BR112021008691A2 - nova classe de pigmentos em aspergillus - Google Patents

Abstract

NOVA CLASSE DE PIGMENTOS EM ASPERGILLUS. A invenção provê uma nova classe de pigmentos de azafilona vermelhos naturais: cavernaminas e seus derivados de hidroxila; bem como o precursor de cavernina laranja/amarelo. Além disso, métodos para a sua produção por fermentação usando uma cepa fúngica pertencente à espécie Aspergillus cavernicola são providos; e adicionalmente o uso de novos pigmentos como um agente corante para itens alimentícios e/ou itens não alimentícios, e para cosméticos. Os pigmentos de cavernamina têm a estrutura de Fórmula I ou II, o derivado de hidroxila do referido pigmento de cavernamina tem a estrutura de Fórmula III: Os pigmentos de cavernina tendo a estrutura de Fórmula IV ou V são precursores dos pigmentos de cavernamina I-III acima.

Description

NOVA CLASSE DE PIGMENTOS EM ASPERGILLUS Campo da invenção

[001] A invenção provê uma nova classe de pigmentos de azafilona vermelhos naturais: cavernaminas e seus derivados de hidroxila; bem como sua respectiva cavernina precursora laranja/amarela. Além disso, métodos para sua produção por fermentação usando Aspergillus cavernicola, são providos; e adicionalmente o uso dos novos pigmentos, e um kit compreendendo o mesmo, como um agente corante para itens alimentícios e/ou itens não alimentícios, e para cosméticos. Antecedentes da Invenção

[002] Corantes alimentícios naturais são cada vez mais procurados devido à crescente conscientização do consumidor sobre os potenciais efeitos nocivos dos corantes sintéticos1,2. Em vista do crescente reconhecimento de uma ligação entre dieta e saúde, a indústria de aditivos alimentícios enfrenta novos desafios no fornecimento de alternativas de cores naturais. Até agora, a maioria dos corantes naturais usados industrialmente são extraídos diretamente de fontes naturais, por exemplo, betanina (extrato de raiz de beterraba - Beta vulgaris), licopeno (extrato de tomate - Solanum lycopersicum) ou ácido carmínico (extraído do inseto Dactylopius coccus3 fêmea). Sua produção é altamente dependente do fornecimento de matérias-primas, que estão sujeitas a variações sazonais ambas em quantidade e qualidade4. Essas limitações podem ser superadas ao explorar novas fontes para pigmentos naturais, tais como microrganismos5. Os fungos são conhecidos por biossintetizar e excretar naturalmente diversas classes de metabólitos secundários, incluindo pigmentos dentro de uma faixa de cores6.

[003] Monascus é um gênero de fungo produtor de pigmentos que há muito é usado para a fabricação de alimentos tradicionais em países asiáticos 7.

Pigmentos derivados de Monascus são referidos como “pigmentos de Monascus”, que são uma mistura de azafilonas incluindo constituintes amarelos, laranja e vermelhos.

[004] O uso de espécies de Monascus para a produção de pigmentos de Monascus resulta em um coquetel de diferentes pigmentos de Monascus8, tendo uma faixa de tons, cuja composição é difícil de controlar e pode variar de batelada-para-batelada. Além disso, espécies de Monascus são conhecidas por produzir micotoxinas, tais como citrinina9, que causa diversos efeitos tóxicos, incluindo efeitos nefrotóxicos, hepatotóxicos e citotóxicos e que exclui seu uso para fins industriais nos países ocidentais. De uma perspectiva industrial, seria altamente preferencial produzir esses pigmentos componentes individualmente por fermentação, onde as espécies individuais de pigmentos produzidos estivessem livres de micotoxinas, tal que o pigmento possa ser facilmente extraído e recuperado sem a necessidade de múltiplas e possivelmente complexas etapas de purificação. Entre os usos importantes de pigmentos naturais estão como aditivos alimentícios; onde os pigmentos solúveis em água são altamente desejáveis. Sumário da invenção

[005] De acordo com um primeiro aspecto, a presente invenção provê um pigmento de cavernamina tendo a estrutura de Fórmula I ou II: Fórmula I Fórmula II em que R é hidrogênio, ou N-R é selecionado a partir de um aminoácido,

um peptídeo, um amino açúcar e uma amina primária.

[006] Preferencialmente, N-R de Fórmula I é um aminoácido selecionado a partir do grupo consistindo em: L-alanina, L-arginina, L-asparagina, L-aspartato, L-cisteína, L-glutamina, L-glutamato, L-glicina, L-histidina, L-isoleucina, L-leucina, L-lisina, L-metionina, L-fenilalanina, L-prolina, L-serina, L-treonina, L-triptofano, L-tirosina, L-valina e L-ornitina.

[007] De acordo com um segundo aspecto, a invenção provê uma cavernamina de hidroxila tendo a estrutura de fórmula III: Fórmula III em que R é hidrogênio, ou N-R é selecionado a partir de um aminoácido, um peptídeo, um amino açúcar e uma amina primária; e em que a referida hidroxi-cavernamina é um derivado de hidroxila da cavernamina do primeiro aspecto da invenção.

[008] Preferencialmente, N-R de Fórmula III é um aminoácido selecionado a partir do grupo consistindo em: L-alanina, L-arginina, L-asparagina, L-aspartato, L-cisteína, L-glutamina, L-glutamato, L-glicina, L-histidina, L-isoleucina, L-leucina, L-lisina, L-metionina, L-fenilalanina, L-prolina, L-serina, L-treonina, L-triptofano, L-tirosina, L-valina e L-ornitina.

[009] De acordo com um terceiro aspecto, a invenção provê um pigmento de cavernina tendo a estrutura de Fórmula IV ou Fórmula V:

Fórmula IV Fórmula V em que o referido pigmento de cavernina é um precursor do pigmento de cavernamina do primeiro aspecto da invenção e/ou a cavernaina de hidroxila do segundo aspecto da invenção.

[010] De acordo com um quarto aspecto, a invenção provê um método para produzir um pigmento de cavernamina e/ou um derivado de hidroxila do referido pigmento de cavernamina por fermentação, compreendendo as etapas de: a. fornecer esporos ou micélios de uma cepa de Aspergillus cavernicola, b. cultivar os referidos esporos ou micélios em um meio de crescimento líquido compreendendo uma fonte de nitrogênio, c. recuperar o pigmento de cavernamina e/ou seu derivado de hidroxila produzido durante o referido cultivo na etapa (b), e d. opcionalmente, isolar o referido pigmento de cavernamina e/ou seu derivado de hidroxila.

[011] Preferencialmente, a única fonte de nitrogênio na etapa (b) é um composto selecionado a partir do grupo consistindo em um único aminoácido, um peptídeo, um amino açúcar e uma amina primária.

[012] A invenção provê adicionalmente um método para produzir um pigmento de cavernamina e/ou um derivado de hidroxila da referida cavernamina por fermentação, compreendendo a etapa adicional de: a') cultivar esporos ou micélios da etapa (a) em um meio de crescimento líquido preliminar, em que a única fonte de nitrogênio do referido meio de crescimento líquido preliminar é uma fonte de nitrogênio inorgânico; e em que a referida etapa (a') é seguida pela etapa (b).

[013] A invenção refere-se adicionalmente ao uso de um pigmento de cavernamina de Fórmula I ou II, uma cavernamina de hidroxila de Fórmula III e/ou uma cavernina de Fórmula IV ou V como um agente corante para qualquer um dentre um alimento, um produto não alimentício e um cosmético.

[014] Além disso, a invenção se refere a um kit de partes para colorir uma composição, em que o kit compreende (i) pelo menos um pigmento de cavernamina de Fórmula I ou II, pelo menos uma cavernamina de hidroxila de Fórmula III e/ou pelo menos uma cavernina de Fórmula IV ou V, e (ii) um agente estabilizante, em que o pigmento é fornecido em um recipiente, em que a composição é selecionada a partir de um alimento, um produto não alimentício e um cosmético. Descrição da invenção

FIGURAS

[015] Figura 1: Estrutura de (A) pigmento de cavernamina (Fórmula I e II), (B) hidroxi-derivado de carvermina (Fórmula III) e (C) pigmento de cavernina (Fórmula IV e V).

[016] Figura 2: Diagrama mostrando o Cromatograma de Pico Base (BPC) e o Cromatograma UV (EWC, medido a 520 nm) de compostos extraídos da triagem inicial de A. cavernicola crescido em placas de ágar de extrato de levedura Czapek Dox (CYA) ou em caldo de fermentação líquido em uma etapa (como definido no exemplo 1.7). (A) A. cavernicola IBT32660: 1) BPC de extrato de placa CYA. 2) EWC (520nm) de extrato de placa CYA. 3) BPC de extrato de caldo Czapek Dox e 4) EWC (520 nm) de extrato de caldo Czapek Dox. (B) A. cavernicola IBT23158: 1) BPC de extrato de placa CYA, 2) EWC (520nm) de extrato de placa CYA, 3) BPC de extrato de caldo Czapek Dox e 4) EWC (520nm) de extrato de caldo Czapek Dox. A linha tracejada vertical em (A) e (B) indica o precursor cavernina amarelo/laranja.

