BR112021010775A2 - Derivado de poliestireno sulfonado para uso no tratamento e/ou na profilaxia da gripe felina - Google Patents

Abstract

derivado de poliestireno sulfonado para uso no tratamento e/ou na profilaxia da gripe felina. a presente invenção refere-se a um poliestireno sulfonado derivado de fórmula i para uso no tratamento e/ou na profilaxia da gripe felina, especialmente infecção causada por calicivírus felino ou herpesvírus felino, sozinho ou em terapia combinada.

Description

DERIVADO DE POLIESTIRENO SULFONADO PARA USO NO TRATAMENTO E/OU NA PROFILAXIA DA GRIPE FELINA

[001] A presente invenção se refere a um derivado de poliestireno sulfonado, em particular poliestireno sulfonato de sódio, para uso no tratamento e/ou na profilaxia da gripe felina, em particular infecção causada por calicivírus felino ou herpesvírus felino, sozinho ou em combinação com outros fármacos.

[002] A doença do trato respiratório superior (URTD) em gatos, chamada “gripe felina”, é uma doença comum cujos sintomas incluem tosse, espirros, coriza, vermelhidão dos olhos, febre ou aparecimento de secreção purulenta do nariz e dos olhos [1,2]. A doença é considerada uma das principais causas de morte em abrigos para animais e gatis [3]. Os principais fatores etiológicos virais dessa doença são herpesvírus felino tipo 1 (FHV-1, FeHv-1) e calicivírus felinos (FCV) [1,3-5].

[003] O herpesvírus felino tipo 1 (FHV-1, FeHv-1) é um membro da família Herpesviridae, que engloba vírus de DNA com envelope. Os herpesvírus são patógenos que infectam humanos e muitas espécies animais - mamíferos, répteis, pássaros, anfíbios e peixes [6]. Um dos patógenos mais comuns encontrados em humanos é o vírus herpes simplex tipo 1 (HSV- 1), responsável por úlceras que ocorrem principalmente na face, embora infecções também sejam possíveis em outras regiões do corpo. As infecções causadas por herpesvírus podem levar ao desenvolvimento de doenças mais graves ou morte [6,7]. O herpesvírus felino está relacionado ao HSV-1 e está espalhado mundialmente na população felina. Estima-se que até 90% da população felina seja soropositiva para esse patógeno, enquanto em 80% dos vírus estão presentes no estado latente [8,9]. As infecções por FHV-1 estão principalmente associadas à inflamação do trato respiratório superior, a infecções da mucosa e a infecções oculares (úlceras da córnea, conjuntivite aguda e ceratite), que podem levar à cegueira [10-13]. Além disso, as coinfecções bacterianas são especialmente perigosas para gatinhos e indivíduos imunocomprometidos, pois podem ser fatais.

[004] O herpesvírus felino se replica principalmente no tecido epitelial e leva à inflamação aguda [13]. Após a infecção das células epiteliais, o vírus é transportado para dentro dos neurônios sensoriais por via retrógrada, isto é, em direção ao corpo celular, e então entra em um estado de latência. O vírus latente ocorre na forma epissomal, porém pode ser reativado e a doença pode recidivar no caso de enfraquecimento do sistema imunológico do hospedeiro [8, 14, 15].

[005] Para tratar infecções virais por herpes em humanos, são usados atualmente análogos de nucleosídeos. O aciclovir, o penciclovir, a idoxuridina, o cidovir e a vidarabina pertencem a esse grupo. Essas moléculas inibem a replicação viral, bloqueando o centro ativo da DNA polimerase viral. Os análogos de nucleosídeos são dispensados à célula em uma forma inativa e a ativação ocorre como resultado da fosforilação realizada pela timidina quinase (TK) do herpesvírus. No estágio seguinte, ocorrem outras duas fosforilações da molécula, realizadas pelas GMP quinases do hospedeiro [16, 17]. O composto trifosforilado pode ser usado pela DNA polimerase viral como um substrato durante a reação de extensão de cadeia do polinucleotídeo, e uma vez que o derivado é incorporado ao DNA, o alongamento para. Os análogos de nucleosídeos têm uma afinidade muito maior para a polimerase viral do que para a polimerase do hospedeiro

[18]. Surpreendentemente, apesar dos sintomas de doença similares e da similaridade filogenética dos vírus, o perfil de eficácia de fármacos individuais varia em humanos e gatos. Alguns fármacos que são seguros e eficazes em humanos são tóxicos para o gato [19-21]. Por exemplo, o aciclovir (ACV) é um inibidor muito eficaz da replicação do vírus do HSV-1 em humanos, mas em gatos não apresentou atividade igualmente alta e sua biodisponibilidade era baixa [22]. Valaciclovir (VCV) é um composto transformado por esterases hepáticas em ACV, que também é muito frequentemente usado em humanos para tratar infecções herpesvirais [23]. Apesar da alta atividade antiviral de VCV in vitro, gatos que tomaram o fármaco não melhorou os sintomas da doença e, além disso, houve muitos efeitos adversos, tal como supressão da medula óssea ou necrose hepática e renal levando à morte do animal [24]. No entanto, outro derivado do aciclovir, o penciclovir (PCV), parece ser uma solução eficaz e segura [20, 25, 26]. Além disso, o famciclovir, um precursor do PCV, foi testado no tratamento e na profilaxia da infecção por FHV em gatos e se mostrou seguro [27, 28]. O famciclovir é convertido em PCV pelas aldeído oxidases hepáticas [29, 30], transportado para a célula e, como ACV, é então fosforilado por TK viral. Em seguida, outras duas fosforilações são realizadas por enzimas celulares e a extensão da cadeia polinucleotídica do material genético dos vírus é inibido [31]. No entanto, a concentração de PCV em gatos foi muito menor do que o esperado, o que provavelmente está associado a uma atividade muito menor das aldeído oxidases hepáticas em gatos do que em outros mamíferos, de modo que o precursor, isto é, o famciclovir, não seja convertido na forma ativa, isto é, PCV [26, 27, 32].

[006] O FCV é um membro da família Caliciviridae, que inclui vírus sem envelope contendo material genético na forma de RNA de fita simples com polaridade positiva. Devido à relação filogenética, os calicivírus foram divididos até agora em cinco tipos: Lagovirus, Nebovirus, Norovirus, Sapovirus e Vesivirus [45], enquanto em fevereiro de 2019 o Comitê Internacional de Taxonomia de Vírus (ICTV) formulou uma nova classificação na qual, devido à grande diversidade genética de membros da família Caliciviridae, seis novos gêneros foram classificados (além dos cinco anteriores): Bavovirus, Minovirus, Nacovirus, Nebovirus, Recovirus e Valovirus. Os vírus dessa família podem infectar humanos e animais. Um dos mais conhecidos representantes dessa família são os norovírus e sapovírus, que causam gastroenterites não bacterianas em mamíferos. Lagovírus causam febre hemorrágica letal em coelhos. Em gatos, o FCV costuma causar inflamação do trato respiratório superior, especialmente perigoso para indivíduos com sistema imunológico comprometido [46-48]. O FCV é um patógeno encontrado na população felina em todo o mundo [45, 49]. Usualmente causa conjuntivite leve e inflamação do trato respiratório superior, no entanto, os sintomas também incluem ulceração e estomatite crônica, salivação e raramente claudicação associada à sinovite aguda [50-52]. O material genético do FCV é RNA de fita simples e a alta variabilidade do genoma significa que o vírus é capaz de se adaptar muito rapidamente às mudanças nas condições ambientais [53]. Embora exista uma vacina relativamente eficaz contra o FCV e as infecções usualmente não ameacem a vida do animal, as infecções bacterianas secundárias representam uma grande ameaça para os gatos [54]. Nos últimos anos, as cepas de FCV pertencentes aos chamados VS-FCV (FCV sistêmico virulento) também foi mostrado para aparecer na população felina, que são a causa de uma epidemia com uma taxa de mortalidade de até 60% em conexão com falência de múltiplos órgãos; de acordo com a literatura, uma cepa causou sintomas de febre hemorrágica [48, 55-58]. O tratamento de uma infecção causada por FCV é baseado apenas na antibioticoterapia, que visa prevenir infecções bacterianas secundárias. Atualmente, nenhum agente terapêutico atuando diretamente sobre o FCV é usado na medicina veterinária. Vale a pena mencionar que uma atividade antiviral in vitro muito alta foi demonstrada para compostos, tais como cloreto de lítio [59] e mefloquina [60]. Infelizmente, nenhum estudo sobre a eficácia desses compostos em gatos in vivo foi realizado [59, 60]. Além disso, a ribavirina, que também inibe a infecção por FCV in vitro, é muito tóxica após administração oral para ser usada em gatos [61].

[007] Os exemplos acima indicam que os agentes atualmente disponíveis para o tratamento e/ou a profilaxia da síndrome respiratória em gatos que podem ser causados por vírus, tal como FHV ou FCV, são insuficientemente eficazes e/ou muito tóxicos. Há, portanto, a necessidade de encontrar um agente terapêutico eficaz que reduza com eficiência a infecção e a transmissão de ambos os vírus, ao mesmo tempo que é seguro para os gatos.

[008] Derivados de poliestireno sulfonado são conhecidos.

As suas propriedades antimicrobianas, em particular antivirais, também são conhecidas, bem como o seu uso em medicina, por exemplo, para o tratamento da hipercalemia.

Um derivado de poliestireno sulfonado conhecido é o poliestireno sulfonato de sódio (poli(estirenossulfonato de sódio, PSSNa)). É conhecido por sua atividade antibacteriana e antiviral.

Foi demonstrado que inibe a replicação de muitos patógenos, incluindo: HIV, HPV, HSV-1, HSV-2, Gardnerella vaginalis, Chlamydia trachomatis e Neisseria gonorrhoeae [33-37]. Até agora, porém, a possibilidade de seu uso o caso de infecção pelo vírus FCV ou FHV-1 não foi demonstrado.

No caso do HSV, o polímero PSSNa demonstrou inibir a replicação ao impedir que os vírions se liguem à superfície celular, o que torna a transmissão do vírus de uma célula infectada para uma célula saudável mais difícil [35]. Considerando que o mecanismo proposto de ação envolve atividade antiviral nos estágios iniciais da infecção, foi sugerido que PSSNa é um heparan sulfato (HS) mimético, isto é, é capaz de “mimetizar” o HS presente na superfície das células infectadas, que serve como uma molécula de adesão para HSV.

Além disso, outros miméticos de heparan sulfato, tais como fucosanóides, sulfatos de dextrano e sulfatos de manana, mostraram bloquear a ligação dos vírus HSV-1 e HSV-2 a agentes adesivos [38-41]. Além disso, λ-carragenanos tipo IV, que também são considerados miméticos de HS, são capazes de se ligar ao vírus FHV-1, o que leva ao bloqueio de sua interação com o fator de adesão (HS). Apesar de os resultados obtidos com o uso de λ-carragenanos tipo IV in vitro serem promissores, nenhuma melhora no estado de saúde foi observada após a administração da preparação contendo esse composto em gatos [42].

[009] É necessário obter novos inibidores do herpesvírus felino e a replicação do calicivírus, em particular FHV-1 e FCV, especialmente agentes com um mecanismo de ação diferente do atualmente disponível para o tratamento e/ou a prevenção da infecção causada pelo herpesvírus felino e calicivírus felino, que também seria adequado para terapia combinada para esse tipo de infecção.

[0010] O objetivo da invenção descrita no presente pedido de patente é, portanto, obter uma nova substância ativa eficaz para uso no tratamento e/ou na profilaxia da gripe felina, em particular infecção causada por calicivírus ou herpesvírus felino, em particular FHV-1, obter um novo agente eficaz para uso no tratamento e/ou na profilaxia da gripe felina, especialmente infecção causada por calicivírus ou herpesvírus felino, que pode ser usado em terapia combinada com as terapias já disponíveis para esse tipo de infecção, bem como demonstrar a possibilidade de usar tal preparação para o tratamento desse tipo de infecção.

[0011] Esses objetivos foram alcançados com as soluções apresentadas nas reivindicações de patentes anexas. Surpreendentemente, verificou-se que esses objetivos podem ser alcançados usando um derivado de poliestireno sulfonado.

[0012] A presente invenção se refere a um derivado de poliestireno sulfonado de fórmula I:

em que M é um cátion de metal, z é um número inteiro de 1 a 3 e n é um número inteiro na faixa de 7 a 6.000, para uso no tratamento e/ou na profilaxia da gripe felina, especialmente infecção causada por calicivírus felino ou herpesvírus felino.

[0013] De preferência, o derivado de poliestireno sulfonado a ser usado de acordo com a invenção está na forma de um sal, mais de preferência o derivado de poliestireno sulfonado está na forma de um sal de sódio, que é o sal de sódio de sulfonato de poliestireno (PSSNa).

[0014] De preferência, o derivado de poliestireno sulfonado a ser usado de acordo com a invenção tem um peso molecular de pelo menos 1,5 kDa, mais de preferência pelo menos 8 kDa.

