em todos os exemplos) com um embolo ou impulsor 3, um fecho aparafusável 5 com uma peça de fecho 13 (Luer macho) e uma tampa 7 dotada de um septo que pode ser retirada e que é disposta sobre a peça de fecho 13 fechando esta. O êmbolo 3 apresenta um ponto de ruptura 15. Deste modo depois da ruptura do êmbolo se centrifugar diretamente a seringa. É também ilustrado o granulado 9 constituído de vidro (pérolas de vidro da Firma Roth, art. número A 557.1). 0 tamanho das proteínas de granulado 9 se encontra entre 1 e 3 mm de diâmetro, podendo, no entanto ser empregadas também partículas menores, especialmente tendo acima de 100 pm, tal como, por exemplo, pó de vidro. Naturalmente podem ser também empregadas seringas, de vidro ou de material sintético, por exemplo, que não apresentam nenhum ponto de ruptura no êmbolo.

[036] Para a fabricação da seringa 1, a superfície da estrutura interna da seringa 1 direta do fabricante e na embalagem original e do granulado 9 direto do fabricante e na embalagem original é modificada com a ajuda de um preparado de ácido cromo-sulfúrico, sendo o preparado de ácido cromo-sulfúrico acolhido na seringa e a parede interna da seringa, isto é a parede interna do cilindro e o êmbolo, juntamente com o granulado com ele corroídos. A seringa é tratada por enchimento e esvaziamento completos da seringa, com ácido cromo-sulfúrico a 50% (Merck, Darmstadt, Best. Número. 1.02499.2500, o ácido cromo-sulfúrico foi diluído até a diluição desejada com Reinstwasser Ultra Pure Water No. L 0040 de Biochrom) repetidos de uma a dez vezes, de preferência três vezes, sendo durante este processo a seringa limpa, mais exatamente modificada. Depois do último enchimento a seringa é vedada embaixo e no estado preenchido incubada com o ácido cromo-sulfúrico durante 5 a 30 minutos. Em seguida retira-se o êmbolo da seringa e lava-se o cilindro de seringa enchendo-se e esvaziando-se completamente o cilindro com Reinstwasser fresca repetindo-se de duas a dez vezes, de preferência quatro, devendo-se zelar para que a água de lavagem seja completamente introduzida e descarregada. Em seguida o êmbolo de seringa é mergulhado em ácido cromo-sulfúrico a 50% e bem lavado com água destilada.

[037] Os restos de água eventualmente presentes dentro da seringa são absorvidos por efeito capilar com o fecho de Luer, a fim de garantir uma secagem rápida da seringa. Os êmbolos e as seringas separados ente si, inclusive as pérolas de vidro eventualmente nelas contidas são acondicionados dentro de uma película Melag com campo indicador (Melag, Melafol 1502) que é soldada (Melag, Melaseal). As seringas deste modo acondicionadas são secadas em estufa de secagem (Melag-Trockensterilisator) a 80°C durante pelo menos 60 minutos. As seringas acondicionadas secas são em seguida esterilizadas em autoclave a 132°C durante um período de 30 min a 2 x 105 Pa (Wolf Autoclav HRM 242 II) e mais uma vez secas a 80°C durante um período de pelo menos 60 minutos.

[038] Antes da coleta de sangue (veja abaixo) introduz-se heparina (Liquemin N 2500, heparina-sódio 2500 I.E.) ou citrato (ACDA) na seringa, a fim de se impedir a coagulação do sangue que será mais tarde coletado. O emprego de coagulantes pode ter vantagens durante a preparação de soro contendo IL-lRa.

