BR112021007376A2 - proteínas de fusão de peptídeo semelhante ao glucagon 1 (glp-1)/fator de diferenciação de crescimento 15 (gdf15) e usos dos mesmos - Google Patents

Abstract

PROTEÍNAS DE FUSÃO DE PEPTÍDEO SEMELHANTE AO GLUCAGON 1 (GLP-1)/FATOR DE DIFERENCIAÇÃO DE CRESCIMENTO 15 (GDF15) E USOS DOS MESMOS. A presente invenção refere-se a proteínas de fusão GLP1- GDF15 que compreendem um peptídeo GLP1 ou variante de peptídeo GLP1, um primeiro peptídeo ligante, uma proteína albumina sérica, um segundo peptídeo ligante e uma proteína GDF15.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PROTE- ÍNAS DE FUSÃO DE PEPTÍDEO SEMELHANTE AO GLUCAGON 1 (GLP-1/FATOR DE DIFERENCIAÇÃO DE CRESCIMENTO 15 (GDF15) E USOS DOS MESMOS".

CAMPO DA INVENÇÃO

[0001] A presente invenção refere-se, de modo geral, a novas pro- teínas de fusão de peptídeo semelhante ao glucagon 1 (GLP-1) / fator de diferenciação de crescimento 15 (GDF15). As proteínas de fusão de GLP1/GDF15 modulam o GLP1R e/ou o GDF15R. A invenção tam- bém se refere a composições farmacêuticas e métodos para uso das mesmas. As novas proteínas de fusão de GLP1/GDF15 são úteis para prevenir, tratar ou aliviar doenças e distúrbios, como obesidade, diabe- tes tipo 2, síndrome metabólica, resistência à insulina e dislipidemia, entre outras.

REFERÊNCIA REMISSIVA A PEDIDO RELACIONADO

[0002] Este pedido reivindica a prioridade ao pedido de patente provisório US nº 62/784.603, depositado em 22 de outubro de 2018, cuja revelação está aqui incorporada em sua totalidade por referência. REFERÊNCIA À LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS SUBMETIDA ELE-

TRONICAMENTE

[0003] Este pedido contém uma listagem de sequências, que foi submetida eletronicamente via EFS-Web como uma listagem de se- quência no formato ASCIIl com um nome de arquivo "PRD3474 Se- quence Listing" que foi criada em 14 de outubro 2019, e com um ta- manho de 327 kb. A listagem de sequências submetida via EFS-Web faz parte do relatório descritivo e está aqui incorporada a título de refe- rência em sua totalidade.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0004] GDF15, um membro da família TGFB, é uma proteína se- cretada que circula no plasma como um homodímero de 25 kDa e in-

duz sua função biológica através da interação com o receptor GFRAL expresso no tronco cerebral (Mullican et al., Nat Med. 23:1150 a 1157 (2017), Yang et al., Nat Med. 23:1158 a 1166 (2017), Hsu et al., Nature 550:255 a 259 (2017), Emmerson et al., Nat Med 23:1215 a 1219 (2017)). Os níveis plasmáticos de GDF15 situam-se na faixa entre 150 e 1150 pg/ml na maioria dos indivíduos (Tsai et al., J Cachexia Sarco- penia Muscle 3:239 a 243 (2012)). Níveis plasmáticos elevados de GDF15 estão associados à perda de peso decorrente de anorexia e caquexia causadas pelo câncer, e à insuficiência renal e cardíaca. Além disso, o GDF15 é aumentado em pacientes que sofrem perda de peso após a cirurgia de desvio gástrico em Y de Roux (RYGB) (Vila et al., Clin Chem 57:309 a 316 (2011)).

[0005] A correlação entre a perda de peso e GDF15 é conservada em roedores. A superexpressão de GDF15 resulta em diminuição na ingestão de alimentos, menor peso corporal e protege os camundon- gos da obesidade, esteatose hepática e intolerância à glicose após alimentação com dieta rica em gordura (Baek et al., Gastroenterology 131:1553 a 1560 (2006), Johnen et al., Nat Med 13:1333 a 1340 (2007), Chrysovergis et al., Int J Obesity 38:1555 a 1564 (2014), Macia et al., PloS One 7: e34868 (2012), Jones et al., Cell Reports 22:1522 a 1530 (2018), Xiong et al., Sci Trans Med 9:412 (2017)). Xenoenxertos de células tumorais de próstata transfectadas com GDF15 também diminuem a ingestão de alimentos e o peso corporal (Johnen et al., Nat Med 13:1333 a 1340 (2007)). Por outro lado, numerosos pesqui- sadores relataram que camundongos sem GDF15 ganham mais peso e têm maior massa gorda que os animais do tipo selvagem (Strelau et al., J Neurosci 29:13640 a 13648 (2009), Casanovas et al., Haemato- logica 98:444 a 447 (2013), Bonaterra et al., J Amer Heart Assoc 1: e002550 (2012), Tsai et al., PloS One. 8/255174 (2013)).

[0006] O potencial de GDF15 farmacologicamente administrado para diminuir a ingestão de energia e, assim, induzir a perda de peso, foi demonstrado em camundongos, ratos e macacos. Camundongos magros tratados com GDF15 recombinante comem menos e perdem peso (Johnen et al., Nat Med 13:1333 a 1340 (2007), Hsu et al., Nature 550:255 a 259 (2017), Mullican et al., Nat Med 23:1150 a 1157 (2017), Tsai et al., Int J Obesity 42:561 a 571 (2018)). A diminuição da inges- tão de alimentos e do peso corporal também é observada em modelos de obesidade induzida por genética e dieta em ratos e camundongos após a administração de GDF15 (Johnen et al., Nat Med 13:1333 a 1340 (2007), Hsu et al., Nature 550:255 a 259 (2017), Mullican et al., Nat Med 23:1150 a 1157 (2017), Yang et al., Nat Med 23:1158 a 1166 (2017), Tsai et al., Int J Obesity 42:561 a 571 (2018), Xiong et al., Sci Trans Med 9:412 (2017)). A perda de peso mediada pelo tratamento com GDF15 em camundongos com obesidade induzida por dieta leva a melhorias metabólicas, incluindo aumento da homeostase da glicose e redução dos níveis plasmáticos de triglicerídeos e colesterol. Esses efeitos traduzidos em espécies superiores como um regime de trata- mento diário de seis semanas com GDF15 humano recombinante em primatas não humanos espontaneamente obesos reduziram a ingestão de alimentos, o peso corporal e as concentrações plasmáticas de tri- glicerídeos e melhoraram a tolerância à glicose (Xiong et al., Sci Trans Med 9:412 (2017)). Além disso, foi demonstrado anteriormente que a meia-vida do GDF15 recombinante é estendida por fusão à albumina sérica humana (HSA) sendo previsivelmente um agente terapêutico adequado para dosagem uma vez por semana em humanos (Mullican et al., Nat Med 23:1150 a 1157 (2017) e publicação de patente US nº 2017/0327560.

[0007] O GLP1 é um hormônio peptídico derivado das células en- teroendócrinas do intestino que também reduz a ingestão de alimen- tos, levando à perda de peso. Essa função é mediada pela interação com o receptor de GLP1 (GLP1R) dentro do sistema nervoso central e essa interação ligante/receptor nos tecidos periféricos tem efeitos bio- lógicos adicionais incluindo a melhora da secreção de insulina estimu- lada por glicose, supressão da liberação de glucagon e desaceleração do esvaziamento gástrico (Druker et al. Cell Met 27:740 a 756 (2018)). Aproveitando todos esses efeitos biológicos, os agonistas de GLPIR melhoram a homeostase da glicose e levam à perda de peso em seres humanos. Além disso, foi relatado que o tratamento com agonistas de GLP1R melhora significativamente os resultados cardiovasculares em pacientes diabéticos embora o mecanismo exato ainda precisa ser de- terminado (Lim et al. Trends Endocrinol Metab. 29: 238 a 248 (2018)). Os agentes terapêuticos agonistas de GLP1R são sequências peptídi- cas baseadas em GLP1 humano nativo ou exendina-4 (um peptídeo isolado da saliva do lagarto monstro-de-Gila) com modificações para evitar a clivagem enzimática. Os agonistas de GLP1R podem ser libe- rados através de plataformas que estendem a meia-vida, como lipida- ção, Fc de anticorpo ou albumina sérica humana (HSA) (Cheang e Moyle, Chem Med Chem 13:662 a 671 (2018)).

[0008] Dessa forma, é desejável obter um análogo de GLP1 ou derivado do mesmo e/ou um análogo de GDF-15 ou derivado do mesmo com estabilidade metabólica e perfil farmacocinético melhora- dos em relação ao GLP1 ou ao GDF15, respectivamente. Esses deri- vados proporcionariam modulação do receptor de GLP1 e do receptor de GDF15 com maior duração de ação, tornando-os adequados como agentes terapêuticos para indivíduos que precisam dessa modulação.

[0009] A discussão anterior é apresentada apenas para proporcio- nar uma melhor compreensão da natureza dos problemas que a técni- ca enfrenta e não deve ser interpretada de forma alguma como uma admissão de que tal referência constitui "técnica anterior" à aplicação imediata.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0010] Em um aspecto geral, a invenção se refere a novas proteí- nas de fusão de peptídeo semelhante ao glucagon 1 (GLP-1) / fator de diferenciação de crescimento 15 (GDF15). As proteínas de fusão de GLP1/GDF15 modulam o GLP1R e/ou o GDF15R (GFRAL).

[0011] São aqui fornecidas proteínas de fusão de peptídeo seme- lhante ao glucagon 1 (GLP-1) / fator de diferenciação de crescimento (GDF15). As proteínas de fusão de GLP1/GDF15 compreendem um peptídeo GLP1, um primeiro peptídeo ligante, uma proteína albu- mina sérica, um segundo peptídeo ligante e uma proteína GDF15.

[0012] Em certas modalidades, o peptídeo GLP1 compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 1 a 4.

[0013] Em certas modalidades, o primeiro peptídeo ligante com- preende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 5 a 25.

[0014] Em certas modalidades, a proteína albumina sérica com- preende uma sequência de aminoácidos selecionada da SEQ ID NO: 26 ou SEQ ID NO: 27.

[0015] Em certas modalidades, o segundo peptídeo ligante com- preende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 28 a 30.

[0016] Em certas modalidades, a proteína GDF15 compreende uma sequência de aminoácidos selecionada da SEQ ID NO: 31 ou da SEQ ID NO: 32.

[0017] Em certas modalidades, a proteína de fusão de GLP1/GDF15 compreende uma sequência de aminoácidos seleciona- da do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 33 a 74 e 84.

[0018] Também são fornecidos ácidos nucleicos isolados que codi- ficam as proteínas de fusão de GLP1/GDF15 da invenção. Também são fornecidos vetores que compreendem os ácidos nucleicos isolados da invenção. Também são fornecidas células hospedeiras que com- preendem os ácidos nucleicos isolados da invenção ou os vetores da invenção.

[0019] Também são fornecidas composições farmacêuticas que compreendem as proteínas de fusão de GLP1/GDF15 da invenção e um veículo farmaceuticamente aceitável.

[0020] Também são fornecidos métodos para tratamento ou pre- venção de uma doença ou distúrbio em um indivíduo que esteja preci- sando do mesmo, sendo que a dita doença ou distúrbio é selecionada do grupo que consiste em obesidade, diabetes tipo | ou tipo Il, síndro- me metabólica, resistência à insulina, tolerância diminuída à glicose, hiperglicemia, hiperinsulinemia, hipertrigliceridemia, hipoglicemia devi- do a hiperinsulinismo congênito (CHI), dislipidemia, aterosclerose, ne- fropatia diabética, e outros fatores de risco cardiovascular como hiper- tensão e fatores de risco cardiovascular relacionados aos níveis de colesterol e/ou de lipídeos não controlados, osteoporose, inflamação, doença hepática gordurosa não alcoólica (NAFLD), esteato-hepatite não alcoólica (NASH), doença renal, e eczema, sendo que o método compreende a administração ao indivíduo que esteja precisando do mesmo de uma quantidade eficaz da composição farmacêutica da in- venção.

[0021] Também são fornecidos métodos para reduzir a ingestão de alimentos em um indivíduo que esteja precisando dos mesmos, sendo que o método compreende administrar ao indivíduo que esteja precisando do mesmo uma quantidade eficaz da composição farma- cêutica da invenção.

[0022] Também são fornecidos métodos de modulação da ativida- de do receptor de GLP1 em um indivíduo que esteja precisando dos mesmos, sendo que o método compreende administrar ao indivíduo que esteja precisando do mesmo uma quantidade eficaz da composi- ção farmacêutica da invenção.

[0023] Também são fornecidos métodos de modulação da ativida- de do receptor de GDF15 (GFRAL) em um indivíduo que esteja preci- sando dos mesmos, sendo o método caracterizado por compreender administrar ao indivíduo que esteja precisando do mesmo uma quanti- dade eficaz da composição farmacêutica da invenção.

[0024] Em certas modalidades, a composição farmacêutica é ad- ministrada por meio de uma injeção.

[0025] Também são fornecidos kits que compreendem as proteí- nas de fusão de GLP1/GDF15 da invenção, os ácidos nucleicos isola- dos da invenção e/ou os vetores da invenção. O kit pode, por exemplo, compreender adicionalmente um dispositivo para injeção.

[0026] Também são fornecidos métodos de produção de uma composição farmacêutica que compreende as proteínas de fusão de GLP1/GDF15 da invenção. Os métodos compreendem combinar as proteínas de fusão de GLP1/GDF15 com um veículo farmaceuticamen- te aceitável para obter a composição farmacêutica.

[0027] Também são fornecidos métodos de produção das proteí- nas de fusão de GLP1/GDF15 da invenção. Os métodos compreen- dem cultivar uma célula que compreende um ácido nucleico que codi- fica a proteína de fusão de GLP1/GDF15 sob condições para produzir a proteína de fusão de GLP1/GDF15 e recuperar a proteína de fusão de GLP1/GDF15 da célula ou cultura.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0028] O sumário supracitado, bem como a descrição detalhada a seguir das modalidades preferenciais do presente pedido, serão mais bem entendidos quando lidos em conjunto com os desenhos em ane- xo. Deve-se compreender, no entanto, que o pedido de patente não se limita às modalidades precisas mostradas nos desenhos.

[0029] A Figura 1 mostra um gráfico que demonstra a alteração percentual de peso (a partir do dia 0) em camundongos DIO receben- do administração diária de liraglutida (lira) e/ou administração de HSA- GDF15 (SEQ ID NO:81) em dias alternados.

[0030] A Figura 2 mostra um gráfico demonstrando a porcenta- gem média de alteração de peso (a partir do dia 0) em camundongos DIO que recebem a administração diária de GLP1-GSA-GDF15 (SEQ ID NO:72), GLP1-GSA-GDF15(I89R) (SEQ ID NO:73; a mutação I89R que elimina a atividade do GDF15), GLP1(9-39)-GSA-GDF15 (SEQ ID NO:74, que elimina a atividade de GLP1) ou GSA-GDF15 (SEQ ID NO:75). O tratamento com dulaglutida serviu como um controle positi- vo, enquanto o tratamento com veículo serviu como um controle nega- tivo. + EPM, n= 8.

[0031] A Figura 3 mostra um desenho esquemático de uma prote- ína de fusão de GLP1/GDF15.

[0032] A Figura 4 mostra um gráfico que demonstra os efeitos da administração subcutânea das SEQ ID NOs: 45, 49, 50, 33, 46 e 44 sobre a ingestão de alimentos em camundongos C57BL/6. Os dados são apresentados como alteração percentual na ingestão de alimentos em comparação com a ingestão de alimentos antes do tratamento em 24 horas.

[0033] A Figura 5 mostra um gráfico que demonstra a concentra- ção plasmática de proteínas de fusão de GLP1/GDF15 (SEQ ID NOs:45, 49, 50, 33, 46, e 44) em 24 horas após a administração em camundongos, conforme determinado através de análise por cromato- grafia líquida de alta eficiência acoplada à espectrometria de massas em sequência (LC-MS/MS) por digestão com tripsina e captura por imunoafinidade.

[0034] A Figura 6 mostra um gráfico que demonstra os efeitos da administração subcutânea das SEQ ID NOs: 45, 50, 46 e 44 sobre a ingestão de alimentos em camundongos deficientes de GFRAL. Os dados são apresentados como alteração percentual na ingestão de alimentos (em comparação com o tratamento com veículo) versus a concentração plasmática do artigo de teste com braços de GLP1 intac- to em 24 horas.

[0035] A Figura 7 mostra um gráfico que demonstra os efeitos da administração subcutânea da SEQ ID NO:45 sobre a ingestão de ali- mentos em camundongos deficientes em GFRAL. Os dados são apre- sentados como alteração percentual na ingestão de alimentos (em comparação com o tratamento com veículo) versus a concentração plasmática do artigo de teste com braços de GLP1 intacto em 24 ho- ras.

[0036] A Figura 8 mostra um gráfico que demonstra os efeitos da administração subcutânea da SEQ ID NO:33 sobre a ingestão de ali- mentos em camundongos deficientes de GFRAL. Os dados são apre- sentados como alteração percentual na ingestão de alimentos (em comparação com o tratamento com veículo) versus a concentração plasmática do artigo de teste com braços de GLP1 intacto em 24 ho- ras.

[0037] A Figura 9 mostra um gráfico que demonstra os efeitos da administração subcutânea das SEQ ID NOs: 50, 46 e 44 sobre a tole- rância à glicose em camundongos. Os dados são apresentados como alteração percentual na AUC delta em comparação com o tratamento com veículo versus a concentração plasmática das proteínas de fusão de GLP1/GDF15 com peptídeos GLP1 intactos ou variantes de peptí- deo GLP1.

[0038] A Figura 10 mostra um gráfico que demonstra os efeitos da administração subcutânea das SEQ ID NOs: 45 e 49 sobre a tolerân- cia à glicose em camundongos. Os dados são apresentados como al- teração percentual na AUC delta em comparação com o tratamento com veículo versus a concentração plasmática das proteínas de fusão de GLP1/GDF15 com peptídeos GLP1 intactos ou variantes de peptí- deo GLP1.

[0039] A Figura 11 mostra um gráfico que demonstra os efeitos da administração subcutânea da SEQ ID NO:33 sobre a tolerância à gli- cose em camundongos. Os dados são apresentados como alteração percentual na AUC delta em comparação com o tratamento com veícu- lo versus a concentração plasmática das proteínas de fusão de GLP1/GDF15 com peptídeos GLP1 intactos ou variantes de peptídeo GLP1.

[0040] A Figura 12 mostra um gráfico que demonstra os efeitos da administração subcutânea da SEQ ID NO:45 e SEQ ID NO:36 sobre a tolerância à glicose em camundongos. Os dados são apresentados como alteração percentual na AUC delta em comparação com o trata- mento com veículo versus a concentração plasmática das proteínas de fusão de GLP1/GDF15 com peptídeos GLP1 intactos ou variantes de peptídeo GLP1.

[0041] A Figura 13 mostra um gráfico que demonstra os efeitos da administração subcutânea das SEQ ID NOs: 45 e 44 sobre a secreção de insulina durante uma infusão de glicose graduada em macacos cynomolgus. Os dados são apresentados como alteração em potência de dez na AUC (Area Under Curve - "área sob a curva") da ISR (Insu- lin-Secretion Rate - "taxa de secreção de insulina") normalizada para a AUC de glicose (em comparação com a linha de base) versus a con- centração plasmática das proteínas de fusão de GLP1/GDF15 com peptídeos GLP1 intactos ou variantes de peptídeo GLP1.

[0042] A Figura 14 mostra um gráfico que demonstra a eficácia de perda de peso da administração subcutânea diária de proteínas de fu- são de GLP1/GDF15 (SEQ ID NOs: 45 e 44) em camundongos com obesidade induzida por dieta. Os dados são apresentados como alte-

ração percentual no peso corporal a partir do Dia O.

[0043] A Figura 15 mostra um gráfico que demonstra a concentra- ção plasmática de proteínas de fusão de GLP1/GDF15 (SEQ ID no 45 e 44) após 7 dias de administração diária em camundongos com obe- sidade induzida por dieta, conforme determinado através de análise LC-MS/MS por digestão com tripsina e captura por imunoafinidade.

[0044] A Figura 16 mostra um gráfico que demonstra a alteração percentual de 3 dias na ingestão de alimentos na linha de base e após cada administração subcutânea basal e após cada administração sub- cutânea QW (uma vez por semana) das proteínas de fusão de GLP1/GDF15 (SEQ ID NOs: 44 e 83) durante 4 semanas em primatas não humanos espontaneamente obesos. Os dados são apresentados para sujeitos individuais e aqueles sem nível detectável de artigo de teste em seu plasma não estão incluídos na figura, conforme delinea- do abaixo do eixo geométrico x.

[0045] A Figura 17 mostra um gráfico que demonstra a concentra- ção plasmática do artigo de teste total durante um tratamento de 4 semanas com diferentes concentrações variáveis de proteínas de fu- são de GLP1/GDF15 (SEQ ID NOs: 44 e 83) administradas QW em primatas não humanos espontaneamente obesos conforme determi- nado por imunoensaio. Os dados são apresentados como a média (+ DPM).

[0046] A Figura 18 mostra um gráfico que demonstra a concentra- ção plasmática da porção de GLP1 contendo o artigo de teste durante um tratamento de 4 semanas com concentrações variáveis de proteína de fusão de GLP1/GDF15 (SEQ ID no.44) administrada QW em prima- tas não humanos espontaneamente obesos, conforme determinado por imunoensaio. Os dados são apresentados como a média (+ DPM).

[0047] A Figura 19 mostra um gráfico que demonstra a ingestão diária absoluta de alimentos antes, durante e após um tratamento de

21 dias com concentrações escalonadas de proteínas de fusão de GLP1/GDF15 (SEQ ID NOs: 44, 83 e 84) administradas Q3D (uma vez a cada 3 dias) em primatas não humanos espontaneamente obesos. Os dados são apresentados como a média (+ DPM) de dez indivíduos por grupo.

[0048] A Figura 20 mostra um gráfico que demonstra a alteração do peso corporal (em relação à linha de base) após um tratamento de 21 dias com concentrações escalonadas de proteínas de fusão de GLP1/GDF15 (SEQ ID NOs: 44, 83 e 84) administradas Q3D (uma vez a cada 3 dias) em primatas não humanos espontaneamente obesos. Os dados são apresentados como a média (+ DPM) de dez indivíduos por grupo.

[0049] A Figura 21 mostra um gráfico que demonstra a concentra- ção plasmática do artigo de teste total durante e após um tratamento de 21 dias com concentrações crescentes das proteínas de fusão de GLP1/GDF15 (SEQ ID NOs: 44, 83 e 84) administradas Q3D em pri- matas não humanos espontaneamente obesos, conforme determinado por imunoensaio. Os dados são apresentados para sujeitos individu- ais.

[0050] A Figura 22 mostra um gráfico que demonstra a concentra- ção plasmática da porção de GLP1 contendo o artigo de teste durante e após um tratamento de 21 dias com concentrações escalonadas das proteínas de fusão de GLP1/GDF15 (SEQ ID NOs: 44 e 84) adminis- tradas Q3D em primatas não humanos espontaneamente obesos, con- forme determinado por imunoensaio. Os dados são apresentados para sujeitos individuais.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0051] Várias publicações, artigos e patentes são citados ou des- critos em segundo plano e ao longo do relatório descritivo; cada uma dessas referências está aqui incorporada por referência em sua totali-

dade. A discussão de documentos, atos, materiais, dispositivos, arti- gos ou similares que tenha sido incluída no presente relatório descriti- vo tem o propósito de fornecer contexto para a invenção. Tal discus- são não é uma admissão de que qualquer um ou todos esses assun- tos façam parte da técnica anterior no que diz respeito a quaisquer in- venções reveladas ou reivindicadas.

[0052] Exceto quando definido em contrário, todos os termos téc- nicos e científicos utilizados na presente invenção têm o mesmo signi- ficado como comumente compreendido pelo versado na técnica à qual essa invenção pertence. De outro modo, certos termos utilizados na presente invenção têm os significados conforme definidos no relatório descritivo.

[0053] Deve-se observar que, conforme usado na presente inven- ção e nas reivindicações em anexo, as formas no singular "um/uma" e "o/a" incluem a referência no plural, salvo se o contexto claramente indicar o contrário.

[0054] Exceto onde especificado de outra forma, quaisquer valores numéricos, como uma concentração ou uma faixa de concentração aqui descrita, deve ser entendido como sendo modificado em todos os casos pelo termo "cerca de". Dessa forma, um valor numérico tipica- mente inclui + 10% do valor mencionado. Por exemplo, uma concen- tração de 1 mg/ml inclui 0,9 mg/ml a 1,14 mg/ml. De modo semelhante, uma faixa de concentração de 1% a 10% (p/v) inclui 0,9% (p/v) a 11% (p/v). Como usado na presente invenção, o uso de uma faixa numérica inclui expressamente todas as subfaixas possíveis, todos os valores numéricos individuais dentro dessa faixa, incluindo números inteiros dentro dessas faixas, e frações dos valores, a menos que o contexto indique claramente de outro modo.

[0055] Exceto quando indicado em contrário, o termo "ao menos" anterior a uma série de elementos deve ser entendido como se refe-

rindo a cada elemento na série. Os versados na técnica reconhecerão, ou serão capazes de verificar com o uso de não mais que experimen- tação de rotina, muitos equivalentes às modalidades específicas da invenção aqui descritas. Tais equivalentes se destinam a ser abrangi- dos pela invenção.

[0056] Para uso na presente invenção, entende-se que os termos "compreende", "compreendendo", "inclui", "incluindo", "tem", "tendo", "contém", ou "contendo" ou qualquer outra variação dos mesmos, se- rão destinados para implicar a inclusão de um número inteiro ou grupo de números inteiros declarados, mas não a exclusão de qualquer outro número inteiro ou grupo de números inteiros e se destinam a ser não exclusivos e abertos. Por exemplo, uma composição, uma mistura, um processo, um método, um artigo ou um aparelho que compreende um grupo de elementos não é necessariamente limitado apenas àqueles elementos mas pode incluir outros elementos não expressamente lis- tados ou inerentes a tal composição, mistura, processo, método, artigo ou aparelho. Exceto onde expressamente declarado em contrário, "ou" se refere a um "ou" inclusivo e não a um "ou" exclusivo. Por exemplo, uma condição A ou B é satisfeita por qualquer um dos seguintes: A é verdadeiro (ou está presente) e B é falso (ou não está presente), A é falso (ou não está presente) e B é verdadeiro (ou está presente), e tan- to A como B são verdadeiros (ou estão presentes).