[0015] Ainda mais de preferência, o derivado de poliestireno sulfonado a ser usado de acordo com a invenção tem um peso molecular na faixa de 8 kDa a 1.200 kDa, e ainda mais de preferência tem um peso molecular selecionado do grupo que consiste em 8 kDa, 19,3 kDa, 35 kDa, 46 kDa, 93,5 kDa, 200 kDa, 400 kDa, 780 kDa e 1.200 kDa, mais de preferência tem um peso molecular de 93,5 kDa ou 780 kDa.

[0016] De preferência, a infecção causada por herpesvírus felino ou calicivírus felino é gripe felina.

[0017] De preferência, a infecção causada pelo herpesvírus felino é uma infecção causada pelo herpesvírus felino tipo 1 (FHV-1).

[0018] De preferência, de acordo com a invenção, o derivado de poliestireno sulfonado é para uso em terapia combinada, que de preferência inclui o uso simultâneo de outro agente para o tratamento da gripe felina, especialmente infecção causada por calicivírus felino ou herpesvírus felino.

[0019] Por uso simultâneo entende-se nesse documento a administração de um composto da invenção simultaneamente com outro agente, de preferência para o tratamento da gripe felina, especialmente infecção causada por calicivírus felino ou herpesvírus felino, em uma formulação ou em formulações separadas.

[0020] Mais de preferência, esse outro agente para o tratamento da infecção por FHV-1 é um análogo de nucleosídeo, mais de preferência aciclovir (ACV) e/ou penciclovir (PCV).

[0021] O derivado de poliestireno sulfonado de acordo com a invenção está de preferência na forma de um sal, em particular um sal de sódio. Um derivado de poliestireno sulfonado representativo é poliestireno sulfonato de sódio (PSSNa). Um exemplo de outro sal de sulfonato de poliestireno pode ser o sal de cálcio ou sal de potássio.

[0022] Derivados de poliestireno sulfonado, tais como poliestireno sulfonato de sódio (PSSNa), podem ser preparados por qualquer método conhecido pelos habilitados na técnica. Esses compostos podem então ser incluídos na composição farmacêutica juntamente com excipientes, diluentes e/ou substratos farmaceuticamente aceitáveis adequados. As composições desse tipo podem ser preparadas na forma de formulações adequadas para administração por qualquer via de administração, tal como, por exemplo, via tópica, via nasal ou via oral. As composições desse tipo podem, por exemplo, estar na forma de uma formulação tópica, por exemplo, uma pomada, ou uma formulação oral, por exemplo, uma solução ou suspensão.

[0023] Os compostos para uso de acordo com a invenção permitem a profilaxia e/ou o tratamento da gripe felina, especialmente infecção causada por calicivírus felino ou herpesvírus felino e reduzem o risco de infecções secundárias.

Os compostos para uso de acordo com a invenção permitem adicionalmente o alívio do curso da gripe felina, especialmente infecção causada por calicivírus felino ou herpesvírus felino.

Os compostos para uso de acordo com a invenção são extremamente eficazes na medida em que conduzem à inibição quase completa da replicação in vitro de vírus que causam a gripe felina e, além disso, têm toxicidade muito baixa ou indetectável.

Além disso, os compostos para uso de acordo com a invenção são adequados para uso em terapia combinada de gripe felina, especialmente infecção causada por calicivírus felino ou herpesvírus felino, especialmente FHV-1, juntamente com pelo menos um agente adicional usado para tratar esse tipo de infecções, especialmente com um mecanismo de ação diferente do derivado de poliestireno sulfonado, especialmente o sal de sódio de sulfonato de poliestireno.

Exemplos de outros agentes usados para tratar esse tipo de infecção são análogos de nucleosídeos.

Os compostos para uso de acordo com a invenção são particularmente adequados para uso em conjunto com penciclovir (PCV). Esse uso combinado de um derivado de poliestireno sulfonado e um análogo de nucleosídeo permite um efeito sinergístico que é extremamente importante in vivo, permitindo um aumento na eficácia da terapia da gripe felina causada pelo FHV-1, especialmente a infecção causada pelo herpesvírus felino, diminuindo as doses dos agentes terapêuticos usados e reduzindo as mesmas para possíveis toxicidade e efeitos colaterais. Também possibilita o tratamento da gripe felina, especialmente a infecção causada pelo calicivírus felino ou infecção causada pelo herpesvírus felino resistente aos agentes terapêuticos atualmente disponíveis e usados para essa finalidade.

[0024] A pesquisa mostrou que um derivado de poliestireno sulfonado, de preferência PSSNa, não atua na célula infectada, mas se liga a um herpesvírus, tal como preferencialmente FHV-1, e assim bloqueia a disseminação desse vírus, limitando a infecção que ele causa. Graças a isso, tal derivado é extremamente eficaz. Além disso, apresenta baixa toxicidade e não causa efeitos adversos.

[0025] A pesquisa também mostrou que o derivado de poliestireno sulfonado, de preferência PSSNa, tem mecanismo de atividade antiviral diferente dos agentes atualmente disponíveis no mercado. Graças a isso, pode ser eficazmente usado em terapia combinada com outros fármacos antivirais usados em caso de infecção causada pelo herpesvírus felino, de preferência com análogos de nucleosídeos, especialmente o aciclovir e/ou penciclovir, de forma a obter um efeito sinergístico. Isso permite aumentar a eficácia da terapia para a infecção causada por herpesvírus felino, reduzindo as doses dos agentes usados e reduzindo a toxicidade enquanto mantém a eficácia terapêutica ou profilática adequada, bem como para o tratamento eficaz da infecção causada por mutantes resistentes a terapias atualmente disponíveis de herpesvírus felino.

[0026] Apesar de o fator de adesão para o FCV ser o ácido siálico [62], e não o HS, cujo mimético é o polímero em estudo, os inventores demonstraram que os sais de sódio de sulfonato de poliestireno de alto peso molecular inibem eficazmente a infecção induzida pelo FCV in vitro causada por ambas as cepas de laboratório F9, bem como seis cepas clínicas Kl, K2, K3, K5, K8 e K10. A inibição é observada principalmente nos estágios finais da infecção, mas a atividade antiviral também é observada nos estágios iniciais da infecção.

[0027] A pesquisa também mostrou que quanto maior o peso molecular do poliestireno sulfonato de sódio usado, maior sua atividade contra o FCV. Por exemplo, um polímero com um peso molecular de 8 kDa tem atividade antiviral similar aos polímeros de sulfonato de poliestireno com um peso molecular menor. Em contraste, os polímeros de sulfonato de poliestireno com um peso molecular acima de 35 kDa exibem atividade antiviral significativamente maior. A diferença de atividade deve-se, pelo menos em parte, ao fato de que o PSSNa com um peso molecular maior inibe o processo de infecção do FCV também nos estágios iniciais da infecção - ao inibir a adesão do vírus à superfície celular.

[0028] A presente invenção será agora ilustrada por meio de modalidades e figuras que não têm, no entanto, a intenção de limitar o escopo de proteção da invenção de qualquer forma como definido nas reivindicações da patente. Breve descrição das Figuras

[0029] A Fig. 1 mostra os resultados de um estudo sobre o efeito de polímeros de diferentes pesos moleculares na sobrevivência de células renais felinas de Crandell-Rees (CrFK). Os resultados foram apresentados para duas concentrações selecionadas, que foram a maior concentração testada e a concentração na qual foi demonstrada alta atividade antiviral, respectivamente: 500 µg/ml (fig. 1 A) e 20 µg/ml (fig. 1 B). Os valores foram normalizados para 100% de sobrevivência das células de controle não tratadas.

[0030] A Fig. 2 mostra a relação entre o peso molecular de um polímero e sua atividade contra vírus FHV-1. Usando PCR em tempo real, o número de cópias de DNA viral em 1 ml de meio foi determinado (Fig. 2 A), enquanto os ensaios de placa permitiram determinar o número de vírions infecciosos (Fig. 2 B). O teste de replicação foi realizado usando polímeros com diferentes pesos moleculares na concentração de 20 µg/ml. Para determinar a ocorrência de diferenças estatisticamente significativas entre os grupos comparados e o controle não tratado, foi realizada uma análise de variância ANOVA de uma via suportada pelo teste post-hoc de Tukey. Os valores que foram estatisticamente significativamente diferentes do controle viral foram marcados com ***, p <0,001; **, p <0,01; *, p <0,05, enquanto os valores que não foram estatisticamente diferentes foram marcados como “ns”. Os resultados são apresentados como média ± SEM.

[0031] A Fig. 3 mostra a relação entre a concentração de polímero e sua atividade contra vírus FHV-1. Usando PCR em tempo real, o número de cópias de DNA viral em 1 ml de meio foi determinado (Fig. 3 A, Fig. 3 B), enquanto os ensaios de placa permitiram para determinar o número de vírions infecciosos (Fig. 3 C, Fig. 3 D). O teste de replicação foi realizado usando diferentes concentrações de um polímero com um peso molecular de 93,5 kDa (Fig. 3 A, Fig. 3 C) e um polímero com um peso molecular de 780 kDa (Fig. 3 B, Fig. 3

D). Os valores foram normalizados para o controle viral.

[0032] A Fig. 4 mostra os resultados dos estudos sobre o mecanismo de ação dos polímeros PSSNa. Quatro testes funcionais foram realizados para identificar o estágio em que a replicação do vírus FHV-1 pelo polímero PSSNa é inibida. Usando PCR em tempo real, o número de cópias de DNA viral em 1 ml de meio foi determinado (Fig. 4 A), enquanto os ensaios de placa permitiram determinar o número de vírions infecciosos (Fig. 4 B). O teste I foi realizado usando diferentes concentrações de um polímero com um peso molecular de 93,5 kDa (Fig. 4 C) e um polímero com um peso molecular de 780 kDa (Fig. 4 D). Para determinar a ocorrência de diferenças estatisticamente significativas entre os grupos comparados e o controle de polímero não tratado, foi realizada uma análise de variância ANOVA de uma via suportada pelo teste post-hoc de Tukey. Os valores que foram estatisticamente significativamente diferentes do controle viral foram marcados com ***, p <0,001; **, p <0,01; *, p <0,05, enquanto os valores que não foram estatisticamente diferentes foram marcados como “ns”. Os resultados são apresentados como média ± SEM.

[0033] A Fig. 5 mostra a visualização da inibição da infecção pelo vírus FHV-1 de células CrFK por polímeros PSSNa. Canais individuais e uma combinação de 3 canais são mostrados separadamente. O canal azul apresenta núcleos celulares, o canal vermelho é F-actina, enquanto o canal verde é vírions FHV-1. A figura mostra visualizações de células de controle (branco), controle viral, células tratadas com PSSNa de 93,5 kDa e células tratadas com PSSNa de 780 kDa. A barra de escala marca 10 µm.

[0034] A Fig. 6 mostra a análise quantitativa das imagens obtidas em um microscópio confocal após a realização do teste II (Fig. 6A) e do teste III (Fig. 6B) feito em ImageJ Fiji. A quantidade de vírus por célula é apresentada como contagens por célula (% da média obtida para o controle viral). Os resultados são apresentados como média ± SEM; os dados eram da análise de 10 células diferentes; as imagens eram de três experimentos independentes. A fim de determinar a ocorrência de diferenças estatisticamente significativas entre os grupos comparados, uma análise de variância ANOVA de uma via foi realizada, suportada pelo teste post-hoc de Tukey. Os valores que foram estatisticamente significativamente diferentes do controle viral foram marcados com ****, p <0,0001, enquanto os valores que não eram estatisticamente diferentes foram marcados como “ns”. Os resultados são apresentados como média ± SEM.

[0035] A Fig. 7 mostra a relação entre a concentração de polímero e sua atividade contra a cepa clínica K7 de FHV-1. Uma mudança logarítmica no número de DNA viral por 1 ml de meio de cultura (Fig. 7A) foi determinada por PCR em tempo real, enquanto os ensaios de placa permitiram determinar a mudança logarítmica no número de vírions infecciosos (PFU/ml) (Fig. 7B). O teste foi realizado usando polímeros PSSNa com dois pesos moleculares diferentes (93,5 kDa e 780 kDa) em três concentrações diferentes (20, 200 e 500 µg/ml). Os valores foram normalizados para o controle viral, isto é, células infectadas não incubadas com o polímero. Os resultados são apresentados como média ± SEM.

[0036] A Fig. 8 mostra a análise da capacidade dos polímeros PSSNa para se ligarem ao vírus FHV-1, que foi apresentada como o número de contagens (vírions) por plano confocal. As contagens foram registradas em 12 planos para cada amostra. Pelo fato de os dados fornecidos não atenderem aos requisitos para uso do teste paramétrico, foi realizado o teste não paramétrico de Kruskal-Wallis, suportado pelo teste post-hoc de Dunn. Os valores que foram estatisticamente significativamente diferentes do controle viral foram marcados com ****, p <0,0001; ***, p <0,001; **, p <0,01; enquanto os valores que não foram estatisticamente diferentes foram marcados como “ns”. Os resultados foram apresentados como mediana ± intervalo interquartil.

