BR112021010364A2 - Composições farmacêuticas que compreendem conjugados de anticorpo-fármaco anti-191p4d12 e métodos de uso das mesmas - Google Patents

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Gayathri Ratnaswamy
Yingqing Sun
Marie Rose Van Schravendijk
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Agensys, Inc.
Seagen Inc.
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Abstract

COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS QUE COMPREENDEM CONJUGADOS DE ANTICORPO-FÁRMACO ANTI-191P4D12 E MÉTODOS DE USO DAS MESMAS. A presente invenção refere-se a composição farmacêutica, que compreende um conjugado de anticorpo-fármaco que compreende um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que se liga à 191P4D12 conjugado a uma ou mais unidades de monometil auristatina E (MMAE) e um excipiente farmaceuticamente aceitável que compreende L-histidina, polissorbato-20 (TWEEN-20) e pelo me-nos um dentre di-hidrato de trealose e sacarose.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "COMPO-
SIÇÕES FARMACÊUTICAS QUE COMPREENDEM CONJUGADOS DE ANTICORPO-FÁRMACO ANTI-191P4D12 E MÉTODOS DE USO DAS MESMAS".
REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS
[0001] O presente pedido reivindica o benefício de prioridade do Pedido de Patente Provisório U.S. Nº 62/774.819, depositado em 3 de dezembro de 2018, cuja descrição é incorporada ao presente docu- mento a título de referência na íntegra.
1. Campo
[0002] São fornecidas no presente documento composições farma- cêuticas que compreendem conjugados de anticorpo anti-191P4D12- fármaco. Métodos de uso das composições farmacêuticas também são fornecidos no presente documento.
2. Antecedentes
[0003] As substâncias medicamentosas são geralmente adminis- tradas como parte de uma formulação em combinação com um ou mais de outros agentes que servem a funções farmacêuticas especia- lizadas e variadas. Os excipientes farmacêuticos têm várias funções e contribuem para as formulações farmacêuticas de muitas maneiras diferentes, por exemplo, solubilização, diluição, espessamento, estabi- lização, preservação, coloração, aromatizante, etc. Propriedades que podem ser consideradas ao formular uma substância ativa do medi- camento incluem biodisponibilidade, facilidade de fabricação, facilida- de de administração e estabilidade da forma de dosagem. Em virtude das propriedades variáveis das substâncias ativas medicamentosas que estão sendo formuladas, as formas de dosagem requerem, tipi- camente, excipientes farmacêuticos que são exclusivamente adapta- dos à substância ativa medicamentosa a fim de alcançar propriedades físicas e farmacêuticas vantajosas.
[0004] Assim, há uma necessidade quanto às composições farma- cêuticas de conjugados de anticorpo anti-191P4D12-fármaco com pro- priedades físicas e farmacêuticas vantajosas. A presente invenção sa- tisfaz esta necessidade e fornece benefícios relacionados.
3. Sumário
[0005] Em um aspecto, é fornecida no presente documento uma composição farmacêutica que compreende (a) um conjugado de anti- corpo-fármaco que compreende um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que se liga à 191P4D12 conjugado a uma ou mais unidades de monometil auristatina E (MMAE), em que o anticor- po ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende regiões determi- nantes de complementaridade (CDRs) que compreendem as sequên- cias de aminoácidos das CDRs da região variável de cadeia pesada apresentadas em SEQ ID NO: 7 e uma região variável de cadeia leve que compreende CDRs que compreendem as sequências de aminoá- cidos das CDRs da região variável de cadeia leve apresentadas em SEQ ID NO: 8; e (b) um excipiente farmaceuticamente aceitável que compreende L-histidina, polissorbato-20 (TWEEN-20) e pelo menos um dentre trealose di-hidratada e sacarose.
[0006] Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de li- gação a antígeno do mesmo compreende CDR H1 que compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9, CDR H2 que com- preende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, CDR H3 que compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11; CDR L1 que compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12, CDR L2 que compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13 e CDR L3 que compreende uma sequência de amino- ácidos de SEQ ID NO: 14.
[0007] Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de li-
gação a antígeno do mesmo compreende uma região variável de ca- deia pesada que compreende a sequência de aminoácidos que varia do 20º aminoácido (ácido glutâmico) ao 136º aminoácido (serina) de SEQ ID NO: 7 e uma região variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos que varia do 23º aminoácido (ácido aspárti- co) ao 130º aminoácido (arginina) de SEQ ID NO: 8.
[0008] Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos que va- ria do 20º aminoácido (ácido glutâmico) ao 466º aminoácido (lisina) de SEQ ID NO: 7 e uma cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos que varia do 23º aminoácido (ácido aspártico) ao 236º aminoácido (cisteína) de SEQ ID NO: 8.
[0009] Em algumas modalidades, o fragmento de ligação a antíge- no é um fragmento Fab, F(ab')2, Fv ou scFv.
[0010] Em algumas modalidades, o anticorpo é um anticorpo to- talmente humano.
[0011] Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de li- gação a antígeno do mesmo é produzido de forma recombinante.
[0012] Em algumas modalidades, o conjugado de anticorpo- fármaco tem a seguinte estrutura: | (o ECO fo o dg , NH7 em que L- representa o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo e p é a partir de 1 a 10.
[0013] Em algumas modalidades, p é a partirde 2a 8.
[0014] Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de li- gação a antígeno do mesmo está ligado a cada unidade de monometil auristatina E (MMAE) através de um ligante.
[0015] Em algumas modalidades, o ligante é um ligante clivável por enzima e, em uma modalidade, o ligante forma uma ligação com um átomo de enxofre do anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo.
[0016] Em algumas modalidades, o ligante tem uma fórmula de: — Aa WwY,y; em que -A- é uma unidade extensora, a é O ou 1; -W- é uma unidade de aminoácido, w é um número inteiro a partir de O a 12; e —Y- é uma unidade espaçadora, y é 0, 1 ou 2.
[0017] Em algumas modalidades, a unidade extensora tem a es- trutura de Fórmula (1) abaixo; a unidade de aminoácido é valina citruli- na; e a unidade espaçadora é um grupo PAB que tem a estrutura da Fórmula (2) abaixo: o ' AAA 9 º Fórmula (1) - o Fórmula (2)
[0018] Em algumas modalidades, a unidade extensora forma uma ligação com um átomo de enxofre do anticorpo ou fragmento de liga- ção a antígeno do mesmo; e em que a unidade espaçadora está ligada à MMAE por meio de um grupo carbamato.
[0019] Em algumas modalidades, o conjugado de anticorpo- fármaco compreende a partir de 1 a 10 unidades de MMAE por anti- corpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo.
[0020] Em algumas modalidades, o conjugado de anticorpo-
fármaco compreende a partir de 2 a 8 unidades de MMAE por anticor- po ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo.
[0021] Em algumas modalidades, a composição farmacêutica compreende o conjugado de anticorpo-fármaco em uma concentração de cerca de | a cerca de 20 mg/mL. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica compreende o conjugado de anticorpo- fármaco em uma concentração de cerca de 5 a cerca de 15 mg/mL. Em outras modalidades, a composição farmacêutica compreende o conjugado de anticorpo-fármaco em uma concentração de cerca de 8 a cerca de 12 mg/mL. Em ainda outras modalidades, a composição farmacêutica compreende o conjugado de anticorpo-fármaco em uma concentração de cerca de 10 mg/mL.
[0022] Em algumas modalidades, a L-histidina está presente na faixa a partir de cerca de 5 a cerca de 50 MM. Em outras modalidades, a L-histidina está presente na faixa a partir de cerca de 10 a cerca de 40 mM. Em outras modalidades, a L-histidina está presente na faixa a partir de cerca de 15 a cerca de 35 mM. Em outras modalidades, a L- histidina está presente na faixa a partir de cerca de 15 a cerca de 30 mM. Em outras modalidades, a L-histidina está presente na faixa a partir de cerca de 15 a cerca de 25 mM. Em ainda outras modalidades, a L-histidina está presente em cerca de 20 mM.
[0023] Em algumas modalidades, a concentração de TWEEN-20 está na faixa a partir de cerca de 0,001 a cerca de 0,1 % (v/v). Em ou- tras modalidades, a concentração de TWEEN-20 está na faixa a partir de cerca de 0,0025 a cerca de 0,075 % (v/v). Em outras modalidades, a concentração de TWEEN-20 está na faixa a partir de cerca de 0,005 a cerca de 0,05 % (v/v). Em outras modalidades, a concentração de TWEEN-20 está na faixa a partir de cerca de 0,01 a cerca de 0,03 % (v/v). Em ainda outras modalidades, a concentração de TWEEN-20 está na faixa de cerca de 0,02 % (v/v).
[0024] Em algumas modalidades, a composição farmacêutica for- necida no presente documento compreende trealose di-hidratada. Em algumas modalidades, o trealose di-hidratada está presente na faixa a partir de cerca de 1 a cerca de 20 % (p/v). Em algumas modalidades, o trealose di-hidratada está presente na faixa a partir de cerca de 2 a cerca de 15 % (p/v). Em outras modalidades, o trealose di-hidratada está presente na faixa a partir de cerca de 3 a cerca de 10 % (p/v). Em ainda outras modalidades, o trealose di-hidratada está presente na fai- xa a partir de cerca de 4 a cerca de 6 % (p/v). Em ainda outras moda- lidades, o trealose di-hidratada está presente em cerca de 5,5 % (p/v).
[0025] Em algumas modalidades, o trealose di-hidratada está pre- sente na faixa a partir de cerca de 50 MM a cerca de 300 mM. Em al- gumas modalidades, o trealose di-hidratada está presente na faixa a partir de cerca de 75 mM a cerca de 250 mM. Em outras modalidades, o trealose di-hidratada está presente na faixa a partir de cerca de 100 mM a cerca de 200 mM. Em ainda outras modalidades, o trealose di- hidratada está presente na faixa a partir de cerca de 130 mM a cerca de 150 mM. Em ainda outras modalidades, o trealose di-hidratada está presente em cerca de 146 mM.
[0026] Em algumas modalidades, a composição farmacêutica compreende sacarose. Em algumas modalidades, a sacarose está presente na faixa a partir de cerca de 1 a cerca de 20 % (p/v). Em al- gumas modalidades, a sacarose está presente na faixa a partir de cer- ca de 2 a cerca de 15 % (p/v). Em outras modalidades, a sacarose es- tá presente na faixa a partir de cerca de 3 a cerca de 10 % (p/v). Em outras modalidades, a sacarose está presente na faixa a partir de cer- ca de 4 a cerca de 6 % (p/v). Em ainda outras modalidades, a sacaro- se está presente em cerca de 5,5 % (p/v).
[0027] Em algumas modalidades, a sacarose está presente na fai- xa a partir de cerca de 50 MM a cerca de 300 mM. Em outras modali-
dades, a sacarose está presente na faixa a partir de cerca de 75 mM a cerca de 250 mM. Em outras modalidades, a sacarose está presente na faixa a partir de cerca de 100 mM a cerca de 200 mM. Em ainda outras modalidades, a sacarose está presente na faixa a partir de cer- ca de 130 mM a cerca de 150 mM. Em ainda outras modalidades, a sacarose está presente em cerca de 146 mM.
[0028] Em algumas modalidades, a composição farmacêutica tem um pH em uma faixa a partir de cerca de 5,5 a cerca de 6,5. Em algu- mas modalidades, a composição farmacêutica tem um pH em uma fai- xa a partir de cerca de 5,7 a cerca de 6,3. Em outras modalidades, a composição farmacêutica tem um pH de cerca de 6,0.
[0029] Em algumas modalidades, o pH é medido em temperatura ambiente. Em algumas modalidades, o pH é medido em cerca de 15ºC a cerca de 27ºC. Em outras modalidades, o pH é medido a cerca de 4ºC. Em outras modalidades, o pH é medido a cerca de 25ºC.
[0030] Em algumas modalidades, a composição farmacêutica for- necida no presente documento compreende ácido clorídrico (HCI). Em algumas modalidades, o pH é ajustado pelo HCI.
[0031] Em outras modalidades, a composição farmacêutica forne- cida no presente documento compreende ácido succínico. Em algu- mas modalidades, o pH é ajustado pelo ácido succínico.
[0032] Em algumas modalidades, a composição farmacêutica for- necida no presente documento compreende, TWEEN-20 a cerca de 0,02 % (p/v) e pelo menos um de trealose di-hidratada a cerca de 5,5 % (p/v) ou sacarose a cerca de 5 % (p/v). Em algumas modalidades, a composição farmacêutica fornecida no presente documento compre- ende ainda HCI ou ácido succínico. Em algumas modalidades, o pH é de cerca de 6,0 em temperatura ambiente. Em outras modalidades, o pH é cerca de 6,0 a 25ºC.
[0033] Em algumas modalidades específicas, a composição far-
macêutica fornecida no presente documento compreende: (a) um conjugado de anticorpo-fármaco que tem a seguinte estrutura: o K RIAA t oH feno OCH$O OCH;O To o ? , “ em que L- representa o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo e p é a partir de 1 a 10; e (b) um excipiente farmaceutica- mente aceitável que compreende L-histidina a cerca de 20 mM, TWEEN-20 a cerca de 0,02 % (p/v), trealose di-hidratada a cerca de 5,5 % (p/v) e HCl, em que o pH é cerca de 6,0 a 25ºC.
[0034] Em algumas modalidades, o conjugado de anticorpo- fármaco está na concentração de cerca de 10 mg/mL.
[0035] Em outras modalidades específicas, a composição farma- cêutica fornecida no presente documento compreende: (a) um conjugado de anticorpo-fármaco que compreende a seguinte estrutura: o K RIDIAAK oH o ? , “. em que L- representa o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo e p é a partir de 1a 10; e (b) um excipiente farmaceuticamente aceitável que compreende L- histidina a cerca de 20 mM, TWEEN-20 a cerca de 0,02 % (p/v), trea- lose di-hidratada a cerca de 5,5 % (p/v) e ácido succínico, em que o pH é cerca de 6,0 a 25ºC.
[0036] Em algumas modalidades, o conjugado de anticorpo- fármaco está na concentração de cerca de 10 mg/mL na composição farmacêutica fornecida no presente documento.
[0037] Em ainda outras modalidades específicas, a composição farmacêutica fornecida no presente documento compreende: (a) um conjugado de anticorpo-fármaco que compreende a seguinte estrutura: g 8 i Li TO | (e Y ES ) oz NH7 em que L- representa o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo e p é a partir de 1a 10; e (b) um excipiente farmaceuticamente aceitável que compreende L- histidina a cerca de 20 MM, TWEEN-20 a cerca de 0,02 % (p/v), saca- rose a cerca de 5,0 % (p/v) e HCI, em que o pH é cerca de 6,0 a 25ºC.
[0038] Em algumas modalidades, o conjugado de anticorpo- fármaco está na concentração de cerca de 10 mg/mL na composição farmacêutica fornecida no presente documento.
[0039] Em algumas modalidades, a composição farmacêutica for- necida no presente documento está na forma líquida.
[0040] Em outras modalidades, a composição farmacêutica forne- cida no presente documento é liofilizada.
[0041] Em outro aspecto, é fornecida no presente documento uma composição liofilizada produzida por meio de liofiização da composi- ção farmacêutica fornecida no presente documento.
[0042] Em algumas modalidades, a composição farmacêutica é armazenada a -80ºC, 4ºC, 25ºC ou 37ºC.
[0043] Em outro aspecto, é fornecido no presente documento um método de prevenção ou tratamento de uma doença ou transtorno em um indivíduo que compreende administrar ao indivíduo uma quantida- de eficaz da composição farmacêutica fornecida no presente docu-
mento.
[0044] Em algumas modalidades, o indivíduo é um ser humano.
[0045] Em algumas modalidades, o câncer é um tumor sólido. Em algumas modalidades, o câncer é câncer de cólon, câncer pancreático, câncer de ovário, câncer de pulmão, câncer de bexiga, câncer de ma- ma, câncer de esôfago, câncer de cabeça ou câncer de pescoço.
[0046] Em uma modalidade específica, o câncer é câncer de có- lon. Em uma modalidade específica, o câncer é câncer pancreático. Em uma modalidade específica, o câncer é câncer de ovário. Em uma modalidade específica, o câncer é câncer de pulmão. Em algumas modalidades, o câncer de pulmão é câncer de pulmão de células não pequenas. Em uma modalidade específica, o câncer é câncer de bexi- ga. Em uma modalidade específica, o câncer é câncer de bexiga avançado. Em uma modalidade específica, o câncer é câncer de bexi- ga metastático. Em uma modalidade específica, o câncer é câncer de mama. Em uma modalidade específica, o câncer é câncer de esôfago. Em uma modalidade específica, o câncer é câncer de cabeça. Em uma modalidade específica, o câncer é câncer de pescoço. Em uma modalidade específica, o câncer tem células tumorais que expressam 191P4D12.
[0047] Em algumas modalidades, o método fornecido no presente documento compreende ainda administrar ao indivíduo um segundo agente terapêutico. Em algumas modalidades, o segundo agente tera- pêutico é um inibidor do ponto de verificação imune. Em algumas mo- dalidades, o inibidor do ponto de verificação imune é um inibidor de PD-1 ou um inibidor de PD-L1. Em outras modalidades, o inibidor do ponto de verificação imune é um inibidor de PD-1. Em ainda outras modalidades, o inibidor de PD-1 é pembrolizumabe ou nivolumabe. Em outras modalidades, o inibidor do ponto de verificação imune é um ini- bidor de PD-L1. Em outras modalidades, o inibidor de PD-L1 é seleci-
onado a partir de um grupo que consiste em atezolizumabe, aveluma- be e durvalumabe.
[0048] Em algumas modalidades, o conjugado de anticorpo- fármaco formulado na composição farmacêutica é administrado em uma dose a partir de 1 a 10 mg/kg de peso corporal do indivíduo. Em outras modalidades, o conjugado de anticorpo-fármaco formulado na composição farmacêutica é administrado em uma dose a partir de 1 a mg/kg de peso corporal do indivíduo. Em ainda outras modalidades, o conjugado de anticorpo-fármaco formulado na composição farma- cêutica é administrado em uma dose a partir de 1 a 2,5 mg/kg de peso corporal do indivíduo. Em algumas modalidades, o conjugado de anti- corpo-fármaco formulado na composição farmacêutica é administrado em uma dose a partir de 1 a 1,25 mg/kg de peso corporal do indivíduo. Em algumas modalidades, o conjugado de anticorpo-fármaco formula- do na composição farmacêutica é administrado em uma dose de cerca de 1 mg/kg de peso corporal do indivíduo. Em algumas modalidades, o conjugado de anticorpo-fármaco formulado na composição farmacêuti- ca é administrado em uma dose de cerca de 1,25 mg/kg de peso cor- poral do indivíduo.
[0049] Em algumas modalidades, o conjugado de anticorpo- fármaco formulado na composição farmacêutica é administrado atra- vés de injeção ou infusão intravenosa (IV).
[0050] Em algumas modalidades, o conjugado de anticorpo- fármaco formulado na composição farmacêutica é administrado atra- vés de uma injeção intravenosa (IV) ou infusão durante cerca de 30 minutos duas vezes a cada ciclo de três semanas. Em algumas moda- lidades, o conjugado de anticorpo-fármaco formulado na composição farmacêutica é administrado através de injeção intravenosa (IV) ou in- fusão durante cerca de 30 minutos nos Dias 1 e 8 de cada ciclo de três semanas. Em algumas modalidades, o método compreende ainda administrar um inibidor do ponto de verificação imune através de uma injeção intravenosa (IV) ou infusão no Dia 1 de cada ciclo de três se- manas. Em algumas modalidades, o inibidor do ponto de verificação imune é o pembrolizumabe, e em que o pembrolizumabe é administra- do em uma quantidade de cerca de 200 mg ao longo de cerca de 30 minutos. Em outras modalidades, o inibidor do ponto de verificação imune é o atezolizumabe e em que o atezolizumabe é administrado em uma quantidade de cerca de 1200 mg durante cerca de 60 minutos ou 30 minutos.
[0051] Em outras modalidades, o conjugado de anticorpo-fármaco formulado na composição farmacêutica é administrado através de uma injeção intravenosa (IV) ou infusão durante cerca de 30 minutos três vezes a cada ciclo de quatro semanas. Em algumas modalidades, o conjugado de anticorpo-fármaco formulado na composição farmacêuti- ca é administrado através de injeção intravenosa (IV) ou infusão du- rante cerca de 30 minutos nos Dias 1, 8 e 15 de cada ciclo de quatro semanas. Em algumas modalidades, o método compreende ainda administrar um inibidor do ponto de verificação imune através de uma injeção intravenosa (IV) ou infusão. Em algumas modalidades, o inibi- dor do ponto de verificação imune é o pembrolizumabe. Em outras modalidades, o inibidor do ponto de verificação imune é o atezolizu- mabe.
4. Descrição dos Desenhos
[0052] As Figuras 1A, 1B, 1C e 1D representam os resultados da análise SDS-PAGE para o estudo de estabilidade de 14 dias para as formulações F1-F14 a 40ºC.
[0053] A Figura 1E representa o resumo do estudo PR-HPLC descrito na Seção 6.1.
[0054] As Figuras 1F, 1G e 1H representam os resultados da aná- lise SE-HPLC para as formulações F1-F14 a 40ºC.
[0055] A Figura 2A representa os resultados do estudo de tonali- dade para as formulações F4, F9 e F14 em TO.
[0056] A Figura 2B representa os resultados de SDS-PAGE do estudo de ciclo de congelamento-descongelamento para as formula- ções F4, F9 e F14.
[0057] A Figura 2C representa as contagens cumulativas totais por mL medidas por HIAC para as formulações F4, F9 e F14.
[0058] A Figura 3A representa os resultados da análise de umida- de residual para as formulações F4, F9 e F14.
[0059] A Figura 3B representa os resultados de A280 (concentra- ção) no estudo de formulação simultânea de BDS e DP de 12 sema- nas.
[0060] A Figura 3C representa os resultados de A330 (turbidez) no estudo de formulação da BDS e DP simultâneo de 12 semanas.
[0061] A Figura 3D representa os resultados da análise SDS- PAGE da BDS (antes de liofilização) em TO.
[0062] A Figura 3E representa os resultados da análise SDS- PAGE da BDS armazenada a -70ºC ou 2-8ºC durante 12 semanas.
[0063] A Figura 3F representa os resultados da análise SDS- PAGE do DP após liofilização e reconstituição em TO.
[0064] A Figura 3G representa os resultados da análise SDS- PAGE do DP (após liofilização e reconstituição) armazenado a 25ºC ou 40ºC durante 12 semanas.
[0065] A Figura 3H representa os resultados da análise SDS- PAGE do DP (após liofilização e reconstituição) armazenado a 2-8ºC durante 12 semanas.
[0066] A Figura 31 representa os resultados da análise SE-HPLC para as BDSs AGS-22M6E armazenada a 2-8ºC e -70ºC e AGS- 22M6E liofiizada armazenada sob condições de 2-8ºC, 25ºC/60 % de RH e 40ºC/75 % de RH durante 12 semanas.
[0067] A Figura 4 representa os resultados da análise de SDS- PAGE para a formulação liofilizada F4 em volumes de enchimento de 3,0 e 1,5 mL.
[0068] A Figura 5A representa as sequências de nucleotídeos e de aminoácidos da proteína 191P4D12.
[0069] A Figura 5B representa as sequências de nucleotídeos e de aminoácidos da cadeia pesada e da cadeia leve de Ha22-2(2,4)6.1.
[0070] A Figura 5C representa as sequências de aminoácidos da cadeia pesada e da cadeia leve de Ha22-2(2,4)6.1.
5. Descrição Detalhada
[0071] Antes que a presente invenção seja melhor descrita, deve ser entendido que a invenção não está limitada às modalidades parti- culares apresentadas no presente documento, e também deve ser en- tendido que a terminologia usada no presente documento tem a finali- dade de descrever modalidades particulares apenas e não se destina a ser limitativa.
5.1 Definições
[0072] Técnicas e procedimentos descritos ou citados no presente documento incluem aqueles que são geralmente bem compreendidos e/ou comumente usados usando metodologia convencional conhecida daqueles versados na técnica tais como, por exemplo, as metodologi- as amplamente usadas descritas em Sambrook et al., Molecular Clo- ning: A Laboratory Manual (3º ed. 2001); Current Protocols in Molecu- lar Biology (Ausubel et a/. eds., 2003); Therapeutic Monoclonal Antibo- dies: From Bench to Clinic (An ed. 2009); Monoclonal Antibodies: Me- thods and Protocols (Albitar ed. 2010); e Antibody Engineering Vols. 1 e 2 (Kontermann e Dúbel eds., 2º ed. 2010).
[0073] A menos que definido de outra forma no presente docu- mento, os termos técnicos e científicos usados na presente descrição têm os significados que são comumente compreendidos por aqueles versados na técnica. Para fins de interpretação do presente relatório descritivo, a descrição de termos a seguir será aplicada e, sempre que apropriado, os termos usados no singular também incluirão o plural e vice-versa. No caso onde qualquer descrição de um termo apresenta- do entra em conflito com qualquer documento incorporado ao presente documento a título de referência, a descrição do termo apresentada abaixo deve prevalecer.
[0074] O termo "anticorpo", "imunoglobulina" ou "Ig" é usado indis- tintamente no presente documento e é usado no sentido mais amplo e cobre especificamente, por exemplo, anticorpos monoclionais (incluin- do anticorpos agonistas, antagonistas, neutralizantes, de comprimento total ou monoclonais intactos), composições de anticorpos com especi- ficidade poliepitópica ou monoepitópica, anticorpos policlonais ou mo- novalentes, anticorpos multivalentes, anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos, contanto que exibam a atividade biológica desejada) formados a partir de pelo menos dois anticorpos intactos, anticorpos de cadeia única e fragmentos dos mesmos, con- forme descrito abaixo. Um anticorpo pode ser humano, humanizado, quimérico e/ou maturado por afinidade, bem como um anticorpo de outras espécies, por exemplo, camundongo e coelho, etc. O termo "an- ticorpo" se destina a incluir um produto polipeptídico de células B den- tro do classe de polipeptídeos de imunoglobulina que é capaz de se ligar a um antígeno molecular específico e é composto por dois pares idênticos de cadeias polipeptídicas, em que cada par tem uma cadeia pesada (cerca de 50-70 kDa) e uma cadeia leve (cerca de 25 kDa), cada porção do terminal amino de cada cadeia inclui uma região variá- vel de cerca de 100 a cerca de 130 ou mais aminoácidos e cada por- ção do terminal carboxila de cada cadeia inclui uma região constante. Consulte, por exemplo, Antibody Engineering (Borrebaeck ed., 2º ed. 1995); e Kuby, Immunology (3º ed. 1997). Em modalidades especiífi-
cas, o antígeno molecular específico pode ser ligado por um anticorpo fornecido no presente documento, incluindo um polipeptídeo ou um epítopo.
Os anticorpos também incluem, porém sem limitações, anti- corpos sintéticos, anticorpos produzidos de forma recombinante, anti- corpos camelizados, intracorpos, anticorpos anti-idiotípicos (anti-ld) e fragmentos funcionais (por exemplo, fragmentos de ligação a antíge- no) de qualquer um dos acima, os quais referem-se a uma porção de um polipeptídeo de cadeia pesada ou leve de anticorpo que retém par- te ou toda a atividade de ligação do anticorpo a partir do qual o frag- mento foi derivado.
Exemplos não limitativos de fragmentos funcionais (por exemplo, fragmentos de ligação a antígeno) incluem Fvs com uma única cadeia (scFv) (por exemplo, incluindo monoespecífico, biespecí- fico, etc.), fragmentos Fab, fragmentos F(ab'), fragmentos F(ab)>, fra- gmentos F(ab'), Fvs ligados por dissulfureto (dsFv), fragmentos Fd, fragmentos Fv, diacorpo, triacorpo, tetracorpo e minicorpo.
Em particu- lar, os anticorpos fornecidos no presente documento incluem molécu- las de imunoglobulina e porções imunologicamente ativas de molécu- las de imunoglobulina, por exemplo, domínios de ligação a antígeno ou moléculas que contêm um sítio de ligação a antígeno que se liga a um antígeno (por exemplo, uma ou mais CDRs de um anticorpo). Estes fragmentos de anticorpo podem ser encontrados, por exemplo, em Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual (1989); Mol.
Bio- logy and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference (Myers ed., 1995); Huston et a/., 1993, Cell Biophysics 22: 189-224; Plúckthun e Skerra, 1989, Meth.
Enzymol. 178: 497-515; e Day, Advanced Immu- nochemistry (2º ed. 1990). Os anticorpos fornecidos no presente do- cumento podem ser de qualquer classe (por exemplo, IgG, IgE, IgM, IgD e IgA) ou qualquer subclasse (por exemplo, IgG1, IgG2, 1gG3, IgG4, IgA1 e IgA2) da molécula de imunoglobulina.
Os anticorpos po- dem ser anticorpos agonistas ou anticorpos antagonistas.
[0075] O termo "anticorpo monoclonal" refere-se a um anticorpo obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmente ho- mogênea, isto é, os anticorpos individuais que compreendem a popu- lação são idênticos, exceto quanto a possíveis mutações de ocorrência natural que possam estar presentes em quantidades menores. Os an- ticorpos monoclonais são altamente específicos, sendo direcionados contra um único sítio antigênico. Em contraste com as preparações de anticorpos policlonais, as quais podem incluir diferentes anticorpos di- recionados contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticorpo monoclonal é direcionado contra um único determinante antigênico.
[0076] Um "antígeno" é uma estrutura à qual um anticorpo pode se ligar seletivamente. Um antígeno alvo pode ser um polipeptídeo, car- boidrato, ácido nucleico, lipídio, hapteno ou outro composto de ocor- rência natural ou sintético. Em algumas modalidades, o antígeno alvo é um polipeptídeo. Em determinadas modalidades, um antígeno está associado a uma célula, por exemplo, está presente em ou em uma célula, por exemplo, uma célula cancerosa.
[0077] Um anticorpo "intacto" é aquele que compreende um sítio de ligação a antígeno, bem como uma CL e pelo menos as regiões constantes de cadeia pesada, CH1, CH2 e CH3. As regiões constan- tes podem incluir regiões constantes humanas ou variantes da se- quência de aminoácidos. Em determinadas modalidades, um anticorpo intacto tem uma ou mais funções efetoras.
[0078] Os termos "fragmento de ligação a antígeno", "domínio de ligação a antígeno", "região de ligação a antígeno" e termos similares referem-se àquela porção de um anticorpo que compreende os resí- duos de aminoácidos que interagem com um antígeno e conferem ao agente de ligação sua especificidade e afinidade pelo antígeno (por exemplo, as CDRs). "Fragmento de ligação a antígeno", conforme usado no presente documento, inclui "fragmento de anticorpo" que compreende uma porção de um anticorpo intacto, tal como a região de ligação a antígeno ou região variável do anticorpo intacto. Exemplos de fragmentos de anticorpo incluem, sem limitação, fragmentos Fab, Fab', F(ab'))> e Fv; diacorpos e di-diacorpos (consulte, por exemplo, Holliger et a/., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. 90: 6444-48; Lu et al., 2005, J. Biol. Chem. 280: 19665-72; Hudson et a/., 2003, Nat. Med. 9: 129- 34; documento WO 93/11161; e Patentes Norte-Americanas Nº
5.837.242 e 6.492.123); moléculas de anticorpo com uma única cadeia (consulte, por exemplo, Patentes Norte-Americanas Nº 4.946.778;
5.260.203; 5.482.858; e 5.476.786); anticorpos de domínio variável duplo (consulte, por exemplo, Patente Norte-Americana Nº 7.612.181); anticorpos de domínio variável único (sdAbs) (consulte, por exemplo, Woolven et al., 1999, Immunogenetics 50: 98-101; e Streltsov et al., 2004, Proc Natl Acad Sci USA. 101: 12444-49); e anticorpos multies- pecíficos formados a partir de fragmentos de anticorpos.
[0079] Os termos "liga" ou "ligação" referem-se a uma interação entre moléculas incluindo, por exemplo, para formar um complexo. As interações podem ser, por exemplo, interações não covalentes, inclu- indo ligações de hidrogênio, ligações iônicas, interações hidrofóbicas e/ou interações de van der Waals. Um complexo também pode incluir a ligação de duas ou mais moléculas mantidas juntas através de liga- ções, interações ou forças covalentes ou não covalentes. A força das interações não covalentes totais entre um único sítio de ligação a antí- geno em um anticorpo e um único epítopo de uma molécula alvo, tal como um antígeno, é a afinidade do anticorpo ou fragmento funcional para este epítopo. A proporção da taxa de dissociação (Ko) para a ta- xa de associação (Kon) de uma molécula de ligação (por exemplo, um anticorpo) para um antígeno monovalente (Kot/Kon) É a constante de dissociação Kp, a qual está inversamente relacionada à afinidade. Quanto mais baixo for o valor de Kp, maior será a afinidade do anticor-
po. O valor de Kp varia para diferentes complexos de anticorpo e antí- geno e depende de kon E Korr. A constante de dissociação Kp para um anticorpo fornecido no presente documento pode ser determinada usando qualquer método fornecido no presente documento ou qual- quer outro método bem conhecido por aqueles versados na técnica. À afinidade em um sítio de ligação nem sempre reflete a verdadeira força da interação entre um anticorpo e um antígeno. Quando antígenos complexos que contêm múltiplos determinantes antigênicos repetidos, tal como um antígeno polivalente, entram em contato com anticorpos que contêm múltiplos sítios de ligação, a interação do anticorpo com o antígeno em um sítio aumentará a probabilidade de uma reação em um segundo sítio. A intensidade destas múltiplas interações entre um anticorpo multivalente e um antígeno é denominada de avidez.
[0080] Em relação ao anticorpo ou fragmento de ligação a antíge- no do mesmo descrito no presente documento, termos como "se liga a", "que se liga especificamente a" e termos análogos também são usados indistintamente no presente documento e referem-se a molé- culas de ligação de domínios de ligação a antígeno que se ligam es- pecificamente a um antígeno, tal como um polipeptídeo. Um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno que se liga ou se liga especifica- mente a um antígeno pode apresentar reação cruzada com antígenos relacionados. Em determinadas modalidades, um anticorpo ou frag- mento de ligação a antígeno que se liga ou se liga especificamente a um antígeno não apresenta reação cruzada com outros antígenos. Um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno que se liga ou se liga especificamente a um antígeno pode ser identificado, por exemplo, por meio de imunoensaios, Octet&, Biacore& ou outras técnicas conheci- das por aqueles versados na técnica. Em algumas modalidades, um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno se liga a ou se liga es- pecificamente a um antígeno quando se liga a um antígeno com maior afinidade do que qualquer antígeno de reação cruzada, conforme de- terminado usando técnicas experimentais, tais como radioimunoensai- OS (RIA) e ensaios imunoabsorventes ligados à enzima (ELISAs). Normalmente, uma reação específica ou seletiva será pelo menos du- as vezes o sinal de fundo ou ruído e pode ser mais de 10 vezes o fun- do.
Consulte, por exemplo, Fundamental Immunology 332-36 (Paul ed., 2º ed. 1989) para uma discussão a respeito da especificidade de ligação.
Em determinadas modalidades, a extensão da ligação de um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno a uma proteína "não al- vo" é inferior a cerca de 10 % da ligação da molécula de ligação ou domínio de ligação a antígeno ao seu antígeno alvo particular, por exemplo, conforme determinado por meio de análise de classificação de células ativadas por fluorescência (FACS) ou RIA.
Em relação a termos tais como "ligação específica", "se liga especificamente a" ou "é específico para", estes significam uma ligação que é mensuravel- mente diferente de uma interação não específica.
A ligação específica pode ser medida, por exemplo, ao determinar a ligação de uma molé- cula comparado com a ligação de uma molécula de controle, a qual geralmente é uma molécula de estrutura similar que não tem atividade de ligação.
Por exemplo, a ligação específica pode ser determinada através de competição com uma molécula de controle que é similar ao alvo, por exemplo, um excesso de alvo não marcado.
Neste caso, a ligação específica é indicada se a ligação do alvo marcado a uma son- da for inibida competitivamente por excesso de alvo não marcado.
Um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno que se liga a um antíge- no inclui um que é capaz de se ligar ao antígeno com afinidade sufici- ente, de modo que a molécula de ligação seja útil, por exemplo, como um agente diagnóstico no direcionamento do antígeno.
Em determina- das modalidades, um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno que se liga a um antígeno tem uma constante de dissociação (Kp) me-
nor do que ou igual a 1000 nM, 800 nM, 500 nM, 250 nM, 100 nM, 50 NM, 10 nM, 5 NM, 4 NM, 3 NM, 2 nM, 1 nM, 0,9 nM, 0,8 nM, 0,7 nM, 0,6 NM, 0,5 nM, 0,4 nM, 0,3 nM, 0,2 nM ou 0,1 nM. Em determinadas mo- dalidades, um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno se liga a um epítopo de um antígeno que é conservado entre o antígeno de di- ferentes espécies (por exemplo, entre as espécies humanas e cyno).
[0081] "Afinidade de ligação" refere-se, em geral, à força da soma total de interações não covalentes entre um único sítio de ligação de uma molécula (por exemplo, uma proteína de ligação, tal como um an- ticorpo) e seu parceiro de ligação (por exemplo, um antígeno). A me- nos que indicado de outra forma, conforme usado no presente docu- mento, "afinidade de ligação" refere-se à afinidade de ligação intrínse- ca que reflete uma interação a 1:1 entre membros de um par de liga- ção (por exemplo, anticorpo e antígeno). A afinidade de uma molécula de ligação X por seu parceiro de ligação Y pode, em geral, ser repre- sentada pela constante de dissociação (Ko). A afinidade pode ser me- dida por meio de métodos comuns conhecidos na técnica, incluindo aqueles descritos no presente documento. Os anticorpos de baixa afi- nidade geralmente se ligam ao antígeno lentamente e tendem a se dissociar prontamente, enquanto que anticorpos de alta afinidade ge- ralmente se ligam ao antígeno mais rápido e tendem a permanecer ligados por mais tempo. Uma variedade de métodos para medição da afinidade de ligação é conhecida na técnica, qualquer um dos quais pode ser usado para fins da presente invenção. Modalidades ilustrati- vas específicas incluem o seguinte. Em uma modalidade, a "Kp" ou "valor de Kp" pode ser medido através de ensaios conhecidos na téc- nica, por exemplo, por um ensaio de ligação. A Kp pode ser medida em um RIA, por exemplo, realizado com a versão Fab de um anticorpo de interesse e seu antígeno (Chen et a/l., 1999, J. Mol Biol 293: 865- 81). O valor de Ko ou Kp também pode ser medido usando interfero-
metria de biocamada (BLI) ou ensaios de ressonância plasmônica de superfície (SPR) através do Octet& usando, por exemplo, um sistema Octet& QK384, ou através do Biacore& usando, por exemplo, um Bia- core&TM-2000 ou um Biacore&TM-3000. Uma "taxa de ligação" ou "taxa de associação" ou "taxa de associação" ou "kon" também pode ser determinada com a mesma interferometria de biocamada (BLI) ou técnicas de ressonância plasmônica de superfície (SPR) descritas acima usando, por exemplo, o sistema Octet& QK384, o sistema Bia- core&TM-2000 ou o sistema Biacore&TM-3000.
[0082] Em determinadas modalidades, os anticorpos ou fragmen- tos de ligação a antígeno podem compreender sequências "quiméri- cas" em que uma porção da cadeia pesada e/ou leve é idêntica ou homóloga às sequências correspondentes em anticorpos derivados de uma espécie particular ou pertencente a um classe ou subclasse de anticorpo particular, enquanto que o restante da(s) cadeia(s) é idêntico ou homólogo às sequências correspondentes em anticorpos derivados de outra espécie ou pertencentes a outra classe ou subclasse de anti- corpo, bem como fragmentos de tais anticorpos, contanto que exibem a atividade biológica desejada (consulte Patente Norte-Americana Nº
4.816.567; e Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851-55).
[0083] Em determinadas modalidades, os anticorpos ou fragmen- tos de ligação a antígeno podem compreender porções de formas "humanizadas" de anticorpos não humanos (por exemplo, de murino) que são anticorpos quiméricos que incluem imunoglobulinas humanas (por exemplo, anticorpo receptor) em que os resíduos de CDR nativos são substituídos por resíduos da CDR correspondente de uma espécie não humana (por exemplo, anticorpo doador), tal como camundongo, rato, coelho ou primata não humano que compreende a especificidade, afinidade e capacidade desejadas. Por outro lado, um ou mais resí-
duos da região FR da imunoglobulina humana são substituídos por resíduos não humanos correspondentes. Além disso, os anticorpos humanizados podem compreender resíduos que não são encontrados no anticorpo receptor ou no anticorpo doador. Estas modificações são feitas para refinar ainda mais o desempenho do anticorpo. Uma cadeia pesada ou leve de anticorpo humanizado pode compreender substan- cialmente todas de pelo menos uma ou mais regiões variáveis, em que todas ou substancialmente todas as CDRs correspondem àquelas de uma imunoglobulina não humana e todas ou substancialmente todas as FRs são aquelas de uma sequência de imunoglobulina humana. Em determinadas modalidades, o anticorpo humanizado compreende- rá pelo menos uma parte de uma região constante de imunoglobulina (Fc), tipicamente aquela de uma imunoglobulina humana. Para mais detalhes, consulte Jones et a/., 1986, Nature 321: 522-25; Riechmann et al., Nature 332: 323-29, 1988; Presta, 1992, Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593-96; Carter et a/l., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 4285-89; Patentes Norte-Americanas Nº 6.800.738; 6.719.971; 6.639.055;
6.407.213; e 6.054.297.
[0084] Em determinadas modalidades, os anticorpos ou fragmen- tos de ligação a antígeno podem compreender porções de um "anti- corpo totalmente humano" ou "anticorpo humano", em que os termos são usados indistintamente no presente documento e referem-se a um anticorpo que compreende uma região variável humana e, por exem- plo, uma região constante humana. Em modalidades específicas, os termos referem-se a um anticorpo que compreende uma região variá- vel e uma região constante de origem humana. Anticorpos "totalmente humanos", em determinadas modalidades, também pode abranger an- ticorpos que se ligam a polipeptídeos e são codificados por sequências de ácidos nucleicos que são variantes somáticas de ocorrência natural da sequência de ácidos nucleicos da imunoglobulina de linhagem germinativa humana.
O termo "anticorpo totalmente humano" inclui an- ticorpos que compreendem regiões variáveis e constantes que corres- pondem às sequências de imunoglobulina da linhagem germinativa humana, conforme descrito por Kabat et al. (consulte Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edi- ção, U.S.
Department of Health and Human Services, Publicação NIH Nº 91-3242). Um "anticorpo humano" é aquele que possui uma se- quência de aminoácidos que corresponde àquela de um anticorpo pro- duzido pelo homem e/ou foi produzido usando qualquer uma das téc- nicas para a produção de anticorpos humanos.
Esta definição de um anticorpo humano exclui especificamente um anticorpo humanizado que compreende resíduos de ligação a antígeno não humanos.
Os an- ticorpos humanos podem ser produzidos usando vários métodos co- nhecidos na técnica, incluindo bibliotecas de exibição em fagos (Hoo- genboom e Winter, 1991, J.
Mol.
Biol. 227: 381; Marks et al., 1991, J.
Mol.
Biol. 222: 581) e bibliotecas de exibição em leveduras (Chao et al., 2006, Nature Protocols 1: 755-68). Também estão disponíveis para a preparação de anticorpos monoclonais humanos os métodos descri- tos em Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy 77 (1985); Boerner et al., 1991, J.
Immunol. 147 (1): 86-95; e van Dijik e van de Winkel, 2001, Curr.
Opin.
Pharmacol. 5: 368-74. Os anticorpos humanos podem ser preparados pela administração do antígeno a um animal transgênico que foi modificado para produzir tais anticorpos em resposta ao desafio antigênico, mas cujos /oci endógenos foram desa- tivados, por exemplo, camundongos (consulte, por exemplo, Jakobo- vits, 1995, Curr.
Opin.
Biotechnol. 6 (5): 561-66; Brúggemann e Taus- sing, 1997, Curr.
Opin.
Biotechnol. 8 (4): 455-58; e Patentes Norte- Americanas Nº* 6.075.181 e 6.150.584 referentes à tecnologia XE- NOMOUSETY). Consulte também, por exemplo, Li et al., 2006, Proc.
Natl.
Acad.
Sci.
USA 103: 3557-62 a respeito de anticorpos humanos gerados por meio de uma tecnologia de hibridoma de células B huma- nas.
[0085] Em determinadas modalidades, os anticorpos ou fragmen- tos de ligação a antígeno podem compreender porções de um "anti- corpo humano recombinante", em que a frase inclui anticorpos huma- nos que são preparados, expressos, criados ou isolados por meios re- combinantes, tais como anticorpos expressos usando um recombinan- te vetor de expressão transfectado em uma célula hospedeira, anticor- pos isolados de uma biblioteca recombinante combinatória de anticor- pos humanos, anticorpos isolados de um animal (por exemplo, um camundongo ou vaca) que é transgênico e/ou transcromossômico para genes de imunoglobulina humana (consulte, por exemplo, Taylor, L.D. et al. (1992) Nucl. Acids Res. 20: 6287-6295) ou anticorpos prepara- dos, expressos, criados ou isolados através de qualquer outro meio que envolva o splicing de sequências de genes de imunoglobulina hu- mana a outras sequências de DNA. Tais anticorpos humanos recom- binantes podem ter regiões variáveis e constantes derivadas de se- quências de imunoglobulina da linhagem germinativa humana (consul- te Kabat, E.A. et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edição, US Department of Health and Human Servi- ces, Publicação NIH Nº 91 -3242). Em determinadas modalidades, no entanto, tais anticorpos humanos recombinantes são submetidos à mutagênese in vitro (ou, quando um animal transgênico para sequên- cias de lg humana é usado, mutagênese somática in vivo) e, assim, as sequências de aminoácidos das regiões VH e VL do recombinante an- ticorpos são sequências que, embora derivadas de um e relacionados a sequências de VH e VL da linhagem germinativa humana podem não existir naturalmente dentro do repertório da linhagem germinativa de anticorpo humano in vivo.
[0086] Em determinadas modalidades, os anticorpos ou fragmen-
tos de ligação a antígeno podem compreender uma porção de um "an- ticorpo monoclonal" em que o termo, conforme usado no presente do- cumento, refere-se a um anticorpo obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogênea, por exemplo, os anticorpos individuais que compreendem a população são idênticos, exceto quan- to a possíveis mutações de ocorrência natural que possam estar pre- sentes em pequenas quantidades, e cada anticorpo monoclonal reco- nhecerá, tipicamente, um único epítopo no antígeno. Em modalidades específicas, um "anticorpo monoclonal", conforme usado no presente documento, é um anticorpo produzido por um único hibridoma ou outra célula. O termo "monoclonal" não está limitado a qualquer método par- ticular para produzir o anticorpo. Por exemplo, os anticorpos monoclo- nais úteis na presente invenção podem ser preparados pela metodolo- gia de hibridoma primeiro descrita por Kohler et al., 1975, Nature 256: 495, ou podem ser produzidos usando métodos de DNA recombinante em células bacterianas ou eucariotas de animais ou plantas (consulte, por exemplo, Patente Norte-Americana Nº 4.816.567). Os "anticorpos monoclonais" também podem ser isolados de bibliotecas de anticorpos de fago usando as técnicas descritas em Clackson et a/., 1991, Nature 352: 624-28 e Marks et a/., 1991, J. Mol. Biol. 222: 581-97, por exem- plo. Outros métodos para a preparação de linhagens de células clonais e anticorpos monoclonais assim expressos são bem conhecidos na técnica. Consulte, por exemplo, Short Protocols in Molecular Biology (Ausubel et a/. Eds., 5º ed. 2002).
