BR112021011334A2 - Composições e métodos para tratamento e prevenção da esclerose lateral amiotrófica - Google Patents

Composições e métodos para tratamento e prevenção da esclerose lateral amiotrófica Download PDF

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Abstract

composições e métodos para tratamento e prevenção da esclerose lateral amiotrófica. os regimes de dosagem para oligonucleotídeos antissenso direcionados a sod1 e sais dos mesmos são fornecidos. estes regimes de dosagem encontram uso no tratamento de indivíduos com ou em risco de desenvolver esclerose lateral amiotrófica.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "COM-
POSIÇÕES E MÉTODOS PARA TRATAMENTO E PREVENÇÃO DA ESCLEROSE LATERAL AMIOTRÓFICA". Referência Cruzada a Pedidos Relacionados
[001] Este pedido reivindica o benefício de prioridade do Pedido Provisório U.S. N° 62/779,916, depositado em 14 de dezembro de 2018; 62/807.603, depositado em 19 de fevereiro de 2019; e 62/840,879 depositado em 30 de abril de 2019, cujos conteúdos são incorporados por referência neste documento em sua totalidade. Campo
[002] O presente pedido refere-se geralmente a regimes de do- sagem para o uso clínico de oligonucleotídeos antissenso, ou sais dos mesmo, que reduzem a expressão de superóxido dismutase 1 (SOD1) em um indivíduo humano com necessidade da mesma, por exemplo, adultos com esclerose lateral amiotrófica (amyotrophic lateral sclero- sis, ALS) que têm uma mutação confirmada do gene SOD1 humano. Tais métodos são úteis para tratar, prevenir ou melhorar a ALS inibin- do a expressão de SOD1. Fundamentos
[003] A enzima SOD1 solúvel (também conhecida como Cu/Zn superóxido dismutase) é uma das superóxido dismutases que fornece defesa contra o dano oxidativo das biomoléculas, catalisando a des- mutação do superóxido em peróxido de hidrogênio (H2O2) (Fridovich, Annu. Rev. Biochem., 64:97-112 (1995)). O ânion de superóxido (O2-) é um subproduto celular potencialmente prejudicial, produzido princi- palmente por erros de fosforilação oxidativa nas mitocôndrias (Turrens, J. Physiol., 552:335-344 (2003))
[004] A Esclerose Lateral Amiotrófica (ALS, também conhecida como doença de Lou Gehrig) é uma doença neurodegenerativa pro- gressiva devastadora que afeta até 30,000 americanos em qualquer momento. Mutações no gene SOD1 estão associadas a uma forma hereditária dominante de ALS, um distúrbio caracterizado por uma de- generação seletiva dos neurônios motores superiores e inferiores (Rowland, N. Engl. J. Med., 2001, 344:1688-1700 (2001)). Há uma li- gação genética estreita entre ALS familiar e mutações missense no gene da SOD1 (Rosen, Nature, 362:59-62 (1993)).
[005] Acredita-se que a toxicidade da SOD1 mutante surge a par- tir de um desdobramento incorreto inicial (ganho de função) reduzindo a proteção nuclear da enzima ativa (perda de função nos núcleos), um processo que pode estar envolvido na patogênese da ALS (Sau, Hum. Mol. Genet., 16:1604-1618 (2007)). A degeneração progressiva dos neurônios motores na ALS eventualmente leva à morte. Quando os neurônios motores morrem, a capacidade do cérebro de iniciar e con- trolar o movimento muscular é perdida. Com a ação muscular voluntá- ria afetada progressivamente, os pacientes nas fases mais avançadas da doença podem ficar totalmente paralisados.
[006] Atualmente, carecem opções aceitáveis para o tratamento de tais doenças neurodegenerativas. É, portanto, um objetivo deste documento fornecer métodos para o tratamento dessas doenças. Sumário
[007] Esta divulgação refere-se, em parte, a regimes de dosagem de oligonucleotídeos antissenso, que reduzem a expressão da superó- xido dismutase 1 (SOD1) e ao uso de tais oligonucleotídeos antissen- so, ou sais dos mesmos, para inibir a expressão de SOD1 e para tra- tar, prevenir ou melhorar a ALS em um indivíduo humano com uma mutação no gene SOD1.
[008] Em um primeiro aspecto, a divulgação apresenta um méto- do de tratamento ou prevenção da esclerose lateral amiotrófica asso- ciada a uma mutação no gene da superóxido dismutase 1 humana (SOD1) em um indivíduo humano em necessidade da mesma. O mé-
todo envolve a administração ao indivíduo humano (por exemplo, por administração intratecal) de uma composição farmacêutica em uma quantidade suficiente para distribuir uma dose fixa de cerca de 100 mg ou 100 mg de um oligonucleotídeo antissenso, em que a sequência de nucleobase do oligonucleotídeo antissenso consiste em CAGGATA- CATTTCTACAGCT (SEQ ID NO: 1), em que cada um dos nucleosí- deos 1-5 e 16-20 são nucleosídeos modificados com 2'-O- metoxietilribose e cada um dos nucleosídeos 6-15 são 2'- desoxinucleosídeos, em que as ligações internucleosídeos entre os nucleosídeos 2 a 3, 4 a 5, 16 a 17 e 18 a 19 são ligações fosfodiéster e as ligações internucleosídeos entre os nucleosídeos 1 a 2, 3 a 4, 5 a 6, 6 a 7, 7 a 8, 8 a 9, 9 a 10, 10 a 11, 11 a 12, 12 a 13, 13 a 14, 14 a 15, 15 a 16, 17 a 18 e 19 a 20 são ligações fosforotioato, e em que ca- da citosina é uma 5-metilcitosina.
[009] Em um segundo aspecto, a divulgação apresenta um méto- do de tratamento ou prevenção da esclerose lateral amiotrófica asso- ciada a uma mutação no gene SOD1 humano em um indivíduo huma- no em necessidade do mesmo. O método envolve a administração ao indivíduo humano (por exemplo, por administração intratecal) de uma composição farmacêutica em uma quantidade suficiente para distribuir uma dose fixa de cerca de 60 mg ou 60 mg de um oligonucleotídeo antissenso, em que a sequência de nucleobase do oligonucleotídeo antissenso consiste em CAGGATACATTTCTACAGCT (SEQ ID NO: 1), em que cada um dos nucleosídeos 1-5 e 16-20 são nucleosídeos modificados com 2'-O-metoxietilribose e cada um dos nucleosídeos 6- 15 são 2'-desoxinucleosídeos, em que as ligações internucleosídeos entre os nucleosídeos 2 a 3, 4 a 5, 16 a 17 e 18 a 19 são ligações fos- fodiéster e as ligações internucleosídeos entre os nucleosídeos 1 a 2, 3 a 4, 5 a 6, 6 a 7, 7 a 8, 8 a 9, 9 a 10, 10 a 11, 11 a 12, 12 a 13, 13 a 14, 14 a 15, 15 a 16, 17 a 18 e 19 a 20 são ligações fosforotioato, e em que cada citosina é uma 5-metilcitosina.
[0010] Em um terceiro aspecto, a divulgação apresenta um méto- do de tratamento ou prevenção da esclerose lateral amiotrófica asso- ciada a uma mutação no gene SOD1 humano em um indivíduo huma- no em necessidade do mesmo. O método envolve a administração ao indivíduo humano (por exemplo, por administração intratecal) de uma composição farmacêutica em uma quantidade suficiente para distribuir uma dose fixa de cerca de 40 mg ou 40 mg de um oligonucleotídeo antissenso, em que a sequência de nucleobase do oligonucleotídeo antissenso consiste em CAGGATACATTTCTACAGCT (SEQ ID NO: 1), em que cada um dos nucleosídeos 1-5 e 16-20 são nucleosídeos modificados com 2'-O-metoxietilribose e cada um dos nucleosídeos 6- 15 são 2'-desoxinucleosídeos, em que as ligações internucleosídeos entre os nucleosídeos 2 a 3, 4 a 5, 16 a 17 e 18 a 19 são ligações fos- fodiéster e as ligações internucleosídeos entre os nucleosídeos 1 a 2, 3 a 4, 5 a 6, 6 a 7, 7 a 8, 8 a 9, 9 a 10, 10 a 11, 11 a 12, 12 a 13, 13 a 14, 14 a 15, 15 a 16, 17 a 18 e 19 a 20 são ligações fosforotioato, e em que cada citosina é uma 5-metilcitosina.
[0011] Em um quarto aspecto, a divulgação apresenta um método de tratamento ou prevenção da esclerose lateral amiotrófica associada a uma mutação no gene SOD1 humano em um indivíduo humano em necessidade do mesmo. O método envolve a administração ao indiví- duo humano (por exemplo, por administração intratecal) de uma com- posição farmacêutica em uma quantidade suficiente para distribuir uma dose fixa de cerca de 20 mg ou 20 mg de um oligonucleotídeo antissenso, em que a sequência de nucleobase do oligonucleotídeo antissenso consiste em CAGGATACATTTCTACAGCT (SEQ ID NO: 1), em que cada um dos nucleosídeos 1-5 e 16-20 são nucleosídeos modificados com 2'-O-metoxietilribose e cada um dos nucleosídeos 6- 15 são 2'-desoxinucleosídeos, em que as ligações internucleosídeos entre os nucleosídeos 2 a 3, 4 a 5, 16 a 17 e 18 a 19 são ligações fos- fodiéster e as ligações internucleosídeos entre os nucleosídeos 1 a 2, 3 a 4, 5 a 6, 6 a 7, 7 a 8, 8 a 9, 9 a 10, 10 a 11, 11 a 12, 12 a 13, 13 a 14, 14 a 15, 15 a 16, 17 a 18 e 19 a 20 são ligações fosforotioato, e em que cada citosina é uma 5-metilcitosina.
[0012] Em um quinto aspecto, a divulgação fornece um método de redução da síntese de proteína SOD1 humana ou níveis de mRNA de SOD1 humano em um indivíduo humano com uma mutação no gene SOD1 humano associada à esclerose lateral amiotrófica. O método envolve a administração ao indivíduo humano por administração intra- tecal de uma composição farmacêutica em uma quantidade suficiente para distribuir uma dose fixa de cerca de 100 mg ou 100 mg de um oligonucleotídeo antissenso, em que a sequência de nucleobase do oligonucleotídeo antissenso consiste em CAGGATACATTTCTACA- GCT (SEQ ID NO: 1), em que cada um dos nucleosídeos 1-5 e 16-20 são nucleosídeos modificados com 2'-O-metoxietilribose e cada um dos nucleosídeos 6-15 são 2'-desoxinucleosídeos, em que as ligações internucleosídeos entre os nucleosídeos 2 a 3, 4 a 5, 16 a 17 e 18 a 19 são ligações fosfodiéster e as ligações internucleosídeos entre os nu- cleosídeos 1 a 2, 3 a 4, 5 a 6, 6 a 7, 7 a 8, 8 a 9, 9 a 10, 10 a 11, 11 a 12, 12 a 13, 13 a 14, 14 a 15, 15 a 16, 17 a 18 e 19 a 20 são ligações fosforotioato, e em que cada citosina é uma 5-metilcitosina.
[0013] Em um sexto aspecto, a divulgação fornece um método de redução da síntese de proteína SOD1 humana ou níveis de mRNA de SOD1 humana em um indivíduo humano com uma mutação no gene SOD1 humano associada à esclerose lateral amiotrófica. O método envolve a administração ao indivíduo humano por administração intra- tecal de uma composição farmacêutica em uma quantidade suficiente para distribuir uma dose fixa de cerca de 60 mg ou 60 mg de um oligo- nucleotídeo antissenso, em que a sequência de nucleobase do oligo-
nucleotídeo antissenso consiste em CAGGATACATTTCTACAGCT (SEQ ID NO: 1), em que cada um dos nucleosídeos 1-5 e 16-20 são nucleosídeos modificados com 2'-O-metoxietilribose e cada um dos nucleosídeos 6-15 são 2'-desoxinucleosídeos, em que as ligações in- ternucleosídeos entre os nucleosídeos 2 a 3, 4 a 5, 16 a 17 e 18 a 19 são ligações fosfodiéster e as ligações internucleosídeos entre os nu- cleosídeos 1 a 2, 3 a 4, 5 a 6, 6 a 7, 7 a 8, 8 a 9, 9 a 10, 10 a 11, 11 a 12, 12 a 13, 13 a 14, 14 a 15, 15 a 16, 17 a 18 e 19 a 20 são ligações fosforotioato, e em que cada citosina é uma 5-metilcitosina.
[0014] Em um sétimo aspecto, a divulgação fornece um método de redução da síntese de proteína SOD1 humana ou níveis de mRNA de SOD1 humana em um indivíduo humano com uma mutação no gene SOD1 humano associada à esclerose lateral amiotrófica. O método envolve a administração ao indivíduo humano por administração intra- tecal de uma composição farmacêutica em uma quantidade suficiente para distribuir uma dose fixa de cerca de 40 mg ou 40 mg de um oligo- nucleotídeo antissenso, em que a sequência de nucleobase do oligo- nucleotídeo antissenso consiste em CAGGATACATTTCTACAGCT (SEQ ID NO: 1), em que cada um dos nucleosídeos 1-5 e 16-20 são nucleosídeos modificados com 2'-O-metoxietilribose e cada um dos nucleosídeos 6-15 são 2'-desoxinucleosídeos, em que as ligações in- ternucleosídeos entre os nucleosídeos 2 a 3, 4 a 5, 16 a 17 e 18 a 19 são ligações fosfodiéster e as ligações internucleosídeos entre os nu- cleosídeos 1 a 2, 3 a 4, 5 a 6, 6 a 7, 7 a 8, 8 a 9, 9 a 10, 10 a 11, 11 a 12, 12 a 13, 13 a 14, 14 a 15, 15 a 16, 17 a 18 e 19 a 20 são ligações fosforotioato, e em que cada citosina é uma 5-metilcitosina.