[0057] Como usado aqui, o termo conjuntivo "e/ou" entre múltiplos elementos mencionados é entendido como abrangendo ambas as op- ções individuais e combinadas. Por exemplo, quando dois elementos são co-unidos por "e/ou", uma primeira opção se refere à aplicabilida- de do primeiro elemento sem o segundo. Uma segunda opção se refe- re à aplicabilidade do segundo elemento sem o primeiro. Uma terceira opção se refere à aplicabilidade do primeiro e do segundo elementos juntos. Entende-se que qualquer uma dessas opções se enquadra no significado, e portanto satisfazem o requisito do termo "e/ou" conforme usado na presente invenção. Também entende-se que a aplicabilidade simultânea de mais de uma das opções se enquadra no significado e, portanto, atende ao requisito do termo "e/ou".

[0058] Deve-se compreender, também, que os termos "cerca de", ou "aproximadamente", e "de modo geral", "substancialmente" e ter- mos similares, usados na presente invenção quando se referem a uma dimensão ou característica de um componente da invenção preferen- cial, indicam que a dimensão/característica descrita não é um limite ou parâmetro estrito e não exclui variações menores da mesma que se- jam funcionalmente iguais ou similares, como seria compreendido pelo versado na técnica. No mínimo, tais referências que incluem um parâ- metro numérico podem incluir variações que, com o uso de princípios matemáticos e industriais aceitos na técnica (por exemplo, arredon- damento, medição ou outros erros sistemáticos, tolerâncias de fabrica- ção, etc.), não variariam o dígito menos significativo.

[0059] Os termos "idêntico" ou "identidade" percentual no contexto de duas ou mais sequências de ácidos nucleicos ou de polipeptídeos (por exemplo, peptídeo GLP1, peptídeos ligantes, proteínas albumina sérica, proteínas GDF15 e polinucleotídeos que codificam os peptí- deos), se referem a duas ou mais sequências ou subsequências que são iguais ou que têm uma porcentagem especificada de resíduos de aminoácido ou nucleotídeos que são iguais, quando comparadas e ali- nhadas para correspondência máxima, conforme medido usando um dos algoritmos de comparação de sequências a seguir ou por inspe- ção visual, usando métodos conhecidos na técnica em vista da pre- sente revelação.

[0060] Para a comparação de sequências, tipicamente uma se- quência atua como uma sequência de referência, à qual as sequências de teste são comparadas. Ao se usar um algoritmo de comparação de sequências, as sequências de teste e de referência são inseridas em um computador, as coordenadas de subsequência são designadas, se necessário, e os parâmetros de programa de algoritmo de sequência são designados. O algoritmo de comparação de sequência então cal- cula a porcentagem de identidade de sequência para a sequência (ou sequências) de teste em relação à sequência de referência, com base nos parâmetros de programa designados.

[0061] O alinhamento de sequências ótimo para comparação pode ser conduzido, por exemplo, pelo algoritmo de homologia local de Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981), pelo algoritmo de alinhamento de homologia de Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970), pela busca por método de similaridade de Pearson & Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. EUA 85:2.444 (1988), por implementa- ções computadorizadas desses algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA e TFASTA no Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Compu- ter Group, 575 Science Dr., Madison, WI) ou por inspeção visual (con- sulte, em geral, Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., eds., Current Protocols, a joint venture between Greene Publis- hing Associates, Inc. e John Wiley & Sons, Inc., (1995 Suplemento) (Ausubel)).

[0062] Exemplos de algoritmos que são adequados para determi- nar a porcentagem de identidade de sequência e similaridade de se- quência são os algoritmos BLAST e BLAST 2.0, que são descritos em Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403 a 410 e Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3.389 a 3.402, respectivamente. O sof- tware para realizar análises de BLAST está disponível publicamente junto ao National Center for Biotechnology Information (Centro Nacio- nal para Informação de Biotecnologia). Este algoritmo envolve primeiro identificar pares de sequências de alta pontuação (HSPs) por identifi- cação de palavras curtas de comprimento W na sequência de consul-

ta, que se correlacionam ou satisfazem alguma pontuação limite com valor positivo T quando alinhadas com uma palavra do mesmo com- primento em uma sequência de dados. T é chamado de limite de pon- tuação de palavra vizinha (Altschulet al., acima). Estes acertos iniciais de palavras vizinhas agem como sementes para iniciar buscas para encontrar HSPs mais longos que os contenham. Os acertos de pala- vras são então estendidos em ambas as direções ao longo de cada sequência até o ponto em que a pontuação de alinhamento cumulativa pode ser aumentada.

[0063] Além de calcular a identidade de sequência percentual, o algoritmo BLAST também executa uma análise estatística da similari- dade entre duas sequências (consulte, por exemplo, Karlin & Altschul, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 90:5873 a 5787 (1993)). Uma medida de similaridade fornecida pelo algoritmo BLAST é a menor probabilidade de soma (P (N)), que fornece uma indicação da probabilidade através da qual uma correspondência entre duas sequências de nucleotídeos ou de aminoácidos ocorreria por acaso. Por exemplo, um ácido nuclei- co é considerado similar a uma sequência de referência se a menor probabilidade de soma em uma comparação entre o ácido nucleico de teste e o ácido nucleico de referência é menor que cerca de 0,1, com mais preferência menor que cerca de 0,01, e com mais preferência menor que cerca de 0,001.

[0064] Uma outra indicação de que duas sequências de ácidos nucleicos ou polipeptídeos são substancialmente idênticas é que o po- lipeptídeo codificado pelo primeiro ácido nucleico é reativo de forma cruzada imunologicamente com o polipeptídeo codificado pelo segun- do ácido nucleico, conforme descrito abaixo. Dessa forma, um polipep- tídeo é substancialmente tipicamente idêntico a um segundo polipeptí- deo, por exemplo, quando os dois peptídeos diferem apenas por subs- tituições conservativas. Uma outra indicação de que duas sequências de ácidos nucleicos são substancialmente idênticas é que as duas mo- léculas hibridizam entre si sob condições estringentes.

[0065] Para uso na presente invenção, "sujeito" significa qualquer animal, de preferência um mamífero, com a máxima preferência um ser humano. O termo "mamífero", como usado aqui, abrange qualquer mamífero. Exemplos de mamíferos incluem, mas não se limitam a, va- cas, cavalos, ovelhas, porcos, gatos, cães, camundongos, ratos, coe- lhos, porquinhos da Índia, Macacos, seres humanos, etc., com mais preferência, um ser humano.

[0066] O termo "administração" em relação aos métodos da inven- ção, significa um método para prevenir, tratar ou aliviar terapêutica ou profilaticamente uma síndrome, distúrbio ou doença, conforme descrito aqui, com o uso de um conjugado ou composto da invenção ou uma forma, composição ou medicamento do mesmo. Tais métodos incluem a administração de uma quantidade eficaz do dito conjugado, compos- to, uma forma, composição ou medicamento do mesmo, em diferentes momentos durante o curso de uma terapia ou concomitantemente em uma forma de combinação. Os métodos da presente invenção devem ser entendidos como abrangentes de todos os regimes de tratamento terapêutico.

[0067] O termo "quantidade eficaz" significa aquela quantidade de conjugado, composto ou agente farmacêutico ativo que provoca a res- posta biológica ou medicinal em um sistema de tecido, animal ou hu- mano, que esteja sendo procurada por um pesquisador, veterinário, médico, ou outro profissional de saúde, que inclui a prevenção, trata- mento ou melhora dos sintomas de uma síndrome, distúrbio ou doença que esteja sendo tratada.

[0068] Como usado aqui, o termo "composição" tem por objetivo abranger um produto que compreende os ingredientes especificados nas quantidades especificadas, bem como qualquer produto, que re-

sulte, direta ou indiretamente, de combinações dos ingredientes espe- cificados nas quantidades especificadas.

[0069] O termo "isolado" pode se referir a um ácido nucleico ou polipeptídeo que é substancialmente isento de material celular, materi- al bacteriano, material viral ou meio de cultura (quando produzido por técnicas de DNA recombinante) de sua fonte de origem, ou precurso- res químicos ou outros produtos químicos (quando sintetizados quimi- camente). Além disso, um polipeptídeo isolado se refere a um polipep- tídeo que pode ser administrado a um indivíduo como um polipeptídeo isolado; em outras palavras, o polipeptídeo pode não ser simplesmen- te considerado "isolado" se ele for aderido a uma coluna ou embutido em um gel. Além disso, um "fragmento de ácido nucleico isolado" ou "peptídeo isolado" é um ácido nucleico ou fragmento de proteína que não é de ocorrência natural como fragmento e/ou não está tipicamente no estado funcional.

[0070] Como usado na presente invenção, o termo "polinucleotí- deo", chamado de "molécula de ácido nucleico", "nucleotídeos" ou "ácidos nucleicos", se refere a qualquer polirribonucleotídeo ou polide- soxirribonucleotídeo, que pode ser RNA ou DNA não modificado ou RNA ou DNA modificado. Os "polinucleotídeos" incluem, mas não se limitam, ao DNA de fita simples e dupla, DNA que é uma mistura de regiões de fita simples e dupla, RNA de fita simples e dupla e RNA que é a mistura de regiões de fita simples e dupla, moléculas híbridas que compreendem DNA e RNA que podem ser de fita simples ou, mais ti- picamente, fita dupla, ou uma mistura de regiões de fita simples e fita dupla. Além disso, "polinucleotídeo" se refere a regiões de fita tripla que compreendem RNA ou DNA ou ambos RNA e DNA. O termo poli- nucleotídeo inclui DNAs ou RNAs contendo uma ou mais bases modi- ficadas e DNAs ou RNAs com a cadeia principal modificada para esta- bilidade ou por outros motivos. Bases "modificadas" incluem, por exemplo, bases tritiadas e bases incomuns, como inosina. Uma varie- dade de modificações pode ser feita no DNA e no RNA; dessa forma, "polinucleotídeo" abrange formas quimicamente, enzimaticamente ou metabolicamente modificadas de polinucleotídeos como tipicamente encontradas na natureza, assim como as formas químicas de DNA e RNA características de vírus e células. "Polinucleotídeo" também abrange cadeias relativamente curtas de ácido nucleico, com frequên- cia, chamadas de oligonucleotídeos.

[0071] O termo "expressão", como usado aqui, se refere à biossín- tese de um produto gênico. Esses termos abrangem a transcrição de um gene no RNA. O termo também abrange a tradução do RNA em um ou mais polipeptídeos e abrange, ainda, todas as modificações pós-transcricionais e pós-traducionais de ocorrência natural. O poli- peptídeo expresso pode estar dentro do citoplasma de uma célula hospedeira, no meio extracelular, como no meio de crescimento de uma cultura ou ancorado à membrana celular.

[0072] Como usado aqui, os termos "peptídeo", "polipeptídeo" ou "proteína" podem se referir a uma molécula que compreende aminoá- cidos e podem ser reconhecidos como uma proteína pelos versados na técnica. O código de uma letra ou de três letras convencional para resíduos de aminoácido é usado na presente invenção. Os termos "peptídeo", "polipeptídeo" e "proteína" podem ser usados de forma in- tercambiável na presente invenção para se referir a polímeros de ami- noácidos de qualquer comprimento, inclusive aqueles que compreen- dem peptídeos/polipeptídeos ligados (por exemplo, fundidos) (por exemplo, proteínas de fusão). O polímero pode ser linear ou ramifica- do, pode compreender aminoácidos modificados e pode ser interrom- pido por não aminoácidos. Os termos também abrangem um polímero de aminoácidos que foi modificado naturalmente ou por intervenção; por exemplo, formação de ligação dissulfeto, glicosilação, lipidação,

acetilação, fosforilação ou qualquer outra manipulação ou modificação, como conjugação com um componente de marcação. Também estão incluídos na definição, por exemplo, polipeptídeos contendo um ou mais análogos de um aminoácido (incluindo, por exemplo, aminoáci- dos não naturais, etc.), bem como outras modificações conhecidas na técnica.

[0073] As sequências de peptídeo aqui descritas são escritas de acordo com a convenção habitual de modo que a região N-terminal do peptídeo está à esquerda e a região carbóxi-terminal está à direita. Embora formas isoméricas dos aminoácidos sejam conhecidas, é a forma L do aminoácido que é representada exceto se expressamente indicado em contrário. Proteínas de fusão de peptídeo semelhante ao glucagon 1 (GLP-1)/ fator de diferenciação de crescimento 15 (GDF15)

[0074] Embora tanto a sinalização de GDF15 quanto a sinalização de GLP1 possam reduzir a ingestão de alimentos, esses efeitos pare- cem ser independentes um do outro. Por exemplo, os efeitos de GDF15 são mantidos na ausência de GLP1R em camundongos e, por outro lado, o tratamento com GLP1 ainda leva a efeitos sobre a inges- tão de alimentos na ausência de GFRAL (Hsu et al., Nature 550:255 a 259 (2017), Mullican et al., Nat Med 23:1150 a 1157 (2017)). Portanto, existe a hipótese de que o direcionamento de ambos os mecanismos poderia levar simultaneamente a maiores reduções de ingestão de alimentos e perda de peso do que qualquer mecanismo sozinho. À combinação da farmacologia independente, porém complementar. de agonistas de GDF15 e GLP1 por fusão à albumina sérica humana for- necerá benefícios sobre a perda de peso, sensibilidade à insulina, se- creção de insulina e resultados cardiovasculares com uma única molé- cula totalmente recombinante adequada para administração uma vez por semana. Um grande desafio para essa abordagem será liberar ca-

da agonista dentro da molécula de uma maneira equilibrada que ative o receptor correspondente no nível desejado, o suficiente para alcan- çar todos os efeitos desejados, mas que evite efeitos adversos no al- vo. Esse equilíbrio pode ser aperfeiçoado mediante o ajuste da potên- cia e/ou das propriedades farmacocinéticas de qualquer braço agonis- ta da molécula.

[0075] Em um aspecto geral, a invenção se refere a proteínas de fusão de peptídeo semelhante ao glucagon 1 (GLP-1) / fator de dife- renciação de crescimento 15 (GDF15). As proteínas de fusão de GLP1/GDF15 compreendem um peptídeo GLP1 ou peptídeo GLP1 variante, um primeiro peptídeo ligante (por exemplo, um ligante amino (N)-terminal), uma proteína albumina sérica humana (HSA), um se- gundo peptídeo ligante (por exemplo, um ligante carbóxi (C)-terminal), e uma proteína GDF15 ou proteína variante GDF15. Peptídeo semelhante ao glucagon 1 (GLP-1) ou peptídeo GLP1 varian- te

[0076] O peptídeo semelhante ao glucagon 1 (GLP1) é um secre- tagogo de insulina sintetizado no intestino e liberado em resposta à ingestão de alimentos. Ele é secretado principalmente em duas for- mas, GLP1-(7-37) e GLP1-(7-36)NH>z, sendo que ambas se ligam a um receptor de GLP1 específico (GLP1R) encontrado em muitos tecidos incluindo a célula pancreática beta onde ele aumenta a secreção de insulina estimulada por glicose e no tronco cerebral onde ele controla a saciedade e o tamanho da refeição.

[0077] Vários análogos e derivados de GLP1 são conhecidos e podem ser chamados na presente invenção de "variantes de GLP1." Esses peptídeos variantes GLP1 podem incluir as exendinas, que são peptídeos encontrados no veneno do lagarto monstro-de-Gila. Essas exendinas têm homologia de sequência com o GLP1 nativo e podem se ligar ao receptor GLP1 e iniciar a resposta em cascata de transdu-

ção de sinal.

[0078] Foi demonstrado que os peptídeos GLP1 e os peptídeos variantes GLP1 atuam em uma variedade de formas, que podem inclu- ir, mas não se limitam a, estimulação da liberação de insulina, redução da secreção de glucagon, inibição do esvaziamento gástrico e aumen- to da utilização de glicose.

[0079] O GLP1R pertence à classe B da família de receptores acoplados à proteína G heterotrimérica com sete domínios transmem- branares e é expresso em uma ampla gama de tecidos incluindo, mas sem limitação, a-, B-, e d- células das ilhotas pancreáticas, coração, rim, estômago, intestino, neurônios do gânglio nodoso do nervo vago e várias regiões do sistema nervoso central (SNC) incluindo o hipotála- mo e tronco cerebral. O GLP1R pode se acoplar a Gas, Ga", Ga; e Gao (Montrose-Rafizadeh et al., Endocrinology 140:1132 a 1140 (1999); Hallbrink et al., Biochim Biophys Acta 1546: 79-86 (2001)) le- vando a aumentos no cálcio intracelular, adenilato ciclase e fosfolipase C, e ativação de PKA, PKC, PI-3K, Epac2, e das vias de transdução de sinal de MAPK (Drucker et al., PNAS 84:3434-8 (1987); Wheeler et al., Endrocrinology 133:57-62 (1993); e Holz et al., JBC 270:17749-57 (1995)).

[0080] São aqui fornecidas as proteínas de fusão de GLP1/GDF15 que compreendem um primeiro componente, sendo que o primeiro componente é um peptídeo GLP-1 ou um peptídeo variante GLP-1. Como usado aqui, os termos "peptídeo GLP1," "peptídeo GLP1 varian- te", "variante de peptídeo GLP1" e "peptídeo GLP1 ou peptídeo GLP1 variante" são usados de forma intercambiável. O peptídeo GLP1 ou o peptídeo GLP1 variante pode compreender uma das sequências for- necidas na Tabela 1. O peptídeo GLP1 ou o peptídeo GLP1 variante pode compreender ao menos 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 290%, 91%, 92%, 93%,

94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com uma das se- quências fornecidas na Tabela 1. A sequência de peptídeo GLP1 ou de peptídeo GLP1 variante pode ser escolhida com base em ao menos um dos seguintes critérios: (i) produtividade de expressão e pureza, (ii) estabilidade in vitro, (iii) potência in vitro, (iv) a retenção de potência in vitro em combinação com a proteína GDF15 ou a proteína variante GDF15, (v) falta de xilosilação de serina ou de potencial para xilosila- ção de serina, e (vi) propriedades das proteínas de fusão de GLP1/GDF15 (por exemplo, estabilidade in vivo, potência in vivo (isto é, se o peptídeo GPL1 ou o peptídeo GLP1 variante e a proteína GDF15 ou a proteína variante GDF15 podem ter atividade agonista sobre o receptor GLP1R e GDF15 (GFRAL), respectivamente)).

[0081] O peptídeo GLP1 ou os peptídeos variantes GLP1 que compõem o primeiro componente do peptídeo de fusão de GLP1 são destinados a abranger peptídeos que têm homologia e funcionalidade suficientes para o GLP1 nativo. O peptídeo GLP1 ou os peptídeos va- riantes GLP1 são projetados para ter a capacidade de ligação ao re- ceptor de GLP1 nos tecidos incluindo o pâncreas e o tronco cerebral, resultando na mesma via de sinalização e apresentando atividade fisiológica igual ou similar como quando o GLP1 nativo se liga ao re- ceptor GLP1 nos tecidos. Tabela 1: peptídeo semelhante ao glucagon-1e variantes do mesmo deo GLP1 variante (7-36)

PSSGAPPPS Primeiro peptídeo ligante: ligante amino-terminal (ligante N-terminal)

[0082] São aqui fornecidas as proteínas de fusão de GLP1/GDF15 que compreendem um segundo componente, sendo que o segundo componente é um primeiro peptídeo ligante (isto é, um peptídeo |i- gante amino-terminal). O primeiro peptídeo ligante pode compreender uma das sequências fornecidas na Tabela 2. O primeiro peptídeo li- gante pode compreender ao menos 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com uma das sequências fornecidas na Tabela 2.

[0083] O primeiro peptídeo ligante pode, por exemplo, compreen- der cerca de 5 a cerca de 60 resíduos de aminoácidos, cerca de 10 a cerca de 50 resíduos de aminoácidos, cerca de 10 a cerca de 60 resí- duos de aminoácidos, cerca de 5 a cerca de 50 resíduos de aminoáci- dos, cerca de 15 a cerca de 40 resíduos de aminoácidos, cerca de 12 a cerca de 30 resíduos de aminoácidos, cerca de 12 a cerca de 42 re- síduos de aminoácidos, cerca de 20 a cerca de 25 resíduos de amino- ácidos, cerca de 8 a cerca de 48 resíduos de aminoácidos, cerca de a cerca de 46 resíduos de aminoácidos, cerca de 12 a cerca de 44 resíduos de aminoácidos, cerca de 14 a cerca de 42 resíduos de ami- noácidos, cerca de 16 a cerca de 40 resíduos de aminoácidos, cerca de 18 a cerca de 38 resíduos de aminoácidos, cerca de 20 a cerca de 36 resíduos de aminoácidos, cerca de 20 a cerca de 42 resíduos de aminoácidos, cerca de 22 a cerca de 34 resíduos de aminoácidos, cer- ca de 24 a cerca de 32 resíduos de aminoácidos, cerca de 26 a cerca de 30 resíduos de aminoácidos, ou qualquer valor entre os mesmos. O primeiro peptídeo ligante pode compreender 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59 ou 60 resíduos de aminoácido.

[0084] Em certas modalidades, o primeiro peptídeo ligante pode conter uma repetição de alanina-prolina (isto é, uma repetição de AP),

sendo que um dipeptídeo de AP pode ser chamado de unidade de AP. A repetição de AP pode compreender 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 ou 27 unidades de AP. Em certas modalidades, o primeiro peptídeo ligante pode, por exemplo, compreender de 2 a 25 unidades de unidades de AP, de 5a 25 unidades, de 4 a 23 unidades de AP, de 6 a 21 unidades de AP, de 8 a 19 unidades de AP, de 10 a 17 unidades de AP, de 12 a 15 unida- des de AP, de 5 a 10 unidades de AP, de 5 a 15 unidades de AP, de a 25 unidades de AP, de 15 a 25 unidades de AP, de 20 a 25 uni- dades DE AP, ou qualquer valor entre os mesmos. Em certas modali- dades, a repetição de AP pode ser interna a um dipeptídeo de alanina- serina (isto é, uma unidade de AS) e um dipeptídeo de glicina-serina (isto é, uma unidade de GS). A unidade de AS pode, por exemplo, es- tar na extremidade amino terminal do primeiro peptídeo ligante. A uni- dade de GS pode, por exemplo, estar na extremidade terminal carboxi- la do primeiro peptídeo ligante.

[0085] Em certas modalidades, o primeiro peptídeo ligante pode conter uma repetição de glicina-glicina-glicina-glicina-serina (isto é, uma repetição G4S), sendo que um pentapeptídeo G4S pode ser cha- mado de unidade G.4S. A repetição G4S pode compreender 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 unidades de G4S. Em certas moda- lidades, o primeiro peptídeo ligante pode, por exemplo, compreender de 2 a 15 unidades G.S, de 4 a 13 unidades GS, de 6 a 11 unidades GS, de 8 a 9 unidades G.S, de 2 a 8 unidades G.S, de 2 a 6 unidades GS, de 6 a 8 unidades G.S, de 7 a 8 unidades G.S, de 7 a 9 unidades GS, de 7 a 10 unidades GS, ou qualquer valor entre os mesmos. Em certas modalidades, uma unidade de AS ou de GS pode, por exemplo, estar na extremidade amino terminal do primeiro peptídeo ligante.

[0086] Em certas modalidades, o primeiro peptídeo ligante pode conter uma repetição de glicina-glicina-glicina-glicina-alanina (isto é,

uma repetição de G4A), sendo que um pentapeptídeo G4A pode ser chamado de unidade de G.4A. A repetição de G4A pode compreender 2,3,4,5,6,7,8,9, 10,11, 12,13, 14 ou 15 unidades de G4A. Em cer- tas modalidades, o primeiro peptídeo ligante pode, por exemplo, com- preender de 2 a 15 unidades de G.aA, de 4 a 13 unidades de G4A, de 6 a 11 unidades de G.4A, de 8 a 9 unidades de G.4A, de 2 a 8 unidades de GaA, de 2 a 4 unidades de G4A, de 2 a 6 unidades de G4A, de 4a 8 unidades de GA, de 6 a 8 unidades de G.4A, de 6 a 9 unidades de G.4A, de 6 a 10 unidades de G.4A, ou qualquer entre os mesmos. Em certas modalidades, uma unidade de dipeptídeo de glicina-alanina (isto é, uma unidade GA) pode, por exemplo, estar na extremidade amino terminal do primeiro peptídeo ligante.

[0087] Em certas modalidades, o primeiro peptídeo ligante pode ser um peptídeo de poliglicina. O peptídeo de poliglicina pode compre- ender cerca de 6 a cerca de 50 resíduos de glicina, cerca de 10 a cer- ca de 45 resíduos de glicina, cerca de 15 a cerca de 40 resíduos de glicina, cerca de 20 a cerca de 35 resíduos de glicina, cerca de 25 a cerca de 30 resíduos de glicina, cerca de 20 a cerca de 25 resíduos de glicina, ou qualquer número entre os mesmos. O primeiro peptídeo |i- gante de poliglicina pode compreender 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 resí- duos de glicina.

[0088] A sequência do primeiro peptídeo ligante pode ser escolhi- da com base em ao menos um dos seguintes critérios: (i) produtivida- de de expressão e pureza, (ii) potência in vitro, (iii) estabilidade in vitro, (iv) falta de xilosilação de serina ou de potencial para xilosilação de serina, e (v) propriedades da proteína de fusão de GLP1/GDF15 (por exemplo, estabilidade in vivo, potência in vivo (isto é, se o peptídeo GLP1 ou o peptídeo GLP1 variante e a proteína GDF15 ou a proteína variante GDF15 podem ter atividade agonista sobre o GLPIR e o GDF15R (GFRAL), respectivamente)). Tabela 2: Primeiros peptídeos ligantes (peptídeo ligante N-terminal) Primeiro peptí- | Sequência de peptídeo deo ligante APAPAPAPAPAPAPAPAPAP e

APAPAPAPAPAPAPAPAPAPAPAPAPAPAP APAPAPAPAPAPAPAPAPAPAPAPAPAPAPAPAPAPAPAP |jg =| 1-5 APAPAPAPAPAPAPAPAPAPAPAPAPAPAPAPAPAPAPAP

APAPAPAPAP

ASAPAPAPAPAPAPAPAPAPAPGS 1-9 ASGGGEGSCECESCEGESCEGESCEGESCEGESEEGGEGS | 13

SGGGGES 111 GAGGGGAGEGGCAGEGGCAGEGGAGGGGAGGGGAGGGG | 15

AGGGGA GEGEGCGAGGGCGAGGGGAGEGGA GEGGCAGEGCAGEGEAGEGGAGEGGA

GEGGCGAGEGCAGEGEAGEGGAGEGGGAGGGGA 1-16 GEGEGCAGEGCAGEGEAGEGGAGEGGAGGGGAGGGGAGS | 20

GGGA GCECECECEGECGECECEGEGEÇÇE GCECECCEGECGECECECEGECGECEGEGÇ GECESCECESCEGESCEGESCEEGES

GECESCECGESCEGESCEGESCEGESCEEGES Proteína albumina sérica

[0089] São aqui fornecidas proteínas de fusão de GLP1/GDF15 que compreendem um terceiro componente, sendo que o terceiro componente é uma proteína albumina sérica (por exemplo, uma prote- íÍna albumina sérica humana (HSA) ou uma proteína albumina sérica de gorila (GSA)). A proteína albumina sérica humana nativa contém 35 resíduos de cisteína (Cys, C) que formam 17 ligações dissulfeto, com o resíduo Cys-34 sendo a única cisteína livre na molécula. Essa Cys- 34 livre demonstrou funcionar como um sequestrante de radicais li-

vres, mediante a captura de múltiplas espécies reativas de oxigênio (ROS, de "reactive oxygen species") e espécies reativas de nitrogênio (RNS, de "reactive nitrogen species") (Taverna et al., Ann. Intensive Care 3:4 (2013)). Esse Cys livre foi, dessa forma, mutado para serina (Ser) para minimizar o risco de heterogeneidade devido à oxidação.

