BR122021004187B1 - Kit para identificar bordetella pertussis e/ou bordetella parapertussis - Google Patents

Abstract

A presente invenção se refere a métodos e composições para detectar Bordetella pertussis e Bordetella parapertussis através da detecção da presença das sequências de inserção genômicas IS481 e IS1001, respectivamente.

Description

Campo da Invenção

[001] Esta invenção se refere ao campo da detecção de patógenos.

Antecedentes da Invenção

[002] A seguinte discussão dos antecedentes da invenção é me ramente fornecida para auxiliar o leitor a entender a invenção e não descreve ou constitui a técnica anterior à presente invenção.

[003] A coqueluche é uma doença altamente contagiosa do sis tema respiratório. Os sintomas da coqueluche incluem episódios de tosse violenta seguidos por uma respiração pesada e às vezes vômito. Em casos extremos, esses sintomas levam à hipoxia, dano permanente no cérebro e até morte. A maioria dos casos (80 a 98%) é causada pela pequena bactéria gram-negativa Bordetella pertussis; entretanto, uma minoria significativa dos casos (2 a 20%) é causada por Bordetel- la parapertussis. (Mattoo e outros, Clin. Microbiol. Ver., 18 326 a 382, 2005). Os sintomas da coqueluche causados por B. parapertussis são tipicamente mais leves do que os causados por B. pertussis; entretanto, um diagnóstico diferencial é difícil com base somente em sintomatologia clínica. Muito raramente os sintomas similares aos do pertussis são causados por infecção com B. bronchiseptica ou B. holmesii.

[004] Diagnosticar a coqueluche em seu estado precoce pode ser difícil, porque os sinais e sintomas lembram aqueles de outras doenças respiratórias comuns, tal como resfriado, gripe, ou bronquite. Tra-dicionalmente, as culturas de bactérias foram usadas para diagnosticar definitivamente a coqueluche. O muco é obtido do nariz e/ou da garganta do paciente e enviado para um laboratório médico para cultura. Embora os resultados positivos sejam considerados conclusivos, as culturas de Bordetella tipicamente exigem de 5 a 7 dias para obter um diagnóstico. As culturas bacterianas de Bordetella sp. são também propensas a resultados falso negativos por causa da natureza delicada da bactéria.

[005] Os ensaios com anticorpos, incluindo ELISA, são também usa-dos para diagnosticar Bordetella sp. detectando os antígenos bac- terianos característicos. Mais usualmente, a de detecção da proteína sensível à toxina pertussis é usada como um indício de infecção com Bordetella. Embora esses ensaios baseados em anticorpo tenham boa sensibilidade e especificidade, eles tipicamente exigem uma amostra de sangue do paciente, ao invés de uma amostra de muco obtida de forma não invasiva, e também exigem que a infecção esteja no estágio precoce e/ou convalescente. Esses ensaios são então propensos a resultados falso negativos se a amostra do paciente não é obtida na hora apropriada no processo da doença.

[006] Outros métodos para detectar a infecção com Bordetella incluem teste de anticorpo fluorescente direto (DFA) e vários métodos baseados em PCR. O teste DFA tem a vantagem de ser capaz de detectar a Bordetella usando amostras de muco obtidas de forma não invasiva, mas sofre de uma ausência de sensibilidade. Os ensaios baseados em PCR estão se tornando mais amplamente usados.

Sumário da Invenção

[007] A presente invenção fornece composições e métodos para determinar a presença ou ausência de Bordetella pertussis e/ou Bor- detella parapertussis em uma amostra biológica. A invenção pode também ser usada sozinha, ou em combinação com sintomas clínicos ou outros indicadores, para diagnosticar um indivíduo como tendo coqueluche. Especificamente, a presente invenção habilita a detecção de bactéria patogênica (Bordetella spp.) conhecida por causar a coqueluche detectando-se a presença de ácidos nucleicos bacterianos na amostra. A metodologia de detecção é baseada na constatação de se-quências-alvos particulares dentro dos genomas bacterianos que são indicadores úteis de infecção bacteriana.

[008] Consequentemente, em um aspecto, a invenção fornece um método para determinar a presença ou ausência de Bordetella pertussis e/ou Bordetella parapertussis em uma amostra biológica, detectando-se a presença ou ausência de: (a) um ácido nucleico-alvo IS481 tendo ao menos 14 nucle- otídeos contíguos que são ao menos 95% idênticos à SEQ ID NO: 2 ou um complemento desse, e (b) um ácido nucleico-alvo IS1001 tendo ao menos 14 nu- cleotídeos contíguos que são ao menos 95% idênticos à SEQ ID NO: 8 ou um complemento desse, onde a presença do dito ácido nucleico-alvo IS481 identifica a presença de B. pertussis, e a presença do dito ácido nucleico-alvo IS1001 identifica a presença de B. parapertussis.

[009] Em algumas modalidades, um ou ambos dentre o ácido nu- cleico-alvo IS481 e o ácido nucleico-alvo IS1001 são amplificados (por exemplo, por PCR).

[010] Em outra modalidade, o método inclui as etapas de: (a) fornecer um primeiro par de iniciadores adequado para amplificar o ácido nucleico-alvo IS481 ou um fragmento dele, e fornecer um segundo par de iniciadores adequado para amplificar o ácido nucleico-alvo IS1001 ou um fragmento desse, (b) executar uma reação de extensão de iniciador multiplex compreendendo os pares de iniciadores da etapa (a) sob condições adequadas para produzir um primeiro produto da reação quando o ácido nucleico-alvo IS481 está presente na amostra, e um segundo produto da reação quando o ácido nucleico-alvo IS1001 está presente na amostra; e (c) determinar a presença ou ausência de Bordetella pertussis detectando a presença ou ausência de um primeiro produto de reação tendo ao menos 14 nucleotídeos contíguos que são ao menos 95% idênticos à sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 2 ou um complemento dela, e/ou determinar a presença ou ausência de Borde- tella parapertussis detectando a presença ou ausência de um segundo produto de reação tendo ao menos 14 nucleotídeos contíguos que são ao menos 95% idênticos à sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 8 ou um complemento dela.

[011] Em outro aspecto, a invenção também fornece um método para determinar a presença ou ausência de Bordetella pertussis em uma amostra biológica detectando a presença ou ausência de um ácido nucleico-alvo IS481 tendo ao menos 14 nucleotídeos contíguos de SEQ ID NO: 2, ou um complemento dela.

[012] Em uma modalidade, o método para detectar B. pertussis inclui as etapas de: (a) fornecer um par de iniciadores adequado para amplificar um ácido nucleico-alvo IS481 ou um fragmento dele; (b) executar uma reação de extensão de iniciador compreendendo o par de iniciadores da etapa (a) sob condições adequadas para produzir um produto de reação quando o ácido nucleico-alvo IS481 está presente na dita amostra; e (c) determinar a presença ou ausência de Bordetella pertussis detectando a presença ou ausência de um produto de reação tendo ao menos 14 nucleotídeos contíguos que são ao menos 95% idênticos à sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 2 ou um complemento dela.

[013] Em outro aspecto, a invenção também fornece um método para determinar a presença ou ausência de Bordetella parapertussis em uma amostra biológica detectando a presença ou ausência de um ácido nucleico-alvo IS1001 tendo ao menos 14 nucleotídeos contíguos de SEQ ID NO: 8, ou um complemento dela.

[014] Em uma modalidade, o método para detectar B. parapertus sis inclui as etapas de: (a) fornecer um par de iniciadores adequado para amplificar um ácido nucleico-alvo IS1001 ou um fragmento dele; (b) executar uma reação de extensão de iniciador compreendendo o par de iniciador da etapa (a) sob condições adequadas para produzir um produto de reação quando o ácido nucleico-alvo IS1001 está presente na dita amostra; e (c) determinar a presença ou ausência de Bordetella parapertussis detectando a presença ou ausência de um produto de reação tendo ao menos 14 nucleotídeos contíguos que são ao menos 95% idênticos à sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 8 ou um complemento dela.

[015] Em modalidades preferenciais de todos os aspectos desta invenção, o produto da reação com IS481 contém ao menos 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 125, ou 140 ácidos nucleicos contíguos que são ao menos 95% (por exemplo, ao menos 99% ou 100%) idênticos à SEQ ID NO: 2, ou complementos dela. Em outras modalidades preferenciais, o produto de reação com IS481 é ao menos 95% (por exemplo, ao menos 99% ou 100%) idêntico a ao menos 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, ou 85 ácidos nucleicos contíguos de SEQ ID NO: 3, ou complementos dela. Em outras modalidades preferenciais, o produto de reação com IS481 tem menos de aproximadamente 175, 150, 125, 100, ou 75 ácidos nucleicos de comprimento.

[016] Em outras modalidades preferenciais, ao menos um dos iniciadores de IS481 (isto é, iniciadores adequados para amplificar IS481 ou um fragmento desse) compreende um ácido nucleico tendo a sequência de SEQ ID NO: 4 ou 5, ou um complemento dessa. Em uma modalidade, o ácido nucleico-alvo IS481 é detectado usando uma sonda de oligonucleotídeo. A sonda de oligonucleotídeo preferencialmente tem a sequência de SEQ ID NO: 6 ou 27, ou complementos dela e é detectavelmente marcada. Em outras modalidades preferenciais, a marcação detectável é uma marcação fluorescente.

[017] Em modalidades preferenciais de todos os aspectos desta invenção, o produto de reação com IS1001 contém ao menos 20, 25, 30, 35, 40. 45, 50, 75, 100, 125, 140, 160, ou 180 ácidos nucleicos contíguos que são ao menos 95% (por exemplo, ao menos 99% ou 100%) idênticos à SEQ ID NO: 8, ou complementos dela. Em outras modalidades preferenciais, o produto de reação com IS1001 é ao menos 95% (por exemplo, ao menos 99% ou 100%) idêntico a ao menos 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, ou 70 ácidos nucleicos contíguos de SEQ ID NO: 9, ou complementos dela. Em outras modalidades preferenciais, o ácido nucleico-alvo IS1001 tem menos de aproximadamente 175, 150, 125, 100, ou 75 ácidos nucleicos de comprimento.

[018] Em outras modalidades preferenciais, ao menos um dos iniciadores de IS1001 (isto é, iniciadores adequados para amplificar IS1001 ou um fragmento dele) compreende um ácido nucleico tendo a sequência de SEQ ID NO: 10 ou 11, ou um complemento dessa. Em uma modalidade, o ácido nucleico-alvo IS1001 é detectado usando uma sonda de oligonucleotídeo. A sonda de oligonucleotídeo preferencialmente tem a sequência de SEQ ID NO: 12, ou complementos dela e é detectavelmente marcada. Em outras modalidades preferenciais, a marca detectável é uma marca fluorescente.

