PL239391B1 - Sulfonowana pochodna polistyrenu do zastosowania w leczeniu i/lub profilaktyce infekcji wywołanej przez kociego herpeswirusa - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest sulfonowana pochodna polistyrenu, w szczególności sól sodowa sulfonianu polistyrenu, do zastosowania w leczeniu i/lub profilaktyce infekcji wywołanej przez kociego herpeswirusa, w szczególności kociego herpeswirusa typu 1 (FHV-1), jak również taka sulfonowana pochodna polistyrenu do zastosowania w terapii skojarzonej infekcji wywołanej przez kociego herpeswirusa, w szczególności kociego herpeswirusa typu 1 (FHV-1).

Zapalenie górnych dróg oddechowych u kotów, zwane „kocim katarem”, jest powszechną chorobą, której objawy obejmują kaszel, kichanie, katar, zaczerwienienie oczu, gorączkę czy też pojawienie się ropnych wydzielin z nosa oraz z oczu [1,2]. Koci katar jest uważany za jedną z głównych przyczyn zgonów w schroniskach oraz w hodowlach [3]. Głównymi czynnikami etiologicznymi tej choroby są koci herpeswirus typu 1 (ang. feline herpesvirus type 1, FHV-1, FeHv-1) oraz koci kaliciwirus (ang. feline calicivirus, FCV) [1,3-5].

Koci herpeswirus typu 1 (FHV-1, FeHv-1) jest członkiem rodziny Herpesviridae, do której należą otoczkowe wirusy zawierające materiał genetyczny w postaci DNA. Herpeswirusy są patogenami człowieka oraz wielu gatunków zwierząt - ssaków, gadów, ptaków, płazów oraz ryb [6]. Jednym z najbardziej rozpowszechnionych patogenów spotykanych u ludzi jest wirus opryszczki pospolitej typu 1 (ang. herpes simplex virus type 1, HSV-1) odpowiedzialny za owrzodzenia występujące głównie w obrębie twarzy, chociaż możliwe są zakażenia również w innych regionach ciała. Infekcje wywołane przez herpeswirusa (HSV) mogą doprowadzić do cięższych schorzeń, takich jak zapalenie oka lub zapalenie mózgu. Choroby te charakteryzują się ciężkim przebiegiem i mogą prowadzić do nieodwracalnych problemów ze zdrowiem (np. utrata wzroku), a nawet zgonu [6, 7]. Koci herpeswirus jest spokrewniony z wirusem HSV-1 i jest również szeroko rozpowszechniony w populacji kotów na świecie. Szacuje się, że nawet 90% populacji kotów jest seropozytywne względem tego patogenu, natomiast u 80% wirus jest obecny w stanie latencji czyli tzw. stanie utajenia [8, 9]. Infekcje FHV-1 są związane głównie z zapaleniem górnych dróg oddechowych, infekcjami błon śluzowych oraz infekcjami oczu (owrzodzenia rogówki, ostre zapalenie spojówki oraz rogówki), które mogą prowadzić do utraty wzroku [10-13]. Co więcej, bakteryjne koinfekcje są szczególnie niebezpieczne dla kociąt oraz osobników o obniżonej odporności, gdyż mogą prowadzić do śmierci.

Replikacja wirusowa zachodzi przede wszystkim w tkance nabłonkowej i prowadzi do ostrego stanu zapalnego [13]. Po zakażeniu komórek nabłonkowych wirus jest transportowany wewnątrz neuronów czuciowych drogą retrogradową, tj. w kierunku ciała komórki, a następnie przechodzi w stan latencji. Latentny wirus występuje w formie episomów, jednak może dojść do nawrotu choroby w przypadku osłabienia sprawności układu immunologicznego gospodarza [8, 14, 15].

Do leczenia infekcji herpeswirusowych u ludzi stosuje się obecnie analogi nukleozydów. Do tej grupy należy acyklowir, pencyklowir, idoksyurydyna, cidowir oraz widarabina. Cząsteczki te hamują replikację wirusa poprzez zablokowanie centrum aktywnego wirusowej polimerazy DNA. Analogi nukleozydów są dostarczane do komórki w formie nieaktywnej, a do aktywacji dochodzi w efekcie fosforylacji przeprowadzanej przez kinazę tymidynową (TK) herpeswirusa. W kolejnym etapie dochodzi do kolejnych dwóch fosforylacji cząsteczki, przeprowadzanych przez kinazy GMP gospodarza. [16, 17]. Ufosforylowany związek może być wykorzystywany przez wirusową polimerazę DNA jako substrat podczas reakcji wydłużania łańcucha polinukleotydowego i w momencie, w którym pochodna zostanie włączona do DNA, dochodzi do zatrzymania elongacji. Analogi nukleozydów wykazują dużo wyższe powinowactwo do polimerazy wirusowej aniżeli do polimerazy gospodarza [18]. Zaskakująco, pomimo podobnych symptomów choroby oraz podobieństwa filogenetycznego wirusów, sukces NA w terapiach przeciwherpeswirusowych u ludzi nie przekłada się na leczenie infekcji wywołanych przez herpeswirusy u kotów. Ponadto, wykazano, że niektóre ze związków przeciwwirusowych stosowanych u ludzi są toksyczne dla organizmu kota i nie mogą zostać wprowadzone do leczenia [19-21]. Przykładowo, acyklowir (ACV) jest bardzo efektywnym inhibitorem replikacji wirusa HSV-1 u ludzi, jednak u kotów nie wykazał równie wysokiej aktywności, a jego przyswajalność była niska [22]. Walacyklowir (VCV) jest związkiem przekształcanym przez wątrobowe esterazy w ACV, który również bardzo często stosowany jest u ludzi w leczeniu infekcji herpeswirusowych [23]. Pomimo wysokiej aktywności przeciwwirusowej VCV in vitro, u kotów, które przyjmowały ten lek, nie doszło do złagodzenia symptomów choroby, a dodatkowo wystąpiło wiele skutków ubocznych, takich jak zahamowanie czynności szpiku kostnego czy też nekroza wątroby oraz nerek prowadząca do śmierci zwierząt [24]. Inna pochodna acyklowiru, pencyklowir (PCV), wydaje się być efektywnym oraz bezpiecznym do stosowania rozwiązaniem [20, 25, 26]. Dodatkowo,

PL 239 391 Β1 famcyklowir, stanowiący prekursor PCV, został przetestowany w leczeniu i profilaktyce infekcji wirusem FHV u kotów i wykazano, że jest bezpieczny [27, 28]. Famcyklowir jest przekształcany do PCV przez aldehydowe oksydazy wątrobowe [29, 30], który po przetransportowaniu do wnętrza komórki, analogicznie do acyklowiru, jest fosforylowany przez wirusową TK. Następnie dochodzi do kolejnych dwóch fosforylacji przeprowadzanych przez enzymy komórkowe i zahamowania wydłużania łańcucha polinukleotydowego materiału genetycznego wirusa [31]. Jednakże stężenie PCV w ustroju kotów było dużo niższe od oczekiwanego, co prawdopodobnie jest związane z dużo niższą aktywnością aldehydowych oksydaz wątrobowych u kotów niż u innych ssaków, przez co prekursor, tj. famcyklowir, nie jest przekształcany w ustroju kotów do formy aktywnej, czyli PCV [26, 27, 32].