[0015] Em um oitavo aspecto, a divulgação fornece um método de redução da síntese de proteína SOD1 humana ou níveis de mRNA de SOD1 humana em um indivíduo humano com uma mutação no gene SOD1 humano associada à esclerose lateral amiotrófica. O método envolve a administração ao indivíduo humano por administração intra- tecal de uma composição farmacêutica em uma quantidade suficiente para distribuir uma dose fixa de cerca de 20 mg ou 20 mg de um oligo- nucleotídeo antissenso, em que a sequência de nucleobase do oligo- nucleotídeo antissenso consiste em CAGGATACATTTCTACAGCT (SEQ ID NO: 1), em que cada um dos nucleosídeos 1-5 e 16-20 são nucleosídeos modificados com 2'-O-metoxietilribose e cada um dos nucleosídeos 6-15 são 2'-desoxinucleosídeos, em que as ligações in- ternucleosídeos entre os nucleosídeos 2 a 3, 4 a 5, 16 a 17 e 18 a 19 são ligações fosfodiéster e as ligações internucleosídeos entre os nu- cleosídeos 1 a 2, 3 a 4, 5 a 6, 6 a 7, 7 a 8, 8 a 9, 9 a 10, 10 a 11, 11 a 12, 12 a 13, 13 a 14, 14 a 15, 15 a 16, 17 a 18 e 19 a 20 são ligações fosforotioato, e em que cada citosina é uma 5-metilcitosina.
[0016] Em algumas modalidades dos aspectos acima, a mutação no gene SOD1 é A4V, H46R, G93S, A4T, G141X, D133A, V148G, N139K, G85R, G93A, V14G, C6S, I113T, D49K, G37R, A89V, E100G, D90A, T137A, E100K, G41A, G41D, G41S, G13R, G72S, L8V, F20C, Q22L, H48R, T54R, S591, V87A, T88deltaTAD, A89T, V97M, S105deltaSL, V118L, D124G, L114F, D90A, G12R, ou G147R. Em uma modalidade, a mutação no gene SOD1 é A4V. Em outra modali- dade, a mutação no gene SOD1 é H46R. Em ainda outra modalidade, a mutação no gene SOD1 é G93S.
[0017] Em algumas modalidades, a mutação no gene SOD1 hu- mano é identificada por um teste genético.
[0018] Em certas modalidades, os métodos acima envolvem ainda a identificação da mutação no gene SOD1 humano por um teste gené- tico.
[0019] Em algumas modalidades, a composição farmacêutica é administrada ao indivíduo humano pelo menos 5 vezes (por exemplo, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 vezes) ao longo de quatro meses.
[0020] Em certas modalidades, o indivíduo humano é administrado com uma dose de ataque ou doses de ataque da composição farma- cêutica, seguida por uma dose de manutenção ou doses de manuten- ção. Em alguns casos, três doses de ataque são administradas, em que a segunda dose de ataque é administrada cerca de duas semanas após ou duas semanas após a primeira dose de ataque e a terceira dose de ataque é administrada cerca de duas semanas após ou duas semanas após a segunda dose de ataque (por exemplo, as doses de ataque são administradas no dia 1, dia 15 e dia 29). Em alguns casos, as doses de manutenção são administradas a cada 4 semanas ou 4 semanas, começando 4 semanas após a terceira dose de ataque (por exemplo, por 1 mês, 2 meses, três meses, quatro meses, cinco meses, seis meses, sete meses, oito meses, nove meses, dez meses).
[0021] Em certas modalidades, o indivíduo humano recebe três doses de ataque da composição farmacêutica seguidas por pelo me- nos uma (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12) dose de ma- nutenção. Em alguns casos, as três doses de ataque são administra- das com cerca de duas semanas ou duas semanas de intervalo. Em alguns casos, as três doses de ataque são administradas com cerca de 14 dias ou 14 dias de intervalo. Em alguns casos, a dose/doses de manutenção são administradas começando cerca de 4 semanas ou 4 semanas após a terceira dose de ataque. Em alguns casos, a do- se/doses de manutenção são administradas todos os meses, come- çando um mês após a terceira dose de ataque. Em alguns casos, a dose/doses de manutenção são administradas a cada 28 dias, come- çando 28 dias após a terceira dose de ataque.
[0022] Em certas modalidades, as doses de ataque e as doses de manutenção da composição farmacêutica são administradas ao indiví- duo humano da seguinte forma:
(i) uma primeira dose de ataque da composição farmacêuti- ca; (ii) uma segunda dose de ataque da composição farmacêu- tica administrada 14 dias após a primeira dose de ataque; (iii) uma terceira dose de ataque da composição farmacêu- tica administrada 28 dias após a primeira dose de ataque; e (iv) uma primeira dose de manutenção da composição far- macêutica administrada 28 dias ou 1 mês após a terceira dose de ata- que.
[0023] Em certas modalidades, as doses de ataque e as doses de manutenção da composição farmacêutica são administradas ao indiví- duo humano da seguinte forma: (i) uma primeira dose de ataque em uma quantidade sufici- ente para distribuir uma dose fixa de 100 mg do oligonucleotídeo an- tissenso; (ii) uma segunda dose de ataque em uma quantidade sufi- ciente para distribuir uma dose fixa de 100 mg do oligonucleotídeo an- tissenso, em que a segunda dose de ataque é administrada 14 dias após a primeira dose de ataque; (iii) uma terceira dose de ataque em uma quantidade sufici- ente para distribuir uma dose fixa de 100 mg do oligonucleotídeo an- tissenso, em que a terceira dose de ataque é administrada 28 dias após a primeira dose de ataque; e (iv) uma primeira dose de manutenção em uma quantidade suficiente para distribuir uma dose fixa de 100 mg do oligonucleotídeo antissenso, em que a primeira dose de manutenção é administrada 28 dias após a terceira dose de ataque.
[0024] Em certas modalidades, as doses de ataque e as doses de manutenção da composição farmacêutica são administradas ao indiví- duo humano da seguinte forma:
(i) uma primeira dose de ataque em uma quantidade sufici- ente para distribuir uma dose fixa de 100 mg do oligonucleotídeo an- tissenso; (ii) uma segunda dose de ataque em uma quantidade sufi- ciente para distribuir uma dose fixa de 100 mg do oligonucleotídeo an- tissenso, em que a segunda dose de ataque é administrada 14 dias após a primeira dose de ataque; (iii) uma terceira dose de ataque em uma quantidade sufici- ente para distribuir uma dose fixa de 100 mg do oligonucleotídeo an- tissenso, em que a terceira dose de ataque é administrada 28 dias após a primeira dose de ataque; e (iv) uma primeira dose de manutenção em uma quantidade suficiente para distribuir uma dose fixa de 100 mg do oligonucleotídeo antissenso, em que a primeira dose de manutenção é administrada 1 mês após a terceira dose de ataque.
[0025] Em um nono aspecto, a divulgação fornece um método de tratamento ou prevenção de esclerose lateral amiotrófica associada a uma mutação no gene SOD1 em um indivíduo humano em necessida- de deste. O método envolve a administração ao indivíduo humano por administração intratecal de uma composição farmacêutica compreen- dendo um oligonucleotídeo antissenso ou um sal do mesmo, em que o oligonucleotídeo antissenso possui a seguinte estrutura:
, e em que o oligonucleotídeo antissenso ou o sal do mesmo é adminis- trado em uma dose equivalente a 100 mg do oligonucleotídeo antis- senso. 105,9 mg de Composto A (ou seja, o sal nonadecassódico de ISIS 666853) é equivalente a 100 mg do oligonucleotídeo antissenso. A composição farmacêutica administrada pode compreender o oligo- nucleotídeo antissenso, um ou mais sais do oligonucleotídeo antissen- so ou misturas dos mesmos.
[0026] Em um décimo aspecto, a divulgação fornece um método de tratamento ou prevenção de esclerose lateral amiotrófica associada a uma mutação no gene SOD1 em um indivíduo humano em necessi- dade do mesmo. O método envolve a administração ao indivíduo hu- mano por administração intratecal de uma composição farmacêutica compreendendo um oligonucleotídeo antissenso ou um sal do mesmo, em que o oligonucleotídeo antissenso possui a seguinte estrutura:
, e em que o oligonucleotídeo antissenso ou o sal do mesmo é adminis- trado em uma dose equivalente a 60 mg do oligonucleotídeo antissen- so. 63,5 mg do Composto A é equivalente a 60 mg do oligonucleotídeo antissenso. A composição farmacêutica administrada pode compreen- der o oligonucleotídeo antissenso, um ou mais sais do oligonucleotí- deo antissenso ou misturas dos mesmos.
[0027] Em um décimo primeiro aspecto, a divulgação fornece um método de tratamento ou prevenção de esclerose lateral amiotrófica associada a uma mutação no gene SOD1 em um indivíduo humano em necessidade do mesmo. O método envolve a administração ao in- divíduo humano por administração intratecal de uma composição far- macêutica compreendendo um oligonucleotídeo antissenso ou um sal do mesmo, em que o oligonucleotídeo antissenso possui a seguinte estrutura:
, e em que o oligonucleotídeo antissenso ou o sal do mesmo é adminis- trado em uma dose equivalente a 40 mg do oligonucleotídeo antissen- so. 42,3 mg do Composto A é equivalente a 40 mg do oligonucleotídeo antissenso. A composição farmacêutica administrada pode compreen- der o oligonucleotídeo antissenso, um ou mais sais do oligonucleotí- deo antissenso ou misturas do mesmo.
[0028] Em um décimo segundo aspecto, a divulgação fornece um método de tratamento ou prevenção de esclerose lateral amiotrófica associada a uma mutação no gene SOD1 em um indivíduo humano em necessidade do mesmo. O método envolve a administração ao in- divíduo humano por administração intratecal de uma composição far- macêutica compreendendo um oligonucleotídeo antissenso ou um sal do mesmo, em que o oligonucleotídeo antissenso possui a seguinte estrutura:
, e em que o oligonucleotídeo antissenso ou o sal do mesmo é adminis- trado em uma dose equivalente a 20 mg do oligonucleotídeo antissen- so. 21,2 mg do Composto A é equivalente a 20 mg do oligonucleotídeo antissenso. A composição farmacêutica administrada pode compreen- der o oligonucleotídeo antissenso, um ou mais sais do oligonucleotí- deo antissenso ou misturas dos mesmos.
[0029] Em um décimo terceiro aspecto, a divulgação fornece um método de redução da síntese de proteína SOD1 humana ou níveis de mRNA de SOD1 humana em um indivíduo humano com uma mutação no gene SOD1 humano associada à esclerose lateral amiotrófica. O método envolve a administração ao indivíduo humano por administra- ção intratecal de uma composição farmacêutica compreendendo um oligonucleotídeo antissenso ou um sal do mesmo, em que o oligonu- cleotídeo antissenso possui a seguinte estrutura:
, e em que o oligonucleotídeo antissenso ou o sal do mesmo é adminis- trado em uma dose equivalente a 100 mg do oligonucleotídeo antis- senso. 105,9 mg do Composto A é equivalente a 100 mg do oligonu- cleotídeo antissenso. A composição farmacêutica administrada pode compreender o oligonucleotídeo antissenso, um ou mais sais do oligo- nucleotídeo antissenso ou misturas dos mesmos.
[0030] Em um décimo quarto aspecto, a divulgação fornece um método de redução da síntese de proteína SOD1 humana ou níveis de mRNA de SOD1 humana em um indivíduo humano com uma mutação no gene SOD1 humano associada à esclerose lateral amiotrófica. O método envolve a administração ao indivíduo humano por administra- ção intratecal de uma composição farmacêutica compreendendo um oligonucleotídeo antissenso ou um sal do mesmo, em que o oligonu- cleotídeo antissenso possui a seguinte estrutura:
, e em que o oligonucleotídeo antissenso ou o sal do mesmo é adminis- trado em uma dose equivalente a 60 mg do oligonucleotídeo antissen- so. 63,5 mg do Composto A é equivalente a 60 mg do oligonucleotídeo antissenso. A composição farmacêutica administrada pode compreen- der o oligonucleotídeo antissenso, um ou mais sais do oligonucleotí- deo antissenso ou misturas dos mesmos.
[0031] Em um décimo quinto aspecto, a divulgação fornece um método de redução da síntese de proteína SOD1 humana ou níveis de mRNA de SOD1 humana em um indivíduo humano com uma mutação no gene SOD1 humano associada à esclerose lateral amiotrófica. O método envolve a administração ao indivíduo humano por administra- ção intratecal de uma composição farmacêutica compreendendo um oligonucleotídeo antissenso ou um sal do mesmo, em que o oligonu- cleotídeo antissenso possui a seguinte estrutura:
, e em que o oligonucleotídeo antissenso ou o sal do mesmo é adminis- trado em uma dose equivalente a 40 mg do oligonucleotídeo antissen- so. 42,3 mg do Composto A é equivalente a 40 mg do oligonucleotídeo antissenso. A composição farmacêutica administrada pode compreen- der o oligonucleotídeo antissenso, um ou mais sais do oligonucleotí- deo antissenso ou misturas dos mesmos.
[0032] Em um décimo sexto aspecto, a divulgação fornece um mé- todo de redução da síntese de proteína SOD1 humana ou níveis de mRNA de SOD1 humana em um indivíduo humano com uma mutação no gene SOD1 humano associada à esclerose lateral amiotrófica. O método envolve a administração ao indivíduo humano por administra- ção intratecal de uma composição farmacêutica compreendendo um oligonucleotídeo antissenso ou um sal do mesmo, em que o oligonu- cleotídeo antissenso possui a seguinte estrutura:
, e em que o oligonucleotídeo antissenso ou o sal do mesmo é adminis- trado em uma dose equivalente a 20 mg do oligonucleotídeo antissen- so. 21,2 mg do Composto A é equivalente a 20 mg do oligonucleotídeo antissenso. A composição farmacêutica administrada pode compreen- der o oligonucleotídeo antissenso, um ou mais sais do oligonucleotí- deo antissenso ou misturas dos mesmos.
