BR112021016698A2

BR112021016698A2 - Método para realçar o potencial de retorno e/ou retenção de célula t gama delta, método para realçar a expressão de célula t gama delta cd62l, método para transplantar células em um sujeito, e, composição de célula terapêutica

Info

Publication number: BR112021016698A2
Application number: BR112021016698-0A
Authority: BR
Inventors: Tony Peled
Original assignee: Gamida-Cell Ltd.
Priority date: 2019-02-24
Filing date: 2020-02-24
Publication date: 2021-10-13
Also published as: AU2020225597A1; CA3130442A1; JP2022521027A; WO2020170260A1; US20220143086A1; IL285806A; EP3927353A4; KR20210133996A; SG11202109055UA; EP3927353A1; CN113710257A

Abstract

método para realçar o potencial de retorno e/ou retenção de célula t gama delta, método para realçar a expressão de célula t gama delta cd62l, método para transplantar células em um sujeito, e, composição de célula terapêutica. métodos de cultura ex vivo de células t gama delta e populações de célula enriquecida com célula t gama delta são providos e, mais particularmente, métodos para realçar a funcionalidade de populações de célula gama delta pelo tratamento das células com uma nicotinamida em combinação com citocinas realçadoras do potencial de retorno e/ou retenção de célula t gama delta. também são consideradas composições compreendendo células t gama delta cultivadas e populações de célula enriquecida com célula t gama delta misturadas e usos terapêuticos das mesmas.

Description

1 / 69 MÉTODO PARA REALÇAR O POTENCIAL DE RETORNO E/OU RETENÇÃO DE CÉLULA T GAMA DELTA, MÉTODO PARA REALÇAR A EXPRESSÃO DE CÉLULA T GAMA DELTA CD62L, MÉTODO PARA TRANSPLANTAR CÉLULAS EM UM SUJEITO, E,

COMPOSIÇÃO DE CÉLULA TERAPÊUTICA PEDIDO RELACIONADO

[001] Este Pedido reivindica o benefício de prioridade do Pedido de Patente Provisória U.S. No. 62/809.671 depositado em 24 de fevereiro de 2019, os conteúdos do qual são aqui incorporados por referência em suas totalidades.

CAMPO E FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[002] A presente invenção, em algumas modalidades desta, diz respeito aos métodos para cultivar populações de célula gama delta, ao uso terapêutico das populações de célula gama delta cultivadas, e aos kits compreendendo as células T gama delta cultivadas. Mais particularmente, mas não exclusivamente, a presente invenção diz respeito ao uso das células T gama delta cultivadas, sozinhas ou em combinação com outras células para transplante.

[003] As células T gama delta (γδ) são uma população conservada de linfócitos inatos que participa de várias respostas imunológicas durante a homeostase tissular, doença infecciosa, doença autoimune, inflamação, transplante e vigilância tumoral. As células T gama delta podem compartilhar atributos do sistema imunológico adaptativo ou inato, ou ambos, e compreendem um subconjunto do tecido do timo e periférico que reconhece antígenos relacionados ao estresse (células Vδ1), um subconjunto circulante ativado através dos fosfoantígenos (células Vδ2) e um subconjunto verificado principalmente no fígado (Vδ3 células) e comuns nas infecções virais e na leucemia.

[004] Quando ativadas, as células T gama delta exercem uma

2 / 69 atividade citotóxica restrita que não do MHC potente, especialmente eficaz em exterminar vários tipos de células, particularmente as células patogênicas tais como células infectadas (infecções virais, parasíticas, fúngicas etc.) e cancerosas. As células T gama delta foram implicadas na sobrevivência a longo prazo dos pacientes de transplante de células tronco hematopoiéticas, e a presença destas nas amostras tumorais foram identificadas como uma assinatura para o prognóstico do câncer favorável significante. As células T gama delta são capazes de sentir caminhos lipídicos alterados, detectando e eliminando as células malignas independente da assinatura do antígeno tumoral, e são altamente quimiorresistentes, tornando estas particularmente adequadas para a imunoquimioterapia de combinação.

[005] As células T gama delta constituem somente uma pequena porcentagem das células T que residem no sangue e tecido periféricos humanos (1 a 5%), e uma porcentagem ainda menor (<1%) de linfócitos do cordão umbilical. Deste modo, a aplicação terapêutica das populações de célula gama delta requer meios para sua expansão. Os dois métodos principais para o enriquecimentos das células T gama delta para o uso clínico (por exemplo, na imunoterapia do câncer) incluem a expansão in vivo das populações gama delta endógenas administrando-se fosfoantígenos de estimulação ou amino bisfosfonatos juntos com IL-2 recombinante de baixa dose e a transferência da célula adotiva ex vivo das células T gama delta in vitro expandidas (autólogas ou heterólogas) em um paciente, (ver, por exemplo, o Pedido de Patente US 2017/0196910 para Leeks et al). Devido aos efeitos colaterais indesejados, à breve meia-vida sérica de IL-2, e aos resultados decepcionantes nos testes clínicos de administração de IL-2 in vivo, a expansão ex vivo das células T gama delta é o método atualmente preferido. Alguns estudos também indicaram que a IL-15 pode ser eficaz em promover a proliferação, sobrevivência e citotoxicidade das células T gama delta.

[006] Melhorar a funcionalidade das células T gama delta é crítico

3 / 69 para a terapia de célula T eficaz. As células T gama delta são ativadas através de, entre outras coisas, compostos pequenos tais como as HMB-PP não específicas; e aminobisfosfonatos, acumulando no câncer, e as proteínas de estresse celular tal como a anexina A2. Algumas citocinas da família de cadeia gama, além da IL-2 (em particular, IL-7, IL-15 e IL-21) também podem aumentar a proliferação, sobrevivência e citotoxicidade das células T gama delta (Van Acker et al, Cytokine and Growth Factor Rev 2018 41:54- 64). As células T gama delta também possuem integrinas (por exemplo, beta1, beta2, beta7 integrina, receptor de vitronectina) que funcionam no retorno, adesão, sinalização, migração, infiltração e retenção das células T gama delta nos tecidos após o transplante (Seigers, Front in Immunol, 2018). As células T gama delta também expressam os ligantes L-selectina (CD62L) e- e P- selectina, bem como outras moléculas de retorno em resposta à inflamação, mediando seu retorno e retenção em vários tipos de tecido (pele, intestino, fígado, cérebro, medula óssea, linfônodos, etc.) (Sackstein et al, Lab Invest 2017 97:669-97).

[007] Métodos para a cultura ex vivo das células T gama delta para transplante foram propostos. Por exemplo, US2005/0196385 para Romagne e Laplace e a US2009/0130074 para Moser e Kuchen ensinam a expansão e ativação das células T gama delta usando moléculas pequenas ativadoras da célula T gama delta sintéticas ou naturais. A US2017/0107490 para Maeurer e a US2018/0312808 para Hayday et al, ensinam a expansão ex vivo das células T gama delta cultivando-se com combinações diferentes de IL-2, IL-15 e IL-

21. Alguns modelos de expansão da célula T gama delta incluem a indução ou engenheiramento das funções que apresentam antígeno nas células T gama delta (ver, por exemplo, US2008/0075732 para Moser e Kuchen), engenheiramento da expressão das porções de reconhecimento de tumor (ver, por exemplo, Jakobovits et al, US2016/0175358), seleção das células T gama delta das células tronco pluripotentes que expressam CAR (receptor de

4 / 69 antígeno quimérico) (por exemplo: US2016/0009813 para Themeli et al, US2018/ 0353588 para Boyd et al, 2018/0125889 para Leek et al, US2018/0200299 para Cooper et al, US2018/0250337 para Lamb et al), direcionando HSC para diferenciar em células T gama delta (por exemplo, US2016/0213715 para Messina e Tie) e engenheiramento da expressão de CXCR6 nas células T gama delta (US2018/0256645 para Kobold et al) para alvejamento aos tumores.

[008] O uso terapêutico das populações expandidas das células T gama delta foram o assunto de mais do que 15 testes clínicos completos, ativos, recrutando ou autorizados (ver o site da internet clinical trials (dot)gov) investigando a aplicação das células T gama delta expandidas através de diferentes protocolos para o tratamento de uma variedade de condições infecciosas e cancerosas. As populações expandidas de célula gama delta foram verificadas, em geral, manter a função citotóxica. Contudo, os resultados até o presente ressaltam a dificuldade em projetar a expansão da célula T gama delta e os protocolos de terapia que não somente seguros mas provêm populações grades expandidas de células T gama delta suficientemente eficazes no alvejamento dos tecidos afetados.

[009] As publicações relevantes adicionais incluem Nicol et al (BJ of Cancer, 2011 105:778-106), Kobayashi et al (AntiCancer Res 2010 30:575-580), Berglund et al (Stem Cell Int 2018 ID8529104), Tan et al (J Immunol Sci 2018 2:6-12), Fisher et al (Frontiers in Immunol 2018 9:1409), US20018/0207568 para Belmant e a US2009/0304688 para Fournie et al.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0010] De acordo com um aspecto da presente invenção é provido um método para melhorar o potencial de retorno e/ou retenção da célula T gama delta, o método compreendendo: (a) obter uma população de células selecionada enriquecida por células T gama delta;

5 / 69 (b) prover ex vivo a população de células selecionada com condições para a expansão da célula T gama delta, (c) prover nicotinamida na faixa de 0,5 a 50 mM por um período de tempo suficiente para melhorar o potencial de retorno e/ou retenção da célula T gama delta, deste modo melhorando o potencial de retorno e/ou retenção das células T gama delta na população de células selecionada.

[0011] De acordo com um aspecto da presente invenção é provido um método para melhorar a expressão de CD62L da célula T gama delta, o método compreendendo: (a) obter uma população de células selecionada enriquecida para as células T gama delta; (b) prover ex vivo a população de células selecionada com condições para expansão da célula T gama delta, (c) prover nicotinamida na faixa de 0,5 a 50 mM por um período de tempo suficiente para melhorar a expressão de CD62L da célula T gama delta, deste modo melhorando a expressão de CD62L das células T gama delta na população de células selecionada.

[0012] Ainda de acordo com as características adicionais nas modalidades preferidas descritas, as condições para a expansão da célula T gama delta compreendem prover nutrientes e citocinas.

[0013] Ainda de acordo com as características adicionais nas modalidades preferidas descritas, as citocinas são selecionadas do grupo que consiste em IL-2, IL-15 e IL-21.

[0014] Ainda de acordo com as características adicionais nas modalidades preferidas descritas, a nicotinamida é selecionada a partir do grupo que consiste em nicotinamida, um análogo de nicotinamida, um metabólito de nicotinamida, um análogo do metabólito de nicotinamida e

6 / 69 derivados destes.

[0015] Ainda de acordo com as características adicionais nas modalidades preferidas descritas, a população de células selecionada é uma população de células de linfócitos enriquecida para as células T gama delta através da depleção da célula T alfabeta.

[0016] Ainda de acordo com as características adicionais nas modalidades preferidas descritas, a população de células selecionada compreende as células exterminadoras naturais (NK).

[0017] Ainda de acordo com as características adicionais nas modalidades preferidas descritas, o método adicionalmente compreende prover as condições para expansão da célula NK.

[0018] Ainda de acordo com as características adicionais nas modalidades preferidas descritas, prover as condições para a expansão da célula T gama delta e a nicotinamida melhora o potencial de retorno e/ou retenção e/ou a expressão de CD62L das células NK na população de células selecionada.

[0019] Ainda de acordo com as características adicionais nas modalidades preferidas descritas, a população de células selecionada é uma população de células de linfócitos enriquecida para as células T gama delta através da seleção das células T gama delta.

[0020] Ainda de acordo com as características adicionais nas modalidades preferidas descritas, a população de células selecionada é desprovida de células NK.

[0021] Ainda de acordo com as características adicionais nas modalidades preferidas descritas, a população de células T gama delta é derivada de um órgão selecionado a partir do grupo que consiste em um músculo, pele, um osso, um órgão linfático, um pâncreas, um fígado, uma vesícula biliar, um rim, um órgão do trato digestivo, um órgão do trato respiratório, um órgão reprodutivo, um órgão do trato urinário, um órgão

7 / 69 associado ao sangue, um timo, um baço, um órgão do sistema nervoso.

[0022] Ainda de acordo com as características adicionais nas modalidades preferidas descritas, a população de células T gama delta é derivada de uma fonte selecionada a partir do grupo que consiste em células hematopoiéticas, células de sangue do cordão umbilical, células sanguíneas periféricas mobilizadas e células da medula óssea.

[0023] Ainda de acordo com as características adicionais nas modalidades preferidas descritas, a população de células T gama delta é derivada de medula óssea ou sangue periférico.

[0024] Ainda de acordo com as características adicionais nas modalidades preferidas descritas, a população de células T gama delta é derivada do sangue do cordão umbilical neonatal.

[0025] Ainda de acordo com as características adicionais nas modalidades preferidas descritas, a população de células é derivada de uma fração celular mononuclear.

[0026] Ainda de acordo com as características adicionais nas modalidades preferidas descritas, a população de células T gama delta é de uma amostra de aférese.

[0027] Ainda de acordo com as características adicionais nas modalidades preferidas descritas, o período de tempo da etapa (c) do método é entre 1 e 3 semanas.

[0028] Ainda de acordo com as características adicionais nas modalidades preferidas descritas, o período de tempo da etapa (c) do método é entre 1 e 7 dias.

[0029] Ainda de acordo com as características adicionais nas modalidades preferidas descritas, a concentração da nicotinamida é na faixa de 0,5 a 20 mM.

[0030] Ainda de acordo com as características adicionais nas modalidades preferidas descritas, a nicotinamida é provida em uma

8 / 69 concentração de 5 mM.

[0031] Ainda de acordo com as características adicionais nas modalidades preferidas descritas, o método adicionalmente compreende selecionar uma população de células T gama delta de acordo com um marcador celular selecionado a partir do grupo que consiste em um tumor antígeno, um antígeno viral e um antígeno bacteriano.

[0032] De acordo com um aspecto da presente invenção é provida uma composição celular terapêutica compreendendo uma população de células T gama delta expandida selecionada, a população de células ex vivo cultivada com condições para a expansão da célula T gama delta e quantidade de nicotinamida na faixa de 0,5 a 50 mM, em que a população de células T gama delta expandida selecionada é distinguida por pelo menos um de: (i) potencial de retorno e/ou retenção da célula T gama delta melhorado, e (ii) expressão melhorada de CD62L, em comparação com uma população selecionada similar de célula T gama delta expandida com condições idênticas e não mais do que 0,1 mM de nicotinamida.

[0033] Ainda de acordo com as características adicionais nas modalidades preferidas descritas, a composição celular terapêutica compreende as células T gama delta cultivadas de acordo com o método da invenção como aqui detalhado.

[0034] Ainda de acordo com as características adicionais nas modalidades preferidas descritas, a composição celular terapêutica adicionalmente compreende as células NK.

[0035] De acordo com um aspecto da presente invenção é provido um método para transplantar as células em um sujeito, o método compreendendo: (a) expandir ex vivo uma população selecionada de célula T gama delta cultivando-se as condições de população de células para a

9 / 69 expansão da célula T gama delta e nicotinamida na faixa de 0,5 a 50 mM por um período de tempo suficiente para melhorar o potencial de retorno e/ou retenção da célula T gama delta e/ou expressão de CD62L, em que a população de células T gama delta expandida selecionada é distinguida por pelo menos um de: (i) potencial de retorno e/ou retenção da célula T gama delta melhorado, e (ii) expressão de CD62L melhorada, em comparação com uma população de células T gama delta similar expandida selecionada sem 0,5 a 50 nM de nicotinamida, e (b) infusão das células T gama delta expandidas em um sujeito em necessidade desta.

[0036] Ainda de acordo com as características adicionais nas modalidades preferidas descritas, a etapa (a) do método para transplantar as células é afetada de acordo com o método da expansão da célula T gama delta da invenção como aqui descrito em detalhes.

[0037] Ainda de acordo com as características adicionais nas modalidades preferidas descritas, o sujeito é um sujeito humano.

[0038] Ainda de acordo com as características adicionais nas modalidades preferidas descritas, as células T gama delta são halogênicas ao sujeito.

[0039] Ainda de acordo com as características adicionais nas modalidades preferidas descritas, as células T gama delta são autólogas ao sujeito.

[0040] Ainda de acordo com as características adicionais nas modalidades preferidas descritas, o sujeito está sofrendo de uma condição selecionada a partir do grupo que consiste em um câncer, uma infecção bacteriana, uma infecção viral, uma condição autoimune e uma condição inflamatória.

10 / 69

[0041] Ainda de acordo com as características adicionais nas modalidades preferidas descritas, o transplante das células no sujeito compreende uma terapia adjunta.

[0042] Ainda de acordo com as características adicionais nas modalidades preferidas descritas, a terapia adjunta é em combinação com uma terapia selecionada a partir do grupo que consiste em terapia antiviral, terapia anti-inflamatória, terapia antibiótica, terapia bactericida, quimioterapia, cirurgia, imunoterapia, imunoquimioterapia, radioterapia, transplante de medula óssea e transplante de célula tronco hematopoiética.

[0043] Ainda de acordo com as características adicionais nas modalidades preferidas descritas, o sujeito está sendo tratado com células tronco hematopoiéticas do sangue do cordão umbilical expandidas em cultura com mais do que 1,0 mM de nicotinamida antes de, concomitantemente com ou após o transplante das células T gama delta expandidas.