[039] É empregada a seringa 1, sendo o sangue de um paciente é coletado com a ajuda de um adaptador não ilustrado que liga a tampa 7 aparafusável através de um tubo não ilustrado com uma cânula não ilustrada. 0 adaptador apresenta uma agulha com a qual é perfurado o septo existente na peça de fecho 13. Em seguida a adaptador é retirado e é conduzida uma incubação do sangue integral a 37°C durante 24 horas sob a proteção da tampa removível 7, cujo septo se fecha automaticamente. A incubação pode se produzir na posição vertical ou horizontal. Se a incubação se processar na posição vertical, o plasma é retirado através do septo e de um filtro adicional esterilizado (0,2 μπι) . Além disso, ou como uma alternativa, pode ser prevista uma centrifugação. Se a incubação se produzir na posição horizontal, o sangue é centrifugado e o plasma é extraído através de um filtro adicional esterilizado (0,2 μπι) . Pode, no entanto, também ser previsto fazer-se com que o plasma seja extraído através do septo sem se conduzir uma centrifugação. Em seguida, o plasma é reinjetado em uma raiz de nervo ou em uma articulação do paciente.

[040] Exemplo 2: Produção e Emprego de uma Seringa de Material Sintético com Granulado [041] Neste Exemplo é empregado um granulado esterilizado constituído por poliestireno, vidro ou um outro material modificável e/ou esterilizável. A superfície do granulado é modificada com a ajuda de um preparado de ácido cromo-sulfúrico disponível no comércio, em um processo descontínuo, tal como descrito no exemplo 1. Em seguida o granulado é lavado com água, a fim de eliminar os resíduos do ácido cromo-sulfúrico. Em seguida o granulado é incubado a 121°C sob uma pressão de 2 x 105 Pa durante um período de pelo menos 20 minutos, a fim de esterilizar o granulado e satura-se com água. 0 granulado é em seguida seco a 80°C durante 20 minutos.

[042] Uma seringa de polipropileno convencional não modificada, direta do fabricante e na embalagem original (50 ml, Becton Dickinson, Heidelberg, art. número 00137) foi preenchida com o granulado modificado e esterilizado (1, 2, 4, ou 10 cm3) e também com uma quantidade suficiente de um anti-coagulante tal como heparina (liquemin, heparina-sódio 2500 I.E.) ou citrato (ACDA, por exemplo).

[043] A seringa cheia é acondicionada inclusive com a cânula de extração e o tubo e é submetida em seguida a esterilização por raios γ ou por elétrons.

[044] O usuário retira o estojo esterilizado e coleta o sangue do paciente. A seringa dispõe na sua abertura na peça de fecho de um septo, que é perfurado para a retirada através dos acessórios de coleta, portanto pela agulha do adaptador. Depois da retirada do adaptador o septo se fecha automaticamente novamente. Depois da coleta de sangue, o êmbolo da seringa é quebrado no seu ponto de ruptura.

[045] A seringa com o sangue é incubada durante 24 horas a uma temperatura de 37°C a 41°C. a) Se a incubação se processa na posição vertical, o plasma é retirado através do septo e de um filtro adicional esterilizado, de 0,2 μπι, por exemplo. b) Se a incubação se processa na posição horizontal, depois da centrifugação da seringa o plasma é extraído através de um filtro adicional filtrado, de 0,2 μπι, por exemplo.

[046] A reinjeção do plasma se produz, por exemplo, em uma raiz nervosa, na junta ou no disco vertebral.

[047] Exemplo 3: Produção e Emprego de uma Seringa sem Granulado [048] Uma seringa direta do fabricante, na embalagem original fabricada de um material modificável e esterilizável (5, 10, 20 ou 50 ml) é modificada com ácido cromo-sulfúrico, conforme exposto no exemplo 1, e em seguida esterilizada em autoclave e seca. É preferível que a seringa seja constituída de vidro, poliestireno ou de um outro material especial modificável.

[049] A seringa modificada e esterilizada é preenchida com uma quantidade suficiente de heparina (Liquemin, heparina-sódio 2.500 I. E.) ou citrato (ACDA).

[050] A seringa cheia inclusive a cânula de extração e o tubo são em seguida esterilizado por raios γ ou por elétrons.

