BR122021025251B1 - Uso in vitro ou ex vivo de, pelo menos, um mirna, método in vitro ou ex vivo para rastreamento de um derivado de quinolina e método de avaliar e seguir a eficácia de um composto de fórmula (i) - Google Patents

Abstract

A presente invenção se refere a um composto de fórmula (I) em que: significa um anel aromático em que V é C ou N e quando V é N; Q é N ou O, desde que R não exista quando Q é O; R? representa, independentemente, um átomo de hidrogênio ou um grupo escolhido entre um grupo alquila (C1-C3), um átomo de halogênio, um grupo hidroxila, um grupo - COOR1, um grupo -NO2, um grupo - NR1R2, um grupo morfolinila ou um grupo morfolino, um grupo N-metilpiperazinila, um fluoroalquila (C1C3), um grupo OP(=O)(OR3)(OR4), um grupo alcoxi (C1-C4) e um grupo -CN, e pode ainda ser um grupo escolhido entre: (IIa) (IIb) ou qualquer um de um seu sal farmaceuticamente aceitável, para utilização no tratamento e / ou prevenção de uma doença inflamatória.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[0001] A invenção presente se refere à identificação de novos derivados de quinolina que são eficientes para tratar e / ou prevenir doenças inflamatórias, bem como novas utilizações terapêuticas do derivado de quinolina para doenças inflamatórias.

[0002] A invenção também se refere ao campo de biomarcadores com referência a tais doenças inflamatórias.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0003] Uma inflamação é uma resposta protetora do sistema imune a danos nos tecidos e a uma infecção. No entanto, a resposta inflamatória, em algumas circunstâncias, pode danificar o corpo. Na fase aguda, a inflamação é caracterizada por dor, calor, vermelhidão, inchaço e perda de função. Há uma ampla faixa de condições inflamatórias que afetam milhões de pessoas em todo o mundo.

[0004] De fato, as doenças inflamatórias incluem uma ampla faixa de condições, incluindo uma doença inflamatória associada a uma doença autoimune, a uma doença inflamatória do sistema nervoso central (SNC), a uma doença inflamatória das articulações, a uma doença inflamatória do trato digestivo e a uma inflamação de pele. Entre eles, a Doença Inflamatória do Intestino, a Artrite Reumatóide e aEsclerose Múltipla são de particular interesse.

[0005] A Doença Inflamatória Intestinal (IBD) é uma doença multifatorial complexa (Perse e Cerar, 2012). Ela comumente se refere à colite ulcerativa (UC) e à doença de Crohn (CD), as duas condições crônicas que envolvem inflamação do intestino. A IBD é comum em países desenvolvidos, com até 1 em cada 200 indivíduos da região do norte da Europa afetados por essas doenças. Pacientes com IBD apresentam vários problemas clinicamente desafiadores para os médicos. A colite induzida por DSS está associada à regulação positiva de diferentes citocinas pró-inflamatórias incluindo TNFalfa e IFNgama. Recentemente, o miR-124 demonstrou ser desregulado especificamente em doentes pediátricos com UC ativa, levando a níveis aumentados de transdutor e ativador da expressão da transcrição 3 (STAT3) e à ativação transcricional dos seus alvos a jusante, entre os quais as citoquinas pró-inflamatórias (Koukos Et al., Gastroenterology, 145 (4): 842-52: 2013). No entanto, apesar dos avanços recentes, continua a ser necessária uma terapia segura, bem tolerada com um início rápido e com uma capacidade aumentada para manter a remissão a longo prazo.

[0006] A artrite reumatóide (AR) é a doença auto-imune mais comum com uma prevalência de cerca de 0,3 a 1% da população mundial e, muitas vezes, é associada com mobilidade reduzida, aumento da dependência social e deficiência de trabalho. A AR é uma doença inflamatória sistêmica que afeta o tecido do revestimento articular chamado sinóvia. O tecido sinovial reumatóide é caracterizado por hiper-proliferação de sinoviócitos semelhantes a fibroblastos (FLS) na camada de revestimento intimal e infiltração do sublinhado por macrófagos, células T e B e outras células inflamatórias que promovem inflamação e destruição de osso e cartilagem. A expressão intraarticular e sistêmica de citoquinas pró-inflamatórias, em particular do fator alfa de necrose tumoral (TNF α), interleucina-1 (IL-1) e interleucina-6 (IL-6), que são produzidos principalmente por macrófagos sinoviais, apresentam um papel crucial na patogênese da AR, por exemplo, contribuindo para a hiper-proliferação de FLs de AR. Os pacientes com AR são tratados, em geral, com um grupo de pequenos fármacos moleculares chamados fármacos antirreumáticos modificadores de doença (DMARDs). Os DMARD suprimem os sistemas imunes e / ou inflamatórios do corpo de algum modo, retardando assim a progressão da doença. Os doentes com AR que não respondem aos DMARDs são tratados com agentes biológicos tais como antagonistas do Fator de Necrose Tumoral (TNF). No entanto, apesar de os antagonistas do TNF serem eficazes em cerca de dois terços dos pacientes, os pacientes que respondem frequentemente se tornam não responsivos dentro de cinco anos. Portanto, tratamentos alternativos são necessários. Notavelmente, existe um interesse particular para novas abordagens terapêuticas concebidas para pacientes com AR em fases iniciais, antes que a doença se torne crônica.

[0007] A esclerose múltipla (EM) é uma doença auto-imune inflamatória, doenças desmielinizantes do sistema nervoso central que destrói a mielina, oligodendrócitos e axónios. MS é caracterizada por múltiplos focos de inflamação e infiltração de macrófagos e células T encefalitogênicas no sistema nervoso central. Microglias são encontrados em todo o sistema nervoso central e participam no início e progressão de respostas inflamatórias do SNC. A microglia, quando ativada, é altamente prejudicial para a função do SNC através da sua produção de neurotoxinas, células inflamatórias (Proteína Inflamatória-10, Proteína-1 Inflamatória de Macrófagos, Proteína-2 Inflamatória de Macrófagos, Ligoc 19 de Quimiocina de CC, Proteína Quemoatratora de Monócitos 1, Proteína Quemoatratora de Monócitos-2) e células imunes que produzem anticorpos. Microglias direcionam respostas inflamatórias que podem resultar no cérebro e medula espinhal sendo infiltrado com células imunes contra invasores estrangeiros, bem como células T que destroem proteínas mielina. Os macrófagos periféricos aparecem no SNC durante a inflamação e estas células têm um fenótipo altamente ativado, estimulam eficientemente a expansão das células T encefalitogênicas e pensa-se que contribuem para a destruição do tecido neuronal.

[0008] MicroRNAs (miRNA), o grupo não codificante mais abrangente, são uma classe de cerca de 22 RNAs NT não codificadoras que inibem a expressão de genes através de ligação à região não traduzida (UTR) de transcritos de RNAm alvo (Lai et al., Nature Genetics, vol. 30, n ° 4, pp 363-364, 2002; Bartel et al, Cell, vol 136, n ° 2, pp 215-233, 2009). Genes miRNA representam cerca de 1 a 2% dos genomas eucarióticos conhecidos. As previsões sugerem que cada miRNA pode atingir mais de 200 transcritos e que um mRNA único pode ser regulado por vários miRNAs (LINDOW, DNA Cell Biol., Vol. 26 (5), p.333-351, 2007). Os miRNAs são gerados a partir de transcritos endógenos em forma de "hairpin" e atuam por pares de bases com mRNAs alvo, o que conduz à clivagem de mRNA ou repressão translacional, dependendo do grau de emparelhamento de bases. Dois eventos de processamento conduzem à formação de miRNA maduro: primeiro, os transcritos de miRNA nascente (pri-miRNA) são processados em 70 nucleotídeos precursores (pre-miRNA) que são exportados do núcleo e são clivados no citoplasma para gerar miRNAs curtos (cerca de 22 nucleotídeos Longos) maduros (LEE, EMBO J., vol. 21, p, 4663-4670, 2002). Os miRNAs podem ser localizados intra ou intragenicamente. Quando intergênicos, sua expressão é coordenada com outros miRNAs como um cluster (Altuvia et al., Nucleic Acids Research, vol. 33, n. 8, pp. 2697-2706, 2005, Ozsolak et al., Genes and Development, vol. 22, No. 22, pgs 3172-3183, 2008). Quando intragênicos, isto é, posicionados no interior do gene (quase exclusivamente em íntrons), eles são muitas vezes expressos a partir do mesmo fio como seu hospedeiro-gene (Liu et al., Cell Research, vol. 18, no. 10, pp. 985-996, 2008, Kim et al., EMBO Journal, vol. 26, no. 3, pp. 775-783, 2007) e em níveis correlacionados (Baskerville et al., RNS, vol. 11, n. ° 3 , Pp. 241-247, 2005).

[0009] Foi agora demonstrado que a sobreexpressão de um miRNA, nomeadamente miR-124, desativa macrófagos inflamatórios e os converte em células semelhantes a microglia. Acredita-se que miR-124 inibe a ativação de macrófagos por direcionamento de CEBPα, um fator de transcrição responsável pela diferenciação de células de linhagem mielóide. A injeção intravenosa de lipossomas contendo miR-124 suprime acentuadamente os sintomas clínicos de EAE e inibe a infiltração de células T encefalitogênicas e de macrófagos inflamatórios no SNC.

[0010] Com efeito, Ponomarev et al. ("microRNA-124 promotes microglia quiescence and suppresses EAE by deactivating macrophages via the C/EBP-α-PU.1 pathway”; Nature Medicine (2011); 17:1: 64-71) sugerem que o miR-124 poderia desempenhar um papel como regulador chave da quiescência da microglia e como um modulador da ativação de monócitos e macrófagos. Com base num modelo experimental de encefalomielite auto-imune (EAE), este estudo sugere que o padrão de expressão de miR-124 é modulado (regulado ou regulado para baixo dependendo do tipo de célula) em camundongos com EAE.

[0011] O documento WO2010 / 151755 também ensina a administração de miR- 124 para o tratamento de uma doença inflamatória do sistema nervoso central (SNC).

[0012] Sun et al. ("microRNA-124 mediates the cholinergic anti-inflammatory action through inhibiting the production of pro-inflammatory cytokines”; Cell Research (2013); 23:1270-1283) também ensinam que miR-124 pode mediar uma ação anti- inflamatória colinérgica através de STAT3 e TACE.

[0013] Por outro lado, os novos compostos, também aqui referidos como "derivados de quinolina" foram identificados, mas para indicações distintas.

[0014] Para referência, uma quinolina é um composto orgânico aromático heterocíclico de fórmula:

[0015] Assim,"derivados" de quinolinas incluem quinolinas substituídas, tais como quinolinas mono- ou polissubstituídas.

[0016] O documento WO2010 / 143170 descreve a utilização de compostos para o tratamento de condições associadas com o envelhecimento prematuro.

[0017] Os documentos WO2010 / 143169 e WO2012 / 080953 ensinam a utilização de compostos para o tratamento de AIDS.

[0018] O documento WO2010 / 143168 descreve a utilização de compostos para o tratamento de uma variedade de cânceres. Estes compostos demonstraram ser capazes de corrigir defeitos de splicing alternativo.

SUMARIO DA INVENÇÃO

[0019] Verificou-se agora que os compostos como definidos na fórmula (I) daqui em diante são úteis no tratamento e / ou prevenção de doenças inflamatórias.

[0020] A presente invenção refere-se, portanto, a compostos de fórmula (I), tal como definidos abaixo, para utilização no tratamento e / ou prevenção de uma doença inflamatória.

[0021] Em particular, a invenção refere-se a compostos de fórmula (I), tal como definidos abaixo, para utilização no tratamento e / ou prevenção de inflamação e / ou inflamação que podem ocorrer juntamente com tais doenças inflamatórias.

[0022] A invenção também se refere a uma in vitro ou a utilização ex vivo de, pelo menos, um miRNS, o referido pelo menos um miRNA sendo o miR-124, como um biomarcador para o rastreamento, um derivado de quinolina, e em particular um composto de fórmula (I), que se presume ser eficaz no tratamento e / ou na prevenção de uma doença inflamatória.

[0023] A invenção refere-se ainda a um composto de fórmula (Id) ou (Ie) como definido a seguir como tal.

[0024] A invenção refere-se ainda a uma composição farmacêutica compreendendo pelo menos um composto de fórmula (Id) ou (Ie).

[0025] Também se refere a um composto como tal, selecionado numa lista que consiste em: - (8) 8-cloro-5- (3- (piperidin-1-il) propoxi) -N- (4- (trifluorometil) piridin-2- il) quinolin-2-amina - (9) 8-cloro-N 4 - (3- (piperidin-1-il) propil) -N 2 - (4- (trifluorometil) piridin- 2-il) quinolina-2,4-diamina - (10) 8-cloro-N-metil-N- (4- (trifluorometil) piridin-2-il) quinolin-2-amina - (11) 8-cloro-N 4 - (2-morfolinoetil) -N 2 - (4- (trifluorometil) piridin-2-il) quinolina-2,4-diamina - (13) 4,8-dicloro-N- (4- (trifluorometil) piridin-2-il) quinolin-2-amina - (14) 8-cloro-N- (3-morfolinopropil) -N- (4- (trifluorometil) piridin-2-il) quinolin-2-amina - (15) 8-cloro-6- (2-morfolinoetoxi) -N- (3-morfolinopropil) -N- (4- (trifluorometil) piridin-2-il) quinolin-2-amina - (16) 8-cloro-5- (2-morfolinoetoxi) -N- (3-morfolinopropil) -N- (4- (trifluorometil) piridin-2-il) quinolin-2-amina - (17) 8-cloro-6- (2- (4-metilpiperazin-1-il) etoxi) -N- (4- (trifluorometil) piridin-2- il) quinolin-2-amina - (18) 8-cloro-6- (2- (piperidin-1-il) etoxi) -N- (4- (trifluorometil) piridin-2-il) quinolin-2-amina - (19) 8-cloro-6- (3- (piperidin-1-il) propoxi) -N- (4- (trifluorometil) piridin-2- il) quinolin-2-amina - (20) 8-cloro-N- (3-fluoro-4- (trifluorometil) piridin-2-il) quinolin-2-amina - (21) N- (5-bromo-4- (trifluorometil) piridin-2-il) -8-cloroquinolin-2-amina - (22) N 2 - (8-cloroquinolin-2-il) -N 5 - (3- (4-metilpiperazin-1-il) propil) -4- (trifluorometil) piridina-2,5-diamina - (28) 8-cloro-N-metil-N- (4- (trifluorometoxi) fenil) quinolin-2-amina - (29) 8-cloro-5- (3- (piperidin-1-il) propoxi) -N- (4- (trifluorometoxi) fenil) quinolin-2-amina - (30) 8-cloro-N- (3- (piperidin-1-il) propil) -N- (4- (trifluorometoxi) fenil) quinolin-2-amina - (31) 8-cloro-N- (2-morfolinoetil) -N- (4- (trifluorometoxi) fenil) quinolin-2- amina - (32) 8-cloro-N- (2- (pirrolidin-1-il) etil) -N- (4- (trifluorometoxi) fenil) quinolin-2-amina - (33) 8-cloro-N- (4-morf olinobutil) -N- (4- (trifluorometoxi) fenil) quinolin- 2-amina - (34) 8-cloro-N 4 - (3- (piperidin-1-il) propil) -N 2 - (4- (trifluorometoxi) fenil) -quinolina-2,4-diamina - (35) 4,8-dicloro-N- (4- (trifluorometoxi) fenil) quinolin-2-amina - (36) 8-cloro-5- (2-morfolinoetoxi) -N- (4- (trifluorometoxi) fenil) quinolin- 2-amina - (37) N 1 - (4,8-dicloroquinolin-2-il) -4- (trifluorometoxi) benzeno-1,2- diamina - (38) 4,8-dicloro-N- (2-morfolinoetil) -N- (4- (trifluorometoxi) fenil) quinolin-2-amina - (39) 8-cloro-6- (2-morfolinoetoxi) -N- (4- (trifluorometoxi) fenil) quinolin- 2-amina - (40) 8-cloro-N 2 - (2-morfolinoetil) -N 4 - (3- (piperidin-1-il) propil) -N 2 - (4- (trifluorometoxi) fenil) quinolina-2,4- Diamina - (41) 8-cloro-N- (2-morfolinoetil) -N- (2-nitro-4- (trifluorometoxi) fenil) quinolin-2-amina - (42) N 1 - (8-cloroquinolin-2-il) -N 1 - (2-morfolinoetil) -4- (trifluorometoxi) benzeno-1,2-diamina - (43) 8-cloro-5- (2-morfolinoetoxi) -N- (2-morfolinoetil) -N- (4- (trifluorometoxi) fenil) quinolin-2-amina - (44) N 1 - (8-cloro-5- (2-morfolinoetoxi) quinolin-2-il) -4- (trifluorometoxi) benzeno-1,2-diamina - (46) 8-cloro-2 - ((4- (trifluorometil) piridin-2-il) oxi) quinolina - (47) 4- (2 - ((8-cloro-2 - ((4- (trifluorometil) piridin-2-il) oxi) quinolin-6-il) oxi) etil) morfolina - (48) 8-cloro-2- (4- (trifluorometoxi) fenoxi) quinolina - (49) 4- (2 - ((8-cloro-2- (4- (trifluorometoxi) fenoxi) quinolin-6-il) oxi) etil) morfolina - (50) 4- (2 - ((8-cloro-2- (4- (trifluorometoxi) fenoxi) quinolin-5-il) oxi) etil) morfolina - (51) ácido mono- [8-cloro-2- (4-trifluorometil-piridin-2-ilamino) -quinolin- 6-il] fosfórico - (52) éster de ácido mono- [2- (8-cloro-quinolin-2-ilamino) -5- trifluorometoxi-fenil] fosfórico - (53) éster de ácido mono- [8-cloro-2- (4-trifluorometoxi-fenilamino) - quinolin-6-il] fosfórico - e aos seus sais farmaceuticamente aceitáveis, e mais particularmente selecionado entre os compostos (8), (9); (10); (11); (30); (46); (47); (48); (49) e (50) tal como definido acima ou um dos seus sais farmacêuticos.