[019] Em outras modalidades preferenciais de qualquer dos mé todos anteriores, o método adicionalmente compreende PCR em tempo real. Em outras modalidades, ao menos um dos iniciadores é iniciador Scorpion. Os iniciadores Scorpion de IS481 adequados incluem, por exemplo, um iniciador de ácido nucleico tendo a sequência de SEQ ID NO: 13 ou 28, ou complemento dela. Os iniciadores Scorpion de IS1001 adequados incluem, por exemplo, um iniciador de ácido nu- cleico tendo a sequência de SEQ ID NO: 14, ou um complemento dela.

[020] Em outro aspecto, a invenção fornece ácidos nucleicos iso lados codificando um ácido nucleico-alvo IS481. O ácido nucleico-alvo IS481 é substancialmente idêntico a ao menos 20 (por exemplo, ao menos 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 125, ou 140) nucleotídeos contíguos de SEQ ID NO: 2, ou um complemento dela, e tem menos de 1000 nucleotídeos de comprimento (por exemplo, menos de 750, 500, 250, 200, 175, 150, 125, 100, ou 75 nucleotídeos). Em uma modalidade, o ácido nucleico-alvo IS481 contém uma sequência de nucleotídeo que é substancialmente idêntica a ao menos 20 nucleotídeos contíguos de SEQ ID NO: 3.

[021] Em outro aspecto, a invenção fornece ácidos nucleicos iso lados codificando um ácido nucleico-alvo IS1001. O ácido nucleico- alvo IS1001 é substancialmente idêntico a ao menos 20 (por exemplo, ao menos 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 125, 150 ou 175) nucleotí- deos contíguos de SEQ ID NO: 8, ou um complemento dela, e tem menos de 1000 nucleotídeos de comprimento (por exemplo, menos de 750, 500, 250, 200, 175, 150, 125, 100, ou 75 nucleotídeos). Em uma modalidade, o ácido nucleico-alvo IS1001 contém uma sequência de nucleotídeo que é substancialmente idêntica a ao menos 20 nucleotí- deos contíguos de SEQ ID NO: 9.

[022] Em outro aspecto, a invenção fornece iniciadores e sondas de oligonucleotídeos adequadas para amplificar e/ou detectar um ácido nucleico-alvo IS481 ou um ácido nucleico-alvo IS1001. Os iniciadores de IS481 e sondas da invenção têm 10 a 50 nucleotídeos de comprimento (por exemplo, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 25, 30, 35, 40, ou 45) e são substancialmente idênticos, preferencialmente 100% idênticos) à sequência de nucleotídeo correspondente de SEQ ID NO: 2. Os inicia- dores de IS1001 e sondas da invenção têm 10 a 50 nucleotídeos de comprimento (por exemplo, 12, 14, 16, 18 20, 22, 25, 30, 35, 40, ou 45) e são substancialmente idênticos, preferencialmente 100% idênticos) à sequência correspondente de SEQ ID NO: 8. Em modalidades preferenciais, os iniciadores de IS481 e sondas têm uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NOs: 4 a 6 ou 27. Em outras modalidades preferenciais, os iniciadores de IS1001 e sondas têm uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NOs: 10 a 12.

[023] Em outro aspecto, a invenção fornece iniciadores Scorpion para amplificar e detectar um ácido nucleico-alvo IS481 e um ácido nu- cleico-alvo IS1001, onde o iniciador Scorpion compreende uma sequência de sonda de oligonucleotídeo e uma sequência de iniciador de oligonucleotídeo, cada uma das quais individualmente obedece às exigências de uma sonda e iniciador de oligonucleotídeo, respectivamente. Em modalidades preferenciais, o iniciador Scorpion de IS481 tem a sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 13. Em outras modalidades preferenciais, o iniciador Scorpion IS1001 tem a sequência de nucleo- tídeo de SEQ ID NO: 14.

[024] Em outro aspecto, a invenção fornece um kit contendo: (a) um primeiro par de iniciadores que especificamente hi- bridiza com um ácido nucleico tendo a sequência de SEQ ID NO: 2 ou um complemento dela e uma primeira sonda capaz de especificamente hibridizar com um ácido nucleico tendo a sequência de SEQ ID NO: 2 ou um complemento dela, e (b) um segundo par de iniciadores que especificamente hi- bridiza com a sequência de SEQ ID NO: 8 ou um complemento dela, e uma segunda sonda capaz de especificamente hibridizar com um ácido nucleico tendo a sequência de SEQ ID NO: 8 ou um complemento dela.

[025] Em modalidades preferenciais, o primeiro par de iniciadores e/ou a primeira sonda são capazes de especificamente hibridizar com um ácido nucleico tendo a sequência de SEQ ID NO: 3, ou um complemento dela. Os membros preferenciais do primeiro par de iniciadores têm as sequências de SEQ ID NOs: 4-5, ou complementos dela, e uma primeira sonda preferencial tem a sequência de SEQ ID NO: 6 ou 27, ou complementos dela.

[026] Em outras modalidades preferenciais, o segundo par de iniciadores e/ou a segunda sonda são capazes de especificamente hibridizar com um ácido nucleico tendo a sequência de SEQ ID NO: 9, ou um complemento dela. Os membros preferenciais do segundo par de iniciadores têm as sequências de SEQ ID NOs:10-11, ou complementos dela, e uma segunda sonda preferencial tem a sequência de SEQ ID NO: 12.

[027] Preferencialmente, as sondas adicionalmente compreendem uma marcação detectável (por exemplo, uma marcação fluorescente).

Breve Descrição das Figuras

[028] A FIG. 1 é a sequência de nucleotídeo da sequência de in serção IS481 de B. pertussis fornecida pelo GenBank No Acesso M28220 (SEQ ID NO: 1).

[029] A FIG. 2 é a sequência de nucleotídeo da sequência de in serção IS1001 de B. parapertussis fornecida pelo GenBank No Acesso X66858 (SEQ ID NO: 7).

Descrição Detalhada da Invenção

[030] A presente invenção fornece métodos, composições, e kits adequados para identificar Bodetella pertussis e/ou Bordetella parapertussis, os patógenos mais usualmente associados com a coqueluche. A invenção é baseada na detecção PCR em tempo real da sequência de inserção IS481 de B. pertussis e/ou a sequência de inserção IS1001 de B. parapertussis em uma amostra biológica obtida a partir de um indivíduo. Essas sequências de inserção são vantajosamente usadas para ensaios de diagnóstico baseados em PCR porque elas têm um número de cópia genômica relativamente alto. O genoma de B. pertussis tipicamente contém aproximadamente 100 a 200 cópias da sequência US481. E, o genoma de B. parapertussis tipicamente contém aproximadamente 20 cópias da sequência IS1001.

[031] Como usadas aqui, a menos que de outra forma determinado, as formas singulares "um", "uma", e "o", "a" incluem referência plural. Assim, por exemplo, uma referência a "um oligonucleotídeo" inclui uma pluralidade de moléculas de oligonucleotídeo, e uma referência a "um ácido nucleico" é uma referência a um ou mais ácidos nucleicos.

[032] Como usado aqui, "aproximadamente" significa mais ou mais 10%.

[033] Os termos "amplificação" ou "amplificar", como usados aqui, incluem métodos para copiar um ácido nucleico-alvo, aumentando desse modo o número de cópias de uma sequência de ácido nu- cleico selecionada. A amplificação pode ser exponencial ou linear. Um ácido nucleico-alvo pode ser ou DNA ou RNA. As sequências amplificadas dessa maneira formam um "amplicon" ou "produto de amplificação". Enquanto os métodos exemplificados descritos aqui se referem à amplificação usando a reação em cadeia da polimerase (PCR), numerosos outros métodos são conhecidos na técnica para amplificação de ácidos nucleicos (por exemplo, métodos isotérmicos, métodos de círculo rolante, etc.). Os versados na técnica entenderão que esses outros métodos podem ser usados ou em lugar de, ou junto com os métodos PCR. Ver, por exemplo, Saiki, "Amplification of Genomic DNA" in PCR Protocols, Innis e outros, Eds., Academic Press, San Diego, CA 1990, pág. 13 a 20, Wharam e outros, Nucleic Acids Res, 1 de junho de 2001, 29(11) E54-E54, Hafner e outros, Biotechniques, Abril de 2001, 30(4) 852 a 856, 858, 860, Zhong e outros , Biotechniques Abril de 2001, 30(4) 852 a 856, 858, 860.

[034] O termo "complemento", "complementariedade", ou "com- plementar", como usado aqui, com relação a polinucleotídeos (isto é, uma sequência de nucleotídeos tal como um oligonucleotídeo ou um ácido nucleico-alvo) se refere a regras de pareamento de Wat- son/Crick padrão. O complemento de uma sequência de ácido nuclei- co tal que a extremidade 5’ de uma sequência é pareada com a extre-midade 3’ da outra, está em "associação antiparalela". Por exemplo, a sequência "5’-A-G-T-3’" é complementar à sequência "3’-T-C-A-5’". Certas bases não encontradas usualmente em ácidos nucleicos naturais podem ser incluídas nos ácidos nucleicos descritos aqui; esses incluem, por exemplo, inosina, 7-deazaguanina, Ácidos Nucleicos Bloqueados (LNA), e Ácidos Nucleicos de Peptídeos (PNA). A comple- mentariedade não precisa ser perfeita; dúplices estáveis podem conter pares base que não combinam, degenerativos, ou bases que não combinam. Os versados na técnica de tecnologia de ácido nucleico podem determinar a estabilidade de duplex empiricamente considerando um número de variáveis incluindo, por exemplo, o comprimento do oligonucleotídeo, composição base e sequência do oligonucleotí- deo, resistência iônica e incidência de pares base que não combinam. Uma sequência complemento pode também ser uma sequência de RNA complementar à sequência de DNA ou sua sequência complemento, e pode também ser um cDNA. O termo "substancialmente complementar", como usado aqui, significa que duas sequências especificamente hibridizam (definido abaixo). Os versados na técnica entenderão que sequências substancialmente complementares não precisam hibridizar ao longo de seu comprimento inteiro.