[0090] A proteína albumina sérica pode compreender uma das se- quências fornecidas na Tabela 3. A proteína albumina sérica pode compreender ao menos 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 290%, 291%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com uma das sequências fornecidas na Tabela 3. A proteína albumina sérica pode ser escolhida com base em ao menos um dos seguintes critérios: (i) estabilidade in vitro (ii) potência in vitro, e (iii) propriedades da proteína de fusão de GLP1/GDF15 (por exemplo, estabilidade in vivo e potência in vivo (isto é, se o peptídeo GPL1 ou o peptídeo GLP1 variante e a proteína GDF15 ou proteína variante GDF15 podem ter atividade agonista so- bre o GLP1IR e o GDF15R, respectivamente)).

Tabela 3: Proteína albumina sérica Proteína de | Sequência de proteína extensão de meia-vida HSA (C34S) | DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQSPFEDHVKLV | 26

NEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGE MADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAF HDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQA ADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKORLKCASLQKFGERAFKA WAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECAD DRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMP ADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDY SVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEP OQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVS RNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPV SDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHAD ICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVE KCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGL

Tabela 3: -continuação- Proteína de | Sequência de proteína extensão de meia-vida GSA DAHKSEVAHRFKDLGEETFKALVLVAFAQYLQQSPFEDHVKLV | 27 (C34S) NEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGE

MADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAF HDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAARYKAAFTECCQA ADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKA WAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECAD DRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCLAEVENDEM PADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPD YSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEP QNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVS RNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPV SDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHAD ICTLSEKERQIKKQTALAELVKHKPKATKEQLKTVMDDFAAFVE

KCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGL Segundo peptídeo ligante: ligante carbóxi-terminal (ligante C-terminal)

[0091] São aqui fornecidas as proteínas de fusão de GLP1/GDF15 que compreendem um quarto componente, sendo que o quarto com- ponente é um segundo peptídeo ligante (isto é, um peptídeo ligante carbóxi-terminal). O segundo peptídeo ligante pode compreender uma das sequências fornecidas na Tabela 4. O segundo peptídeo ligante pode compreender ao menos 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com uma das se- quências fornecidas na Tabela 4.

[0092] O segundo peptídeo ligante pode, por exemplo, compreen- der cerca de 5 a cerca de 60 resíduos de aminoácidos, cerca de 10 a cerca de 50 resíduos de aminoácidos, cerca de 10 a cerca de 60 resí- duos de aminoácidos, cerca de 5 a cerca de 50 resíduos de aminoáci- dos, cerca de 15 a cerca de 40 resíduos de aminoácidos, cerca de 12 a cerca de 30 resíduos de aminoácidos, cerca de 12 a cerca de 42 re- síduos de aminoácidos, cerca de 20 a cerca de 25 resíduos de amino- ácidos, cerca de 8 a cerca de 48 resíduos de aminoácidos, cerca de

10 a cerca de 46 resíduos de aminoácidos, cerca de 12 a cerca de 44 resíduos de aminoácidos, cerca de 14 a cerca de 42 resíduos de ami- noácidos, cerca de 16 a cerca de 40 resíduos de aminoácidos, cerca de 18 a cerca de 38 resíduos de aminoácidos, cerca de 20 a cerca de 36 resíduos de aminoácidos, cerca de 20 a cerca de 42 resíduos de aminoácidos, cerca de 22 a cerca de 34 resíduos de aminoácidos, cer- ca de 24 a cerca de 32 resíduos de aminoácidos, cerca de 26 a cerca de 30 resíduos de aminoácidos, ou qualquer valor entre os mesmos. O segundo peptídeo ligante pode compreender 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59 ou 60 resíduos de aminoácido.

[0093] Em certas modalidades, o segundo peptídeo ligante pode conter uma repetição de alanina-prolina (isto é, uma repetição de AP), sendo que um dipeptídeo de AP pode ser chamado de unidade de AP. A repetição de AP pode compreender 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 ou 27 unidades de AP. Em certas modalidades, o segundo peptídeo ligante pode, por exemplo, compreender de 2 a 25 unidades de AP, de 5 a 25 unidades, de 4 a 23 unidades de AP, de 6 a 21 unidades de AP, de 8 a 19 unida- des de AP, de 10 a 17 unidades de AP, de 12 a 15 unidades de AP, de a 10 unidades, de 5 a 15 unidades, de 10 a 25 unidades, de 15 a 25 unidades, de 20 a 25 unidades, ou qualquer valor entre os mesmos. Em certas modalidades, a repetição de AP pode ser interna a um di- peptídeo de alanina-serina (isto é, uma unidade de AS) e um dipeptí- deo de glicina-serina (isto é, uma unidade de GS). A unidade de AS pode, por exemplo, estar na extremidade amino terminal do segundo peptídeo ligante. A unidade de GS pode, por exemplo, estar na extre- midade terminal carboxila do segundo peptídeo ligante.

[0094] Em certas modalidades, o segundo peptídeo ligante pode conter uma repetição de glicina-glicina-glicina-glicina-serina (isto é, uma repetição de G.S), sendo que um pentapeptídeo G4S pode ser chamado de unidade G.S. A repetição G14S pode compreender 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 unidades de G4S. Em certas mo- dalidades, o segundo peptídeo ligante pode, por exemplo, compreen- der de 2 a 15 unidades de G.S, de 4 a 13 unidades de G.S, de 6 a 11 unidades de GS, de 8 a 9 unidades de GS, de 2 a 8 unidades de GS, de 2 a 6 unidades de G.S, de 6 a 8 unidades de G.S, de 7 a 8 unidades de GS, de 7 a 9 unidades de GS, de 7 a 10 unidades de GS, ou qualquer valor entre os mesmos. Em certas modalidades, uma unidade de AS ou de GS pode, por exemplo, estar na extremidade amino terminal do segundo peptídeo ligante.

[0095] Em certas modalidades, o segundo peptídeo ligante pode conter uma repetição glicina-glicina-glicina-glicina-alanina (isto é, uma repetição de G4S), sendo que um pentapeptídeo G4A pode ser chama- do de unidade de GA. A repetição de G4A pode compreender 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 unidades de G4A. Em certas mo- dalidades, o segundo peptídeo ligante pode, por exemplo, compreender de 2 a 15 unidades de GaA, de 4 a 13 unidades de GA, de 6 a 11 unida- des de GA, de 8 a 9 unidades de G.aA, de 2 a 8 unidades de Gs$A, de 2 a 4 unidades de G.A, de 2 a 6 unidades de GA, de 4 a 6 unidades de G.A, de 4 a 8 unidades de G.4A, de 6 a 8 unidades de G.4A, de 6 a 9 unidades de GA, de 6 a 10 unidades de GA, ou qualquer valor entre os mesmos. Em certas modalidades, uma unidade de dipeptídeo de glicina-alanina (isto é, uma unidade de GA) pode, por exemplo, estar na extremidade amino terminal do segundo peptídeo ligante.

[0096] Em certas modalidades, o segundo peptídeo ligante pode ser um peptídeo de poliglicina. O peptídeo de poliglicina pode compreender cerca de 6 a cerca de 50 resíduos de glicina, cerca de 10 a cerca de 45 resíduos de glicina, cerca de 15 a cerca de 40 resíduos de glicina, cerca de 20 a cerca de 35 resíduos de glicina, cerca de 25 a cerca de 30 resí- duos de glicina, cerca de 20 a cerca de 25 resíduos de glicina, ou qual- quer número entre os mesmos. O segundo peptídeo ligante de poliglicina pode compreender 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 resíduos de glicina.

[0097] A segunda sequência de peptídeo ligante pode ser escolhi- da com base em ao menos um dos seguintes critérios: (i) produtivida- de de expressão e pureza, (ii) potência in vitro, (iii) estabilidade in vitro, (iv) falta de xilosilação de serina ou de potencial para xilosilação de serina, e (v) propriedades da proteína de fusão de GLP1/GDF15 (por exemplo, estabilidade in vivo, potência in vivo (isto é, se o peptídeo GLP1 ou peptídeo GLP1 variante e a proteína GDF15 ou a proteína variante GDF15 podem ter atividade agonista de GLP1IR e o GDF1I5R (GFRAL), respectivamente)). Tabela 4: Segundo peptídeo ligante (peptídeo ligante C-terminal) Segundo | Sequência de peptídeo ligante

GGGGA GGGs Proteína GDF15 ou proteína variante GDF15

[0098] O fator de diferenciação de crescimento 15 (GDF15) é uma proteína que pertence à superfamília beta de fator de crescimento de transformação (TGF-B). O GDF15 é uma proteína secretada que circu- la como um dímero de 25 kDa. O GDF15 também é chamado de fator derivado da próstata (PDF), citocina-1 inibidora de macrófagos (CIM- 1), gene ativado por NSAID (fármacos anti-inflamatórios não esteroi- dais) (NAG-1) e TGF-beta placentário (PTGFB).

[0099] A função do GDF15 ainda precisa ser completamente elu- cidada, mas tem sido implicada em múltiplos processos biológicos in- cluindo, mas não se limitando a, homeostase energética, regulação do peso corporal e caquexia induzida por câncer e doença crônica. O po- tencial de GDF15 farmacologicamente administrado para diminuir a ingestão de energia e, assim, induzir a perda de peso, foi demonstrado em camundongos, ratos e macacos. (Johnen et al., Nat Med 13:1333 a 1340 (2007), Hsu et al., Nature 550:255 a 259 (2017), Mullican et al., Nat Med 23:1150 a 1157 (2017), Tsai et al., Int J Obesity 42:561 a 571 (2018)). A perda de peso mediada pelo tratamento com GDF15 leva a melhorias metabólicas, incluindo aumento da homeostase da glicose e níveis mais baixos de triglicerídeos e colesterol (Xiong et al., Sci Trans Med 9:412 (2017)).

[0100] O GDF15 se liga ao receptor alfa semelhante da família GDNF (GFRAL), um receptor transmembranar situado exclusivamente em neurônios no tronco cerebral (Mullican et al., Hsu et al., Yang et al., Emmerson et al.). Após a ligação ao GDF15, o GFRAL forma comple- xos com RET, uma tirosina quinase que estimula uma cascata de fos- forilação intracelular a jusante que inclui a modificação pós-traducional de AKT, ERK e PLCy. Embora os componentes moleculares e celula- res adicionais dessa cascata permaneçam elucidados, o efeito final da sinalização de GDF15/GFRAL é a redução da ingestão de alimentos e a perda de peso (Mullican e Rangwala, 2018).

[0101] São aqui fornecidas as proteínas de fusão GLP1/GDF15 que compreendem um quinto componente, sendo que o quinto com- ponente é uma proteína GDF15 ou uma proteína variante GDF15. À proteína GDF15 pode compreender a sequência fornecida na Tabela 5, e uma proteína variante GDF15 pode compreender uma variante da sequência fornecida na Tabela 5. A proteína GDF15 ou a proteína va- riante GDF15 pode compreende ao menos 75%, 76%, 77%, 78%,

79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com uma das sequências fornecidas na Tabela 5. A sequência de pro- teína GDF15 e/ou de proteína variante GDF15 pode ser escolhida com base em ao menos um dos seguintes critérios: (i) produtividade de ex- pressão e pureza, (ii) estabilidade in vitro, (iii) potência in vitro, (iv) a retenção de potência in vitro em combinação com GLP1 ou com a pro- teína variante GLP1, (v) falta de xilosilação de serina ou de potencial para xilosilação de serina, e (vi) propriedades da proteína de fusão de GLP1/GDF15 (por exemplo, estabilidade in vivo, potência in vivo (isto é, se o peptídeo GPL1 ou peptídeo GLP1 variante e a proteína GDF15 ou a proteína variante GDF15 são capazes de ter atividade agonista sobre o receptor GLP1R e/ou GDF15R (GFRAL), respectivamente)).

[0102] O GDF15 ou as proteínas variantes de GDF15 que com- põem o quinto componente das proteínas de fusão de GLP1/GDF15 são destinados a abranger proteínas que têm homologia e funcionali- dade suficientes para ativar o GDF15R (GFRAL) nativo. As proteínas GDF15 ou as proteínas variantes GDF15 são projetados para ter ca- pacidade de ligação ao GFRAL no tronco cerebral, resultando na mesma via de sinalização e apresentando o mesmo impacto sobre a ingestão de alimentos como quando o GDF15 se liga ao GFRAL nes- ses neurônios. Tabela 5: Proteína GDF15 ou proteína variante GDF15 ou proteína variante GDF15 GDF15 MCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPA

SYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI duro EVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAP

CCVPASYNPMVLIQOKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI

Proteínas de fusão de GLP1/GDF15

[0103] São aqui fornecidas proteínas de fusão de GLP1/GDF15 que compreendem um primeiro, um segundo, um terceiro, um quarto e um quinto componentes, conforme descrito anteriormente. O primeiro componente é um peptídeo GLP1 ou peptídeo GLP1 variante, o se- gundo componente é um primeiro peptídeo ligante, o terceiro compo- nente é uma proteína albumina sérica, o quarto componente é um se- gundo peptídeo ligante, e o quinto componente é uma proteína GDF15 ou proteína variante GDF15. As proteínas de fusão de GLP1/GDF15 podem compreender uma das sequências fornecidas na Tabela 6. À proteína de fusão de GLP1/GDF15 pode compreender ao menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 294%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com uma das sequências fornecidas na Tabela 6. A proteína de fusão de GLP1/GDF15 pode ser escolhida com base em ao menos um dos seguintes critérios: (i) produtividade de expressão e pureza, (ii) potência in vitro, (iii) estabilidade in vitro, (iv) falta de xilosilação de serina, e (v) propriedades físicas da proteína de fusão de GLP1/GDF15 (por exemplo, estabilidade in vivo, potência in vivo (isto é, se o peptídeo GLP1 ou o peptídeo GLP1 variante e a proteína GDF15 ou a proteína variante GDF15 podem ter atividade agonista sobre o GLP1IR e o GDF15R, respectivamente)) e (vi) equilí- brio desejado da farmacologia dual de agonista in vivo.

[0104] Para um agente terapêutico de proteína de fusão que libera farmacologia dual em uma única molécula, é importante ajustar ade- quadamente as propriedades farmacocinéticas/farmacodinâmicas (PK/PD) de cada porção, de modo que ambos os agonistas estejam na faixa terapêutica com a dosagem pretendida. A investigação exaustiva de várias proteínas de fusão de peptídeo semelhante ao glucagon 1 (GLP-1) / fator de diferenciação de crescimento 15 (GDF15) compre- endendo várias combinações de uma sequência de peptídeo GLP1 ou de peptídeo GLP1 variante, uma sequência de primeiro peptídeo ligan- te, uma sequência de proteína albumina sérica, uma sequência de se- gundo peptídeo ligante, e uma sequência de proteína GDF15 ou de proteína variante GDF15 resultou na descoberta de moléculas inova- doras que possuem a propriedade exclusiva de liberar doses equili- bradas ideais tanto de agonistas de GLP1 quanto de GDF15. Foi de- monstrado que as proteínas de fusão de GLP1/GDF15 são tão efica- zes em ligar o GDF15R (GFRAL) in vivo quanto a HSA-GDF15, quan- do usadas em uma faixa de dose específica (consulte o Exemplo 11).

Além disso, as proteínas de fusão de GLP1/GDF15, usadas na mesma faixa de dose (consulte o Exemplo 11), foram inesperadamente tão eficazes na ativação do GLP1R quanto a dulaglutida (GLP1-Fc), e sem causar efeitos colaterais adversos, apesar de ter uma exposição da porção de GLP1 10 a 30 vezes maior que a da dulaglutida. A aplicação de peptídeos GLP1 como fusões com HSA-GDF15 alterou inespera- damente a potência in vivo da porção de GLP1 mas ainda assim pos- sibilitou que novas proteínas de fusão de peptídeo semelhante ao glu- cagon 1 (GLP-1) / fator de diferenciação de crescimento 15 (GDF15) tivessem um equilíbrio ideal de ambos os agonistas.

Tabela 6: Proteínas de fusão de GLP1/GDF15 Proteínas de Sequência de proteína fusão de GLP1/ GDF15 1 HGEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLVKGGGGGGAGGG | 33

GAGGGGAGGGGAGGGGADAHKSEVAHRFKDLGEENFK ALVLIAFAQYLQQSPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAE NCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERN ECFLOHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKY LYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACL LPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVA RLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADD RADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDE MPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYAR RHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDE FKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVP QVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSV VLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVD ETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKH KPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKK LVAASQAALGLAPAPAPAPAPAPAPAPAPAPDHCPLGPG RCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPS QFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQ

KTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI 2 HGEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLVKGGGGGGAGGG | 34

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TVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCH cl 7 HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS | 39

APAPAPAPAPAPAPAPAPAPAPAPAPAPAPAPAPAPAPA PAPAPAPAPAPDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQ YLQQSPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHT LFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKD DNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHP YFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRD EGKASSAKQRLKCASLQOKFGERAFKAWAVARLSQRFPK AEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYIC ENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSL AADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVV LLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEP QNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLV EVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVL HEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEF NAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQ LKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAA LGLAPAPAPAPAPAPAPAPAPAPDHCPLGPGRCCRLHTV RASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMH AQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSL

QTYDDLLAKDCHCI HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS | 40

APAPAPAPAPAPAPAPAPAPAPAPAPAPAPDAHKSEVAH RFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQSPFEDHVKLVNEVTEF AKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMA DCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTA FHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTE CCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKF GERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTEC CHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLE KSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKD VFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAA DPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQ NALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEA KRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLV NRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQ! KKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKAD DKETCFAEEGKKLVAASQAALGLAPAPAPAPAPAPAPAP APAPDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPRE VQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPC

CVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS | 41

APAPAPAPAPAPAPAPAPAPDAHKSEVAHRFKDLGEENF KALVLIAFAQYLQQSPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESA ENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPER NECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKK YLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAAC LLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAV ARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECAD DRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVEND EMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYA RRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFD EFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKV PQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLS VVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEV DETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVK HKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGK KLVAASQAALGLAPAPAPAPAPAPAPAPAPAPDHCPLGP GRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACP SQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLI

QKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS | 42

GGGGAGGGCGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGA GGGGADAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQOOS PFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKL CTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNL PRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAP ELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKAS

SAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEV SKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSI|

SSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVE SKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLA KTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQ NCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNL GKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPV SDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTF HADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMD DFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGLAPA PAPAPAPAPAPAPAPAPDHCPLGPGRCCRLHTVRASLED LGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSL HRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQOTYDDLL AKDCHCI GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGADAHKSEVAHRF KDLGEENFKALVLIAFAQYLQQSPFEDHVKLVNEVTEFAK TCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADC CAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFH DNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECC QAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGE RAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCH GDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKS HCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFL GMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPH ECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNAL LVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRM PCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRR PCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQ TALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKE TCFAEEGKKLVAASQAALGLAPAPAPAPAPAPAPAPAPA PDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQV TMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVP

ASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI 12 HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS | 44

APAPAPAPAPDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQY LQQSPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTL FGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKD DNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHP YFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRD EGKASSAKQRLKCASLQOKFGERAFKAWAVARLSQRFPK AEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYIC ENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSL AADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVV LLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEP QNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLV EVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVL HEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEF NAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQ LKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAA LGLAPAPAPAPAPAPAPAPAPAPDHCPLGPGRCCRLHTV RASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMH AQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSL QTYDDLLAKDCHCI

13 HGEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLVKGGAPAPAPAPA | 45

PAPAPAPAPAPDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQ YLQQSPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHT LFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKD DNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHP YFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRD EGKASSAKQRLKCASLQOKFGERAFKAWAVARLSQRFPK AEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYIC ENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSL AADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVV LLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEP QNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLV EVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVL HEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEF NAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQ LKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAA LGLAPAPAPAPAPAPAPAPAPAPDHCPLGPGRCCRLHTV RASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMH AQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSL

QTYDDLLAKDCHCI 14 HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS | 46

APAPAPAPAPDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQY LQQSPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTL FGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKD DNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHP YFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRD EGKASSAKQRLKCASLQOKFGERAFKAWAVARLSQRFPK AEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYIC ENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSL AADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVV LLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEP QNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLV EVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVL HEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEF NAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQ LKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAA LGLGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGA GGGGAGGGGADHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWAD WVLSPREVOQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKP

DTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDC a me HGEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLVKGGGGGGGGGG | 47

GGSCECEGECGESSESEGSSGSGGDAHKSEVAHRFKDLGEENF KALVLIAFAQYLQQSPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESA ENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPER NECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKK YLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAAC LLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAV ARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECAD DRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVEND EMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYA RRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFD EFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKV PQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLS VVLNQLCVLHEKTPVYSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEV DETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVK HKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGK KLVAASQAALGLGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGG GGAGGGGAGGGGAGGGGADHCPLGPGRCCRLHTVRA SLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQ IKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQOT

YDDLLAKDCHCI 16 HGEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLVKGGGGGGGGGG | 48

GGSGGEGGGGGGGGDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIA FAQYLQQSPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKS LHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQO HKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIAR RHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDE LRDEGKASSAKQRLKCASLQOKFGERAFKAWAVARLSQOR FPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAK YICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLP SLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYS VVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVE EPOQNLIKQONCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPT LVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLC VLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPK EFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATK EQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQ AALGLGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGG GAGGGGAGGGGADHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGW ADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRL KPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKD

CHCI 7 HGEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLVKGGGGGGAGGG | 49

GAGGGGAGGGGADAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAF AQYLQQASPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSL HTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQH KDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARR HPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDEL RDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQORF PKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAK YICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLP SLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYS VVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVE EPOQNLIKQONCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPT LVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLC VLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPK EFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATK EQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQ AALGLGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGG GAGGGGAGGGGADHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGW ADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRL KPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKD

CHCI 18 HGEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLVKGGGGGGAGGG | 50

GAGGGGAGGGGAGGGGADAHKSEVAHRFKDLGEENFK ALVLIAFAQYLOQSPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAE NCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERN ECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKY LYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACL LPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVA RLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADD RADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDE MPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYAR RHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDE FKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVP QVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSV VLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVD ETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKH KPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKK LVAASQAALGLGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGG GAGGGGAGGGGAGGGGADHCPLGPGRCCRLHTVRASL EDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIK TSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYD

DLLAKDCHCI 19 HGEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLVKGGGAGGGGAG | 51

GGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAD AHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQSPFEDHVK LVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLR ETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPE VDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAK RYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRL KCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTD LTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKE CCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCK NYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTL EKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFE QLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGS KCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVT KCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADIC TLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAF VEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGLGSGGGGS GGGESCEGESCEGESGCEGESGCEGESGEGESCGGGGES DHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVOVT MCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPA

SYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS | 52

GAGGGGAGGGGADAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAF AQYLQQASPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSL HTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQH KDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARR HPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDEL RDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQORF PKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAK YICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLP SLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYS VVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVE EPOQNLIKQONCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPT LVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLC VLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPK EFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATK EQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQ AALGLGSGGGGESCGGESGCEGESGGGESGEGESSCEG GSGGGGSCGESGESDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGW ADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRL KPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKD

CHCI 21 HGEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLVKGGGGGGAGGG | 53

GAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGADAHKSEVAHRFKDL GEENFKALVLIAFAQYLQOQSPFEDHVKLVNEVTEFAKTCV ADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAK QEPERNECFLOHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNE ETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAA DKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAF KAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDL LECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIA EVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMF LYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECY AKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVR YTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCA EDYLSVVLNQLCVLHEKTPVYSDRVTKCCTESLVNRRPCF SALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTAL VELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCF AEEGKKLVAASQAALGLGSGGGGSCGEGGSCEGGESCEG GSGGGESCSEGESGEGGESGGGGSDHCPLGPGRCCRLH TVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAAN MHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGV

SLQTYDDLLAKDCHCI 22 HGEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLVKGGGGGGAGGG | 54

GAGGGGAGGGGAGGGGADAHKSEVAHRFKDLGEENFK ALVLIAFAQYLOQSPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAE NCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERN ECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKY LYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACL LPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVA RLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADD RADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDE MPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYAR RHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDE FKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVP QVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSV VLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVD ETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKH KPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKK LVAASQAALGLGSGGGGSCSEGESCEGESCEGESCSG GSGGGCSCSGESGGGGSDHCPLGPGRCCRLHTVRASL EDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIK TSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYD

DLLAKDCHCI 23 HGEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLVKKGGGGGGSGGG | 55

GSGEGGESCSEGESGEGESGGEGSDAHKSEVAHRFKDL GEENFKALVLIAFAQYLQOQSPFEDHVKLVNEVTEFAKTCV ADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAK QEPERNECFLOHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNE ETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAA DKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAF KAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDL LECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIA EVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMF LYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECY AKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVR YTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCA EDYLSVVLNQLCVLHEKTPVYSDRVTKCCTESLVNRRPCF SALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTAL VELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCF AEEGKKLVAASQAALGLGSGGGGSCGEGGSCEGGESCEG GSGGGESCSEGESGEGGESGGGGSDHCPLGPGRCCRLH TVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAAN MHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGV

SLQTYDDLLAKDCHCI 24 HGEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLVKKGGGGGGSGGG | 56

GSGGGCGSCSGESGGGGSDAHKSEVAHRFKDLGEENFK ALVLIAFAQYLOQSPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAE NCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERN ECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKY LYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACL LPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQOKFGERAFKAWAVA RLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADD RADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDE MPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYAR RHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDE FKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVP QVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSV VLNQLCVLHEKTPVYSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVD ETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKH KPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKK LVAASQAALGLGSGGGGSCCGSCESCSCGGESCEGGESCGEGÇ GSGGCGGSCSCGSCSSGGSPDHCPLGPGRCCRLHTVRASL EDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIK TSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQOTYD

DLLAKDCHCI HGEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLVKGGASAPAPAPA | 57

PAPAPAPAPAPAPGSDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLI AFAQYLQQSPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDK SLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFL QHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIA RRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLD ELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQ RFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADL AKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPA DLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHP DYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKP LVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVS TPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLN QLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETY VPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPK ATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVA ASQAALGLGSGGGGSCSGESCSGESCSEGESCSGESE GGGSCGECESCSGGESPDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDL GWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSL HRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQOTYDDLL AKDCHCI GGESCGSEGSCSEGESGCEGESGGGESGEGESGGGGSD AHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQSPFEDHVK LVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLR ETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPE VDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAK RYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRL KCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTD LTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKE CCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCK NYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTL EKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFE QLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGS KCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVT KCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADIC TLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAF VEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGLGSGGGGS GGGESCEGESCEGESGCEGESGCEGESGEGESCGGGGES DHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVOVT MCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPA

SYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI 27 HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS | 59

ASGGGGSCECECGSCSEGESCGGESGGGESCGEGESCEG GSGGGGSDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQ QSPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFG DKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDN PNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYF YAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEG KASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEF AEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQ DSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAAD FVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLL RLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPOQNL IKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVS RNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEK TPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAE TFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKA VMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGL GSGEGGESCEGESCEGESCSEGSCGGESCGGESCSEGS GSGGGGSDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVL

SPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTV | 2 irreameninamamanmatas 28 HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS

ASAPAPAPAPAPAPAPAPAPAPGSDAHKSEVAHRFKDLG EENFKALVLIAFAQYLOQSPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVA DESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQ EPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEET FLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAAD KAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFK AWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLL ECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAE VENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFL YEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYA KVFDEFKPLVEEPOQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRY TKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAE DYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFS ALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALV ELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFA EEGKKLVAASQAALGLGSGGGGSCGGESCSEGESCSEGGÇE SGGEEGSCEGESGEGESGGGESDHCPLGPGRCCORLHT VRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANM HAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVS

LQTYDDLLAKDCHCI 29 HSEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIEWLVKGRASAPAPAPA | 61

PAPAPAPAPAPAPGSDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLI AFAQYLQOQSPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDK SLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFL QHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIA RRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLD ELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQ RFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADL AKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPA DLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHP DYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKP LVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVS TPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLN QLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETY VPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPK ATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVA ASQAALGLGSGGGESCSSGESGCEGESCEGESGGGESGS GGGSGGGGSGCSGGESDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDL GWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSL HRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLL

AKDCHCI HSEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIEWLVKGRASGGGGSG | 62

GGESCGSEGSCSEGESGCEGESGGGESGEGESGGGGSD AHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQSPFEDHVK LVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLR ETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPE VDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAK RYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRL KCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTD LTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKE CCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCK NYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTL EKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFE QLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGS KCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVT KCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADIC TLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAF VEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGLGSGGGGS GGGESCEGESCEGESGCEGESGCEGESGEGESCGGGGES DHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVOVT MCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPA

SYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI 31 HGEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLVKGGGGGGSGGG | 63

GSGGGGSDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQ QSPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFG DKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDN PNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYF YAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEG KASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEF AEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQ DSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAAD FVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLL RLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPOQNL IKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVS RNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEK TPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAE TFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKA VMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGL GSGEGGESCEGESCEGESCSEGSCGGESCGGESCSEGS GSGGGGSDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVL SPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTV

PAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI 32 HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS | 64

GGGEGESGCEGESGEGGESDAHKSEVAHRFKDLGEENFKAL VLIAFAQYLOQSPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENC DKSLHTLFGDKLCTVATLRETY GEMADCCAKQEPERNEC FLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLY EIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLP KLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARL SQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRA DLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMP ADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRH PDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFK PLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQV STPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVL NQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDET YVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKP KATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLV AASQAALGLGSGGGGSCEGESCEGESGGGESCGGGGES GGGEGSGCEGESGEGESDHCPLGPGRCCRLHTVRASLED LGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSL HRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLL

AKDCHCI 33 HSEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIEWLVKGRASGGGGSG |65

GGGSDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQOQSP FEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKL CTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNL PRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAP ELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKAS

SAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEV SKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDS|

SSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVE SKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLA KTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQ NCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNL GKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPV SDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTF HADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMD DFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGLGSG GGEGSCGSEGSCSEGESCEGESCGGESCEGESCGEGESSE GGGSDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPR EVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAP

CCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI 34 HSEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIEWLVKGRASAPAPAPA

PAPGSDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQOQOSP FEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKL CTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNL PRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAP ELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKAS

SAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEV SKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDS|

SSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVE SKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLA KTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQ NCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNL GKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPV SDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTF HADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMD DFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGLGSG GGEGSCGSEGSCSEGESCEGESCGGESCEGESCGEGESSE GGGSDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPR EVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAP

CCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS | 67

ASGGGGSGGGGSDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAF AQYLQQASPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSL HTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQH KDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARR HPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDEL RDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQORF PKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAK YICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLP SLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYS VVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVE EPOQNLIKQONCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPT LVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLC VLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPK EFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATK EQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQ AALGLGSGGGGESCGGESGCEGESGGGESGEGESSCEG GSGGGGSCGESGESDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGW ADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRL KPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKD

CHCI 36 HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS

ASAPAPAPAPAPGSDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIA FAQYLQQSPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKS LHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQO HKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIAR RHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDE LRDEGKASSAKQRLKCASLQOKFGERAFKAWAVARLSQOR FPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAK YICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLP SLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYS VVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVE EPOQNLIKQONCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPT LVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLC VLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPK EFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATK EQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQ AALGLGSGGGGESCGGESGCEGESGGGESGEGESSCEG GSGGGGSCGESGESDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGW ADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRL KPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKD

CHCI 37 HGEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLVKGGASGGGGSG

GGGSDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQOQSP FEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKL CTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNL PRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAP ELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKAS SAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEV

SKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDS|

SSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVE SKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLA KTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQ NCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNL GKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPV SDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTF HADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMD DFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGLGSG GGEGSCGSEGSCSEGESCEGESCGGESCEGESCGEGESSE GGGSDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPR EVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAP

CCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI 38 HGEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLVKGGASAPAPAPA | 70

PAPGSDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQOQOSP FEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKL CTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNL PRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAP ELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKAS

SAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEV SKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDS|

SSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVE SKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLA KTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQ NCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNL GKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPV SDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTF HADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMD DFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGLGSG GGEGSCGSEGSCSEGESCEGESCGGESCEGESCGEGESSE GGGSDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPR EVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAP

CCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI 39 HSEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIEWLVKGRGGGGSGGG | 71

GSGGGGSDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQ QSPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFG DKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDN PNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYF YAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEG KASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEF AEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQ DSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAAD FVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLL RLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPOQNL IKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVS RNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEK TPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAE TFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKA VMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGL GSGEGGESCEGESCEGESCSEGSCGGESCGGESCSEGS GSGGGGSDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVL SPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTV

PAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI 40 HGEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLVKGGGGGGSGGG | 72

GSGGGGSDAHKSEVAHRFKDLGEETFKALVLVAFAQYLQ QSPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFG DKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDN PNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYF YAPELLFFAARYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEG KASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEF AEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQ DSISSKLKECCEKPLLEKSHCLAEVENDEMPADLPSLAAD FVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLL RLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPOQNL IKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVS RNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEK TPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAE TFTFHADICTLSEKERQIKKQTALAELVKHKPKATKEQLKT VMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGL GSGEGGESCEGESCEGESCSEGSCGGESCGGESCSEGS GSGGGGSDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVL SPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTV

PAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI 41 HGEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLVKGGGGGGSGGG | 73

GSGGGGSDAHKSEVAHRFKDLGEETFKALVLVAFAQYLQ QSPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFG DKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDN PNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYF YAPELLFFAARYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEG KASSAKORLKCASLOKFGERAFKAWAVARLSORFPKAEF AEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQ DSISSKLKECCEKPLLEKSHCLAEVENDEMPADLPSLAAD FVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLL RLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNL IKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVS RNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEK TPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAE TFTFHADICTLSEKERQIKKOTALAELVKHKPKATKEQLKT VMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGL GSCEGESCEGESCEGESCEGESCCGESCGEGESCEG GSGEGGESDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVL SPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTV

PAPCCVPASYNPMVLRQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI 42 EGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLVKGGGGGGSGGGGS | 74

GGGGSDAHKSEVAHRFKDLGEETFKALVLVAFAQYLQAOS PFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKL CTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNL PRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAP ELLFFAARYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKAS SAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEV SKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSI! SSKLKECCEKPLLEKSHCLAEVENDEMPADLPSLAADFV ESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRL AKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIK QNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSR NLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKT PVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAET FTFHADICTLSEKERQIKKQTALAELVKHKPKATKEQLKTV MDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGLG SECEEGESCECESCECECESCEGESCEGESCEGESCEGGE SGGGEGSDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLS PREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVP

APCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI Polinucleotídeos de fusão de GLP1/GDF15 e vetores

[0105] Em um outro aspecto geral, a invenção se refere a um ácido nucleico isolado que codifica as proteínas de fusão de GLP1/GDF15 da invenção. Será entendido pelos versados na técnica que a sequência de codificação de uma proteína pode ser alterada (por exemplo, subs- tituída, deletada, inserida, etc.) sem alterar a sequência de aminoáci- dos da proteína. Consequentemente, será entendido pelos versados na técnica que sequências de ácido nucleico que codificam as proteí- nas de fusão da invenção podem ser alteradas sem modificar as se- quências de aminoácidos das proteínas.

[0106] Em um outro aspecto geral, a invenção se refere a um vetor que compreende um ácido nucleico isolado que codifica uma proteína de fusão da invenção. Qualquer vetor conhecido pelos versados na técnica, em vista da presente revelação, pode ser usado, como um plasmídeo, cosmídeo, um vetor de fago ou um vetor viral. Em algumas modalidades, o vetor é um vetor de expressão recombinante como um plasmídeo. O vetor pode incluir qualquer elemento para estabelecer uma função convencional de um vetor de expressão, por exemplo, um promotor, elemento de ligação ao ribossoma, terminador, intensifica- dor, marcador de seleção e origem de replicação. O promotor pode ser um promotor constitutivo, induzível ou reprimível. Vários vetores de expressão capazes de liberar ácidos nucleicos para uma célula são conhecidos na técnica e podem ser usados na presente invenção para a produção de uma proteína de fusão na célula. Técnicas de clonagem convencionais ou síntese de gene artificiais podem ser usadas para gerar um vetor de expressão recombinante de acordo com as modali- dades da invenção.

[0107] Em um outro aspecto geral, a invenção se refere a uma cé- lula hospedeira que compreende um ácido nucleico isolado que codifi- ca uma proteína de fusão da invenção. Qualquer célula hospedeira conhecida pelos versados na técnica em vista da presente revelação pode ser utilizada para a expressão recombinante de proteínas de fu- são da invenção. Em algumas modalidades, as células hospedeiras são células de E. coli TG1 ou BL21, células CHO-DG44 ou células CHO-K1 ou células HEK293. De acordo com modalidades específicas, o vetor de expressão recombinante é transformado em células hospe- deiras por métodos convencionais como transfecção química, choque térmico, ou eletroporação, onde ele é integrado de maneira estável ao genoma da célula hospedeira, de modo que o ácido nucleico recombi- nante é expresso de forma eficaz.

[0108] Em um outro aspecto geral, a invenção se refere a um mé- todo de produção de uma proteína de fusão da invenção, que compre- ende cultivar uma célula que compreende um ácido nucleico que codi- fica a proteína de fusão sob condições para produzir uma proteína de fusão da invenção, e recuperar a proteína de fusão da célula ou da cultura celular (por exemplo, do sobrenadante). As proteínas de fusão expressas podem ser coletadas das células e purificadas de acordo com técnicas convencionais conhecidas na técnica e conforme des- crito na presente invenção. Composições farmacêuticas

[0109] Em um outro aspecto geral, a invenção se refere a uma composição farmacêutica que compreende as proteínas de fusão de GLP1/GDF15 e/ou os polinucleotídeos de fusão de GLP1/GDF15 da invenção e um veículo farmaceuticamente aceitável. O termo "compo- sição farmacêutica", como usado aqui, significa um produto que com- preende proteínas de fusão de GLP1/GDF15 e/ou polinucleotídeos de fusão de GLP1/GDF15 da invenção em conjunto com um veículo far- maceuticamente aceitável. As proteínas de fusão de GLP1/GDF15 e/ou os polinucleotídeos de fusão de GLP1/GDF15 da invenção e as composições que os compreendem também são úteis na fabricação de um medicamento para aplicações terapêuticas mencionadas na presente invenção.

[0110] Como usado na presente invenção, o termo "veículo" se refere a qualquer excipiente, diluente, carga, sal, tampão, estabilizan- te, solubilizante, óleo, lipídio, vesícula contendo lipídio, microesfera, encapsulação em lipossomas ou outro material bem conhecido na téc- nica para uso em formulações farmacêuticas. Deve-se compreender que as características do veículo, excipiente ou diluente dependerão da via de administração para uma aplicação específica. Como usado aqui, o termo "veículo farmaceuticamente aceitável" se refere a um material não tóxico que não interfere com a eficácia de uma composi- ção de acordo com a invenção ou com a atividade biológica de uma composição de acordo com a invenção. De acordo com modalidades específicas, em vista da presente revelação, qualquer veículo farma- ceuticamente aceitável adequado ao uso em uma composição farma- cêutica de peptídeo pode ser usado na invenção.

[0111] Sais ácidos/aniônicos farmaceuticamente aceitáveis, para uso na presente invenção, incluem, porém não se limitam a, acetato, benzenossulfonato, benzoato, bicarbonato, bitartarato, brometo, edeta- to de cálcio, cansilato, carbonato, cloreto, citrato, dicloridrato, edetato, edisilato, estolato, esilato, fumarato, gliceptato, gluconato, glutamato, glicolilarsanilato, hexilresorcinato, hidrabamina, bromidrato, cloridrato, hidróxi naftoato, iodeto, isetionato, lactato, lactobionato, malato, malea- to, mandelato, mesilato, metilbrometo, metilnitrato, metilsulfato, muca- to, napsilato, nitrato, pamoato, pantotenato, fosfato/difospato, poliga- lacturonato, salicilato, estearato, subacetato, succinato, sulfato, tanato, tartarato, teoclato, tosilato e trietiodeto. Ácidos orgânicos ou inorgâni- cos incluem também, e não se limitam a, ácido hidriódico, perclórico, sulfúrico, fosfórico, propiônico, glicólico, metanossulfônico, hidroxieta- nossulfônico, oxálico, 2-naftalenossulfônico, p-toluenossulfônico, ciclo- hexanossulfâmico, sacarínico ou trifluoro acético.

[0112] Sais básicos/catiônicos farmaceuticamente aceitáveis in- cluem, porém não se limitam a alumínio, 2-amino-2-hidróxi-metil-pro-

pano-1,3-diol (também conhecido como tris(hidróxi-metil)aminome- tano, trometano ou "TRIS"), amônia, benzatina, t-butilamina, cálcio, cloroprocaína, colina, ciclo-hexilamina, dietanolamina, etilenodiamina, lítio, L-lisina, magnésio, meglumina, N-metil-D-glucamina, piperidina, potássio, procaína, quinina, sódio, trietanolamina ou zinco.

[0113] Em algumas modalidades da invenção, são fornecidas for- mulações farmacêuticas que compreendem os as proteínas de fusão de GLP1/GDF15 e/ou os polinucleotídeos de fusão de GLP1/GDF15 da invenção em uma quantidade de cerca de 0,001 mg/ml a cerca de 100 mg/ml, de cerca de 0,01 mg/ml a cerca de 50 mg/ml, ou de cerca de 0,1 mg/ml a cerca de 25 mg/ml. A formulação farmacêutica pode ter um pH de cerca de 3,0 a cerca de 10, por exemplo, de cerca de 3 a cerca de 7, ou de cerca de 5 a cerca de 9. A formulação pode compre- ender adicionalmente ao menos um ingrediente selecionado do grupo que consiste em um sistema tampão, conservante (ou conservantes), agente de tonicidade (ou agentes de tonicidade), agente quelante (ou agentes quelantes), estabilizante (ou estabilizantes) e tensoativo (ou tensoativos).

[0114] A formulação de ingredientes farmaceuticamente ativos com veículos farmaceuticamente aceitáveis é conhecida na técnica, por exemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy (por exemplo, 21º edição (2005), e quaisquer edições posteriores). Exem- plos não limitadores de ingredientes adicionais incluem: tampões, dilu- entes, solventes, agentes reguladores de tonicidade, conservantes, estabilizantes e agentes quelantes. Um ou mais veículos farmaceuti- camente aceitáveis podem ser usados na formulação das composi- ções farmacêuticas da invenção.

[0115] Em uma modalidade da invenção, a composição farmacêu- tica é uma formulação líquida. Um exemplo preferencial de uma formu- lação líquida é uma formulação aquosa, isto é, uma formulação que compreende água. A formulação líquida pode compreender uma solu- ção, uma suspensão, uma emulsão, uma microemulsão, um gel e simi- lares. Uma formulação aquosa compreende tipicamente ao menos 50% em peso/peso de água, ou ao menos 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou ao menos 95% em peso/peso de água.

[0116] Em uma modalidade, a composição farmacêutica pode ser formulada como um injetável que pode ser administrado, por exemplo, por meio de um dispositivo de injeção (por exemplo, uma seringa ou uma bomba de infusão). A injeção pode ser administrada por via sub- cutânea, intramuscular, intraperitoneal ou intravenosa, por exemplo.

[0117] Em uma outra modalidade, a composição farmacêutica é uma formulação sólida, por exemplo, uma composição secada por congelamento ou secada por atomização, que pode ser usada na for- ma em que se encontra, ou à qual o médico ou o paciente adiciona solventes, e/ou diluentes antes do uso. As formas sólidas de dosagem podem incluir comprimidos, como comprimidos compactados, e/ou comprimidos revestidos, e cápsulas (por exemplo, cápsulas de gelati- na duras ou moles). A composição farmacêutica pode também estar sob a forma de sachês, drágeas, pós, grânulos, pastilhas ou pós para reconstituição, por exemplo.

[0118] As formas de dosagem podem ser de liberação imediata, e neste caso elas podem compreender um veículo solúvel ou dispersível em água, ou podem ser de liberação retardada, liberação prolongada ou liberação modificada, e neste caso elas podem compreender polí- meros insolúveis em água que regulam a taxa de dissolução da forma de dosagem no trato gastrointestinal.

[0119] Em outras modalidades, a composição farmacêutica pode ser administrada por via intranasal, intrabucal ou sublingual.

[0120] O pH em uma formulação aquosa pode estar entre pH 3 e pH 10. Em uma modalidade da invenção, o pH da formulação é de cerca de 7,0 a cerca de 9,5. Em uma outra modalidade da invenção, o pH da formulação é de cerca de 3,0 a cerca de 7,0.

[0121] Em uma outra modalidade da invenção, a composição far- macêutica compreende um tampão. Exemplos não limitadores de tam- pões incluem: arginina, ácido aspártico, bicina, citrato, hidrogenofosfa- to dissódico, ácido fumárico, glicina, glicilglicina, histidina, lisina, ácido maleico, ácido málico, acetato de sódio, carbonato de sódio, di- hidrogenofosfato de sódio, fosfato de sódio, succinato, ácido tartárico, tricina e tris(hidroximetil)-aminometano, e misturas dos mesmos. O tampão pode estar presente individualmente ou em um agregado, a uma concentração de cerca de 0,01 mg/mL a cerca de 50 mg/mL, por exemplo, de cerca de 0,1 mg/mL a cerca de 20 mg/mL. As composi- ções farmacêuticas que compreendem cada um desses tampões es- pecíficos constituem modalidades alternativas da invenção.

[0122] Em uma outra modalidade da invenção, a composição far- macêutica compreende um conservante. Exemplos não limitadores de conservantes incluem: cloreto de benzetônio, ácido benzoico, álcool benzílico, bronopol, 4-hidroxibenzoato de butila, clorobutanol, clorocre- sol, clorexidina, clorfenesina, o-cresol, m-cresol, p-cresol, 4-hidroxiben- zoato de etila, imidureia, 4-hidroxibenzoato de metila, fenol, 2-feno- xietanol, 2-feniletanol, 4-hidroxibenzoato de propila, desidroacetato de sódio, timerosal, e misturas dos mesmos. O conservante pode estar presente individualmente ou em um agregado, a uma concentração de cerca de 0,01 mg/mL a cerca de 50 mg/mL, por exemplo, de cerca de 0,1 mg/mL a cerca de 20 mg/mL. As composições farmacêuticas que compreendem cada um desses conservantes específicos constituem modalidades alternativas da invenção.

[0123] Em outra modalidade da invenção, a composição farmacêu- tica compreende um agente isotônico. Exemplos não limitadores da modalidade incluem um sal (como cloreto de sódio), um aminoácido

(como glicina, histidina, arginina, lisina, isoleucina, ácido aspártico, triptofano e treonina), um alditol (como glicerol, 1,2-propanodiol propi- leno glicol), 1,3-propanodiol e 1,3-butanodiol), polietileno glicol (por exemplo, PEG400) e misturas dos mesmos. Outro exemplo de um agente isotônico inclui um açúcar. Exemplos não limitadores de açúca- res podem ser mono-, di-, ou polissacarídeos, ou glucanos solúveis em água, incluindo por exemplo frutose, glicose, manose, sorbose, xilose, maltose, lactose, sacarose, trealose, dextrano, pululano, dextrina, ci- clodextrina, alfa e beta- HPCD, amido solúvel, hidróxi etil amido e car- boximetilcelulose de sódio. Um outro exemplo de um agente isotônico é um álcool de açúcar, sendo que o termo "álcool de açúcar" é definido como um hidrocarboneto C(4 a 8) que tem ao menos um grupo -OH. Exemplos não limitadores de álcoois de açúcar incluem manitol, sorbi- tol, inositol, galactitol, dulcitol, xilitol e arabitol. As composições farma- cêuticas compreendendo cada agente isotônico mencionado neste pa- rágrafo constituem modalidades alternativas da invenção. O agente isotônico pode estar presente individualmente ou em um agregado, a uma concentração de cerca de 0,01 mg/mL a cerca de 50 mg/mL, por exemplo, de cerca de 0,1 mg/mL a cerca de 20 mg/mL. As composi- ções farmacêuticas que compreendem cada um desses agentes isotô- nicos específicos constituem modalidades alternativas da invenção.

[0124] Em outra modalidade da invenção, a composição farmacêu- tica compreende um agente quelante. Exemplos não limitadores de agentes quelantes incluem ácido cítrico, ácido aspártico, sais de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), e misturas dos mesmos. O agente quelante pode estar presente individualmente ou em um agregado, a uma concentração de cerca de 0,01 mg/mL a cerca de 50 mg/mL, por exemplo, de cerca de 0,1 mg/mL a cerca de 20 mg/mL. As composi- ções farmacêuticas que compreendem cada um desses agentes que- lantes específicos constituem modalidades alternativas da invenção.

[0125] Em uma outra modalidade da invenção, a composição far- macêutica compreende um estabilizante. Exemplos não limitadores de estabilizantes incluem um ou mais inibidores de agregação, um ou mais inibidores de oxidação, um ou mais tensoativos e/ou um ou mais inibidores de protease.

[0126] Em outra modalidade da invenção, a composição farmacêu- tica compreende um estabilizante, sendo que o dito estabilizante é carbóxi-/hidroxicelulose e derivados do mesmo (como HPC, HPC-SL, HPC-I e HPMC), ciclodextrinas, 2-metiltioetanol, polietileno glicol (co- mo PEG 3350), álcool polivinílico (PVA), polivinilpirrolidona, sais (tais como cloreto de sódio), substâncias contendo enxofre, como monotio- glicerol) ou ácido tioglicólico. O estabilizante pode estar presente indi- vidualmente ou em um agregado, a uma concentração de cerca de 0,01 mg/mL a cerca de 50 mg/mL, por exemplo, de cerca de 0,1 mg/mL a cerca de 20 mg/mL. As composições farmacêuticas que compreen- dem cada um desses estabilizantes específicos constituem modalida- des alternativas da invenção.

[0127] Em modalidades adicionais da invenção, a composição farmacêutica compreende um ou mais tensoativos, de preferência, um tensoativo, ao menos um tensoativo, ou dois tensoativos diferentes. O termo "tensoativo" se refere a quaisquer moléculas ou íons que são compostos por uma parte solúvel em água (hidrofílica) e uma parte solúvel em gordura (lipofílica). O tensoativo pode, por exemplo, ser selecionado do grupo que consiste em tensoativos aniônicos, tensoati- vos catiônicos, tensoativos não iônicos, e/ou tensoativos zwiteriônicos. O tensoativo pode estar presente individualmente ou em um agregado, a uma concentração de cerca de 0,1 mg/mL a cerca de 20 mg/mL. As composições farmacêuticas que compreendem cada um desses ten- soativos específicos constituem modalidades alternativas da invenção.

[0128] Em uma outra modalidade da invenção, a composição far-

macêutica compreende um ou mais inibidores da protease, como, por exemplo, EDTA e/ou ácido clorídrico (HCI) benzamidina. O inibidor de protease pode estar presente individualmente ou em um agregado, a uma concentração de cerca de 0,1 mg/mL a cerca de 20 mg/mL. As composições farmacêuticas que compreendem cada um desses inibi- dores de protease específicos constituem modalidades alternativas da invenção.