[0026] Também se refere a uma composição farmacêutica compreendendo pelo menos um composto de fórmula (Id) ou (Ie), ou um dos compostos (8), (9), (10), (11), (13), (14), (15), (16), (17), (18), (19), (20), (21), (22), (28), (29), (30), (31) ), (34), (35), (36), (37), (38), (39), (40), (41), (42), (43), (44), (47), (48), (49), (50), (51), (52) e (53) e mais particularmente um dos compostos (8), (9), (10), (11), (30), (46), (47), (48), (49) e (50) como definidos acima.

[0027] A invenção refere-se ainda a um método in vitro ou ex vivo para aumentar a expressão de miR-124 em uma célula eucariótica, compreendendo pelo menos uma etapa de: a) proporcionar uma célula eucariótica, b) colocar em contato a referida célula com um derivado de quinolina, e em particular um composto de fórmula (I).

[0028] A invenção refere-se ainda a um método in vitro ou ex vivo para rastreamento de um composto derivado, e em particular um composto de fórmula (I), presume eficazes no tratamento e / ou prevenção de uma doença inflamatória, que compreende pelo menos uma etapa de: a) proporcionar uma célula eucariótica, b) colocar em contato a referida célula com um composto de fórmula (I), c) medir uma expressão de miR-124 na referida célula, e d) selecionar o candidato presumivelmente eficaz no tratamento e / ou na prevenção de uma doença inflamatória quando o nível de expressão de miR-124 medido na etapa c) é aumentado relativamente a um valor de referência.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0029] Figura 1: Modelo de colite induzida por sulfato de dextrano e sódio (DSS) 1 - Variação da percentagem de perda de peso ao longo do tempo (dias), num modelo DSS-camundongo, na presença de composto derivado de quinolina (24) tal como definido a seguir. A percentagem de perda de peso (%) é indicada no eixo y. O tratamento com DSS ocorre nos dias 3 a 10 (eixo x). A gavagem com um derivado de quinolina em metilcelulose (MC), ou MC apenas, ocorre entre os dias 3 a 29.

[0030] Figura 2 - Variação da percentagem de perda de peso ao longo do tempo (dias), num modelo DSS-camundongo, após um segundo ciclo de DSS na presença de composto derivado de quinolina (24) tal como definido a seguir. A percentagem de perda de peso (%) é indicada no eixo y. O tratamento com DSS começou no dia 12 durante um período de 5 dias (eixo x). A gavagem com um derivado de quinolina em metilcelulose (MC), ou MC apenas, ocorre entre os dias 3 a 29.

[0031] Figura 3: Modelo de colite induzida por sulfato de dextrano e sódio (DSS-) - Dois pontos foram removidos 2 a 3 dias após um segundo tratamento com DSS (durante 5 dias) e da variação do tamanho do cólon (cm) foi medida. (ns) marca uma diferença não-estatisticamente significante. A análise estatística foi realizada com o teste de Mann-Whitney, o asterisco indica diferença significativa (p <0,5), dois asteriscos indicam diferença significativa (p <0,05).

[0032] Figura 4: Modelo de colite induzida por sulfato de dextrano e sódio (DSS-) Dois pontos foram removidos em 3 dias sobre um segundo tratamento de DSS e analisados para obter os números de lesão. As lesões foram observadas ao microscópio e medidas.

[0033] Figura 5: Modelo de colite induzida por sulfato de dextrano e sódio (DSS-) Dois pontos foram removidos em 3 dias após um segundo tratamento DSS e a área de lesão (mm 2)) foi determinada.

[0034] Figura 6: Modelo de artrite induzida por colágeno - Variação do inchaço das articulações (mm) ao longo do tempo (semanas) num corte médio de 10 indivíduos. O inchaço das juntas (mm) é indicado no eixo y. A variação entre os grupos não tratado vs tratados é avaliada ao longo de 12 semanas.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0035] Existe uma necessidade de se identificar novos compostos para utilização no tratamento e / ou prevenção de uma doença inflamatória.

[0036] Existe também a necessidade de um novo biomarcador para avaliar a atividade de fármacos candidatos, tais como derivados de quinolina para doenças inflamatórias.

[0037] A presente invenção tem por objetivo satisfazer estas necessidades.

[0038] Derivados de quinolina

[0039] De acordo com um primeiro aspecto, o objeto da presente invenção refere- se à utilização de um composto de fórmula (I):

[0040] em que:

[0041] Z é C ou N,

[0042] V é C ou N,

[0043] significa um anel aromático em que V é C ou N e quando V é N, V está em orto, meta ou para de Z, isto é, forma respectivamente um grupo piridina, piridazina, pirimidina ou pirazina,

[0044] R representa, independentemente, um átomo de hidrogênio, um átomo de halogênio ou um grupo escolhido entre um grupo -CN, um grupo hidroxila, um grupo -COOR 1, um grupo (C1-C3) fluoroalquila, um grupo (C1-C3) fluoroalcoxi , um grupo (C3C6) cicloalquila, um grupo -NO2, um grupo -NR1R2, um grupo (C1-C4) alcoxi, um grupo fenoxi, um grupo -NR1-SO2-NR1R2, um grupo -NR1-SO2-R1, um grupo -NR1-C(=O)-R1, um grupo -NR1-C(=O)-NR1R2, um grupo -SO2-NR1R2, um grupo -SO3H, um grupo -O- SO2, um grupo -(OR3), um grupo -OP(=O)-(OR3)(OR4), um grupo -OCH2-COOR3 e um grupo (C1-C3) alquila, sendo o referido alquila opcionalmente mono-substituído por um grupo hidroxila,

[0045] Q é N ou O, desde que R'' não exista quando Q é O,

[0046] R1 e R2 são, independentemente, um átomo de hidrogênio ou um grupo (C1-C3) alquila,

[0047] R3 e R4 representam, independentemente, um átomo de hidrogênio, Li +, Na +, K +, N(Ra)4+ ou um grupo benzila,

[0048] N é 1, 2 ou 3,

[0049] N‘ é 1, 2 ou 3,

[0050] R’ representa, independentemente, um átomo de hidrogênio ou um grupo escolhido entre um (C1-C3) alquila, um átomo de halogênio, um grupo hidroxila, um grupo -COOR1, um grupo -NO2, um grupo -NR1R2, um grupo morfolinila ou um grupo morfolino, um grupo N-metilpiperazinila, um grupo (C1-C3) fluoroalquila, um grupo (C1C4) alcoxi, um grupo -OP(=O)- (OR3)(OR4) e um grupo -CN, e pode ainda ser um grupo escolhido entre:

[0051] A é uma ligação covalente, um átomo de oxigênio ou NH,

[0052] B é uma ligação covalente ou NH,

[0053] m é 1, 2, 3, 4 ou 5,

[0054] p é 1, 2 ou 3,

[0055] Ra e Rb representam, independentemente, um átomo de hidrogênio, um grupo (C1-C5) alquila ou um grupo (C3-C6) cicloalquila,

[0056] Ra e Rb podem ainda formar em conjunto com o átomo de nitrogênio ao qual estão ligados um heterociclo saturado de 5 ou 6 membros contendo opcionalmente um outro heteroátomo escolhido entre N, O e S, sendo o referido heterociclo opcionalmente substituído por um ou mais Ra, em que quando R’ é um grupo (IIa) ou (IIIa), n' pode ser 2 ou 3 apenas se outros grupos R’ forem diferentes dos referidos grupos (IIa) ou (IIIa),

[0057] R'' é um átomo de hidrogênio, um grupo (C1-C4) alquila, ou é um grupo (IIa), tal como definido acima,

[0058] ou qualquer um dos seus sais farmaceuticamente aceitáveis,

[0059] no tratamento e / ou na prevenção de uma doença inflamatória.

[0060] De acordo com uma forma de realização preferida, Q é N.

[0061] De acordo com outra forma de realização preferida, n é 1 ou 2.

[0062] De acordo com outra forma de realização preferida, n’ é 1 ou 2.

[0063] De acordo com uma outra forma de realização preferida, R'' é um átomo de hidrogênio, um grupo alquila ou um grupo em que m é 2 ou 3 e X1 representa O, CH2 ou N-CH3.

[0064] De acordo com uma outra forma de realização preferida, R representa, independentemente, um átomo de hidrogênio, um grupo metila, um grupo metoxi, um grupo trifluorometila, um grupo trifluorometoxi, um grupo amino, um átomo de halogênio e um grupo -OP(=O)- (OR3)(OR4) e, mais particularmente, um átomo de flúor ou cloro, um grupo trifluorometoxila e um grupo amino.

[0065] De acordo com uma outra forma de realização preferida, R’ representa, independentemente, um átomo de hidrogênio, um átomo de halogênio e mais particularmente um átomo de flúor ou cloro, um grupo amino, um grupo metila, um grupo -OP(=O)-(OR3)(OR4) ou grupo em que A é O ou NH, m é 2 ou 3 e X1 representa O, CH2 ou N-CH3, desde que quando R’ é um tal grupo, n' é 1 ou 2, e quando n’ é 2 , o outro grupo R’ é diferente do referido grupo.

[0066] De acordo com um aspecto da referida forma de realização preferida, R’ representa, alternativamente, independentemente, um átomo de hidrogênio, um átomo de halogênio e mais particularmente um átomo de flúor ou cloro, um grupo metila ou um grupo em que A é O ou NH, m é 2 e Xi representa O, CH2 ou N-CH3, desde que quando R’ é um tal grupo, n' é 1 ou 2, e quando n’ é 2, o outro grupo R’ é diferente do referido grupo.

[0067] Todas as formas de realização particulares anteriores e seguintes podem naturalmente ser combinadas em conjunto e fazem parte da invenção.

[0068] Os compostos de fórmula (I) incluem compostos de fórmula (Ia), (Ib), (Ic), (Id) e (Ie), como aqui definido abaixo.

[0069] De acordo com uma modalidade particular, outro objeto da presente invenção é a utilização de um composto de fórmula (Ia)

[0070] Em que R, R', R'', n e n' são como definidos acima,

[0071] no tratamento e / ou na prevenção de uma doença inflamatória.

[0072] De acordo com um aspecto da referida forma de realização preferida, n é 1 ou 2.

[0073] De acordo com um aspecto da referida forma de realização preferida, n’ é 1 ou 2.

[0074] De acordo com um dos aspectos da referida forma de realização preferida, R representam independentemente um átomo de hidrogênio, um átomo de halogênio ou um grupo escolhido entre um grupo hidroxila, um grupo fluoroalquila (C1-C3), um grupo fluoroalcoxi (C1-C3), um grupo -NR1R2, um grupo (C1-C4) alcoxi e um grupo (C1C3) alquila.

[0075] De acordo com um dos aspectos da referida forma de realização preferida, R’ representa, independentemente, um átomo de hidrogênio, um átomo de halogênio ou um grupo escolhido entre um grupo (C1-C3) alquila, um grupo hidroxila, um grupo - OP(=O)-(OR3)(OR4), um grupo -NR1R2, ou um grupo em que A é O ou NH, m é 2 ou 3 e X 1 representa O, CH2 ou N-CH3, desde que quando R’ é um tal grupo, n' é 1 ou 2 e quando n’ é 2, o outro grupo R’ é diferente do referido grupo.

[0076] De acordo com um dos aspectos da referida forma de realização, R'' preferido é um átomo de hidrogênio, um grupo (C1-C4) alquila ou um grupo em que m é 2 ou 3 e Xi representa O, CH2 ou N-CH3 e, de preferência, R” é um átomo de hidrogênio ou um grupo metila.

[0077] De acordo com uma modalidade particular, outro objeto da presente invenção é a utilização de um composto de fórmula (Ib)

[0078] em que R, R', R'', n e n' são como definidos acima,

[0079] no tratamento e / ou na prevenção de uma doença inflamatória.

[0080] De acordo com um aspecto da referida forma de realização preferida, n é 1 ou 2.

[0081] De acordo com um aspecto da referida modalidade preferida, n’ é 1, 2 ou 3.

[0082] De acordo com um dos aspectos da referida forma de realização preferida, R representam independentemente um átomo de hidrogênio, um átomo de halogênio ou um grupo escolhido entre um grupo hidroxila, um grupo um grupo fluoroalquila (C1C3), um grupo fluoroalcoxi (C1-C3), um grupo -NR1R2, um grupo (C1-C4) alcoxi, grupo -OP(=O)-(OR3)(OR4), e um grupo (C1-C3) alquila.

[0083] De acordo com um dos aspectos da referida forma de realização preferida, R 'representam, independentemente, um átomo de hidrogênio, um átomo de halogênio ou um grupo escolhido entre um grupo (C1-C3) alquila, um grupo hidroxila, um grupo -OP(=O)-(OR3)(OR4), um grupo -NR1R2 ou um grupo em que A é O ou NH, m é 2 ou 3 e X 1 representa O, CH2 ou N-CH3, desde que quando R’ é um tal grupo, n' é 1 ou 2, e quando n’ é 2, o outro grupo R’ é diferente do referido grupo.

[0084] De acordo com um dos aspectos da referida forma de realização preferida, R', alternativamente, representa, independentemente, um átomo de hidrogênio, um átomo de halogênio ou um grupo escolhido entre um (C1-C3) alquila, um grupo hidroxila ou um grupo -NR1R2.

[0085] De acordo com um dos aspectos da referida forma de realização, R'' preferido é um átomo de hidrogênio, um grupo (C1-C4) alquila ou um grupo em que m é 2 ou 3 e XI representa O, CH2 ou N-CH3 e, de preferência, R” é um átomo de hidrogênio ou um grupo metila.

[0086] De acordo com uma modalidade particular, outro objeto da presente invenção é a utilização de um composto de fórmula (Ic)

[0087] em que R, R', R'', n e n' são como definidos acima,

[0088] no tratamento e / ou na prevenção de uma doença inflamatória.

[0089] De acordo com um aspecto da referida forma de realização preferida, n é 1.

[0090] De acordo com um aspecto da dita modalidade preferida, n’ é 1.

[0091] De acordo com um dos aspectos da referida forma de realização preferida, R representam independentemente um átomo de hidrogênio, um átomo de halogênio ou um grupo escolhido entre um grupo hidroxila, um grupo fluoroalquila (C1-C3), um grupo fluoroalcoxi (C1-C3), um grupo -NR1R2, um grupo (C1-C4) alcoxi e um grupo (C1C3) alquila.

[0092] De acordo com um aspecto da dita modalidade preferida, R representa, alternativamente, independentemente um átomo de hidrogênio ou um átomo de halogênio.

[0093] De acordo com um dos aspectos da referida forma de realização preferida, R’ representa, independentemente, um átomo de hidrogênio, um átomo de halogênio ou um grupo escolhido entre um (C1-C3) alquila, um grupo hidroxila, um grupo -NR1R2 ou um grupo , em que A é O ou NH, m é 2 ou 3 e Xi representa O, CH2 ou N-CH3, desde que quando R’ é um tal grupo, n' é 1 ou 2 e quando n’ é 2, o outro grupo R’ é diferente do referido grupo.

[0094] De acordo com um aspecto da referida forma de realização preferida, R’ representa, alternativamente, independentemente um átomo de hidrogênio ou um átomo de halogênio.

[0095] De acordo com um dos aspectos da referida forma de realização, R'' preferido é um átomo de hidrogênio, um grupo (C1-C4) alquila ou um grupo em que m é 2 ou 3 e Xi representa O, CH2 ou N-CH3 e de preferência R” é um átomo de hidrogênio ou um grupo metila.

[0096] De acordo com uma modalidade particular, outro objeto da presente invenção é a utilização de um composto de fórmula (Id)

[0097] em que R, R', n e n' são como definidos acima,

[0098] no tratamento e / ou na prevenção de uma doença inflamatória.

[0099] De acordo com um aspecto da referida forma de realização preferida, n é 1.

[00100] De acordo com um aspecto da dita modalidade preferida, n’ é 1.

[00101] De acordo com um dos aspectos da referida forma de realização preferida, R representa, independentemente, um átomo de hidrogênio, um átomo de halogênio ou um grupo escolhido entre um grupo hidroxila, um grupo fluoroalquila (C1-C3), um grupo fluoroalcoxi (C1-C3), um grupo -NR1R2, um grupo (C1-C4) alcoxi e um grupo (C1C3) alquila.

[00102] De acordo com um aspecto da forma de realização o referido preferida, R, alternativamente, representa, independentemente, um átomo de hidrogênio, um grupo (C1-C3) fluoroalquila, um grupo (C1-C3) fluoroalcoxi ou um átomo de halogênio.

[00103] De acordo com um dos aspectos da referida forma de realização preferida, R’ representa, independentemente, um átomo de hidrogênio, um átomo de halogênio ou um grupo escolhido entre um grupo (C1-C3) alquila, um grupo hidroxila, um grupo - NRi R2, ou um grupo em que A é O ou NH, m é 2 ou 3 e X1 representa O, CH2 ou N-CH3, desde que quando R’ é um tal grupo, n' é 1 ou 2 e quando n’ é 2, o outro grupo R’ é diferente do referido grupo.

[00104] De acordo com um aspecto da referida forma de realização preferida, R’ representa, alternativamente, independentemente um átomo de hidrogênio ou um átomo de halogênio.

[00105] De acordo com um dos aspectos da referida forma de realização, R'' preferido é um átomo de hidrogênio, um grupo (C1-C4) alquila ou um grupo em que m é 2 ou 3 e Xi representa O, CH2 ou N-CH3 e, de preferência, R” é um átomo de hidrogênio ou um grupo metila.

[00106] De acordo com uma modalidade particular, outro objeto da presente invenção é a utilização de um composto de fórmula (Ie)

[00107] em que R, R', n e n' são como definidos acima,

[00108] no tratamento e / ou na prevenção de uma doença inflamatória.

[00109] De acordo com um aspecto da referida forma de realização preferida, n é 1.

[00110] De acordo com um aspecto da dita modalidade preferida, n’ é 1.

[00111] De acordo com um dos aspectos da referida forma de realização preferida, R representa, independentemente, um átomo de hidrogênio, um átomo de halogênio ou um grupo escolhido entre um grupo hidroxila, um grupo fluoroalquila (C1-C3), um grupo fluoroalcoxi (C1-C3), um grupo -NR1R2, um grupo (C1-C4) alcoxi e um grupo (C1C3) alquila.

[00112] De acordo com um aspecto da forma de realização o referido preferida, R, alternativamente, representa, independentemente, um átomo de hidrogênio, um grupo (C1-C3) fluoroalquila, um grupo (C1-C3) fluoroalcoxi ou um átomo de halogênio.