[017] Figura 3: Diagrama mostrando cromatogramas EWC de compostos extraídos do meio de cultivo derivado de (A) A. carvernicola cepa IBT32660, ou (B) A. cavernicola cepa IBT23158 crescida em meio Czapek Dox suplementado com aminoácidos leucina, histidina, valina, arginina ou triptofano. Asterisco* indica os derivados de aminoácidos de cavernamina esperados; cruz† indica hidroxi-derivado das cavernaminas; a linha tracejada vertical indica o precursor cavernina amarelo/laranja; todos verificados por MS.

[018] Figura 4: Apresentação gráfica dos espectros de absorbância de (A) cavernina e (B) cis-cavernamina-L.

[019] Figura 5: Produção de pigmento (absorbância 520 nm, colunas cinza escura) e formação de biomassa (g/l, colunas cinza-claros) por A. cavernicola IBT32660 cultivado em diferentes pH.

[020] Figura 6: (A) Diagrama mostrando deslocamentos de 1H e 13C NMR para cavernamina trans; asterisco indica nenhum sinal detectado. (B) Diagrama mostrando a estrutura química de cavernamina trans.

[021] Figura 7: (A) Diagrama mostrando deslocamentos de 1H e 13C NMR para cavernamina cis; asterisco indica nenhum sinal detectado; (B) Diagrama mostrando a estrutura química de cavernamina cis.

[022] Figura 8: (A) Diagrama mostrando deslocamentos de 1H e 13C NMR para cis-cavernamina-L; asterisco indica nenhum sinal detectado. (B) Diagrama mostrando a estrutura química de cis-cavernamina-L.

[023] Figura 9: (A) Diagrama mostrando deslocamentos de 1H e 13C NMR para cavernina trans; asterisco indica nenhum sinal detectado. (B) Diagrama mostrando a estrutura química de carvernina trans.

[024] Figura 10: (A) Diagrama mostrando deslocamentos de 1H e 13C NMR para hidroxi-cavernamina-H; asterisco indica nenhum sinal detectado. (B) Diagrama mostrando a estrutura química de hidroxi-cavernamina-H.

[025] Figura 11: Da esquerda para a direita: Leite desnatado 0,1% como controle, leite desnatado 0,1% com 28 ppm de cavernamina-L, leite desnatado 0,1% com 140 ppm de cavernamina-L e leite desnatado 0,1% com 280 ppm de cavernamina-L.

[026] Figura 12: Esquerda: Controle de Skyr, Direita: Skyr com 46 ppm de cavernamina-L.

[027] Figura 13: Da esquerda para direita: Controle de epóxi, epóxi com 30 ppm de cavernamina-L e epóxi com 600 ppm de cavernamina-L.

[028] Figura 14: Esquerda: Controle de goma, Direita: Goma com 180 ppm de cavernamina-L. Abreviações e termos:

[029] Cavernamina: é um pigmento tendo fórmula química C20H20O4N-R (ver fórmula I e II na Figura 1). Na cavernamina mais simples, R é hidrogênio. Em outros derivados da cavernamina, N-R é um composto contendo uma amina primária, tal como um aminoácido, um peptídeo, um amino açúcar.

[030] Derivado de aminoácido de cavernamina: é uma cavernamina de fórmula química C20H20O4N-R, onde N-R é um aminoácido.

[031] Derivado de hidroxila de cavernamina: é usado alternadamente com hidroxi-cavernamina; e tem a fórmula química C21H21O4N-R, onde o carbono 2 tem um grupo hidroxila, e onde N-R é um aminoácido (ver fórmula III na figura 1).

[032] Cavernina: é um pigmento tendo a fórmula química C20H20O5 (ver as fórmulas IV e V na Figura 1); e é um precursor da cavernamina.

[033] Meio de crescimento essencialmente desprovido de nitrogênio inorgânico disponível: é um meio de crescimento que limita o crescimento exponencial e causa o crescimento microbiano (fúngico) entre uma fase de latência ou morte celular, devido à falta de nitrogênio disponível. A fonte de nitrogênio é depletada e nenhum nitrogênio disponível é deixado quando o meio de crescimento contém menos de 5 mM da fonte de nitrogênio (por exemplo,  5mM KNO3, NaNO3, (NH4)SO4ou NH4NO3). Descrição detalhada da invenção

[034] A presente invenção provê novos pigmentos de azafilona: cavernaminas e derivados de carvernamina, bem como seu precursor: cavernina. Esses pigmentos vermelhos e laranja/amarelo têm uso potencial como, por exemplo, corante alimentício. Adicionalmente, é provido um método para a produção de espécies individuais de pigmentos de azafilona por fermentação, usando cepas de fungos pertencentes às espécies Aspergillus cavernicola. Cepas de Aspergillus cavernicola foram inicialmente selecionados como um organismo potencial de produção, em comum com espécies de Monascus, eles apresentaram a excreção de uma cor vermelha brilhante quando cultivados em meio sólido.

[035] De acordo com um primeiro aspecto, a invenção provê um novo pigmento de cavernamina.

[036] Em uma modalidade, a invenção provê um novo pigmento de cavernamina tendo a fórmula I ou fórmula II: Fórmula I Fórmula II em que R é hidrogênio, ou N-R é selecionado a partir de um aminoácido, um peptídeo, um amino açúcar (por exemplo, glucosamina ou galactosamina) e uma amina primária (por exemplo, ácido antranílico, anilina, etanolamina ou p- fenilenodiamina).

[037] Em uma modalidade adicional, o pigmento de cavernamina tem a fórmula I ou II, em que R é hidrogênio.

[038] Em uma modalidade preferencial, o pigmento de cavernamina tem a fórmula I, em que N-R é um aminoácido. A título de exemplo, o pigmento de cavernamina tem a fórmula I, em que N-R é um aminoácido selecionado a partir do grupo consistindo em: L-alanina, L-arginina, L-asparagina, L-aspartato, L- cisteína, L-glutamina, L-glutamato, L-glicina, L-histidina, L-isoleucina, L-leucina, L-lisina, L-metionina, L-fenilalanina, L-prolina, L-serina, L-treonina, L-triptofano, L-tirosina, L-valina e L-ornitina.

[039] A nova cavernamina tendo a fórmula I ou II, como definido acima, é um pigmento de azafilona vermelho produzido naturalmente por Aspergillus cavernicola.

[040] Uma propriedade importante da nova cavernamina tendo a fórmula I ou II é a sua inesperada solubilidade aumentada em fase aquosa quando comparada aos pigmentos de Monascus conhecidos (ver Exemplo 4). Isso pode ser principalmente devido ao comprimento da cadeia mais curta da estrutura de “cauda” da cadeia principal na cavernamina.

[041] De acordo com um segundo aspecto, a invenção provê um novo pigmento de hidroxi-cavernamina.

[042] Em uma modalidade, a invenção provê um novo pigmento de hidroxi- cavernamina tendo a fórmula III:

Fórmula III em que R é hidrogênio, ou N-R é selecionado a partir de um aminoácido, um peptídeo, um amino açúcar (por exemplo, glucosamina ou galactosamina) e uma amina primária (por exemplo, ácido antranílico, anilina, etanolamina ou p- fenilenodiamina).

[043] Em uma modalidade, o pigmento de hidroxi-cavernamina tem a fórmula III, em que R é hidrogênio.

[044] Em uma modalidade preferencial, o pigmento de hidroxi- cavernamina tem a fórmula III, em que N-R é um aminoácido. A título de exemplo, o pigmento de hidroxi-cavernamina tem a fórmula III, em que N-R é um aminoácido selecionado a partir do consistido em: L-alanina, L-arginina, L- asparagina, L-aspartato, L-cisteína, L-glutamina, L-glutamato, L-glicina, L- histidina, L-isoleucina, L-leucina, L-lisina, L-metionina, L-fenilalanina, L-prolina, L- serina, L-treonina, L-triptofano, L-tirosina, L-valina e L-ornitina.

[045] A nova hidroxi-cavernamina tendo a fórmula III, como definido acima, é um pigmento de azafilona vermelho produzido naturalmente por Aspergillus cavernicola.

[046] A hidroxi-cavernamina é um derivado de hidroxila do pigmento de carvernamina da presente invenção descrito acima no primeiro aspecto. Portanto, a estrutura do núcleo é a mesma (ver Figura 1, onde apenas o arranjo do carbono 1-3 difere, enquanto a estrutura do núcleo do carbono 4-18 é idêntica) e que confere as propriedades técnicas aprimoradas observadas.

[047] Uma propriedade importante da nova hidroxi-cavernamina tendo a fórmula III é a sua solubilidade aumentada em fase aquosa quando comparada aos pigmentos de Monascus conhecidos (ver Exemplo 4). Isso é principalmente devido ao comprimento da cadeia mais curta da estrutura de “cauda” da cadeia principal na hidroxi-cavernamina, bem como no grupo hidroxila em C2.