[0037] A Fig. 9 mostra a relação entre o peso molecular de um polímero e sua atividade anti-FCV. Usando reações de RT-qPCR em tempo real, o número de cópias de RNA viral em 1 ml de meio foi determinado (Fig. 9 A), enquanto os ensaios de placa permitiram determinar o número de vírions infecciosos (Fig. 9 B). O teste foi realizado usando polímeros com diferentes pesos moleculares na concentração de 200 µg/ml. Para determinar a ocorrência de diferenças estatisticamente significativas entre os grupos comparados e o controle de polímero não tratado, foi realizada uma análise de variância ANOVA de uma via suportada pelo teste post-hoc de Tukey. Os valores que foram estatisticamente significativamente diferentes do controle viral um do outro foram marcados com ****, p <0,0001; **, p <0,01; *, p <0,05, enquanto os valores que não foram estatisticamente diferentes foram marcados como “ns”. Os resultados são apresentados como média ± SEM.

[0038] A Fig. 10 mostra a relação entre a concentração de polímero e sua atividade contra FCV. Usando reações RT-

qPCR em tempo real, o número de cópias de RNA viral em 1 ml de meio foi determinado (Fig. 10 A, Fig. 10 B), enquanto os ensaios de placa permitiram determinar o número de vírions infecciosos (Fig. 10 C, Fig. 10 D). O teste foi obtido usando diferentes concentrações de um polímero com um peso molecular de 93,5 kDa (Fig. 10 A, Fig. IO C) e um polímero com um peso molecular de 780 kDa (Fig. 10 B, Fig. 10 D). Os valores foram normalizados para o controle viral.

[0039] A Fig. 11 mostra os resultados de estudos sobre o mecanismo de ação dos polímeros PSSNa. Para identificar o estágio em que a infecção pelo FCV é inibida pelo polímero PSSNa, foram realizados 4 testes funcionais, descritos a seguir, utilizando um polímero com concentração de 200 µg/ml. Usando reações de RT-qPCR em tempo real, o número de cópias de RNA viral em 1 ml de meio foi determinado (Fig. 11 A), enquanto os ensaios de placa permitiram determinar o número de vírions infecciosos (Fig. 11 B). O teste III foi realizado usando diferentes concentrações do polímero com um peso molecular de 93,5 kDa (Fig. 11 C) e um polímero com uma massa molecular de 780 kDa (Fig. 11 D). Para determinar a ocorrência de diferenças estatisticamente significativas entre os grupos comparados e o controle de polímero não tratado, foi realizada uma análise de variância ANOVA de uma via suportada pelo teste post-hoc de Tukey. Os valores que foram estatisticamente significativamente diferentes do controle viral foram marcados com ***, p <0,001; **, p <0,01, enquanto os valores que não foram estatisticamente diferentes foram marcados como “ns”. Os resultados são apresentados como média ± SEM.

[0040] A Fig. 12 mostra uma visualização da inibição da infecção por FCV de células CrFK por polímeros PSSNa a uma concentração de 1000 µg/mL. Canais individuais e uma combinação de 3 canais são mostrados separadamente. O canal azul apresenta núcleos celulares, o canal vermelho é F- actina, enquanto o canal verde é vírions de FCV. A figura mostra visualizações de células de controle, controle viral, células tratadas com PSSNa com um peso molecular de 93,5 kDa e células tratadas com PSSNa com um peso molecular de 780 kDa. A barra de escala marca 10 µm.

[0041] A Fig. 13 mostra a análise quantitativa das imagens obtidas em um microscópio confocal após a realização do teste II (A) e do teste III (B) feito no ImageJ Fiji. A quantidade de vírus por célula é apresentada como contagens por célula (% da média obtida para o controle viral). Os resultados são apresentados como média ± SEM; os dados eram da análise de 10 células diferentes; as imagens eram de três experimentos independentes. De modo a determinar a ocorrência de diferenças estatisticamente significantes entre os grupos comparados, foi realizada uma análise de variância ANOVA de uma via suportada pelo teste post-hoc de Tukey. Os valores que foram estatisticamente significativamente diferentes do controle viral foram marcados com ****, p <0,0001, enquanto os valores que não eram estatisticamente diferentes foram marcados como “ns”.

[0042] A Fig. 14 mostra a relação entre a concentração de polímero e sua atividade contra as cepas clínicas de FCV. Usando reações RT-qPCR em tempo real, o número de RNA viral por 1 ml de meio de cultura foi determinado, enquanto os ensaios de placa permitiram determinar o número de vírions infecciosos. O teste foi realizado usando polímeros com dois pesos moleculares diferentes (93,5 kDa e 780 kDa) em três concentrações diferentes (200, 500 e 1.000 µg/ml). Os valores foram normalizados para o controle viral, isto é, células infectadas não incubadas com o polímero. Os resultados são apresentados como média ± SEM.

[0043] A Fig. 15 mostra uma análise da capacidade dos polímeros PSSNa de se ligarem aos vírus, apresentada como o número de contagens (vírions) por plano confocal. As contagens foram feitas em 12 planos para cada amostra. Pelo fato de os dados fornecidos não atenderem aos requisitos para uso do teste paramétrico, foi realizado o teste não paramétrico de Kruskal-Wallis suportado pelo teste post-hoc de Dunn. Os valores que foram estatisticamente diferentes do controle viral foram marcados com ****, p <0,0001, **, p <0,01, enquanto os valores que não eram estatisticamente diferentes foram marcados como “ns”. Os resultados foram apresentados como mediana ± intervalo interquartil.

[0044] A Figura 16 mostra a análise in vitro da atividade antiviral do hidrogel de PSSNa-PEG. A citotoxicidade do PEG400 nas concentrações de 100, 50, 40, 30, 25, 20, 15 e 10 mg/ml foi determinada pelo teste XTT (A). Os resultados foram normalizados para células de controle (não tratadas com polímero), que foi de 100%. O ensaio de replicação viral foi realizado usando células CrFK na presença de PEG400 (30 mg/ml) e PSSNa1000kDa (200 µg/ml) para FHV-1 (B, C) e para FCV (D, E). A inibição da infecção viral foi determinada por PCR em tempo real e apresentada como uma mudança logarítmica no número de cópias de DNA (para FHV-1) ou RNA (para FCV) por mililitro (B, D) ou usando um ensaio de placa e apresentado como a mudança logarítmica no número de PFU/ml

(C, E). Os resultados foram normalizados para o controle viral, isto é, células infectadas não tratadas com polímero e apresentados como média ± SEM de três experimentos independentes. Exemplos

[0045] Todos os testes e procedimentos experimentais descritos a seguir foram realizados com kits de teste, reagentes e aparelhos comercialmente disponíveis, seguindo as recomendações dos fabricantes dos kits, reagentes e aparelhos usados, salvo indicação expressa em contrário. Os parâmetros de teste indicados acima foram medidos usando métodos padrão comumente conhecidos usados no campo ao qual pertence a presente invenção. Exemplo 1 O efeito do poliestireno sulfonato de sódio (PSSNa) de diferentes pesos moleculares na sobrevivência de células CrFK

[0046] A citotoxicidade dos polímeros foi determinada usando o Kit de ensaio de Viabilidade XTT (Biological Industries, Israel), que quantifica a capacidade das células metabolicamente ativas de transformar um substrato em seu derivado colorido. A linha de célula CrFK permissiva (córtex renal do gato Crandell-Rees, Felis catus, Células Renais Felinas Crandell-Rees, ATCC® CCL-94) foi usada para conduzir o experimento. As condições de teste eram padrão. As células foram cultivadas por 48 horas em meio DMEM (Meio de Eagle Modificado com Dulbecco) suplementado com FBS a 3% (soro bovino fetal termoinativado), penicilina, estreptomicina, gentamicina e polímeros PSSNa com diferentes pesos moleculares. A Fig. 1 mostra os resultados para duas concentrações de polímero selecionadas: 500 µg/ml (Fig. 1A, concentração mais alta testada) e 20 µg/ml (Fig. 1B, concentração na qual foi demonstrada alta atividade antiviral). Resumidamente, após a cultura de células CrFK em uma placa de 96 poços por 24 horas, o meio antigo foi removido e 100 µL de meio fresco contendo a concentração de polímero selecionada foram adicionados a cada poço da placa. A amostra de controle não continha polímero no meio. O meio polimérico foi então removido e 100 µl de meio fresco com 20 µl de 2,3- bis-(2-metoxi-4-nitro-5-sulfenil)-(2H)-tetrazolina carboxianilida (XTT) ativado foram adicionados a cada poço. Após 2 horas de incubação, o sobrenadante foi transferido para uma placa transparente de 96 poços e a absorbância a 480 nm foi medida de maneira padrão usando um espectrofotômetro. Os valores dos resultados obtidos foram normalizados para a absorbância medida para células controle (sem polímeros), às quais foi atribuído um valor de sobrevivência de 100%. Onze polímeros PSSNa com diferentes pesos moleculares foram testados (1,5; 5,4; 8; 19,3; 35; 46; 93,5; 200; 400; 780 e 1200 kDa).

[0047] Os resultados obtidos indicam a falta de citotoxicidade significativa dos polímeros na faixa de peso molecular testada e na faixa de concentração testada, isto é, de 20 µg/ml a 500 µg/ml. Exemplo 2 O efeito do poliestireno sulfonato de sódio (PSSNa) na replicação do herpesvírus felino tipo 1) (FHV-1)

[0048] Para determinar a atividade do poliestireno sulfonato de sódio (PSSNa) contra o herpesvírus felino tipo 1 (cepa C-27, ATCC: VR-636), foi realizado um teste do efeito desse polímero na replicação viral. Nesse experimento, o polímero estava presente em todos os estágios da replicação viral - antes, durante e após a infecção. Resumidamente, células CrFK completamente confluentes foram semeadas 24 horas antes do experimento em uma placa de 96 poços. Em seguida, o meio foi descartado e 20 mL de meio fresco contendo polímero foram adicionados. As placas foram incubadas por 30 min a 37 °C, então o meio com o polímero foi descartado e 50 µl de solução polimérica em DMEM a 3% ou DMEM a 3% sem polímero (amostra de controle) adicionado com branco ou vírus FHV-1 (cepa C-27) com título TCID50 (50% da dose infectante da cultura de tecidos) = 400/ml. As placas foram incubadas por 2 horas a 37 °C, então as células foram lavadas duas vezes com 1 x PBS para remover as partículas virais não ligadas. Finalmente, 100 µL de solução polimérica em DMEM a 3% foram adicionados a cada poço e as células foram incubadas por 48 horas. Após esse tempo, o sobrenadante foi coletado para quantificar a infecção usando (a) PCR quantitativo (qPCR) e (b) ensaio de placa como a seguir: (a) qPCR.

[0049] O isolamento do DNA viral foi realizado 48 horas após a infecção usando o teste de isolamento do Kit de Isolamento de DNA/RNA Viral (A&A Biotechnology, Polônia) de acordo com o protocolo fornecido pelo fabricante. O DNA assim isolado foi o molde para a realização de PCR quantitativo em tempo real (qPCR). Iniciadores conhecidos na técnica para amplificar um fragmento conservado da sequência do gene para a glicoproteína B e uma sonda complementar a esse fragmento foram usados [43]. As sequências de iniciadores e sondas usadas são mostradas na Tabela 1.

Tabela 1. Sequências de iniciadores e sondas usadas para PCR em tempo real Oligonucleotídeo Sequência de Oligonucleotídeos 5’->3’ Iniciador Direto Iniciador Reverso Sonda

[0050] Resumidamente, a reação qPCR foi obtida da seguinte forma. 2,5 µl de DNA viral isolado foi amplificado em uma reação de 10 µl contendo 1 x Mistura de qPCR Kapa Probe Fast MasterMix (Sigma-Aldrich, Polônia), sonda específica a 100 nM rotulada com 6-carboxifluoresceína (FAM) e 6-carboxitetrametilrodamina (TAMRA) (5’-FAM - TAT ATG TGT CCA CCA CCT TCA GGA TCT ACT GTC GT - TAMRA – 3’), e 450 nM de cada iniciador (5’ - AGA GGC TAA CGG ACC ATC GA – 3’ e 5’ - GCC CGT GGT GGC TCT AAA C – 3’). A sonda e os iniciadores específicos mencionados acima amplificaram um fragmento de 81 pb da sequência do gene da glicoproteína B (gB) do FHV-1 para medir o número de cópias de DNA viral na amostra [43]. A reação foi realizada em um termociclador (Sistema de Detecção de PCR em Tempo Real-197 CFX96 Touch™, Bio-Rad) sob as seguintes condições: 3 min a 95 °C, então 39 ciclos de 15 segundos a 95 °C e 30 segundos a 58 °C.