[0087] Uma unidade típica de anticorpo de 4 cadeias é uma glico- proteína heterotetramérica composta por duas cadeias leves (L) idênti- cas e duas cadeias pesadas (H) idênticas. No caso de IgGs, a unidade de 4 cadeias tem geralmente cerca de 150.000 daltons. Cada cadeia L está ligada a uma cadeia H através de uma ligação de dissulfureto co- valente, enquanto que as duas cadeias H estão ligadas entre si atra-
vés de uma ou mais ligações de dissulfureto dependendo do isotipo da cadeia H. Cada cadeia H e L também tem pontes de dissulfureto intra- cadeia regularmente espaçadas. Cada cadeia H tem, no N-término, um domínio variável (VH) seguido por três domínios constantes (CH) para cada uma das cadeias a e y e quatro domínios CH para os isoti- pos u e e. Cada cadeia L tem, no N-término, um domínio variável (VL) seguido por um domínio constante (CL) em sua outra extremidade. À VL está alinhada com a VH e a CL está alinhada com o primeiro domí- nio constante de cadeia pesada (CH1). Acredita-se que resíduos de aminoácidos particulares formam uma interface entre os domínios va- riáveis da cadeia leve e da cadeia pesada. O emparelhamento de uma VH e uma VL juntas forma um único sítio de ligação a antígeno. Para a estrutura e propriedades das diferentes classes de anticorpos consul- te, por exemplo, Basic and Clinical Immunology 71 (Stites et al. Eds., 8º ed. 1994); e Immunobiology (Janeway et al. eds., 5º ed. 2001).
[0088] O termo "Fab" ou "região Fab" refere-se a uma região de anticorpo que se liga a antígenos. Uma IgG convencional geralmente compreende duas regiões Fab, cada uma residindo em um dos dois braços da estrutura de IgG em forma de Y. Cada região Fab é, tipica- mente, composta por uma região variável e uma região constante de cada uma das cadeias pesada e leve. Mais especificamente, a região variável e a região constante da cadeia pesada em uma região Fab são regiões VH e CH1 e a região variável e a região constante da ca- deia leve em uma região Fab são regiões VL e CL. A VH, CH1, VL e CL em uma região Fab podem ser arranjadas de várias maneiras para conferir uma capacidade de ligação a antígeno de acordo com a pre- sente invenção. Por exemplo, as regiões VH e CH1 podem estar em um polipeptídeo e as regiões VL e CL podem estar em um polipeptí- deo separado, de forma similar a uma região Fab de uma IgG conven- cional. Alternativamente, as regiões VH, CH1, VL e CL podem estar todas no mesmo polipeptídeo e orientadas em ordens diferentes, con- forme descrito em mais detalhes nas seções abaixo.
[0089] O termo "região variável", "domínio variável", "região V" ou "domínio V" refere-se a uma porção das cadeias leve ou pesada de um anticorpo que geralmente está localizada no terminal amino da cadeia pesada ou leve e tem um comprimento a partir de cerca de 120 a 130 aminoácidos na cadeia pesada e cerca de 100 a 110 aminoácidos na cadeia leve, e são usadas na ligação e especificidade de cada anticor- po particular por seu antígeno particular. A região variável de cadeia pesada pode ser denominada como "VH". A região variável de cadeia leve pode ser denominada como "VL". O termo "variável" refere-se ao fato de que determinados segmentos das regiões variáveis diferem extensivamente quanto à sequência entre os anticorpos. A região V media a ligação a antígeno e define a especificidade de um determi- nado anticorpo por seu antígeno particular. No entanto, a variabilidade não é uniformemente distribuída ao longo da faixa de 110 aminoácidos das regiões variáveis. Em vez disso, as regiões V consistem em tre- chos menos variáveis (por exemplo, relativamente invariantes) deno- minados regiões estruturais (FRs) de cerca de 15-30 aminoácidos se- paradas por regiões mais curtas de maior variabilidade (por exemplo, extrema variabilidade) denominadas "regiões hipervariáveis" que têm cerca de 9-12 aminoácidos de comprimento cada. As regiões variáveis das cadeias pesadas e leves compreendem, cada uma, quatro FRs, em grande parte adotando uma configuração de folha B, conectada através de três regiões hipervariáveis, as quais formam laços de cone- xão e, em alguns casos, fazem parte da estrutura de folha B. As regi- ões hipervariáveis em cada cadeia são mantidas juntas em estreita proximidade pelas FRs e, com as regiões hipervariáveis da outra ca- deia, contribuem para a formação do sítio de ligação a antígeno de an- ticorpos (consulte, por exemplo, Kabat et al., Sequences of Proteins of
Immunological Interest (5º ed. 1991)). As regiões constantes não estão envolvidas diretamente na ligação de um anticorpo a um antígeno, mas exibem várias funções efetoras, tal como a participação do anti- corpo na citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) e na citotoxicidade dependente de complemento (CDC). As regiões variá- veis diferem extensivamente quanto à sequência entre diferentes anti- corpos. Em modalidades específicas, a região variável é uma região variável humana.
[0090] Os termos "numeração de resíduo de região variável de acordo com Kabat" ou "numeração de posição de aminoácido confor- me em Kabat", e variações os mesmos, referem-se ao sistema de nu- meração usado para regiões variáveis de cadeia pesada ou regiões variáveis de cadeia leve da compilação de anticorpos em Kabat et al., supra. Usando este sistema de numeração, a sequência de aminoáci- dos linear real pode conter menos ou mais aminoácidos que corres- pondem a um encurtamento ou inserção em uma FR ou CDR do do- mínio variável. Por exemplo, um domínio variável de cadeia pesada pode incluir uma única inserção de aminoácido (resíduo 52a de acordo com Kabat) após o resíduo 52 e três resíduos inseridos (por exemplo, resíduos 82a, 82b e 82c, etc. de acordo com Kabat) após o resíduo 82. A numeração de Kabat de resíduos pode ser determinada para um dado anticorpo através de alinhamento em regiões de homologia da sequência do anticorpo com uma sequência numerada de Kabat "pa- drão". O sistema de numeração de Kabat é, em geral, usado quando de referência a um resíduo no domínio variável (aproximadamente re- síduos 1-107 da cadeia leve e resíduos 1-113 da cadeia pesada) (por exemplo, Kabat et al., supra). O "sistema de numeração EU" ou "índice EU" é, em geral, usado quando de referência a um resíduo em uma região constante da cadeia pesada de imunoglobulina (por exemplo, o índice EU relatado em Kabat et al., supra). O "índice EU conforme em
Kabat" refere-se à numeração de resíduos do anticorpo I9gG1 humana. Outros sistemas de numeração foram descritos, por exemplo, APM, Chothia, Contact, IMGT e AHon.
[0091] O termo "cadeia pesada", quando usado em referência a um anticorpo, refere-se a uma cadeia polipeptídica de cerca de 50-70 kDa, em que a porção amino-terminal inclui uma região variável de cerca de 120 a 130 ou mais aminoácidos e a porção carboxila-terminal inclui uma região constante. A região constante pode ser um dos cinco tipos distintos (por exemplo, isotipos) denominados como alfa (a), delta (5), épsilon (€), gama (y) e mu (uy), com base na sequência de aminoá- cidos da região constante de cadeia pesada. As cadeias pesadas dis- tintas diferem quanto ao tamanho: a, ô e y contêm aproximadamente 450 aminoácidos, enquanto que uy e € contêm aproximadamente 550 aminoácidos. Quando combinados com uma cadeia leve, estes tipos distintos de cadeias pesadas dão origem a cinco classes bem conhe- cidas (por exemplo, isotipos) de anticorpos, IgA, 1gD, IgE, IgG e IgM, respectivamente, incluindo quatro subclasses de IgG, particularmente Ig9G1, I9gG2, I9G3 e I1gG4.
[0092] O termo "cadeia leve", quando usado em referência a um anticorpo, refere-se a uma cadeia polipeptídica de cerca de 25 kDa, em que a porção amino-terminal inclui uma região variável de cerca de 100 a cerca de 110 ou mais aminoácidos e a porção carboxila-terminal inclui uma região constante. O comprimento aproximado de uma ca- deia leve é a partir de 211 a 217 aminoácidos. Há dois tipos distintos, denominados capa (K) ou lambda (A), com base na sequência de ami- noácidos dos domínios constantes.
[0093] Conforme usado no presente documento, os termos "região hipervariável", "HVR", "Região Determinante de Complementaridade" e "CDR" são usados indistintamente. Uma "CDR" refere-se a uma das três regiões hipervariáveis (H1, H2 ou H3) dentro da região não estru-
tural da estrutura de B folha da VH da imunoglobulina (Ig ou anticorpo) ou uma das três regiões hipervariáveis (L1, L2 ou L3 ) dentro da região não estrutural da estrutura de B folha da VL do anticorpo. Consequen- temente, as CDRs são sequências de região variável intercaladas nas sequências de região estrutural.
[0094] As regiões CDR são bem conhecidas por aqueles versados na técnica e foram definidas através de sistemas de numeração bem conhecidos. Por exemplo, as regiões determinantes de complementa- ridade (CDRs) de Kabat são com base na variabilidade da sequência e são as mais comumente usadas (consulte, por exemplo, Kabat et al., Supra). Chothia refere-se, em vez disso, à localização das alças estru- turais (consulte, por exemplo, Chothia e Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196: 901-17). O fim da alça de CDR-H1 de Chothia, quando numerado usando a convenção de numeração de Kabat, varia entre H32 e H34, dependendo do comprimento da alça (isto ocorre porque o esquema de numeração de Kabat coloca inserções em H35A e H35B; se nem 35A nem 35B estiverem presentes, a alça termina em 32; se apenas 35A está presente, a alça termina em 33; se tanto 35A como 35B esti- verem presentes, a alça termina em 34). As regiões hipervariáveis AbM representam um compromisso entre as CDRs de Kabat e as al- ças estruturais de Chothia, e são usadas pelo software de modelagem de anticorpos ADM da Oxford Molecular (consulte, por exemplo, Anti- body Engineering Vol. 2 (Eds. Kontermann e Dúbel, 2º ed. 2010)). As regiões hipervariáveis "Contact" são com base em uma análise das estruturas cristalinas complexas disponíveis. Outro sistema de nume- ração universal que foi desenvolvido e amplamente adotado é o ImMunoGeneTics (IMGT) Information System& (Lafranc et al., 2003, Dev. Comp. Immunol. 27 (1): 55-77). IMGT é um sistema de informa- ção integrado especializado em imunoglobulinas (IG), receptores de células T (TCR) e principal complexo de histocompatibilidade (MHC)
de seres humanos e outros vertebrados.
No presente documento, as CDRs são referidas em termos da sequência de aminoácidos e da lo- calização dentro da cadeia leve ou pesada.
Uma vez que a "localiza- ção" das CDRs dentro da estrutura do domínio variável da imunoglo- bulina é conservada entre as espécies e está presente em estruturas denominadas alças, usando sistemas de numeração que alinham se- quências de domínio variável de acordo com características estrutu- rais, os resíduos das regiões CDR e estrutural são prontamente identi- ficados.
Esta informação pode ser usada no enxerto e substituição de resíduos de CDR de imunoglobulinas de uma espécie em uma estrutu- ra aceitadora, normalmente, um anticorpo humano.
Um sistema de numeração adicional (AHon) foi desenvolvido por Honegger e Plú- ckthun, 2001, J.
Mol.
Biol. 309: 657-70. A correspondência entre o sis- tema de numeração incluindo, por exemplo, a numeração de Kabat e o sistema de numeração único IMGT, é bem conhecida por aqueles ver- sados na técnica (consulte, por exemplo, Kabat, supra; Chothia e Lesk, supra; Martin, supra; Lefranc et a/., supra). Os resíduos de cada uma destas regiões hipervariáveis ou CDRs são indicados abaixo.
Tabela 30
[ | E am eras Teosa | mer]
H31--H35B
CDRH1 | (Numeração | H26--H35B H26- nor ls as
H31-H35 FarHss de Chothia)
[0095] Os limites de uma determinada CDR podem variar depen- dendo do esquema usado para a identificação. Assim, a menos que especificado de outra forma, os termos "CDR" e "região determinante de complementaridade" de um determinado anticorpo ou região do mesmo, tal como uma região variável, bem como CDRs individuais (por exemplo, "CDR-H1, CDR-H2") do anticorpo ou região do mesmo, deve ser entendido como abrangendo a região determinante de com- plementaridade conforme definido por qualquer um dos esquemas co- nhecidos descritos acima. Em alguns casos, o esquema para identifi- cação de uma determinada CDR ou CDRs é especificado, tal como a CDR conforme definido através do método de Kabat, Chothia ou Con- tact. Em outros casos, é fornecida a sequência de aminoácidos parti- cular de uma CDR.
[0096] As regiões hipervariáveis podem compreender "regiões hi- pervariáveis estendidas" como segue: 24-36 ou 24-34 (L1), 46-56 ou 50-56 (L2) e 89-97 ou 89-96 (L3) na VL e 26-35 ou 26-35A (H1), 50-65 ou 49-65 (H2) e 93-102, 94-102 ou 95-102 (H3) na VH.
[0097] O termo "região constante" ou "domínio constante" refere- se a uma porção do terminal carboxila da cadeia leve e pesada que não está diretamente envolvida na ligação do anticorpo ao antígeno, mas exibe várias funções efetoras, tal como a interação com o recep- tor Fc. O termo refere-se à porção de uma molécula de imunoglobulina que compreende uma sequência de aminoácidos mais conservada em relação à outra porção da imunoglobulina, a região variável, a qual contém o sítio de ligação a antígeno. A região constante pode conter as regiões CH1, CH2 e CH3 da cadeia pesada e a região CL da ca- deia leve.
[0098] O termo "estrutural" ou "FR" refere-se aos resíduos da regi- ão variável que flanqueiam as CDRs. Os resíduos de FR estão presen- tes, por exemplo, em anticorpos quiméricos, humanizados, humanos,
de domínio, diacorpos, anticorpos lineares e anticorpos biespecíficos. Os resíduos de FR são aqueles resíduos do domínio variável que não os resíduos da região hipervariável ou resíduos de CDR.
[0099] O termo "região Fc", no presente documento, é usado para definir uma região C-terminal de uma cadeia pesada de imunoglobuli- na incluindo, por exemplo, regiões Fc de sequência nativa, regiões Fc recombinantes e regiões Fc variantes. Embora os limites da região Fc de uma cadeia pesada de imunoglobulina possam variar, a região Fc da cadeia pesada de IgG humana é frequentemente definida para se estender a partir de um resíduo de aminoácido na posição Cys226, ou a partir de Pro230, até o terminal carboxila da mesma. A lisina C- terminal (resíduo 447 de acordo com o sistema de numeração EU) da região Fc pode ser removida, por exemplo, durante a produção ou pu- rificação do anticorpo, ou através de engenharia recombinante do áci- do nucleico que codifica uma cadeia pesada do anticorpo. Consequen- temente, uma composição de anticorpos intactos pode compreender populações de anticorpos com todos os resíduos K447 removidos, po- pulações de anticorpos sem resíduos K447 removidos e populações de anticorpos que compreendem uma mistura de anticorpos com e sem o resíduo K447. Uma "região Fc funcional" possui uma "função efetora" de uma região Fc de sequência nativa. "Funções efetoras" exemplificativas incluem ligação a C1g; CDC; ligação ao receptor Fc; ADCC; fagocitose; regulação negativa de receptores na superfície ce- lular (por exemplo, receptor de células B), etc. Tais funções efetoras geralmente requerem que a região Fc seja combinada com uma região de ligação ou domínio de ligação (por exemplo, uma região ou domínio variável de anticorpo) e pode ser avaliada usando vários ensaios co- nhecido por aqueles versados na técnica. Uma "região Fc variante" compreende uma sequência de aminoácidos que difere daquela de uma região Fc de sequência nativa em virtude de pelo menos uma modificação de aminoácido (por exemplo, substituição, adição ou eli- minação). Em determinadas modalidades, a região Fc variante tem pelo menos uma substituição de aminoácido comparado com uma re- gião Fc de sequência nativa ou com a região Fc de um polipeptídeo precursor, por exemplo, a partir de cerca de uma a cerca de dez subs- tituições de aminoácidos ou a partir de cerca de um a cerca de cinco substituições de aminoácidos em uma região Fc de sequência nativa ou na região Fc de um polipeptídeo precursor. A região Fc variante no presente documento pode possuir pelo menos cerca de 80 % de ho- mologia com uma região Fc de sequência nativa e/ou com uma região Fc de um polipeptídeo precursor ou pelo menos cerca de 90 % de ho- mologia com a mesma, por exemplo, pelo menos cerca de 95 % de homologia com a mesma.
[00100] Conforme usado no presente documento, um "epítopo" é um termo na técnica e refere-se a uma região localizada de um antí- geno ao qual uma molécula de ligação (por exemplo, um anticorpo) pode se ligar especificamente. Um epítopo pode ser um epítopo linear ou um epítopo conformacional, não linear ou descontínuo. No caso de um antígeno polipeptídico, por exemplo, um epítopo pode ser aminoá- cidos contíguos do polipeptídeo (um epítopo "linear") ou um epítopo pode compreender aminoácidos de duas ou mais regiões não contí- guas do polipeptídeo (um epítopo "conformacional", "não linear" ou "descontínuo"). Será reconhecido por aqueles versados na técnica que, em geral, um epítopo linear pode ou não ser dependente da es- trutura secundária, terciária ou quaternária. Por exemplo, em algumas modalidades, uma molécula de ligação se liga a um grupo de aminoá- cidos independentemente de estarem ou não dobrados em uma estru- tura natural de proteína tridimensional. Em outras modalidades, uma molécula de ligação requer que os resíduos de aminoácidos que cons- tituem o epítopo exibam uma conformação particular (por exemplo,
curvar, torcer, virar ou dobrar) a fim de reconhecer e se ligar ao epíto- po.
[00101] Os termos "polipeptídeo" e "peptídeo" e "proteína" são usa- dos indistintamente no presente documento e referem-se a polímeros de aminoácidos de qualquer comprimento. O polímero pode ser linear ou ramiíificado, pode compreender aminoácidos modificados e pode ser interrompido por não aminoácidos. Os termos também abrangem um polímero de aminoácidos que foi modificado naturalmente ou através de intervenção; por exemplo, formação de ligação de dissulfureto, gli- cosilação, lipidação, acetilação, fosforilação ou qualquer outra manipu- lação ou modificação. Também incluídos na definição estão, por exemplo, polipeptídeos que contêm um ou mais análogos de um ami- noácido incluindo, porém sem limitações, aminoácidos não naturais, bem como outras modificações conhecidas na técnica. Deve ser en- tendido que, uma vez que os polipeptídeos da presente invenção po- dem ser com base em anticorpos ou outros membros da superfamília das imunoglobulinas, em determinadas modalidades, um "polipeptí- deo" pode ocorrer como uma única cadeia ou como duas ou mais ca- deias associadas.
[00102] O termo "vetor" refere-se a uma substância que é usada para transportar ou incluir uma sequência de ácidos nucleicos incluin- do, por exemplo, uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma molécula de ligação (por exemplo, um anticorpo), conforme descrito no presente documento, a fim de introduzir uma sequência de ácidos nu- cleicos em uma célula hospedeira. Vetores aplicáveis para uso inclu- em, por exemplo, vetores de expressão, plasmídeos, vetores de fago, vetores virais, epissomas e cromossomos artificiais, os quais podem incluir sequências de seleção ou marcadores operáveis para integra- ção estável no cromossomo de uma célula hospedeira. Além disso, os vetores podem incluir um ou mais genes marcadores selecionáveis e sequências de controle de expressão apropriadas. Genes marcadores selecionáveis que podem ser incluídos, por exemplo, conferem resis- tência a antibióticos ou toxinas, complementam deficiências auxotrófi- cas ou fornecem nutrientes críticos que não estão no meio de cultura. As sequências de controle de expressão podem incluir promotores constitutivos e indutíveis, intensificadores de transcrição, terminadores de transcrição e assim por diante, os quais são bem conhecidos na técnica. Quando duas ou mais moléculas de ácidos nucleicos devem ser coexpressas (por exemplo, uma cadeia pesada e leve de anticorpo ou uma VH e VL de anticorpo), ambas as moléculas de ácidos nuclei- cos podem ser inseridas, por exemplo, em um único vetor de expres- são ou separadamente vetores de expressão. Para expressão em um único vetor, os ácidos nucleicos codificantes podem ser operativamen- te ligados a uma sequência de controle de expressão em comum ou ligados a diferentes sequências de controle de expressão, tais como um promotor indutível e um promotor constitutivo. A introdução de mo- léculas de ácidos nucleicos em uma célula hospedeira pode ser con- firmada usando métodos bem conhecidos na técnica. Tais métodos incluem, por exemplo, análise de ácidos nucleicos, tal como Northern blots, ou reação em cadeia de polimerase (PCR), amplificação de MRNA, immunoblotting para expressão de produtos gênicos ou outros métodos analíticos adequados para testar a expressão de uma se- quência de ácidos nucleicos introduzida ou seu produto gênico corres- pondente. Será entendido por aqueles versados na técnica que as mo- léculas de ácidos nucleicos são expressas em uma quantidade sufici- ente para produzir um produto desejado e deve ser entendido ainda que os níveis de expressão podem ser otimizados para obter expres- são suficiente usando métodos bem conhecidos na técnica.
[00103] O termo "hospedeiro", conforme usado no presente docu- mento, refere-se a um animal, tal como um mamífero (por exemplo,
um ser humano).
[00104] O termo "célula hospedeira", conforme usado no presente documento, refere-se a uma célula em particular que pode ser trans- fectada com uma molécula de ácidos nucleicos e a progênie ou progê- nie potencial de tal célula. A progênie de tal célula pode não ser idênti- ca à célula-mãe transfectada com a molécula de ácidos nucleicos em virtude de mutações ou influências ambientais que podem ocorrer nas gerações seguintes ou integração da molécula de ácidos nucleicos no genoma da célula hospedeira.
[00105] Um "ácido nucleico isolado" é um ácido nucleico, por exemplo, um RNA, DNA ou ácidos nucleicos mistos, que é substanci- almente separado de outras sequências de DNA do genoma, bem co- mo proteínas ou complexos, tais como ribossomos e polimerases, que acompanham naturalmente uma sequência nativa. Uma molécula de ácidos nucleicos "isolada" é aquela que é separada de outras molécu- las de ácidos nucleicos que estão presentes na fonte natural da molé- cula de ácidos nucleicos. Além disso, uma molécula de ácidos nuclei- cos "isolada", tal como uma molécula de cDNA, pode ser substancial- mente isenta de outro material celular ou meio de cultura quando pro- duzida por meio de técnicas recombinantes ou substancialmente isen- ta de precursores químicos ou outros produtos químicos quando sinte- tizada quimicamente. Em uma modalidade específica, uma ou mais moléculas de ácidos nucleicos que codificam um anticorpo, conforme descrito no presente documento, são isoladas ou purificadas. O termo abrange sequências de ácidos nucleicos que foram removidas de seu ambiente de ocorrência natural e inclui isolados de DNA recombinante ou clonados e análogos quimicamente sintetizados ou análogos biolo- gicamente sintetizados por sistemas heterólogos. Uma molécula subs- tancialmente pura pode incluir formas isoladas da molécula.
[00106] "“Polinucleotídeo" ou "ácido nucleico", conforme usado indis-
tintamente no presente documento, refere-se a polímeros de nucleotí- deos de qualquer comprimento e inclui DNA e RNA. Os nucleotídeos podem ser desoxirribonucleotídeos, ribonucleotídeos, nucleotídeos modificados ou bases e/ou análogos dos mesmos, ou qualquer subs- trato que possa ser incorporado em um polímero por uma DNA ou RNA polimerase ou através de uma reação sintética. Um polinucleotí- deo pode compreender nucleotídeos modificados, tais como nucleotí- deos metilados e análogos dos mesmos. "Oligonucleotídeo", conforme usado no presente documento, refere-se a polinucleotídeos sintéticos curtos, geralmente fita simples os quais, em geral, mas não necessari- amente, têm menos do que cerca de 200 nucleotídeos de comprimen- to. Os termos "oligonucleotídeo" e "polinucleotídeo" não são mutua- mente exclusivos. A descrição acima para polinucleotídeos é igual e totalmente aplicável aos oligonucleotídeos. Uma célula que produz uma molécula de ligação da presente invenção pode incluir uma célula de hibridoma precursora, bem como células hospedeiras bacterianas e eucariotas nas quais os ácidos nucleicos que codificam os anticorpos foram introduzidos. A menos que especificado de outra forma, a ex- tremidade esquerda de qualquer sequência polinucleotídica fita sim- ples descrita no presente documento é a extremidade 5'; a direção a partir do lado esquerdo das sequências polinucleotídicas fita dupla é denominada como a direção 5'. A direção a partir de 5' para 3' de transcritos de RNA nascentes é denominada como a direção da trans- crição; regiões de sequência na fita de DNA que compreende a mes- ma sequência que o transcrito de RNA que são 5' à extremidade 5' do transcrito de RNA são denominadas como "sequências a montante"; regiões de sequência na fita de DNA que compreende a mesma se- quência que o transcrito de RNA que são 3' à extremidade 3' do trans- crito de RNA são denominadas como "sequências a jusante".
[00107] O termo "farmaceuticamente aceitável", conforme usado no presente documento, significa ser aprovado por uma agência regula- dora do Governo Federal ou Estadual, ou listado na Farmacopeia dos Estados Unidos, Farmacopeia Europeia ou outra farmacopeia geral- mente reconhecida para uso em animais e, mais particularmente, em seres humanos.
[00108] "Excipiente" significa um material, composição ou veículo farmaceuticamente aceitável, tal como um material de enchimento lí- quido ou sólido, diluente, solvente ou material encapsulante. Excipien- tes incluem, por exemplo, materiais encapsulantes ou aditivos, tais como aceleradores de absorção, antioxidantes, aglutinantes, tampões, carreadores, agentes de revestimento, agentes corantes, diluentes, agentes desintegrantes, emulsificantes, extensores, materiais de en- chimentos, agentes aromatizantes, umectantes, lubrificantes, perfu- mes, conservantes, propelentes, agentes de liberação, agentes esteri- lizantes, adoçantes, solubilizantes, agentes umectantes e misturas dos mesmos. O termo "excipiente" também pode referir-se a um diluente, adjuvante (por exemplo, adjuvante de Freund (completo ou incomple- to) ou veículo.
[00109] Em algumas modalidades, os excipientes são excipientes farmaceuticamente aceitáveis. Exemplos de excipientes farmaceuti- camente aceitáveis incluem tampões, tais como fosfato, citrato e ou- tros ácidos orgânicos; antioxidantes, incluindo ácido ascórbico; poli- peptídeo de baixo peso molecular (por exemplo, menos do que cerca de 10 resíduos de aminoácidos); proteínas, tais como albumina sérica, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos, tal como polivinil- pirrolidona; aminoácidos, tais como I-histidina, glicina, glutamina, aspa- ragina, arginina ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos e outros carboidratos, incluindo glicose, sacarose, trealose di-hidratada, mano- se ou dextrinas; agentes quelantes, tal como EDTA; álcoois de açúcar, tais como manitol ou sorbitol; contra-íons formadores de sal, tal como sódio; e/ou tensoativos não iônicos, tais como TWEEN'TY, polietileno glicol (PEG) e PLURONICSTY. Outros exemplos de excipientes farma- ceuticamente aceitáveis são descritos em Remington e Gennaro, Re- mington's Pharmaceutical Sciences (18º ed. 1990).
[00110] Em uma modalidade, cada componente é "farmaceutica- mente aceitável" no sentido de ser compatível com os outros ingredi- entes de uma formulação farmacêutica e adequado para uso em con- tato com o tecido ou órgão de seres humanos e animais sem toxicida- de excessiva, irritação, resposta alérgica, imunogenicidade ou outros problemas ou complicações comensuráveis com uma proporção ris- co/benefício razoável. Consulte, por exemplo, Lippincott Williams & Wilkins: Filadélfia, PA, 2005; Handbook of Pharmaceutical Excipients, 6º ed.; Rowe et al., Eds.; The Pharmaceutical Press and American Pharmaceutical Association: 2009; Handbook of Pharmaceutical Addi- tives, 3º ed.; Ash e Ash Eds.; Gower Publishing Company: 2007; Pharmaceutical Preformulation and Formulation, 2º ed.; Gibson Ed.; CRC Press LLC: Boca Raton, FL, 2009. Em algumas modalidades, excipientes farmaceuticamente aceitáveis não são tóxicos para a célu- la ou mamífero exposto aos mesmos nas dosagens e concentrações usadas. Em algumas modalidades, um excipiente farmaceuticamente aceitável é uma solução aquosa de pH tamponado.
[00111] Em algumas modalidades, os excipientes são líquidos esté- reis, tais como água e óleos, incluindo aqueles originários de petróleo, animal, vegetal ou sintéticos, tais como óleo de amendoim, óleo de soja, óleo mineral, óleo de gergelim e assim por diante. A água é um excipiente exemplificativo quando uma composição (por exemplo, uma composição farmacêutica) é administrada através da via intravenosa. Soluções salinas e soluções aquosas de dextrose e glicerol também podem ser usadas como excipientes líquidos, particularmente para so- luções injetáveis. Um excipiente também pode incluir amido, glicose,
lactose, sacarose, gelatina, malte, arroz, farinha, giz, gel de sílica, es- tearato de sódio, monoestearato de glicerol, talco, cloreto de sódio, leite desnatado em pó, glicerol, propileno, glicol, água, etanol e assim por diante. A composição, se desejado, também pode conter peque- nas quantidades de agentes umectantes ou emulsificantes ou agentes de tamponamento de pH. As composições podem assumir a forma de soluções, suspensões, emulsões, comprimidos, pílulas, cápsulas, pós, formulações de liberação sustentada e assim por diante.
[00112] As composições, incluindo compostos farmacêuticos, po- dem conter uma molécula de ligação (por exemplo, um anticorpo), por exemplo, na forma isolada ou purificada, juntamente com uma quanti- dade adequada de excipientes.
[00113] A abreviatura "MMAE" refere-se a monometil auristatina E.
[00114] Salvo indicação em contrário, o termo "alquila" refere-se a um hidrocarboneto saturado linear ou ramificado que compreende a partir de cerca de 1 a cerca de 20 átomos de carbono (e todas as combinações e subcombinações de faixas e números específicos de átomos de carbono nas mesmas), com cerca de 1 até cerca de 8 áto- mos de carbono sendo preferido. Exemplos de grupos alquila são me- tila, etila, n-propila, iso-propila, n-butila, iso-butila, sec-butila, terc- butila, n-pentila, 2-pentila, 3-pentila, 2-metila-2 -butila, n hexila, n- heptila, n-octila, n-nonila, n-decila, 3-metila-2-butila, 3-metila-1-butila, 2 metila-1-butila, 1-hexila, 2 -hexila, 3-hexila, 2-metila-2-pentila, 3-metila- 2-pentila, 4-metila-2-pentila, 3-metila-3-pentila, 2-metila-3-pentila, 2,3 - dimetila-2-butila e 3,3-dimetila-2-butila. Os grupos alquila, individual- mente ou como parte de outro grupo, podem ser opcionalmente substi- tuídos por um ou mais grupos, de preferência 1 a 3 grupos (e quais- quer substituintes adicionais selecionados a partir de halogênio) inclu- indo, porém sem limitações, -halogênio, -O-(C1-Cs alquila), -O-(C2-Cs alquenila), -O-(C2-Cs alquinila), -arila, -C(O)R', -OC(O)R', -C(O0)OR', -
C(O)NH2 , -C(OINHR', -C(O)N (R'), -NHC(OJR', -SR', -SO3R', - S(O)2R', -S(O)R', -OH, =O, -N3 , -NH2, -NH(R'), -N(R')2 e -CN, onde cada R' é independentemente selecionado a partir de -H, -C1-Cs alqui- la, -C2-Cg alquenila, -C2-Cg alquinila ou -arila, e em que os ditos grupos -O-(C1-Cg alquila), -O-(C2-Cg alquenila), -O-(C2-Cs alquinila), -arila, -C1- Cs alquila, -C2-Cg alquenila e -C2-Cg alquinila podem ser opcionalmente ainda substituídos por um ou mais grupos incluindo, porém sem limita- ções, -C1-Cs alquila, -C2-Cg alquenila, -C2-Cg alquinila, -halogênio, -O- (C1-Cg alquila), -O-(C2-Cg alquenila), -O-(C>-Cs8 alquinila), -arila, - C(O)R", -OC(O)R", -C(O0)OR", -C(O)NH2 , -C(O)NHR", -C(O)N(R")2, - NHC(O)R", -SR", -SO3R", -S(O)2R", -S(O)R", -OH, -N3 , -NH2, -NH(R"), -N(R")2 e -CN, onde cada R" é independentemente selecionado a partir de -H, -C1-C;s alquila, -C2-Cg alquenila, -C2-Cs alquinila ou -arila.
[00115] Salvo indicação em contrário, os termos "alquenila" e "al- quinila" referem-se a cadeias de carbono lineares e ramificadas que compreendem a partir de cerca de 2 a cerca de 20 átomos de carbono (e todas as combinações e subcombinações de faixas e números es- pecíficos de átomos de carbono nas mesmas), com de cerca de 2 a cerca de 8 átomos de carbono sendo preferido. Uma cadeia alquenila tem pelo menos uma ligação dupla na cadeia e uma cadeia alquinila tem pelo menos uma ligação tripla na cadeia. Exemplos de grupos al- quenila incluem, porém sem limitações, etileno ou vinila, alila, - 1-butenila, -2-butenila, — -isobutilenila, -1-pentenila, -2-pentenila, - 3-metil-1-butenila, -2-metil-2-butenila e -2,3-dimetil-2- butenila. Exem- plos de grupos alquinila incluem, porém sem limitações, acetilênico, propargila, acetilenila, propinila, -1-butinila, -2-butinila, -1-pentinila, - 2-pentinila e -3-metil-1 butinila. Grupos alquenila e alquinila, seja indi- vidualmente ou como parte de outro grupo, podem ser opcionalmente substituídos por um ou mais grupos, de preferência 1 a 3 grupos (e quaisquer substituintes adicionais selecionados a partir de halogênio)
incluindo, porém sem limitações, -halogênio, -O-(C1-Cs alquila), -O-(C2- Cs alquenila), -O-(C2-Cs alquinila), -arila, -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)NH>2, -C(O)NHR', -C(O)N(R')2a, -NHC(OJ)R', -SR', -SO3R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, =O, -N3, -NH>2, -NH(R'), -N(R')2 e -CN, onde cada R' é independentemente selecionado a partir de -H, -C1-Cs8 alquila, -C2-Csg alquenila, -C2-Cg alquinila ou -arila e em que os ditos grupos -O-(C1-Csg alquila), -O-(C2-Cg alquenila), -O-(C2-C;s alquinila), -arila, -C1-Cg alquila, -C2-Cg alquenila e -C2-Cg alquinila podem ser opcionalmente ainda substituídos por um ou mais substituintes incluindo, porém sem limita- ções, -C1-Cs alquila, -C2-Cg alquenila, -C2-Cg alquinila, -halogênio, -O- (C1-Cg alquila), -O-(C2-Cs8 alquenila), -O-(C2C;s alquinila), -arila, -C(O) R", -OC(O)R", -C(O0)OR", -C(O) NH2 , -C(O)NHR", -C(O)N(R"), -NHC (O)R", -SR", -SO3R", -S(O)2R", -S(O)R", -OH, -N3 , -NH2, -NH(R"), - N(R")2 e -CN, onde cada R" é independentemente selecionado a partir de -H, -C1-C;s alquila, -C2-Cg alquenila, -C2-Cs alquinila ou -arila.
[00116] A menos que indicado de outra forma, o termo "alquileno" refere-se a um radical hidrocarboneto de cadeia linear ou ramificada saturada que compreende a partir de cerca de 1 a cerca de 20 átomos de carbono (e todas as combinações e subcombinações de faixas e números específicos de átomos de carbono nas mesmas), com a partir de cerca de 1 a cerca de 8 átomos de carbono sendo preferido, e que tem dois centros de radicais monovalentes derivados da remoção de dois átomos de hidrogênio do mesmo ou de dois átomos de carbono diferentes de um alcano precursor. Alquilenos típicos incluem, porém sem limitações, metileno, etileno, propileno, butileno, pentileno, hexile- no, heptileno, octileno, nonileno, decaleno, 1,4-ciclo-hexileno e assim por diante. Os grupos alquileno, seja individualmente ou como parte de outro grupo, podem ser opcionalmente substituídos por um ou mais grupos, de preferência 1 a 3 grupos (e quaisquer substituintes adicio- nais selecionados a partir de halogênio), incluindo, porém sem limita-
ções, -halogênio, -O-(C1-Csg alquila), -O-(C2-Cg alquenila), -O-(C2-Cg alquinila), -arila, -C(O)R', -OC(O)R', -C(O0)OR', -C(O)NH>2, -C(O)NHR', - C(O)N(R')2, -NHC(OJ)R', -SR', -SO3R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, =O, -N3, -NH2, -NH(R'), -N(R')r e -CN, onde cada R' é independentemente sele- cionado a partir de -H, -C1-Cg alquila, -C2-Cg alquenila, -C2-Cs alquini- la, ou -arila e em que os ditos grupos -O-(C1-Cg alquila), -O-(C2-C; al- quenila), -O-(C2-C;g alquinila), -arila, -C1-Cg alquila, -C2-Cg alquenila e - C2-Cg alquinila podem ser ainda opcionalmente substituídos por um ou mais substituintes incluindo, porém sem limitações, -C1-Cs alquila, -C2- Cs alquenila, -C2-Cs alquinila, -halogênio, -O-(C1-Cg alquila), -O-(C2-Cg alquenila), -O-(C2-Cs alquinila), -arila, -C(O)R", -OC(O)R", -C(O0)OR", - C(O)NH2, -C(O)NHR", -C(OJ)N (R")2, -NHC(OJ)R", -SR", -SOs3R", -S(O)2 R", -S(O)R", -OH, -N3 , -NH>2, -NH(R"), -N(R")2 e -CN, onde cada R" é independentemente selecionado a partir de -H, -C1-Cs alquila, -C2-Csg alquenila, -C2-C;g alquinila ou -arila.
[00117] Salvo indicação em contrário, o termo "alquenileno" refere- se a um grupo alquileno opcionalmente substituído que contém pelo menos uma ligação dupla carbono-carbono. Grupos alquenileno exemplificativos incluem, por exemplo, etenileno (-CH=CH-) e propeni- leno (-CH=CHCH>2-).
[00118] Salvo indicação em contrário, o termo "alquinileno" se refere a um grupo alquileno opcionalmente substituído que contém pelo menos uma ligação tripla carbono-carbono. Grupos alquinileno exemplificativos incluem, por exemplo, acetileno (-C=C-), propargila (-CH2C0=C-) e 4- pentinila (-CH2CH2CH2C=CH-).
[00119] Salvo indicação em contrário, o termo "arila" refere-se a um radical hidrocarboneto aromático monovalente de 6-20 átomos de car- bono (e todas as combinações e subcombinações de faixas e números específicos de átomos de carbono nas mesmas) derivado da remoção de um átomo de hidrogênio de um único átomo de carbono de um sis-
tema de anel aromático precursor. Alguns grupos arila são representa- dos nas estruturas exemplificativas como "Ar". Grupos arila típicos in- cluem, porém sem limitações, radicais derivados de benzeno, benzeno substituído, fenila, naftaleno, antraceno, bifenila e assim por diante.
[00120] Um grupo arila, seja individualmente ou como parte de ou- tro grupo, pode ser opcionalmente substituído por um ou mais, de pre- ferência 1 a 5, ou mesmo 1 a 2 grupos incluindo, porém sem limita- ções, -halogênio, -C1-Cg alquila, -C2-Cg alquenila, -C2-Cg alquinila, -O- (C1-Cg alquila), -O-(C2-Cg alquenila), -O-(C>-Cs8 alquinila), -arila, - C(O)R', -OC(O)R', -C(O0)OR', -C(O)NH2 , -C(O)NHR', -C(O)N(R')2, - NHC(OJ)R', -SR', -SO3R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, -NO>, -N3 , -NH>, - NH(R'), -N(R')2 e -CN, onde cada R' é independentemente selecionado a partir de -H, -C1-Cg alquila, -C2-Cg alquenila, -C2-Cg alquinila ou -arila e em que os ditos grupos -C1-Cs alquila, -C2-Cg alquenila, -C2-C;s al- quinila, O-(C1-Ca alquila), -O-(C2-Cg alquenila), -O-(C2-Cg alquinila) e - arila podem ser opcionalmente ainda substituídos por um ou mais substituintes incluindo, porém sem limitações, -C1-Cg alquila, -C2-Cg alquenila, -C2-Cg alquinila, -halogênio, -O-(C1-Cg alquila), -O-(C2-Csg alquenila), -O-(C2-Cs alquinila), -arila, -C(O)R", -OC(O)R", -C(O0)OR", - C(O)NH2 , -C(O)NHR", -C(OJ)N (R")a, -NHC(OJ)R", -SR", -SO3R", - S(O)2R", -S(O)R", -OH, -N3 , -NH>2, -NH(R"), -N(R")2 e -CN, onde cada R" é independentemente selecionado a partir de -H, -C1-C;g alquila, - C2-Cg alquenila, -C2-C;g alquinila ou -arila.
[00121] Salvo indicação em contrário, o termo "arileno" refere-se a um grupo arila opcionalmente substituído que é divalente (isto é, deri- vado pela remoção de dois átomos de hidrogênio do mesmo ou de dois átomos de carbono diferentes de um sistema de anel aromático precursor) e pode estar nas configurações orto, meta ou para, confor- me mostrado nas seguintes estruturas com fenila como o grupo arila exemplificativo.
AR Ot EO FO
[00122] Grupos "-(C1:-Cg alquileno)arila", "-(C2>-Cg alquenileno)arila" e "-(C2-Cg alquinileno)arila" incluem, porém sem limitações, benzila, 2- feniletan-1-ila, 2-fenileten-1-ila, = naftilmetila, 2-naftiletan-1-ila, 2- naftileten-1-ila, naftobenzila, 2-naftofeniletan-1-ila e assim por diante.
[00123] Salvo indicação em contrário, o termo "heterociclo" refere- se a um sistema de anel monocíclico, bicíclico ou policíclico que tem a partir de 3 a 14 átomos no anel (também denominados como elemen- tos do anel) em que pelo menos um átomo no anel em pelo menos um anel é um heteroátomo selecionado a partir de N, O, P ou S (e todas as combinações e subcombinações de faixas e números específicos de átomos de carbono e heteroátomos nos mesmos). O heterociclo pode ter a partir de 1 a 4 heteroátomos no anel independentemente selecionados a partir de N, O, P ou S. Um ou mais átomos de N, C ou S em um heterociclo podem ser oxidados. Um heterociclo monocíclico tem, de preferência, 3 a 7 elementos no anel (por exemplo, 2 a 6 áto- mos de carbono e 1 a 3 heteroátomos selecionados independente- mente a partir de N, O, P ou S), e um heterociclo bicíclico tem, de pre- ferência, 5 a 10 elementos no anel (por exemplo, 4 a 9 átomos de car- bono e 1 a 3 heteroátomos selecionados independentemente a partir de N, O, Pou S). O anel que inclui o heteroátomo pode ser aromático ou não aromático. Salvo indicação em contrário, o heterociclo está li- gado ao seu grupo pendente em qualquer heteroátomo ou átomo de carbono que resulte em uma estrutura estável. Heterociclos são des- critos em Paquette, "Principies of Modern Heterocyclic Chemistry" (W.A. Benjamin, New York, 1968), particularmente os Capítulos 1,3, 4, 6,7 e 9; "The Chemistry of Heterocyclic Compounds, A series of Mo- nographs" (John Wiley & Sons, New York, 1950 até o presente), em particular os volumes 13, 14, 16, 19 e 28; e J.
Am.
Chem.
Soc. 82: 5566 (1960). Exemplos de grupos "heterocíclicos" incluem, a título de exemplo e não limitação, piridila, di-hidropiridila, tetra-hidropiridila (pi- peridila), tiazolila, pirimidinila, furanila, tienila, pirrolila, pirazolila, imi- dazolila, tetrazolila, benzofuranila, tianaftalenila, indolila, indolenila, quinolinila, isoquinolinila, benzimidazolila, piperidinila, 4-piperidonila, pirrolidinila, 2-pirrolidonila, pirrolinila, tetra-hidrofuranila, bis-tetra-hidro- furanila, tetra-hidropiranila, bis-tetra-hidropiranila, tetra-hidroquinolinila, tetra-hidroisoquinolinila, deca-hidroquinolinila, octa-hidroisoquinolinila, azocinila, triazinila, 6H-1,2,5-tiadiazinila, 2H,6H-1,5,2-ditiazinila, tienila, tiantrenila, piranila, isobenzofuranila, cromenila, xantenila, fenoxatinila, 2H-pirrolila, isotiazolila, isoxazolila, pirazinila, piridazinila, indolizinila, isoindolila, 3H-indolila, 1H-indazolila, purinila, 4H-quinolizinila, ftalazini- la, naftiridinila, quinoxalinila, quinazolinila, cinolinila, pteridinila, 4H- carbazolila, carbazolila, B-carbolinila, fenanthridinila, acridinila, pirimi- dinila, fenantrolinila, fenazinila, fenotiazinila, furazanila, fenoxazinila, isocromanila, cromanila, imidazolidinila, imidazolinila, pirazolidinila, pi- razolinila, piperazinila, indolinila, isoindolinila, quinuclidinila, morpholini- la, oxazolidinila, benzotriazolila, benzisoxazolila, oxindolila, benzoxazo- linila e isatinoíla.
Grupos "heterociclo" preferidos incluem, porém sem limitações, benzofuranila, benzotiofenila, indolila, benzopirazolila, cu- marinila, isoquinolinila, pirrolila, tiofenila, furanila, tiazolila, imidazolila, pirazolila, triazolila, quinolinila, pirimidinila, piridinila, piridonila, pirazini- la, piridazinila, isotiazolila, isoxazolila e tetrazolila.
Um grupo heteroci- clo, seja individualmente ou como parte de outro grupo, podem ser op- cionalmente substituídos por um ou mais grupos, de preferência 1 a 2 grupos incluindo, porém sem limitações, -C1-Cg alquila, -C2-Cg alqueni- la, -C2-Cg alquinila, -halogênio, -O-(C1-Cg alquila), -O-(C2-Cg alquenila), -O-(C2-C;g alquinila), -arila, -C(O)R', -OC(O)R', -C(O0)OR', -C(O)NH>, - C(O)NHR', -C(O)N(R')a, -NHC(OJ)R', -SR', -SO3R', -S(O)2R', -S(OJ)R', -
OH, -N3 , -NH>2, -NH(R'), -N(R')2 e -CN, onde cada R' é independente- mente selecionado a partir de -H, -C1-Cg alquila, -C2-Cs alquenila, -C2- Cz alquinila ou -arila e em que os ditos grupos -O-(C1-C;s alquila), -O- (C2-Cg alquenila), -O-(C2-Cs alquinila), -C1-Cs alquila, -C2-Cg alquenila, -C2-Cg alquinila e -arila podem ser opcionalmente ainda substituídos por um ou mais substituintes incluindo, porém sem limitações, -C1-Csg alquila, -C2-Cg alquenila, -C2-Cg alquinila, -halogênio, -O-(C1-Cs alqui- la), -O-(C2-Cs8 alquenila), -O-(C2-Ca alquinila), -arila, -C(O)R", -OC(O) R", -C(O0)JOR", -C(O)NH2 , -C(O)NHR", -C(O)N(R")2, -NHC(O)R", -SR", -SO3R", -S(O)2R", -S(O)R", -OH, -N3 , -NH2, -NH(R"), -N(R")2 e -CN, onde cada R" é independentemente selecionado a partir de -H, -C1-Cs alquila, -C2-Cg alquenila, -C2-Cg alquinila ou arila.
[00124] A título de exemplo e não de limitação, os heterociclos com ligações de carbono podem ser ligados nas seguintes posições: posi- ção 2, 3, 4, 5 ou 6 de uma piridina; posição 3, 4, 5 ou 6 de uma pirida- zina; posição 2, 4, 5 ou 6 de uma pirimidina; posição 2, 3, 5 ou 6 de uma pirazina; posição 2, 3, 4 ou 5 de um furano, tetra-hidrofurano, tio- furano, tiofeno, pirrol ou tetra-hidropirrol; posição 2, 4 ou 5 de um oxa- zol, imidazol ou tiazol; posição 3, 4 ou 5 de um isoxazol, pirazol ou iso- tiazol; posição 2 ou 3 de uma aziridina; posição 2, 3 ou 4 de uma aze- tidina; posição 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 de uma quinolina; ou posição 1,3, 4, 5,6, 7 ou 8 de uma isoquinolina. Ainda mais tipicamente, os hetero- ciclos ligados a carbono incluem 2-piridila, 3-piridila, 4-piridila, 5-piri- dila, 6-piridila, 3-piridazinila, 4-piridazinila, 5-piridazinila, 6-piridazinila, 2-pirimidinila, 4- pirimidinila, 5-pirimidinila, 6-pirimidinila, 2-pirazinila, 3- pirazinila, 5-pirazinila, 6-pirazinila, 2-tiazolila, 4-tiazolila ou 5-tiazolila.