[048] De acordo com um terceiro aspecto, a invenção provê um novo pigmento de cavernina.

[049] Em uma modalidade, a invenção provê um novo pigmento de cavernina tendo a fórmula IV ou fórmula V: Fórmula IV Fórmula V

[050] A nova cavernina tendo a fórmula IV ou V, como definido acima, é um pigmento de azafilona amarelo produzido naturalmente por Aspergillus cavernicola.

[051] A cavernina é um precursor dos pigmentos de carvernamina da presente invenção descritos acima no primeiro e segundo aspectos. Comparada a carvernamina, a cavernina tem um átomo de oxigênio em vez do grupo N-R. Portanto, a estrutura central é a mesma (ver Figura 1), o que confere as propriedades técnicas aprimoradas observadas.

[052] Uma propriedade importante da nova cavernina tendo a fórmula IV ou V é a sua solubilidade em água aumentada quando comparada aos pigmentos de Monascus conhecidos (ver Exemplo 4). Isso é principalmente devido ao comprimento da cadeia mais curta da estrutura de “cauda” da cadeia principal na cavernamina.

[053] Métodos para extrair e detectar uma cavernamina de fórmula I ou II, uma hidroxi-cavernamina de fórmula III ou uma carvenina de fórmula IV ou V, de acordo com um primeiro, segundo e terceiro aspectos da invenção, são ilustrados nos Exemplos 1.4, 1.5 e 1.6. A estrutura química de uma cavernamina de fórmula I ou II, uma hidroxi-cavernamina de fórmula III ou uma carvenina de fórmula IV ou V, de acordo com um primeiro, segundo e terceiro aspecto da invenção, pode ser determinada por meio de Cromatografia Líquida de Ultra-alta Performance acoplada à Detecção de Matriz de Diodo e Espectrometria de Massa de Alta Resolução e espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear (NMR), como descrito nos exemplos 1.5 e 3.1.

[054] Uma cavernamina de fórmula I ou II, uma hidroxi-cavernamina de fórmula III e/ou uma carvenina de fórmula IV ou V, de acordo com um primeiro, segundo e terceiro aspectos da invenção, podem ser usadas como um agente corante em um produto alimentício, um produto não alimentício e um cosmético (tal como descrito no Exemplo 5). O produto alimentício pode ser selecionado a partir dos seguintes alimentos: produtos assados, mistura para assar, bebida e base de bebida, cereais para café da manhã, queijo, condimentos e tempero, confeito e cobertura, gordura e óleo, sobremesa láctea congelada e mistura, gelatina, pudim e recheio, molho e caldo, produto lácteo, produto à base de proteína vegetal, fruta processada e suco de fruta e aperitivos.

[055] O produto não alimentício pode ser selecionado a partir dos seguintes não alimentícios: têxteis, algodão, lã, seda, couro, papel, tinta, polímero, plástico e tintas.

[056] O produto cosmético pode estar na forma de um pó livre, despejado ou compacto, um produto oleoso de anidro fluido, um óleo para o corpo e/ou o rosto, uma loção para o corpo e/ou o rosto, ou um produto para o cabelo.

[057] A invenção provê adicionalmente um kit de partes para colorir uma composição, em que o kit compreende pelo menos (i) um pigmento de cavernamina tendo a fórmula I ou II, pelo menos uma hidroxi-cavernamina de fórmula III e/ou pelo menos uma carvenina de fórmula IV ou V de acordo com a invenção e (ii) um agente estabilizante, em que a composição é selecionada a partir de um alimento, um produto não alimentício e um cosmético. O agente estabilizante pode ser goma arábica ou estabilizador da indústria alimentícia similar. Os kits de partes podem compreender adicionalmente maltodextrina ou outros aditivos alimentícios com propriedades semelhantes à maltodextrina. Um exemplo de tal composição é provido no Exemplo 6. O pigmento é preferencialmente fornecido em um recipiente (opcionalmente combinado com um agente dispersante, por exemplo, colóide ou agente espessante).

[058] De acordo com um quarto aspecto, a invenção provê um método para produzir pigmentos de cavernamina e/ou seus derivados de hidroxila.

[059] De acordo com uma modalidade, a invenção provê um método (1 etapa) para produzir pigmento de cavernamina e/ou derivado de hidroxila do referido pigmento de cavernamina por fermentação compreendendo as etapas de: a) fornecer esporos ou micélios de uma cepa de Aspergillus cavernicola, b) cultivar os referidos esporos ou micélios em um meio de crescimento líquido compreendendo uma fonte de nitrogênio, c) recuperar o pigmento de cavernamina e/ou derivado de hidroxila do referido pigmento de cavernamina produzido durante o cultivo na etapa (b), e d) opcionalmente, isolar um ou mais dos referidos pigmentos de cavernamina e/ou derivado de hidroxila do referido pigmento de cavernamina, em que o referido pigmento de cavernamina tem a estrutura de Fórmula I ou II Fórmula I Fórmula II e em que o referido derivado de hidroxila do referido pigmento de cavernamina tem a estrutura de fórmula III: Fórmula III

[060] Em uma modalidade, a fonte de nitrogênio do meio de crescimento líquido é selecionada a partir de uma fonte complexa, tal como extrato de levedura ou licor de maceração de milho. Em outra modalidade, a fonte de nitrogênio pode ser ureia. Em ainda outra modalidade, a fonte de nitrogênio é selecionada a partir de uma fonte de nitrogênio inorgânico, como KNO3, NaNO3, (NH4)2SO4 ou NH4NO3.

[061] Em uma modalidade preferencial, a fonte de nitrogênio no meio de crescimento líquido na etapa (b) consiste apenas em um composto selecionado a partir do grupo consistindo em um aminoácido, um peptídeo, um amino açúcar e qualquer outra amina primária.

[062] Uma única fonte de nitrogênio adequada inclui um amino açúcar, tal como glucosamina ou galactosamina; e inclui uma amina primária, tal como ácido antranílico, anilina, etanolamina ou p-fenilenodiamina.

[063] Ainda mais preferencialmente, a única fonte de nitrogênio é um único aminoácido, selecionado a partir de um do grupo consistindo em: L-alanina, L- arginina, L-asparagina, L-aspartato, L-cisteína, L-glutamina, L-glutamato, L- glicina, L-histidina, L-isoleucina, L-leucina, L-lisina, L-metionina, L-fenilalanina, L- prolina, L-serina, L-treonina, L-triptofano, L-tirosina, L-valina e L-ornitina.

[064] O meio de crescimento líquido, compreendendo uma fonte de nitrogênio, é preferencialmente um meio sintético compreendendo sais, metais vestigiais e uma fonte de carbono. Uma fonte adequada de carbono inclui glicose, sacarose, maltose, amido solúvel, beterraba ou melaço de cana, malte e qualquer combinação de pelo menos dois dos mesmos.

[065] O meio de crescimento preferencialmente compreende adicionalmente ou consiste nos seguintes sais e metais vestigiais: KH 2PO4 (por exemplo 1 g/L), NaCl (por exemplo 1 g/L), MgSO4.7H2O (por exemplo 2 g/L), KCl (por exemplo 0,5 g/L), CaCl2.H2O (por exemplo 0,1 g/L) e uma solução de metais vestigiais (por exemplo 2 mL/L). A solução de metais vestigiais pode compreender, ou consistir em: CuSO4.5 H2O (por exemplo 0,4 g/L), Na2B4O7.10 H2O (por exemplo 0,04 g/L), FeSO4.7 H2O (por exemplo 0,8 g/L), MnSO4.H2O (por exemplo 0,8 g/L), Na2MoO4.2 H2O (por exemplo 0,8 g/L), ZnSO4.7 H2O (por exemplo 8 g/L).

[066] A concentração do composto fornecendo a fonte de nitrogênio no meio de crescimento pode ser de 0,01 M a 1 M, por exemplo, pelo menos 0,01, 0,025, 0,05, 0,075, 0,10, 0,125, 0,15, 0,175, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7 e 0,8 M.

[067] O pH do meio de crescimento provido e mantido durante a etapa (b) é preferencial entre 3 e 8, mais preferencialmente entre 4,0 e 6,5, ainda mais preferencialmente entre 4,0 e 6,0; onde o pH pode ser ajustado pela adição de NaOH ou HCl aquoso.

[068] O cultivo na etapa (b) pode ser realizado suspendendo esporos ou micélios de Aspergillus cavernicola no meio de crescimento líquido.

[069] Os esporos na etapa (a) podem compreender uma suspensão aquosa de esporos de Aspergillus cavernicola.

[070] Em uma modalidade, o pigmento de cavernamina e/ou seu derivado de hidroxila produzido de acordo com o método de 1 etapa da invenção tem a estrutura de Fórmula I ou III, em que N-R é selecionado a partir de um aminoácido, um peptídeo, um amino açúcar e uma amina primária.