[0051] Padrões apropriados foram preparados para avaliar o número de cópias do DNA viral na amostra. O fragmento da sequência gB foi amplificado usando os iniciadores descrito acima. O DNA assim obtido foi clonado no plasmídeo pTZ57R/T (Thermo Scientific, Polônia) usando o Kit de Clonagem de PCR InsTAclone (Thermo Scientific, Polônia). A transformação da cepa TOP 10 de E. coli (Life Technologies, Polônia) e a propagação do vetor plasmídeo de uma maneira padrão foi realizada. O plasmídeo foi então purificado usando o kit Miniprep de Plasmídeo GeneJET (Thermo Scientific, Polônia) e submetido à linearização por digestão com a enzima de restrição KpnI. A concentração de DNA linearizado foi avaliada por medição espectrofotométrica e o número de cópias de DNA em 1 ml de meio foi calculado. Oito diluições em série de 10 vezes consecutivas foram usadas como molde para PCR em tempo real. A capacidade dos polímeros para inibir a replicação do vírus FHV-1 foi determinada como uma diminuição no número de cópias de DNA viral em 1 ml de meio. b) Ensaios de placa

[0052] A análise quantitativa de vírions de FHV-1 infecciosos foi realizada em células CrFK que foram divididas em placas de 24 poços. 80-90% das células confluentes foram infectadas 24 horas após a divisão em placas por adição de diluições em série de 10 vezes frescas de sobrenadantes, após o que as células foram incubadas por 1 hora a 37 °C em uma atmosfera contendo CO2 a 5%. Em seguida, as células foram lavadas uma vez com 1 x PBS para remover partículas virais não ligadas e 0,5 ml de meio DMEM suplementado com soro fetal bovino termoinativado a 10% (FBS, Life Technologies, Polônia), penicilina (100 U/ml), estreptomicina (100 µg/ml) e metilcelulose a 1% (Sigma-Aldrich, Polônia). O tempo que leva para que as placas se formem pelo vírus FHV-1 é de cerca de 72 horas. Após esse tempo, as células foram fixadas e coradas com solução de violeta cristal a 0,1% dissolvida em 50% (v/v) de metanol:água. As placas foram contadas e os valores obtidos foram representados graficamente como PFU (unidade formadora de placa) por ml de meio.

[0053] Dessa forma, a relação entre o peso molecular do polímero e sua atividade contra o vírus FHV-1 foi investigada. O número de cópias de DNA viral em 1 ml de meio foi determinado por PCR quantitativo em tempo real, enquanto os ensaios de placa permitiram determinar o número de vírions infecciosos. Como mostrado na Fig. 2, o teste de replicação foi realizado usando polímeros com diferentes pesos moleculares e uma concentração de 20 µg/ml. Os resultados dos valores obtidos foram normalizados e apresentados como uma mudança logarítmica em relação ao controle viral.

[0054] As pesquisas realizadas mostraram que os polímeros testados apresentam atividade antiviral e inibem a replicação do vírus FHV-1. Não houve correlação entre a atividade antiviral e o peso molecular do polímero. Porém, observou-se que polímeros com um peso molecular acima de 8 kDa apresentaram a melhor atividade antiviral. Polímeros com um peso molecular abaixo de 8 kDa apresentaram atividade antiviral mais fraca. Exemplo 3 Relação entre a atividade antiviral do poliestireno sulfonato de sódio (PSSNa) e sua concentração no meio

[0055] Para determinar o IC50 (concentração inibitória de 50%, 50% de inibição da replicação viral) do poliestireno sulfonato de sódio (PSSNa), foi testado o efeito de diferentes concentrações desse polímero na replicação viral. Esse teste foi realizado analogamente ao Exemplo 2. A relação entre a concentração de polímero e sua atividade contra o vírus FHV-1 foi investigada.

[0056] Resumidamente, o número de cópias de DNA viral em 1 ml de meio foi determinado por PCR em tempo real (Fig. 3

A, Fig. 3 B), enquanto os testes de placa permitiram determinar o número de vírions infecciosos (Fig. 3 C, Fig. 3 D). O teste de replicação foi realizado usando diferentes concentrações do polímero com um peso molecular de 93,5 kDa (Fig. 3 A, Fig. 3 C) e um peso molecular de 780 kDa (Fig. 3 B, Fig. 3 D). Os valores foram normalizados para o controle viral.

[0057] Os valores de IC50 calculados são mostrados na Tabela 2 abaixo. Tabela 2. Valores de IC50 para polímeros determinados por PCR em tempo real e ensaio de placa Polímero IC50 ± DP [µg/ml] qPCR Ensaio de placas PSSNa93.5 2,25 ± 1,01 5,74 ± 1,32 PSSNa780 2,28 ± 1,01 5,06 ± 1,33

[0058] Os polímeros testados mostraram inibir a replicação do vírus FHV-1, em particular em baixas concentrações não tóxicas. Exemplo 4 Determinação do mecanismo de ação antiviral de polímeros PSSNa

[0059] O mecanismo de ação dos polímeros PSSNa foi estudado como a seguir. De modo a identificar o estágio no qual a replicação do vírus FHV-1 é inibida pelo polímero PSSNa, foram realizados os 4 testes funcionais descritos abaixo. Teste I (teste de inativação)

[0060] A suspensão de vírus concentrada foi incubada com o polímero por 1 hora a 22 °C com agitação e, em seguida, as amostras foram diluídas para reduzir a concentração de polímero abaixo da faixa de concentrações em que era ativo, e o título viral foi avaliado usando um ensaio de placas.

[0061] Esse teste permite determinar se a inibição ocorre por meio da interação entre o polímero e os vírus, o que evita a infecção das células. Em outras palavras, pode determinar se o composto de teste tem um efeito direto sobre os vírus. Teste II (teste de proteção de células)

[0062] As células semeadas 24 horas antes do experimento foram incubadas na presença ou ausência de polímero por 1 hora a 37 °C. As placas foram então lavadas duas vezes com 1 x PBS para remover partículas de polímero não ligadas, após o que meio fresco com amostra simulada ou o vírus (400 TCID50/ml) foi adicionado a cada poço em volume igual e incubado por 2 horas a 37 °C. As placas foram então lavadas duas vezes com 1 x PBS para remover as partículas virais não ligadas, meio fresco foi aplicado às células e incubado por 48 horas a 37 °C. Finalmente, os sobrenadantes foram coletados e a replicação de vírus foi quantificada usando ensaio de placa e qPCR.

[0063] Esse teste determina se o polímero por, por exemplo, a ligação às superfícies celulares é capaz de “protegê-las" da infecção, evitando a interação com o receptor de entrada. Teste III (teste de adesão)

[0064] Esse teste foi realizado a 4 °C em que o transporte intracelular é inibido. Resumidamente, as células CrFK confluentes foram resfriadas a 4 °C por 20 min. Em seguida, meio fresco frio com ou sem vírus (400 TCID50/ml) e com ou sem polímero foi aplicado às células. As placas foram incubadas por 1 hora a 4 °C. O transporte intracelular nessa temperatura foi interrompido, mas a adsorção de vírus aos receptores celulares foi possível. Após a incubação, as células foram lavadas duas vezes com 1 x PBS resfriadas em gelo para remover as partículas virais não ligadas e o polímero não ligado, foi adicionado meio fresco e as células foram incubadas por 48 horas a 37 °C. Após 48 horas, o sobrenadante foi coletado e o vírus foi quantificado usando qPCR e ensaio de placa.

[0065] Esse teste permite determinar se a inibição ocorre através da competição do polímero com os vírus pelo agente adesivo e/ou se o polímero, interagindo com o agente adesivo, impede sua interação com os vírus. Teste IV (teste de estágios finais: replicação, montagem e liberação).

[0066] Nesse teste, a infecção foi primeiro realizada pela incubação das células com os vírus, depois, após a incubação, os vírions não ligados foram lavados com solução de PBS e o polímero foi aplicado. Resumidamente, meio fresco contendo uma amostra simulada não infecciosa ou uma amostra de vírus (400 TCID50/ml) em volume igual foi aplicado a células CrFK confluentes, então as placas foram incubadas por 2 horas a 37 °C. Após a incubação, os poços foram lavados duas vezes com 1 x PBS para remover as partículas virais não ligadas e, em seguida, meio fresco contendo a concentração de polímero selecionada foi adicionado a cada poço. As placas foram incubadas por 48 horas a 37 °C. Após 48 horas, os sobrenadantes foram coletados, então separadamente PBS foi adicionado aos poços e as células foram submetidas a dois ciclos de congelamento-descongelamento para obter lisados de células, a replicação de vírus foi quantificada usando ensaio de placa e qPCR.

[0067] Esse teste mostra se a inibição da replicação de vírus ocorre nos estágios finais da infecção, por exemplo, replicação, montagem, liberação. Enquanto uma determinação separada do título viral em sobrenadantes e lisados de células permite determinar se a inibição ocorre no estágio de replicação viral ou no estágio de liberação de vírions infecciosos.

[0068] Nos testes descritos acima, o número de cópias de DNA viral em 1 ml de meio foi determinado por PCR em tempo real (Fig. 4 A), enquanto os ensaios de placa permitiram determinar o número de vírions (Fig. 4 B). O teste I foi realizado usando diferentes concentrações de 93,5 kDa de PSSNa (Fig. 4 C) e 780 kDa de PSSNa (Fig. 4 D).

[0069] A pesquisa realizada mostrou que o polímero interage diretamente com os vírus, o que impede que os vírus entrem na célula CrFK. Também foi demonstrado que quanto maior a concentração do polímero, maior sua eficácia na ligação do FHV-1. A inibição muito forte da infecção também é visível no estágio de adesão, mas é importante notar que durante esse teste o polímero e os vírus estão ao mesmo tempo no meio de cultura, o que permite que o polímero se ligue aos vírus e inibe sua capacidade para internalizar. A atividade antiviral também é visível nos estágios finais da infecção, que está relacionada à interação dos vírions da progênie com o polímero presente no meio; a possibilidade de um segundo mecanismo de ação independente foi excluída por experimentos adicionais. Exemplo 5

Visualização da inibição da replicação do herpesvírus felino tipo 1 por dois polímeros PSSNa selecionados por microscopia confocal

[0070] Para preparar lâminas, células CrFK foram semeadas de uma maneira padrão em lâminas de microscópio 24 horas antes do experimento. As células foram então resfriadas e incubadas por uma hora a 4 °C de uma maneira padrão na presença de vírus ou vírus e polímero. Após um determinado tempo de incubação, as partículas virais não ligadas foram removidas por lavagem, as preparações foram fixadas e coradas de maneira padrão. Para a coloração de imunofluorescência, anticorpos primários anti-FHV-1 de camundongo e anticorpos secundários anti-camundongo de cabra conjugados ao corante fluorescente Alexa Fluor 488 foram usados para visualizar vírions, faloidina conjugada a Alexa Fluor 647 para corar filamentos de F-actina e 4’,6’-diamidina-2-fenilindol (DAPI) para coloração de DNA nuclear. As projeções máximas foram apresentadas.

[0071] A Fig. 5 mostra a visualização da inibição da infecção de vírus FHV-1 de células CrFK por polímeros PSSNa. O sinal para cada uma das cores é apresentado separadamente (canais azul, vermelho e verde) e a combinação dos sinais de todos os três corantes (canais combinados). Os núcleos das células são mostrados em azul, F-actina em vermelho e os vírions de FHV-1 em verde. A figura mostra visualizações de células de controle (amostra simulada), controle viral, células tratadas com 93,5 kDa de PSSNa e células tratadas com 780 kDa de PSSNa. A barra de escala corresponde a 10 µm.

[0072] As visualizações microscópicas mostram uma diminuição significativa no número de vírions de FHV-1 em células CrFK na presença dos polímeros PSSNa testados. O estudo confirma a eficácia do derivado de poliestireno sulfonado contra a infecção causada pelo herpesvírus felino. Exemplo 6 Avaliação do efeito sinergístico de derivados de poliestireno sulfonados e análogos de nucleosídeos

[0073] O efeito sinergístico de um derivado de poliestireno sulfonado representativo, PSSNa, e análogos de nucleosídeos exemplificativos com um mecanismo diferente de atividade antiviral, isto é, aciclovir (ACV) e penciclovir (PCV), foram estudados de uma maneira conhecida [44], com algumas modificações. O experimento foi realizado em dois sistemas. Um sistema usou uma concentração constante de PSSNa (composto II) e diferentes concentrações do análogo de nucleosídeo de teste correspondente (composto I), enquanto o outro sistema usou uma concentração constante do análogo de nucleosídeo de teste correspondente (composto II) e diferentes concentrações de PSSNa (composto I). Resumidamente, o teste XTT foi realizado primeiro como descrito acima para excluir a toxicidade associada ao arrasto, então o teste de replicação do vírus foi realizado como descrito acima para determinar o valor de IC50 para cepa C-27 de FHV-1 a 400 TCID50/ml para ACV e PCV (usando qPCR). Em seguida, dois tipos de diluições em série foram preparados para avaliar o efeito sinergístico de ACV/PCV e um polímero PSSNa com um peso molecular de 780 kDa (PSSNa780): (1) seis diluições em série de 2 vezes do composto I a partir de uma concentração igual a IC50 do composto I misturado com o composto II a uma concentração igual a IC50 do composto II;

(2) seis diluições em série de 2 vezes do composto II começando com uma concentração igual a IC50 do composto II foram misturadas com o composto I a uma concentração igual a IC50 do composto I. As concentrações máximas de ambos os compostos foram, portanto, iguais à metade de suas IC50. Como descrito anteriormente, o ensaio de replicação do vírus foi realizado em células CrFK completamente confluentes. Após 48 horas, os sobrenadantes foram coletados e o número de vírions foi avaliado usando uma reação qPCR quantitativa de uma maneira padrão.