[0044] A menos que de outro modo definido, todos os termos técnicos e/ou científicos aqui usados têm o mesmo significado como comumente entendido por uma pessoa de habilidade comum na técnica na técnica à qual a invenção pertence. Embora os métodos e materiais similares ou equivalentes àqueles aqui descritos possam ser usados na prática ou teste das modalidades da invenção, os métodos e/ou materiais exemplificativos são descritos abaixo. No caso de conflito, o pedido de patente, incluindo as definições, controlará. Além disso, os materiais, métodos, e exemplos são apenas ilustrativos e não são intencionados ser necessariamente limitantes. DESCRIÇÃO RESUMIDA DAS DIVERSAS VISTAS DA(S) FIGURA(S)

[0045] Algumas modalidades da invenção são aqui descritas, apenas por via de exemplo somente, com referência às figuras em anexo. Com referência específica agora às figuras em detalhes, é enfatizado que os particulares mostrados são por via de exemplo e para propósito de descrição ilustrativa as modalidades da invenção. A este respeito, a descrição tomada

11 / 69 com as figuras torna evidente àqueles habilitados na técnica como as modalidades da invenção podem ser praticadas.

[0046] Nas figuras: A FIG. 1 é um histograma mostrando o enriquecimento das células T gama delta nas amostras celulares de sangue periférico esgotadas em alfabeta. As células sanguíneas esgotadas em alfabeta foram cultivadas com ou sem 5 mM de nicotinamida (NAM) por 12 a 13 dias, as células CD3+ foram selecionadas e analisadas por FACS quanto a células CD3+/gama delta + e CD3+/alfabeta+. Foram observadas mais do que 90% de células T gama delta nestas frações de célula T das culturas tanto de NAM quanto de controle; A FIG. 2 é um histograma mostrando a melhora na expressão de CD62L (L-selectina) nas células T gama delta através da nicotinamida. As células T gama delta purificadas das células sanguíneas esgotadas em alfabeta cultivadas de 12 a 13 dias com 5 mM de nicotinamida (NAM) foram tingidas por CD62L e analisadas por FACS. Foi observado um aumento de quase 3 vezes na expressão de CD62L nas culturas tratadas com nicotinamida; A FIG. 3 é um histograma mostrando a melhora da funcionalidade das células T gama delta por cultura de nicotinamida. As células T gama delta purificadas das células sanguíneas esgotadas em alfabeta expandidas com ou sem 5 mM de nicotinamida (NAM) e rotuladas com CFSE foram injetadas em camundongos imunodeficientes de NSG irradiada. As frações das células tingidas com CFSE de vários órgãos foram avaliadas por FACS após 4 dias. Foi notado um efeito marcante de NAM no retorno in vivo e na retenção tissular das células gama delta em todos os tecidos analisados.

DESCRIÇÃO DAS MODALIDADES ESPECÍFICAS DA INVENÇÃO

[0047] A presente invenção, em algumas modalidades desta, diz respeito aos métodos para cultivar populações de célula gama delta, uso terapêutico das populações de célula gama delta cultivadas, e kits

12 / 69 compreendendo as células T gama delta cultivadas. Mais particularmente, mas não exclusivamente, a presente invenção diz respeito ao uso das células T gama delta cultivadas, sozinhas ou em combinação com outras células para transplante.

[0048] A nicotinamida (NAM), a forma amida de niacina (niacinamida, Vitamina B3) é um substrato de troca de base e um inibidor potente de enzimas dependentes de NAD(+) dotado de atividades de mono- e poli-ADP-ribosiltransferase. Como um micronutriente traço, a nicotinamida é necessária, em quantidades micro molares, para garantir a viabilidade e proliferação das células mamíferas na cultura ex vivo, e é comumente incluída, junto com outras vitaminas nas fórmulas para o meio de cultura celular. Como outras frações de linfócito, as células T gama delta são tipicamente cultivadas ex vivo em um meio compreendendo nicotinamida em concentrações que variam de cerca de 8 µM de nicotinamida (MEMα, RPMI) a cerca de 33 µM (DMEM) para promover o crescimento da célula T gama delta robusta (ver, por exemplo, o Pedido de Patente US 2016/0175358 para Jakobovits et al).

[0049] As concentrações mais altas de nicotinamida foram verificadas eficazes para melhorar a expansão e a funcionalidade das células tronco e progenitoras hematopoiéticas CD34+ e CD133+ (ver, por exemplo, as Patentes US Nos. 7.955.852 e 8.846.393) e as células exterminadoras naturais CD56+ (ver, por exemplo, Frei et al. Blood 2011 118:4035), mas também foram reportadas inibir a responsividade aos sinais de ativação e induze2m a apoptose nas células T (ver, por exemplo, Liu et al J Immunol 2001 167:4942-4947) e neutrófilos (Fernandes et al, Am J Physiol Lung Cell Mol Phys 2011 300: L354-361).

[0050] Os presentes inventores supreendentemente mostraram que a adição de concentrações milimolares de nicotinamida às populações enriquecidas de células T gama delta humanas cultivadas ex vivo na presença

13 / 69 de condições para a proliferação da célula T gama delta, como também é aqui detalhado, resulta em uma funcionalidade melhorada, por exemplo, um maior retorno e retenção tissular das células T gama delta quando infundidas em camundongos SCID hospedeiros.

[0051] Visto que as células T gama delta participam das respostas imunológicas durante a homeostase tissular, doença infecciosa e autoimune, inflamação, transplante e vigilância tumoral, apresentam atividade citotóxica espontânea não restrita ao MHC contra as células infectadas e tumorais, e mediam a resistência às infecções virais e desenvolvimento do câncer in vivo, os métodos para aumentar eficazmente a funcionalidade da célula T gama delta podem ser úteis para o tratamento de tumores e para a eliminação das células infectadas com uma resposta mais forte e menos efeitos adversos.

[0052] Deste modo, desenvolver protocolos para eficazmente melhorar a função da célula T gama delta cultivada e a probabilidade de seu retorno e retenção em tecidos hospedeiros in vivo após a infusão, poderia melhorar o sucesso de terapias, tal como a imunoterapia adotiva, com células T gama delta para o tratamento de tumores sólidos, malignidades, distúrbios virais e autoimunes e os semelhantes.

[0053] Deste modo, de acordo com um aspecto de uma modalidade da presente invenção é provido um método para melhorar o potencial de retorno e/ou retenção da célula T gama delta, o método compreendendo obter uma população de células selecionada enriquecida para as células T gama delta, ex vivo provendo a população de células selecionada com condições para a expansão da célula T gama delta, e provendo a nicotinamida na faixa de 0,5 a 50 mM por um período de tempo suficiente para melhorar o potencial de retorno e/ou retenção da célula T gama delta, deste modo melhorando o potencial de retorno e/ou retenção das células T gama delta na população de células selecionada.

[0054] Como aqui usado, o termo “célula T gama delta” também pode

14 / 69 ser aqui indicado como uma “célula T γδ”, uma “célula-T gama delta”, ou adicionalmente como uma “célula-T gd” ou “célula T gd”.

[0055] As células T gama delta são definidas através da expressão dos receptores da célula T heterodiméricos (TCRs) compostos de cadeias γ(gama) e δ(delta). Isso os diferencia das células T auxiliares CD4+ clássicas e muito mais bem conhecidas e das células T citotóxicas CD8+ que expressam os TCRs de αβ. O mecanismo de seleção (tímico) das células T γδ é ainda amplamente desconhecido.

[0056] As células T gama delta mostram frequentemente um retorno específica ao tecido de subpopulações oligoclonais que compartilham as mesmas cadeias de TCR. Por exemplo, as células T gama delta do sangue periférico humano são amplamente Vgama9/Vdelta2+, e células T gama delta da pele de murinos, a então chamadas células T epidérmicas dendríticas (células DECT), são amplamente Vgama5/Vdelta1+. Em geral, as células T gama delta são enriquecidas nos tecidos epiteliais e da mucosa onde estes são pensados servir como a primeira linha de defesa contra a inoculação patogênica.

[0057] Como aqui usado, “ativação da célula T gama delta” se refere a qualquer fenômeno biológico mensurável associado com uma célula T gama delta que é representativa de tal célula T sendo ativada. Exemplos não limitantes de tal fenômeno biológico incluem um aumento da produção de citocina, mudanças na composição qualitativa ou quantitativa das proteínas da superfície celular, um aumento na proliferação da célula T, e/ou um aumento na função efetora da célula T, tal extermínio de uma célula alvo ou ajudando uma outra célula efetora a exterminar uma célula alvo.

[0058] De acordo com algumas modalidades da presente invenção, o método da invenção melhora o potencial de retorno e/ou retenção das células T gama delta.

[0059] Como aqui usado, os termos “função” ou “função da célula T

15 / 69 gama delta” se referem a qualquer função biológica atribuída às células T gama delta. Uma lista não limitante das funções da célula T gama delta inclui, por exemplo, citotoxicidade, indução do apoptose, motilidade celular, migração direcionada, citocina e outras respostas do sinal celular, produção e secreção de citocina/quimiocina, expressão de moléculas da superfície celular ativadoras e inibidoras in vitro, retorno celular e retenção in vivo em um hospedeiro transplantado, e alteração da doença ou processos da doença in vivo. Em algumas modalidades, as funções da célula T gama delta melhoradas pela exposição à nicotinamida e/ou outra porção de nicotinamida incluem pelo menos um de expressão elevada do marcador de superfície de CD62L, resposta à migração elevada, e maior atividade citotóxica das células T gama delta, bem como retorno elevada e retenção in vivo das células T gama delta infundida. Em algumas modalidades especificas, as funções da célula T gama delta melhoraram através da exposição à nicotinamida e/ou outra porção de nicotinamida inclui pelo menos um de expressão elevada do marcador de superfície de CD62L das células T gama delta e retorno elevada e retenção in vivo das células T gama delta infundidas. Nas modalidades particulares, tanto a expressão do marcador de superfície de CD62L das células T gama delta quanto a retorno e retenção in vivo das células T gama delta infundidas são melhoradas pela exposição das células T gama delta à nicotinamida e/ou outra porção de nicotinamida.

[0060] Os ensaios para as moléculas de adesão e migração tais como CD62L, CXCR-4, CD49e e os semelhantes, importantes para a retorno e retenção das células no transplante, são bem conhecidas na técnica. A expressão de CD62L em uma célula pode ser ensaiada, por exemplo, por citometria de fluxo, imunodetecção, amplificação de cDNA quantitativo, hibridização e os semelhantes. Em uma modalidade, a expressão de CD62L é detectada em diferentes populações das células T gama delta pela exposição das células a um anticorpo monoclonal de CD62L anti-humano específico

16 / 69 rotulado por fluorescência [por exemplo, CD62L PE, Cat. No. 304806 da BioLegend (San Diego, CA, EUA)], e ordenamento das células pela ordenação celular ativada por fluorescência (FACS).

[0061] Os ensaios para a migração celular são bem conhecidos na técnica. A migração das células pode ser ensaiada, por exemplo, através dos ensaios de transmigração ou ensaios de fechamento de lacunas. Nos ensaios de transmigração, tal como a técnica de duas câmaras, as células são separadas de um estímulo por uma barreira (por exemplo, filtro), e a migração das células é detectada contando-se a perda das células na origem, o acúmulo das células através da barreira, ou ambos, em intervalos específicos. No ensaio de fechamento de lacuna, as células são colocadas na periferia de uma lacuna visível (placa de ágar graduada, em torno de um círculo, etc.) e incubadas com um estímulo. O fechamento do espaço entre as células aplicado pela motilidade celular, em resposta a um estímulo, é visualizado usando citometria, imunodetecção, microscopia/morfométricas, etc. Em uma modalidade, o potencial de migração de diferentes populações das células é determinado pelo ensaio de transmigração “Transwell®”.

[0062] Os ensaios para a retorno e retenção in vivo das células transfundidas ou transplantadas são bem conhecidos na técnica. Como aqui usado, o termo “migrar” se refere à capacidade de uma célula transfundida ou transplantada de chegar a, e sobreviver em um órgão hospedeiro alvo. Por exemplo, os órgãos alvo da célula T gama delta podem ser o tecido linfoide, os órgãos alvos dos hepatócitos podem ser o parênquima hepático, órgãos alvos das células alveolar podem ser o parênquima pulmonar, etc. Como aqui usado, o termo “retenção in vivo” se refere à capacidade das células transfundidas ou transplantadas de popular, opcionalmente proliferar e permanecer viável nos órgãos alvos. Os modelos animais para ensaiar a retorno e retenção in vivo das células T gama delta transplantadas incluem, mas não são limitadas aos mamíferos pequenos imunodeficientes (tais como

17 / 69 os camundongos SCID e IL2Rγnull e os semelhantes). O modelo de camundongo SCID-Hu utiliza o camundongo C.B-17 scid/scid (SCID) transplantado com timo fetal humano e tecido hepático ou tecido BM fetal e provê um modelo apropriado para a avaliação do potencial de retenção e terapêutico das células T gama delta humanas transplantadas. A retorno e a retenção in vivo das células transplantadas também pode ser avaliada em sujeitos hospedeiros humanos. Em uma modalidade, a retorno e retenção in vivo é ensaiada em camundongos NOD/SCID irradiados, transfundidos com, por exemplo, cerca de 15X104, cerca de 15X105, cerca de 15X106, cerca de 15X107 ou mais células T gama delta humanas enriquecidas cultivadas com uma concentrações eficazes de nicotinamida de acordo com a presente invenção, e sacrificados em um tempo pré-determinado após a transfusão (por exemplo, cerca de 5 horas, 10 horas, 12 horas, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 dias, 1, 2, 3, 4, 5 semanas, 2, 3, 4 meses ou mais após a transfusão). No sacrifício dos camundongos, as amostras do baço, medula óssea, sangue periférico, e outros órgãos são avaliadas por FACS quanto a presença das células T gama delta humanas.

[0063] Adicionalmente, a frase “potencial de retorno e/ou retenção” se refere à capacidade das células (por exemplo células T gama delta), quando infundidas em um organismo hospedeiro (por exemplo, sujeito), mais comumente na circulação como uma infusão intravenosa, para sair do sistema circulatório e popular um órgão ou tecido hospedeiro. Em particular, o termo “retenção”, como aqui usado, se refere à capacidade das células infundidas de permanecer em um tecido ou órgão hospedeiro após a “retorno” e população daquele tecido ou órgão. Como aqui usado, a frase “melhorando o potencial de retorno e/ou retenção” se refere a uma melhora na eficácia, qualidade ou rapidez do transplante celular que pode resultar do retorno e/ou retenção melhorados ao tecido ou órgão alvo, adesão melhorada, rejeição reduzida e os semelhantes.

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[0064] Os ensaios para citotoxicidade (“extermínio celular”) são bem conhecidos na técnica. Os exemplos de células alvo adequadas para o uso nos ensaios de extermínio redirecionados são linhagem celular cancerosa, células cancerosas primárias, células de tumor sólido, células leucêmicas, ou células viralmente infectadas. Particularmente, K562, BL-2, colo250 e células leucêmicas primárias podem ser usadas, mas qualquer um de vários outros tipos celulares podem ser usados e são bem conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Sivori et al. (1997) J. Exp. Med. 186: 1129-1136; Vitale et al. (1998) J. Exp. Med. 187: 2065-2072; Pessino et al. (1998) J. Exp. Med. 188: 953-960; Neri et al. (2001) Clin. Diag. Lab. Immun. 8:1131-1135). O extermínio celular é avaliado pelos ensaios de viabilidade celular (por exemplo, exclusão de corante, liberação de cromo, CFSE), ensaios metabólicos, por exemplo, sais de tetrazólio), e observação direta.

[0065] O potencial de retorno e/ou retenção das células pode ser determinado ex vivo através da medição dos marcadores da funcionalidade celular (por exemplo, moléculas de adesão tais como CD62L, ligante de selectina, etc.), ou através da infusão e transplante in vivo no modelo de camundongo SCID-Hu. O modelo de camundongo SCID-Hu utiliza camundongos C.B-17 scid/scid (SCID) transplantados com timo fetal humano e tecido hepático ou tecido BM fetal e provê um modelo apropriado para a avaliação das células linfoides putativas humanas transplantáveis e outras células. Por causa da reconstituição dos camundongos SCID com tecido fetal humano, o modelo oferece a retorno e retenção das células humanas e funciona em um microambiente de origem humana. Os camundongos são tipicamente irradiados, então liberaram células linfoides nos enxertos, e a retorno/retenção é medida através de qualquer número de métodos, incluindo FACS e imuno-histoquímica dos órgãos repopulados (por exemplo, ver Materiais e Métodos Experimentais abaixo).

[0066] Como aqui usado o termo “ex vivo” se refere a um processo no

19 / 69 qual as células são removidas de um organismo vivo e são propagadas fora do organismo (por exemplo, em um tubo de teste).

[0067] Como aqui usado, o termo “in vitro” se refere a um processo no qual as células que se originam de uma linhagem ou linhagens celulares (tais como as células neurais NTera2, linhagens celulares embrionárias, etc.) mantidas no laboratório, são manipuladas fora de um organismo. Tais linhagens celulares são, frequentemente, células imortalizadas.

[0068] Como aqui usado a frase “população de células” se refere a uma população de células homogênea ou heterogênea isolada que pode compreender as populações celulares adequadas para a expansão ou transplante de acordo com os métodos da invenção. Em uma modalidade preferida, pelo menos uma porção da população de células deste aspecto da presente invenção são células T gama delta, expressando os TCRs heterodiméricos compreendendo cadeias γ(gama) e δ(delta) na superfície da célula.

[0069] Em alguns aspectos, a presente descrição provê métodos para a expansão ex vivo de uma população de células T gama delta. Uma célula T gama delta ou população de células T gama delta da descrição podem ser expandidas ex vivo. Uma célula T gama delta ou população de células T gama delta da descrição podem ser expandidas sem a ativação por APCs, ou sem cocultura com APCs e aminofosfatos.

[0070] De acordo com algumas modalidades do método da invenção, as células T gama delta são providas com condições para a expansão da célula T gama delta.

[0071] Nas modalidades específicas, as condições para a expansão da célula T gama delta compreendem a provisão de nutrientes e citocinas.