[0129] A composição farmacêutica da invenção pode compreender uma quantidade de uma base de aminoácido suficiente para diminuir a formação de agregado do polipeptídeo durante o armazenamento da composição. O termo "base de aminoácido" se refere a um ou mais aminoácidos (como metionina, histidina, imidazol, arginina, lisina, iso- leucina, ácido aspártico, triptofano, treonina), ou análogos dos mes- mos. Qualquer aminoácido pode estar presente em sua forma de base livre ou em sua forma de sal. Qualquer estereoisômero (isto é, L, D ou uma mistura dos mesmos) da base de aminoácido pode estar presen- te. A base de aminoácido pode estar presente individualmente ou em combinação com outras bases de aminoácido, a uma concentração de cerca de 0,01 mg/mL a cerca de 50 mg/mL, por exemplo, de cerca de 0,1 mg/mL a cerca de 20 mg/mL. As composições farmacêuticas que compreendem cada uma dessas bases de aminoácido específicas constituem modalidades alternativas da invenção.

[0130] Os sais farmaceuticamente aceitáveis das proteínas de fusão de GLP1/GDF15 e/ou dos polinucleotídeos de fusão de GLP1/GDF15 da invenção incluem os sais não tóxicos convencionais ou os sais de amônio quaternário que são formados a partir de bases ou ácidos inorgânicos ou orgânicos. Exemplos de tais sais de adição ácida inclu- em acetato, adipato, benzoato, benzenossulfonato, citrato, canforato, dodecilsulfato, cloridrato, bromidrato, lactato, maleato, metanossulfo- nato, nitrato, oxalato, pivalato, proprionato, succinato, sulfato e tartara-

to. Os sais de base incluem sais de amônio, sais de metais alcalinos, como sais de sódio e de potássio, sais de metais alcalinoterrosos, co- mo sais de cálcio e magnésio, sais com bases orgânicas, como sais de diciclo-hexilamino e sais com aminoácidos, como arginina. Ade- mais, os grupos contendo nitrogênio básico podem ser quaternizados com haletos de alquila, por exemplo.

[0131] As composições farmacêuticas da invenção podem ser ad- ministradas por quaisquer meios que desempenhem seu propósito previsto. Exemplos incluem administração por via parenteral, subcutâ- nea, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, transdérmica, bucal ou ocular. A administração pode ser realizada por via oral. Formulações adequadas para a administração parenteral incluem soluções aquosas dos conjugados ativos em forma solúvel em água, por exemplo, sais solúveis em água, soluções ácidas, soluções alcalinas, soluções de dextrose-água, soluções isotônicas de carboidrato e complexos de in- clusão de ciclodextrina.

[0132] A presente invenção abrange, também, um método de pro- dução de uma composição farmacêutica que compreende a mistura de um veículo farmaceuticamente aceitável com qualquer uma das prote- íÍnas de fusão de GLP1/GDF15 e/ou dos polinucleotídeos de fusão de GLP1/GDF15 da presente invenção. Adicionalmente, a presente in- venção inclui composições farmacêuticas produzidas através da mistu- ra de um ou mais veículos farmaceuticamente aceitáveis com qualquer uma das proteínas de fusão GLP1/GDF15 e/ou dos polinucleotídeos de GLP1/GDF15 da presente invenção.

[0133] Além disso, as proteínas de fusão de GLP1/GDF15 e/ou os polinucleotídeos de fusão de GLP1/GDF15 da presente invenção po- dem ter uma ou mais formas cristalinas polimorfas ou amorfas e, como tal, são destinados à inclusão no escopo da invenção. Além disso, as proteínas de fusão de GLP1/GDF15 e/ou os polinucleotídeos de fusão de GLP1/GDF15 podem formar solvatos, por exemplo, com água (isto é, hidratos) ou solventes orgânicos comuns. Como usado aqui, o ter- mo "solvato" significa uma associação física das proteínas de fusão de GLP1/GDF15 e/ou dos polinucleotídeos de fusão de GLP1/GDF15 da presente invenção com uma ou mais moléculas de solvente. Essa as- sociação física envolve diferentes graus de ligação iônica e covalente, incluindo ligação ao hidrogênio. Em certos casos, o solvato será capaz de isolamento, por exemplo, quando uma ou mais moléculas de sol- vente forem incorporadas na retícula de cristal do sólido cristalino. O termo "solvato" destina-se a abranger solvatos isoláveis e em fase de solução. Exemplos não limitadores de solvatos adequados incluem etanolatos, metanolatos e similares.

[0134] Pretende-se que a presente invenção inclua em seu escopo os polimorfos e solvatos das proteínas de fusão de GLP1/GDF15 e/ou dos polinucleotídeos de fusão de GLP1/GDF15 da presente invenção. Portanto, nos métodos de tratamento da presente invenção, o termo "administrar" deve abranger os meios de tratamento, alívio ou preven- ção de uma síndrome, distúrbio ou doença aqui descritos com as pro- teínas de fusão de GLP1/GDF15 e/ou os polinucleotídeos de fusão de GLP1/GDF15 da presente invenção ou um polimorfo ou solvato dos mesmos, o que estaria evidentemente no escopo da invenção, embora não especificamente revelado.

[0135] Em uma outra modalidade, a invenção se refere às proteí- nas de fusão de GLP1/GDF15 e/ou aos polinucleotídeos de fusão de GLP1/GDF15 da invenção para uso como medicamento.

[0136] A presente invenção inclui em seu escopo pró-fármacos das proteínas de fusão de GLP1/GDF15 e/ou dos polinucleotídeos de fusão de GLP1/GDF15 desta invenção. Em geral, esses pró-fármacos serão derivados funcionais das proteínas de fusão de GLP1/GDF15 e/ou dos polinucleotídeos de fusão de GLP1/GDF15, que são pronta-

mente conversíveis in vivo nas proteínas de fusão de GLP1/GDF15 e/ou nos polinucleotídeos de fusão de GLP1/GDF15 necessários. Dessa forma, nos métodos de tratamento da presente invenção, o termo "administrar" deve abranger o tratamento dos vários distúrbios descritos com as proteínas de fusão de GLP1/GDF15 e/ou polinucleo- tídeos de fusão de GLP1/GDF15 especificamente revelados ou com as proteínas de fusão de GLP1/GDF15 e/ou os polinucleotídeos de fusão de GLP1/GDF15, que podem não ser especificamente revelados, mas que se convertem nas proteínas de fusão de GLP1/GDF15 especifica- das e/ou nos polinucleotídeos de fusão de GLP1/GDF15 in vivo após a administração ao paciente. Os procedimentos convencionais para a seleção e preparação de derivados de pró-fármacos são descritos, por exemplo, em "Design of Prodrugs", ed. H. Bundgaard, Elsevier, 1985.

[0137] Durante qualquer um dos processos para a preparação das proteínas de fusão de GLP1/GDF15 e/ou dos polinucleotídeos de fu- são de GLP1/GDF15 da presente invenção, pode ser necessário e/ou desejável proteger os grupos sensíveis ou reativos em qualquer uma das moléculas relacionadas. Isso pode ser obtido por meio de grupos protetores convencionais, como aqueles descritos em Protective Groups in Organic Chemistry, ed. J.F.W. McOmie, Plenum Press, 1973; e TW Greene & P.G.M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley & Sons, 1991, cada um dos quais está aqui in- corporado na íntegra, a título de referência, para todos os propósitos. Os grupos protetores podem ser removidos em um estágio subse- quente conveniente com o uso de métodos conhecidos na técnica. Métodos de uso

[0138] A presente invenção se refere a um método para a preven- ção, tratamento ou o alívio de uma síndrome mediada pelo receptor de GDF15 (GDF15R, GFRAL) e/ou uma síndrome, distúrbio ou doença mediada pelo receptor de GLP1 em um indivíduo que esteja precisan-

do do mesmo, compreendendo administrar ao indivíduo que esteja precisando do mesmo uma quantidade eficaz de uma proteína de fu- são de GLP1/GDF15, polinucleotídeo de fusão de GLP1/GDF15, e/ou composição farmacêutica da invenção.

[0139] A presente invenção também fornece um método para pre- venção, tratamento, retardo do início ou alívio de um distúrbio, doença ou condição ou qualquer um ou mais sintomas do dito distúrbio, doen- ça ou condição em um indivíduo que esteja precisando do mesmo, que compreende administrar ao indivíduo que esteja precisando do mesmo uma quantidade eficaz de uma proteína de fusão de GLP1/GDF15, polinucleotídeo de fusão de GLP1/GDF15, e/ou uma composição far- macêutica da invenção.

[0140] De acordo com as modalidades específicas, a doença dis- túrbio, ou quadro clínico é selecionada do grupo que consiste em obe- sidade, diabetes do tipo 2, síndrome metabólica (isto é, Síndrome X), resistência à insulina, tolerância diminuída à glicose (por exemplo, in- tolerância à glicose), hiperglicemia, hiperinsulinemia, hipertrigliceride- mia, hipoglicemia devido a hiperinsulinismo congênito (CHI), dislipide- mia, aterosclerose, nefropatia diabética, e outros fatores de risco car- diovascular como hipertensão e fatores de risco cardiovascular relaci- onados aos níveis de colesterol e/ou de lipídeos não controlados, os- teoporose, inflamação, doença hepática gordurosa não alcoólica (NA- FLD), esteato-hepatite não alcoólica (NASH), doença renal, eczema, apneia de sono, osteoartrite, síndrome do ovário policístico, síndrome renal crônica, depressão e/ou câncer.

[0141] De acordo com as modalidades particulares, uma quantida- de terapeuticamente eficaz se refere à quantidade de terapia que é suficiente para alcançar um, dois, três, quatro ou mais dos seguintes efeitos: (i) reduzir ou melhorar a gravidade da doença, distúrbio ou condição a ser tratado, ou um sintoma associado ao mesmo; (ii) redu-

zir a duração da doença, distúrbio ou condição a ser tratado, ou um sintoma associado ao mesmo; (iii) evitar a progressão da doença, dis- túrbio ou condição a ser tratado, ou um sintoma associado ao mesmo; (iv) causar a regressão da doença, distúrbio ou condição a ser tratado, ou um sintoma associado ao mesmo; (v) evitar o desenvolvimento ou o início da doença, distúrbio ou condição a ser tratado, ou um sintoma associado ao mesmo; (vi) evitar a recorrência da doença, distúrbio ou condição a ser tratado, ou um sintoma associado ao mesmo; (vii) re- duzir a hospitalização de um indivíduo que tem a doença, distúrbio ou condição a ser tratado, ou um sintoma associado ao mesmo; (viii) re- duzir o período de hospitalização de um indivíduo que tem a doença, distúrbio ou condição a ser tratado, ou um sintoma associado ao mesmo; (ix) aumentar a sobrevida de um indivíduo com a doença, dis- túrbio ou condição a ser tratado, ou um sintoma associado ao mesmo; (xi) inibir ou reduzir a doença, distúrbio ou condição a ser tratado, ou um sintoma associado ao mesmo em um indivíduo; (xii) aumentar ou melhorar o efeito profilático ou terapêutico (ou os efeitos profiláticos e terapêuticos) de outra terapia; e/ou (xiii) melhorar a qualidade de vida de um indivíduo com a doença, distúrbio ou quadro clínico a ser trata- do.

[0142] A quantidade terapeuticamente eficaz ou a dosagem pode variar de acordo com vários fatores, como a doença, distúrbio ou con- dição a ser tratada, os meios de administração, o sítio alvo, o estado fisiológico do indivíduo (incluindo, por exemplo, idade, peso corporal, saúde), se o indivíduo é um ser humano ou um animal, outros medi- camentos administrados, e se o tratamento é profilático ou terapêutico. As dosagens de tratamento são idealmente tituladas para otimizar a segurança e a eficácia.

[0143] Para uso na presente invenção, os termos "tratar", "tratan- do" e "tratamento" destinam-se a referir a uma melhora ou reversão de ao menos um parâmetro físico mensurável relacionado à doença, dis- túrbio ou condição, que não é necessariamente discernível no indiví- duo, mas que pode ser discernível no indivíduo. Os termos "tratar", "tratando" e "tratamento" também podem se referir a causar a regres- são, evitar a progressão ou, pelo menos, diminuir a progressão da do- ença, distúrbio ou condição. Em uma modalidade particular, "tratar", "tratando" e "tratamento" referem-se a um alívio, prevenção do desen- volvimento ou início, ou redução na duração de um ou mais sintomas associados à doença, distúrbio ou condição. Em uma modalidade par- ticular, "tratar", "tratando" e "tratamento" referem-se à prevenção da recorrência da doença, distúrbio ou condição. Em uma modalidade particular, "tratar", "tratando" e "tratamento" referem-se a um aumento na sobrevida de um indivíduo que tem a doença, distúrbio ou condi- ção. Em uma modalidade particular, "tratar", "tratando" e "tratamento" referem-se à eliminação da doença, distúrbio ou condição no indiví- duo.

[0144] Em uma modalidade, a invenção fornece um método para prevenção, tratamento, retardo do início ou alívio de obesidade, ou de qualquer um ou mais sintomas de obesidade em um indivíduo que es- teja precisando do mesmo, sendo que o método compreende adminis- trar ao indivíduo que esteja precisando do mesmo uma quantidade efi- caz de uma proteína de fusão de GLP1/GDF15, polinucleotídeo de fu- são de GLP1/GDF15, e/ou uma composição farmacêutica da inven- ção. Em algumas modalidades, o peso corporal de um indivíduo é re- duzido, por exemplo, entre cerca de 0,01% a cerca de 0,1%, entre cer- ca de 0,1% a cerca de 0,5%, entre cerca de 0,5% a cerca de 1%, entre cerca de 1% a cerca de 5%, entre cerca de 2% a cerca de 3%, entre cerca de 5% a cerca de 10%, entre cerca de 10% a cerca de 15%, en- tre cerca de 15% a cerca de 20%, entre cerca de 20% a cerca de 25%, entre cerca de 25% a cerca de 30%, entre cerca de 30% a cerca de

35%, entre cerca de 35% a cerca de 40%, entre cerca de 40% a cerca de 45%, ou entre cerca de 45% a cerca de 50%, em relação ao peso corporal de um indivíduo antes da administração de qualquer uma das proteínas de fusão de GLP1/GDF15, polinucleotídeos de fusão de GLP1/GDF15, formas ou medicamentos da invenção, ou em compara- ção com indivíduos de controle que não recebem nenhuma das proteí- nas de fusão de GLP1/GDF15, polinucleotídeos de fusão de GLP1/GDF15, composições, formas, medicamentos ou combinações da invenção aqui descrita.

[0145] Em algumas modalidades, a redução no peso corporal é mantida durante cerca de 1 semana, durante cerca de 2 semanas, du- rante cerca de 3 semanas, durante cerca de 1 mês, durante cerca de 2 meses, durante cerca de 3 meses, durante cerca de 4 meses, durante cerca de 5 meses, durante cerca de 6 meses, durante cerca de 7 me- ses, durante cerca de 8 meses, durante cerca de 9 meses, durante cerca de 10 meses, durante cerca de 11 meses, durante cerca de 1 ano, durante cerca de 1,5 ano, durante cerca de 2 anos, durante cerca de 2,5 anos, durante cerca de 3 anos, durante cerca de 3,5 anos, du- rante cerca de 4 anos, durante cerca de 4,5 anos, durante cerca de 5 anos, durante cerca de 6 anos, durante cerca de 7 anos, durante cerca de 8 anos, durante cerca de 9 anos, durante cerca de 10 anos, durante cerca de 15 anos ou durante cerca de 20 anos, por exemplo.

[0146] A presente invenção fornece um método para prevenção, tratamento, retardo de início, ou alívio de uma síndrome, distúrbio ou doença, ou qualquer um ou mais sintomas da dita síndrome, distúrbio, ou doença em um indivíduo que esteja precisando do mesmo, sendo que a dita síndrome, distúrbio ou doença é selecionada do grupo que consiste em obesidade, diabetes tipo | ou diabetes tipo Il, síndrome metabólica (isto é, Síndrome X), resistência à insulina, tolerância dimi- nuída à glicose (por exemplo, intolerância à glicose), hiperglicemia,

hiperinsulinemia, hipertrigliceridemia, hipoglicemia devido a hiperinsu- linismo congênito (CHI), dislipidemia, aterosclerose, nefropatia diabéti- ca, e outros fatores de risco cardiovascular como hipertensão e fatores de risco cardiovascular relacionados aos níveis de colesterol e/ou de lipídeos não controlados, osteoporose, inflamação, doença hepática gordurosa não alcoólica (NAFLD), esteato-hepatite não alcoólica (NASH), doença renal, e eczema, que compreende administrar ao in- divíduo que esteja precisando do mesmo uma quantidade eficaz de uma proteína de fusão de GLP1/GDF15, polinucleotídeo de fusão de GLP1/GDF15, e/ou composição farmacêutica da invenção.

[0147] Para uso na presente invenção, síndrome metabólica se refere a um indivíduo que tem qualquer um ou mais dos seguintes: açúcar elevado no sangue (por exemplo, alto nível de açúcar no san- gue em jejum), pressão arterial elevada, níveis de colesterol anormais (por exemplo, níveis de HDL baixo), níveis de triglicerídeo anormais (por exemplo, alto nível de triglicerídeos), uma grande linha da cintura (isto é, a circunferência da cintura), aumento de gordura no área ab- dominal, resistência à insulina, intolerância à glicose, níveis elevados de proteína C-reativa (isto é, um estado pró-inflamatório), e aumento dos níveis de inibidor ativador de plasminogênio plasmático 1 e de fi- brinogênio (isto é, um estado pró-trombótico).

[0148] A presente invenção fornece um método para reduzir a in- gestão de alimentos em um indivíduo que esteja precisando do mes- mo, sendo que o método compreende administrar ao indivíduo que esteja precisando do mesmo uma quantidade eficaz de uma proteína de fusão de GLP1/GDF15, polinucleotídeo de fusão de GLP1/GDF15 e/ou composição farmacêutica da invenção. Em algumas modalidades, a ingestão de alimentos de um indivíduo é reduzido, por exemplo, en- tre cerca de 0,01% a cerca de 0,1%, entre cerca de 0,1% a cerca de 0,5%, entre cerca de 0,5% a cerca de 1%, entre cerca de 1% a cerca de 5%, entre cerca de 2% a cerca de 3%, entre cerca de 5% a cerca de 10%, entre cerca de 10% a cerca de 15%, entre cerca de 15% a cerca de 20%, entre cerca de 20% a cerca de 25%, entre cerca de 25% a cerca de 30%, entre cerca de 30% a cerca de 35%, entre cerca de 35% a cerca de 40%, entre cerca de 40% a cerca de 45%, ou entre cerca de 45% a cerca de 50%, em relação à ingestão de alimentos de um indivíduo antes da administração de qualquer uma das proteínas de fusão de GLP1/GDF15, polinucleotídeos de fusão de GLP1/GDF15, composições, formas, medicamentos ou combinações da invenção aqui descritos, ou em comparação com indivíduos de controle que não recebem nenhuma das proteínas de fusão de GLP1/GDF15, polinucle- otídeos de fusão de GLP1/GDF15, composições, formas, medicamen- tos ou combinações da invenção aqui descrita.

[0149] Em algumas modalidades, a redução na ingestão de ali- mentos é mantida durante cerca de 1 semana, 2 semanas para cerca de, durante cerca de 3 semanas, cerca de 1 por mês, durante cerca de 2 meses, durante cerca de 3 meses, durante cerca de 4 meses, duran- te cerca de 5 meses, durante cerca de 6 meses, durante cerca de 7 meses, durante cerca de 8 meses, durante cerca de 9 meses, durante cerca de 10 meses, durante cerca de 11 meses, durante cerca de 1 ano, cerca de 1,5 anos para, durante cerca de 2 anos, cerca de 2,5 anos para, durante cerca de 3 anos, cerca de 3,5 anos para, durante cerca de 4 anos, cerca de 4,5 anos para, durante cerca de 5 anos, cerca de 6 anos para, durante cerca de 7 anos, cerca de 8 anos para, durante cerca de 9 anos, cerca de 10 anos para, durante cerca de 15 anos ou durante cerca de 20 anos, por exemplo.

[0150] A presente invenção fornece um método para reduzir a he- moglobina glicada (AIC) em um indivíduo que esteja precisando do mesmo, sendo que o método compreende administrar ao indivíduo que esteja precisando do mesmo uma quantidade eficaz de uma proteína de fusão de GLP1/GDF15, polinucleotídeo de fusão de GLP1/GDF15, e/ou composição farmacêutica da invenção. Em algumas modalidades, a AIC de um indivíduo é reduzida, por exemplo, entre cerca de 0,001% e cerca de 0,01%, entre cerca de 0,01% e cerca de 0,1%, en- tre cerca de 0,1% e cerca de 0,2%, entre cerca de 0,2% e cerca de 0,3%, entre cerca de 0,3% e cerca de 0,4%, entre cerca de 0,4% e cerca de 0,5%, entre cerca de 0,5% e cerca de 1%, entre cerca de 1% e cerca de 1,5%, entre cerca de 1,5% e cerca de 2%, entre cerca de 2% e cerca de 2,5%, entre cerca de 2,5% e cerca de 3%, entre cerca de 3% e cerca de 4%, entre cerca de 4% e cerca de 5%, entre cerca de 5% e cerca de 6%, entre cerca de 6% e cerca de 7%, entre cerca de 7% e cerca de 8%, entre cerca de 8% e cerca de 9% ou entre cerca de 9% e cerca de 10% em relação ao A1C de um indivíduo antes da admi- nistração de qualquer uma das proteínas de fusão de GLP1/GDF15, polinucleotídeos de fusão de GLP1/GDF15, composições, formas, medi- camentos, ou combinações da invenção aqui descrita, ou em compara- ção com indivíduos de controle que não recebem nenhuma das proteínas de fusão de GLP1/GDF15, polinucleotídeos de fusão de GLP1/GDF15, composições, formas, medicamentos, ou combinações da invenção aqui descrita.

[0151] Em outras modalidades, são fornecidos métodos para re- duzir os níveis de glicose sanguínea em jejum em um indivíduo que esteja precisando do mesmo, sendo que os métodos compreendem administrar ao indivíduo que esteja precisando dos mesmos uma quantidade eficaz de uma proteína de fusão de GLP1/GDF15, polinu- cleotídeo de fusão de GLP1/GDF15, e/ou composição farmacêutica da invenção. Os níveis de glicose sanguínea em jejum podem ser reduzi- dos para menos que cerca de 140 a cerca de 150 mg/dL, menos que cerca de 140 a cerca de 130 mg/dL, menos que cerca de 130 a cerca de 120 mg/dL, menos que cerca de 120 a cerca de 110 mg/dL, menos que cerca de 110 a cerca de 100 mg/dL, menos que cerca de 100 a cerca de 90 mg/dL, ou menos que cerca de 90 a cerca de 80 mg/dL, em relação aos níveis de glicose sanguínea em jejum de um indivíduo antes da administração de qualquer uma das proteínas de fusão de GLP1/GDF15, polinucleotídeos de fusão de GLP1/GDF15, composi- ções, formas, medicamentos, ou combinações da invenção aqui des- crita, ou em comparação com indivíduos de controle que não recebem nenhuma das proteínas de fusão de GLP1/GDF15, polinucleotídeos de fusão de GLP1/GDF15, composições, formas, medicamentos, ou combinações da invenção aqui descrita.

[0152] A presente invenção fornece um método para modular a atividade do receptor de GLP1 e a atividade do receptor de GDF15 em um indivíduo que esteja precisando do mesmo, sendo que o método compreende administrar ao indivíduo que esteja precisando do mesmo uma quantidade eficaz de uma proteína de fusão de GLP1/GDF15, polinucleotídeo de fusão de GLP1/GDF15, e/ou composição farmacêu- tica da invenção. Para uso na presente invenção, "modular" se refere a aumentar ou diminuir a atividade do receptor.

[0153] Em algumas modalidades, uma quantidade eficaz de uma proteína de fusão de GLP1/GDF15 e/ou de polinucleotídeo de fusão de GLP1/GDF15 da invenção ou uma forma, composição ou medica- mento dos mesmos é administrada a um indivíduo que esteja preci- sando do mesmo uma vez ao dia, duas vezes ao dia, três vezes ao dia, quatro vezes ao dia, cinco vezes ao dia, seis vezes ao dia, sete vezes ao dia, ou oito vezes ao dia. Em outras modalidades, uma quan- tidade eficaz de uma proteína de fusão de GLP1/GDF15 e/ou de poli- nucleotídeo de fusão de GLP1/GDF15 da invenção ou uma forma, composição ou medicamento do mesmo é administrada a um indivíduo que esteja precisando do mesmo uma vez a cada dois dias, uma vez por semana, duas vezes por semana, três vezes por semana, quatro vezes por semana, cinco vezes por semana, seis vezes por semana, duas vezes por mês, três vezes por mês, ou quatro vezes por mês.

[0154] Uma outra modalidade da invenção compreende um méto- do para prevenção, tratamento, retardo do início ou alívio de uma do- ença, distúrbio ou síndrome, ou um ou mais sintomas de qualquer uma das ditas doenças, distúrbios ou síndromes em um indivíduo que este- ja precisando do mesmo, sendo que o método compreende adminis- trar ao indivíduo que esteja precisando do mesmo uma quantidade efi- caz de uma proteína de fusão de GLP1/GDF15, polinucleotídeo de fu- são de GLP1/GDF15, e/ou composição farmacêutica da invenção em uma terapia de combinação. Em certas modalidades, a terapia de combinação é um segundo agente terapêutico. Em certas modalida- des, a terapia de combinação é uma terapia cirúrgica.

[0155] Como usado uso na presente invenção, o termo "em com- binação", no contexto da administração de duas ou mais terapias a um indivíduo, se refere ao uso de mais de uma terapia.

[0156] Como usado aqui, terapia de combinação se refere à admi- nistração a um indivíduo que esteja precisando do mesmo, de um ou mais agentes terapêuticos adicionais, ou de um ou mais tratamentos cirúrgicos, simultaneamente com uma quantidade eficaz de uma prote- ína de fusão de GLP1/GDF15 e/ou polinucleotídeo de fusão de GLP1/GDF15 ou uma forma, composição ou medicamento dos mes- mos. Em algumas modalidades, o um ou mais agentes terapêuticos adicionais ou tratamentos cirúrgicos podem ser administrados no mesmo dia que uma quantidade eficaz de uma proteína de fusão de GLP1/GDF15 e/ou de polinucleotídeo de fusão de GLP1/GDF15 da invenção e, em outras modalidades, o um ou mais agentes terapêuti- cos adicionais ou tratamentos cirúrgicos podem ser administrados na mesma semana ou no mesmo mês que uma quantidade eficaz de uma proteína de fusão de GLP1/GDF15 e/ou polinucleotídeos de fusão de

GLP1/GDF15 da invenção.

