BR112021012441A2

BR112021012441A2 - Polipeptídeo dimérico, polinucleotídeo, vetor, célula hospedeira, métodos para produzir o polipeptídeo e para tratar uma doença ou distúrbio, composição farmacêutica e uso do polipeptídeo

Info

Publication number: BR112021012441A2
Application number: BR112021012441-1A
Authority: BR
Inventors: Young Kee Shin; Sae Hyung LEE; Sung Su Kim
Original assignee: Seoul National University R&Db Foundation; Logone Bio Convergence Research Foundation
Priority date: 2018-12-24
Filing date: 2019-12-20
Publication date: 2021-10-26
Also published as: US20220089684A1; EP3904375A4; JP2022515468A; CN113544145A; EP3904375A1; KR20200079197A; WO2020138868A1; AU2019416427A1; AU2019416427B2; CA3124762A1

Abstract

polipeptídeo dimérico, polinucleotídeo, vetor, célula hospedeira, métodos para produzir o polipeptídeo e para tratar uma doença ou distúrbio, composição farmacêutica e uso do polipeptídeo. a presente invenção refere-se a uma proteína de fusão fc neutralizadora de interferon tipo 1 e um uso da mesma e, mais especificamente, a: um polipeptídeo do tipo dímero ao qual um monômero compreendendo um fragmento de receptor de interferon ou um fragmento fc de anticorpo está ligado; um método de preparação para o mesmo; e uma composição farmacêutica compreendendo o mesmo. a proteína de fusão fc neutralizadora de interferon tipo 1 da presente invenção bloqueia a ligação entre interferon tipo 1 e um receptor de interferon, e tem uma excelente capacidade de inibir a sinalização e atividades biológicas de interferon, permitindo assim que doenças mediadas por um interferon tipo 1 sejam tratadas de forma eficaz.

Description

“POLIPEPTÍDEO DIMÉRICO, POLINUCLEOTÍDEO, VETOR, CÉLULA HOSPEDEIRA, MÉTODOS PARA PRODUZIR O POLIPEPTÍDEO E PARA TRATAR UMA DOENÇA OU DISTÚRBIO, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA E USO DO POLIPEPTÍDEO” CAMPO TÉCNICO

[001] Este pedido reivindica prioridade para o Pedido de Patente Coreano No. 10-2018-0168801 depositado em 24 de dezembro de 2018, e cujas especificações completas são incorporadas neste documento por referência em sua totalidade.

[002] A presente invenção se refere a uma proteína de fusão Fc neutralizadora de interferon tipo 1 e seu uso, mais especificamente, se refere a um polipeptídeo dimérico no qual um monômero compreendendo um fragmento de receptor de interferon ou um fragmento Fc de anticorpo está ligado, e um método para preparar o mesmo, e uma composição para prevenir ou tratar doenças relacionadas com a expressão anormal de interferon tipo 1 ou gene induzível por interferon compreendendo o mesmo.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[003] Os interferons tipo I (IFNs) (IFN-α, IFN-β, IFN-ω, IFN-τ) são um grupo de citocinas estruturalmente relacionadas com efeitos antivirais, antitumorais e imunomoduladores. O locus IFNa humano tem dois subgrupos.

O primeiro subgrupo possui 14 não alelos e 4 pseudogenes com pelo menos 80% de identidade. O segundo subgrupo, αII ou ômega (ω), possui 1 gene funcional e 5 pseudogenes apresentando 70% de identidade com o gene IFNα.

Os subtipos de IFNα possuem diferentes atividades específicas, mas apresentam o mesmo espectro biológico e possuem os mesmos receptores celulares. O interferon β (IFN β) é codificado por um único gene com quase 50% de identidade com o gene IFNα. O interferon γ produzido por linfócitos ativados não tem identidade com interferon alfa/beta e não reage com seus receptores.

[004] Todos os IFNs tipo I humanos se ligam a um receptor de superfície celular (receptor IFN alfa, IFNAR), que consiste em duas proteínas transmembrana, IFNAR-1 e IFNAR-2. IFNAR-1 é essencial para a ligação de alta afinidade e especificidade diferente do complexo IFNAR. Embora a diferença na função de cada subtipo de IFN tipo I não tenha sido elucidada, pensa-se que cada um exibe uma ação diferente com o componente receptor IFNAR, potencialmente levando a várias sinalizações.

[005] Os primeiros estudos sobre a função do IFN tipo I enfocaram as defesas inatas contra a infecção viral. No entanto, estudos mais recentes referem-se aos IFNs tipo I como potentes citocinas imunorreguladoras na resposta imune adaptativa. Em particular, o IFN tipo I demonstrou facilitar a mutação de células T nativas na via Th1, aumentar a produção de anticorpos e apoiar a atividade funcional e a sobrevivência de células T de memória.

[006] Vários grupos de estudos recentes sugeriram que o IFN-α pode aumentar a maturação ou ativação de células dendríticas (DCs). Além disso, o aumento da expressão do interferon tipo I foi descrito em uma série de literatura relacionada com doenças autoimunes.

[007] O exemplo mais estudado disso é diabetes mellitus insulino-dependente (DMID) (Paulis et al. (1987) Lancet 2:1423), lúpus eritematoso sistêmico (LES) (Hooks et al. (1982) Arthritis Rheum. 25:396), síndrome de Sjögren (Lee Hong-Yau et al. (2013) Autoimmun Rev. 12(5):558- 66), miosite inflamatória (Beckler et al. (2007) Mol Med. 13(1-2):59-68.) e artrite reumatóide (AR) em que IFN-β desempenha um papel mais importante (Herzzog et al. (1988) Clin. Immunol. Immunopathol. 48:192, Hopkins e Meggle (1988) Clin. Exp. Immunol. 73:88, Alvin e Miller (1984) Arthritis Rheum. 27:582), que estão todos associados a níveis elevados de IFNα.

[008] Além disso, foi relatado que a administração de interferon α, um tipo representativo de interferon tipo 1, exacerba a doença subjacente em pacientes com psoríase e esclerose múltipla e induz sintomas semelhantes aos do LES em pacientes sem experiência anterior de doença autoimune. O interferon α também demonstrou induzir glomerulonefrite em camundongos normais e acelerar o desenvolvimento de doença autoimune concomitante em camundongos NZB/W. Além disso, a terapia com IFN-α demonstrou induzir efeitos colaterais indesejáveis, incluindo febre e distúrbios neurológicos em alguns casos.

[009] Embora tenha a diversidade do IFN tipo 1, e em estudos recentes em pacientes com LES, não apenas o IFN-α, mas também o IFN- β atua como etiologia para doenças de pele da mucosa, há um problema em que o tratamento para doença mediada por interferon tipo 1 é concentrado em IFN-α sozinho, tal como um tratamento com vacina (IFN- quinóide) ou anticorpo neutralizante monoclonal anti-IFN-α (Sifalimumab, Rontalizumab, AGS-009). Além disso, o problema de tais anticorpos neutralizantes é que eles não podem neutralizar todas as partes que se ligam a dois receptores diferentes de interferon e têm capacidade de ligação apenas a IFNAR1 ou IFNAR2. A fim de compensar este problema, Anifrolumab (MAbs. mar-abr 2015; 7(2): 428-439.), que se liga especificamente a IFNAR1, um receptor IFN tipo I, e exibe capacidade de neutralização, está sendo desenvolvido. No entanto, as características destes anticorpos neutralizantes, terapêuticos em vários mecanismos de sinalização do interferon tipo 1, são esperados de que haverá uma limitação na incapacidade de remover interferon tipo 1 do corpo e mecanismos de sinalização complexos, tais como vias não canônicas mediadas por IFNAR1 (Nat Immunol. Set 2013; 14(9): 901-7.) ou IFNAR2 (Sci Signal. 27 de maio de 2014; 7(327):ra50.; PLoS One. 2017; 12(8):e0182866.), diferente de vias canônicas mediadas por IFNAR1 e

IFNAR2.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO PROBLEMA TÉCNICO

[010] Os inventores da presente invenção completaram a presente invenção ao desenvolver um tratamento para doença mediada por interferon tipo 1, uma vez que confirmou que o polipeptídeo do tipo dímero compreendendo o fragmento de receptor de interferon 1 e o fragmento de receptor de interferon 2 não se liga apenas ao interferon tipo 1, mas também inibe significativamente a inibição do início do mecanismo de sinalização e da atividade biológica durante o tratamento.

[011] Portanto, o objetivo da presente invenção é fornecer: um polipeptídeo dimérico no qual um monômero compreendendo um fragmento de receptor de interferon ou um fragmento Fc de anticorpo está ligado, em que o monômero é um polipeptídeo selecionado a partir do grupo que consiste em (i), (ii) e (iii): (i) um monômero compreendendo um fragmento de receptor de interferon 1 (IFNAR1) e um fragmento Fc de anticorpo; (ii) um monômero compreendendo um fragmento de receptor de interferon 2 (IFNAR2) e um fragmento Fc de anticorpo; e (iii) um fragmento Fc de anticorpo.

[012] Outro objetivo da presente invenção é fornecer um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo.

[013] Outro objetivo da presente invenção é fornecer um vetor compreendendo o polinucleotídeo.

[014] Outro objetivo da presente invenção é fornecer uma célula hospedeira transformada com o vetor.

[015] Outro objetivo da presente invenção é fornecer um método para produzir o polipeptídeo, compreendendo: (a) fornecer a célula hospedeira; (b) cultivar as células fornecidas; e (c) preparar o polipeptídeo recuperando o polipeptídeo da célula ou meio de cultura.

[016] Outro objetivo da presente invenção é: - fornecer uma composição farmacêutica para prevenir ou tratar uma doença ou distúrbio mediado por interferon tipo 1, compreendendo um polipeptídeo como um ingrediente ativo; - também, fornecer uma composição farmacêutica para prevenir ou tratar uma doença ou distúrbio mediado por interferon tipo 1, consistindo em um polipeptídeo como um ingrediente ativo; - também, fornecer uma composição farmacêutica para prevenir ou tratar uma doença ou distúrbio mediado por interferon tipo 1, consistindo essencialmente em um polipeptídeo como um ingrediente ativo.

[017] Outro objetivo da presente invenção é fornecer um uso do polipeptídeo para a preparação de um agente para a prevenção ou tratamento de uma doença ou distúrbio mediado por interferon tipo 1.