[00125] A título de exemplo e não de limitação, os heterociclos liga- dos a nitrogênio podem ser ligados na posição 1 de uma aziridina, azetidina, pirrol, pirrolidina, 2-pirrolina, 3-pirrolina, imidazol, imidazoli- dina, 2-imidazolina, 3-imidazolina, pirazol, pirazolina, 2-pirazolina, 3-
pirazolina, piperidina, piperazina, indol, indolina ou 1H-indazol; posição 2 de um isoindol ou isoindolina; posição 4 de uma morfolina; e a posi- ção 9 de um carbazol ou B-carbolina. Ainda mais tipicamente, os hete- rociclos ligados por nitrogênio incluem 1-aziridila, 1-azetedila, 1-pirro- lila, 1-imidazolila, 1 pirazolila e 1-piperidinila.
[00126] Salvo indicação em contrário, o termo "carbociclo" refere-se a um sistema de anel não aromático saturado ou insaturado, monocí- clico, bicíclico ou policíclico que tem 3 a 14 átomos no anel (e todas as combinações e subcombinações de faixas e números específicos de carbono átomos no mesmo) em que todos os átomos do anel são átomos de carbono. Os carbociclos monocíclicos têm, de preferência, 3 a 6 átomos no anel, ainda mais preferivelmente 5 ou 6 átomos no anel. Carbociclos bicíclicos têm, de preferência, 7 a 12 átomos no anel, por exemplo, posicionados como um sistema [4,5], [5,5], [5,6] ou [6,6] bicíclico, ou 9 ou 10 átomos no anel posicionados como um sis- tema [5,6] ou [6,6] bicíclico. O termo "carbociclo" inclui, por exemplo, um anel carbociclo monocíclico fundido a um anel de arila (por exem- plo, um anel carbociclo monocíclico fundido a um anel de benzeno). Os carbociclos têm, de preferência, 3 a 8 átomos de carbono no anel. Grupos carbociclo, seja individualmente ou como parte de outro grupo, podes ser opcionalmente substituídos, por exemplo, por um ou mais grupos, de preferência 1 ou 2 grupos (e quaisquer substituintes adicio- nais selecionados a partir de halogênio), incluindo, porém sem limita- ções, -halogênio, -C1-Cg alquila, -C2-Cg alquenila, -C2-Cg alquinila, -O- (C1-Cg alquila), -O-(C2-Cs alquenila), -O-(C2-Cs alquinila), -arila, -C(O) R', -OC(O)R', -C(O0)OR', -C(O)NH2 , -C(O)NHR', -C(O)N(R')2, -NHC(O) R', -SR', -SO3R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, =O, -N3, -NH2, -NH(R'), - N(R')2 e -CN, onde cada R' é independentemente selecionado a partir de -H, -C1-Cs alquila, -C2-Cs alquenila, -C2-Cs alquinila ou -arila e em que os ditos grupos -C1-C;g alquila, -C2-Cg alquenila, -C2-Cs alquinila, -
O-(C1-Cg alquila), -O-(C2-Cg alquenila), -O-(C2-Cg alquinila), e -arila po- dem ser opcionalmente ainda substituídos por um ou mais substituin- tes incluindo, porém sem limitações, -C1-Cs alquila, -C2-Cg alquenila, - C2-C; alquinila, -halogênio, -O-(C1-Cs alquila), -O-(C2-C;a alquenila), -O- (C2-Cg alquinila), -arila, -C(O)R", -OC(O)R", -C(O0)OR", -C(O)NH2 , - C(O)NHR", -C(O)N(R")2, -NHC(OJ)R", -SR", -SO3R", -S(O)2R", -S(O)R", -OH, -N3 , -NH>2, -NH(R"), -N(R")2 e -CN, onde cada R" é independen- temente selecionado a partir de -H, -C1-C;g alquila, -C2-Csg alquenila, - C2-Cg alquinila ou -arila.
[00127] Exemplos de substituintes carbocíclicos monocíclicos inclu- em -ciclopropila, -ciclobutila, -ciclopentila, -1-ciclopent-1-enila, -1-ciclo- pent-2-enila, -1-ciclopent-3-enila, ciclo-hexila, -1-ciclo-hex-1-enila, -1- ciclo-hex-2-enila, -1-ciclo-hex-3-enila, -ciclo-heptila, -ciclo-octila-,1,3- ciclo-hexadienila, -1,4-ciclo-hexadienila, -1,3-ciclo-heptadienila, -1,3,5- ciclo-heptatrienila e -ciclo-octadienila.
[00128] Um "carbociclo", seja usado individualmente ou como parte de outro grupo, refere-se a um grupo carbociclo opcionalmente substi- tuído, conforme definido acima, o qual é divalente (isto é, derivado pe- la remoção de dois átomos de hidrogênio do mesmo ou de dois áto- mos de carbono diferentes de um sistema de anel carbocíclico precur- sor).
[00129] Salvo indicação em contrário pelo contexto, um hífen (-) de- signa o ponto de ligação à molécula pendente. Consequentemente, o termo "-(C1-Cg alquileno)arila" ou ""-C1-Cg alquileno(arila)" refere-se a um radical C1-Cg alquileno conforme definido no presente documento, em que o radical alquileno está ligado à molécula pendente em qual- quer um dos átomos de carbono do radical alquileno e um dos átomos de hidrogênio ligados a um átomo de carbono do radical alquileno são substituídos por um radical arila, conforme definido no presente docu- mento.
[00130] “Quando um determinado grupo é "substituído", este grupo pode ter um ou mais substituintes, de preferência de um a cinco subs- tituintes, mais preferivelmente um a três substituintes, ainda mais pre- ferivelmente um a dois substituintes, independentemente selecionados da lista de substituintes. O grupo pode, no entanto, em geral ter qual- quer número de substituintes selecionados a partir de halogênio. Gru- pos substituídos são assim indicados. Pretende-se que a definição de qualquer substituinte ou variável em um determinado local em uma molécula seja independente de suas definições em outras partes desta molécula. Deve ser entendido que substituintes e padrões de substitui- ção nos compostos da presente invenção podem ser selecionados por aqueles versados na técnica para fornecer compostos que são quimi- camente estáveis e que podem ser prontamente sintetizados por meio de métodos conhecidos na técnica, bem como aqueles métodos defi- nidos apresentados no presente documento.
[00131] Grupos de proteção, conforme usado no presente docu- mento, refere-se a grupos que bloqueiam seletivamente, seja temporá- ria ou permanentemente, um local reativo em um composto multifunci- onal. Grupos de proteção de hidróxi adequados para uso na presente invenção são farmaceuticamente aceitáveis e podem ou não precisar ser clivados do composto original após administração a um indivíduo para que o composto seja ativo. A clivagem ocorre por meio de pro- cessos metabólicos normais dentro do corpo. Grupos de proteção de hidróxi são bem conhecidos na técnica, consulte Protective Groups in Organic Synthesis de T.W. Greene e P.G.M. Wuts (John Wiley & sons, 3º edição) incorporado ao presente documento a título de referência na íntegra e para todas as finalidades e incluem, por exemplo, grupos de proteção de éter (por exemplo, éteres alquílicos e éteres silílicos incluin- do, por exemplo, éter dialquilsilílico, éter trialquilsilílico, éter dialquilalco- xissilílico), éster, carbonato, carbamatos, sulfonato e fosfato. Exemplos de grupos de proteção de hidróxi incluem, porém sem limitações, éter metílico; éter metoximetílico, éter metiltiometílico, éter (fenildimetilsi- li)]metoximetílico, éter benziloximetílico, éter p-metoxibenziloximetílico, éter p-nitrobenziloximetílico, éter o-nitrobenziloximetílico, éter (4-meto- xifenoxi)metílico, éter guaiacolmetílico-pentilenometílico,, éter siloxime- tílico, éter 2-metoxietoximetílico, éter 2,2,2-tricloroetoximetílico, éter bis(2-cloroetoxi)metílico, éter 2- (trimetilsilil)etoximetílico, éter mento- ximetílico, éter tetra-hidropiranílico, éter 1-metoxiciclo-hexílico, éter 4- metoxitetra-hidrotiopiranílico, S,S-dióxido de éter 4 metoxitetra-hidroti- opiranílico, éter 1-[(2-cloro-4-metil)fenil]-4-metoxipiperidin-4-ílico, éter 1-(2-fluorofenil)-4-metoxipiperidin-4-ílico, éter 1,4-dioxan-2-ílico, éter tetra-hidrofuranílico, éter tetra-hidrotiofuranílico; éteres etílicos substi- tuídos, tais como éter 1-etoxietílico, éter 1-(2-cloroetoxi)etílico, éter 1- [2-(trimetilsilil )etóxiletílico, éter 1-metil-1-metoxietílico, éter 1-metil-1- benziloxietílico, éter 1-metil-1-benzilóxi-2-fluoroetílico, éter 1-metil-1- fenoxietílico, éter 2-trimetilsilílico, éter t-butílico, éter alílico, éteres pro- pargílicos, éter p-clorofenílico, éter p-metoxifenílico, éter benzílico, éter p-metoxibenzílico, éter 3,4-dimetoxibenzílico, éter trimetilsilílico, éter trietilsilílico, éter tripropilsilílico, éter dimetilisopropilsilílico, éter dietili- sopropilsilílico, éter dimetil-hexilsilílico, éter t-butildimetilsilílico, éter di- fenilmetilsilílico, éster formato de benzoíla, éster etílico, éster cloroace- tato, éster dicloroacetato, éster tricloroacetato, éster trifluoroacetato, éster metoxiacetato, éster trifluoroilmetoxiacetato, éster fenilacetato, éster benzoato, carbonato de alquil metila, carbonato de alquil 9- fluorenilmetila, carbonato de alquil etila, carbonato de alquil 2,2,2- tricloroetila, carbonato de 1,1-dimetil-2,2,2-tricloroetila, alquilsulfonato, metanossulfonato, benzilsulfonato, tosilato, metileno acetal, etilideno acetal e t-butilmetilideno cetal.
Os grupos de proteção preferidos são representados pelas fórmulas -R?, -Si(Rº)(Rº)(R3), -C(O)R?, -C(O0)OR?, -C(O)NH(Rº?), -S(O)2Rº, -S(0)2OH, P(O)(OH)2, e -P(O)(OH)ORº, em que Rº é C1-C20 alquila, C2-C20 alquenila, C2-C20 alquinila, -C1-Ca20 al- quileno(carbociclo), -C2-C205 alquenileno(carbociclo), -C2-C20 alquinileno (carbociclo), -Cs-C10 arila, -C1-C20 alquileno(arila), -C2-C209 alquenileno (arila), -C2-C20 alquinileno(arila), -C1-C20 alquileno(heterociclo), -C2-C20 alquenileno(heterociclo) ou -C2-C20o alquinileno(heterociclo), em que ditos radicais alquila, alquenila, alquinila, alquileno, alquenileno, al- quinileno, arila, carbociclo e heterociclo, seja individualmente ou como parte de outro grupo, são opcionalmente substituídos.
[00132] O termo "quantidade eficaz" ou "quantidade terapeutica- mente eficaz", conforme usado no presente documento, refere-se à quantidade de molécula de ligação (por exemplo, um anticorpo) ou composição farmacêutica fornecida no presente documento que é su- ficiente para resultar no resultado desejado.
[00133] Os termos "indivíduo" e "paciente" podem ser usados indistintamente. Conforme usado no presente documento, em determi- nadas modalidades, um indivíduo é um mamífero, tal como um não primata (por exemplo, vaca, porco, cavalo, gato, cachorro, rato, etc.) ou um primata (por exemplo, macaco e ser humano). Em modalidades específicas, o indivíduo é um ser humano. Em uma modalidade, o in- divíduo é um mamífero, por exemplo, um ser humano, diagnosticado com uma condição ou transtorno. Em outra modalidade, o indivíduo é um mamífero, por exemplo, um ser humano, em risco de desenvolver uma condição ou transtorno.
[00134] "Administrar" ou "administração" refere-se ao ato de injetar ou de outra forma distribuir fisicamente uma substância como ela exis- te fora do corpo em um paciente, tal como através da via mucosal, in- tradérmica, intravenosa, intramuscular e/ou qualquer outro método de distribuição física descrita no presente documento ou conhecida na técnica.
[00135] “Conforme usado no presente documento, os termos "tra-
tar", "tratamento" e "tratando" referem-se à redução ou melhora da progressão, gravidade e/ou duração de uma doença ou condição re- sultante da administração de uma ou mais terapias. O tratamento pode ser determinado ao avaliar se houve uma diminuição, alívio e/ou miti- gação de um ou mais sintomas associados ao transtorno subjacente, de modo que uma melhora seja observada com o paciente, apesar do paciente ainda poder estar sofrendo do transtorno subjacente. O termo "tratar" inclui tanto o manejo quanto a melhora da doença. Os termos "administrar", "administração" e "administrando" referem-se aos efeitos benéficos que um indivíduo deriva de uma terapia que não resulta ne- cessariamente na cura da doença.
[00136] Os termos "prevenir", "prevenção" e "prevenindo" referem- se à redução da probabilidade do início (ou recorrência) de uma doen- ça, transtorno, condição ou sintoma(s) associado(s) (por exemplo, um câncer).
[00137] O termo "câncer" ou "célula cancerosa" é usado no presen- te documento para denotar um tecido ou célula encontrada em um ne- oplasma que possui características que o diferenciam do tecido normal ou células de tecido. Dentre estas características incluem, porém sem limitações: grau de anaplasia, irregularidade no formato, indistinção do contorno celular, tamanho do núcleo, mudanças na estrutura do núcleo ou citoplasma, outras alterações fenotípicas, presença de proteínas celulares indicativas de uma doença cancerosa ou pré-cancerosa, au- mento do número de mitoses e capacidade de metástase. Palavras pertencentes a "câncer" incluem carcinoma, sarcoma, tumor, epitelio- ma, leucemia, linfoma, pólipo e esporo, transformação, neoplasia e assim por diante.
[00138] Os termos "cerca de" e "aproximadamente" significam den- tro de 20 %, dentro de 15 %, dentro de 10 %, dentro de 9 %, dentro de 8 %, dentro de 7 %, dentro de 6 %, dentro de 5 %, dentro de 4 %, den-
tro 3 %, dentro de 2 %, dentro de 1 % ou menos de um determinado valor ou faixa.
[00139] Conforme usado na presente invenção e nas reivindica- ções, as formas no singular "um", "uma" e "o/a" incluem formas no plu- ral, a menos que o contexto dite claramente o contrário.
[00140] Deve ser entendido que sempre que modalidades são des- critas no presente documento com o termo "que compreende(m)", mo- dalidades análogas descritas em termos de "que consiste(m) em" e/ou "que consiste(m) essencialmente em" também são fornecidas. Tam- bém deve ser entendido que sempre que modalidades são descritas no presente documento com a frase "que consiste(m) essencialmente em" modalidades análogas descritas em termos de "que consiste(m) em" também são fornecidas.
[00141] O termo "e/ou", conforme usado em uma frase como "A e/ou B" no presente documento, se destina a incluir Ae B/ AouB; À (apenas); e B (apenas). Da mesma forma, o termo "e/ou", conforme usado em uma frase como "A, B e/ou C", se destina a abranger cada uma das seguintes modalidades: A, B e C; A, Bou C; Aou C; A ou B; BouC;AeC;AeB;BeC;A (apenas); B (apenas); e C (apenas).
5.2 Composições Farmacêuticas
[00142] Em um aspecto, são fornecidas no presente documento "composições farmacêuticas" que incluem um conjugado de anticorpo- fármaco fornecido no presente documento e um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis ou fisiologicamente aceitáveis. Em de- terminadas modalidades, o conjugado de anticorpo-fármaco é forneci- do em combinação com, ou separado de, um ou mais agentes adicio- nais. Também é fornecida uma composição que compreende um ou mais agentes adicionais e um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis ou fisiologicamente aceitáveis. Em modalidades particula- res, o conjugado de anticorpo-fármaco e (um) agente(s) adicional(is)
estão presentes em uma quantidade terapeuticamente aceitável. As composições farmacêuticas podem ser usadas de acordo com os mé- todos e usos fornecidos no presente documento. Assim, por exemplo, as composições farmacêuticas podem ser administradas ex vivo ou in vivo a um indivíduo, a fim de praticar métodos de tratamento e usos fornecidos no presente documento. As composições farmacêuticas fornecidas no presente documento podem ser formuladas para serem compatíveis com o método ou via de administração pretendida; vias de administração exemplificativas são apresentadas no presente docu- mento.
[00143] Em algumas modalidades, são fornecidas composições farmacêuticas de conjugados de anticorpo-fármaco que modulam um câncer ou tumor.
[00144] Em alguns aspectos, as composições farmacêuticas podem compreender ainda outros agentes ou compostos terapeuticamente ativos descritos no presente documento ou conhecidos por aqueles versados na técnica que podem ser usados no tratamento ou preven- ção de várias doenças e transtornos, conforme apresentado no pre- sente documento (por exemplo, um câncer). Conforme afirmado aci- ma, agentes ou compostos terapeuticamente ativos adicionais podem estar presentes em (uma) composição(ões) farmacêutica(s) separa- da(s).
[00145] “Composições farmacêuticas, tipicamente, compreendem uma quantidade terapeuticamente eficaz de pelo menos um dos con- jugados de anticorpo-fármaco fornecidos no presente documento e um ou mais agentes de formulação farmaceuticamente aceitáveis. Em de- terminadas modalidades, a composição farmacêutica compreende ainda um ou mais agentes adicionais descritos no presente documen- to.
[00146] Em uma modalidade, uma composição farmacêutica com-
preende um conjugado de anticorpo-fármaco fornecido no presente documento. Em algumas modalidades, uma composição farmacêutica compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz de um conjuga- do de anticorpo-fármaco fornecido no presente documento. Em deter- minadas modalidades, a composição farmacêutica compreende um excipiente farmaceuticamente aceitável.
[00147] Em algumas modalidades, o conjugado de anticorpo- fármaco na composição farmacêutica fornecida no presente documen- to é selecionado a partir dos conjugados anticorpo-fármaco descritos na Seção 5.3 abaixo.
[00148] Em determinadas modalidades, a composição farmacêutica compreende o conjugado de anticorpo-fármaco em uma concentração de a partir 0,1 -100 mg/mL. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica compreende o conjugado de anticorpo-fármaco em uma concentração a partir de 1 a 20 mg/mL. Em outras modalidades, a composição farmacêutica compreende o conjugado de anticorpo- fármaco em uma concentração a partir de 5 a 15 mg/mL. Em outras modalidades, a composição farmacêutica compreende o conjugado de anticorpo-fármaco em uma concentração a partir de 8 a 12 mg/mL. Em outras modalidades, a composição farmacêutica compreende o conju- gado de anticorpo-fármaco em uma concentração a partir de 9 a 11 mg/mL. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica com- preende o conjugado de anticorpo-fármaco em uma concentração de cerca de 9,5 mg/mL. Em algumas modalidades, a composição farma- cêutica compreende o conjugado de anticorpo-fármaco em uma con- centração de cerca de 9,6 mg/mL. Em algumas modalidades, a com- posição farmacêutica compreende o conjugado de anticorpo-fármaco em uma concentração de cerca de 9,7 mg/mL. Em algumas modalida- des, a composição farmacêutica compreende o conjugado de anticor- po-fármaco em uma concentração de cerca de 9,8 mg/mL. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica compreende o conjugado de anticorpo-fármaco em uma concentração de cerca de 9,9 mg/mL. Em ainda outras modalidades, a composição farmacêutica compreende o conjugado de anticorpo-fármaco em uma concentração de cerca de 10 mg/mL. Em ainda outras modalidades, a composição farmacêutica compreende o conjugado de anticorpo-fármaco em uma concentração de cerca de 10,1 mg/mL. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica compreende o conjugado de anticorpo-fármaco em uma concentração de cerca de 10,2 mg/mL. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica compreende o conjugado de anticorpo- fármaco em uma concentração de cerca de 10,3 mg/mL. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica compreende o conjugado de anticorpo-fármaco em uma concentração de cerca de 10,3 mg/mL. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica compreende o con- jugado de anticorpo-fármaco em uma concentração de cerca de 10,4 mg/mL. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica com- preende o conjugado de anticorpo-fármaco em uma concentração de cerca de 10,5 mg/mL.
[00149] Em algumas modalidades, a composição farmacêutica for- necida no presente documento compreende L-histidina, TWEEN-20 e pelo menos um de trealose di-hidratada ou sacarose. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica fornecida no presente do- cumento compreende ainda ácido clorídrico (HCl) ou ácido succínico.
[00150] Em algumas modalidades, a concentração de L-histidina útil nas composições farmacêuticas fornecidas no presente documento está na faixa a partir de entre 5 e 50 mM. Em algumas modalidades, a concentração de L-histidina nas composições farmacêuticas forneci- das no presente documentos está na faixa a partir de entre 10 e 40 mM. Em algumas modalidades, a concentração de L-histidina nas composições farmacêuticas fornecidas no presente documentos está na faixa a partir de entre 15 e 35 mM.
[00151] Em algumas modalidades, a concentração de L-histidina nas composições farmacêuticas fornecidas no presente documentos está na faixa a partir de 15 a 30 MM. Em algumas modalidades, a con- centração de L-histidina nas composições farmacêuticas fornecidas no presente documentos está na faixa a partir de entre 15 e 25 MM. Em algumas modalidades, a concentração de L-histidina nas composições farmacêuticas fornecidas no presente documentos está na faixa a par- tir de entre 15 e 35 mM. Em algumas modalidades, a concentração de L-histidina nas composições farmacêuticas fornecidas no presente do- cumentos é de cerca de 16 mM. Em algumas modalidades, a concen- tração de L-histidina nas composições farmacêuticas fornecidas no presente documentos é de cerca de 17 mM. Em algumas modalida- des, a concentração de L-histidina nas composições farmacêuticas fornecidas no presente documentos é de cerca de 18 mM. Em algu- mas modalidades, a concentração de L-histidina nas composições farmacêuticas fornecidas no presente documentos é de cerca de 19 mM. Em algumas modalidades, a concentração de L-histidina nas composições farmacêuticas fornecidas no presente documentos é de cerca de 20 mM. Em algumas modalidades, a concentração de L- histidina nas composições farmacêuticas fornecidas no presente do- cumento é de cerca de 21 mM. Em algumas modalidades, a concen- tração de L-histidina nas composições farmacêuticas fornecidas no presente documentos é de cerca de 22 mM. Em algumas modalida- des, a concentração de L-histidina nas composições farmacêuticas fornecidas no presente documentos é de cerca de 23 mM. Em algu- mas modalidades, a concentração de L-histidina nas composições farmacêuticas fornecidas no presente documentos é de cerca de 24 mM. Em algumas modalidades, a concentração de L-histidina nas composições farmacêuticas fornecidas no presente documentos é de cerca de 25 mM.
[00152] Em algumas modalidades, a concentração de TWEEN-20 útil nas composições farmacêuticas fornecidas no presente documen- tos está na faixa a partir de 0,001 a 0,1 % (v/v). Em outra modalidade, a concentração de TWEEN-20 está na faixa a partir de 0,0025 a 0,075 % (v/v). Em uma modalidade, a concentração de TWEEN-20 está na faixa a partir de 0,005 a 0,05 % (v/v). Em outra modalidade, a concen- tração de TWEEN-20 está na faixa a partir de 0,0075 a 0,025 % (v/v). Em outra modalidade, a concentração de TWEEN-20 está na faixa a partir de 0,0075 a 0,05 % (v/v). Em outra modalidade, a concentração de TWEEN-20 está na faixa a partir de 0,01 a 0,03 % (v/v). Em uma modalidade particular, a concentração de TWEEN-20 é de cerca de 0,01 % (v/v). Em uma modalidade particular, a concentração de TWEEN-20 é de cerca de 0,015 % (v/v). Em uma modalidade particu- lar, a concentração de TWEEN-20 é de cerca de 0,016 % (v/v). Em uma modalidade particular, a concentração de TWEEN-20 é de cerca de 0,017 % (v/v). Em uma modalidade particular, a concentração de TWEEN-20 é de cerca de 0,018 % (v/v). Em uma modalidade particu- lar, a concentração de TWEEN-20 é de cerca de 0,019 % (v/v). Em uma modalidade particular, a concentração de TWEEN-20 é de cerca de 0,02 % (v/v). Em uma modalidade particular, a concentração de TWEEN-20 é de cerca de 0,021 % (v/v). Em uma modalidade particu- lar, a concentração de TWEEN-20 é de cerca de 0,022 % (v/v). Em uma modalidade particular, a concentração de TWEEN-20 é de cerca de 0,023 % (v/v). Em uma modalidade particular, a concentração de TWEEN-20 é de cerca de 0,024 % (v/v). Em uma modalidade particu- lar, a concentração de TWEEN-20 é de cerca de 0,025 % (v/v).
[001583] Em uma modalidade, a concentração de trealose di- hidratada útil nas composições farmacêuticas fornecidas no presente documento está na faixa a partir de entre 1 % e 20 % (p/v). Em outra modalidade, a concentração de trealose di-hidratada está na faixa a partir de 2 % e 15 % (p/v). Em uma modalidade, a concentração de trealose di-hidratada está na faixa a partir de 3 % e 10 % (p/v). Em ou- tra modalidade, a concentração de trealose di-hidratada está na faixa a partir de 4 % e 9 % (p/v). Em outra modalidade, a concentração de trealose di-hidratada está na faixa a partir de 4 % e 8 % (p/v). Em outra modalidade, a concentração de trealose di-hidratada está na faixa a partir de 4 % e 7 % (p/v). Em outra modalidade, a concentração de trealose di-hidratada está na faixa a partir de 4 % e 6 % (p/v). Em outra modalidade, a concentração de trealose di-hidratada está na faixa a partir de 4,5 % e 6 % (p/v). Em outra modalidade, a concentração de trealose di-hidratada é de cerca de 4,6 % (p/v). Em outra modalidade, a concentração de trealose di-hidratada é de cerca de 4,7 % (p/v). Em outra modalidade, a concentração de trealose di-hidratada é de cerca de 4,8 % (p/v). Em outra modalidade, a concentração de trealose di- hidratada é de cerca de 4,9 % (p/v). Em outra modalidade, a concen- tração de trealose di-hidratada é de cerca de 5,0 % (p/v). Em outra modalidade, a concentração de trealose di-hidratada é de cerca de 5,1 % (p/v). Em outra modalidade, a concentração de trealose di-hidratada é de cerca de 5,2 % (p/v). Em outra modalidade, a concentração de trealose di-hidratada é de cerca de 5,3 % (p/v). Em outra modalidade, a concentração de trealose di-hidratada é de cerca de 5,4 % (p/v). Em outra modalidade, a concentração de trealose di-hidratada é de cerca de 5,5 % (p/v). Em outra modalidade, a concentração de trealose di- hidratada é de cerca de 5,6 % (p/v). Em outra modalidade, a concen- tração de trealose di-hidratada é de cerca de 5,7 % (p/v). Em outra modalidade, a concentração de trealose di-hidratada é de cerca de 5,8 % (p/v). Em outra modalidade, a concentração de trealose di-hidratada é de cerca de 5,9 % (p/v). Em outra modalidade, a concentração de trealose di-hidratada é de cerca de 6,0 % (p/v). Em outra modalidade,
a concentração de trealose di-hidratada é de cerca de 6,1 % (p/v). Em outra modalidade, a concentração de trealose di-hidratada é de cerca de 6,2 % (p/v). Em outra modalidade, a concentração de trealose di- hidratada é de cerca de 6,3 % (p/v). Em outra modalidade, a concen- tração de trealose di-hidratada é de cerca de 6,4 % (p/v). Em outra modalidade, a concentração de trealose di-hidratada é de cerca de 6,5 % (p/v).
[00154] Em determinadas modalidades, a molaridade do trealose di-hidratada é de 50 a 300 mM. Em outras modalidades, a molaridade da trealose di-hidratada é de 75 a 250 mM. Em algumas modalidades, a molaridade do trealose di-hidratada é de 100 a 200 mM. Em outras modalidades, a molaridade do trealose di-hidratada é de 130 a 150 mM. Em algumas modalidades, a molaridade do trealose di-hidratada é de 135 a 150 mM. Em determinadas modalidades, a molaridade do trealose di-hidratada é de cerca de 135 mM. Em determinadas modali- dades, a molaridade do trealose di-hidratada é de cerca de 136 mM. Em determinadas modalidades, a molaridade do trealose di-hidratada é de cerca de 137 mM. Em determinadas modalidades, a molaridade do trealose di-hidratada é de cerca de 138 mM. Em determinadas mo- dalidades, a molaridade do trealose di-hidratada é de cerca de 139 mM. Em determinadas modalidades, a molaridade do trealose di- hidratada é de cerca de 140 mM. Em determinadas modalidades, a molaridade do trealose di-hidratada é de cerca de 141 mM. Em deter- minadas modalidades, a molaridade do trealose di-hidratada é de cer- ca de 142 mM. Em determinadas modalidades, a molaridade do trea- lose di-hidratada é de cerca de 143 mM. Em determinadas modalida- des, a molaridade do trealose di-hidratada é de cerca de 144 mM. Em determinadas modalidades, a molaridade do trealose di-hidratada é de cerca de 145 mM. Em determinadas modalidades, a molaridade do trealose di-hidratada é de cerca de 146 mM. Em determinadas modali-
dades, a molaridade do trealose di-hidratada é de cerca de 150 mM. Em determinadas modalidades, a molaridade do trealose di-hidratada é de cerca de 151 mM. Em determinadas modalidades, a molaridade do trealose di-hidratada é de cerca de 151 mM. Em determinadas mo- dalidades, a molaridade do trealose di-hidratada é de cerca de 152 mM. Em determinadas modalidades, a molaridade do trealose di- hidratada é de cerca de 153 mM. Em determinadas modalidades, a molaridade do trealose di-hidratada é de cerca de 154 mM. Em deter- minadas modalidades, a molaridade do trealose di-hidratada é de cer- ca de 155 mM.
[00155] Em uma modalidade, a concentração de sacarose útil nas composições farmacêuticas fornecidas no presente documento está na faixa a partir de entre 1 % e 20 % (p/v). Em outra modalidade, a con- centração de sacarose está na faixa a partir de 2 % e 15 % (p/v). Em uma modalidade, a concentração de sacarose está na faixa a partir de 3 % e 10 % (p/v). Em outra modalidade, a concentração de sacarose está na faixa a partir de 4 % e 9 % (p/v). Em outra modalidade, a con- centração de sacarose está na faixa a partir de 4 % e 8 % (p/v). Em outra modalidade, a concentração de sacarose está na faixa a partir de 4 % e 7 % (p/v). Em outra modalidade, a concentração de sacarose está na faixa a partir de 4 % e 6 % (p/v). Em outra modalidade, a con- centração de sacarose está na faixa a partir de 4,5 % e 6 % (p/v). Em outra modalidade, a concentração de sacarose é de cerca de 4,6 % (p/v). Em outra modalidade, a concentração de sacarose é de cerca de 4,7 % (p/v). Em outra modalidade, a concentração de sacarose é de cerca de 4,8 % (p/v). Em outra modalidade, a concentração de sacaro- se é de cerca de 4,9 % (p/v). Em outra modalidade, a concentração de sacarose é de cerca de 5,0 % (p/v). Em outra modalidade, a concen- tração de sacarose é de cerca de 5,1 % (p/v). Em outra modalidade, a concentração de sacarose é de cerca de 5,2 % (p/v). Em outra modali-
dade, a concentração de sacarose é de cerca de 5,3 % (p/v). Em outra modalidade, a concentração de sacarose é de cerca de 5,4 % (p/v). Em outra modalidade, a concentração de sacarose é de cerca de 5,5 % (p/v). Em outra modalidade, a concentração de sacarose é de cerca de 5,6 % (p/v). Em outra modalidade, a concentração de sacarose é de cerca de 5,7 % (p/v). Em outra modalidade, a concentração de sa- carose é de cerca de 5,8 % (p/v). Em outra modalidade, a concentra- ção de sacarose é de cerca de 5,9 % (p/v). Em outra modalidade, a concentração de sacarose é de cerca de 6,0 % (p/v). Em outra modali- dade, a concentração de sacarose é de cerca de 6,1 % (p/v). Em outra modalidade, a concentração de sacarose é de cerca de 6,2 % (p/v). Em outra modalidade, a concentração de sacarose é de cerca de 6,3 % (p/v). Em outra modalidade, a concentração de sacarose é de cerca de 6,4 % (p/v). Em outra modalidade, a concentração de sacarose é de cerca de 6,5 % (p/v).
[00156] Em determinadas modalidades, a molaridade da sacarose é de 50 a 300 mM. Em outras modalidades, a molaridade da sacarose é de 75 a 250 mM. Em algumas modalidades, a molaridade da sacarose é de 100 a 200 mM. Em outras modalidades, a molaridade da sacaro- se é de 130 a 150 mM. Em algumas modalidades, a molaridade da sacarose é de 135 a 150 MM. Em determinadas modalidades, a mola- ridade da sacarose é de cerca de 135 mM. Em determinadas modali- dades, a molaridade da sacarose é de cerca de 136 mM. Em determi- nadas modalidades, a molaridade da sacarose é de cerca de 137 mM. Em determinadas modalidades, a molaridade da sacarose é de cerca de 138 mM. Em determinadas modalidades, a molaridade da sacarose é de cerca de 139 mM. Em determinadas modalidades, a molaridade da sacarose é de cerca de 140 mM. Em determinadas modalidades, a molaridade da sacarose é de cerca de 141 mM. Em determinadas mo- dalidades, a molaridade da sacarose é de cerca de 142 mM. Em de-
terminadas modalidades, a molaridade da sacarose é de cerca de 143 mM. Em determinadas modalidades, a molaridade da sacarose é de cerca de 144 mM. Em determinadas modalidades, a molaridade da sacarose é de cerca de 145 mM. Em determinadas modalidades, a molaridade da sacarose é de cerca de 146 mM. Em determinadas mo- dalidades, a molaridade da sacarose é de cerca de 150 mM. Em de- terminadas modalidades, a molaridade da sacarose é de cerca de 151 mM. Em determinadas modalidades, a molaridade da sacarose é de cerca de 151 mM. Em determinadas modalidades, a molaridade da sacarose é de cerca de 152 mM. Em determinadas modalidades, a molaridade da sacarose é de cerca de 153 mM. Em determinadas mo- dalidades, a molaridade da sacarose é de cerca de 154 mM. Em de- terminadas modalidades, a molaridade da sacarose é de cerca de 155 mM.
[00157] Em algumas modalidades, a composição farmacêutica for- necida no presente documento compreende HCl. Em outras modalida- des, a composição farmacêutica fornecida no presente documento compreende ácido succínico.
[00158] Em algumas modalidades, a composição farmacêutica for- necida no presente documento tem um pH na faixa a partir de 5,5 a 6,5. Em outras modalidades, a composição farmacêutica fornecida no presente documento tem um pH na faixa a partir de 5,7 a 6,3. Em al- gumas modalidades, a composição farmacêutica fornecida no presen- te documento tem um pH de cerca de 5,7. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica fornecida no presente documento tem um pH de cerca de 5,8. Em algumas modalidades, a composição farma- cêutica fornecida no presente documento tem um pH de cerca de 5,9. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica fornecida no presente documento tem um pH de cerca de 6,0. Em algumas modali- dades, a composição farmacêutica fornecida no presente documento tem um pH de cerca de 6,1. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica fornecida no presente documento tem um pH de cerca de 6,2. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica fornecida no presente documento tem um pH de cerca de 6,3.
[00159] Em algumas modalidades, o pH é medido em temperatura ambiente. Em outras modalidades, o pH é medido entre 15ºC e 27ºC. Em ainda outras modalidades, o pH é medido a 4ºC. Em ainda outras modalidades, o pH é medido a 25ºC.
[00160] Em algumas modalidades, o pH é ajustado por HCl. Em al- gumas modalidades, a composição farmacêutica compreende HCl e a composição farmacêutica tem um pH em uma faixa a partir de 5,5 a 6,5 em temperatura ambiente. Em algumas modalidades, a composi- ção farmacêutica compreende HCl e a composição farmacêutica tem um pH na faixa a partir de 5,7 a 6,3 em temperatura ambiente. Em al- gumas modalidades mais específicas, a composição farmacêutica compreende HCl e a composição farmacêutica tem um pH de cerca de 5,7 em temperatura ambiente. Em algumas modalidades mais especí- ficas, a composição farmacêutica compreende HCl e a composição farmacêutica tem um pH de cerca de 5,8 em temperatura ambiente. Em algumas modalidades mais específicas, a composição farmacêuti- ca compreende HCl e a composição farmacêutica tem um pH de cerca de 5,9 em temperatura ambiente. Em algumas modalidades mais es- pecíficas, a composição farmacêutica compreende HCl e a composi- ção farmacêutica tem um pH de cerca de 6,0 em temperatura ambien- te. Em algumas modalidades mais específicas, a composição farma- cêutica compreende HCl e a composição farmacêutica tem um pH de cerca de 6,1 em temperatura ambiente. Em algumas modalidades mais específicas, a composição farmacêutica compreende HCl e a composição farmacêutica tem um pH de cerca de 6,2 em temperatura ambiente. Em algumas modalidades mais específicas, a composição farmacêutica compreende HCl e a composição farmacêutica tem um pH de cerca de 6,3 em temperatura ambiente.
[00161] Em algumas modalidades, a composição farmacêutica compreende HCl e a composição farmacêutica tem um pH em uma faixa a partir de 5,5 a 6,5 a 15ºC a 27ºC. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica compreende HCl e a composição farmacêu- tica tem um pH em uma faixa a partir de 5,7 a 6,3 a 15ºC a 27ºC. Em algumas modalidades mais específicas, a composição farmacêutica compreende HCl e a composição farmacêutica tem um pH de cerca de 5,7 a 15ºC a 27ºC. Em algumas modalidades mais específicas, a composição farmacêutica compreende HCl e a composição farmacêu- tica tem um pH de cerca de 5,8 a 15ºC a 27ºC. Em algumas modalida- des mais específicas, a composição farmacêutica compreende HCl e a composição farmacêutica tem um pH de cerca de 5,9 a 15ºC a 27ºC. Em algumas modalidades mais específicas, a composição farmacêuti- ca compreende HCl e a composição farmacêutica tem um pH de cerca de 6,0 a 15ºC a 27ºC. Em algumas modalidades mais específicas, a composição farmacêutica compreende HCl e a composição farmacêu- tica tem um pH de cerca de 6,1 a 15ºC a 27ºC. Em algumas modalida- des mais específicas, a composição farmacêutica compreende HCl e a composição farmacêutica tem um pH de cerca de 6,2 a 15ºC a27ºC. Em algumas modalidades mais específicas, a composição farmacêuti- ca compreende HCl e a composição farmacêutica tem um pH de cerca de 6,3 a 15ºC a 27ºC.
[00162] Em algumas modalidades, o pH é ajustado por ácido succí- nico. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica compre- ende ácido succínico e a composição farmacêutica tem um pH na faixa a partir de 5,5 a 6,5 em temperatura ambiente. Em algumas modalida- des, a composição farmacêutica compreende ácido succínico e a composição farmacêutica tem um pH na faixa a partir de 5,7 a 6,38 em temperatura ambiente. Em algumas modalidades mais específicas, a composição farmacêutica compreende ácido succínico e a composição farmacêutica tem um pH de cerca de 5,7 em temperatura ambiente. Em algumas modalidades mais específicas, a composição farmacêuti- ca compreende ácido succínico e a composição farmacêutica tem um pH de cerca de 5,8 em temperatura ambiente. Em algumas modalida- des mais específicas, a composição farmacêutica compreende ácido succínico e a composição farmacêutica tem um pH de cerca de 5,9 em temperatura ambiente. Em algumas modalidades mais específicas, a composição farmacêutica compreende ácido succínico e a composição farmacêutica tem um pH de cerca de 6,0 em temperatura ambiente. Em algumas modalidades mais específicas, a composição farmacêuti- ca compreende ácido succínico e a composição farmacêutica tem um pH de cerca de 6,1 em temperatura ambiente. Em algumas modalida- des mais específicas, a composição farmacêutica compreende ácido succínico e a composição farmacêutica tem um pH de cerca de 6,2 em temperatura ambiente. Em algumas modalidades mais específicas, a composição farmacêutica compreende ácido succínico e a composição farmacêutica tem um pH de cerca de 6,3 em temperatura ambiente.
[00163] Em algumas modalidades, a composição farmacêutica compreende ácido succínico e a composição farmacêutica tem um pH em uma faixa a partir de 5,5 a 6,5 a 15ºC a 27ºC. Em algumas modali- dades, a composição farmacêutica compreende ácido succínico e a composição farmacêutica tem um pH na faixa a partir de 5,7 a 63 a 15ºC a 27ºC. Em algumas modalidades mais específicas, a composi- ção farmacêutica compreende ácido succínico e a composição farma- cêutica tem um pH de cerca de 5,7 a 15ºC a 27ºC. Em algumas moda- lidades mais específicas, a composição farmacêutica compreende áci- do succínico e a composição farmacêutica tem um pH de cerca de 5,8 a 15ºC a 27ºC. Em algumas modalidades mais específicas, a compo-
sição farmacêutica compreende ácido succínico e a composição far- macêutica tem um pH de cerca de 5,9 a 15ºC a 27ºC. Em algumas modalidades mais específicas, a composição farmacêutica compreen- de ácido succínico e a composição farmacêutica tem um pH de cerca de 6,0 a 15ºC a 27ºC. Em algumas modalidades mais específicas, a composição farmacêutica compreende ácido succínico e a composição farmacêutica tem um pH de cerca de 6,1 a 15ºC a 27ºC. Em algumas modalidades mais específicas, a composição farmacêutica compreen- de ácido succínico e a composição farmacêutica tem um pH de cerca de 6,2 a 15ºC a 27ºC. Em algumas modalidades mais específicas, a composição farmacêutica compreende ácido succínico e a composição farmacêutica tem um pH de cerca de 6,3 a 15ºC a 27ºC.
[00164] Em algumas modalidades específicas, a composição far- macêutica fornecida no presente documento compreende L-histidina a cerca de 20 mM, TWEEN-20 a cerca de 0,02 % (p/v) e pelo menos um de trealose di-hidratada a cerca de 5,5 % (p/v) ou sacarose a cerca de % (p/v). Em algumas modalidades, a composição farmacêutica for- necida no presente documento compreende ainda HCI ou ácido succí- nico. Em algumas modalidades, o pH é de cerca de 6,0 em temperatu- ra ambiente. Em algumas modalidades, o pH é de cerca de 6,0 a 25ºC.
[00165] Em algumas modalidades específicas, a composição far- macêutica fornecida no presente documento compreende L-histidina a cerca de 20 mM, TWEEN-20 a cerca de 0,02 % (p/v), trealose di- hidratada a cerca de 5,5 % (p/v) e HCl. Em algumas modalidades, o pH é de cerca de 6,0 em temperatura ambiente. Em algumas modali- dades, o pH é de cerca de 6,0 a 25ºC.
[00166] Em algumas modalidades, a composição farmacêutica for- necida no presente documento compreende L-histidina a cerca de 20 mM, TWEEN-20 a cerca de 0,02 % (p/v), sacarose a cerca de 5 %
(p/v) e HCl. Em algumas modalidades, o pH é de cerca de 6,0 em temperatura ambiente. Em algumas modalidades, o pH é de cerca de 6,0 a 25ºC.
[00167] Em outras modalidades específicas, a composição farma- cêutica fornecida no presente documento compreende L-histidina a cerca de 20 mM, TWEEN-20 a cerca de 0,02 % (p/v), trealose di- hidratada a cerca de 5,5 % (p/v) e ácido succínico. Em algumas moda- lidades, o pH é de cerca de 6,0 em temperatura ambiente. Em algu- mas modalidades, o pH é de cerca de 6,0 a 25ºC.
[00168] Em algumas modalidades específicas, a composição far- macêutica fornecida no presente documento compreende L-histidina a cerca de 20 mM, TWEEN-20 a cerca de 0,02 % (p/v), sacarose a cerca de 5 % (p/v) e ácido succínico. Em algumas modalidades, o pH é de cerca de 6,0 em temperatura ambiente. Em algumas modalidades, o pH é de cerca de 6,0 a 25ºC.
[00169] Em uma modalidade específica, fornecida no presente do- cumento compreende: (a) um conjugado de anticorpo-fármaco que compreende a seguinte estrutura: o H eo Nr.) | Omo — oco “o = '
NH em que L- representa o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo e p é a partir de 1a 10; e (b) um excipiente farmaceuticamente aceitável que compreende L- histidina a cerca de 20 mM, TWEEN-20 a cerca de 0,02 % (p/v), trea- lose di-hidratada a cerca de 5,5 % (p/v) e HCl, em que o conjugado de anticorpo-fármaco está na concentração de cerca de 10 mg/mL, e em que o pH é cerca de 6,0 a 25ºC.
[00170] Em outramodalidade específica, a composição farmacêuti- ca fornecida no presente documento compreende: (a) um conjugado de anticorpo-fármaco que compreende a seguinte estrutura: o " LISA OH o ? , “ em que L- representa o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo e p é a partirde 1a 10;e (b) um excipiente farmaceuticamente aceitável que compreende L- histidina a cerca de 20 mM, TWEEN-20 a cerca de 0,02 % (p/v), trea- lose di-hidratada a cerca de 5,5 % (p/v) e ácido succínico,
[00171] em que o conjugado de anticorpo-fármaco está na concen- tração de cerca de 10 mg/mL, e em que o pH é de cerca de 6,0 a 25ºC.
[00172] [00168] Em ainda outra modalidade específica, a composi- ção farmacêutica fornecida no presente documento compreende: (a) um conjugado de anticorpo-fármaco que compreende a seguinte estrutura: L o or o y , “, em que L- representa o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo e p é a partir de 1a 10; e (b) um excipiente farmaceuticamente aceitável que compreende L- histidina a cerca de 20 MM, TWEEN-20 a cerca de 0,02 % (p/v), saca- rose a cerca de 5,0 % (p/v) e HCI,
[00173] em que o conjugado de anticorpo-fármaco está na concen- tração de cerca de 10 mg/mL, e em que o pH é de cerca de 6,0 a 25ºC.
[00174] Embora determinados números (e faixas numéricas dos mesmos) sejam fornecidos, deve ser entendido que, em determinadas modalidades, valores numéricos dentro, por exemplo, de 2 %, 5%, 10 %, 15 % ou 20 % dos ditos números (ou faixas numéricas) também são considerados. Outras composições farmacêuticas exemplificativas são fornecidas na seção Experimental abaixo.
[00175] Um solvente primário em um veículo pode ser de natureza aquosa ou não aquosa. Além disso, o veículo pode conter outros exci- pientes farmaceuticamente aceitáveis para modificar ou manter o pH, osmolaridade, viscosidade, esterilidade ou estabilidade da composição farmacêutica. Em determinadas modalidades, o veículo farmaceutica- mente aceitável é um tampão aquoso. Em outras modalidades, um ve- ículo compreende, por exemplo, cloreto de sódio e/ou citrato de sódio.
[00176] As composições farmacêuticas fornecidas no presente do- cumento podem conter ainda outros agentes de formulação farmaceu- ticamente aceitáveis para modificar ou manter a taxa de liberação de um conjugado de anticorpo-fármaco e/ou um agente adicional, con- forme descrito no presente documento. Tais agentes de formulação incluem aquelas substâncias conhecidas por aqueles versados na téc- nica de preparação de formulações de liberação sustentada. Para refe- rência adicional referente a agentes de formulação farmacêutica e fisi- ologicamente aceitáveis consulte, por exemplo, Remington's Pharma- ceutical Sciences, 18º Ed. (1990, Mack Publishing Co., Easton, Pa. 18042) páginas 1435-1712, The Merck Index, 12º Ed. (1996, Merck Publishing Group, Whitehouse, NJ); e Pharmaceutical Principles of So- lid Dosage Forms (1993, Technonic Publishing Co., Inc., Lancaster, Pa.). Composições farmacêuticas adicionais apropriadas para adminis-
tração são conhecidas na técnica e são aplicáveis nos métodos e composições fornecidos no presente documento.
[00177] Em algumas modalidades, a composição farmacêutica for- necida no presente documento está na forma líquida. Em outras moda- lidades, a composição farmacêutica fornecida no presente documento é liofilizada.