[071] De acordo com uma segunda modalidade, a invenção provê um método (2 etapas) para produzir um pigmento de cavernamina de Fórmula I e/ou uma cavernamina de hidroxila de Fórmula III usando uma modificação do procedimento de fermentação de 1 etapa descrito acima. De acordo com esta modificação, uma etapa adicional (a’) é realizada após a etapa (a). Na etapa (a’), os esporos ou micélios providos na etapa (a) são cultivados em um meio de crescimento líquido preliminar, em que a única fonte de nitrogênio é ureia ou uma fonte de nitrogênio inorgânico. A fonte de nitrogênio inorgânico pode ser selecionada a partir do grupo consistindo em: KNO3, NaNO3, (NH4)2SO4e NH4NO3.

[072] Preferencialmente, a concentração da fonte de nitrogênio no meio de crescimento preliminar é menos que 50 mM, tal como não é maior que 45, 40, 35, 30, 25, 20, 17,5, 15, 12,5 ou 10 mM

[073] O meio de crescimento líquido preliminar na etapa (a’), compreendendo o nitrogênio inorgânico como única fonte de nitrogênio, é um meio sintético compreendendo sais, metais vestigiais e uma fonte de carbono. Uma fonte adequada de carbono inclui glicose, sacarose, maltose, amido solúvel, beterraba ou melaço de cana, malte e qualquer combinação de pelo menos dois dos mesmos. A composição deste meio sintético em relação a sais e metais vestigiais preferencialmente compreende ou consiste em: KH2PO4 (por exemplo

1 g/L), NaCl (por exemplo 1 g/L), MgSO4.7H2O (por exemplo 2 g/L), KCl (por exemplo 0,5 g/L), CaCl2.H2O (por exemplo 0,1 g/L) e uma solução de metais vestigiais (por exemplo 2 mL/L). A solução de metais vestigiais pode compreender ou consiste em: CuSO4.5 H2O (por exemplo 0,4 g/L), Na2B4O7 .10 H2O (por exemplo 0,04 g/L), FeSO4.7 H2O (por exemplo 0,8 g/L), MnSO4.H2O (por exemplo 0,8 g/L), Na2MoO4.2 H2O (por exemplo 0,8 g/L), ZnSO4.7 H2O (por exemplo 8 g/L).

[074] De acordo com o método de fermentação em 2 etapas, o cultivo do Aspergillus a cultura produzida na etapa (a’) é então continuada com uma etapa de cultivo adicional (b) em um meio de crescimento líquido. O meio de crescimento líquido na etapa (b) é preferencialmente um meio sintético tendo a mesma composição em relação a sais e metais vestigiais como o meio de crescimento líquido preliminar. No entanto, o meio de crescimento líquido na etapa (b) compreende além disso, uma fonte de nitrogênio orgânico. Fontes de nitrogênio orgânico adequadas são selecionadas a partir do grupo consistindo em um aminoácido, um peptídeo, um amino açúcar e qualquer outra amina primária; e correspondem a fontes adequadas usadas no meio de crescimento líquido no procedimento de fermentação de 1 etapa. O composto de nitrogênio orgânico é preferencialmente selecionado a partir de um dentre um aminoácido, um peptídeo, um amino açúcar e uma amina primária como uma única fonte de nitrogênio orgânico.

[075] Embora uma fonte de nitrogênio inorgânico seja um componente do meio de crescimento líquido preliminar na etapa (a’); nenhuma fonte adicional de nitrogênio inorgânico é incluída no meio de crescimento líquido na etapa (b), mas em vez disso, o nitrogênio inorgânico é substituído com as fontes dadas de nitrogênio orgânico.

[076] A fermentação em 2 etapas, de acordo com a segunda modalidade,

pode ser realizada cultivando os esporos ou micélios no meio de crescimento líquido preliminar na etapa (a’) e, em seguida, adicionando na etapa (b) a única fonte de nitrogênio orgânico à cultura produzida pela etapa (a’). O teor de nitrogênio inorgânico do meio de crescimento líquido preliminar é depletada durante o cultivo dos esporos de fungos esporos ou micélios na etapa (a’), de modo que o meio de crescimento é essencialmente desprovido de nitrogênio inorgânico disponível no final da etapa (a’). O teor de nitrogênio inorgânico do meio de crescimento líquido preliminar pode ser ajustado para garantir a depleção completa no final da etapa (a’); por exemplo, ao fornecer não mais que 50 mM, 45 mM, 40 mM, 35 mM, 30 mM, 25 mM, 20 mM, 17,5 mM, 15 mM, 12,5 mM, 10 mM de NO3- ou NH4+. Uma vez que o nível de nitrogênio inorgânico presente no meio de crescimento líquido preliminar é depletada para uma quantidade menor que 5 mM, 4 mM, 3 mM, 2 mM, 1 mM, 0,5 mM de NO 3- ou NH4, então não é mais capaz de suportar o crescimento da cultura de Aspergillus.

[077] Alternativamente, o meio de crescimento líquido preliminar na etapa (a’) é substituído pelo meio de crescimento líquido compreendendo o composto de nitrogênio orgânico identificado acima como única fonte de nitrogênio, no início da etapa de cultivo (b) adicional.

[078] O pH do meio de crescimento preliminar provido na etapa (a’) pode ser o mesmo ou diferente do pH do meio de crescimento na etapa (b).

[079] O pH do meio de crescimento preliminar provido e mantido durante a etapa (a’) é preferencial entre 3 e 8, tal como entre 3 e 5, tal como entre 4 e 7, mais preferencialmente entre 4,0 e 6,5, ainda mais preferencialmente entre 4,0 e 6,0; onde o pH pode ser ajustado pela adição de NaOH ou HCl aquoso.

[080] O pH do meio de crescimento provido e mantido durante a etapa (b) é preferencial entre 3 e 8, mais preferencialmente entre 4,0 e 6,5, ainda mais preferencialmente entre 4,0 e 6,0; onde o pH pode ser ajustado pela adição de

NaOH ou HCl aquoso.

[081] O pigmento de cavernamina e/ou seu derivado produzido de acordo com o método de 2 etapas da invenção tem a estrutura de Fórmula I ou III, em que N-R é selecionado a partir de um aminoácido, um peptídeo, um amino açúcar e uma amina primária.

[082] As condições de cultivo durante a fermentação de 1 e 2 etapas suportam o metabolismo aeróbio na cultura de Aspergillus. O metabolismo aeróbico depende de uma aeração suficiente, que pode ser obtida agitando a cultura líquida ou fornecendo uma fonte de ar (por exemplo, oxigênio).

[083] O procedimento de fermentação de 1 e 2 etapas pode ser realizado em um biorreator. O meio de crescimento líquido (descrito acima) usado em ambos os procedimentos de fermentação de 1 e 2 etapas pode ser fornecido ao biorreator para facilitar a cultura em batelada, batelada alimentada ou cultura contínua da cultura de fungos.

[084] A duração das etapas de cultivo (a’) e (b) no procedimento de fermentação de 2 etapas são selecionadas para otimizar o crescimento da cultura de Aspergillus (como medido pela biomassa) e o rendimento de pigmento produzido pela cultura de Aspergillus. A etapa de cultivo (a’) é preferencialmente pelo menos 28 h; por exemplo, entre 30 h e 40 h. A etapa de cultivo (a’) pode ter cerca de 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, e 72 h de duração. A duração da etapa de cultivo (b), que segue a etapa (a’), é preferencialmente pelo menos 48 h, pelo menos 72 h, pelo menos 96 h, ou mesmo pelo menos 120 h. A etapa de cultivo (b) pode ser, por exemplo, entre 48 h e 168 h. A etapa de cultivo (b) pode ter cerca de 48, 54, 60, 66, 72, 78, 84, 90, 96, 104, 110, 116, 120, 144 ou mesmo 168 h de duração.

[085] Os pigmentos de cavernamina e hidroxi-carvernamina produzidos pelo cultivo de Aspergillus cavernicola é extracelular e pode, desse modo, ser recuperado do meio líquido.

[086] Surpreendentemente, o pigmento vermelho produzido pelo método de 2 etapas da invenção é essencialmente uma única espécie de pigmento de cavernamina e hidroxi-carvernamina e não uma mistura de pigmentos (ver Exemplo 1). Quando baixas quantidades de fonte de nitrogênio inorgânico são fornecidas durante a etapa (a’) do procedimento de fermentação em 2 etapas, isso promove seletivamente a síntese de baixas quantidades de formas cis e trans do pigmento de cavernina amarelo/laranja de Fórmula IV e V, respectivamente, durante a etapa (a’). Na etapa subsequente (b), o grupo amino presente na fonte de nitrogênio orgânico é incorporado nas estruturas isoméricas do núcleo de cavernina (cis- e trans) para formar o derivado de cavernamina cis específico de Fórmula I em forma essencialmente pura. Assim, a única espécie de pigmento de cavernamina produzida pelo método pode ser extraída e recuperada sem a necessidade de múltiplas e possivelmente complexas etapas de purificação. Além disso, os produtos da fermentação usando o método são livres de qualquer micotoxina (ver Exemplo 2) e, desse modo, são seguros para uso humano.