[051] 0 usuário retira o estojo esterilizado e coleta o sangue do paciente. A seringa tem na abertura um septo contido na peça de fecho e que para a retirada é perfurado pelo equipamento de coleta, portanto por um adaptador contendo uma agulha. Depois da retirada do adaptador o septo se fecha automaticamente de novo. Depois da coleta de sangue o embolo da seringa é quebrado no seu ponto de ruptura.

[052] A seringa com o sangue é incubada durante 24 horas a uma temperatura de 37°C a 41°C. a) Se a incubação se produzir na posição vertical (em um suporte de provetas, por exemplo), o plasma é extraído através do septo produzindo-se uma filtração no caso através de um filtro adicional esterilizado, tendo por exemplo 0,2 μπι. b) Se a incubação se produzir na posição horizontal, depois da centrifugação da seringa, o plasma é extraído através do septo, produzindo-se durante este processo uma filtração através de um filtro adicional, tendo por exemplo 0,2 μπι.

[053] A reinjeção do plasma se produz, por exemplo, em uma raiz de nervo ou uma articulação ou no disco da coluna vertebral.

[054] Exemplo 4: Produção do Antagonista do Receptor de Interleucina-1 em uma Seringa com o Emprego de Heparina [055] Uma seringa disponível no comércio direta do fabricante e na embalagem original, constituída de vidro, foi preenchida com ácido cromo-sulfúrico, e foi incubada durante 20 minutos à temperatura ambiente, conforme indicado no Exemplo 1. Em seguida a seringa foi enxaguada com água destilada quatro vezes, acondicionada, esterilizada em autoclave durante 30 minutos a uma temperatura de 131°C sob uma pressão de 2 x 105 Pa e seca durante 30 minutos a 100°C.

[056] Depois da conclusão da modificação e esterilização a seringa foi armazenada. Aplicou-se na seringa como anticoagulante heparina liberada como medicamento (Liquemin, heparina-sódio 2500 I.E.).

[057] Em seguida sangue venoso é extraído de modo esterilizado do paciente com a seringa revestida.

[058] A seringa é incubada à temperatura ambiente durante 12 a 72 horas. Durante este período de tempo ocorre no sangue um intenso aumento de proteínas contidas no plasma, especialmente do antagonista do receptor de interleucina-1. Pôde ser determinada uma concentração de 1 a 50 ng/ml do antagonista do receptor de interleucina-1.

[059] Em seguida o sangue ou o plasma é injetado no paciente com a seringa revestida.

[060] Exemplo 5: Produção do Antagonista do Receptor de Interleucina-1 em uma Seringa sem emprego de Heparina [061] Uma seringa disponível no comércio, direta do fabricante e na embalagem original, de vidro, foi preenchida com ácido cromo-sulfúrico e incubada durante 2o minutos à temperatura ambiente, tal como indicado no Exemplo 1. Em seguida a seringa foi quatro vezes lavada com água destilada, acondicionada, esterilizada em autoclave durante 30 minutos a 131°C sob uma pressão de 2 x 105 Pa e 30 min seca a 100°C.

[062] Depois da conclusão da modificação e esterilização, a seringa foi armazenada.

[063] Em seguida extrai-se esterilmente sangue venoso do paciente com a seringa.

[064] A seringa foi incubada à temperatura ambiente durante 12 a 72 horas. Durante este período de tempo ocorre no plasma sangüíneo um intenso aumento das proteínas contidas no plasma, especialmente do antagonista do receptor de interleucia-1. Pôde ser observada uma concentração de 1 a 50 ng/ml do antagonista do receptor de interleucina-1.

[065] Em seguida o sangue diluído ou o resíduo de cultura injetado ao paciente.

[066] Exemplo 6: Produção do IL-lRa em uma Placa de Microtitulação de Poliestireno com Granulado.