[035] Como usado aqui, o termo "detectar" usado no contexto de detectar um sinal a partir de uma marcação detectável para indicar a presença de um ácido nucleico-alvo na amostra não exige que o método forneça 100% de sensibilidade e/ou 100% de especificidade. Como bem se sabe, "sensibilidade" é a probabilidade de que um teste seja positivo, dado que a pessoa tem uma sequência de ácido nuclei- co-alvo, enquanto "especificidade" é a probabilidade de que um teste seja negativo, dado que a pessoa não tem a sequência de ácido nu- cleico-alvo. Uma sensibilidade de ao menos 50% é preferencial, embora sensibilidades de ao menos 60%, ao menos 70%, ao menos 80%, ao menos 90%, e ao menos 99% são claramente mais preferenciais. Detectar também abrange ensaios com falso positivos e falso negativos. As taxas falso negativas podem ser 1%, 5%, 10%, 15%, 20% ou até maiores. As taxas falso positivas podem ser 1%, 5%, 10%, 15%, 20% ou até maiores.

[036] Um "fragmento" no contexto de um fragmento de gene se refere a uma sequência de resíduos de nucleotídeo que são ao menos aproximadamente 20 nucleotídeos, ao menos aproximadamente 25 nucleotídeos, ao menos aproximadamente 30 nucleotídeos, ao menos aproximadamente 40 nucleotídeos, ao menos aproximadamente 50 nucleotídeos, ou ao menos aproximadamente 100 nucleotídeos. O fragmento é tipicamente menos do que aproximadamente 400 nucleotí- deos, menos do que aproximadamente 300 nucleotídeos, menos do que aproximadamente 250 nucleotídeos, menos do que aproximadamente 200 nucleotídeos, ou menos do que aproximadamente 150 nu- cleotídeos. Em certas modalidades, os fragmentos podem ser usados em vários procedimentos de hibridização ou procedimentos de micro- arranjos para identificar patógenos específicos.

[037] Por "isolado", quando se referindo a um ácido nucleico (por exemplo, um oligonucleotídeo) significa um ácido nucleico que é separado de uma parte substancial do genoma no qual ele naturalmente ocorre. Por exemplo, qualquer ácido nucleico que foi produzido sinteticamente (por exemplo, por condensação de base serial) é considerado como sendo isolado. Igualmente, os ácidos nucleicos que são recom- binantemente expressos, produzidos por uma reação de extensão de iniciador (por exemplo, PCR), ou de outra forma, cortado de um geno- ma, são também considerados como sendo isolados.

[038] O termo "reação de extensão de iniciador multiplex", como usado aqui, se refere a uma reação de extensão de iniciador que é capaz de simultaneamente produzir cópias complementares de dois ou mais ácidos nucleicos-alvos dentro do mesmo recipiente reacional. Cada produto de reação é iniciado usando um par de iniciadores distinto. Uma reação multiplex pode adicionalmente incluir sondas específicas para cada produto que são detectavelmente marcadas com diferentes porções de- tectáveis. Em modalidades preferenciais, a reação de extensão de iniciador multiplex é uma PCR multiplex na qual dois ou mais produtos dentro do mesmo recipiente reacional são amplificados.

[039] Como usado aqui, o termo "oligonucleotídeo" se refere a um polímero curto composto de desoxirribonucleotídeos, ribonucleotí- deos, ou qualquer combinação desses. Os oligonucleotídeos têm geralmente entre aproximadamente 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 a aproximadamente 150 nucleotídeos (nt) de comprimento, mais preferencialmente, aproximadamente 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 a aproximadamente 70 nt, e mais preferencialmente entre aproximadamente 18 a aproximadamente 26 nt de comprimento. O código de única letra para nucleotí- deos é como descrito no Manual de Escritório de Patentes U.S. do Procedimento de Exame de Patentes, seção 2422, tabela 1. Nesse aspecto, a designação de nucleotídeo "R" significa purina, tal como guanina ou adenina, "Y" significa pirimidina, tal como citosina ou timi- dina (uracila se RNA); e "M" significa adenina ou citosina. Um oligonu- cleotídeo pode ser usado como um iniciador ou uma sonda.

[040] Os oligonucleotídeos usados como iniciadores ou sondas para especificamente amplificar (isto é, amplificar uma sequência de ácido nucleico-alvo particular) ou especificamente detectar (isto é, detectar uma sequência de ácido nucleico-alvo particular) um ácido nu- cleico-alvo geralmente são capazes de especificamente hibridizar com o ácido nucleico-alvo.

[041] Por "patógeno" entende-se qualquer organismo microbiano capaz de causar coqueluche ou uma condição relacionada em um mamífero (por exemplo, um ser humano). Os patógenos específicos incluem, por exemplo, Bordetella pertussis e Bordetella parapertussis.

[042] Como usado aqui, um "iniciador" para amplificação é um oligonucleotídeo que é complementar a uma sequência de nucleotídeo alvo e leva à adição de nucleotídeos na extremidade 3’ do iniciador na presença de um DNA ou RNA polimerase. O nucleotídeo 3’ do iniciador deveria geralmente ser idêntico à sequência-alvo em uma posição de nucleotídeo correspondente para expressão e amplificação ótimas. O termo "iniciador", como usado aqui, inclui todas as formas de iniciador que podem ser sintetizadas incluindo iniciadores de ácido nucleico de peptídeo, iniciadores de ácido nucleico bloqueados, iniciadores modificados por fosforotioato, iniciadores marcados, e seus similares. Como usado aqui, um "iniciador direto" é um iniciador que é complementar ao filamento antissenso de dsDNA. Um "iniciador reverso" é complementar ao filamento senso de dsDNA. Um "par de iniciadores" se refere à combinação de um iniciador direto e um iniciador reverso, cada um específico para o mesmo ácido nucleico-alvo.

[043] Os iniciadores têm tipicamente entre aproximadamente 10 e aproximadamente 100 nucleotídeos de comprimento, preferencialmente entre aproximadamente 10 e aproximadamente 60 nucleotídeos de comprimento, e mais preferencialmente, entre aproximadamente 13 e aproximadamente 25 nucleotídeos de comprimento (por exemplo, 13, 15, 17, 19, 21 ou 23 nucleotídeos de comprimento). Não há comprimento padrão para a hibridização ótima ou amplificação da reação em cadeia da polimerase. Um comprimento ótimo para uma aplicação de iniciador particular pode ser prontamente determinado da maneira descrita em H. Erhch, PCR Technology, Principles and Application for DNA Amplification, (1989).

[044] Um oligonucleotídeo (por exemplo, uma sonda ou um inici ador) que é específico para um ácido nucleico-alvo "hibridizará" com o ácido nucleico-alvo sob condições adequadas. Como usado aqui, "hi- bridização" ou "hibridizar" se refere ao processo pelo qual um único filamento de oligonucleotídeo anela com um filamento complementar através do pareamento base sob condições de hibridização definidas.

[045] Por "reação de extensão de iniciador" entende-se uma rea ção sintética na qual um iniciador de oligonucleotídeo hibridiza com um ácido nucleico-alvo e uma cópia complementar do ácido nucleico-alvo é produzida pela adição em 3’ dependente da polimerase dos nucleo- tídeos complementares individuais. Em modalidades preferenciais, a reação de extensão de iniciador é PCR.

[046] Como usado aqui, o termo "amostra" ou "amostra biológica" se refere a amostras clínicas obtidas a partir de um paciente (por exemplo, um paciente humano). Em modalidades preferenciais, uma amostra é obtida de tecido, fluido corporal, ou micro-organismos coletados de um sujeito. As fontes de amostra incluem, mas não estão limitadas a, muco, saliva (processada ou não processada), lavagem broncoalveolar (BAL), lavagem brônquica (BW), sangue (por exemplo, sangue integral, plasma, e soro), fluidos corporais, fluido cerebroespi- nhal (CSF), urina, plasma, soro ou tecido (por exemplo, material de biópsia). As fontes de amostra preferenciais incluem amostras da garganta e/ou nasofaringeais.

[047] Como usado aqui, "iniciador Scorpion" se refere a um oligo- nucleotídeo compreendendo um iniciador 3’ com uma cauda de sonda se estendendo em 5’ compreendendo uma estrutura em forma de grampo de cabelo que possui um par fluoróforo/agente de arrefecimento. Opcionalmente, o iniciador Scorpion adicionalmente contém um bloqueador de amplificação (por exemplo, hexetileno glicol "HEG") separando a porção de sonda da porção de iniciador. Como descrito mais detalhadamente aqui, os iniciadores Scorpion® são exemplos de iniciadores Scorpion.

[048] Como usado aqui, o termo "sistema de detecção Scor pion®" se refere a um método para PCR em tempo real. Esse método utiliza uma molécula bifuncional (referida aqui como um "Scorpion®"), que contém um elemento iniciador PCR covalentemente ligado por um grupo de bloqueio da polimerase a um elemento de sonda. Adicionalmente, cada molécula de Scorpion® contém um flu- oróforo que interage com um agente de arrefecimento para reduzir a fluorescência de fundo.

[049] "Hibridização específica" é uma indicação de que duas se quências de ácido nucleico compartilham um alto grau de complemen- tariedade. Os complexos de hibridização específicos foram sob condições de anelamento permissivas e permanecem hibridizados após quaisquer etapas de lavagem subsequentes. As condições permissivas para anelamento de sequências de ácido nucleico são usualmente determináveis por um versado na técnica e podem ocorrer, por exemplo, a 65° C na presença de aproximadamente 6xSSC. A severidade da hibridização pode ser expressa, em parte, com relação à temperatura sob a qual as etapas de lavagem são executadas. Tais temperaturas são tipicamente selecionadas como sendo aproximadamente 5° C a 20° C mais baixas do que o ponto de fusão térmica (Tm) para a sequência específica em uma resistência iônica definida e pH. A Tm é a temperatura (sob resistência iônica definida e pH) na qual 50% da se-quência-alvo hibridiza com uma sonda perfeitamente combinada. As equações para calcular Tm e as condições para hibridização de ácido nucleico são conhecidas na técnica.

[050] Como usado aqui, um oligonucleotídeo é "específico" para um ácido nucleico, se o oligonucleotídeo tem ao menos 50% de identidade de sequência com uma parte do ácido nucleico quando o oligo- nucleotídeo e o ácido nucleico estão alinhados. Um oligonucleotídeo que é específico para um ácido nucleico é um que, sob as condições de hibridização ou lavagem apropriadas, é capaz de hibridizar com o alvo de interesse e não substancialmente hibridizar com ácidos nuclei- cos que não são de interesse. Níveis mais altos de identidade de sequência são preferenciais e incluem ao menos 75%, ao menos 80%, ao menos 85%, ao menos 90%, ao menos 95%, e mais preferencialmente ao menos 98% de identidade de sequência. A identidade de sequência pode ser determinada usando um programa de computador comercialmente disponível com uma configuração padrão que emprega algoritmos bem conhecidos na técnica. Como usado aqui, sequên-cias que têm "alta identidade de sequência", têm nucleotídeos idênticos ao menos em aproximadamente 50% das posições de nucleotídeo alinhadas, preferencialmente ao menos em aproximadamente 60% das posições de nucleotídeo alinhadas, e mais preferencialmente ao menos aproximadamente 75% das posições de nucleotídeo alinhadas.