Sulfonowane pochodne polistyrenu są znane. Znane są także ich właściwości przeciwdrobnoustrojowe, w szczególności przeciwwirusowe, a także ich zastosowanie w medycynie, np. do leczenia hiperkalemii. Reprezentatywną, znaną sulfonowaną pochodną polistyrenu jest sól sodowa sulfonianu polistyrenu (ang. poly(sodium styrenesulfonate, PSSNa)). Znana jest ona ze swojej przeciwbakteryjnej oraz przeciwwirusowej aktywności. Wykazano, że hamuje ona namnażanie się wielu patogenów, w tym: HIV, HPV, HSV-1, HSV-2, Gardnerella vaginalis, Chlamydia trachomatis and Neisseria gonorrhoeae [33-37]. Jak dotąd nie wykazano jednak możliwości jej stosowania w przypadku infekcji wywołanej przez wirusa FHV-1. W przypadku wirusa HSV wykazano, że polimer PSSNa hamuje replikację poprzez uniemożliwienie wiązania się wirionów na powierzchni komórek, przez co przenoszenie się wirusa z komórki zainfekowanej na komórkę zdrową jest utrudnione [35]. Zważywszy na to, że zaproponowany mechanizm działania obejmuje aktywność przeciwwirusową na wczesnych etapach infekcji zasugerowano, iż PSSNa jest mimetykiem siarczanu heparanu (HS), czyli że jest w stanie „naśladować” HS obecny na powierzchni infekowanych komórek, który stanowi czynnik adhezyjny dla wirusa HSV. Ponadto wykazano, że mimetyki siarczanu heparanu, takie jak fukozanoidy, siarczany dekstranu czy siarczany mannanu blokują wiązanie się wirusów HSV-1 oraz HSV-2 z czynnikami adhezyjnymi [38-41]. Co więcej, λ-karageny typu IV, które również są uważane za mimetyki HS, są zdolne do wiązania wirusa FHV-1, co prowadzi do zablokowania jego interakcji z czynnikiem adhezyjnym (HS). Pomimo tego, że rezultaty uzyskane przy zastosowaniu λ-karagenów typu IV in vitro były obiecujące, w modelu kocim nie zaobserwowano poprawy stanu zdrowia po podaniu preparatu zawierającego ten związek [42].

Nadal istnieje potrzeba otrzymania nowych inhibitorów replikacji kocich herpeswirusów, w szczególności wirusa FHV-1, zwłaszcza zaś środków o innym mechanizmie działania niż obecnie dostępne do leczenia i/lub profilaktyki infekcji wywołanej przez kociego herpeswirusa, które to środki nadawałyby się także do terapii skojarzonej tego rodzaju infekcji.

Celem wynalazku opisanego w niniejszym zgłoszeniu jest zatem otrzymanie nowej, skutecznej substancji czynnej do zastosowania w leczeniu i/lub profilaktyce infekcji wywołanej przez kociego herpeswirusa, w szczególności wirusa FHV-1, otrzymanie nowego skutecznego środka do zastosowania w leczeniu i/lub profilaktyce infekcji wywołanej przez kociego herpeswirusa, który może być stosowany w terapii skojarzonej z dostępnymi już terapiami tego rodzaju infekcji.

Cele te zrealizowano przy pomocy rozwiązań przedstawionych w załączonych zastrzeżeniach patentowych. Nieoczekiwanie stwierdzono bowiem, że cele te można zrealizować stosując sulfonowaną pochodną polistyrenu.

Przedmiotem niniejszego wynalazku jest sulfonowana pochodna polistyrenu o wzorze I:

(Wzórl)

PL 239 391 BI w którym M oznacza kation metalu, z oznacza liczbę całkowitą od 1 do 3 a n oznacza liczbę całkowitą w zakresie od 7 do 6000 do zastosowania w leczeniu i/lub profilaktyce infekcji wywołanej przez kociego herpeswirusa.

Korzystnie sulfonowana pochodna polistyrenu, do zastosowania według wynalazku, ma postać soli, korzystniej sulfonowana pochodna polistyrenu ma postać soli sodowej, którą stanowi sól sodowa sulfonianu polistyrenu (PSSNa).

Korzystnie sulfonowana pochodna polistyrenu do zastosowania według wynalazku ma masę cząsteczkową wynoszącą co najmniej 1,5 kDa, korzystniej co 10 najmniej 8 kDa.

Jeszcze korzystniej sulfonowana pochodna polistyrenu do zastosowania według wynalazku ma masę cząsteczkową w zakresie od 8 kDa do 1200 kDa, a nawet jeszcze korzystniej ma ona masę cząsteczkową wybraną z grupy składającej się z 8 kDa, 19,3 kDa, 35 kDa, 46 kDa, 93,5 kDa, 200 kDa, 400 kDa, 780 kDa i 1200 kDa, najkorzystniej ma ona masę cząsteczkową wynoszącą 93,5 kDa lub 780 kDa.

Korzystnie infekcję wywołaną przez kociego herpeswirusa stanowi koci katar.

Korzystnie infekcję wywołaną przez kociego herpeswirusa stanowi infekcja wywołana przez kociego herpeswirusa typu 1 (FHV-1).

Przedmiotem wynalazku jest ponadto sulfonowana pochodna polistyrenu o wzorze I:

(Wzórl) w którym M oznacza kation metalu, z oznacza liczbę całkowitą od 1 do 3 a n oznacza liczbę całkowitą w zakresie od 7 do 6000 do zastosowania w terapii skojarzonej infekcji wywołanej przez kociego herpeswirusa.

Korzystnie zgodnie z wynalazkiem sulfonowana pochodna polistyrenu przeznaczona jest do zastosowania w terapii skojarzonej, która obejmuje równoczesne zastosowanie innego środka do leczenia infekcji wywołanej przez kociego herpeswirusa.

Przez równoczesne stosowanie rozumie się tutaj podawanie związku według wynalazku jednocześnie z innym środkiem do leczenia infekcji wywołanej przez kociego herpeswirusa, w jednym preparacie lub w odrębnych preparatach.

Korzystniej taki inny środek do leczenia infekcji wywołanej przez kociego herpeswirusa stanowi analog nukleozydu, jeszcze korzystniej acyklowir (ACV) i/lub pencyklowir (PCV).

Korzystnie sulfonowana pochodna polistyrenu do zastosowania w terapii skojarzonej według wynalazku ma postać soli, korzystniej ma postać soli sodowej, którą stanowi sól sodowa sulfonianu polistyrenu.

Korzystnie sulfonowana pochodna polistyrenu do zastosowania w terapii skojarzonej według wynalazku ma masę cząsteczkową wynoszącą co najmniej 1,5 kDa, korzystniej co najmniej 8 kDa.

Jeszcze korzystniej sulfonowana pochodna polistyrenu do zastosowania w terapii skojarzonej według wynalazku ma masę cząsteczkową w zakresie od 8 kDa do 1200 kDa, a nawet jeszcze korzystniej ma ona masę cząsteczkową wybraną z grupy składającej się z 8 kDa, 19,3 kDa, 35 kDa, 46 kDa, 93,5 kDa, 200 kDa, 400 kDa, 780 kDa i 1200 kDa, najkorzystniej ma ona masę cząsteczkową wynoszącą 93,5 kDa lub 780 kDa.

Korzystnie infekcję wywołaną przez kociego herpeswirusa stanowi koci katar.

PL 239 391 B1

Korzystnie infekcję wywołaną przez kociego herpeswirusa stanowi infekcja wywołana przez kociego herpeswirusa typu 1 (FHV-1).

Jak opisano powyżej przedmiotem wynalazku jest sulfonowana pochodna polistyrenu, szczególnie korzystnie sól sodowa sulfonianu polistyrenu, do zastosowania w leczeniu i/lub profilaktyce infekcji wywołanej przez kociego herpeswirusa, w szczególności wirusa FHV-1, jak również do zastosowania w terapii skojarzonej infekcji wywołanej przez kociego herpeswirusa. Taka sulfonowana pochodna polistyrenu, zwłaszcza sól sodowa sulfonianu polistyrenu, może być stosowana do wytwarzania leku do leczenia i/lub profilaktyki infekcji wywołanej przez kociego herpeswirusa, w tym także terapii skojarzonej infekcji wywołanej przez tego wirusa, zwłaszcza kociego herpeswirusa 1 (FHV-1), obejmującej dodatkowo podawanie innego środka do leczenia infekcji wywołanej przez kociego herpeswirusa, takiego jak analog nukleozydu, w szczególności acyklowir (ACV) i/lub pencyklowir (PCV).