[0033] Em algumas modalidades, o indivíduo humano recebe um sal do oligonucleotídeo antissenso. Em algumas modalidades, o sal é um sal de sódio. Em algumas modalidades, o sal do oligonucleotídeo antissenso possui a seguinte estrutura:
.
[0034] Em algumas modalidades dos aspectos acima, a mutação no gene SOD1 é A4V, H46R, G93S, A4T, G141X, D133A, V148G, N139K, G85R, G93A, V14G, C6S, I113T, D49K, G37R, A89V, E100G, D90A, T137A, E100K, G41A, G41D, G41S, G13R, G72S, L8V, F20C, Q22L, H48R, T54R, S591, V87A, T88deltaTAD, A89T, V97M, S105deltaSL, V118L, D124G, L114F, D90A, G12R, ou G147R. Em uma modalidade, a mutação no gene SOD1 é A4V. Em outra modali- dade, a mutação no gene SOD1 é H46R. Em ainda outra modalidade, a mutação no gene SOD1 é G93S.
[0035] Em algumas modalidades, a mutação no gene SOD1 hu- mano é identificada por um teste genético.
[0036] Em certas modalidades, os métodos acima envolvem ainda a identificação da mutação no gene SOD1 humano por um teste gené- tico.
[0037] Em algumas modalidades, a composição farmacêutica é administrada ao indivíduo humano pelo menos 5 vezes ao longo de quatro meses.
[0038] Em certas modalidades, o indivíduo humano é administrado com uma dose de ataque ou doses de ataque da composição farma- cêutica seguida por uma dose de manutenção ou doses de manuten- ção. Em alguns casos, três doses de ataque são administradas, em que as doses de ataque são separadas por duas semanas, por exem- plo, no dia 1, dia 15 e dia 29. Em alguns casos, as doses de manuten- ção são administradas a cada 4 semanas começando 4 semanas após a terceira dose de ataque (por exemplo, por 1 mês, 2 meses, três me- ses, quatro meses, cinco meses, seis meses, sete meses, oito meses, nove meses, dez meses).
[0039] Em certas modalidades, o indivíduo humano recebe três doses de ataque da composição farmacêutica seguidas por pelo me- nos uma (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12) dose de ma- nutenção. Em alguns casos, as três doses de ataque são administra- das com duas semanas de intervalo. Em alguns casos, as três doses de ataque são administradas com 14 dias de intervalo. Em alguns ca- sos, a dose/doses de manutenção são administradas a cada 4 sema- nas, começando 4 semanas após a terceira dose de ataque. Em al- guns casos, a dose/doses de manutenção são administradas todos os meses, começando um mês após a terceira dose de ataque. Em al- guns casos, a dose/doses de manutenção são administradas a cada 28 dias, começando 28 dias após a terceira dose de ataque.
[0040] Em certas modalidades, as doses de ataque e as doses de manutenção da composição farmacêutica são administradas ao indiví- duo humano da seguinte forma: (i) uma primeira dose de ataque da composição farmacêuti- ca; (ii) uma segunda dose de ataque da composição farmacêu-
tica administrada 14 dias após a primeira dose de ataque; (iii) uma terceira dose de ataque da composição farmacêu- tica administrada 28 dias após a primeira dose de ataque; e (iv) uma primeira dose de manutenção da composição far- macêutica administrada 28 dias ou 1 mês após a terceira dose de ata- que.
[0041] Em certas modalidades, as doses de ataque e as doses de manutenção da composição farmacêutica são administradas ao indiví- duo humano da seguinte forma: (i) uma primeira dose de ataque equivalente a 100 mg do oligonucleotídeo antissenso; (ii) uma segunda dose de ataque equivalente a 100 mg do oligonucleotídeo antissenso, em que a segunda dose de ataque é ad- ministrada 14 dias após a primeira dose de ataque; (iii) uma terceira dose de ataque equivalente a 100 mg do oligonucleotídeo antissenso, em que a terceira dose de ataque é ad- ministrada 28 dias após a primeira dose de ataque; e (iv) uma primeira dose de manutenção equivalente a 100 mg do oligonucleotídeo antissenso, em que a primeira dose de manu- tenção é administrada 28 dias após a terceira dose de ataque.
[0042] Em certas modalidades, as doses de ataque e as doses de manutenção da composição farmacêutica são administradas ao indiví- duo humano da seguinte forma: (i) uma primeira dose de ataque equivalente a 100 mg do oligonucleotídeo antissenso; (ii) uma segunda dose de ataque equivalente a 100 mg do oligonucleotídeo antissenso, em que a segunda dose de ataque é ad- ministrada 14 dias após a primeira dose de ataque; (iii) uma terceira dose de ataque equivalente a 100 mg do oligonucleotídeo antissenso, em que a terceira dose de ataque é ad-
ministrada 28 dias após a primeira dose de ataque; e (iv) uma primeira dose de manutenção equivalente a 100 mg do oligonucleotídeo antissenso, em que a primeira dose de manu- tenção é administrada 1 mês após a terceira dose de ataque.
[0043] Em outro aspecto, a divulgação apresenta uma seringa ou bomba compreendendo uma preparação estéril de um oligonucleotí- deo antissenso. A seringa ou bomba é adaptada para administração intratecal do oligonucleotídeo antissenso em uma dose fixa de 20 mg, 40 mg, 60 mg ou 100 mg. A sequência de nucleobase do oligonucleo- tídeo antissenso consiste em CAGGATACATTTCTACAGCT (SEQ ID NO: 1), em que cada um dos nucleosídeos 1-5 e 16-20 são nucleosí- deos modificados com 2'-O-metoxietilribose e cada um dos nucleosí- deos 6-15 são 2'-desoxinucleosídeos, em que as ligações internucleo- sídicas entre os nucleosídeos 2 a 3, 4 a 5, 16 a 17 e 18 a 19 são liga- ções fosfodiéster e as ligações internucleosídicas entre os nucleosí- deos 1 a 2, 3 a 4, 5 a 6, 6 a 7, 7 a 8, 8 a 9, 9 a 10, 10 a 11, 11 a 12, 12 a 13, 13 a 14, 14 a 15, 15 a 16, 17 a 18 e 19 a 20 são ligações fosforo- tioato, e em que cada citosina é uma 5-metilcitosina.
[0044] A menos que definido de outra forma, todos os termos téc- nicos e científicos utilizados neste documento possuem o mesmo sig- nificado conforme comumente entendido por uma pessoa versada na técnica à qual esta invenção pertence. Embora métodos e materiais semelhantes ou equivalentes aos descritos neste documento possam ser utilizados na prática ou na testagem da presente invenção, os mé- todos e materiais exemplares são descritos abaixo. Todas as publica- ções, pedidos de patentes, patentes e outras referências mencionadas neste documento estão incorporadas para referência em suas totalida- des. Em caso de conflito, o presente pedido, incluindo definições, irá prevalecer. Os materiais, métodos e exemplos são ilustrativos apenas, e não são destinados a ser um fator limitante.
[0045] Outras características e vantagens da invenção ficarão apa- rentes a partir da seguinte descrição detalhada, bem como das reivin- dicações. Breve Descrição das Figuras
[0046] A Figura 1 é uma representação gráfica da duração média da doença (anos a partir do início dos sintomas) para pacientes com diferentes mutações de SOD1 humanas.
[0047] A Figura 2 representa os aumentos dependentes da dose nas concentrações do líquido cefalorraquidiano (LCR) do Composto A, observados em coortes de dose ascendente múltipla (MAD). A linha tracejada superior representa a dose de 100 mg; as próximas duas linhas tracejadas representam as doses de 60 e 40 mg e a linha trace- jada inferior representa a dose de 20 mg.
[0048] A Figura 3 representa as diminuições dependentes da dose nas concentrações de SOD1 no LCR observadas em coortes de MAD. No dia do estudo 85, o círculo superior corresponde a 20 mg; o próxi- mo círculo abaixo ao placebo; o próximo círculo abaixo a 60 mg; o próximo círculo abaixo a 40 mg; e o círculo mais inferior a 100 mg do Composto A.
[0049] A Figura 4A é um gráfico da alteração média de LS da ava- liação inicial na Escala de Avaliação Funcional da Esclerose Lateral Amiotrófica Revisada (ALFSFRS-R) em pacientes em coortes de MAD. No dia de estudo 85, o círculo superior corresponde a 40 mg do Com- posto A; o próximo círculo abaixo a 100 mg do Composto A; o próximo círculo abaixo a 60 mg do Composto A; o próximo círculo abaixo a 20 mg do Composto A; e o círculo mais inferior ao placebo.
[0050] A Figura 4B é um gráfico da alteração média de LS da ava- liação inicial (90% de CI) em porcentagem da Capacidade Vital Lenta Prevista (SVC) em pacientes em coortes de MAD. No dia do estudo 85, o círculo superior corresponde a 60 mg do Composto A; o próximo círculo abaixo a 40 mg do Composto A; o próximo círculo abaixo a 100 mg do Composto A; o próximo círculo abaixo a 20 mg do Composto A; e o círculo mais inferior ao placebo.
[0051] A Figura 4C é um gráfico da alteração média LS da avalia- ção inicial (CI a 90%) no megascore geral da dinamometria manual (HHD) em pacientes em coortes de MAD. No dia de estudo 92, o círcu- lo superior corresponde a 40 mg do Composto A; o próximo círculo abaixo a 100 mg do Composto A; o próximo círculo abaixo a 60 mg do Composto A; o próximo círculo abaixo a 20 mg do Composto A; e o círculo mais inferior ao placebo.
[0052] A Figura 5 ilustra as alterações em ALSFRS-R, SVC, me- gascore HHD e nível de LCR SOD1 desde a avaliação inicial até o Dia 85 em pacientes com mutações de progresso rápido recebendo place- bo ou 100 mg de Composto A.
[0053] A Figura 6 ilustra as alterações em ALSFRS-R, SVC, me- gascore HHD e nível de LCR SOD1 desde a avaliação inicial até o Dia 85 em pacientes com mutações de progressão lenta recebendo place- bo ou 100 mg de Composto A.
[0054] A Figura 7 representa o efeito do tratamento com 100 mg de Composto A nos níveis de pNFH desde a avaliação inicial até o Dia 85 em pacientes com mutações SOD1 de progresso rápido.
[0055] A Figura 8 representa o efeito do tratamento com 100 mg de Composto A nos níveis de pNFH desde a avaliação inicial até o Dia 85 em pacientes com mutações SOD1 de progressão lenta. Descrição Detalhada
[0056] Esta divulgação apresenta regimes de dosagem de oligo- nucleotídeos antissenso ou sais dos mesmos, que reduzem a expres- são de superóxido dismutase 1 (SOD1) e o uso de tais oligonucleotí- deos antissenso ou sais dos mesmos, para tratar, prevenir ou melhorar a esclerose lateral amiotrófica (ALS) em adultos tendo uma mutação do gene SOD1 humano. Definições
[0057] "2'-O-metoxietil" (também 2'-MOE e 2'-OCH2CH2-OCH3 e MOE) refere-se a uma modificação O-metoxi-etil da posição 2' de um anel furanose. Um açúcar modificado em 2’-O-metoxietil é um açúcar modificado.
[0058] "Nucleosídeo de 2’-MOE" (também nucleosídeo de 2’-O- metoxietil) denota um nucleosídeo que compreende uma porção de açúcar modificada em MOE.
[0059] "5-metilcitosina" denota uma citosina modificada com um grupo metil ligado à posição 5'. Uma 5-metilcitosina é uma nucleobase modificada.
[0060] "Ligação de fosforotioato" significa uma ligação entre nu- cleosídeos onde a ligação fosfodiéster é modificada pela substituição de um dos átomos de oxigênio que não fazem ponte por um átomo de enxofre. Uma ligação de fosforotioato é uma ligação internucleosídica modificada.
[0061] "Sobre" no contexto da quantidade de uma substância sig- nifica +/- 10% do valor indicado. Assim, cerca de 100 mg de um oligo- nucleotídeo antissenso inclui 90 mg a 110 mg do oligonucleotídeo an- tissenso. No contexto de unidades temporais, por exemplo, cerca de 10 dias ou cerca de 1 semana, "cerca de" significa +/- 3 dias.
[0062] "Intratecal" ou "IT" significa administração no líquido cefa- lorraquidiano sob a membrana aracnoide que cobre o cérebro e a me- dula espinhal.
[0063] "Dose de ataque" significa uma dose administrada durante uma fase de dosagem durante a qual a administração é iniciada e a concentração de estado estacionário da droga (por exemplo, oligonu- cleotídeo antissenso) alcançada.
[0064] "Dose de manutenção" significa uma dose administrada du-
rante uma fase de dosagem após a concentração de estado estacioná- rio da droga (por exemplo, oligonucleotídeo antissenso) ter sido alcan- çada.