[0072] Os meios de cultura adequados capazes de suportar as células T gama delta incluem HEM, DMEM, RPMI, F-12, e os semelhantes. Se requerido, o meio pode conter suplementos requeridos para o metabolismo

20 / 69 celular tal como glutamina e outros aminoácidos, vitaminas, minerais e proteínas úteis tais como transferrina, e os semelhantes. O meio pode ou pode não conter soro adicionado. O meio também pode conter antibióticos para prevenir a contaminação com levedura, bactéria, e fungos, tais como penicilina, estreptomicina, gentamicina, e os semelhantes. Se as células devem ser cultivadas, as condições devem estar próximas às condições fisiológicas (preferivelmente, um pH de cerca de 6 a cerca de 8, e uma temperatura de cerca de 30ºC a cerca de 40ºC). Em algumas modalidades, o meio de cultura pode ser opcionalmente suplementado com pelo menos um fator de crescimento que induz a proliferação, citocinas e/ou quimiocinas tais como IL-2, IL, IL-4, IL-7, IL-15, IL-12, IL-21, IL-23 ou IL-33 e combinações destes. Nas modalidades específicas, o meio de cultura é suplementado com IL-2, e/ou IL-15. Além do fator de crescimento que induz a proliferação, outros fatores de crescimento podem ser adicionados ao meio de cultura. Em algumas modalidades exemplificativas, as células T gama delta são estimuladas e expandidas em um meio isento de soro tal como Ex vivo 10, Ex vivo 15, Ex vivo 20, meio AIMV, Optimizer CTS, contendo citocinas (IL-2, IL-4, IL-7, IL-15, IL-12, IL-21, IL-23 ou IL-33), fatores de crescimento (insulina e transferrina, fatores de crescimento semelhantes à insulina), albumina, lipídeos (colesterol, soluções lipídicas, precursores lipídicos), vitaminas, cobre, ferro, selênio, hidrolisado de proteína, aminoácidos essenciais, aminoácidos não essenciais, e protetores ao cisalhamento (Pluronic F-68).

[0073] As citocinas e outros fatores de crescimento são tipicamente providos em concentrações variando de 0,5 a 100 ng/ml, ou 1,0 a 80 ng/ml, mais tipicamente de 5 a 750ng/ml, ainda mais tipicamente de 5,0 a 50 ng/ml (até 10X tais concentrações podem ser consideradas), e estão comercialmente disponíveis, por exemplo, da Perpo Tech, Inc., Rocky Hill, NJ, EUA. Em uma modalidade, as condições que permitem a proliferação celular inclui prover a

21 / 69 citocina interleucina 2 ou interleucina 15. Nas modalidades específicas, as células T gama delta são cultivadas com 20 ng/ml de IL-15 e/ou IL-2.

[0074] Além disso, será reconhecido a este respeito que novas citocinas são continuamente verificações, algumas das quais podem encontrar usos nos métodos de proliferação da célula T gama delta da presente invenção. Para as aplicações nas quais as células são introduzidas (ou reintroduzidas) em um sujeito humano, é frequentemente preferível usar formulações isentas de soro, tal como um meio isento de soro AIM VRTM para a cultura de linfócitos ou meio de medula óssea MARROWMAXRTM. Tais formulações de meio e suplementos estão disponíveis de fontes comerciais tais como Invitrogen (GIBCO) (Carlsbad, Calif). As culturas podem ser suplementadas com aminoácidos, antibióticos, e/ou com citocinas para promover a viabilidade, proliferação, funcionalidade e/ou e sobrevivência ótimas.

[0075] Tal meio isento de soro pode ser adicionalmente suplementado com aditivos para suportar o crescimento da célula T gama delta com alta densidade celular em uma cultura de suspensão (por exemplo, biorreator WAVE) enquanto mantendo a funcionalidade biológica das células T gama delta.

[0076] A cultura Ex vivo das células T gama delta pode ser efetuada de acordo com um aspecto da presente invenção, provendo-se as células T gama delta ou populações de célula gama delta ex vivo com condições para a proliferação celular e a cultura ex vivo das células T gama delta com uma porção de nicotinamida, deste modo expandindo ex vivo e/ou melhorando a retorno ex vivo e/ou o potencial de retenção da população de células T gama delta.

[0077] Como aqui usado “cultivar” incluir prover as condições químicas e físicas (por exemplo, temperatura, gás) que são requeridas para a manutenção da célula T gama delta, e, opcionalmente, fatores de crescimento.

22 / 69 Em uma modalidade, cultivar as células T gama delta inclui prover as células T gama delta com condições para a expansão da célula T gama delta (por exemplo, proliferação). Os exemplos de condições químicas que podem suportar a expansão da célula T gama delta incluem, mas não são limitados a tampões, nutrientes, soro, vitaminas e antibióticos, bem como citocinas e outros fatores de crescimento que são tipicamente providos no meio de crescimento (isto é, cultura). Em uma modalidade particular, as condições para o crescimento celular compreendem nutrientes, soro e citocina(s). Em uma modalidade, o meio de cultura T gama delta inclui um meio essencial mínimo (MEM), tal como MEMα (BI, Bet HaEmek, Israel) e soro. Em uma modalidade particular, o meio de cultura é MEMα compreendendo Soro AB Humano a 10 % (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Outros meios adequados para usar com a invenção incluem, mas não são limitados ao meio de Glascow (Gibco Carlsbad CA), meio RPMI (Sigma-Aldrich, St Louis MO) ou DMEM (Sigma-Aldrich, St Louis MO). Será notado que muitos dos meios de cultura contêm nicotinamida como um suplemento vitamínico por exemplo, MEMα (8,19 µM de nicotinamida), RPMI (8,19 µM de nicotinamida), DMEM (32,78 µM de nicotinamida) e meio de Glascow (16,39 µM de nicotinamida), contudo, os métodos da presente invenção dizem respeito à nicotinamida adicionada de maneira exógena suplementando qualquer nicotinamida e/ou porção de nicotinamida incluída na fórmula do meio, ou que resulta do ajuste global das concentrações dos componentes do meio.

[0078] De acordo com uma modalidade, a célula T gama delta ou população de células T gama delta é cultivada com nutrientes, soro, citocina(s) (por exemplo IL-15 e/ou IL-2) e nicotinamida e/ou uma porção de nicotinamida. Como aqui usado, o termo “porção de nicotinamida” se refere à nicotinamida bem como aos produtos que são derivados da nicotinamida, derivados, análogos e metabólitos destes, tais como, por exemplo, NAD, NADH e NADPH, que são capazes de melhorar eficazmente e

23 / 69 preferencialmente a retorno e/ou retenção da célula T gama delta. Os derivados análogos e metabólitos de nicotinamida, podem ser triados e avaliados quanto ao seu efeito no retorno e/ou retenção em cultura através da adição às culturas de célula T gama delta mantidas como aqui descrito, adicional aos ensaios funcionais tais como adesão celular, ensaio de rolagem e motilidade, ou em protocolos de triagem automatizados para os marcadores de retorno e/ou retenção projetados para os ensaios de alto rendimento bem conhecidos na técnica.

[0079] Como aqui usado, a frase “análogo de nicotinamida” se refere a qualquer molécula que é conhecida agir de maneira similar à nicotinamida nos ensaios acima mencionados ou similares. Os exemplos representativos de análogos de nicotinamida podem incluir, sem limitação, benzamida, nicotinotioamida (o análogo de tiol da nicotinamida), ácido nicotínico e ácido α-amino-3-indolepropiônico.

[0080] A frase “derivado de nicotinamida” adicionalmente se refere a qualquer derivado estrutural da nicotinamida em si ou de um análogo da nicotinamida. Os exemplos de tais derivados incluem, sem limitação, benzamidas substituídas, nicotinamidas e nicotinotioamidas substituídas e nicotinamidas e nicotintioamidas N-substituídas, 3-acetilpiridina e nicotinato de sódio. Em uma modalidade particular da invenção, a porção de nicotinamida é nicotinamida.

[0081] A concentrações da nicotinamida ou porção de nicotinamida adequadas para o uso em algumas modalidades da presente invenção são tipicamente na faixa de cerca de 0,5 mM a cerca de 50 mM, cerca de 1,0 mM a cerca de 25 mM, cerca de 1,0 mM a cerca de 25 mM, cerca de 2,5 mM a cerca de 10 mM, cerca de 5,0 mM a cerca de 10 mM, cerca de 0,5 mM a 20 mM. As concentrações eficazes exemplificativas da nicotinamida podem ser de cerca de 0,5 a cerca de 15 mM, 1,0 a 10,0 mM, tipicamente 2,5 ou 5,0 mM, com base no efeito destas concentrações de nicotinamida no retorno e/ou

24 / 69 retenção das células T gama delta. De acordo com algumas modalidades da invenção, a nicotinamida é provida em uma concentração na faixa (mM) de cerca de 0,5, cerca de 0,75, cerca de 1,0, cerca de 1.25, cerca de 1,5, cerca de 1,75, cerca de 2,0, cerca de 2,25, cerca de 2,5, cerca de 2,75, cerca de 3,0, cerca de 3,25, cerca de 3,5, cerca de 3,75, cerca de 4,0, cerca de 4,25, cerca de 4,5, cerca de 4,75, cerca de 5,0, cerca de 5,25, cerca de 5,5, cerca de 5,75, cerca de 6,0, cerca de 6,25, cerca de 6,5, cerca de 6,75, cerca de 7,0, cerca de 7,25, cerca de 7,5, cerca de 7,75, cerca de 8,0, cerca de 8,25, cerca de 8,5, cerca de 8,75, cerca de 9,0, cerca de 9,25, cerca de 9,5, cerca de 9,75, cerca de 10,0, cerca de 11,0, cerca de 12,0, cerca de 13,0, cerca de 14,0, cerca de 15,0, cerca de 16,0, cerca de 17,0, cerca de 18,0, cerca de 20,0 mM, cerca de 23,0 mM, cerca de 25,0 mM, cerca de 30,0 mM, cerca de 35,0 mM, cerca de 40,0 mM, cerca de 45,0 mM ou cerca de 50,0 mM. Todas as concentrações intermediárias eficazes são consideradas. Nas modalidades específicas, as condições que permitem a proliferação compreendem entre 0,5 e 50 mM, 1,0 a 10,0 mM de nicotinamida. Ainda em outras modalidades, as condições que melhoram a retorno e/ou retenção das células T gama delta compreendem 5,0 mM de nicotinamida.

[0082] As concentrações adequadas da nicotinamida e/ou porção de nicotinamida podem ser determinadas de acordo com qualquer ensaio de retorno e/ou retenção da célula T gama delta, ou expressão de CD62L. A concentração adequada de nicotinamida é uma concentração na qual o uso desta em cultura “melhora”, ou resulta em um aumento líquido da função da retorno e/ou retenção da célula T gama delta, se comparado às culturas de “controle” tendo menos do que 0,1 mM, menos do que 0,2 mM, ou menos do que 0,4 mM da nicotinamida e testadas da mesma fonte de célula T gama delta (por exemplo preparação de sangue do cordão, medula óssea ou sangue periférico), no mesmo ensaio e sob condições de cultura similares (duração da exposição à nicotinamida, tempo de exposição à nicotinamida, condições para

25 / 69 expansão).

[0083] Será notado que as condições para a expansão e melhoria das células T gama delta de acordo com os métodos da presente invenção também podem ser favoráveis para a cultura de outros tipos de células verificadas em uma população misturada de células com células T gama delta. Deste modo, em algumas modalidades, prover as condições para a expansão da célula T gama delta e nicotinamida de acordo com os métodos aqui descritos também melhora o potencial de retorno e/ou retenção de outras células linfoides, por exemplo, células NK, provendo populações celulares expandidas de eficácia terapêutica potencialmente maior do que populações celulares similares cultivadas e/ou expandidas sem nicotinamida adicional.

[0084] Nas modalidades específicas, o método da invenção pode expandir e melhorar a funcionalidade de várias populações de célula(s) T gama delta, tal como uma população de células T gama delta Vgama1+, um Vgama2+, Vgama3+. Em alguns exemplos, uma população de células T gama delta pode ser cultivada ex vivo em menos do que 36 dias, menos do que 35 dias, menos do que 34 dias, menos do que 33 dias, menos do que 32 dias, menos do que 31 dias, menos do que 30 dias, menos do que 29 dias, menos do que 28 dias, menos do que 27 dias, menos do que 26 dias, menos do que 25 dias, menos do que 24 dias, menos do que 23 dias, menos do que 22 dias, menos do que 21 dias, menos do que 20 dias, menos do que 19 dias, menos do que 18 dias, menos do que 17 dias, menos do que 16 dias, menos do que 15 dias, menos do que 14 dias, menos do que 13 dias, menos do que 12 dias, menos do que 11 dias, menos do que 10 dias, menos do que 9 dias, menos do que 8 dias, menos do que 7 dias, menos do que 6 dias, menos do que 5 dias, menos do que 4 dias, menos do que 3 dias. em alguns exemplos a população de células T gama delta é cultivada por entre 1 e 8 semanas, entre 1 e 5 semanas, entre 1 e 4 semanas, entre 1 e 3 semanas, entre 1 e 2 semanas, entre 1 e 14 dias, entre 2 e 13 dias, entre 1 e 10 dias, entre 2 e 8 dias, entre 1 e 7

26 / 69 dias, entre 3 e 12 dias e entre 5 e 14 dias. Em algumas modalidades, a exposição ex vivo de curto prazo das células T gama delta enriquecidas à nicotinamida e/ou outra porção de nicotinamida, por períodos de minutos, horas, 1 dia, e os semelhantes também é previstas.

[0085] Em alguns estudos, a expansão ex vivo das células T gama delta cultivando-se com nutrientes, soro, citocinas e nicotinamida não requer o reabastecimento do meio ou manipulação durante o período de cultura, enquanto outros estudos defenderam o reabastecimento do meio de cultura (“realimentação”) em diferentes intervalos durante a cultura de célula T gama delta. Em algumas modalidades da presente invenção, a fração de célula T gama delta é “realimentada” durante o período de cultura. Deste modo, nas modalidades específicas, cultivar a população de células T gama delta compreende suplementar a células enriquecida com célula T gama delta com nutrientes frescos, soro, citocinas e nicotinamida de 8 a 10 dias após o início da cultura ex vivo. Em algumas modalidades, a suplementação é provida entre 8 e 9 dias após o início da cultura ex vivo, entre 9 e 10 dias após o início da cultura ex vivo, ou entre 8 e 10 dias após o início da cultura células enriquecidas com célula T gama delta. Em algumas modalidades, a suplementação (ou “realimentação”) compreende remover cerca de 30 a 80%, cerca de 40 a 70% ou cerca de 45 a 55% do meio da cultura, e substituir a mesma com um volume similar (por exemplo, equivalente) de meio fresco tendo a mesma composição e nível de nutrientes, soro, citocinas (por exemplo IL-2 e/ou IL-15) e nicotinamida como o meio removido. Em algumas modalidades, suplementar (ou “realimentar”) compreende remover cerca de 50% do meio da cultura, e substituir o meio removido com um volume similar (por exemplo, equivalente) do meio fresco tendo a mesma composição e nível de nutrientes, soro, citocinas (por exemplo IL-2 e/ou IL-15) e nicotinamida. Em outras modalidades, o volume de cultura após a realimentação atinge aproximadamente duas vezes o volume de cultura original no início da cultura

27 / 69 de células enriquecidas com a célula T gama delta (“semeadura”).

[0086] As populações celulares de gama delta podem ser cultivadas usando uma variedade de métodos e dispositivos. A seleção do dispositivo de cultura geralmente tem base na escala e propósito da cultura. Aumentar a escala da cultura celular preferivelmente envolve o uso de dispositivos dedicados. Em algumas modalidades, o cultivo das frações enriquecidas com a célula T gama delta é efetuado em frascos, em uma densidade celular de 100 a 4000 X 106 células por frasco. Nas modalidades específicas, o cultivo das frações enriquecidas com a célula T gama delta (por exemplo, início da cultura ex vivo e/ou “realimentação”) é efetuado em frascos, em uma densidade celular de 200 a 300 X 106 células por frasco. Em algumas modalidades, os frascos são frascos compreendendo uma membrana permeável a gás, tal como o dispositivo de cultura G-Rex (G-Rex 100M ou sistema fechado G-Rex MCS, WolfWilson, St Paul MN).

[0087] O cultivo das células enriquecidas com célula T gama delta pode ser efetuado com ou sem células alimentadoras ou uma camada de célula alimentadora. A cultura ex vivo sem camada alimentadora é altamente vantajosa para as aplicações clínicas de células cultivadas. Deste modo, de acordo com uma modalidade, o cultivo da população de células enriquecidas com a célula T gama delta é efetuada sem a camada alimentadora ou células alimentadoras.

[0088] Em alguns aspectos, são providos os métodos para expandir várias células T gama delta ou populações de célula gama delta, colocando-se em contato as células T gama delta com um agente de ativação. Em alguns casos, o agente de ativação liga a um epítopo específico em uma superfície da célula receptora de uma célula T gama delta, tal como um anticorpo monoclonal. O agente de ativação pode especificamente ativar o crescimento de um ou mais tipos de células T gama delta, tais como as populações celulares delta1, delta2, ou delta3. Em algumas modalidades o agente de

28 / 69 ativação especificamente ativa o crescimento das populações celulares delta1. Em outros casos, o agente de ativação especificamente ativa o crescimento das populações celulares delta2. Um agente de ativação pode estimular a expansão das células T gama delta em uma taxa rápida de crescimento.