[051] Como usado aqui, o termo "substancialmente idêntico", quando se referindo a um ácido nucleico, é um que tem ao menos 80%, 85%, 90%, 95%, ou 99% de identidade de sequência com uma sequência de ácido nucleico de referência. O comprimento de comparação é preferencialmente o comprimento total do ácido nucleico, mas é geralmente ao menos 20 nucleotídeos, 30 nucleotídeos, 40 nucleotí- deos, 50 nucleotídeos, 75 nucleotídeos, 100 nucleotídeos, 125 nucleo- tídeos, ou mais.

[052] Por "adequado para amplificação", quando se referindo ao iniciador de oligonucleotídeo ou pares de iniciadores, entende-se iniciadores que especificamente hibridizam com um ácido nucleico-alvo e são capazes de fornecer um sítio de iniciação para uma reação de ex- tensão de iniciador na qual uma cópia complementar do ácido nuclei- co-alvo é sintetizada.

[053] O termo "ácido nucleico-alvo" ou "sequência-alvo", como usado aqui, se refere a uma sequência que inclui um segmento de nu- cleotídeos de interesse a ser amplificado e detectado. As cópias da sequência-alvo que são geradas durante a reação de amplificação são referidas como produtos de amplificação, amplímeros, ou amplicons. O ácido nucleico-alvo pode ser composto de segmentos de um cromossomo, um gene completo com ou sem sequência intergênica, segmentos ou partes de um gene com ou sem sequência intergênica, ou sequência de ácidos nucleicos que sondas ou iniciadores são designados. Os ácidos nucleicos-alvos podem incluir uma sequência de ocorrência natural, uma mutação, deleção ou duplicação, regiões de repetição acoplada, um gene de interesse, uma região de um gene de interesse ou qualquer região a montante ou a jusante dessa. Os ácidos nucleicos- alvos podem representar sequências alternativas ou alelos de um gene particular. Os ácidos nucleicos-alvos podem ser derivados de DNA ge- nômico, cDNA, ou RNA. Como usado aqui, o ácido nucleico-alvo pode ser DNA ou RNA extraído de uma célula ou ácido nucleico copiado ou amplificado a partir dessa, ou pode inclui ácidos nucleicos extraídos adicionalmente convertidos usando uma reação bissulfito.

[054] Como usado aqui, "sistema de detecção PCR TaqMan®" se refere a um método para PCR em tempo real. Nesse método, uma sonda TaqMan® que hibridiza com o segmento de ácido nucleico amplificado é incluída na mistura de reação PCR. A sonda TaqMan® compreende um doador e um fluoróforo/agente de arrefecimento em qualquer extremidade da sonda e em proximidade bastante um com o outro, tal que a fluorescência do doador é obtida pelo agente de arrefecimento. Entretanto, quando a sonda hibridiza com o segmento amplificado, a atividade de 5’-exonuclease da Taq polimerase cliva a son- da permitindo desse modo que o fluoróforo doador emita fluorescência que pode ser detectada.

Coleta e Preparação de Amostra Biológica

[055] Os métodos e composições desta invenção podem ser usados para detectar patógenos que causam coqueluche detectandose os ácidos nucleicos patógenos em uma amostra biológica obtida de um indivíduo. As amostras para detecção de patógeno podem também compreender culturas de bactérias isoladas cultivadas em meio apropriado para formar colônias, onde as culturas foram preparadas a partir de uma amostra biológica obtida a partir de um indivíduo.

[056] O ácido nucleico (DNA ou RNA) pode ser isolado da amos tra de acordo com quaisquer métodos bem conhecidos pelos versados na técnica. Se necessário, a amostra pode ser coletada ou concentrada por centrifugação e seus similares. As células da amostra podem ser submetidas à lise, tal como por tratamentos com enzimas, calor, tensoativos, ultrassonicação, ou uma combinação desses. O tratamento de lise é executado de modo a obter uma quantidade suficiente de DNA derivada dos patógenos, se presentes na amostra, para detectar usando a reação em cadeia da polimerase.

[057] Vários métodos de extração de DNA são adequados para isolar o DNA. Os métodos adequados incluem extração de fenol e clorofórmio. Ver, Maniatis e outros, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d, Cold Spπng Harbor Laboratory Press, páginas 16 a 54 (1989). Numerosos kits comerciais também fornecem DNA adequado incluindo, mas não limitado ao mini kit de sangue Q1Aamp®, Agencourt Genfind®, Roche Cobas® Roche MagNA Pure® ou extração fe- nol:clorofórmio usando Eppendorf Phase Lock Gels®.

Ácidos Nucleicos-alvos e Iniciadores

[058] Em várias modalidades da presente invenção, os iniciado res de oligonucleotídeos e sondas são usados nos métodos descritos aqui para amplificar e detectar sequências-alvos de patógenos. Em certas modalidades, os ácidos nucleicos-alvos podem incluir a sequência de inserção IS481 (e fragmentos dela) de B. pertussis, e a sequência de inserção (e fragmentos dela) de B. parapertussis. Em adição, os iniciadores podem também ser usados para amplificar uma ou mais sequências de ácido nucleico de controle. Os ácidos nucleicos- alvos descritos aqui podem ser detectados unicamente ou em um formato multiplex, utilizando marcações individuais para cada alvo.

[059] Os versados na técnica são capazes de designar e prepa rar iniciadores que são apropriados para amplificar uma sequência- alvo em vista desta descrição. O comprimento dos iniciadores de amplificação para uso na presente invenção depende de vários fatores incluindo a identidade de sequência de nucleotídeo e a temperatura na qual esses ácidos nucleicos são hibridizados ou usados durante a amplificação de ácido nucleico in vitro. As considerações necessárias para determinar um comprimento preferencial para um iniciador de amplificação de uma identidade de sequência particular são bem conhecidas pelos versados na técnica.

[060] Os iniciadores que amplificam uma molécula de ácido nu- cleico podem ser designados usando, por exemplo, um programa de computador tal como OLIGO (Molecular Biology Insights, Inc., Cascade, CO). Importantes características quando designando oligonucleotí- deos a serem usados como iniciadores de amplificação incluem, mas não estão limitadas a um produto de amplificação de tamanho apropriado para facilitar a detecção (por exemplo, por eletroforese ou PCR em tempo real), temperaturas de fusão similares para os membros de um par de iniciadores, e o comprimento de cada iniciador (isto é, os iniciadores precisam ser longos o bastante para anelar com especificidade de sequência e para iniciar a síntese, mas não tão longos que a fidelidade seja reduzida durante a síntese de oligonucleotídeo). Tipi- camente, os iniciadores de oligonucleotídeo têm 15 a 35 nucleotídeos de comprimento.

[061] Designação dos oligonucleotídeos a serem usados como sondas de hibridização pode ser executada de uma maneira similar à designação dos iniciadores. Como com os iniciadores de oligonucleo- tídeo, as sondas de oligonucleotídeo usualmente têm temperaturas de fusão similares, e o comprimento de cada sonda precisa ser suficiente para que a hibridização sequência-específica ocorra, mas não tão longo que a fidelidade seja reduzida durante a síntese. As sondas de oli- gonucleotídeos têm geralmente 15 a 60 nucleotídeos de comprimento.

[062] Em algumas modalidades, uma mistura de iniciadores é fornecida tendo degeneração em uma ou mais posições de nucleotí- deo. Os iniciadores degenerados são usados em PCR, onde a variabilidade existe na sequência-alvo, isto é, a informação da sequência é ambígua. Tipicamente, os iniciadores degenerados exibirão variabilidade em não mais do que aproximadamente 4, não mais do que aproximadamente 3, preferencialmente não mais do que aproximadamente 2, e mais preferencialmente, não mais do que aproximadamente 1 posição de nucleotídeo.

[063] Em uma modalidade adequada, PCR é executada usando uma combinação iniciador/sonda bifuncional (por exemplo, iniciador Scorpion®). Os iniciadores Scorpion, como usados na presente invenção, compreendem um iniciador em 3’ com uma cauda de sonda estendida em 5’ compreendendo uma estrutura em grampo de cabelo que possui um par fluoróforo/agente de arrefecimento. Durante a PCR, a polimerase é bloqueada de se estender para a cauda de sonda pela inclusão de hexetileno glicol (HEG). Durante o primeiro tempo da amplificação, o iniciador-alvo-específico em 3’anela ao alvo e é estendido tal que o Scorpion® seja agora incorporado no filamento recentemente sintetizado, que possui uma região-alvo recentemente sintetizada para a sonda 5’. Durante o próximo tempo de desnaturação e anelamento, a região de sonda do ciclo em grampo de cabelo do iniciador Scorpion hibridizará com o alvo, assim separando o fluoróforo e o agente de arrefecimento e criando um sinal mensurável. Tais sondas são descritas em Whitcombe e outros, Nature Biotech 17: 804 a 807 (1999).

Amplificação de Ácidos Nucleicos

[064] As amostras de ácido nucleico ou ácidos nucleicos isolados podem ser amplificadas por vários métodos conhecidos pelos versados na técnica. Preferencialmente, PCR é usada para amplificar os ácidos nucleicos de interesse. Brevemente, em PCR, duas sequências de iniciador são preparadas, as quais são complementares para regiões em filamentos complementares opostos da sequência marcadora. Um excesso de trifosfatos de desoxinucleotídeo é adicionado a uma mistura reacional junto com um DNA polimerase, por exemplo, Taq polimerase. Quando o modelo é modificado em sequência, como descrito acima, a mistura de amplificação preferencialmente não contém uma UNG nuclease.

[065] Se a sequência-alvo está presente em uma amostra, os ini ciadores se ligarão à sequência e a polimerase levará os iniciadores a serem estendidos ao longo da sequência-alvo adicionando-se nucleo- tídeos. Elevando-se e reduzindo-se a temperatura da mistura reacio- nal, os iniciadores estendidos se dissociarão do marcador para formar produtos reacionais, iniciadores em excesso se ligarão ao marcador e aos produtos reacionais e o processo é repetido, gerando desse modo produtos de amplificação. Os parâmetros de ciclo podem ser variados, dependendo do comprimento dos produtos de amplificação a ser estendido. Um controle de amplificação positivo interno (IPC) pode ser incluído na amostra, utilizando iniciadores e/ou sondas de oligonucleo- tídeos. O IPC pode ser usado para monitorar ambos o processo de conversão e qualquer amplificação subsequente.