[018] Outro objetivo da presente invenção é fornecer um método para tratar uma doença ou distúrbio mediado por interferon tipo 1, compreendendo administrar a um sujeito, em necessidade do mesmo, uma quantidade eficaz de uma composição compreendendo o polipeptídeo como um ingrediente ativo

SOLUÇÃO TÉCNICA

[019] Consequentemente, a presente invenção, a fim de alcançar o objetivo da presente invenção, fornece um polipeptídeo dimérico no qual um monômero compreendendo um fragmento de receptor de interferon ou um fragmento Fc de anticorpo está ligado, em que o monômero é um polipeptídeo selecionado a partir do grupo que consiste em (i), (ii) e (iii): (i) um monômero compreendendo um fragmento de receptor de interferon 1 (IFNAR1) e um fragmento Fc de anticorpo; (ii) um monômero compreendendo um fragmento de receptor de interferon 2 (IFNAR2) e um fragmento Fc de anticorpo; e (iii) um fragmento Fc de anticorpo.

[020] A fim de alcançar outro objetivo da presente invenção, a presente invenção fornece um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo.

[021] A fim de alcançar outro objetivo da presente invenção, a presente invenção fornece um vetor que compreende o polinucleotídeo.

[022] A fim de alcançar outro objetivo da presente invenção, a presente invenção fornece uma célula hospedeira transformada com o vetor.

[023] A fim de alcançar outro objetivo da presente invenção, a presente invenção fornece um método para produzir o polipeptídeo, compreendendo: (a) fornecer a célula hospedeira; (b) cultivar as células fornecidas; e (c) preparar o polipeptídeo recuperando o polipeptídeo da célula ou meio de cultura.

[024] A fim de alcançar outro objetivo da presente invenção, a presente invenção fornece uma composição farmacêutica para prevenção ou tratamento de doenças ou distúrbios mediados por interferon tipo 1, compreendendo o polipeptídeo como um ingrediente ativo.

[025] Além disso, fornece uma composição farmacêutica para prevenir ou tratar uma doença ou distúrbio mediado por interferon tipo 1, que consiste em um polipeptídeo como um ingrediente ativo.

[026] Além disso, fornece uma composição farmacêutica para prevenir ou tratar uma doença ou distúrbio mediado por interferon tipo 1, que consiste essencialmente em um polipeptídeo como um ingrediente ativo.

[027] A fim de alcançar outro objetivo da presente invenção, a presente invenção fornece um uso do polipeptídeo para a preparação de um agente para a prevenção ou tratamento de uma doença ou distúrbio mediado por interferon tipo 1.

[028] A fim de alcançar outro objetivo da presente invenção, a presente invenção fornece um método de tratamento de uma doença ou distúrbio mediado por interferon tipo 1, compreendendo administrar a um sujeito, em necessidade do mesmo, uma quantidade eficaz de uma composição compreendendo o polipeptídeo como um ingrediente ativo.

[029] A seguir, a presente invenção será descrita em detalhes.

[030] Portanto, a presente invenção é um polipeptídeo dimérico em que um monômero compreendendo um fragmento de receptor de interferon ou um fragmento Fc de anticorpo está ligado, em que o monômero fornece um polipeptídeo selecionado a partir do grupo que consiste em (i), (ii) e (iii): (i) um monômero compreendendo um fragmento de receptor de interferon 1 (IFNAR1) e um fragmento Fc de anticorpo; (ii) um monômero compreendendo um fragmento de receptor de interferon 2 (IFNAR2) e um fragmento Fc de anticorpo; e (iii) um fragmento Fc de anticorpo.

[031] No presente relatório descritivo, incluindo as reivindicações, o termo “fragmento de receptor de interferon” pretende incluir todos os polipeptídeos possuindo atividade de receptor de interferon humano, embora possuindo toda ou parte de uma sequência de aminoácidos derivada de um receptor de interferon humano nativo.

[032] Os termos “receptor de interferon 1”, “IFNAR 1” e “antígeno IFNAR-1” são usados de forma intercambiável, e variantes, isoformas, isoformas de espécies de IFNAR 1 humano e análogos com pelo menos um epítopo comum de IFNAR 1 estão incluídos. Assim, os polipeptídeos da invenção podem, em alguns casos, apresentar reação cruzada com IFNAR 1 de outras espécies não humanas ou outras proteínas estruturalmente associadas ao IFNAR 1 humano (por exemplo, homólogos de IFNAR-1 humano). Em outros casos, o polipeptídeo pode ser intactamente específico para IFNAR-1 humano e não representa uma espécie ou outro tipo de reatividade cruzada. A sequência de cDNA completa do IFNAR 1 humano tem o número de acesso ao GenBank XM_005260964.2, NM_000629.2 ou XM_011529552.2.

[033] A sequência de nucleotídeos utilizada na presente invenção pode incluir o domínio extracelular (28-436a.a.; P17181-1) da sequência de IFNAR 1 Isoforma 1 (número de acesso ao GenBank: NM_000629.2), e pode incluir uma parte da sequência de nucleotídeos. O fragmento IFNAR 1 da presente invenção pode ser preferencialmente um receptor de interferon 1 compreendendo a sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 4, mais preferencialmente, pode ser um receptor de interferon 1 consistindo na sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 4.

[034] Em uma forma de realização da presente invenção, o polipeptídeo foi preparado usando o receptor de interferon 1 compreendendo a sequência de aminoácidos (sequência polinucleotídica representada por SEQ ID NO: 3 - A sequência polinucleotídica pode incluir um códon de parada.

Doravante, é o mesmo para todas as sequências de DNA) representadas por SEQ ID NO: 4.

[035] Os termos “receptor de interferon 2”, “IFNAR 2” e “antígeno

IFNAR-2” são usados de forma intercambiável, e variantes, isoformas, isoformas de espécies de IFNAR 2 humano e análogos com pelo menos um epítopo comum de IFNAR 2 estão incluídos. Assim, os polipeptídeos da invenção podem, em alguns casos, apresentar reação cruzada com IFNAR 2 de outras espécies não humanas ou outras proteínas estruturalmente relacionadas ao IFNAR 2 humano (por exemplo, homólogos de IFNAR-2 humano). Em outros casos, o polipeptídeo pode ser intactamente específico para IFNAR-2 humano e não representa uma espécie ou outro tipo de reatividade cruzada. A sequência de cDNA completa do IFNAR 2 humano tem o número de acesso ao GenBank NM_000874.4, NM_001289125.1, ou NM_001289126.1. A sequência de nucleotídeos usada na presente invenção pode incluir o domínio extracelular (27-243a.a.; P48551-1) da sequência da Isoforma 1 do IFNAR2 humano (número de acesso ao GenBank: NM_001289125.1), pode incluir uma parte da sequência de nucleotídeos. O fragmento IFNAR 2 da presente invenção pode ser preferencialmente um receptor de interferon 2 compreendendo a sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 6, mais preferencialmente, pode ser um receptor de interferon 2 consistindo na sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 6.

[036] Em uma forma de realização da presente invenção, o polipeptídeo foi preparado utilizando um fragmento de receptor de interferon 2 compreendendo a sequência de aminoácidos (sequência polinucleotídica representada por SEQ ID NO: 5) representada por SEQ ID NO: 6.

[037] Além disso, o termo “polipeptídeo possuindo toda ou parte de uma sequência de aminoácidos derivada de um fragmento de receptor de interferon” pretende incluir um polipeptídeo compreendendo toda ou uma parte substancial da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 6, que é a sequência de aminoácidos de um fragmento de receptor de interferon nativo, ou um polipeptídeo substancialmente semelhante a esse polipeptídeo.

[038] Aqui, o “polipeptídeo compreendendo uma parte substancial de toda a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 6” é definido como um polipeptídeo possuindo uma atividade igual ou superior à do receptor de interferon nativo tendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 6, ou uma parte da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 6 compreendendo um ou mais aminoácidos substituídos, embora ainda retendo a atividade do receptor de interferon, embora com baixa atividade. O “polipeptídeo substancialmente semelhante a toda ou uma parte substancial da sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 6” é definido como um polipeptídeo possuindo uma atividade igual ou superior à do receptor de interferon da SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 6, ou a totalidade ou uma parte substancial da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 6 compreendendo um ou mais aminoácidos substituídos, embora ainda retendo a atividade do receptor de interferon, embora com baixa atividade.

[039] Pode haver casos em que uma porção N-terminal e/ou uma porção C-terminal são deletadas em um polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 6 como um polipeptídeo compreendendo uma parte substancial de toda a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 6, e pode haver casos em que mesmo se um ou mais aminoácidos forem substituídos, se o aminoácido antes da substituição for quimicamente equivalente ao aminoácido substituído, por exemplo, quando a alanina, que é um aminoácido hidrofóbico, é substituída por outro aminoácido hidrofóbico, em particular, um caso em que é substituído por um aminoácido mais hidrofóbico, por exemplo, valina, leucina ou isoleucina, como um polipeptídeo substancialmente semelhante a toda ou uma parte substancial da sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO:6.

[040] Na presente invenção, “fusão” refere-se à integração de duas moléculas com função ou estrutura diferente ou igual, e pode ser fusão por qualquer método físico, químico ou biológico capaz de ligar a porção Fc do anticorpo ou cada monômero ao receptor de interferon.

[041] A fusão é preferencialmente por um peptídeo ligante, que pode se ligar, por exemplo, ao C-terminal de um fragmento Fc de um anticorpo.

[042] “Fragmento Fc de anticorpo” pode ser um fragmento Fc de um anticorpo IgA, IgM, IgE, IgD ou IgG, ou uma modificação do mesmo. Em uma forma de realização, o fragmento é um fragmento Fc (por exemplo, fragmento Fc de um anticorpo IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3 ou IgG4) de um anticorpo IgG. Além disso, o polipeptídeo compreendendo o fragmento Fc da presente invenção pode ser parcial ou totalmente glicosilado ou não glicosilado.

Além disso, o polipeptídeo pode incluir uma ou mais regiões derivadas de um anticorpo além do fragmento Fc. Além disso, o polipeptídeo pode incluir um domínio de ligação ao antígeno derivado de um anticorpo e uma pluralidade de polipeptídeos pode formar um anticorpo ou proteína semelhante a um anticorpo.

[043] No presente relatório descritivo, o número de resíduos de aminoácidos de fragmentos Fc de anticorpo está de acordo com o sistema de numeração Kabat comumente usado na técnica (número de índice EU como em Kabat et al., em Proteins of Immunological Interest, 5ª Ed., Departamento de Saúde e Serviços Humanos dos EUA, NIH Publication No. 91-3242, 1991).

[044] De acordo com uma forma de realização da presente invenção, pode incluir o fragmento Fc de tipo selvagem da presente invenção, bem como uma variante Fc substituída.

[045] A sequência do fragmento Fc de tipo selvagem da presente invenção pode compreender o aminoácido representado por SEQ ID NO: 8 e,

de preferência, pode consistir no aminoácido representado por SEQ ID NO: 8.