[0089] Em algumas modalidades, a população de células T gama delta compreende diferentes porcentagens de células T delta1, delta2, e delta3. Uma população de células T gama delta pode compreender, por exemplo, menos do que 90% de células T delta1, células T delta2, ou células T delta3, menos do que 80% de células T delta1, células T delta2, ou células T delta3, menos do que 70% de células T delta1, células T delta2, ou células T delta3, menos do que 60% de células T delta1, células T delta2, ou células T delta3, menos do que 50% de células T delta1, células T delta2, ou células T delta3, menos do que 40% de células T delta1, células T delta2, ou células T delta3, menos do que 30% de células T delta1, células T delta2, ou células T delta3, menos do que 20% de células T delta1, células T delta2, ou células T delta3, menos do que 10% de células T delta1, células T delta2, ou células T delta3, ou menos do que 5% de células T delta1, células T delta2, ou células T delta3. Alternativamente, uma população de células T gama delta pode compreender mais do que 5% de células T delta1, células T delta2, ou células T delta3, mais do que 10% de células T delta1, células T delta2, ou células T delta3, mais do que 20% de células T delta1, células T delta2, ou células T delta3, mais do que 30% de células T delta1, células T delta2, ou células T delta3, mais do que 40% de células T delta1, células T delta2, ou células T delta3, mais do que 50% de células T delta1, células T delta2, ou células T delta3, mais do que 60% de células T delta1, células T delta2, ou células T delta3, mais do que 70% de células T delta1, células T delta2, ou células T delta3, mais do que 80% de células T delta1, células T delta2, ou células T delta3, ou mais do que 90% de células T delta1, células T delta2, ou células T delta3.

[0090] Em algumas modalidades, a(s) célula(s) T gama delta pode(m)

29 / 69 se expandir rapidamente em resposta ao contato com um ou mais antígenos. Alguma(s) célula(s) T gama delta, tais como a(s) célula(s) T gama delta Vgama9Vdelta2+ se expande(m) rapidamente ex vivo em resposta ao contato com alguns antígenos, como prenil-pirofosfatos, alquil-aminas, e metabólitos ou extratos microbianos durante a cultura tissular. Além disso, alguma(s) célula(s) T gama delta do tipo selvagem, tal(is) como a(s) célula(s) T gama delta Vgama2Vdelta2+ se expande(m) rapidamente in vivo em seres humanos em resposta a certos tipos de vacinação(ões). As células T gama delta estimuladas podem apresentar várias apresentações ao antígeno, coestimulação, e moléculas de adesão que podem facilitar a isolação da(s) célula(s) T gama delta de uma amostra complexa. A(s) célula(s) T gama delta dentro de uma amostra complexa pode(m) ser estimulada(s) in vitro com pelo menos um antígeno por 1 dia, 2 dias, 3 dias, 4 dias, 5 dias, 6 dias, 7 dias, ou um outro período de tempo adequado. O estímulo da célula T gama delta com um antígeno adequado pode expandir ex vivo a população de células T gama delta.

[0091] Os exemplos não limitantes de antígenos que podem ser usados para estimular a expansão da(s) célula(s) T gama delta de uma amostra complexa incluem prenil-pirofosfatos, tais como isopentenil pirofosfato (IPP), alquil-aminas, metabólitos de patógenos microbianos humanos, metabólitos de bactéria comensal, -metil-3-butenil-1-pirofosfato (2M3B1PP), (E)-4- pirofosfato de hidróxi-3-metil-but-2-enila (HMB-PP), pirofosfato de etila (EPP), pirofosfato de farnesila (FPP), fosfato de dimetilalila (DMAP), pirofosfato de dimetilalila (DMAPP), trifosfato de etil-adenosina (EPPPA), pirofosfato de geranila (GPP), pirofosfato de geranilgeranila (GGPP), trifosfato de isopentenil-adenosina (IPPPA), fosfato de monoetila (MEP), pirofosfato de monoetila (MEPP), 3-formil-1-butil-pirofosfato (TUBAg 1), X- pirofosfato (TUBAg 2), trifosfato de 3-formil-1-butil-uridina (TUBAg 3), trifosfato de 3-formil-1-butil-desóxitimidina (TUBAg 4), monoetil

30 / 69 alquilaminas, pirofosfato de alila, pirofosfato de crotoíla, trifosfato de dimetilalil-gama-uridina, trifosfato de crotoil-gama-uridina, trifosfato de alil- gama-uridina, etilamina, isobutilamina, sec-butilamina, iso-amilamina e bisfosfonatos contendo nitrogênio.

[0092] A ativação e/ou expansão das células T gama delta podem ser realizadas usando os agentes de ativação e coestimuladores aqui descritos para acionar a proliferação da célula T gama delta específica e populações de persistência. Em algumas modalidades, a ativação e a expansão das células T gama delta de diferentes culturas podem obter subconjuntos de população policlonal clonais ou mistos distintos. Em algumas modalidades, agentes agonistas diferentes podem ser usados para identificar agentes que provêm sinais de ativação de gama delta específicos. Em um aspecto, os agentes que provêm os sinais de ativação de gama delta específicos podem ser anticorpos monoclonais (MAbs) diferentes direcionados contra os TCRs de gama delta. Em um aspecto, os MAbs podem ligar a diferentes epítopos nas regiões constantes ou variáveis de TCR gama e/ou TCR delta. Em um aspecto, os MAbs podem incluir pan MAbs do TCR de gama delta. Em um aspecto, o pan MAbs do TCR gama delta pode reconhecer os domínios compartilhados por diferentes TCRs gama e delta em ambos, incluindo populações celulares delta1 e delta2. Em um aspecto, os anticorpos podem ser 5A6.E9 (Thermo scientific), B1 (Biolegend), IMMU510 e/ou 11F12 (Beckman Coulter). Em um aspecto, os MAbs podem ser direcionados aos domínios específicos únicos para as regiões variáveis da cadeia gama (7A5 Mab, direcionado como TCR Vgama9 (Thermo Scientific #TCR1720)), ou domínios na região variável Vdelta1 (Mab TS8,2 (Thermo scientific #TCR1730; MAb TC1, MAb R9.12 (Beckman Coulter)), ou cadeia Vdelta2 (MAb 15D (Thermo Scientific #TCR1732)). Em algumas modalidades, os anticorpos contra diferentes domínios do TCR de gama delta (pan anticorpos e anticorpos que reconhecem os epítopos de região variável específicos nas populações do subconjunto)

31 / 69 podem ser combinados. Em algumas modalidades, os ativadores das células T gama delta podem incluir os agentes de ligação o TCR de gama delta tal como MICA, anticorpo agonista para NKG2D, (etiqueta de Fc) proteína de fusão de MICA, ULBP1, ULBP3 (R&D systems Minneapolis, Minn.) ULBP2, ou ULBP6 (Sino Biological Beijing, China). Em algumas modalidades, os agentes coestimuladores de companhia para auxiliar no acionamento da proliferação da célula T gama delta específica sem a indução da anergia celular e apoptose podem ser em combinação, tal como, mas não limitado aos ligantes aos receptores expressos nas células gama delta, tais como NKG2D, CD161, CD70, JAML, molécula acessório DNAX-1 (DNAM-1) ICOS, CD27, CD137, CD30, HVEM, SLAM, CD122, DAP, e CD28- ou anticorpos específicos aos epítopos únicos nas moléculas CD2 e CD3.

[0093] Os exemplos não limitantes de reagentes que podem ser usados para facilitar a expansão de uma população de células T gama delta ex vivo inclui os anticorpos anti-CD3 ou anti-CD2, anti-CD27, anti-CD30, anti- CD70, anti-OX40, IL-2, IL-15, IL-12, IL-9, IL-33, IL-18, ou IL-21, CD70 (ligante CD27), fito-hemaglutinina (PHA), concavalina A (ConA), erva daninha (PWM), aglutinina de amendoim protéica (PNA), aglutinina de soja (SBA), Aglutinina Les Culinaris (LCA), Aglutinina Pisum Sativum (PSA), Aglutinina Helix pomatia (HPA), Lectina Vicia graminaa (VGA), ou um outro mitógeno adequado capaz de estimular a proliferação da célula T.

[0094] Em alguns aspectos, a presente descrição provê métodos para o cultivo das células T gama delta que foram isoladas de um sujeito. Uma célula T gama delta pode ser isolada de uma amostra complexa de um sujeito. Uma amostra complexa pode ser uma amostra de sangue periférico, uma amostra sanguínea do cordão, um tumor, um precursor de célula tronco, uma biópsia tumoral, um tecido, uma linfa, ou de sítios epiteliais de um sujeito diretamente contendo o meio externo, ou derivada das células tronco precursoras. Nas modalidades particulares, a amostra é derivada de um órgão

32 / 69 selecionado a partir do grupo que consiste em um músculo, pele, osso, órgão linfático, pâncreas, fígado, vesícula biliar, rim, órgão do trato digestivo, órgão do trato respiratório, órgão reprodutivo, órgão do trato urinário, um órgão associado ao sangue, um timo, um baço e um órgão do sistema nervoso. Nas modalidades específicas, as células gama delta ou população de células gama delta são derivadas de uma fonte selecionada a partir do grupo que consiste em células hematopoiéticas, células do cordão umbilical, células de sangue periférico (mobilizadas ou não mobilizadas) e células da medula óssea. Ainda em modalidades adicionais, as células ou populações gama delta são isoladas das amostras de medula óssea ou sangue periférico, sangue do cordão umbilical neonatal, ou de uma fração celular mononuclear.

[0095] Uma célula T gama delta pode ser diretamente isolada de uma amostra complexa de um sujeito, por exemplo, classificando a(s) célula(s) T gama delta que expressam um ou mais marcadores da superfície celular com técnicas de citometria de fluxo. As células T gama delta do tipo selvagem apresentam vários reconhecimentos do antígeno, apresentações do antígeno, coestimulação, e moléculas de adesão as quais podem ser associadas com a(s) célula(s) T gama delta. Um ou mais marcadores da superfície celular tais como os TCRs de gama delta específicos, reconhecimento do antígeno, apresentação do antígeno, ligantes, moléculas de adesão, ou moléculas coestimuladoras podem usados para isolar uma célula T gama delta do tipo selvagem de uma amostra complexa. Várias moléculas associadas com, ou expressas por uma célula T gama delta podem ser usadas para isolar uma célula T gama delta de uma amostra complexa. Em algumas modalidades, a presente descrição provê métodos para a isolação da população misturada de células Vdelta1+, Vdelta2+, Vdelta3+ ou qualquer combinação destas.

[0096] As células mononucleares de sangue periférico podem ser coletadas de um sujeito, por exemplo, com uma máquina de aférese, incluindo o sistema Ficoll-Paque® PLUS (GE Healthcare), ou um outro dispositivo/

33 / 69 sistema adequado. A(s) célula(s) T gama delta, ou uma subpopulação desejada da(s) célula(s) T gama delta, pode(m) ser purificada(s) da amostra coletada com, por exemplo, técnicas de citometria de fluxo. As células sanguíneas do cordão também podem ser obtidas do sangue do cordão durante o nascimento de um sujeito. Nas modalidades particulares, a célula T gama delta ou população de células T gama delta é de uma amostra de aférese, ou derivada de uma amostra de aférese.

[0097] A seleção positiva ou negativa de marcadores da superfície celular expressas na(s) célula(s) T gama delta coletada(s) pode ser usada para isolar diretamente uma célula T gama delta, ou uma população da(s) célula(s) T gama delta expressando marcadores da superfície celular similares de uma amostra de sangue periférico, uma amostra sanguínea do cordão, um tumor, uma biópsia tumoral, um tecido, uma linfa, ou de uma amostra epitelial de um sujeito. Por exemplo, uma célula T gama delta pode ser isolada de uma amostra complexa com base na expressão positiva ou negativa de CD2, CD3, CD4, CD8, CD24, CD25, CD44, Kit, TCRalfa, TCRbeta, TCRdelta, NKG2D, CD70, CD27, CD30, CD16, CD337 (NKp30), CD336 (NKp46), OX40, CD46, CCR7, e outros marcadores da superfície celular adequados. Nas modalidades particulares, a população de células selecionada é uma população de células de linfócito enriquecida por células T gama delta através da depleção da célula T TCRalfabeta (seleção negativa). Será reconhecido que tal população de células enriquecida com a célula T gama delta pode incluir frações significantes de outros tipos celulares, tais como as células NK.

[0098] Ainda em outras modalidades, a população de células selecionada é uma população de células de linfócito enriquecida por células T gama delta pela seleção de célula T TCRgama delta positiva. Será reconhecido que as células T não gama delta serão escassas em tal população de células enriquecida por célula T gama delta. Em algumas modalidades, a

34 / 69 população de células enriquecida por célula T gama delta positiva selecionada é desprovida de células NK.

[0099] Uma célula T gama delta pode ser isolada de uma amostra complexa que é cultivada ex vivo. Nas modalidades específicas, as populações de célula gama delta enriquecidas podem ser geradas antes da sua ativação e expansão específica. Em algumas modalidades, as populações celulares adicionais tais como monócitos, células T, células B, e células NK são incluídas na população de células T gama delta enriquecida, e em alguns casos podem ser ativadas e expandidas junto com as células T gama delta. Em alguns aspectos, a ativação e expansão das células T gama delta são realizadas sem a presença de APCs nativas ou engenheiradas. Em alguns aspectos, a isolação e expansão das células T gama delta de amostras de tumor podem ser realizadas usando mitógenos da célula T gama delta imobilizados, incluindo anticorpos específicos ao TCR gama delta, e outros agentes que ativam o TCR gama delta, incluindo as lectinas.

[00100] Em algumas modalidades, as células enriquecidas com célula T gama delta são coletadas da cultura 14 a 16 dias após o início da cultura celular enriquecida com célula T gama delta. A coleta das células pode ser realizada manualmente, liberando-se as células ligadas (por exemplo “raspando” as superfícies do recipiente de cultura) ou por um dispositivo de coleta celular, que é projetado para lavar as células de maneira eficaz para fora dos recipientes de cultura e coletar as células automaticamente. Nas modalidades específicas, a fração celular expandida é coletada dos recipientes de cultura através de um dispositivo de coleta celular (por exemplo o dispositivo de coleta da G-Rex MCS, WolfWilson, St Paul MN).

[00101] Em algumas modalidades, a coleta das células expandidas enriquecidas com a célula T gama delta da cultura remove a maioria, ou quase todas as células do recipiente de cultura. Em outras modalidades, a coleta pode ser realizada em duas ou mais etapas, permitindo que as células não

35 / 69 coletadas permaneçam em cultura até coletadas em um tempo posterior. A coleta das duas porções pode ser realizada com um intervalo de horas, dias ou mais entre a coleta da primeira e da segunda porção.

[00102] De modo a preparar as células enriquecidas expandidas com célula T gama delta para transplante, as células coletadas precisam ser lavadas do meio de cultura, os parâmetros críticos avaliados e o volume ajustado até uma concentração adequada para a infusão durante um período de tempo clinicamente razoável.

[00103] Após a coleta, a população de células enriquecida com a célula T gama delta expandida pode ser lavada sem o meio de cultura, manualmente ou, preferivelmente, para aplicações clínicas, usando um dispositivo automatizado utilizando um sistema fechado. As células lavadas podem ser reconstituídas com uma solução de infusão (por exemplo, uma solução de infusão exemplificativa compreende 8% p/v de HSA e 6,8% p/v de Dextran- 40). Em algumas modalidades, a reconstituição é realizada em um sistema fechado. Em algumas modalidades, a solução de infusão é triada quanto a adequabilidade para o uso com os métodos e composições da presente invenção. Os critérios exemplificativos para a seleção de solução de infusão adequada incluem os testes de segurança que indicam a ausência de bactérias, leveduras ou crescimento de bolor, o teor de endotoxina de menos do que 0,5 Eu/ml e uma aparência clara, isenta de partículas externas.

[00104] Os métodos descritos acima para o cultivo ex vivo das células T gama delta e populações enriquecidas com a célula T gama delta podem resultar, entre outras coisas, em uma população de células T gama delta cultivadas e células enriquecidas com célula T gama delta.

[00105] Deste modo, adicionalmente de acordo com um aspecto da presente invenção é provida uma população de células T gama delta distinguida por pelo menos um de expressão elevada de CD62L, resposta à migração elevada, retorno e retenção in vivo elevados e atividade citotóxica

36 / 69 aumentada se comparado a uma população de células T gama delta e/ou células enriquecidas com célula T gama delta cultivada sob condições de cultura de outro modo idêntica com menos do que 0,1 mM da nicotinamida e/ou outra porção de nicotinamida. Em algumas modalidades, a população de células T gama delta e/ou células enriquecidas com célula T gama delta é distinguida por pelo menos qualquer duas, pelo menos qualquer três, pelo menos qualquer quatro ou qualquer cinco da expressão elevada de CD62L, resposta à migração elevada, retorno e/ou retenção in vivo elevados, e atividade citotóxica aumentada, se comparado a uma população de células enriquecidas com a célula T gama delta cultivada sob condições de cultura de outro modo idêntica com menos do que 0,1 mM da nicotinamida e/ou outra porção de nicotinamida.

[00106] No Exemplo 1, os inventores mostraram que as populações de célula gama delta preparadas de acordo com os métodos da invenção aumentaram a expressão do marcador de superfície celular CD62L (L- selectina), importante para adesão e “rolamento” celular. No Exemplo 2 os inventores mostraram que as populações enriquecidas com a célula T gama delta preparadas de acordo com os métodos da invenção aumentaram o potencial funcional in vivo, como demonstrado pelo retorno e retenção in vivo nos órgãos alvo (por exemplo, baço e medula óssea). Deste modo, em um aspecto particular de algumas modalidades da presente invenção é provida uma população de células enriquecidas com célula T gama delta distinguida por pelo menos um de expressão de CD62L melhorada e retorno e/ou retenção in vivo melhorada quando transplantada.