[00113] De acordo com um dos aspectos da referida forma de realização preferida, R’ representa, independentemente, um átomo de hidrogênio, um átomo de halogênio ou um grupo escolhido entre um grupo (C1-C3) alquila, um grupo hidroxila, um grupo - NRi R2, ou um grupo em que A é O ou NH, m é 2 ou 3 e X1 representa O, CH2 ou N-CH3, desde que quando R’ é um tal grupo, n' é 1 ou 2 e quando n’ é 2, o outro grupo R’ é diferente do referido grupo.

[00114] De acordo com um aspecto da referida forma de realização preferida, R’ representa, alternativamente, independentemente, um átomo de hidrogênio ou um átomo de halogênio.

[00115] De acordo com um dos aspectos da referida forma de realização, R'' preferido é um átomo de hidrogênio, um grupo (C1-C4) alquila ou um grupo em que m é 2 ou 3 e Xi representa O, CH2 ou N-CH3 e de preferência R "é um átomo de hidrogênio ou um grupo metila.

[00116] De acordo com outra modalidade particular, os compostos (Id) e (Ie) como definidos acima, como tal, também fazem parte da presente invenção.

[00117] De acordo com uma forma de realização preferida da presente invenção, alguns compostos de fórmula (I) são novos, fazem parte da presente invenção e são escolhidos entre (com o número sendo encontrado na tabela 1 a seguir): - (8) 8-cloro-5- (3- (piperidin-1-il) propoxi) - N - (4- (trifluorometil) piridin-2- il) quinolin-2-amina - (9) N-cloro- 4 8 - (3- (piperidin-1-il) propil) - N 2 - (4- (trifluorometil) piridin- 2-il) quinolina-2,4-diamina - (10) 8-cloro-N-metil-N - (4- (trifluorometil) piridin-2-il) quinolin-2-amina - (11) 8-cloro-N 4 - (2-morfolinoetil) - N 2 - (4- (trifluorometil) piridin-2-il) quinolina-2,4-diamina - N (13) 4,8-dicloro- - (4- (trifluorometil) piridin-2-il) quinolin-2-amina - (14) 8-cloro-N - (3-morfolinopropil) - N - (4- (trifluorometil) piridin-2-il) quinolin-2-amina - (15) 8-cloro-6- (2-morfolinoetoxi) - N - (3-morfolinopropil) - N - (4- (trifluorometil) piridin-2-il) quinolin-2-amina - (16) 8-cloro-5- (2-morf olinoetoxi) - N - (3-morfolinopropil) - N - (4- (trifluorometil) piridin-2-il) quinolin-2-amina - (17) 8-cloro-6- (2- (4-metilpiperazin-1-il) etoxi) - N - (4- (trifluorometil) piridin-2-il) quinolin-2-amina - (18) 8-cloro-6- (2- (piperidin-1-il) etoxi) - N - (4- (trifluorometil) piridin-2- il) quinolin-2-amina - (19) 8-cloro-6- (3- (piperidin-1-il) propoxi) - N - (4- (trifluorometil) piridin- 2-il) quinolin-2-amina - (20) 8-cloro- N - (3-fluoro-4- (trifluorometil) piridin-2-il) quinolin-2-amina - (21) N - (5-bromo-4- (trifluorometil) piridin-2-il) -8-cloroquinolin-2-amina - (22) N 2 - (8-cloroquinolin-2-il) - N 5 - (3- (4-metilpiperazin-1-il) propil) -4- (trifluorometil) piridina-2,5-diamina - (28) 8-cloro- N -metil- N - (4- (trifluorometoxi) fenil) -quinolin-2-amina - (29) 8-cloro-5- (3- (piperidin-1-il) propoxi) - N - (4- (trifluorometoxi) fenil) -quinolin-2-amina - (30) 8-cloro- N - (3- (piperidin-1-il) propil) - N - (4- (trifluorometoxi) fenil) -quinolin-2-amina - (31) 8-cloro- N - (2-morfolinoetil) - N - (4- (trifluorometoxi) fenil) -quinolin- 2-amina - (32) 8-cloro- N - (2- (pirrolidin-1-il) etil) - N - (4- (trifluorometoxi) fenil) - quinolin-2-amina - (33) 8-cloro- N - (4-morfolinobutila) - N - (4- (trifluorometoxi) fenil) - quinolin-2-amina - (34) 8-cloro- N 4 - (3- (piperidin-1-il) propil) - N 2 - (4- (trifluorometoxi) fenil) -quinolina-2,4-diamina - (35) 4,8-dicloro- N - (4- (trifluorometoxi) fenil) -quinolin-2-amina - (36) 8-cloro-5- (2-morf olinoetoxi) - N - (4- (trifluorometoxi) fenil) - quinolin-2-amina - (37) N 1 - (4,8-dicloroquinolin-2-il) -4- (trifluorometoxi) benzeno-1,2- diamina - (38) 4,8-dicloro- N - (2-morfolinoetil) - N - (4- (trifluorometoxi) fenil) - quinolin-2-amina - (39) 8-cloro-6- (2-morfolinoetoxi) - N - (4- (trifluorometoxi) fenil) -quinolin- 2-amina - (40) 8-cloro- N 2 - (2-morfolinoetil) - N 4 - (3- (piperidin-1-il) propil) - N 2 - (4- (trifluorometoxi) fenil) quinolina-2,4- diamina - (41) 8-cloro- N - (2-morfolinoetil) - N - (2-nitro-4- (trifluorometoxi) fenil) - quinolin-2-amina - (42) N 1 - (8-cloroquinolin-2-il) - N 1 - (2-morfolinoetil) -4- (trifluorometoxi) benzeno-1,2-diamina - (43) 8-cloro-5- (2-morf olinoetoxi) - N - (2-morfolinoetil) - N - (4- (trifluorometoxi) fenil) -quinolin-2-amina - (44) N 1 - (8-cloro-5- (2-morfolinoetoxi) quinolin-2-il) -4- (trifluorometoxi) benzeno-1,2-diamina - (46) 8-cloro-2 - ((4- (trifluorometil) piridin-2-il) oxi) quinolina - (47) 4- (2 - ((8-cloro-2 - ((4- (trifluorometil) piridin-2-il) oxi) quinolin-6-il) oxi) etil) morfolina - (48) 8-cloro-2- (4- (trifluorometoxi) fenoxi) quinolina - (49) 4- (2 - ((8-cloro-2- (4- (trifluorometoxi) fenoxi) quinolin-6-il) oxi) etil) morfolina - (50) 4- (2 - ((8-cloro-2- (4- (trifluorometoxi) fenoxi) quinolin-5-il) oxi) etil) morfolina - (51) Éster de ácido mono- [8-cloro-2- (4-trifluorometil-piridin-2-ilamino) - quinolin-il-6] fosfórico - (52) Éster de ácido mono- [2- (8-cloro-quinolin-2-ilamino) -5- trifluorometoxi-fenil] fosfórico - (53) Éster de ácido mono- [8-cloro-2- (4-trifluorometoxi-fenilamino) - quinolin-il-6] fosfórico - e os seus sais farmaceuticamente aceitáveis.

[00118] Para a finalidade da presente invenção, um composto de fórmula (I), inclui qualquer um dos compostos de fórmula (Ia), (Ib), (Ic), (Id) e (Ie), bem como combinações dos mesmos. Os compostos de fórmula (I) incluem os compostos (1) a (53), tal como definidas na tabela 1, e as suas combinações.

[00119] Os compostos da invenção podem existir na forma de bases livres ou de sais de adição com ácidos farmaceuticamente aceitáveis.

[00120] Os sais de adição de ácido fisiologicamente aceitáveis adequados dos compostos de fórmula (I) incluem bromidrato, tartarato, citrato, trifluoroacetato, ascorbato, cloridrato, tartarato, triflato, maleato, mesilato, formato, acetato e fumarato.

[00121] Os compostos de fórmula (I) e ou os seus sais podem formar solvatos ou hidratos e a invenção inclui todos esses solvatos e hidratos.

[00122] Os termos "hidratos" e "solvatos" significam simplesmente que os compostos (I) de acordo com a invenção pode ser sob a forma de um hidrato ou solvato, ou seja, combinado ou associado com um ou mais moléculas de solvente ou de água. Esta é apenas uma característica química de tais compostos, que podem ser aplicados para todos os compostos orgânicos deste tipo.

[00123] Os compostos de fórmula (I) podem compreender um ou mais átomos de carbono assimétricos. Eles podem, assim, existir na forma de enantiômeros ou de diastereoisômeros. Estes enantiômeros, diastereoisômeros e suas misturas, incluindo as misturas racêmicas, estão abrangidas no âmbito da presente invenção.

[00124] No contexto da presente invenção, o termo: - "Halogênio" é entendido como significando cloro, flúor, bromo, ou iodo, e em particular significa cloro, flúor ou bromo, - "(C1-C5) alquila" como aqui utilizado refere-se respectivamente a um hidrocarboneto saturado normal, secundário ou terciário de C1-C5. Os exemplos são, mas não estão limitados a, metila, etila, 1-propila, 2- propila, butila, pentila, - "(C3-C6) cicloalquila", tal como aqui utilizado, refere-se respectivamente a hidrocarbonetos saturados cíclicos. Os exemplos são, mas não estão limitados a ciclopropila, ciclobutila, ciclopentila, ciclo-hexila, - "(C1-C4) alcoxi", tal como aqui utilizado, refere-se respectivamente a um radical alquila (C1-C4), em que o termo alquila é como definido acima. Os exemplos são, mas não estão limitados a, metoxi, etoxi, 1-propoxi, 2-propoxi, butoxi, - "Grupo fluoroalquila" e “grupo fluoroalcoxila" refere-se, respectivamente, a um grupo alquila e um grupo alcoxi como definido acima, os referidos grupos sendo substituídos por pelo menos um átomo de flúor. Exemplos são grupos perfluoroalquila tais como trifluorometila ou perfluoropropila, - "Heterociclo saturado de 5 ou 6 membros", tal como aqui utilizado refere-se respectivamente a um ciclo saturado compreendendo, pelo menos, um heteroátomo. Os exemplos são, mas não estão limitados a, morfolina, piperazina, tiomorfolina, piperidina, pirrolidina, - "Paciente" pode estender-se a seres humanos ou mamíferos, tais como gatos ou cães.

[00125] Os compostos de fórmula (I) que são adequados para a invenção podem ser preparados tal como descrito nos documentos WO2010 / 143170 , WO2010 / 143169 , WO2012 / 080953 e WO2010 / 143168 , e / ou como aqui descrito mais abaixo.

[00126] Mais particularmente, os compostos de fórmula (I) em que R’ representa um grupo escolhido entre:

[00127] tal como definido acima, podem ser preparados de acordo com vias sintéticas, tal como descrito no documento WO2012 / 080953, mais particularmente quando A é O.

[00128] Quando A é N, a rota sintética a seguir pode ser implementada. Um derivado de quinolina de fórmula (VII) pode ser sintetizado como um bloco de construção, antes de reações de acoplamento cruzado adicionais.

[00129] A fim de obter o referido composto de fórmula (VII), a seguinte sequência de reações pode ser efetuada como mostrado no Esquema 1 abaixo.

[00130] Esquema 1 - composto de fórmula (II), em que R’ é diferente de H e é como acima definido e pode ser em particular um átomo de cloro, pode ser colocado na piridina, o composto de fórmula (III) pode então ser adicionado numa proporção molar variando de 1 a 2, por exemplo 1,5, com respeito ao composto de fórmula (II). A mistura reacional pode ser agitada a uma temperatura no intervalo de 110 a 150 °C, por exemplo a 130 °C, durante um tempo variando de 8 horas a 18 horas, por exemplo 14 horas. Após resfriamento até temperatura ambiente, a mistura reacional pode ser concentrada sob pressão reduzida e o resíduo resultante pode ser diluído com um solvente orgânico, tal como diclorometano. A fase orgânica pode então ser lavada com uma solução aquosa saturada de uma base inorgânica, tal como Na2CO3 , seca sobre MgSO4, filtrada e concentrada sob pressão reduzida para se obter um composto de fórmula (IV). - composto de fórmula (IV) pode ser colocado numa mistura de THF / água, hidróxido de sódio pode então ser adicionado numa proporção molar que varia de 1 a 1,5, por exemplo 1,2, com respeito ao composto de fórmula (IV), e a mistura reacional pode ser agitada em temperatura ambiente durante um tempo que varia de 8 horas a 18 horas, por exemplo 14 horas. Ácido clorídrico concentrado, em seguida, pode ser adicionado até atingir um pH de 2, e a solução resultante pode ser extraído com um solvente orgânico tal como acetato de etila. A fase orgânica pode então ser seca sobre MgSO4, filtrada e concentrada sob pressão reduzida para se obter um composto de fórmula (V). - composto de fórmula (V) pode ser colocado em ácido polifosfórico, adicionado numa razão molar que varia de 5 a 15, por exemplo 10, com respeito ao composto de fórmula (V), e a mistura reacional pode ser agitada a uma temperatura variando de 110 a 150 °C, por exemplo a 130 °C, durante um tempo variando de 8 horas a 18 horas, por exemplo 14 horas. Após resfriamento até temperatura ambiente, uma solução aquosa de hidróxido de sódio com uma molaridade na faixa de 1 a 5 M, por exemplo 2M, pode ser lentamente adicionada. O precipitado resultante pode ser filtrado, lavado com água e seco sob pressão reduzida num dessecador para dar um composto de fórmula (VI). - composto de fórmula (VI) pode ser colocado em POCl3, adicionado numa razão molar que varia de 5 a 15, por exemplo 10, com respeito ao composto de fórmula (VI), e a mistura reacional pode ser agitada a uma temperatura variando de 80 a 120 °C, por exemplo a 100 °C, durante um tempo que varia entre 1 hora e 5 horas, por exemplo 2 horas. Após resfriamento até temperatura ambiente, água pode ser lentamente adicionada. O precipitado resultante pode ser filtrado, lavado com água e seco sob pressão reduzida num dessecador para dar um composto de fórmula (VII). - referido composto intermediário de fórmula (VII) pode ser utilizado para formar um composto de fórmula (I) por acoplamento cruzado com um derivado de anilina, um derivado de aminopiridina, um derivado de pirimidina, um derivado de hidroxipiridina, um derivado de fenol ou um derivado de hidroxipirimidina, tal como descrito nos documentos WO2010 / 143170, WO2010 / 143169, WO2012 / 080953 e WO2010 / 143168 e / ou como aqui descrito mais abaixo. - cloro na posição 4 do composto intermediário de fórmula (VII) podem em seguida ser substituídos por uma amina para formar um derivado de quinolina possuindo um grupo de fórmula (II-A) com A = NH.

[00131] Quando Q = N e R'' é diferente de H, as seguintes rotas, ilustradas nos esquemas 2 e 3 , podem ser implementadas.

[00132] A fim de se obter os compostos de fórmula (IX), a seguinte reação pode ser levada a cabo como mostrado no Esquema 2 abaixo.

[00133] Esquema 2 • composto de fórmula (VIII), em que Z, V, N, N', R e R' são como definidos acima, pode ser colocado num solvente polar anidro tal como o anidro de N, N -dimetilformamida na presença de AklHal, caracterizado pelo fato de que Alk representa um grupo (C1-C4)alquila e Hal representa um átomo de halogênio, em uma proporção molar que varia de 1 a 2, por exemplo 1, 1, e na presença de uma base inorgânica tal como hidróxido de potássio terc -butóxido de um molar proporção que varia de 1 a 2, por exemplo 1, 1, com respeito ao composto de fórmula (VIII). A mistura de reação pode ser agitada em temperatura ambiente durante um tempo que varia desde 7 horas a 24 horas, por exemplo 16 horas. A mistura reacional pode ser particionada entre água e um solvente orgânico tal como acetato de etila. As fases orgânicas pode então ser recolhidas, lavadas com uma solução aquosa saturada de salmoura, secas sobre MgSO4, filtradas e concentradas sob pressão reduzida para se obter um composto de fórmula (IX).

[00134] A fim de se obter os compostos de fórmula (XII), a seguinte reação pode ser levada a cabo como mostrado no Esquema 3 abaixo.

[00135] Esquema 3 • composto de fórmula (X), em que Z, V, N, N', R e R' são como definidos acima, pode ser colocado num solvente polar anidro tal como o anidro de N, N -dimetilformamida na presença de NaH numa razão molar varia de 2 a 5, por exemplo 3, e a mistura reacional pode ser agitada em temperatura ambiente durante um tempo que varia desde 10 minutos até 50 minutos, por exemplo 30 minutos. O composto de fórmula (XI), em que m, B, Ra e Rb são como definidos acima, pode então ser colocado, numa proporção molar que varia de 1 a 2, por exemplo 1, num solvente polar anidro tal como o anidro de N, N -dimetilformamida na presença de Kl em uma proporção molar que varia de 1 a 2, por exemplo 1, e na presença de uma base orgânica tal como Et3N, em uma proporção molar que varia de 1 a 2, por exemplo 1, com a relativamente ao composto de fórmula (X), e a mistura reacional pode ser agitada à temperatura ambiente durante um tempo que varia desde 10 minutos até 50 minutos, por exemplo 30 minutos, sob uma atmosfera inerte de gás, por exemplo de argônio. O composto ativado (X) pode, em seguida, adicionado ao composto (XI) e a mistura reacional resultante pode ser agitada a uma temperatura variando de 70 °C, durante um tempo que varia desde exemplo, 4 horas. Após resfriamento até mistura reacional pode ser concentrada resíduo resultante pode ser diluído com um solvente orgânico tal como acetato de etila. A fase orgânica pode então ser lavada com uma solução aquosa saturada de salmoura, seca sobre MgSO4, filtrada e concentrada sob pressão reduzida para se obter um composto de fórmula (XII).

[00136] Quando o grupo carrega uma substituição ser um grupo amino de fórmula geral (Ha), em que A é NH, a rota a seguir pode ser implementada, como no Esquema 4 .