[067] Para a preparação do granulado, o granulado direto do fabricante e na embalagem original é modificado em processo descontínuo com a ajuda de um preparado de ácido cromo-sulfúrico disponível no comércio, sendo o granulado levado a um recipiente (tal como por exemplo um copo de vidro XXX de 250 ml) ao qual é adicionado um preparado de ácido cromo-sulfúrico a 50% (Merck, Darmstadt, Best. Número. 1.02499.2500, o ácido cromo-sulfúrico foi diluído com Reinstwasser Ultra Pure Water No. L 0040 de Biochrom Biochrom até a diluição desejada) , sendo o granulado tratado, sendo durante o processo limpo, mais exatamente modificado. O granulado é incubado durante um período de 5 a 60 minutos com o ácido cromo-sulfúrico.

[068] Em seguida, o ácido cromo-sulfúrico é eliminado e as esferas são bem lavadas de duas a dez vezes com Reinstwasser fresca. Lava-se até um ponto em que na penúltima etapa de lavagem o pH e o valor da Reinstwasser e da água de lavagem coincidem.

[069] Em seguida o granulado em um copo de vidro (em um copo de vidro XXX de 250 ml, por exemplo) é esterilizado em autoclave a 132°C durante 30 minutos a uma pressão de 2 x 105 Pa, (Wolf Autoclav HRM 242 II) e seco a uma temperatura de 60°C a 100°C, de preferência a 80°C durante 30 minutos. Alternativamente o granulado pode ser diretamente esterilizado por calor a uma temperatura de 120°C a 210°C, de preferência a 180°C durante 30 minutos (Melag-Trockensterilisator).

[070] Para a coleta do sangue foram utilizados: Monovettes Sarstedt com EDTA, citrato, CPDA, CPDM ou heparina, a fim de impedir uma coagulação do sangue posteriormente coletado.

[071] 3 a 12 pérolas de vidro foram acrescentadas a cada uma das cavidades de uma placa de microtitulação (Nunc, Art. Número. 150.687), 1 ml de sangue acrescentado o mais rapidamente possível depois da coleta.

[072] Depois de 24 horas de incubação (37°C, CO2 a 5 %) (Incubador Hereaus): De um dia para o outro sedimentou-se o bolo sangüíneo, 300 μΐ de soro são coletadas sem se agitar ou levantar os componente sólidos e determina-se a concentração de proteínas IL-lRa (ELISA, R&D, Wiesbaden, Quantikine Human IL-lRa).

[073] Figura 2: Produção de IL-lRa em uma seringa de vidro com e sem vidro granulado.

Processos [074] Produção de IL-lRa: Emprego de uma seringa de vidro conforme descrito no exemplo 1. Medições em um paciente.

[075] Esferas de vidro: Roth, tratadas com ácido cromo-sulfúrico e esterilizadas.

[076] RLW: Valor vazio de reação, concentração de IL-lRa na ocasião da coleta (antes da produção de IL-lRa).

Resultado [077] O acréscimo do vidro granulado aumenta a produção de IL-lRa.

[078] Figura 3: Produção de IL-lRa em uma seringa de vidro com e sem anti-coagulante Processos [079] Produção de IL-lRa: Emprego de uma seringa de vidro, conforme descrito no Exemplo 1, medições em um paciente.

[080] Esferas de vidro: Roth, tratadas com ácido cromo-sulfúrico, lavadas e esterilizadas em autoclave.

[081] CPDM: Citrato Fosfato Dextrose Manose [082] CPDA: Citrato Fosfato Dextrose Adenina Resultado [083] O acréscimo de diferentes anti-coagulantes influi na eficácia da produção de IL-lRa em diferentes medidas.

[084] Figura 4: Produção de IL-lRa em uma placa de microtitulação com e sem anti-coagulante Processos [085] Produção de IL-lRa: Emprego de uma placa de microtitulação conforme descrito no Exemplo 6, medições em um paciente.

[086] Esferas de vidro: Duran, tratadas com ácido cromo-sulfúrico, lavadas e esterilizadas em autoclave. Foram adicionadas 12 esferas a 1 ml de sangue integral.

[087] RLW: Valor vazio de reação, concentração de IL-lRa na ocasião da coleta (antes da produção de IL-lRa).