[00107] Em algumas modalidades, as células T gama delta podem ser geneticamente modificadas. A modificação genética da(s) célula(s) T gama delta podem compreendem integrar estavelmente um construto que expressa uma porção de reconhecimento de tumor, tal como um TCR alfabeta, um TCR gama delta, um CAR que codifica um anticorpo, um fragmento de

37 / 69 ligação ao antígeno deste, ou um domínio de ligação ao linfócito no genoma da(s) célula(s) T gama delta isolada(s), uma citocina (por exemplo IL-15, IL- 12, IL-2, IL-7, IL-21, IL-18, IL-19, IL-33, IL-4, IL-9, IL-23, IL1beta) para melhorar a proliferação, sobrevivência, e função ex vivo e in vivo da célula T. A modificação genética da célula T gama delta isolada também pode compreender excluir ou romper a expressão genética de um ou mais genes endógenos no genoma da célula T gama delta isolada, tal como o local de MHC (locais).

[00108] Terapia de gene: para uma terapia de gene de longo prazo de sucesso, uma alta frequência de células geneticamente modificadas com transgenes estavelmente integrados dentro do seu genoma, é um requerimento obrigatório. Os vetores com base viral (por exemplo, retroviral) requerem a divisão celular ativa para a integração do transgene no genoma hospedeiro. Portanto, a transferência genética em algumas populações celulares frescas, sendo não estimulada, é altamente ineficaz. A capacidade de armazenar e processar uma população selecionada de células T gama delta ex vivo, e melhorar seu potencial de retorno e retenção proveria uma probabilidade aumentada do uso de sucesso do transplante de célula geneticamente modificada.

[00109] Imunoterapia adotiva: as subpopulações linfoides expandidas Ex vivo definidas foram estudadas e usadas para a imunoterapia adotiva de várias malignidades, imunodeficiências, doenças virais e genéticas [Freedman Nature Medicine 2: 46, (1996); Heslop Nature Medicine 2: 551, (1996); Protti Cancer Res 56: 1210, (1996)].

[00110] O tratamento melhora a resposta imune requerida ou substitui as funções deficientes. Este método foi clinicamente verificado por Rosenberg et al. [Rosenberg J Natl Cancer Inst. 85: 622, 1993] usando um grande número de células T exterminadoras autólogas também halogênicas expandidas ex vivo não específicas, e subsequentemente linfócitos de

38 / 69 infiltração tumoral expandidos ex vivo específicos.

[00111] Como aqui detalhado, as células T gama delta são altamente desejáveis para as aplicações terapêuticas. Deste modo, em um aspecto de uma modalidade da invenção é provida uma composição celular terapêutica compreendendo uma população de células T gama delta expandida selecionada, a população de células ex vivo cultivadas com condições para a expansão da célula T gama delta e a quantidade de nicotinamida na faixa de 0,5 a 50 mM, em que a população de células T gama delta expandida selecionada é distinguida por pelo menos um de potencial de retorno e/ou retenção da célula T gama delta melhorado e expressão melhorada do marcador de superfície celular CD62L (L-selectina), se comparado a uma população de células T gama delta similar expandida selecionada com condições idênticas e não mais do que 0,1 mM de nicotinamida. Nas modalidades particulares, a composição celular terapêutica compreende as células T gama delta cultivadas de acordo com os métodos da invenção.

[00112] Em algumas modalidades, a composição celular terapêutica é uma composição farmacêutica compreendendo uma população enriquecida por célula T gama delta, e um carregador farmaceuticamente aceitável. Como é d em detalhes acima, as culturas ex vivo de células enriquecidas com célula T gama delta podem ser vantajosamente utilizadas no transplante ou implantação de célula T gama delta. Consequentemente, de acordo com um outro aspecto da presente invenção é provido um método para transplante ou implantação das células T gama delta ou células enriquecidas com célula T gama delta ou população em um recipiente. O método para acordo com este aspecto da presente invenção é efetuado através da (a) expansão ex vivo de uma população selecionada de célula T gama delta cultivando-se as ditas condições de população de células para a expansão da célula T gama delta e nicotinamida de acordo com os métodos da presente invenção, em que a dita população de células T gama delta expandida selecionada tem potencial de

39 / 69 retorno e/ou retenção da célula T gama delta melhorado, se comparado a uma população de células T gama delta similar expandida selecionada sem 0,5 a 50 nM de nicotinamida, e (b) infusão das células T gama delta expandidas em um sujeito em necessidade desta.

[00113] A presente invenção também considera as composições farmacêuticas compreendendo as células T gama delta expandidas ou população(ões) ou preparadas de acordo com os métodos da invenção, e um carregador farmaceuticamente aceitável. As células T gama delta expandidas ou população(ões) preparadas de acordo com os métodos da invenção, e as composições farmacêuticas contendo uma população de células T gama delta expandida aqui descrita podem ser administradas para os tratamentos profiláticos e/ou terapêuticos. Nas aplicações terapêuticas, as composições podem ser administradas a um sujeito já sofrendo de uma doença ou condição em uma quantidade suficiente para curar ou pelo menos deter parcialmente os sintomas da doença ou condição. Uma célula T gama delta ou população também podem ser administradas para diminuir uma probabilidade de desenvolver, contrair, ou piorar uma condição. As quantidades eficazes de uma população de células T gama delta expandidas, ou composições compreendendo as células T gama delta expandida de acordo com os métodos da presente invenção para o uso terapêutico podem variar com base na gravidade e decorrer da doença ou condição, terapia prévia, o estado de saúde do sujeito, peso, e/ou resposta aos fármacos, e/ou o julgamento do médico do tratamento.

[00114] Uma população de células T gama delta expandida ou composição compreendendo tal da descrição pode ser usada para tratar um sujeito em necessidade de tratamento para uma condição. Os exemplos de condições incluem câncer, doença infecciosa, distúrbio autoimune e septicemia. Os sujeitos podem ser humanos, primatas não humanos tais como chimpanzés, e outras espécies de bugios e macacos; animais de fazenda tais

40 / 69 como gado, cavalos, ovelhas, cabras e suínos; animais domésticos tais como coelhos, cães, e gatos; animais de laboratório incluindo roedores, tais como ratos, camundongos e porquinhos-da-índia, e os semelhantes. Nas modalidades específicas, o sujeito sendo tratado é um sujeito humano. O sujeito pode ser de qualquer idade. Os sujeitos podem ser, por exemplo, adultos idosos, adultos, adolescentes, pré-adolescentes, crianças, crianças pequenas e bebês.

[00115] Um método para tratar uma condição (por exemplo, doença) em um sujeito com uma população de células T gama delta expandida, ou composição compreendendo uma população de células T gama delta expandida de acordo com os métodos da presente invenção pode compreender administrar ao sujeito uma quantidade terapeuticamente eficaz da(s) célula(s) T gama delta expandida(s) ou de uma população de células T gama delta expandida da invenção. Uma célula T gama delta da descrição pode ser administrada em vários regimes (por exemplo, tempo, concentração, dosagem, espaçamento entre o tratamento e/ou formulação). Um sujeito recebendo ou a receber a administração da(s) tal(is) célula(s) T gama delta ou população de células T gama delta também pode ser pré-condicionado com, por exemplo, quimioterapia, radiação, ou uma combinação de ambas, antes de receber uma célula T gama delta ou população de células T gama delta da descrição. Como parte de um tratamento, uma célula T gama delta ou população de células T gama delta pode ser administrada a um sujeito em um primeiro regime e o sujeito pode ser monitorado para determinar se o tratamento no primeiro regime satisfaz um dado nível de eficácia terapêutica. Em alguns casos, a célula T gama delta ou população de células T gama delta, ou uma outra célula T gama delta ou população de células T gama delta podem ser administradas ao sujeito em um segundo regime. Em um método exemplificativo para tratar um sujeito, pelo menos uma célula T gama delta ou população de células T gama delta são administradas a um sujeito que tem

41 / 69 ou é suspeito de ter uma dada condição (por exemplo, câncer), opcionalmente administradas em um primeiro regime. Subsequentemente, o sujeito pode ser monitorado, por exemplo, por um prestador de cuidados com a saúde (por exemplo, médico assistente ou enfermeiro), por exemplo, para determinar ou medir uma eficácia da(s) célula(s) T gama delta expandidas ou população de células T gama delta no tratamento da condição do sujeito, ou também para determinar a expansão, retorno e/ou retenção in vivo de uma população de células T gama delta no sujeito. Em algumas modalidades, pelo menos uma outra célula T gama delta ou população de células T gama delta é administrada ao sujeito em um segundo regime, que pode ser o mesmo que o primeiro regime ou diferente do que o primeiro regime. Em algumas situações, a administração da célula T gama delta ou população de células T gama delta foi verificada ser eficaz (por exemplo, uma rodada única de administração pode ser suficiente para tratar a condição) e é suficiente. Devido às suas características doadoras alogênicas e universais, uma população de células T gama delta expandidas pode ser administrada a vários sujeitos, com diferentes haplótipos de MHC. Uma célula T gama delta ou população de células T gama delta podem ser congeladas ou crio preservadas antes de serem administradas a um sujeito.

[00116] Em algumas modalidades, o sujeito recebendo ou a receber a administração de tal(is) célula(s) T gama delta ou população de células T gama delta também pode ser tratado com uma outra terapia do câncer, tal como quimioterapia, radiação, ou com uma combinação de ambas, concomitante com a recepção de uma célula T gama delta ou população de células T gama delta da descrição. Em outras modalidades, a administração de tal(is) célula(s) T gama delta ou população de células T gama delta pode ser provida antes de uma outra terapia do câncer, tal como quimioterapia, radiação, cirurgia ou uma combinação destas.

[00117] Uma população de células T gama delta expandidas pode

42 / 69 compreender duas ou mais células que expressam uma combinação idêntica, diferente ou uma combinação de porções de reconhecimento de tumor idênticas e diferentes.

[00118] Em uma modalidade, a população de células enriquecida por célula T gama delta expandida é administrada em uma quantidade eficaz para reduzir ou eliminar um câncer, tal como um tumor sólido, câncer metastático ou uma malignidade, ou prevenir sua ocorrência ou recorrência. “Uma quantidade eficaz para reduzir ou eliminar o tumor sólido ou para prevenir sua ocorrência ou recorrência” ou “uma quantidade eficaz para reduzir ou eliminar o distúrbio hiper proliferativo ou para prevenir sua ocorrência ou recorrência” se refere a uma quantidade de uma composição terapêutica que melhora os resultados de um paciente ou a sobrevivência após o tratamento para o estado de doença tumoral ou distúrbio hiper proliferativo como medido pelos dados de teste do paciente, dados de sobrevivência, elevação ou inibição dos níveis de marcador tumoral, suscetibilidade reduzida com base no perfil genético ou exposição aos fatores ambientais. “Inibir o crescimento tumoral” se refere à redução do tamanho ou viabilidade ou número das células de um tumor. O “câncer”, “malignidade”, “tumor sólido” ou “distúrbio hiper proliferativo” são usados como termos sinônimos e se referem a qualquer uma de várias doenças que são distinguidas pela proliferação anormal incontrolada de células, capacidade das células afetadas de se espalhar localmente ou através da corrente sanguínea e sistema linfático para outras partes do corpo (isto é, sofrer metástase) além de qualquer uma de várias características estruturais e/ou aspectos moleculares. Uma “cancerosa”, “célula maligna” ou “célula de tumor sólido” é entendida como uma célula tendo propriedades estruturais específicas, sem a diferenciação e sendo capaz de invasão e metástase. O “câncer” se refere a todos os tipos de câncer, neoplasmas ou tumores malignos verificados em mamíferos, incluindo carcinomas e sarcomas. Os exemplos são os cânceres de mama, pulmão, pulmão de célula

43 / 69 não pequena, estômago, cérebro, cabeça e pescoço, meduloblastoma, osso, fígado, cólon, geniturinário, bexiga, urinário, rim, testículos, útero, ovário, colo do útero, próstata, melanoma, mesotelioma, sarcoma, (ver, DeVita, et al., (eds.), 2001, Cancer Principles and Practice of Oncology, 6a. Ed., Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, Pa.; esta referência é aqui incorporada por referência na sua totalidade para todos os propósitos).

[00119] “Associado ao câncer” se refere à relação de um ácido nucléico e sua expressão, ou falta desta, ou uma proteína e seu nível ou atividade, ou falta deste, ao início de uma malignidade em uma célula do paciente. Por exemplo, o câncer pode estar associado com a expressão de um gene particular que não expresso, ou é expresso em um nível mais baixo, em uma célula normal saudável. Por outro lado, um gene associado ao câncer pode ser aquele que não é expresso em uma célula maligna (ou em uma célula que está sendo submetida a uma transformação), ou é expresso em um nível mais baixo na célula maligna do que é expresso em uma célula saudável normal.

[00120] “Doença hiper proliferativa” se refere a qualquer doença ou distúrbio em que as células se proliferam mais rapidamente do que o normal tecido cresce. Deste modo, uma célula que está hiper proliferando é uma célula que está proliferando mais rapidamente do que as células normais.

[00121] O “câncer avançado” significa que o câncer não está mais localizado no sítio tumoral primário, ou um câncer que está no Estágio III ou IV de acordo com o American Joint Committee on Cancer (AJCC).

[00122] “Bem tolerado” se refere à ausência de mudanças adversas no estado de saúde que ocorre como um resultado do tratamento e afetaria as decisões no tratamento.

[00123] “Metastático” se refere às células tumorais, por exemplo, tumor sólido humano ou malignidade geniturinária, que são capazes de estabelecer lesões tumorais secundárias nos pulmões, fígado, osso ou cérebro

44 / 69 de camundongos imunodeficientes na injeção na almofada de gordura mamária e/ou na circulação do camundongo imunodeficiente.

[00124] Um “tumor sólido” inclui, mas não é limitado a, sarcoma, melanoma, carcinoma, ou outros cânceres de tumor sólido. “Sarcoma” se refere a um tumor que é feito de uma substância como o tecido conectivo embrionário e é geralmente composto de células compactadas embebidas em uma substância fibrilar ou homogênea. Os sarcomas incluem, mas não são limitados a, condrossarcoma, fibrossarcoma, linfossarcoma, melanossarcoma, mixossarcoma, osteossarcoma, sarcoma de Abemethy, sarcoma adiposo, lipossarcoma, sarcoma da parte alveolar macia, sarcoma ameloblástico, sarcoma botrióide, sarcoma de cloroma, corio carcinoma, sarcoma embrionário, sarcoma de tumor de Wilms, sarcoma do endométrio, sarcoma estrômico, sarcoma de Ewing, sarcoma facial, sarcoma fibroblástico, sarcoma da célula gigante, sarcoma granulocítico, sarcoma de Hodgkin, sarcoma hemorrágico pigmentado múltiplo idiopático, sarcoma imunoblástico das células B, linfoma, sarcoma imunoblástico das células T, sarcoma de Jensen, sarcoma de Kaposi, sarcoma da célula de Kupffer, angiossarcoma, leucossarcoma, sarcoma mesenquimoma maligno, sarcoma parosteal, sarcoma reticulocítico, sarcoma de Rous, sarcoma serocístico, sarcoma sinovial, e sarcoma telangiectásico.

[00125] “Melanoma” se refere a um tumor que surge do sistema melanocítico da pele e outros órgãos. Os melanomas incluem, por exemplo, o melanoma lentiginoso de acral, melanoma amelanótico, melanoma juvenil benigno, melanoma de Cloudman, melanoma S91, melanoma de Harding- Passey, melanoma juvenil, melanoma lentigo maligno, melanoma maligno, melanoma nodular, melanoma subungueal, e melanoma de disseminação superficial.

[00126] “Carcinoma” se refere a um novo crescimento maligno formado de células epiteliais que tendem a infiltrar os tecidos adjacentes e dão

45 / 69 origem às metástases.

Os carcinomas exemplificativos incluem, por exemplo, carcinoma acinar, carcinoma acinoso, carcinoma adenocístico, carcinoma adenóide cístico, carcinoma adenomatoso, carcinoma do córtex adrenal, carcinoma alveolar, carcinoma da célula alveolar, carcinoma da célula basal, carcinoma basocelular, carcinoma basalóide, carcinoma da célula basoescamosa, carcinoma bronquioalveolar, carcinoma bronquiolar, carcinoma broncogênico, carcinoma cerebriforme, carcinoma colangiocelular, carcinoma coriônico, carcinoma coloidal, comedocarcinoma, carcinoma do corpo, carcinoma cribriforme, carcinoma em couraça, carcinoma cutâneo, carcinoma cilíndrico, carcinoma da célula cilíndrica, carcinoma de duto, carcinoma duro, carcinoma embrionário, carcinoma encefalóide, carcinoma epiermóide, adenóides epiteliais de carcinoma, carcinoma exofítico, carcinoma ex ulcere, carcinoma fibroso, carcinoma gelatiniforme, carcinoma gelatinoso, carcinoma de célula gigante, carcinoma de célula gigante, carcinoma glandular, carcinoma da célula granulosa, carcinoma da matriz capilar, carcinoma hematóide, carcinoma hepatocelular, carcinoma da célula de Hurthle, carcinoma hialino, carcinoma hipemefróide, carcinoma embrionário infantil, carcinoma in situ, carcinoma intraepidérmico, carcinoma intraepitelial, carcinoma de Krompecher, carcinoma da célula de Kulchitzky, carcinoma da célula grande, carcinoma lenticular, carcinoma lenticular, carcinoma lipomatoso, carcinoma linfoepitelial, carcinoma da medula, carcinoma medular, carcinoma melanótico, carcinoma mole, carcinoma mucinoso, carcinoma mucíparo, carcinoma mucocelular, carcinoma mucoepidernóide, carcinoma mucósico, carcinoma da mucosa, carcinoma mixomatóides, carcinoma nasofaríngeo, carcinoma de células de aveia, carcinoma ossificante, carcinoma osteóide, carcinoma papilar, carcinoma periportal, carcinoma pré-invasivo, carcinoma da célula da espinha, carcinoma pultáceo, carcinoma da célula renal do rim, carcinoma da célula reserva, carcinoma sarcomatóide, carcinoma de schneideriano, carcinoma

46 / 69 cirrótico, carcinoma do escroto, carcinoma de célula de anel de sinete, carcinoma simples, carcinoma da célula pequena, carcinoma solanóide, carcinoma da célula esferoidal, carcinoma das células fusiformes, carcinoma esponjoso, carcinoma escamoso, carcinoma da célula escamosa, carcinoma de corda, carcinoma telangiectático, telangiectodos de carcinoma, carcinoma da célula transitória, carcinoma tuberoso, carcinoma verrugoso, e carcinoma viloso.