[00137] Esquema 4 • composto de fórmula (XIII), em que Z, V, N', R e R' são como definidos acima e X é um átomo de halogênio tal como Br, pode ser colocado numa mistura de solventes polar, tal como uma mistura de dioxano / N, N-dimetilformamida. Um composto de fórmula (XIV), em que B, Ra e Rb sejam tal como definidos acima, é então adicionado numa proporção molar que varia de 1 a 2, por exemplo 1,5, com respeito ao composto de fórmula (XIII), na presença de uma base orgânica não nucleofílica, tal como sódio terc -butóxido ou potássio terc -butóxido, numa proporção molar que varia de 2 a 5, por exemplo 3, na presença de uma difosfina, tais como Xantfos (4, 5-bis (difenilfosfino) -9,9-dimetilxanteno) ou X-fos (2-diciclo-hexilfosfino-2', 4', 6'-tri-isopropilbisfenila) numa quantidade que varia de 5% molar a 40% molar em relação à quantidade total do composto de fórmula (XIII), e na presença de um catalisador, tal como Pd(OAc)2 ou Pd2(dba)3, numa quantidade que varia de 2% molar a 15% molar em relação à quantidade total de composto de fórmula (XIII). A mistura reacional pode ser aquecida num reator de microondas a uma temperatura entre 90 e 150 °C, por exemplo a 120 °C, durante um tempo que varia de 30 minutos a 100 minutos, por exemplo 70 minutos. A mistura de reação pode ser concentrada sob pressão reduzida e o resíduo pode ser diluído com um solvente orgânico tal como acetato de etila. A fase orgânica pode ser lavada com água, decantada, seca sobre sulfato de magnésio, filtrada e concentrada sob pressão reduzida para se obter um composto de fórmula (XV).

[00138] Os compostos de fórmula geral (Id), como definido acima podem ser preparados de acordo com o Esquema 5 abaixo.

[00139] Esquema 5 • composto de fórmula (XVI), em que n'and R’ são como definidos acima e X é um átomo de halogênio tal como Cl, pode ser colocado num solvente polar tal como N, N -dimetilformamida na presença de uma base inorgânica tal como Cs2CO3, numa relação molar variando de 2 a 5, por exemplo 3, e na presença de Cul, em uma razão molar compreendida entre 1 e 2, por exemplo 1. o composto de fórmula (XVII), em que R, V e n são como definidos acima, pode então ser adicionado numa proporção molar que varia de 1 a 2, por exemplo 1, no que diz respeito ao composto de fórmula (XVI). A mistura reacional pode ser aquecida num reator de microondas a uma temperatura na faixa de 130 a 170 °C, por exemplo a 150 °C, durante um tempo que varia de 30 minutos a 100 minutos, por exemplo 50 minutos. Após resfriamento até a temperatura ambiente, a água pode ser adicionada à mistura de reação, os sólidos não dissolvidos pode ser filtrada através de celite e o filtrado resultante pode ser extraído com um solvente orgânico tal como acetato de etila. A fase orgânica pode então ser lavada com água e uma solução aquosa saturada de salmoura, seca sobre MgSO4, filtrada e concentrada sob pressão reduzida para se obter um composto de fórmula (Id).

[00140] Os compostos de fórmula geral (Ie) como definido acima pode ser preparado de acordo com o Esquema 6 abaixo.

[00141] Esquema 6 • composto de fórmula (XVI), em que n’ e R' são como definidos acima e X é um átomo de halogênio tal como Cl, pode ser colocado num solvente polar tal como N, N -dimetilformamida na presença de uma base inorgânica tal como Cs2CO3, numa relação molar variando de 2 a 5, por exemplo 3, e na presença de Cul, em uma razão molar compreendida entre 1 e 2, por exemplo 1. O composto de fórmula (XIX), em que R, V e n são como definidos acima, pode então ser adicionado numa proporção molar que varia de 1 a 2, por exemplo 1, no que diz respeito ao composto de fórmula (XVI). A mistura reacional pode ser aquecida num reator de microondas a uma temperatura na faixa de 130 a 170 °C, por exemplo a 150 °C, durante um tempo que varia de 30 minutos a 100 minutos, por exemplo 50 minutos. Após resfriamento até a temperatura ambiente, água pode ser adicionada à mistura de reação, os sólidos não dissolvidos podem ser filtrados através de celite e o filtrado resultante pode ser extraído com um solvente orgânico tal como acetato de etila. A fase orgânica pode então ser lavada com água e uma solução aquosa saturada de salmoura, seca sobre MgSO4, filtrada e concentrada sob pressão reduzida para se obter um composto de fórmula (Ie).

[00142] Mais particularmente, os compostos de fórmula (I) em que R’ representa um grupo -OP(=O)-(OR3)(OR4) podem ser preparados a partir de um composto de fórmula (XX) com um R' sendo um grupo OH, através da rota a seguir:

[00143] Esquema 7 • composto de fórmula (XX), em que Z, V, N, N', R e R' são como definidos acima, pode ser colocado em um solvente de tipo cloroalcano anidro, tal como diclorometano anidro, a 0 °C sob uma atmosfera de gás inerte, por exemplo, argônio, na presença de clorofosfato de dietila em uma razão molar de 1, e na presença de uma base orgânica tal como a trietilamina numa razão molar que varia de 1 a 2, por exemplo 1,2, com respeito ao composto de fórmula (XX). A mistura de reação pode ser agitada em temperatura ambiente durante um tempo que varia desde 7 horas a 24 horas, por exemplo 14 horas. A mistura de reação pode depois ser concentrada sob pressão reduzida e o resíduo resultante pode ser submetido a partição entre uma solução aquosa de ácido clorídrico com uma molaridade variando de 1 a 2 m, por exemplo, 1 M, e um solvente orgânico tal como acetato de etila. As fases orgânicas pode então ser recolhidas, lavadas com uma solução aquosa saturada de uma base inorgânica, tal como Na2CO3, secas sobre MgSO4, filtradas e concentradas sob pressão reduzida para se obter um composto de fórmula (XXI). • composto de fórmula (XXI) pode ser colocado num solvente polar aprótico tal como acetonitrila, na presença de brometo de trimetilsilila em uma proporção molar que varia de 1 a 5, por exemplo 4, com respeito ao composto de fórmula (XXI). A mistura reacional pode ser agitada sob irradiação de microondas, a uma temperatura variando de 50 a 70 °C, por exemplo a 60 °C, durante um tempo compreendido entre 15 horas e 60 minutos, por exemplo 30 minutos. Após resfriamento até a temperatura ambiente, uma mistura de MeOH / água (95/5) pode ser adicionada lentamente. O precipitado resultante pode ser filtrado, lavado com água e seco sob pressão reduzida num dessecador para dar um composto de fórmula (XXII). • mesmo procedimento pode ser aplicado para a obtenção de compostos de fórmula (I) em que R representa um grupo -OP(=O)-(OR3)(OR4), a partir de um composto de fórmula (I) possuindo um grupo R que é um grupo OH.

Doenças inflamatórias

[00144] Assim, a invenção também se refere a um composto de fórmula (Ia), (Ib), (Ic), (Id) e (Ie), para utilização no tratamento e / ou prevenção de uma doença inflamatória.

[00145] Surpreendentemente, os inventores foram capazes de mostrar que os compostos de fórmula (I) conduziram a uma melhoria dramática dos sinais associados com doenças inflamatórias tais como doença inflamatória intestinal (IBD) e artrite reumatóide (AR), com base em dois modelos de camundongo in vivo.

[00146] A capacidade inflamação de compostos de fórmula modular (I), foi agora avaliada em dois modelos de ratos estabelecidos para duas doenças inflamatórias: Doenças inflamatórias intestinais (IBD) e artrite reumatóide (RA). O modelo de rato para colite induzida por dextrano sulfato de sódio (DSS-) tem sido usado para estudar a doença inflamatória intestinal (ver Perse & Cerar; “Dextran Sodium Sulphate Colitis Mouse Model: Traps and Tricks”; Journal of Biomedicine and Biotechnology (2012); 718617). O modelo de artrite induzida por colágeno tem sido usado para estudar a artrite reumatóide, como mostrado por Brand et al. (“Collagen-induced arthritis”; Nature Protocols;; (2007); 2 (5): 1269-1275).

[00147] Com efeito, os inventores mostraram que a administração de um composto que pertence à fórmula (I) conduzido in vivo, a uma melhoria do comprimento do cólon e uma diminuição das alterações nos órgãos linfóides, tais como placas de Peyer, em modelos de ratos para colite induzida por (DSS-). Os inventores mostraram ainda que a administração de um composto de fórmula (I), levou a uma redução significativa da inflamação e reduzido sinais de inflamação com base em um modelo de rato de artrite induzida por colágeno.

[00148] De acordo com a invenção, uma « inflamação » caracteriza-se por dor, calor, vermelhidão e inchaço, e pode resultar de infecção, irritação ou lesão.

[00149] Assim, uma " doença inflamatória » refere-se a um grupo de doenças e / ou desordens que são causadas por uma inflamação excessiva ou desregulada.

[00150] De acordo com a presente invenção, « tratamento e / ou prevenção de uma doença inflamatória » podem referir-se tanto ao tratamento e / ou prevenção de uma doença inflamatória, ou à inflamação em si, o que pode ocorrer, juntamente com a referida doença inflamatória num indivíduo.

[00151] Assim, um tratamento e / ou prevenção de uma doença inflamatória, também inclui um tratamento e / ou prevenção da inflamação propriamente dita.

[00152] De acordo com a presente invenção, « tratamento e / ou prevenção de» uma doença inflamatória inclui o tratamento, redução da probabilidade de desenvolvimento, ou atraso da ocorrência da referida doença inflamatória.

[00153] De acordo com a invenção, um " indivíduo " pode dizer respeito a um mamífero humano ou não-humano e, de preferência, a um ser humano.

[00154] De um modo não limitativo, as doenças inflamatórias incluem: uma doença inflamatória associada com uma doença auto-imune, uma doença inflamatória do sistema nervoso central (SNC), uma doença com inflamação das articulações, uma doença inflamatória do trato digestivo, uma doença inflamatória da pele e outras doenças inflamatórias relacionadas com células epiteliais tais como bronquite, inflamação associada com o câncer, tais como carcinoma do cólon, uma inflamação associada com a irritação e inflamação associada a lesões.

[00155] Assim, uma doença inflamatória pode ser selecionado na lista consistindo de: uma doença inflamatória associada com uma doença auto-imune, uma doença inflamatória do sistema nervoso central (SNC), uma doença com inflamação das articulações, uma doença inflamatória do trato digestivo inflamatória, uma doença inflamatória da pele e outras doenças inflamatórias relacionadas com células epiteliais, inflamação associada com o câncer, inflamação associada com a irritação e inflamação associada a lesões.

[00156] Em particular, uma doença inflamatória é selecionada da lista que consiste em: doença inflamatória do intestino, artrite reumatóide, doença de Crohn, colite ulcerativa, esclerose múltipla, doença de Alzheimer, Parkinson, osteoartrite, aterosclerose, espondilite anquilosante, psoríase, dermatite, síndrome de Sjogren, bronquite, asma e inflamação associada com carcinoma do cólon.

[00157] Mais particularmente, uma doença inflamatória é selecionada da lista que consiste em: Doença inflamatória do intestino, artrite reumatóide, doença de Crohn, colite ulcerativa, esclerose múltipla, osteoartrite, espondilite anquilosante, psoríase, síndrome de Sjogren, bronquite e a inflamação associada com carcinoma do cólon.

[00158] Mais particularmente, uma doença inflamatória é selecionada entre o conjunto constituído por: doença inflamatória intestinal, artrite reumatóide, doença de Crohn, colite ulcerativa, esclerose múltipla, osteoartrite, espondilite anquilosante e psoríase.

[00159] De um modo preferido, uma doença inflamatória de acordo com a invenção inclui: Doença inflamatória do intestino, doença de Crohn, colite ulcerativa, artrite reumatóide e esclerose múltipla.

[00160] Ainda mais preferivelmente, uma doença inflamatória de acordo com o invenção inclui: a doença inflamatória intestinal, artrite reumatóide e esclerose múltipla.

[00161] Uma doença inflamatória pode também abranger a doença de Alzheimer, Parkinson, asma, aterosclerose e dermatite.

[00162] Eczema pode ser citado como um exemplo de dermatite.

[00163] Em vista do acima exposto, a invenção refere-se a um composto de fórmula (I) para utilização no tratamento e / ou prevenção de uma doença inflamatória, que compreende uma inflamação, propriamente dita, e uma inflamação associada com uma doença inflamatória.

[00164] Assim, a invenção também se relaciona com a utilização de um composto de fórmula (I) para o tratamento e / ou prevenção de uma doença inflamatória, que compreende uma inflamação, propriamente dita, e uma inflamação associada com uma doença inflamatória.

[00165] De acordo com um outro aspecto, um objeto do presente invenção refere- se a um composto (Ie), (Id), (8), (9), (10), (11), (44), (46), (47), (48), (49), (50), (51), (52), (53) ou os seus sais farmaceuticamente aceitáveis, quer isoladamente ou em combinação, para utilização como um medicamento.

[00166] De acordo com outro dos seus objetos, a invenção relaciona-se com uma composição farmacêutica compreendendo um composto (Ie), (Id), (8), (9), (10), (11), (44), (46), ( 47), (48), (49), (50), (51), (52), (53) ou os seus sais farmaceuticamente aceitáveis, quer isoladamente ou em combinação.

[00167] A invenção também se relaciona com a utilização de um composto de fórmula (I) para a preparação de uma composição, tal como um medicamento, para o tratamento e / ou prevenção da inflamação, que engloba uma inflamação, propriamente dita, e uma inflamação associada com uma doença inflamatória.

[00168] A invenção também se refere a um método para o tratamento e / ou prevenção de uma doença inflamatória, que inclui uma inflamação, propriamente dita, e uma inflamação associada com a referida doença inflamatória, e que compreende um etapa de administração de um composto de fórmula (I) a um paciente em necessidade dos mesmos.

[00169] miRNA-124

[00170] MicroRNAs (miRNAs) são RNAs pequenos, de cadeia simples, que podem atuar no citoplasma de uma célula para provocar uma diminuição na expressão dos seus RNAs mensageiros-alvo cognatos ou tradução do produto de proteína do mRNA não-codificante. miRNAs maduros têm tipicamente de cerca de 19 a 23 nucleotídeos de comprimento. Esta capacidade de miRNAs para inibir a produção de suas proteínas-alvo resulta na regulação de diversos tipos de atividades celulares, tais como a determinação de células-destino, apoptose, diferenciação, e oncogênese.

[00171] O miR-124 foi inicialmente clonado no rato. O precursor miR-124 humano (ou miRN-124 ou miRNA-124 ou micro-RNA 124) foi clonado a partir de células estaminais embrionárias. 9 haplótipos de precursores miR-124 foram identificados até agora (Guo et al. , PLoS ONE, 2009, 4 (11): e7944), a partir dos quais 3 estão presentes no humano, HSA-miR-124-1, hsa- miR-124-2 e HSA-miR-124-3. (Respectivamente SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 3). • precursor de miR-124 microARN é uma molécula de RNA de pequena não-codificante. Os ~ 21 microRNAs maduros são nucleotídeos processados a partir de sequências precursoras em hairpin pela enzima Dicer. As sequências maduras são SEQ ID NO: 4 para miR-124-3p e SEQ ID NO: 5 para miR-124-5p.

[00172] De acordo com a invenção, a medição do nível de expressão de miR-124 engloba tanto a medição do nível de expressão de um precursor de miR-124 quanto de um de miR-124 maduro.

[00173] A invenção também se refere a um composto de fórmula (I) para aumentar a expressão de miR-124 numa amostra biológica.

[00174] Assim, de acordo com outro dos seus objetos, a invenção refere-se a um método in vitro ou ex vivo para aumentar a expressão de miR-124 em uma célula eucariótica, compreendendo pelo menos uma etapa de: a) proporcionar uma célula eucariótica, b) colocar em contato a referida célula com um composto derivado, e em particular um composto de fórmula (I).

[00175] Métodos ou rastreamento de compostos candidatos.

[00176] Um fator chave para o sucesso do desenvolvimento de uma determinada droga ou vacina é a possibilidade de se avaliar rapidamente e eficientemente a sua eficácia. Sendo assim, é importante ter as ferramentas adequadas, tais como biomarcadores específicos, para se confiar e para avaliar a eficácia de uma vacina ou medicamento.

[00177] Surpreendentemente, verificou-se que, durante a inflamação, o miR-124 desempenha um papel importante. De fato, os inventores demonstraram que os compostos de fórmula (I) são capazes de modular a expressão de miR-124. Em particular, os inventores demonstraram que os compostos da invenção podem regular positivamente (aumento de até 100 vezes) a expressão do miR-124 em células mononucleares de sangue periférico (PBMC) de doadores, isoladas por centrifugação num gradiente de Ficoll™.

[00178] Uma vez que os inventores estabeleceram agora que os compostos de fórmula (I) são capazes de modular a expressão de miR-124, a invenção também se refere a um método in vitro ou ex vivo para o rastreamento de um derivado de quinolina e, em particular, um composto de fórmula (I), que se presume ser eficaz no tratamento e / ou prevenção de uma doença inflamatória.

[00179] Assim, de acordo com outro dos seus objetos, a invenção refere-se a um uso in vitro ou ex vivo de pelo menos um miRNA, o referido pelo menos um miRNA sendo o miR-124, como um biomarcador para a triagem de um derivado de quinolina e, em particular, um composto de fórmula (I), que se presume ser eficaz no tratamento e / ou prevenção de uma doença inflamatória.

[00180] Assim, a invenção também se refere a um método in vitro ou ex vivo para o rastreamento de um derivado de quinolina e, em particular, um composto de fórmula (I), que se presume ser eficaz no tratamento e / ou prevenção de uma doença inflamatória, que compreende pelo menos um aetapa de: a) proporcionar uma célula eucariótica, b) colocar em contato a referida célula com um composto de fórmula (I), c) medição de uma expressão de miR-124 na referida célula, e d) selecionar o candidato que se presume ser eficaz no tratamento e / ou prevenção de uma doença inflamatória, quando o nível de expressão de miR-124 medido na etapa c) é modulado relativamente a um valor de referência.

[00181] De acordo com a invenção, o termo "modulação" de um nível de expressão inclui tanto o aumento da regulação quanto a sub-regulação de um nível de expressão. No sentido da invenção, o termo "modulação" de um nível de expressão de miR-124 refere-se preferencialmente a uma sobre-regulação.