Sulfonowana pochodna polistyrenu do zastosowania według wynalazku ma korzystnie postać soli, w szczególności soli sodowej. Reprezentatywną sulfonowaną pochodną polistyrenu jest sól sodowa sulfonianu polistyrenu (PSSNa). Przykładem innej soli sulfonianu polistyrenu może być sól wapniowa czy sól potasowa.

Sulfonowane pochodne polistyrenu, takie jak sól sodowa sulfonianu polistyrenu (PSSNa), mogą być wytwarzane dowolną metodą znaną specjalistom. Związki te mogą być następnie włączane do kompozycji farmaceutycznej wraz z odpowiednimi farmaceutycznie dopuszczalnymi zaróbkami, rozcieńczalnikami i/lub podłożami. Kompozycje tego rodzaju można wytwarzać w postaci preparatów odpowiednich do podawania dowolną drogą podawania, taką jak na przykład droga miejscowa, droga donosowa lub droga doustna. Kompozycje tego rodzaju mogą mieć przykładowo postać preparatu do podawania miejscowego, na przykład maści lub preparatu do podawania doustnego, na przykład roztworu lub zawiesiny.

Związki do zastosowania zgodnie z wynalazkiem pozwalają na profilaktykę i/lub leczenie infekcji wywołanej przez kociego herpeswirusa i zmniejszenie ryzyka infekcji wtórnych. Związki do zastosowania zgodnie z wynalazkiem pozwalają ponadto na łagodzenie przebiegu infekcji wywołanej przez kociego herpeswirusa. Związki do zastosowania zgodnie z wynalazkiem są niezwykle skuteczne, gdyż wykazano niemal całkowite zahamowanie przez nie replikacji wirusa FHV-1 in vitro, a ponadto charakteryzują się one bardzo niską lub niewykrywalną toksycznością. Co więcej, związki do zastosowania zgodnie z wynalazkiem nadają się do stosowania w terapii skojarzonej infekcji wywołanej przez kociego herpeswirusa, zwłaszcza FHV-1, wraz z co najmniej jednym innym, dodatkowym środkiem stosowanym w leczeniu tego rodzaju infekcji, zwłaszcza o innym mechanizmie działania niż sulfonowana poc hodna polistyrenu, zwłaszcza sól sodowa sulfonianu polistyrenu. Przykładami takich innych środków stosowanych w leczeniu tego rodzaju infekcji są analogi nukleozydów. Związki do zastosowania zgodnie z wynalazkiem szczególnie nadają się do zastosowania wraz z pencyklowirem (PCV). Takie skojarzone zastosowanie sulfonowanej pochodnej polistyrenu i analogu nukleozydu pozwala na uzyskanie efektu synergistycznego, który jest niezwykle istotny w warunkach in vivo, pozwalając na zwiększenie skuteczności terapii infekcji wywołanej przez kociego herpeswirusa, obniżenie stosowanych dawek stosowanych środków leczniczych oraz obniżenie ich ewentualnej toksyczności i skutków ubocznych. Umożliwia to także leczenie infekcji wywołanej przez kociego herpeswirusa opornego na obecnie dostępne środki lecznicze stosowane do tego celu.

Przeprowadzone badania wskazały, że sulfonowana pochodna polistyrenu, korzystnie PSSNa, nie działa na zakażoną komórkę, ale wiąże się z herpeswirusem, takim jak korzystnie FHV-1, i blokuje w ten sposób rozprzestrzenianie się tego wirusa, ograniczając wywołaną przez niego infekcję. Dzięki temu taka pochodna jest niezwykle skuteczna. Ponadto charakteryzuje się bardzo niską toksycznością i nie wywołuje skutków ubocznych.

Przeprowadzone badania wykazały ponadto, że sulfonowana pochodna polistyrenu, korzystnie PSSNa, posiada inny mechanizm działania przeciwwirusowego niż środki obecnie dostępne na rynku. Dzięki temu może być skutecznie stosowana w terapii skojarzonej z innymi lekami przeciwwirusowymi stosowanymi w przypadku infekcji wywołanej przez kociego herpeswirusa, korzystnie z analogami nukleozydów, zwłaszcza acyklowirem i/lub pencyklowirem, w celu uzyskania efektu synergistycznego. Pozwala to na zwiększenie skuteczności terapii infekcji wywołanej przez kociego herpeswirusa, zmniejszenie dawek stosowanych środków i ograniczenie toksyczności przy zachowaniu odpowiedniej skuteczności terapeutycznej czy profilaktycznej, jak również na skuteczne leczenie infekcji wywołanej przez oporne na obecnie dostępne terapie mutanty kocich herpeswirusów.

PL 239 391 B1

Niniejszy wynalazek zostanie poniżej zilustrowany za pomocą przykładów wykonania i figur, które nie mają jednak w jakikolwiek sposób ograniczać zakresu ochrony wynalazku jak zdefiniowano w zastrzeżeniach patentowych.

Krótki opis figur

Fig. 1 przedstawia wyniki badania wpływu polimerów o różnych masach cząsteczkowych na przeżywalność komórek nerki kota Crandell-Reese (CrFK, ang. Crandell-Reese Feline Kidney cells). Zostały przedstawione wyniki dla dwóch wybranych stężeń, które stanowiły odpowiednio najwyższe stężenie, które przetestowano oraz stężenie, w którym wykazana została wysoka aktywność przeciwwirusowa: 500 μg/ml (Fig. 1 A) oraz 20 μg/ml (Fig. 1 B). Wartości zostały znormalizowane względem przeżywalności komórek kontrolnych, stanowiącej 100%.

Fig. 2 przedstawia zależność pomiędzy masą cząsteczkową polimeru a jego aktywnością przeciwko wirusowi FHV-1. Za pomocą reakcji PCR w czasie rzeczywistym wyznaczono liczbę kopii DNA wirusowego w 1 ml pożywki (Fig. 2 A), natomiast testy łysinkowe pozwoliły na wyznaczenie liczby zakaźnych wirionów (Fig. 2 B). Test replikacji przeprowadzony został z użyciem polimerów o różnych masach cząsteczkowych w stężeniu 20 μg/ml.

Fig. 3 przedstawia zależność pomiędzy stężeniem polimeru a jego aktywnością przeciwko wirusowi FHV-1. Za pomocą reakcji PCR w czasie rzeczywistym wyznaczono liczbę kopii DNA wirusowego w 1 ml pożywki (Fig. 3 A, Fig. 3 B), natomiast testy łysinkowe pozwoliły na wyznaczenie liczby zakaźnych wirionów (Fig. 3 C, Fig. 3 D). Test replikacji przeprowadzony został z użyciem różnych stężeń polimeru o masie cząsteczkowej 93,5 kDa (Fig. 3 A, Fig. 3 C) oraz polimeru o masie cząsteczkowej 780 kDa (Fig. 3 B, Fig. 3 D). Wartości zostały znormalizowane względem kontroli wirusowej.

Fig. 4 przedstawia wyniki badań mechanizmu działania polimerów PSSNa. W celu identyfikacji etapu, na którym dochodzi do zahamowania replikacji wirusa FHV-1 przez polimer PSSNa przeprowadzono 4 testy funkcjonalne. Za pomocą reakcji PCR w czasie rzeczywistym wyznaczono liczbę kopii DNA wirusowego w 1 ml pożywki (Fig. 4 A), natomiast testy łysinkowe pozwoliły na wyznaczenie liczby zakaźnych wirionów (Fig. 4 B). Test I został przeprowadzony z użyciem różnych stężeń polimeru o masie cząsteczkowej 93,5 kDa (Fig. 4 C) oraz polimeru o masie cząsteczkowej 780 kDa (Fig. 4 D).