[00127] “Leucemia” se refere às doenças malignas progressivas dos órgãos formadores de sangue e é geralmente distinguida por uma proliferação distorcida e o desenvolvimento de leucócitos e seus precursores no sangue e medula óssea. A leucemia é, em geral, clinicamente classificada com base (1) na duração e caráter da doença--aguda ou crônica; (2) no tipo de célula envolvida; mielóide (mielógena), linfóide (linfógena), ou monocítica; e (3) no aumento ou não aumento no número de células anormais no sangue-- leucêmica ou aleucêmica (subleucêmica). A leucemia inclui, por exemplo, leucemia não linfocítica aguda, leucemia linfocítica crônica, leucemia granulocítica aguda, leucemia granulocítica crônica, leucemia promielocítica aguda, leucemia da célula T adulta, leucemia aleucêmica, uma leucemia leucocitêmica, leucemia basofílica, leucemia da célula explosiva, leucemia bovina, leucemia mielocítica crônica, leucemia cutânea, leucemia embrionária, leucemia eosinofílica, leucemia de Gross, leucemia da célula capilar, leucemia hemoblástica, leucemia hemocitoblástica, leucemia histiocítica, leucemia da célula tronco, leucemia monocítica aguda, leucemia leucopênica, leucemia linfática, leucemia linfoblástica, leucemia linfocítica, leucemia linfogenosa, leucemia linfóide, leucemia da célula de linfossarcoma, leucemia de mastócito, leucemia megacariocítica, micromieloblástica leucemia, leucemia monocítica, leucemia mieloblástica, leucemia mielocítica, leucemia mielóide granulocítica, leucemia mielomonocítica, leucemia de Naegeli, leucemia da célula plasmática, leucemia plasmocítica, leucemia

47 / 69 promielocítica, leucemia da célula de Rieder, leucemia de Schilling, leucemia da célula tronco, leucemia subleucêmica, e leucemia da célula não diferenciada. Os cânceres adicionais que podem ser tratados ou prevenidos com os métodos, composições ou populações celulares enriquecidas com a célula T gama delta da presente invenção incluem, por exemplo, Doença de Hodgkin, Linfoma Não Hodgkin, mieloma múltiplo, neuroblastoma, câncer de mama, câncer do ovário, câncer de pulmão, rabdomiossarcoma, trombocitose primária, macroglobulinhagemia primária, tumores pulmonares da célula pequena, tumores primários no cérebro, câncer de estômago, câncer do cólon, insulanoma pancreático maligno, carcinóide maligno, câncer da bexiga urinária, lesões pré-malignas na pele, câncer testicular, linfomas, câncer da tireóide, neuroblastoma, câncer esofágico, câncer do trato genitourinário, hipercalcemia maligna, câncer cervical, câncer do endométrio, câncer de adrenal no córtex, e câncer de próstata.

[00128] Em uma outra modalidade particular deste aspecto da presente invenção, o método é afetado concomitantemente com, após ou antes do transplante hematopoiético, progenitor hematopoiético ou transplante de célula tronco hematopoiética no dito sujeito.

[00129] Nas modalidades específicas, as células T gama delta expandidas da invenção são transplantadas (por exemplo, infundidas) em um sujeito antes de, concomitantemente com ou após o tratamento com células tronco hematopoiéticas ex vivo expandidas.

[00130] Em algumas modalidades particulares, o sujeito em necessidade destas é um recipiente passado presente ou futuro das células tronco hematopoiéticas expandidas cultivando-se com mais do que 1,0 mM de nicotinamida. Os protocolos para a preparação e tratamento dos pacientes com uma tal população de células tronco hematopoiéticas expandidas com concentrações milimolares de nicotinamida (por exemplo, NiCord®, Gamida- Cell, Jerusalém, Israel) são descritos em detalhes nos Pedidos de Patente

48 / 69 Internacionais Nos: WO2018211487 e WO2018211509, e nas Patentes US Nos: 7.955.852, 8.187.876 e 8.846.393. Nas modalidades específicas, o sujeito em necessidade destas é um paciente seguindo o tratamento com NiCord®. Ainda em outra modalidade específica, o sujeito em necessidade deste é um paciente prestes a ser tratado com NiCord®, ou atualmente sendo tratado com NiCord®. Ainda em outra modalidade, o sujeito em necessidade destas está em remissão de um câncer após o tratamento com NiCord®.

[00131] Ainda nas modalidades adicionais, o sujeito está sendo concomitantemente tratado com um agente de sensibilização ou potencialização (por exemplo, inibidor de proteassoma, IL-2, IL-15, etc) adicionalmente melhorando a função in vivo das células transfundidas enriquecidas com a célula T gama delta.

[00132] Os números diminuídos e a funcionalidade das células T gama delta em pacientes autoimunes foram observados, indicando a possibilidade da terapia de célula T gama delta em uma variedade de doenças e condições autoimunes. Deste modo, ainda em uma outra modalidade da presente invenção, é provido um método para tratar uma doença ou condição autoimune em um sujeito em necessidade deste. O método para acordo com este aspecto da presente invenção é efetuado administrando-se uma quantidade terapêutica de uma população de células T gama delta da invenção ao dito sujeito.

[00133] As doenças autoimunes que podem ser tratadas pelo método e/ou composições da invenção incluem, mas não são limitadas às doenças cardiovasculares, doenças reumatóides, doenças glandulares, doenças gastrointestinais, doenças cutâneas, doenças hepáticas, doenças neurológicas, doenças musculares, doenças nefríticas, doenças relacionadas à reprodução, doenças no tecido conectivo e doenças sistêmicas.

[00134] Os exemplos de doenças cardiovasculares autoimunes incluem, mas não são limitados à aterosclerose, infartação miocárdica,

49 / 69 trombose, granulomatose de Wegener, arterite de Takayasu, síndrome de Kawasaki, doença autoimune antifator VIII, vasculite de vaso pequeno necrosante, poliangiíte microscópica, síndrome de Churg e Strauss, glomerulonefrite pauci-imune focal necrosante e crescêntica, síndrome antifosfolipídica, insuficiência cardíaca induzida por anticorpo, púrpura trombocitopênica, anemia hemolítica autoimune, autoimunidade cardíaca na doença de Chagas e autoimunidade antilinfócito T auxiliar.

[00135] Os exemplos de doenças reumatóides autoimunes incluem, mas não são limitadas à artrite reumatóide e espondilite anquilosante.

[00136] Os exemplos de doenças autoimunes glandulares incluem, mas não são limitadas a, doença pancreática, diabete Tipo I, doença da tireóide, doença de Graves, tireoidite, tireoidite autoimune espontânea, tireoidite de Hashimoto, mixedema idiopática, autoimunidade ovariana, infertilidade antiesperma autoimune, prostatite autoimune e síndrome poliglandular autoimune Tipo I. As doenças incluem, mas não são limitadas às doenças autoimunes do pâncreas, diabete Tipo 1, doenças da tireóide autoimune, doença de Graves, tireoidite autoimune espontânea, tireoidite de Hashimoto, mixedema idiopático, autoimunidade ovariana, infertilidade antiesperma autoimune, prostatite autoimune e síndrome poliglandular autoimune Tipo I.

[00137] Os exemplos de doenças gastrointestinais autoimune incluem, mas não são limitadas a, doenças intestinais inflamatórias crônicas, doença celíaca, colite, ileíte e doença de Crohn.

[00138] Os exemplos de doenças cutâneas autoimunes incluem, mas não são limitadas a, doenças de pele bolhosa autoimunes, tais como, mas não são limitadas a, pênfigo vulgar, penfigóide bolhoso e pênfigo foliáceo.

[00139] Os exemplos de doenças hepáticas autoimunes incluem, mas não são limitadas a, hepatite, hepatite ativa crônica autoimune, cirrose biliar primária e hepatite autoimune.

[00140] Os exemplos de doenças neurológicas autoimunes incluem,

50 / 69 mas não são limitadas a, esclerose múltipla, doença de Alzheimer, miastenia grave, neuropatias, neuropatias motoras; síndrome de Guillain-Barre e neuropatias autoimunes, miastenia, síndrome miastênica de Lambert-Eaton; doenças neurológicas paraneoplásticas, atrofia cerebelar, atrofia cerebelar paraneoplástica e síndrome do homem duro; síndrome do homem duro não paraneoplástica, atrofias cerebelares progressivas, encefalite, encefalite de Rasmussen, esclerose lateral amiotrófica, coreia de Sydeham, síndrome de Gilles de la Tourette e poliendocrinopatias autoimunes; neuropatias disimune; neuromiotonia adquirida, artrogripose múltipla congênita, neurite, neurite óptica e doenças neurodegenerativas.

[00141] Os exemplos de doenças musculares autoimunes incluem, mas não são limitadas a, miosite, miosite autoimune e síndrome de Sjogren primária e doença autoimune do músculo liso.

[00142] Os exemplos de doenças néfricas autoimunes incluem, mas não são limitadas a, nefrite e nefrite intersticial autoimune.

[00143] Os exemplos de doenças autoimunes relacionadas com a reprodução incluem, mas não são limitadas a, perda fetal repetida.

[00144] Os exemplos de doenças autoimunes do tecido conectivo incluem, mas não são limitadas a, doenças do ouvido, doenças autoimunes do ouvido e doenças autoimunes do ouvido interno.

[00145] Os exemplos de doenças sistêmicas autoimunes incluem, mas não são limitadas a, lúpus eritematoso sistêmico e esclerose sistêmica.

[00146] Em alguns casos, os métodos da presente invenção expandiram as células T gama delta ou uma população de célula T gama delta da descrição pode ser usada para tratar uma doença infecciosa. O método para acordo com este aspecto da presente invenção é efetuado pela administração de uma quantidade terapêutica das células cultivadas enriquecidas com célula T gama delta da invenção a um sujeito. Uma doença infecciosa pode ser causada, por exemplo, por uma bactéria patogênica ou por um vírus. Várias

51 / 69 proteínas patogênicas, ácidos nucléicos, lipídeos, ou fragmentos dos mesmos podem ser expressos por uma célula doente.

Uma célula apresentadora de antígeno pode internalizar tais moléculas patogênicas, por exemplo com fagocitose ou pela endocitose mediada por receptor, e exibir um fragmento do antígeno ligado a uma molécula MHC apropriada.

As células T gama delta expandidas da descrição podem reconhecer vários antígenos e fragmentos de antígeno de uma bactéria patogênica ou um vírus.

Os exemplos não limitantes de bactérias patogênicas podem ser verificados no: a) gênero Bordetella, tal como a espécie Bordetella pertussis; b) gênero Borrelia, tal como a espécie Borrelia burgdorferi; c) gênero Brucelia, tal como as espécies Brucella abortus, Brucella canis, Brucela meliterisis e/ou Brucella suis; d) gênero Campylobacter, tal como a espécie Campylobacter jejuni; e) os gêneros Chlamydia e Chlamydophila, tais como as espécies Chlamydia pneumonia, Chlamydia trachomatis e/ou Chlamydophila psittaci; f) gênero Clostridium, tal como as espécies Clostridium botulinum, Clostridium difficile, Clostridium perfringens, Clostridium tetani; g) gênero Corynebacterium, tal como a espécie Corynebacterium diphtheria; h) gênero Enterococcus, tal como as espécies Enterococcus faecalis e/ou Enterococcus faecium; i) gênero Escherichia, tal como a espécie Escherichia coli; j) gênero Francisella, tal como a espécie Francisella tularensis; k) gênero Haemophilus, tal como a espécie Haemophilus influenza; l) gênero Helicobacter, tal como a espécie Helicobacter pylori; m) gênero Legionella, tal como a espécie Legionella pneumophila; n) gênero Leptospira, tal como a espécie Leptospira interrogans; o) gênero Listeria, tal como a espécie Listeria monocytogenes; p) gênero Mycobacterium, tal como as espécies Mycobacterium leprae, Mycobacterium tuberculosis e/ou Mycobacterium ulcerans; q) gênero Mycoplasma, tal como a espécie Mycoplasma pneumonia; r) gênero Neisseria, tal como as espécies Neisseria gonorrhoeae e/ou Neisseria meningitidis; s) gênero Pseudomonas, tal como a espécie Pseudomonas

52 / 69 aeruginosa; t) gênero Rickettsia, tal como a espécie Rickettsia rickettsii; u) gênero Salmonella, tal como as espécies Salmonella typhi e/ou Salmonella typhimurium; v) gênero Shigella, tal como a espécie Shigella sonnei; w) gênero Staphylococcus, tal como as espécies Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis e/ou Staphylococcus saprophyticus; x) gênero Streptpcoccus, tal como as espécies Streptococcus agalactiae, Streptococcus pneumonia e/ou Streptococcus pyogenes; y) gênero Treponema, tal como a espécie Treponema pallidum; z) gênero Vibrio, tal como Vibrio cholera; e/ou aa) gênero Yersinia, tal como a espécie Yersinia pestis.

[00147] Em alguns casos, os métodos e/ou composições da presente invenção ou a célula T gama delta expandida ou população de célula T gama delta da descrição podem ser usadas para tratar uma doença infecciosa, uma doença infecciosa pode ser causada por um vírus. Os exemplos não limitantes de vírus podem ser verificados nas seguintes famílias de vírus e são ilustrados com a espécie exemplificativa: a) família Adenoviridae, tal como a espécie Adenovírus; b) família Herpesviridae, tal como as espécies Herpes simples tipo 1, Herpes simples tipo 2, vírus Varicella-zoster, vírus Epstein-barr, citomegalovírus humano, espécie herpesvírus humano tipo 8; c) família Papillomaviridae, tal como a espécie papilomavírus humano; d) família Polyomaviridae, tal como as espécies vírus BK, vírus JC; e) família Poxviridae, tal como a espécie da varíola; f) família Hepadnaviridae, tal como a espécie do vírus da Hepatite B; g) família Parvoviridae, tal como as espécies bocavírus humano, Parvovírus B19; h) família Astroviridae, tal como espécie de astrovírus humano; i) família Caliciviridae, tal como espécie do vírus de Norwalk; j) família Flaviviridae, tal como as espécies do vírus da Hepatite C (HCV), vírus da febre amarela, vírus da dengue, vírus do Nilo Ocidental; k) família Togaviridae, tal como a espécie do vírus da rubéola; l) família Hepeviridae, tal como a espécie do vírus da Hepatite E; m) família Retroviridae, tal como a espécie do vírus da imunodeficiência humana; n)

53 / 69 família Orthomyxoviridae, tal como a espécie do vírus da Influenza; o) família Arenaviridae, tal como as espécies de vírus Guanarito, vírus Junin, vírus Lassa, vírus Machupo e/ou vírus Sabia; p) família Bunyaviridae, tal como espécie do vírus da febre hemorrágica da Crimeia-Congo; q) família Filoviridae, tal como as espécies do vírus Ebola e/ou vírus Marburg; família Paramyxoviridae, tal como as espécies do vírus do sarampo, vírus da cachumba, vírus da parainfluenza, vírus sincicial respiratório, metapneumovírus humano, vírus Hendra e/ou vírus Nipah; r) gênero Rhabdoviridae, tal como a espécie do vírus da raiva; s) família Reoviridae, tal como as espécies de Rotavírus, Orbivírus, Coltivírus e/ou vírus Banna. Em alguns exemplos, um vírus não é atribuído a uma família viral, tal como o da Hepatite D.

[00148] O transplante de células hematopoiéticas tem se tornado o tratamento de escolha para uma variedade de doenças hereditárias ou malignas. Entretanto, as composições de célula hematopoiética são frequentemente ricas em linfócitos T, o que contribui para a doença do enxerto-versus-hospedeiro. Visto que os pacientes sofrendo de malignidades hematológicas são frequentemente deficientes nos números e função da célula T gama delta, a administração exógena de células T gama delta junto com o transplante de célula hematopoiética está sendo correntemente investigada para o enxerto de longa duração realçado e prevenção da doença do enxerto versus hospedeiro. Assim, ainda em uma outra modalidade da presente invenção é provido um método para tratar ou prevenir a doença do enxerto versus hospedeiro em um sujeito em necessidade do mesmo. Assim, ainda em uma outra modalidade da presente invenção é provido um método para tratar uma doença ou condição autoimune em um sujeito em necessidade do mesmo. O método para acordo com este aspecto da presente invenção é efetuado pela administração de uma quantidade terapêutica de uma população de células T gama delta ou composições compreendendo a mesma da

54 / 69 invenção ao dito sujeito. Regimes de Tratamento

[00149] De acordo com alguns aspectos de algumas modalidades da presente invenção, são providas composições farmacêuticas compreendendo uma população de células enriquecidas com a célula T gama delta da invenção para o tratamento de doença, por exemplo, câncer metastático, tumores sólidos, doença autoimune, distúrbio hiperproliferativo ou uma infecção viral, formulada junto com um carreador farmaceuticamente aceitável. Algumas composições incluem uma combinação de populações de célula enriquecida com célula T gama delta múltiplas (por exemplo, duas ou mais) da invenção.