[046] O fragmento Fc substituído da presente invenção compreende uma ou mais substituições de aminoácidos selecionadas a partir do grupo que consiste em Q347R, K360E, D399V, F405T e K409W, de acordo com o sistema de numeração Kabat.

[047] O fragmento Fc substituído da presente invenção pode ser um compreendendo substituições de aminoácidos K360E e K409W, de preferência, pode compreender a sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 12, mais preferencialmente, pode consistir na sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 12.

[048] O fragmento Fc substituído da presente invenção pode ser um compreendendo substituições de aminoácidos Q347R, D399V e F405T, de preferência, pode consistir na sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 14, mais preferencialmente, pode consistir em SEQ ID NO: 14.

[049] Além disso, o fragmento Fc de anticorpo como um monômero formando um dímero compreende SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 12 ou SEQ ID NO: 14, e um ligante ou outro peptídeo de fragmento curto pode ser anexado ao N-terminal ou C-terminal. O ligante pode ser um ligante compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 34 e SEQ ID NO: 53 a SEQ ID NO: 76. O fragmento Fc de anticorpo como um monômero pode consistem em uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38 e SEQ ID NO: 40.

[050] O “monômero compreendendo fragmento de receptor de interferon 1 (IFNAR1) e fragmento Fc de anticorpo” da presente invenção, preferencialmente, pode ser um compreendendo i) um fragmento de receptor de interferon 1 (IFNAR1) compreendendo a sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 4 e ii) um fragmento Fc de anticorpo compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 12 e SEQ ID NO: 14, mais preferencialmente, pode ser um compreendendo i) um fragmento de receptor de interferon 1 (IFNAR1) compreendendo a sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 4, ii) um ligante compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 34 e SEQ ID NO: 53 a SEQ ID NO: 76, e iii) um fragmento Fc de anticorpo compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 12 e SEQ ID NO:14, mais preferencialmente, pode ser um monômero compreendendo ou consistindo em um aminoácido selecionado a partir do grupo consistindo em SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44 e SEQ ID NO: 46.

[051] O “monômero compreendendo o fragmento de receptor de interferon 2 (IFNAR2) e o fragmento Fc de anticorpo” da presente invenção é preferencialmente um compreendendo i) um fragmento de receptor de interferon 2 (IFNAR2) compreendendo a sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 6 e ii) um fragmento Fc de anticorpo compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 12 e SEQ ID NO: 14, mais preferencialmente, pode ser um compreendendo i) um fragmento de receptor de interferon 2 (IFNAR2) compreendendo a sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 6, ii) um ligante compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 53 a SEQ ID NO: 76 e iii) um fragmento Fc de anticorpo compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO:12 e SEQ ID NO: 14,

mais preferencialmente, pode ser um monômero compreendendo ou consistindo em aminoácidos selecionados a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50 e SEQ ID NO: 52.

[052] O polipeptídeo da presente invenção pode ser um que neutraliza o interferon tipo I e, portanto, pode ser usado como um anticorpo neutralizante de interferon tipo I.

[053] Conforme usado neste documento, o termo “interferon tipo I” se destina a referir-se ao grupo de interferon de classe I múltiplo (isto é, grupos de interferon tipo I múltiplos de moléculas capazes de se ligar a IFNAR 1 ou IFNAR 2) de moléculas que são ligantes de IFNAR 1 e IFNAR 2.

Exemplos de ligantes de interferon tipo I são interferon alfa 1, 2a, 2b, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 14, 16, 17, 21, interferon beta, interferon ômega e interferon épsilon.

[054] Um técnico no assunto pode usar os polipeptídeos descritos acima, sem limitação na prática da presente invenção.

[055] A presente invenção também fornece um polipeptídeo dimérico em que o monômero está ligado ao anticorpo ou fragmento do mesmo por um ligante peptídico. Um ligante peptídico refere-se a uma molécula que conecta duas ou mais substâncias separadas entre si como um pequeno fragmento de aminoácidos ou análogos de aminoácidos em que aminoácidos ou substâncias semelhantes a aminoácidos estão ligados uns aos outros por ligações peptídicas. Glicina, serina e alanina são usadas como aminoácidos constituintes principais, de modo que um ligante de glicina-serina, um ligante de glicina-serina-alanina etc. pode ser usado, e de acordo com uma forma de realização preferida da presente invenção, o ligante pode consistir em ou compreendem uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 8 e SEQ ID NO: 10.

[056] Os polipeptídeos da presente invenção podem compreender preferencialmente uma sequência de ligante flexível inserida entre os monômeros.

[057] O ligante refere-se a um ligante peptídico derivado naturalmente ou um ligante peptídico derivado sinteticamente. O ligante peptídico consiste em uma cadeia de aminoácidos linear, em que os 20 aminoácidos de ocorrência natural são blocos de construção monoméricos. O ligante pode ter uma sequência de aminoácidos repetitiva ou pode ter a sequência de um polipeptídeo de ocorrência natural, por exemplo, um polipeptídeo com uma função de dobradiça. Uma vez que todos os ligantes peptídicos podem ser codificados por moléculas de ácido nucleico, eles podem ser expressos em um método recombinante. Uma vez que o ligante é ele próprio um peptídeo, cada monômero pode ser ligado ao ligante por meio de uma ligação peptídica para formar um dímero.

[058] O ligante consiste em aminoácidos ligados entre si por ligações peptídicas, de preferência 1 a 20 aminoácidos ligados entre si por ligações peptídicas, neste caso, o aminoácido é preferencialmente selecionado entre 20 aminoácidos naturais. Um ou mais destes aminoácidos são glicosilados como entendido por um técnico no assunto. De preferência, mas não limitado a, 1 a 20 aminoácidos são selecionados entre glicina, alanina, prolina, asparagina, glutamina e lisina.

[059] Os ligantes adequados incluem, por exemplo, ligantes cliváveis e ligantes não cliváveis. Os ligantes cliváveis são tipicamente facilmente clivados em condições intracelulares. Ligantes cliváveis adequados incluem, por exemplo, ligantes peptídicos cliváveis por proteases intracelulares, tais como proteases lisossomais ou proteases endossômicas.

[060] O ligante é, por exemplo, o N-terminal do ligante está conectado ao C-terminal do receptor de interferon. A ligação ao C-terminal do receptor de interferon pode, de preferência, ser diretamente ligada ao anticorpo expresso pelo vetor de expressão, uma vez que a sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de ligante está ligada ao vetor de expressão que expressa a proteína da presente invenção de modo que o quadro de expressão de proteína coincide. Além disso, o N-terminal da porção Fc do anticorpo da presente invenção está ligado ao C-terminal do ligante.

[061] O ligante peptídico da presente invenção pode ser um ligante peptídico conhecido na técnica, mas de preferência um ligante glicina- serina, um ligante peptídico formador de hélice ou um ligante peptídico compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 ou SEQ ID NO: 10.

[062] O ligante é, de preferência, um ligante gly-ser, por exemplo tipo (GlyxSery)z (x é um número inteiro de 1 a 5, y é um número inteiro de 1 a 2, z é um número inteiro de 1 a 6), por exemplo (gly4ser1)3 ou (gly3ser2)3, no caso de um ligante peptídico formador de hélice (ou ligante helicoidal rígido), pode ser A(EAAAK)nA (n = um número inteiro de 2 a 5).

[063] De preferência, o ligante peptídico da presente invenção pode ser GGGGS, (GGGGS)3, (GGGGS)n (n = 1, 2, 4), (Gly)6, (Gly)8, AEAAAKEAAAKA, A(EAAAK)4ALEA(EAAAK)4A, (EAAAK)3, EAAAK, (EAAAK)2, (Ala-Pro)n (n é 5 a 17, comprimento de 10 a 34 aa), PAPAP, e pode ser um ligante peptídico que consiste em uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 34 e SEQ ID NO: 53 a SEQ ID NO: 76.

[064] Na presente invenção, o ligante peptídico pode ser adequadamente construído por sobreposição dos ligantes peptídicos exemplificados acima ou em combinação com outros ligantes, se necessário.

[065] Para heterodimerização de Fc na presente invenção, podem ser utilizadas técnicas de heterodimerização de Fc conhecidas na técnica. A tecnologia de heterodimerização de Fc é mostrada na Tabela 1 abaixo.

TABELA 1 Estratégia Domínio CH3 1 Domínio CH3 2 Protuberâncias-em-orifícios T366Y Y407T (“knobs-into-holes”) (Y-T) Protuberâncias-em-orifícios (CW- Y349C, T366S, L368A, S354C, T366W CSAV) Y407V HA-TF S364H, F405A Y349T, T394F ZW1 (VYAV-VLLW) T350V, L351Y, F405A, Y407V T350V, T366L, K392L, T394W Pares de carga CH3 (DD-KK) K392D, K409D E356K, D399K Dobradiça IgG1 / pares de carga IgG1: D221E, P228E, L368E IgG1: D221R, P228R, K409R CH3 (EEE-RRR) Dobradiça IgG2/ pares de carga IgG2: C223R, E225R, P228R, IgG2: C223E, P228E, L368E CH3 (EEE-RRRR) K409R EW-RVT K360E, K409W, Q347R, D399V, F405T Q347R, D399V, F405T, EW-RVTS-S K360E, K409W, Y349C S354C 351D ou E ou D em 349, 368, Biclonic 366K (+351K) 349, ou 349 + 355 DuoBody (L-R) F405L K409R SEEDbody Quimera IgG/A Quimera IgG/A BEAT Resíduos da interface TCRα Resíduos da interface TCRβ E345R, Q347R, T366V,

7.8.60 (DMA-RRVV) K360D, D399M, Y407A K409V Y349S, K370Y, T366M, E356G, E357D, S364Q,

20.8.34 (SYMV-GDQA) K409V Y407A

[066] A presente invenção também fornece um polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 6, respectivamente ou todo o polipeptídeo.

[067] Além disso, a presente invenção fornece: (a) um monômero compreendendo um fragmento de receptor de interferon 1 e um fragmento Fc de anticorpo representado pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4; (b) um polipeptídeo dimérico compreendendo um monômero compreendendo um fragmento de receptor de interferon 2 e fragmento Fc de anticorpo representado pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6.

[068] O monômero (a) compreende um fragmento de receptor de interferon 1 e um fragmento Fc de anticorpo representado pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, de preferência, pode consistir em ou compreender uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44 e SEQ ID NO: 46.

[069] O monômero (b) compreende um fragmento de receptor de interferon 2 e um fragmento Fc de anticorpo representado pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, de preferência, pode consistir em ou compreender uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50 e SEQ ID NO: 52.