[0065] "Dose fixa" refere-se a uma quantidade predeterminada de oligonucleotídeo antissenso (por exemplo, 20 mg, 40 mg, 60 mg, 100 mg) destinada a atingir uma concentração terapêutica desejada (por exemplo, concentração de estado estacionário) ou efeito no indivíduo. Esclerose lateral amiotrófica
[0066] A esclerose lateral amiotrófica (ALS) é uma doença neuro- degenerativa rara, que resulta na perda de neurônios motores no cór- tex, tronco cerebral e medula espinhal. Os pacientes sofrem com a perda progressiva de massa muscular, força e função nos músculos bulbares, respiratórios e voluntários. O declínio é inevitável, com mor- te, tipicamente por insuficiência respiratória, ocorrendo de 2 a 5 anos, em média, após o diagnóstico. Embora a maioria dos pacientes sofra de ALS esporádica, uma fração menor de pacientes, aproximadamen- te 2%, tem uma forma hereditária ou familiar de ALS causada por uma variedade de mutações na superóxido dismutase 1 (SOD1). Mais de 180 mutações SOD1 foram relatadas para causar esta forma de ALS (referido como SOD1 ALS) desde sua descoberta inicial em 1993. The Amyotrophic Lateral Sclerosis Online Genetics Database (ALSoD). Ins- titute of Psychiatry, Psychology & Neuroscience. Publicado em 2015; Rosen, Nature, 364(6435):362 (1993)). A progressão da doença para mutações individuais é variável, com sobrevida de menos de 15 meses com as mutações mais graves. Embora o mecanismo pelo qual as mu- tações causam SOD1 ALS não seja conhecido, dados convincentes sugerem que o ganho tóxico de função, não a perda da atividade de SOD1, é o gatilho que inicia a cascata de eventos resultando na morte do neurônio motor (Bruijn et al., Science, 281(5384):1851-4 (1998)).
[0067] Os tratamentos aprovados para ALS são riluzol (Rilutek®) e edaravona (Radicava™). O riluzol fornece um aumento modesto na sobrevida (2 a 3 meses), sem melhora demonstrável na força ou inca- pacidade. Edaravona diminui o declínio funcional conforme medido pela Escala de Avaliação Funcional da Esclerose Lateral Amiotrófica - Revisada (ALSFRS-R). O efeito da edaravona na sobrevida é desco- nhecido. Nenhum tratamento de ALS específico para SOD1 está dis- ponível. Superóxido Dismutase 1
[0068] A superóxido dismutase [Cu-Zn], também conhecida como superóxido dismutase 1 (SOD1), é uma enzima que em humanos é codificada pelo gene SOD1, localizado no cromossomo 21.
[0069] SOD1 é um homodímero de 32 kDa que forma um barril β e contém uma ligação dissulfeto intramolecular e um sítio Cu/Zn binu- clear em cada subunidade. Este sítio Cu/Zn contém o íon cobre e zin- co e é responsável por catalisar a desproporção do superóxido em pe- róxido de hidrogênio e dioxigênio.
[0070] SOD1 é uma das três superóxido dismutases responsáveis por destruir os radicais superóxidos livres no corpo. A isoenzima codi- ficada é uma proteína solúvel do espaço intermembranar citoplasmáti- co e mitocondrial, atuando como um homodímero para converter radi- cais superóxido de ocorrência natural, mas prejudiciais, em oxigênio molecular e peróxido de hidrogênio. O peróxido de hidrogênio pode então ser decomposto por outra enzima chamada catalase.
[0071] Pelo menos 180 mutações no gene SOD1 foram ligadas à ALS familiar (Conwit RA, J Neurol Sci., . 251 (1–2):1–2 (2006); Al- Chalabi A, Leigh PN, Curr. Opin. in Neurol., 13(4):397–405 (2000); Redler RL, Dokholyan NV, Progress in Molecular Biology and Transla- tional Science, 107:215–62 (2012)). No entanto, SOD1 de tipo selva- gem, sob condições de estresse celular, também foi implicado em uma fração significativa de casos esporádicos de ALS, que representam
90% dos pacientes de ALS. As mutações mais frequentes no SOD1 humano são A4V nos Estados Unidos; H46R no Japão; e G93S na Is- lândia. Outras mutações SOD1 humanas bem conhecidas incluem: A4T, G141X, D133A, V148G, N139K, G85R, G93A, V14G, C6S, I113T, D49K, G37R, A89V, E100G, D90A, T137A, E100K, G41A, G41D, G41S, G13R, G72S, L8V, F20C, Q22L, H48R, T54R, S591, V87A, T88deltaTAD, A89T, V97M, S105deltaSL, V118L, D124G, L114F, D90A, G12R e G147R. Há uma heterogeneidade significativa na duração da doença com base na mutação SOD1 (ver Figura 1). Praticamente todas as mutações SOD1 causadoras de ALS conheci- das agem de forma dominante; uma única cópia mutante do gene SOD1 é suficiente para causar a doença.
[0072] A sequência de aminoácidos de SOD1 humana pode ser encontrada em UniProt P00441 e GENBANK Nº de acesso NP_000445, e é fornecida abaixo:
MATKAVCVLK GDGPVQGIIN FEQKESNGPV KVWGSIKGLT EGLHGFHVHE FGDNTAGCTS AGPHFNPLSR KHGGPKDEER
HVGDLGNVTA DKDGVADVSI EDSVISLSGD HCIIGRTLVV HEKADDLGKG GNEESTKTGN AGSRLACGVI GIAQ (SEQ ID NO:2)
[0073] A sequência de nucleotídeos que codifica SOD1 humano é fornecida no GENBANK Nº de Acesso NM_000454.4, e também é for- necida abaixo (a região reconhecida pelo oligonucleotídeo antissenso desta divulgação está sublinhada): 1 gtttggggcc agagtgggcg aggcgcggag gtctggccta taaagtagtc gcggagacgg 61 ggtgctggtt tgcgtcgtag tctcctgcag cgtctggggt ttccgttgca gtcctcggaa 121 ccaggacctc ggcgtggcct agcgagttat ggcgacgaag gccgtgtgcg tgctgaaggg 181 cgacggccca gtgcagggca tcatcaattt cgagcagaag gaaagtaatg gaccagtgaa 241 ggtgtgggga agcattaaag gactgactga aggcctgcat ggattccatg ttcatgagtt 301 tggagataat acagcaggct gtaccagtgc aggtcctcac tttaatcctc tatccagaaa 361 acacggtggg ccaaaggatg aagagaggca tgttggagac ttgggcaatg tgactgctga 421 caaagatggt gtggccgatg tgtctattga agattctgtg atctcactct caggagacca
481 ttgcatcatt ggccgcacac tggtggtcca tgaaaaagca gatgacttgg gcaaaggtgg 541 aaatgaagaa agtacaaaga caggaaacgc tggaagtcgt ttggcttgtg gtgtaattgg 601 gatcgcccaa taaacattcc cttggatgta gtctgaggcc ccttaactca tctgttatcc 661 tgctagctgt agaaatgtat cctgataaac attaaacact gtaatcttaa aagtgtaatt 721 gtgtgacttt ttcagagttg ctttaaagta cctgtagtga gaaactgatt tatgatcact 781 tggaagattt gtatagtttt ataaaactca gttaaaatgt ctgtttcaat gacctgtatt 841 ttgccagact taaatcacag atgggtatta aacttgtcag aatttctttg tcattcaagc 901 ctgtgaataa aaaccctgta tggcacttat tatgaggcta ttaaaagaat ccaaattcaa 961 actaaaaaaa aaaaaaaaaa a (SEQ ID NO:3) ISIS 666853
[0074] ISIS 666853 é um gapmer 5-10-5 MOE, tendo a sequência de (de 5’ a 3’) CAGGATACATTTCTACAGCT (SEQ ID NO:1), em que cada um dos nucleosídeos 1-5 e 16-20 são nucleosídeos modificados por 2’-O-metoxietilribose, e cada um dos nucleosídeos 6-15 são 2’- desoxinucleosídeos, em que as ligações internucleosídicas entre os nucleosídeos 2 a 3, 4 a 5, 16 a 17, e 18 a 19 são ligações fosfodiéster e ligações internucleosídicas entre os nucleosídeos 1 a 2, 3 a 4, 5 a 6, 6 a 7, 7 a 8, 8 a 9, 9 a 10, 10 a 11, 11 a 12, 12 a 13, 13 a 14, 14 a 15, 15 a 16, 17 a 18, e 19 a 20 são ligações fosforotioato, e em que cada citosina é uma 5-metilcitosina. ISIS 666853 é descrito pela seguinte notação química: mCes Aeo Ges Geo Aes Tds Ads mCds Ads Tds Tds mCds Tds Ads mCeo Aes Geo mCes Te; em que, A = uma adenina, mC = uma 5-metilcitosina, G = uma guanina, T = uma timina, e = um açúcar modificado com 2'-O-metoxietilribose, d = um açúcar 2'-desoxirribose, s = uma ligação internucleosídica fosforotioato, e o = uma ligação internucleosídica fosfodiéster.
[0075] A sequência ISIS 666853 também pode ser escrita abrevia-
damente da seguinte forma: 5′ -MeCAP=OGGP=OATAMeCATTTMeCTAMeCP=OAGP=OMeCMeU- 3′
[0076] Os resíduos sublinhados são nucleosídeos 2'-MOE. A ano- tação P = O reflete a localização das ligações de diéster de fosfato.
[0077] ISIS 666853 é representado pela seguinte estrutura quími- ca: .
[0078] Deve ser entendido que em solução o oligonucleotídeo an- tissenso pode existir na forma de ácido livre, em uma forma de sal ou uma mistura das mesmas. Sal nonadecassódico de ISIS 666853 ("Composto A")
[0079] O Composto A é um sal nonadecossódico de ISIS 666853, um oligonucleotídeo inibidor antissenso do ácido ribonucleico mensa- geiro de SOD1 (mRNA) que reduz os níveis da proteína SOD1 em in- divíduos com SOD1 ALS. Reduzir o mRNA de SOD1 e, subsequente- mente, a proteína tóxica SOD1 pode oferecer benefícios terapêuticos para indivíduos com SOD1 ALS.
[0080] A estrutura do Composto A é fornecida abaixo:
.
[0081] A fórmula molecular do Composto A é: C230 H298 N72 Na19 O123 P19 S15, que tem um peso molecular = 7545,59 amu.
[0082] O composto A é complementar a uma porção da região 3' não traduzida (3' UTR) do mRNA para SOD1 humano, ligação por par de bases de Watson Crick. A hibridização (ligação) do Composto A ao mRNA cognato resulta na degradação mediada por RNase-H1 do mRNA para SOD1 e, assim, reduz a quantidade de síntese de proteína SOD1. A RNase H é uma enzima expressa de forma ubíqua (nu- clease) que reconhece um heteroduplex ácido desoxirribonucleico- ácido ribonucleico (DNA-RNA) e cliva a fita de RNA do duplex. Ao se ligar à região 3'-UTR do mRNA de SOD1, o Composto A direciona se- letivamente a RNase H1 ao mRNA de SOD1 e promove sua clivagem, o que leva à expressão reduzida de ambas as variantes de SOD1 de tipo selvagem e mutantes.
[0083] O Composto A aumentou significativamente a sobrevida média em camundongos transgênicos SOD1 G93A (Mantel-Cox, p <0,01). Também causou uma proteção dependente da dose da função neuromuscular, medida pelo potencial de ação muscular composto em camundongos transgênicos SOD1 G93A. Oligonucleotídeos antissenso conjugados
[0084] Os Oligonucleotídeos antissenso desta divulgação podem estar covalentemente ligados a uma ou mais frações ou conjugados que intensificam a atividade, a distribuição celular ou a absorção celu- lar dos oligonucleotídeos antissenso resultantes. Os grupos conjuga- dos típicos incluem frações de colesterol e frações de lipídio. Os gru- pos conjugados adicionais incluem carboidratos, fosfolipídios, biotina, fenazina, folato, fenantridina, antraquinona, acridina, fluoresceínas, rodaminas, cumarinas e corantes. Oligonucleotídeos antissenso tam- bém podem ser modificados para ter um ou mais grupos de estabiliza- ção que estão geralmente ligados a um ou a ambos os terminais dos oligonucleotídeos antissenso para intensificar as propriedades, tal co- mo, por exemplo, a estabilidade à nuclease. Incluídas nos grupos de estabilização estão as estruturas de cap. Estas modificações terminais protegem o oligonucleotídeo antissenso tendo um ácido nucleico ter- minal a partir da degradação pela exonuclease, e podem ajudar na dis- tribuição e/ou localização dentro de uma célula. O cap pode estar pre- sente no 5'-terminal (5'-revestimento), ou no 3'-terminal (3'- revestimento), ou pode estar presente em ambos os terminais. As es- truturas de cap são bem conhecidas na técnica e incluem, por exem- plo, revestimentos abásicos de desóxi invertido. Outros grupos de es- tabilização 3' e 5' que podem ser usados para cobrir uma ou ambas as extremidades de um oligonucleotídeo antissenso para conferir estabili- dade de nuclease incluem aqueles divulgados em WO 03/004602. Composições e Métodos para a Formulação de Composições Farma- cêuticas
[0085] Os oligonucleotídeos antissenso ou sais dos mesmos, des- ta divulgação, podem ser misturados com substâncias farmaceutica- mente aceitáveis ativas ou inertes para a preparação de composições ou formulações farmacêuticas. As composições e métodos para a for- mulação de composições farmacêuticas são dependentes de uma sé- rie de critérios, incluindo, sem limitação, via de administração, exten- são da doença, ou dose a ser administrada.
[0086] Um oligonucleotídeo antissenso, ou sal do mesmo, direcio- nado a um ácido nucleico de SOD1 pode ser usado em composições farmacêuticas combinando o oligonucleotídeo antissenso ou sal do mesmo, com um diluente ou carreador farmaceuticamente aceitável adequado. Um diluente farmaceuticamente aceitável inclui solução sa- lina tamponada com fosfato (PBS). O PBS é um diluente adequado para uso em composições a serem distribuídas por via parenteral. Nesse sentido, em uma modalidade, empregada nos métodos descri- tos neste documento, está uma composição farmacêutica que com- preende um oligonucleotídeo antissenso, ou sal do mesmo, direciona- do para um ácido nucleico de SOD1 e um diluente farmaceuticamente aceitável.