[00178] Uma composição farmacêutica pode ser armazenada em um frasco estéril como uma solução, suspensão, gel, emulsão, sólido ou pó di-hidratado ou liofilizado. Tais composições podem ser armaze- nadas em uma forma pronta para uso, uma forma liofilizada que reque- rer reconstituição antes do uso, uma forma líquida que requerer dilui- ção antes do uso ou outra forma aceitável. Em algumas modalidades, uma composição farmacêutica é fornecida em um recipiente de uso único (por exemplo, um frasco de uso único, ampola, seringa ou autoi- njetor (similar, por exemplo, a uma EpiPen&)), enquanto que um reci- piente de uso múltiplo (por exemplo, um frasco multiuso) é fornecido em outras modalidades. Qualquer dispositivo de distribuição de fárma- cos pode ser usado para distribuir peptídeos e os outros agentes des- critos no presente documento, incluindo implantes (por exemplo, bom- bas implantáveis) e sistemas de cateter, ambos os quais são conheci- dos por aqueles versados na técnica. Injeções de depósito, as quais geralmente são administradas através da via subcutânea ou intramus- cular, também podem ser usadas para liberar peptídeos e/ou outros agentes descritos no presente documento durante um período de tem- po definido. As injeções de depósito são, em geral, com base em sóli- do ou óleo e geralmente compreendem pelo menos um dos compo- nentes da formulação apresentados no presente documento. Aqueles versados na técnica estão familiarizados com as formulações e possí- veis usos de injeções de depósito. Em determinadas modalidades, o uso da tecnologia de distribuição de depósito da Nano Precision Medi-
cal (Nano Precision Medical; Emeryville, CA) é considerado. A tecno- logia usa uma membrana de nanotubo de titânia que aumenta as taxas de liberação de ordem zero de macromoléculas, tais como proteínas e peptídeos terapêuticos. A membrana biocompatível é alojada em um pequeno implante subcutâneo que permite, a longo prazo (por exem- plo, até um ano), uma distribuição de taxa constante de macromolécu- las terapêuticas.
[00179] “Uma composição farmacêutica pode ser formulada para ser compatível com sua via de administração pretendida. Assim, as com- posições farmacêuticas incluem excipientes adequados para adminis- tração através de vias incluindo parentérica (por exemplo, subcutânea (s.c.), intravenosa, intramuscular ou intraperitoneal), intradérmica, oral (por exemplo, ingestão), inalação, intracavidade, intracraniana e trans- dérmica (tópico). Outras vias de administração exemplificativas são apresentadas no presente documento.
[00180] As composições farmacêuticas podem estar na forma de uma suspensão aquosa ou oleosa injetável estéril. Esta suspensão pode ser formulada usando agentes dispersantes ou umectantes e agentes de suspensão adequados descritos no presente documento ou conhecidos por aqueles versados na técnica. A preparação injetá- vel estéril também pode ser uma solução ou suspensão injetável esté- ril em um diluente ou solvente não tóxico parentericamente aceitável, por exemplo, como uma solução em 1,3-butanodiol. Diluentes, solven- tes e meios de dispersão aceitáveis que podem ser usados incluem água, solução de Ringer, solução isotônica de cloreto de sódio, Cre- mophor ELTY (BASF, Parsippany, NJ) ou solução salina tamponada com fosfato (PBS), etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propileno glicol e polietileno glicol líquido) e misturas adequadas dos mesmos. Além disso, óleos fixos estéreis são convencionalmente usados como um solvente ou meio de suspensão. Para esta finalidade, qualquer óleo fixo suave pode ser usado, incluindo mono- ou diglicerídeos sintéticos. Além disso, ácidos graxos, tal como ácido oleico, encontram uso na preparação de injetáveis. A absorção prolongada de formulações inje- táveis particulares pode ser alcançada incluindo um agente que retar- da a absorção (por exemplo, monoestearato de alumínio ou gelatina).
[00181] Em uma modalidade, as composições farmacêuticas forne- cidas no presente documento podem ser administradas parenterica- mente através de injeção, infusão ou implantação para administração local ou sistêmica. Administração parentérica, conforme usado no pre- sente documento, inclui administração intravenosa, intra-arterial, intra- peritoneal, intratecal, intraventricular, intrauretral, intraesternal, intra- craniana, intramuscular, intrassinovial e subcutânea.
[00182] Em uma modalidade, as composições farmacêuticas forne- cidas no presente documento podem ser formuladas em quaisquer formas de dosagem que sejam adequadas para administração paren- térica, incluindo soluções, suspensões, emulsões, micelas, liposso- mas, microesferas, nanossistemas e formas sólidas adequadas para soluções ou suspensões em líquido antes da injeção. Estas formas de dosagem podem ser preparadas de acordo com métodos convencio- nais conhecidos por aqueles versados na técnica de ciência farmacêu- tica (consulte, por exemplo, Remington, The Science and Practice of Pharmacy, supra).
[00183] Em uma modalidade, as composições farmacêuticas desti- nadas à administração parentérica podem incluir um ou mais excipien- tes farmaceuticamente aceitáveis incluindo, porém sem limitações, ve- íÍculos aquosos, veículos miscíveis em água, veículos não aquosos, agentes antimicrobianos ou conservantes contra o crescimento de mi- cro-organismos, estabilizantes, intensificadores de solubilidade, agen- tes isotônicos, agentes de tamponamento, antioxidantes, anestésicos locais, agentes de suspensão e dispersão, agentes umectantes ou emulsificantes, agentes formadores de complexo, agentes sequestran- tes ou quelantes, crioprotetores, lioprotetores, agentes espessantes, agentes para ajuste de pH e gases.
[00184] Em uma modalidade, veículos aquosos adequados incluem, porém sem limitações, água, solução salina, solução salina fisiológica ou solução salina tamponada com fosfato (PBS), injeção de cloreto de sódio, injeção de Ringer, injeção isotônica de dextrose, injeção de água estéril, injeção de dextrose e lactato. Veículos não aquosos in- cluem, porém sem limitações, óleos fixos de origem vegetal, óleo de rícino, óleo de milho, óleo de algodão, azeite, óleo de amendoim, óleo de hortelã-pimenta, óleo de cártamo, óleo de gergelim, óleo de soja, óleos vegetais hidrogenados, óleo de soja hidrogenado e triglicerídeos de cadeia média de óleo de coco e óleo de semente de palma. Veícu- los miscíveis em água incluem, porém sem limitações, etanol, 1,3- butanodiol, polietileno glicol líquido (por exemplo, polietileno glicol 300 e polietileno glicol 400), propileno glicol, glicerina, N-metil-2-pirrolidona, N ,N-dimetilacetamida e sulfóxido de dimetila.
[00185] Em uma modalidade, agentes antimicrobianos ou conser- vantes adequados incluem, porém sem limitações, fenóis, cresóis, mercuriais, álcool benzílico, clorobutanol, metil e propil p- hidroxibenzoatos, timerosal, cloreto de benzalcônio (por exemplo, clo- reto de benzetônio), metil - e propil-parabenos e ácido sórbico. Agen- tes isotônicos adequados incluem, porém sem limitações, cloreto de sódio, glicerina e dextrose. Agentes de tamponamento adequados in- cluem, porém sem limitações, fosfato e citrato. Antioxidantes adequa- dos são aqueles descritos no presente documento, incluindo bissulfito e metabissulfito de sódio. Anestésicos locais adequados incluem, po- rém sem limitações, cloridrato de procaína. Agentes de suspensão e dispersão adequados são aqueles descritos no presente documento, incluindo carboximetilcelulose de sódio, hidroxipropilmetilcelulose e polivinilpirrolidona. Agentes emulsificantes adequados incluem aqueles descritos no presente documento, incluindo monolaurato de polioxieti- leno sorbitano, mono-oleato de polioxietileno sorbitano 80 e oleato de trietanolamina. Agentes sequestrantes ou quelantes adequados inclu- em, porém sem limitações EDTA. Agentes para ajuste de pH adequa- dos incluem, porém sem limitações, hidróxido de sódio, ácido clorídri- co, ácido cítrico e ácido láctico. Agentes formadores de complexo ade- quados incluem, porém sem limitações, ciclodextrinas, incluindo a- ciclodextrina, B-ciclodextrina, hidroxipropil-B-ciclodextrina, sulfobutilé- ter-B-ciclodextrina e sulfobutiléter 7-B-ciclodextrina (CAPTISOLO, CyDex, Lenexa, KS )
[00186] Em uma modalidade, as composições farmacêuticas forne- cidas no presente documento podem ser formuladas para administra- ção de dosagem única ou múltipla. As formulações de dosagem única são embaladas em uma ampola, um frasco ou uma seringa. As formu- lações parentéricas de dosagem múltipla podem conter um agente an- timicrobiano em concentrações bacteriostáticas ou fungistáticas. To- das as formulações parentéricas devem ser estéreis, conforme conhe- cido e praticado na técnica.
[00187] Em uma modalidade, as composições farmacêuticas são fornecidas como soluções estéreis prontas para uso. Em outra modali- dade, as composições farmacêuticas são fornecidas como produtos solúveis secos estéreis, incluindo pós liofiizados e comprimidos hipo- dérmicos, para serem reconstituídos com um veículo antes de uso. Em ainda outra modalidade, as composições farmacêuticas são fornecidas como suspensões estéreis prontas para uso. Em ainda outra modali- dade, as composições farmacêuticas são fornecidas como produtos insolúveis secos estéreis para serem reconstituídos com um veículo antes de uso. Em ainda outra modalidade, as composições farmacêu- ticas são fornecidas como emulsões estéreis prontas para uso.
[00188] Em uma modalidade, as composições farmacêuticas forne- cidas no presente documento podem ser formuladas como formas de dosagem de liberação imediata ou modificada, incluindo formas de |i- beração retardada, sustentada, pulsada, controlada, direcionada e programada.
[00189] Em uma modalidade, as composições farmacêuticas po- dem ser formuladas como uma suspensão, sólido, semissólido ou lí- quido tixotrópico para administração como um depósito implantado. Em uma modalidade, as composições farmacêuticas fornecidas no presente documento são dispersas em uma matriz interna sólida, a qual é cercada por uma membrana polimérica externa que é insolúvel em fluidos corporais, mas permite que o ingrediente ativo nas compo- sições farmacêuticas se difunda.
[00190] Em uma modalidade, matrizes internas adequadas incluem metacrilato de polimetila, metacrilato de polibutila, policloreto de polivi- nila plastificado ou não plastificado, náilon plastificado, tereftalato de polietileno plastificado, borracha natural, poli-isopreno, polisobutileno, polibutadieno, polietileno, copolímero de polietileno-acetato, copolíime- ros de silicone, copolímeros de carbonato de silicone, polímeros hidro- fílicos, tais como hidrogéis de ésteres de ácido acrílico e metacrílico, colágeno, álcool polivinílico reticulado e acetato de polivinila parcial- mente hidrolisado reticulado.
[00191] Em uma modalidade, membranas poliméricas externas adequadas incluem polietileno, polipropileno, copolímeros de etile- no/propileno, copolímeros de etileno/acrilato de etila, copolímeros de etileno/acetato de vinila, borrachas de silicone, polidimetilsiloxanos, borracha de neopreno, polietileno clorado, cloreto de polivinila, copolií- meros de cloreto de vinila com acetato de vinila, cloreto de vinilideno, etileno e propileno, ionômero de tereftalato de polietileno, borrachas de epicloroidrina de borracha butílica, copolímero de etileno/álcool viní-
lico, copolímero de etileno/viniloxietanol e terpolímero de etile- no/acetato de vinila/álcool vinílico.
[00192] As suspensões aquosas contêm os materiais ativos em mistura com os excipientes adequados para sua fabricação. Estes ex- cipientes são agentes de suspensão, por exemplo, carboximetilcelulo- se de sódio, metilcelulose, hidróxi-propilmetilcelulose, alginato de só- dio, polivinilpirrolidona, goma tragacanto e goma acácia; agentes dis- persantes ou umectantes podem ser um fosfatídeo de ocorrência natu- ral, por exemplo, lecitina, ou produtos da condensação de um óxido de alquileno com ácidos graxos, por exemplo, estearato de polioxietileno, ou produtos da condensação de óxido de etileno com álcoois alifáticos de cadeia longa, por exemplo, heptadecaetileno-oxicetanol, ou produ- tos da condensação de óxido de etileno com ésteres parciais deriva- dos de ácidos graxos e um hexitol, tal como mono-oleato de polioxieti- leno sorbitol, ou produtos da condensação de óxido de etileno com és- teres parciais derivados de ácidos graxos e anidridos de hexitol, por exemplo, mono-oleato de polietileno sorbitano. As suspensões aquo- sas também podem conter um ou mais conservantes.
[00193] As suspensões oleosas podem ser formuladas ao suspen- der o ingrediente ativo em um óleo vegetal, por exemplo, óleo de amendoim, azeite de oliva, óleo de gergelim ou óleo de coco, ou em um óleo mineral, tal como parafina líquida. As suspensões oleosas po- dem conter um agente espessante, por exemplo, cera de abelha, para- fina dura ou álcool cetílico. Agentes adoçantes, tais como aqueles apresentados acima, e agentes aromatizantes podem ser adicionados para fornecer uma preparação oral saborosa.
[00194] Pós e grânulos dispersíveis adequados para a preparação de uma suspensão aquosa através da adição de água fornecem o in- grediente ativo em mistura com um agente dispersante ou umectante, agente de suspensão e um ou mais conservantes. Agentes dispersan-
tes ou umectantes e agentes de suspensão adequados são exemplifi- cados no presente documento.
[00195] As composições farmacêuticas fornecidas no presente do- cumento também podem estar na forma de emulsões óleo-em-água. À fase oleosa pode ser um óleo vegetal, por exemplo, azeite ou óleo de amendoim, ou um óleo mineral, por exemplo, parafina líquida, ou mis- turas dos mesmos. Agentes emulsificantes adequados podem ser go- mas de ocorrência natural, por exemplo, goma acácia ou goma traga- canto; fosfatídeos de ocorrência natural, por exemplo, soja, lecitina e ésteres ou ésteres parciais derivados de ácidos graxos; anidridos de hexitol, por exemplo, mono-oleato de sorbitano; e produtos da conden- sação de ésteres parciais com óxido de etileno, por exemplo, mono- oleato de polioxietileno sorbitano.
[00196] As composições farmacêuticas também podem incluir exci- pientes para proteger a composição contra a rápida degradação ou eliminação do corpo, tal como uma formulação de liberação controla- da, incluindo implantes, lipossomas, hidrogéis, profármacos e sistemas de distribuição microencapsulados. Por exemplo, um material de retar- do de tempo, tal como monoestearato de glicerila ou estearato de gli- cerila apenas, ou em combinação com uma cera, pode ser usado. À absorção prolongada de composições farmacêuticas injetáveis pode ser alcançada ao incluir um agente que retarda a absorção, por exem- plo, monoestearato de alumínio ou gelatina. A prevenção da ação de micro-organismos pode ser alcançada por vários agentes antibacteria- nos e antifúngicos, por exemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal e assim por diante.
[00197] A composição farmacêutica fornecida no presente docu- mento pode ser armazenada a -80ºC, 4ºC, 25ºC ou 37ºC.
[00198] Uma composição liofilizada pode ser produzida por meio de liofiização da composição farmacêutica líquida fornecida no presente documento. Em uma modalidade específica, a composição farmacêu- tica fornecida no presente documento é uma composição farmacêutica liofilizada. Em algumas modalidades, as formulações farmacêuticas são pós liofilizados, os quais podem ser reconstituídos para adminis- tração como soluções, emulsões e outras misturas. Eles também po- dem ser reconstituídos e formulados como sólidos ou géis.
[00199] Em algumas modalidades, a preparação da formulação liofi- lizada fornecida no presente documento envolve mistura da solução a granel formulada para liofilização, filtração asséptica, enchimento em frascos, congelamento em frascos em uma câmara de liofilização, se- guido por liofilização, colocação de rolhas e tampas.
[00200] Um liofilizador pode ser usado na preparação da formula- ção liofilizada. Por exemplo, uma unidade piloto VirTis Genesis Model EL pode ser usada. A unidade incorpora uma câmara com três prate- leiras de trabalho (para uma área útil total de prateleira de cerca de 0,4 metros quadrados), um condensador externo e um sistema mecânico de bombeamento a vácuo. A refrigeração mecânica em cascata permi- te que as prateleiras sejam resfriadas a -70 * C ou menos e o conden- sador externo a -90 *º C ou menos. A temperatura da prateleira e a pressão da câmara foram controladas automaticamente para +/- 0,5ºC e +/- 2 mícrons (miliTorr), respectivamente. A unidade foi equipada com um manômetro de capacitância a vácuo, um vacuômetro Pirani, um transdutor de pressão (para medição a partir de O a 1 atmosfera) e um sensor de umidade relativa.
[00201] O pó liofiizado pode ser preparado pela dissolução de um conjugado de anticorpo-fármaco fornecido no presente documento ou um derivado farmaceuticamente aceitável do mesmo, em um solvente adequado. Em algumas modalidades, o pó liofilizado é estéril. A filtra- ção estéril subsequente da solução seguido por liofilização sob condi- ções padrão conhecidas por aqueles versados na técnica fornece a formulação desejada. Em uma modalidade, a solução resultante será distribuída em frascos para liofilização. Cada frasco conterá uma do- sagem única ou múltiplas dosagens do conjugado de anticorpo- fármaco. O pó liofilizado pode ser armazenado sob condições apropri- adas, tal como a cerca de 4ºC até a temperatura ambiente.
[00202] A reconstituição deste pó liofiizado com água para injeção fornece uma formulação para uso em administração parentérica. Para reconstituição, o pó liofilizado é adicionado à água estéril ou outro ex- cipiente adequado. Este valor pode ser determinado empiricamente e ajustado de acordo com as necessidades específicas.
[00203] Um procedimento de reconstituição exemplificativo é ilus- trado como segue: (1) encaixar na seringa de 5 mL ou 3 mL uma agu- lha de calibre 18 ou 20 e encher a seringa com água de grau para in- jecção (WFI); (2) medir a quantidade apropriada de WFI usando as graduações da seringa, assegurando que a seringa esteja livre de bo- lhas de ar; (3) inserir a agulha através da rolha de borracha; (4) dis- pensar todo o conteúdo da seringa no recipiente pela parede do fras- co, remover a seringa e a agulha e colocar no recipiente; (4) agitar o frasco continuamente para solubilizar cuidadosamente todo o conteú- do do frasco até estar totalmente reconstituído (por exemplo, cerca de 20-40 segundos) e minimizar a agitação excessiva da solução de pro- teína que possa resultar na formação de espuma.
5.3 Conjugado de Anticorpo Anti-191P4D12-Fármaco
[00204] As composições farmacêuticas, formulações e formas de dosagem fornecidas no presente documento compreendem conjuga- dos de anticorpo anti-191P4D12-fármaco. O conjugado de anticorpo anti-191P4D12-fármaco fornecido no presente documento compreen- de um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que se liga à 191P4D12 conjugado a uma ou mais unidades de agentes cito- tóxicos (ou unidades de fármaco). Os agentes citotóxicos (ou unidades de fármaco) podem ser covalentemente ligados diretamente ou atra- vés de uma unidade de ligação (LU).
[00205] Em algumas modalidades, o composto de conjugado de anticorpo-fármaco tem a seguinte fórmula: L-(LU-D)) (1) ou um sal ou solvato farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que: L é a unidade de anticorpo, por exemplo, o anticorpo anti- 191P4D12 ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo, confor- me fornecido na Seção 5.3.1 abaixo, e (LU-D) é uma porção de unidade de fármaco-unidade ligan- te, em que: LU- é uma unidade ligante, e D é uma unidade de fármaco que tem atividade citostática ou citotóxica contra uma célula alvo; e p é um número inteiro a partir de 1 a 20.
[00206] Em algumas modalidades, p varia a partir de 1a 10,1a9, 1a8,1a7,1a6,1a5,1a4,1a30ou1a2 Em algumas modalida- des, p varia a partir de 2a 10,2a9,2a8,2a7,2a6,2a5,2a4ou 2 a 3. Em outras modalidades, p é cerca de 1. Em outras modalidades, p é cerca de 2. Em outras modalidades, p é cerca de 3. Em outras modalidades, p é cerca de 4. Em outras modalidades, p é cerca de 5. Em outras modalidades, p é cerca de 6. Em outras modalidades, p é cerca de 7. Em outras modalidades, p é cerca de 8. Em outras modali- dades, p é cerca de 9. Em outras modalidades, p é cerca de 10.
[00207] Em algumas modalidades, o composto de anticorpo- fármaco conjugado tem a seguinte fórmula: L - (Aa-Ww-YyD)p (11) ou um sal ou solvato farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que: L é a unidade de anticorpo, por exemplo, o anticorpo anti- 191P4D12 ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo, confor-
me fornecido na Seção 5.3.1 abaixo; e -Aa-Ww-Y,y- é uma unidade ligante (LU), em que: -A- é uma unidade extensora, aéboul, cada -W- é independentemente uma unidade de aminoáci- do, w é um número inteiro que varia a partir de 0 a 12, -Y- é uma unidade espaçadora autoimolativa, yé0o,1ou2; D é uma unidade de fármaco que tem atividade citostática ou citotóxica contra a célula alvo; e p é um número inteiro a partir de 1 a 20.
[00208] Em algumas modalidades, a é O ou1,wéOouleyéo,1 ou 2. Em algumas modalidades, a é 0 ou 1, wé O0ou 1eyéOoul. Em algumas modalidades, p varia de 1a 10, 1a9,1a8,1a7,1a6, 1a5,1a4,1a3ou1a2 Em algumas modalidades, varia de 2a 8, 2 a7,2a6,2a5,2a40u2a3. Em outras modalidades, p é 1,2,3,4, ou 6. Em algumas modalidades, p é 2 ou 4. Em algumas modalida- des, quando w não é zero, y é 1 ou 2. Em algumas modalidades, quando w é 1 a 12, y é 1 ou 2. Em algumas modalidades, wé 2a 12 e y é 1 ou 2. Em algumas modalidades, a é 1eweysão0O.
[00209] “Para composições que compreendem uma pluralidade de anticorpos ou fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos, a carga de fármaco é representada por p, o número médio de moléculas de fármaco por unidade de anticorpo. A carga de fármacos pode variar a partir de 1 a 20 fármacos (D) por anticorpo. O número médio de fár- macos por anticorpo na preparação de reações de conjugação pode ser caracterizado por meios convencionais, tais como espectroscopia de massa, ensaio ELISA e HPLC. A distribuição quantitativa de conju- gados de anticorpo-fármaco em termos de p também pode ser deter-
minada. Em alguns casos, a separação, purificação e caracterização de conjugados de anticorpo-fármaco homogêneos onde p é um deter- minado valor de conjugados de anticorpo-fármaco com outras cargas de fármaco podem ser alcançadas por meios como HPLC de fase re- versa ou eletroforese. Em modalidades exemplificativas, p é a partir de 2aê8.
5.3.1 Anticorpos Anti-191P4D12 ou Fragmentos de Ligação a An- tígeno dos Mesmos
[00210] Em uma modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que se liga às proteínas relacionadas à 191P4D12 é um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente à proteína 191P4D12 que compreende a sequên- cia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 (consulte Figura 5A). O cDNA correspondente que codifica a proteína 191P4D12 tem uma sequência de SEQ ID NO: 1 (consulte Figura 5A).
[00211] O anticorpo que se liga especificamente à proteína 191P4D12 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 inclui anticorpos que podem se ligar a outras proteínas relacio- nadas à 191P4D12. Por exemplo, os anticorpos que se ligam à proteí- na 191P4D12 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 podem se ligar a proteínas relacionadas à 191P4D12, tais como variantes de 191P4D12 e homólogos ou análogos da mesma.
[00212] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-191P4D12 for- necido no presente documento é um anticorpo monoclonal.
[00213] Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 (sequência de cDNA de SEQ ID NO: 3) e/ou uma ca- deia leve que compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 (sequência de cDNA de SEQ ID NO: 5), conforme mostrado na Figura 5B.
[00214] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-191P4D12 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende regiões determinantes de complementaridade (CDRs) que compreendem a sequência de ami- noácidos das CDRs da região variável de cadeia pesada apresentada em SEQ ID NO: 7 e uma região variável de cadeia leve que compre- ende CDRs que compreendem a sequência de aminoácidos das CDRs da região variável de cadeia leve apresentada em SEQ ID NO: 8. SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 8 são mostradas na Figura 5C e listadas abai- xo: SEQ ID NO: 7
MELGLCWVFLVAILEGVQCEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGF TFSSYNMNWVRQAPGKGLEWVSYISSSSSTIY YADSVKGRFTISRDN AKNSLSLQMNSLRDEDTAVYYCARAYYYGMDVWGQGTTVTVSSAS TKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG VHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKR VEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCV VVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL HQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRE EMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGS
FFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 8
MDMRVPAQLLGLLLLWFPGSRCDIQMTASPSSVSASVGDRVTITCRA SQGISGWLAWYQQKPGKAPKFLIYAASTLASGVPSRFSGSGSGTDFT LTISSLAPEDFATYYCQQANSFPPTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPS DEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQD SKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
[00215] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-191P4D12 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende as sequências de aminoá-
cidos da região variável de cadeia pesada apresentadas em SEQ ID NO: 22 (a qual é a sequência de aminoácidos que varia do 20º amino- ácido (ácido glutâmico) ao 136º aminoácido (serina) de SEQ ID NO: 7) e uma região variável de cadeia leve que compreende as sequências de aminoácidos da região variável de cadeia leve apresentada em SEQ ID NO: 23 (a qual é a sequência de aminoácidos que varia do 23º aminoácido (ácido aspártico) ao 130º aminoácido (arginina) de SEQ ID NO: 8). Em outras modalidades, o anticorpo anti-191P4D12 ou frag- mento de ligação a antígeno do mesmo compreende uma região vari- ável de cadeia pesada que consiste nas sequências de aminoácidos da região variável de cadeia pesada apresentadas em SEQ ID NO: 22 (a qual é a sequência de aminoácidos que varia de 20º aminoácido (ácido glutâmico) ao 136º aminoácido (serina) de SEQ ID NO: 7) e uma região variável de cadeia leve que consiste nas sequências de aminoácidos da região variável de cadeia leve apresentadas em SEQ ID NO: 23 (a qual é a sequência de aminoácidos que varia do 23º ami- noácido (ácido aspártico) ao 130º aminoácido (arginina) de SEQ ID NO: 8). SEQ ID NO: 22 e SEQ ID NO: 23 estão listadas abaixo: SEQ ID NO: 22
EVOLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYNMNWVRQAPGKGLE WVSYISSSSSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLSLQMNSLRDEDTAVYY
CARAYYYYGMDVWGOGTTVTVSS SEQ ID NO: 23
DIQMTOSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISGWLAWYQQKPGKAPKFLI YAASTLOSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQOPEDFATYYCQQANSFPP TFGGGTKVEIKR
[00216] As sequências de CDR podem ser determinadas de acordo com sistemas de numeração bem conhecidos. Conforme descrito aci- ma, as regiões CDR são bem conhecidas por aqueles versados na técnica e foram definidas por sistemas de numeração bem conhecidos.
Por exemplo, as regiões determinantes de complementaridade (CDRs) de Kabat são com base na variabilidade da sequência e são as mais comumente usadas (consulte, por exemplo, Kabat et al., Supra). Chothia refere-se, em vez disso, à localização das alças estruturais (consulte, por exemplo, Chothia e Lesk, 1987, J.
Mol.
Biol. 196: 901- 17). O final da alça CDR-H1 de Chothia, quando numerado usando a convenção de numeração de Kabat, varia entre H32 e H34 dependen- do do comprimento da alça (isto ocorre porque o esquema de numera- ção de Kabat coloca inserções em H35A e H35B; se nem 35A nem 35B estiverem presentes, a alça termina em 32; se apenas 35A estiver presente, a alça termina em 33; se tanto 35A como 35B estiverem pre- sentes, a alça termina em 34). As regiões hipervariáveis pelo ADM re- presentam um compromisso entre as CDRs de Kabat e as alças estru- turais de Chothia e são usadas pelo software de modelagem de anti- corpos ADM da Oxford Molecular (consulte, por exemplo, Antibody En- gineering Vol. 2 (Eds Kontermann e Dúbel, 2º ed. 2010)) As regiões hipervariáveis pelo "Contact" são com base em uma análise das estru- turas cristalinas complexas disponíveis.
Outro sistema de numeração universal que foi desenvolvido e amplamente adotado é ImMunoGe- neTics (IMGT) Information System& (Lafranc et al., 2003, Dev.
Comp.
Immunol. 27 (1): 55-77). O IMGT é um sistema de informação integra- do especializado em imunoglobulinas (IG), receptores de células T (TOR) e principal complexo de histocompatibilidade (MHC) de seres humanos e outros vertebrados.
No presente documento, as CDRs são referidas em termos da sequência de aminoácidos e da localização dentro da cadeia leve ou pesada.
Uma vez que a "localização" das CDRs dentro da região estrutural do domínio variável da imunoglobuli- na é conservada entre as espécies e está presente em estruturas de- nominadas alças, usando sistemas de numeração que alinham se- quências de domínio variável de acordo com características estrutu-
rais, resíduos das CDR e da região estrutural são prontamente identifi- cados. Esta informação pode ser usada na enxertia e substituição de resíduos de CDR de imunoglobulinas de uma espécie em uma estrutu- ra aceitadora, normalmente, de um anticorpo humano. Um sistema de numeração adicional (AHon) foi desenvolvido por Honegger e Plú- ckthun, 2001, J. Mol. Biol. 309: 657-70. A correspondência entre o sis- tema de numeração incluindo, por exemplo, a numeração de Kabat e o sistema de numeração único IMGT, é bem conhecida por aqueles ver- sados na técnica (consulte, por exemplo, Kabat, supra; Chothia e Lesk, supra; Martin, supra; Lefranc et a/., Supra). Os resíduos de cada uma destas regiões hipervariáveis ou CDRs são indicados na Tabela acima.
[00217] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-191P4D12 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende regiões determinantes de complementaridade (CDRs) que compreendem a sequência de ami- noácidos das CDRs da região variável de cadeia pesada apresentada em SEQ ID NO: 7 de acordo com a numeração de Kabat e uma região variável de cadeia leve que compreende CDRs que compreendem a sequência de aminoácidos das CDRs da região variável de cadeia leve apresentada em SEQ ID NO: 8 de acordo com a numeração de Kabat.
[00218] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-191P4D12 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende regiões determinantes de complementaridade (CDRs) que compreendem a sequência de ami- noácidos das CDRs da região variável de cadeia pesada apresentada em SEQ ID NO: 7 de acordo com a numeração AbM e uma região va- riável de cadeia leve que compreende CDRs que compreendem a se- quência de aminoácidos das CDRs da região variável de cadeia leve apresentada em SEQ ID NO: 8 de acordo com a numeração AbM.
[00219] Em outras modalidades, o anticorpo anti-191P4D12 ou fra- gmento de ligação a antígeno do mesmo compreende uma região va- riável de cadeia pesada que compreende regiões determinantes de complementaridade (CDRs) que compreendem a sequência de ami- noácidos das CDRs da região variável de cadeia pesada apresentada em SEQ ID NO: 7 de acordo com a numeração de Chothia e uma re- gião variável de cadeia leve que compreende CDRs que compreen- dem a sequência de aminoácidos das CDRs da região variável de ca- deia leve apresentada em SEQ ID NO: 8 de acordo com a numeração de Chothia.
[00220] Em outras modalidades, o anticorpo anti-191P4D12 ou fra- gmento de ligação a antígeno do mesmo compreende uma região va- riável de cadeia pesada que compreende regiões determinantes de complementaridade (CDRs) que compreendem a sequência de ami- noácidos das CDRs da região variável de cadeia pesada apresentada em SEQ ID NO: 7 de acordo com a numeração Contact e uma região variável de cadeia leve que compreende CDRs que compreendem a sequência de aminoácidos das CDRs da região variável de cadeia leve apresentada em SEQ ID NO: 8 de acordo com a numeração Contact.
[00221] Em ainda outras modalidades, o anticorpo anti-191P4D12 ou fragmento de ligação a antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende regiões determinantes de comple- mentaridade (CDRs) que compreendem a sequência de aminoácidos das CDRs da região variável de cadeia pesada apresentada em SEQ ID NO: 7 de acordo com a numeração IMGT e uma região variável de cadeia leve que compreende CDRs que compreendem a sequência de aminoácidos das CDRs da região variável de cadeia leve apresentada em SEQ ID NO: 8 de acordo com a numeração IMGT.
[00222] Conforme descrito acima, sequências de CDR de acordo com diferentes sistemas de numeração podem ser prontamente de-
terminadas, por exemplo, usando ferramentas online, tal como aquela fornecida pelo Antigen receptor Numbering And Receptor Classifica- tlon (ANARCI). Por exemplo, as sequências de CDR da cadeia pesada dentro de SEQ ID NO: 7 e as sequências de CDR da cadeia leve den- tro de SEQ ID NO: 8 de acordo com a numeração de Kabat, conforme determinado pelo ANARCI, estão listadas na Tabela 31 abaixo. Tabela 31 o TESSSRST T wrassanNos —) NO: 10)
[00223] Para outro exemplo, as sequências de CDR da cadeia pe- sada dentro de SEQ ID NO: 22 e as sequências de CDR da cadeia leve dentro de SEQ ID NO: 23 de acordo com a numeração IMGT, conforme determinado pelo ANARCI, estão listadas na Tabela 32 abaixo. Tabela 32
[00224] Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de |i- gação a antígeno do mesmo compreende CDR H1 que compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9, CDR H2 que com- preende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, CDR H3 que compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11, CDR L1 que compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12, CDR L2 que compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13 e CDR L3 que compreende uma sequência de amino- ácidos de SEQ ID NO: 14.
[00225] Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de |i- gação a antígeno do mesmo compreende uma região variável de ca- deia pesada que compreende a sequência de aminoácidos que varia do 20º aminoácido (ácido glutâmico) ao 136º aminoácido (serina) de SEQ ID NO: 7 e uma região variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos que varia do 23º aminoácido (ácido aspárti- co) ao 130º aminoácido (arginina) de SEQ ID NO: 8.
[00226] Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos que va- ria do 20º aminoácido (ácido glutâmico) ao 466º aminoácido (lisina) de SEQ ID NO: 7 e uma cadeia leve que compreende o aminoácido se- quência que varia do 23º aminoácido (ácido aspártico) ao 236º amino- ácido (cisteína) de SEQ ID NO: 8.
[00227] Em algumas modalidades, é/são considerada(s) modifica- ção(ões) da sequência de aminoácidos dos anticorpos descritos no presente documento. Por exemplo, pode ser desejável otimizar a afini- dade de ligação e/ou outras propriedades biológicas do anticorpo in- cluindo, porém sem limitações, especificidade, termoestabilidade, nível de expressão, funções efetoras, glicosilação, imunogenicidade reduzi- da ou solubilidade. Assim, além dos anticorpos descritos no presente documento, considera-se que variantes de anticorpos podem ser pre- paradas. Por exemplo, variantes de anticorpos podem ser preparadas ao introduzir alterações de nucleotídeos apropriadas no DNA codifica- dor e/ou através de síntese do anticorpo ou polipeptídeo desejado. Aqueles versados na técnica reconhecerão que as modificações de aminoácidos podem alterar os processos pós-traducionais do anticor- po, tal como alterar o número ou a posição dos sítios de glicosilação ou alterar as características de ancoragem à membrana.
[00228] Em algumas modalidades, os anticorpos fornecidos no pre- sente documento são quimicamente modificados, por exemplo, pela ligação covalente de qualquer tipo de molécula ao anticorpo. Os deri- vados de anticorpos podem incluir anticorpos que foram quimicamente modificados, por exemplo, através de glicosilação, acetilação, peguila- ção, fosforilação, amidação, derivatização por grupos de prote- ção/bloqueio conhecidos, clivagem proteolítica, ligação a um ligante celular ou outra proteína, etc. Qualquer uma das inúmeras modifica- ções químicas pode ser realizada por meio de técnicas conhecidas incluindo, porém sem limitações, clivagem química específica, acetila- ção, formilação, síntese metabólica de tunicamicina, etc. Além disso, o anticorpo pode conter um ou mais aminoácidos não clássicos.
[00229] As variações podem ser uma substituição, eliminação ou inserção de um ou mais códons que codificam o anticorpo ou polipep- tídeo de domínio único que resulta em uma alteração na sequência de aminoácidos comparado com o anticorpo ou polipeptídeo original. As substituições de aminoácidos podem ser o resultado da substituição de um aminoácido por outro aminoácido que compreende proprieda- des estruturais e/ou químicas similares, tal como a substituição de uma leucina por uma serina, por exemplo, substituições conservativas de aminoácidos. Métodos padrão conhecidos por aqueles versados na técnica podem ser usados para introduzir mutações na sequência de nucleotídeos que codifica uma molécula fornecida no presente docu- mento incluindo, por exemplo, mutagênese sítio-dirigida e mutagênese mediada por PCR, que resultam em substituições de aminoácidos. As inserções ou eliminações podem estar opcionalmente na faixa a partir de cerca de 1 a 5 aminoácidos. Em determinadas modalidades, a substituição, eliminação ou inserção inclui menos de 25 substituições de aminoácidos, menos de 20 substituições de aminoácidos, menos de 15 substituições de aminoácidos, menos de 10 substituições de aminoácidos, menos de 5 substituições de aminoácidos, menos de 4 substituições de aminoácidos, menos de 3 substituições de aminoáci-
dos ou menos de 2 substituições de aminoácidos em relação à molé- cula original. Em uma modalidade específica, a substituição é uma substituição conservativa de aminoácidos produzida em um ou mais resíduos de aminoácidos não essenciais previstos. A variação permiti- da pode ser determinada fazendo sistematicamente inserções, elimi- nações ou substituições de aminoácidos na sequência e testando as variantes resultantes quanto à atividade exibida pelos anticorpos pre- Cursores.
[00230] As inserções de sequência de aminoácidos incluem fusões amino- e/ou carboxila-terminais que variam, quanto ao comprimento, a partir de um resíduo a polipeptídeos que contêm múltiplos resíduos, bem como inserções intra-sequência de um único ou múltiplos resí- duos de aminoácidos. Exemplos de inserções terminais incluem um anticorpo com um resíduo metionila N-terminal.
[00231] — Anticorpos gerados por substituições conservativas de ami- noácidos estão incluídos na presente invenção. Em uma substituição conservativa de aminoácidos, um resíduo de aminoácido é substituído por um resíduo de aminoácido que compreende uma cadeia lateral com uma carga similar. Conforme descrito acima, famílias de resíduos de aminoácidos que compreendem cadeias laterais com cargas simila- res foram definidas na técnica. Estas famílias incluem aminoácidos com cadeias laterais básicas (por exemplo, lisina, arginina, histidina), cadeias laterais ácidas (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmi- co), cadeias laterais polares não carregadas (por exemplo, glicina, as- paragina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadeias late- rais não polares (por exemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, pro- lina, fenilalanina, metionina, triptofano), cadeias laterais beta ramiífica- das (por exemplo, treonina, valina, isoleucina) e cadeias laterais aro- máticas (por exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina). Alter- nativamente, as mutações podem ser introduzidas aleatoriamente ao longo de toda ou parte da sequência codificante, tal como por meio de mutagênese de saturação e os mutantes resultantes podem ser ras- treados quanto à atividade biológica para identificar mutantes que re- têm a atividade. Após a mutagênese, a proteína codificada pode ser expressa e a atividade da proteína pode ser determinada. Substitui- ções conservativas (por exemplo, dentro de um grupo de aminoácidos com propriedades e/ou cadeias laterais similares) podem ser feitas de modo a manter ou não alterar significativamente as propriedades.
[00232] Os aminoácidos podem ser agrupados de acordo com simi- laridades nas propriedades de suas cadeias laterais (consulte, por exemplo, Lehninger, Biochemistry 73-75 (2º ed. 1975)): (1) não pola- res: Ala (A), Val (V), Leu (L), Ile (1), Pro (P), Phe (F), Trp (W), Met (M); (2) polares não carregados: Gly (G), Ser (S), Thr (T), Cys (C), Tyr (Y), Asn (N), GIn (Q); (3) ácidos: Asp (D), Glu (E); e (4) básicos: Lys (K), Arg (R), His (H). Alternativamente, os resíduos de ocorrência natural podem ser divididos em grupos com base nas propriedades em co- mum da cadeia lateral: (1) hidrofóbicos: Norleucina, Met, Ala, Val, Leu, Ile; (2) hidrofílicos neutros: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln; (3) ácidos: Asp, Glu; (4) básicos: His, Lys, Arg; (5) resíduos que influenciam a orienta- ção da cadeia: Gly, Pro; e (6) aromáticos: Trp, Tyr, Phe.
[00233] Por exemplo, qualquer resíduo de cisteína não envolvido na manutenção da conformação adequada do anticorpo também pode ser substituído, por exemplo, por outro aminoácido, tal como alanina ou serina, para melhorar a estabilidade oxidativa da molécula e prevenir reticulação aberrante.
[00234] Variações podem ser feitas usando métodos conhecidos na técnica, tais como mutagênese mediada por oligonucleotídeo (sítio- dirigida), varredura de alanina e mutagênese por PCR, mutação sítio- dirigida (consulte, por exemplo, Carter, 1986, Biochem J. 237: 1-7; e Zoller et al., 1982, Nucl. Acids Res. 10: 6487-500), mutagênese de cassete (consulte, por exemplo, Wells et a/., 1985, Gene 34: 315-23) ou outras técnicas conhecidas podem ser realizadas no DNA clonado para produzir o DNA variante do anticorpo anti-MSLN.
[00235] “Modificações covalentes de anticorpos estão incluídas no escopo da presente invenção. Modificações covalentes incluem a rea- ção de resíduos de aminoácidos direcionados de um anticorpo com um agente derivatizante orgânico que é capaz de reagir com cadeias laterais selecionadas ou os resíduos N- ou C- terminais do anticorpo. Outras modificações incluem desamidação de resíduos de glutaminila e asparaginila aos resíduos de glutamila e aspartila correspondentes, respectivamente, hidroxilação de prolina e lisina, fosforilação de gru- pos hidroxila de resíduos de serila ou treonila, metilação dos grupos a- amino de cadeias laterais de lisina, arginina e histidina (consulte, por exemplo, Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties 79- 86 (1983)), acetilação da amina N-terminal e amidação de qualquer grupo carboxila C-terminal.
[00236] Outros tipos de modificação covalente do anticorpo incluí- dos no escopo da presente invenção incluem a alteração do padrão de glicosilação nativo do anticorpo ou polipeptídeo (consulte, por exem- plo, Beck et al., 2008, Curr. Pharm. Biotechnol. 9: 482-501; e Walsh, 2010, Drug Discov. Today 15: 773-80) e ligação do anticorpo a um dentre uma variedade de polímeros não proteináceos, por exemplo, polietileno glicol (PEG), polipropileno glicol ou polioxialquilenos, da maneira apresentada, por exemplo, nas Patentes Norte-Americanas Nº* 4.640.835; 4,496,689; 4.301.144; 4.670.417; 4.791.192; ou
4.179.337.
[00237] Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de |i- gação a antígeno do mesmo fornecido no presente documento com- preende uma cadeia pesada que tem mais de 70 % de homologia com a cadeia pesada conforme apresentado em SEQ ID NO: 7. Em algu-
mas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo fornecido no presente documento compreende uma cadeia pesada que tem mais de 75 % de homologia com a cadeia pesada conforme apresentado em SEQ ID NO: 7. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo fornecido no presente documento compreende uma cadeia pesada que tem mais de 80 % de homologia com a cadeia pesada conforme apresentado em SEQ ID NO: 7. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmen- to de ligação a antígeno do mesmo fornecido no presente documento compreende uma cadeia pesada que tem mais de 85 % de homologia com a cadeia pesada conforme apresentado em SEQ ID NO: 7. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo fornecido no presente documento compreende uma cadeia pesada que tem mais de 90 % de homologia com a cadeia pesada conforme apresentado em SEQ ID NO: 7. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo fornecido no presente documento compreende uma cadeia pesada que tem mais de 95 % de homologia com a cadeia pesada conforme apresentado em SEQ ID NO: 7.
[00238] Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de |i- gação a antígeno do mesmo fornecido no presente documento com- preende uma cadeia leve que tem mais de 70 % de homologia com a cadeia leve conforme apresentado em SEQ ID NO: 8. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mes- mo fornecido no presente documento compreende uma cadeia leve que tem mais de 75 % de homologia com a cadeia leve conforme apresentado em SEQ ID NO: 8. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo fornecido no presente documento compreende uma cadeia leve que tem mais de 80 % de homologia com a cadeia leve conforme apresentado em SEQ ID NO:
8. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo fornecido no presente documento compreende uma cadeia leve que tem mais de 85 % de homologia com a cadeia leve conforme apresentado em SEQ ID NO: 8. Em algumas modalida- des, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo forne- cido no presente documento compreende uma cadeia leve que tem mais de 90 % de homologia com a cadeia leve conforme apresentado em SEQ ID NO: 8. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmen- to de ligação a antígeno do mesmo fornecido no presente documento compreende uma cadeia leve que tem mais de 95 % de homologia com a cadeia leve conforme apresentado em SEQ ID NO: 8.
[00239] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-191P4D12 for- necido no presente documento compreende regiões CDR de cadeias pesada e leve de um anticorpo designado Ha22-2(2,4)6.1 produzido por um hibridoma depositado na American Type Culture Collection (ATCC) Nº de Acesso: PTA-11267 ou regiões CDR de cadeias pesada e leve que compreendem sequências de aminoácidos que são homó- logas às sequências de aminoácidos das regiões CDR das cadeias pesada e leve de Ha22-2(2,4)6.1 e em que os anticorpos retêm as propriedades funcionais desejadas do anticorpo anti-191P4D12 desig- nado Ha22-2(2,4)6.1 produzido por um hibridoma depositado na Ame- rican Type Culture Collection (ATCC) Nº de Acesso: PTA-11267.
[00240] Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de |i- gação a antígeno do mesmo fornecido no presente documento com- preende uma região variável de cadeia pesada humanizada e uma re- gião variável de cadeia leve humanizada, em que: (a) a região variável de cadeia pesada compreende CDRs que com- preendem as sequências de aminoácidos das CDRs da região variável de cadeia pesada encontradas no anticorpo produzido por um hibri- doma depositado na American Type Culture Collection (ATCC) Nº de
Acesso: PTA-11267; (b) a região variável de cadeia leve compreende CDRs que compreen- dem as sequências de aminoácidos das CDRs da região variável de cadeia leve encontradas no anticorpo produzido por um hibridoma de- positado na American Type Culture Collection (ATCC) Nº de Acesso: PTA-11267.
[00241] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-191P4D12 for- necido no presente documento compreende regiões variáveis de ca- deias pesada e leve de um anticorpo designado Ha22-2(2,4)6.1 produ- zido por um hibridoma depositado na American Type Culture Collec- tion (ATCC) Nº de Acesso: PTA-11267 (consulte Figura 3) ou regiões variáveis pesadas e leves que compreendem sequências de aminoá- cidos que são homólogas às sequências de aminoácidos das regiões variáveis de cadeias pesada e leve de Ha22-2(2,4)6.1 e em que os anticorpos retêm as propriedades funcionais desejadas do anticorpo anti-191P4D12 fornecido no presente documento. Como a região constante do anticorpo da invenção, qualquer subclasse de região constante pode ser escolhida. Em uma modalidade, a região constante de IgG1 humana como a região constante de cadeia pesada e a região constante capa de lg humana como a região constante de cadeia leve podem ser usadas.
[00242] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-191P4D12 for- necido no presente documento compreende cadeias pesadas e leves de um anticorpo designado Ha22-2(2,4)6.1 produzido por um hibrido- ma depositado na American Type Culture Collection (ATCC) Nº de Acesso: PTA-11267 (consulte Figura 3) ou cadeias pesadas e leves que compreendem sequências de aminoácidos que são homólogas às sequências de aminoácidos das cadeias pesadas e leves de Ha22- 2(2,4)6.1 e em que os anticorpos retêm as propriedades funcionais desejadas do anticorpo anti-191P4D12 fornecido no presente docu-
mento.
[00243] Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de |i- gação a antígeno do mesmo fornecido no presente documento com- preende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que: (a) a região variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80 % homóloga à sequência de ami- noácidos da região variável de cadeia pesada do anticorpo produzido por um hibridoma depositado na American Type Culture Collection (ATCC) Nº de Acesso: PTA-11267; e (b) a região variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80 % homóloga à sequência de ami- noácidos da região variável de cadeia leve do anticorpo produzido por um hibridoma depositado na American Type Culture Collection (ATCC) Nº de Acesso: PTA-11267.