[070] O polipeptídeo da presente invenção pode ser preferencialmente um anticorpo que medeia o interferon tipo 1.

[071] A presente invenção também fornece um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo.

[072] Na presente invenção, 'polinucleotídeo' ou 'ácido nucleico' refere-se a ácido desoxirribonucleico (DNA) ou ácido ribonucleico (RNA) na forma de fita simples ou dupla. A menos que de outra forma limitado, análogos conhecidos de nucleotídeos naturais que hibridizam a ácidos nucleicos de uma maneira análoga aos nucleotídeos de ocorrência natural também estão incluídos.

[073] Um monômero compreendendo um fragmento de receptor de interferon 1 e um fragmento Fc de anticorpo representado pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, de preferência, pode consistir em ou compreender uma sequência de DNA selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43 e SEQ ID NO: 45.

[074] Um monômero compreendendo um fragmento de receptor de interferon 2 e um fragmento Fc de anticorpo representado pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, de preferência, pode consistir em ou compreender uma sequência de DNA selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49 e SEQ ID NO: 51.

[075] O polinucleotídeo pode ser usado sem limitação, desde que codifique o polipeptídeo da presente invenção e inclua todas as sequências de DNA, cDNA e RNA. Refere-se a um polinucleotídeo que codifica um peptídeo possuindo uma sequência de aminoácidos representada pela sequência ou possuindo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70% de homologia com a sequência de aminoácidos, pode ser isolado da natureza ou preparado por métodos de engenharia genética conhecidos na arte.

[076] A presente invenção também fornece um vetor que compreende o polinucleotídeo.

[077] O vetor refere-se a um vetor de expressão preparado por técnicos no assunto para expressar o polipeptídeo da presente invenção inserindo o polinucleotídeo da presente invenção no vetor de acordo com qualquer método conhecido na técnica e usando sequências de controle de transcrição/ tradução apropriadas.

[078] A sequência polinucleotídica clonada de acordo com a presente invenção pode ser operacionalmente ligada a uma sequência de controle de expressão apropriada, e a sequência de gene operacionalmente ligada e a sequência de controle de expressão podem ser incluídas em um vetor de expressão incluindo um marcador de seleção e uma origem de replicação. “Ligado operacionalmente” significa que a sequência polinucleotídica está ligada a sequências de controle de expressão de modo a permitir a expressão gênica. A 'sequência de controle de expressão' refere-se a uma sequência de DNA que controla a expressão de uma sequência polinucleotídica operacionalmente ligada em uma célula hospedeira específica.

Essas sequências regulatórias podem compreender uma ou mais selecionadas a partir do grupo que consiste em um promotor para efetuar a transcrição, uma sequência de operador opcional para regular a transcrição, sequências que codificam locais de ligação de lipossoma de mRNA adequados e sequências que controlam a terminação da transcrição e tradução e semelhantes.

[079] O vetor usado como o vetor parental do vetor de expressão não é particularmente limitado, todos os plasmídeos, vírus ou outros mediadores comumente usados para a expressão em microrganismos usados como células hospedeiras na técnica à qual a presente invenção pertence podem ser usados. Por exemplo, o plasmídeo inclui plasmídeos derivados de E. coli (pBR322, pBR325, pUC118 e pUC119, pET-22b(+)), plasmídeos derivados de Bacillus subtilis (pUB110 e pTP5) e plasmídeos derivados de levedura (YEp13, YEp24 e YCp50) e semelhantes, o vírus pode ser usado por um vírus animal, tal como retrovírus, adenovírus ou vírus vaccinia, vírus de inseto, tais como baculovírus e semelhantes, mas não se limita a isso.

[080] A presente invenção também fornece uma célula hospedeira transformada com o vetor.

[081] A célula hospedeira pode escolher modular a expressão da sequência inserida ou processar o produto do gene da maneira particular desejada. Diferentes células hospedeiras têm mecanismos característicos e específicos para tradução e processamento pós-traducional e modificação de proteínas. Linhagens celulares ou sistemas hospedeiros adequados podem ser selecionados para fornecer a modificação e processamento desejados da proteína heteróloga expressa. A expressão em leveduras pode produzir produtos biologicamente ativos. A expressão em células eucarióticas pode aumentar a probabilidade de dobramento “nativo”.

[082] Como uma célula hospedeira capaz de clonar e expressar de forma estável e contínua o vetor da presente invenção, pode ser usada em qualquer célula hospedeira conhecida na técnica, por exemplo, E. coli JM109,

E. coli BL21DE, E. coli DH5, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110 e semelhantes podem ser usados, além disso, cepas do gênero Agrobacterium, tais como Agrobacterium A4, Bacilli, tais como Bacillus subtilis, outras bactérias intestinais e várias cepas do gênero Pseudomonas, como Salmonella typhimurium ou Serratia marcescens, podem ser usadas como células hospedeiras.

[083] Além disso, quando o vetor da presente invenção é transfectado em células eucarióticas, como células hospedeiras, levedura (Saccharomyces cerevisiae), células de inseto e células humanas (por exemplo, linhagens celulares CHO (ovário de hamster chinês), linhagens celulares Expi293, W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN e MDCK) e semelhantes podem ser utilizadas.

[084] Na presente invenção, a célula hospedeira pode ser preferencialmente linhagem celular Expi293 ou CHO.

[085] O método para transfectar a célula hospedeira através da entrega do vetor na célula hospedeira pode ser qualquer método conhecido e não é particularmente limitado. Por exemplo, a transfecção pode ser realizada por bombardeamento de genes, policátion e transfecção mediada por receptor usando precipitação com fosfato de cálcio, método DEAE-dextrano, método de eletroporação, método de microinjeção direta, método de lipossoma carregado com DNA, método do complexo lipofectamina-DNA, método de sonicação celular (sonicação celular), microprojétil de alta velocidade. Algumas dessas técnicas podem ser melhoradas para uso in vivo ou ex vivo.

[086] A presente invenção também fornece um método para produzir um polipeptídeo dimérico compreendendo a etapa de (a) fornecer uma célula hospedeira, (b) cultivar a célula fornecida e (c) preparar o polipeptídeo da presente invenção recuperando o polipeptídeo da célula ou meio de cultura.

[087] A cultura das células transformadas é realizada em condições adequadas que permitem a expressão da proteína de fusão (ou polipeptídeo de fusão), estas condições podem ser realizadas de acordo com métodos bem conhecidos dos técnicos no assunto. As células transformadas podem ser cultivadas em grandes quantidades por métodos de cultura convencionais. Como meio de cultura, um meio composto por uma fonte de carbono, uma fonte de nitrogênio, vitaminas e minerais pode ser usado, por exemplo, o meio 2XYT pode ser usado. A cultura de células é possível em condições normais de cultura de células, por exemplo, pode ser cultivada por 10 horas a 40 horas em uma faixa de temperatura de 15 °C a 45 °C. Para remover as células do meio de cultura e recuperar apenas o meio de cultura, pode ser realizada uma centrifugação ou filtração. Estas etapas podem ser realizadas por técnicos no assunto conforme necessário. O meio de cultura (filtrado) do qual as células foram retiradas pode ser refrigerado de acordo com um método convencional e armazenado por um curto período de tempo para não perder a sua atividade.

[088] A proteína de fusão expressa na célula transformada (ou transformante) pode ser purificada de uma maneira convencional, por exemplo, a proteína de fusão da presente invenção pode ser purificada pela aplicação de técnicas tais como precipitação por sais (salting out) (por exemplo, precipitação com sulfato de amônio, precipitação com fosfato de sódio), cromatografia em coluna e ultrafiltração, como precipitação com solvente (precipitação da fração de proteína usando acetona, etanol etc.), diálise, filtração em gel, troca iônica, cromatografia em coluna de fase reversa, cromatografia de afinidade sozinha ou em combinação.

[089] O receptor de interferon da presente invenção é uma proteína hiperglicosilada contendo uma grande quantidade de glicosilação durante a modificação pós-traducional e a cultura microbiana pode não ser adequada porque o açúcar correspondente causa problemas de estabilidade estrutural. Consequentemente, o polipeptídeo da presente invenção pode ser preferencialmente uma célula hospedeira de uma célula animal.

[090] Consequentemente, a presente invenção fornece uma composição farmacêutica para prevenir ou tratar uma doença ou distúrbio mediado por interferon tipo 1, compreendendo um polipeptídeo como um ingrediente ativo.

[091] “Doença ou distúrbio mediado por interferon tipo 1”, de acordo com a presente invenção, refere-se a uma doença ou distúrbio mediado por interferon tipo 1 ou uma doença associada à expressão anormal (por exemplo, superexpressão ou inibição da expressão) de um gene induzível por interferon, exemplos incluem, mas não estão limitados a lúpus eritematoso sistêmico (LES, J Immunol. 15 de junho de 2014; 192(12): 5459–5468.) síndrome de Sjögren (Autoimmun Rev. 2013 Mar; 12(5): 558-66.), diabetes mellitus insulino-dependente (DMID), doença inflamatória intestinal (DII) (incluindo doença de Crohn, colite ulcerativa e doença celíaca), esclerose múltipla (EM), psoríase, tireoidite autoimune, artrite reumatóide (AR, Front Immunol. 2017; 8: 2007.), miosite inflamatória (Arthritis Rheum 2009; 60:

181524.; Mol Med 2007;13:5968.) e glomerulonefrite. Além disso, a composição da presente invenção pode ser usada para a inibição ou prevenção da rejeição de transplante ou para o tratamento da reação de enxerto contra hospedeiro (GVHD) ou para o tratamento de infecção por HIV/ AIDS.

[092] Entretanto, a composição farmacêutica de acordo com a presente invenção pode ser fornecida formulando o polipeptídeo em uma forma pura ou em uma forma adequada juntamente com um veículo farmaceuticamente aceitável. 'Farmaceuticamente aceitável' refere-se a uma composição não tóxica que é fisiologicamente aceitável e normalmente não causa reações alérgicas, tais como distúrbios gastrointestinais, tonturas ou reações semelhantes quando administrada a humanos. O veículo inclui todos os tipos de solventes, meios de dispersão, emulsões óleo-em-água ou água- em-óleo, composições aquosas, lipossomas, microesferas e microssomas.

[093] Entretanto, a composição farmacêutica de acordo com a presente invenção pode ser formulada com um veículo adequado dependendo da via de administração. A via de administração da composição farmacêutica de acordo com a presente invenção não está limitada à mesma, mas pode ser administrada por via oral ou parenteral. As vias parenterais de administração incluem vias múltiplas, tais como, por exemplo, transdérmica, nasal, intraperitoneal, intramuscular, subcutânea ou intravenosa.