Fig. 5 przedstawia wizualizację zahamowania zakażenia komórek CrFK wirusem FHV-1 poprzez polimery PSSNa. Osobno przedstawiono poszczególne kanały oraz połączenie 3 kanałów. Kanał niebieski przedstawia jądra komórkowe, kanał czerwony F-aktynę, natomiast kanał zielony wiriony FHV-1. Na figurze zostały przedstawione wizualizacje komórek kontrolnych (ślepa próba), kontroli wirusowej, komórek traktowanych PSSNa93,5 oraz komórek traktowanych PSSNa780. Pasek skali wyznacza 10 μm.

Przykłady

Wszystkie opisane poniżej testy i procedury doświadczalne przeprowadzono z zastosowaniem komercyjnie dostępnych zestawów testowych, odczynników i aparatury, postępując zgodnie z zaleceniami producentów stosowanych zestawów, odczynników i aparatury, o ile nie wskazano wyraźnie inaczej. Wskazane powyżej parametry testowe mierzono z zastosowaniem standardowych, powszechnie znanych metod stosowanych w dziedzinie, do której należy niniejszy wynalazek.

P r z y k ł a d 1

Wpływ soli sodowej sulfonianu polistyrenu (PSSNa) o różnej masie cząsteczkowej na przeżywalność komórek CrFK

Cytotoksyczność polimerów została oznaczona z wykorzystaniem zestawu do testu żywotności XTT (XTT Viability Assay Kit, Biological Industries, Izrael), który polega na ilościowym oznaczeniu zdolności komórek aktywnych metabolicznie do przekształcenia substratu w jego barwną pochodną. Do przeprowadzenia doświadczenia wykorzystano permisywną linię komórkową CrFK (komórki kory kociej nerki Crandell-Reese, Felis catus, ang. Crandell-Reese Feline Kidney Cells, ATCC® CCL-94™). Warunki testu były standardowe. Komórki hodowane były przez 48 godzin w pożywce DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium) suplementowanej 3% FBS (inaktywowana termicznie płodowa surowica bydlęca), penicyliną, streptomycyną, gentamycyną oraz polimerami PSSNa o różnych masach cząsteczkowych. Na Fig. 1 przedstawiono wyniki dla dwóch wybranych stężeń polimerów: 500 μg/ml (Fig. 1 A, najwyższe przetestowane stężenie) oraz 20 μg/ml (Fig. 1 B, stężenie, w którym wykazano wysoką aktywność przeciwwirusową). W skrócie, po hodowli komórek CrFK na 96-dołkowej płytce przez 24 godz. usuwano starą pożywkę i do każdego dołka płytki dodawano 100 μl świeżej pożywki zawierającej wybrane stężenie polimeru. Próbka kontrolna nie zawierała polimeru w pożywce. Następnie usuwano po

PL 239 391 Β1 żywkę z polimerami i do każdego dołka dodawano 100 μΙ świeżej pożywki z 20 μΙ aktywowanego karboksyanilidu 2,3-bis-(2-metoksy-4-nitro-5-sulfenylo)-(2H)-tetrazoliny (ΧΤΤ). Po 2 godz. inkubacji nadsącz przeniesiono do przezroczystej płytki 96-dołkowej i za pomocą spektrofotometru w standardowy sposób mierzono absorbancję przy długości fali wynoszącej 480 nm. Uzyskane wartości wyników zostały znormalizowane względem absorbancji zmierzonej dla komórek kontrolnych (bez polimerów), którym przypisano 100% wartości przeżywalności. Przetestowano 11 polimerów PSSNa o różnych masach cząsteczkowych (1,5; 5,4; 8; 19,3; 35; 46; 93,5; 200; 400; 780 i 1200 kDa).

Uzyskane wyniki wskazują na brak znaczącej cytotoksyczności polimerów w badanym zakresie masy cząsteczkowej i w badanym zakresie stężeń, tj. od 20 pg/ml do 500 pg/ml.

Przykład 2

Wpływ soli sodowej sulfonianu polistyrenu (PSSNa) na replikację kociego herpeswirusa typu 1 (FHV-1)

W celu określenia aktywności soli sodowej sulfonianu polistyrenu (PSSNa) przeciwko kociemu herpeswirusowi typu 1 (szczep C-27, ATCC: VR-636) przeprowadzono test wpływu tego polimeru na replikację wirusową. W tym doświadczeniu polimer był obecny na każdym etapie replikacji wirusowej przed, podczas oraz po infekcji. W skrócie, całkowicie konfluentne komórki CrFK wysiano 24 godziny przed doświadczeniem na płytkę 96-dołkową. Następnie pożywkę odrzucono i dodano 20 μΙ świeżej pożywki zawierającej polimer. Płytki inkubowano przez 30 min w 37°C, następnie odrzucono pożywkę z polimerem i dodano 50 μΙ roztworu polimeru w 3% DMEM lub 3% DMEM bez polimeru (próbka kontrolna) z próbką ślepą lub wirusem FHV-1 (szczep C-27) o mianie TClDso (ang. 50% of tissue culture infective dose, dawka zakażająca 50% hodowli tkankowej) = 400/ml. Płytki inkubowano przez 2 godz. w 37°C, następnie komórki płukano dwukrotnie 1 x PBS w celu usunięcia niezwiązanych cząstek wirusowych. Na koniec do każdej studzienki dodano 100 μΙ roztworu polimeru w 3% DMEM i komórki inkubowano przez 48 godz. Po tym czasie nadsącze zebrano w celu oceny ilościowej zakażenia z zastosowaniem (a) ilościowej reakcji PCR (qPCR) oraz (b) testów łysinkowych w następujący sposób:

(a ) qPCR

Izolację wirusowego DNA przeprowadzono 48 godz. po infekcji z zastosowaniem testu do izolacji Viral DNA/RNA Isolation Kit (A&A Biotechnology, Polska), zgodnie z protokołem dostarczonym przez producenta. Tak wyizolowany DNA stanowił matrycę do przeprowadzenia ilościowej reakcji PCR w czasie rzeczywistym (qPCR). Zastosowano znane w tej dziedzinie startery amplifikujące konserwatywny fragment sekwencji genu dla glikoproteiny B oraz komplementarną do tego fragmentu sondę [43]. Zastosowane sekwencje starterów i sondy zostały przedstawione w Tabeli 1.

Tabela 1. Sekwencje starterów oraz sondy użytych do reakcji PCR w czasie rzeczywistym

OUgonukleotyd	Sekwencja oligonukleotydu 5’->3’
Starter sensowny	AGAGGCTAACGGACCATCGA
Starter antysensowny	GCCCGTGGTGGCTCTAAAC
Sonda	TATATGTGTCCACCACCTTCAGGATCTACTGTCGT

W skrócie, reakcję qPCR przeprowadzono w następujący sposób. 2,5 μΙ wyizolowanego wirusowego DNA powielono w reakcji o objętości 10 μΙ zawierającej 1 x mieszaninę Kapa Probe Fast qPCR MasterMix (Sigma-Aldrich, Polska), 100 nM swoistej sondy znakowanej 6-karboksyfluoresceiną (FAM) i 6-karboksytetrametylorodaminą (TAMRA) (5’ - FAM - TAT ATG TGT CCA CCA CCT TCA GGA TCT ACT GTC GT - TAMRA - 3'), oraz 450 nM każdego startera (5' - AGA GGC TAA CGG ACC ATC GA - 3’ i 5’ - GCC CGT GGT GGC TCT AAA C - 3’). Powyżej wspomniana swoista sonda i startery powielały fragment sekwencji o długości 81 p.z. z genu glikoproteiny B (gB) FHV-1 umożliwiając zmierzenie liczby kopii wirusowego DNAw próbce [43]. Reakcję przeprowadzono w termocyklerze (CFX96 Touch™ Real-197 Time PCR Detection System, Bio-Rad) w następujących warunkach: 3 min w 95°C, następnie 39 cykli po 15 sekund w 95°C i 30 sekund w 58°C.