[00244] Em algumas modalidades, a região variável de cadeia pe- sada compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 85 % homóloga à sequência de aminoácidos da região variável de ca- deia pesada do anticorpo produzido por um hibridoma depositado na American Type Culture Collection (ATCC) Nº de Acesso: PTA-11267. Em outras modalidades, a região variável de cadeia pesada compre- ende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90 % homólo- ga à sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada do anticorpo produzido por um hibridoma depositado na American Type Culture Collection (ATCC) Nº de Acesso: PTA-11267. Em ainda outras modalidades, a região variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95 % homóloga à sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada do an- ticorpo produzido por um hibridoma depositado na American Type Cul- ture Collection (ATCC) Nº de Acesso: PTA-11267. Em outras modali-
dades, a região variável de cadeia pesada pode ser 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % homóloga à sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada do anticorpo produzido por um hibridoma depositado na American Type Culture Collection (ATCC) Nº de Acesso: PTA-11267.
[00245] Em algumas modalidades, a região variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 85 % homóloga à sequência de aminoácidos da região variável de cadeia leve do anticorpo produzido por um hibridoma depositado na American Type Culture Collection (ATCC) Nº de Acesso: PTA-11267. Em outras modalidades, a região variável de cadeia leve compreende uma se- quência de aminoácidos que é pelo menos 90 % homóloga à sequên- cia de aminoácidos da região variável de cadeia leve do anticorpo pro- duzido por um hibridoma depositado na American Type Culture Collec- tion (ATCC) Nº de Acesso: PTA-11267. Em ainda outras modalidades, a região variável de cadeia leve compreende uma sequência de ami- noácidos que é pelo menos 95 % homóloga à sequência de aminoáci- dos da região variável de cadeia leve do anticorpo produzido por um hibridoma depositado na American Type Culture Collection (ATCC) Nº de Acesso: PTA-11267. Em outras modalidades, a região variável de cadeia leve pode ser 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 Y%, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % homóloga à sequên- cia de aminoácidos da região variável de cadeia leve do anticorpo pro- duzido por um hibridoma depositado na American Type Culture Collec- tion (ATCC) Nº de Acesso: PTA-11267.
[00246] Em outras modalidades, o anticorpo ou fragmento de liga- ção a antígeno do mesmo fornecido no presente documento compre- ende uma cadeia pesada e uma cadeia leve, em que: (a) a cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80 % homóloga à sequência de aminoácidos da cadeia pesada do anticorpo produzido por um hibridoma depositado na Ame- rican Type Culture Collection (ATCC) Nº de Acesso: PTA-11267; e (b) a cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80 % homóloga à sequência de aminoácidos da cadeia leve do anticorpo produzido por um hibridoma depositado na American Type Culture Collection (ATCC) Nº de Acesso: PTA-11267.
[00247] Em algumas modalidades, a cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 85 % homóloga à sequência de aminoácidos da cadeia pesada do anticorpo produzido por um hibridoma depositado na American Type Culture Collection (ATCC) Nº de Acesso: PTA-11267. Em outras modalidades, a cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo me- nos 90 % homóloga à sequência de aminoácidos da cadeia pesada do anticorpo produzido por um hibridoma depositado na American Type Culture Collection (ATCC) Nº de Acesso: PTA-11267. Em ainda outras modalidades, a cadeia pesada compreende uma sequência de amino- ácidos que é pelo menos 95 % homóloga à sequência de aminoácidos da cadeia pesada do anticorpo produzido por um hibridoma depositado na American Type Culture Collection (ATCC) Nº de Acesso: PTA-
11267. Em outras modalidades, a cadeia pesada pode ser 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % homóloga à sequência de aminoácidos da cadeia pesa- da do anticorpo produzido por um hibridoma depositado na American Type Culture Collection (ATCC) Nº de Acesso: PTA-11267.
[00248] Em algumas modalidades, a cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 85 % homóloga à se- quência de aminoácidos da cadeia leve do anticorpo produzido por um hibridoma depositado na American Type Culture Collection (ATCC) Nº de Acesso: PTA-11267. Em outras modalidades, a cadeia leve com- preende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90 % ho-
móloga à sequência de aminoácidos da cadeia leve do anticorpo pro- duzido por um hibridoma depositado na American Type Culture Collec- tion (ATCC) Nº de Acesso: PTA-11267. Em ainda outras modalidades, a cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95 % homóloga à sequência de aminoácidos da cadeia leve do anticorpo produzido por um hibridoma depositado na American Type Culture Collection (ATCC) Nº de Acesso: PTA-11267. Em outras mo- dalidades, a cadeia leve pode ser 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % homó- loga à sequência de aminoácidos da cadeia leve do anticorpo produzi- do por um hibridoma depositado na American Type Culture Collection (ATCC) Nº de Acesso: PTA-11267.
[00249] — Anticorpos manipulados fornecidos no presente documento incluem aqueles nos quais modificações foram feitas aos resíduos de estrutura dentro da VH e/ou VL (por exemplo, para melhorar as propri- edades do anticorpo). Normalmente, estas modificações estruturais são feitas para diminuir a imunogenicidade do anticorpo. Por exemplo, uma abordagem é "retromutar" um ou mais resíduos da região estrutu- ral para a sequência da linhagem germinativa correspondente. Mais especificamente, um anticorpo que sofreu mutação somática pode conter resíduos de região estrutural que diferem da sequência da |i- nhagem germinativa da qual o anticorpo é derivado. Estes resíduos podem ser identificados ao comparar as sequências das regiões estru- turais do anticorpo com as sequências da linhagem germinativa das quais o anticorpo é derivado. Para retornar as sequências da região estrutural à sua configuração de linhagem germinativa, as mutações somáticas podem sofrer "retromutação" para a sequência da linhagem germinativa, por exemplo, mutagênese sítio-dirigdida ou mutagênese mediada por PCR (por exemplo, "retromutação" de leucina para metio- nina). Estes anticorpos "retromutantes" também se destinam a ser abrangidos pela invenção.
[00250] Outro tipo de modificação estrutural envolve a mutação de um ou mais resíduos dentro da região estrutural ou mesmo dentro de uma ou mais regiões CDR para remover epítopos de células T para, deste modo, reduzir a imunogenicidade potencial do anticorpo. Esta abordagem é também denominada como "desimunização" e é descrita em mais detalhes na Publicação de Patente Norte-Americana Nº 2003/0153043 para Carr et al.
[00251] —Alternativamente ou além das modificações feitas dentro da região estrutural ou regiões CDR, os anticorpos da invenção podem ser manipulados para incluir modificações dentro da região Fc, tipica- mente para alterar uma ou mais propriedades funcionais do anticorpo, tais como meia-vida sérica, fixação de complemento, ligação ao recep- tor Fc e/ou citotoxicidade celular dependente de antígeno. Além disso, um anticorpo anti-191P4D12 fornecido no presente documento pode ser modificado quimicamente (por exemplo, uma ou mais porções químicas podem ser ligadas ao anticorpo) ou ser modificado para alte- rar sua glicosilação, novamente para alterar uma ou mais propriedades funcionais do anticorpo. Cada uma destas modalidades é descrita em mais detalhes abaixo.
[00252] Em uma modalidade, a região de dobradiça de CH1 é modi- ficada de modo que o número de resíduos de cisteína na região de dobradiça seja alterado, por exemplo, aumentado ou diminuído. Esta abordagem é descrita ainda na Patente Norte-Americana Nº 5.677.425 para Bodmer et al. O número de resíduos de cisteína na região de do- bradiça de CH1 é alterado, por exemplo, para facilitar a montagem das cadeias leve e pesada ou aumentar ou diminuir a estabilidade do anti- corpo anti-191P4D12.
[00253] Em outra modalidade, a região de dobradiça Fc de um anti- corpo sofre mutação para diminuir a meia-vida biológica do anticorpo anti-191P4D12. Mais especificamente, uma ou mais mutações de ami- noácidos são introduzidas na região de interface do domínio CH2-CH3 do fragmento Fc-dobradiça, de modo que o anticorpo tenha ligação da proteína A estafilocócica (SpA) comprometida em relação à ligação do domínio Fc-dobradiça da SpA nativa. Esta abordagem é descrita em mais detalhes na Patente Norte-Americana Nº 6.165.745 para Ward et al.
[00254] Em outra modalidade, o anticorpo anti-191P4D12 é modifi- cado para aumentar sua meia-vida biológica. Várias abordagens são possíveis. Por exemplo, mutações podem ser introduzidas conforme descrito na Patente Norte-Americana Nº 6.277.375 para Ward. Alterna- tivamente, para aumentar a meia-vida biológica, o anticorpo pode ser alterado dentro da região CH1 ou CL para conter um epítopo de liga- ção ao receptor de salvamento retirado de duas alças de um domínio CH2 de uma região Fc de uma IgG, conforme descrito nas Patentes Norte-Americanas Nºº 5.869.046 e 6.121.022 para Presta et al.
[00255] Em ainda outras modalidades, a região Fc é alterada ao substituir pelo menos um resíduo de aminoácido por um resíduo de aminoácido diferente para alterar a(s) função(ões) efetora(s) do anti- corpo. Por exemplo, um ou mais aminoácidos selecionados a partir de resíduos de aminoácidos específicos podem ser substituídos por um resíduo de aminoácido diferente, de modo que o anticorpo tenha uma afinidade alterada por um ligante efetor, mas retenha a capacidade de ligação a antígeno do anticorpo precursor. O ligante efetor para o qual a afinidade é alterada pode ser, por exemplo, um receptor de Fc ou o componente C1 do complemento. Esta abordagem é descrita em mais detalhes nas Patentes Norte-Americanas Nº 5.624.821 e 5.648.260, ambas para Winter et al.
[00256] A reatividade dos anticorpos anti-191P4D12 com uma pro- teína relacionada à 191P4D12 pode ser estabelecida por uma série de meios bem conhecidos, incluindo Western blot, imunoprecipitação, ELISA e análises FACS usando, conforme apropriado, proteínas rela- cionada à 191P4D12, células que expressam 191P4D12 ou extratos das mesmas. Um anticorpo anti-191P4D12 ou fragmento do mesmo pode ser marcado com um marcador detectável ou conjugado a uma segunda molécula. Marcadores detectáveis adequados incluem, po- rém sem limitações, um radioisótopo, um composto fluorescente, um composto bioluminescente, um composto quimioluminescente, um quelante de metal ou uma enzima. Além disso, anticorpos biespeciífi- cos específicos para dois ou mais epítopos na 191P4D12 são gerados usando métodos geralmente conhecidos na técnica. Anticorpos homo- diméricos também podem ser gerados por meio de métodos de reticu- lação conhecidos na técnica (por exemplo, Wolff et al., Cancer Res. 53: 2560-2565).
[00257] Em ainda outra modalidade específica, o anticorpo anti- 191P4D12 fornecido no presente documento é um anticorpo que com- preende a cadeias pesada e leve de um anticorpo designado Ha22- 2(2,4)6.1. A cadeia pesada de Ha22-2(2,4)6.1 consiste na sequência de aminoácidos que varia do 20º resíduo E ao 466º resíduo K de SEQ ID NO: 7 e a cadeia leve de Ha22-2(2,4)6.1 consiste de sequência de aminoácidos que varia de 23º resíduo D ao 236º resíduo C da sequên- cia SEQ ID NO: 8.
[00258] O hibridoma que produz o anticorpo designado Ha22- 2(2,4)6.1 foi enviado (via Federal Express) para a American Type Cul- ture Collection (ATCC), P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108 em 18 de agosto de 2010 e recebeu número de acesso PTA-11267.
[00259] 5.3.2 Agentes Citotóxicos (Unidades de Fármaco)
[00260] Em algumas modalidades, o ADC compreende um anticor- po ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo conjugado a dolas- tatinas ou análogos peptídicos de dolostatina e derivados, as auristati-
nas (Patentes Norte-Americanas Nº* 5.635.483; 5.780.581). Foi de- monstrado que dolastatinas e auristatinas interferem com a dinâmica dos microtúbulos, hidrólise de GTP e divisão nuclear e celular (Woyke et al (2001) Antimicrob. Agents and Chemother. 45 (12): 3580-3584) e têm atividade anticâncer (Patente Norte-Americana Nº 5.663.149) e antifúngica (Pettit et al. (1998) Antimicrob. Agents Chemother. 42: 2961-2965). A unidade de fármaco dolastatina ou auristatina pode ser ligada ao anticorpo através do N-término (amino) ou C-término (carbo- xil) da unidade de fármaco peptídica (documento WO 02/088172).
[00261] “Modalidades exemplificativas de auristatina incluem as uni- dades de monometilauristatina DE e DF ligadas ao N-término descritas em "Senter et al., Proceedings of the American Association for Cancer Research, Volume 45, Resumo Número 623, apresentado em 28 de março de 2004 e descrito na Publicação de Patente Norte-Americana Nº 2005/0238649, cuja invenção é expressamente incorporada a título de referência na íntegra.
[00262] Em algumas modalidades, a auristatina é MMAE (em que a linha ondulada indica a ligação covalente a um ligante de um conjuga- do de anticorpo-fármaco). N ” N LD À. | O O O O
[00263] Em algumas modalidades, uma modalidade exemplificativa que compreende MMAE e um componente ligante (descrito mais adi- ante) tem a seguinte estrutura (em que L apresenta o anticorpo e p varia a partir de 1 a 12): or, te E o L o on" o ; 9 , “,.
[00264] Normalmente, unidades de fármaco com base em peptídeo podem ser preparadas ao formar uma ligação peptídica entre dois ou mais aminoácidos e/ou fragmentos peptídicos. Estas ligações peptídi- cas podem ser preparadas, por exemplo, de acordo com o método de síntese em fase líquida (consulte E. Schróder e K. Lubke, "The Pepti- des", volume 1, páginas 76-136, 1965, Academic Press) que é bem conhecido no campo da química de peptídeos. As unidades de aurista- tina/dolastatina podem ser preparadas de acordo com os métodos de: Patente Norte-Americana Nº 5.635.483; Patente Norte-Americana Nº
5.780.588; Pettit et al (1989) J. Am. Chem. Chem. Soc. 111: 5463- 5465; Pettit et a/. (1998) Anti-Cancer Drug Design 13: 243-277; Pettit, G.R. et al., Synthesis, 1996, 719-725; Pettit et al. (1996) J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1 5: 859-863; e Doronina (2003) Nat Biotechnol 21 (7): 778-78A4.
5.3.3 Ligantes
[00265] — Normalmente, os conjugados de anticorpo-fármaco com- preendem uma unidade de ligação entre a unidade de fármaco (por exemplo, MMAE) e a unidade de anticorpo (por exemplo, o anticorpo anti-191P4D12 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo). Em algumas modalidades, o ligante é clivável sob condições intracelula- res, de modo que a clivagem do ligante libera a unidade de fármaco do anticorpo no ambiente intracelular. Em ainda outras modalidades, a unidade de ligação não é clivável e o fármaco é liberado, por exemplo, através de degradação do anticorpo.
[00266] Em algumas modalidades, o ligante é clivável por um agen- te de clivagem que está presente no ambiente intracelular (por exem- plo, dentro de um lisossoma ou endossomo ou cavéolo). O ligante po- de ser, por exemplo, um ligante de peptidila que é clivado por uma en- zima peptidase ou protease intracelular incluindo, porém sem limita- ções, uma protease lisossômica ou endossômica. Em algumas moda-
lidades, o ligante de peptidila tem pelo menos dois aminoácidos de comprimento ou pelo menos três aminoácidos de comprimento. Agen- tes de clivagem podem incluir catepsinas B e D e plasmina, todos os quais são conhecidos por hidrolisar derivados de fármacos dipeptídi- cos, resultando na liberação do fármaco ativo dentro das células alvo (consulte, por exemplo, Dubowchik e Walquer, 1999, Pharm. Thera- peutics 83: 67-123). Os mais típicos são os ligantes de peptidila que são cliváveis por enzimas que estão presentes em células que expres- sam 191P4D12. Por exemplo, um ligante de peptidila que é clivável pela proteína dependente de tiol de catepsina-B, a qual é altamente expressa em tecido canceroso, pode ser usado (por exemplo, um li- gante de Phe-Leu ou Gly-Phe-Leu-Gly (SEQ ID NO: 15)). Outros exemplos de tais ligantes são descritos, por exemplo, na Patente Nor- te-Americana Nº No. 6.214.345, incorporada ao presente documento a título de referência na íntegra e para todas as finalidades. Em uma modalidade específica, o ligante de peptidila clivável por uma protease intracelular é um ligante de Val-Cit ou um ligante de Phe-Lys (consulte, por exemplo, Patente Norte-Americana Nº 6.214.345, a qual descreve a síntese de doxorrubicina com o ligante de Val-Cit). Uma vantagem de usar a liberação proteolítica intracelular do agente terapêutico é que o agente é, tipicamente, atenuado quando conjugado e as estabilida- des séricas dos conjugados normalmente são altas.
[00267] Em outras modalidades, o ligante clivável é sensível ao pH, isto é, sensível à hidrólise em determinados valores de pH. Normal- mente, o ligante sensível ao pH pode ser hidrolisado sob condições ácidas. Por exemplo, um ligante sensível a ácido que é hidrolisável no lisossoma (por exemplo, uma hidrazona, semicarbazona, tiosemicar- bazona, amida cis-aconítica, ortoéster, acetal, cetal ou similar) pode ser usado (consulte, por exemplo, Patentes Norte-Americanas Nºs
5.122.368; 5.824.805; 5.622.929; Dubowchik e Walquer, 1999, Pharm.
Therapeutics 83: 67-123; Neville et a/l., 1989, Biol. Chem. 264: 14653-
14661.) Tais ligantes são relativamente estáveis sob condições de pH neutro, como no sangue, mas são instáveis abaixo de um pH de 5,5 ou 5,0, o pH aproximado do lisossoma. Em determinadas modalidades, o ligante hidrolisável é um ligante de tioéter (tal como, por exemplo, um tioéter ligado ao agente terapêutico por meio de uma ligação de acil- hidrazona (consulte, por exemplo, Patente Norte-Americana Nº
5.622.929).
[00268] Em ainda outras modalidades, o ligante é clivável sob con- dições redutivas (por exemplo, um ligante de dissulfureto). Uma varie- dade de ligantes de dissulfureto são conhecidos na técnica incluindo, por exemplo, aqueles que podem ser formados usando SATA (N- succinimidil-S-acetiltivacetato), SPDP (N-succinimidil-3-(2-piridilditio) propionato), SPDB (N-succinimidil-3-(2-piridilditio)butirato) e SMPT (N- succinimidil-oxicarbonil-alfa-metil-alfa-(2-piridil-ditio)tolueno), SPDB e SMPT (consulte, por exemplo, Thorpe et al., 1987, Cancer Res. 47: 5924-5931; Wawrzynczak et al. em Immunoconjugates: Antibody Con- jugates in Radioimagery and Therapy of Cancer (C.W. Vogel ed., Ox- ford U. Press, 1987. Consulte também Patente Norte-Americana Nº
4.880.935).
[00269] Em ainda outras modalidades específicas, o ligante é um ligante de malonato (Johnson et al., 1995, Anticancer Res. 15: 1387- 93), um ligante de maleimidobenzoíla (Lau et a/., 1995, Bioorg-Med- Chem. 3 (10): 1299-1304) ou um análogo de 3'-N-amida (Lau et al., 1995, Bioorg-Med-Chem. 3 (10): 1305-12).
[00270] Em ainda outras modalidades, a unidade de ligação não é clivável e o fármaco é liberado pela degradação do anticorpo (consulte Publicação Norte-Americana Nº 2005/0238649, incorporada ao pre- sente documento a título de referência na íntegra e para todas as fina- lidades).
[00271] Normalmente, o ligante não é substancialmente sensível ao ambiente extracelular. Conforme usado no presente documento, "não substancialmente sensível ao ambiente extracelular", no contexto de um ligante, significa que não mais do que cerca de 20 %, tipicamente não mais do que cerca de 15 %, mais tipicamente não mais do que cerca de 10 % e, ainda mais tipicamente, não mais do que cerca de 5 %, não mais do que cerca de 3 % ou não mais do que cerca de 1 % dos ligantes, em uma amostra de conjugado de anticorpo-fármaco, são clivados quando o conjugado de anticorpo-fármaco se apresenta em um ambiente extracelular (por exemplo, no plasma). Se um ligante não é substancialmente sensível ao ambiente extracelular pode ser deter- minado, por exemplo, ao incubar com plasma o composto conjugado de anticorpo-fármaco durante um período de tempo predeterminado (por exemplo, 2, 4, 8, 16 ou 24 horas) e, então, quantificar a quantida- de de fármaco livre presente no plasma.
[00272] Em outras modalidades não mutuamente exclusivas, o li- gante promove a internalização celular. Em determinadas modalida- des, o ligante promove a internalização celular quando conjugado com o agente terapêutico (ou seja, no meio da porção ligante-agente tera- pêutico do composto de conjugado de anticorpo-fármaco, conforme descrito no presente documento). Em ainda outras modalidades, o li- gante promove a internalização celular quando conjugado com o com- posto de auristatina e o anticorpo anti-191P4D12 ou fragmento de |li- gação a antígeno do mesmo.
[00273] Uma variedade de ligantes exemplificativos que podem ser usados com as presentes composições e métodos é descrita no docu- mento WO 2004-010957, Publicação Norte-Americana Nº 2006/0074008, Publicação Norte-Americana Nº 20050238649 e Publicação Norte- Americana Nº 2006/0024317 (cada um dos quais é incorporado a título de referência ao presente documento na íntegra e para todas as finali-
dades).
[00274] Uma "unidade de ligação" (LU) é um composto bifuncional que pode ser usado para ligar uma unidade de fármaco e uma unidade de anticorpo para formar um conjugado de anticorpo-fármaco. Em al- gumas modalidades, a unidade de ligação tem a fórmula: Aa Wy-Yy- em que: -A- é uma unidade extensora, aéboul, cada -W- é independentemente uma unidade de aminoáci- do, w é um número inteiro que varia a partir de 0 a 12, -Y- é uma unidade espaçadora autoimolativa, e yé0O,1ou2.
[00275] Em algumas modalidades, a é 0 ou 1, vwé 0 ou 1eyé 0,1 ou 2. Em algumas modalidades, a é 0 ou 1, wé 0 ou 1eyé0Ooul. Em algumas modalidades, quando w é 1 a 12, y é 1 ou 2. Em algumas modalidades, w é 2a 12e€ y é 1 ou 2. Em algumas modalidades, a é 1 eweysão0O.
5.3.3.1 Unidade Extensora
[00276] A unidade extensora (A), quando presente, é capaz de ligar uma unidade de anticorpo a uma unidade de aminoácido (-W-), se presente, a uma unidade espaçadora (-Y-), se presente; ou a uma uni- dade de fármaco (-D). Grupos funcionais úteis que podem estar pre- sentes em um anticorpo anti-191P4D12 ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo (por exemplo, Ha22-2(2,4)6.1), tanto naturalmente quanto por meio de manipulação química incluem, porém sem limita- ções, sulfidrila, amino, hidroxila, o grupo hidroxila anomérico de um carboidrato e carboxila. Grupos funcionais adequados são sulfidrila e amino. Em um exemplo, grupos sulfidrila podem ser gerados por meio de redução das ligações de dissulfureto intramoleculares de um anti- corpo anti-191P4D12 ou um fragmento de ligação a antígeno do mes- mo. Em outra modalidade, os grupos sulfidrila podem ser gerados pela reação de um grupo amino de uma porção lisina de um anticorpo anti- 191P4D12 ou um fragmento de ligação a antígeno com 2-iminotiolano (reagente de Traut) ou outros reagentes geradores de sulfidrila. Em determinadas modalidades, o anticorpo anti-191P4D12 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo é um anticorpo recombinante e é manipulado para portar uma ou mais lisinas. Em determinadas outras modalidades, o anticorpo anti-191P4D12 recombinante é manipulado para portar grupos sulfidrila adicionais, por exemplo, cisteínas adicio- nais.
[00277] Em uma modalidade, a unidade extensora forma uma liga- ção com um átomo de enxofre da unidade de anticorpo. O átomo de enxofre pode ser derivado de um grupo sulfidrila de um anticorpo. As unidades extensoras representativas desta modalidade são represen- tadas dentro dos colchetes das Fórmulas llla e Illb abaixo, em que L-, -W-, -Y-, -D, w e y são conforme definido acima e R'” é selecionado a partir de -C1-C1o alquileno-, -C1-C1o alquenileno-, -C1-C10o alquinileno-, carbociclo-, -O-(C1-Cg alquileno)-, O-(C1-Cg alquenileno)-, -O-(C1-Cs8 alquinileno)-, -arileno-, -C1-C1o alquileno-arileno-, -C2-C10 alquenileno- arileno, -C2-C10 alquinileno-arileno, -arileno-C1-C10 alquileno-, -arileno- C2-C1o alquenileno-, -arileno-C2-C1o alquinileno-, -C1-C1o alquileno- (carbociclo)-, -C2-C10 alquenileno-( carbociclo)-, -C2-C1o alquinileno- (carbociclo)-, -(carbociclo)-C1-C1o alquileno-, -(carbociclo)-C2-C109 al- quenileno-, -(carbociclo)-C2-C10 alquinileno, -heterociclo-, -C1-C10 alqui- leno-(heterociclo)-, -C2-C1o alquenileno-(heterociclo)-, -C2-C1o alquini- leno-(heterociclo)-, -(heterociclo)-C1-C1o alquileno-, -( heterociclo)-C>2- C10 alquenileno-, -( heterociclo)-C1-C10 alquinileno-, -(CH2CH20O),;- ou - (CH2CH20),--CH>2-, e r é um número inteiro que varia a partir de 1-10,
em que em que os ditos radicais alquila, alquenila, alquinila, alquileno, alquenileno, alquinileno, arila, carbociclo, carbociclo, heterociclo e ari- leno, seja individualmente ou como parte de outro grupo, são opcio- nalmente substituídos. Em algumas modalidades, os ditos radicais al- quila, alquenila, alquinila, alquileno, alquenileno, alquinileno, arila, car- bociclo, carbociclo, heterociclo e arileno, seja individualmente ou como parte de outro grupo, são não substituídos.
[00278] Em algumas modalidades, R'” é selecionado a partir de - C1-C1o alquileno-, -carbociclo-, -O-(C1-Cg alquileno)-, -arileno-, -C1-C1o alquileno-arileno-, -arileno-C1-C1o alquileno-, -C1-C1o alquileno-(carbo- ciclo)-, -( carbociclo)-C1-C109 alquileno-, -C3-Cg heterociclo-, -C1-C1o al- quileno-( heterociclo)-, -( heterociclo)-C1-C109 alquileno-, -(CH2CH2O)--, e -(CH2CH20),-CH>2-; e r é um número inteiro que varia a partir de 1-10, em que os ditos grupos alquileno são não substituídos e o restante dos grupos são opcionalmente substituídos.
[00279] Deve ser entendido a partir de todas as modalidades exemplificativas que, mesmo quando não indicado expressamente, 1 a unidades de fármaco podem ser ligadas a uma unidade de anticor- po (p = 1-20).
O E sao
O Ila elon-contRT=c(o-wy=x,-0 Illb
[00280] Uma unidade extensora ilustrativa é aquela de Fórmula llla em que R*' é -(CH>)s-:
Oo
OA
O > :
[00281] Outra unidade extensora ilustrativa é aquela de Fórmula llla em que R*' é -(CH2CH20)--CH2-; e r é 2: Oo
OA Oo o
[00282] Uma unidade extensora ilustrativa é aquela de Fórmula llla em que R”* é arileno- ou arileno-C1-C1o alquileno-. Em algumas moda- lidades, o grupo arila é um grupo fenila não substituído.
[00283] Ainda outra unidade extensora ilustrativa é aquela de Fór- mula Illb em que R*7 é -(CH>)s: Oo
ÁSIA o
[00284] Em determinadas modalidades, a unidade extensora está ligada à unidade de anticorpo através de uma ligação de dissulfureto entre um átomo de enxofre da unidade de anticorpo e um átomo de enxofre da unidade extensora. Uma unidade extensora representativa desta modalidade é representada dentro dos colchetes da Fórmula |V, em que R“*, L-, -W-, -Y-, -D, w e y são conforme definido acima. Lslsri=col-nan o
DD
[00285] Deve ser observado que, ao longo do presente pedido, a porção S na fórmula abaixo refere-se a um átomo de enxofre da uni- dade de anticorpo, a menos que indicado de outra forma pelo contex- to.
st
[00286] Em algumas das descrições estruturais do ADC ligado a enxofre no presente documento, o anticorpo é representado como "L". ele também pode ser indicado como "Ab-S". A inclusão de "S" indica meramente a característica de ligação de enxofre e não indica que um átomo de enxofre particular traz múltiplas porções de ligante-fármaco. Os parênteses à esquerda das estruturas usando a descrição "Ab-S" também podem ser colocados à esquerda do átomo de enxofre, entre Ab e S, o que seria uma descrição equivalente do ADC da invenção descrito no presente documento.
[00287] Em ainda outras modalidades, o extensor contém um sítio reativo que pode formar uma ligação com um grupo amino primário ou secundário de uma unidade de anticorpo. Exemplos destes sítios rea- tivos incluem, porém sem limitações, ésteres ativados, tais como éste- res de succinimida, ésteres 4-nitrofenílicos, ésteres pentafluorofeníli- cos, ésteres tetrafluorofenílicos, anidridos, cloretos de ácido, cloretos de sulfonila, isocianatos e isotiocianatos. As unidades extensoras re- presentativas desta modalidade são representadas entre colchetes nas Fórmulas Va e Vb, em que -R'”-, L-, -W-, -Y-, -D, w e y são con- forme definido acima: ir eoncencoo dv D Va õ LAT CNH-R!-C(O)JTAW, Y,y-D Vb
[00288] Em algumas modalidades, o extensor contém um sítio rea- tivo que é reativo a um grupo carboidrato modificado (-CHO) que pode estar presente em uma unidade de anticorpo. Por exemplo, um carboi- drato pode ser levemente oxidado usando um reagente tal como peri- odato de sódio e a unidade (-CHO) resultante do carboidrato oxidado pode ser condensada com um extensor que contém uma funcionalida- de, tal como uma hidrazida, uma oxima, uma amina primária ou se- cundária, uma hidrazina, uma tiossemicarbazona, um carboxilato de hidrazina e uma aril-hidrazida, tais como aquelas descritas por Kaneko et al., 1991, Bioconjugate Chem. 2: 133-41. As unidades extensoras representativas desta modalidade são representadas dentro dos col- chetes nas Fórmulas Vla, Vlb e Vlc, em que -R'”-, L-, -W-, -Y-, -D, w e y são conforme definido acima. L meto mo Vila L porco bm xo Vlb
O L cat rcolnoço Vilc
5.3.3.2 Unidade de Aminoácido
[00289] A unidade de aminoácido (-W-), quando presente, liga a unidade extensora à unidade espaçadora se a unidade espaçadora estiver presente, liga a unidade extensora à unidade de fármaco se a unidade espaçadora estiver ausente e liga a unidade de anticorpo à unidade de fármaco se a unidade extensora e a unidade espaçadora estiverem ausentes.
[00290] Wry- pode ser, por exemplo, uma unidade de monopeptídeo, dipeptídeo, tripeptídeo, tetrapeptídeo, pentapeptídeo, hexapeptídeo,
heptapeptídeo, octapeptídeo, nonapeptídeo, decapeptídeo, undeca- peptídeo ou dodecapeptídeo. Cada unidade -W- tem, independente- mente, a fórmula denotada abaixo entre colchetes e w é um número inteiro que varia a partir de 0 a 12: o PV o
N N . o Y Si ou em que R'*º é hidrogênio, metila, isopropila, isobutila, sec-butila, benzila, p-hidroxibenzila, -CH20H, -CH(OH)CH3, -CH2CH2SCH3, -CH2CONH>, - CH2COOH, -CH2CH2CONH>2, -CH2CH2COOH, -(CH2);NHC(=NH)NH,>, - (CH2)3NH>2, -(CH2);NHCOCH3, -(CH2);:NHCHO, -(CH2)ANHC(=NH)NH,>, -(CH2)aNH2, -(CH2)ANHCOCH3, -(CH2)NHCHO, -(CH2);NHCONH,>, - (CH2)ANHCONH>2, -CH2CH2CH(OH)CH2aNH>2, 2-piridilmetila-, 3-piridil- metila-, 4-piridilmetila-, fenila, ciclo-hexila. DO i <
N a O O | N
[00291] Em algumas modalidades, a unidade de aminoácido pode ser clivada enzimaticamente por uma ou mais enzimas, incluindo uma protease associada a câncer ou tumor, para liberar a unidade de fár-
maco (-D) a qual, em uma modalidade, é protonada in vivo após a libe- ração para fornecer um fármaco (D).
[00292] Em determinadas modalidades, a unidade de aminoácido compreende aminoácidos naturais. Em outras modalidades, a unidade de aminoácido compreende aminoácidos não naturais. Unidades Ww ilustrativas são representadas pelas Fórmulas VII-IX abaixo: Oo R21
H ONO
H R2º o VII em que R?º e R?º são como segue: (CH2);NHCONH>; (CH2);NHCONH>; || isobutia | (CH2);:NHCONH>; (CH2);NHCONH>; "TS N (CH2);:NHCONH>;
H (CH2);NHC(=NH)NH>; Oo R21 O
O N % AY x R2º o R VII em que R2º, R2º e R?? são como segue:
fo] R?1 O R
H H SONO
H H R2o o Rº O X em que R2?º, R2!, Rº e R$ são como segue: [reta [ scoata] mata [sonata
[00293] Unidades de aminoácidos exemplificativas incluem, porém sem limitações, unidades de Fórmula VII acima, onde: R?º é benzila e R2' é -(CH2)aNH>2; R2º é isopropila e R2º é -(CH2)ANH>2; ou Rº é isopro- pila e R?º é -(CH2);NHCONH>.
[00294] Outra unidade de aminoácido exemplificativa é uma unida- de de Fórmula VIIl em que Rºº é benzila, Rºº é benzila e R2º é - (CH2)aNH>.
[00295] “Unidades -W,- úteis podem ser manipuladas e otimizadas em relação à sua seletividade para clivagem enzimática por uma en- zima particular, por exemplo, uma protease associada a tumor. Em uma modalidade, uma unidade -Wy- é aquela cuja clivagem é catalisa- da pela catepsina B, C e D ou uma plasmina protease.
[00296] Em uma modalidade, -Wv- é um dipeptídeo, tripeptídeo, te- trapeptídeo ou pentapeptídeo. Quando R*º, R2º, R2!, R22º ou R?* é dife- rente de hidrogênio, o átomo de carbono ao qual R'!º, R2º, R21, R22 ou R? está ligado é quiral.
[00297] Cada átomo de carbono ao qual R'º, R2º, R2!, R2 ou Rº está ligado está, independentemente, na configuração (S) ou (R).
[00298] Em uma modalidade específica, a unidade de aminoácido é valina-citrulina (vc ou Val-Cit). Em outra modalidade específica, a uni- dade de aminoácido é fenilalanina-lisina (isto é, fk). Em ainda outra modalidade específica, a unidade de aminoácido é N-metilvalina- citrulina. Em ainda outra modalidade específica, a unidade de aminoá- cido é ácido 5-aminovalérico, homo fenilalanina lisina, tetraisoquinoli- nocarboxilato lisina, ciclo-hexilalanina lisina, ácido isonepecótico lisina, beta-alanina lisina, glicina serina valina glutamina e ácido isonepecóti- co.
5.3.3.3 Unidade Espaçadora
[00299] A unidade espaçadora (-Y-), quando presente, liga uma unidade de aminoácido à unidade de fármaco quando uma unidade de aminoácido está presente. Alternativamente, a unidade espaçadora liga a unidade extensora à unidade de fármaco quando a unidade de aminoácido está ausente. A unidade espaçadora também liga a unida- de de fármaco à unidade de anticorpo quando a unidade de aminoáci- do e a unidade extensora estão ausentes.
[00300] As unidades espaçadoras são de dois tipos gerais: não au- toimolativas ou autoimolativas. Uma unidade espaçadora não autoimo- lativa é aquela em que parte ou a totalidade da unidade espaçadora permanece ligada à unidade de fármaco após a clivagem, particular- mente enzimática, de uma unidade de aminoácido do conjugado de anticorpo-fármaco. Exemplos de uma unidade espaçadora não autoi- molativa incluem, porém sem limitações uma unidade espaçadora (gli- cina-glicina) e uma unidade espaçadora de glicina (ambas representa- das no Esquema 1) (infra). Quando um conjugado que contém uma unidade espaçadora de glicina-glicina ou uma unidade espaçadora de glicina sofre clivagem enzimática por meio de uma enzima (por exem- plo, uma protease associada a células tumorais, uma protease associ- ada a células cancerosas ou uma protease associada a linfócitos),
uma unidade de glicina-fármaco ou uma unidade de glicina-fármaco é clivada de L-Aa-Ww-. Em uma modalidade, uma reação de hidrólise independente ocorre dentro da célula alvo, clivando a ligação da uni- dade de glicina-fármaco e liberando o fármaco. Esquema 1 L Taweo WD | FA, W., > Gh Gy bo agem | nica | Gl-D Gly-Ghy-D hidrólise | hidrólise | Fármaco Fármaco
[00301] Em algumas modalidades, uma unidade espaçadora não autoimolativa (-Y-) é -Gly-. Em algumas modalidades, uma unidade espaçadora não autoimolativa (-Y-) é -Gly-Gly-.
[00302] Em uma modalidade, a unidade espaçadora está ausente (- Y,- onde y = O).
[00303] Alternativamente, um conjugado de anticorpo-fármaco que contém uma unidade espaçadora autoimolativa pode liberar -D. Con- forme usado no presente documento, o termo "espaçador autoimolati- vo" refere-se a uma porção química bifuncional que é capaz de ligar covalentemente duas porções químicas espaçadas em uma molécula tripartida estável. Ele se separará espontaneamente da segunda por- ção química se sua ligação à primeira porção for clivada.
[00304] Em algumas modalidades, -Y,- é uma unidade de álcool p- aminobenzílico (PAB) (consulte Esquemas 2 e 3), cuja porção fenileno é substituída por Qm em que Q é -C1-C;g alquila, -C1-Cg alquenila, -C1- Cs alquinila, -O-(C1-Cg alquila), -O-(C1-Csg alquenila), -O-(C1-Cs alquini- la), -halogênio, - nitro ou -ciano; e m é um número inteiro que varia a partir de 0-4. Os grupos alquila, alquenila e alquinila, seja individual- mente ou como parte de outro grupo, podem ser opcionalmente substi-
tuídos.
[00305] Em algumas modalidades, -Y- é um grupo PAB que está ligado a -Wuw- através do átomo de nitrogênio amino do grupo PAB e conectado diretamente a -D através de um grupo carbonato, carbama- to ou éter. Sem estar limitado por qualquer teoria ou mecanismo parti- cular, o Esquema 2 descreve um possível mecanismo de liberação de fármaco de um grupo PAB que está ligado diretamente a -D através de um grupo carbamato ou carbonato, conforme descrito por Toki et al., 2002, J. Org. Chem. 67: 1866-1872. Esquema 2 Qm fer º p clivagem enzimática Qm | EO e | Ss 0—C—D
O | 1,6-eliminação Fármaco
[00306] “No Esquema 2, Q é -C1-Cg alquila, -C1-Cs8 alquenila, -C1-Cs8 alquinila, -O-(C1-Cg alquila), -O-(C1-Cs8 alquenila), -O-(C1-Cg alquinila), - halogênio, -nitro ou -ciano; m é um número inteiro que varia a partir de 0-4; e p varia a partir de 1 a cerca de 20. Os grupos alquila, alquenila e alquinila, seja individualmente ou como parte de outro grupo, podem ser opcionalmente substituídos.
[00307] Sem estar limitado por qualquer teoria ou mecanismo parti- cular, o Esquema 3 representa um possível mecanismo de liberação de fármaco de um grupo PAB que está ligado diretamente a -D através de uma ligação de éter ou amina, em que D inclui o grupo oxigênio ou nitrogênio que é parte da unidade de fármaco. Esquema 3 Am de E AsWIANH OD
D p clivagem enzimática Qm
EO 2 = à Aa D | 1,6-eliminação Qm na + Fármaco
[00308] “No Esquema 3, Q é -C1-Cg alquila, -C1-Cs8 alquenila, -C1-Cg alquinila, -O-(C1-Cg alquila), -O-(C1-Cs8 alquenila), -O-(C1-Cg alquinila), - halogênio, -nitro ou -ciano; m é um número inteiro que varia a partir de 0-4; e p varia a partir de 1 a cerca de 20. Os grupos alquila, alquenila e alquinila, seja individualmente ou como parte de outro grupo, podem ser opcionalmente substituídos.
[00309] Outros exemplos de espaçadores autoimolativos incluem, porém sem limitações, compostos aromáticos que são eletronicamente similares ao grupo PAB, tais como derivados de 2-aminoimidazol-5- metanol (Hay et a/., 1999, Bioorg. Med. Chem. Lett. 9: 2237) e orto ou para-aminobenzilacetais. Podem ser usados espaçadores que sofrem ciclização após hidrólise da ligação de amida, tais como amidas de ácido 4-aminobutírico substituídas e não substituídas (Rodrigues et al., 1995, Chemistry Biology 2: 223), sistemas de anel biciclo[2.2.1] e bici- clo[2.2.2] (Storm et al., 1972, J. Amer. Chem. Soc. 94: 5815) e amidas de ácido 2-aminofenilpropiônico (Amsberry et a/l., 1990, J. Org. Chem. 55: 5867). A eliminação de fármacos que contêm amina que são subs- tituídos na posição a da glicina (Kingsbury et a/l., 1984, J. Med. Chem. 27: 1447) também são exemplos de espaçadores autoimolativos.
[00310] Em uma modalidade, a unidade espaçadora é uma unidade ramificada de bis(hidroximetil)-estireno (BHMS), conforme representa- do no Esquema 4, a qual pode ser usada para incorporar e liberar vá- rios fármacos. Esquema 4 Ar — CHO(C(O)))-D am coco) p clivagem | enzimática 2 fármacos
[00311] No Esquema 4, Q é -C1-Cg alquila, -C1-Cs8 alquenila, -C1-Cg alquinila, -O-(C1-Cg alquila), -O-(C1-Cs8 alquenila), -O-(C1-Cg alquinila), - halogênio, -nitro ou -ciano; m é um número inteiro que varia a partir de 0-4; né O ou 1; e p varia a partir de 1 a cerca de 20. Os grupos alquila, alquenila e alquinila, seja individualmente ou como parte de outro gru- po, podem ser opcionalmente substituídos.
[00312] Em algumas modalidades, as unidades -D são as mesmas. Em ainda outra modalidade, as porções -D são diferentes.
[00313] Em um aspecto, as unidades espaçadoras (-Y,-) são repre- sentadas pelas Fórmulas X-XII:
H Q — m e ás Pá A oO XxX
[00314] em que Q é -C1r-Csg alquila, -C1-Cg alquenila, -C1-Cg alquini- la, -O-(C1-C8 alquila), -O-(C:-Cg alquenila), -O-(C1-C8 alquinila), - halogênio, -nitro ou -ciano; e m é um número inteiro que varia a partir de 0-4. Os grupos alquila, alquenila e alquinila, seja individualmente ou como parte de outro grupo, podem ser opcionalmente substituídos. i—HN-CH-COSx,, | NHCHZ0(0)NHCHZC(O0)—: XII.
[00315] As modalidades das Fórmulas | e |l que compreendem compostos conjugados de anticorpo-fármaco podem incluir: o é ODIN WD ) | ; So p em que w e y são, cada um, 0, 1 ou2,e o
NOSSA D —— A o o p em que w e y são, cada um, O, o " o SO L—H-A,-HN N a
SR H Oo P
NH o= NH>z o TEA Xido,. )
S o=< NH e o i o fe) T o O?
ASA
S o< NH?
5.3.3.4 Carga de Fármaco
[00316] A carga de fármaco é representada por p e é o número mé- dio de unidades de fármaco por anticorpo em uma molécula. A carga de fármaco pode variar a partir de 1 a 20 unidades de fármaco (D) por anticorpo. Os ADCs fornecidos no presente documento incluem cole- ções de anticorpos ou fragmentos de ligação de antígeno dos mesmos conjugados com uma variedade de unidades de fármaco, por exemplo, a partir de 1 a 20. O número médio de unidades de fármaco por anti- corpo em preparações de ADC nas reações de conjugação pode ser caracterizado por meios convencionais, tais como espectroscopia de massa e ensaio ELISA. A distribuição quantitativa de ADC em termos de p também pode ser determinada. Em alguns casos, a separação, purificação e caracterização de um ADC homogêneo, onde p é um de- terminado valor de ADC com outras cargas de fármaco, podem ser obtidas por meio de eletroforese.
[00317] Em determinadas modalidades, a carga de fármaco para um ADC fornecido no presente documento varia a partir de 1 a 20. Em determinadas modalidades, a carga de fármaco para um ADC forneci- do no presente documento varia a partir de 1 a 18. Em determinadas modalidades, a carga de fármaco para um ADC fornecido no presente documento varia a partir de 1 a 15. Em determinadas modalidades, a carga de fármaco para um ADC fornecida no presente documento va- ria a partir de 1 a 12. Em determinadas modalidades, a carga de fár- maco para um ADC fornecida no presente documento varia a partir de 1 a 10. Em determinadas modalidades, a carga de fármaco para um ADC fornecido no presente documento varia a partir de 1 a 9. Em de- terminadas modalidades, a carga de fármaco para um ADC fornecido no presente documento varia a partir de 1 a 8. Em determinadas mo- dalidades, a carga de fármaco para um ADC fornecido no presente documento varia a partir de 1 a 7. Em determinadas modalidades, a carga de fármaco para um ADC fornecido no presente documento va- ria a partir de 1 a 6. Em determinadas modalidades, a carga de fárma- co para um ADC fornecido no presente documento varia a partirde 1a
5. Em determinadas modalidades, a carga de fármaco para um ADC fornecido no presente documento varia a partir de 1 a 4. Em determi- nada em modalidades, a carga de fármaco para um ADC fornecido no presente documento varia a partir de 1 a 3. Em determinadas modali- dades, a carga de fármaco para um ADC fornecido no presente docu- mento varia a partir de 2 a 12. Em determinadas modalidades, a carga de fármaco para um ADC fornecido no presente documento varia a partir de 2 a 10. Em determinadas modalidades, a carga de fármaco para um ADC fornecido no presente documento varia a partir de 2a 9. Em determinadas modalidades, a carga de fármaco para um ADC for- necido no presente documento varia a partir de 2 a 8. Em determina- das modalidades, a carga de fármaco para um ADC fornecido no pre- sente documento varia a partir de 2 a 7. Em determinadas modalida- des, a carga de fármaco para um ADC fornecido no presente docu-
mento varia a partir de 2 a 6. Em determinadas modalidades, a carga de fármaco para um ADC fornecido no presente documento varia a partir de 2a 5.
[00318] Em determinadas modalidades, a carga de fármaco para um ADC fornecido no presente documento varia a partir de 1 a cerca de 8; a partir de cerca de 2 a cerca de 6; a partir de cerca de 3 a cerca de 5; a partir de cerca de 3 a cerca de 4; a partir de cerca de 3,1 a cer- ca de 3,9; a partir de cerca de 3,2 a cerca de 3,8; a partir de cerca de 3,2 a cerca de 3,7; a partir de cerca de 3,2 a cerca de 3,6; a partir de cerca de 3,3 a cerca de 3,8; ou a partir de cerca de 3,3 a cerca de 3,7.
[00319] Em determinadas modalidades, menos do que o máximo teórico de unidades de fármaco são conjugadas a um anticorpo duran- te uma reação de conjugação. Um anticorpo pode conter, por exemplo, resíduos de lisina que não reagem com o intermediário fármaco-ligante ou reagente-ligante. Em geral, os anticorpos não contêm muitos gru- pos tiol de cisteína livres e reativos que podem ser ligados a uma uni- dade de fármaco; na verdade, a maioria dos resíduos de tiol de cisteí- na em anticorpos existem como pontes de dissulfureto. Em determina- das modalidades, um anticorpo pode ser reduzido com um agente re- dutor, tal como ditiotreitol (DTT) ou tricarboniletilfosfina (TCEP), sob condições redutivas parciais ou totais, para gerar grupos tiol de cisteí- na reativos. Em determinadas modalidades, um anticorpo é submetido a condições desnaturantes para descrever grupos nucleofílicos reati- vos, tais como lisina ou cisteína. Em algumas modalidades, a unidade de ligação ou uma unidade de fármaco é conjugada por meio de um resíduo de lisina à unidade de anticorpo. Em algumas modalidades, a unidade de ligação ou uma unidade de fármaco é conjugada por meio de um resíduo de cisteína à unidade de anticorpo.