[094] Quando a composição farmacêutica da presente invenção é administrada por via oral, a composição farmacêutica da presente invenção pode ser formulada na forma de pó, grânulos, comprimidos, pílulas, drágeas, cápsulas, líquidos, géis, xaropes, suspensões, pastilhas e semelhantes de acordo com um método conhecido na técnica juntamente com um veículo adequado para administração oral. Exemplos de veículos adequados podem ser incluídos em açúcares, incluindo lactose, dextrose, sacarose, sorbitol, manitol, xilitol, eritritol e maltitol e semelhantes, e amidos, incluindo amido de milho, amido de trigo, amido de arroz e amido de batata e semelhantes, celuloses incluindo celulose, metilcelulose, carboximetilcelulose de sódio e hidroxipropilmetilcelulose e semelhantes, e semelhantes, cargas, tais como gelatina, polivinilpirrolidona e semelhantes. Além disso, polivinilpirrolidona reticulada, ágar, ácido algínico ou alginato de sódio podem ser adicionados como um desintegrante, se necessário. Além disso, a composição farmacêutica pode incluir ainda um agente antiagregante, um lubrificante, um agente umectante, um agente aromatizante, um agente emulsificante e um conservante e semelhantes.

[095] Além disso, quando administrada por via parenteral, a composição farmacêutica da presente invenção pode ser formulada de acordo com métodos conhecidos na técnica na forma de injeções, administrações transdérmicas e inalantes nasais juntamente com veículos parenterais adequados. No caso da injeção, deve ser esterilizada e protegida da contaminação de microrganismos como bactérias e fungos. Para injeção, exemplos de veículos adequados podem incluir, mas não estão limitados a, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propilenoglicol e polietilenoglicol líquido etc.), misturas dos mesmos e/ou um solvente ou meio de dispersão contendo óleo vegetal. Mais preferencialmente, como um veículo adequado, podem ser usados solução de Hanks, solução de Ringer, uma solução isotônica, tal como solução salina tamponada com fosfato (PBS) ou água estéril para injeção, etanol a 10%, propilenoglicol a 40% e dextrose a 5% com trietanolamina e semelhantes. A fim de proteger a injeção de contaminação microbiana, pode ainda incluir vários agentes antibacterianos e antifúngicos, tais como parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal e semelhantes. Além disso, na maioria dos casos, a injeção pode conter ainda um agente isotônico, tal como açúcar ou cloreto de sódio.

[096] No caso de administração transdérmica, estão incluídas formas como pomada, creme, loção, gel, solução externa, massa, linimento e ar. Tal como aqui utilizado, “administração transdérmica” significa que uma quantidade eficaz do ingrediente ativo contido na composição farmacêutica é distribuída na pele por administração tópica da composição farmacêutica na pele. Essas formulações são descritas em formulários comumente conhecidos em química farmacêutica.

[097] Para administração por inalação, os compostos para uso de acordo com a invenção podem ser convenientemente administrados na forma de um spray de aerossol a partir de uma embalagem pressurizada ou nebulizador usando um propelente adequado, por exemplo diclorofluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, dióxido de carbono ou outro gás adequado. No caso de um aerossol pressurizado, a unidade de dosagem pode ser determinada fornecendo uma válvula para distribuir uma quantidade medida. Por exemplo, cápsulas de gelatina e cartuchos usados em inaladores ou insufladores podem ser formulados para conter uma mistura de pó do composto e uma base de pó adequada, tal como lactose ou amido. Como outros veículos farmaceuticamente aceitáveis, aqueles conhecidos na técnica podem ser indicados.

[098] Além disso, a composição farmacêutica de acordo com a presente invenção pode compreender ainda um ou mais tampões (por exemplo, solução salina ou PBS), carboidrato (por exemplo, glicose, manose, sacarose ou dextrano), estabilizador (bissulfito de sódio, sulfito de sódio ou ácido ascórbico) antioxidante, bacteriostático, agente quelante (por exemplo, EDTA ou glutationa), adjuvantes (por exemplo, hidróxido de alumínio), agentes de suspensão, agentes espessantes e/ou conservantes (cloreto de benzalcônio, metil- ou propil-parabeno e clorobutanol).

[099] Além disso, as composições farmacêuticas da presente invenção podem ser formuladas usando métodos conhecidos na técnica para fornecer liberação rápida, prolongada ou retardada do ingrediente ativo após administração a um mamífero.

[0100] A composição farmacêutica formulada da maneira acima pode ser administrada em uma quantidade eficaz através de várias vias incluindo oral, transdérmica, subcutânea, intravenosa ou intramuscular.

Conforme usado neste documento, o termo 'quantidade eficaz' refere-se a uma quantidade de um composto ou extrato que permite o monitoramento de efeitos diagnósticos ou terapêuticos quando administrado a um paciente. A dosagem da composição farmacêutica de acordo com a presente invenção pode ser apropriadamente selecionada de acordo com a via de administração, o alvo da administração, a doença alvo e sua gravidade, idade, sexo, peso corporal, diferenças individuais e estado da doença. De preferência, a composição farmacêutica que compreende o polipeptídeo da presente invenção pode variar o teor do ingrediente ativo, dependendo da gravidade da doença, mas, em geral, com base em um adulto, pode ser administrada repetidamente várias vezes ao dia em uma dose eficaz de 10 µg a 10 mg quando administrada uma vez.

[0101] Além disso, a presente invenção fornece uma vacina compreendendo um polipeptídeo como um ingrediente ativo, e a vacina de acordo com a presente invenção é uma vacina para prevenir ou tratar uma doença ou distúrbio mediado por interferon tipo 1.

[0102] Conforme usado neste documento, o termo “vacina” se refere a uma substância imunogênica ou antigênica que induz imunidade em um corpo vivo por injeção ou administração oral a uma pessoa ou animal para a prevenção de infecção como um agente biológico contendo um antígeno que dá imunidade a um corpo vivo. A imunidade in vivo é amplamente dividida em imunidade automática, que é obtida automaticamente após a infecção por um patógeno, e imunidade passiva, que é obtida por uma vacina injetada externamente. Enquanto a autoimunidade é caracterizada por um longo período de produção de anticorpos relacionados à imunidade e imunidade contínua, a imunidade passiva por vacina atua imediatamente no tratamento da infecção, mas tem a desvantagem de pouca durabilidade.

[0103] A composição de vacina da presente invenção pode incluir um veículo farmaceuticamente aceitável. Refere-se a qualquer componente adequado para entrega de um material antigênico a um sítio in vivo, os exemplos incluem, mas não estão limitados a água, solução salina, solução salina tamponada com fosfato, solução de Ringer, solução de dextrose, solução contendo soro, solução de Hans, outras soluções aquosas fisiologicamente equilibradas, óleos, ésteres e glicóis e semelhantes.

[0104] O veículo da presente invenção pode conter ingredientes auxiliares adequados e conservantes para aumentar a estabilidade química e a isotonicidade, estabilizadores como trealose, glicina, sorbitol, lactose ou glutamato monossódico (MSG) podem ser incluídos para proteger a composição de vacina contra mudanças de temperatura ou liofilização. A composição de vacina da presente invenção pode conter um líquido em suspensão, como água estéril ou solução salina (de preferência solução salina tamponada).

[0105] A composição de vacina da presente invenção pode conter qualquer adjuvante em uma quantidade suficiente para aumentar a resposta imune ao imunogênio. Adjuvantes adequados são conhecidos na técnica, os exemplos incluem, mas não estão limitados a sais de alumínio (fosfato de alumínio ou hidróxido de alumínio), mistura de esqualeno (SAF-1), peptídeo muramil, derivado de saponina, preparação de parede celular de micobactéria, monofosforil lipídeo A, derivado de ácido micólico, tensoativos de copolímero em bloco não iônico, Quil A, subunidade B da toxina da cólera, polifosfazeno e derivados e complexos imuno-estimulantes (ISCOMs).

[0106] Tal como acontece com todas as outras composições de vacina, a quantidade imunologicamente eficaz do imunogênio deve ser determinada empiricamente, em cujo caso os fatores que podem ser considerados incluem imunogenicidade, via de administração e frequência de administração do sistema imunológico. Além disso, pode ser ajustado de acordo com a progressão da doença do paciente e o estado de metástase, o tipo de formulação, a idade do paciente, sexo, peso, estado de saúde, dieta, tempo de administração e método de administração.

[0107] O polipeptídeo dimérico na composição de vacina da presente invenção pode estar presente em várias concentrações na composição da presente invenção, mas, tipicamente, o material de antígeno está incluído em uma concentração necessária para induzir a formação de um nível apropriado de anticorpo in vivo.

[0108] Conforme usado neste documento, o termo “administração” significa introduzir uma substância predeterminada em um paciente por qualquer método adequado, e a via de administração da vacina da presente invenção pode ser administrada por qualquer via geral, desde que possam atingir o tecido alvo.

[0109] A composição de vacina da presente invenção pode ser usada para tratar doenças ou distúrbios mediados por interferon tipo 1 por administração por via sistêmica ou mucosa.

[0110] A administração da composição de vacina pode incluir, mas não está limitada a injeção por via intramuscular, intraperitoneal, intradérmica ou subcutânea, administração oral/alimentar, respiratória e mucosa ao trato geniturinário.

[0111] Além disso, para aumentar a eficácia da vacina, quando a vacina é injetada, citocinas que ajudam a ativar células T, como IL-12, são coadministradas, ou uma vacina transfectada com esses genes de citocinas pode ser usada.

[0112] As células contendo o polipeptídeo do tipo dímero, que é um ingrediente ativo da vacina produzida pela presente invenção, também podem ter sua proliferação celular esgotada a fim de aumentar a segurança, porque o corpo humano é inoculado como uma vacina terapêutica. Por exemplo, a fim de ser usada seletivamente como uma vacina celular com mais segurança, ela pode ser tratada com tratamento térmico, tratamento por radiação ou tratamento com mitomicina C (MMC), e a proliferação pode ser eliminada, deixando a função de vacina. Por exemplo, ao usar irradiação de raios-X, pode ser irradiado com uma dose total de radiação de 1000 a 3300

Rad. No método de tratamento com mitomicina C, por exemplo, 25 a 50 µg/ml de mitomicina C são adicionados ao polipeptídeo e o tratamento térmico pode ser realizado a 37 °C por 30 minutos a 60 minutos. No método de tratamento de células por calor, por exemplo, o tratamento térmico pode ser realizado de 50 °C a 65 °C por 20 minutos.