Resultado [088] O acréscimo de diferentes anti-coagulantes influi na eficácia da produção de IL-lRa em diferentes medidas.

[089] Figura 5: Produção de IL-lRa em uma seringa de vidro ou de material sintético com vidro granulado em um grupo de pacientes Processos [090] Produção de IL-lRa: Emprego de uma seringa de vidro, conforme descrito no Exemplo 1 e 2, medições em um grupo de pacientes ortopédicos.

[091] Esferas de vidro: Roth, tratadas com o ácido cromo-sulfúrico, lavadas e esterilizadas em autoclave.

Resultado [092] Tanto em uma seringa de vidro como de material sintético pode ser produzido IL-lRa, no entanto o grau de eficácia da produção de IL-lRa em uma seringa de vidro é consideravelmente mais alto.

[093] Figura 6: Produção de IL-lRa em uma seringa de vidro com e sem vidro granulado em um grupo de pacientes Processos [094] Produção de IL-lRa: Emprego de uma seringa de vidro, conforme descrito no Exemplo 1, medições em um grupo de pacientes ortopédicos.

[095] Esferas de vidro: Roth, tratadas com ácido cromo-sulfúrico, lavadas e esterilizadas em autoclave.

Resultado [096] Tanto com o vidro granulado como sem ele pode ser produzido o IL-lRa em uma seringa de vidro, no entanto o grau de eficácia da produção de IL-lRa com vidro granulado é consideravelmente mais alto.

[097] Figura 7: Produção de IL-lRa em uma seringa de vidro com e sem vidro granulado e com e sem heparina em um grupo de pacientes.

Processos [098] Produção de IL-lRa: Emprego de uma seringa de vidro, conforme descrito no Exemplo 1, medições em um gruo de pacientes ortopédicos.

[099] Esferas de vidro: Roth, tratadas com ácido cromo-sulfúrico, lavadas e esterilizadas em autoclave.

Resultado [100] Tanto com o vidro granulado como sem ele e tanto com heparina ou sem ela, pode ser produzido IL-lRa em uma seringa de vidro, no entanto o grau de eficácia da produção de IL-lRa com vidro granulado e sem heparina é consideravelmente mais alto.

[101] Figura 8: Produção de proteínas com o emprego de uma seringa de vidro com vidro granulado em um grupo de pacientes Processos [102] Produção de proteínas: Emprego de uma seringa de vidro, conforme descrito no Exemplo 1, medições em um grupo de pacientes ortopédicos.

[103] Esferas de vidro: Roth, tratadas com ácido cromo-sulfúrico, lavadas e esterilizadas em autoclave.

[104] TNFa: Fator de Necrose de Tumor alfa.

[105] IL-6: Interleucina-6.

[106] ELISA: As concentrações de IL-1, TNFa e IL-6 foram determinadas com um Kombo-Kit de R&D.

Resultado [107] Pelos processos descritos é produzido especificamente IL-lRa. A produção de TNF-α e de IL-6 não pôde ser determinada. Em quantidades pequenas pode ser também produzida a IL-Ιβ. Como a relação IL-lRa : IL-Ιβ, que segundo as expectativas para um efeito clínico terapêutico do IL-lRa produzido deve ser superior a 100 (W.P. Arend et al.r 1998, Annu. Rev. Immo. 16m 27 - 5), se encontra em média em 148, o IL-lRa autólogo produzido tem valor terapêutico.

[108] Figura 9: Produção de IL-lRa com o emprego de uma placa de microtitulação com quantidades variáveis de vidro granulado e a diversas concentrações sangüineas Processos [109] Produção de IL-lRa: Emprego de uma placa de microtitulação, conforme descrito no Exemplo 6. No entanto não foi acrescentado 1 ml de sangue integral heparinizado, mas acrescentou-se uma quantidade de sangue integral heparinizado, até o volume final ter atingido 1 ml.

[110] Esferas de vidro: Duran, tratadas com ácido cromo-sulfúrico, lavadas e esterilizadas em autoclave.