[00182] Em particular, a invenção refere-se a um método in vitro ou ex vivo para o rastreamento de um derivado de quinolina e, em particular, a um composto de fórmula (I), que se presume ser eficaz no tratamento e / ou prevenção de uma doença inflamatória, que compreende pelo menos uma etapa de: a) proporcionar uma célula eucariótica, b) colocar em contato a referida célula com um composto de fórmula (I), c) medir uma expressão de miR-124 na referida célula, e d) selecionar o candidato que se presume ser eficaz no tratamento e / ou prevenção de uma doença inflamatória, quando o nível de expressão de miR-124 medida na etapa c) é aumentado em relação a um valor de referência.

[00183] De acordo com uma forma de realização, uma presença ou um nível de expressão de miR-124 é medido a partir de uma célula eucariótica de uma amostra biológica, e é comparado com um valor de referência de regulação.

[00184] Em particular, uma "amostra biológica" apropriada para a invenção pode ser um fluido biológico, tal como sangue, plasma, soro ou saliva, um fluido intersticial ou uma amostra de urina, uma amostra de células, tal como uma cultura celular, uma linha celular, uma linha de células estaminais ou células mononucleares de sangue periférico (PBMC) contendo a amostra, uma biopsia de tecido, tal como um tecido oral, um tecido gastrointestinal, uma pele, uma amostra de mucosa oral ou de uma pluralidade de amostras a partir de um ensaio clínico. A amostra pode ser uma amostra bruta, ou pode ser uma amostra purificada em vários graus, antes do armazenamento, processamento ou medição.

[00185] Em particular, uma amostra biológica adequada para a invenção é uma célula mononuclear do sangue periférico (PBMC) ou uma amostra contendo PBMC. Assim, uma amostra biológica da presente invenção pode ser processada a partir de sangue total periférico utilizando técnicas comuns no estado da técnica, tais como centrifugação em gradiente de densidade e, mais particularmente, um gradiente de Ficoll ™.

[00186] Amostras de PBMC, especialmente aquelas que foram processadas utilizando-se um gradiente de Ficoll ™, são susceptíveis de incluir linfócitos (células T, células B, e células NK), monócitos e células dendríticas. Nos seres humanos, as frequências dessas populações variam entre os indivíduos.

[00187] Assim, e de um modo não limitativo, uma célula eucariótica inclui qualquer um dos tipos de células, tal como definidos acima, tais como os linfócitos (células T, células B, e células NK), monócitos e células dendríticas.

[00188] A etapa de coleta de amostras biológicas para as utilizações e métodos da invenção é realizada antes da realização da invenção e não é um etapa de um uso ou um método de acordo com a invenção.

[00189] As amostras para avaliação de miRNA podem ser tomadas durante quaisquer intervalos desejados. Por exemplo, as amostras podem ser tomadas por hora, duas vezes por dia, diariamente, semanalmente, mensalmente, todos os dois meses, anualmente ou de modo semelhante. A amostra pode ser testada imediatamente ou pode ser armazenada para testes posteriores.

[00190] As amostras podem ser purificadas antes de serem testadas. Em algumas formas de realização, o miR-124 pode ser isolado a partir dos conteúdos celulares restantes antes do teste. Além disso, as moléculas de miR-124 podem ser separadas do resto do mRNA na amostra, se desejado. Por exemplo, o miR-124 pode ser separado a partir do RNAm com base em diferenças de tamanho antes do teste.

[00191] O valor de referência de controle para ser usado para comparar o nível medido de expressão do miR-124 numa amostra biológica testada é obtido a partir de uma amostra de controle.

[00192] As amostras de controle podem ser tomadas a partir de várias fontes. Em algumas formas de realização, as amostras de controle são retiradas do paciente antes do tratamento ou antes da presença da doença (tal como uma amostra de sangue de arquivo). Em outras formas de realização, as amostras de controle são obtidas de um conjunto de membros normais, não-doentes, de uma população. Noutra forma de realização, um ensaio de células pode ser realizado em uma cultura de células controle, por exemplo, que não tenha sido tratada com o composto de teste ou tenha sido tratada com um composto de referência, tal como o DMSO, metilcelulose (MC) ou água.

[00193] De acordo com uma forma de realização, para a determinação ou controle de uma doença inflamatória num paciente, um valor de referência de controle pode ser obtido a partir de uma amostra biológica isolada obtida relativamente a uma pessoa ou grupo de pessoas que sabidamente não sofrem de tal condição.

[00194] De acordo com uma outra forma de realização, para a determinação ou a monitorização de uma eficácia de um tratamento de uma doença inflamatória num doente, um valor de referência de controle pode ser obtido a partir de uma amostra biológica isolada obtida a partir de uma pessoa ou grupo de pessoas que sabidamente não sofrem de tais condição (ções), e / ou que não recebem o tratamento cuja eficácia se pretende determinar ou controlar. Em alternativa, um valor de referência de controle pode ser obtido a partir de uma amostra biológica isolada obtida a partir de um paciente que sofre de uma doença inflamatória e que recebe um tratamento cuja eficácia está sendo determinada ou monitorada, em que a amostra biológica isolada é retirada do paciente antes da administração do tratamento.

[00195] Numerosos métodos estão disponíveis para um técnico no assunto poder medir a presença ou o nível de expressão do biomarcador de miR-124.

[00196] Por exemplo, ensaios de ácidos nucleicos ou vetores podem ser usados para avaliar a presença e / ou nível de expressão de miR-124 numa amostra.

[00197] A sequência do miR-124 pode ser utilizada para preparar um nucleotídeo correspondente na qualidade da sonda como complementar ou iniciador para ser utilizado em ensaios de ácidos nucleicos diferentes para a detecção da expressão ou presença do biomarcador de miR-124 na amostra, sendo exemplos, mas não exemplos limitantes, transferência de Northern e métodos baseados em PCR (por exemplo, Real-Time Reverse Transcription-PCR ou qRT- PCR). Métodos tais como qRT-PCR podem ser usados para quantificar com precisão a quantidade de miRNA numa amostra.

[00198] As sondas com sentido e anti-sentido ou iniciadores de acordo com a invenção podem ser obtidas utilizando-se qualquer processo conhecido para o técnico no assunto desta arte, em particular, aqueles que estão descritos em Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3 rd Ed., 2001, Cold Spring Harbor, NY).

[00199] Os métodos relacionados com a detecção e quantificação de RNA ou DNA são bem conhecidos na arte. O técnico no assunto nesta arte pode, por exemplo, se basear em Wang et al. (1989, Proc Natl Acad Sci EUA, Vol. 86: 917-921), Wong et al. (2005, Bio Techniques, Vol 39 (1):. 75-85), Nolan et al. (2006, Nat Protoc, Vol 1 (3):. 1559-1582) ou Klinck et al. (2008, Cancer Research, Vol. 68: 657-663), ou também em uma revisão geral tal como a publicada por Bustin (2000, Journal of Molecular Endocrinology, Vol. 25: 169-193).

[00200] Uma sonda de ácido nucleico isolada adequada para medir uma expressão presença ou o nível de miR-124 é uma sonda de ácido nucleico capaz de hibridar especificamente com um miR-124, tais como um precursor de miR-124 ou um miR- 124 maduro.

[00201] Tal sonda de ácido nucleico pode compreender de 18 a 30 nucleotídeos, em particular de 20 a 27, preferivelmente de 20 a 25, de preferência de 20, 22, ou 25 e, mais preferivelmente, cerca de 25 nucleotídeos. Conforme indicado anteriormente, tais sondas de ácidos nucleicos podem ser preparadas de acordo com quaisquer métodos conhecidos no estado da técnica.

[00202] Métodos e composições são bem conhecidos no estado da técnica para se prever a temperatura de hibridação ótima para uma dada sonda e um dado alvo.

[00203] Assim, o técnico no assunto nesta especialidade pode facilmente calcular uma temperatura de hibridação ótima com base num conjunto de sondas, em uma determinada sequência alvo e com as condições particulares de hibridação.

[00204] Vantajosamente, a temperatura de hibridação ótima das referidas sondas situa-se entre 40 °C e 60 °C e, mais particularmente, entre 45 °C e 55 °C, sendo de preferência de cerca de 48 °C.

[00205] Como exemplos de tampões úteis para a hibridação de uma sonda de ácido nucleico da invenção a um biomarcador da invenção pode-se mencionar, como uma solução tampão de hibridação, um tampão compreendendo 100 mM de MES, 1 M [Na +], 20 mM de EDTA, 0,01% de Tween-20, como um tampão para lavagem não rigorosa um tampão que compreende 6X SSPE, 0,01% de Tween-20 e como um tampão de lavagem rigorosa um tampão compreendendo MES 100 mM, 0,1 M [Na +], 0,01% de Tween-20.

[00206] Numa modalidade, um método para a detecção e quantificação de ácidos nucleicos pode ser um método com base em fluorescência-corante, em que a concentração do ácido nucleico é avaliada por medição da intensidade de fluorescência de ligantes, tais como corantes, que se ligam aos referidos ácidos nucleicos. Corantes fluorescentes são bem conhecidos no estado da técnica.

[00207] Em alternativa, o referido ácido nucleico pode ser quantificado por espectrofotometria.

[00208] Numa outra forma de realização, um método para a detecção e quantificação de ácidos nucleicos pode ser um método baseado em hibridação. Os referidos métodos baseados em hibridação podem incluir técnicas de PCR e PCR quantitativa (qRT-PCR ou Q-PCR) ou técnicas baseadas em transcriptase / polimerase inversa. De um modo vantajoso, o referido método pode compreender, ou ser ainda combinado, com uma etapa de sequenciação.

[00209] Estes métodos podem compreender (i) uma etapa de extração de RNAm celulares, (ii) uma etapa de transcrição reversa do RNAm de DNA utilizando uma transcriptase reversa e (iii) uma etapa de amplificação de DNA a partir do DNA obtido na etapa anterior. Normalmente, a partir da mesma amostra, os seguintes ácidos nucleicos são amplificados: (a) DNA obtido depois de um etapa de transcrição reversa do RNAm alvo e (b) um DNA ou uma pluralidade de DNAs obtidos depois da transcrição reversa de RNAm que são constitutivamente e constantemente expressos por células («genes housekeeping"), tais como RNA codificados pelos genes MRPL19, PUM1 e GADPH. • DNA amplificado pode ser quantificado, após separação por eletroforese, e medido em termos de bandas de DNA. Os resultados referentes a mRNAs alvo são expressos como unidades relativas em comparação com mRNAs codificados por genes de «limpeza». Em algumas formas de realização, a etapa de separação do DNA amplificado é alcançada após eletroforese em gel de agarose e, em seguida, com a coloração de bandas de DNA com brometo de etídio antes da quantificação do DNA contido nestas bandas de migração, com densitometria. Em outras formas de realização, pode-se utilizar um dispositivo de micro-canal em que o DNA amplificado é separado por eletroforese capilar, antes da quantificação do sinal emitido através de um feixe de laser. Um tal dispositivo pode ser um dispositivo LabChip®, por exemplo a partir da série «GX», comercializado pela empresa Caliper Life Sciences (Hopkinton, MA, EUA).

[00210] Os resultados quantitativos obtidos por qRT-PCR algumas vezes podem ser mais informativos do que os dados qualitativos, e podem simplificar a padronização de ensaio e da gestão da qualidade. Assim, em algumas formas de realização, os ensaios baseados em qRT-PCR podem ser úteis para se medir os níveis de miRNA durante ensaios baseados em células. O método de qRT-PCR pode ser também útil no controle de terapia do paciente, tais como os métodos baseados e comercialmente disponíveis qRT-PCR (por exemplo, TaqmanR Array™).

[00211] Uma plataforma de ensaio adequado pode ser utilizada para determinar a expressão ou presença de miRNA numa amostra. Por exemplo, um ensaio pode ser na forma de uma vareta, uma membrana, um chip, um disco, uma tira de teste, um filtro, uma microesfera, uma corrediça, uma placa de poços múltiplos, ou uma fibra óptica. Um sistema de ensaio pode ter um suporte sólido no qual um oligonucleotídeo correspondente à miRNA está ligado. O suporte sólido pode compreender, por exemplo, um plástico, silício, um metal, uma resina, vidro, uma membrana, uma partícula, um precipitado, um gel, um polímero, uma folha, uma esfera, um polissacarídeo, um capilar, um filmar uma placa ou um slide. Os componentes de ensaio podem ser preparados e embalados em conjunto como um kit para a detecção de um miRNA.

[00212] Em algumas formas de realização, uma série de oligonucleotídeos para o ensaio da atividade derivado de quinolina ou candidato a fármaco numa amostra biológica podem ser preparados ou adquiridos. Uma matriz contém, tipicamente, um suporte sólido e, pelo menos, um oligonucleotídeo contato do suporte, em que o oligonucleotídeo corresponde a pelo menos uma porção do biomarcador de miR-124. Em algumas formas de realização, a porção do biomarcador de miR-124 compreende, pelo menos, 5, 10, 15, 20 ou mais bases.

[00213] De acordo com uma forma de realização, a presença ou a expressão de miR-124 pode ser ensaiada em combinação com outros miRNA também utilizados como biomarcadores. Em tal forma de realização, uma matriz pode ser usada para avaliar a expressão ou presença de vários miRNAs numa amostra, incluindo miRNA- 124. Em geral, o método compreende as seguintes etapas: a) contato da amostra com uma matriz que compreende uma sonda definida, sob condições suficientes para que ocorra a ligação específica; e b) examinar a matriz para detectar a presença de qualquer marcador detectável, avaliando deste modo a quantidade dos respectivos miRNA alvo na amostra. O uso de uma matriz de expressão permite a obtenção de um perfil de expressão de miRNA para uma determinada amostra.

[00214] Métodos de ensaios ou matrizes que se preparam para ensaiar miRNAs são bem conhecidos no estado da técnica e não é necessário que sejam aqui detalhados.

[00215] As matrizes de ácidos nucleicos podem ser utilizados para detectar a presença ou a expressão diferencial de miRNA em amostras biológicas. Matrizes de polinucleotídeos (tais como arrays de DNA ou RNA) tipicamente incluem regiões de diferentes polinucleotídeos geralmente de sequência ("agentes de captura") dispostas numa configuração pré-determinada num suporte. As matrizes são "endereçáveis" em que estas regiões (por vezes referenciadas como "características de matriz") têm locais predeterminados diferentes ("endereços") sobre o suporte da matriz. A região (isto é, uma "função" ou "spot" de matriz), num local pré-determinado específico (isto é, um "endereço") na matriz irá detectar um miRNA alvo particular. As matrizes de polinucleotídeos são tipicamente fabricadas em um suporte planar quer pelo depósito polinucleotídeos anteriormente obtidos para o suporte num local de forma específica ou por uma local síntese específica in situ de polinucleotídeos sobre o suporte. Matrizes para detectar a expressão de miRNA podem ser fabricadas por deposição (por exemplo, por meio de métodos baseados em jato ou por contato ou fotolitografia) seja de unidades precursoras (tais como monômeros de nucleotídeos ou aminoácidos) ou agentes de captura pré-sintetizados. Depois de depositar os agentes de captura polinucleotídicos sobre o suporte, o suporte é tipicamente processado (por exemplo, lavado e bloqueado) e armazenado antes da utilização.

[00216] Uma matriz para detectar a expressão de miRNA tem, pelo menos, dois, três, quatro, ou cinco sondas de sujeitos diferentes. No entanto, em certas formas de realização, uma matriz sujeito pode incluir uma sonda possuindo pelo menos 10, pelo menos 20, pelo menos 50, pelo menos 100, pelo menos 200, pelo menos 500, ou pelo menos 1,000 ou mais sondas que possa detectar um número de miRNAs correspondente. Em algumas formas de realização, as matrizes sujeitas podem incluir sondas para a detecção de, pelo menos, uma porção ou a totalidade dos miRNAs identificados de um organismo, ou pode incluir sondas de ortólogos de vários organismos.

[00217] Uma matriz de ácido nucleico pode ser contactada com uma amostra contendo ou amostra de analitos de miRNA sob condições que promovam a ligação específica da miRNA na amostra a um ou mais dos agentes de captura presentes na matriz para exibir um padrão de ligação observado marcado. Este padrão de ligação pode ser detectado mediante a inspeção da matriz. Por exemplo, os miRNA alvo na amostra podem ser marcados com um marcador adequado (tal como um composto fluorescente), e o marcador, em seguida, pode ser observado com precisão (por exemplo, através da observação do padrão de fluorescência) sobre a matriz, após a exposição da matriz à amostra. O padrão de ligação observado pode ser indicativo da presença e / ou concentração de um ou mais componentes de miRNA da amostra.

[00218] A rotulagem de miRNA pode ser realizada utilizando-se métodos bem conhecidos na especialidade, tais como utilizando a ligase de DNA, transferase terminal ou através da marcação do esqueleto de RNA, etc. Em algumas formas de realização, os miRNA podem ser marcados com um marcador fluorescente. Corantes fluorescentes exemplificativos incluem, mas não estão limitados a corantes de xanteno, corantes de fluoresceína, rodamina, corantes isotiocianato de fluoresceína (FITC), 6 carboxifluoresceína (FAM), 6-carboxi 2 l, 4 l, 7 ', 4,7-hexaclorofluoresceína (HEX) , 6 carboxil 4 ', 5' -dicloro 2 ', 7' dimetoxifluoresceína (JOE ou J), N, N, N ', N' tetrametil 6 carboxirrodamina (TAMRA ou T), 6 carboxi X rodamina (ROX ou R), 5 carboxirrodamina 6G (R6G5 ou G5), 6 carboxirrodamina 6G (R6G6 ou G6) e rodamina 110; corantes de cianina, por exemplo corantes Cy3, Cy5 e Cy7; corantes Alexa, por exemplo, Alexa Fluor-555-; cumarina, dietilaminocumarina, umbeliferona; corantes benzimida, por exemplo, o Hoechst 33258; corantes fenantridina, por exemplo, vermelho do Texas; corantes etídio; corantes de acridina; corantes carbazol; corantes fenoxazina; corantes porfirina; corantes polimetina, corantes BODIPY, corantes de quinolina, pireno, fluoresceína clorotriazinila, RL 10, eosina, JOE, R6G, tetrametilrodamina, lissamina, ROX, nafto fluoresceína, e similares.