[00150] Nas aplicações profiláticas, as composições farmacêuticas ou medicamentos são administrados a um paciente susceptível a, ou de outro modo em risco de uma doença ou condição (isto é, uma doença hiperproliferativa ou tumor sólido) em uma quantidade suficiente para eliminar ou reduzir o risco de recorrência da doença hiperproliferativa ou tumor sólido, diminuir a severidade, ou retardar o início da doença, incluindo sintomas bioquímicos, histológicos e/ou comportamentais da doença, as suas complicações e fenótipos patológicos intermediários que se apresentam durante o desenvolvimento da doença. Nas aplicações terapêuticas, as composições ou medicamentos são administrados a um paciente suspeito de ou já sofrendo de uma tal doença em uma quantidade suficiente para curar ou pelo menos parcialmente deter, os sintomas da doença (bioquímico, histológico e/ou comportamental), incluindo as suas complicações e fenótipos patológicos intermediários no desenvolvimento da doença. Uma quantidade adequada para realizar o tratamento terapêutico ou profilático é definido como uma dose terapeuticamente ou profilaticamente eficaz. Nos regimes tanto profiláticos quanto terapêuticos, os agentes são usualmente administrados em diversas dosagens até que uma resposta antiproliferativa suficiente tenha sido

55 / 69 alcançada. Tipicamente, a resposta antiproliferativa é monitorada e dosagens repetidas são dadas se a resposta antiproliferativa começa a diminuir.

[00151] Uma célula(s) T gama delta expandida(s) ou população de célula T gama delta como aqui descrita(s) pode(m) ser administrada(s) antes, durante ou depois da ocorrência de uma doença ou condição (por exemplo, no início de um câncer, uma doença infecciosa, uma doença imune, septicemia ou com um transplante de medula óssea) e por um período de tempo necessário para o tratamento da, e o tempo de administração de uma composição farmacêutica contendo uma célula T gama delta expandida ou população de célula T gama delta pode variar. Por exemplo, a célula T gama delta expandida ou população de célula T gama delta pode ser usada como um profilático, pode ser administrado a um sujeito durante ou tão logo quanto possível depois do início dos sintomas ou dentro de qualquer período de tempo a partir do início dos sintomas. Para o tratamento de câncer, por exemplo, uma ou dosagens múltiplas da célula T gama delta expandida ou população de célula T gama delta pode(m) ser administrada(s) anos depois do início do câncer e antes ou depois de outros tratamentos. A duração do tratamento pode variar para cada sujeito. Dosagens Eficazes

[00152] As doses eficazes de uma composição de uma população de célula T gama delta para o tratamento de doença, por exemplo, câncer metastático, tumores sólidos ou um distúrbio hiperproliferativo, aqui descritos variam dependendo de muitos fatores diferentes, incluindo meios de administração, sítio alvo, estado fisiológico do paciente, se o paciente é ser humano ou um animal, outras medicações administradas e se o tratamento é profilático ou terapêutico. Usualmente, o paciente é um ser humano, mas mamíferos não humanos incluindo mamíferos transgênicos também podem ser tratados. As dosagens de tratamento precisam ser tituladas para otimizar a segurança e eficácia.

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[00153] Para a administração com uma célula T gama delta ou população terapêutica de células enriquecidas com a célula T gama deltas, a dosagem varia de cerca de 1 x 106 a cerca de 1 x 109 células T gama delta e/ou células enriquecidas com célula T gama delta por paciente. Para a administração com uma população de células enriquecidas com a célula T gama delta, as faixas de dosagem de cerca de 1 x 105 a cerca de 1 x 109 células T gama delta e/ou células enriquecidas com célula T gama delta por quilograma de peso do receptor ou as faixas de dosagem de cerca de 5 x 105 a cerca de 1 x 108 células T gama delta e/ou células enriquecidas com célula T gama delta por quilograma de peso do receptor. Um regime de tratamento exemplificativo acarreta necessariamente a administração uma vez a cada duas semanas ou uma vez ao mês ou uma vez a cada 3 a 6 meses. Em alguns métodos, duas ou mais populações de célula enriquecida com célula T gama delta são administradas simultaneamente, caso no qual a dosagem de cada uma das populações de célula enriquecida com célula T gama delta administrada situa-se dentro das faixas indicadas. As administrações múltiplas de populações de célula enriquecida com célula T gama delta podem ocorrer. Os intervalos entre dosagens únicas podem ser semanais, mensais ou anuais. Os intervalos também podem ser irregulares como indicado medindo-se os níveis sanguíneos da população de células enriquecidas com a célula T gama delta no paciente. Alternativamente, as populações de célula enriquecida com célula T gama delta podem ser administradas como uma formulação de liberação prolongada, caso no qual administração menos frequente é requerida. A dosagem e frequência variam dependendo da meia-vida das populações de célula enriquecida com célula T gama delta no paciente. A dosagem e frequência de administração podem variar dependendo de se o tratamento é profilático ou terapêutico. Nas aplicações profiláticas, uma dosagem relativamente baixa é administrada em intervalos relativamente infrequentes em um período longo de tempo. Alguns pacientes continuam a

57 / 69 receber tratamento pelo resto de suas vidas. Nas aplicações terapêuticas, uma dosagem relativamente alta em intervalos relativamente curtos é algumas vezes requerida até que a progressão da doença seja reduzida ou terminada e preferivelmente até que o paciente mostre melhora parcial ou completa dos sintomas da doença. Daí em diante, o paciente pode ser administrado com um regime profilático. Vias de Administração

[00154] As composições de uma população terapêutica de células enriquecidas com a célula T gama delta para o tratamento de doença, por exemplo, câncer metastático, tumores sólidos ou um distúrbio hiperproliferativo, podem ser administradas pelas vias intravenosa, intravesicular, intratecal, parenteral, tópica, subcutânea, oral, intranasal, intra- arterial, intracraniana, intraperitoneal ou intramuscular. Como um profilático/adjuvante ou para o tratamento de doença, as populações de célula enriquecida com célula T gama delta terapêuticas alvejam um distúrbio hiperproliferativo ou tumor sólido, por exemplo, uma malignidade genitourinária e/ou tratamento terapêutico. A via mais típica de administração de um agente imunogênico é a subcutânea embora outras vias possam ser igualmente eficazes. A via seguinte mais comum é a injeção intramuscular. Este tipo de injeção é mais tipicamente realizado nos músculos dos braços e pernas. Em alguns métodos, os agentes são injetados diretamente dentro de um tecido particular onde depósitos se acumularam, por exemplo injeção intracraniana. A injeção intramuscular ou infusão intravenosa são preferidas para a administração de uma população de células enriquecidas com a célula T gama delta. Em alguns métodos, uma população de célula terapêutica particular é injetada diretamente dentro da bexiga. Formulação

[00155] As composições de uma população de células enriquecidas com a célula T gama delta para o tratamento de doença, por exemplo, câncer

58 / 69 metastático, tumores sólidos, viral ou outra infecção, inflamatório ou um distúrbio hiperproliferativo.

[00156] Composições de uma população terapêutica de células enriquecidas com a célula T gama delta para o tratamento de doença, por exemplo, câncer metastático, tumores sólidos ou um distúrbio hiperproliferativo, são frequentemente administradas como composições farmacêuticas compreendendo um agente terapêutico ativo, isto é, e uma variedade de outros componentes farmaceuticamente aceitáveis. Ver, por exemplo, Alfonso R Gennaro (ed), Remington: The Science and Practice of Pharmacy, (Antigamente Remington’s Pharmaceutical Sciences) 20a ed., Lippincott, Williams & Wilkins, 2003, aqui incorporada por referência na sua totalidade. A forma preferida depende do modo pretendido de administração e aplicação terapêutica. As composições também podem incluir, dependendo da formulação desejada, carreadores ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis, não tóxicos, que são definidos como veículos habitualmente usados para formular composições farmacêuticas para a administração animal ou humana. O diluente é selecionado de modo a não afetar a atividade biológica da combinação. Um exemplo de tal diluente é o meio X-vivo 20 (Cambrex Bio Science, Walkersville, Md.) contendo 10% de soro AB humano inativado por calor ou 10% de soro autólogo. Exemplos adicionais de tais diluentes são água destilada, solução salina tamponada com fosfato fisiológica, soluções de Ringer, solução de dextrose e solução de Hank. Além disso, a composição ou formulação farmacêuticas também podem incluir outros carreadores, adjuvantes ou estabilizantes não tóxicos, não terapêuticos, não imunogênicos e os semelhantes.

[00157] As composições farmacêuticas também podem incluir macromoléculas grandes, lentamente metabolizadas tais como proteínas, polissacarídeos tais como quitosano, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos e copolímeros (tais como Sepharose® funcionalizada em látex, agarose,

59 / 69 celulose e semelhantes), aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácido, e agregados lipídicos (tais como gotículas oleosas ou lipossomas). Adicionalmente, estes carreadores podem funcionar como agentes imunoestimuladores (isto é, adjuvantes).

[00158] Para a administração parenteral, as composições da invenção podem ser administradas como dosagens injetáveis de uma solução ou suspensão da substância em um diluente fisiologicamente aceitável com um carreador farmacêutico que pode ser um líquido estéril tal como óleos em água, solução salina, glicerol ou etanol. Adicionalmente, substâncias adicionais, tais como agentes de umectação ou emulsificação, tensoativos, substâncias tamponantes de pH e semelhantes podem estar presentes nas composições. Outros componentes de composições farmacêuticas são aqueles de origem de petróleo, animal, vegetal ou sintética, por exemplo, óleo de amendoim, óleo de soja e óleo mineral. No geral, glicóis tais como propileno glicol ou polietileno glicol são carreadores líquidos preferidos, particularmente para soluções injetáveis. As populações de célula enriquecida com célula T gama delta terapêuticas podem ser administradas na forma de uma preparação de depósito por injeção ou implante que pode ser formulada em uma tal maneira como para permitir uma liberação prolongada do ingrediente ativo. Uma composição exemplificativa compreende uma população terapêutica de células enriquecidas com a célula T gama delta a 5 mg/mL, formulada em tampão aquoso consistindo em 50 mM de L-histidina, 150 mM de NaCl, ajustada ao pH 6,0 com HCl.

[00159] Tipicamente, as composições são preparadas como injetáveis, como soluções ou suspensões líquidas; formas sólidas adequadas para solução ou suspensão em veículos líquidos antes da injeção também podem ser preparadas. A preparação também pode ser emulsificada ou encapsulada em lipossomas ou micropartículas tais como polilactídeo, poliglicolídeo ou copolímero para efeito adjuvante realçado, como debatido acima. Langer,

60 / 69 Science, 249: 1527, 1990; Hanes, Advanced Drug Delivery Reviews, 28: 97- 119, 1997, aqui incorporadas por referência em suas totalidades. Os agentes desta invenção podem ser administrados na forma de uma preparação de depósito por injeção ou implante que pode ser formulada em uma tal maneira como para permitir uma liberação prolongada ou pulsátil do ingrediente ativo. Formulações adicionais adequadas para outros modos de administração incluem formulações orais, intranasais, e pulmonares, supositórios e aplicações transdérmicas.

[00160] Para supositórios, os aglutinantes e carreadores incluem, por exemplo, polialquileno glicóis ou triglicerídeos; tais supositórios podem ser formados a partir de misturas contendo o ingrediente ativo na faixa de 0,5% a 10%, preferivelmente 1% a 2%. As formulações orais incluem excipientes, tais como graus farmacêuticos de manitol, lactose, amido, estearato de magnésio, sacarina sódica, celulose e carbonato de magnésio. Estas composições tomam a forma de soluções, suspensões, tabletes, pílulas, cápsulas, formulações de liberação prolongada ou pós e contém de 10% a 95% de ingrediente ativo, preferivelmente de 25% a 70%.

[00161] As composições farmacêuticas geralmente compreendem uma composição da população terapêutica de células enriquecidas com a célula T gama delta em uma forma adequada para a administração a um paciente. As composições farmacêuticas são geralmente formuladas como estéreis, substancialmente isotônicas e em conformidade com todas as regulamentações da Good Manufacturing Practice (GMP) da U.S. Food and Drug Administration. Toxicidade

[00162] Preferivelmente, uma dose terapeuticamente eficaz de uma composição da(s) população(ões) de células enriquecidas com a célula T gama delta aqui descrita(s) proverão benefício terapêutico sem causar toxicidade substancial.

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[00163] A toxicidade da(s) população(ões) terapêutica(s) de células enriquecidas com a célula T gama delta aqui descrita(s) pode ser determinada pelos procedimentos farmacêuticos padrão em culturas de célula ou animais experimentais, por exemplo, determinando-se a LD50 (a dose letal para 50% da população) ou a LD100 (a dose letal para 100% da população). A razão de dose entre efeito tóxico e terapêutico é o índice terapêutico. Os dados obtidos a partir destes ensaios de cultura de célula e estudos com animal podem ser usados na formulação de uma faixa de dosagem que não seja tóxica para o uso em ser humano. A dosagem da(s) população(ões) terapêutica(s) de células enriquecidas com a célula T gama delta aqui descrita(s) reside preferivelmente dentro de uma faixa de concentrações circulantes que incluem a dose eficaz com pouca ou nenhuma toxicidade. A dosagem pode variar dentro desta faixa dependendo da forma de dosagem utilizada e da via de administração utilizada. A formulação, via de administração e dosagem exatas podem ser escolhidas pelos médicos individuais em vista da condição do paciente. (Ver, por exemplo, Fingl, et al., The Pharmacological Basis Of Therapeutics, Cap. 1, 1975), aqui incorporados por referência na sua totalidade. Dosagem Unitária

[00164] Uma célula(s) T gama delta expandida(s) ou população de célula T gama delta aqui descritas podem ser formuladas nas formas de dosagem unitária adequadas para a administração única de dosagens precisas. Em alguns casos, as formas de dosagem unitária compreendem linfócitos adicionais, por exemplo, mas não limitados a NK ou células tronco hematopoiéticas. Na forma de dosagem unitária, a formulação é dividida em doses unitárias contendo quantidades apropriadas de um ou mais compostos. A dosagem unitária pode estar na forma de uma embalagem contendo quantidades separadas da formulação. Os exemplos não limitantes são tabletes ou cápsulas embalados, e pós em frascos ou ampolas. As composições de

62 / 69 suspensão aquosas podem ser empacotadas em recipientes que não podem ser novamente fechados de dose única. Os recipientes que podem ser novamente fechados de dose múltipla podem ser usados, por exemplo, em combinação com um preservante ou sem um preservante. Em alguns exemplos, as células, composições ou composição farmacêutica não compreendem um preservante. As formulações para injeção parenteral podem ser apresentadas na forma de dosagem unitária, por exemplo, em ampolas ou em recipientes de dose múltipla com um preservantes. Kits

[00165] Também dentro do escopo da invenção são kits compreendendo as composições (por exemplo, uma população terapêutica de células enriquecidas com a célula T gama delta) da invenção e instruções para o uso. O kit pode conter adicionalmente pelo menos um reagente adicional ou um ou mais anticorpos humanos adicionais da invenção (por exemplo, um anticorpo humano tendo uma atividade complementar que se liga a um epítopo no antígeno distinto do primeiro anticorpo humano). Os kits tipicamente incluem um rótulo indicando o uso pretendido dos conteúdos do kit. O termo rótulo inclui qualquer material escrito ou registrado suprido no ou com o kit ou que de outro modo acompanha o kit. Criopreservação

[00166] Em algumas modalidades, as células T gama delta ou população(ões) de célula T gama delta pode(m) ser formulada(s) em meios de criopreservação e colocados em unidades de armazenagem criogênicas tais como congeladores de nitrogênio líquido (-195C) ou congeladores de temperatura ultrabaixa (-65C, -80C ou -120C) para armazenagem de longa duração de pelo menos cerca de 1 mês, 2 meses, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses, 1 ano, 2 anos, 3 anos ou pelo menos 5 anos. Os meios de criopreservação podem conter sulfóxido de dimetila (DMSO) e/ou cloreto de sódio (NaCl) e/ou dextrose e/ou sulfato de dextrano e/ou hidroxietil amido

63 / 69 (HES) com agentes tamponantes no pH fisiológico para manter o pH entre cerca de 6,0 e cerca de 6,5, cerca de 6,5 a cerca de 7,0, cerca de 7,0 a cerca de 7,5, cerca de 7,5 a cerca de 8,0 ou cerca de 6,5 a cerca de 7,5. As células T gama delta ou população(ões) de célula T gama delta criopreservada(s) podem ser descongeladas e adicionalmente processadas pela estimulação com anticorpos, proteínas, peptídeos e/ou citocina como aqui descrito.

[00167] Como aqui usado o termo “cerca de” se refere a ± 10%.

[00168] Os termos “compreende”, “compreendendo”, “inclui”, “incluindo”, “tendo” e seus conjugados significa “incluindo mas não limitado a”. Este termo abrange os termos “consistindo em” e “consistindo essencialmente de”.

[00169] A frase “consistindo essencialmente de” significa que a composição ou método pode incluir ingredientes e/ou etapas adicionais, mas somente se os ingredientes e/ou etapas adicionais não alterarem materialmente as características básicas e novas da composição ou método reivindicados.

[00170] Como aqui usada, as formas singulares “um”, “uma” e “o/a” incluem referências plurais a menos que o contexto claramente imponha de outro modo. Por exemplo, o termo “um composto” ou “pelo menos um composto” pode incluir uma pluralidade de compostos, incluindo misturas dos mesmos.

[00171] Por todo este pedido, várias modalidades desta invenção podem ser apresentadas em um formato de faixa. Deve ser entendido que a descrição no formato de faixa é meramente por conveniência e brevidade e não deve ser interpretada como uma limitação inflexível sobre o escopo da invenção. Consequentemente, a descrição de uma faixa deve ser considerada ter especificamente descritas todas as subfaixas possíveis assim como valores numéricos individuais dentro desta faixa. Por exemplo, a descrição de uma faixa tal como de 1 a 6 deve ser considerada ter especificamente descritas

64 / 69 subfaixas tais como de 1 a 3, de 1 a 4, de 1 a 5, de 2 a 4, de 2 a 6, de 3 a 6, etc., assim como números individuais dentro desta faixa, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, e 6. Isto se aplica independente da amplitude da faixa.