[0157] A presente invenção também contempla evitar, tratar, retar- dar o início de, ou aliviar qualquer uma das doenças, distúrbios, síndro- mes, ou sintomas descritos na presente invenção em um indivíduo que esteja precisando do mesmo com uma terapia de combinação que com- preende administrar a um indivíduo que esteja precisando do mesmo uma quantidade eficaz de uma proteína de fusão de GLP1/GDF15, polinucleotídeo de fusão de GLP1/GDF15, e/ou composição farmacêu- tica da invenção, em combinação com qualquer um ou mais dentre os seguintes agentes terapêuticos: um inibidor de dipeptidil peptidase-4 (DPP-4) (por exemplo, a sitagliptina, saxagliptina, linagliptina, aloglipti- na, etc.); um agonista do receptor de GLP1 (por exemplo, agonistas do receptor de GLP1 de curta ação como exenatida e lixisenatida; agonis- tas do receptor de GLP1 de ação intermediária como liraglutida; ago- nistas do receptor de GLP1 de longa ação como exenatida de libera- ção prolongada, albiglutida, dulaglutida); inibidores de cotransportador de sódio-glicose 2 (SGLT-2) (por exemplo, canaglifozina, dapaglifozi- na, empadglifozina, etc.); sequestrantes de ácido biliar (por exemplo, colessevelam, etc.); agonistas do receptor de dopamina (por exemplo, bromocriptina de liberação rápida); biguanidas (por exemplo, metfor- mina, etc.); insulina; oxintomodulina; sulfonilureias (por exemplo, clor- propamida, glimepirida, glipizida, gliburida, glibenclamida, glibornurida, glisoxepida, gliclopiramida, tolazamida, tolbutamida, aceto-hexamida, carbutamida, etc.); e tiazolidinedionas (por exemplo, pioglitazona, rosi- glitazona, lobeglitazona, ciglitazona, darglitazona, englitazona, netogli- tazona, rivoglitazona, troglitazona, etc.). Em algumas modalidades, a dose do agente terapêutico adicional (ou agentes terapêuticos adicio- nais) é reduzida quando administrada em combinação com uma prote- ína de fusão de GLP1/GDF15 e/ou polinucleotídeo de fusão de GLP1/GDF15 da invenção. Em algumas modalidades, quando usados em combinação com uma proteína de fusão de GLP1/GDF15 e/ou po- linucleotídeo de fusão de GLP1/GDF15 da invenção, o (s) agente (s) terapêutico (s) adicionais podem ser usados em doses mais baixas do que quando cada um é usado individualmente.

[0158] A presente invenção contempla evitar, tratar, retardar o iní- cio de, ou aliviar qualquer uma das doenças, distúrbios, síndromes, ou sintomas descritos na presente invenção em um indivíduo que esteja precisando do mesmo com uma terapia de combinação que compre- ende administrar a um indivíduo que esteja precisando do mesmo uma quantidade eficaz de uma proteína de fusão de GLP1/GDF15, polinu- cleotídeo de fusão de GLP1/GDF15, e/ou composição farmacêutica da invenção, em combinação com tratamento cirúrgico. Em certas moda- lidades, a terapia cirúrgica pode ser cirurgia bariátrica (por exemplo, cirurgia de desvio gástrico, como cirurgia de desvio gástrico em Y de Roux-en; gastrectomia em luva; cirurgia da banda gástrica ajustável; desvio biliopancreático com troca duodenal; Balão intragástrico; plica- tura gástrica; e combinações dos mesmos).

[0159] Em modalidades em que o um ou mais agentes terapêuti- cos adicionais ou tratamentos cirúrgicos é administrado no mesmo dia que uma quantidade eficaz de uma proteína de fusão de GLP1/GDF15 e/ou polinucleotídeo de fusão de GLP1/GDF15 da invenção, a proteína de fusão de GLP1/GDF15 e/ou o polinucleotídeo de fusão de GLP1/ GDF15 da invenção pode ser administrado antes, após, ou simultane- amente com o agente terapêutico adicional ou tratamento cirúrgico. O uso do termo "em combinação" não restringe a ordem em que as tera- pias são administradas a um indivíduo. Por exemplo, uma primeira te- rapia (por exemplo, uma composição aqui descrita) pode ser adminis- trada antes de (por exemplo, 5 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 1 hora, 2 horas, 4 horas, 6 horas, 12 horas, 16 horas, 24 ho- ras, 48 horas, 72 horas, 96 horas, | semana, 2 semanas, 3 semanas,

4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 8 semanas ou 12 semanas an- tes), concomitantemente com, ou posteriormente a (por exemplo, 5 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 1 hora, 2 horas, 4 horas, 6 horas, 12 horas, 16 horas, 24 horas, 48 horas, 72 horas, 96 horas, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 8 semanas ou 12 semanas depois) da administração de uma segunda terapia a um indivíduo. Modalidades

[0160] A revelação também fornece as seguintes modalidades não limitadoras.

[0161] A modalidade 1 é uma proteína de fusão de peptídeo seme- lhante ao glucagon 1 (GLP1)/fator de diferenciação de crescimento 15 (GDF15), sendo que a proteína de fusão de GLP1/GDF15 compreende um peptídeo GLP1, um primeiro peptídeo ligante, uma proteína albu- mina sérica, um segundo peptídeo ligante e uma proteína GDF15.

[0162] A modalidade 2 é a proteína de fusão de GLP1/GDF15, de acordo com a modalidade 1, sendo que o peptídeo GLP1 compreender uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 1 a 4.

[0163] A modalidade 3 é a proteína de fusão de GLP1/GDF15, de acordo com a modalidade 1 ou 2, sendo que o primeiro peptídeo ligan- te compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 5 a 25.

[0164] A modalidade 4 é a proteína de fusão de GLP1/GDF15, de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 3, sendo que a proteí- na albumina sérica compreende uma sequência de aminoácidos sele- cionada dentre a SEQ ID NO: 26 ou a SEQ ID NO: 27.

[0165] A modalidade 5 é a proteína de fusão de GLP1/GDF15, de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 4, sendo que o segun- do peptídeo ligante compreende uma sequência de aminoácidos sele-

cionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 28 a 30.

[0166] A modalidade 6 é a proteína de fusão de GLP1/GDF15, de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 5, sendo que a proteí- na GDF15 compreende uma sequência de aminoácidos selecionada dentre SEQ ID NO: 31 ou SEQ ID NO: 32.

[0167] A modalidade 7 é uma proteína de fusão de GLP1/GDF15, sendo que a proteína de fusão de GLP1/GDF15 compreende uma se- quência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 33 a 74 e 84.

[0168] A modalidade 8 é um ácido nucleico isolado que codifica a proteína de fusão de GLP1/GDF15, de qualquer uma das modalidades 1a7.

[0169] A modalidade 9 é um vetor que compreende o ácido nuclei- co isolado da modalidade 8.

[0170] A modalidade 10 é uma célula hospedeira que compreende o ácido nucleico isolado da modalidade 8, ou o vetor da reivindicação

9.

[0171] A modalidade 11 é uma composição farmacêutica que compreende a proteína de fusão de GLP1/GDF15 de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 7, e um veículo farmaceuticamente aceitável.

[0172] A modalidade 12 é um método para tratar ou evitar a obesi- dade em um indivíduo que esteja precisando do mesmo, compreen- dendo administrar ao indivíduo que esteja precisando do mesmo uma quantidade eficaz da composição farmacêutica da modalidade 11.

[0173] A modalidade 13 é o método de acordo com a modalidade 12, sendo que a administração da quantidade eficaz da composição farmacêutica ao indivíduo que esteja precisando da mesma resulta em uma redução no peso corporal de cerca de 5% a cerca de 10%, cerca de 10% a cerca de 15%, cerca de 15% a cerca de 20%, ou de cerca de 20% a cerca de 25% em comparação com o peso corporal do indi- víduo antes da administração da composição farmacêutica.

[0174] A modalidade 14 é um método para tratamento ou preven- ção de uma doença ou distúrbio em um indivíduo que esteja precisan- do do mesmo, sendo que a dita doença ou distúrbio é selecionada do grupo que consiste em obesidade, diabetes tipo | ou tipo Il, síndrome metabólica, resistência à insulina, tolerância diminuída à glicose, hi- perglicemia, hiperinsulinemia, hipertrigliceridemia, hipoglicemia devido a hiperinsulinismo congênito (CHI), dislipidemia, aterosclerose, nefro- patia diabética, e outros fatores de risco cardiovascular como hiperten- são e fatores de risco cardiovascular relacionados aos níveis de coles- terol e/ou de lipídeos não controlados, osteoporose, inflamação, doen- ça hepática gordurosa não alcoólica (NAFLD), esteato-hepatite não alcoólica (NASH), doença renal, e eczema, sendo que o método com- preende a administração ao indivíduo que esteja precisando do mes- mo de uma quantidade eficaz da composição farmacêutica da modali- dade 11.

[0175] A modalidade 15 é o método de acordo com a modalidade 14, sendo que a dita doença ou distúrbio é obesidade.

[0176] A modalidade 16 é o método de acordo com a modalidade 14, sendo que a dita doença ou distúrbio é diabetes tipo |.

[0177] A modalidade 17 é o método de acordo com a modalidade 14, sendo que a dita doença ou distúrbio é diabetes tipo |l.

[0178] A modalidade 18 é o método de acordo com a modalidade 14, sendo que a dita doença ou distúrbio é síndrome metabólica.

[0179] A modalidade 19 é o método de acordo com a modalidade 14, sendo que a dita doença ou distúrbio é uma doença renal.

[0180] A modalidade 20 é o método de acordo com a modalidade 14, sendo que a dita doença ou distúrbio é esteato-hepatite não alcoó- lica (NASH).

[0181] A modalidade 21 é o método de acordo com a modalidade 14, sendo que a dita doença ou distúrbio é doença hepática gordurosa não alcoólica (NAFLD).

[0182] A modalidade 22 é um método para redução de ingestão de alimentos em um indivíduo que esteja precisando do mesmo, que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamen- te eficaz da composição farmacêutica da modalidade 11.

[0183] A modalidade 23 é o método de acordo com a modalidade 22, sendo que a administração da quantidade eficaz da composição farmacêutica ao indivíduo que esteja precisando da mesma resulta em uma redução na ingestão de alimentos de cerca de 5% a cerca de 10%, cerca de 10% a cerca de 15%, cerca de 15% a cerca de 20%, cerca de 20% a cerca de 25%, cerca de 25% a cerca de 30%, cerca de 30% a cerca de 35%, cerca de 35% a cerca de 40%, cerca de 40% a cerca de 45% ou cerca de 45% a cerca de 50% em comparação com a ingestão de alimentos do indivíduo antes da administração da com- posição farmacêutica.

[0184] A modalidade 24 é um método de modulação da atividade do receptor de GLP1 em um indivíduo que esteja precisando do mes- mo, sendo que o método compreende administrar ao indivíduo que esteja precisando do mesmo uma quantidade eficaz da composição farmacêutica da modalidade 11.

[0185] A modalidade 25 é um método de modulação da atividade do receptor de GDF15 em um indivíduo que esteja precisando do mesmo, sendo que o método compreende administrar ao indivíduo que esteja precisando do mesmo uma quantidade eficaz da composi- ção farmacêutica da modalidade 11.

[0186] A modalidade 26 é o método de acordo com qualquer uma das modalidades 11 a 25, sendo que a composição farmacêutica é administrada através de uma injeção.

[0187] A modalidade 27 é o método de acordo com a modalidade 26, sendo que a injeção é aplicada por via subcutânea, intramuscular, intraperitoneal ou intravenosa.

[0188] A modalidade 28 é o método de acordo com qualquer uma das modalidades 11 a 27, sendo que a composição farmacêutica é administrada em combinação com um segundo agente terapêutico.

[0189] A modalidade 29 é o método de acordo com qualquer uma das modalidades 11 a 28, sendo que a composição farmacêutica é administrada diariamente, semanalmente ou mensalmente ao indiví- duo que esteja precisando da mesma.

[0190] A modalidade 30 é o método de acordo com a modalidade 29, sendo que a composição farmacêutica é administrada uma, duas, três, quatro, cinco ou seis vezes por dia.

[0191] A modalidade 31 é o método de acordo com a modalidade 29, sendo que a composição farmacêutica é administrada uma, duas, três, quatro, cinco ou seis vezes por semana.

[0192] A modalidade 32 é o método de acordo com a modalidade 29, sendo que a composição farmacêutica é administrada uma, duas, três, ou quatro vezes por mês.

[0193] A modalidade 33 é um kit que compreende a proteína de fusão de GLP1/GDF15, de acordo com qualquer uma das modalidades 1a7,o ácido nucleico isolado da modalidade 8, e/ou o vetor da moda- lidade 9.

[0194] A modalidade 34 é o kit da modalidade 33, sendo que o kit compreende adicionalmente um dispositivo para injeção.

[0195] A modalidade 35 é um método de produção de uma com- posição farmacêutica compreendendo a proteína de fusão de GLP1/GDF15 de acordo com qualquer uma das modalidades 1, que compreende combinar a proteína de fusão de GLP1/GDF15 com um veículo farmaceuticamente aceitável para obter a composição farma-

cêutica.

[0196] A modalidade 36 é um método de produção da proteína de fusão de GLP1/GDF15 de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a7, que compreende cultivar uma célula que compreende um ácido nucleico que codifica a proteína de fusão de GLP1/GDF15 sob condi- ções para produzir a proteína de fusão de GLP1/GDF15 e recuperar a proteína de fusão de GLP1/GDF15 da célula ou cultura. Exemplos Exemplo 1: Combinação de agonistas de GLP1 e GDF15

[0197] Os efeitos potenciais aditivos de perda de peso da combi- nação dos agonistas de GLP1 e GDF15 foram testados em camun- dongos com obesidade induzida por dieta (DIO). A liraglutida, um ago- nista de GLP1, foi administrada sozinha ou em combinação com uma molécula de HSA-GDF15 (SEQ ID NO:81) durante 8 dias. A liraglutida foi administrada por via subcutânea diariamente enquanto a HSA- GDF15 foi administrada a cada dois dias. A perda de peso corporal foi maior nos animais que receberam ambos os agonistas em compara- ção com qualquer um dos agentes únicos que demonstraram o poten- cial de aditividade ao combinar esses mecanismos independentes (Fi- gura 1). Exemplo 2: Design das proteínas de fusão de GLP1/GDF15

[0198] As proteínas de fusão recombinantes compreendendo um peptídeo GLP1 ou peptídeo GLP1 variante, proteína albumina sérica, e proteína GDF15 ou proteína variante GDF15 foram projetadas da se- guinte forma: O peptídeo GLP1 ou os peptídeos variantes GLP1 foram conectados através de um primeiro peptídeo ligante no C-terminal do peptídeo GLP1 ou do peptídeo GLP1 variante ao amino-terminal da albumina sérica humana. A albumina sérica humana é conectada no C-terminal ao amino-terminal da proteína GDF15 ou da variante da proteína GDF15 através de um segundo peptídeo ligante. O design visa deixar a interface de dimerização de GDF15 sem perturbações e possibilitar a formação do dissulfeto intercadeia nativo, resultando em um homodímero de aproximadamente 170KDa. As moléculas inteiras foram projetadas para ser produzidas de forma recombinante, preci- sando de apenas um gene (Figura 3).

[0199] Os peptídeos GLP1 ou os peptídeos variantes GLP1 inclu- em o peptídeo GLP1(7-36) humano com mutações ou peptídeo exen- dina 4(9-39), um peptídeo de veneno do lagarto monstro-de-Gila que agoniza o receptor de GLP1 humano. A SEQ ID NO:1 contém (A8S, A3O0E) mutações (a numeração das posições de mutação se refere às mutações do peptídeo GLP1 na Tabela 1, e não a partir do início da proteína de fusão) e a SEQ ID NO:2 contém (A8G, G22E, R36G) mu- tações do peptídeo GLP1 humano (UniProtKB a P01275 98-127). À SEQ ID NO:3 contém o peptídeo exendina 4 (UniProtKB - P26349 48- 86).

[0200] A albumina sérica humana nativa (UniProtKB - P02768 25- 609) contém 35 resíduos de cisteína (Cys, C) que formam 17 ligações dissulfeto intramoleculares, deixando Cys-34 como a única cisteína livre. Essa Cys-34 livre funcionou como um sequestrante de radicais livres, mediante a captura de múltiplas espécies reativas de oxigênio (ROS, de "reactive oxygen species") e espécies reativas de nitrogênio (RNS, de "reactive nitrogen species") ((Taverna et. al, Ann Intensive Care, 3:4 (2013)). Essa Cys livre foi, portanto, mutada para Ser para criar a SEQ ID NO:26 e minimizar a reatividade química e o risco de heterogeneidade devido à oxidação.

[0201] O amino-terminal do GDF15 maduro (UniProtKB - Q99988 197-308) contém um sítio de suscetibilidade proteolítica (R198) e um sítio de suscetibilidade à desamidação (N199). Portanto, as proteínas de fusão contêm GDF15 (201-308) (SEQ ID NO:31) com esses sítios de suscetibilidade deletados.

Exemplo 3: Métodos de expressão e purificação

[0202] As proteínas de fusão de GLP1/GDF15, as proteínas de GLP1/primeiro ligante/albumina sérica (por exemplo, HSA, GSA), as proteínas albumina sérica (por exemplo, HSA, GSA)/segundo ligan- te/GDF15), e/ou as proteínas de GDF15 utilizadas nos exemplos ante- riores foram expressas em HEK Expi293F'Y (ThermoFisher Scientific, Cat Nº A14527) ou em ExpiCHO-S'Y (ThermoFisher Scientific, Cat Nº A29127; Waltham, MA, EUA). Para expressão em HEK Expi293FTY, um plasmídeo que codifica a proteína de fusão de GLP1/GDF15 foi transfectado em células por transfecção temporária seguindo as reco- mendações do fabricante. Em resumo, as células Expi293F foram mantidas em suspensão em meio de expressão Expi293'" (Thermo- Fisher Scientific) em uma incubadora com agitação ajustada a 37ºC, 8% CO e 125 RPM. As células foram subcultivadas de modo que no dia da transfecção, uma diluição até 2,5 x 106 células por ml! pode ser alcançada, mantendo a viabilidade celular em 95% ou mais. As trans- fecções temporárias foram feitas com o uso do kit de transfecção Ex- piFectamine'Ty 293 (ThermoFisher Scientific). Para cada ml de células diluídas a serem transfectadas, um micrograma de DNA plasmidial foi diluído em meio de complexação OptiMEMTY SFM. O reagente Expi- FectamineTY 293 foi usado a uma razão de 1:2,6 (v/v, DNA:reagente), e também diluído em OptiMEM'Y, e deixado em incubação durante 5 minutos à temperatura ambiente. O DNA diluído e o reagente de trans- fecção foram combinados durante vinte minutos, possibilitando a forma- ção do complexo DNA/lipídeo, e então adicionados às células. Após in- cubação de um dia para outro, o fluxo de alimentação do Expi293"" e o intensificador ("enhancer") ExpiFectamineT“Y 293 foram adicionados às células. As células foram cultivadas com agitação a 37ºC durante qua- tro dias antes da coleta dos sobrenadantes de cultura.

[0203] As células ExpiCHO-S'TY foram mantidas em suspensão em meio de expressão ExpiCHO'Y (ThermoFisher Scientific) em uma in- cubadora com agitação ajustada a 37ºC, 8% CO, e 125 RPM. As célu- las foram subcultivadas de modo que no dia da transfecção, uma dilui- ção até 6,0 x 106 células por ml! pode ser alcançada, mantendo a viabi- lidade celular em 98% ou mais. As transfecções temporárias foram fei- tas com o uso do kit de transfecção ExpiFectamine"y CHO (Thermo- Fisher Scientific). Para cada ml de células diluídas a serem transfecta- das, um micrograma de DNA plasmidial foi diluído em meio de com- plexação OptiMEM'Y SFM. O reagente de CHO ExpiFectamine"" é usado a uma razão de 1:3 (v/v, DNA:reagente) e também diluído em OptiPRO'TY. O DNA diluído e o reagente de transfecção foram combi- nados durante um minuto, permitindo a formação de complexos de DNA/lipídio, e então adicionados às células. Após incubação de um dia para outro, a alimentação de ExpiCHO'"Y e o intensificador de CHO ExpiFectamine'"Y foram adicionados às células. As células foram culti- vadas com agitação a 32ºC durante cinco dias antes da coleta dos so- brenadantes de cultura.

[0204] As proteínas de fusão de GLP1/GDF15 foram purificadas a partir de sobrenadante de cultura colhido por captura de afinidade em etapa única ou por um processo em duas etapas com o uso de captura de afinidade seguido de uma etapa de polimento através de cromato- grafia por exclusão de tamanho preparatória (SEC). Os sobrenadantes celulares das células Expi293TM transfectadas temporariamente foram carregados para uma coluna CaptureSelect com HSA pré-equilibrada (dASTF, pH 7,2) (CaptureSelect Human Albumin Affinity Matrix, disponí- vel junto à ThermoFisher Scientific) com uma capacidade aproximada de 10 mg de proteína por ml de resina. Após o carregamento, as prote- Ínas e impurezas não ligadas foram removidas por lavagem da coluna com até 12 volumes de coluna (CV) de dSTF (salina tamponada com fosfato) pH 7,2 seguido por 3 CV de NaCl IM em fosfato de sódio 50

MM, pH 7,4. A proteína de fusão de GLP1/GDF15 que se liga à coluna foi eluída com até 10 CV de 0,1 M de acetato de sódio, pH 3,5, em tu- bos de fração contendo 10 por cento (por volume) de Tris 1M (não titu- lado). As frações de pico foram agrupadas e filtradas sobre uma mem- brana de 0,2 um, então o tampão foi trocado para dPBS pH 7,2 ou prosseguiu para a etapa SEC a 4ºC.

[0205] Após a etapa SEC, a proteína da etapa de captura foi con- centrada até um volume adequado antes do carregamento para uma coluna Superdex 200 26/60 (GE Healthcare; Little Chalfont, Reino Uni- do). As frações de proteína que eluíram da coluna de cromatografia de exclusão de tamanho (SEC, de "size exclusion chromatography") com alta pureza (determinada por SDS-PAGE) foram agrupadas. A concen- tração de proteína (de qualquer um dos métodos) foi determinada pela absorbância a 280 nm em um espectrofotômetro BioTek Synergy HTTM. A qualidade das proteínas purificadas foi avaliada por SDS- PAGE e HPLC de exclusão de tamanho analítico (SE-HPLC, sistema HPLC Dionex). Os níveis de endotoxina foram medidos com o uso de um ensaio LAL (Pyrotell&-T, Associates of Cape Cod; East Falmouth, MA, EUA). Exemplo 4: Ativação dual do alvo e efeitos aditivos com a liberação de agonistas tanto de GLP1 quanto de GDF15 em uma molécula

[0206] O potencial para alcançar efeitos aditivos através da libera- ção de agonistas de GLP1 e GDF15 em uma molécula foi testado me- diante avaliação da perda de peso em camundongos DIO durante oito dias de tratamento com fusões dos agonistas com albumina sérica de gorila (GSA). A GSA foi usada como um substituto para a HSA nessas moléculas de ferramenta. Os camundongos receberam a administra- ção subcutânea de 8 nmol/kg de GLP1-GSA-GDF15 (SEQ ID NO:72), GLP1-GSA-GDF15(I89R) (SEQ ID NO:73, a mutação I89R eliminou a atividade do GDF15), GLP1(9-36)-GSA-GDF15 (SEQ ID NO:74, ou

GSA-GDF15 (SEQ ID NO:75), sendo que as duas últimas foram proje- tadas para representar o GLP1 degradado. Dois grupos adicionais de animais serviram como controles e referências, um deles recebendo veículo sozinho ou um outro que recebeu o agonista de GLP1 dulaglu- tida. Os camundongos tratados com GLP1-GSA-GDF15 (SEQ ID NO:72) tiveram maior perda de peso do que aqueles tratados com GLP1(9-36)-GSA-GDF15 (SEQ ID NO:74), GLP1-GSA-GDF15(I89R) (SEQ ID NO:73), e GSA-GDF15 (SEQ ID NO:75), fornecendo prova de conceito de que tanto o GLP1R quanto o GFRAL podem ser agonizados com uma única molécula o que resulta em eficácia aditiva (Figura 2). Exemplo 5: Efeito do peptídeo GLP1 ou das variantes do peptídeo GLP1 e dos primeiros peptídeos ligantes sobre a potência de GLPIR humano in vitro, e estabilidade de plasma humano ex vivo, e estabili- dade de plasma de camundongo in vivo

[0207] Peptídeos GLP1 ou variantes de peptídeo GLP1 diferentes e primeiros peptídeos ligantes diferentes têm efeitos diferentes sobre a potência do receptor de hGLP1 in vitro em um ensaio que mede os níveis de monofosfato de adenosina cíclica (CAMP) em células HEK com superexpressão de hGLP1. As fusões foram verificadas quanto à potência de GLP1R in vitro em ensaios baseados em células que me- dem a produção da cAMP intracelular com o uso do imunoensaio de CAMP competitivo Lance (Perkin Elmer, Waltham, MA, EUA) de acordo com as instruções do kit. Nos ensaios foram utilizadas células HEK293 clonais expressando de maneira estável o GLP1R humano ou de ca- mundongo. Os dados resultantes foram usados para calcular os valo- res ECso do composto com o uso do software estatístico Prism (Gra- phPad Software, San Diego, CA, EUA). Em geral, a variante GLP1 (SEQ ID NO:1) é menos potente do que as outras duas variantes GLP1 (SEQ ID NO:2 e SEQ ID NO:3) no ensaio de hGLP1R in vitro.

[0208] A estabilidade ex vivo no plasma humano foi avaliada. Em resumo, o plasma humano fresco não congelado foi gerado a partir de sangue heparinizado por centrifugação. As proteínas de fusão foram incubadas nessa matriz a 37ºC sob misturação delicada por O, 4, 24, 48, 72 e 96 horas. A estabilidade da região de GLP1 das moléculas de fusão ao longo do tempo em plasma humano foi monitorada através de análise de LC-MS/MS por digestão com tripsina e captura por imu- noafinidade. Os peptídeos trípticos selecionados, a saber HSE (HSEGTFTSDVSSYLEGQAAK) (SEQ ID NO:76), HGE-1 (HGEGT- FTSDVSSYLEEQAAK) (SEQ ID NO:77), e HGE-2 (HGEGTFTSDLSK) (SEQ ID NO:78), estão situados no amino-terminal do peptídeo GLP1 ou dos peptídeos variantes GLP1 (SEQ ID NOs:1, 2, e 3), respectiva- mente. Esses peptídeos trípticos selecionados foram monitorados por análise de LC-MS/MS por digestão com tripsina e captura por imunoa- finidade que serviu como uma medida substituta da concentração da molécula de fusão com um amino-terminal contendo GLP1 intacto. Com essa metodologia, todas as moléculas testadas demonstraram estabilidade razoável de GLP1 ao longo do tempo em plasma humano.