[087] De acordo com um quinto aspecto, a invenção provê um método para produzir pigmentos de cavernina.

[088] De acordo com uma modalidade, a invenção provê um método para produzir um pigmento de cavernina por fermentação compreendendo as etapas de: a) fornecer esporos ou micélios de uma cepa de Aspergillus cavernicola, b) cultivar os referidos esporos ou micélios em um meio de crescimento líquido, c) recuperar o pigmento de cavernina produzido durante o cultivo na etapa (b), e d) opcionalmente, isolar o referido pigmento de cavernina, em que o referido pigmento de cavernina tem a estrutura de Fórmula IV ou V: Fórmula IV Fórmula V

[089] Para a produção de cavernina, os esporos ou micélios providos na etapa (a) estão na etapa (b) cultivados em um meio de crescimento líquido, em que a fonte de nitrogênio pode ser ureia ou uma fonte de nitrogênio complexa, tal como extrato de levedura ou licor de maceração de milho, ou a fonte de nitrogênio pode ser uma fonte de nitrogênio inorgânico, tal como selecionado a partir do grupo consistindo em: KNO3, NaNO3, (NH4)2SO4 e NH4NO3.

[090] Preferencialmente, a concentração da fonte de nitrogênio no meio de crescimento para a produção de cavernina é menor que 50 mM, tal como não mais que 45, 40, 35, 30, 25, 20, 17,5, 15, 12,5 ou 10 mM.

[091] O meio de crescimento líquido pode ser um meio sintético compreendendo sais, metais vestigiais e uma fonte de carbono. Uma fonte adequada de carbono inclui glicose, sacarose, maltose, amido solúvel, melaços de beterraba ou cana, malte e qualquer combinação de pelo menos dois dos mesmos. A composição deste meio sintético em relação a sais e metais vestigiais compreende ou consiste em: KH2PO4 (por exemplo 1 g/L), NaCl (por exemplo 1 g/L), MgSO4.7H2O (por exemplo 2 g/L), KCl (por exemplo 0,5 g/L), CaCl2.H2O (por exemplo 0,1 g/L) e uma solução de metais vestigiais (por exemplo 2 mL/L). A solução de metais vestigiais pode compreender ou consiste em: CuSO 4.5 H2O (por exemplo 0,4 g/L), Na2B4O7.10 H2O (por exemplo 0,04 g/L), FeSO4.7 H2O (por exemplo 0,8 g/L), MnSO4.H2O (por exemplo 0,8 g/L), Na2MoO4.2 H2O (por exemplo 0,8 g/L), ZnSO4.7 H2O (por exemplo 8 g/L).

[092] A fermentação para produção de cavernina, de acordo com a quinta modalidade, pode ser realizada em um biorreator, tal como executado em uma batelada, batelada alimentada ou modo contínuo. O teor de nitrogênio do meio de crescimento líquido na etapa (b) pode ser depletado durante a fermentação tal que o meio de crescimento é essencialmente desprovido de nitrogênio disponível no final da etapa (b); ou um fornecimento de fonte de nitrogênio (possivelmente misturado com outros componentes/nutrientes do meio) pode ser fornecido durante a etapa (b) para prover uma concentração mínima de nitrogênio para sustentar as células. O teor de nitrogênio do meio de crescimento líquido na etapa (b) pode ser ajustado inicialmente, ao longo ou em certos intervalos para ser 50 mM, 45 mM, 40 mM, 35 mM, 30 mM, 25 mM, 20 mM, 17,5 mM, 15 mM, 12,5 mM ou 10 mM de fonte de nitrogênio, tal como 50 mM, 45 mM, 40 mM, 35 mM, 30 mM, 25 mM, 20 mM, 17,5 mM, 15 mM, 12,5 mM ou NO 10 mM3- ou NH4+.

[093] O tempo de cultivo na etapa (b) deve ser preferencialmente ajustado para evitar o potencial início da produção de cavernamina. Tal ajuste pode envolver o término do cultivo após 16 h, 20 h, 24 h, 28 h ou 32 h; por exemplo, entre 20 h e 46 h. A etapa de cultivo (b) pode ter cerca de 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52 e 54 h de duração.

[094] O pH do meio de crescimento provido e mantido durante a etapa (b) é preferencial entre 3 e 8, tal como entre 3 e 5, tal como entre 4 e 7, mais preferencialmente entre 4,0 e 6,5, ainda mais preferencialmente entre 4,0 e 6,0; onde o pH pode ser ajustado pela adição de NaOH ou HCl aquoso.

[095] Os pigmentos de cavernina produzidos pelo cultivo de Aspergillus cavernicola são extracelulares e podem, desse modo, ser recuperados a partir do meio líquido.

EXEMPLOS Exemplo 1. Produção de cavernaminas por fermentação

[096] 1.1 Manutenção de cepas e produção de esporos: As cepas de fungos, Aspergillus cavernicola IBT 32660 e IBT 23158 (coleção de cepas da IBT Technical University of Denmark), foram usados para produção de caverninas e cavernaminas. Esporos de A. cavernicola foram propagados em placas em ágar CYA (ágar de extrato de levedura Czapek Dox fornecido por Sigma-Aldrich) e incubados a 25 °C por 7 dias. Os esporos foram colhidos com solução de cloreto de sódio (NaCl) a 0,9% e Tween 20 a 0,01%; a suspensão foi filtrada através de mira-cloth para separar os esporos dos micélios. A solução de esporos foi centrifugada por 10 min a 10.000 rpm a 4 °C. O sobrenadante foi removido e o pellet de esporos foi ressuspenso em solução de NaCl a 0,9%. A concentração de esporos foi determinada usando uma câmara de contagem Burker-Turk. Todos os cultivos foram inoculados em um meio especificado para dar uma concentração inicial de esporos de 106 esporos/mL.

1.2 Amostragem

[097] Amostras para peso seco (DW), HPLC, absorbância e análise LC-MS foram retiradas no final do cultivo em frasco de agitação ou regularmente ao longo dos cultivos em biorreatores. As amostras destinadas a HPLC, absorbância e LC-MS foram filtradas através de um filtro estéril com tamanho de poro de 0,45 μm a fim de separar a biomassa do filtrado.

1.3 Análise de peso seco: Análise de biomassa de A. cavernicola obtida por fermentação

[098] O peso seco (DW) foi avaliado em filtros que foram pré-secos em um micro-ondas por 20 min, mantidos em dessecador por no mínimo 10 min e pesados. Para análise de DW, os filtros foram colocados em uma bomba de filtração a vácuo e foi adicionado 10 ml de caldo de cultura. Posteriormente, os filtros com a biomassa foram secos em um micro-ondas por 20 min e mantidos em um dessecador por um mínimo de 10 min antes de serem repesados. O peso da biomassa foi determinado como a diferença do peso do filtro antes e depois da aplicação da amostra.

1.4 Extração e purificação

[099] Os pigmentos foram extraídos do cultivo submerso de A. cavernicola separando primeiro a biomassa e o meio por filtração. Em seguida, o meio foi extraído usando acetato de etila e a fase de acetato de etila foi seca. O extrato seco foi fracionado em um sistema flash Isolera One (Biotage) equipado com uma coluna de diol, usando n-heptano, n-heptano:diclorometano (1:1), diclorometano, diclorometano:acetato de etila (1:1), acetato de etila, acetato de etila:metanol (1:1) e metanol. As frações contendo os pigmentos foram adicionalmente submetidas a HPLC semi-preparativa em um controlador Waters 600 conectado a um detector Waters 966 PDA. A coluna usada foi uma Phenomenex Luna II C18, e os compostos foram eluídos usando um gradiente de água MQ e acetonitrila com 50 ppm de ácido trifluoroacético.

1.5 Cromatografia Líquida de Ultra-alta Performance- Espectrometria de Massa de Alta Resolução (UHPLC-HRMS)

[100] O UHPLC-HRMS foi realizado em um sistema Agilent Infinity 1290 UHPLC (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EUA) equipado com um detector de matriz de diodos. A separação foi obtida em uma coluna Agilent Poroshell 120 fenil-hexil (2,1 × 250 mm, 2,7 μm) com um gradiente linear consistindo em água (A) e acetonitrila (B), ambos tamponados com ácido fórmico 20 mM, começando em 10% B e aumentando para 100% em 15 min, onde foi mantido por 2 min,

voltou a 10% em 0,1 min e permaneceu por 3 min (0,35 mL/min, 60 °C). Foi usada um volume de injeção de 1 μL. A detecção UV-VIS foi feita em um detector Agilent 1290 DAD com uma célula de fluxo de 60 mm. A detecção de MS foi realizada no modo de detecção positiva em um Agilent 6545 QTOF MS equipado com fonte de íons de eletropulverização Agilent Dual Jet Stream com uma temperatura de gás de secagem de 250 °C, fluxo de gás de 8 L/min, temperatura de gás de revestimento de 300 °C e fluxo de 12 L/min. A tensão capilar foi definida para 4000 V e a tensão do bocal para 500 V. Os espectros de massa foram registrados a 10, 20 e 40 eV como dados de centróide para m/z 85-1700 no modo MS e m/z 30–1700 no modo MS/MS, com uma taxa de aquisição de 10 espectros/s. Solução de massa de bloqueio em 70:30 de metanol:água foi infundida no segundo pulverizador usando uma bomba LC extra a um fluxo de 15 μL/min usando um divisor de 1:100. A solução continha 1 μM de tributilamina (Sigma-Aldrich) e 10 μM de Hexakis (2,2,3,3-tetrafluoropropóxi)fosfazeno (Apollo Scientific Ltd., Cheshire, Reino Unido) como massas de bloqueio. Os íons [M + H]+ (m/z 186,2216 e 922,0098 respectivamente) de ambos os compostos foram usados.