W celu oceny liczby kopii wirusowego DNA w próbce przygotowano odpowiednie wzorce. Fragment sekwencji gB powielono z zastosowaniem starterów opisanych powyżej. Tak otrzymany DNA klonowano do plazmidu pTZ57R/T (Thermo Scientific, Polska) z zastosowaniem zestawu InsTAclone PCR Cloning Kit (Thermo Scientific, Polska). Przeprowadzono transformację szczepu E. coli TOP10 (Life

PL 239 391 Β1

Technologies, Polska) i namnażanie wektora plazmidowego w standardowy sposób. Następnie plazmid oczyszczono z zastosowaniem zestawu do izolacji GeneJET Plasmid Miniprep Kit (Thermo Scientific, Polska) i poddawano linearyzacji poprzez trawienie enzymem restrykcyjnym Kpnl. Stężenie linearyzowanego DNA oceniano poprzez pomiar spektrofotometryczny i obliczano liczbę kopii DNA w 1 ml pożywki. Jako matrycę w reakcji PCR w czasie rzeczywistym stosowano osiem 10-krotnych kolejnych rozcieńczeń seryjnych. Zdolność polimerów do zahamowania replikacji wirusa FHV-1 wyznaczono jako spadek liczby kopii DNA wirusowego w 1 mililitrze pożywki.

b) Testy łysinkowe

Analizę ilościową zakaźnych wirionów FHV-1 przeprowadzono na komórkach CrFK, które wysiano na 24-dołkowe płytki. Komórki konfluentne w 80-90% zakażano 24 godz. od wysiania poprzez dodanie świeżej, zawierającej 10-krotne seryjne rozcieńczenia nadsączy, po czym komórki inkubowano przez 1 godz. w 37°C w atmosferze zawierającej 5% CO2. Następnie komórki płukano jednokrotnie 1 x PBS w celu usunięcia niezwiązanych cząstek wirusowych i nakładano 0,5 ml pożywki DMEM suplementowanej 10% inaktywowaną termicznie płodową surowicą bydlęcą (FBS, Life Technologies, Polska), penicyliną (100 U/ml), streptomycyną (100 pg/ml) i 1% metylocelulozą (Sigma-Aldrich, Polska). Czas potrzebny na utworzenie łysinek przez wirusa FHV-1 to około 72 godz. Po tym czasie komórki były utrwalane i wybarwiane 0,1% roztworem fioletu krystalicznego rozpuszczonego w 50% (obj./obj.) roztworze metanol:woda. Łysinki zostały zliczone, a uzyskane wartości zostały przedstawione na wykresie jako PFU (ang. plaque forming unit, jednostka tworząca łysinkę) na 1 ml pożywki.

W powyższy sposób zbadano zależność pomiędzy masą cząsteczkową polimeru a jego aktywnością przeciwko wirusowi FHV-1. Za pomocą ilościowej reakcji PCR w czasie rzeczywistym wyznaczono liczbę kopii DNA wirusowego w 1 ml pożywki, natomiast testy łysinkowe pozwoliły na wyznaczenie liczby zakaźnych wirionów. Jak pokazano na Fig. 2 test replikacji przeprowadzony został z użyciem polimerów o różnych masach cząsteczkowych i stężeniu 20 pg/ml. Uzyskane wyniki wartości zostały znormalizowane względem kontroli wirusowej.

Przeprowadzone badania wykazały, że testowane polimery wykazują działanie przeciwwirusowe i hamują namnażanie się wirusa FHV-1. Nie wykazano zależności pomiędzy aktywnością przeciwwirusową a masą cząsteczkową polimeru. Zaobserwowano natomiast, że najlepszą aktywność przeciwwirusową wykazywały polimery o masie cząsteczkowej powyżej 8 kDa. Polimery o masie cząsteczkowej poniżej 8 kDa wykazywały słabszą aktywność przeciwwirusową.

Przykład 3

Zależność pomiędzy aktywnością przeciwwirusową soli sodowej sulfonianu polistyrenu (PSSNa) a jej stężeniem w pożywce

W celu wyznaczenia wartości IC50 (ang. 50% inhibitory concentration, stężenie związku w którym dochodzi do 50% zahamowania replikacji wirusa) soli sodowej sulfonianu polistyrenu (PSSNa) testowano wpływ różnych stężeń tego polimeru na replikację wirusową. Test ten został przeprowadzony analogicznie do Przykładu 2. Zbadano zależność pomiędzy stężeniem polimeru a jego aktywnością przeciwko wirusowi FHV-1.

W skrócie, za pomocą reakcji PCR w czasie rzeczywistym wyznaczono liczbę kopii DNA wirusowego w 1 ml pożywki (Fig. 3 A, Fig. 3 B), natomiast testy łysinkowe pozwoliły na wyznaczenie liczby zakaźnych wirionów (Fig. 3 C, Fig. 3 D). Test replikacji przeprowadzony został z użyciem różnych stężeń polimeru o masie cząsteczkowej 93,5 kDa (Fig. 3 A, Fig. 3 C) oraz o masie cząsteczkowej 780 kDa (Fig. 3 B, Fig. 3 D). Wartości zostały znormalizowane względem kontroli wirusowej.

Obliczone wartości IC50 przedstawiono poniżej w Tabeli 2.

Tabela 2. Wartości IC50 dla polimerów wyznaczone metodą PCR w czasie rzeczywistym oraz testem łysinkowym

Polimer	ICso ± SD [pg/ml]
qPCR	Test tysinkowy
PSSNa93,5	2,25 ± 1,01	5,74 ± 1,32
PSSNa780	2.28 ±1.01	5.06 ±1.33

PL 239 391 B1

Wykazano, że testowane polimery hamują namnażanie się wirusa FHV-1, w szczególności w niskim, nietoksycznym stężeniu.

P r z y k ł a d 4

Wyznaczenie mechanizmu przeciwwirusowego działania polimerów PSSNa

Mechanizm działania polimerów PSSNa badano w następujący sposób. W celu identyfikacji etapu, na którym dochodzi do zahamowania replikacji wirusa FHV-1 przez polimer PSSNa przeprowadzono opisane poniżej 4 testy funkcjonalne.

Test I (test inaktywacji)

Zatężoną zawiesinę wirusa inkubowano wraz z polimerem przez 1 godz. w 22°C, a następnie próbki rozcieńczono w celu obniżenia stężenia polimeru poniżej zakresu stężeń w których jest aktywny i oceniano miano wirusa z zastosowaniem testu łysinkowego.

Test ten pozwala stwierdzić, czy do zahamowania dochodzi poprzez oddziaływanie polimeru z wirusem, które uniemożliwia zainfekowanie komórek, czyli innymi słowy pozwala stwierdzić czy testowany związek wywiera bezpośredni wpływ na wirusa.

Test II (test adhezji)

Test ten przeprowadzano w temperaturze 4°C, w której następuje zahamowanie transportu wewnątrzkomórkowego. W skrócie, całkowicie konfluentne komórki CrFK schładzano w 4°C przez 20 min. Następnie na komórki nałożono świeżą pożywkę z próbką ślepą lub z wirusem (TCID50 = 400/ml) z polimerem lub bez polimeru. Płytki inkubowano przez 1 godz. w 4°C. Transport wewnątrzkomórkowy w tej temperaturze został zatrzymany, natomiast możliwa była adsorpcja wirusów do receptorów komórkowych. Po inkubacji komórki płukano dwukrotnie schłodzonym na lodzie 1 x PBS w celu usunięcia niezwiązanych cząstek wirusowych i niezwiązanego polimeru, dodano świeżą pożywkę i komórki inkubowano przez 48 godz. w 37°C. Po 48 godz. nadsącz zebrano i oszacowano replikację wirusa z zastosowaniem qPCT i testów łysinkowych.

Test ten pozwala stwierdzić, czy do zahamowania dochodzi poprzez kompetycję polimeru z wirusem o czynnik adhezyjny i/lub czy polimer oddziałując z czynnikiem adhezyjnym uniemożliwia jego interakcję z wirusem.