[00320] Em algumas modalidades, o aminoácido que se liga a uma unidade de ligação ou uma unidade de fármaco está na cadeia pesada de um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo. Em algumas modalidades, o aminoácido que se liga a uma unidade de |i- gação ou uma unidade de fármaco está na cadeia leve de um anticor- po ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo. Em algumas moda- lidades, o aminoácido que se liga a uma unidade de ligação ou uma unidade de fármaco está na região de dobradiça de um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo. Em algumas modalida- des, o aminoácido que se liga a uma unidade de ligação ou uma uni- dade de fármaco está na região Fc de um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo. Em outras modalidades, o aminoácido que se liga a uma unidade de ligação ou unidade de fármaco está na região constante (por exemplo, CH1, CH2 ou CH3 de uma cadeia pe- sada ou CH1 de uma cadeia leve) de um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo. Em ainda outras modalidades, o amino- ácido que se liga a uma unidade de ligação ou uma unidade de fárma- co está nas regiões estruturais de VH de um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo. Em ainda outras modalidades, o aminoácido que se liga a uma unidade de ligação ou uma unidade de fármaco está nas regiões estruturais de VL de um anticorpo ou frag- mento de ligação a antígeno do mesmo.
[00321] A carga (proporção de fármaco/anticorpo) de um ADC pode ser controlada de diferentes maneiras, por exemplo, ao: (i) limitar o excesso molar de intermediário de fármaco-ligante ou reagente-ligante em relação ao anticorpo, (ii) limitar o tempo de conjugação ou tempe- ratura de reação, (iii) condições redutoras parciais ou limitativas para modificação de tiol de cisteína, (iv) manipulação por meio de técnicas recombinantes da sequência de aminoácidos do anticorpo, de modo que o número e a posição dos resíduos de cisteína sejam modificados para controle do número e/ou posição de ligações de ligante-fármaco (tal como tioMab ou tioFab preparado conforme descrito no presente documento e no documento WO2006/034488 (incorporado a título de referência na íntegra)).
[00322] Deve ser entendido que, onde mais de um grupo nucleofí- lico reage com um intermediário de ligante-fármaco ou reagente- ligante seguido por uma unidade de fármaco, então, o produto resul- tante é uma mistura de compostos de ADC com uma distribuição de uma ou mais unidades de fármaco ligadas a uma unidade de anticor- po. O número médio de fármacos por anticorpo pode ser calculado a partir da mistura através de um ensaio de anticorpos ELISA duplo, o qual é específico para o anticorpo e específico para o fármaco. As mo- léculas de ADC individuais podem ser identificadas na mistura por meio de espectroscopia de massa e separadas por HPLC, por exem- plo, cromatografia de interação hidrofóbica (consulte, por exemplo, Hamblett, K.J. et al. "Effect of drug loading on the pharmacology, pharmacokinetics, e toxicity of an anti-CD30 antibody-drug conjugate", Resumo nº 624, American Association for Cancer Research, Reunião Anual de 27-31 de março de 2004, Proceedings of the AACR, Volume 45, março de 2004; Alley, S.C. et al. "Controlling the location of drug attachment in antibody-drug conjugates", Resumo nº 627, American Association for Cancer Research, Reunião Anual de 27-31 de março de 2004, Proceedings of the AACR, Volume 45, Março de 2004). Em determinadas modalidades, um ADC homogêneo com um único valor de carga pode ser isolado da mistura de conjugação por meio de ele- troforese ou cromatografia.
5.3.3 Preparação dos Conjugados de Anticorpo-Fármaco
[00323] A geração dos conjugados de anticorpo-fármaco fornecidos no presente documento pode ser realizada através de qualquer méto- do conhecido por aqueles versados na técnica. Resumidamente, os conjugados de anticorpo-fármaco compreendem um anticorpo anti- 191P4D12 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo como a uni-
dade de anticorpo, um fármaco e, opcionalmente, um ligante que une o fármaco e o agente de ligação. Em algumas modalidades, o anticor- po é o anticorpo anti-191P4D12 que compreende as regiões CDR de um anticorpo designado Ha22-2(2,4)6.1 descrito acima. Em uma mo- dalidade específica, o anticorpo é o anticorpo anti-191P4D12 que compreende regiões variáveis das cadeias pesada e leve de um anti- corpo designado Ha22-2(2,4)6.1 descrito acima. Em uma modalidade específica, o anticorpo é o anticorpo anti-191P4D12 que compreende as cadeias pesada e leve de um anticorpo designado Ha22-2(2,4)6.1 descrito acima.
[00324] Uma série de reações diferentes estão disponíveis para |li- gação covalente de fármacos e/ou ligantes a agentes de ligação. Isto é frequentemente realizado pela reação dos resíduos de aminoácidos do agente de ligação, por exemplo, molécula de anticorpo, incluindo os grupos amina da lisina, os grupos ácido carboxílico livres do ácido glu- tâmico e aspártico, os grupos sulfidrila da cisteína e as várias porções do aminoácidos aromáticos. Um dos métodos não específicos mais comumente usados de ligação covalente é a reação de carbodi-imida para ligar um grupo carbóxi (ou amino) de um composto a grupos ami- no (ou carbóxi) do anticorpo. Adicionalmente, agentes bifuncionais, tais como dialdeídos ou imidoésteres, têm sido usados para ligar o grupo amino de um composto a grupos amino de uma molécula de an- ticorpo. Também disponível para ligação de fármacos a agentes de ligação está a reação de base de Schiff. Este método envolve a oxida- ção de periodato de um fármaco que contém grupos glicol ou hidroxila, deste modo, formando um aldeído que é, então, reagido com o agente de ligação. A ligação ocorre através da formação de uma base de Schiff com grupos amino do agente de ligação. Isotiocianatos também podem ser usados como agentes de acoplamento para ligar covalen- temente fármacos a agentes de ligação. Outros métodos são conheci-
dos por aqueles versados na técnica e estão dentro do escopo da pre- sente invenção.
[00325] Em determinadas modalidades, um intermediário, o qual é o precursor do ligante, reage com o fármaco sob condições apropria- das. Em determinadas modalidades, grupos reativos são usados no fármaco e/ou no intermediário. O produto da reação entre o fármaco e o intermediário ou o fármaco derivatizado é subsequentemente reagi- do com o anticorpo anti-191P4D12 sob condições apropriadas.
[00326] Cada uma das unidades particulares dos conjugados de anticorpo-fármaco é descrita em mais detalhes no presente documen- to. A síntese e a estrutura de unidades de ligação, unidades extenso- ras, unidades de aminoácidos, unidades espaçadoras autoimolativas e unidades de fármacos exemplificativas também são descritas nas Pu- blicações de Pedido de Patente Norte-Americana 2003-0083263, 2005-0238649 e 2005-0009751, cada uma das quais é incorporada ao presente documento a título de referência na íntegra e para todas as finalidades.
[00327] Um método exemplificativo para gerar os conjugados de anticorpo-fármaco fornecidos no presente documento é descrito bre- vemente abaixo.
[00328] O anticorpo Ha22-2(2,4)6.1 é conjugado a uma MMAE deri- vada de auristatina usando um ligante vc (Val-Cit) descrito no presente documento para criar o conjugado de anticorpo-fármaco (ADC) (desig- nado como AGS-22M6E) usando os seguintes protocolos. A conjuga- ção do ligante vc (Val-Cit) à MMAE (Seattle Genetics, Inc., Seattle, WA) foi concluída usando o método geral apresentado no Esquema 5 abaixo para criar o VCMMAE citotóxico (consulte Patente Norte- Americana Nº 7.659.241).
Esquema 5. Método Geral para Síntese de vcMMAE Ate + pm ANY AREDII PN + AN Y OCH; O AATAALg DI Dap -AAs Ligante AA AA DIl-Dap-AAs onde: AA1 = Aminoácido 1 AA2 = Aminoácido 2 AAB5 = Aminoácido 5 DIL = Dolaisoleucina DAP = Dolaproína Ligante = Val-Cit (vc)
[00329] Em seguida, o conjugado de anticorpo-fármaco AGS- 22M6E foi feito usando os seguintes protocolos.
[00330] Resumidamente, uma solução de 15 mg/mL do anticorpo Ha22-2(2,4)6.1 em acetato a 10 mM, pH de 5,0, sorbitol a 1 %, L- arginina a 3 %, é adicionada a um volume de 20 % de Tris-Cl a 0,1 M, pH de 8,4, EDTA a 25 mM e NaCl a 750 mM para ajustar o pH da so- lução para 7,5, EDTA a 5 mM e cloreto de sódio a 150 mM. O anticor- po é, então, parcialmente reduzido pela adição de 2,3 equivalentes molares de TCEP (em relação a moles de MAb) e, em seguida, agita- do a 37ºC durante 2 horas. A solução de anticorpo parcialmente redu- zida é, então, esfriada para 5ºC e 4,4 equivalentes molares de vcM- MAE (em relação a moles de anticorpo) são adicionados como uma solução em DMSO a 6 % (v/v). A mistura é agitada durante 60 minutos a 5ºC, depois durante mais 15 minutos após a adição de 1 equivalente molar de N-acetilcisteína em relação a vcMMAE. O excesso de vcM- MAE é extinto e os outros componentes da reação são removidos por meio de ultrafiltração/diafiltração do conjugado de anticorpo-fármaco (ADC) com 10 volumes de histidina a 20 mM, pH de 6,0.
[00331] O conjugado de anticorpo-fármaco AGS-22M6E resultante tem a seguinte fórmula: feno O OSHO OCHO Yo) o dg , NH7 em que L é Ha22-2(2,4)6.1 e pé a partir de 1 a 20.
5.4 Métodos de Uso de Composições Farmacêuticas
[00332] Em um aspecto, é fornecido no presente documento um método de prevento ou tratamento de uma doença ou transtorno em um indivíduo que compreende administrar ao indivíduo uma quantida- de eficaz da composição farmacêutica fornecida no presente docu- mento. Em algumas modalidades, o indivíduo é um ser humano.
[00333] Em algumas modalidades, a doença ou transtorno é cân- cer. Em algumas modalidades, o câncer tem células tumorais que ex- pressam 191P4D12. Em algumas modalidades, o câncer é um tumor sólido. Em algumas modalidades, o câncer é câncer de cólon, câncer pancreático, câncer de ovário, câncer de pulmão, câncer de bexiga, câncer de mama, câncer de esôfago, câncer de cabeça ou câncer de pescoço. Em algumas modalidades, o câncer é câncer de cólon. Em algumas modalidades, o câncer é câncer pancreático. Em algumas modalidades, o câncer é câncer de ovário. Em algumas modalidades, o câncer é câncer de pulmão. Em algumas modalidades, o câncer de pulmão é câncer de pulmão de células não pequenas. Em algumas modalidades, o câncer é câncer de bexiga. Em algumas modalidades, o câncer é câncer de bexiga avançado. Em algumas modalidades, o câncer é câncer de bexiga metastático. Em algumas modalidades, o câncer é câncer urotelial. Em algumas modalidades, o câncer é câncer urotelial avançado. Em algumas modalidades, o câncer é câncer de mama. Em algumas modalidades, o câncer é câncer de esôfago. Em algumas modalidades, o câncer é câncer de cabeça. Em algumas mo- dalidades, o câncer é câncer de pescoço. Em algumas modalidades, o câncer é câncer avançado ou metastático.
[00334] Em algumas modalidades, o tratamento com a composição farmacêutica fornecida no presente documento é indicado para indiví- duos que receberam um ou mais ciclos de quimioterapia. Alternativa- mente, a composição farmacêutica fornecida no presente documento é combinada com um regime quimioterapêutico ou radiação para indiví- duos que não receberam tratamento quimioterapêutico. Além disso, em algumas modalidades, o uso da composição farmacêutica forneci- da no presente documento pode permitir o uso de dosagens reduzidas de quimioterapia concomitante, particularmente para indivíduos que não toleram muito bem a toxicidade do agente quimioterapêutico. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica descrita no presen- te documento é administrada a pacientes com câncer urotelial metas- tático que apresentaram progressão da doença ou recidiva durante ou após o tratamento com um inibidor do ponto de verificação imune.
[00335] “Métodos de administração da composição farmacêutica fornecida no presente documento incluem, porém sem limitações, ad- ministração parentérica (por exemplo, intradérmica, intramuscular, in- traperitoneal, intravenosa e subcutânea), epidural e mucosal (por exemplo, vias intranasal e oral). Em uma modalidade específica, a composição farmacêutica fornecida no presente documento é adminis- trada através da via intranasal, intramuscular, intravenosa ou subcutâ-
nea. A composição farmacêutica fornecida no presente documento pode ser administrada através de qualquer via conveniente, por exem- plo, por meio de infusão ou injeção em bolus, por meio de absorção através de revestimentos epiteliais ou mucocutâneos (por exemplo, mucosa oral, mucosa intranasal, mucosa retal e intestinal, etc.) e pode ser administrada em conjunto com outros agentes biologicamente ati- vos. A administração pode ser sistêmica ou local. Além disso, adminis- tração pulmonar também pode ser usada, por exemplo, pelo uso de um inalador ou nebulizador e formulação com um agente aerossolizan- te. Consulte, por exemplo, Patentes Norte-Americanas Nº 6.019.968,
5.985.320, 5.985.309, 5.934.272, 5.874.064, 5.855.913, 5.290.540 e
4.880.078; e Publicações PCT Nº WO 92/19244, WO 97/32572, WO 97/44013, WO 98/31346 e WO 99/66903, cada uma das quais incorpo- rada ao presente documento a título de referência na íntegra.
[00336] Em uma modalidade específica, pode ser desejável admi- nistrar a composição farmacêutica fornecida no presente documento localmente na área que precisa de tratamento. Isto pode ser consegui- do, por exemplo e não a título de limitação, através de infusão local, administração tópica (por exemplo, através de pulverização intrana- sal), injeção ou por meio de um implante, o dito implante sendo de um material poroso, não poroso ou gelatinoso, incluindo membranas, tais como membranas sialásticas, ou fibras. Em algumas modalidades, ao administrar a composição farmacêutica fornecida no presente docu- mento, deve-se ter cuidado ao usar materiais aos quais o conjugado de anticorpo-fármaco fornecido no presente documento não absorve.
[00337] Em outramodalidade, a composição farmacêutica fornecida no presente documento pode ser distribuída em uma vesícula, em par- ticular um lipossoma (consulte Langer, 1990, Science 249: 1527-1533; Treat et al., em Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein e Fidler (eds.), Liss, New York, páginas 353-
365 (1989); Lopez-Berestein, ibid., páginas 317-327; consulte, de mo- do geral, ibid.).
[00338] Em outramodalidade, a composição farmacêutica fornecida no presente documento pode ser distribuída em um sistema de libera- ção controlada ou liberação sustentada. Em uma modalidade, uma bomba pode ser usada para alcançar a liberação controlada ou sus- tentada (consulte Langer, supra; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:20; Buchwald et a/., 1980, Surgery 88: 507; Saudek et al., 1989, N. Engl. J. Med. 321: 574). Em outra modalidade, materiais po- liméricos podem ser usados para alcançar a liberação controlada ou sustentada de um agente profilático ou terapêutico (por exemplo, um conjugado de anticorpo-fármaco fornecido no presente documento) ou uma composição farmacêutica fornecida no presente documento (con- sulte, por exemplo, Medical Applications of Controlled Release, Langer e Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Flórida (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen e Ball (eds.), Wiley, New York (1984); Ranger e Peppas, 1983, J., Macromol. Rev. Macromol. Chem. 23: 61; consulte também Levy et a/., 1985, Sci- ence 228: 190; Durant et a/., 1989, Ann. Neurol. 25: 351; Howard et al., 1989, J. Neurosurg. 71: 105); Patente Norte-Americana Nº 5.679.377; Patente Norte-Americana Nº 5.916.597; Patente Norte-Americana Nº
5.912.015; Patente Norte-Americana Nº 5.989.463; Patente Norte- Americana Nº 5.128.326; Publicação PCT Nº WO 99/15154; e Publica- ção PCT Nº WO 99/20253. Exemplos de polímeros usados em formu- lações de liberação sustentada incluem, porém sem limitações, po- liémetacrilato) de 2-hidroxietila, poli(metacrilato) de metila, ácido (po- li)acrílico, poli(etileno-co-acetato de vinila), ácido (poli)metacrílico, poli- glicolídeos (PLG), polianidridos, poli(N-vinil pirrolidona), álcool (po- li)vinílico, poliacrilamida, (poli)etileno glicol, polilactídeos (PLA), po- li(lactídeo-co-glicolídeos) (PLGA) e poliortoésteres. Em uma modalida-
de, o polímero usado em uma formulação de liberação sustentada é inerte, isento de impurezas lixiviáveis, estável ao armazenamento, es- téril e biodegradável. Em ainda outra modalidade, um sistema de libe- ração controlada ou sustentada pode ser colocado na proximidade do alvo terapêutico, ou seja, as passagens nasais ou pulmões, deste mo- do, requerendo apenas uma fração da dose sistêmica (consulte, por exemplo, Goodson, em Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, páginas 115-138 (1984)). Os sistemas de liberação con- trolada são discutidos na revisão de Langer (1990, Science 249: 1527- 1533). Qualquer método conhecido por aqueles versados na técnica pode ser usado para produzir formulações de liberação sustentada que compreendem o conjugado de anticorpo-fármaco ou a composi- ção farmacêutica fornecida no presente documento. Consulte, por exemplo, Patente Norte-Americana Nº 4.526.938, Publicação PCT WO 91/05548, publicação PCT WO 96/20698, Ning et a/., 1996, "Intratumo- ral Radioimmunotherapy of a Human Colon Cancer Xenograft Using a Sustained-Release Gel", Radiotherapy & Oncology 39: 179-189, Song et al., 1995, "Antibody Mediated Lung Targeting of Long-Circulating Emulsions", PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50: 372-397, Cleek et al., 1997, "Biodegradable Polymeric Carriers for a bFGF Antibody for Cardiovascular Application", Pro. Int'l. Symp. Con- trol. Rel. Bioact. Mater. 24: 853-854 e Lam et al., 1997, "Microencapsu- lation of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody for Local Deli- very", Pro. Intl. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24: 759-760, cada um dos quais é incorporado ao presente documento a título de refe- rência na íntegra.
[00339] A quantidade da composição farmacêutica fornecida no presente documento que será eficaz na prevenção e/ou tratamento de um câncer pode ser determinada por meio de técnicas clínicas padrão. Além disso, os ensaios in vitro podem ser opcionalmente usados para ajudar a identificar as faixas de dosagem ideais. A dose precisa a ser usada também dependerá da via de administração e da gravidade de uma doença ou transtorno e deve ser decidida de acordo com o julga- mento do médico e as circunstâncias de cada indivíduo. As doses efi- cazes podem ser extrapoladas a partir de curvas de resposta à dose derivadas de sistemas de teste in vitro ou em modelo animal.
[00340] Em determinadas modalidades, os métodos terapêuticos fornecidos no presente documento consideram administrar um único ADC, bem como combinações ou coquetéis de diferentes ADCs que compreendem diferentes anticorpos anti-191P4D12 ou diferentes uni- dades de fármaco. Em algumas modalidades, tais métodos têm de- terminadas vantagens porque, por exemplo, eles contêm ADCs que têm como alvo diferentes epítopos, exploram diferentes mecanismos efetores ou combinam anticorpos citotóxicos diretamente com anticor- pos que dependem da funcionalidade imune efetora. Estes métodos podem exibir efeitos terapêuticos sinérgicos. Além disso, a composi- ção farmacêutica fornecida no presente documento pode ser adminis- trada concomitantemente com outras modalidades terapêuticas inclu- indo, porém sem limitações, vários agentes quimioterapêuticos e bio- lógicos, bloqueadores de androgênios, moduladores imunes (por exemplo, IL-2, GM-CSF), cirurgia ou radiação.
[00341] Em uma modalidade, há sinergia quando tumores, incluindo tumores humanos, são tratados com a composição farmacêutica for- necida no presente documento em conjunto com agentes quimiotera- pêuticos ou radiação ou combinações dos mesmos.
[00342] O método para inibir o crescimento de células tumorais usando a composição farmacêutica fornecida no presente documento e uma combinação de quimioterapia ou radiação ou ambos compreen- de administrar a presente composição farmacêutica antes, durante ou após o início da quimioterapia ou radioterapia, bem como qualquer combinação dos mesmos (ou seja, antes e durante, antes e depois, durante e depois ou antes, durante e após o início da quimioterapia e/ou radioterapia). Dependendo do protocolo de tratamento e das ne- cessidades específicas do paciente, o método é realizado de maneira a fornecer o tratamento mais eficaz e, por fim, prolongar a vida do pa- ciente.
[00343] A administração de agentes quimioterapêuticos pode ser realizada através de uma variedade de maneiras, incluindo sistemica- mente pelas vias parentérica e entérica. Em uma modalidade, o agen- te quimioterapêutico é administrado separadamente. Exemplos parti- culares de agentes quimioterapêuticos ou quimioterapia incluem cis- platina, dacarbazina (DTIC), dactinomicina, mecloretamina (mostarda de nitrogênio), estreptozocina, ciclofosfamida, carmustina (BCNU), lo- mustina (CCNU), doxorrubicina (adriamicina), daunorrubicina, procar- bazina, mitomicina, citarabina, etoposídeo, metotrexato, 5-fluoroura- cila, vinblastina, vincristina, bleomicina, paclitaxel (busol), docetaxel (taxotero), aldessulfparinase, aldesucparinase, aldesucparina dacar- bazina, floxuridina, fludarabina, hidroxiureia, ifosfamida, interferon alfa, leuprolida, megestrol, melfalano, mercaptopurina, plicamicina, mitota- no, pegaspargase, pentostatina, pipobromano, plicamicina, estrepto- zocina, tamoxifeno, teniposídeo, testolactona, tioguanina, tiotepa, mos- tarda de uracila, vinorelbina, gencitabina, clorambucila, taxol e combi- nações dos mesmos.
[00344] A fonte de radiação, usada em combinação com a compo- sição farmacêutica fornecida no presente documento, pode ser externa ou interna ao paciente a ser tratado. Quando a fonte é externa ao pa- ciente, a terapia é conhecida como radioterapia por feixe externo (EBRT). Quando a fonte de radiação é interna ao paciente, o tratamen- to é denominado braquiterapia (BT).
[00345] Os regimes terapêuticos descritos acima podem ser ainda combinados com agentes e/ou regimes de tratamento adicionais para o câncer, por exemplo, quimioterapia adicional, vacinas contra o câncer, inibidores de transdução de sinal, agentes úteis no tratamento de cresci- mento celular anormal ou câncer, anticorpos (por exemplo, anticorpos anti-CTLA-4 conforme descrito no documento WO/2005/092380 (Pfi- zer)) ou outros ligantes que inibem o crescimento do tumor através de ligação ao IGF-1R e citocinas.
[00346] “Quando o mamífero é submetido à quimioterapia adicional, os agentes quimioterapêuticos descritos acima podem ser usados. Além disso, podem ser usados inibidores de fator de crescimento, modificado- res da resposta biológica, terapia anti-hormonal, moduladores seletivos do receptor de estrogênio (SERM;s), inibidores de angiogênese e anti- androgênios. Por exemplo, anti-hormonais, por exemplo, anti-estrogê- nios, tal como Nolvadex (tamoxifeno) ou, anti-androgênios, tal como Ca- sodex — (4'-ciano-3-(4-fluorofenilsulfonil)-2-hidróxi-2-metil-3-"-(trifluoro- metil)propionanilida) podem ser usados.
[00347] Em algumas modalidades, o produto farmacêutico fornecido no presente documento é usado em combinação com um segundo agente terapêutico, por exemplo, para o tratamento de um câncer.
[00348] Em algumas modalidades, o segundo agente terapêutico é um inibidor do ponto de verificação imune. Conforme usado no presen- te documento, o termo "inibidor do ponto de verificação imune" ou "ini- bidor do ponto de verificação" refere-se a moléculas que reduzem, ini- bem, interferem ou modulam total ou parcialmente uma ou mais prote- ínas do ponto de verificação. Sem estar limitado por uma teoria parti- cular, as proteínas do ponto de verificação regulam a ativação ou fun- ção das células T. Numerosas proteínas do ponto de verificação são conhecidas, tais como CTLA-4 e seus ligantes CD80 e CD86; e PD-1 e seus ligantes PD-L1 e PD-L2 (Pardoll, Nature Reviews Cancer, 2012, 12, 252-264). Estas proteínas parecem responsáveis por interações coestimuladoras ou inibidoras de respostas de células T. As proteínas do ponto de verificação imune parecem regular e manter a autotole- rância e a duração e amplitude das respostas imunes fisiológicas. Ini- bidores do ponto de verificação imune incluem anticorpos ou são deri- vados de anticorpos.
[00349] Em uma modalidade, o inibidor do ponto de verificação é um inibidor de CTLA-4. Em uma modalidade, o inibidor de CTLA-4 é um anticorpo anti-CTLA-4. Exemplos de anticorpos anti-CTLA 4 inclu- em, porém sem limitações, aqueles descritos nas Patente Norte- Americana Nº: 5.811.097; 5.811.097; 5.855.887; 6.051.227; 6.207.157;
6.682.736; 6.984.720; e 7.605.238, todas as quais são incorporadas ao presente documento na íntegra. Em uma modalidade, o anticorpo anti-CTLA-4 é tremelimumabe (também conhecido como ticilimumabe ou CP-675.206). Em outra modalidade, o anticorpo anti-CTLA-4 é ipi- limumabe (também conhecido como MDX-010 ou MDX-101). O ipi- limumabe é um anticorpo IgG monoclonal totalmente humano que se liga à CTLA-4. O ipilimumabe é comercializado com o nome comercial Yervoy""Y.
[00350] Em uma modalidade, o inibidor do ponto de verificação é um inibidor de PD-1/PD-L1. Exemplos de inibidores de PD-1/PD-L1 incluem, porém sem limitações, aqueles descritos nas Patentes Norte- Americanas Nºs 7.488.802; 7.943.743; 8.008.449; 8.168.757; 8.217.149 e Publicação de Pedido de Patente PCT Nº* WO2003042402, WO2008 156712, WO2010089411, WO2010036959, WO2011066342, WO2011 159877, WO2011082400 e WOZ2011161699, todos os quais são incor- porados ao presente documento na íntegra.
[00351] Em uma modalidade, o inibidor do ponto de verificação é um inibidor de PD-1. Em uma modalidade, o inibidor de PD-1 é um an- ticorpo anti-PD-1. Em uma modalidade, o anticorpo anti-PD-1 é BGB- A317, nivolumabe (também conhecido como ONO-4538, BMS-936558 ou MDX1106) ou pembrolizumabe (também conhecido como MK- 3475, SCH 900475 ou lambrolizumabe). Em uma modalidade, o anti- corpo anti-PD-1 é nivolumabe. O nivolumabe é um anticorpo monoclo- nal humano IgG4 anti-PD-1 e é comercializado com o nome comercial Opdivo'Y. Em outra modalidade, o anticorpo anti-PD-1 é pembrolizu- mabe. O pembrolizumabe é um anticorpo I9gG4 monoclonal humaniza- do e é comercializado com o nome comercial Keytruda'!". Em ainda outra modalidade, o anticorpo anti-PD-1 é CT-011, um anticorpo hu- manizado. O CT-011 administrado individualmente não mostrou res- posta no tratamento da leucemia mieloide aguda (AML) quando de re- cidiva. Em ainda outra modalidade, o anticorpo anti-PD-1 é AMP-224, uma proteína de fusão. Em outra modalidade, o anticorpo anti-PD-1 é BGB-A317. O BGB-A317 é um anticorpo monoclonal no qual a capaci- dade de se ligar ao receptor Fc gama | é especificamente manipulada e que possui uma assinatura de ligação única pela PD-1 com alta afi- nidade e especificidade superior pelo alvo.
[00352] Em uma modalidade, o inibidor do ponto de verificação é um inibidor de PD-L1. Em uma modalidade, o inibidor de PD-L1 é um anticorpo anti-PD-L1. Em uma modalidade, o anticorpo anti-PD-L1 é MEDI4736 (durvalumabe). Em outra modalidade, o anticorpo anti-PD- L1 é BMS-936559 (também conhecido como MDX-1105-01). Em ainda outra modalidade, o inibidor de PD-L1 é o atezolizumabe (também co- nhecido como MPDL3280A e TecentrigO).
[00353] Em uma modalidade, o inibidor do ponto de verificação é um inibidor de PD-L2. Em uma modalidade, o inibidor de PD-L2 é um anticorpo anti-PD-L2. Em uma modalidade, o anticorpo anti-PD-L2 é rHIgM12B7A.
[00354] Em uma modalidade, o inibidor do ponto de verificação é um inibidor do gene-3 de ativação de linfócitos (LAG-3). Em uma mo- dalidade, o inibidor de LAG-3 é IMP321, uma proteína de fusão de lg solúvel (Brignone et al., J. Immunol., 2007, 179, 4202-4211). Em outra modalidade, o inibidor de LAG-3 é BMS-986016.
[00355] Em uma modalidade, os inibidores do ponto de verificação são um inibidor de B7. Em uma modalidade, o inibidor de B7 é um ini- bidor de B7-H3 ou um inibidor de B7-H4. Em uma modalidade, o inibi- dor de B7-H3 é MGA271, um anticorpo anti-B7-H3 (Loo et al., Clin. Cancer Res., 2012, 3834).
[00356] Em uma modalidade, os inibidores do ponto de verificação são um inibidor de TIM3 (domínio de imunoglobulina de células T e domínio de mucina 3) (Fourcade et al., J. Exp. Med., 2010, 207, 2175- 86; Sakuishi et al., J. Exp. Med., 2010, 207, 2187-94).
[00357] Em uma modalidade, o inibidor do ponto de verificação é um agonista de OX40 (CD134). Em uma modalidade, o inibidor do ponto de verificação é um anticorpo anti-OX40. Em outra modalidade, o anticorpo anti-OX40 é MEDI6469.
[00358] Em uma modalidade, o inibidor do ponto de verificação é um agonista de GITR. Em uma modalidade, o inibidor do ponto de ve- rificação é um anticorpo anti-GITR. Em uma modalidade, o anticorpo anti-GITR é TRX518.
[00359] Em uma modalidade, o inibidor do ponto de verificação é um agonista de CD137. Em uma modalidade, o inibidor do ponto de verificação é um anticorpo anti-CD137. Em uma modalidade, o anti- corpo anti-CD137 é urelumabe. Em outra modalidade, o anticorpo anti- CD137 é PF-05082566.
[00360] Em uma modalidade, o inibidor do ponto de verificação é um agonista de CD40. Em uma modalidade, o inibidor do ponto de ve- rificação é um anticorpo anti-CD40. Em uma modalidade, o anticorpo anti-CD40 é CF-870.893.
[00361] Em uma modalidade, o inibidor do ponto de verificação é a interleucina-15 humana recombinante (rhlL-15).
[00362] Em uma modalidade, o inibidor do ponto de verificação é um inibidor de IDO. Em uma modalidade, o inibidor de IDO é INCB024360. Em outra modalidade, o inibidor de IDO é indoximode.
[00363] Em determinadas modalidades, as terapias combinadas fornecidas no presente documento incluem dois ou mais dos inibidores do ponto de verificação descritos no presente documento (incluindo inibidores do ponto de verificação da mesma classe ou de classes dife- rentes). Além disso, as terapias combinadas descritas no presente do- cumento podem ser usadas em combinação com um ou mais de ou- tros agentes ativos, conforme descrito no presente documento, quando apropriado para o tratamento das doenças descritas no presente do- cumento e entendidas na técnica.
[00364] Em algumas modalidades, o inibidor do ponto de verifica- ção é administrado antes da administração da presente composição farmacêutica. Em outras modalidades, o inibidor do ponto de verifica- ção é administrado simultaneamente (por exemplo, no mesmo período de dosagem) com a composição farmacêutica fornecida no presente documento. Em ainda outras modalidades, o inibidor do ponto de veri- ficação é administrado após a administração da composição farmacêu- tica fornecida no presente documento.
[00365] Em algumas modalidades, a quantidade do inibidor do pon- to de verificação pode ser determinada por meio de técnicas clínicas padrão.
[00366] Uma dosagem do inibidor do ponto de verificação resulta em uma titulação sérica de cerca de 0,1 ug/ml a cerca de 450 pg/ml e, em algumas modalidades, pelo menos 0,1 pg/ml, pelo menos 0,2 upo/ml, pelo menos 0,4 ug/ml, pelo menos 0,5 pg/ml, pelo menos 0,6 upg/ml, pelo menos 0,8 ug/ml, pelo menos 1 pg/ml, pelo menos 1,5 pg/ml, como pelo menos 2 pg/ml, pelo menos 5 pg/ml, pelo menos 10 upo/ml, pelo menos 15 ug/ml, pelo menos 20 ug/ml, pelo menos 25 upo/ml, pelo menos 30 pg/ml, pelo menos 35 ug/ml, pelo menos 40 upg/ml, pelo menos 50 pg/ml, pelo menos 75 pg/ml, pelo menos 100 pg/ml, pelo menos 125 pg/ml, pelo menos 150 pg/ml, pelo menos 200 pg/ml, pelo menos 250 ug/ml, pelo menos 300 pg/ml, pelo menos 350 upg/ml, pelo menos 400 pg/ml ou pelo menos 450 pg/ml podem ser administrados a um ser humano para prevenção e/ou tratamento de um câncer. Deve ser entendido que a dose precisa do inibidor do pon- to de verificação a ser usado também dependerá da via de administra- ção e da gravidade do câncer em um indivíduo e deve ser decidida de acordo com o julgamento do médico e as circunstâncias de cada paci- ente.
[00367] Em algumas modalidades, a dosagem do inibidor do ponto de verificação (por exemplo, um inibidor de PD-1 ou um inibidor de PD-L1) administrado a um paciente normalmente é a partir de 0,1 mg/kg a 100 mg/kg de peso corporal do indivíduo. Em algumas moda- lidades, a dosagem administrada ao paciente é a partir de cerca de 1 mg/kg a cerca de 75 mg/kg de peso corporal do indivíduo. Em algumas modalidades, a dosagem administrada a um paciente está entre 1 mg/kg e 20 mg/kg de peso corporal do indivíduo, tal como 1 mg/kg a 5 mg/kg de peso corporal do indivíduo. Em algumas modalidades, a do- sagem administrada a um paciente é cerca de 1 mg/kg de peso corpo- ral do indivíduo. Em algumas modalidades, a dosagem administrada a um paciente é cerca de 1,5 mg/kg de peso corporal do indivíduo. Em algumas modalidades, a dosagem administrada a um paciente é cerca de 2 mg/kg de peso corporal do indivíduo. Em algumas modalidades, a dosagem administrada a um paciente é cerca de 2,5 mg/kg de peso corporal do indivíduo. Em algumas modalidades, a dosagem adminis- trada a um paciente é cerca de 3 mg/kg de peso corporal do indivíduo. Em algumas modalidades, a dosagem administrada a um paciente é cerca de 3,5 mg/kg de peso corporal do indivíduo. Em algumas moda-
lidades, a dosagem administrada a um paciente é cerca de 4 mg/kg de peso corporal do indivíduo. Em algumas modalidades, a dosagem ad- ministrada a um paciente é cerca de 4,5 mg/kg de peso corporal do indivíduo. Em algumas modalidades, a dosagem administrada a um paciente é cerca de 5 mg/kg de peso corporal do indivíduo. Em algu- mas modalidades, a dosagem administrada a um paciente é cerca de 5,5 mg/kg de peso corporal do indivíduo. Em algumas modalidades, a dosagem administrada a um paciente é cerca de 6 mg/kg de peso cor- poral do indivíduo. Em algumas modalidades, a dosagem administrada a um paciente é cerca de 6,5 mg/kg de peso corporal do indivíduo. Em algumas modalidades, a dosagem administrada a um paciente é cerca de 7 mg/kg de peso corporal do indivíduo. Em algumas modalidades, a dosagem administrada a um paciente é cerca de 7,5 mg/kg de peso corporal do indivíduo. Em algumas modalidades, a dosagem adminis- trada a um paciente é cerca de 8 mg/kg de peso corporal do indivíduo. Em algumas modalidades, a dosagem administrada a um paciente é cerca de 8,5 mg/kg de peso corporal do indivíduo. Em algumas moda- lidades, a dosagem administrada a um paciente é cerca de 9,0 mg/kg de peso corporal do indivíduo. Em algumas modalidades, a dosagem administrada a um paciente é cerca de 10,0 mg/kg de peso corporal do indivíduo. Em algumas modalidades, a dosagem administrada a um paciente é cerca de 15,0 mg/kg de peso corporal do indivíduo. Em al- gumas modalidades, a dosagem administrada a um paciente é cerca de 20,0 mg/kg de peso corporal do indivíduo.
[00368] Em algumas modalidades, a composição farmacêutica for- necida no presente documento é fornecida como um pó liofilizado es- terilizado a seco ou concentrado sem água em um recipiente hermeti- camente fechado e pode ser reconstituído, por exemplo, com água ou solução salina para a concentração apropriada para administração a um indivíduo Em determinadas modalidades, o conjugado de anticor-
po-fármaco é fornecido como um pó liofilizado estéril seco em um reci- piente hermeticamente fechado em uma unidade de dosagem de pelo menos 0,1 mg, pelo menos 0,5 mg, pelo menos 1 mg, pelo menos 2 mg ou pelo menos 3 mg, tal como pelo menos 5 mg, pelo menos 10 mg, pelo menos 15 mg, pelo menos 25 mg, pelo menos 30 mg, pelo menos 35 mg, pelo menos 45 mg, pelo menos 50 mg, pelo menos 60 mg, em pelo menos 75 mg, pelo menos 80 mg, pelo menos 85 mg, pe- lo menos 90 mg, pelo menos 95 mg ou pelo menos 100 mg. O conju- gado de anticorpo-fármaco liofilizado pode ser armazenado entre 2 e 8ºC em seu recipiente original e o conjugado de anticorpo-fármaco po- de ser administrado dentro de 12 horas, tal como dentro de 6 horas, dentro de 5 horas, dentro de 3 horas ou dentro de 1 hora após ser re- constituído. Em uma modalidade alternativa, a composição farmacêu- tica que compreende o conjugado de anticorpo-fármaco fornecido no presente documento é fornecida na forma líquida em um recipiente hermeticamente fechado que indica a quantidade e a concentração do conjugado de anticorpo-fármaco. Em determinadas modalidades, a forma líquida do conjugado de anticorpo-fármaco é fornecida em um recipiente hermeticamente fechado de pelo menos 0,1 mg/ml, pelo menos 0,5 mg/ml ou pelo menos 1 mg/ml e tal como pelo menos 5 mg/ml, pelo menos 10 mg/ml, pelo menos 15 mg/ml, pelo menos 25 mg/ml, pelo menos 30 mg/ml, pelo menos 40 mg/ml, pelo menos 50 mg/ml, pelo menos 60 mg/ml, pelo menos 70 mg/ml, pelo menos 80 mg/ml, pelo menos 90 mg/ml ou pelo menos 100 mg/ml.
[00369] Em algumas modalidades, a quantidade de um agente pro- filático ou terapêutico (por exemplo, um conjugado de anticorpo- fármaco fornecido no presente documento) ou uma composição far- macêutica fornecida no presente documento que será eficaz na pre- venção e/ou tratamento de um câncer pode ser determinada por meio de técnicas clínicas padrão.
[00370] Consequentemente, uma dosagem de um conjugado de anticorpo-fármaco na composição farmacêutica que resulta em uma titulação sérica a partir de cerca de 0,1 ug/ml a cerca de 450 pg/ml e, em algumas modalidades, pelo menos 0,1 pg/ml, pelo menos 0,2 upo/ml, pelo menos 0,4 ug/ml, pelo menos 0,5 pg/ml, pelo menos 0,6 upg/ml, pelo menos 0,8 ug/ml, pelo menos 1 pg/ml, pelo menos 1,5 pg/ml, tal como pelo menos 2 pg/ml, pelo menos 5 pg/ml, pelo menos pg/ml, pelo menos 15 ug/ml, pelo menos 20 pg/ml, pelo menos 25 upo/ml, pelo menos 30 pg/ml, pelo menos 35 ug/ml, pelo menos 40 upg/ml, pelo menos 50 pg/ml, pelo menos 75 pg/ml, pelo menos 100 pg/ml, pelo menos 125 pg/ml, pelo menos 150 pg/ml, pelo menos 200 pg/ml, pelo menos 250 ug/ml, pelo menos 300 pg/ml, pelo menos 350 pg/ml, pelo menos 400 pg/ml ou pelo menos 450 pg/ml pode ser admi- nistrada a um ser humano para prevenção e/ou tratamento de um cân- cer. Deve ser entendido que a dose precisa a ser usada na formulação também dependerá da via de administração e da gravidade do câncer em um indivíduo e deve ser decidida de acordo com o julgamento do médico e as circunstâncias de cada paciente.
[00371] Doses eficazes podem ser extrapoladas a partir de curvas de dose-resposta derivadas de sistemas de teste in vitro ou um mode- lo animal.
[00372] Paraa composição farmacêutica que compreende o conju- gado de anticorpo-fármaco fornecido no presente documento, a dosa- gem do conjugado de anticorpo-fármaco administrada a um paciente é, tipicamente, a partir de 0,1 mg/kg a 100 mg/kg de peso corporal do indivíduo. Em algumas modalidades, a dosagem administrada ao pa- ciente é a partir de cerca de 1 mg/kg a cerca de 75 mg/kg de peso corporal do indivíduo. Em algumas modalidades, a dosagem adminis- trada a um paciente está entre 1 mg/kg e 20 mg/kg de peso corporal do indivíduo, tal como 1 mg/kg a 5 mg/kg de peso corporal do indiví-
duo.
Em algumas modalidades, a dosagem administrada a um pacien- te é cerca de 1 mg/kg de peso corporal do indivíduo.
Em algumas mo- dalidades, a dosagem administrada a um paciente é cerca de 1,25 mg/kg de peso corporal do indivíduo.
Em algumas modalidades, a do- sagem administrada a um paciente é cerca de 1,5 mg/kg de peso cor- poral do indivíduo.
Em algumas modalidades, a dosagem administrada a um paciente é cerca de 2 mg/kg de peso corporal do indivíduo.
Em algumas modalidades, a dosagem administrada a um paciente é cerca de 2,5 mg/kg de peso corporal do indivíduo.
Em algumas modalidades, a dosagem administrada a um paciente é cerca de 3 mg/kg de peso corporal do indivíduo.
Em algumas modalidades, a dosagem adminis- trada a um paciente é cerca de 3,5 mg/kg de peso corporal do indiví- duo.
Em algumas modalidades, a dosagem administrada a um pacien- te é cerca de 4 mg/kg de peso corporal do indivíduo.
Em algumas mo- dalidades, a dosagem administrada a um paciente é cerca de 4,5 mg/kg de peso corporal do indivíduo.
Em algumas modalidades, a do- sagem administrada a um paciente é cerca de 5 mg/kg de peso corpo- ral do indivíduo.
Em algumas modalidades, a dosagem administrada a um paciente é cerca de 5,5 mg/kg de peso corporal do indivíduo.
Em algumas modalidades, a dosagem administrada a um paciente é cerca de 6 mg/kg de peso corporal do indivíduo.
Em algumas modalidades, a dosagem administrada a um paciente é cerca de 6,5 mg/kg de peso corporal do indivíduo.
Em algumas modalidades, a dosagem adminis- trada a um paciente é cerca de 7 mg/kg de peso corporal do indivíduo.
Em algumas modalidades, a dosagem administrada a um paciente é cerca de 7,5 mg/kg de peso corporal do indivíduo.
Em algumas moda- lidades, a dosagem administrada a um paciente é cerca de 8 mg/kg de peso corporal do indivíduo.
Em algumas modalidades, a dosagem ad- ministrada a um paciente é cerca de 8,5 mg/kg de peso corporal do indivíduo.
[00373] Em algumas modalidades, o conjugado de anticorpo-fárma- co formulado na composição farmacêutica fornecida no presente do- cumento é administrado com base no peso corporal real do paciente na linha de base e as doses não mudarão, a menos que o peso do pa- ciente mude em 2 10 % da linha de base em relação ao ciclo anterior ou os critérios de ajuste da dose forem atendidos. Em algumas moda- lidades, o peso real será usado, exceto quanto a pacientes com peso superior a 100 kg, em tais casos, a dose será calculada com base em um peso de 100 kg. Em algumas modalidades, as doses máximas são de 100 mg para pacientes que recebem o nível de dose de 1,00 mg/kg e 125 mg para pacientes que recebem o nível de dose de 1,25 mg/kg.
[00374] Em uma modalidade, aproximadamente 100 mg/kg ou me- nos, aproximadamente 75 mg/kg ou menos, aproximadamente 50 mg/kg ou menos, aproximadamente 25 mg/kg ou menos, aproxima- damente 10 mg/kg ou menos, aproximadamente 5 mg/kg ou menos, aproximadamente 1 mg/kg ou menos, aproximadamente 0,5 mg/kg ou menos ou aproximadamente 0,1 mg/kg ou menos de um conjugado de anticorpo-fármaco formulado na presente composição farmacêutica é administrado 5 vezes, 4 vezes, 3 vezes, 2 vezes ou 1 vez para tratar um câncer. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica que compreende o conjugado de anticorpo-fármaco fornecido no presente documento é administrada cerca de 1-12 vezes, em que as doses po- dem ser administradas conforme necessário, por exemplo, semanal- mente, quinzenalmente, mensalmente, bimestralmente, trimestralmen- te, etc., conforme determinado por um médico. Em algumas modalida- des, uma dose mais baixa (por exemplo, 0,1-15 mg/kg) pode ser ad- ministrada com mais frequência (por exemplo, 3-6 vezes). Em outras modalidades, uma dose mais elevada (por exemplo, 25-100 mg/kg) pode ser administrada com menos frequência (por exemplo, 1-3 ve- zes).
[00375] Em algumas modalidades, uma dose única de um conjuga- do de anticorpo-fármaco formulado na composição farmacêutica for- necida no presente documento é administrada a um paciente para prevenir e/ou tratar um câncer 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ou 26 vezes para cada ciclo de duas semanas (por exemplo, cerca de 14 dias ) ao longo de um período de tempo (por exemplo, um ano), em que a dose é selecionada a partir do grupo que consiste em cerca de 0,1 mg/kg, cerca de 0,5 mg/kg, cerca de 1 mg/kg, cerca de 1,25 mg/kg, cerca de 1,5 mg/kg, cerca de 2 mg/kg, cerca de 2,5 mg/kg, cerca de 3 mg/kg, cerca de 4 mg/kg, cerca de mg/kg, cerca de 10 mg/kg, cerca de 15 mg/kg, cerca de 20 mg/kg, cer- ca de 25 mg/kg, cerca de 30 mg/kg, cerca de 35 mg/kg, cerca de 40 mg/kg, cerca de 45 mg/kg, cerca de 50 mg/kg, cerca de 55 mg/kg, cer- ca de 60 mg/kg, cerca de 65 mg/kg, cerca de 70 mg/kg, cerca de 75 mg/kg, cerca de 80 mg/kg, cerca de 85 mg/kg, cerca de 90 mg/kg, cer- ca de 95 mg/kg, cerca de 100 mg/kg ou uma combinação dos mesmos (ou seja, cada dose mensal pode ou não ser idêntica).