[0087] Um oligonucleotídeo antissenso, ou sal do mesmo, descrito neste documento pode ser formulado como uma composição farma- cêutica para administração intratecal a um indivíduo.
[0088] As composições farmacêuticas que compreendem oligonu- cleotídeos antissenso englobam quaisquer sais farmaceuticamente aceitáveis, ésteres e sais desses ésteres, ou qualquer outro oligonu- cleotídeo que, após a administração a um animal, incluindo um huma- no, seja capaz de fornecer (direta ou indiretamente) o metabólito bio- logicamente ativo ou resíduo do mesmo. Consequentemente, por exemplo, a divulgação também é direcionada a sais farmaceuticamen- te aceitáveis de oligonucleotídeos antissenso e outros bioequivalentes. Os sais farmaceuticamente aceitáveis adequados incluem, mas não se limitam a, sais de sódio e de potássio. Métodos de Tratamento
[0089] A divulgação apresenta um método de tratamento ou pre- venção da esclerose lateral amiotrófica associada a uma mutação no gene SOD1 humano em um indivíduo humano em necessidade do mesmo. O método envolve a administração ao indivíduo humano por administração intratecal de uma dose fixa de um oligonucleotídeo an- tissenso, em que a sequência de nucleobase do oligonucleotídeo an- tissenso consiste em CAGGATACATTTCTACAGCT (SEQ ID NO: 1), em que cada um dos nucleosídeos 1-5 e 16-20 são nucleosídeos mo- dificados com 2'-O-metoxietilribose e cada um dos nucleosídeos 6-15 são 2'-desoxinucleosídeos, em que as ligações internucleosídicas en- tre os nucleosídeos 2 a 3, 4 a 5, 16 a 17 e 18 a 19 são ligações fosfo- diéster e as ligações internucleosídicas entre os nucleosídeos 1 a 2, 3 a 4, 5 a 6, 6 a 7, 7 a 8, 8 a 9, 9 a 10, 10 a 11, 11 a 12, 12 a 13, 13 a 14, 14 a 15, 15 a 16, 17 a 18 e 19 a 20 são ligações fosforotioato, e em que cada citosina é uma 5-metilcitosina. Em certos casos, a dose fixa do oligonucleotídeo antissenso é de cerca de 100 mg ou 100 mg. Em outros casos, a dose fixa do oligonucleotídeo antissenso é de cer- ca de 60 mg ou 60 mg. Em ainda outros casos, a dose fixa do oligonu- cleotídeo antissenso é de cerca de 40 mg ou 40 mg. Em alguns outros casos, a dose fixa do oligonucleotídeo antissenso é de cerca de 20 mg ou 20 mg. Em certos casos, a dose fixa do sal de sódio do oligonucleo- tídeo antissenso é de cerca de 105,9 mg ou 105,9 mg. Em outros ca- sos, a dose fixa do sal de sódio do oligonucleotídeo antissenso é de cerca de 63,5 mg ou 63,5 mg. Em ainda outros casos, a dose fixa do sal de sódio do oligonucleotídeo antissenso é de cerca de 42,3 mg ou 42,3 mg. Em alguns outros casos, a dose fixa do sal de sódio do oligo- nucleotídeo antissenso é de cerca de 21,2 mg ou 21,2 mg.
[0090] Também são fornecidos métodos de redução da síntese de proteína SOD1 humana em um indivíduo humano com uma mutação no gene SOD1 humano associado à esclerose lateral amiotrófica. O método envolve a administração ao indivíduo humano por administra- ção intratecal de uma dose fixa de um oligonucleotídeo antissenso, em que a sequência de nucleobase do oligonucleotídeo antissenso consis- te em CAGGATACATTTCTACAGCT (SEQ ID NO: 1), em que cada um dos nucleosídeos 1-5 e 16-20 são nucleosídeos modificados com 2'-O-metoxietilribose e cada um dos nucleosídeos 6-15 são 2'- desoxinucleosídeos, em que as ligações internucleosídicas entre os nucleosídeos 2 a 3, 4 a 5, 16 a 17 e 18 a 19 são ligações fosfodiéster e as ligações internucleosídicas entre os nucleosídeos 1 a 2, 3 a 4, 5 a 6, 6 a 7, 7 a 8, 8 a 9, 9 a 10, 10 a 11, 11 a 12, 12 a 13, 13 a 14, 14 a 15, 15 a 16, 17 a 18 e 19 a 20 são ligações fosforotioato, e em que ca- da citosina é uma 5-metilcitosina. Em certos casos, a dose fixa do oli- gonucleotídeo antissenso é de cerca de 100 mg ou 100 mg. Em outros casos, a dose fixa do oligonucleotídeo antissenso é de cerca de 60 mg ou 60 mg. Em ainda outros casos, a dose fixa do oligonucleotídeo an- tissenso é de cerca de 40 mg ou 40 mg. Em alguns outros casos, a dose fixa do oligonucleotídeo antissenso é de cerca de 20 mg ou 20 mg.
[0091] Também são fornecidos métodos de redução dos níveis de mRNA de SOD1 humano em um indivíduo humano com uma mutação no gene SOD1 humano associado à esclerose lateral amiotrófica. O método envolve a administração ao indivíduo humano por administra- ção intratecal de uma dose fixa de um oligonucleotídeo antissenso, em que a sequência de nucleobase do oligonucleotídeo antissenso consis- te em CAGGATACATTTCTACAGCT (SEQ ID NO: 1), em que cada um dos nucleosídeos 1-5 e 16-20 são nucleosídeos modificados com 2'-O-metoxietilribose e cada um dos nucleosídeos 6-15 são 2'- desoxinucleosídeos, em que as ligações internucleosídicas entre os nucleosídeos 2 a 3, 4 a 5, 16 a 17 e 18 a 19 são ligações fosfodiéster e as ligações internucleosídicas entre os nucleosídeos 1 a 2, 3 a 4, 5 a
6, 6 a 7, 7 a 8, 8 a 9, 9 a 10, 10 a 11, 11 a 12, 12 a 13, 13 a 14, 14 a 15, 15 a 16, 17 a 18 e 19 a 20 são ligações fosforotioato, e em que ca- da citosina é uma 5-metilcitosina. Em certos casos, a dose fixa do oli- gonucleotídeo antissenso é de cerca de 100 mg ou 100 mg. Em outros casos, a dose fixa do oligonucleotídeo antissenso é de cerca de 60 mg ou 60 mg. Em ainda outros casos, a dose fixa do oligonucleotídeo an- tissenso é de cerca de 40 mg ou 40 mg. Em alguns outros casos, a dose fixa do oligonucleotídeo antissenso é de cerca de 20 mg ou 20 mg.
[0092] Também são fornecidos métodos de tratamento ou preven- ção de esclerose lateral amiotrófica associada a uma mutação no gene SOD1 em um indivíduo humano em necessidade do mesmo, em que o método envolve a administração ao indivíduo humano por administra- ção intratecal de uma composição farmacêutica compreendendo um oligonucleotídeo antissenso ou um sal do mesmo, em que o oligonu- cleotídeo antissenso tem a seguinte estrutura: .
[0093] Em certos casos, o oligonucleotídeo antissenso ou o sal do mesmo é administrado em uma dose equivalente a cerca de 100 mg ou 100 mg do oligonucleotídeo antissenso. Em outros casos, o oligonucleo- tídeo antissenso ou o sal do mesmo é administrado em uma dose equi- valente a cerca de 60 mg ou 60 mg do oligonucleotídeo antissenso. Em outros casos, o oligonucleotídeo antissenso ou o sal do mesmo é admi- nistrado em uma dose equivalente a cerca de 40 mg ou 40 mg do oligo- nucleotídeo antissenso. Em outros casos, o oligonucleotídeo antissenso ou o sal do mesmo é administrado em uma dose equivalente a cerca de 20 mg ou 20 mg do oligonucleotídeo antissenso.
[0094] Também são fornecidos métodos de redução da síntese de proteína SOD1 humana em um indivíduo humano com uma mutação no gene SOD1 humano associado à esclerose lateral amiotrófica, em que o método envolve a administração ao indivíduo humano por admi- nistração intratecal de uma composição farmacêutica compreendendo um oligonucleotídeo antissenso ou um sal do mesmo, em que o oligo- nucleotídeo antissenso tem a seguinte estrutura: .
[0095] Em certos casos, o oligonucleotídeo antissenso ou o sal do mesmo é administrado em uma dose equivalente a cerca de 100 mg ou 100 mg do oligonucleotídeo antissenso. Em outros casos, o oligonucleo- tídeo antissenso ou o sal do mesmo é administrado em uma dose equi- valente a cerca de 60 mg ou 60 mg do oligonucleotídeo antissenso. Em outros casos, o oligonucleotídeo antissenso ou o sal do mesmo é admi- nistrado em uma dose equivalente a cerca de 40 mg ou 40 mg do oligo- nucleotídeo antissenso. Em outros casos, o oligonucleotídeo antissenso ou o sal do mesmo é administrado em uma dose equivalente a cerca de 20 mg ou 20 mg do oligonucleotídeo antissenso.
[0096] Também são fornecidos métodos de redução dos níveis de mRNA de SOD1 humano em um indivíduo humano com uma mutação no gene SOD1 humano associado à esclerose lateral amiotrófica, em que o método envolve a administração ao indivíduo humano por admi- nistração intratecal de uma composição farmacêutica compreendendo um oligonucleotídeo antissenso ou um sal do mesmo, em que o oligo- nucleotídeo antissenso tem a seguinte estrutura: .
[0097] Em certos casos, o oligonucleotídeo antissenso ou o sal do mesmo é administrado em uma dose equivalente a cerca de 100 mg ou 100 mg do oligonucleotídeo antissenso. Em outros casos, o oligo- nucleotídeo antissenso ou o sal do mesmo é administrado em uma do- se equivalente a cerca de 60 mg ou 60 mg do oligonucleotídeo antis- senso. Em outros casos, o oligonucleotídeo antissenso ou o sal do mesmo é administrado em uma dose equivalente a cerca de 40 mg ou 40 mg do oligonucleotídeo antissenso. Em outros casos, o oligonucleo- tídeo antissenso ou o sal do mesmo é administrado em uma dose equivalente a cerca de 20 mg ou 20 mg do oligonucleotídeo antissen- so.
[0098] Em alguns casos, uma dose fixa do oligonucleotídeo antis- senso, ou sal do mesmo, é administrada ao indivíduo humano uma vez por semana, uma vez a cada duas semanas, uma vez a cada três se- manas ou uma vez a cada quatro semanas.
[0099] Em alguns casos, o oligonucleotídeo antissenso descrito neste documento é administrado ao indivíduo humano como parte de uma composição farmacêutica. Em certas modalidades, a composição farmacêutica é administrada ao indivíduo humano em uma quantidade suficiente para distribuir uma dose fixa de (ou seja, o equivalente de) cerca de 20 mg do oligonucleotídeo antissenso. Em certas modalida- des, a composição farmacêutica é administrada ao indivíduo humano em uma quantidade suficiente para distribuir uma dose fixa de cerca de 40 mg do oligonucleotídeo antissenso. Em certas modalidades, a composição farmacêutica é administrada ao indivíduo humano em uma quantidade suficiente para distribuir uma dose fixa de cerca de 60 mg do oligonucleotídeo antissenso. Em certas modalidades, a compo- sição farmacêutica é administrada ao indivíduo humano em uma quan- tidade suficiente para distribuir uma dose fixa de cerca de 100 mg do oligonucleotídeo antissenso.
[00100] Em certas modalidades, uma dose fixa do oligonucleotídeo antissenso, ou sal do mesmo, é administrada como dose(s) de ataque. Em algumas modalidades, uma dose fixa do oligonucleotídeo antis- senso observada acima é administrada como dose(s) de manutenção. Em certos casos, a dose fixa acima observada do oligonucleotídeo an- tissenso é administrada como uma dose(s) de ataque e seguida por uma dose(s) de manutenção. A(s) dose(s) de ataque pode(m) ser ad- ministrada(s), por exemplo, todas as semanas, a cada duas semanas, a cada três semanas ou a cada quatro semanas. A(s) dose(s) de ma- nutenção pode(m) ser administrada(s), por exemplo, todas as sema- nas, a cada duas semanas, a cada três semanas ou a cada quatro semanas após a última dose de ataque. Em alguns casos, a(s) dose(s) de manutenção é(são) administrada(s) todos os meses.
[00101] Em certas modalidades, o indivíduo humano recebe três doses de ataque do oligonucleotídeo antissenso, ou sal do mesmo, seguidas por pelo menos uma (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, ou mais) dose de manutenção. Em alguns casos, as três doses de ataque são administradas com duas semanas de intervalo. Em al- guns casos, as três doses de ataque são administradas com 14 dias de intervalo. Em alguns casos, a dose/as doses de manutenção são administradas começando em após a terceira dose de ataque. Em al- guns casos, a dose/doses de manutenção é(são) administradas todos os meses, começando após a terceira dose de ataque. Em alguns ca- sos, a dose/doses de manutenção é(são) administradas a cada 28 di- as, começando após a terceira dose de ataque.