[066] Em uma modalidade adequada, PCR em tempo real é exe cutada usando qualquer instrumento adequado capaz de detectar o acúmulo do produto de amplificação de PCR. Mais usualmente, o instrumento é capaz de detectar fluorescência de uma ou mais marcações fluorescentes. Por exemplo, a detecção em tempo real no instrumento (por exemplo, um detector de sequência de Sistema 7500® PCR em tempo real ABI) monitora a fluorescência e calcula a medição do sinal repórter, no valor Rn, durante cada ciclo de PCR. O ciclo limite, ou valor Ct, é o ciclo no qual a fluorescência insere o valor limite. O valor limite é determinado pelo software de sistema de detecção de sequência ou manualmente.

Detecção de Ácidos Nucleicos-alvos Amplificados

[067] A amplificação de ácidos nucleicos pode ser detectada por qualquer de um número de métodos bem conhecidos na técnica, tal como eletroforese em gel, cromatografia de coluna, hibridização com uma sonda, sequenciamento, análise de curva de fusão, ou detecção em "tempo real".

[068] Na abordagem preferencial, as sequências de dois ou mais fragmentos de interesse são amplificadas no mesmo recipiente reacio- nal (isto é, "PCR multiplex"). A detecção pode acontecer medindo-se o ponto final da reação ou em "tempo real". Para detecção em tempo real, os iniciadores e/ou sondas podem ser detectavelmente marcados para permitir diferenças na fluorescência quando os iniciadores se tornam incorporados ou quando as sondas são hibridizadas, por exemplo, e amplificadas em um instrumento capaz de monitorar a mudança na fluorescência durante a reação. Os métodos de detecção em tempo real para amplificação de ácido nucleico são bem conhecidos e incluem, por exemplo, o sistema TaqMan®, sistema de iniciador Scorpion® e uso de corantes intercalados para ácido nucleico de filamento duplo.

[069] Na detecção de ponto final, o amplicon(s) poderia ser de- tectado primeiramente separando os amplicons por tamanho, então detectando os amplicons separados por tamanho. A separação de amplicons de diferentes tamanhos pode ser executada, por exemplo, por eletroforese em gel, cromatografia de coluna, ou eletroforese capilar. Esses e outros métodos de separação são bem conhecidos na técnica. Em um exemplo, os amplicons de aproximadamente 10 a aproximadamente 150 pares base cujos tamanhos diferem em 10 ou mais pares base podem ser separados, por exemplo, em um gel de agarose a 4% a 5% (um gel de agarose a 2 a 3% para amplicons de aproximadamente 150 a aproximadamente 30 pares base), ou um gel de poliacrilamida de 6% a 10%. Os ácidos nucleicos separados podem então ser marcados com um corante tal como brometo de etídio e o tamanho da faixa ou faixas marcadas resultantes pode ser comparado a uma escada de DNA.

[070] Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos amplificados são detectados por hibridização com uma sonda específica. Os oligo- nucleotídeos de sonda, complementares a uma parte da sequência- alvo amplificada, podem ser usados para detectar fragmentos amplificados. A hibridização pode ser detectada em tempo real ou em tempo não real. Os ácidos nucleicos amplificados para cada uma das sequências-alvos podem ser detectados simultaneamente (isto é, no mesmo recipiente reacional) ou individualmente (isto é, em recipientes reacionais separados). Em modalidades preferenciais, o DNA amplificado é detectado simultaneamente, usando duas ou mais sondas de oligonucleotídeos gene-específicas, marcadas distinguivelmente, uma das quais hibridiza com a primeira sequência-alvo e uma hibridiza com a segunda sequência-alvo. Para ácidos nucleicos modificados em sequência, o alvo pode ser independentemente selecionado a partir do filamento superior ou do filamento inferior. Assim, todos os alvos a serem detectados podem compreender filamento superior, filamento infe rior, ou uma combinação de alvos de filamento superior e de filamento inferior.

[071] A sonda pode ser detectavelmente marcada por métodos conhecidos na técnica. As marcações úteis incluem, por exemplo, corantes fluorescentes (por exemplo, Cy5®, Cy3®, FlTC, rodamina, fósforos lantanídeos, Texas red, FAM, JOE, Cal Fluor Red 610®, Quasar 670®), radioisótopos (por exemplo, 32P, 35S, 3H, 14C, 125I, 131I), reagentes elétron-densos (por exemplo, ouro), enzimas (por exemplo, peroxidase de rábano de cavalo, beta-galactosidase, luciferase, fosfatase alcalina), marcações colorimétricas (por exemplo, ouro coloidal), marcações magnéticas (por exemplo, Dynabeads®), biotina, dioxigenina, ou haptenos e proteínas para as quais os anticorpos monoclonais e antissoro estão disponíveis. Outras marcações incluem ligantes ou oli- gonucleotídeos capazes de formar um complexo com o receptor cor-respondente ou complemento de oligonucleotídeo, respectivamente. A marcação pode ser diretamente incorporada no ácido nucleico a ser detectado, ou pode ser acoplada a uma sonda (por exemplo, um oli- gonucleotídeo) ou anticorpo que hibridiza ou se liga ao ácido nucleico a ser detectado.

[072] Um método geral para PCR em tempo real usa sondas fluo rescentes, tal como as sondas TaqMan®, sinalizadores moleculares, e Scorpions. A PCR em tempo real quantifica a quantidade inicial do modelo com mais especificidade, sensibilidade e reproducibilidade, do que outras formas de PCR quantitativa, que detectam a quantidade de produto amplificado final. PCR em tempo real não detecta o tamanho do amplicon. As sondas empregadas em tecnologias Scorpion® e TaqMan® são baseadas no princípio de fluorescência/arrefecimento e envolvem um fluoróforo doador e uma porção de arrefecimento.

[073] Em uma modalidade preferencial, a marcação detectável é um fluoróforo. O termo "fluoróforo", como usado aqui, se refere a uma molécula que absorve luz em um comprimento de onda particular (frequência de excitação) e subsequentemente emite luz de um comprimento de onda mais longo (frequência de emissão). O termo "fluorófo- ro doador", como usado aqui, significa um fluoróforo que, quando em proximidade a uma porção de arrefecimento, doa ou transfere energia de emissão ao agente de arrefecimento. Como um resultado de doar energia à porção de arrefecimento, o fluoróforo doador emitirá menos luz em uma frequência de emissão particular do que ele teria na ausência de uma porção de arrefecimento intimamente posicionada.

[074] O termo "porção de arrefecimento", como usado aqui, signi fica que, em proximidade íntima com um fluoróforo doador, obtém energia de emissão gerada pelo doador e ou dissipa a energia como calor ou emite luz de um comprimento de onda maior do que o comprimento de onda de emissão do doador. No último caso, o agente de arrefecimento é considerado como sendo um fluoróforo aceptor. A porção de arrefecimento pode agir via arrefecimento proximal (isto é, colisional) ou por transferência de energia de ressonância por fluorescência de Foster ("FRET"). O arrefecimento por FRET é geralmente usado em sondas TaqMan®, enquanto o arrefecimento proximal é usado em sinalizadores moleculares e sondas do tipo Scorpion®.

[075] As porções fluorescentes adequadas incluem os seguintes fluoróforos conhecidos na técnica: ácido 4-acetamido-4’-isotiocianato- estilbeno-2,2’-dissulfônico, acridina e derivados (acridina, isotiocianato de acridina) Alexa Fluor® 350, Alexa Fluor® 488, Alexa Fluor® 546, Alexa Fluor® 555, Alexa Fluor® 568, Alexa Fluor® 594, Alexa Fluor® 647 (Sondas Moleculares), ácido 5-(2’-aminoetil)aminonaftaleno-1-sulfônico (EDANS), dissulfonato de 4-amino-N-[3-vinilsulfonil)fenil]naftalimida-3,5 (Amarelo Lucifer VS), N-(4-amino-1-naftil)maleimido, antranil amida, BO- DIPY® R-6G, BOPIPY® 530/550, BODIPY® FL, Amarelo Brilhante, cuma- rina e derivados (cumarina, 7-amino-4-metilcumarina (AMC, Cumarina 120), 7-amino-4-trifluorometilcumarina (Cumarina 151)), Cy2®, Cy3®, Cy3.5®, Cy5®, Cy5.5®, cianosina, 4’,6-diaminidino-2-fenilindol (DAP1), 5',5"- dibromopirogalol-sulfonaftalina (vermelho de Bromopirogalol), 7- dietilamino-3-(4'-isotiocianatofenil)-4-metilcumarina, pentaacetato de dieti- lenotriamina, ácido 4,4'- di-isotiocianatodiidro-estilbeno-2,2'-dissulfônico, ácido 4,4'-di-isotiocianatoestilbeno-2,2'-dissulfônico, cloreto de 5- [dimetilamino]naftaleno-1-sulfonila (DNS, cloreto de dansil), ácido 4-(4'- dimetilaminofenilazo)benzoico (DABCYL), 4-dimetilaminofenilazofenil-4'- isotiocianato (DABITC), Eclipse® (Epoch Biosciences Inc.), eosina e derivados (eosina, isotiocianato de eosina), eritrosina e derivados (eritrosina B, isotiocianato de eritrosina), etídio, fluoresceína e derivados (5- carboxifluoresceína (FAM), 5-(4,6-diclorotriazin-2-il)aminofluoresceína (DTAF), 2',7'-dimetóxi-4'5'-dicloro-6-carboxifluoresceína (JOE), fluoresce- ína, isotiocianato de fluoresceína (FITC), hexacloro-6-carboxifluoresceína (HEX), QFITC (XRlTC), tetraclorofluoresceína (TET)), fluorescamina, IR144, IR1446, isotiocianato de verde malaquita, 4-metilumbeliferona, orto cresolftaleína, nitrotirosina, pararosanilina, vermelho de fenol, B- ficoeritrina, R-ficoeritrina, o-ftaldialdeído, Oregon Green®, iodeto de pro- pídio, pireno e derivados (pireno, butirato de pireno, butirato de succini- midil 1-pireno), QSY® 7, QSY® 9, QSY® 21, QSY® 35 (Sondas Moleculares), Vermelho Reativo 4 (Vermelho Brilhante 3B-A Cibacron®), rodamina e derivados (6-carbóxi-X-rodamina (ROX), 6-carboxirodamina (R6G), cloreto de sulfonila, lissamina, rodamina B, rodamina (Rhod), rodamina B, rodamina 123, verde de rodamina, isotiocianato de rodamina X, sulforo- damina B, sulforodamina 101, derivado de cloreto de sulfonila de rodami- na 101 (Vermelho Texas)), N,N,N',N'-tetrametil-6-carboxirodamina (TAMRA), tetrametil rodamina, isotiocianato de tetrametil rodamina (TRITC), riboflavina, ácido rosólico, derivados de quelato de térbio.