[111] 3, 9, 12 = Acréscimo de 3, 9 ou 12 esferas.

[112] lx, 2x, 4x = sangue integral heparinizado diluído lx, 2x ou 4x com RPMI 1640.

[113] RLW: Valor vazio de reação, concentração de IL-lRa na ocasião da coleta (antes da produção de IL-lRa) em sangue não diluído.

Resultado [114] A cada diluição de sangue, a elevação da quantidade de vidro granulado leva a um aumento da produção de IL-lRa. Um máximo para a produção de IL-lRa é determinado pela relação entre o número de esferas e quantidades de sangue, mais exatamente entre a superfície de vidro e o número de células sangüineas.

[115] Figura 10: Produção de IL-lRa com o emprego de uma placa de microtitulação com quantidades variáveis de vidro granulado e dois tipos de vidro granulado Processos [116] Produção de IL-lRa: Emprego de uma placa de microtitulação, conforme descrito no Exemplo 6.

[117] Esferas de vidro: Duran ou Worf, tratadas com ácido cromo-sulfúrico, lavadas e esterilizadas em autoclave.

[118] 3, 9, 12 = Acréscimo de 3, 9 ou 12 esferas [119] RLW: Valor vazio de reação, concentração de IL-lRa na ocasião da coleta (antes da produção de IL-lRa).

Resultado [120] Tanto o aumento do número de esferas, mais exatamente da superfície de vidro no caso de vidro de cálcio e soda (Worf, por exemplo) como também no caso de vidro de boro-silicato (Duran, por exemplo) , leva a um aumento na produção de IL-1R.

[121] Figura 11: Produção de IL-lRa com o emprego de uma placa de microtitulação com quantidades variáveis de vidro granulado e dois tipos de vidro granulado.

Processos [122] Produção de IL-lRa: Emprego de uma placa de microtitulação, conforme descrito no exemplo 6.

[123] Esferas de vidro: Duran, tratadas com ácido cromo-sulfúrico, lavadas e esterilizadas em autoclave.

[124] RLW: Valor vazio de reação, concentração de IL-lRa na ocasião da coleta (antes da produção de IL-lRa) em sangue não diluído [125] Corundo: AI2O3 alfa, Suspensão [126] Quartzo: Areia de quartzo, 220 mg/m [127] Vidro em pó: 0,2 mg/ml Resultado [128] O acréscimo de óxidos de silicatos ou óxidos de alumínio, que são componentes dos vidros granulados descritos (veja dados técnicos dos vidros granulados), na forma de corundo ou de areia de quartzo leva a um aumento na produção de IL-lRa.

[129] Figura 12: Produção de IL-lRa com o emprego de uma variedade de materiais para recipientes.

Processos [130] Produção de IL-lRa: Emprego de uma placa de microtitulação, conforme descrito no Exemplo 6.

[131] Esferas de vidro: Duran, tratadas com ácido cromo-sulfúrico, lavadas e esterilizadas em autoclave.

[132] RLW: Valor vazio de reação, concentração de IL-lRa na ocasião da coleta (antes da produção de IL-lRa) em sangue não diluído.

[133] PS: Poliestireno, placa de microtitulação (Firma Nunc, Art. Nr. 150687) [134] PP: Polipropileno, provetas (Firma Sarsted, Art. Nr 62/554.502 [135] Vidro: proveta disponível no comércio, esterilizada por autoclave.

Resultado [136] O IL-lRa pode ser produzido tanto em recipientes de vidro como de material sintético, no entanto o grau de eficácia da produção de IL-lRa em recipientes de vidro é consideravelmente mais alto.

[137] Figura 13: pH na água de lavagem depois de tratamento com ácido cromo-sulfúrico do vidro granulado.

Processos [138] Esferas de vidro: Todas as esferas relacionadas foram tratadas com ácido cromo-sulfúrico, sendo o pH determinado por meio de um medidor de pH depois de cada etapa de lavagem. Empregou-se para a lavagem Reinstwasser (Reinstwasser Art. Nr. L 0040 de Biochrom), pH entre 6,0 e 6,5.