Test III (test protekcji komórek)

Komórki najpierw inkubowano z polimerem, co umożliwiało związanie się polimeru do komórek i ewentualną ich protekcję przed infekcją. Niezwiązany polimer wypłukiwano roztworem PBS, a następnie przeprowadzano zakażenie. W skrócie, całkowicie konfluentne komórki CrFK inkubowano w obecności lub nieobecności polimeru przez 1 godz. w 37°C. Następnie płytki płukano dwukrotnie 1 x PBS w celu usunięcia niezwiązanych cząstek polimeru, po czym do każdego dołka dodano świeżą pożywkę z próbką ślepą lub wirusem (TCID50 = 400/ml) w równej objętości i inkubowano przez 2 godz. w 37°C. Następnie płytki płukano dwukrotnie 1 x PBS w celu usunięcia niezwiązanych cząstek wirusowych, na komórki nakładano świeżą pożywkę i inkubowano przez 48 godz. w 37°C. Na koniec zebrano nadsącz z hodowli w celu oceny replikacji wirusa z wykorzystaniem testów łysinkowych i ilościowej reakcji qPCR.

Test ten pozwala stwierdzić, czy polimer wiążąc się do powierzchni komórek jest w stanie je „ochronić” przed infekcją poprzez uniemożliwienie interakcji z receptorem wejścia.

Test IV (późnych etapów: replikacji, składania oraz uwalniania)

W teście tym najpierw przeprowadzano zakażenie poprzez inkubację komórek z wirusem, następnie po inkubacji niezwiązane wiriony wypłukiwano roztworem PBS i nakładano polimer. W skrócie, na konfluentne komórki CrFK nakładano świeżą pożywkę zawierającą próbkę niezakaźną lub próbkę z wirusem (TCID50 = 400/ml) w równej objętości, następnie płytki inkubowano przez 2 godz. w 37°C. Po inkubacji dołki płukano dwukrotnie 1 x PBS w celu usunięcia niezwiązanych cząstek wirusowych, następnie do każdego dołka dodawano świeżą pożywkę zawierającą wybrane stężenie polimeru. Płytki inkubowano przez 48 godz. w 37°C. Po 48 godz. nadsącz znad komórek zbierano i oceniano replikację wirusa z zastosowaniem testów łysinkowych i ilościowej reakcji qPCR.

Test ten pozwala stwierdzić, czy do zahamowania rozprzestrzeniania się wirusa dochodzi na późnych etapach infekcji, np. replikacja, składanie, uwalnianie.

W opisanych powyżej testach za pomocą reakcji PCR w czasie rzeczywistym wyznaczono liczbę kopii DNA wirusowego w 1 ml pożywki (Fig. 4 A), natomiast testy łysinkowe pozwoliły na wyznaczenie liczby zakaźnych wirionów (Fig. 4 B). Test I został przeprowadzony z użyciem różnych stężeń polimeru o masie cząsteczkowej 93,5 kDa (Fig. 4 C) oraz polimeru o masie cząsteczkowej 780 kDa (Fig. 4 D).

Przeprowadzane badania wykazały, że polimer oddziałuje bezpośrednio z wirusem, przez co nie dochodzi do wejścia wirusa do komórki CrFK. Wykazano również, iż im wyższe stężenie polimeru, tym

PL 239 391 BI większa jego efektywność w wiązaniu FHV-1. Bardzo silne zahamowanie infekcji również jest widoczne na etapie adhezji, jednak warto zwrócić uwagę, że podczas tego testu polimer oraz wirus są w tym samym czasie w pożywce hodowlanej, co umożliwia związanie się polimeru do wirusa i zahamowanie jego zdolności do internalizacji. Aktywność przeciwwirusowa jest również widoczna na późnych etapach infekcji, co prawdopodobnie ma związek z interakcją wirionów potomnych z obecnym w pożywce polimerem, jednakże nie wyklucza się dodatkowego działania PSSNa na późnych etapach infekcji.

Przykład 5

Wizualizacja zahamowania replikacji kociego herpeswirusa typu 1 przez wybrane dwa polimery PSSNa za pomocą mikroskopii konfokalnei

Aby przygotować preparaty komórki CrFK zostały wysiane w standardowy sposób na szkiełka mikroskopowe 24 godziny przed doświadczeniem. Następnie komórki schłodzono i inkubowano przez godzinę w temperaturze 4°C w obecności wirusa lub wirusa i polimeru w standardowy sposób. Po zadanym czasie inkubacji niezwiązane cząstki wirusowe odpłukano, preparaty utrwalono i wybarwiono w standardowy sposób. Do barwień immunofluorescencyjnych użyto mysich przeciwciał pierwszorzędowych skierowanych przeciwko wirusowi FHV-1 oraz kozich anty-mysich przeciwciał drugorzędowych sprzęgniętych z barwnikiem fluorescencyjnym Alexa Fluor 488 w celu wizualizacji wirionów, falloidyny sprzęgniętej z Alexa Fluor 647 w celu barwienia filamentów F-aktyny oraz4’,6’-diamidyno-2-fenyloindolu (DAPI) w celu barwienia DNA jądrowego. Przedstawione zostały projekcje maksymalne.

Fig. 5 przedstawia wizualizację zahamowania zakażenia komórek CrFK wirusem FHV-1 poprzez polimery PSSNa. Osobno przedstawiono sygnał dla każdego z kolorów (kanały niebieski, czerwony oraz zielony) oraz połączenie sygnału od wszystkich trzech barwników (połączone kanały). Kolorem niebieskim przedstawiono jądra komórkowe, kolorem czerwonym F-aktynę, natomiast kolorem zielonym wiriony FHV-1. Na figurze zostały przedstawione wizualizacje komórek kontrolnych (ślepa próba), kontroli wirusowej, komórek traktowanych PSSNa93,5 oraz komórek traktowanych PSSNa780. Pasek skali odpowiada 10 pm.

Na wizualizacjach mikroskopowych widać znaczne zmniejszenie się liczby wirionów FHV-1 na komórkach CrFK w obecności badanych polimerów PSSNa. Przeprowadzone badania potwierdzają skuteczność sulfonowanej pochodnej polistyrenu przeciwko infekcji wywołanej przez kociego herpeswirusa.

Przykład 6

Ocena efektu synergistycznego sulfonowanych pochodnych polistyrenu i analogów nukleozydów Efekt synergistyczny reprezentatywnej sulfonowanej pochodnej polistyrenu, PSSNa, oraz przykładowych analogów nukleozydów o innym mechanizmie działania przeciwwirusowego, tj. acyklowiru (ACV) i pencyklowiru (PCV), badano w znany sposób [44], z pewnymi modyfikacjami. Doświadczenie przeprowadzono w dwóch układach. W jednym układzie stosowano stałe stężenie PSSNa (związek II) i różne stężenia odpowiedniego badanego analogu nukleozydu (związek I), natomiast w drugim układzie stosowano stałe stężenie odpowiedniego badanego analogu nukleozydu (związek II) i różne stężenia PSSNa (związek I). W skrócie, najpierw przeprowadzono w sposób opisany powyżej test ΧΤΤ w celu wykluczenia toksyczności związanej ze stosowanym lekiem, następnie przeprowadzono w sposób opisany powyżej test replikacji wirusa w celu określenia wartości ICso dla FHV-1 szczepu C-27 przy TCID50 = 400/ml dla ACV i PCV (z zastosowaniem gPCR). Następnie w celu oceny efektu synergistycznego ACV/PCV i polimeru PSSNa o masie cząsteczkowej 780 kDa (PSSNa780) przygotowano dwa typy seryjnych rozcieńczeń: (1) sześć 2-krotnych seryjnych rozcieńczeń związku I począwszy od stężenia równego ICso związku I zmieszano ze związkiem II o stężeniu równym IC50 związku II; (2) sześć 2-krotnych seryjnych rozcieńczeń związku II począwszy od stężenia równego IC50 związku II zmieszano ze związkiem I o stężeniu równym IC50 związku I. Maksymalne stężenia obu związków wynosiły zatem połowę wartości ich IC50. W opisany wcześniej sposób przeprowadzono test replikacji wirusa na całkowicie konfluentnych komórkach CrFK. Po 48 godz. nadsącza zebrano i oceniano liczbę wirionów z zastosowaniem ilościowej reakcji gPCR w standardowy sposób.