[076] Outros análogos de nucleotídeo fluorescentes podem ser usados, ver, por exemplo, Jameson, 278 Meth. Enzymol. 363 a 390 (1997); Zhu, 22 Nucl. Acids Res 3418 a 3422 (1994). As Patentes U.S. Nos 5.652.099 e 6.268.132 também descrevem análogos de nucleosí- deo para incorporação em ácidos nucleicos, por exemplo, DNA e/ou RNA, ou oligonucleotídeos, via ou síntese enzimática ou química para produzir oligonucleotídeos fluorescentes. A patente U.S. No 5.135.717 descreve reagentes de ftalocianina e tetrabenzotriazaporfirina para uso como marcações fluorescentes.

[077] Os agentes de arrefecimento adequados são selecionados com base no espectro de fluorescência do fluoróforo particular. Os agentes de arrefecimento úteis incluem, por exemplo, os agentes de arrefecimento Black Hole® BHQ-1, BHQ-2, e BHQ-3 (Biosearch Technologies, Inc.), e a série ATTO de agentes de arrefecimento (AT- TO 540Q, ATTO 580Q, e ATTO 612Q; Atto-Tec GmbH).

[078] A marcação detectável pode ser incorporada, associada ou conjugada a um ácido nucleico. A marcação pode ser ligada por braços espaçadores de vários comprimentos para reduzir o obstáculo es- térico potencial ou impacto nas outras propriedades úteis ou desejadas. Ver, por exemplo, Mansfield, 9 Mol. Cell. Probes 145 a 156 (1995). As marcações detectáveis podem ser incorporadas em ácidos nucleicos por ligações covalentes ou não covalentes, por exemplo, por transcrição, tal como por marcação com iniciador aleatório usando Klenow polimerase, ou tradução por cortes, ou amplificação, ou equivalente como é conhecido na técnica. Por exemplo, uma base de nu- cleotídeo é conjugada a uma porção detectável, tal como um corante fluorescente, e então incorporada em ácidos nucleicos durante a síntese ou amplificação de ácido nucleico.

[079] Com iniciadores Scorpion, a detecção de iniciador específi co de sequência e de produto PCR é alcançada usando uma única molécula. O iniciador Scorpion mantém uma configuração em laço no estado hibridizado. O fluoróforo é acoplado à extremidade 5’ e é arre- fecido por uma porção acoplada à extremidade 3’, embora em modalidades adequadas, esse arranjo possa ser comutado. A parte 3’ da alça e/ou laço também contém a sequência que é complementar ao produto de extensão do iniciador. Essa sequência é ligada à extremidade 5’ de um iniciador específico via um monômero não amplificável. Após a extensão da porção de iniciador, a sequência de sonda específica é capaz de se ligar a seu complemento dentro do amplicon estendido, assim abrindo a estrutura em grampo. Isso impede que a fluorescência seja arrefecida e um sinal seja observado. Um alvo específico é amplificado pelo iniciador reverso e a parte de iniciador do iniciador Scorpion, resultando em um produto de extensão. Um sinal fluorescente é gerado devido à separação do fluoróforo do agente de arrefecimento resultando da ligação do elemento de sonda do iniciador Scorpion ao produto de extensão.

[080] As sondas TaqMan® (Heid, e outros, Genome Res 6: 986 a 994, 1996) usam a atividade de exonuclease 5’ fluorogênica de Taq polimerase para medir a quantidade de sequências-alvos em amostras de cDNA. As sondas TaqMan® são oligonucleotídeos que contêm um fluoróforo doador usualmente na base 5’ ou próximo a ela, e uma porção de arrefecimento tipicamente na base 3’ ou próxima a ela. A porção de arrefecimento pode ser um corante, tal como TAMRA ou pode ser uma molécula não fluorescente, tal como ácido 4-(4- dimetilaminofenilazo)benzoico (DABCYL). Ver Tyagi, e outros, 16 Nature Biotechnology, 49 a 53 (1998). Quando irradiado, o doador fluorescente excitado transfere energia à porção de arrefecimento vizinha por FRET ao invés de fluorescência. Assim, a proximidade íntima do doador e agente de arrefecimento impede a emissão de fluorescência de doador enquanto a sonda está intacta.

[081] As sondas TaqMan® são projetadas para anelar em uma região interna de um produto de PCR. Quando a polimerase (por exemplo, transcriptase reversa) replica um modelo no qual uma sonda TaqMan® está ligada, sua atividade de exonuclease 5’ clica a sonda. Isso termina a atividade do agente de arrefecimento (não FRET) e o fluoróforo doador começa a emitir fluorescência que aumenta em cada ciclo proporcional à taxa de clivagem da sonda. O acúmulo de produto de PCR é detectado monitorando-se o aumento na fluorescência do corante repórter (nota-se que os iniciadores não são marcados). Se o agente de arrefecimento é um fluoróforo aceptor, então o acúmulo do produto de PCR pode ser detectado monitorando-se a diminuição na fluorescência do fluoróforo aceptor.

Detecção de Bordetella pertussis

[082] A presença de B. pertussis em um paciente pode ser de terminada detectando-se a presença de uma sequência de inserção IS481 de codificação de ácido nucleico, ou um fragmento de diagnóstico desse, em uma amostra biológica. A sequência de nucleotídeo de B. pertussis IS481 é fornecida no GenBank No. Acesso M28220 e é mostrada na FIG. 1 (SEQ ID NO: 1).

[083] Em modalidades preferenciais, o ácido nucleico-alvo cor responde a nucleotídeos 553 a 693 de IS481 ou um fragmento dele, e é fornecido abaixo como SEQ ID NO: 2. 1 gcgccctggc caccgggtca cgggcaaccg acgcga- tacc gttgaggggg ccggctggga 61 cttcgtcttc gtggccdtcg dtgaccacgc ccgcg- tggcc ttcaccgaca tcccccccg a 121 cgagcgcttc cccagcgccg t SEQ ID NO: 2

[084] A sequência de ácido nucleico-alvo completa, ou qualquer parte dela, pode ser amplificada e detectada usando quaisquer iniciadores e sondas apropriadas. Uma sequência de ácido nucleico-alvo particularmente útil abrange os nucleotídeos 580 a 665 de IS481 (SEQ ID NO: 3), correspondendo aos nucleotídeos 28 a 113 de SEQ ID NO: 2. Os iniciadores úteis incluem, por exemplo, aqueles direcionados aos nucleotídeos 580 a 597 (SEQ ID NO: 4) e 648 a 665 (SEQ ID NO: 5) de IS481, ou complementos desses (sublinhados no ácido nucleico- alvo fornecido acima). As sondas úteis são direcionadas a qualquer região útil da sequência IS481 amplificada incluindo, por exemplo, os nucleotídeos 623 a 642 (SEQ ID NO: 6) e nucleotídeos 604 a 628 (SEQ ID NO: 27) de IS481, ou um complemento desse (nucleotídeos 71 a 90 e 52 a 76 de SEQ ID NO: 2, respectivamente).

[085] Uma busca BLAST com a sonda de SEQ ID NO: 6 revela uma combinação completa com a sequência de ácido nucleico-alvo IS481 de B. pertussis e B. holmesii. Adicionalmente, há 18 a 20 combinações de nucleotídeos dentro do genoma de Pseudomonas fluores- cens, e 17 a 20 combinações de nucleotídeos dentro dos genomas de Magnaporthe grisea e Xanthomonas oryzae. Como notado abaixo, não há identidade de sequência significativa para P. fluorescen, M. grisea, e X. oryzae com os iniciadores de SEQ ID NOs: 4-5. Consequentemente, essas espécies não deveriam ser uma fonte significativa de falsos positivos quando os iniciadores de amplificação de SEQ ID NOs: 4-5 são usados. A reatividade cruzada da sonda de SEQ ID NO: 6 pode ser reduzida ou eliminada usando condições de hibridização de alto rigor suficientes para inibir a hibridização nesse nível de não homologia.

[086] Uma busca BLAST com as sequências de iniciador de SEQ ID NOs: 4-5 mostra a homologia completa com a sequência de ácido nucleico-alvo IS481 de B. pertussis e B. holmesii. A infecção humana por B. holmesii é rara, mas pode ser detectada usando os iniciadores e sondas descritas aqui. São também encontradas 15 a 17 combinações de nucleotídeos com sequências nos genomas de Bordetella avium, Mcthylobacillus flagellalus, Rhodococcus, e Rubrobacter xylanophilus. Entretanto, essas bactérias e fungos não são conhecidos por infectar seres humanos, então não deveriam ser uma causa significativa de resultados de diagnósticos falso positivos.

Detecção de Bordetella parapertussis

[087] A presença de B. parapertussis em um paciente pode ser determinada detectando-se a presença de uma sequência de inserção IS1001 de codificação de ácido nucleico, ou um fragmento de diagnóstico desse, em uma amostra biológica. A sequência de nucleotídeo de B. parapertussis IS1001 é fornecida no GenBank No Acesso X66858 e é mostrada na FIG. 2 (SEQ ID NO: 7).

[088] Em modalidades preferenciais, o ácido nucleico-alvo cor responde aos nucleotídeos 680 a 859 de IS1001 ou um fragmento desse, e é fornecido abaixo como SEQ ID NO: 8. 1 caattgccgc ctggggccgc ccaacgcatc aaggccg- ttg ccatcgacat gaccaccgcc 61 tacgagttGG AGATCCAGGC CCacagccca caggcg- gaga tcgtctatga cttgttccat 121 gtcgtggcca agtatggacg agaggtcatt gatcogotgc gcgtggatca ggccaatcaa SEQ ID NO: 8

[089] A sequência de ácido nucleico-alvo completa, ou qualquer parte dessa, pode ser amplificada e detectada usando quaisquer iniciadores e sondas apropriadas. Uma sequência de ácido nucleico-alvo particularmente útil abrange os nucleotídeos 730 a 802 de IS481 (SEQ ID NO: 9), correspondente aos nucleotídeos 51 a 123 da SEQ ID NO: 8. Os iniciadores úteis incluem, por exemplo, aqueles direcionados aos nucleotídeos 730 a 747 (SEQ ID NO: 10) e 777 a 802 (SEQ ID NO: 11) de IS1001, ou complementos desse (sublinhados no ácido nucleico- alvo fornecido acima). Uma sonda útil é direcionada aos nucleotídeos 748 a 761 (SEQ ID NO: 12) de IS1001, ou um complemento dessa (em letras maiúsculas no ácido nucleico-alvo fornecido acima).