[0113] Tal como aqui utilizado, 'tratamento' refere-se a um procedimento clínico destinado a alterar o processo natural de um sujeito ou célula a ser tratada, podendo também ser realizado para a prevenção de patologia clínica. Os efeitos desejáveis do tratamento incluem a supressão da ocorrência ou recorrência da doença, alívio dos sintomas, redução de quaisquer consequências patológicas diretas ou indiretas da doença, redução da taxa de progressão da doença, aperfeiçoamento, melhoria, alívio ou melhoria do prognóstico e semelhantes. Além disso, o termo 'prevenção' se refere a qualquer ação que suprime o início ou retarda a progressão de uma doença.

[0114] Conforme usado neste documento, o termo 'compreendendo' é usado com o mesmo significado que 'incluindo' ou 'caracterizado por', na composição ou método de acordo com a presente invenção, componentes ou etapas adicionais do método não especificamente mencionados não são excluídos. Além disso, o termo 'consistindo em' significa excluir elementos, etapas ou ingredientes adicionais que não são descritos separadamente. O termo 'consistindo essencialmente em' significa que, no escopo da composição ou método, pode incluir substâncias ou etapas que não afetam substancialmente as propriedades básicas das mesmas, além das substâncias ou etapas descritas.

[0115] A presente invenção também fornece um uso do polipeptídeo para a preparação de um agente para prevenir ou tratar uma doença ou distúrbio mediado por interferon tipo 1.

[0116] Além disso, a presente invenção fornece um método para o tratamento de uma doença ou distúrbio mediado por interferon tipo 1, compreendendo administrar a um sujeito, em necessidade do mesmo, uma quantidade eficaz de uma composição compreendendo o polipeptídeo como um ingrediente ativo.

[0117] A 'quantidade eficaz' da presente invenção refere-se a uma quantidade que, quando administrada a um indivíduo, exibe um efeito de melhorar, tratar, prevenir, detectar, diagnosticar ou inibir ou reduzir uma doença ou distúrbio mediado por interferon tipo 1, ou uma doença ou distúrbio mediado por interferon tipo 1, e o 'sujeito' pode ser um animal, de preferência um animal, incluindo um mamífero, particularmente um humano, e uma célula, tecido, órgão ou semelhante derivado de um animal. O sujeito pode ser um paciente com necessidade do efeito.

[0118] O “tratamento” da presente invenção refere-se genericamente a melhorar uma doença ou distúrbio mediado por interferon tipo 1, ou um sintoma de uma doença ou distúrbio mediado por interferon tipo 1, e isso pode incluir a cura, prevenção substancial ou melhoria da condição, e incluindo aliviar, curar ou prevenir um ou a maioria dos sintomas resultantes da doença, mas não se limita a isso.

EFEITO VANTAJOSO

[0119] A proteína de fusão Fc neutralizadora de interferon tipo 1 da presente invenção bloqueia a ligação do interferon tipo 1 ao receptor de interferon e tem excelente iniciação e inibição da atividade biológica dos mecanismos de sinalização, tratando assim efetivamente doenças mediadas por interferon tipo 1.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0120] A Figura 1 mostra um diagrama esquemático da preparação de um vetor de expressão para a produção da proteína de fusão Fc do receptor de interferon tipo 1.

[0121] A Figura 2a é o resultado da comparação do tamanho de cada proteína por meio de cromatografia de exclusão por tamanho.

[0122] A Figura 2b é um resultado que confirma a ligação da proteína de fusão Fc IFNAR1/2 hetero e IFN β humano sob condições nativas e condições de redução.

[0123] A Figura 2c é um diagrama esquemático que mostra a proteína de fusão Fc do receptor de interferon tipo 1.

[0124] A Figura 3 é um diagrama que mostra os resultados da análise de SPR da proteína de fusão Fc do receptor de interferon tipo 1.

[0125] As Figuras 4a a 4c são resultados que confirmam a capacidade de neutralização do interferon tipo 1 da proteína de fusão Fc do receptor de interferon tipo 1 da presente invenção.

[0126] A Figura 4a é um resultado que mostra a viabilidade celular em células Daudi tratadas com IFN β-1a humano sozinho ou proteína de fusão Fc do receptor de interferon tipo 1.

[0127] A Figura 4b é um resultado que mostra o valor de IC50 tratado com IFN β-1a humano sozinho ou proteína de fusão Fc do receptor de interferon tipo 1.

[0128] A Figura 4c é um resultado que mostra a viabilidade celular de células Daudi tratadas com IFN β-1a humano de acordo com a concentração da proteína da presente invenção.

[0129] A Figura 5 confirma a capacidade de neutralização da proteína do heterodímero IFNAR1/2-Fc (4GS*3) da presente invenção para a atividade biológica do interferon tipo 1 (IFN-α 1, IFN-α 2a, IFN-α 2b, IFN-α 5, IFN-α 8, IFN-α 10, IFN-β 1a, IFN-ω) e a viabilidade celular de células Daudi no grupo ao qual o interferon tipo 1 foi adicionado e no grupo no qual cada interferon foi tratado com proteína do heterodímero IFNAR1/2-Fc (4GS*3) foi mostrada.

[0130] As Figuras 6a e 6b são os resultados da confirmação da capacidade de neutralização da proteína do heterodímero IFNAR1/2-Fc (4GS*3) da presente invenção para o mecanismo de sinalização do interferon tipo 1, e os resultados mostram a mudança de fosforilação da proteína STAT1 em células Daudi do grupo ao qual interferon tipo 1 (IFN-α 1, IFN-α 2a, IFN-α 2b, IFN-α 5, IFN-α 8, IFN-α 10, IFN-β 1a, IFN-ω, IFN-ε) foi adicionado e o grupo no qual cada interferon foi tratado com a proteína do heterodímero IFNAR1/2- Fc (4GS*3).

MODO PARA REALIZAR A INVENÇÃO

[0131] A seguir, a presente invenção será descrita em detalhes.

[0132] No entanto, os seguintes exemplos são apenas ilustrativos da presente invenção, e o conteúdo da presente invenção não está limitado aos seguintes exemplos.

EXEMPLO 1: PREPARAÇÃO DO VETOR DE EXPRESSÃO PARA A PRODUÇÃO DA PROTEÍNA DE FUSÃO FC DO RECEPTOR DE INTERFERON TIPO 1

[0133] Sequências de aminoácidos IFNAR1 humana (P17181, 28- 436 aa.), IFNAR2 (P48552, 27-243 aa.) e IGHG (P01857, 100-330 aa.) foram usadas para desenvolver uma proteína de fusão Fc capaz de se ligar ou neutralizar a proteína do interferon tipo 1. Como mostrado na Figura 1 (esquerda), Fc foram marcados com um ligante polipeptídico (L; IEGRMD) no C-terminal do vetor de expressão em todos os vetores de expressão da proteína de fusão Fc, está ligado por IFNAR1 ou IFNAR2 entre o C-terminal e o N-terminal incluindo a sequência de Kozac (▲) e a sequência de sinal indutor de secreção extracelular (S), ou diretamente ligado.

[0134] Como mostrado na Figura 1 (direita), a sequência incluindo cada gene foi ligada entre as enzimas de restrição NheI e XhoI. Os vetores de expressão foram denominados pIFNAR1-FcWT, pIFNAR2-FcWT, pIFNAR1-

FcA, pIFNAR2-FcB, pIFNAR1-FcB e pLíder-FcA, respectivamente.

[0135] A otimização de códon do gene que compreende a sequência polinucleotídica (SEQ ID NO: 1), o domínio extracelular de IFNAR1 (SEQ ID NO: 3), o domínio extracelular de IFNAR2 (SEQ ID NO: 5), um ligante polipeptídico (SEQ ID NO: 7), e a porção Fc do IGHG humano (SEQ ID NO: 11) e variantes (SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15) compreendendo a sequência de Kozac e a sequência de sinal, foi realizada para sintetizar o gene para preparar os fragmentos de sequência de nucleotídeos e a g da Figura 1. Um vetor de expressão foi preparado usando T4 DNA ligase (RBC) entre NheI e Xho I entre os sítios de enzima de restrição do vetor de expressão (pOptiVec-TOPO) para cada fragmento de sequência de nucleotídeos.

[0136] Além disso, o vetor de expressão foi preparado da mesma maneira, exceto que o ligante de SEQ ID NO: 33 foi usado em vez do ligante polipeptídico de SEQ ID NO: 7. Em outras palavras, o gene que compreende a sequência polinucleotídica (SEQ ID NO: 1), o domínio extracelular de IFNAR1 (SEQ ID NO: 3), o domínio extracelular de IFNAR2 (SEQ ID NO: 5), um ligante polipeptídico (SEQ ID NO: 33) e a porção Fc de IGHG humano (SEQ ID NO: 11) e variantes (SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 13) número 15) compreendendo a sequência de Kozac e a sequência de sinal, foi otimizado por códons para sintetizar o gene para preparar os fragmentos de sequência de nucleotídeos e a g da Figura 1. Um vetor de expressão foi preparado usando T4 DNA ligase (RBC) entre NheI e Xho I entre os sítios de enzima de restrição do vetor de expressão (pOptiVec-TOPO) para cada fragmento de sequência de nucleotídeos.

EXEMPLO 2: PURIFICAÇÃO DE EXPRESSÃO DE PROTEÍNA, CONFIRMAÇÃO DA

ESTRUTURA E CONFIRMAÇÃO DA LIGAÇÃO

[0137] Os seguintes processos de expressão e purificação foram realizados a fim de produzir uma proteína com a estrutura mostrada na Figura

2c usando vetores de expressão nos quais os fragmentos da sequência de nucleotídeos de cada combinação foram inseridos.

[0138] A fim de manter a modificação pós-traducional nativa (PTM) de cada receptor de interferon tipo 1, toda a expressão de proteína recombinante usa o meio de expressão Expi293TM em 300-600 ml, de acordo com o protocolo do sistema de expressão transiente, usando a célula de expressão de origem humana, linhagem celular Expi293 (Thermo Fisher Scientific). Dependendo da proteína final, um ou dois vetores de expressão foram transfectados em células e, em seguida, os Potenciadores 1 e 2 foram adicionados de acordo com o protocolo do fabricante. Posteriormente, o meio de cultura cultivado por 6 dias foi centrifugado a 6580 rpm, 20 minutos e 8 °C e, em seguida, filtrado usando um filtro de poliestireno de 0,22 µm (Corning).

Todas as proteínas foram purificadas no sistema de purificação AKTA avant (GE Healthcare Life Sciences) e a coluna preenchida com MabSelect SuRe (GE Healthcare Life Science) foi equilibrada em até 2 CV usando fosfato de sódio 20 mM, pH 7,2 e tampão NaCl 150 mM a uma taxa de 5 ml/min e, em seguida, a solução de cultura foi fluida para se ligar à resina.