1.6 Análise de absorvância: Análise quantitativa de carvernaminas produzidas por fermentação

[101] Análise quantitativa de pigmentos foi realizada por medições de absorbância. Os valores de absorvância das soluções de pigmento individuais foram determinados usando um espectrofotômero Synergy 2 (BioTek, Alemanha) e uma placa de microtitulação de 96 poços. 150 µL de caldo de amostra de cada solução de pigmento de aminoácido foram escaneados na faixa de 200-700 nm e os valores máximos de absorbância foram determinados. A absorvância a 500 nm indicou a presença de pigmentos vermelhos. Uma curva padrão de um pigmento laranja e vermelho foi usada para calcular a concentração no meio. Para os aminoácidos, onde nenhuma curva padrão estava disponível, a absorbância é dada em AU/150µL.

1.7 Triagem inicial: procedimento de fermentação em uma etapa para produção de cavernaminas

[102] A triagem inicial das duas cepas foi conduzida (i) em placas de Agar de Extrato de Levedura Czapek (CYA), bem como (ii) em caldo Czapek Dox líquido.

[103] (i) Os esporos de A. cavernicola foram propagados em placas CYA incubadas a 25 °C durante 7 dias. As extrações dos tampões foram realizadas retirando 3-5 tampões de 6 mm de diâmetro através de uma colônia. Os tampões foram transferidos para tubos Eppendorf e extraídos com 800 μL de uma mistura 3:1 de acetato de etila e isopropanol, com 1% (v/v) de ácido fórmico (AF), por uma hora com sonicação. Após sonicação, o líquido de extração foi decantado para novos tubos Eppendorf e o solvente foi evaporado sob uma vazão suave de gás nitrogênio a 30 °C. Os extratos secos foram redissolvidos em 400 μL de metanol (MeOH) com sonicação e centrifugados por 3 min a 13500 rpm para evitar quaisquer esporos ou outras partículas na amostra. O perfil cromatográfico dos compostos extracelulares secretados por A. cavernicola foi preparado como descrito no exemplo 1.5.

[104] (ii) Os esporos de A. cavernicola foram inoculados em caldo Czapek Dox (pH 6) e cultivados por 7 dias. O caldo Czapek Dox consistiu em sacarose (30 g/L), NaNO3 (3 g/L), MgSO4∙7 H2O (0,5 g/L), KCl (0,5 g/L), K2HPO4 (1 g/L), FeSO4 (0,01 g/L)) e 1 ml/L de solução de metal vestigial. A solução de metal vestigial consistiu em CuSO4∙5 H2O (0,5 g/L) e ZnSO4∙7 H2O (1 g/L). O cultivo foi feito em frascos de agitação não defletores a 25 oC e 150 RPM (agitador orbital Forma, Thermo FIsher Scientific, US) com um volume de amostra de 100 ml. Os experimentos em frasco de agitação foram feitos em duplicata. As amostras foram retiradas após 7 dias. O perfil cromatográfico dos compostos extracelulares secretados por A. cavernicola foram preparados como descrito no exemplo 1.5.

[105] Foi visualmente observado que ambas as placas bem como o meio de cultura líquida tornaram-se vermelhos durante o cultivo de A. cavernicola. O perfil cromatográfico de compostos extracelulares secretados por A. cavernicola são vistos na Figura 2, mostrando uma ampla faixa de pigmentos produzidos. Os perfis metabólicos das placas CYA e do caldo Czapek Dox têm picos similares. Foi assim demonstrado que eles podem ser igualmente usados para testes subsequentes de produção de cavernamina por A. cavernicola.

1.8 Triagem inicial: procedimento de fermentação em duas etapas para produção de cavernaminas

[106] Os esporos de A. cavernicola foram inoculados em caldo Czapek Dox (pH 6) consistindo em sacarose (30 g/L), NaNO3 (3 g/L), MgSO4∙7 H2O (0,5 g/L), KCl (0,5 g/L), K2HPO4 (1 g/L), FeSO4 (0,01 g/L)) e 1 ml/L de solução de metal vestigial. A solução de metal vestigial consistiu em CuSO4∙5 H2O (0,5 g/L) e ZnSO4∙7 H2O (1 g/L). Fonte de nitrogênio adicional na forma de aminoácidos (por exemplo, L-leu, L-his, L-val, L-arg ou L-trp) foi adicionada em uma concentração de 2 mM após 5 dias de cultivo. Os cultivos foram feitos em frascos de agitação defletores aos 25 °C e 150 RPM (agitador orbital Forma, Thermo Fisher Scientific, US) com um volume de amostra de 100 ml. Os experimentos em frasco de agitação foram feitos em duplicata. O caldo Czapek Dox sem adição de aminoácidos foi usado como controle/referência (Exemplo 1.7 (ii)). As amostras foram retiradas após 7 dias. O perfil cromatográfico dos compostos extracelulares secretados por A. cavernicola foi preparado como descrito no exemplo 1.5.

[107] O perfil cromatográfico das culturas induzidas por aminoácidos mostrou um perfil significativamente mais simples (Figura 3) comparada às amostras não induzidas (Figura 2). Os derivados de aminoácidos da cavernamina apresentaram os principais constituintes do caldo das amostras induzidas por aminoácidos.

[108] Os espectros de absorbância de cavernina e cavernamina (cavermanina-L exemplar) são apresentados na Figura 4.

1.9 Triagem de pH para produção de cavernamina

[109] Aspergillus cavernicola IBT 32660 foi cultivado em caldo Czapek dox líquido (35 g/L) suplementado com extrato de levedura (5 g/L) e 1 ml/L de solução de metal vestigial consistindo em CuSO4∙5 H2O (0,5 g/L) e ZnSO∙7 H2O (1 g/L). O pH foi ajustado por KOH ou H2SO4 para pH 3, 5 e 8. Os cultivos foram executados por 168 horas em frascos de agitação, com um volume de amostra de 50 ml a 25 °C, 150 rpm. A produção de pigmento foi avaliada no final do cultivo por análise de absorvância. O meio de cultura foi filtrado através de um filtro de tamanho de poro de 0,45 µm e a absorbância medida a 520 nm em um espectrofotômetro. A análise HPLC-MS como descrita no exemplo 1.5 foi conduzida em todas as três amostras; e a análise de peso seco como descrito no exemplo 1.3 também foi realizada.

[110] Os resultados da triagem de pH são apresentados na Figura 5, mostrando que a produção de cavernamina é possível em uma faixa de pH entre 3 - 8, no entanto, o pH 5 é preferencial. Em pH 3, o crescimento do fungo é muito inibido e lento, o que provavelmente explica a baixa quantidade de pigmentos produzidos. Exemplo 2. Produtos de A. cavernicola são livres da micotoxina citrinina

[111] A análise (como descrita no exemplo 1.5) de extratos derivados de A. carvernicola cultivada em CYA (extrato de levedura 5 g/L, caldo Czapek dox 35 g/L, ágar 20 g/L, metais vestigiais 1 ml/L), MEA (extrato de malte 20 g/L, peptona

1 g/L, 20 g/L glicose, 20 g/L de ágar, 1 ml/L de metais vestigiais), OAT (30 g/L de farinha de aveia, 15 g/L de ágar, 1 ml/L de metais vestigiais), PDA (39 g/L de ágar de dextrose de batata, 1 ml/L metais vestigiais) e YES (20 g/L de extrato de levedura, 150 g/L de sacarose, 0,5 g/L de MgSO4/H2O, 1 ml/L metais vestigiais) mostra que a micotoxina citrinina não é produzida (dados não mostrados) em qualquer uma das condições de cultivo. Exemplo 3. Estrutura de novos pigmentos de cavernamina, cavernina e hidroxi-carvernamina produzidos por fermentação de A. cavernicola

[112] Dos cultivos de A. cavernicola, um total de quatro tipos diferentes de novos compostos de azafilona foram identificados: Caverninas, cavernaminas, derivados de aminoácidos das cavernaminas e hidroxi-derivado de cavernaminas.