[00172] Sempre que uma faixa numérica é aqui indicada, é intencionado incluir qualquer numeral citado (fracionário ou inteiro) dentro da faixa indicada. As frases “variando/varia entre” um primeiro número indicado e um segundo número indicado e “varando/varia de” um primeiro número indicado “a” um segundo número indicado são aqui usados intercambiavelmente e são intencionados a incluir o primeiro e segundo números indicados e todos os numerais fracionários e integrais entre eles.

[00173] Como aqui usado o termo “método” se refere às maneiras, meios, técnicas e procedimentos para realizar uma dada tarefa incluindo, mas não limitada àquelas maneiras, meios, técnicas e procedimentos conhecidos ou facilmente desenvolvidos a partir de maneiras, meios, técnicas e procedimentos conhecidos pelos profissionais das técnicas químicas, farmacológicas, biológicas, bioquímicas e médicas.

[00174] Como aqui usado, o termo “tratar” inclui anular, substancialmente inibir, retardar ou reverter a progressão de uma condição, substancialmente melhorar os sintomas clínicos ou estéticos de uma condição ou substancialmente prevenir o aparecimento de sintomas clínicos ou estéticos de uma condição.

[00175] É avaliado que certos traços da invenção, que são, para clareza, descritos no contexto de modalidades separadas, também podem ser providos em combinação em uma única modalidade. Ao contrário, vários traços da invenção, que são, para brevidade, descritos no contexto de uma única modalidade, também podem ser providos separadamente ou em qualquer subcombinação adequada ou como adequado em qualquer outra modalidade descrita da invenção. Certos traços descritos no contexto de várias modalidades não devem ser considerados traços essenciais destas

65 / 69 modalidades, a menos que a modalidade seja inoperante sem estes elementos.

[00176] Várias modalidades e aspectos da presente invenção como delineado acima e como reivindicado na seção de reivindicações abaixo encontram suporte experimental nos seguintes exemplos.

EXEMPLOS

[00177] Referência é agora feita aos seguintes exemplos, que juntos com as descrições acima ilustram algumas modalidades da invenção em uma maneira não limitante.

[00178] Geralmente, a nomenclatura aqui usada e os procedimentos de laboratório utilizados na presente invenção incluem técnicas moleculares, bioquímicas, microbiológicas e de DNA recombinante. Tais técnicas são completamente explicadas na literatura. Ver, por exemplo, “Molecular Cloning: A Laboratory Manual” Sambrook et al., (1989); “Current Protocols in Molecular Biology” Volumes I-III Ausubel, R. M., ed. (1994); Ausubel et al., “Current Protocols in Molecular Biology”, John Wiley and Sons, Baltimore, Mariland (1989); Perbal, “A Practical Guide to Molecular Cloning”, John Wiley & Sons, New York (1988); Watson et al., “Recombinant DNA”, Scientific American Books, New York; Birren et al. (eds) “Genome Analysis: A Laboratory Manual Series”, Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998); metodologias como apresentadas nas Patentes U.S. Nos. 4.666.828, 4.683.202, 4.801.531,

5.192.659 e 5.272.057; “Cell Biology: A Laboratory Handbook”, Volumes I- III Cellis, J. E., ed. (1994); “Culture of Animal Cells - A Manual of Basic Technique” por Freshney, Wiley-Liss, N. Y. (1994), Terceira Edição; “Current Protocols in Immunology” Volumes I-III Coligan J. E., ed. (1994); Stites et al. (eds), “Basic and Clinical Immunology” (8a Edição), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell e Shiigi (eds), “Selected Methods in Cellular Immunology”, W. H. Freeman e Co., New York (1980); os imunoensaios disponíveis são extensivamente descritos na literatura

66 / 69 patentária e científica, ver, por exemplo, as Patentes U.S. Nos. 3.791.932,

3.839.153, 3.850.752, 3.850.578, 3.853.987, 3.867.517, 3.879.262, 3.901.654,

3.935.074, 3.984.533, 3.996.345, 4.034.074, 4.098.876, 4.879.219, 5.011.771 e 5.281.521; “Oligonucleotide Synthesis” Gait, M. J., ed. (1984); “Nucleic Acid Hybridization” Hames, B. D., e Higgins S. J., eds. (1985); “Transcription and Translation” Hames, B. D., e Higgins S. J., eds. (1984); “Animal Cell Culture” Freshney, R. I., ed. (1986); “Immobilized Cells and Enzymes” IRL Press, (1986); “A Practical Guide to Molecular Cloning” Perbal, B., (1984) e “Methods in Enzymology” Vol. 1-317, Academic Press; “PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications”, Academic Press, San Diego, CA (1990); Marshak et al., “Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual” CSHL Press (1996); todas das quais são incorporadas por referência como se completamente aqui apresentadas. Outras referências gerais são providas por todo este documento. Os procedimentos nelas são acreditados ser bem conhecidos na técnica e são providos para a conveniência do leitor. Toda informação nelas contida é aqui incorporada por referência.

PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS Cultura ex vivo de células T gama delta

[00179] Amostras unitárias de sangue de doador saudável foram esgotadas de células T expressando TCR alfabeta usando colunas midiMACS® e o Kit TCRα/β (Miltenyi Biotec, Gaithersberg, MD). As populações esgotadas de célula T alfabeta foram cultivadas por 12 a 13 dias em bolsas VueLife® (Saint-Gobain, Gaithersburg, MD) com meio suplementado com 0 (controle) ou 5 mM de nicotinamida (NAM) e 50 ng/ml de IL-2. Distinção de receptor de célula T

[00180] Para distinguir receptor de célula T (TCR) expresso nas células CD3+ em cultura, as células CD3 positivas foram purificadas com reagente

67 / 69 CD3 CliniMACS® (Miltenyi, 273-01, Gaithersburg, MD) seguido pela análise de FACS das porcentagens de células CD3+/γδ+ e CD3+/ α/β+. O tingimento e análise de FACS foram realizados de acordo com procedimentos padrão utilizando anticorpos específicos de superfície celular. Expressão de CD62L em Células T gama delta Expandidas

[00181] As células T gama-delta purificadas a partir das culturas tratadas com NAM e de controle (- NAM) foram tingidas para CD62L (L- selectina) e analisadas por FACS, usando anticorpos anti-CD62L. Transplante e Funcionalidade in vivo de Células T gama delta Expandidas

[00182] As células CD3+/gama delta+ foram purificadas a partir da cultura, como descrito acima, e depois marcadas com CFSE (Invitrogen, Thermo-Fisher, Carlsbad, CA). Camundongos SCID NSG foram irradiados a 350cGy. No dia seguinte a seguir da irradiação, 5 a 6 x 106 células positivas em CD3+/gama delta rotuladas com CFSE por camundongo a partir das culturas NAM e de controle (- NAM) foram injetadas intravenosamente nos camundongos.

[00183] Os camundongos foram sacrificados 4 dias depois da infusão de célula, e os órgãos excisados. As frações de células tingidas com CFSE foram avaliadas por FACS de suspensões de célula de órgão. Exemplo 1: A Cultura Ex Vivo de Células T Gama-Delta Humanas com NAM Realça a Funcionalidade da Célula T

[00184] A análise de FACS de células T esgotadas em alfabeta cultivadas com 5 mM de nicotinamida (NAM) mostraram que o esgotamento da fração de célula T alfabeta provê uma população expandida de célula CD3+ compreendendo mais do que 90% das células T gama delta. Cultivar as células com nicotinamida não parece afetar a expansão do componente positivo em gama delta das populações de célula T cultivadas (Fig. 1).

[00185] CD62L (L-selectina) é uma molécula de adesão de linfócito

68 / 69 importante, atuando como um “receptor de retorno” para o retorno e entrada de linfócitos dentro do tecido linfóide assim como um sinal coestimulador de linfócito T. A Fig. 2 mostra o realce notável da expressão de CD62L (detectada por FACS) nas células T gama delta cultivadas com 5 mM de NAM, comparadas com células idênticas cultivadas sem NAM. Exemplo 2: Retorno e retenção in vivo realçadas de células T gama delta cultivadas com NAM

[00186] As baixas frequências de retorno e retenção em tecido eficazes de linfócitos infundidos constituem um sério obstáculo para as terapias de célula T bem-sucedidas, aumentando os números de células requeridas para se alcançar resultados ótimos. A funcionalidade aumentada das células T gama delta cultivadas em NAM é refletida na incidência realçada de retorno e retenção em tecidos depois da infusão em camundongos scid NSG irradiados.

[00187] A Fig. 3 mostra a magnitude do efeito da NAM sobre o retorno e retenção in vivo 4 dias após a infusão das células T gama delta cultivadas em NAM. De significância particular é o realce poderoso das células T gama delta retidas em tecido linfóide (baço, medula óssea), acompanhado com o aumento de quase três vezes nas células T gama delta retidas no sangue e tecido pulmonar resultante da cultura com NAM.

[00188] Embora a invenção tenha sido descrita em conjunção com modalidades específicas desta, é evidente que muitas alternativas, modificações e variações estarão evidentes para aqueles versados na técnica. Consequentemente, é intencionado abranger todas de tais alternativas, modificações e variações que se situem dentro do espírito e escopo amplo das reivindicações anexas.

[00189] Todas as publicações, patentes e pedidos de patente mencionados neste relatório descritivo são aqui incorporadas em suas totalidades por referência no relatório descritivo, no mesmo grau como se cada publicação, patente ou pedido de patente individual fosse específica e

69 / 69 individualmente indicado ser aqui incorporado por referência. Além disso, a citação ou identificação de qualquer referência neste pedido não deve ser interpretada como uma admissão de que tal referência esteja disponível como técnica anterior à presente invenção. Ao grau que os cabeçalhos de seção são usados, eles não devem ser interpretados como necessariamente limitantes.

[00190] Além disso, qualquer documento(s) de prioridade deste pedido é/são por meio deste aqui incorporado(s) por referência na sua totalidade.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Método para realçar o potencial de retorno e/ou retenção de célula T gama delta, caracterizado pelo fato de que o método compreende: (a) obter uma população de célula selecionada enriquecida para células T gama delta; (b) prover ex vivo a dita população de célula selecionada com condições para a expansão de célula T gama delta, (c) prover nicotinamida na faixa de 0,5 a 50 mM por um período de tempo suficiente para realçar o potencial de retorno e/ou retenção de célula T gama delta, realçando deste modo o potencial de retorno e/ou retenção de células T gama delta na dita população de célula selecionada.

2. Método para realçar a expressão de célula T gama delta CD62L, o método caracterizado pelo fato de que compreende: (a) obter uma população de célula selecionada enriquecida para células T gama delta; (b) prover ex vivo a dita população de célula selecionada com condições para a expansão de célula T gama delta, (c) prover nicotinamida na faixa de 0,5 a 50 mM por um período de tempo suficiente para realçar a expressão de célula T gama delta CD62L, realçando deste modo a expressão em CD62L de células T gama delta na dita população de célula selecionada.

3. Método para acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as ditas condições para a expansão de célula T gama delta compreendem prover nutrientes e citocinas, e, opcionalmente, em que as ditas citocinas são selecionadas do grupo consistindo em IL-2, IL-15 e IL-21.

4. Método para acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que as ditas condições para a expansão de célula T gama delta compreendem prover nutrientes e citocinas e, opcionalmente, em que as ditas citocinas são selecionadas do grupo consistindo em IL-2, IL-15 e IL-21.

5. Método para acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a dita nicotinamida é selecionada a partir do grupo consistindo em nicotinamida, um análogo de nicotinamida, um metabólito de nicotinamida, um metabólito análogo de nicotinamida e derivados dos mesmos.

6. Método para acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a dita população de célula selecionada é uma população de célula de linfócito enriquecida para células T gama delta pelo esgotamento de células T alfabeta.

7. Método para acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a dita população de célula selecionada compreende células exterminadoras naturais (NK).

8. Método para acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente prover condições para a expansão de célula NK.

9. Método para acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que prover as ditas condições para a expansão de célula T gama delta e a dita nicotinamida realça o potencial de retorno e/ou retenção e/ou expressão em CD62L das ditas células NK na dita população de célula selecionada.

10. Método para acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a dita população de célula selecionada é uma população de célula de linfócito enriquecida para células T gama delta pela seleção de células T gama delta.

11. Método para acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a dita população de célula selecionada é destituída de células NK.

12. Método para acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a dita população de células T gama delta é derivada de um órgão selecionado a partir do grupo consistindo em um músculo, pele, um osso, um órgão linfático, um pâncreas, um fígado, uma vesícula biliar, um rim, um órgão do trato digestivo, um órgão do trato respiratório, um órgão reprodutivo, um órgão do trato urinário, um órgão associado com o sangue, um timo, um baço, um órgão do sistema nervoso.

13. Método para acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a dita população de células T gama delta é derivada de uma fonte selecionada a partir do grupo consistindo em células hematopoiéticas, células do sangue de cordão umbilical, células de sangue periférico mobilizadas e células da medula óssea.

14. Método para acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a dita população de células T gama delta é derivada da medula óssea ou sangue periférico.

15. Método para acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a dita população de células T gama delta é derivada do sangue de cordão umbilical neonatal.

16. Método para acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a dita população de células é derivada de uma fração de célula mononuclear.

17. Método para acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a dita população de células T gama delta é de uma amostra de aférese.

18. Método para acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dito período de tempo da etapa (c) está entre 1 e 3 semanas.

19. Método para acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dito período de tempo da etapa (c) está entre 1 e 7 dias.

20. Método para acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que uma concentração da dita nicotinamida está na faixa de 0,5 a 20 mM.

21. Método para acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a dita nicotinamida é provida em uma concentração de 5 mM.

22. Método para acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente selecionar uma população de célula T gama delta de acordo com um marcador de célula selecionado a partir do grupo consistindo em um antígeno de tumor, um antígeno viral e um antígeno bacteriano.

23. Composição de célula terapêutica, caracterizada pelo fato de que compreende uma população de célula T gama delta selecionada expandida, a dita população de célula expandida ex vivo cultivada com condições para a expansão de célula T gama delta e quantidade de nicotinamida na faixa de 0,5 a 50 mM, em que a dita população de célula T gama delta selecionada expandida é distinguida por pelo menos um de: (i) potencial de retorno e/ou retenção de célula T gama delta realçadas, e (ii) expressão realçada de CD62L, quando comparada com uma população de célula T gama delta selecionada similar expandida com condições idênticas e não mais do que 0,1 mM de nicotinamida.

24. Composição de célula terapêutica de acordo com a reivindicação 23, caracterizada pelo fato de que compreende células T gama delta cultivadas de acordo com o método compreendendo: (a) obter uma população de célula selecionada enriquecida para células T gama delta; (b) prover ex vivo a dita população de célula selecionada com condições para expansão de célula T gama delta,

(c) prover nicotinamida na faixa de 0,5 a 50 mM por um período de tempo suficiente para realçar o potencial de retorno e/ou retenção de célula T gama delta.

25. Composição de célula terapêutica de acordo com a reivindicação 23, caracterizada pelo fato de que compreende adicionalmente células NK.

26. Método para transplantar células em um sujeito, o método caracterizado pelo fato de que compreende: (a) expandir ex vivo uma população de célula T gama delta selecionada cultivando-se a dita população de célula em condições para expansão de célula T gama delta e nicotinamida na faixa de 0,5 a 50 mM por um período de tempo suficiente para realçar o potencial de retorno e/ou retenção de célula T gama delta e/ou expressão de CD62L, em que a dita população de célula T gama delta selecionada expandida é distinguida em pelo menos um de: (i) potencial de retorno e/ou retenção de célula T gama delta realçado, e (ii) expressão de CD62L realçada, quando comparada com uma população de célula T gama delta selecionada similar expandida sem 0,5 a 50 nM de nicotinamida, e (b) infundir as células T gama delta expandidas dentro de um sujeito em necessidade das mesmas.

27. Método para acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que a etapa (a) é afetada de acordo com o método compreendendo: (i) obter uma população de célula selecionada enriquecida para células T gama delta; (ii) prover ex vivo a dita população de célula selecionada com condições para expansão de célula T gama delta,

(iii) prover nicotinamida na faixa de 0,5 a 50 mM por um período de tempo suficiente para realçar o potencial de retorno e/ou retenção de célula T gama delta.

28. Método para acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que o sujeito é um sujeito humano.

29. Método para acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que as ditas células T gama delta são alogênicas para o dito sujeito.

30. Método para acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que as ditas células T gama delta são autólogas para o dito sujeito.

31. Método para acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que o dito sujeito está sofrendo de uma condição selecionada a partir do grupo consistindo em um câncer, uma infecção bacteriana, uma infecção viral, uma condição autoimune e uma condição inflamatória.

32. Método para acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que o transplante das ditas células no dito sujeito compreende uma terapia adjunta.

33. Método para acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que a dita terapia adjunta é em combinação com uma terapia selecionada a partir do grupo consistindo em terapia antiviral, terapia anti- inflamatória, terapia antibiótica, terapia bactericida, quimioterapia, cirurgia, imunoterapia, imunoquimioterapia, radioterapia, transplante de medula óssea e transplante de célula tronco hematopoiética.

34. Método para acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que o dito sujeito está sendo tratado com células tronco hematopoiéticas do sangue de cordão umbilical expandidas em cultura com mais do que 1,0 mM de nicotinamida antes, concomitantemente com ou a seguir do transplante das ditas células T gama delta expandidas.