[0074] O efeito sinergístico foi avaliado calculando o índice de combinação (Cl) de acordo com a fórmula: em que: d1 é a concentração do composto I na presença de IC50/2 do composto II causando uma diminuição de 50% no número de vírions; d2 é a concentração do composto II na presença de IC50/2 do composto I causando uma diminuição de 50% no número de vírions; D1 é a IC50 do composto I; D2 é a IC50 do composto II.

[0075] A CI indica o efeito sinergístico dos fármacos: CI > 1 significa um efeito antagonista, CI de cerca de 1 significa um efeito aditivo e CI < 1 significa um efeito sinergístico.

[0076] A pesquisa realizada mostrou que dois análogos de nucleosídeos, que possuem mecanismos de ação diferentes do mecanismo de ação do PSSNa, isto é, o aciclovir (ACV) e o penciclovir (PCV), apresentam efeito sinergístico com o sal sódico do sulfonato de poliestireno (PSSNa). Os valores de CI calculados para esses compostos foram de 0,92 para PSSNa780/ACV e 0,46 para PSSNa780/PCV. Esse efeito sinergístico é particularmente relevante em ambientes clínicos in vivo. Exemplo 7 Análise quantitativa da inibição de estágios iniciais de infecção celular após incubação com ou sem polímero PSSNa tendo um peso molecular de 93,5 kDa e 780 kDa

[0077] Imagens de microscópio representativas mostradas no Exemplo 5 foram quantificadas em ImageJ Fiji e o número de vírions C-27 de FHV-1 por célula contado - tanto partículas internalizadas quanto aderentes às células. A análise percentual das contagens de vírus por célula é mostrada na Fig. 6. Foi demonstrado que após o teste de proteção celular (teste II), o número de vírions de FHV não diminuiu na presença de polímero, o que é consistente com resultados anteriormente obtidos. Também foi confirmado que após a realização do teste de adesão (teste III) foi visível uma diminuição estatisticamente significativa na quantidade de vírus por célula em comparação com o controle viral, tanto após o uso do polímero com peso molecular de 93,5 kDa quanto com 780 kDa. Os resultados para cada um dos sistemas são apresentados como contagens médias de 10 células CrFK. Por análise quantitativa de imagens microscópicas, os polímeros mostraram inibir a infecção nos estágios iniciais da infecção. A análise percentual obtida de contagens de vírus por célula é consistente com observações microscópicas.

Exemplo 8 O efeito do poliestireno sulfonato de sódio (PSSNa) na infetividade da cepa clínica K7 de FHV-1

[0078] A cepa veterinária foi obtida graças à gentileza dos veterinários do Abrigo para Animais Abandonados em Cracóvia, que coletaram suábes de gatos com sintomas de infecção do trato respiratório superior. Os suábes foram retirados da garganta e da cavidade nasal com hastes de suábe especiais para transportar amostras clínicas virais. Para eliminar possíveis infecções bacterianas e fúngicas, as amostras foram filtradas com filtros descartáveis estéreis com poro de 0,2 µm, que não deve ser uma barreira aos vírions de FHV. O meio de transporte filtrado foi transferido para uma placa de 12 poços com células CrFK confluentes. As placas foram incubadas por até 96 horas, monitorando os poços duas vezes ao dia. Se o efeito citopático (CPE) fosse visível, o sobrenadante era coletado e submetido a ensaios de placa (procedimento descrito no Exemplo 10b). Após 48 horas, placas únicas bem visíveis foram selecionadas e perfuradas com ágar nesse local com uma ponta de pipeta estéril. A ponta foi então transferida e o meio foi tocado com ela em uma nova placa de 12 poços contendo células CrFK totalmente confluentes. Se ocorresse um efeito citopático, o sobrenadante era transferido e dividido em alíquotas para novos tubos de congelamento e armazenado a -80 °C. A afiliação de espécies de cada cepa foi confirmada por sequenciamento de fragmentos de sequência para TK timidina quinase. A origem da cepa clínica K7 de FHV-1 é caracterizada na Tabela 3. Tabela 3. Origem da cepa clínica de FHV.

Local de Gênero Idade Data de coleta Sintomas da A origem do Cepa do do Coleta pelo Doença suábe Gato gato suábe Inflamação do trato K7 respiratório Abrigo para de superior, animais

25.11.2018 ♂ 1 ano Garganta FHV- espirro, abandonados 1 secreção em Cracóvia purulenta do nariz

[0079] A fim de determinar a atividade antiviral do poliestireno sulfonato de sódio (PSSNa) contra a cepa clínica isolada K7 de FHV-1, o efeito de diferentes concentrações desse polímero com dois pesos moleculares selecionados (93,5 kDa e 780 kDa) na infecção viral foi testado. O teste de replicação viral foi realizado de forma análoga ao Exemplo 2. Resumidamente, uma mudança logarítmica no número de cópias de DNA viral por ml do material infeccioso isolado foi determinada por PCR quantitativo em tempo real (Fig. 7A), enquanto os ensaios de placa permitiram determinar a mudança logarítmica no número de vírions infecciosos (Fig. 7B). Os valores foram normalizados para o controle viral, isto é, células infectadas não incubadas com o polímero.

[0080] Os testes confirmaram que os polímeros testados apresentam atividade antiviral também contra a cepa clínica de FHV em baixa concentração não tóxica. O polímero inibiu completamente a replicação viral, tanto o número de cópias do DNA viral quanto o número de vírions infecciosos estavam abaixo do limiar de detecção. Exemplo 9 Teste de interação: análise da capacidade de ligação do vírus FHV-1 a superfícies revestidas com polímero PSSNa, análise de interação direta de vírus-polímero

[0081] O teste de interação permite determinar se há uma interação direta entre o inibidor e o vírus. Lâminas de cobertura esterilizadas foram colocadas dentro de uma placa de 12 poços. Para compensar a carga negativa das lâminas de cobertura, elas foram incubadas com FBS a 3% ou colágeno bovino (Purecol) em PBS por 2 horas a 37 °C, as lâminas incubadas em PBS foram o controle. As lâminas foram então lavadas duas vezes com PBS e incubadas com solução de PBS ou o polímero a uma concentração de 20 µg/ml foi adicionado na quantidade de 1 ml por poço. As amostras foram incubadas por 2 horas a 37 °C. Essa etapa é cobrir as lâminas com um polímero carregado negativamente. Em seguida, as partículas de polímero não ligadas foram lavadas com solução de PBS. A próxima etapa foi a incubação das lâminas com uma suspensão viral de TCID50 igual a

63.000.000/ml ou controle por 2 horas a 37 °C. Foi assumido que se houver uma interação direta entre o polímero e o vírus, os vírions irão se ligar à superfície coberta com o polímero. Partículas não ligadas foram removidas por lavagem com solução de PBS e o material foi preparado para formação de imagens de microscopia confocal. A coloração imunofluorescente foi realizada, as preparações foram visualizadas e, em seguida, o número de partículas virais por plano confocal foi contado no ImageJ Fiji. A análise quantitativa é mostrada na Fig. 8. Exemplo 10 Efeito do poliestireno sulfonato de sódio (PSSNa) na infecção por FCV

[0082] Para determinar a atividade antiviral do poliestireno sulfonato de sódio (PSSNa) contra FCV (F-9, cepa ATCC® VR-782), foi realizado um teste do efeito dos compostos na infecção viral. Nesse experimento, o polímero esteve presente em todos os estágios da infecção viral. No experimento, células CrFK completamente confluentes foram usadas após 24 horas da divisão em placas em uma placa de 96 poços. O meio foi removido e foram adicionados 20 ml de meio fresco contendo polímero. As placas foram incubadas por 30 min a 37 °C, então o meio com o polímero foi removido e 50 µl de solução polimérica em DMEM a 3% ou DMEM a 3% sem polímero (amostra de controle) foram adicionados, sem vírus (amostra de controle) ou com 400 TCID50 ml de título de FCV. As placas foram incubadas por 1,5 horas a 37 °C, então as células foram lavadas duas vezes com solução de PBS para remover as partículas virais não ligadas. Finalmente, 100 µL de solução polimérica em DMEM a 3% foram adicionados a cada poço e as células foram incubadas por 18 horas. Após esse tempo, o sobrenadante foi coletado para avaliar o número de vírus usando (a) RT-PCR quantitativo (RT-qPCR) e (b) ensaios de placa, como a seguir: a) RT – qPCR.

[0083] O isolamento do RNA viral foi realizado de maneira padrão usando um kit de isolamento de RNA disponível comercialmente (Kit de Isolamento de DNA/RNA Viral, A&A Biotecnology, Polônia) de acordo com o protocolo fornecido pelo fabricante. O RNA isolado foi transcrito reversamente (RT) usando um kit comercialmente disponível (Kit de Transcrição Reversa de cDNA de Alta Capacidade, Life Technologies, Polônia). O cDNA assim obtido foi o molde para a realização de PCR quantitativo em tempo real (qPCR). Iniciadores conhecidos na técnica para amplificar um fragmento conservador da sequência do genoma de FCV e uma sonda complementar a esse fragmento foram usados [63]. As sequências de iniciadores e de sondas usadas são mostradas na Tabela 4. Tabela 4. Sequências de iniciadores e sondas usadas para PCR quantitativo em tempo real Oligonucleotídeo Sequência de Oligonucleotídeos 5’->3’ Iniciador Direto Iniciador Reverso Sonda Y* - nucleotídeo degenerado (C ou T)

[0084] Resumidamente, a reação de qPCR foi realizada como a seguir. 2,5 µl de DNA viral isolado foi amplificado em uma reação de 10 µl contendo 1 x Mistura de qPCR Kapa Probe Fast MasterMix (Sigma-Aldrich, Polônia), sonda específica de 100 nM rotulada com 6-carboxifluoresceína (FAM) e 6- carboxitetrametilrrodamina (TAMRA) (5’-FAM - CTT AAA TAY TAT GAT TGG GAY CCC CA - TAMRA – 3’), e 450 nM de cada iniciador (5’- CAA CCT GCG CTA ACG – 3’ e 5’- TCC CAY ACA GTT CCA A AT T – 3’). A sonda e os iniciadores específicos mencionados acima foram usados para amplificar um fragmento de sequência de 151 bp derivado do genoma do FCV para medir o número de cópias de RNA viral na amostra [63]. A reação foi realizada em um termociclador (Sistema de Detecção de PCR 197 em Tempo Real CFX96 Touch, Bio-Rad) nas seguintes condições: 3 min a 95 °C, depois 39 ciclos de 15 segundos a 95 °C e 30 segundos a 51 °C.

[0085] Padrões apropriados foram preparados para avaliar o número inicial de moléculas de RNA viral na amostra. O fragmento de sequência transcrita de cDNA foi amplificado usando os iniciadores descritos acima. O DNA assim obtido foi clonado no plasmídeo pTZ57R/T (Thermo Scientific, Polônia) usando o Kit de Clonagem de PCR InsTAclone (Thermo Scientific, Polônia). A transformação da cepa TOP10 de E. coli (Life Technologies, Polônia) e a propagação do vetor plasmídeo de uma maneira padrão foi realizada. O plasmídeo foi então purificado usando o kit Miniprep de Plasmídeo GeneJET (Thermo Scientific, Polônia) e submetido à linearização por digestão com a enzima de restrição KpnI. A concentração de DNA linearizado foi avaliada por medição espectrofotométrica e o número de cópias por mililitro foi calculado. Oito diluições em série de 10 vezes foram usadas como modelo para PCR em tempo real. A capacidade dos polímeros para inibir a replicação do FCV foi determinada como uma diminuição no número de cópias do RNA viral em função do logaritmo por mililitro de meio. b) Ensaios de placa.

[0086] A análise quantitativa de vírions infecciosos de FCV foi realizada por ensaios de placa usando agarose de baixo ponto de fusão. Diluições em série de 10 vezes dos sobrenadantes coletados foram preparadas, depois aplicadas às células e incubadas por 1 hora. Em seguida, o meio foi removido e agarose líquida a 0,6% misturada com o meio de cultura DMEM foi aplicada às células. As placas foram incubadas em temperatura ambiente por cerca de 20 minutos e, em seguida, as placas foram transferidas para a incubadora. O tempo necessário para a formação das placas foi de cerca de 24 horas. Após esse tempo, as células foram fixadas por um mínimo de 12 h (tempo necessário para penetrar na agarose) com uma solução de formaldeído a 4% e, em seguida, coradas com uma solução a 0,1% de violeta de cristal dissolvido em 50% (v/v) de metanol:água. As placas foram contadas e representadas graficamente como o número de PFU (unidade formadora de placa) por ml.