[0209] A estabilidade in vivo em camundongos foi avaliada. As proteínas de fusão foram administradas por via subcutânea a camun- dongos C57BI/6 machos em uma dose de 2 mg/kg em STF, pH 7. Amostras de sangue foram coletadas em tubos de coleta de sangue K3E Sarstedt com inibidores de protease 0, 4, 24 e 48 horas após a administração. O plasma foi preparado por centrifugação. A estabilida- de da região de GLP1 das proteínas de fusão ao longo do tempo in vivo em camundongos foi monitorada através de análise de LC-MS/MS por digestão com tripsina e captura por imunoafinidade. Os peptídeos trípticos selecionados, a saber HSE (HSEGTFTSDVSSYLEGQAAK) (SEQ ID NO:76), HGE-1 (HGEGTFTSDVSSYLEEQAAK) (SEQ ID NO:77), e HGE-2 (HGEGTFTSDLSK) (SEQ ID NO:78), estão situados no amino-terminal das SEQ ID Nos: 1, 2 e 3 contendo proteínas de fusão, respectivamente. Esses peptídeos trípticos selecionados foram monitorados por LC-MS/MS após a captura por imunoafinidade e di- gestão por tripsina de anti-GDF15 que serviram como uma medida substituta da concentração de proteína de fusão com um amino- terminal contendo GLP1 intacto. Com esta metodologia, todas as mo- léculas testadas demonstraram estabilidade razoável de GLP1 ao lon- go do tempo in vivo em camundongos.

[0210] A Tabela 7 fornece resultados da potência de receptor GLP1 in vitro pela medição dos níveis de CAMP das células com supe- rexpressão de GLP1R, da estabilidade no plasma humano ex vivo e da estabilidade no plasma de camundongo in vivo, ambas avaliadas por espectrometria de massa, para as proteínas de fusão de GLP1/GDF15 indicadas.

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Exemplo 6: Remoção de xilosilação ligada em O por eliminação dos resíduos de serina no primeiro e no segundo peptídeos ligantes

[0211] As moléculas contendo os ligantes glicina-serina foram tes- tadas quanto aos níveis de xilose ligada em O devido ao relato de que os glicanos de xilose se fixam aos ligantes glicina-serina (Spahr et. al, mAbs 6 (4): 904 a 914). Resumidamente, as amostras foram prepara- das por diluição em guanidina-HCI tamponado a pH 8,0 para desnatu- ração, seguido por adição de DTT para redução e incubação durante 1 hora a 37ºC. Após a redução, as amostras foram alquiladas com o uso de iodoacetamida recém-preparada durante 60 minutos à temperatura ambiente no escuro. Então, o DTT foi adicionado à amostra para que- lar a iodoacetamida não reagida. Em seguida, as amostras foram des- salinizadas com o uso de colunas de dessalinização Zeba Spin Desal- ting de acordo com o protocolo do fabricante em Tris 50 mM, CaCl2 1 mM, pH 8,0 e digeridas com tripsina (Promega) durante 4 h a 37ºC. Após a digestão, TFA foi adicionado a cada amostra para arrefecer bruscamente a reação de digestão. As amostras digeridas foram man- tidas a 4ºC e injetadas em LC/MS dentro de 24 horas.

[0212] As amostras digeridas foram injetadas em uma coluna de resolução rápida para mapeamento de peptídeos Micro Bore Agilent AdvanceBio com o uso de cromatografia líquida de ultraeficiência (UHPLC - "Ultra-High Performance Liquid Chromatography") Agilent Infinity 1290 (Agilent Technologies) a uma vazão de 0,1 ml/min. À temperatura da coluna foi mantida a 65 ºC. Solventes grau HPLC para espectrometria de massa (0,1% de ácido fórmico e B: 100% ACN em 0,1% de ácido fórmico) foram adquiridos junto à VWR. Os peptídeos proteolíticos foram eluídos da coluna com o uso de um gradiente de 50 minutos de 2 a 40% ACN em 0,1% FA. O efluente de coluna foi intro- duzido em um espectrômetro de massa Thermo Orbitrap Q-Exactive através de uma sonda de ionização por eletrospray aquecido (HESI)

usando uma tensão de aspersão de 3,5 kV, gás de bainha de 20 (uni- dades arb.), gás auxiliar 7, tubo de transferência de íons a 299 “Ce vaporizador a 100 ºC.

[0213] Um experimento dependente de dados top 2 foi conduzido com a varredura de precursor ajustada para detecção por Orbitrap, resolução 70.000, faixa de massa 150 a 2000 m/z, alvo AGC 1.0e€6, tempo máximo de injeção 50 ms, 1 microvarredura, polaridade positi- va. Os critérios de decisão do precursor foram a seleção de precursor monoisotópico - peptídeos, estado de carga: 2-7, exclusão dinâmica: 6,0 segundos e limite de intensidade de precursor de 5e4. Os peptí- deos precursores foram isolados pelo quadrupolo com uma janela de isolamento de 1,6 m/z e enviados para a célula de colisão. Uma ener- gia de colisão de 28 resultou em dissociação colisional de alta energia (HCD) do peptídeo. Esses fragmentos foram, então, transferidos para o orbitrap para medição de massa. As configurações do orbitrap foram resolução, faixa de 200 a 2000 m/z, alvo AGC 5e5, tempo máximo de injeção de 100 ms, 1 microvarredura e espectros adquiridos em modo centroide.

[0214] Os dados de mapeamento de peptídeos são processados com o uso do algoritmo de busca Byonic (Protein Metrics Inc). A biblio- teca personalizada de glicosoaminoglicanos de xilose de núcleo e sua massa monoisotópica foi adicionada aos parâmetros de busca como uma modificação específica de Ser. Os resultados da pesquisa Byonic foram importados para Byologic (Protein Metrics Inc) para quantifica- ção baseada em áreas de cromatogramas de íons extraídos (XIC) das espécies de peptídeo modificadas e não modificadas.

[0215] As proteínas de fusão de GLP1/GDF15 contendo primeiro e segundo peptídeos ligantes G4S mostraram vários níveis de xilosilação ligada em O nos resíduos de serina do primeiro e do segundo peptí- deos ligantes. A Tabela 8 mostra os resultados de três dessas molécu-

las expressas transitoriamente a partir de células ExpiCHO. O nível de xilose era dependente do contexto de proteína e situava-se na faixa de 'não detectado' a 1% nos primeiros peptídeos ligantes, que conectam o peptídeo GLP1 ou as variantes de peptídeo GLP1 à proteína HSA, e de 11,61% a 56,2% nos segundos peptídeos ligantes, que conectam a proteína HSA à proteína GDF15 ou à variante de proteína GDF15. Pa- ra evitar o risco potencial de xilosilação ligada em O em peptídeos |i- gantes, as proteínas de fusão de GLP1/GDF15 desprovidas de resí- duos de serina no primeiro e/ou no segundo peptídeos ligantes foram projetadas e geradas. Essas proteínas de fusão de GLP1/GDF15 con- tinham ligantes que compreendem repetições AP, repetições G4A ou repetições de poliglicina. Tabela 8: Níveis de xilose detectados em resíduos de serina no primeiro ou no segundo peptídeo ligante de proteínas de fusão de GLP1/GDF15 compreendendo peptídeos ligante GS. ID de se- | Motivo ligante Abundância relativa de quência % xil total por mapea- mento de peptídeo 64 Primeiro peptídeo ligante (1-9) | SEQ ID NO:13 | Não detectado conectando GLP1 à HSA AS-8x(G4S) Segundo peptídeo ligante (2-3) | SEQ ID NO:30 | 11,61 conectando HSA ao GDF15 GS-8x(G1S) 67 Primeiro peptídeo ligante (1-8) | SEQ ID NO:12 | 1,0 conectando GLP1 à HSA AS-2x(G4S) Segundo peptídeo ligante (2-3) | SEQ ID NO:30 | 56,2 conectando HSA ao GDF15 GS-8x(G1S) 63 Primeiro peptídeo ligante (1- | SEQ ID NO:23 | 0,5 19) conectando GLP1 à HSA 3Xx(G41S) Segundo peptídeo ligante (2-3) | SEQ ID NO:30 | 23,1 conectando HSA ao GDF15 GS-8x(G1S) Exemplo 7: Potência in vitro em GLP1R e GDF15R

[0216] A atividade in vitro das proteínas de fusão de GLP1/GDF15 foi testada tanto para a potência de GLP1R quanto para a potência de

GDF15R em ensaios baseados em células. A atividade de GDF15R (GFRAL) foi determinada mediante a medição do nível de phospho- AKT (Ser473) em células de neuroblastoma humano SK-N-AS trans- fectadas de maneira estável para superexpressar GFRAL humano ou de macaco cinomolgo. A fosforilação de AKT após o tratamento das células que expressam GFRAL com várias concentrações de molécu- las de fusão foi medida com o uso do Kkit de ensaio Phospho-AKT (Ser473) (Cisbio, Beford, MA, EUA) de acordo com as instruções do fa- bricante. Os dados resultantes foram usados para calcular os valores EC5so do composto com o uso do software estatístico Prism (GraphPad Software, San Diego, CA, EUA). As proteínas de fusão de GLP1/GDF15 testadas na Tabela 9 têm potência de GDF15R similar, com EC5so na faixa de 4,6 a 6,9 nM.

[0217] A potência de GLP1R das fusões foi determinada mediante a medição dos níveis de CAMP em células HEK293 clonais transfecta- das de maneira estável para superexpressar GLP1R humano, de ca- mundongo ou de macaco cinomolgo. A produção intracelular de CAMP após o tratamento das células com concentrações variadas das molé- culas de fusão foi medida com o uso do imunoensaio de CAMP compe- titivo Lance (Perkin Elmer, Waltham, Massachusetts, EUA) de acordo com as instruções do kit. Os dados resultantes foram usados para cal- cular os valores ECso do composto com o uso do software estatístico Prism (GraphPad Software, San Diego, CA, EUA).

[0218] Quando os resíduos de serina no primeiro peptídeo ligante, que conecta o peptídeo GLP1 ou a variante do peptídeo GLP1 à prote- ína HSA, foram substituídos por alanina ou removidos (troca de G1S para G.4A ou para ligante poli-G com comprimento similar), a atividade de GLP1 não sofreu impacto quando testada em um ensaio de GLP1IR humano ou de camundongo. Além disso, a troca do segundo peptídeo ligante, que conecta a proteína HSA à proteína GDF15 ou à variante da proteína GDF15, de GS-8x(G1S) para GA-8x(G4A) ou 10x(AP) não afetou a potência de GLP1IR.

Além disso, as proteínas de fusão com números crescentes de repetições no primeiro ligante (5X(GJ4A), 8X(G4A), 5X(AP), 10X(AP), 20X(AP), 25X(AP) foram produzidas e tes- tadas no ensaio de GLP1R humano.

Os resultados demonstraram que essas proteínas de fusão ativaram a sinalização de GLP1IR com po- tência variável.

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Exemplo 8: Efeito do primeiro e do segundo peptídeos ligantes sobre a pureza e a estabilidade da proteína

[0219] A cromatografia líquida de alta eficiência por exclusão de tamanho (SE-HPLC) foi usada para examinar a pureza e a estabilida- de das moléculas mediante a quantificação da porcentagem de espé- cies principais, bem como de ambas as espécies de alto peso molecu- lar (APM) que representam agregados e espécies de baixo peso mole- cular (BPM) que representam fragmentos. Resumidamente, para de- terminar a pureza da proteína, 20 ug de proteína foram injetados em coluna Tosoh TSKgel BioAssist G3SWXL (Cat Nº 20026) com uma fase móvel 1x DSTF, pH 7,2 (Gibco Cat Nº 14190-136). As espécies de proteína foram eluídas a uma vazão de 1 ml/min à temperatura am- biente, e os valores de absorbância UV-280 nm foram monitorados com o uso de um sistema de HPLC Dionex Ultimate3000 equipado com um detector de comprimento de onda variável. Para determinar a estabilidade da proteína, 100 ug de proteína foram injetados em colu- na Tosoh TSKgel BioAssist G3SWXL (Cat Nº 20026) com uma fase móvel 0,2 M de fosfato de sódio pH 7,0. As espécies de proteína foram eluídas a uma vazão de 0,7 ml/min à temperatura ambiente, e os valo- res de absorbância UV-280 nm foram monitorados com o uso de um sistema de HPLC Dionex Ultimate3000 equipado com um detector de comprimento de onda variável. Os dados são analisados com o uso do software Chromeleon.

[0220] Quando as proteínas de fusão de GLP1/GDF15 foram pro- duzidas a partir da expressão temporária em células ExpiCHO e purifi- cadas por captura de afinidade seguindo os métodos descritos no Exemplo 2, as proteínas de fusão de GLP1/GDF15 com segundos peptídeos ligantes 10x(AP) (SEQ ID NO:28) (conectando a proteína HSA à proteína GDF15 ou à variante de proteína GDF15) resultaram consistentemente em uma porcentagem mais baixa de espécies com baixo peso molecular (BPM) em comparação com moléculas contendo segundos peptídeos ligantes GA-8x(G4A) (SEQ ID NO:29) (Tabela 10). As espécies com BPM foram removidas através de etapas de polimen- to durante a purificação e as proteínas de fusão de GLP1/GDF15 finais resultantes apresentaram pureza maior que 97% puras através de SE- HPLC.

[0221] Essas proteínas de fusão de GLP1/GDF15 foram testadas quanto à estabilidade sob condições de estresse definidas. Para forçar o estresse por oxidação induzido por agentes químicos, as amostras foram expostas a uma concentração final de 0,1% de peróxido de hi- drogênio e incubadas durante 6 horas no escuro antes da adição de catalase para interromper a reação. Na condição de oxidação induzida por metal, uma concentração final de 30 uM de ferro ferroso foi adicio- nada às amostras. Após a incubação durante duas semanas no escu- ro, EDTA foi adicionado para interromper a reação. Para testar a esta- bilidade em pH baixo, as amostras foram dialisadas em tampão de acetato 50 mM a pH 3,5, mantidas durante 6 horas e dialisadas nova- mente em fosfato de sódio 0,1 M a pH 7,4. Para testar a estabilidade da amostra sob estresse térmico, elas foram concentradas até aproxi- madamente 10 mg/ml com o uso de um filtro ultracentrífugo com um peso molecular de corte de 30 KDal e foram mantidas a 40 ºC durante duas semanas em STF. Essas amostras que sofrem a oxidação indu- zida por agentes químicos ou metal anteriormente mencionadas, bem como a condição de baixo pH ou condição de estresse térmico foram analisadas sob cromatografia analítica por exclusão de tamanho (colu- na TOSOH) com taxa de fluxo de 1 ml/min para um teste de 20 minu- tos à temperatura ambiente. Os sinais são coletados para UV-280 nm (sistema 1100 LC Agilent 1100) e a análise de dados é feita com Chemstation (Agilent).

[0222] A Tabela 11 mostra a influência do segundo ligante sobre a estabilidade das proteínas de fusão de GLP1/GDF15 sob estresse térmico (40 ºC durante 2 semanas). As proteínas de fusão de GLP1/GDF15 que continham um segundo peptídeo ligante 10x(AP) (SEQ ID NO:28) resultaram em um nível mais baixo de espécies de BPM formadas em comparação com as proteínas de fusão de GLP1/GDF15 contendo um segundo peptídeo ligante GA-8x(G4A) (SEQ ID NO:29), indicando que um segundo peptídeo ligante AP é mais estável termicamente em comparação com um segundo peptídeo ligante G4A. Sob outras condições testadas de estresse (baixo pH, oxidação induzida por metal ou agentes químicos), o nível de espécies com BPM das amostras permanece em níveis mínimos, similares aos das amostras não submetidas a estresse.

[0223] A calorimetria de varredura diferencial (DSC) foi executada para determinar a estabilidade térmica das proteínas GLP1-HSA- GDF15. As amostras foram avaliadas a aproximadamente 0,5 a 1 mg/ml em tampão STF a pH 7,4 com o uso de um instrumento DSC MicroCal VP-Capilar automatizado. As varreduras térmicas variam de “C a 95 ºC a uma taxa linear de 1 ºC/min. Um tempo de pré- varredura de 15 minutos e um período de filtração de 10 segundos fo- ram usados para cada ciclo. Os dados foram processados com o uso da função de ajuste de estado não 2 no pacote de software Origin7. Os resultados de DSC demonstraram que essas proteínas de fusão de GLP1/GDF15 têm temperatura de fusão (Tm) na faixa de 63 a 72 ºC (Tabela 12), similar a uma proteína de fusão de HSA-GDF15 que não contém um peptídeo GLP1 ou uma variante de peptídeo GLP1.

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Exemplo 9: Estudo de plasma humano ex vivo

[0224] A estabilidade das proteínas de fusão de GLP1-GDF15 foi avaliada ex vivo em plasma humano. Em resumo, o plasma humano fresco não congelado foi gerado a partir de sangue heparinizado por centrifugação. As proteínas de fusão foram incubadas nessa matriz a 37ºC sob misturação delicada durante O, 4, 24, 48, 72 e 96 horas. À concentração das moléculas de fusão ao longo do tempo no plasma humano foi monitorada através de captura por imunoafinidade com um anticorpo anti-GDF15 e por imunodetecção com um anticorpo anti- HSA ("formato total") ou anticorpo específico anti-GLP1 amino-terminal ("formato ativo de GLP1"). As Tabelas 13 e 14 demonstram os resulta- dos desses dois imunoensaios.

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Exemplo 10: Farmacocinética de múltiplas espécies Farmacocinética de camundongo

[0225] As proteínas de fusão de GLP1/GDF15 derivadas das SEQ ID Nos: 50, 45, 46 e 44 foram administradas a camundongos C57BI/6 fêmeas em uma dose de 5 mg/kg IV e SC em STF, pH 7. Foram cole- tadas amostras sanguíneas, o soro foi processado e as concentrações de fármaco foram medidas até 4 dias após ambas as vias de adminis- tração. A concentração de analitos no plasma após a administração IV e SC foi medida através de análise de LC-MS/MS por digestão com tripsina e captura por imunoafinidade. Peptídeos trípticos seleciona- dos, a saber, ALV (ALVLIAFAQYLQQSPFEDHVK) (SEQ ID NO:79), HGE-1 (HGEGTFTSDVSSYLEEQAAK) (SEQ ID NO:77), e HGE-2 (HGEGTFTSDLSK) (SEQ ID NO:78), e TDT (TDTGVSLQTYDDLLAK) (SEQ ID NO:80), que estão situados próximos ao amino-terminal da proteína HSA, ao amino-terminal do peptídeo GLP1 ou da variante do peptídeo GLP1 e ao C-terminal da proteína GDF15 ou da variante da proteína GDF15, respectivamente. O monitoramento desses peptídeos substitutos possibilitou a avaliação farmacocinética de cada região (GLP1, HSA, GDF15) das proteínas de fusão de GLP1/GDF15. Os perfis de concentração plasmática de fármaco em função do tempo estão resumidos na Tabela 15 a 22. Tabela 15: Concentração plasmática (pvg/ml) e erro padrão da média (EPM, n = 3) da SEQ ID NO:50 ao longo do tempo após uma única administração subcutânea (SC) em camundongos C57BL/6 fêmeas. (GLP1) |(HSA) (GDF15) |(GLP1) |(HSA) (GDF15) 2 [170 1530 [163600 fogos —[1om 1068 | [6 26700 [57300 [30180 [1248 [502 [1563 | 2 osso 36760 [26880 [os9t [2956 [os | [e ore [2250 [1560 fosso [16m osss | [6 2450 728 8a fo —fosm fosso

Tabela 16: Concentração plasmática (pvg/ml) e erro padrão da média (EPM, n = 3) da SEQ ID NO:50 ao longo do tempo após uma única administração intravenosa (IV) em camundongos C57BL/6 fêmeas. Concentração (nalm) Tempo (n) | HSE ALV TDT HGE ALV TDT P (GLP1) |(HSA) (GDF15) |(GLP1) |(HSA) (GDF15) |o5 68320 71,760 82,860 4,188 6,659 5,408 |6e 45020 48,560 60,660 1,427 1,487 1,707 244 16900 23,820 28,340 0,991 0,913 1,646 | ae joam 20,620 20,540 0,510 0,843 1,365 5,048 12,118 14,440 0,303 0,996 0,842 joe 214 5,404 7,926 0,103 0,365 0,445 Tabela 17: Concentração plasmática (pvg/ml) e erro padrão da média (EPM, n = 3) da SEQ ID NO:45 ao longo do tempo após uma única administração subcutânea (SC) em camundongos C57BL/6 fêmeas. Concentração (uglm]) Tempo (h) HGE ALV TDT HGE ALV TDT P (GLP1) |(HSA) (GDF15) |(GLP1) |(HSA) (GDF15) 2 “13536 12032 [12512 [3674 3,373 3,499 |6e 2178 20,540 22,120 3,155 2,770 3,161 2a 180% 27,580 26,520 1,712 3,014 2,732 |a8 [8656 20,060 18,980 0,469 1,183 1,248 4,348 18,180 15,260 0,329 1,697 1,065 66 1786 9,866 9,676 0,164 0,907 Tabela 18: Concentração plasmática (pg/ml) e erro padrão da média (EPM, n = 3) da SEQ ID NO:45 ao longo do tempo após uma única administração intravenosa (IV) em camundongos C57BL/6 fêmeas.

HGE ALV TDT HGE ALV TDT Tempo (h) (GLP1) |(HSA) (GDF15) |(GLP1) |(HSA) (GDF15) jos 76,800 69,080 69,560 7,469 7,052 7,981 |6 56,180 57,040 59,460 5,162 5,781 5,527 ja 21,120 30,860 30,680 1,668 2,444 2,480 ja8 10,398 22,560 21,500 0,855 2,104 2,152 4,794 18,800 16,180 0,368 1,880 1,030 ja6 1,986 10,854 10,284 0,134 0,837 0,707

Tabela 19: Concentração plasmática (pg/ml) e erro padrão da média (EPM, n = 3) da SEQ ID NO:46 ao longo do tempo após uma única administração subcutânea (SC) em camundongos C57BL/6 fêmeas.

Tempo (hn) | HGE ALV TDT HGE ALV TDT

P (GLP1) |(HSA) (GDF15) | (GLP1) (HSA) (GDF15) Fem rm em Joe jom Jos [6 67 652 756 foro fora Toco | MM 72 [esmero [os oz fosse | [8 216 [5766 [690 [os Jos foz [86 oz Tao 1516 Too Tor Tor Tabela 20: Concentração plasmática (pg/ml) e erro padrão da média (EPM, n = 3) da SEQ ID NO:46 após uma única administração intrave- nosa (IV) em camundongos C57BL/6 fêmeas.

Concentração (uglm) Tempo (h) HGE ALV TDT HGE ALV TDT

P (GLP1) | (HSA) (GDF15) | (GLP1) |(HSA) (GDF15) |jo5 55525 [42525 57875 |15,521 10,592 | 15,368 |6 27125 [24750 |34,950 |5,185 4,660 6,461 24 a938 9,423 11,280 [0,255 0,893 0,879 jas [1355 [5023 5,893 [0,125 0,278 0,702 0,510 2,623 2,968 —|0,049 0,269 0,329 le68 —jo16 |1,345 1,568 Joo2o Jo155 [oi Tabela 21: Concentração plasmática (pg/ml) e erro padrão da média (EPM, n = 3) da SEQ ID NO:44 após uma única administração subcu- tânea (SC) em camundongos C57BL/6 fêmeas.

Tempo (h) HGE ALV TDT HGE ALV TDT

P (GLP1) (HSA) (GDF15) | (GLP1) (HSA) | (GDF15) Fes fem Tem [20 185 (22 | [6 ss 100 [1062 167 1721 (186 | [2 ass 10008 Tioois fosso Treo (187a | [88 1879 6264 [640 — foge [177 [116 | [86 os 7 To oo fos0 os

Tabela 22: Concentração plasmática (pg/ml) e erro padrão da média (EPM, n = 3) da SEQ ID NO:44 após uma única administração intrave- nosa (IV) em camundongos C57BL/6 fêmeas. Concentração (malml) Tempo (hn) | SE ALV TDT HGE ALV TDT P (GLP1) (HSA) (GDF15) |(GLP1) (HSA) (GDF15) |o5 57920 53,300 60,760 4,648 3,971 4,489 |6ê 29560 33,360 37,400 2,266 2,199 2,176 ja 456 10,420 10,684 0,424 0,393 0,560 48 1300 6,276 6,022 0,217 0,312 0,250 0,540 3,396 3,562 0,040 0,257 0,195 [joe — jo159 1,784 1,804 0,025 0,180 0,123

[0226] A análise farmacocinética não compartimental (NCA) usan- do os dados nas Tabelas 15 a 22 revelou uma meia-vida terminal de 14 a 23 horas para o peptídeo GLP1 ou a variante de peptídeo GLP1, 22 a 49 horas para a proteína GDF15 ou a variante da proteína GDF15 e 22 a 47 horas para a proteína HSA após a administração SC e IV das quatro proteínas de fusão de GLP1/GDF15 testadas em camun- dongos C57BL/6 (Tabela 23). Tabela 23: Meia-vida terminal estimada das proteínas de fusão de GLP1/GDF15 após a administração IV e SC de 5 mg/kg em camun- dongos C57BL/6 fêmeas.