[00219] Em algumas formas de realização, uma série de oligonucleotídeos para avaliação de atividade imunomoduladora podem ser preparados ou adquiridos, por exemplo, de Affymetrix. A matriz pode conter um suporte sólido e uma pluralidade de oligonucleotídeos de contato do suporte. Os oligonucleotídeos podem estar presentes em localizações endereçáveis, específicas sobre o suporte sólido; cada um correspondendo a, pelo menos, uma porção das sequências de miRNA que podem ser diferencialmente expressas quando do tratamento de um derivado de quinolina ou de um candidato a fármaco numa célula ou num paciente. As sequências de miRNA compreendem pelo menos uma sequência de miR-124.

[00220] Quando uma matriz é utilizada para avaliar miRNAs, um método típico pode conter as etapas de 1) a obtenção da matriz contendo sondas sujeitos ligadas à superfície; 2) hibridação de uma população de miRNAs para as sondas ligadas à superfície sob condições suficientes para fornecer para a ligação (3) lavagens pós- hibridação para remover os ácidos nucleicos não ligados na hibridação especifica; e (4) detecção dos miRNAs hibridaram. Os reagentes utilizados em cada uma destas etapas e as suas condições de utilização podem variar dependendo da aplicação particular.

[00221] A hibridação pode ser realizada sob condições de hibridação adequadas, que podem variar em severidade como desejado. As condições típicas são suficientes para produzir complexos sonda / alvo numa superfície da matriz entre membros de ligação complementares, ou seja, entre as sondas sujeitos ligados à superfície e miRNAs complementares numa amostra. Em certas formas de realização, podem ser utilizadas condições de hibridação rigorosas. A hibridação é tipicamente realizada sob condições de hibridação rigorosas. As técnicas de hibridação convencionais que são bem conhecidas no estado da técnica (por exemplo, sob condições suficientes para garantir a ligação específica de miRNA alvo na amostra com as sondas em matriz) são utilizadas para hibridar uma amostra a uma matriz de ácido nucleico. A selecção de condições adequadas, incluindo a temperatura, concentração de sal, a concentração de polinucleotídeo, o tempo de hibridação, rigor das condições de lavagem e semelhantes, dependerá do desenho experimental, incluindo a fonte de amostra, a identidade de agentes de captura, o grau de complementaridade esperado, etc, e pode ser determinada como uma questão de experimentação de rotina para os técnico no assuntos nesta arte. Em geral, os termos "hibridação" e "condições de lavagem de hibridação rigorosas" no contexto de hibridação de ácidos nucleicos estão normalmente sequenciar dependente, e são diferentes sob diferentes condições experimentais. A hibridação pode ser feita durante um período de cerca de 12 a cerca de 24 horas. O rigor das condições de lavagem pode afetar o grau ao qual as sequências de miRNA são especificamente hibridadas com agentes de captura complementares. Os especialistas na matéria reconhecerão facilmente que alternativa mas comparável de hibridação e quais condições de lavagem podem ser utilizados para proporcionar condições de rigor semelhantes.

[00222] Como uma ilustração, numa forma de realização, as experiências perfil de expressão de miRNA podem ser realizadas usando-se a matriz Affymetrix Genechip miRNA 2,0 de acordo com os protocolos descritos no manual de instruções.

[00223] Numa forma de realização particular, a referida hibridação pode ser realizada utilizando o kit GeneChip® para hibridação, lavagem e coloração (Affymetrix Ref. # 900720). Vantajosamente, a referida hibridação é realizada seguindo os protocolos do fabricante.

[00224] Após o processo de hibridação de miRNA, os polinucleotídeos ligado matriz de superfície são tipicamente lavados para se remover ácidos nucleicos não ligados. A lavagem pode ser realizada utilizando qualquer protocolo conveniente de lavagem, onde as condições de lavagem são tipicamente rigorosas, tal como descrito acima. Por exemplo, uma etapa de lavagem pode ser realizada utilizando tampões de lavagem vendidos pela empresa Affymetrix (Ref. # 900721 e # 900722). A hibridação da miRNA alvo para as sondas é então detectada usando-se técnicas convencionais de leitura da matriz. A leitura da matriz resultante hibridada pode ser conseguida, por exemplo, através da iluminação do array e pela leitura da localização e da intensidade de fluorescência resultante a cada recurso da matriz para detectar complexos de ligação / sonda de miRNA.

[00225] A modulação da presença ou o nível de expressão de miR-124 relativamente à referência de controle, tal como um valor de referência de controle a partir de um doador saudável, pode ser indicativa de uma doença inflamatória. Em particular, uma presença reduzida ou suprimida, ou uma diminuição do nível de expressão, do referido miRNA em relação a um valor de referência de controle (isto é, um valor de referência de controle a partir de um doador saudável) pode ser indicativa de uma doença inflamatória.

[00226] Assim, numa forma de realização, uma utilização da presente invenção pode compreender a obtenção ou a medição de um nível de expressão de miR-124 numa amostra biológica isolada e comparando o referido nível medido de expressão de um valor de referência de regulação. Uma observação de uma modulação do referido nível medido relativamente ao referido valor de referência de controle pode ser indicativo de uma doença inflamatória, ou do tratamento da referida doença inflamatória.

[00227] Um aumento ou um nível sobre-regulado de expressão de miR-124 na presença de um fármaco candidato, relativamente a um valor de referência de controle (ou seja, sem o tratamento pelo candidato a fármaco, tal como um derivado de quinolina) é indicativa de um fármaco candidato poder ser presumidamente eficaz no tratamento e / ou prevenção de uma doença inflamatória.

[00228] Sendo assim, quando o miR-124 a partir de uma amostra é "aumentado" ou "sobre-regulado" em uma amostra biológica, em comparação com um valor de referência de controle, este aumento pode ser de cerca de 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 90%, 100%, 200%, 300%, 500%, 1000%, 5000% ou mais do valor de referência de controle comparativo (ou seja, sem o tratamento pelo derivado de quinolina).

[00229] Em particular, a expressão nível medido de miR-124 pode ser, pelo menos, duas vezes, de um modo preferido, pelo menos, um de quatro vezes, de um modo preferido, pelo menos, um de seis vezes, de um modo preferido, pelo menos, um de oito vezes, e mais de preferência, pelo menos, um aumento de dez vezes relativamente ao referido valor de referência de regulação.

[00230] De acordo com uma forma de realização preferida, o nível medido de expressão do miR-124 pode ser, pelo menos, um aumento de 100 vezes relativamente ao referido valor de referência de regulação.

[00231] De acordo com uma forma de realização, um ou uso num método de acordo com a invenção pode ser implementado para a otimização do regime de dosagem de um paciente. Os doentes podem responder de forma diferente a um determinado derivado de quinolina, em particular um composto de fórmula (I), dependendo de fatores tais como a idade, saúde, do fundo genético, presença de outras complicações, progressão da doença e da co-administração de outras drogas. Pode ser útil se utilizar o miR-124 como biomarcador para avaliar e otimizar o regime de dosagem, tais como a quantidade de dose e / ou o esquema de dose, de um derivado de quinolina em um paciente. A este respeito, com base em um biomarcador-miR- 124, este também pode ser utilizado para controlar e ajustar a eficácia do tratamento do paciente individual ao longo do tempo. O biomarcador pode ser utilizado para reunir a informação necessária para fazer ajustes no tratamento de um paciente, aumentando ou diminuindo a dose de um agente, conforme necessário. Por exemplo, um paciente que recebe um derivado de quinolina pode ser testado utilizando o biomarcador baseado em miR-124 para se verificar se a dose realmente está se tornando efetiva, ou se um plano de tratamento mais agressivo deve ser considerado e implementado. A quantidade de fármaco administrado, o tempo de administração, a frequência de administração e a duração da administração podem ser, em seguida, ajustados em função da medição biomarcador de miR-124. • biomarcador miR-124 também pode ser usado para controlar a conformidade do paciente durante os regimes de tratamento individuais, ou durante ensaios clínicos. Este controle pode ser seguido em intervalos definidos para assegurar que os pacientes incluídos no estudo estão tomando os medicamentos conforme instruído. Além disso, um paciente que recebe um derivado de quinolina pode ser testado utilizando o biomarcador miR-124 para determinar se o paciente se encontra em conformidade com o regime de dosagem do plano de tratamento. Um aumento do nível de expressão do biomarcador comparado com o de uma amostra de controle não tratada é indicativo de conformidade com o protocolo.

[00232] Assim, e sem se afastar do âmbito da invenção, um valor de referência de controle pode ser obtido a partir de uma célula eucariótica, que é derivada a partir de: uma amostra biológica a partir de um doador saudável, e / ou um doador que não foi previamente tratado com um determinado candidato a fármaco, tal como um determinado derivado de quinolina.

[00233] Um biomarcador da invenção pode ser implementado para avaliar e seguir a eficácia dos derivados de quinolina, em particular os compostos de fórmula (I). Sendo assim, a presença ou o nível de expressão de miR-124 podem ser medidos em uma amostra biológica isolada obtida de um doente previamente tratado com um derivado de quinolina, tal como um composto de fórmula (I).

[00234] Em seguida, a presença ou o nível de expressão medido de miR-124 numa amostra biológica isolada pode ser comparado com um valor de referência de regulação.

[00235] Quando um aumento do nível medido de expressão do miR-124, relativamente ao valor de referência de controle, é observado em sequência, a medida é indicativa de uma atividade de derivados de quinolina, e em particular de compostos de fórmula (I).

[00236] Numa outra forma de realização, quando é observado um aumento do nível medido de expressão do miR-124 relativamente ao valor de referência de controle, em sequência, a medida pode ser indicativa de uma resposta de um paciente a um tratamento com o referido derivado de quinolina, em particular, aos referidos compostos de fórmula (I).

[00237] Numa outra forma de realização, quando é observado um aumento do nível medido relativamente ao valor de referência de controle, em sequência, a medida é indicativa de uma eficácia de um tratamento com o referido derivado de quinolina, em particular, dos referidos compostos de fórmula (I).

[00238] Numa outra forma de realização, quando é observado um aumento do nível medido de expressão do miR-124 relativamente ao valor de referência de controle, em sequência, a medida é indicativa de um efeito terapêutico dos referidos derivados de quinolina, em particular, dos referidos compostos de fórmula (I), se comportando como um agente terapêutico para prevenção e / ou tratamento de uma doença inflamatória.

[00239] Numa outra forma de realização, quando é observado um aumento do nível medido de expressão do miR-124 relativamente ao valor de referência de controle, em sequência, a medida é indicativa de uma eficácia terapêutica de um regime de dosagem particular do referido derivado de quinolina, em particular, dos referidos compostos de fórmula (I) como um agente terapêutico para prevenção e / ou tratamento de uma doença inflamatória, se o valor de referência de controle é medido a partir de uma amostra biológica que é derivada de um paciente tratado com outro regime de dosagem.

[00240] As estruturas químicas e dados espectroscópicos de alguns compostos de fórmula (I) da invenção são ilustrados, respectivamente, na Tabela I e na Tabela II, apresentadas adiante (ver exemplos). Tabela I

[00241] Os exemplos aqui proporcionados têm a intenção de ser meramente exemplificativos, e os técnicos no assunto nesta arte reconhecerão, ou serão capazes de determinar usando não mais do que uma experimentação de rotina, numerosos equivalentes de compostos, materiais e procedimentos específicos. Todos esses equivalentes são considerados como estando dentro do âmbito da invenção e estão englobados pelas reivindicações apresentadas a seguir.

EXEMPLOS Exemplo 1 : 8-cloro- N 4 - (3- (piperidin-1-il) propil) - N 2 - (4- (trifluorometil) piridin-2-il) quinolina-2,4-diamina; Composto (9)

[00242] o-Cloroanilina (5,3 mL, 50 mmoles, 1 eq.) foi colocada em piridina (8 mL). Malonato de dietila (11,4 mL, 75 mmol, 1,5 eq.) foi então adicionado e a mistura reacional foi agitada a 130 °C durante 14 horas. Após resfriamento até a temperatura ambiente, a mistura reacional foi concentrada sob pressão reduzida e o resíduo resultante foi diluído com diclorometano. A fase orgânica foi então lavada com uma solução aquosa saturada de Na2CO3 , seca sobre MgSO4 , filtrada e concentrada sob pressão reduzida. O resíduo resultante foi purificado por cromatografia em coluna sobre gel de sílica para se obter o acetato de 2 - [(2-clorofenil) carbamoil] etila (2,7 g, 22%).

[00243] 1 H RMN (300 MHz, CDCl3) δ 9,74 (s largo, 1H), 8,38 (dd, J = 8,1, 1,5 Hz, 1H), 7,40 (dd, J = 8,1, 1,5 Hz, 1H), 7,28 (td , J = 8,1, 1,5 Hz, 1H), 7,07 (td, J = 8,1, 1,5 Hz, 1H), 4,30 (q, J = 7,1 Hz, 2H), 3,54 (s, 2H), 1,34 (t, J = 7,1 Hz, 3H).

[00244] Acetato de 2 - [(2-clorofenil) carbamoil] etila (2,4 g, 9,93 mmoles, 1 eq) foi colocado em uma solução em THF (9,9 mL) / água (3,8 mL) mistura. Hidróxido de sódio (477 mg, 11,92 mmoles, 1,2 eq.) foi então adicionado e a mistura de reação foi agitada durante 14 horas em temperatura ambiente. Ácido clorídrico concentrado foi então adicionado até se atingir um pH de 2 e a solução resultante foi extraída com acetato de etila. A fase orgânica foi então seca sobre MgSO4, filtrada e concentrada sob pressão reduzida para se obter o ácido 2 - [(2-clorofenil) carbamoil] acético (2 g, 94%).

[00245] 1 H RMN (300 MHz, MeOD) δ 7,98 (dd, J = 8,1, 1,5 Hz, 1H), 7,45 (dd, J = 8,1, 1,5 Hz, 1H), 7,30 (td, J = 8,1, 1,5 Hz, 1H ), 7,16 (td, J = 8,1, 1,5 Hz, 1H), 3,54 (s, 2H).

[00246] Uma mistura de reação de ácido 2 - [(2-clorofenil) carbamoil] acético (3,7 g, 17,32 mmoles, 1 eq.) em ácido polifosfórico (17 g, 173,2 mmol, 10 eq.) foi agitada a 130 °C durante 14 horas. A mistura de reação foi resfriada até a temperatura ambiente e depois uma solução aquosa 2M de hidróxido de sódio foi adicionada lentamente. O precipitado resultante foi filtrado, lavado com água e seco sob pressão reduzida num dessecador para se obter o 8-cloro-quinolina-2,4-diol (3 g, 89%).

[00247] 1 H RMN (300 MHz, DMSO) δ 11,66 (s largo, 1H), 10,40 (s largo, 1H), 7,78 (d, J = 7,8 Hz, 1H), 7,66 (d, J = 7,8 Hz, 1H), 7,17 (t, J = 7,8 Hz, 1H), 5,81 (s, 1H).

[00248] MS (ESI) [MH] - = 194,1

[00249] Uma mistura de reação de 8-cloro-quinolina-2,4-diol (1,5 g, 7,67 mmoles, 1 eq.) em POCl3 (7,1 mL, 76,7 mmol, 10 eq.) foi agitada a 100 °C durante 2 horas. A mistura de reação foi resfriada até a temperatura ambiente e depois foi adicionada água lentamente. O precipitado resultante foi filtrado, lavado com água e seco sob pressão reduzida num dessecador para se obter a 2,4,8-trichloroquinolina (1,6 g, 90%).

[00250] 1 H RMN (300 MHz, DMSO) δ 8,21 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 8,14 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 8,11 (s, 1H), 7,78 (t, J = 8,4 Hz, 1H).

[00251] Uma mistura de reação de 2,4,8-trichloroquinolina (1 g, 4,30 mmoles, 1 eq.), 2-amino-4-trifluorometil-piridina (768 mg, 4,73 mmoles, 1,1 eq.), Pd(OAc)2 (19 mg , 0,09 mmol, 2 mol%), Xantfos (50 mg, 0,09 mmol, 2 mol%) e Cs2CO3 (3,9 g, 12,04 mmoles, 2,8 eq.) em t -BuOH (17,2 ml) foi aquecida a 90 °C durante 2 dias. Após resfriamento até a temperatura ambiente, a mistura reacional foi concentrada sob pressão reduzida e o resíduo resultante foi diluído com acetato de etila. A fase orgânica foi, em seguida, lavada com água, seca sobre MgSO4, filtrada e concentrada sob pressão reduzida. O resíduo resultante foi purificado por cromatografia em coluna sobre gel de sílica para se obter a (4,8-dicloro-quinolin-2-il) - (4-trifluorometil-piridin-2- il) -amina (13) (588 mg, 38%) .

[00252] 1 H RMN (300 MHz, CDCl 3 ) δ 9,40 (s, 1H), 8,46 (d, J = 5,4 Hz, 1H), 8,06 (dd, J = 8,1, 1,5 Hz, 1H), 7,86 (dd, J = 8,1, 1,5 Hz, 1H), 7,81 (s, 1H), 7,40 (t, J = 8,1 Hz, 1H), 7,25 (s, 1H), 7,22 (d, J = 5,4 Hz, 1H).

[00253] MS (ESI) [M + H] + = 358,1

[00254] Uma mistura de reação de (4,8-dicloro-quinolin-2-il) (4-trifluorometil-piridin- 2-il) -amina (200 mg, 0,54 mmol, 1 eq), 3- (piperidin-1- il) propan-1-amina (94 μL, 0,59 mmol, 1,1 eq.), CuI (10 mg, 0,05 mmol, 0,1 eq), L-prolina (9 mg, 0,11 mmole, 0,2 eq.), carbonato de potássio ( 148 mg, 1,01 mmol, 2 eq.) em DMSO (1,4 mL) foi agitada a 90 °C durante 24 horas sob uma atmosfera inerte de argônio. A mistura de reação foi, em seguida, repartida entre acetato de etila e água. Após decantação, a fase aquosa foi ainda extraída com diclorometano. As fases orgânicas foram reunidas, secas sobre MgSO4, filtradas e concentradas sob pressão reduzida. O resíduo resultante foi purificado por cromatografia em coluna sobre gel de sílica para se obter a 8-cloro- N 4 - (3-piperidin-1-il-propil) - N 2 - (4-trifluorometil-piridin-2-il) -quinolina-2 , 4-diamina ( 9) (48 mg, 7%).