[00102] A mutação em SOD1 pode ser qualquer mutação no gene SOD1 humano que está ligado a ALS. Em alguns casos, a mutação é uma mutação da doença ALS de progressão lenta. Em outros casos, a mutação é uma mutação da doença ALS de progressão rápida. Em certos casos, a mutação no gene SOD1 é um ou mais de A4V, H46R,
G93S, A4T, G141X, D133A, V148G, N139K, G85R, G93A, V14G, C6S, I113T, D49K, G37R, A89V, E100G, D90A, T137A, E100K, G41A, G41D, G41S, G13R, G72S, L8V, F20C, Q22L, H48R, T54R, S591, V87A, T88deltaTAD, A89T, V97M, S105deltaSL, V118L, D124G, L114F, D90A, G12R, ou G147R. Em uma modalidade particular, o in- divíduo humano tem uma mutação de A4V no gene SOD1 humano. Em outra modalidade particular, o indivíduo humano tem uma mutação H46R no gene SOD1 humano. Em ainda outra modalidade particular, o indivíduo humano tem uma mutação G93S no gene SOD1 humano.
[00103] Em certos casos, a mutação no gene SOD1 é identificada por um teste genético.
[00104] Em alguns casos, os métodos descritos acima envolvem a identificação da mutação no gene SOD1 por um teste genético.
[00105] Em certas modalidades, a administração de uma quantida- de terapeuticamente eficaz de um oligonucleotídeo antissenso, ou um sal do mesmo (por exemplo, Composto A), a um indivíduo humano, é acompanhada pelo monitoramento dos níveis de SOD1 no indivíduo humano, para determinar a resposta do indivíduo humano à adminis- tração do oligonucleotídeo antissenso, ou sal do mesmo. A resposta de um indivíduo humano à administração do oligonucleotídeo antis- senso, ou um sal do mesmo, pode ser usada por um médico para de- terminar a quantidade e a duração da intervenção terapêutica. Em cer- tas modalidades, os níveis de SOD1 humano são monitorados no LCR. Em certas modalidades, os níveis de SOD1 humano são monito- rados no plasma.
[00106] Em certas modalidades, a administração de um oligonucle- otídeo antissenso, ou um sal do mesmo (por exemplo, Composto A), resulta na redução da expressão da proteína SOD1. Em certas moda- lidades, a administração de um oligonucleotídeo antissenso, ou um sal do mesmo (por exemplo, Composto A), resulta na redução da expres-
são da proteína SOD1 em pelo menos 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 ou 99%, ou um intervalo definido por qualquer um desses valores. Em certas modalidades, a redução da expressão da proteína SOD1 é uma redução no LCR. Em certas modalidades, a redução da expressão da proteína SOD1 é uma redu- ção no plasma.
[00107] Em certas modalidades, a administração de um oligonucle- otídeo antissenso, ou um sal do mesmo (por exemplo, Composto A), resulta em função motora e respiração melhoradas no indivíduo hu- mano. Em certas modalidades, a administração do oligonucleotídeo antissenso, ou sal do mesmo, melhora a função motora e a respiração em pelo menos 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 ou 99%, ou um intervalo definido por dois desses valo- res.
[00108] Em certas modalidades, as composições farmacêuticas que compreendem um oligonucleotídeo antissenso, ou um sal do mesmo (por exemplo, Composto A), são usadas para a preparação de um medicamento para tratar um indivíduo humano que sofre ou é suscetí- vel a ALS (por exemplo, um indivíduo humano com uma mutação SOD1 vinculada à ALS). Dispositivos de distribuição
[00109] Em certas modalidades, um oligonucleotídeo antissenso, ou um sal do mesmo (por exemplo, Composto A), é administrado ao indi- víduo humano com uma seringa para distribuição intratecal. Em outra modalidade, um oligonucleotídeo antissenso, ou um sal do mesmo (por exemplo, Composto A), é administrado ao indivíduo humano com uma bomba para distribuição intratecal. Assim, esta divulgação tam- bém fornece uma bomba ou seringa compreendendo uma preparação estéril do oligonucleotídeo antissenso, ou um sal do mesmo (por exemplo, Composto A). A seringa ou bomba pode ser adaptada para administração intratecal do oligonucleotídeo antissenso, ou um sal do mesmo. Em alguns casos, a seringa ou bomba fornece uma (s) dose (s) fixa (s) (por exemplo, cerca de 20 mg ou 20 mg, cerca de 40 mg ou 40 mg, cerca de 60 mg ou 60 mg, ou cerca de 100 mg ou 100 mg) do oligonucleotídeo antissenso. A divulgação também fornece uma bom- ba ou seringa que compreende uma preparação estéril de uma com- posição farmacêutica que compreende um oligonucleotídeo antissenso ou um sal do mesmo (por exemplo, Composto A). A seringa ou bomba pode ser adaptada para administração intratecal da composição far- macêutica. Em alguns casos, a seringa ou bomba fornece uma (s) do- se (s) fixa (s) (por exemplo, cerca de 20 mg ou 20 mg, cerca de 40 mg ou 40 mg, cerca de 60 mg ou 60 mg, ou cerca de 100 mg ou 100 mg do oligonucleotídeo antissenso da composição farmacêutica. Em uma modalidade particular, a bomba ou seringa compreende uma prepara- ção estéril de um oligonucleotídeo antissenso, ou sal do mesmo, em que a seringa ou bomba é adaptada para administração intratecal de um oligonucleotídeo antissenso, ou um sal deste (por exemplo, Com- posto A), em um dose fixa de 20 mg, 40 mg, 60 mg ou 100 mg do oli- gonucleotídeo antissenso. Ensaios Isolamento de RNA
[00110] A análise de RNA pode ser executada no RNA celular total ou poli(A)+ mRNA. O RNA é preparado usando os métodos conheci- dos na técnica, por exemplo, usando o Reagente TRIZOL (Invitrogen, Carlsbad, CA) de acordo com os protocolos recomendados pelo fabri- cante. Análise da Inibição de Níveis ou Expressão Alvo
[00111] A inibição dos níveis ou da expressão de um ácido nucleico de SOD1 pode ser avaliada de várias maneiras conhecidas na técnica. Por exemplo, os níveis de ácido nucleico alvo podem ser quantificados por, por exemplo, análise de Northern blot, reação em cadeia da poli- merase competitiva (PCR) ou PCR quantitativo em tempo real. A aná- lise de RNA pode ser executada no RNA celular total ou poli(A)+ mRNA. Os métodos de isolamento de RNA são bem conhecidos na técnica. A análise de Northern blot também é rotina na técnica. PCR quantitativo em tempo real pode ser convenientemente realizado usando o ABI PRISM 7600, 7700 ou 7900 Sequence Detection System comercialmente disponível, disponível em PE-Applied Biosystems, Foster City, CA e usado de acordo com as instruções do fabricante. Análise de PCR Quantitativa em Tempo Real de Níveis de RNA Alvo
[00112] A quantificação dos níveis de RNA SOD1 alvo pode ser realizada pelo PCR em tempo real quantitativo, usando o Sequence Detection System 7600, 7700, ou 7900 da ABI PRISM (PE-Applied Biosystems, Foster City, CA) de acordo com as instruções do fabrican- te. Métodos de PCR quantitativa em tempo real são bem conhecidos na técnica.
[00113] Antes da PCR em tempo real, o RNA isolado é submetido a uma reação de transcriptase reversa (RT), que produz o DNA com- plementar (cDNA) que é então usado como o substrato para a amplifi- cação de PCR em tempo real. A RT e as reações de PCR em tempo real são executadas sequencialmente no mesmo poço da amostra. A RT e os reagentes de PCR em tempo real são obtidos a partir de Invi- trogen (Carlsbad, CA). Reações de PCR em tempo real de RT são realizadas por métodos bem conhecidos àqueles versados na técnica.
[00114] As quantidades alvo do gene (ou RNA) obtidas por PCR em tempo real são normalizadas usando o nível de expressão de um gene cuja expressão é constante, como a ciclofilina A, ou através da quanti- ficação do RNA total usando o RIBOGREEN (Invitrogen, Inc. Carlsbad, CA). A expressão da ciclofilina A é quantificada por PCR em tempo real, ao ser executada simultaneamente com o alvo, por multiplexação ou separadamente. O RNA total é quantificado usando o reagente de quantificação de RNA da RIBOGREEN (Invitrogen, Inc. Eugene, OR). Os métodos de quantificação de RNA por RIBOGREEN são ensinados em Jones, L.J., et al., (Analytical Biochemistry, 1998, 265, 368-374). Um instrumento CYTOFLUOR 4000 (PE Applied Biosystems) é usado para medir a fluorescência RIBOGREEN.
[00115] As sondas e primers são desenhados para hibridizar a um ácido nucleico SOD1. Os métodos para desenhar as sondas e primers de PCR em tempo real são bem conhecidos na técnica e podem incluir o uso de software, tal como o Software PRIMER EXPRESS (Applied Biosystems, Foster City, CA). Análise de Níveis de Proteína
[00116] A inibição antissenso de ácidos nucleicos SOD1 pode ser avaliada ao medir níveis de proteína SOD1. Os níveis de proteína de SOD1 podem ser avaliados ou quantificados em uma variedade de maneiras bem conhecidas na técnica, tais como imunoprecipitação, análise por Western blot (immunoblotting), ensaio imunoadsorvente ligado à enzima (ELISA), ensaios de proteína quantitativos, ensaios de atividade de proteína (por exemplo, ensaios de atividade da caspase), imunohistoquímica, imunocitoquímica ou separação de células ativada por fluorescência (FACS). Os anticorpos direcionados a um alvo po- dem ser identificados e obtidos a partir de uma variedade de fontes, tais como o catálogo MSRS de anticorpos (Aerie Corporation, Birmin- gham, MI), ou podem ser preparados por meio de métodos de geração de anticorpos monoclonais ou policlonais convencionais bem conheci- dos na técnica. Anticorpos úteis para a detecção de SOD1 humano estão disponíveis comercialmente. Teste para mutações SOD1
[00117] Uma causa genética subjacente para ALS é (são) uma mu- tação(ões) no gene SOD1 humano. Consequentemente, a identifica-
ção de um indivíduo que sofre ou é suscetível a ALS pode ser realiza- da por teste genético do gene SOD1 do indivíduo usando ensaios co- nhecidos na técnica, como por exemplo, sequenciamento genético. Pelo menos 180 mutações em SOD1 humano são conhecidas na téc- nica por estarem ligadas a ALS.
[00118] A análise da suscetibilidade de um indivíduo à doença de ALS também pode ser realizada analisando o histórico familiar do indi- víduo para ALS. A análise da história familiar pode incluir um pedigree de três gerações que documenta ALS, uma revisão de registros médi- cos e estudos de autópsia de membros da família e a identificação de um padrão autossômico dominante de mutação SOD1.
[00119] O exemplo a seguir não deve ser interpretado como limi- tando o escopo da invenção de forma alguma. Exemplos Exemplo 1: Desenho do ensaio
[00120] O Composto A está sob investigação em ensaios clínicos em andamento. Os ensaios envolvem um estudo randomizado, contro- lado por placebo, de dose única ascendente (SAD) e de dose múltipla ascendente (MAD) em pacientes com SOD1 ALS. Na porção MAD, os participantes receberam 5 doses do medicamento do estudo durante aproximadamente 3 meses. Cinquenta participantes foram randomiza- dos (3:1 por coorte) para receber 20 mg, 40 mg, 60 mg ou 100 mg de Composto A ou placebo. Entre 1 e 4 participantes tratados com o Composto A por coorte tinham uma mutação SOD1 documentada que foi julgada a priori como de progresso rápido (principalmente A4V). Exemplo 2: Perfil de Segurança
[00121] No ensaio, 66 de 70 pacientes (94%) experimentaram pelo menos 1 evento adverso (AE), a maioria dos quais foi classificada co- mo leve ou moderada. Os AEs mais comuns que ocorrem em ≥ 3 par- ticipantes que receberam o Composto A foram dor de cabeça (n = 16),
dor durante o procedimento (n = 14) e síndrome pós-punção lombar (n = 13). Sete pacientes experimentaram eventos adversos graves (SA- Es), 3 dos quais foram eventos fatais. Nenhum SAE relatado no grupo de dose mais alta (Composto A 100 mg). Seis indivíduos tiveram SAEs que foram avaliados como não relacionados ao Composto A e foram considerados relacionados a ALS ou comorbidades. Todos os eventos fatais foram avaliados como não relacionados. Um paciente teve um SAE de aumento de glóbulos brancos no LCR e aumento de proteína no LCR avaliado como relacionado ao Composto A. Essas anormali- dades laboratoriais foram resolvidas apesar da dosagem contínua com o Composto A, e o paciente completou o estudo. Nenhum evento ad- verso sério foi relatado na dose mais alta testada, 100 mg. Exemplo 3: Farmacocinética e Farmacodinâmica
[00122] Aumentos dependentes da dose no plasma do Composto A (não mostrado) e concentrações de LCR foram observados nas coor- tes SAD (não mostrado) e MAD (Figura 2). A concentração plasmática do Composto A foi proporcional à dose, medida nos Dias 1 e 85, en- quanto a exposição ao Composto A no LCR mostrou uma resposta menor do que proporcional à dose. As reduções da avaliação inicial nas concentrações de SOD1 no LCR foram observadas no nível de dose múltipla de 40 mg e acima (ou seja, 60 mg e 100 mg), que au- mentaram com a quantidade de dosagem, com uma redução média máxima de 36% no grupo de dose múltipla de 100 mg (Figura 3). As reduções da avaliação inicial no LCR SOD1 foram observadas em to- dos os participantes no grupo de dose de 100 mg. A redução máxima de SOD1 foi observada na ou imediatamente após a última dose, indi- cando que a dosagem contínua além de 5 doses pode resultar em re- duções adicionais. A modelagem com base em dados pré-clínicos su- gere que o Composto A 100 mg reduz efetivamente os níveis de SOD1 na medula espinhal em >99% e aproximadamente em 25-30% no cór-
tex. Exemplo 4: Observações clínicas
[00123] A eficácia foi avaliada em vários pontos de tempo em várias escalas, incluindo a escala de avaliação funcional de esclerose lateral amiotrófica revisada (ALFSFRS-R), capacidade vital lenta (SVC) e es- calas de dinamometria manual (HHD). Em todas as coortes, os grupos tratados com o Composto A tiveram pontuações mais altas, ou seja, melhores, em comparação com os grupos tratados com placebo (Figu- ras 4A a 4C). A alteração média da avaliação inicial ao Dia 85 nas pontuações ALSFRS-R para participantes tratados com Composto A no grupo de dose de 100 mg (N = 10) foi -1,1 versus -5,6 para partici- pantes tratados com placebo (N = 12); uma diferença de 4,4 pontos. Em participantes com mutações SOD1 que são conhecidas por serem rapidamente progressivas, por exemplo, A4V, foi observada uma dife- rença marcante entre os participantes tratados com Composto A no grupo de dose de 100 mg e os participantes tratados com placebo. Nestes participantes de rápido progresso, a diferença média na mu- dança de ALSFRS-R da avaliação inicial ao Dia 85 se aproximou de 10 pontos (Figura 5). O efeito do tratamento parece ser consistente em várias escalas clínicas e redução de SOD1 no LCR em participantes de progressão rápida (Figura 5) e não rápida (Figura 6). Como quadro de referência, a diferença ALSFRS-R em 6 meses foi de 2,5 pontos no ensaio principal da edaravona em ALS.