[0139] Depois disso, a proteína recombinante foi eluída com tampão citrato 100 mM, tampão pH 3,5 após um processo de lavagem da coluna usando 5 CV de fosfato de sódio 35 mM, pH 7,2, tampão NaCl 500 mM e 1 CV de fosfato de sódio 20 mM, tampão pH 7,2. A proteína eluída foi concentrada para 3 ml usando um filtro Amicon Ultra Centrifugal (50K-cut off, Merck Millipore) após diálise por 12 horas e 3 vezes usando 4L de tampão PBS 1X (Biosesang). A proteína recombinante concentrada foi adicionalmente separada da proteína alvo usando o mesmo tampão usado para diálise em uma coluna Hiload Superdex 200 pg (GE Healthcare Life Sciences).

[0140] Como resultado, como mostrado na Figura 2a, o tamanho de cada proteína de fusão Fc foi comparado através de cromatografia de exclusão por tamanho, e esperava-se que tivesse a estrutura da proteína mostrada na Figura 2c.

[0141] Além disso, como mostrado na Figura 2b, a ligação entre a proteína de fusão Fc IFNAR1/2 hetero e o IFN β-1a humano foi confirmada, respectivamente em condições nativas (7,5% de géis de proteína Mini- PROTEIN® TGXTM Precase), condições de redução (qualquer gel de proteína kDTM Mini-PROTEIN® TGXTM Precast, Bio-rad).

[0142] A porção FC da sequência de aminoácidos da presente invenção inclui a porção de DOBRADIÇA de IGHG1 (100-330a.a.), e uma ligação dissulfeto é formada pelos aminoácidos 109-109 e 112-112 para formar um dímero. Em mais detalhes, a formação de um heterodímero ocorre predominantemente de um homodímero para um heterodímero devido a uma mudança na sequência de aminoácidos específica da porção CH3 de FC.

EXEMPLO 3: ANÁLISE SPR USANDO PROTEÍNA DE FUSÃO FC

[0143] Afinidade de ligação e cinética de proteínas de fusão Fc (heterodímero IFNAR2-Fc, heterodímero IFNAR1/2-Fc, heterodímero IFNAR1- Fc) expressa/ purificada através da combinação de vetor de expressão da Figura 1 e hIFN β-1a entre os IFNs Tipo I foram analisadas.

[0144] Neste experimento, (IFNAR1-Fc EW + -Fc RVT), (IFNAR2- Fc EW + -Fc RVT) e (IFNAR1-Fc EW + IFNAR2Fc RVT) foram usados para analisar a força de ligação e a cinética. Ao expressar (IFNAR1-Fc RVT + IFNAR2-Fc EW), como foi confirmado que o problema de a forma homodímero aparecer mais do que (IFNAR1-Fc EW + IFNAR2-Fc RVT) foi confirmado, então (IFNAR1-Fc RVT + IFNAR2-Fc EW) não foi usado.

[0145] Com base em Biacore T200 (GE Healthcare Life Sciences), condições de 25 °C, 30 µl/min e tampão de corrida DPBST a 0,005% (DPBS/ modificado, Hyclone e Tween20, Signal) foram utilizadas e o chip sensor de ouro foi acoplado com amina a um anticorpo de captura de Fcγ anti-humano

(AffiniPure Goat Anti-Human IgG, fragmento Fcγ específico, Jackson ImmunoResearch). Cada analito foi testado em 180 segundos, associação e 600 segundos, e condições de dissociação.

[0146] Como mostrado na Figura 3, o ajuste da curva foi realizado de acordo com formato de sensorgrama de hIFNb-1a-IFNAR2 (modelo de ajuste 1:1), hIFNb-1a-IFNAR1/2 (modelo de ligante heterogêneo), hIFNb-1a- IFNAR1 (modelos de ligação de dois estados) e a previsão do modelo de encaixe. Em particular, a proteína de fusão Fc IFNAR1/2 hetero mostrou um baixo valor de KD (Ver Tabela 2 e Tabela 3).

TABELA 2 k1a x k1d x K2a x K2d x k1D K2D Ligante Analito 105 (M- 10-3 (s- 107 (M- 10-3 (s- (nM) (pM) 1 s-1) 1) 1 s-1) 1) IFN-β- Heterodímero 1aa 0,47 75,45 3,556 IFNAR2-Fc IFN-β- 4,26 1ab IFN-β- Heterodímero 1ac 0,0006 76,85 0,0044 1,57 3,109 198,6 IFNAR1/2-Fc IFN-β- 4,775 1ab IFN-β- Heterodímero 1aa 41,11 0,2368 0,9723 IFNAR1-Fc IFN-β- 81,51 1ab a Sensorgramas se ajustam com modelo de ligação individual (A + B ↔ AB) b A análise de equilíbrio de estado estacionário foi estimada usando cada parâmetro em 179,04 segundos.

c Sensorgramas se ajustam com modelo de ligante heterogêneo (A + B ↔ AB + C ↔ ABC) TABELA 3 K2d x k1a x 105 k1d x 10-3 K2a x 10- K2D Ligante Analito 10-3 (s- (M-1 s-1) (s-1) 3 (s-1) (nM) 1) Heterodímero IFN-β- 5,426 129,7 1,776 45,75 48,97 IFNAR1-Fc 1aa Heterodímero IFN-β- 2,23E+06 8,81E+05 22,04 3,444 0,5342 IFNAR2-Fc 1aa a Sensorgramas se ajustam com modelo de ligação de dois estados (A + B ↔ AB ↔ AB*) EXEMPLO 4: CONFIRMAÇÃO DA CAPACIDADE DE NEUTRALIZAÇÃO DA ATIVIDADE

BIOLÓGICA PELO LIGANTE DA PROTEÍNA DE FUSÃO FC

[0147] O seguinte experimento foi conduzido para confirmar a capacidade de neutralização da proteína de fusão Fc para a atividade biológica causada pelo ligante. Como no Exemplo 3, (IFNAR1-Fc EW + -Fc RVT), (IFNAR2-Fc EW + -Fc RVT) e (IFNAR1-Fc EW + IFNAR2Fc RVT) foram usados neste experimento.

[0148] Todos os experimentos foram projetados com base no efeito antiproliferativo de hIFN-β utilizando o kit de ensaio de viabilidade celular Ez-cytox (Deaillab) em células Daudi, onde a expressão de cada receptor é elevada. Este método de teste apresentou resultados de teste que refletem bem as características biofísicas do ligante, semelhantes aos resultados da análise cinética de SPR.

[0149] Especificamente, em uma placa de 96 poços (SPL), a concentração de hIFN-β-1a em células de 3 × 103 células foi determinada pela concentração (10 nM de heterodímero IFNAR1-Fc, heterodímero IFNAR2-Fc,

heterodímero IFNAR1/2-Fc; 6 pM de heterodímero IFNAR1-Fc; heterodímero IFNAR1/2-Fc) e, em seguida, a reação foi realizada em uma incubadora de células a 37 °C e 5% de CO2 por 72 horas. Em seguida, após adicionar o reagente Ex-cytox de acordo com o protocolo do fabricante, após mais 3 horas de reação, ele foi medido a 450 nm com um leitor de microplaca (Genios Pro, Tecan), e os valores de IC50 foram comparados e analisados usando análise de regressão não linear (software GraphPad Prism versão 7.0, San Diego, Ca, EUA). A capacidade de neutralização de cada proteína da presente invenção foi confirmada quanto à significância estatística através de ANOVA One-way, teste post-hoc de comparações múltiplas de Bonferroni.

[0150] Como mostrado na Figura 4a, foi confirmado que a proliferação anticélula por interferon foi significativamente reduzida em comparação com o caso de uma proteína de fusão que bloqueia IFNAR1 e IFNAR2, respectivamente, quando o interferon é tratado com uma proteína de fusão Fc que bloqueia a ligação de IFNAR1 e IFNAR2.

[0151] Como mostrado na Figura 4b, o valor de IC50 foi o mais alto quando a proteína de fusão Fc bloqueando IFNAR1 e IFNAR2, de acordo com a presente invenção, foi adicionada. Portanto, foi confirmado que a proliferação anticélula por interferon foi superior à viabilidade celular ao bloquear IFNAR1 ou IFNAR2, respectivamente.

[0152] Como mostrado na Figura 4c, foi confirmado que a viabilidade celular aumentou de maneira dependente da concentração quando o heterodímero IFNAR1/2-Fc com a maior capacidade de neutralização foi tratado.

EXEMPLO 5: CONFIRMAÇÃO DA CAPACIDADE DE NEUTRALIZAÇÃO DA ATIVIDADE DO MECANISMO DE SINAL PELO LIGANTE DO HETERODÍMERO IFNAR1/2-FC

[0153] Da mesma maneira que no Exemplo 4, exceto para o heterodímero IFNAR1/2-Fc mencionado abaixo, a capacidade de neutralizar a atividade biológica pelo ligante do heterodímero IFNAR1/2-Fc foi confirmada.

[0154] Especificamente, o grupo adicionou IFNs (IFN-α 1 (pbl assay science_cat#11125-1), IFN-α 2a (pbl assay science_ cat#11100-1), IFN- α 2b (pbl assay science_ cat#11105-1), IFN-α 5 (pbl assay science_ cat#11135-1), IFN-α 8 (pbl assay science_ cat#11115-1), IFN-α 10 (pbl assay science_ cat#11120-1), IFN-β 1a (pbl assay science_ cat#11415-1), IFN-ω (pbl assay science_cat#11395) -One) a uma concentração de 1 nM e o grupo em que cada interferon foi tratado com uma proteína de fusão Fc de receptor de interferon tipo 1 a uma concentração de 10 nm em células de 3 × 10 3 células foram reagidos em uma incubadora de células a 37 °C e 5% de CO2 por 72 horas. Em seguida, após adicionar o reagente Ex-cytox de acordo com o protocolo do fabricante, e após mais 2 horas de reação, foi medido a 450 nm com um leitor de microplaca (Genios Pro, Tecan) e os valores de IC50 foram comparados e analisados por meio de análise de regressão não linear (software GraphPad Prism versão 7.0, San Diego, Ca, EUA).

[0155] Como resultado, como mostrado na Figura 5, foi confirmado que a viabilidade celular foi significativamente superior em comparação com a viabilidade celular tratada apenas com interferon, quando IFN-α 1, IFN-α 2a, IFN-α 2b, IFN-α 5, IFN-α 8, IFN-α 10, IFN-β 1a, IFN-ω foi tratado com um heterodímero IFNAR1/2-Fc (usando 4GS*3 como um ligante) que bloqueia a ligação de IFNAR1 e IFNAR2.