[090] Uma busca BLAST com os iniciadores de SEQ ID NOs: 10 a 11 revela combinações completas com a sequência de ácido nuclei- co-alvo IS1001 de B. parapertussis. Adicionalmente, o iniciador de SEQ ID NO: 10mostra combinações de 16 a 17 nucleotídeos dentro dos genomas de Acanthostigma perpusillum, Rhodobacter sphaeroi- des, Bradyrhizobium japonicum, e Salinibacter ruber. O iniciador de SEQ ID NO: 11 mostra somente combinações curtas e insignificantes com qualquer espécie relevante.

Exemplos Exemplo 1: Coleta de Amostra e Extração de DNA

[091] Um total de 306 amostras nasofaringeais foi preparado e testado para propósitos de validação de ensaio. Das 306 amostras, 290 foram espécimes clínicos reais obtidos de pacientes. As 16 amostras restantes foram espécimes B. parapertussis "planejados" (isto é, controle positivo). Os espécimes planejados foram preparados encravando matriz de amostra nasofaringeal patógeno-negativa com organismos B. parapertussis cultivados.

[092] As amostras nasofaringeais foram coletadas de pacientes e localizadas imediatamente em meio Aimes com carvão ou em meio de transporte viral líquido (meio Micro Test® M4; Remel, Inc.), congeladas a - 20° C para transporte, e armazenadas a -20° C até que são ensaiadas.

[093] Para os ensaios com Bordetella spp. descritos abaixo, o DNA foi extraído das amostras nasofaringeais. Brevemente, as amostras foram degeladas e 200 μL de cada amostra foram aliquotados em 1,5 ml de tubos Eppendorf. Tubos adicionais contendo 200 μL de dilu- ente com DNA de controle positivo (ver abaixo) ou nenhum DNA (controle negativo) foram preparados e processados simultaneamente com as amostras do paciente. 5 μL de DNA de controle interno (ver abaixo) foram então adicionados a cada amostra. O mini kit de sangue QIAamp® (Qiagen) foi usado para extrair o DNA de acordo com as instruções do fabricante.

[094] O DNA de controle interno (IC) consiste em um fragmento de DNA de sequência aleatória não presente em qualquer dos organismos ensaiados. Dois oligonucleotídeos com fosfato 5’ (pIC F 5’P e pIC R 5’p) foram anelados, e o produto foi clonado em sítio EcoRI de pUC19. (pIC F 5’P) : 5’ Fosfato-aaTTCGCCCT TTGTTTCGAC CTAGCTTGCC AGTTCGCAGAA TTTGTTGCTC GTCAGTCGTC GGCGGTTTTA agggcg (SEQ ID NO: 15) (pIC R 5’P) : 5’ Fosfato-aattcgccct TAAAACCGCC GA- CGACTGAC GAGCAACAAA TTCTGCGAAC TGGCAAGCTA GGTCGAAACA AAGGGCG (SEQ ID NO: 16)

[095] O amplicon IC foi gerado pelos seguintes iniciadores, o qual anela para as sequências pUC19. Iniciador direto (PUC-For): 5’ GTTTTCCCAG TCACGA- CGTT GTA (SEQ ID NO: 17) Iniciador reverso (PUC-Rev): 5’ CACTTTATGC TTCCGG- CTCG TA (SEQ ID NO: 18)

[096] Sequência de Amplicon IC: 1 GTTTTCCCAG TCACGACGTT GTAAAACGAC GGCCAG- TGAA TTCgccctta aaaccgccga 61 cgactgacga gcaacaaatt ctgcgaactg gcaagc- tagg tcgaaacaaa gggcggattc 121 GAGCTCGGTA CCCGGGGATC CTCTAGAGTC GACCTG- CAGG CATGCAAGCT TGGCGTAAT C 181 ATGGTCATAG CTGTTTCCTG TGTGAAATTG TTA- TCCGCTC ACAATTCCAC ACAACATACG 241 AGCCGGAAGC ATAAAGTG (SEQ ID NO: 19)

[097] As sequências sublinhadas são parte do Sítio de Clonagem Múltipla (MCS) de pUC19. As sequências em letra minúscula foram geradas anelando dois oligonucleotídeos complementares. O amplicon IC foi gerado pelos seguintes iniciadores, o qual anela para as sequências pUC19.

[098] Para todos os ensaios, o controle positivo e o controle ne- gativo foram preparados e executados simultaneamente com as amostras de paciente. O DNA de controle positivo consistia em um fragmento de DNA de 625 bp contendo regiões-alvos de IS481 e IS1001 de B. pertussis e B. parapertussis, respectivamente, em uma única molécula. Os ensaios de controle negativo não continham DNA.

[099] Para construir o modelo de controle positivo, os iniciadores foram projetados para amplificar as regiões-alvos de IS481 e IS1001, e cloná-los em conjunto no plasmídeo pUC19. O iniciador direto de IS481 foi projetado com um sítio de restrição EcoRI adicionado (EcoRI F de IS481), enquanto o iniciador reverso de IS481 foi projetado com um sítio de restrição BamHI adicionado (BamHI R de IS481). Esses iniciadores foram então usados para gerar um amplicon de 237 bp a partir de IS481 de B. pertussis. 1S481 EcoRI F: 5’ agcagtgaat tcggtggtgc gctacgagca (SEQ ID NO: 20) IS481 BamHI R: 5’ atatgcggat ccgccactgc gtccttgagga (SEQ ID NO: 21)

[0100] O iniciador direto de IS1001 foi projetado com um sítio de res trição BamHI adicionado (BamHI F de IS1001) e o iniciador reverso de IS1001 foi projetado com um sítio de restrição PstI adicionado (PstI R de IS1001). IS1001 BamHI F: 5’ atatgcggat ccataccgtc aagacgctgg aca (SEQ ID NO: 22) IS1001 PstI R: 5’ tagcaactgc agcgatcaat gacctctcgt ccata (SEQ ID NO: 23)

[0101] Esses iniciadores foram usados para gerar um amplicon de 358 bp a partir de IS1001 de B. parapertussis.

[0102] Os amplicons foram então purificados e ligados simultane amente no plasmídeo pUC19 anteriormente digerido com EcoRI e PstI usando T4 DNA ligase. Os plasmídeos ligados foram transformados em E. coli seguido por cultura seletiva em LB ágar contendo ampicili- na. As únicas colônias foram selecionadas e o DNA foi preparado. Esse DNA foi usado como DNA modelo na varredura por PCR em tempo real verde SYBR usando o iniciador direto de IS481 junto com o iniciador reverso de IS1001. Os plasmídeos produzindo resultados de PCR verde SYBR positivo foram então sequenciados para confirmar a presença de um inserto de 601 pb contendo alvos IS481 e IS1001 (595 pb) arranjados de forma acoplada, e o sítio de restrição BamHI (6 pb).

[0103] O amplicon de controle positivo foi gerado por amplificação usando o plasmídeo contendo o inserto IS481/IS1001 de 601 pb acoplado como modelo junto com os iniciadores EcoRI F de IS481 e PstI de IS1001. Incluindo os sítios de restrição adicionados, o tamanho total do amplicon de controle positivo é 625 pb tendo a seguinte sequência de nucleotídeo: 1 agcagtgaat tcggtggtgc gctacgagca tcagg- ccccc ggcgatc tgc tgcacatcga 61 catcaagaag ctgggacgta tccagcgccc tggccac- cgg gtcacgggca accgacgcga 121 taccgttgag ggggccggct gggacttcgt cttcg- tggcc atcgatgacc acgcccgcgt 181 ggccttcacc gacatccccc ccgacgagcg ctt- ccccagc gccgtccagt tcctcaagga 241 cgcagtggcg gatccatacc gtcaagacgc tgga- caaggc tcggctgcgt gcgtcggtgc 301 gcgaaccgga ttggtccaag atcgagtatt tgg- cgatgga cgagtttgcc ctgcacaaag 361 ggcatcgcta cgcgacagtg gtggtcgatc cgatcggcag gcaggtgctg tggattggcc 421 caggacgctc acgcgagacg gcccgggcgt tctt- cgaaca attgccgcct ggggccgccc 481 aacgcatcaa ggccgttgcc atcgacatga ccaccg- ccta cgagttggag atccaggccc 541 acagcccaca ggcggagatc gtctatgact tgtt- ccatgt cgtggccaag tatggacgag 601 aggtcattga tcgctgcagt tgcta (SEQ ID NO: 24) Exemplo 2: Detecção por PCR Multiplex de Bordetella spp.

[0104] A solução de Reagentes da PCR final continha o seguinte: Tris-HCl (pH 9,0), MgCl2, KCl, EDTA, DTT, Tween 20, (NH4)2SO4, gli- cerol, dNTPs (dT, dA, dG, e dC), e FastStart DNA Polimerase®.

[0105] A solução de iniciador de PCR 10x foi preparada contendo iniciadores Scorpion e iniciadores reversos para B. pertussis, B. parapertussis, e o controle interno. O iniciador Scorpion de B. pertussis e iniciadores reversos estavam em uma concentração final de 2 μM, o iniciador Scorpion de B. parapertussis e os iniciadores reversos estavam em uma concentração final de 1,5 μM e o iniciador Scorpion IC e os iniciadores reversos estavam em uma concentração final de 1 μM na Solução de Iniciador de PCR 10X. Dois diferentes iniciadores Scorpion de B. pertussis foram individualmente testados. Os pares de iniciadores foram como segue: B. pertussis (IS481): [Q]-GCGTGGTCATCGATGGCCACcacgct-[F]-tttttt-heg- ccgacgcgataccgttga (SEQ ID NO: 13) e [Q]-agcGGCCACGAAGACGAAGTCCCAGCCGct-[F]-heg- ccgacgcgataccgttga (SEQ ID NO: 28), e Iniciador Reverso: ggatgtcggtgaaggcca (SEQ ID NO: 25). B. parapertussis (IS1001): [Q]-accGGGCCTGGATCTCCcggt-[F]-heg- αaccaccgcctacgagtt (SEQ ID NO: 14), e Iniciador Reverso: gacatggaacaagtcatagacgatcL (SEQ ID NO: 26). Controle Interno: [Q]-TGCGAACTGGCAAGCT-[F]-heg-attcgccctttgtttcgaccta (SEQ ID NO: 15), e Iniciador Reverso: CCGACGACTGACGAGCAA (SEQ ID NO: 16).