[00124] Tomados em conjunto, o ensaio demonstrou que o Com- posto A é um tratamento seguro e eficaz para indivíduos com SOD1 ALS. Isso é reforçado mais fortemente pelos resultados em indivíduos tratados com Composto A com subtipos de mutação de progressão rápida (principalmente A4V), particularmente no grupo de dose de 100 mg, para quem um declínio rápido seria esperado na ausência de um tratamento eficaz. Como observado acima, a eficácia foi avaliada em vários pontos de tempo em várias escalas, incluindo as escalas de avaliação funcional de esclerose lateral amiotrófica revisada (ALSFRS- R), capacidade vital lenta (SVC) e de dinamometria manual (HHD). Os resultados mostram um declínio muito menor para cada um dos 3 des- fechos de função clínica no grupo de dose de Composto A 100 mg em comparação com o grupo de placebo. Exemplo 5: Níveis de Cadeia Pesada de Neurofilamento Fosforila- do (pNFH) de LCR
[00125] Em pacientes com mutações SOD1 de progressão rápida, o tratamento com o Composto A resultou em uma redução nos níveis de pNFH no LCR e uma desaceleração do declínio clínico em compara- ção com o placebo. Uma diferença maior nos níveis de pNFH no dia 85 entre os grupos de Composto A 100 mg e placebo foi observada em pacientes com mutações SOD1 de progressão rápida (Figura 7), em comparação com pacientes com outras mutações SOD1 (Figura 8). Outras Modalidades
[00126] Embora a invenção tenha sido descrita em combinação com a descrição detalhada da mesma, a descrição supracitada é des- tinada a ilustrar e não limitar o escopo da invenção, o que é definido pelo escopo das reivindicações anexas. Outros aspectos, vantagens e modificações estão dentro do escopo das reivindicações a seguir.

Claims (41)

REIVINDICAÇÕES
1. Método de tratamento ou prevenção da esclerose lateral amiotrófica associada com uma mutação no gene superóxido dismu- tase 1 (SOD1) em um indivíduo humano em necessidade do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao indivíduo humano por administração intratecal uma composição farmacêutica em uma quantidade suficiente para distribuir uma dose fixa de cerca de 100 mg de um oligonucleotídeo antissenso, em que a sequência de nucleobase do oligonucleotídeo antissenso consiste em CAGGATA- CATTTCTACAGCT (SEQ ID NO: 1), em que cada um dos nucleosí- deos 1-5 e 16-20 são nucleosídeos modificados com 2'-O- metoxietilribose e cada um dos nucleosídeos 6-15 são 2'- desoxinucleosídeos, em que as ligações internucleosídicas entre os nucleosídeos 2 a 3, 4 a 5, 16 a 17 e 18 a 19 são ligações fosfodiéster e as ligações internucleosídicas entre os nucleosídeos 1 a 2, 3 a 4, 5 a 6, 6 a 7, 7 a 8, 8 a 9, 9 a 10, 10 a 11, 11 a 12, 12 a 13, 13 a 14, 14 a 15, 15 a 16, 17 a 18 e 19 a 20 são ligações fosforotioato, e em que ca- da citosina é uma 5-metilcitosina.
2. Método de tratamento ou prevenção de esclerose lateral amiotrófica associada com uma mutação no gene superóxido dismu- tase 1 (SOD1) em um indivíduo humano em necessidade do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao indivíduo humano por administração intratecal uma composição farmacêutica em uma quantidade suficiente para distribuir uma dose fixa de cerca de 60 mg de um oligonucleotídeo antissenso, em que a sequência de nucleobase do oligonucleotídeo antissenso consiste em CAGGATA- CATTTCTACAGCT (SEQ ID NO: 1), em que cada um dos nucleosí- deos 1-5 e 16-20 são nucleosídeos modificados com 2'-O- metoxietilribose e cada um dos nucleosídeos 6-15 são 2'- desoxinucleosídeos, em que as ligações internucleosídicas entre os nucleosídeos 2 a 3, 4 a 5, 16 a 17 e 18 a 19 são ligações fosfodiéster e as ligações internucleosídicas entre os nucleosídeos 1 a 2, 3 a 4, 5 a 6, 6 a 7, 7 a 8, 8 a 9, 9 a 10, 10 a 11, 11 a 12, 12 a 13, 13 a 14, 14 a 15, 15 a 16, 17 a 18 e 19 a 20 são ligações fosforotioato, e em que ca- da citosina é uma 5-metilcitosina.
3. Método de tratamento ou prevenção da esclerose lateral amiotrófica associada com uma mutação no gene superóxido dismu- tase 1 (SOD1) em um indivíduo humano em necessidade do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao indivíduo humano por administração intratecal, uma composição farmacêutica em uma quantidade suficiente para distribuir uma dose fixa de cerca de 40 mg de um oligonucleotídeo antissenso, em que a sequência de nucleobase do oligonucleotídeo antissenso consiste em CAGGATA- CATTTCTACAGCT (SEQ ID NO: 1), em que cada um dos nucleosí- deos 1-5 e 16-20 são nucleosídeos modificados com 2'-O- metoxietilribose e cada um dos nucleosídeos 6-15 são 2'- desoxinucleosídeos, em que as ligações internucleosídicas entre os nucleosídeos 2 a 3, 4 a 5, 16 a 17 e 18 a 19 são ligações fosfodiéster e as ligações internucleosídicas entre os nucleosídeos 1 a 2, 3 a 4, 5 a 6, 6 a 7, 7 a 8, 8 a 9, 9 a 10, 10 a 11, 11 a 12, 12 a 13, 13 a 14, 14 a 15, 15 a 16, 17 a 18 e 19 a 20 são ligações fosforotioato, e em que ca- da citosina é uma 5-metilcitosina.
4. Método de tratamento ou prevenção de esclerose lateral amiotrófica associada com uma mutação no gene superóxido dismu- tase 1 (SOD1) em um indivíduo humano em necessidade do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao indivíduo humano por administração intratecal uma composição farmacêutica em uma quantidade suficiente para distribuir uma dose fixa de cerca de 20 mg de um oligonucleotídeo antissenso, em que a sequência de nucleobase do oligonucleotídeo antissenso consiste em CAGGATA-
CATTTCTACAGCT (SEQ ID NO: 1), em que cada um dos nucleosí- deos 1-5 e 16-20 são nucleosídeos modificados com 2'-O- metoxietilribose e cada um dos nucleosídeos 6-15 são 2'- desoxinucleosídeos, em que as ligações internucleosídicas entre os nucleosídeos 2 a 3, 4 a 5, 16 a 17 e 18 a 19 são ligações fosfodiéster e as ligações internucleosídicas entre os nucleosídeos 1 a 2, 3 a 4, 5 a 6, 6 a 7, 7 a 8, 8 a 9, 9 a 10, 10 a 11, 11 a 12, 12 a 13, 13 a 14, 14 a 15, 15 a 16, 17 a 18 e 19 a 20 são ligações fosforotioato, e em que ca- da citosina é uma 5-metilcitosina.
5. Método de redução da síntese de proteína superóxido dismutase 1 (SOD1) em um indivíduo humano com uma mutação no gene SOD1 associada à esclerose lateral amiotrófica, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao indivíduo humano por administração intratecal uma composição farmacêutica em uma quan- tidade suficiente para distribuir uma dose fixa de cerca de 100 mg de um oligonucleotídeo antissenso, em que a sequência de nucleobase do oligonucleotídeo antissenso consiste em CAGGATACATTTCTA- CAGCT (SEQ ID NO: 1), em que cada um dos nucleosídeos 1-5 e 16- 20 são nucleosídeos modificados por 2'-O-metoxietilribose e cada um dos nucleosídeos 6-15 são 2'-desoxinucleosídeos, em que as ligações internucleosídicas entre os nucleosídeos 2 a 3, 4 a 5, 16 a 17 e 18 a 19 são ligações fosfodiéster e as ligações internucleosídicas entre os nucleosídeos 1 a 2, 3 a 4, 5 a 6, 6 a 7, 7 a 8, 8 a 9, 9 a 10, 10 a 11, 11 a 12, 12 a 13, 13 a 14, 14 a 15, 15 a 16, 17 a 18, e 19 a 20 são liga- ções de fosforotioato, em que cada citosina é uma 5-metilcitosina.
6. Método de redução da síntese da proteína superóxido dismutase 1 (SOD1) em um indivíduo humano com uma mutação no gene SOD1 associada à esclerose lateral amiotrófica, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao indivíduo humano por administração intratecal uma composição farmacêutica em uma quan-
tidade suficiente para distribuir uma dose fixa de cerca de 60 mg de um oligonucleotídeo antissenso, em que a sequência de nucleobase do oligonucleotídeo antissenso consiste em CAGGATACATTTCTA- CAGCT (SEQ ID NO: 1), em que cada um dos nucleosídeos 1-5 e 16- 20 são nucleosídeos modificados por 2'-O-metoxietilribose e cada um dos nucleosídeos 6-15 são 2'-desoxinucleosídeos, em que as ligações internucleosídicas entre os nucleosídeos 2 a 3, 4 a 5, 16 a 17 e 18 a 19 são ligações fosfodiéster e as ligações internucleosídicas entre os nucleosídeos 1 a 2 , 3 a 4, 5 a 6, 6 a 7, 7 a 8, 8 a 9, 9 a 10, 10 a 11, 11 a 12, 12 a 13, 13 a 14, 14 a 15, 15 a 16, 17 a 18, e 19 a 20 são liga- ções de fosforotioato, e em que cada citosina é uma 5-metilcitosina.
7. Método de redução da síntese de proteína superóxido dismutase 1 (SOD1) em um indivíduo humano com uma mutação no gene SOD1 associada à esclerose lateral amiotrófica, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao indivíduo humano por administração intratecal uma composição farmacêutica em uma quan- tidade suficiente para distribuir uma dose fixa de cerca de 40 mg de um oligonucleotídeo antissenso, em que a sequência de nucleobase do oligonucleotídeo antissenso consiste em CAGGATACATTTCTA- CAGCT (SEQ ID NO: 1), em que cada um dos nucleosídeos 1-5 e 16- 20 são nucleosídeos modificados por 2'-O-metoxietilribose e cada um dos nucleosídeos 6-15 são 2'-desoxinucleosídeos, em que as ligações internucleosídicas entre os nucleosídeos 2 a 3, 4 a 5, 16 a 17 e 18 a 19 são ligações fosfodiéster e as ligações internucleosídicas entre os nucleosídeos 1 a 2, 3 a 4, 5 a 6, 6 a 7, 7 a 8, 8 a 9, 9 a 10, 10 a 11, 11 a 12, 12 a 13, 13 a 14, 14 a 15, 15 a 16, 17 a 18, e 19 a 20 são liga- ções de fosforotioato, em que cada citosina é uma 5-metilcitosina.
8. Método de redução da síntese da proteína superóxido dismutase 1 (SOD1) em um indivíduo humano com uma mutação no gene SOD1 associada à esclerose lateral amiotrófica, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao indivíduo humano por administração intratecal uma composição farmacêutica em uma quan- tidade suficiente para distribuir uma dose fixa de cerca de 20 mg de um oligonucleotídeo antissenso, em que a sequência de nucleobase do oligonucleotídeo antissenso consiste em CAGGATACATTTCTA- CAGCT (SEQ ID NO: 1), em que cada um dos nucleosídeos 1-5 e 16- 20 são nucleosídeos modificados por 2'-O-metoxietilribose e cada um dos nucleosídeos 6-15 são 2'-desoxinucleosídeos, em que as ligações internucleosídicas entre os nucleosídeos 2 a 3, 4 a 5, 16 a 17 e 18 a 19 são ligações fosfodiéster e as ligações internucleosídicas entre os nucleosídeos 1 a 2, 3 a 4, 5 a 6, 6 a 7, 7 a 8, 8 a 9, 9 a 10, 10 a 11, 11 a 12, 12 a 13, 13 a 14, 14 a 15, 15 a 16, 17 a 18, e 19 a 20 são liga- ções de fosforotioato, e em que cada citosina é uma 5-metilcitosina.
9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que a mutação no gene SOD1 é A4V.
10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 8, caracterizado pelo fato de que a mutação no gene SOD1 é A4V, H46R, G93S, A4T, G141X, D133A, V148G, N139K, G85R, G93A, V14G, C6S, I113T, D49K, G37R, A89V , E100G, D90A, T137A, E100K, G41a, G41D, G41S, G13R, G72S, L8V, F20C, Q22L, H48R, T54R, S591, V87A, T88deltaTAD, A89T, V97M, S105deltaSL, V118L, D124G, L114F, D90A, G12R ou G147R.