[0087] As pesquisas realizadas mostraram que os polímeros testados exibem atividade antiviral e inibem a replicação do FCV. Foi demonstrada uma relação positiva entre a atividade antiviral e o peso molecular do polímero. Os resultados estão resumidos na Fig. 9. Exemplo 11 A relação entre a atividade antiviral do poliestireno sulfonato de sódio (PSSNa) e sua concentração no meio

[0088] Para determinar a IC50 de sal de sódio de sulfonato de poliestireno (PSSNa), foi testado o efeito de várias concentrações desse polímero na infecção viral. Esse teste foi realizado analogamente ao Exemplo 10. A relação entre a concentração de polímero e a sua atividade contra o FCV foi investigada. Resumidamente, o número de cópias de RNA viral por ml foi determinado por RT-qPCR (Fig. 10 A, Fig. 10 B), enquanto os ensaios de placa permitiram determinar o número de vírions infecciosos (Fig. 10 C, Fig. 10 D). O teste foi realizado usando polímeros com peso molecular de 93,5 kDa (Fig. 10 A, Fig. 10 C) e 780 kDa (Fig. 10 B, Fig. 10 D) em várias concentrações. Os valores foram normalizados para o controle viral.

[0089] Os valores de IC50 calculados são mostrados na Tabela 5 abaixo. Tabela 5. Valores de IC50 determinados para polímeros por RT-qPCR em tempo real e ensaio de placa Polímero IC50 ± DP [µg/ml] RT-qPCR Ensaio de placas PSSNa93.5 42,75 ± 2,46 49,51 ± 0,14 PSSNa780 9,72 ± 1,05 10,47 ± 1,47

[0090] As pesquisas realizadas mostraram que os polímeros testados apresentam atividade antiviral e inibem a replicação do FCV em baixas concentrações não tóxicas. Exemplo 12 Determinação do mecanismo antiviral de ação dos polímeros PSSNa

[0091] Para determinar o mecanismo de ação do polímero PSSNa e identificar o estágio em que o PSSNa inibe a infecção celular induzida por FCV, os 4 testes funcionais descritos abaixo foram realizados a uma concentração de polímero de 200 µg/ml. Teste I (teste de inativação)

[0092] A suspensão concentrada de vírus foi incubada com o polímero por 1 hora a 22 °C com agitação e, em seguida, as amostras foram diluídas para reduzir a concentração de polímero abaixo da faixa de concentrações em que é ativo. Os títulos de vírus foram avaliados usando um ensaio de placa.

[0093] O teste I permite determinar se a inibição ocorre por meio da interação entre o polímero e o vírus, ou seja, permite determinar se o composto teste tem efeito direto sobre o vírus. Teste II (teste de proteção celular)

[0094] Células CrFK totalmente confluentes foram incubadas na presença ou ausência do polímero durante 1 hora a 37 °C. As placas foram então lavadas duas vezes com 1 X PBS para remover as partículas de polímero não ligadas, após o que meio fresco sem vírus (amostra de controle) ou com vírus (400 TCID50/ml) foi adicionado a cada poço em igual volume e incubado por 1,5 horas a 37 °C. As placas foram então lavadas duas vezes com 1 x PBS para remover as partículas virais não ligadas. Meio fresco foi aplicado às células e elas foram incubadas por 18 horas a 37 °C. Finalmente, o sobrenadante da cultura foi coletado para avaliar a eficiência da replicação, quantificando o número de partículas virais infecciosas e o número de cópias de RNA viral usando ensaios de placa e reações de RT-qPCR, respectivamente.

[0095] Esse teste determina se o polímero pela, por exemplo, ligação às superfícies celulares é capaz de “protegê-las" da infecção, evitando a interação com o receptor de entrada. Teste III (teste de adesão)

[0096] Esse teste foi realizado a 4 °C em que o transporte intracelular é inibido. Resumidamente, células CrFK completamente confluentes foram resfriadas a 4 °C por 20 min. Subsequentemente, meio fresco sem vírus (amostra de controle) ou com vírus (400 TCID50/ml) com ou sem polímero foi aplicado às células. As placas foram incubadas por 1 hora a 4 °C. O transporte intracelular nessa temperatura foi interrompido, enquanto a adição de vírus aos receptores celulares foi possível. Após a incubação, as células foram lavadas duas vezes com 1 x PBS resfriada em gelo para remover as partículas virais não ligadas e o polímero não ligado, foi adicionado meio fresco e as células foram incubadas durante 18 horas a 37 °C. Após 18 h, o sobrenadante foi coletado e o número de partículas virais foi quantificado usando RT-qPCR e ensaios de placa.

[0097] Esse teste permite determinar se a inibição ocorre através da competição do polímero com os vírus pelo agente adesivo e/ou se o polímero, interagindo com o agente adesivo, impede sua interação com os vírus. Teste IV (estágios finais: replicação, montagem e liberação)

[0098] Nesse teste, a infecção foi realizada primeiro pela incubação das células com os vírus, e somente após a infecção o polímero foi aplicado. Meio fresco contendo uma amostra não infecciosa ou uma amostra de vírus (400 TCID50/ml) foi aplicado a células CrFK confluentes, então as placas foram incubadas por 1,5 h a 37 °C. Após a incubação, os poços foram lavados duas vezes com PBS para remover as partículas virais não ligadas e, em seguida, meio fresco contendo a concentração de polímero selecionada foi adicionado a cada poço. As placas foram incubadas durante 18 horas a 37 °C. Após 18 h, os sobrenadantes foram coletados, então separadamente PBS foi adicionado aos poços e as células foram submetidas a dois ciclos de congelamento-descongelamento para obter lisados celulares, então a replicação de vírus foi avaliada quantificada usando ensaios de placa e RT-qPCR.

[0099] Esse teste permite determinar se a inibição da propagação do vírus ocorre nas fases finais da infecção, por exemplo, replicação, montagem ou liberação.

[00100] Depois de realizar cada um dos testes funcionais, as células foram incubadas por 18 horas a 37 °C. Após esse tempo, o sobrenadante (e lisado celular no caso de teste IV) foi coletado e os testes de placa e RT-qPCR foram realizados em tempo real para identificar o estágio em que a infecção é inibida. A exceção foi o teste I, para o qual, por razões técnicas, apenas testes de placa puderam ser realizados.

[00101] Nos testes descritos acima, o número de cópias de RNA viral em 1 ml de meio foi determinado por RT-qPCR em tempo real (Fig. 11A), enquanto os ensaios de placa permitiram determinar o número de vírions infecciosos na amostra (Fig. 11B). Os testes foram realizados usando diferentes concentrações de polímeros com um peso molecular de 93,5 kDa (Fig. 11 C) e 780 kDa (Fig. 11 D).

[00102] Como resultado da pesquisa, verificou-se que os polímeros PSSNa exibem atividade antiviral em estágios tardios da infecção (teste IV), provavelmente no estágio de replicação viral. A eficácia antiviral dos polímeros com peso molecular de 93,5 kDa e 780 kDa nos estágios tardios da infecção foi similar, enquanto o polímero com maior peso molecular no teste geral (Fig. 11) é mais eficaz, indicando um possível mecanismo adicional de sua ação. Essa observação é consistente com os resultados do teste III, que indicam que um polímero de maior peso molecular inibe a infecção viral também nos estágios iniciais da infecção, no estágio de adesão do vírus à superfície celular, enquanto o polímero de menor peso molecular não apresentou a capacidade de inibir o vírus nesse estágio (Fig. 11 C, Fig. 11 D).

Exemplo 13 Visualização da inibição de infecção celular em estágios iniciais por FCV por polímero PSSNa com massa molecular de 93,5 kDa e 780 kDa por microscopia confocal

[00103] Para preparar preparações para formação de imagens usando um microscópio confocal, as células CrFK foram divididas em placas em lâminas de microscópio 24 horas antes do experimento. As células foram então resfriadas e incubadas por uma hora a 4 °C na presença de vírus ou vírus e polímero, de uma maneira padrão. Após um determinado tempo de incubação, as partículas virais não ligadas foram removidas por lavagem, as preparações fixadas e coradas de maneira padrão. Para a coloração de imunofluorescência, foram usados anticorpos primários direcionados contra a proteína do capsídeo de FCV (número de catálogo: sc-80785, Santa Cruz CA, EUA), seguidos por anticorpos secundários conjugados com Alexa Fluor 488 (Invitrogen, Polônia) para visualizar vírions, faloidina Fluor 647 conjugada com Alexa (Invitrogen, Polônia) para coloração de F-actina e DAPI (Sigma-Aldrich, Polônia) para coloração de DNA nuclear. As projeções máximas foram apresentadas.

[00104] A Fig. 12 mostra uma visualização da inibição da infecção de células CrFK induzida por FCV por polímeros PSSNa. O sinal para cada cor (canais azul, vermelho e verde) e a combinação de sinais de todos os três corantes (canais combinados) são apresentados separadamente. Os núcleos celulares (DNA nuclear) são mostrados em azul, a F-actina é mostrada em vermelho e os vírions de FCV em verde. A figura mostra visualizações de células controle não infectadas, controle viral, 1.000 µg/ml de células tratadas com PSSNa93.5 e 1.000 µg/ml de células tratadas com PSSNa780. A barra de escala corresponde a 10 µm.

[00105] As visualizações microscópicas mostram uma diminuição significativa no número de vírions de FCV presentes em células CrFK na presença do polímero PSSNa com alto peso molecular de 780 kDa, enquanto a diminuição no número de vírions de FCV após o uso de um polímero com peso molecular de 93,5 kDa não é perceptível. O estudo confirma a eficácia do derivado de poliestireno sulfonado, em particular o alto peso molecular, na inibição da infecção induzida por FCV também nos estágios iniciais da infecção. Exemplo 14 Análise quantitativa da inibição de estágios iniciais de infecção celular após incubação com ou sem polímero PSSNa com um peso molecular de 93,5 kDa e 780 kDa

[00106] Imagens microscópicas representativas no Exemplo 13 foram quantificadas em ImageJ Fiji e o número de vírions F9 de FCV por célula contado - tanto internalizadas quanto partículas aderentes à superfície celular. Foi demonstrado que após o teste de proteção celular (teste II) o número de vírions F9 de FCV não diminuiu na presença de polímero, o que é consistente com os resultados obtidos anteriormente. Também foi confirmado que após a realização do teste de adesão (teste III), uma diminuição estatisticamente significativa no número de vírus por célula foi perceptível em comparação com o controle viral, mas apenas no caso de um polímero com maior peso molecular. Os resultados para cada um dos sistemas são apresentados como contagens médias de 10 células CrFK. A análise quantitativa de imagens microscópicas mostrou que um polímero com peso molecular de

780 kDa também inibiu a infecção nos estágios iniciais da infecção. Para um polímero com peso molecular de 93,5 kDa, não houve diferença estatisticamente significativa entre as células de controle e as incubadas com o inibidor. A análise percentual obtida de contagens de vírus por célula é consistente com observações microscópicas. Exemplo 15 O efeito do poliestireno sulfonato de sódio (PSSNa) na infecciosidade de cepas clínicas

[00107] As cepas veterinárias foram obtidas graças à gentileza dos veterinários da clínica veterinária 'Ambuvet’ e do Abrigo para Animais Abandonados em Cracóvia, que coletaram suábes de gatos com sintomas de infecção do trato respiratório superior. Os suábes foram retirados da garganta e da cavidade nasal usando hastes de suábes especiais para o transporte de amostras clínicas virais. Para eliminar uma possível infecção bacteriana e fúngica, as amostras foram filtradas usando filtros estéreis e descartáveis com um diâmetro de poro de 0,2 µm, que não deve ser uma barreira para calicivírus com um diâmetro de cerca de 35 nm. O meio de transporte filtrado foi transferido para uma placa de 12 poços com células CrFK confluentes. As placas foram incubadas por até 96 horas, monitorando os poços duas vezes ao dia. Se o efeito citopático (CPE) fosse visível, o sobrenadante era tomado para ensaios de placa (procedimento descrito no Exemplo 10b). Após 24 horas, placas únicas de poços bem visíveis foram selecionadas e perfuradas com ágar nesse local com uma ponta de pipeta estéril. A ponta foi então transferida e o meio foi tocado com ela em uma nova placa de 12 poços contendo células CrFK totalmente confluentes. Se ocorresse um efeito citopático, o sobrenadante era transferido e dividido em alíquotas para novos tubos de congelamento e armazenado a -80 °C. A afiliação de espécies de cada cepa foi confirmada por sequenciamento de fragmentos de sequência para a proteína do capsídeo VP1 principal. A origem de seis cepas veterinárias (Kl, K2, K3, K5, K8 e K10 de FCV) é caracterizada na Tabela 6. Tabela 6. Origem das cepas clínicas de FCV. Gênero Idade Local da Data Da Sintomas da A origem do Cepa do do Coleta Coleta Doença suábe Gato Gato do suábe Infecção do K1 trato Clínica 3 de 27.09.2018 ♂ Garganta respiratório veterinária meses FCV superior, Ambuvet espirro Infecção do trato K2 respiratório Clínica 6 de 08.10.2018 ♀ Garganta superior, veterinária meses FCV secreção Ambuvet purulenta dos olhos Infecção do K3 trato Clínica 3 de 08.11.2018 ♂ Garganta respiratório veterinária anos FCV superior Ambuvet recorrente Infecção do trato Abrigo para K5 respiratório 6 animais de 25.11.2018 ♀ Garganta superior, meses abandonados FCV secreção em Cracóvia purulenta dos olhos Infecção do trato Abrigo para K8 respiratório 9 Cavidade animais de 25.11.2018 ♂ superior, meses Nasal abandonados FCV secreção em Cracóvia purulenta do nariz Infecção do Abrigo para K10 3 trato animais de 25.11.2018 ♀ Garganta meses respiratório abandonados

FCV superior em Cracóvia

[00108] De modo a determinar a atividade antiviral do poliestireno sulfonato de sódio (PSSNa) contra cepas clínicas de FCV isoladas, foi testado o efeito de diferentes concentrações desse polímero com dois pesos moleculares selecionados (93,5 kDa e 780 kDa) na infecção viral. O ensaio de replicação viral foi realizado analogamente ao Exemplo 9. Resumidamente, cópias de RNA viral por ml foram determinadas por transcrição reversa e PCR quantitativa em tempo real, enquanto os ensaios de placa permitiram determinar o número de vírions infecciosos (Fig. 14). Os valores foram normalizados para o controle viral, isto é, células infectadas não incubadas com o polímero.