[0106] Para cada iniciador Scorpion listado acima, Q = agente de arrefecimento, F = fluoróforo, e "heg" = hexetileno glicol. A sequência de sonda é identificada por letras maiúsculas.

[0107] A solução de Reação PCR foi criada misturando-se 12,5 μL de Solução de Reagente de PCR, 2,5 μL de Solução de Iniciador de PCR 10X, e 5 μL de água isenta de nuclease por ensaio de amostra a ser executado.

[0108] Os ensaios de detecção de PCR multiplex foram execu tados em placas com 96 cavidades. Cada ensaio continha 20 μL da Solução de Reação PCR e 5 μL de ácido nucleico extraído (isto é, amostra de paciente, controle positivo, ou controle negativo). As placas foram vedadas, centrifugadas em 2000 xg por 2 minutos, e colocadas em um Sistema de Detecção PCR em tempo real da Applied Biosystems (ABI). A reação PCR foi executada como segue: Estágio 1 (um ciclo): 10 minutos a 95° C Estágio 2 (45 ciclos): Etapa 1: 95° C por 15 s Etapa 2: 60° C por 35 s (coleta de dados durante a Etapa 2).

[0109] Os dados foram coletados e as amostras de paciente anali- sadas quanto à presença de uma ou mais espécies patogênicas. As amostras de paciente tendo um resultado positivo para qualquer uma ou mais das espécies patogênicas foram pontuadas como positivas para aquelas espécies. As amostras de paciente tendo um resultado negativo para todas as espécies patogênicas foram somente pontuadas como negativas já que o ácido nucleico-alvo de controle interno foi detectado e o ensaio de amostra de controle positivo foi positivo para ambos os ácidos nucleicos-alvos de B. pertussis e B. parapertussis. Exemplo 3: Confirmação dos Resultados do Ensaio PCR Multiplex

[0110] Os resultados do ensaio multiplex descrito acima foram comparados a outros ensaios de detecção. As alíquotas de todas as amostras foram executadas em um ensaio secundário para confirmação do resultado do ensaio multiplex. O B. pertussis foi avaliado no ensaio ProPertussis (Prodesse, Inc.) que detectou um ácido nucleico- alvo diferente dentro da sequência de inserção IS481 bem como um controle interno separado. O B. parapertussis foi avaliado usando um ensaio estilo TaqMan® para a sequência de inserção IS1001 usando iniciadores e sondas idênticas às regiões de iniciador e sonda do iniciador Scorpion e reverso descrito acima.

[0111] Cada uma das 306 amostras foi ensaiada simultaneamente para B. pertussis e B. parapertussis no ensaio multiplex. Adicionalmente, as 306 amostras foram ensaiadas uma vez usando o ensaio ProPertussis, e uma vez usando o ensaio TaqMan® para B. parapertussis. Para os ensaios para B. pertussis (multiplex e ProPertussis), um valor Ct < 36,5 foi pontuado como positivo. O ensaio multiplex para três amostras falhou na primeira repetição e duas amostras falharam no teste de repetição, mais provavelmente devido a substâncias inibidoras no espécime clínico causando uma falha do controle interno. Isso aumentou o total de 303 a 304 entre a Repetição no1 e no 2 mostradas abaixo. Adicionalmente, todas as amostras que estavam em desacordo entre os dois testes para B. pertussis ou para B. parapertusis foram repetidas com ambos o teste multiplex e o comparador. Os resultados da Repetição no 2 incluem os resultados da amostra seguindo qualquer teste de repetição. Os resultados de cada ensaio foram como segue: B. pertussis:

[0112] O componente de B. pertussis do ensaio multiplex teve uma concordância positiva de 95,9% e uma concordância negativa de 96,4% com o ensaio ProPertussis.

[0113] O componente de B. pertussis do ensaio multiplex teve uma concordância positiva de 96,2% e uma concordância negativa de 99,6% com o ensaio ProPertussis. B. parapertussis:

Sensibilidade = 91,3%, Especificidade = 99,2%, Concordância = 98,0%.

Sensibilidade = 97,8%, Especificidade = 100%, Concordância = 99,7%.

[0114] O componente de B. parapertussis do ensaio multiplex teve uma concordância positiva de 97,8% e uma concordância negativa de 100% com o ensaio Taqman®. Exemplo 4: Reatividade Cruzada do Ensaio Multiplex com Bordetella.

[0115] Para ensaios de reatividade cruzada, os espécimes de amos tras nasais de controle foram encravados com um dos organismos de teste (n = 5 para cada organismo) e o DNA foi extraído de acordo com os métodos descritos acima. A única exceção foi para S. aureus para o qual os espécimes de amostra nasal clínicos conhecidos como sendo positivos para S. aureus foram usados (isto é, a amostra de S. aureus foi genuína, não planejada). O ensaio multiplex com Bordetella foi executado em cada amostra. Em cada caso, um valor Ct < 37,0 foi interpretado como um resultado positivo para reatividade cruzada de B. pertussis e um valor Ct < 36,5 foi interpretado como um resultado positivo para reativi- dade cruzada de B. parapertussis.

[0116] Nenhuma reatividade cruzada foi medida para as seguintes espécies: Bacillus cereus Chlamydophila pneumoniae Haemophilus influenza Klebsiella pneumoniae Legionella pneumophila Mycoplasma pneumoniae Streptococcus pneumonia Staphylococcus aureus Muraxella catarrhalis Influenza A Influenza B RSV B

DNA de controle aleatório humano

[0117] O Haemophilus parainfluenzae foi também testado quanto à reatividade cruzada usando cinco amostras nasais planejadas individuais. Cada uma das cinco amostras foi executada em duplicata. Duas das amostras testadas moderadamente positivas para B. pertussis em ambas as replicatas (valores Ct de 36,65 e 36,46, respectivamente). Cada uma das amostras positivas também testou positiva para B. pertussis no ensaio ProPertussos. Nenhuma reatividade cruzada com B. parapertussis foi observada para qualquer dos organismos listados incluindo H. parainfluenzae. Apesar dos resultados positivos mistos, a busca BLAST não revelou homologia entre os iniciadores de PCR multiplex para B. pertussis, B. parapertussis e H. parainfluenzae.

[0118] A menos que de outra forma definido, todos os termos técni cos e científicos usados aqui têm o mesmo significado usualmente entendido por um versado na técnica a qual essa invenção pertence.

[0119] A invenção descrita ilustrativamente aqui pode adequada mente ser praticada na ausência de qualquer elemento ou elementos, limitação ou limitações, não especificamente descrita aqui. Assim, por exemplo, os termos "compreendendo", "incluindo", "contendo", etc. devem ser lidos expansivamente e sem limitação. Adicionalmente, os termos e expressões empregados aqui foram usados como termos de descrição e não de limitação, e não há intenção no uso de tais termos e expressões de excluir quaisquer equivalentes das características mostradas e descritas ou partes dessas, mas reconhece-se que várias modificações são possíveis dentro do escopo da invenção reivindicada.

[0120] Assim, dever-se-ia entender que embora a invenção tenha sido especificamente descrita por modalidades preferenciais e características, modificações, otimizações e variações opcionais da invenção incorporadas aqui podem ser recorridas pelos versados na técnica, e que tais modificações, otimizações e variações são consideradas co- mo estando dentro do escopo desta invenção. Os materiais, métodos e exemplos fornecidos aqui são representativos de modalidades preferenciais, são exemplificados, e não são destinados como limitações do escopo da invenção.

[0121] A invenção foi descrita amplamente e genericamente aqui. Cada uma das espécies e agrupamentos subgenéricos mais limitados dentro da descrição geral também forma parte da invenção. Isso inclui a descrição geral da invenção com uma condição ou limitação negativa removendo qualquer assunto do gênero, sem considerar se o material cortado é especificamente citado aqui ou não.

[0122] Em adição, se as características ou aspectos da invenção são descritos em termos de grupos Markush, os versados na técnica reco-nhecerão que a invenção é também desse modo descrita em termos de qualquer membro individual ou subgrupo de membros do grupo Markush.

[0123] Todas as publicações, pedidos de patentes, patentes e ou tras referências mencionadas aqui são expressamente incorporadas a título de referência em sua totalidade, ao mesmo grau se cada uma fosse incorporada a título de referência individualmente. No caso de conflito, a presente especificação incluindo as definições, controlará.

Claims (11)

1. Kit, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) um primeiro par de iniciadores, em que pelo menos um iniciador do primeiro par de iniciadores apresenta uma sequência nu- cleica de SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 13 ou SEQ ID NO: 28, em que os iniciadores amplificam um ácido nucleico de Borde- tella pertussis ou Bordetella holmesii, mas não amplificam o ácido nu- cleico de Magnaporthe grisea; e (b) uma primeira sonda, em que a primeira sonda apresenta a sequência da SEQ ID NO: 6 ou SEQ ID NO: 27, e é marcada com um marcador detectável selecionado a partir do grupo que consiste em um marcador fluorescente, um radioisótopo, um reagente denso em elétrons, uma enzima, um marcador colorimétrico, um marcador magnético, biotina, dioxigenina e um marcador imunológico.

2. Kit, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda um segundo par de iniciadores, em que pelo menos um iniciador do segundo par de iniciadores apresenta uma sequência de ácido nucleico de SEQ ID NOs: 10, 11, 14 ou 26, e em que os iniciadores amplificam um ácido nucleico de Bordetella pertussis, mas não amplificam o ácido nucleico de Salinobacter ruber.

3. Kit, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma segunda sonda, em que a segunda sonda apresenta a sequência da SEQ ID NO: 12, e é marcada com um marcador detectável selecionado a partir do grupo que consiste em um marcador fluorescente, um radioisótopo, um reagente denso em elétrons, uma enzima, um marcador colorimétrico, um marcador magnético, biotina, dioxigenina e um marcador imunológico.

4. Kit, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que pelo menos um iniciador do primeiro par de iniciadores apresenta uma sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 4 ou 5.

5. Kit, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que pelo menos um iniciador do primeiro par de iniciadores apresenta uma sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 13 ou 28.

6. Kit, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que pelo menos um iniciador do segundo par de iniciadores apresenta uma sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 10 ou 11.

7. Kit, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que pelo menos um iniciador do segundo par de iniciadores apresenta uma sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 14.

8. Kit, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que um iniciador apresentando a sequência de SEQ ID NO: 13 ou SEQ ID NO: 28 é um iniciador Scorpion.

9. Kit, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que um iniciador apresentando a sequência de SEQ ID NO: 14 é um iniciador Scorpion.

10. Kit, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que a primeira sonda é marcada com um marcador fluorescente.

11. Kit, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que a segunda sonda é marcada com um marcador fluorescente.

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