[00255] 1 H RMN (300 MHz, CDCl3) δ 9,55 (s, 1H), 8,40 (d, J = 4,8 Hz, 1H), 7,85 (s, 1H), 7,77 (d, J = 7,8 Hz, 1H), 7,72 (d, J = 7,8 Hz, 1H), 7,62 (s, 1H), 7,18 (t, J = 7,8 Hz, 1H), 7,10 (d, J = 4,8 Hz, 1H), 5,88 (s, 1H), 3,41 - 3,31 (m, 2H), 2,59 (t, J = 5,4 Hz, 2H), 2,57 - 2,43 (m, 4H), 2,01 - 1,92 (m, 2H), 1,79 - 1,70 (m, 4H), 1,65-1,54 (m, 2H).

[00256] 13 C RMN (75 MHz, CDCl3) δ 154,9, 154,0, 152,3, 148,5, 144,2, 132,2, 129,7, 121,7, 119,7, 118,4, 112,4, 109,8, 88,0, 59,6, 55,1, 44,9, 26,1, 24,4, 23,4.

[00257] MS (ESI) [M + H] + = 464,2 Exemplo 2: 2- N - (8-cloroquinolin-2-il) -5- N - [3- (4-metilpiperazin-1-il) propil] -4- (trifluorometil) piridina-2,5-diamina; composto (22)

[00258] Uma mistura reacional de 2,8-dicloroquinolina (198 mg, 1,0 mmol, 1 eq.), 5-bromo-4- (trifluorometil) piridin-2-amina (241 mg, 1,0 mmol, 1 eq.), Pd(OAc )2 (4,5 mg, 0,02 mmol, 2 mol%), Xantfos (11,6 mg, 0,02 mmol, 2 mol%) e Cs2CO3 (782 mg, 2,4 mmoles, 2,4 eq.) em t -BuOH (4 mL) foi aquecida num reator de micro-ondas a 120 °C durante 70 minutos. Após resfriamento até a temperatura ambiente, a mistura reacional foi concentrada sob pressão reduzida e o resíduo resultante foi diluído com acetato de etila. A fase orgânica foi, em seguida, lavada com água, seca sobre MgSO4, filtrada e concentrada sob pressão reduzida. O resíduo resultante foi purificado por cromatografia em coluna sobre gel de sílica para se obter a N - [5-bromo-4- (trifluorometil) piridin-2-il] -8-cloroquinolin-2-amina ( 21) (300 mg, 75%).

[00259] 1 H RMN (300 MHz, CDCl 3 ) δ 9,71 (s, 1H), 8,51 (s, 1H), 8,06 (d, J = 9,0 Hz, 1H), 7,81 (m, 2H), 7,65 (d, J = 7,8 Hz, 1H), 7,33 (t, J = 7,8 Hz, 1H), 7,00 (d, J = 9,0 Hz, 1H).

[00260] MS (ESI) [M + H] + = 403,7

[00261] Uma mistura reacional de N - [5-bromo-4- (trifluorometil) piridin-2-il] -8- cloroquinolin-2-amina (101 mg, 0,250 mmol, 1 eq.), 3- (4-metilpiperazin-1 -il) propan- 1-amina (64 μL, 0,375 mmol, 1,5 eq.), Pd2(dba)3 (28 mg, 0,030 mmol, 12 mol%), Xantfos (43,4 mg, 0,075 mmol, 30 mol% ) e de sódio terc -butóxido (72 mg, 0,75 mmol, 3 eq.) em uma mistura dioxano (1 mL) / DMF (0,1 mL) foi aquecida num reator de micro-ondas a 120 °C durante 70 minutos. Após resfriamento até a temperatura ambiente, a mistura reacional foi concentrada sob pressão reduzida e o resíduo resultante foi diluído com acetato de etila. A fase orgânica foi, em seguida, lavada com água, seca sobre MgSO4, filtrada e concentrada sob pressão reduzida. O resíduo resultante foi purificado por cromatografia em coluna sobre gel de sílica para se obter a 2- N - (8-cloroquinolin-2-il) -5- N - [3- (4-metilpiperazin-1-il) propil] -4- (trifluorometil ) piridina-2,5-diamina (22) (52 mg, 43%).

[00262] 1 H RMN (300 MHz, CDCl3) δ 9,39 (s, 1H), 7,97-7,86 (m, 2H), 7,82 (s largo, 1H), 7,73 (d, J = 7,5 Hz, 1H), 7,56 (d , J = 7,5 Hz, 1H), 7,23 (t, J = 7,5 Hz, 1H), 6,94 (d, J = 9,0 Hz, 2H), 3,34-3,22 (m, 2H), 2,80-2,44 (m, 10H) , 2,37 (s, 3H), 1,87 (t, J = 6,0 Hz, 2H).

[00263] MS (ESI) [M + H] + = 479,0 Exemplo 3 : 8-cloro- N -metil- N - (4- (trifluorometoxi) fenil) -quinolin-2-amina; composto (28)

[00264] A 8-cloro- N - [4- (trifluorometoxi) fenil] quinolin-2-amina, isto é, o composto (24) , foi sintetizada tal como descrito no documento WO2010 / 143169, no Exemplo 5.

[00265] Uma mistura de reação de 8-cloro- N - (4- (trifluorometoxi) fenil) -quinolin- 2-amina (24) (340 mg, 1,0 mmol, 1 eq.) e potássio terc -butóxido (124 mg, 1,1 mmole, 1,1 eq.) foi feita, e adicionou-se iodometano (69 μL, 1,1 mmol, 1,1 eq.), em DMF (2 mL) e esta foi agitada em temperatura ambiente durante 4 horas. A mistura de reação foi em seguida repartida entre acetato de etila e água. As fases orgânicas foram reunidas, secas sobre MgSO4, filtradas e concentradas sob pressão reduzida. O resíduo resultante foi purificado por cromatografia em coluna sobre gel de sílica para se obter a 8-cloro- N -metil- N - (4- (trifluorometoxi) fenil) -quinolin-2-amina (28) (247 mg, 70%).

[00266] 1 H RMN (300 MHz, CDCl 3 ) δ 7,69 (d, J = 9,0 Hz, 2H), 7,49 (d, J = 7,8 Hz, 1H), 7,36-7,25 (m, 4H), 7,14 (t, J = 7,8 Hz, 1H), 6,75 (d, J = 9,0 Hz, 1H), 3,69 (s, 3H).

[00267] MS (ESI) [M + H] + = 353,1

[00268] Exemplo 4: 8-cloro- N - (3- (piperidin-1-il) propil) - N - (4- (trifluorometoxi) fenil) -quinolin-2-amina; composto (30)

[00269] A 8-cloro- N - [4- (trifluorometoxi) fenil] quinolin-2-amina, isto é, o composto (24) , foi sintetizada tal como descrito no documento WO2010 / 143169, no Exemplo 5.

[00270] Uma mistura de reação de 8-cloro- N - [4- (trifluorometoxi) fenil] quinolin-2- amina ( 24) (. 500 mg, 1,47 mmol, 1 eq) e NaH (177 mg, 4,43 mmoles, 3 eq) em DMF anidro (2 mL) foi agitada em temperatura ambiente durante 30 minutos. Uma mistura de reação de 1- (3-cloropropil) piperidina (292 mg, 1,47 mmole, 1 eq.), KI (245 mg, 1,47 mmole, 1 eq.) e Et3N (205 mL, 1,47 mmole, 1 eq .) em DMF anidro (5 mL) foi agitada em temperatura ambiente durante 30 minutos sob uma atmosfera inerte de argônio. A quinolina ativada foi então adicionado à cadeia de piperidina e a mistura de reação resultante foi agitada a 90 °C durante 4 horas. A mistura de reação foi então concentrada sob pressão reduzida e o resíduo resultante foi diluído com acetato de etila. A fase orgânica foi lavada com uma solução aquosa saturada de salmoura, seca sobre MgSO4, filtrada e concentrada sob pressão reduzida. O resíduo resultante foi purificado por cromatografia em coluna sobre gel de sílica para se obter a 8-cloro- N - (3- (piperidin-1-il) propil) - N - (4- (trifluorometoxi) fenil) -quinolin-2-amina (30) (472 mg, 69%).

[00271] 1H RMN (300 MHz, CDCl3) δ 7,73-7,63 (m, 2H), 7,48 (d, J = 7,9 Hz, 1H), 7,39-7,26 (m, 4H), 7,13 (t, J = 7,9 Hz, 1H), 6,67 (d, J = 9,1 Hz, 1H), 4,26-4,14 (m, 2H), 2,52-2,33 (m, 6H), 2,11-1,97 (m, 2H), 1,64-1,52 (m, 4H) , 1,45 (s, 2H).

[00272] 13C RMN (75 MHz, CDCl3) δ 156,5, 147,3, 144,1, 143,5, 137,1, 130,8, 129,7, 129,1, 126,4, 124,7, 122,7, 122,4, 118,9 (t, J = 222 Hz), 112,5, 56,9, 54,5 , 49,6, 25,6, 24,6, 24,3.

[00273] MS (ESI) [M + H] + = 464,4 Exemplo 5: 8-cloro-2 - ((4- (trifluorometil) piridin-2-il) oxi) quinolina; composto (46)

[00274] Uma mistura reacional de 2,8-dicloroquinolina (79 mg, 0,4 mmol, 1 eq.), 2- hidroxi-4- (trifluorometil) piridina (65 mg, 0,4 mmol, 1 eq.), CuI (76 mg, 0,4 mmol , 1 eq.) e Cs2CO3 (391 mg, 1,2 mmol, 3 eq.) em DMF (6 mL) foi aquecida num reator de micro-ondas a 150 °C durante 50 minutos. Após resfriamento até a temperatura ambiente, foi adicionada água à mistura de reação. Os sólidos não dissolvidos foram filtrados através de celite e o filtrado resultante foi extraído duas vezes com acetato de etila. A fase orgânica foi lavada com água e uma solução aquosa saturada de salmoura, seca sobre MgSO4, filtrada e concentrada sob pressão reduzida. O resíduo resultante foi purificado por cromatografia em coluna sobre gel de sílica para se obter a 8-cloro-2 - {[4- (trifluorometil) piridin-2-il] oxi} quinolina ( 46) (68 mg, 52%).

[00275] 1 H RMN (300 MHz, CDCl 3 ) δ 8,40 (d, J = 7,2 Hz, 1H), 8,34 (d, J = 8,8 Hz, 1H), 8,18 (d, J = 8,8 Hz, 1H), 7,90 (d , J = 7,2 Hz, 1H), 7,85 (d, J = 7,9 Hz, 1H), 7,56 (t, J = 7,9 Hz, 1H), 6,98 (s, 1H), 6,53 (d, J = 7,9 Hz, 1H ).

[00276] 13 C RMN (75 MHz, CDCl 3 ) ô 161,6, 151,2, 143,4, 142,3, 138,7, 138,2, 137,4, 133,4, 130,6, 129,1, 127,6, 126,7, 120,2, 119,7, 102,3.

[00277] MS (ESI) [M + H] + = 325,1 Exemplo 6: 8-cloro-2- (4- (trifluorometoxi) fenoxi) quinolina; composto (48)

[00278] Uma mistura reacional de 2,8-dicloroquinolina (2x 79 mg, 2x 0,4 mmol, 1 eq.), 4- (trifluorometoxi) fenol (2x 52 μL, 2x 0,4 mmol, 1 eq.), CuI (2x 76 mg, 2x 0,4 mmol, 1 eq.) e Cs2CO3 (2x 391 mg, 2x 1,2 mmol, 3 eq.) em DMF (2 x 6 mL) foi aquecida num reator de micro-ondas a 150 °C durante 50 minutos. Após resfriamento até a temperatura ambiente, foi adicionada água à mistura de reação. Os sólidos não dissolvidos foram filtrados através de celite e o filtrado resultante foi extraído duas vezes com acetato de etila. A fase orgânica foi lavada com água e uma solução aquosa saturada de salmoura, seca sobre MgSO4, filtrada e concentrada sob pressão reduzida. O resíduo resultante foi purificado por cromatografia em coluna sobre gel de sílica para se obter a 8-cloro-2- [4- (trifluorometoxi) fenoxi] quinolina 48 (212 mg, 78%).

[00279] 1 H RMN (300 MHz, CDCl 3 ) δ 8,12 (d, J = 8,8 Hz, 1H), 7,73 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 7,66 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 7,46 (d , J = 9,1 Hz, 2H), 7,38-7,22 (m, 3H), 7,12 (d, J = 8,8 Hz, 1H).

[00280] 13 C RMN (75 MHz, CDCl 3 ) ô 161,5, 151,9, 145,9, 142,7, 140,5, 132,0, 130,3, 127,0, 126,4, 125,1, 122,8, 122,2, 119,0 (t, J = 255 Hz), 113,6.

[00281] MS (ESI) [M + H] + = 340,1

[00282] As estruturas de outros compostos da invenção foram confirmadas por espectros de RMN. Tabela II

Dados farmacológicos

[00283] Os compostos da invenção foram objeto de ensaios farmacológicos que demonstraram a sua importância como substâncias ativas em terapêutica e, em particular, para a prevenção de uma doença inflamatória. Exemplo 7: Modulação da expressão de miR-124 por derivados de quinolina de uma doença inflamatória dos intestinos em modelo in vivo

A. Materiais e Métodos Estudos Ex Vivo

[00284] Extração de PBMC utilizando um gradiente de Ficoll ™

[00285] Para esse fim, as células mononucleares de sangue periférico (PBMC) de doadores saudáveis foram isoladas por centrifugação num gradiente de Ficoll ™ de acordo com protocolos padrão.

[00286] Resumidamente, de 60 a 70 mL de camada leuco-plaquetária são derramados num balão de 175 cm2 , e o volume é ajustado para 300 ml utilizando PBS, a fim de obter uma diluição de cerca de cinco vezes o número de revestimento buffy. 38 ml de Buffy diluído são então adicionados aos tubos Falcon™ de 50 ml contendo 12 ml de FICOLL™ (Histopack-1077) em temperatura ambiente. A preparação é centrifugada durante 30 minutos a 515 rcf em temperatura ambiente. O anel de linfócitos é recuperado a partir do tubo Falcon™ com uma pipeta de transferência (Pastette®) e, em seguida, lavado com PBS utilizando a centrifugação durante 10 minutos a 290 rcf e em temperatura ambiente até que o sobrenadante se torne claro.

[00287] As células são então suspensas de novo a 37 °C a uma densidade de 1,5x10 6 células / ml em meio RPMI Glutamax (Life Technologies Ref 61870-010) suplementado com 10% de soro fetal de vitelo (FCS) (Thermo Fischer Ref SV30160.03) e sem ativação. As células são incubadas durante 48 horas a 37 °C sob 5% de CO2.

[00288] Tratamento das células com as moléculas estudadas

[00289] Placas de seis poços são usadas para o rastreamento. Dentro de cada cavidade compreendendo 3 x 106 células / 4 ml de RPMI suplementado com 10% de soro fetal de vitelo e 40 U / ml de IL-2 (Ref Peprotech 200-02) são adicionadas as moléculas rastreadas. 100% de DMSO (4 mL) é adicionado ao poço e testado como um controle negativo.

[00290] Cada condição testada é configurada como aqui descrito abaixo e o volume correspondente final é ajustado em conformidade no poço: 1) derivados de quinolina em DMSO a 100% - (5 μM e um volume final de 4 μl) 2) Anti-retrovirais: Maraviroc, Efavirenz, Darunavir, AZT (10 mM para todos - volume final 4 μl).

[00291] Os poços são incubados durante três dias a 37 °C sob 5% de CO2. O meio é mudado (Dia 3) de acordo com protocolos padrão. Resumidamente, as placas são centrifugadas a 290 rcf durante 5 minutos e 3 ml de sobrenadante é removido. 3 ml de meio RPMI suplementado com 10% de soro fetal de vitelo e 40 U / ml de IL-2 é, em seguida, adicionado a 3 mL de uma solução de estoque de molécula rastreada em 5 mM em 100% de DMSO ou 3 mL de 100% de DMSO como um controle negativo .

Extração de miRNAs (Dia 6)

[00292] As células são recuperadas dentro de tubos Falcon™ de 15 ml, centrifugou- se a 290 rcf durante 5 minutos, e, em seguida, lavou-se em 10 mL de PBS e adicionalmente centrifugou-se a 290 rcf durante 5 minutos. As células são então ressuspensas em 1 mL de PBS e contadas.

[00293] 6 x 106 células são recuperadas e centrifugou-se a 290 rcf durante 5 minutos. O sedimento de células foi lisado em 300 mL de ML de tampão de lise a partir do kit de extração de Macherey Nagel NucleoSpin® miRNA (Macherey Nagel Ref 740971) , e adicionalmente armazenado a - 20 °C.

[00294] 5 mL de 2x10 8 cópias / mL de controle de pico-interno (Ce_miR-39 da QIAGEN © - referência 219610 de SEQ ID N ° 6) são adicionados para cada amostra. A extração miRNA é conseguida usando o protocolo do kit de extração de Macherey Nagel NucleoSpin® miRNA utilizando um volume de eluição para a RNA de 50 μl e 30 μl de miRNA, adicionalmente armazenado a - 20 °C.

[00295] Transcrição reversa de miRNAs (Dia 6)

[00296] A etapa de transcrição reversa é seguida por 12 μL de miRNA usando o kit de RT II miScript transcrição reversa (RT) de Qiagen © utilizando o tampão miScript Hispec, e adicionalmente armazenado a - 20 °C.

[00297] PCR quantitativa dos miRNAs (Dia 6)

[00298] A etapa quantitativa PCR é alcançada usando o kit QIAGEN © miScript SYBR ® PCR green e miScript Primer Assays de acordo com o protocolo do fabricante.