[0156] Através destes resultados, foi verificado que a regulação de sinais excessivos de interferon para células é possível pelo polipeptídeo do tipo dímero ao qual o monômero (monômero) compreendendo o fragmento de receptor de interferon ou fragmento Fc de anticorpo da presente invenção está ligado, e através deste, foi confirmado que mostraria excelentes efeitos farmacológicos em pacientes com doenças mediadas por interferon tipo 1, tais como lúpus eritematoso sistêmico, síndrome de Sjögren, esclerose sistêmica,

miosite e artrite reumatoide, em que genes induzíveis por interferon expressos em resposta a sinais excessivos de interferon são altos.

EXEMPLO 6: CONFIRMAÇÃO DA CAPACIDADE DE INIBIÇÃO DE SINAL QUÍMICO PELO LIGANTE DO HETERODÍMERO IFNAR1/2-FC

[0157] Todos os experimentos foram realizados para confirmar as alterações em STAT1 e sua proteína pSTAT1 fosforilada por IFNs Tipo I usando Western blot em células Daudi, nas quais a expressão de cada receptor é alta.

[0158] Especificamente, em uma placa de 6 poços (SPL_cat#30006), o grupo adicionou IFNs (IFN-α 1 (pbl assay science_cat#11125-1), IFN-α 2a (pbl assay science_ cat#11100-1), IFN-α 2b (pbl assay science_ cat#11105-1), IFN-α 5 (pbl assay science_ cat#11135-1), IFN-α 8 (pbl assay science_ cat#11115-1), IFN-α 10 (pbl assay science_ cat#11120-1), IFN-β 1a (pbl assay science_ cat#11415-1), IFN-ω (pbl assay science_cat#11395-) 1), IFN-ε (R&D systems_cat#9667-ME) a um concentração de 1 nM e o grupo em que cada interferon foi tratado com uma proteína do heterodímero IFNAR1/2-Fc a uma concentração de 10 nM nas células de 2 × 106 células foram reagidos em uma incubadora de células a 37 °C e 5% de CO2 por 72 horas. Em seguida, as células foram coletadas da placa, a proteína total foi extraída e determinada com o kit de ensaio de proteína BCA (Thermo scientific_cat#23227). A proteína total foi separada em um gel a 10% por eletroforese em gel de dodecilsulfato de sódio-poliacrilamida (SDS-PAGE) e transcrita em uma membrana de PVDF (BIO RAD_cat#1620177). A membrana foi bloqueada com 5% de leite desnatado, 3% de albumina de soro bovino, Tris-HCL 10 mmol/l (pH 8,0), NaCl 150 mmol/l e 0,05% de Tween-20 por 1 hora em temperatura ambiente. A membrana bloqueada foi tratada com anticorpo STAT1 (cell signaling_cat#06-501), anticorpo pSTAT1 (cell signaling_cat#58D6) e anticorpo beta actina (santa cruz_cat#sc 47778) como anticorpos primários (diluição 1:3000) de um dia para outro a 4 °C. Em seguida, um anticorpo secundário conjugado a HRP, anticorpo de cabra anti-coelho (Invitrogen_cat#31460) e anticorpo de cabra anti-camundongo (invitrogen_cat#G21040), foram tratados em temperatura ambiente por 1 hora. Depois de tratar a membrana com solução ECL (BIO RAD_cat#1705061), foi visualizada em um filme (Agfa Healthcare_cat#EA8EC) usando um revelador e fixador de poohung.

[0159] Como resultado, como mostrado nas Figuras 6a e 6b, foi confirmado que a fosforilação da proteína pSTAT1 foi significativamente reduzida em comparação com a alta fosforilação da proteína pSTAT1 quando apenas o interferon foi tratado, quando a proteína do heterodímero IFNAR1/2- Fc (4GS*3), que bloqueia a ligação de IFNAR1 e IFNAR2, foi tratada com interferon (IFN-α 1, IFN-α 2a, IFN-α 2b, IFN-α 5, IFN-α 8, IFN-α 10, IFN-β 1a, IFN-ω, IFN-ε). Isso indica que a proteína do heterodímero IFNAR1/2-Fc se liga ao interferon tipo 1 e exibe capacidade de neutralização, indicando que a sinalização relacionada ao interferon na célula é inibida.

APLICAÇÃO INDUSTRIAL

[0160] A proteína de fusão Fc neutralizadora de interferon tipo 1 da presente invenção tem excelente aplicação industrial, pois ao mesmo tempo que bloqueia a ligação do interferon tipo 1 ao receptor de interferon, tem excelente iniciação e inibição de atividade biológica de mecanismos de sinalização, de modo que pode ser muito útil no desenvolvimento de agentes terapêuticos para prevenir ou tratar doenças mediadas por interferon tipo 1.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. POLIPEPTÍDEO DIMÉRICO no qual um monômero compreendendo um fragmento de receptor de interferon ou um fragmento Fc de anticorpo está ligado, caracterizado pelo monômero ser um polipeptídeo selecionado a partir do grupo que consiste em (i), (ii) e (iii): (i) um monômero compreendendo um fragmento de receptor de interferon 1 (IFNAR1) e um fragmento Fc de anticorpo; (ii) um monômero compreendendo um fragmento de receptor de interferon 2 (IFNAR2) e um fragmento Fc de anticorpo; e (iii) um fragmento Fc de anticorpo.

2. POLIPEPTÍDEO DIMÉRICO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo polipeptídeo neutralizar o interferon tipo 1.

3. POLIPEPTÍDEO DIMÉRICO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo polipeptídeo compreender (i) e (ii).

4. POLIPEPTÍDEO DIMÉRICO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fragmento de receptor de interferon 1 compreender a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4.

5. POLIPEPTÍDEO DIMÉRICO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fragmento de receptor de interferon 2 compreender a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6.

6. POLIPEPTÍDEO DIMÉRICO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fragmento Fc de anticorpo compreender a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12.

7. POLINUCLEOTÍDEO, caracterizado por codificar o polipeptídeo, conforme definido na reivindicação 1.

8. VETOR, caracterizado por compreender o polinucleotídeo, conforme definido na reivindicação 7.

9. CÉLULA HOSPEDEIRA, caracterizada por ser transformada com o vetor conforme definido na reivindicação 8.

10. MÉTODO PARA PRODUZIR O POLIPEPTÍDEO, conforme definido na reivindicação 1, caracterizado por compreender: (a) fornecer a célula hospedeira, conforme definida na reivindicação 9; (b) cultivar as células fornecidas; e (c) preparar o polipeptídeo recuperando o polipeptídeo da célula ou meio de cultura.

11. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA para prevenção ou tratamento de doenças ou distúrbios mediados por interferon tipo 1, caracterizada por compreender o polipeptídeo, conforme definido na reivindicação 1, como um ingrediente ativo.

12. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pela doença ou distúrbio mediado por interferon tipo 1 ser selecionado a partir do grupo que consiste em lúpus eritematoso sistêmico, síndrome de Sjögren, esclerose sistêmica, diabetes mellitus insulino- dependente (DMID), doença inflamatória intestinal (DII) (incluindo doença de Crohn, colite ulcerativa e doença celíaca), esclerose múltipla (EM), psoríase, tireoidite autoimune, artrite reumatóide, miosite inflamatória, glomerulonefrite, infecção por HIV, AIDS, rejeição de transplante e reação de enxerto contra hospedeiro (GVHD).

13. USO DO POLIPEPTÍDEO, conforme definido na reivindicação 1, caracterizado por ser para a preparação de um agente para a prevenção ou tratamento de uma doença ou distúrbio mediado por interferon tipo 1.

14. MÉTODO PARA TRATAR UMA DOENÇA OU DISTÚRBIO mediado por interferon tipo 1, caracterizado por compreender administrar a um sujeito, em necessidade do mesmo, uma quantidade eficaz de uma composição compreendendo o polipeptídeo, conforme definido na reivindicação

1, como um ingrediente ativo.

Figura 1

Petição 870210061703, de 07/07/2021, pág. 57/66 Líder Líder

Ampicilina 1/8

IFNAR1-ECD humano, códon de parada IFNAR2-ECD humano, códon de parada Sequência de Kozac Ligante polipeptídico (IEGRMD ou 4GS*3) Enzima de restrição, Nhel (5'-), Xhol (-3 ') IgG-Fc humano Peptídeo sinalizador Mutagênese sítio-dirigida

Figura 2a

Heterodímero IFNAR1/2-Fc Heterodímero IFNAR2-Fc Homodímero IFNAR2-Fc

Heterodímero IFNAR1-Fc Homodímero IFNAR1-Fc

Figura 2b

Heterodímero IFNAR1/2-Fc

Nativo Redutor

Figura 2c

Heterodímero Heterodímero Heterodímero Homodímero Homodímero IFNAR1/2-Fc IFNAR2-Fc IFNAR1-Fc IFNAR1-Fc IFNAR2-Fc

Figura 3

Heterodímero IFNAR1

Tempo (s) Resposta (RU) Heterodímero IFNAR1/2

Tempo (s)

Resposta (RU) Heterodímero IFNAR2

Tempo (s)

Resposta (RU)

Figura 4a Viabilidade celular

(% de controle)

Heterodímero IFNAR1 (10 nM) Heterodímero IFNAR2 (10 nM) Heterodímero IFNAR1/2 (10 nM) Heterodímero IFNAR1/2 (6 pM)

Figura 4b IFNAR1

IFNAR2 Heterodímero

Heterodímero

IFNAR1/2

IFNAR1/2 Heterodímero

Heterodímero

Figura 4c Viabilidade celular (% de controle)

Log (heterodímero IFNAR1/2-Fc, pM)

Figura 5

Log(IFN-ômega, pM) Log(IFN-alfa 5, pM)

IFN Tipo I com heterodímero IFNAR1/2 (4GS*3) Viabilidade celular (% de controle) Viabilidade celular (% de controle)

Log(IFN-beta 1a, pM) Log(IFN-alfa 2b, pM)

Viabilidade celular (% de controle) Viabilidade celular (% de controle) Log(IFN-alfa 10, pM) Log(IFN-alfa 2a, pM)

IFN Tipo I

Viabilidade celular (% de controle) Viabilidade celular (% de controle) Log(IFN-alfa 8, pM) Log(IFN-alfa 1, pM)

Viabilidade celular (% de controle) Viabilidade celular (% de controle)

Figura 6a

IFN Tipo I 1nM

Heterodímero IFNAR1/2- Fc (4GS*3) 20nM β-actina

Figura 6b

IFN Tipo I 1nM

Heterodímero IFNAR1/2-Fc (4GS*3) 20nM β-actina