11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 10, caracterizado pelo fato de que a mutação no gene SOD1 é identificada por um teste genético.
12. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 10, caracterizado pelo fato de que compreende a identifica- ção da mutação no gene SOD1 por um teste genético.
13. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 12, caracterizado pelo fato de que a composição farmacêuti-
ca é administrada ao indivíduo humano pelo menos 5 vezes ao longo de quatro meses.
14. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 13, caracterizado pelo fato de que o indivíduo humano recebe doses de ataque da composição farmacêutica seguidas por doses de manutenção da composição farmacêutica.
15. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracteriza- do pelo fato de que ao indivíduo humano são administradas três doses de ataque, e em que as doses de ataque são administradas com duas semanas de intervalo.
16. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracteriza- do pelo fato de que as doses de manutenção são administradas a ca- da 4 semanas, começando 4 semanas após a terceira dose de ataque.
17. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracteriza- do pelo fato de que as doses de ataque e as doses de manutenção da composição farmacêutica são administradas ao indivíduo humano co- mo segue: (i) uma primeira dose de ataque da composição farmacêuti- ca; (ii) uma segunda dose de ataque da composição farmacêu- tica administrada 14 dias após a primeira dose de ataque; (iii) uma terceira dose de ataque da composição farmacêu- tica administrada 28 dias após a primeira dose de ataque; e (iv) uma primeira dose de manutenção da composição far- macêutica administrada 28 dias ou 1 mês após a terceira dose de ata- que.
18. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracteriza- do pelo fato de que as doses de ataque e as doses de manutenção da composição farmacêutica são administradas ao indivíduo humano co- mo segue:
(i) uma primeira dose de ataque em uma quantidade sufici- ente para distribuir uma dose fixa de cerca de 100 mg do oligonucleo- tídeo antissenso; (ii) uma segunda dose de ataque em uma quantidade sufi- ciente para distribuir uma dose fixa de cerca de 100 mg do oligonucle- otídeo antissenso, em que a segunda dose de ataque é administrada 14 dias após a primeira dose de ataque; (iii) uma terceira dose de ataque em uma quantidade sufici- ente para distribuir uma dose fixa de cerca de 100 mg do oligonucleo- tídeo antissenso, em que a terceira dose de ataque é administrada 28 dias após a primeira dose de ataque; e (iv) uma primeira dose de manutenção em uma quantidade suficiente para distribuir uma dose fixa de cerca de 100 mg do oligonu- cleotídeo antissenso, em que a primeira dose de manutenção é admi- nistrada 28 dias após a terceira dose de ataque.
19. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracteriza- do pelo fato de que as doses de ataque e as doses de manutenção da composição farmacêutica são administradas ao indivíduo humano co- mo segue: (i) uma primeira dose de ataque em uma quantidade sufici- ente para distribuir uma dose fixa de cerca de 100 mg do oligonucleo- tídeo antissenso; (ii) uma segunda dose de ataque em uma quantidade sufi- ciente para distribuir uma dose fixa de cerca de 100 mg do oligonucle- otídeo antissenso, em que a segunda dose de ataque é administrada 14 dias após a primeira dose de ataque; (iii) uma terceira dose de ataque em uma quantidade sufici- ente para distribuir uma dose fixa de cerca de 100 mg do oligonucleo- tídeo antissenso, em que a terceira dose de ataque é administrada 28 dias após a primeira dose de ataque; e
(iv) uma primeira dose de manutenção em uma quantidade suficiente para distribuir uma dose fixa de cerca de 100 mg do oligonu- cleotídeo antissenso, em que a primeira dose de manutenção é admi- nistrada 1 mês após a terceira dose de ataque.
20. Seringa ou bomba que compreende uma preparação estéril de um oligonucleotídeo antissenso, caracterizada pelo fato de que a seringa ou bomba é adaptada para administração intratecal do oligonucleotídeo antissenso a uma dose fixa de cerca de 20 mg, cerca de 40 mg, cerca de 60 mg ou cerca de 100 mg, em que a sequência de nucleobases do oligonucleotídeo antissenso consiste em CAGGA- TACATTTCTACAGCT (SEQ ID NO: 1), em que cada um dos nucleo- sídeos 1-5 e 16-20 são nucleosídeos modificados com 2'-O- metoxietilribose e cada um dos nucleosídeos 6-15 são 2'- desoxinu- cleosídeos, em que as ligações internucleosídicas entre os nucleosí- deos 2 a 3, 4 a 5, 16 a 17 e 18 a 19 são ligações fosfodiéster e as liga- ções internucleosídicas entre os nucleosídeos 1 a 2, 3 a 4, 5 a 6, 6 a 7, 7 a 8, 8 a 9, 9 a 10, 10 a 11, 11 a 12, 12 a 13, 13 a 14, 14 a 15, 15 a 16, 17 a 18 e 19 a 20 são ligações de fosforotioato, e em que cada ci- tosina é uma 5-metilcitosina.
21. Método de tratamento ou prevenção de esclerose late- ral amiotrófica associada a uma mutação no gene superóxido dismu- tase 1 (SOD1) em um indivíduo humano em necessidade do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao indivíduo humano por administração intratecal uma composição farmacêutica compreendendo um oligonucleotídeo antissenso ou um sal do mesmo, em que o oligonucleotídeo antissenso tem a seguinte estrutura:
, e em que o oligonucleotídeo antissenso ou o sal do mesmo é adminis- trado em uma dose equivalente a cerca de 100 mg do oligonucleotídeo antissenso.
22. Método de tratamento ou prevenção de esclerose late- ral amiotrófica associada a uma mutação no gene superóxido dismu- tase 1 (SOD1) em um indivíduo humano em necessidade do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao indivíduo humano por administração intratecal uma composição farmacêutica compreendendo um oligonucleotídeo antissenso ou um sal do mesmo, em que o oligonucleotídeo antissenso tem a seguinte estrutura:
, e em que o oligonucleotídeo antissenso ou o sal do mesmo é adminis- trado em uma dose equivalente a cerca de 60 mg do oligonucleotídeo antissenso.
23. Método de tratamento ou prevenção de esclerose late- ral amiotrófica associada a uma mutação no gene superóxido dismu- tase 1 (SOD1) em um indivíduo humano em necessidade do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao indivíduo humano por administração intratecal uma composição farmacêutica compreendendo um oligonucleotídeo antissenso ou um sal do mesmo, em que o oligonucleotídeo antissenso tem a seguinte estrutura:
, e em que o oligonucleotídeo antissenso ou o sal do mesmo é adminis- trado em uma dose equivalente a cerca de 40 mg do oligonucleotídeo antissenso.
24. Método de tratamento ou prevenção de esclerose late- ral amiotrófica associada a uma mutação no gene superóxido dismu- tase 1 (SOD1) em um indivíduo humano em necessidade do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao indivíduo humano por administração intratecal uma composição farmacêutica compreendendo um oligonucleotídeo antissenso ou um sal do mesmo, em que o oligonucleotídeo antissenso tem a seguinte estrutura:
, e em que o oligonucleotídeo antissenso ou o sal do mesmo é adminis- trado em uma dose equivalente a cerca de 20 mg do oligonucleotídeo antissenso.
25. Método de redução da síntese de proteína superóxido dismutase 1 (SOD1) em um indivíduo humano com uma mutação no gene SOD1 associada à esclerose lateral amiotrófica, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao indivíduo humano por administração intratecal de uma composição farmacêutica que com- preende um oligonucleotídeo antissenso ou um sal do mesmo, em que o oligonucleotídeo antissenso tem a seguinte estrutura:
, e em que o oligonucleotídeo antissenso ou o sal do mesmo é adminis- trado em uma dose equivalente a cerca de 100 mg do oligonucleotídeo antissenso.
26. Método de redução da síntese de proteína superóxido dismutase 1 (SOD1) em um indivíduo humano com uma mutação no gene SOD1 associada à esclerose lateral amiotrófica, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao indivíduo humano por administração intratecal uma composição farmacêutica que compre- ende um oligonucleotídeo antissenso ou um sal do mesmo, em que o oligonucleotídeo antissenso tem a seguinte estrutura:
, e em que o oligonucleotídeo antissenso ou o sal do mesmo é adminis- trado em uma dose equivalente a cerca de 60 mg do oligonucleotídeo antissenso.
27. Método de redução da síntese de proteína superóxido dismutase 1 (SOD1) em um indivíduo humano com uma mutação no gene SOD1 associada à esclerose lateral amiotrófica, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao indivíduo humano por administração intratecal uma composição farmacêutica que compre- ende um oligonucleotídeo antissenso ou um sal do mesmo, em que o oligonucleotídeo antissenso tem a seguinte estrutura:
, e em que o oligonucleotídeo antissenso ou o sal do mesmo é adminis- trado em uma dose equivalente a cerca de 40 mg do oligonucleotídeo antissenso.
28. Método de redução da síntese de proteína superóxido dismutase 1 (SOD1) em um indivíduo humano com uma mutação no gene SOD1 associada à esclerose lateral amiotrófica, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao indivíduo humano por administração intratecal uma composição farmacêutica que compre- ende um oligonucleotídeo antissenso ou um sal do mesmo, em que o oligonucleotídeo antissenso tem a seguinte estrutura:
, e em que o oligonucleotídeo antissenso ou o sal do mesmo é adminis- trado em uma dose equivalente a cerca de 20 mg do oligonucleotídeo antissenso.
29. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 21 a 28, caracterizado pelo fato de que a mutação no gene SOD1 é A4V.
30. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 21 a 28, caracterizado pelo fato de que a mutação no gene SOD1 é A4V, H46R, G93S, A4T, G141X, D133A, V148G, N139K, G85R, G93A, V14G, C6S, I113T, D49K, G37R, A89V, E100G, D90A, T137A, E100K, G41a, G41D, G41S, G13R, G72S, L8V, F20C, Q22L, H48R, T54R, S591, V87A, T88deltaTAD, A89T, V97M, S105deltaSL, V118L, D124G, L114F, D90A, G12R ou G147R.
31. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 21 a 30, caracterizado pelo fato de que a mutação no gene SOD1 é identificada por um teste genético.
32. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 21 a 30, caracterizado pelo fato de que compreende a identifica- ção da mutação no gene SOD1 por um teste genético.
33. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 21 a 32, caracterizado pelo fato de que ao indivíduo humano é administrado um sal do oligonucleotídeo antissenso.
34. Método, de acordo com a reivindicação 33, caracteriza- do pelo fato de que o sal é um sal de sódio.
35. Método, de acordo com a reivindicação 33, caracteriza- do pelo fato de que o sal do oligonucleotídeo antissenso tem a seguin- te estrutura: .
36. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 21 a 35, caracterizado pelo fato de que o indivíduo humano rece- be doses de ataque da composição farmacêutica seguidas por doses de manutenção da composição farmacêutica.
37. Método, de acordo com a reivindicação 36, caracteriza-
do pelo fato de que ao indivíduo humano são administradas três doses de ataque, e em que as doses de ataque são administradas com duas semanas de intervalo.
38. Método, de acordo com a reivindicação 36, caracteriza- do pelo fato de que as doses de manutenção são administradas a ca- da 4 semanas, começando 4 semanas após a terceira dose de ataque.
39. Método, de acordo com a reivindicação 36, caracteriza- do pelo fato de que as doses de ataque e as doses de manutenção da composição farmacêutica são administradas ao indivíduo humano co- mo segue: (i) uma primeira dose de ataque da composição farmacêuti- ca; (ii) uma segunda dose de ataque da composição farmacêu- tica administrada 14 dias após a primeira dose de ataque; (iii) uma terceira dose de ataque da composição farmacêu- tica administrada 28 dias após a primeira dose de ataque; e (iv) uma primeira dose de manutenção da composição far- macêutica administrada 28 dias ou 1 mês após a terceira dose de ata- que.
40. Método, de acordo com a reivindicação 36, caracteriza- do pelo fato de que as doses de ataque e as doses de manutenção da composição farmacêutica são administradas ao indivíduo humano co- mo segue: (i) uma primeira dose de ataque equivalente a cerca de 100 mg do oligonucleotídeo antissenso; (ii) uma segunda dose de ataque equivalente a cerca de 100 mg do oligonucleotídeo antissenso, em que a segunda dose de ataque é administrada 14 dias após a primeira dose de ataque; (iii) uma terceira dose de ataque equivalente a cerca de 100 mg do oligonucleotídeo antissenso, em que a terceira dose de ataque é administrada 28 dias após a primeira dose de ataque; e (iv) uma primeira dose de manutenção equivalente a cerca de 100 mg do oligonucleotídeo antissenso, em que a primeira dose de manutenção é administrada 28 dias após a terceira dose de ataque.
41. Método, de acordo com a reivindicação 36, caracteriza- do pelo fato de que as doses de ataque e as doses de manutenção da composição farmacêutica são administradas ao indivíduo humano co- mo segue: (i) uma primeira dose de ataque equivalente a cerca de 100 mg do oligonucleotídeo antissenso; (ii) uma segunda dose de ataque equivalente a cerca de 100 mg do oligonucleotídeo antissenso, em que a segunda dose de ataque é administrada 14 dias após a primeira dose de ataque; (iii) uma terceira dose de ataque equivalente a cerca de 100 mg do oligonucleotídeo antissenso, em que a terceira dose de ataque é administrada 28 dias após a primeira dose de ataque; e (iv) uma primeira dose de manutenção equivalente a cerca de 100 mg do oligonucleotídeo antissenso, em que a primeira dose de manutenção é administrada 1 mês após a terceira dose de ataque.
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