[00376] Em algumas modalidades, uma única dose de um conjuga- do de anticorpo-fármaco formulado na composição farmacêutica for- necida no presente documento é administrada a um paciente para prevenir e/ou tratar um câncer 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ou 26 vezes para cada ciclo de três semanas (por exemplo, cerca de 21 dias ) ao longo de um período de tempo (por exemplo, um ano), em que a dose é seleciona- da a partir do grupo que consiste em cerca de 0,1 mg/kg, cerca de 0,5 mg/kg, cerca de 1 mg/kg, cerca de 1,25 mg/kg, cerca de 1,5 mg/kg, cerca de 2 mg/kg, cerca de 2,5 mg/kg, cerca de 3 mg/kg, cerca de 4 mg/kg, cerca de 5 mg/kg, cerca de 10 mg/kg, cerca de 15 mg/kg, cerca de 20 mg/kg, cerca de 25 mg/kg, cerca de 30 mg/kg, cerca de 35 mg/kg, cerca de 40 mg/kg, cerca de 45 mg/kg, cerca de 50 mg/kg, cer-
ca de 55 mg/kg, cerca de 60 mg/kg, cerca de 65 mg/kg, cerca de 70 mg/kg, cerca de 75 mg/kg, cerca de 80 mg/kg, cerca de 85 mg/kg, cer- ca de 90 mg/kg, cerca de 95 mg/kg, cerca de 100 mg/kg ou uma com- binação dos mesmos (ou seja, cada dose mensal pode ou não ser idêntica).
[00377] Em algumas modalidades, uma dose única de um conjuga- do de anticorpo-fármaco formulado na composição farmacêutica for- necida no presente documento é administrada a um paciente para prevenir e/ou tratar um câncer 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ou 26 vezes para cada ciclo de quatro semanas (por exemplo, cerca de 28 dias ) ao longo de um período de tempo (por exemplo, um ano), em que a dose é selecionada a partir do grupo que consiste em cerca de 0,1 mg/kg, cerca de 0,5 mg/kg, cerca de 1 mg/kg, cerca de 1,25 mg/kg, cerca de 1,5 mg/kg, cerca de 2 mg/kg, cerca de 2,5 mg/kg, cerca de 3 mg/kg, cerca de 4 mg/kg, cerca de mg/kg, cerca de 10 mg/kg, cerca de 15 mg/kg, cerca de 20 mg/kg, cer- ca de 25 mg/kg, cerca de 30 mg/kg, cerca de 35 mg/kg, cerca de 40 mg/kg, cerca de 45 mg/kg, cerca de 50 mg/kg, cerca de 55 mg/kg, cerca de 60 mg/kg, cerca de 65 mg/kg, cerca de 70 mg/kg, cerca de 75 mg/kg, cerca de 80 mg/kg, cerca de 85 mg/kg, cerca de 90 mg/kg, cerca de 95 mg/kg, cerca de 100 mg/kg ou uma combinação dos mesmos (ou seja, cada dose a dose mensal pode ou não ser idêntica).
[00378] Em outramodalidade, uma dose única de um conjugado de anticorpo-fármaco formulado na composição farmacêutica fornecida no presente documento é administrada ao paciente para prevenir e/ou tratar um câncer 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12 vezes em interva- los de cerca de mensal (por exemplo, cerca de 30 dias) ao longo de um período de tempo (por exemplo, um ano), em que a dose é seleci- onada a partir do grupo que consiste em cerca de 0,1 mg/kg, cerca de 0,5 mg/kg, cerca de 1 mg/kg, cerca de 1,25 mg/kg, cerca de 1,5 mg/kg,
cerca de 2 mg/kg, cerca de 2,5 mg/kg, cerca de 3 mg/kg, cerca de 4 mg/kg, cerca de 5 mg/kg, cerca de 10 mg/kg, cerca de 15 mg/kg, cerca de 20 mg/kg, cerca de 25 mg/kg, cerca de 30 mg/kg, cerca de 35 mg/kg, cerca de 40 mg/kg, cerca de 45 mg/kg, cerca de 50 mg/kg, cer- ca de 55 mg/kg, cerca de 60 mg/kg, cerca de 65 mg/kg, cerca de 70 mg/kg, cerca de 75 mg/kg, cerca de 80 mg/kg, cerca de 85 mg/kg, cer- ca de 90 mg/kg, cerca de 95 mg/kg, cerca de 100 mg/kg ou uma com- binação dos mesmos (isto é, cada dose mensal de dose pode ou não ser idêntica).
[00379] Em outramodalidade, uma dose única de um conjugado de anticorpo-fármaco formulado na composição farmacêutica fornecida no presente documento é administrada ao paciente para prevenir e/ou tratar um câncer 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 vezes em cerca de intervalos bimen- sais (por exemplo, cerca de 60 dias) ao longo de um período de tempo (por exemplo, um ano), em que a dose é selecionada a partir do grupo que consiste em cerca de 0,1 mg/kg, cerca de 0,5 mg/kg, cerca de 1 mg/kg, cerca de 1,25 mg/kg, cerca de 1,5 mg/kg, cerca de 2 mg/kg, cerca de 2,5 mg/kg, cerca de 3 mg/kg, cerca de 4 mg/kg, cerca de 5 mg/kg, cerca de 10 mg/kg, cerca de 15 mg/kg, cerca de 20 mg/kg, cer- ca de 25 mg/kg, cerca de 30 mg/kg, cerca de 35 mg/kg, cerca de 40 mg/kg, cerca de 45 mg/kg, cerca de 50 mg/kg, cerca de 55 mg/kg, cer- ca de 60 mg/kg, cerca de 65 mg/kg, cerca de 70 mg/kg, cerca de 75 mg/kg, cerca de 80 mg/kg, cerca de 85 mg/kg, cerca de 90 mg/kg, cer- ca de 95 mg/kg, cerca de 100 mg/kg ou uma combinação dos mesmos (ou seja, cada dose mensal pode ou não ser idêntica).
[00380] Em ainda outra modalidade, uma dose única de um conju- gado de anticorpo-fármaco formulado na composição farmacêutica fornecida no presente documento é administrada ao paciente para prevenir e/ou tratar um câncer 1, 2, 3 ou 4 vezes em cerca de três meses (por exemplo, cerca de 120 dias) intervalos ao longo de um período de tempo (por exemplo, um ano), em que a dose é selecionada a partir do grupo que consiste em cerca de 0,1 mg/kg, cerca de 0,5 mg/kg, cerca de 1 mg/kg, cerca de 1,25 mg/kg, cerca de 1,5 mg/kg, cerca de 2 mg/kg, cerca de 2,5 mg/kg, cerca de 3 mg/kg, cerca de 4 mg/kg, cerca de 5 mg/kg, cerca de 10 mg/kg, cerca de 15 mg/kg, cerca de 20 mg/kg, cerca de 25 mg/kg, cerca de 30 mg/kg, cerca de 35 mg/kg, cerca de 40 mg/kg, cerca de 45 mg/Kkg, cerca de 50 mg/kg, cerca de 55 mg/kg, cerca de 60 mg/kg, cerca de 65 mg/kg, cerca de 70 mg/kg, cerca de 75 mg/kg, cer- ca de 80 mg/kg, cerca de 85 mg/kg, cerca de 90 mg/kg, cerca de 95 mg/kg, cerca de 100 mg/kg ou uma combinação dos mesmos (ou seja, cada dose mensal pode ou não ser idêntica).
[00381] Em determinadas modalidades, a via de administração de uma dose de um conjugado de anticorpo-fármaco formulado na com- posição farmacêutica fornecida no presente documento a um paciente é intranasal, intramuscular, intravenosa ou uma combinação das mesmas, mas outras vias descritas no presente documento também são aceitáveis. Cada dose pode ou não ser administrada através de uma via de administração idêntica. Em algumas modalidades, um con- jugado de anticorpo-fármaco formulado na composição farmacêutica fornecida no presente documento pode ser administrado por meio de múltiplas vias de administração simultânea ou subsequentemente a outras doses de um ou mais agentes terapêuticos adicionais.
[00382] Em algumas modalidades mais específicas, o conjugado de anticorpo-fármaco formulado na composição farmacêutica fornecida no presente documento é administrado em uma dose de cerca de 1 mg/kg, cerca de 1,25 mg/kg ou cerca de 1,5 mg/kg de peso corporal do indivíduo através de uma injeção ou infusão intravenosa (IV).
[00383] Em algumas modalidades mais específicas, o conjugado de anticorpo-fármaco formulado na composição farmacêutica fornecida no presente documento é administrado em uma dose de cerca de 1 mg/kg, 1,25 mg/kg ou cerca de 1,5 mg/kg de peso corporal do indiví- duo através de uma injeção intravenosa (IV) ou infusão durante cerca de 30 minutos, duas vezes a cada ciclo de três semanas. Em algumas modalidades, o conjugado de anticorpo-fármaco formulado na compo- sição farmacêutica é administrado através de injeção intravenosa (IV) ou infusão durante cerca de 30 minutos nos Dias 1 e 8 de cada ciclo de três semanas. Em algumas modalidades, o método compreende ainda administrar um inibidor do ponto de verificação imune através de uma injeção intravenosa (IV) ou infusão uma ou mais vezes em cada ciclo de três semanas. Em algumas modalidades, o método compre- ende ainda administrar um inibidor do ponto de verificação imune atra- vés de uma injeção intravenosa (IV) ou infusão no Dia 1 de cada ciclo de três semanas. Em algumas modalidades, o inibidor do ponto de ve- rificação imune é o pembrolizumabe e o pembrolizumabe é adminis- trado em uma quantidade de cerca de 200 mg ao longo de cerca de 30 minutos. Em outras modalidades, o inibidor do ponto de verificação imune é o atezolizumabe e o atezolizumabe é administrado em uma quantidade de cerca de 1200 mg durante cerca de 60 minutos ou 30 minutos. Em algumas modalidades, o conjugado de anticorpo-fármaco é administrado a pacientes com câncer urotelial que apresentaram progressão da doença ou recidiva durante ou após o tratamento com um inibidor do ponto de verificação imune. Em algumas modalidades, o conjugado de anticorpo-fármaco é administrado a pacientes com câncer urotelial metastático que apresentaram progressão da doença ou recidiva durante ou após o tratamento com um inibidor do ponto de verificação imune.
[00384] Em outras modalidades mais específicas, o conjugado de anticorpo-fármaco formulado na composição farmacêutica fornecida no presente documento é administrado em uma dose de cerca de 1 mg/kg, 1,25 mg/kg ou cerca de 1,5 mg/kg de peso corporal do indiví-
duo através de uma injeção intravenosa (IV) ou infusão durante cerca de 30 minutos, três vezes a cada ciclo de quatro semanas. Em algu- mas modalidades, o conjugado de anticorpo-fármaco formulado na composição farmacêutica é administrado através de injeção intraveno- sa (IV) ou infusão durante cerca de 30 minutos nos Dias 1, 8 e 15 de cada ciclo de quatro semanas. Em algumas modalidades, o método compreende ainda administrar um inibidor do ponto de verificação imune através de uma injeção intravenosa (IV) ou infusão uma ou mais vezes em cada ciclo de quatro semanas. Em algumas modalidades, o inibidor do ponto de verificação imune é o pembrolizumabe. Em outras modalidades, o inibidor do ponto de verificação imune é o atezolizu- mabe. Em algumas modalidades, o conjugado de anticorpo-fármaco é administrado a pacientes com câncer urotelial que apresentaram pro- gressão da doença ou recidiva durante ou após o tratamento com um inibidor do ponto de verificação imune. Em algumas modalidades, o conjugado de anticorpo-fármaco é administrado a pacientes com cân- cer urotelial metastático que apresentaram progressão da doença ou recidiva durante ou após o tratamento com um inibidor do ponto de verificação imune.
[00385] — Por uma questão de concisão, determinadas abreviaturas são usadas no presente documento. Um exemplo é a abreviatura de uma única letra para representar resíduos de aminoácidos. Os aminoácidos e suas abreviações de três letras e uma única letra são os seguintes: alanina Ala (A) arginina Arg (R) asparagina Asn (N) ácido aspártico Asp (D) cisteína Cys (C) ácido glutâmico Glu (E) glutamina GlIn (Q)
glicina Gly (G) histidina His (H) isoleucina Ile (1) leucina Leu (L) lisina Lys (K) metionina Met (M) fenilalanina Phe (F) prolina Pro (P) serina Ser (S) treonina Thr (T) triptofano Trp (W) tirosina Tyr (Y) valina Val (V)
[00386] A invenção é, em geral, descrita no presente documento usando linguagem afirmativa para descrever as inúmeras modalida- des. A invenção também inclui especificamente modalidades nas quais um determinado assunto é excluído, no todo ou em parte, tais como substâncias ou materiais, etapas e condições do método, protocolos, procedimentos, ensaios ou análises. Assim, embora a invenção geral- mente não seja expressa no presente documento em termos do que a invenção não inclui, aspectos que não estão expressamente incluídos na invenção são, no entanto, descritos no presente documento.
[00387] “Modalidades particulares da presente invenção são descri- tas no presente documento, incluindo o melhor modo conhecido pelos inventores para realizar a invenção. Após leitura da descrição anterior, variações das modalidades descritas podem se tornar evidentes para os indivíduos que trabalham na técnica e espera-se que aqueles ver- sados na técnica possam usar tais variações conforme apropriado. Consequentemente, pretende-se que a invenção seja praticada de outra forma que não conforme especificamente descrito no presente documen-
to e que a invenção inclua todas as modificações e equivalentes do as- sunto citado nas reivindicações em anexo, conforme permitido pela lei aplicável. Além disso, qualquer combinação dos elementos descritos acima em todas as variações possíveis dos mesmos é abrangida pela invenção, a menos que indicado de outra forma no presente documento ou de outra forma claramente contradito pelo contexto.
[00388] Todas as publicações, pedidos de patente, números de acesso e outras referências citadas no presente relatório descritivo são incorporados a título de referência na íntegra, como se cada publica- ção ou pedido de patente individual fosse específica e individualmente indicado como sendo incorporado a título de referência. As publica- ções discutidas no presente documento são fornecidas apenas por sua invenção antes da data de depósito do presente pedido. Nada no pre- sente documento deve ser interpretado como uma admissão de que a presente invenção não tem o direito de anteceder tal publicação em virtude da invenção anterior. Além disso, as datas de publicação for- necidas podem ser diferentes das datas de publicação reais que po- dem precisar ser confirmadas de forma independente.
[00389] Uma série de modalidades da invenção foram descritas. No entanto, será entendido que várias modificações podem ser feitas sem se afastar do espírito e do escopo da invenção. Consequentemente, as descrições na seção Experimental têm a intenção de ilustrar, mas não limitar, o escopo da invenção descrito nas reivindicações.
6. Exemplos
[00390] O que segue é uma descrição de vários métodos e materi- ais usados nos estudos e são apresentados de modo a fornecer àque- les versados na técnica uma invenção completa e uma descrição de co- mo fazer e usar a presente invenção e não se destina a limitar o escopo do que os inventores consideram sua invenção, nem se destina a repre- sentar que os experimentos abaixo foram realizados e são todos os ex-
perimentos que podem ser realizados. Deve ser entendido que descri- ções exemplificativas escritas no momento não foram necessariamente realizadas, mas sim que as descrições podem ser realizadas para gerar os dados e assim por diante associados aos ensinamentos da presente invenção. Esforços foram feitos para assegurar a precisão em relação aos números usados (por exemplo, quantidades, temperatura, etc.), mas alguns erros experimentais e desvios devem ser contabilizados.
6.1 Exemplo 1 — Triagem de pH e Tampão
[00391] AGS-22M6E foi formulado a 10 mg/mL em quatorze tam- pões candidatos (todos a 20 mM, conforme detalhado na Tabela 1 abaixo). Foram avaliadas as formulações usando tampão citrato de sódio a 20 mM titulada em um pH de 5,2 e 5,7 com ácido cítrico e tampão de Histidina a 20 mM titulado em um pH de 5,5, 6,0 e 6,5 com HCI. Além disso, três ânions diferentes foram avaliados nos sistemas tampão de histidina - cloreto, fosfato e succinato. As formulações líquidas foram submetidas a condições de temperatura de armazenamento de 40ºC durante 2 semanas, agitação em temperatura ambiente (RT) duran- te 24 horas e ciclos de congelamento-descongelamento (congelamento a -70ºC e descongelamento a 20ºC-25ºC durante 1, 3 e 10 ciclos). Tabela 1 Tm era) * Tampão hidratada (% Conc. (%) (Pplv %) Citrato de sódio/ácido cítrico 0,02 a 20 mM = "7 Histidina/HCI a 20 mM a
Trealose di- Tween 20 Formulação Sacarose Tampão hidratada Conc. * (%) (%) (plv %) | so Citrato de sódio/ácido cítrico Ha FS 5,2 5 a 20 mM Histidina/HCI a 20 mM a | e | Histidina/ácido fosfórico a ss F11 5,5 5,5 mM a | Histidina/ácido succínico a ss F13 5,5 20 mM a Nota: sacarose a 5 % (p. m. 342) = 146 mM; trealose di-hidratada a 5,5 % (p.m. 378) = 146 mM.
[00392] A preparação da formulação e o design do estudo são des- critos em mais detalhes abaixo. Produto Proteico Usado Para Estudo de Formulação
[00393] Quatro tubos, cada um contendo cerca de 50 ml de AGS- 22M6E (Lote HAGS22M6-VCE-02), totalizando cerca de 2,5 gramas foram recebidos congelados. AGS-22M6E estava a 12,5 mg/mL em tampão histidina a 20 mM, pH de 6,0, que contém sacarose a 5% e polissorbato-20 a 0,02 %. O material foi armazenado a -70ºC até ser usado. Preparação de Tampões de Formulação
[00394] Soluções de estoque que incluem ácido cítrico (0,1 M), ci- trato de sódio (0,1 M) e L-histidina (0,2 M), ácido succínico (0,25 M),
trealose di-hidratada (40 %), sacarose (40 %), ácido clorídrico (2M) e ácido fosfórico (2M) foram preparadas de acordo com a Tabela 2 abai- xo: Tabela 2 MW | Concentração de- | Volume | Massa Re- Estoques . . (g/mol) | sejada (mol/L) (L) querida (g) Ácido Cítrico Mo- 210,14 0,1 1,0 21,01 nohidratado Citrato de sódio 294,1 0,1 2,0 58,82 di-hidratado L-Histidina 155,15 46,55 Trealose di- . 378,33 40% 1,5 600,00 hidratada Para medir: Ácido concen- | . Conc. Ini- | Conc. Fi- [Volume final Água Estoques , trado cial (M) nal (M) (mL) (mL) (mL) ácido clorí- . 121 2,0 500 82,6 417,4 drico ácido fosfó- , 14,8 2,0 500 67,6 432,4 rico
[00395] Os reagentes foram pesados de acordo com a tabela acima. Um volume apropriado de água MIilli-Q foi adicionado para dissolver os reagentes. As soluções foram filtradas através de filtros de 0,22 um. Preparação de Tampões de Formulação Para Diálise
[00396] 1,0L de cada formulação foi preparado para diálise e fras- cos de placebo de acordo com a Tabela 3 abaixo:
Tabela 3 Ácido cítrico Citrato de sódio Trealose di- | Sacarose | . Formulação L-histidina a Água Ajuste de pH Volume mono-hidratado | mono-hidratado a hidratada a4o% 4 0,1 M (mL) (mL) com total (mL) a 0,1 M (mL) 0,1 M (mL) a 40 % (mL) (mL) F1 5,2 61 139 137,5 662,5 1000 F2 5,7 37 163 137,5 662,5 1000 F3 5,5 100 137,5 762,5 HCl a 2M 1000 F4 6,0 100 137,5 762,5 HCl a 2M 1000 F5 6,5 100 137,5 762,5 HCl a 2M 1000 F6 5,2 61 139 125 675 1000 = F7 5,7 37 163 125 675 1000 fg F8 5,5 100 125 775 HCl a 2M Ni 1000 NS F9 6,0 100 125 775 HCl a 2M 1000 F10 6,5 100 125 775 HCl a 2M F11 556,0 100 137,5 762,5 | Ácido fosfórico a 2M| 1000 F12 O 100 137,5 762,5 | Ácido fosfórico a 2M| 1000 Ácido succínico a F13 55 100 137,5 762,5 0,25M 1000 F14 ' 100 137,5 752,5 Ácido succínico a 1000 0,25M
[00397] O pH foi ajustado com ácido apropriado para o pH alvo + 0,1. Os tampões foram armazenados a 4ºC até serem usados. Preparação de Formulação
[00398] 4 tubos, cada um contendo 50 ml de AGS-22M6E (Lote HAGS22M6-VCE-02), foram descongelados em banho-maria em tem- peratura ambiente e, em seguida, combinados em uma garrafa de 250 ml. 11 ml foram alocados para cada formulação e foram adicionados a cassetes de diálise. Os cassetes foram colocados em béqueres que contêm — 40 vezes o excesso de tampão de formulação e agitados du- rante a noite a 2-8ºC. O tampão foi descartado e foi adicionado tam- pão fresco e agitado durante a noite a 2-8ºC. O material foi removido dos cassetes e transferido para tubos de 50 ml, as concentrações fo- ram determinadas e os volumes foram ajustados com o tampão de formulação correspondente, de modo a que a concentração final fosse de 10 mg/ml. Os placebos foram os tampões correspondentes usados para formular o produto. Envasamento e Colocação de Rolha no Frasco
[00399] Filtração estéril e enchimento foram realizados em uma coi- fa de fluxo de ar laminar Baker SG600. As formulações e os placebos foram filtrados de forma estéril usando uma técnica asséptica (filtros de seringa de PVDF de 0,22 um Millipore Millex-GV, %SLGVO33RS). Frascos com rolha estéril (frascos com rolha estéril de 2 ml Hollister- Stier, 7505ZA) foram abertos na coifa e as rolhas foram removidas usando uma técnica asséptica. Os frascos foram enchidos com 1,0 ml do produto formulado ou placebo e, a seguir, tampados novamente. Requisitos de Material e Mapa de Amostra
[00400] Os requisitos de material e o mapa de amostra são os se- guintes:
Tabela 4 Concentração Condicã ft de |Volume de en- | Volume total de | Proteína mL total por |mg total mg por ondição (mg/mL) ç frascos chimento enchimento total (mg) | formulação formulação LIES Re Ac ID gg 1 ciclo de cong./descong. 1 1 1,0 10 a -70ºC /25ºC 3 ciclos de 10 cong./descong. a -70ºC 1 1 1,0 10 125ºC 10 ciclos de > 10 cong./descong. a -70ºC 1 1 1,0 10 n 125ºC NS Agitação em RT durante 10 1 1 1,0 10 10 100 24 horas ft de tampões a | Frascos Volume total de enchi- | Proteína nos fras- |Proteína requerida * de Concs. de Prot. a Testar testar totais mento (mL) cos (mg) (mg) Número total de amos- 1 14 140 140,0 1400 1680 tras: 112
Condição Dias na Condição de Armazenamento Poa Dt a | Agitação em RT durante 24 horas EaD Ponto de Tempo e Ensaios
[00401] O ponto de tempo e os ensaios são conforme na Tabela 5 abaixo. Tabela 5 o
É ac NS T=0 T=3d T=7Td T=14d 1 X cong./descong.3 X cong./descong. 10 X cong./descong. guação em NS Ensaio analítico 13-Abr-10 | 16-Abr-10 | 20-Abr-10 | 4/272010 | a-70ºC/25ºC | a-70ºC/25ºC a-T0ºC/25C 24 horas
A RP-HPLS o
Design de Estudo de Estabilidade de Formulação Líquida a 40ºC
[00402] As formulações e frascos de placebo foram colocados na vertical em uma incubadora ajustada para 40ºC. Em cada ponto de tem- po, um frasco ativo e um frasco de placebo para cada formulação foram removidos das condições de armazenamento de acordo com o mapa de amostra. As amostras foram congeladas a -70ºC e analisadas em lotes ao final do estudo. Antes da análise, as amostras foram descongeladas em temperatura ambiente. Conjuntos de 3 alíquotas de cada amostra (alíquotas de 70 ul para cada amostra) foram congelados a -70ºC após filtrar através de um filtro de 0,22 um. Após o teste analítico, qualquer material remanescente foi armazenado a 2-8ºC durante a noite, no caso de ser necessário um novo teste. Após todos os ensaios estarem conclu- ídos, os materiais restantes foram armazenados a -70ºC. Duas alíquo- tas congeladas foram usadas para ensaios cIEF e de potência. Design do Estudo de Estabilidade ao Congelamento-Descongela- mento (-70ºC)
[00403] “Um frasco para cada formulação (enchimento de 1,0 mL) foi colocado na vertical em um freezer a -70ºC durante pelo menos 4 ho- ras, o que permitiu o congelamento. Para o descongelamento, cada frasco foi removido do armazenamento e descongelado em temperatu- ra ambiente até que o gelo não fosse mais observado e, em seguida, o frasco foi girado suavemente. Isto constituía um ciclo completo de congelamento e descongelamento. Um, três e dez ciclos de congela- mento-descongelamento foram concluídos para cada frasco de amos- tra de formulação testada. Após o ciclo final de congelamento e des- congelamento, todas as amostras foram avaliadas por testes analíti- cos. Conjuntos de 3 alíquotas de cada amostra (alíquotas de 70 ul para cada amostra) foram congelados a -70ºC imediatamente. Após o teste analítico, qualquer material remanescente foi armazenado a 2- 8ºC durante a noite, no caso de ser necessário um novo teste. Após todos os ensaios estarem completos, os materiais restantes foram ar- mazenados a -70ºC. Duas alíquotas congeladas foram usadas para ensaios clEF e de potência. Design do Estudo de Agitação
[00404] “Um frasco para cada formulação foi mantido na vertical em uma caixa de congelador padrão. A caixa foi, então, presa a um agita- dor orbital IKA-VIBRAMAX-VXR ajustado para 500 rpm em temperatu- ra ambiente durante 24 horas. As amostras foram, então, removidas e armazenadas a -70ºC até análise. Padrão de Formulação
[00405] 1,2 mL de matéria-prima AGS-22M6E (Lote XAGS22M6- VCE-02) (12,5 mg/mL em tampão de Histidina a 20 mM, pH de 6,0, que contém sacarose a 5 % e polissorbato-20 a 0,02 %) foram toma- dos e transformados em alíquotas a 200 ul/frasco, depois armazena- dos a -70ºC como padrão de formulação para este estudo.
[00406] Aparência visual, A280 (concentração de proteína e carga de fármaco), A330 (turbidez), SE-HPLC, SDS-PAGE não redutor e re- dutor, RP-HPLC-NPI. iCIEF e potência foram usados para avaliar a estabilidade de AGS-22M6E.
[00407] Aparência visual: Todas as amostras não mostraram ne- nhuma cor, nenhuma turvação e nenhuma partícula ao longo do estu- do. Nenhuma partícula foi vista, mesmo após agitação.
[00408] Análise A280 (concentração de proteína): Os resultados da análise A280 são mostrados na Tabela 6 abaixo. Tabela 6
NNE
Poe Li EO ms E E er
Cong./descong. | Cong./descong. | Cong./descong.
F2 0,6818 0,6809 0,6761 0,68321 0,67565 F3 /0,7069 0,6963 0,6958 0,69771 0,70847 F4 0,7056 0,7048 0,6817 0,69875 0,68629 F5 /0,7123 0,7027 0,6961 0,70278 0,71533 F6 O0,6616 0,6651 0,6715 0,68515 0,66747 F7 [0,6594 0,6622 0,6585 0,63399 0,65046 F8 0,6986 0,6969 0,7042 0,69579 0,69878 F9 0,6834 0,6893 0,6876 0,67558 0,69247 F10 |0,6888 0,6862 0,6921 0,68071 0,68312 F11 j0,7032 0,6967 0,6905 0,68287 0,70169 F12 |0,7040 0,6892 0,7064 0,69924 0,68928 F13 |0,6736 0,6746 0,6745 0,65992 0,66715 F14 |0,6944 0,6831 0,7003 0,67608 0,68892 a a F2 9,38 9,65 9,53 9,43 F3 9,72 8,93 9,81 9,62 F4 9,71 9,83 9,77 9,93 F5 9,80 9,40 9,82 9,90 F6 9,10 9,34 9,54 9,40 F7 9,07 9,02 9,18 9,26 F8 9,61 9,50 9,68 9,65 Fº 9,40 9,63 9,71 9,71 F1O 9,47 9,41 9,54 9,66 F11 9,67 9,78 9,73 9,56 F12 9,68 9,11 9,75 9,98 F13 9,27 9,29 9,46 9,38 F14 9,55 9,28 9,46 9,63 o aba Enõo ICong./descong.Cong./descong.|!Cong./descong F2 9,38 9,37 9,30 9,40 9,29 F3 9,72 9,58 9,57 9,60 9,75 F4 9,71 9,69 9,38 9,61 9,44 F5 9,80 9,67 9,57 9,67 9,84 F6 9,10 9,15 9,24 9,42 9,18 F7 9,07 9,11 9,06 8,72 8,95 F8 9,61 9,59 9,69 9,57 9,61 F9 9,40 9,48 9,46 9,29 9,53 F1O0 9,47 9,44 9,52 9,36 9,40 F11 9,67 9,58 9,50 9,39 9,65 F12 9,68 9,48 9,72 9,62 9,48 F13 9,27 9,28 9,28 9,08 9,18 F14 9,55 9,40 9,63 9,30 9,48
[00409] “Conforme mostrado, nenhuma alteração na concentração de proteína foi observada.
[00410] Análise A330 (turbidez): Os resultados da análise A330 são mostrados na Tabela 7 abaixo. Tabela 7 Amostra A a a F1 -0,0006 0,0591 0,1030 0,1053 0,0131 0,1223 F2 -0,0040 | 0,0727 0,0934 0,1067 0,0363 0,1070 F3 -0,0063 | 0,0585 0,0632 0,0715 0,0018 0,0736 F4 -0,0036 | 0,0601 0,0667 0,0730 0,0053 0,0757 F5 0,0027 0,0659 0,0720 0,0917 0,0030 0,0823 F6 0,0028 0,1018 0,0970 0,1196 0,0004 0,1269 F7 0,0029 0,0705 0,0885 0,0925 0,0073 0,1031 F8 0,0019 | 0,0620 0,0598 0,0801 0,0112 0,0860 Fº 0,0041 | 0,0681 0,0776 0,0982 0,0193 0,1046 F1O 0,0013 | 0,0628 0,0760 0,0905 0,0156 0,0886 F11 0,0036 | 0,0773 0,0649 0,0722 0,0100 0,0782 F12 0,0014 | 0,0652 0,0641 0,0861 0,0131 0,0796 F13 0,0142 | 0,0655 0,0660 0,0708 0,0121 0,0936 F14 0,0112 0,0659 0,0637 0,0701 0,0122 0,0857 1X 3x 10X Cong./descong. Agitação 24 h
E E F1 0,0638 0,0787 0,0042 0,0755 0,0083 | 0,0698 F2 0,0683 0,0757 0,0075 0,0774 0,0089 | 0,0719 F3 0,0631 0,0645 0,0008 0,0620 0,0235 | 0,0669 F4 0,0593 0,0908 0,0005 | 0,0600 0,0036 | 0,0577 F5 0,0647 0,0598 0,0049 | 0,0685 0,0099 | 0,0615
1X 3x F6 0,0805 0,0796 -0,0001 0,0728 0,0180 | 0,0737 F7 0,0714 0,0777 0,0025 0,0745 0,0100 | 0,0695 F8 0,0630 0,0750 0,0008 | 0,0696 | 0,0053 | 0,0568 F9 0,0670 0,0737 0,0034 | 0,0715 0,0022 | 0,0692 F1O0 0,0595 0,0750 0,0007 0,0752 0,0050 | 0,0676 F11 0,0559 0,0763 0,0016 0,0694 0,0013 | 0,0629 F12 0,0625 0,0679 0,0006 0,0695 0,0028 | 0,0695 F13 0,0616 0,0701 0,0028 0,0820 | -0,0009 | 0,0759 F14 0,0611 0,0745 -0,0017 0,1033 0,0108 | 0,0972
[00411] “Conforme mostrado, as formulações F1 e F6 exibiram os aumentos mais significativos na turbidez ao longo do tempo. Em t= O, maior turbidez foi observada para a formulação F6, o que não foi ob- servado nas outras formulações.
[00412] Análise SDS-PAGE: Os resultados da análise SDS-PAGE são mostrados nas Figuras 1A, 1B, 1C e 1D. Bandas menores de bai- xo peso molecular (LMW) (- 35kD) foram observadas por SDS-PAGE redutor em F1 e F6 após 14 dias. Na análise de SDS-PAGE não redu- tor, F1, F2, F6 e F7 também demonstraram bandas menores de eleva- do peso molecular (HMW) (—- 200 kD) não presentes anteriormente em T=O0.
[00413] Análise RP-HPLC: A Tabela 8 e Figura 1E mostram os re- sultados da análise RP-HPLC. Nenhum SGD1010 livre (traço de cliva- gem do fármaco MMAE) foi detectado por RP-HPLC em t = O para qualquer uma das formulações, no entanto, após 14 dias a 40ºC, SGD1010 (que varia a partir de 0,17-1,59 uM) foi observado e foi ligei- ramente mais rápido em um pH mais alto para a histidina do que para as formulações de citrato, com histidina/ácido succínico apresentando desempenho ligeiramente melhor do que histidina/ácido fosfórico e his-
tidina/HCI. Tabela 8 Trealose Di- | Sacarose uM Formulação *| Tampão pH hidratada (%) (%) Área SGD1010 F1 lCitrato de sódio// 5,2 [| o | ooo | ácido cit ácido cítrico a F2 20mm | 57 e | eo | F3 5.5 12] o | ot eso | Fa histidina/HCI a 5,5 | o | ooo | F5 65 e | o | F6 Citrato de só- | 5,2 | o | ooo | dio/ácido cítri io/ácido cítrico F7 a20mM | 57 e | o | F8 5.5 191 9% | [E 5] histidina/HCI o nstanarais 5 [Es] F1O 65 e | oo | Histidina/ ácido e fosfórico a 20 [111] 066 | F12 mM 12] o | [5 fame e | 6, Ee succínico a 20 F14 mM 19] 9% |
[00414] Análise SE-HPLC: Conforme mostrado na Tabela 9 abaixo e nas Figuras 1F, 1G e 1H, níveis crescentes de agregados de HMW foram evidentes por SE-HPLC para todas as formulações em um pH de 5,2 - 5,7, com as formulações de citrato mostrando mais agregados do que histidina no pH correspondente.
Em um pH similar, o citrato mostrou mais agregados do que a histidina.
As formulações de histidi- na em um pH de 6,0 mostraram melhor estabilidade do que aquelas em um pH de 5,5 e em um pH de 6,5. Não houve diferença observada entre a trealose e a sacarose.
Tabela 9 Lo lo 1 % da área total integrada Área integrada - , Tempo retenção 1 , o 1 1 , 1 1 Formulação | Dias a 40ºC . as Pré-picos | Pico principal | Pós-picos | Pré-picos |Pico principal| Pós-picos Total Pico principal 3
N pp oo" % da área total integrada Área integrada - , Tempo retenção 1 , o 1 1 , 1 1 Formulação | Dias a 40ºC . as Pré-picos | Pico principal | Pós-picos | Pré-picos |Pico principal| Pós-picos Total Pico principal mm ss sS = pp oo" % da área total integrada Área integrada - , Tempo retenção 1 , o 1 1 , 1 1 Formulação | Dias a 40ºC . as Pré-picos | Pico principal | Pós-picos | Pré-picos |Pico principal| Pós-picos Total Pico principal a | es | res | rs [nr | es oo om S 2 o 2%
pp oo" % da área total integrada Área integrada - , Tempo retenção 1 , o 1 1 , 1 1 Formulação | Dias a 40ºC . as Pré-picos | Pico principal | Pós-picos | Pré-picos |Pico principal| Pós-picos Total Pico principal oO
| % da área total integrada Área integrada . , Tempo retenção o , o 1 1 , o 1 Formulação | Dias a 40ºC À "es Pré-picos | Pico principal | Pós-picos | Pré-picos | Pico principal [Pós-picos| Total Pico principal me pa TA aa e Ro o am 1 =
N Bo pa a a az o oo
| % da área total integrada Área integrada . , Tempo retenção o , o 1 1 , o 1 Formulação | Dias a 40ºC À "es Pré-picos | Pico principal | Pós-picos | Pré-picos | Pico principal [Pós-picos| Total Pico principal
NS NS
[00415] “Nenhuma mudança significativa foi observada entre qual- quer uma das formulações, seja após 24 horas de agitação em tempe- ratura ambiente ou após um, três e dez ciclos de congelamento- descongelamento, conforme demonstrado por A330, SDS-PAGE e SE- HPLC (dados não mostrados no presente documento). Isto assegurou que as amostras do estudo de formulação poderiam ser retiradas em pontos de tempo diferentes e armazenadas a -70ºC.
[00416] Com base nos resultados obtidos neste estudo, as formula- ções F4, F9 e F14 foram selecionadas como ideais dentre as 14 for- mulações testadas e, portanto, foram escolhidas como as 3 formula- ções a serem avaliadas nos estudos subsequentes.
6.2 Exemplo 2 - Estudo de Congelamento, Descongelamento e Agitação de Substância Medicamentosa em Massa (BDS)
[00417] As formulações F4, F9 e F14 foram preparadas conforme descrito na Seção 6.1 acima. Cada uma das formulações F4, F9 e F14 foi submetida a 1, 3 e 10 ciclos de congelamento a -20ºC e -70ºC se- guido por descongelamento entre 20ºC - 25ºC. As amostras foram analisadas através de inspeção visual, medição de concentração (A280), medição de turbidez (A330), SE-HPLC, SDS-PAGE (R&NR). Para os 10 ciclos de estudo de congelamento-descongelamento, as amostras também foram analisadas por RP-HPLC NPI.
[00418] Os requisitos de material e o mapa de amostra são mostra- dos na Tabela 10 abaixo:
Tabela 10 Concentração Volume de Volume total Proteína total Condição f de frascos Cm em [remes amo Jana] nao :
N * de concs. de proteína a Volume total de enchimento Proteína nos frascos|Proteína requerido;
[00419] A Tabela11 abaixo lista os ensaios e pontos de tempo. Tabela 11 1X 3X 10X 1X 3X 10X Agitação em Ensai P” T=0 (Cong./descong.|Cong./descong. | Cong./descong. | Cong./descong. | Cong./descong. ICong./descong. RT durante nsaio analítico = a - 70ºC/25ºC | a - 70ºC /25ºC | a - 70ºC/25ºC | a - 20ºC/25ºC | a - 20ºC/25ºC | a 20ºC/25ºC | 24 horas E | mae de parei isa A O a a a a area IS a a A RR
ÕK ISDS- PAGE não) N x x x x x x x x NS redutor SDS-PAGE re- x x x x x x x x dutor Potência &CIEF Fornecer amostras para testagem
Notas: e Frascos: garrafas de policarbonato com tampa de rosca estéreis de 5 mL (Nalgene 5-ml, t3500-05) e Cong./descong. BDS: Enchimento de 1 mL em garrafa de policarbo- nato de 5 mL e Agitação BDS: Enchimento de 3,5 mL em garrafa de policarbonato de 5 mL
[00420] Um estudo de agitação em RT de 24 horas também foi rea- lizado em cada formulação e todas as amostras de teste foram anali- sadas quanto ao visual, concentração (A280), turbidez (A330), SE- HPLC e HIAC.
[00421] — Amostras selecionadas a partir dos estudos acima também foram usadas para estudos de iCIEF e Potência.
[00422] “Envasamento da formulação e colocação de rolha, design do estudo de agitação, design do estudo de congelamento-desconge- lamento e o padrão de formulação são descritos abaixo.
Envasamento da Formulação e Colocação de Rolha
[00423] Filtração estéril e enchimento foram realizados em uma coi- fa de fluxo de ar laminar Baker SG600. As formulações e os placebos foram filtrados de forma estéril usando uma técnica asséptica (filtros de seringa de PVDF de 0,22 um Millipore Millex-GV, %SLGVO033RS). O AGS-22M6E filtrado e os tampões de formulação filtrados (placebo) foram transferidos para os frascos de policarbonato com tampa de rosca estéreis (Nalgene 5-ml, f$3500-05) usando uma pipeta eletrônica de 5 mL com pontas estéreis.
Design do Estudo de Agitação
[00424] Um frasco por formulação foi mantido na vertical em uma caixa de congelador padrão. A caixa foi, então, presa a um agitador orbital IKA-VIBRAMAX-VXR ajustado para 500 rom em temperatura ambiente durante 24 horas. Em seguida, as amostras foram retiradas e armazenadas a 70ºC até análise. Conjuntos de 3 alíquotas de cada amostra (alíquotas de 70 ul para cada amostra) foram congeladas a - 70ºC após filtrar através de filtro de 0,22 um. Após o teste analítico, qualquer material remanescente foi armazenado a 2-8ºC durante a noite, no caso de ser necessário um novo teste. Após todos os ensaios estarem concluídos, os materiais restantes foram armazenados a - 70ºC. Duas alíquotas congeladas foram usadas para ensaios cIEF e de potência. Design do Estudo de Estabilidade ao Congelamento-Desconge- lamento (-70ºC e -20ºC)
[00425] 1 frasco por formulação (1 ml de enchimento em garrafa de policarbonato de 5 ml) foi colocado na vertical em um freezer a -70ºC e -20ºC durante pelo menos 4 horas, o que permitiu o congelamento. Para o descongelamento, cada frasco foi removido do armazenamento e descongelado em temperatura ambiente (20-25ºC) até que o gelo não fosse mais observado e, em seguida, o frasco foi girado suave- mente. Isto constituía um ciclo completo de congelamento e desconge- lamento. Dez ciclos de congelamento-descongelamento foram conclu- ídos para cada frasco de amostra de formulação testada. Após o ciclo final de congelamento e descongelamento, todas as amostras foram avaliadas através de testes analíticos. As amostras foram analisadas por meio dos seguintes métodos: Aparência visual, A280/A248, Turbi- dez (A330), SE-HPLC, RP-HPLC-NPI e SDS-PAGE (R & NR). Conjun- tos de 3 alíquotas de cada amostra (alíquotas de 70 ul para cada amostra) foram congelados a -70ºC após filtragem através de um filtro de 0,22 um. Após o teste analítico, qualquer material remanescente foi armazenado a 2-8ºC durante a noite, no caso de ser necessário um novo teste. Após todos os ensaios estarem concluídos, os materiais restantes foram armazenados a -70ºC. Duas alíquotas congeladas fo- ram usadas para ensaios clEF e de potência.
Padrão de Formulação
[00426] 15 mL de matéria-prima AGS-22M6E a 12,8 mg/mL em sa- carose a 5,0 %, Tween 20 a 0,02 %, pH de 6,0, foram tomados e transformados em alíquotas a 500 ul/frasco, então, armazenados a - 70ºC como padrão de formulação para este estudo.
Resultados
[00427] — Aparência visual: A aparência visual de todas as amostras foi analisada neste estudo e nenhuma partícula foi observada, mesmo após agitação.
[00428] Análise A280 e A330: Os dados de A280 e A330 para for- mulações submetidas a diferentes condições neste estudo estão re- sumidos na Tabela 12 abaixo. Conforme mostrado, não houve altera- ção na concentração de proteína em nenhuma das condições de agi- tação ou congelamento-descongelamento. Além disso, não houve au- mento na turbidez após congelamento-descongelamento ou agitação.
Tabela 12 A280 A330 Ponto de Tempo IFormulação|Fator de Diluição[/A330/A280 iConc. (mg/mL)) (com A280 para Placebo subtraído) Não diluído 4 20 0,012)0,741 0,728 10,01 0,083 9 20 0,021/0,811 0,795 10,94 0,091 T=0, BDS 14 20 0,004/0,820| 0,789 10,86 0,103 4 20 0,011/0,749| 0,736 10,12 0,089 9 20 0,027/0,827| 0,811 11,16 0,960 Agitação = 14 20 0,001/0,820| 0,789 10,86 0,107 & q 20 0,006o,76 0,752 10,34 0,097 NS 9 20 0,026/0,812] 0,796 10,96 0,098 VP 1X -20C Cong./descong. 14 20 0,005/0,823] 0,792 10,90 0,112 4 20 0,003J0,779| 0,766 10,54 0,096 9 20 0,030/0,819| 0,803 11,05 0,098 3X -20C Cong./descong. 14 20 0,003/0,821 0,790 10,87 0,108 4 20 0,001/0,783] 0,770 10,59 0,097 9 20 0,031/0,822] 0,806 11,08 0,109 10X -20C Cong./descong,;] 14 20 0,008J0,818] 0,787 10,83 0,128
A2Z80 ASSO0 Ponto de Tempo IFormulação|Fator de Diluição[/A330/A280 —, JConc. (mg/mL)) o (com A280 para Placebo subtraído) Não diluído 4 20 0,002J0,780| 0,767 10,55 0,114 9 20 0,028/0,839)| 0,823 11,32 0,120 1X -70C Cong./descong. 14 20 0,001/0,816] 0,785 10,80 0,108 4 20 0,004/0,789) 0,776 10,67 0,095 9 20 0,031/0,8456)] 0,830 11,42 0,097 3X -70C Cong./descong. a 14 20 0,003/0,830| 0,799 11,00 0,107 o f=) 4 20 0,00610,797] 0,784 10,78 0,091 SN 9 20 0,031/0,833] 0,817 11,24 0,090 Ds 10X -70C Cong./descong,] 14 20 0,002Y0,827]| 0,796 10,95 0,093
[00429] Análise SDS-PAGE: Os resultados da análise de SDS-PAGE são mostrados nas Figuras 2A e 2B. Confor- me mostrado, não há alterações observadas por SDS-PAGE para as amostras do estudo de agitação e para as amos- tras de congelamento-descongelamento. Tanto géis redutores como não redutores são comparáveis ao padrão de formulação.
[00430] Análise RP-HPLC: Para as amostras de congelamento-descongelamento de 10 ciclos, a análise de RP- HPLC foi realizada. Nenhuma evidência de pico SGD1010 foi observada em qualquer formulação, conforme analisado por RP-HPLC (dados não mostrados no presente documento).
[00431] Análise SE-HPLC: Os resultados da análise SE-HPLC estão resumidos na Tabela 13 abaixo. Conforme mostrado, não houve diferenças observadas entre TO e as amostras de agitação ou as amostras de congelamento- descongelamento para qualquer uma das três formulações (F4, F9 e 14) ou placebos. Tabela 13 Tempo de Retenção de Nome da Pós- Condição Pico Principal Pré-picos | Pico Principal | Pós-picos | Pré-picos | Pico Principal Amostra picos | e | a Agitação duran- o 19,5 12 96,2 2,6 64 4937 134 |5134 2 te 24h RT NS
NM Agitação duran- 19,6 13 96,4 2,3 65 4980 120 |5164 te 24h RT
Agitação duran- 19,6 13 96,1 2,6 67 5052 138 5256 te 24h RT = FIA, BDS | 10/D 70% sto pas 59 [1 es | S
[00432] Os perfisdeSEC obtidos para cada uma das formulações de BDS, em cada uma das condições de estudo, foram analisados (dados não mostrados no presente documento). Não houve diferença observada para qualquer uma das formulações em qualquer condição comparado com BDS em T= O.
[00433] A Tabela 14 abaixo resume os dados de HIAC para as amostras de BDS para cada uma das 3 formulações testadas. A comparação dos resultados das amostras antes e depois da agitação em temperatura ambiente durante 24 horas descreve que menos de 100 partículas estavam na faixa entre 10 um e 25 um, com menos de 2 partículas na faixa de 25 um para todas as formulações.
Tabela 14 Média de 3 operações para contagens cumulativas totais/mL Tamanho (um) | Eondição Nome amostra | Formuição — | 2 TE Ts | TT 2) ; Placebo 9 [Bs a ri: ss 21] 1 FB ee ea Sem agitação 4 382 77 32 15 2 2 AGS22N6E 9 [5 Te 2 e 7 o 1 ê | 68 | 38 q Pre Tr 7 7 a 31) Placebo 9 [365 ss Ts o qo o Agitação em RT 1 Fr e a ess ee durante 24 horas q AGS22N6E 9 1
[00434] As formulações F9 e F14 mostraram contagens cumulativas levemente elevadas pós-agitação, com F4 mostrando comparabilidade pré e pós-agitação, conforme representado na Figura 2C (todas as contagens para 10 e um estão abaixo do limite USP).
[00435] No geral, os resultados demonstraram que todas as três formulações de BDS testadas exibem excelente estabilidade sob tratamento de ciclos de congelamento-descongelamento e agitação e nenhuma mudança foi obser-
vada em qualquer uma das amostras em relação a T = O através de qualquer um dos métodos analíticos.
6.3 Exemplo 3 - Estudo de Formulação Concorrente de BDS e Produto Medicamentoso (DP)
[00436] Este estudo foi realizado em conjunto com o estudo descrito na Seção 6.2 acima. As composições da for- mulação e os materiais usados para este estudo são os mesmos descritos na Seção 6.2.