[113] Estruturas de cavernina, cavernamina, aminoácidos derivados de cavernaminas e hidroxi-cavernaminas foram determinadas usando experimentos de NMR 1D e 2D. Pigmentos de A. cavernicola foram extraídos, separados e analisados como descrito nos Exemplos 1.4 e 1.5; e subsequentemente analisado usando NMR como descrito abaixo:

3.1 Espectroscopia de ressonância magnética nuclear (NMR)

[114] Os espectros de NMR (1H, DQF-COSY, edHSQC, HMBC e NOESY) foram registrados em um Bruker Avance 800 MHz localizado no Departamento de Química da Universidade Técnica da Dinamarca. Os espectros de NMR foram adquiridos usando sequências de pulso padrão. O solvente usado foi DMSO-d6, que também foi usado como referência com sinais em δH = 2,50 ppm e δC = 39,5 ppm, ou CD3OD (referência a δH = 3,31 ppm e δC = 49,0 ppm). O processamento e a análise dos dados foram feitos usando TopSpin 3.5 (Bruker), MestReNova v.6.2.1-7569 (Mestrelab Research, Santiago de Compostela, Espanha) e ACD NMR Workbook (Advanced Chemical Development, Inc., Toronto, Ontário,

Canadá). Os acoplamentos J são relatados em hertz (Hz) e os deslocamentos químicos em ppm (δ).

3.2 Elucidação estrutural de cavernaminas

[115] Baseado em HR-MS, a fórmula dos dois isômeros da cavenamina foi determinada como sendo C20H21NO4 (m/z medido de [M+H]+ = 340,1541).

[116] A partir do espectro de 1H, 21 prótons foram identificados, juntamente com 19 carbonos baseado no HSQC e HMBC, listados na Figura 6A. A aparente ausência de um sinal de carbono está de acordo com os resultados obtidos anteriormente de outros compostos de azafilona, uma vez que o carbono 8 (Figura 6B) frequentemente tem uma baixa intensidade de sinal quando os espectros são adquiridos em metanol.

[117] O espectro DQF-COSY mostrou correlações entre os prótons em C-1, C-2 e C-3, bem como entre H-16, H-16-CH3, H-17 e H-18. A parte restante da estrutura foi determinada usando correlações HMBC. Os prótons H-3, H-5 e H- 12 mostraram correlações com o C-4 quaternário, enquanto os prótons H-5 e H- 12 tiveram correlações adicionais a C-6 e C-11. Determinou-se que C-4 e C-12 eram colocados em ambos os lados de um heteroátomo, especificamente um nitrogênio. H-7 teve correlações com C-5, C-6 e C-11. Além disso, uma correlação com a cetona C-10 foi observada a partir de H-12 e H-9-CH3. C-9 mostrou correlações com o grupo metila C-9-CH3, que adicionalmente tinha correlações com a carbonil C-13, determinada como parte de uma lactona. Os prótons em C- 16, C-16-CH3, e C-17 tinham todas as correlações com a cetona C-15.

[118] Baseado nas correlações observadas, uma estrutura heteroaromática bicíclica central (C-4 a C-12) ligada a uma lactona foi estabelecida. Uma porção alifática consistindo em quatro carbonos (C-16, C-16-CH3, C-17 e C-18) podem ser ligadas à parte lactona (C-13 e C-14) via C-15. Uma única metilação foi determinada para ser colocada em C-9, enquanto uma cadeia curta de três carbonos (C-1 a C-3) contendo uma única ligação dupla apresentou uma ligação à parte heteroaromática em C-4. Baseado na constante de acoplamento compartilhada entre H-2 e H-3, a ligação dupla foi determinada como sendo uma configuração trans. A estrutura dos compostos que foram nomeados cavernamina trans é mostrada na Figura 6B.

[119] Além da versão trans de cavernamina, uma versão cis também foi isolada (Figura 7B). Os deslocamentos químicos eram altamente comparáveis à versão trans, com diferenças principalmente em H-2 e H-3, para os quais as constantes de acoplamento correspondiam à configuração cis (Figura 7A).

3.3 Elucidação estrutural de derivados de aminoácidos de cavernamina

[120] Derivados de aminoácidos de cavernaminas obtidos dos cultivos em frasco de agitação descritos no exemplo 1.8 foram isolados e estruturalmente elucidados. Cada um dos derivados é nomeado de acordo com o aminoácido incorporado. Como exemplo, a figura 8A lista os deslocamentos de próton e carbono para o derivado de leucina, cis-cavernamina-L (Figura 8B).

3.4 Elucidação estrutural de caverninas

[121] Além das cavernaminas contendo nitrogênio, os pigmentos laranja/amarelo não contendo nitrogênio foram isolados dos cultivos em frasco de agitação antes da adição de aminoácidos (Figura 9B). A análise de HR-MS determinou que a fórmula é C20H20O5. Os deslocamentos químicos foram altamente semelhantes às das cavernaminas e podem ser encontradas na figura 9A.

3.5 Elucidação estrutural de hidroxi-cavernaminas

[122] Uma série de cavernaminas contendo aminoácidos menos reduzidos também foi identificada a partir dos cultivos em frasco de agitação descritos no exemplo 1.8, contendo um grupo hidroxila em C-2 em vez da ligação dupla entre C-2 e C-3 (Figura 10B). Como exemplo, os dados de NMR para o derivado de histidina, hidroxi-cavernamina-H, são encontrados na figura 10A. Exemplo 4. Propriedades físicas dos pigmentos de cavernaminas

[123] Baseado em cálculos (http://www.swissadme.ch/index.php), cavernaminas e caverninas exibiram uma quantidade maior de solubilidade em água comparado aos pigmentos de monascos conhecidos; os valores de logP são apresentados para os pigmentos selecionados (Tabela 1). Em virtude de seu grupo hidroxila, as hidroxi-cavermaninas exibem logP ainda mais baixo do que os outros pigmentos. Tabela 1. Valores LogP para pigmentos de A. cavernicola selecionados e pigmentos de Monascus correspondentes. LogP (cal.) Composto (SwissADME) Cavernamina trans (Figura 6) 2,87 Rubropuntamina de Monascus 3,30 Cavernina trans (Figura 9) 2,91 Rubropuntatina de Monascus 3,29 hidroxi-cavernamina (Figura 10) 2,06 Exemplo 5. Coloração de diferentes produtos usando cis-cavernamina-L

[124] A Cavernamina-L foi preparada como descrito no exemplo 1.8 e purificada como descrito no exemplo 1.4.

[125] A análise colorimétrica foi realizada de acordo com o CIEL*a*b*. CIEL*a*b* é o nome de um espaço de cores especificado pela Comissão Internacional de Iluminação (CIE) e inclui todas as cores perceptíveis. A coordenada L* representa a claridade da cor (L*= 0, rendimento preto e L*=100 indica branco difuso); e a* e b* representam as dimensões do oponente da cor: Vermelho e verde (a*) (verde indica negativo, enquanto vermelho indica positivo), e amarelo e azul (b*) (azul indica negativo e amarelo indica positivo).

[126] O sistema é baseado no fato de que a luz refletida de qualquer superfície colorida pode ser visualmente combinada por uma mistura aditiva das três cores primárias: vermelho, verde e azul. O modelo L*a*b* é um modelo tridimensional, que pode ser representado corretamente apenas em um espaço tridimensional.

[127] Os valores CIELAB foram medidos pelo Chroma Meter CR-200 da Konica Minolta. As medições foram feitas de acordo com o manual. As diferenças perceptivas de cor foram calculadas tomando-se a distância Euclidiana ΔE* entre L*a*b* entre duas cores.

5.1 Coloração do leite

[128] Leite desnatado 1% de Arla foi usado para testar a coloração com cis- cavernamina-L. Cavernamina-L em pó foi adicionado em diferentes concentrações ao leite desnatado 1%. Leite e pó colorido foram misturados por 5 minutos antes de as soluções serem submetidas à análise colorimétrica de acordo com o CIEL*a*b*.

[129] A coloração é visualizada na Figura 11 e os resultados da análise colorimétrica são relatados na Tabela 2. Tabela 2. CIEL*a*b* medidas do sistema de cor de leite corado com diferentes concentrações de cis-cavernamina-L. Cavernamine-L (PPM) Valores L*a*b* ΔE* 0 L: 86,02 0 a: -2,73 b: -1,10 28 L: 78,36 12,07 a: 6,07 b: 2,01 140 L: 53,89 37,37 a: 15,22 b: 5,4 280 L: 52,04 40,74 a: 18,10 b: 7,34

5.2 Coloração de skyr

[130] Skyr de baunilha de Arla foi usado para testar a coloração com cis- cavernamina-L.