Skojarzony efekt oceniano poprzez obliczenie współczynnika kombinacji (ang. combination index, Cl) zgodnie ze wzorem:

Cl = — + — (1)

Dl Oz ' w którym:

PL 239 391 B1 di oznacza stężenie związku I w obecności IC50/2 związku II wywołujące 50% spadek liczby wirionów;

d2 oznacza stężenie związku II w obecności IC50/2 związku I wywołujące 50% spadek liczby wirionów;

Di oznacza IC50 związku I;

D2 oznacza IC50 związku II.

Współczynnik CI określa skojarzony efekt leków: wynik >1 oznacza efekt antagonistyczny, około 1 oznacza efekt addytywny, zaś wynik <1 oznacza efekt synergistyczny.

Przeprowadzone badania wykazały, że dwa analogi nukleozydów, mające odmienne mechanizmy działania od mechanizmu działania PSSNa, to znaczy acyklowir (ACV) i pencyklowir (PCV), wykazują działanie synergistyczne z solą sodową sulfonianu polistyrenu (PSSNa). Obliczone wartości współczynnika CI dla tych związków wyniosły 0,92 dla PSSNa780/ACV i 0,46 dla PSSNa780/PCV. Takie działanie synergistycznie jest szczególnie istotne w warunkach klinicznych in vivo.

Literatura cytowana w opisie

1. Helps, C.R., i wsp., Factors associated with upper respiratory tract disease caused by feline herpesvirus, feline calicivirus, Chlamydophila felis and Bordetella bronchiseptica in cats: experience from 218 European catteries. Vet Rec, 2005. 156(21): str. 669-73.

2. Binns, S.H., i wsp., A study of feline upper respiratory tract disease with reference to prevalence and risk factors for infection with feline calicivirus and feline herpesvirus. J Feline Med Surg, 2000. 2(3): str. 123-33.

3. Bannasch, M.J. and J.E. Foley, Epidemiologic evaluation of multiple respiratory pathogens in cats in animal shelters. J Feline Med Surg, 2005. 7(2): str. 109-19.

4. Fernandez, M., i wsp., Prevalence of feline herpesvirus-1, feline calicivirus, Chlamydophila felis and Mycoplasma felis DNA and associated risk factors in cats in Spain with upper respiratory tract disease, conjunctivitis and/or gingivostomatitis. J Feline Med Surg, 2017. 19(4): str. 461-469.

5. Cohn, L.A., Feline respiratory disease complex. Vet Clin North Am Small Anim Pract, 2011. 41(6): str. 1273-89.

6. Fields BN, K.D., Howley PM, Fields virology. 6th ed., ed. W.K. Health/Lippincott and W. Wilkins. 2013.

7. Xu, F., i wsp., Seroprevalence and coinfection with herpes simplex virus type 1 and type 2 in the United States, 1988-1994. J Infect Dis, 2002. 185(8): str. 1019-24.

8. Gaskell, R.M. and R.C. Povey, Experimental induction of feline viral rhinotracheitis virus reexcretion in FVR-recovered cats. Vet Rec, 1977. 100(7): str. 128-33.

9. Maggs, D.J., i wsp., Evaluation of serologic and viral detection methods for diagnosing feline herpesvirus-1 infection in cats with acute respiratory tract or chronic ocular disease. J Am Vet Med Assoc, 1999. 214(4): str. 502-7.

10. Gould, D., Feline herpesvirus-1: ocular manifestations, diagnosis and treatment options. J Feline Med Surg, 2011. 13(5): str. 333-46.

11. Hartley, C., Aetiology of comeal ulcers assume FHV-1 unless proven otherwise. J Feline Med Surg, 2010. 12(1): str. 24-35.

12. Bistner, S.I., i wsp., Ocular manifestations of feline herpesvirus infection. J Am Vet Med Assoc, 1971. 159(10): str. 1223-37.

13. Stiles, J., Feline herpesvirus. Clin Tech Small Anim Pract, 2003. 18(3): str. 178-85.

14. Gaskell, R.M. and R.C. Povey, Re-excretion of feline viral rhinotracheitis virus following corticosteroid treatment. Vet Rec, 1973.93(7): str. 204-5.

15. Nasisse, M.P., i wsp., Isolation of feline herpesvirus 1 from the trigeminal ganglia of acutely and chronically infected cats. J Vet Intern Med, 1992. 6(2): str. 102-3.

16. Miller, W.H. and R.L. Miller, Phosphorylation of acyclovir diphosphate by cellular enzymes. Biochem Pharmacol, 1982. 31(23): str. 3879-84.

17. Miller, W.H. and R.L. Miller, Phosphorylation of acyclovir (acycloguanosine) monophosphate by GMP kinase. J Biol Chem, 1980. 255(15): str. 7204-7.

18. Elion, G.B., The biochemistry and mechanism of action of acyclovir. J Antimicrob Chemother, 1983. 12 Suppl B: str. 9-17.

PL 239 391 B1

19. Maggs, D.J., Update on pathogenesis, diagnosis, and treatment of feline herpesvirus type 1. Clin Tech Small Anim Pract, 2005. 20(2): str. 94-101.

20. Maggs, D.J. and H.E. Clarke, In vitro efficacy of ganciclovir, cidofovir, penciclovir, foscarnet, idoxuridine, and acyclovir against feline herpesvirus type-1. Am J Vet Res, 2004. 65(4): str. 399-403.

21. Nasisse, M.P., i wsp., In vitro susceptibility of feline herpesvirus-1 to vidarabine, idoxuridine, trifluridine, acyclovir, or bromovinyldeoxyuridine. Am J Vet Res, 1989. 50(1): str. 158-60.

22. Collins, P., The spectrum of antiviral activities of acyclovir in vitro and in vivo, J Antimicrob Chemother, 1983. 12 Suppl B: str. 19-27.

23. Soul-Lawton, J., i wsp., Absolute bioavailability and metabolic disposition of valaciclovir, the L-valyl ester of acyclovir, following oral administration to humans. Antimicrob Agents Chemother, 1995. 39(12): str. 2759-64.

24. Nasisse, M.P., i wsp., Effects of valacyclovir in cats infected with feline herpesvirus 1. Am J Vet Res, 1997. 58(10): str. 1141-4.

25. Hussein, I.T., R.V. Menashy, and H.J. Field, Penciclovir is a potent inhibitor of feline herpesvirus-1 with susceptibility determined at the level of virus-encoded thymidine kinase. Antiviral Res, 2008. 78(3): str. 268-74.

26. Groth, A.D., i wsp., In vitro cytotoxicity and antiviral efficacy against feline herpesvirus type 1 of famciclovir and its metabolites. Vet Ophthalmol, 2014. 17(4): str. 268-74.

27. Thomasy, S.M., i wsp., Evaluation of orally administered famciclovir in cats experimentally infected with feline herpesvirus type-1. Am J Vet Res, 2011. 72(1): str. 85-95.

28. Malik, R., i wsp., Treatment of feline herpesvirus-1 associated disease in cats with famciclovir and related drugs. J Feline Med Surg, 2009. 11(1): str. 40-8.

29. Filer, C.W., i wsp., Metabolic and pharmacokinetic studies following oral administration of 14C-famciclovir to healthy subjects. Xenobiotica, 1994. 24(4): str. 357-68.

30. Pue, M.A., i wsp., Linear pharmacokinetics of penciclovir following administration of single oral doses of famciclovir 125,250, 500 and 750 mg to healthy volunteers. J Antimicrob Chemother, 1994. 33(1): str. 119-27.

31. Hussein, I.T., i wsp., Substrate specificity and molecular modelling of the feline herpesvirus1 thymidine kinase. Arch Virol, 2008. 153(3): str. 495-505.