[00299] Composição da mistura de reação miScript para placas de 384 poços:

[00300] misturaμL/ reação

[00301] 2X SYBR ® mix green5

[00302] 10X Universal Primer1

[00303] 10X Primer assay1

[00304] H2O2

[00305] Volume total da mistura: 9

[00306] Molde cDNA em H2O(*)1

[00307] Volume final:10

[00308] (*) cDNA preparado utilizando o kit de RT II miScript

[00309] A reação é repetida em triplicata numa placa de 384 poços de acordo com o protocolo do fabricante num sistema LightCycler ® 380 Roche de PCR em tempo real. As condições de ciclização também são configurados de acordo com o protocolo do fabricante:

[00310] EtapaTempoTemperatura

[00311] Etapa de ativação inicial15 min95 °C

[00312] Ciclização em 3 etapas:

[00313] Desnaturação15 s94 °C

[00314] Recozimento30 s55 °C

[00315] Extensão30 s70 °C

[00316] número de ciclos 40 ciclos

[00317] A quantificação relativa de qPCR é conhecida no estado da técnica e é detalhada a seguir.

[00318] Quantificação relativa

[00319] Feita a partir de uma diluição de 1/10 em H2O para o miR-124 qPCR (Hs_miR-124a) ou de 1/100 para o gene de referência / limpeza qPCR (Hs_miR-26a e Hs_miR-191, usando miScript Primer Assays (Hs_miR-124a, Hs_miR-26a e Hs_miR-191 ou QIAGEN © - referências ms00006622, ms00029239 e ms00003682).

[00320] A análise é realizada por meio de modelos quantificação relativa sem correção eficiência (2-ΔΔ Cp) utilizando a média de pontos de passagem valores (Cp) a partir triplicatas de miR-124 e a média da média de triplicados de miR-26a e miR-191.

B. Resultados

[00321] Um conjunto de doadores (1 a 7 doadores testados para cada composto) foi avaliado na presença de diferentes compostos de fórmula (I).

[00322] Usando o protocolo acima descrito a mudança média de vezes (em comparação com DMSO) em miR-124 foi avaliada expressão com diferentes doadores (qualquer de 1 a 7) por meio de quantificação relativa e é apresentado na Tabela III, a seguir: Tabela III

[00323] Assim, a evidência experimental mostra que os derivados de quinolina acima mencionados de fórmula (I) sobre-regulam os níveis de expressão de miR-124 em PBMC, quando comparados com um valor de referência estabelecido em PBMC não tratados.

[00324] Em contraste, nenhum dos anti-retrovirais conhecidos (Maraviroc, Efavirenz, Darunavir ou AZT) tem qualquer efeito significativo sobre a sobre- expressão de miR-124 em PBMC de quatro doadores.

Exemplo 8: Efeito de derivados de quinolina no modelo de colite induzida (DSS-) A. Materiais e Métodos

[00325] Modelos de camundongo

[00326] Modelo DSS

[00327] Um modelo de camundongo vulgarmente utilizado de doença inflamatória do intestino é o modelo de colite induzida por de dextrano sulfato de sódio (DSS). Alterações histológicas típicas de colite aguda -DSS são esgotamento mucino, degeneração epitelial e a eventual destruição da barreira mucosa que conduz à inflamação e à colite.

[00328] Três grupos de camundongos de seis semanas de idade C57BL 6 / (8 camundongos cada) receberam administração de DSS na água de beber (2,5%) durante 9 dias (Figuras 1-2). A perda de peso e o consumo de água foram medidos a cada dia. Este último foi determinado através da medição da perda de volume da água de beber nos respectivos dispositivos. Os animais foram tratados por via oral com 200 μl de 0,5 MC sozinho (DSS + grupo MC) ou em conjunto com 40 mg / kg de composto 24 (DSS + MC + grupo 24). No momento em que os camundongos de controle perderam até 20% do seu peso (DSS), o tratamento com DSS é interrompido e substituído com água potável. Os outros tratamentos foram continuados durante 21 dias.

[00329] Três grupos de camundongos de 16 semanas de idade C57BL 6 / (7 camundongos cada) receberam 2,5% de DSS na água potável (Figura 3). Os animais foram tratados por via oral com 200 μl de 0,5 MC sozinho (DSS + grupo MC) ou em conjunto com 40 mg / kg de composto 24 (DSS + MC + grupo 24). Os camundongos foram tratados com DSS durante 6 dias e no ponto em que os camundongos de controle perderam até 15% do seu peso (DSS), todos os camundongos foram sacrificados e seus cólons foram colhidos para análises posteriores.

[00330] Dois pontos foram medidos usando uma régua e para análise histológica foi preparado todo o cólon de acordo com o procedimento do rolo suíço (Whittem et al., "Murine Colitis Modeling using Dextran Sulfate Sodium (DSS)”, J Vis Exp 2010 fixado com formaldeído e embebido em parafina. Seções de 4 μM foram de- parafinadas e coradas com hematoxilina e eosina e analisadas quanto ao tamanho da lesão e outras alterações (Figuras 4-6). Foram comparados os camundongos não tratados e tratados durante o ciclo-DSS com derivados de quinolina em suspensão em metilcelulose ou metil-celulose (MC), apenas. A análise estatística foi realizada através do teste de Mann-Whitney, em que um asterisco indica uma diferença significativa (p <0,5), e dois asteriscos indicam uma diferença muito significativa (p <0,05)

B. Resultados

[00331] Os resultados que são apresentados foram estabelecidos usando o composto derivado de quinolina (24), para os quais a estrutura é representada aqui apresentada adiante para referência:

[00332] Após 5 dias de administração DSS os animais tratados com o derivado de quinolina apresentaram uma perda de peso de menos de 1% em média em contraste com MC ou camundongos não tratados, que apresentaram uma perda de peso compreendida entre 10% e 20% (Figuras 1 e 2).

[00333] Notavelmente, notamos um consumo maior de água em camundongos tratados com o fármaco, que espelha o efeito de amortecimento da doença com os derivados de quinolina. O tratamento com os derivados de quinolina controlou também significativamente a perda de peso em ratos durante a segunda administração de DSS, indicando que os animais não ficam sem resposta e que os derivados de quinolina são adequados para administração repetitiva. Depois de um ciclo de DSS o comprimento do cólon nos camundongos tratados com derivados de quinolina (6,4 cm +/- 0,6 centímetro) era significativamente maior quando comparado com animais tratados apenas com MC (+/- 5,9 cm 0,8 cm) e não tratados (5,8 centímetros +/- 0,8 centímetros) (Figura 3). Esta diferença foi ainda mais evidentes em animais que receberam dois ciclos de DSS, quando o comprimento do cólon nos camundongos tratados com derivados de quinolina (5,7 cm +/- 0,9 cm) foi significativamente maior quando comparado com animais tratados apenas com MC (+/- 4,3 cm 0,5 cm ) e não tratados (+/- 4,4 cm 0,4 cm) (Figura 3). Os animais dos diferentes grupos desenvolveram número comparável de lesões (Figura 4), mas o tamanho médio da área da lesão foi notavelmente inferior em camundongos tratados com derivados de quinolina, ou seja, 2,1 mm2 contra 8,4 mm2 em animais tratados apenas com MC (Figura 5). Esta diferença foi mantida em camundongos expostos a dois ciclos de DSS (3,8 mm2 vs 12,2 mm2).

[00334] Por fim, observou-se uma diminuição de alterações nos órgãos linfóides, tais como placas de Peyer, após dois ciclos DSS, sugerindo que o tratamento com derivados de quinolina modula a resposta imune.

Exemplo 9: Efeito de derivados de quinolina no modelo de artrite induzida pelo colágeno A. Materiais e Métodos

[00335] Modelos de camundongo

[00336] Modelo de artrite induzida por colágeno:

[00337] Grupos de camundongos de 9 a 10 semanas de idade, DBA / 1 foram imunizados intradermicamente com colágeno bovino tipo II emulsificado em uma proporção 1: 1 com adjuvante completo de Freund. Os camundongos foram desafiados 21 dias após a primeira imunização e a aparência fenotípica da artrite foi avaliada através do monitoramento, a cada dois dias, da espessura de cada pata posterior, em que a espessura da articulação do tornozelo foi medida utilizando-se um caliper de marcação (de 0 a 10 mm) de teste calibre usando uma espessura de calibração. Os camundongos foram tratados diariamente durante duas semanas com candidatos derivados de quinolina suspensos em metilcelulose ou metil-celulose (MC) e apenas o desenvolvimento da doença foi então monitorado. A análise estatística foi realizada através do teste de Mann-Whitney, em que um asterisco indica uma diferença significativa (p <0,5).

B. Resultados

[00338] Apenas um fora dos dez camundongos tratados com o composto testado derivado de quinolina (24), apresentou sinais de inflamação (em comparação, 8 dos 10 camundongos tratados com MC desenvolveram a doença). Os camundongos tratados com derivados de quinolina exibiram uma significativa diminuição do edema em comparação com camundongos tratados apenas com MC (1,9 mm em comparação com cerca de 2,2 mm) (Figura 6).

[00339] Sendo assim, o resultado dos ensaios realizados com os compostos revelados na presente invenção mostram que os referidos compostos podem ser úteis para tratar e / ou prevenir doenças inflamatórias, como descrito mais acima.

[00340] Para este fim, uma quantidade eficaz de um referido composto pode ser administrada a um indivíduo que sofre de doenças inflamatórias.

[00341] Assim, um composto de acordo com a presente invenção pode ser preparado na forma de uma composição farmacêutica que pode conter uma quantidade eficaz do referido composto, e um ou mais excipientes farmacêuticos.

[00342] Os excipientes acima mencionados são selecionados de acordo com a forma de dosagem e o modo de administração desejados.

[00343] Neste contexto, eles podem estar presentes em qualquer forma farmacêutica que é adequada para administração entérica ou parentérica, em associação com excipientes apropriados, por exemplo sob a forma de comprimidos simples ou revestidos, de gelatina dura, cápsulas de revestimento mole e outras cápsulas, supositórios, ou de forma potável, tais como suspensões, xaropes, ou soluções injetáveis ou suspensões, em doses que permitem a administração diária de 0,1 a 1000 mg de substância ativa.

[00344] Qualquer via de administração pode ser utilizada. Por exemplo, um composto de fórmula (I) podem ser administrado por via oral, parentérica, intravenosa, transdérmica, intramuscular, retal, sublingual, mucosal, nasal, ou por outros meios. Além disso, um composto de fórmula (I) pode ser administrado numa forma de composição farmacêutica e / ou forma de dosagem unitária.

[00345] Em particular, as composições farmacêuticas da invenção podem ser administradas oralmente e / ou parentericamente.

[00346] Formas de dosagem adequadas incluem, mas não estão limitadas a, cápsulas, comprimidos (incluindo comprimidos de dissolução rápida e de liberação retardada), pó, xaropes, suspensões orais e soluções para administração parentérica.

[00347] A composição farmacêutica também pode conter um outro agente anti- inflamatório, bem conhecido pelo técnico no assunto nesta arte, em combinação com um composto de acordo com a presente invenção. Listagem de Sequências SEQ ID N ° 1 AGGCCUCUCUCUCCGUGUUCACAGCGGACCUUGAUUUAAAUGUCCAUACAAU UAAGGCACGCGGUGAAUGCCAAGAAUGGGGCUG SEQ ID N ° 2 AUCAAGAUUAGAGGCUCUGCUCUCCGUGUUCACAGCGGACCUUGAUUUAAUG UCAUACAAUUAAGGCACGCGGUGAAUGCCAAGAGCGGAGCCUACGGCUGCAC UUGAA SEQ ID N ° 3 UGAGGGCCCCUCUGCGUGUUCACAGCGGACCUUGAUUUAAUGUCUAUACAAU UAAGGCACGCGGUGAAUGCCAAGAGAGGCGCCUCC SEQ ID N ° 4 UAAGGCACGCGGUGAAUGCC SEQ ID N ° 5 CGUGUUCACAGCGGACCUUGAU SEQ ID N ° 6 UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG

Claims (15)

1. Uso in vitro ou ex vivo de, pelo menos, um miRNA, referido pelo menos um miRNA é miR-124, caracterizado pelo fato de ser como um biomarcador para a triagem de um derivado de quinolina e em particular um composto de fórmula (I), presumidamente eficaz no tratamento e / ou prevenção de uma doença inflamatória, em que a fórmula (I) é definida abaixo em que: Z é C ou N, V é C ou N, significa um anel aromático em que V é C ou N e quando V é N, V está em orto, meta ou para de Z, ou seja, forma, respectivamente, uma piridina, uma piridazina, pirimidina ou um grupo pirazina, R representa, independentemente, um átomo de hidrogênio, um grupo metila, um grupo metoxi, um grupo trifluorometila, um grupo trifluorometoxi, um grupo amino, um átomo de halogênio e um grupo -O-P(=O)-(OR3)(OR4) e, mais particularmente, um átomo de flúor ou cloro, um grupo trifluorometoxila e um grupo amino, Q é N ou O, desde que R’’ não exista quando o símbolo Q representa O, R3 e R4 representam, independentemente, um átomo de hidrogênio, Li+, Na+, K+, N+(Ra)4 ou um grupo benzila, Ra representa um átomo de hidrogênio, um grupo (C1-C5) alquila ou um grupo (C3-C6) cicloalquila, n é 1, 2 ou 3, n’ é 1, 2 ou 3, R’ representa, independentemente, um átomo de hidrogênio, um átomo de halogênio e mais particularmente um átomo de flúor ou cloro, um grupo amino, um grupo metila, um grupo -O-P(=O)-(OR3)(OR4) ou grupo em que A é O ou NH, m é 2 ou 3 e X1 representa O, CH2 ou N-CH3, desde que quando R’ é um tal grupo, n' é 1 ou 2, e quando n’ é 2 , o outro grupo R’ é diferente do referido grupo ou alternativamente R’ representa, independentemente, um átomo de hidrogênio, um átomo de halogênio e mais particularmente um átomo de flúor ou cloro, um grupo metila ou um grupo , em que A é O ou NH, m é 2 e X1 representa O, CH2 ou N-CH3, desde que quando R’ é um tal grupo, n' é 1 ou 2, e quando n’ é 2, o outro grupo R’ é diferente do referido grupo, R'' é um átomo de hidrogênio, um grupo (C1-C4) alquila ou um grupo em que m é 2 ou 3 e Xi representa O, CH2 ou N-CH3, ou qualquer um de seus sais farmaceuticamente aceitáveis.

2. Uso in vitro ou ex vivo de acordo com a reivindicação 1 caracterizado pelo fato de que Q representa N.

3. Uso in vitro ou ex vivo de acordo com a reivindicação 1 ou 2 caracterizado pelo fato de que é selecionado dentre: em que R, R’, R’’, n e n’ são tal como definidos na reivindicação 1 ou 2.

4. Método in vitro ou ex vivo para rastreamento de um derivado de quinolina, e em particular um composto de fórmula (I) como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, presumidamente eficaz no tratamento e / ou prevenção de uma doença inflamatória, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos uma etapa de: a) proporcionar uma célula eucariótica, b) colocar em contato a referida célula com um derivado de quinolina e, em particular um composto de fórmula (I), c) medição de uma expressão de miR-124 na referida célula, e d) selecionar o candidato presumidamente eficaz no tratamento e / ou prevenção de uma doença inflamatória quando o nível de expressão de miR-124 medido na etapa c) é aumentado em relação a um valor de referência.

5. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a referida célula eucariótica é uma célula de sangue periférico mononuclear (PBMC).

6. Método de avaliar e seguir a eficácia de um composto de fórmula (I) como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3 caracterizado pelo fato de que compreende a medição da presença ou nível de expressão de miR-124 em uma amostra biológica isolada.

7. Método de acordo com a reivindicação 6 caracterizado pelo fato de que a presença ou o nível de expressão do miR-124 é medido a partir de uma célula eucariótica de uma amostra biológica, e é comparado com um valor de referência de controle.

8. Método de acordo com a reivindicação 6 ou 7 caracterizado pelo fato de que a amostra biológica é selecionada de amostra de um sangue, um plasma, um soro, uma saliva, um fluido intersticial, uma urina; uma amostra de células, tal como uma cultura celular, uma linha celular, uma linha de células estaminais, umas células mononucleares de sangue periférico (PBMC) contendo amostra, uma biopsia de tecido, tal como um tecido oral, um tecido gastrointestinal, uma pele, uma amostra de mucosa oral, ou uma pluralidade de amostras a partir de um ensaio clínico, referida amostra sendo uma amostra bruta ou purificada previamente em vários graus, antes do armazenamento, processamento ou medição.

9. Método de acordo com a reivindicação 7 ou 8 caracterizado pelo fato de que o valor de referência de controle é obtido a partir de uma amostra biológica isolada obtida a partir de uma pessoa ou grupo de pessoas que sabidamente não sofrem de uma doença inflamatória, e/ou não recebem o tratamento cuja eficácia se pretende determinar ou controlar ou alternativamente, o valor de referência de controle é obtido a partir de uma amostra biológica isolada obtida a partir de um paciente que sofre de uma doença inflamatória e que recebe um tratamento cuja eficácia está sendo determinada ou monitorada, em que a amostra biológica isolada é retirada do paciente antes da administração do tratamento.

10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 9 caracterizado pelo fato de que a presença ou nível de expressão de miR-124 é avaliado usando ensaios de ácidos nucleicos ou vetores, tais como transferência de Northern e métodos baseados em PCR.

11. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 10 caracterizado pelo fato de que ele implementa um método para a detecção e quantificação de ácidos nucleicos pode ser um método baseado em hibridação, referidos métodos baseados em hibridação incluindo técnicas de PCR e PCR quantitativa (qRT-PCR ou q-PCR) ou técnicas baseadas em transcriptase / polimerase inversa.

12. Método de acordo com a reivindicação 11 caracterizado pelo fato de que ele compreende, ser ainda combinado, com uma etapa de sequenciação.

13. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 12 caracterizado pelo fato de que ele compreende (i) uma etapa de extração de RNAm celulares, (ii) uma etapa de transcrição reversa do RNAm a DNA utilizando uma transcriptase reversa e (iii) uma etapa de amplificação de DNA a partir do DNA obtido na etapa anterior.

14. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 13 caracterizado pelo fato de que uma modulação da presença ou nível de expressão de miR-124 relativamente à referência de controle, tal como um valor de referência de controle a partir de um doador saudável, pode ser indicativa de uma doença inflamatória.

15. Método de acordo com a reivindicação 14 caracterizado pelo fato de que uma presença reduzida ou suprimida, ou uma diminuição do nível de expressão, do referido miRNA em relação a um valor de referência de controle, tal como um valor de referência de controle a partir de um doador saudável, é indicativa de uma doença inflamatória.