[131] Pó de Cavernamina-L foi adicionado ao skyr de baunilha de Arla. Skyr e pó colorido foram misturados por 5 minutos antes de as soluções serem submetidas à análise colorimétrica de acordo com o CIEL*a*b*. A coloração é visualizada na Figura 12 e os resultados da análise colorimétrica são relatados na Tabela 3. Tabela 3. CIEL *a*b* medidas do sistema de cores de skyr colorido com diferentes concentrações de cis-cavernamina-L. Cavernamina-L (PPM) Valores L*a*b* ΔE* 0 L: 95,39 0 a: -2,42 b: 3,84 46 L: 86,89 12,48 a: 6,40 b: 1,44

5.3 Coloração de epóxi

[132] O sistema de resina epóxi bicomponente (PEBEO GEDEO 300 ml Resina Cristal), consistindo em uma resina e um endurecedor, foi adquirido da Pébéo.

[133] Pó de Cavernamina-L foi adicionado ao endurecedor e misturado completamente. O colorido e o endurecedor foram misturados 1:2 de acordo com as instruções de uso e permitido endurecer por 24 horas. Após foi endurecido, o epóxi foi submetido à análise colorimétrica de acordo com o CIEL*a*b*.

[134] A coloração é visualizada na Figura 13 e os resultados da análise colorimétrica são relatados na Tabela 4. Tabela 4. Medidas de sistema de cores CIEL*a*b* de epóxi colorido com diferentes concentrações de cis-cavernamina-L. Cavernamine-L (PPM) Valores L*a*b* ΔE* 0 L: 79,84 0 a: -0,79 b: 0,47 30 L: 70,13 17,64 a: 4,81 b: 14,09 600 L: 43,20 40,99 a: 15,33 b: 9,32

5.4 Coloração de gomas caseiras

[135] Goma é um doce que é tipicamente colorido. Neste exemplo, foi testada a capacidade da cavernamina-L de colorir a goma caseira.

[136] Receita de ingrediente de goma: 14 g de água desmineralizada, 7 g de ágar, 20 g de açúcar, 25 g de xarope de glicose, 1 g de ácido cítrico. Os ingredientes foram misturados e aquecidos a 65 °C por 30 minutos. Pó de Cavernamina-L foi adicionado à mistura e misturado por 5 minutos a 65 °C. A mistura de goma foi despejada em um molde e refrigerada por 24h até ficar firme. As gomas foram submetidas à análise colorimétrica de acordo com o

CIEL*a*b*.

[137] A coloração é visualizada na Figura 14 e os resultados da análise colorimétrica são relatados na Tabela 5. Tabela 5. Medidas de sistema de cores CIEL*a*b* de gomas coloridas com diferentes concentrações de cis-cavernamina-L. Cavernamina-L (PPM) Valores L*a*b* ΔE* 0 L: 41,66 0 a: 1,19 b: 8,88 180 L: 31,74 22,96 a: 21,89 b: 7,29 Exemplo 6. Composição compreendendo cis-cavernamina-L

[138] A Cavernamina-L foi preparada como descrito no exemplo 1.8 e purificada como descrito no exemplo 1.4.

[139] Formulação de cavernamina-L com maltodextrina e ácido cítrico. A cavernamina-L pura é muito intensa em sua cor para ser prática de trabalhar, pois apenas quantidades minúsculas precisarão ser adicionadas às aplicações, tornando o fluxo de trabalho mais difícil. É, desse modo, ideal diluir e formular a cor em uma intensidade mais fraca, tal como ilustrado abaixo.

[140] A mistura de diluição foi preparada como especificado na tabela 6. Tabela 6. Mistura de diluição Ingrediente Quantidade Água desmineralizada 1000 g Citrato de sódio desidratado 16,9 g Ácido Cítrico 8,1 g Maltodextrina 25 g

[141] A mistura de diluição foi ajustada para pH 5 com hidróxido de sódio a 2 M.

O pó de cavernamina-L foi adicionado à mistura de diluição em uma concentração de 0,5 g/L e misturado por 5 minutos.

A solução colorida foi então congelada antes da liofilização.

O pó vermelho diluído foi recuperado e a intensidade de cor da cavernamina-L formulada foi detectada como sendo E1% (a 492 nm) de 2,2, comparado ao E1% (a 492 nm) de 220 do pó de cavernamina- L puro original.

Claims (15)

REIVINDICAÇÕES

1. Pigmento de cavernamina, caracterizado pelo fato de que tem a estrutura de Fórmula I ou Fórmula II ou um derivado de hidroxila do referido pigmento de cavernamina que tem a estrutura de Fórmula III: Fórmula I Fórmula II Fórmula III em que R é hidrogênio, ou N-R é selecionado a partir de um aminoácido, um peptídeo, um amino açúcar e uma amina primária.

2. Pigmento de cavernamina tendo a estrutura de fórmula I ou seu derivado de hidroxila tendo a estrutura de fórmula III de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que N-R é um aminoácido selecionado a partir do grupo consistindo em: L-alanina, L-arginina, L-asparagina, L-aspartato, L-cisteína, L-glutamina, L-glutamato, L-glicina, L-histidina, L-isoleucina, L-leucina, L-lisina, L- metionina, L-fenilalanina, L-prolina, L-serina, L-treonina, L-triptofano, L-tirosina, L-valina e L-ornitina.

3. Pigmento de cavernina, caracterizado pelo fato de que tem a estrutura de Fórmula IV ou Fórmula V:

Fórmula IV Fórmula V em que o referido pigmento de cavernina é um precursor do pigmento de cavernamina e/ou o derivado de hidroxila do referido pigmento de cavernamina definido na reivindicação 1.

4. Método para produzir um pigmento de cavernamina e/ou um derivado de hidroxila do referido pigmento de cavernamina definido na reivindicação 1 por fermentação, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: a. fornecer esporos ou micélios de uma cepa de Aspergillus cavernicola, b. cultivar os referidos esporos ou micélios em um meio de crescimento líquido compreendendo uma fonte de nitrogênio, c. recuperar o pigmento de cavernamina e/ou seu derivado de hidroxila produzido durante o referido cultivo na etapa (b), e d. opcionalmente isolar o referido pigmento de cavernamina e/ou seu derivado de hidroxila.

5. Método para produzir um pigmento de cavernamina e/ou um derivado de hidroxila do referido pigmento de cavernamina por fermentação de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o referido pigmento de cavernamina tem a estrutura de Fórmula I e seu derivado de hidroxila tem a estrutura de fórmula III, e em que N-R é selecionado a partir de um aminoácido, um peptídeo, um amino açúcar e uma amina primária.

6. Método para produzir um pigmento de cavernamina e/ou um derivado de hidroxila da referida cavernamina por fermentação de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a única fonte de nitrogênio na etapa (b) é um composto selecionado a partir do grupo que consiste em um único aminoácido, um peptídeo, um amino açúcar e uma amina primária.

7. Método para produzir um pigmento de cavernamina e/ou um derivado de hidroxila da referida cavernamina por fermentação de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 6, caracterizado pelo fato de que compreende a etapa adicional de: a’) cultivar esporos ou micélios da etapa (a) em um meio de crescimento líquido preliminar, em que a única fonte de nitrogênio do referido meio de crescimento líquido preliminar é uma fonte de nitrogênio inorgânico; e em que a referida etapa (a’) é seguida pela etapa (b).

8. Método para produzir um pigmento de cavernamina e/ou um derivado de hidroxila da referida cavernamina por fermentação de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a concentração inicial de nitrogênio inorgânico na etapa (a’) é de não mais que 20 mM, continuando o cultivo até que a concentração de nitrogênio inorgânico seja depletada para menos de 5 mM.

9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 8, caracterizado pelo fato de que o meio de crescimento líquido na etapa (b) é mantido dentro de um pH de 4,0 a 6,5.

10. Uso de um pigmento de cavernamina e/ou um derivado de hidroxila da referida cavernamina definido na reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de ser como um agente corante para qualquer um alimento, um produto não alimentício e um cosmético.

11. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende um pigmento de cavernamina e/ou um derivado de hidroxila da referida cavernamina definido na reivindicação 1 ou 2, em que a composição é selecionada a partir de um alimento, um produto não alimentício e um cosmético.

12. Kit para colorir uma composição, caracterizado pelo fato de que o kit compreende (i) pelo menos um pigmento de cavernamina e/ou pelo menos um derivado de hidroxila da referida cavernamina definido na reivindicação 1 ou 2 e (ii) um agente estabilizante, em que o pigmento é fornecido em um recipiente, em que a composição é selecionada a partir de um alimento, um produto não alimentício e um cosmético.

13. Uso de um pigmento de cavernina definido na reivindicação 3, caracterizado pelo fato de ser como um agente corante para qualquer um alimento, um produto não alimentício e um cosmético.

14. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende um pigmento de cavernina definido na reivindicação 3, em que a composição é selecionada a partir de um alimento, um produto não alimentício e um cosmético.

15. Kit para colorir uma composição, caracterizado pelo fato de que o kit compreende (i) pelo menos um pigmento de cavernina definido na reivindicação 3 e (ii) um agente estabilizante, em que o pigmento é fornecido em um recipiente, em que a composição é selecionada a partir de um alimento, um produto não alimentício e um cosmético.