32. Dalvie, D., i wsp., Interspecies variation in the metabolism of zoniporide by aldehyde oxidase. Xenobiotica, 2013. 43(5): str. 399-408.

33. Anderson, R.A., i wsp., Evaluation of poly(styrene-4-sulfonate) as a preventive agent for conception and sexually transmitted diseases. J Androl, 2000. 21(6): str. 862-75.

34. Christensen, N.D., i wsp., Papillomavirus microbicidal activities of high-molecular-weight cellulose sulfate, dextran sulfate, and polystyrene sulfonate. Antimicrob Agents Chemother, 2001.45(12): str. 3427-32.

35. Herold, B.C., i wsp., PoIy(sodium 4-styrene sulfonate): an effective candidate topical antimicrobial for the prevention of sexually transmitted diseases. J Infect Dis, 2000. 181 (2): str. 770-3.

36. Simoes, J.A., i wsp., Two novel vaginal microbicides (polystyrene sulfonate and cellulose sulfate) inhibit Gardnerella vaginalis and anaerobes commonly associated with bacterial vaginosis, Antimicrob Agents Chemother, 2002. 46(8): str. 2692-5.

37. Zaneveld. L.J., i wsp., Efficacy and safety of a new vaginal contraceptive antimicrobial formulation containing high molecular weight poly(sodium 4 styrenesulfonate). Biol Reprod, 2002. 66(4): str. 886-94.

38. Ito, M.. i wsp., In vitro activity of mannan sulfate, a novel sulfated polysaccharide, against human immunodeficiency virus type 1 ami other enveloped viruses. Eur J Clin Microbiol Infect Dis, 1489. 8(2); str. 171-3,

39. Baba, M., i wsp., Sulfated polysaccharides are potent and selective inhibitors of various enveloped viruses, including herpes simplex virus, cytomegalovirus, vesicular stomatitis virus, and human immunodeficiency virus. Antimicrob Agents Chemother, 1988. 32(11): str. 1742-5.

40. Mohan, P., i wsp., Sulfonic acid polymers as a new class of human immunodeficiency virus inhibitors. Antiviral Res, 1992. 18(2): str. 139-50.

41. Zacharopoulos. V.R. and D.M. Phillips, Vaginal formulations of carrageenan protect mice from herpes simplex virus infection. Clin Diagn Lab Immunol. 1997. 4(4): str. 465-8.

PL 239 391 Β1

42. Stiles, J., i wsp., Effects of lambda-carrageenan on in vitro replication of feline herpesvirus and on experimentally induced herpetic conjunctivitis in cats. Invest Ophthalmol Vis Sci, 2008. 49(4): str. 1496-501.

43. Vogtlin, A., i wsp., Ouantification of feline herpesvirus 1 DNA in ocular fluid samples of clinically diseased cals by real time TaqMan PCR, J Clin Microbiol, 2002.40(2): str. 519-23.

44. Benzekri, R., i wsp., Anti HSV-2 activity of Peganum harmala (L.) and isolation of the active compound. Microb Pathog, 2018. 114: str. 291-298.

Claims (21)

1. Sulfonowana pochodna polistyrenu o wzorze I:

$θ³ (Wzór I) w którym M oznacza kation metalu, z oznacza liczbę całkowitą od 1 do 3, n oznacza liczbę całkowitą w zakresie od 7 do 6000 do zastosowania w leczeniu i/lub profilaktyce infekcji wywołanej przez kociego herpeswirusa.

2. Sulfonowana pochodna polistyrenu do zastosowania według zastrz. 1, znamienna tym, że ma postać soli.

3. Sulfonowana pochodna polistyrenu do zastosowania według zastrz. 2, znamienna tym, że ma postać soli sodowej.

4. Sulfonowana pochodna polistyrenu do zastosowania według jednego z zastrz. 1 do 3, znamienna tym, że ma masę cząsteczkową wynoszącą co najmniej 1,5 kDa, korzystnie co najmniej 8 kDa.

5. Sulfonowana pochodna polistyrenu do zastosowania według zastrz. 4, znamienna tym, że ma masę cząsteczkową w zakresie od 8 kDa do 1200 kDa.

6. Sulfonowana pochodna polistyrenu do zastosowania według zastrz. 5, znamienna tym, że ma masę cząsteczkową wybraną z grupy składającej się z 8 kDa, 19,3 kDa, 35 kDa, 46 kDa, 93,5 kDa, 200 kDa, 400 kDa, 780 kDa i 1200 kDa.‘

7. Sulfonowana pochodna polistyrenu do zastosowania według zastrz. 6, znamienna tym, że ma masę cząsteczkową wynoszącą 93,5 kDa lub 780 kDa.

8. Sulfonowana pochodna polistyrenu do zastosowania według dowolnego z zastrz. 1 do 7, znamienna tym, że infekcję wywołaną przez kociego herpeswirusa stanowi koci katar.

9. Sulfonowana pochodna polistyrenu do zastosowania według dowolnego z zastrz. 1 do 8, znamienna tym, że kociego herpeswirusa stanowi koci herpeswirus typu 1 (FHV-1).

10. Sulfonowana pochodna polistyrenu o wzorze I:

$θ³ (Wzór I)

PL 239 391 B1 w którym M oznacza kation metalu, z oznacza liczbę całkowitą od 1 do 3, n oznacza liczbę całkowitą w zakresie od 7 do 6000 do zastosowania w terapii skojarzonej infekcji wywołanej przez kociego herpeswirusa.

11. Sulfonowana pochodna polistyrenu do zastosowania według zastrz. 10, znamienna tym, że terapia skojarzona obejmuje równoczesne zastosowanie innego środka do leczenia infekcji wywołanej przez kociego herpeswirusa.

12. Sulfonowana pochodna polistyrenu do zastosowania według zastrz. 11, znamienna tym, że inny środek do leczenia infekcji wywołanej przez kociego herpeswirusa stanowi analog nukleozydu.

13. Sulfonowana pochodna polistyrenu do zastosowania według zastrz. 12, znamienna tym, że analog nukleozydu stanowi acyklowir (ACV) i/lub pencyklowir (PCV).

14. Sulfonowana pochodna polistyrenu do zastosowania według zastrz. jednego z zastrz. 10 do 13, znamienna tym, że sulfonowana pochodna polistyrenu ma postać soli.

15. Sulfonowana pochodna polistyrenu do zastosowania według zastrz. 14, znamienna tym, że sulfonowana pochodna polistyrenu ma postać soli sodowej.

16. Sulfonowana pochodna polistyrenu do zastosowania według jednego z zastrz. 10 do 15, znamienna tym, że sulfonowana pochodna polistyrenu ma masę cząsteczkową wynoszącą co najmniej 1,5 kDa, korzystniej co najmniej 8 kDa.

17. Sulfonowana pochodna polistyrenu do zastosowania według zastrz. 16, znamienna tym, że sulfonowana pochodna polistyrenu ma masę cząsteczkową w zakresie od 8 kDa do 1200 kDa.

18. Sulfonowana pochodna polistyrenu do zastosowania według zastrz. 17, znamienna tym, że sulfonowana pochodna polistyrenu ma masę cząsteczkową wybraną z grupy składającej się z 8 kDa, 19,3 kDa, 35 kDa, 46 kDa, 93,5 kDa, 200 kDa, 400 kDa, 780 kDa i 1200 kDa.‘

19. Sulfonowana pochodna polistyrenu do zastosowania według zastrz. 18, znamienna tym, że sulfonowana pochodna polistyrenu ma masę cząsteczkową wynoszącą 93,5 kDa lub 780 kDa.

20. Sulfonowana pochodna polistyrenu do zastosowania według dowolnego z zastrz, 10 do 19, znamienna tym, że infekcję wywołaną przez kociego herpeswirusa stanowi koci katar.

21. Sulfonowana pochodna polistyrenu do zastosowania według dowolnego z zastrz. 10 do 20, znamienna tym, że kociego herpeswirusa stanowi koci herpeswirus typu 1 (FHV-1).