[00109] A pesquisa conduzida confirmou que os polímeros testados têm atividade antiviral contra todas as cepas clínicas de FCV isoladas em baixas concentrações não tóxicas. A replicação de cada uma das cepas clínicas foi reduzida em pelo menos 20 vezes (cepa K1 de FCV), enquanto no caso de duas cepas (K5 e K10 de FCV) a infecção foi completamente inibida. Foi demonstrada uma relação positiva entre a atividade antiviral e o peso molecular, de forma idêntica à da cepa de laboratório F9 de FCV, para a qual os resultados são mostrados no Exemplo 10. Exemplo 16 Teste de interação: análise da capacidade de ligação do vírus FCV a superfícies revestidas com polímero PSSNa, análise da interação direta de vírus-polímero

[00110] O teste de interação permite determinar se há uma interação direta entre o inibidor e o vírus. Lâminas esterilizadas foram colocadas dentro de uma placa de 12 poços. Para compensar a carga negativa das lâminas de cobertura, elas foram incubadas com FBS a 3% ou colágeno bovino (Purecol) em PBS por 2 horas a 37 °C, as lâminas incubadas em PBS foram o controle. As lâminas foram então lavadas duas vezes com PBS e uma solução de PBS ou polímero a uma concentração de 20 µg/ml foi adicionada em uma quantidade de 1 ml por poço. As amostras foram incubadas durante 2 horas a 37 °C. Essa etapa é cobrir as lâminas com um polímero carregado negativamente. Em seguida, as partículas de polímero não ligadas foram removidas por lavagem com solução de PBS. A próxima etapa foi a incubação das lâminas com uma suspensão viral de TCID50 igual a

13.000.000/ml ou controle por 2 horas a 37 °C. Foi assumido que se houver uma interação direta entre o polímero e o vírus, os vírions irão se ligar à superfície coberta com o polímero. Partículas não ligadas foram removidas por lavagem com solução de PBS e o material foi preparado para formação de imagens de microscopia confocal. A coloração imunofluorescente foi realizada, preparações foram visualizados e, em seguida, o número de partículas virais por plano confocal foi contado no ImageJ Fiji.

[00111] Para lâminas revestidas com PSSNa de 780 kDa, o número de vírions foi muito maior do que para lâminas não revestidas com polímero ou revestidas com PSSNa de 93,5 kDa. É importante notar que para lâminas revestidas com FBS e revestidas com PSSNa93.5, um aumento estatisticamente significativo no número de vírions por plano confocal também foi mostrado, no entanto, foi muito menor do que no caso de PSSNa780. Os resultados acima indicam que PSSNa de 780 kDa interage diretamente com a partícula viral, mas a influência dessa interação na infectividade do FCV é desconhecida.

Exemplo 17 Determinação da atividade antiviral in vitro do hidrogel de PEG-PSSNa

[00112] O objetivo do estudo foi determinar a formulação na qual o PSSNa pode ser aplicado na pele do animal e, em seguida, determinar o efeito da formulação no processo de infecção e toxicidade transdérmica da formulação.

[00113] O primeiro estágio determinou a maior concentração não tóxica de polietilenoglicol com um peso molecular de 400 Da (PEG, Sigma-Aldrich, Polônia, PM = 400) (PEG400)), que pode ser usado para experimentos in vitro usando a linha de célula CrFK. Para essa finalidade, foram preparadas 8 soluções de polímero de PEG nas concentrações: 100, 50, 40, 30, 25, 20, 15 e 10 mg/ml. As células foram incubadas com o polímero em uma concentração específica por 48 horas, seguido por um ensaio XTT análogo aos exemplos anteriores. Concentrações acima de 30 mg/ml mostraram ser tóxicas para as células CrFK e não podem ser usadas em outros experimentos. Portanto, em estudos adicionais, foi decidido usar a concentração mais alta e não tóxica de PEG-400 de 30 mg/ml. Os resultados de citotoxicidade normalizados para controle (células não tratadas com polímero) são mostrados na Fig. 16 A.

[00114] Para preparar o hidrogel de PSSNa-PEG, o PSSNa de 1000 kDa (PSSNa1000kDa) foi dissolvido em água e depois adicionado em gotas à solução de PEG400 diluída em meio de cultura DMEM. A concentração final de PSSNa1000kDa na solução foi de 200 µg/ml, enquanto a concentração de PEG400 foi de 30 mg/ml.

[00115] De modo a verificar se o hidrogel por si só não afeta a atividade antiviral da substância ativa PSSNa, foi realizado um teste de replicação viral. Resumidamente, as células CrFK foram infectadas na presença de um hidrogel antes, durante e após a infecção. Os experimentos foram realizados de forma análoga como descrita nos exemplos anteriores. As células foram incubadas por 18 horas (infecção por FCV) ou 48 horas (infecção por FHV-1). Após esse tempo, o sobrenadante foi coletado, seguido de PCR em tempo real e os títulos do vírus foram verificados por ensaios de placa. Os resultados obtidos são apresentados na Figura 16 para o vírus FHV-1 (B, C) e para o vírus FCV (D, E).

[00116] Foi demonstrado que a composição do hidrogel não é tóxica e não afeta a atividade antiviral do poliestireno sulfonato de sódio. Exemplo 18 Determinação da toxicidade dérmica do poliestireno sulfonato de sódio em um modelo de camundongo

[00117] O objetivo do experimento foi determinar a dose máxima não tóxica dérmica de poliestireno sulfonato de sódio em um modelo de camundongo. O material de teste foi de camundongos fêmeas de 6 semanas de idade da cepa BALB/c obtida do Centro de Medicina Experimental da Universidade Médica de Bialystok. O consentimento para o experimento nº 281/2018 foi obtido da 2ª Comissão Ética Local para Experimentos com Animais em Cracóvia, no Instituto de Farmacologia da Academia Polonesa de Ciências. Os animais foram colocados em quarentena por 5 dias. Após a quarentena, foi realizado um exame médico geral e veterinário.

[00118] Durante a quarentena e o experimento, os animais permaneceram em salas com parâmetros controlados:

temperatura 22 °C ± 2 °C, umidade 55% ± 5% e iluminação: artificial, fotoperíodo: 12 horas de luz/12 horas de escuridão. Foi usada alimentação de manutenção da Altromin. Apenas indivíduos saudáveis selecionados aleatoriamente foram qualificados para o experimento. Os animais foram divididos em grupos, em cada experimento o grupo continha 5 indivíduos: grupo de controle - solução salina, grupo experimental – PSSNa de 50 mg/ml, grupo experimental - PSSNa de 75 mg/ml, grupo experimental - PSSNa de 100 mg/ml.

[00119] O material de teste foi aplicado diretamente na pele dorsal raspada em um volume de 100 µl/camundongo, uma vez ao dia durante 7 dias. As observações clínicas detalhadas foram feitas diariamente a partir do dia da administração do composto. A medição do peso corporal do animal foi realizada antes da administração do material de teste e diariamente durante a observação. Ao final do experimento, os animais foram submetidos à eutanásia. Foram realizadas necropsias e o sangue foi coletado para análises bioquímicas.

[00120] O hidrogel de PSSNa-PEG foi preparado misturando PEG com um peso molecular de 400 Da com água (em uma razão de 9:1, volume/volume). PSSNa foi dissolvido em água e depois adicionado em gotas à solução de PEG. A análise de toxicidade dérmica foi realizada usando um hidrogel com uma concentração de PSSNa de 50, 75 e 100 mg/ml. Após 5 dias de quarentena, os camundongos foram rapados na parte lateral das costas e, em seguida, 100 ml de hidrogel ou solução salina foram aplicados à pele rapada. O experimento teve duração de 7 dias, o hidrogel foi aplicado diariamente. Os camundongos foram pesados e monitorados todos os dias (as medições de peso diárias são mostradas nas Tabelas 7a-b). Após 7 dias, os camundongos restantes foram sacrificados por deslocamento cervical. A pele no local da injeção de hidrogel foi monitorada de perto para vermelhidão, ulceração ou outras lesões da pele a cada dia de acordo com a seguinte escala de saúde: 0 - boa saúde, sem sintomas óbvios 1 - apatia, pelo levantado 2 - silhueta curvada, leve perda de peso 3 - anorexia, aumento do esforço respiratório e maior perda de peso 4 - agonia 5 - morte

[00121] Os resultados de saúde são mostrados nas Tabelas 8a-b.

[00122] Após a eutanásia do animal, sangue, fígado, rim e baço foram coletados para posterior análise. A análise bioquímica incluiu GLU (mg/dl), BUN (mg/dl), ALP (IU/L), TP (g/dl), GPT (IU/L) e CRE (mg/dl). Os resultados das análises bioquímicas são apresentados nas Tabelas 9a-b.

[00123] Em estudos com animais, o sulfonato de poliestireno após administração direta na pele a 50, 75 e 100 mg/ml não causou sintomas clínicos. Não foram observados sintomas clínicos durante os testes bioquímicos e aferição do peso dos animais. Após as necropsias, não foram encontradas alterações macroscópicas nos órgãos.

[00124] O poliestireno sulfonato de sódio administrado por 7 dias na pele na forma de um hidrogel com polímero de PEG nas doses de 50, 75 e 100 mg/ml não é tóxico para os animais e pode ser usado no futuro para testar a atividade antiviral em animais.

Tabela 7a: Medição do peso corporal do camundongo durante o experimento (dezembro de 2018)

Tabela 7b: Medição do peso corporal do camundongo durante o experimento (janeiro de 2019)

Tabela 8a: Observações Clínicas durante o experimento (dezembro de 2018)

Tabela 8b: Observações Clínicas durante o experimento (dezembro de 2018)

Tabela 9a: Resultados de Análise Bioquímicas após o sacrifício do animal (dezembro de 2018)

Tabela 9b: Resultados de Análise Bioquímicas após o sacrifício do animal (janeiro de 2019)

Literatura

[00130] 1. Helps, C.R. et al., Factors associated with upper respiratory tract disease caused by feline herpesvirus, feline calicivirus, Chlamydophila felis and Bordetella bronchiseptica in cats: experience from 218 European catteries. Vet Rec, 2005. 156(21): págs. 669-73.

[00131] 2. Binns, S.H. et al., A study of feline upper respiratory tract disease with reference to prevalence and risk factors for infection with feline calicivirus and feline herpesvirus. J Feline Med Surg, 2000. 2(3): págs. 123-33.

[00132] 3. Bannasch, M.J. and J.E. Foley, Epidemiologic evaluation of multiple respiratoiy pathogens in cats in animal shelters. J Feline Med Surg, 2005. 7(2): págs. 109-

19.

[00133] 4. Fernandez, M. et al., Prevalence of feline heipes virus- 1, feline calicivirus, Chlamydophila felis and Mycoplasma felis DNA and associated risk factors in cats in Spain with upper respiratory tract disease, conjunctivitis and/or gingivostomatitis. J Feline Med Surg, 2017. 19(4): págs. 461-469.

[00134] 5. Cohn, L.A., Feline respiratoiy disease complex. Vet Clin North Am Small Anim Pract, 2011. 41(6): págs. 1273-89.

[00135] 6. Fields BN, K.D., Howley PM, Fields virology. 6a ed., ed. W.K. Health/Lippincott e W. Wilkins. 2013.

[00136] 7. Xu, F. et al., Seroprevalence and coinfection with heipes simplex virus type 1 and type 2 in the United States, 1988-1994. J Infect Dis, 2002. 185(8): págs. 1019-

24.

[00137] 8. Gaskell, R.M. and R.C. Povey, Experimental induction of feline viral rhinotracheitis virus re-excretion in FVR-recovered cats. Vet Rec, 1977. 100(7): págs. 128-33.

[00138] 9. Maggs, D.J. et al., Evaluation of serologic and viral detection methods for diagnosing feline herpesvirus-1 infection in cats with acute respiratory tract or chronic ocular disease. J Am Vet Med Assoc, 1999. 214(4): págs. 502-7.

[00139] 10. Gould, D., Feline herpesvirus- 1 : ocular manifestations, diagnosis and treatment options. J Feline Med Surg, 2011. 13(5): págs. 333-46.

[00140] 11. Hartley, C., Aetiology of corneal ulcers assume FHV-1 unless proven otherwise. J Feline Med Surg,

2010. 12(1): págs. 24-35.