Região Meia-vida (hora) de do- | Meia-vida (hora) de sagem SC de NCA dosagem IV de NCA

Farmacocinética de macaco

[0227] As proteínas de fusão de GLP1/GDF15 derivadas das SEQ ID NOs: 33, 50, 45, 46 e 44 foram administradas a macacos cynomol- gus (Macaca fascicularis) machos virgens de tratamento em uma dose de 0,5 mg/kg SC em STF, pH 7. Foram coletadas amostras sanguí- neas, o plasma foi processado e as concentrações de fármaco foram medidas até 21 dias com o uso de bioanálise por imunoensaio. A es- tratégia de imunoensaio incluiu um anticorpo de captura anti-GDF15 com um anticorpo que reconhece o GLP1 intacto ("ativo") ou com um anticorpo que reconhece a HSA ("total"). O perfil de concentração plasmática de fármaco em função do tempo está resumido nas Tabe- las 24 e 25. Tabela 24: Concentração plasmática média (Média, n=3) (ng/ml) das SEQ ID NOs:33, 50, 45, 46, e 44 ativas ao longo do tempo após uma única administração SC em macacos cynomolgqus, conforme determi- nado por imunoensaio. SEQ ID|/SEQ ID/SEQ ID/SEQ ID SEQ ID Ponto no tempo | NO:46 NO:44 NO:45 NO:50 NO:33 1747,72 | 2530,81 2457,83 |1667,36 |1880,02 E 3057,60 [349218 |3946,41 3191,24 /3151,63 P 3177,96 |3416,86 /3655,95 364312 |3448,62 9 2689,49 301314 /3015,11 2991,62 —/2949,14 S 120 horas 1501,85 |/1669,39 |/140239 202962 /1991,88 - 168 horas 813,84 1020,04 — | 725,75 120807 | 1246,28 240 horas 378,81 471,08 265,28 564,57 583,56 336 horas 137,73 192,90 81,18 197,74 211,92 432 horas 53,16 61,11 25,47 70,28 79,78 528 horas 23,10 35,96 10,60 25,70 36,59

Tabela 25: Concentração plasmática média (média, n=3) (ng/ml) das SEQ ID NOs:33, 50, 45, 46, e 44 total ao longo do tempo após uma única administração SC em macacos cynomolgqus, conforme determi- nado por imunoensaio. SEQ ID/SEQ ID/SEQ IDJSEQ IDjSEQ |D Ponto no tempo | NO:46 NO:44 NO:45 NO:50 NO:33 162827 [229998 |213900 [142728 |1726,39 3350,99 [387318 [/4639,00 [343023 /3451,14 3956,92 |4427,70 |560740 [489271 |4542,34 367220 439917 [531044 [430343 |4514,28 120 horas 2699,22 |361221 [461656 [413396 /4114,96 168 horas 1930,94 |2745,57 [390273 /3237,20 /3431,95 E | 240 horas 1261,95 [196484 [282020 [235301 /2504,95 | 336 horas 719,72 1357,09 |2005,69 /1597,70 /1682,87 TZ | 432 horas 442,57 806,98 1399,11 964,85 1096,51 2 | 528 horas 328,35 532,75 961,88 708,00 879,52

[0228] A análise farmacocinética dos dados nas Tabelas 24 e 25 revelou uma meia-vida terminal de 2 a 3 dias para a molécula ativa e de 5 a 8 dias para a molécula total em macacos cynomolgus após a administração SC (Tabela 26). Tabela 26: Meia-vida terminal das SEQ ID NOs: 50, 33, 45, 46 e 44 após a administração SC de 0,5 mg/kg em macacos cynomolgus. [semDNo — Detecção — jmadavdaia — | 44 Tea fas 46 50 Tea fas 45 33

Exemplo 11: potência in vivo das proteínas de fusão de GLP1/GDF15

[0229] Avaliação da ingestão de alimentos em camundongos ma- chos C57BL/6: O propósito deste experimento foi demonstrar o efeito farmacodinâmico in vivo das moléculas que correspondem às SEQ ID NOs: 50, 33, 49, 45, 46 e 44 sobre a inibição da ingestão de alimentos em camundongos C57BL/6. A ingestão de alimentos de 24 horas foi medida antes e após a administração subcutânea das proteínas de fusão de GLP1/GDF15 (artigos de teste) ou dos controles (veículo STF ou dulaglutida) entre 16 h e 17 h. A alteração no peso do alimento para cada gaiola foi registrada a cada 24 horas. Os resultados são expres- sos como a alteração percentual na ingestão de alimentos em compa- ração com as 24 horas antes do tratamento e são parcialmente de- pendentes da concentração circulante de cada artigo de teste usado no estudo (Figura 4). A concentração circulante de artigos de teste foi determinada 24 horas após a administração através de análise de LC- MS/MS por digestão com tripsina e captura por imunoafinidade. Os peptídeos trípticos foram monitorados, a saber, ALV (ALVLIA- FAQYLQQSPFEDHVK) (SEQ ID NO:79) HGE-1 (HGEGTFTS- DVSSYLEEQAAK) (SEQ ID NO:77), e HGE-2 (HGEGTFTSDLSK) (SEQ ID NO:78), e TDT (TDTGVSLQTYDDLLAK) (SEQ ID NO:80), que estão situados próximos ao amino-terminal da proteína HSA, ao amino-terminal do peptídeo GLP1 ou da variante do peptídeo GLP1 e ao C-terminal da proteína GDF15 ou da variante da proteína GDF15, respectivamente. O peptídeo VVS (VVSVLTVLHQDWLNGK) (SEQ ID NO:82) está situado na porção Fc da dulaglutida. O monitoramento desses peptídeos substitutos possibilitou a avaliação farmacocinética de cada região (GLP1, HSA, GDF15) das proteínas de fusão de GLP1/GDF15. As concentrações plasmáticas de fármaco são mostra- das na Figura 5. Os resultados indicaram que a administração subcu- tânea das SEQ ID NOs: 50, 33, 49, 45, 46 e 44 a camundongos

C57BL/6 inibiu significativamente a ingestão de alimentos em relação aos animais tratados com veículo.

[0230] Avaliação dos efeitos da ingestão de alimentos mediada por GLP1R em camundongos KO GFRAL: A inibição da ingestão de ali- mentos em camundongos C57BL/6 é um resultado da ativação tanto do GLP1IR quanto do GDF15R (GFRAL). Para determinar os efeitos específicos de GLP1R das SEQ ID NOs: 50, 33, 45, 46 e 44 sobre a ingestão de alimentos, foram usados camundongos sem GFRAL. O objetivo desses experimentos foi determinar a extensão da ativação de GLP1R pelas proteínas de fusão quando elas foram administradas em uma dose prevista como eficaz para as fusões de HSA-GDF15 em camundongos (Figuras 1, 2 e US20170327560A1). A ingestão de ali- mentos de 24 horas foi medida antes e após a administração subcutâã- nea das proteínas de fusão de GLP1/GDF15 (artigos de teste: 3 e 10 nmol/kg) ou controles (veículo STF ou dulaglutida) entre 16 he 17 h. À alteração no peso do alimento para cada gaiola foi registrada a cada 24 horas. A concentração circulante de moléculas de fusão contendo peptídeo GLP1 ou variantes de peptídeo GLP1 intacto foi determinada 24 horas após a administração através de análise de LC-MS/MS por digestão com tripsina e captura por imunoafinidade e monitoramento seletivo de peptídeos trípticos, HGE-1 (HGEGTFTSDVSSYLEEQAAK) (SEQ ID NO:77) ou HGE-2 (HGEGTFTSDLSK) (SEQ ID NO:78) que estão situados próximos ao amino-terminal do peptídeo GLP1 ou vari- ante de peptídeo GLP1. Os resultados são representados graficamen- te como a alteração percentual na ingestão de alimentos em função da concentração plasmática do peptídeo HGE (peptídeo GLP1 ou varian- te de peptídeo GLP1 intacto) (Figuras 6, 7 e 8). Os resultados indica- ram que a aplicação de proteínas de fusão contendo as SEQ ID NOs: 50, 33, 45, 46 e 44 resultaram na ativação de GLP1IR em doses que foram anteriormente demonstradas como eficazes para HSA-GDF15.

Surpreendentemente, a ativação de GLPIR provocou uma resposta farmacodinâmica desejada similar ao agonista de Fc-GLP1 dulagluti- da, apesar de ter uma exposição à porção de GLP1 10 a 30 vezes maior do que a dulaglutida. Se o componente de GLP1 da proteína de fusão fosse tão potente quanto a dulaglutida in vivo, a ativação de GLP1R teria sido muito maior do que o desejado, causando potenci- almente os eventos adversos previsíveis em seres humanos, como náuseas e vômitos. Portanto, a aplicação de peptídeos GLP1 como fusões com HSA-GDF15 impacta a potência in vivo no GLP1IR de uma maneira que possibilita o equilíbrio desejado dos dois agonistas.

[0231] Avaliação da tolerância à glicose mediada por GLP1IR em camundongos DIO em jejum: O agonismo para GLP1IR no pâncreas resulta em otimização da secreção de insulina e aumento da absorção de glicose e pode ser medido com o uso de um teste de tolerância à glicose intraperitoneal em camundongos com obesidade induzida por dieta. O objetivo desses experimentos foi determinar a extensão da ativação de GLP1R pelas proteínas de fusão quando elas foram admi- nistradas em uma dose prevista como eficaz para as fusões de HSA- GDF15 em camundongos (Figuras 1, 2 e US20170327560A1). Ca- mundongos C57BL/6 machos foram mantidos em Research Diet D12492 a partir de 6 semanas de vida até o início da dosagem em 20 semanas de vida para induzir a obesidade. As medições de glicose sanguínea pós-prandial e peso corporal foram usadas para randomizar os camundongos em grupos de tratamento. Às 16h, os camundongos foram transferidos para gaiolas limpas com acesso à água; o alimento foi retirado durante a duração do estudo. O controle (veículo STF e dulaglutida) e os artigos de teste (SEQ ID NOs:33, 50, 49, 45, 46, 44, e 36) (1, 3, e 10 nmol/kg) foram administrados por via subcutânea no momento da retirada do alimento. 17 horas após a administração, a glicose basal foi coletada e 1 g de glicose foi administrado por via in-

terperitoneal por kg de peso corporal. A glicose sanguínea foi medida em 10, 30, 60 e 120 minutos após o bolus de glicose. A concentração plasmática circulante de moléculas de fusão contendo peptídeo GLP1 ou variantes de peptídeo GLP1 intactos foi determinada imediatamente após o ponto no tempo de 120 minutos pela análise de LC-MS/MS por digestão com tripsina e captura por imunoafinidade e monitoramento seletivo de peptídeos trípticos, HGE-1 (HGEGTFTSDVSSYLEEQAAK) (SEQ ID NO:77) ou HGE-2 (HGEGTFTSDLSK) (SEQ ID NO:78) que estão situados próximos ao amino-terminal do peptídeo GLP1 ou vari- ante de peptídeo GLP1. A glicose foi representada graficamente como uma função do tempo e a área sob a curva após a normalização para os níveis de glicose basal (AUC Delta) foi calculada para cada animal. Os resultados são representados graficamente como a alteração per- centual na AUC Delta (em comparação com o tratamento com veículo) versus a concentração plasmática do peptídeo HGE (agonista de GLP1 intacto) (Figuras 9, 10, 11 e 12). Os resultados indicaram que a aplicação de proteínas de fusão tendo as SEQ ID Nos: 33, 50, 49, 45, 46, 44, e 36 resultou na ativação do GLP1R em doses que demonstra- ram anteriormente ser eficazes para HSA-GDF15. Surpreendentemen- te, a ativação do GLP1R provocou uma resposta farmacodinâmica de- sejada similar ao agonista de Fc-GLP1 dulaglutida, apesar de ter uma exposição à porção de GLP1 10 a 30 vezes maior do que a dulagluti- da. Se o componente de GLP1 da proteína de fusão fosse tão potente quanto a dulaglutida in vivo, a ativação de GLP1R teria sido muito maior do que o desejado, causando potencialmente os eventos adver- sos previsíveis em seres humanos, como náuseas e vômitos. Portanto, a aplicação de peptídeos GLP1 como fusões com HSA-GDF15 impac- ta a potência in vivo no GLP1IR de uma maneira que possibilita o equi- líbrio desejado dos dois agonistas.

[0232] Avaliação da ativação do GLPIR em primatas com uma infusão de glicose graduada: A secreção de insulina após a infusão intravenosa de glicose graduada (GGI) em primatas não humanos foi usada para avaliar a ativação do GLP1R das SEQ ID NOs:45 e 44. O objetivo desses experimentos foi determinar a extensão da ativação do GLP1R pelas proteínas de fusão quando as proteínas de fusão foram administradas em uma dose prevista como eficaz para as fusões de HSA-GDF15 em primatas não humanos (Mullican et al., 2017 e US20170327560A1). Os procedimentos de GGI foram conduzidos em macacos cynomolgus sedados após 16 horas de jejum de um dia para o outro para comparar a linha de base e as respostas ao tratamento com um período de recuperação de 14 dias entre os dois procedimen- tos de GGI.

No dia 1, os animais receberam uma dose de veículo ime- diatamente após a retirada do alimento.

No dia 2, os animais foram anestesiados, e a linha de base foi estabelecida com duas amostras de sangue coletadas em intervalos de 10 minutos.

A GGI1 foi iniciada no minuto O com uma taxa de infusão de glicose de 8 mg/Kkg/min, se- guido por infusões de 12, 16 e 24 mg/kg/min.

Cada taxa de infusão foi administrada durante um período de 40 minutos.

As amostras de san- gue foram coletadas em intervalos de 20 minutos para medição de gli- cose, insulina e peptídeo-C, os resultados foram representados grafi- camente em função do tempo e a área sob a curva (AUC) foi determi- nada para cada analito medido em cada animal.

Os animais foram, então, randomizados em grupos de tratamento de artigo de teste com base em sua taxa de secreção de insulina basal (ISR) de GGI1. No dia os animais receberam uma dose do artigo de teste em concentra- ções de dose variáveis (0,1 a 1,1 mg/kg de proteínas de fusão e 0,016 a 0,1 dulaglutida) antes do jejum de um dia para o outro.

A segunda GGI (GGI2) foi realizada no dia 16, conforme descrito para o dia 2. À exposição do composto foi avaliada em amostras de plasma coletadas no ponto de tempo 0 antes da infusão de glicose por imunoensaio es-

pecificamente projetado para monitorar artigos de teste com o peptí- deo GLP1 ou variantes de peptídeo intactos. Os dados na Figura 13 são relatados como a alteração em potência de dez induzida por tra- tamento na AUC da ISR normalizada para a AUC da glicose em com- paração com a linha de base versus a concentração plasmática do ar- tigo de teste com GLP1 intacta. A dulaglutida foi usada como uma re- ferência de agonista de Fc-GLP1. Os resultados indicaram que a apli- cação das proteínas de fusão tendo as SEQ ID NOs: 44 e 45 resultou na ativação do GLP1R em doses que demonstraram anteriormente ser eficazes para HSA-GDF15. Surpreendentemente, a ativação do GLP1R provocou uma resposta farmacodinâmica desejada similar ao agonista de Fc-GLP1 dulaglutida, apesar de ter uma exposição da porção de GLP1 10 a 30 vezes maior do que a dulaglutida. Se o com- ponente de GLP1 da proteína de fusão fosse tão potente quanto a du- laglutida in vivo, a ativação do GLP1R teria sido muito maior do que o desejado, causando potencialmente eventos adversos previstos em seres humanos, como náuseas e vômitos. Portanto, a aplicação de peptídeos GLP1 como fusões com HSA-GDF15 impacta a potência in vivo no GLPIR de uma maneira que possibilita o equilíbrio desejado dos dois agonistas.

[0233] Os resultados mostrados nas Figuras 6 a 13 demonstram que a atividade ou potência de GLP1 in vivo em espécies pré-clínicas é reduzida nos agonistas duais de GLP1/GDF15 homodiméricos em comparação com o peptídeo GLP1 de dulaglutida fusionado a Fc. Isso permite o equilíbrio de ambos os agonistas (peptídeo GLP1 ou varian- te de peptídeo GLP1 e proteína GDF15 ou variante de proteína GDF15) em uma molécula; portanto, possibilitando a aplicação de um peptídeo GLP1 ou variante de peptídeo GLP1 em uma concentração eficaz que também alcança a exposição da proteína GDF15 ou da va- riante da proteína GDF15 dentro da faixa terapêutica prevista.

[0234] Avaliação da eficácia de perda de peso das proteínas de fusão de GLP1/GDF15 após a repetição da dosagem em ca- mundongos: A capacidade das proteínas de fusão de GLP1/GDF15 causarem perda de peso foi testada em camundongos com obesidade induzida por dieta. Os camundongos receberam por via subcutânea concentrações variadas de artigos de teste (SEQ ID NOS:45 e 44), dulaglutida ou um veículo de controle diariamente durante sete dias. O peso corporal foi monitorado durante todo o estudo e a Figura 14 mos- tra a alteração percentual no peso corporal ao longo do tempo em re- lação ao Dia O (logo antes da primeira dose). A concentração circulan- te de artigos de teste foi determinada após sete dias de tratamento através de análise de LC-MS/MS por digestão com tripsina e captura por imunoafinidade. Os peptídeos trípticos foram monitorados, a saber, ALV (ALVLIAFAQYLOQOSPFEDHVK) (SEQ ID NO:79) HGEJ (HGEGTFTSDVSSYLEEQAAK) (SEQ ID NO:77), e HGE-2 (HGEGT- FTSDLSK) (SEQ ID NO:78), e TDT (TDTGVSLQTYDDLLAK) (SEQ ID NO:80), que estão situados próximos ao amino-terminal da proteína HSA, ao amino-terminal do peptídeo GLP1 ou da variante do peptídeo GLP1 e ao C-terminal da proteína GDF15 ou da variante da proteína GDF15, respectivamente. O peptídeo VVS (VVSVLTVLHQDWLNGK) (SEQ ID NO:82) está situado na porção Fc da dulaglutida. O monitora- mento desses peptídeos substitutos possibilitou a avaliação farmacociné- tica de cada região (GLP1, HSA, GDF15) das proteínas de fusão de GLP1/GDF15. As concentrações plasmáticas de fármaco são mostradas na Figura 15. Os resultados indicaram que a administração repetida das SEQ ID NOs: 45 e 44 leva à perda de peso em camundongos com obe- sidade induzida por dieta de maneira dependente da concentração. Avaliação dos efeitos das proteínas de fusão de GLP1/GDF15 sobre a ingestão de alimentos em primatas não humanos.

[0235] A capacidade das proteínas de fusão de GLP1/GDF15 di-

minuírem a ingestão de alimentos foi testada em macacos cynomolgus espontaneamente obesos. Os indivíduos receberam por via subcutãà- nea concentrações variadas de artigos de teste com e sem uma por- ção de GLP1 ativo (SEQ ID NOS: 44 e 83, respectivamente; A SEQ ID NO:83, que compreende um peptídeo de HSA fusionado a um ligante AP10 fusionado a um peptídeo GDF15, foi anteriormente revelada na patente US nº 10.336.812) ou veículo QW (uma vez por semana) du- rante um período de 4 semanas. A ingestão de alimentos foi monitora- da antes da dosagem e durante todo o estudo. A alteração percentual de 3 dias na ingestão de alimentos na linha de base e após cada ad- ministração do artigo de teste é mostrada na Figura 16. A concentra- ção das SEQ ID NOs: 44 e 83 no plasma de macaco cynomolgus du- rante o estudo foi determinada com o uso de dois métodos de imuno- ensaio separados para detectar a molécula "total" (detecção de HSA) e a porção "ativa" de GLP1 (detecção de peptídeo GLP1 amino- terminal). As concentrações plasmáticas de fármaco são mostradas nas Figuras 17 e 18. Os resultados indicaram que a administração das SEQ ID NOs: 44 e 83 reduz a ingestão de alimentos em primatas não humanos espontaneamente obesos.

Avaliação dos efeitos das proteínas de fusão de GLP1/GDF15 sobre a ingestão de alimentos e o peso corporal após um escalonamento de dose de 21 dias em primatas não humanos.

[0236] A capacidade das proteínas de fusão de GLP1/GDF15 di- minuírem a ingestão de alimentos e levarem à perda de peso foi testa- da em macacos cynomolgus espontaneamente obesos. Os indivíduos receberam por via subcutânea artigos de teste contendo tanto o GDF15 quanto o GLP1 ativos, apenas o GDF15 ativo, ou apenas por- ções de GLP1 ativo (SEQ ID NOS: 44, 83, 84, respectivamente; a SEQ ID NO:84 compreende um peptídeo GLP1 fusionado a um peptídeo ligante AP5 fusionado a um peptídeo de HSA fusionado a um peptídeo ligante AP10 fusionado a um peptídeo GDF15 com uma mutação I89R; o peptídeo GDF15 com uma mutação I89R foi anteriormente re- velado na patente US nº 10.336.812) a cada três dias durante um pe- ríodo de 21 dias. A dose inicial administrada no Dia O foi de 0,7 nmol/kg e aumentou gradualmente após cada administração até 20 nmol/kg. A ingestão diária de alimentos antes da dosagem, durante o período de tratamento de 21 dias e durante o período de repouso far- macológico ("washout") do artigo de teste é mostrada na Figura 19. O peso corporal foi monitorado durante todo o estudo e a Figura 20 mos- tra a alteração percentual no peso corporal ao longo do tempo em re- lação à linha de base. A concentração de artigos de teste no plasma de macaco cynomolgus durante o estudo foi determinada com o uso de dois métodos de imunoensaio separados para detectar a molécula "total" (detecção de HSA; SEQ ID NOS: 44, 83, 84) e a porção de GLP1 "ativa" (detecção de peptídeo GLP1 amino-terminal; para SEQ ID NOs: 44 e 84 apenas). As concentrações plasmáticas de fármaco são mostradas nas Figuras 21 e 22. Os resultados indicaram que a administração repetida das SEQ ID NOs: 44, 83, 84 leva a uma redu- ção na ingestão de alimentos e à subsequente perda de peso em pri- matas não humanos espontaneamente obesos.

[0237] Será entendido pelos versados na técnica que podem ser feitas alterações nas modalidades descritas acima sem que se desvie do amplo conceito da invenção. Entende-se, portanto, que esta inven- ção não é limitada às modalidades específicas reveladas, mas tem por objetivo cobrir modificações dentro do espírito e escopo da presente invenção, como definido pela presente invenção.

[0238] Todos os documentos citados na presente invenção estão aqui incorporados a título de referência.

Claims (20)

REIVINDICAÇÕES

1. Proteína de fusão de peptídeo semelhante ao glucagon 1 (GLP1)/fator de diferenciação de crescimento 15 (GDF15), caracteri- zada por compreender um peptídeo GLP1, um primeiro peptídeo ligan- te, uma proteína albumina sérica, um segundo peptídeo ligante e uma proteína GDF15.

2. Proteína de fusão GLP1-GDF15, de acordo com a reivin- dicação 1, caracterizada por o peptídeo GLP1 compreender uma se- quência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID Nos: 1a 4.

3. Proteína de fusão GLP1-GDF15, de acordo com a reivin- dicação 1, caracterizada por o primeiro peptídeo ligante compreender uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 5 a 25.

4. Proteína de fusão GLP1-GDF15, de acordo com a reivin- dicação 1, caracterizada por a proteína albumina sérica compreender uma sequência de aminoácidos selecionada dentre a SEQ ID NO: 26 ou a SEQ ID NO: 27.

5. Proteína de fusão GLP1-GDF15, de acordo com a reivin- dicação 1, caracterizada por o segundo peptídeo ligante compreender uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 28 a 30.

6. Proteína de fusão GLP1-GDF15, de acordo com a reivin- dicação 1, caracterizada por a proteína GDF15 compreender uma se- quência de aminoácidos selecionada dentre SEQ ID NO: 31 ou SEQ ID NO: 32.

7. Proteína de fusão GLP1-GDF15, de acordo com a reivindi- cação 1, caracterizada por compreender uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 33 a 74 e 84.

8. Ácido nucleico isolado, caracterizado por compreender a codificação da proteína de fusão GLP1-GDF15, como definida na rei- vindicação 1.

9. Vetor, caracterizado por compreender o ácido nucleico isolado, como definido na reivindicação 8.

10. Célula hospedeira, caracterizada por compreender o ácido nucleico isolado, como definido na reivindicação 8, ou o vetor, como definido na reivindicação 9.

11. Composição farmacêutica, caracterizada por compre- ender a proteína de fusão GLP1-GDF15, como definida na reivindica- ção 1, e um veículo farmaceuticamente aceitável.

12. Método para tratamento ou prevenção de uma doença ou distúrbio em um indivíduo que esteja precisando do mesmo, sendo que a dita doença ou distúrbio é selecionada do grupo que consiste em obesidade, diabetes tipo | ou tipo Il, síndrome metabólica, resistência à insulina, tolerância diminuída à glicose, hiperglicemia, hiperinsulinemia, hipertrigliceridemia, hipoglicemia devido a hiperinsulinismo congênito (CHI), dislipidemia, aterosclerose, nefropatia diabética, e outros fatores de risco cardiovascular como hipertensão e fatores de risco cardiovascu- lar relacionados aos níveis de colesterol e/ou de lipídeos não controla- dos, osteoporose, inflamação, doença hepática gordurosa não alcoólica (NAFLD), esteato-hepatite não alcoólica (NASH), doença renal, e ecze- ma, o método caracterizado por compreender a administração ao indi- víduo que esteja precisando do mesmo de uma quantidade eficaz da composição farmacêutica, como definida na reivindicação 11.

13. Método de redução da ingestão de alimentos em um in- divíduo que esteja precisando da mesma, caracterizado por compre- ender administrar ao indivíduo que esteja precisando da mesma uma quantidade eficaz da composição farmacêutica, como definida na rei- vindicação 11.

14. Método de modulação da atividade do receptor GLP1 em um indivíduo que esteja precisando da mesma, caracterizado por compreender administrar ao indivíduo que esteja precisando da mes- ma uma quantidade eficaz da composição farmacêutica, como definida na reivindicação 11.

15. Método de modulação da atividade do receptor GDF15 (GFRAL) em um indivíduo que esteja precisando da mesma, caracteri- zado por compreender administrar ao indivíduo que esteja precisando da mesma uma quantidade eficaz da composição farmacêutica, como definida na reivindicação 11.

16. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracteriza- do por a composição farmacêutica ser administrada por meio de uma injeção.

17. Kit, caracterizado por compreender a proteína de fusão GLP1-GDF15 como definida na reivindicação 1, o ácido nucleico isola- do como definido na reivindicação 8, e/ou o vetor, como definido na reivindicação 9.

18. Kit, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado por ainda compreender um dispositivo para injeção.

19. Método de produção de uma composição farmacêutica compreendendo a proteína de fusão de GLP1-GDF15, como definida na reivindicação 1, caracterizado por compreender combinar a proteí- na de fusão GLP1-GDF15 com um veículo farmaceuticamente aceitá- vel para obter a composição farmacêutica.

20. Método de produção da proteína de fusão GLP1- GDF15, como definida na reivindicação 1 caracterizado por compre- ender cultivar uma célula que compreende um ácido nucleico que codi- fica a proteína de fusão GLP1-GDF15 sob condições para produzir a proteína de fusão GLP1-GDF15 e recuperar a proteína de fusão GLP1-GDF15 da célula ou cultura.