[00437] Os requisitos de material e mapa de amostra são mostrados na tabela abaixo. Tabela 15 Condição de frascos Volume de en- [Volume de enchimento Proteína total (mg) mi total por formu-| mg total por for- chimento total lação mulação = BDS a 2-8ºC 5 1 5,0 50 R
NS
NM 10 BDS a -70ºC 1 NM o 9 DPaaSo/G0 RA Ls dd o 9 | 1o Jerassemsnam| e o 1110 Volume de enchimen-| t de Concs. de proteína a t de tampões a Proteína nos frascos (mg) Proteína requerida (mg) Total t frascos to total (mL) testar testat
[00438] Os pontos de tempo e ensaios são conforme descritos na tabela abaixo.
Tabela 16 Ensaio Analítico 1-Jun-10 15-Jun-10 29-Jun-10 27-Jul-10 24-Aug-10 LL EI ADOOS | Aparência visual (BDS ou após reconstituição x x x x x x a o Pp ção (DP apenas) — | a Umidade residual (DP apenas) x x Potência &CIEF* Fornecer amostras para testagem Nota: As amostras para o braço líquido do estudo foram congeladas a -70ºC até que as amostras do braço liofilizado fossem preparadas. As amostras líquidas congeladas foram, então, colocadas em condições ao mesmo tempo que as amostras liofilizadas foram colocadas em condições, de modo a tornar t = O idêntico para ambos os braços líquido e liofilizado do estudo.
[00439] Os parâmetros específicos do ciclo de liofilização são descritos na tabela abaixo. Após a liofilização estar concluída, os frascos foram fechados sob vácuo a 50 mT. Tabela 17 sr Temperatura ou Ter de Elevação | Tempoímin | PressioínTom | LAO er O E gg gerando aaa agem og
ET O [A | Barao [OO em a E e ge ag | LEI o OO ERR a ETR OO ERR a a [5 | serasa | agem a [O ease TO am ag a Ee err a
[00440] “Design do Estudo de Estabilidade de Formulação Líquida a 2-8ºC e -70ºC
[00441] Os frascos com formulações e com placebo foram coloca- dos na vertical em um freezer ajustado para -70ºC e uma incubadora ajustada para 2-8ºC. Em cada ponto de tempo, um frasco com ativo e um frasco com placebo para cada formulação foram removidos das condições de armazenamento de acordo com o mapa de amostra para teste analítico. Após o teste analítico, qualquer material remanescente foi armazenado a 2-8ºC, no caso de ser necessário um novo teste. As alíquotas foram armazenadas a -70ºC e foram usadas para cIEF e tes- te de atividade. Design do Estudo de Estabilidade de Formulação Liofilizada a 2- 8ºC, 25ºC e 40ºC
[00442] — Aos fracos com formulações e com placebo foram coloca- dos na vertical em uma incubadora ajustada para 2-8ºC, uma incuba- dora ajustada para 25ºC/60 % RH e uma incubadora ajustada para 40ºC/75 % RH. Em cada ponto de tempo, um frasco com ativo e um frasco com placebo para cada formulação foram removidos da condi- ção de armazenamento de acordo com o mapa de amostra para teste analítico. Após o teste analítico, qualquer material remanescente foi armazenado a 2-8ºC no caso de ser necessário um novo teste. As alí- quotas foram armazenadas a -70ºC e foram usadas para cIEF e teste de atividade.
[00443] O padrão de formulação usado neste estudo é o mesmo que aquele na Seção 6.2 acima.
[00444] — Análise do ciclo de liofilização: Um ciclo de liofilização típico inclui etapas de congelamento, secagem primária e secagem secundá- ria. Durante o processo de congelamento e secagem, a sublimação do gelo pode ser acompanhada através de referência a vários indicadores separados, tais como as leituras das sondas de termopar colocadas em frascos de amostra de placebo, a divergência e a coincidência pos- terior do manômetro de capacitância e leituras de pressão manômetro de Pirani e a medição do "ponto de orvalho" que rastreia a mudança na umidade relativa no espaço superior da câmara.
[00445] Ao comparar a temperatura média do termopar do produto, a diferença de leitura do manômetro de capacitância/medidor de Pirani e o perfil do ponto de orvalho, pode ser demonstrado que cada um es- tá bem correlacionado entre si.
[00446] Estabilidade das formulações de BDS: A estabilidade da formulação de BDS em condições de armazenamento de 2-8º"C e - 70ºC e em condições de armazenamento de 2-8ºC, 25ºC e 40ºC foram avaliadas nos pontos de tempo T = O, 2, 4, 8 e 12 semanas. Amostras liofilizadas líquidas e reconstituídas foram analisadas quanto à concen- tração (A280), turbidez (A330), SE-HPLC, SDS-PAGE (R e NR) e RP- HPLC NPI em cada ponto de tempo. Para o medicamento liofilizado (DP), a osmolalidade foi medida antes da liofilização e após a reconsti- tuição em t = O apenas; o aparecimento do bolo e o tempo de reconsti- tuição foram medidos em cada ponto de tempo; e Karl Fischer (umida- de residual) foi medido em T = 0 e T = 12 semanas apenas.
[00447] Aparência visual e tempo de reconstituição: As formações de bolo para todas as três formulações eram comparáveis. Tanto os ativos quanto os placebos para as três formulações formaram bolos brancos levemente craquelados com uma superfície brilhante. Todos mantiveram a estrutura intacta. Não houve diferenças entre ativos e placebos. Não houve diferenças entre estas formulações. Para todas as formulações armazenadas sob diferentes condições durante 2, 4,8 e 12 semanas, a aparência visual do bolo foi similar a T = 0, conforme mostrado na tabela abaixo.
Tabela 18 Concentração de Proteína ESET as Fa aa |
E Bolo branco, levemente Límpida, incolor, sem 2 semanas eraquelado, superfície Pa partículas |? | placebo rimam a pp 2 | | | 2 NC SL : Bola branco, Iavemente Límpida, incolor, sem NS 4 semanas Faqueicão superfície [a partículas 1º | Placebo meme a Pa = |
E Bolo branco, levemente Límpida, incolor, sem 8 semanas aquela superíicie Pas partículas |? | placebo men a
CNN ND
Concentração de Proteína Tempo de Reconstituição (segundos) Formulação mg/ml Aparência do Bolo Aparência Visual Lar e Impida, Incolor, sem 12 semanas q brilh e [ [/ partículas 1º | Placebo PL | Paso
[00448] —Análisede umidade: Após a liofilização ser concluída, um frasco com ativo e um frasco com placebo de ca- da formulação foram alocados para teste de umidade residual. Conforme mostrado na tabela abaixo e na Figura 3A, NS as umidades residuais dos ativos e placebos para F4 e F14 foram muito próximas, a qual variava a partir de 0,24 a SN , ; , = NM 0,70 %. F9 apresentou a maior umidade residual em todos os momentos em relação a F4 e F14.
Tabela 19 % umidade residual t=12 semanas; 2-8ºC | t=12 semanas; 25ºC | t=12 semanas; 40ºC Ativo | 0.00 | Placebo rr ae a ea e foot ico loan |
[00449] Os resultados representam a média de três determinações em 1 frasco. Ss
[00450] Depois que as amostras foram incubadas sob diferentes condições durante 12 semanas, a umidade residual para cada formu- lação foi testada novamente tanto para ativos como placebos. A umi- dade residual para todas as três formulações armazenadas a 2-8ºC durante 12 semanas foram similares a t = 0. F4 e F14 aumentaram a umidade em relação a t = O depois de armazenadas a 25ºC e 40ºC durante 12 semanas.
[00451] Para todos os pontos de tempo testados, após reconstitui- ção com 4,7 mL de WFI, todas as formulações reconstituídas e place- bos eram incolores e límpidas. Nenhuma partícula visível foi observa- da. As amostras de BDS armazenadas sob todas as condições e em todos os pontos de tempo também eram límpidas e incolores. Nenhu- ma partícula visível foi observada.
[00452] — Análise A280 e análise de osmolalidade: Antes de enchi- mento e liofilização, as concentrações de proteína das formulações foram verificadas em duplicata e descobriu-se que estavam dentro de + 1 mg/mL da concentração alvo de 10 mg/mL. Após reconstituição com 4,7 mL de WFI, as concentrações de proteína das formulações estavam dentro de + 1 mg/mL de BDS antes da liofilização (consulte Tabela 20 abaixo, BDS, t = 0). As osmolalidades das amostras formu- ladas e do tampão também foram testadas em duplicata antes de en- chimento e após a reconstituição. As osmolalidades antes de liofiliza- ção e após reconstituição estavam entre 187 e 194 mOsm/kg.
[00453] Os resultados da concentração de proteína de amostras de BDS e DP armazenadas sob diferentes condições são mostrados na Tabela 20 abaixo e na Figura 3B. Não houve mudança na concentra- ção de proteína na maioria das condições. No entanto, as amostras de BDS armazenadas a 2-8ºC mostraram um aumento inesperado da concentração de proteína. Houve duas razões possíveis: 1) a conden- sação que estava presente nos frascos pode não ter sido completa-
mente incorporada após a inversão.
Embora tenha sido feito um esfor- ço para absorver toda a condensação das laterais das garrafas, parte da condensação pode ter ficado presa na tampa da garrafa; 2) pode ocorrer alguma evaporação da amostra se um frasco tiver uma rosca defeituosa, embora este problema não tenha sido observado em um estudo anterior no qual 4 mL de substância medicamentosa foram co- locados nestes frascos e armazenados a 2-8ºC durante 12 semanas.
Tabela 20 (Dados de A280 e concentração do estudo de formulação de BDS e DP concorrente de 12 semanas) Em BDS - Semanas a -70ºC Formulação| o 2 4 6 12 0/2/4158 11) 0,757 10,737/0,735/0,740/0,727/10,4/10,1/10,1/10,2/ 10,0 0,735 10,725/0,749/0,727/0,736/10,1/10,0/10,3/10,0/ 10,1 | een | LC asma Formulação === o = [2/4 8 12 0 / 2/4/3812) 4 0,757 0,749 0,7630,801 0,812 10,4/10,3/10,5/11,0/ 11,2 9 0,735 0,748 0,7760,817 0,918 10,1/10,3/10,7/11,2/ 12,6 Co romeno Formulação o fotl2 [a 8 12/0/0112 14]8| 1) 10,757/0,757/0,745/0,778/0,773/0,747] 10,4 / 10,4 /10,2/10,7] 10,6] 10,3 10,735/0,769/0,743/0,777/0,782/0,769|/ 10,1 [10,6 /10,2/10,7] 10,8] 106 [à bopoeeentate tarda à Lj ama
Formulação o [oti2 [a 8 12/09 /o01/2/4/8| nm) lo,757/0,757/0,751/0,765/0,761/0,751/ 10,4 / 10,4 10,3/[10,5/10,5] 10,3 10,735/0,769/0,751/0,778/0,768/0,774 10,1 | 10,6 [10,3 [10,7] 10,6] 10,6 | popenbotntade bitanana e
LL Caran Formulação o [oti2 a 8 12/00 /o1/2 4/8] nm) lo,757/0,757/0,746/0,766/0,758/0,736] 10,4 / 10,4 / 10,3/10,5/ 10,4] 101 10,735/0,769/0,750/0,776/0,763/0,766| 10,1 | 10,6 [10,3 [10,7 10,5) 10,5 | à bopnteestenda ada Tabela 21 (Dados de osmolalidade do estudo de formulação de BDS e DP con- corrente em 12 semanas) [| [raso] IsEra TESE 2] Nas TPisseba 4 193 194 194 191 T=0, Lio 9 197 195 196 192 14 193 194 194 186 4 189 190 190 188 T=0, BDS 9 189 190 190 186 14 188 186 187 180
[00454] Análise A330: As medições de A330 tanto de frascos com ativos BDS como DP reconstituídos e placebo são mostradas na Tabe- la 22 abaixo e Figura 3C. O valor A330 para o frasco com ativo foi li- geiramente superior àquele do placebo, indicando que a proteína AGS-22M6E contribui para a turbidez da formulação. Não houve au- mento significativo na turbidez quando de armazenamento das amos- tras de ativo e placebo em todas as condições.
Tabela 22 LIL seen FOI [Formulação a pç) fFomulaçãà o | 2 Ta TT nn] 4 0,083 0,085 0.084 0,101 0,091 TE Soa 0 2 210 21 14 0,103 0.099 0,005 0.111 | 0,112 lacebo 9 Placebo | 0010 4 Placebo | 0,000 0.003 0.004 0,017 | 0,008 14 Placebo | 0010 9 Placebo | 0,040 0.008 0,005 0,018 | 0.015 [14 Placebo] 0.010 0.005 0.002 0,022 | 0.011 ELI Fuse |] [OTTO ousa | ema o a e
ESTES 9 0,091 0,104 0,105 0,104 | 0111 | 0117 0,091 2104 011 0,104 | 0,105 | 0,118 14 0,103 0114 0,120 0,116 | 0,130 : 0,120 0,103 2114 017 | 0,105 | 0,128 | 0,119 9 Placebo | 0010 | 0030 9 Placebo | 0010 | 2030 14 Placebo 0,010 0,020 [14 Placebo] 0,010 2020 [| pro Semanasasoc | [Formulação | o 2) 9 0,091 0,104 0110 0,103 | 0,107 | 0,109 14 0,103 0114 0,109 0,105 | 0,148 | 0,118 4 Placebo | 0009 0,009 0012 0.008 | 0.015 | 0.016 é Placebo | 0010 | 0.020 | 0007 | 0000 | 0014 oo O semana é antes de lio (BDS t = O) 0,1 semana é após lio (anteriormente indicado como t = O lio)
[00455] Análise SDS-PAGE: As Figuras 3D e 3E mostram a análise SDS-PAGE para BDS T = 0 (pré-liofiização) e T = amostras de 12 se- manas sob condições de armazenamento de 2-8ºC e -70ºC. As Figu- ras 3F, 3G, 3H mostraram a análise SDS-PAGE para DPem T=0eT = amostras de 12 semanas sob condições de armazenamento de 2- 8ºC, 25ºC e 40ºC. Nenhuma mudança óbvia foi observada para todas as formulações após 12 semanas de armazenamento sob todas as condições.
[00456] Análise RP-HPLC: Todas as amostras de BDS e DP neste estudo também foram testadas por meio do método de RP-HPLC NPI. Não houve pico de SGD1010 observado em qualquer formulação sob qualquer condição (dados não mostrados no presente documento). Para todos os controles executados em cada ponto de tempo, as re- cuperações de pico de SGD1010 no padrão de formulação foram de cerca de 100 %. Em T = pontos de tempo de 4 semanas, 8 semanas e
12 semanas, embora uma nova diluição de estoque de SGD1010 a 10 mM tenha sido usada com diluente preparado fresco, a divisão de pico de SGD1010 e a divisão de pico de SGD1010 no padrão de formula- ção não foi dividida (dados não mostrado no presente documento). Isto foi consistente em toda a sequência (dados não mostrados no presen- te documento). A recuperação calculada usou a área combinada dos picos divididos.
[00457] Análise SE-HPLC: A Tabela 23 abaixo resume os dados de SE-HPLC para o padrão de formulação executado em cada ponto de tempo para este estudo. Os dados mostram o nível de variação nas porcentagens do pico principal e dos picos posteriores em diferentes execuções para a mesma amostra.
Tabela 23 Tempo de retenção o [o [Eca ee] iprincipal| iprincipal) LE E e E e es 3] Los RR es Re
S
S et a et oo o | ag | as | at | 25 | Es E o as Ds os ELLE RE Es E E OR e
Padrão de Formulação x % da área integrada total Área integrada Tempo de retenção Pico Pico Injeção de pico principal |Pré-picos Pós-picos |Pré-picos Pós-picos Total iprincipal| iprincipal) vs | or | os [or | so | 12 [og | ao | os | Ã ã Mm
NM % da área integrada total Área integrada Tempo de retenção Pico Pico de pico principal |Pré-picos Pós-picos |Pré-picos Pós-picos Total iprincipal| iprincipal)
[00458] A Tabela 24 abaixo descreve os dados de SE-HPLC que resumem a porcentagem de picos de HMW, pico principal e picos de LMW para amostras de BDS armazenadas sob condições de 2-8ºC e -70ºC durante 12 semanas (dados não mostrados no presente documento). As variações das porcentagens do pico principal e pós-picos em dife- rentes pontos de tempo foram muito similares às variações observadas no padrão de formulação (dados não mostra- dos no presente documento). Portanto, pode-se concluir que não ocorreram alterações importantes e que todas as 3 formulações permaneceram estáveis após 12 semanas a 2-8 º e -70ºC na forma líquida. Não foram observadas gran- des diferenças entre as formulações. Tabela 24
NM . o
N (Semanas a Tempo de retenção Ds Pico Pico Nome Amostra| 2-8ºC de pico principal Pré-picos Pós-picos Pré-picos Pós-picos Total principal principal Fº 32540 1100 34078
Po % da área integrada total (Semanas a Tempo de retenção Pico Pico Nome Amostra| 2-8ºC de pico principal Pré-picos Pós-picos Pré-picos Pós-picos Total principal principal 26688 1285 | 3645 =
NM NM
NM Lo 7% da área integrada total Semanas a | Tempo de retenção Pico prin- Pico prin- Nome Amostra 70ºC de pico principal | Pré-picos Pós-picos | Pré-picos Pós-picos Total cipal cipal
| rememeas | O ame — | Semanas a | Tempo de retenção cipal cipal Loo E E E RE e 5) 8 EE TE R R e e s es5
FEIA E E EE E E ES S S
[00459] A Tabela 25 abaixo descreve os dados SE-HPLC que re- sumem a porcentagem de picos de HMW, pico principal e picos de LMW para AGS-22M6E liofilizada armazenada sob condições de 2- 8ºC, 25ºC/60 % RH e 40ºC /75 % UR durante 12 semanas.
A Figura 31 mostra os dados de SE-HPLC em gráficos para BDS AGS-22M6E e DP armazenadas sob diferentes condições.
As variações das porcen- tagens do pico principal e pós-picos em diferentes pontos de tempo foram muito similares às variações observadas no padrão de formula- ção, indicando que não ocorreram grandes mudanças nas amostras de formulação.
As sobreposições de SE-HPLC para diferentes formu- lações de DP armazenadas sob diferentes condições também foram analisadas (dados não mostrados no presente documento). Não houve diferenças observadas antes e após a liofilização.
Todas as 3 formula- ções eram estáveis após 12 semanas a 2-8 º, 25 º e 40ºC na forma liofilizada.
Todas as formulações se comportaram de forma similar e forneceram um produto de alta qualidade após a liofilização, além de perfis de estabilidade aceitáveis observados para o BDS correspon- dente em cada caso, tanto em T = O quanto após estudos de agitação e congelamento-descongelamento.
Tabela 25 O estreita O Aresmegats Nome amostra Semanas a Tempo de retenção a; Pico - A Pico a : 2-8 ºC de pico principal Pré-picos principal Pós-picos Pré-picos principal Pós-picos Total Fo TB Tg se Far Te ss 3) ea EEE Es sa q E Ts eos Te [s049
N [LA ss as ese [rs [as [ese | 6 6 |
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S eo FE Ta As [sa Tr Ts 055 Too | saa8a | [Fo TB Ts ss Tr Ts Tam e | 5)
F nº CE a Os [ss [| 29 | 46 [33414] o | s4861 |
O renegado |O Aresimegass — | Semanas a| Tempo de retenção Pico Pico Nome Amostra| 25ºC de pico principal Pré-picos principal Pós-picos | Pré-picos principal Pós-picos Total [LE Cs se [E e | so | sz | ea FE Ts Ts s7 [so Ts er os | 35067 | Fo Ts Ts ess Tr Tam [ss sm 3] &
SN Fo [Exa as 7 so asa 203 | 1615 | sas02 | [o ss | [| 29 | ss [sm] om | 5 |
F é PET A [ss7 [ao | a [33192 | o | 34606 | penas TR ERES mens Paga rente rn fia renas | rom Nome Amostra| —40ºC de pico principal Pré-picos is Pós-picos | Pré-picos is Pós-picos Total principal principal Lo ss os | se [er e em o | se | ea FE sz A ss Ts ss [250 | os 5650 | Fo Bs As sa Tr as ese e e] x
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S eo LE az os [ss [a a [sr | 1039 | a5560 | o ss os [sa | Rs se [so | om | aaso |
F 1 ET z As ss Tso sm [255 | o | aa056 |
6.4 Exemplo 4 - Desenvolvimento do Ciclo de Liofilização
[00460] A formulação F4 descrita nas seções acima foi selecionada para este estudo de desenvolvimento de ciclo de liofilização adicional.
Os parâmetros do ciclo de liofilização são mostrados na tabela abaixo.
Após a liofilização es- tar concluída, os frascos foram fechados sob vácuo a 50 mT.
A bandeja de frascos foi removida do liofilizador e os frascos foram fechados individualmente com lacres de alumínio.
Tabela 26 ESTO Fe Temperatura ou Tara de ElevagioTempo [minpressáo (nor) LI et O e e Cr | eesesemero |O oem a LE E a LE e gg LE a e LE do AR Ae am a Cr eos em ar a O eee | sem a E e gem a
Design de Estudo de Formulação Liofilizada
[00461] Para cada configuração de volume de enchimento, 5 fras- cos de produto foram enchidos, além de 5 frascos de placebo. 2 fras- cos de cada um de produto ativo e placebo foram testados para cada volume de enchimento em T = O (1 frasco foi testado quanto à umida- de residual e 1 frasco foi reconstituído e testado usando os ensaios descritos no resumo do estudo). Além disso, 2 frascos de cada um de ativo e placebo foram testados para monitoramento de temperatura durante o processo de liofilização.
[00462] O padrão de formulação usado para este estudo foi a maté- ria-prima AGS-22M6E a 12,8 mg/mL em sacarose a 5,0 %, Tween 20 a 0,02 %, pH de 6,0. Resultados
[00463] Análise do ciclo de liofiização: O tempo total do ciclo con- servador foi de 2,6 dias, o que é significativamente menor do que o tempo de ciclo de 4,7 dias estabelecido para um volume de enchimen- to de 5 mL (consulte Seção 6.3 acima). O tempo de ciclo de 2,6 dias, no entanto, para o presente estudo não é representativo de um tempo de ciclo otimizado para nenhum dos volumes de enchimento. Após avaliação cuidadosa das leituras individuais associadas ao ciclo, uma estimativa de um tempo de ciclo otimizado para qualquer volume de enchimento pode ser feita. Uma vez que o monitor de ponto de orvalho está respondendo à umidade que evolui de ambos os volumes de en- chimento, ele não foi usado neste estudo para estimar um tempo de secagem mais ideal para o volume de enchimento de 3,0 mL ou 1,5 mL. Da mesma forma, o medidor de Pirani, embora normalmente um excelente indicador do ponto final do tempo de secagem primária, nes- te caso, constitui apenas um guia, uma vez que também está respon- dendo à sublimação do gelo de todos os frascos na plataforma. Em vez disso, para fins deste estudo, o monitoramento da temperatura do produto constitui a ferramenta mais confiável para estimar os tempos de secagem para cada volume de enchimento individual. Neste estu- do, as sondas de termopar foram colocadas em frascos com ativo e placebo e foi observada uma concordância próxima entre os perfis de temperatura do produto para ativo e placebo para ambos os volumes de enchimento.
[00464] “Com «esta garantia de que a temperatura do produto fornece uma medição precisa do tempo de secagem, a comparação dos dados para os dois volumes de enchimento (dados não mostrados no presen- te documento) demonstra que o volume de enchimento de 1,5 mL se- ca em aproximadamente 1,3 dias, o que é consideravelmente mais rápido do que o volume de enchimento de 3,0 mL que seca em apro- ximadamente 1,8 dias.
[00465] Aparência do bolo: Todos os bolos eram bolos perfeitos, muito ligeiramente retraídos, com uma superfície brilhante. Todos eles mantiveram a estrutura intacta. Na maioria dos frascos, não havia cra- quelamento nos bolos. Quando os frascos foram invertidos, os bolos não permaneceram aderentes aos frascos, mas tombaram intactos nos frascos. Em alguns frascos, pequenas rachaduras foram observa- das ao redor da borda do círculo do menisco, onde o bolo estava pre- so ao frasco. Não houve diferença entre a formação de bolo para ati- vos e placebos para ambos os volumes de enchimento. A aparência do bolo também foi comparável ao registro da aparência do bolo para o produto liofilizado com volume de enchimento de 5 mL no estudo da Seção 6.3.
[00466] Análise A280: Antes de enchimento e liofilização, a concen- tração de proteína da formulação foi verificada em duplicata e desco- briu-se que estava próximo da concentração alvo de 10 mg/mL. Após reconstituição com 2,8 mL e 1,4 mL de WFI, respectivamente, as con- centrações de proteína para as formulações em um enchimento de 3,0 mL e 1,5 mL também estavam próximas àquelas antes da liofilização (consulte a tabela abaixo).
Tabela 27 Fator de [proteína] Média [Ames Jontcãaias Som rem “ramo mama cl TD F4 10 mg/mL, = ee F4 10 mg/mL,
[00467] “Umidade residual, tempo de reconstituição, A330, osmolali- dade e aparência visual: Depois que a liofilização foi concluída, um frasco de cada volume de enchimento dos frascos com ativo e placebo foi alocado para teste de umidade residual. Conforme mostrado na Tabela 28 abaixo, as umidades residuais dos ativos variavam de 0,18 % para o enchimento de 3,0 mL a 0,29 % para o enchimento de 1,5 mL. Foi determinado que a umidade residual era ligeiramente maior para os placebos, a 0,34 % para ambos os volumes de enchimento. Os tempos de reconstituição foram inferiores a 1 minuto para todos os frascos testados, com tempos ligeiramente superiores registrados para os volumes de enchimento de 3,0 mL (média de 36 s) comparado com as amostras de volume de enchimento de 1,5 mL (média de 20 s). Não houve diferença apreciável observada no tempo de reconstituição en- tre os frascos com placebo e ativos. Da mesma forma, a aparência vi- sual de todas as amostras reconstituídas, tanto de ativos quanto pla- cebo, foi relatada como límpida e incolor, sem partículas.
Tabela 28 Osmolalidade Tempo Reconstituição (seg)| Turbidez (A330) Umidade Residual %* Volume enchi- (mOsm/kg)]! Condição . 0,0610 | 0,0142 Pré-Lio Lo 10 | am Lo = |
[00468] As medições de turbidez (A330) de frascos com placebo e ativo também são mostradas na tabela acima. N o Conforme mostrado, para as amostras pré- e pós-liofilização, os valores de A330 para o frasco com ativo foram ligei- SN ramente maiores do que o placebo, confirmando os resultados anteriores discutidos na Seção 6.3, onde foi demons- D trado que a AGS-22M6E contribui para a turbidez da formulação.
[00469] As osmolalidades das amostras formuladas e do tampão foram testadas em duplicata antes de enchimento e após a reconstitui- ção. A Tabela 28 acima resume estes dados, mostrando que não hou- ve diferença apreciável na osmolalidade antes de liofilização ou após a reconstituição. Elas também foram comparáveis à osmolalidade de- terminada para as amostras de configuração de enchimento de 5,0 mL na Seção 6.3.
[00470] A Figura 4 mostra a análise SDS-PAGE para cada volume de enchimento, tanto redutor quanto não redutor, comparado com o padrão de formulação. Os resultados demonstram que a alteração do volume de enchimento não teve nenhum impacto sobre o perfil de SDS-PAGE.
[00471] A Tabela 29 abaixo resume os dados SEC-HPLC, incluindo as porcentagens de picos de HMW, picos principais e picos de LMW para amostras liofiizadas em cada volume de enchimento. Indepen- dentemente do volume de enchimento avaliado, as amostras liofiliza- das se comportaram de forma similar e não houve diferença nas prin- cipais áreas de pico medidas antes e após a liofiização. Nenhuma mudança foi observada para o volume de enchimento e os perfis eram comparáveis ao volume de enchimento de 5 mL liofilizado no estudo descrito na Seção 6.3.
Tabela 29 [Fo Percentagens de Pico (%) Área de Pico (mAu) Tempo de retenção Nome amostra de pico principal Pré-picos | Pico principal | Pós-picos | Pré-picos | Pico principal |Pós-picos| Total . , 19,8 14 95,2 34 429 29155 1045 30629 Padrão de referência 19,8 13 95,4 3,3 481 34059 1174 35714 FA, ativo, lio, enchimento de 3,0 mL 19,8 14 95,1 3,5 487 32359 1198 34043 FA, ativo, lio, enchimento de 1,5 mL
[00472] A partir do exposto, será reconhecido que, embora modalidades específicas tenham sido descritas no pre- NS ; ; > 1 AAA ; ; 1 N sente documento para fins de ilustração, várias modificações podem ser feitas sem se desviar do espírito e escopo do NS
NM que é fornecido no presente documento. Todas as referências citadas acima são incorporadas ao presente documento MV a título de referência na íntegra.
7. LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS
[00473] O presente relatório descritivo está sendo depositado com uma cópia em formato legível em computador (CRF) da Listagem de Sequências. A CRF intitulada "14369-244-228 SEQ LISTING.txt", a qual foi criada em 11 de outubro de 2019 e tem 39.693 bytes de tamanho, é incorporada ao presente documento a título de referência na ínte- gra.

Claims (114)

REIVINDICAÇÕES
1. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende: (a) um conjugado de anticorpo e fármaco que compreende um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que se liga à 191P4D12 conjugada a uma ou mais unidades de monometil auristatina E (MMAE), em que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende uma região variável de cadeia pesa- da que compreende regiões determinantes de complementaridade (CDRs) que compreendem as sequências de aminoácidos das CDRs da região variável de cadeia pesada apresentada em SEQ ID NO: 7 e uma região variável de cadeia leve que compreende a CDRs que compreendem as sequências de aminoácidos das CDRs da região va- riável de cadeia leve apresentada em SEQ ID NO: 8; e (b) um excipiente farmaceuticamente aceitável que com- preende L-histidina, polissorbato-20 (TWEEN-20) e pelo menos um dentre di-hidrato de trealose e sacarose.
2. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindica- ção 1, caracterizada pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de liga- ção a antígeno compreende CDR H1 que compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9, CDR H2 que compreende uma se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, CDR H3 que compreende um sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11; CDR L1 que com- preende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12, CDR L2 que compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13 e CDR L3 que compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14.
3. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindica- ção 1, caracterizada pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de liga- ção a antígeno do mesmo compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos que varia do 20º aminoácido (ácido glutâmico) ao 136º aminoácido (serina) de SEQ ID NO: 7 e uma região variável de cadeia leve que compreende a se- quência de aminoácidos que varia do 23º aminoácido (ácido aspártico) ao 130º aminoácido (arginina) de SEQ ID NO: 8.
4. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindica- ção 1, caracterizada pelo fato de que o anticorpo compreende uma cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos que va- ria do 20º aminoácido (ácido glutâmico) ao 466º aminoácido (lisina) de SEQ ID NO: 7 e uma cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos que varia do 23º aminoácido (ácido aspártico) ao 236º aminoácido (cisteína) de SEQ ID NO: 8.
5. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que o fragmento de ligação a antígeno é um fragmento Fab, F(ab')z, Fv ou scFv.
6. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo totalmente humano.
7. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo é produzido de forma re- combinante.
8. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo fato de que o conjugado de anticorpo-fármaco tem a seguinte estrutura: o II IAAX oH
É
NH em que L- representa o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo e p é a partir de 1 a 10.
9. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindica- ção 8, caracterizada pelo fato de que p é a partir de 2a8.
10. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindica- ção 1, caracterizada pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de liga- ção a antígeno do mesmo está ligado a cada unidade de monometil auristatina E (MMAE) através de um ligante.
11. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindica- ção 10, caracterizada pelo fato de que o ligante é um ligante enzimati- camente clivável e em que o ligante forma uma ligação com um átomo de enxofre do anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mes- mo.
12. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindica- ção 10, caracterizada pelo fato de que o ligante tem uma fórmula de: — Aa WwY,y; em que -A- é uma unidade extensora, a é O ou 1; -W- é uma unidade de aminoácido, w é um número inteiro a partir de O a 12; e —Y- é uma unidade espaçadora, y é 0, 1 ou 2.
13. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindica- ção 12, caracterizada pelo fato de que a unidade extensora tem a es- trutura de Fórmula (1) abaixo; a unidade de aminoácido é valina citruli- na; e a unidade espaçadora é um grupo PAB que compreende a estru- tura de Fórmula (2) abaixo: o ' AA 9 º Fórmula (1)
- o Fórmula (2).
14. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindica- ção 12, caracterizada pelo fato de que a unidade extensora forma uma ligação com um átomo de enxofre do anticorpo ou fragmento de liga- ção a antígeno do mesmo; e em que a unidade espaçadora está ligada à MMAE através de um grupo carbamato.
15. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindica- ção 1, caracterizada pelo fato de que o conjugado de anticorpo- fármaco compreende a partir de 1 a 10 unidades de MMAE por anti- corpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo.
16. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindica- ção 15, caracterizada pelo fato de que o conjugado de anticorpo- fármaco compreende a partir de 2 a 8 unidades de MMAE por anticor- po ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo.
17. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizada pelo fato de que com- preende o conjugado de anticorpo-fármaco em uma concentração a partir de 1 a 20 mg/mL.
18. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindica- ção 17, caracterizada pelo fato de que compreende o conjugado de anticorpo-fármaco em uma concentração a partir de 5 a 15 mg/mL.
19. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindica- ção 17, caracterizada pelo fato de que compreende o conjugado de anticorpo-fármaco em uma concentração a partir de 8 a 12 mg/mL.
20. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindica- ção 17, caracterizada pelo fato de que compreende o conjugado de anticorpo-fármaco em uma concentração a partir de cerca de 10 mg/mL.
21. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 20, caracterizada pelo fato de que a L- histidina está presente na faixa a partir de 5 a 50 mM.
22. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 20, caracterizada pelo fato de que a L- histidina está presente na faixa a partir de 10 a 40 mM.
23. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 20, caracterizada pelo fato de que a L- histidina está presente na faixa a partir de 15 a 35 mM.
24. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 20, caracterizada pelo fato de que a L- histidina está presente na faixa a partir de 15 a 30 mM.
25. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 20, caracterizada pelo fato de que a L- histidina está presente na faixa a partir de 15 a 25 mM.
26. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 20, caracterizada pelo fato de que a L- histidina está presente em cerca de 20 mM.
27. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 26, caracterizada pelo fato de que a con- centração de TWEEN-20 está na faixa a partir de 0,001 a 0,1 % (v/v).
28. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 26, caracterizada pelo fato de que a con- centração de TWEEN-20 está na faixa a partir de 0,0025 a 0,075 % (v/v).
29. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 26, caracterizada pelo fato de que a con- centração de TWEEN-20 está na faixa a partir de 0,005 a 0,05 % (v/v).
30. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 26, caracterizada pelo fato de que a con- centração de TWEEN-20 está na faixa a partir de 0,01 a 0,03 % (v/v).
31. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 26, caracterizada pelo fato de que a con- centração de TWEEN-20 está na faixa a partir de cerca de 0,02 % (v/v).
32. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 31, caracterizada pelo fato de que a com- posição farmacêutica compreende di-hidrato de trealose.
33. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindica- ção 32, caracterizada pelo fato de que o di-hidrato de trealose está presente na faixa a partir de 1 a 20 % (p/v).
34. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindica- ção 32, caracterizada pelo fato de que o di-hidrato de trealose está presente na faixa a partir de 2 a 15 % (p/v).
35. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindica- ção 32, caracterizada pelo fato de que o di-hidrato de trealose está presente na faixa a partir de 3 a 10 % (p/v).
36. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindica- ção 32, caracterizada pelo fato de que o di-hidrato de trealose está presente na faixa a partir de 4 a 6 % (p/v).
37. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindica- ção 32, caracterizada pelo fato de que o di-hidrato de trealose está presente em cerca de 5,5 % (p/v).
38. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindica- ção 32, caracterizada pelo fato de que o di-hidrato de trealose está presente na faixa a partir de 50 mM a 300 mM.
39. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindica- ção 32, caracterizada pelo fato de que o di-hidrato de trealose está presente na faixa a partir de 75 mM a 250 mM.
40. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindica- ção 32, caracterizada pelo fato de que o di-hidrato de trealose está presente na faixa a partir de 100 mM a 200 mM.
41. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindica- ção 32, caracterizada pelo fato de que o di-hidrato de trealose está presente na faixa a partir de 130 mM a 150 mM.
42. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindica- ção 32, caracterizada pelo fato de que o di-hidrato de trealose está presente em cerca de 146 mM.
43. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 31, caracterizada pelo fato de que a com- posição farmacêutica compreende sacarose.
44. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindica- ção 43, caracterizada pelo fato de que a sacarose está presente na faixa a partir de 1 a 20 % (p/v).
45. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindica- ção 43, caracterizada pelo fato de que a sacarose está presente na faixa a partir de 2 a 15 % (p/v).
46. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindica- ção 43, caracterizada pelo fato de que a sacarose está presente na faixa a partir de 3 a 10 % (p/v).
47. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindica- ção 43, caracterizada pelo fato de que a sacarose está presente na faixa a partir de 4 a 6 % (p/v).
48. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindica- ção 43, caracterizada pelo fato de que a sacarose está presente em cerca de 5,5 % (p/v).
49. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindica- ção 43, caracterizada pelo fato de que a sacarose está presente na faixa a partir de 50 MM a 300 mM.
50. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindica- ção 43, caracterizada pelo fato de que a sacarose está presente na faixa a partir de 75 mM a 250 mM.
51. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindica- ção 43, caracterizada pelo fato de que a sacarose está presente na faixa a partir de 100 MM a 200 mM.
52. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindica- ção 43, caracterizada pelo fato de que a sacarose está presente na faixa a partir de 130 mM a 150 mM.
53. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindica- ção 43, caracterizada pelo fato de que a sacarose está presente em cerca de 146 mM.
54. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 53, caracterizada pelo fato de que a com- posição farmacêutica tem um pH na faixa a partir de 5,5 a 6,5.
55. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 53, caracterizada pelo fato de que a com- posição farmacêutica tem um pH na faixa a partir de 5,7 a 6,3.
56. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 53, caracterizada pelo fato de que a com- posição farmacêutica tem um pH de cerca de 6,0.
57. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 54 a 56, caracterizada pelo fato de que o pH é medido em temperatura ambiente.
58. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 54 a 56, caracterizada pelo fato de que o pH é medido em a partir de 15ºC a 27ºC.
59. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 54 a 56, caracterizada pelo fato de que o pH é medido a 4ºC.
60. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 54 a 56, caracterizada pelo fato de que o pH é medido a 25ºC.
61. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 60, caracterizada pelo fato de que com- preende ácido clorídrico (HCI).
62. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 60, caracterizada pelo fato de que o pH é ajustado pelo HCI.
63. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 60, caracterizada pelo fato de que com- preende ácido succínico.
64. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 60, caracterizada pelo fato de que o pH é ajustado pelo ácido succínico.
65. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizada pelo fato de que com- preende L-histidina a cerca de 20 mM, TWEEN-20 a cerca de 0,02 % (p/v) e pelo menos um de di-hidrato de trealose a cerca de 5,5 % (p/v) OU Sacarose a cerca de 5 % (p/v).
66. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindica- ção 65, caracterizada pelo fato de que compreende ainda HCI ou ácido succínico.
67. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindica- ção 65 ou 66, caracterizada pelo fato de que o pH é 6,0 em temperatu- ra ambiente.
68. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindica- ção 65 ou 66, caracterizada pelo fato de que o pH é 6,0 a 25ºC.
69. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende: (a) um conjugado de anticorpo-fármaco que compreende a seguinte estrutura: ox, Gm ou L o o 6 F A, em que L- representa o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo e p é a partir de 1a 10; e (b) um excipiente farmaceuticamente aceitável que com- preende L-histidina a cerca de 20 mM, TWEEN-20 a cerca de 0,02 % (p/v), di-hidrato de trealose a cerca de 5,5 % (p/v) e HCI.
em que o pH é cerca de 6,0 a 25ºC.
70. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindica- ção 69, caracterizada pelo fato de que o conjugado de anticorpo- fármaco está na concentração de cerca de 10 mg/mL.
71. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende: (a) um conjugado de anticorpo-fármaco que compreende a seguinte estrutura: o à so SH ON *o Je , hr em que L- representa o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo e p é a partir de 1a 10; e (b) um excipiente farmaceuticamente aceitável que com- preende L-histidina a cerca de 20 mM, TWEEN-20 a cerca de 0,02 % (p/v), di-hidrato de trealose a cerca de 5,5 % (p/v) e ácido succínico.
em que o pH é cerca de 6,0 a 25ºC.
72. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindica- ção 71, caracterizada pelo fato de que o conjugado de anticorpo- fármaco está na concentração de cerca de 10 mg/mL.
73. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende: (a) um conjugado de anticorpo-fármaco que compreende a seguinte estrutura: o "à GH o oN [evo PERCENtO L o & , =A,. em que L- representa o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo e p é a partir de 1a 10; e (b) um excipiente farmaceuticamente aceitável que com- preende L-histidina a cerca de 20 mM, TWEEN-20 a cerca de 0,02 % (p/v), sacarose a cerca de 5,0 % (p/v) e HCI.
em que o pH é cerca de 6,0 a 25ºC.
74. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindica- ção 73, caracterizada pelo fato de que o conjugado de anticorpo- fármaco está na concentração de cerca de 10 mg/mL.
75. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 74, caracterizada pelo fato de que a com- posição farmacêutica está na forma líquida.
76. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 74, caracterizada pelo fato de que a com- posição farmacêutica é liofilizada.
77. Composição liofilizada, caracterizada pelo fato de que é produzida através de liofiização da composição farmacêutica como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 74.
78. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 74, caracterizada pelo fato de que a com- posição farmacêutica é armazenada a -80ºC, 4ºC, 25ºC ou 37ºC.
79. Método para prevenir ou tratar uma doença ou transtor- no em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende admi- nistrar ao indivíduo uma quantidade eficaz da composição farmacêuti- ca como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 78.
80. Método, de acordo com a reivindicação 79, caracteriza- do pelo fato de que o indivíduo é um ser humano.
81. Método, de acordo com a reivindicação 80, caracterizado pelo fato de que o câncer é câncer de cólon, câncer pancreático, câncer de ovário, câncer de pulmão, câncer de bexiga, câncer urotelial, câncer de mama, câncer de esôfago, câncer de cabeça ou câncer de pescoço.
82. Método, de acordo com a reivindicação 81, caracteriza- do pelo fato de que o câncer é câncer de cólon.
83. Método, de acordo com a reivindicação 81, caracteriza- do pelo fato de que o câncer é câncer pancreático.
84. Método, de acordo com a reivindicação 81, caracteriza- do pelo fato de que o câncer é câncer de ovário.
85. Método, de acordo com a reivindicação 81, caracteriza- do pelo fato de que o câncer é câncer de pulmão, em que o câncer de pulmão é opcionalmente câncer de pulmão de células não pequenas.
86. Método, de acordo com a reivindicação 81, caracteriza- do pelo fato de que o câncer é câncer de bexiga ou câncer urotelial.
87. Método, de acordo com a reivindicação 86, caracteriza- do pelo fato de que o câncer de bexiga é câncer de bexiga avançado ou câncer urotelial avançado.
88. Método, de acordo com a reivindicação 86, caracteriza- do pelo fato de que o câncer de bexiga é câncer de bexiga metastático ou câncer urotelial metastático.
89. Método, de acordo com a reivindicação 81, caracteriza-
do pelo fato de que o câncer é câncer de mama.
90. Método, de acordo com a reivindicação 81, caracteriza- do pelo fato de que o câncer é câncer de esôfago.
91. Método, de acordo com a reivindicação 81, caracteriza- do pelo fato de que o câncer é câncer de cabeça.
92. Método, de acordo com a reivindicação 81, caracteriza- do pelo fato de que o câncer é câncer de pescoço.
93. Método, de acordo com a reivindicação 80, caracteriza- do pelo fato de que o câncer tem células tumorais que expressam 191P4D12.
94. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 79 a 93, caracterizado pelo fato de que compreende ainda admi- nistrar ao indivíduo um segundo agente terapêutico.
95. Método, de acordo com a reivindicação 94, caracteriza- do pelo fato de que o segundo agente terapêutico é um inibidor do ponto de verificação imune.
96. Método, de acordo com a reivindicação 95, caracteriza- do pelo fato de que o inibidor do ponto de verificação imune é um ini- bidor de PD-1 ou um inibidor de PD-L1.
97. Método, de acordo com a reivindicação 96, caracteriza- do pelo fato de que o inibidor do ponto de verificação imune é um ini- bidor de PD-1.
98. Método, de acordo com a reivindicação 97, caracteriza- do pelo fato de que o inibidor PD-1 é nivolumabe.
99. Método, de acordo com a reivindicação 96, caracteriza- do pelo fato de que o inibidor do ponto de verificação imune é um ini- bidor de PD-L1.
100. Método, de acordo com a reivindicação 99, caracteri- zado pelo fato de que o inibidor de PD-L1 é selecionado a partir de um grupo que consiste em atezolizumabe, avelumabe e durvalumabe.
101. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 79 a 100, caracterizado pelo fato de que o conjugado de anticor- po-fármaco formulado na composição farmacêutica é administrado em uma dose a partir de 1 a 10 mg/kg de peso corporal do indivíduo.
102. Método, de acordo com a reivindicação 101, caracteri- zado pelo fato de que o conjugado de anticorpo-fármaco formulado na composição farmacêutica é administrado em uma dose a partir de 1 a mg/kg de peso corporal do indivíduo.
103. Método, de acordo com a reivindicação 101, caracteri- zado pelo fato de que o conjugado de anticorpo-fármaco formulado na composição farmacêutica é administrado em uma dose a partir de 1 a 2,5 mg/kg de peso corporal do indivíduo.
104. Método, de acordo com a reivindicação 101, caracteri- zado pelo fato de que o conjugado de anticorpo-fármaco formulado na composição farmacêutica é administrado em uma dose de 1 a 1,25 mg/kg de peso corporal do indivíduo.
105. Método, de acordo com a reivindicação 101, caracteri- zado pelo fato de que o conjugado de anticorpo-fármaco formulado na composição farmacêutica é administrado em uma dose a partir de cer- ca de 1 mg/kg de peso corporal do indivíduo.
106. Método, de acordo com a reivindicação 101, caracteri- zado pelo fato de que o conjugado de anticorpo-fármaco formulado na composição farmacêutica é administrado em uma dose a partir de cer- ca de 1,25 mg/kg de peso corporal do indivíduo.
107. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 101 a 106, caracterizado pelo fato de que o conjugado de anti- corpo-fármaco formulado na composição farmacêutica é administrado através de injeção ou infusão intravenosa (IV).
108. Método, de acordo com a reivindicação 107, caracteri- zado pelo fato de que o conjugado de anticorpo-fármaco formulado na composição farmacêutica é administrado através de uma injeção intra- venosa (IV) ou infusão durante cerca de 30 minutos duas vezes a cada ciclo de três semanas.
109. Método, de acordo com a reivindicação 108, caracteri- zado pelo fato de que o conjugado de anticorpo-fármaco formulado na composição farmacêutica é administrado através de injeção intraveno- sa (IV) ou infusão durante cerca de 30 minutos nos Dias 1 e 8 de cada ciclo de três semanas.
110. Método, de acordo com a reivindicação 109, caracteri- zado pelo fato de que compreende ainda administrar um inibidor de ponto de verificação imune através de uma injeção intravenosa (IV) ou infusão no Dia 1 de cada ciclo de três semanas.
111. Método, de acordo com a reivindicação 110, caracteri- zado pelo fato de que o inibidor do ponto de verificação imune é admi- nistrado em uma quantidade a partir de cerca de 100 mg a cerca de 1500 ao longo de cerca de 30 minutos ou 60 minutos.
112. Método, de acordo com a reivindicação 107, caracteri- zado pelo fato de que o conjugado de anticorpo-fármaco formulado na composição farmacêutica é administrado através de injeção intraveno- sa (IV) ou infusão durante cerca de 30 minutos três vezes a cada ciclo de quatro semanas.
113. Método, de acordo com a reivindicação 112, caracteri- zado pelo fato de que o conjugado de anticorpo-fármaco formulado na composição farmacêutica é administrado através de uma injeção intra- venosa (IV) ou infusão durante cerca de 30 minutos nos Dias 1,8 e 15 de cada ciclo de quatro semanas.
114. Método, de acordo com a reivindicação 113, caracteriza- do pelo fato de que compreende ainda administrar um inibidor do ponto de verificação imune através de injeção ou infusão intravenosa (IV).
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