[00141] 12. Bistner, S.I. et al., Ocular manifestations of feline herpesvirus infection. J Am Vet Med Assoc, 1971. 159(10): págs. 1223-37.

[00142] 13. Stiles, J., Feline herpesvirus. Clin Tech Small Anim Pract, 2003. 18(3): págs. 178-85.

[00143] 14. Gaskell, R.M. e R.C. Povey, Re-excretion of feline viral rhinotracheitis virus following corticosteroid treatment. Vet Rec, 1973. 93(7): págs. 204-5.

[00144] 15. Nasisse, M.P. et al, Isolation of feline herpesvirus 1 from the trigeminal ganglia of acutely and chronically infected cats. J Vet Intern Med, 1992. 6(2): págs. 102-3.

[00145] 16. Miller, W.H. e R.L. Miller, Phosphorylation of acyclovir diphosphate by cellular enzymes. Biochem Pharmacol, 1982. 31(23): págs. 3879-84.

[00146] 17. Miller, W.H. and R.L. Miller, Phosphorylation of acyclovir (acycloguanosine) monophosphate by GMP kinase.

J Biol Chem, 1980. 255(15): págs. 7204-7.

[00147] 18. Elion, G.B., The biochemipy and mechanism of action of acyclovir. J Antimicrob Chemother, 1983. 12 Suppl B: págs. 9-17.

[00148] 19. Maggs, D.J., Update on pathogenesis, diagnosis, and treatment of feline herpesvirus type 1. Clin Tech Small Anim Pract, 2005. 20(2): págs. 94-101.

[00149] 20. Maggs, D.J. and H.E. Clarke, In vitro efficacy of ganciclovir, cidofovir, penciclovir, foscamet, idoxuridine, and acyclovir against feline herpesvirus type-

1. Am J Vet Res, 2004. 65(4): págs. 399-403.

[00150] 21. Nasisse, M.P. et al., In vitro susceptibility of feline herpesvirus-1 to vidarabine, idoxuridine, trifluridine, acyclovir, or bromovinyldeoxyuridine. Am J Vet Res, 1989. 50(1): págs. 158-60.

[00151] 22. Collins, P., The spectrum of antiviral activities of acyclovir in vitro and in vivo. J Antimicrob Chemother, 1983. 12 Suppl B: págs. 19-27.

[00152] 23. Soul-Lawton, J. et al., Absolute bioavailability and metabolic disposition of valaciclovir, the L-valyl ester of acyclovir, following oral administration to humans. Antimicrob Agents Chemother, 1995. 39(12): págs. 2759-64.

[00153] 24. Nasisse, M.P. et al., Effects of valacyclovir in cats infected with feline herpesvirus 1. Am J Vet Res,

1997. 58(10): págs. 1141-4.

[00154] 25. Hussein, I.T., R.V. Menashy, and H.J. Field, Penciclovir is a potent inhibitor of feline herpesvirus-1 with susceptibility determined at the level of virus-encoded thymidine kinase. Antiviral Res, 2008. 78(3): págs. 268-74.

[00155] 26. Groth, A.D. et al, In vitro cytotoxicity and antiviral efficacy against feline herpesvirus type 1 of famciclovir and its metabolites. Vet Ophthalmol, 2014. 17(4): págs. 268-74.

[00156] 27. Thomasy, S.M. et al., Evaluation of orally administered famciclovir in cats experimentally infected with feline herpesvirus type- 1. Am J Vet Res, 201 1. 72(1): págs. 85-95.

[00157] 28. Malik, R. et al., Treatment of feline herpesvirus-1 associated disease in cats with famciclovir and related drugs. J Feline Med Surg, 2009. 11(1): págs. 40-

8.

[00158] 29. Filer, C.W. et al., Metabolic and pharmacokinetic studies following oral administration of 14C-famciclovir to healthy subjects. Xenobiotica, 1994. 24(4): págs. 357-68.

[00159] 30. Pue, M.A. et al., Linear pharmacokinetics of penciclovir following administration of single oral doses of famciclovir 125, 250, 500 and 750 mg to healthy volunteers. J Antimicrob Chemother, 1994. 33(1): págs. 119-27.

[00160] 31. Hussein, I.T. et al, Substrate specificity and molecular modelling of the feline herpesvirus-1 thymidine kinase. Arch Virol, 2008. 153(3): págs. 495-505.

[00161] 32. Dalvie, D. et al., Interspecies variation in the metabolism of zoniporide by aldehyde oxidase. Xenobiotica, 2013. 43(5): págs. 399-408.

[00162] 33. Anderson, R.A. et al, Evaluation of poly (styrene-4- sulfonate) as a preventive agent for conception and sexually transmitted diseases. J Androl, 2000. 21(6): págs. 862-75.

[00163] 34. Christensen, N.D. et al., Papillomavirus microbicidal activities of high-molecular-weight cellulose sulfate, dextran sulfate, and polystyrene sulfonate. Antimicrob Agents Chemother, 2001. 45(12): págs. 3427-32.

[00164] 35. Herold, B.C. et al., Poly(sodium 4-styrene sulfonate): an effective candidate topical antimicrobial for the prevention of sexually transmitted diseases. J Infect Dis, 2000. 181(2): págs. 770-3.

[00165] 36. Simoes, J.A. et al., Two novel vaginal microbicides (polystyrene sulfonate and cellulose sulfate) inhibit Gardnerella vaginalis and anaerobes commonly associated with bacterial vaginosis. Antimicrob Agents Chemother, 2002. 46(8): págs. 2692-5.

[00166] 37. Zaneveld, L.J. et al., Efficacy and safety of a new vaginal contraceptive antimicrobial formulation containing high molecular weight poly(sodium 4- styrenesulfonate). Biol Reprod, 2002. 66(4): págs. 886-94.

[00167] 38. Ito, M. et al, In vitro activity of mannan sulfate, a novel sulfated polysaccharide, against human immunodeficiency virus type 1 and other enveloped viruses. Eur J Clin Microbiol Infect Dis, 1989. 8(2): págs. 171-3.

[00168] 39. Baba, M. et al, Sulfated polysaccharides are potent and selective inhibitors of various enveloped viruses, including herpes simplex virus, cytomegalovirus, vesicular stomatitis virus, and human immunodeficiency virus. Antimicrob Agents Chemother, 1988. 32(11): págs. 1742-5.

[00169] 40. Mohan, P. et al, Sulfonic acid polymers as a new class of human immunodeficiency virus inhibitors. Antiviral Res, 1992. 18(2): págs. 139-50.

[00170] 41. Zacharopoulos, V.R. and D.M. Phillips, Vaginal formulations of carrageenan protect mice from herpes simplex vims infection. Clin Diagn Lab Immunol, 1997. 4(4): págs. 465-8.

[00171] 42. Stiles, J. et al., Effects of lambda- carrageenan on in vitro replication of feline herpesvirus and on experimentally induced herpetic conjunctivitis in cats. Invest Ophthalmol Vis Sci, 2008. 49(4): págs. 1496-

501.

[00172] 43. Vogtlin, A. et al., Quantification of feline herpesvirus 1 DNA in ocular fluid samples of clinically diseased cats by real-time TaqMan PCR. J Clin Microbiol,

2002. 40(2): págs. 519-23.

[00173] 44. Benzekri, R. et al, Anti HSV-2 activity of Peganum harmala (L.) and isolation of the active compound. Microb Pathog, 2018. 114: págs. 291-298.

[00174] 45. Fields BN, K.D., Howley PM, Fields virology. 6a ed., ed. W.K. Health/Lippincott e W. Wilkins. 2013.

[00175] 46. Ohlinger, V.F., B. Haas, and H.J. Thiel, Rabbit hemorrhagic disease (RHD): characterization of the causative calicivirus. Vet Res, 1993. 24(2): págs. 103-16.

[00176] 47. Bank-Wolf, B.R., M. Konig, and H.J. Thiel, Zoonotic aspects of infections with noroviruses and sapoviruses. Vet Microbiol, 2010. 140(3-4): págs. 204-12.

[00177] 48. Hurley, K.E. et al., An outbreak of virulent systemic feline calicivirus disease. J Am Vet Med Assoc,

2004. 224(2): págs. 241-9.

[00178] 49. Radford, A.D. et al., Feline calicivirus infection. ABCD guidelines on prevention and management. J Feline Med Surg, 2009. 11(7): págs. 556-64.

[00179] 50. Dawson, S. et al., Acute arthritis of cats associated with feline calicivirus infection. Res Vet Sci,

1994. 56(2): págs. 133-43.

[00180] 51. Reubel, G.H., D.E. Hoffmann, and N.C. Pedersen, Acute and chronic faucitis of domestic cats. A feline calicivirus -induced disease. Vet Clin North Am Small Anim Pract, 1992. 22(6): págs. 1347-60.

[00181] 52. TerWee, J. et al, Comparison of the primary signs induced by experimental exposure to either a pneumotrophic or a 'limping' strain of feline calicivirus. Vet Microbiol, 1997. 56(1-2): págs. 33-45.

[00182] 53. Arias, A. et al., Norovirus Polymerase Fidelity Contributes to Viral Transmission In Vivo. mSphere,

2016. 1(5).

[00183] 54. Hurley, K.F. and J.E. Sykes, Update on feline calicivirus: new trends. Vet Clin North Am Small Anim Pract,

2003. 33(4): págs. 759-72.

[00184] 55. Coyne, K.P. et al., Lethal outbreak of disease associated with feline calicivirus infection in cats. Vet Rec, 2006. 158(16): págs. 544-50.

[00185] 56. Pedersen, N.C. et al., An isolated epizootic of hemorrhagic-like fever in cats caused by a novel and highly virulent strain of feline calicivirus. Vet Microbiol,

2000. 73(4): págs. 281-300.

[00186] 57. Reynolds, B.S. et al., A nosocomial outbreak of feline calicivirus associated virulent systemic disease in France. J Feline Med Surg, 2009. 11 (8) : págs. 633-44.

[00187] 58. Schulz, B.S. et al., Two outbreaks of virulent systemic feline calicivirus infection in cats in Germany. Berl Munch Tierarztl Wochenschr, 2011. 124(5-6):

págs. 186-93.

[00188] 59. Wu, H. et al., Antiviral effect of lithium chloride on feline calicivirus in vitro. Arch Virol, 2015. 160(12): págs. 2935-43.

[00189] 60. McDonagh, P. et al., Antiviral effect of mefloquine on feline calicivirus in vitro. Vet Microbiol,

2015. 176(3-4): págs. 370-7.

[00190] 61. Povey, R.C., Effect of orally administered ribavirin on experimental feline calicivirus infection in cats. Am J Vet Res, 1978. 39(8): págs. 1337-41.

[00191] 62. Stuart, A.D. and T.D. Brown, Alpha2,6-linked sialic acid acts as a receptor for Feline calicivirus. J Gen Virol, 2007. 88(Pt 1): págs. 177-86.

[00192] 63. Chander Y, T.A., Sajja S, Ramakrishnan MA, Faaberg KS, Goyal SM, A TaqMan RT-PCR Assay for the Detection of Feline calicivirus. International Journal of Virology,

2007. 3(3): págs. 100-106.

Claims (12)

REIVINDICAÇÕES

1. Derivado de poliestireno sulfonado, caracterizado pelo fato de ser de fórmula I: em que M é um cátion de metal, z é um número inteiro de 1 a 3, n é um número inteiro na faixa de 7 a 6000, para uso no tratamento e/ou na profilaxia da gripe felina, especialmente infecção causada por calicivírus felino ou herpesvírus felino.

2. Derivado de poliestireno sulfonado para uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de estar na forma de um sal.

3. Derivado de poliestireno sulfonado para uso de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de estar na forma de sal de sódio.

4. Derivado de poliestireno sulfonado para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de ter um peso molecular de pelo menos 1,5 kDa, de preferência pelo menos 8 kDa.

5. Derivado de poliestireno sulfonado para uso de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de ter um peso molecular na faixa de 8 kDa a 1200 kDa.

6. Derivado de poliestireno sulfonado para uso de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de ter o peso molecular selecionado do grupo que consiste em 8 kDa, 19,3 kDa, 35 kDa, 46 kDa, 93,5 kDa, 200 kDa, 400 kDa, 780 kDa e 1200 kDa.

7. Derivado de poliestireno sulfonado para uso de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de ter o peso molecular de 93,5 kDa ou 780 kDa.

8. Derivado de poliestireno sulfonado para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de o herpesvírus felino ser o herpesvírus felino tipo 1 (FHV-1).

9. Derivado de poliestireno sulfonado para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de se destinar ao uso em terapia combinada.

10. Derivado de poliestireno sulfonado para uso de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a terapia combinada envolve o uso simultâneo de outro agente para o tratamento da gripe felina, especialmente infecção causada por calicivírus felino ou herpesvírus felino.

11. Derivado de poliestireno sulfonado para uso de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o outro agente é um análogo de nucleosídeo.

12. Derivado de poliestireno sulfonado para uso de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de o análogo de nucleosídeo ser aciclovir (ACV) e/ou penciclovir (PCV).