Resultado [139] Depois do tratamento com ácido cromo- sulfúrico puderam ser eliminados de todas as esferas todos os resíduos de ácido.

[140] Figura 14: Condutância na água de lavagem depois do tratamento do vidro granulado· com ácido cromo-sulfúrico.

Processos [141] Esferas de vidro: Todas as esferas relacionadas foram tratadas com ácido cromo-sulfúrico, sendo em seguida determinado por meio de um medidor de condutância, depois de cada etapa de lavagem, a condutância da água de lavagem. Empregou-se para a lavagem Reinstwasser (Reinstwasser Art. Nr. L 0040 de Biochrom), condutância 0μ5.

Resultado [142] Depois do tratamento com o ácido cromo-sulfúrico e lavagem não pôde ser determinado para nenhuma das esferas descritas nenhuma água de lavagem. Portanto fica excluída a possibilidade de indução de IL-lRa por águas de lavagem de efeito pirogênico.

[143] Dados Técnicos do Vidro Granulado 1.1 Roth 1.2 SiLi 5506/89-6 1.3 SiLi 5004/99-5 1.4 Worf 1.5 Duraη LEGENDAS DE FIGURAS Figura 2 ohne Glasgranulat = sem vidro granulado mit Glasgranulat = com vidro granulado Figura 3 ohne Anti-Coagulanz = sem anti-coagulante mit Heparin = com heparina mit CPDM = com CPDM

mit CPDA = com CPDA

Figura 4 Standardfehler = Erro padrão EDTA mit Kugelm = EDTA com esferas citrat = citrato citrat mit Kugeln = citrato com esferas heparin = heparina Heparin mit Kugeln = heparina com esferas Figura 5 Standadtfehler = Erro padrão Glasspritze = seringa de vidro Kunststoffspritze = seringa de material sintético Figura 6 Standadtfehler = Erro padrão ohne Granulat = sem Granulado mit Granulat = com granulado Figura 7 Standadtfehler = Erro padrão mit Glasgranulat, ohne Heparin = com vidro granulado sem heparina mit Glasgranulat, mit Heparin = com vidro granulado, com heparina mit Glasgranulat, mit Heparin = sem vidro ranulado, com heparina Figura 8 Standadtfehler = Erro padrão Figura 11 Standadtfehler = Erro padrão Korund = corundo quartz = quartzo glasmehl = vidro em pó Figura 12 Standardtabweichung = desvio padrão Figura 13, 14 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. Waschschritt = la. 2a. 3a. 4a. 5a. 6a. 7a. 8a. Etapa de Lavagem Leitwert = Condutância REIVINDICAÇÕES

Claims

1. Processo para a produção de IL-lRa em uma seringa para uso como um medicamento caracterizado pelo fato de que a seringa é preenchida com sangue de um organismo, incubada e, em seguida, o IL-lRa é formado no sangue.

2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a seringa envolvida no processo é constituída de vidro, material sintético, coríndon e/ou quartzo ou contém este(s) material (is).

3. Processo, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o material sintético consiste em poliestireno, cloreto de polivinila, polietileno ou polipropileno.

4. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a seringa envolvida no processo apresenta uma estrutura interna modificada.

5. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a seringa envolvida no processo apresenta uma estrutura interna modificada por um agente cáustico.

6. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a seringa envolvida no processo apresenta uma estrutura interna sem modificação.

7. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que a estrutura interna da seringa envolvida no processo é formada por sua superfície interna, especialmente por deformações, que aumentam a superfície.

8. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a estrutura interna é formada por pérolas, esferas, géis, lã, pó, granulado ou partículas de vidro, material sintético, coríndon e/ou quartzo.

9. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 8, caracterizado pelo fato de que a estrutura interna é constituída por poliestireno, cloreto de polivinila, polietileno, polipropileno ou os contém.

10. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que o agente cáustico consiste em uma lixívia ou em um ácido, especialmente ácido cromo-sulfúrico.