BR112021002029A2

BR112021002029A2 - métodos para sequenciação de proteínas de novo

Info

Publication number: BR112021002029A2
Application number: BR112021002029-2A
Authority: BR
Inventors: Yuan Mao
Original assignee: Regeneron Pharmaceuticals, Inc.
Priority date: 2018-08-17
Filing date: 2019-08-16
Publication date: 2021-05-25
Also published as: EA202190550A1; JP2021534408A; CN112601962A; AU2019320814A1; MX2021001923A; KR20210045449A; EP3837553A1; CA3107963A1; SG11202100740YA; ZA202100694B; IL280628A; US20210278414A1; US20200057073A1; WO2020037205A1; US11047863B2

Abstract

MÉTODOS PARA SEQUENCIAÇÃO DE PROTEÍNAS DE NOVO. A presente invenção refere-se a um método para determinar uma sequência de aminoácidos de um polipeptídeo que inclui compreender: colocar uma primeira amostra que contém o polipeptídeo em contato com uma primeira protease (por exemplo, Tripsina) para produzir um primeiro conjunto de fragmentos de peptídeo digeridos; fragmentar o primeiro conjunto de fragmentos de peptídeo digeridos para produzir um primeiro conjunto de íons de peptídeo fragmentados; determinar massas do primeiro conjunto de íons de peptídeo fragmentados; colocar uma segunda amostra que contém o polipeptídeo em contato com uma segunda protease (por exemplo, Tryp-N); fragmentar o segundo conjunto de fragmentos de peptídeo digeridos para produzir um segundo conjunto de íons de peptídeo fragmentados; selecionar pares de íons de peptídeo a partir do primeiro e do segundo conjuntos de íons de peptídeo fragmentados que diferem em massa por uma massa de um resíduo de aminoácido arginina ou um resíduo de aminoácido lisina; atribuir um tipo de íon (seja íon de peptídeo de terminal N ou íon de peptídeo de terminal C) aos pares selecionados dos íons de peptídeo a partir de dois conjuntos de íons de peptídeo fragmentados¿; selecionar uma escada de massa dos íons de peptídeo do mesmo tipo no conjunto de íons de peptídeo fragmentados com massa incremental pela massa de resíduo (ou resíduos) de aminoácido, e montar os resíduos de aminoácido identificados a partir da escada de massa para determinar a sequência de aminoácidos do polipeptídeo de interesse.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para “MÉTO- DOS PARA SEQUENCIAÇÃO DE PROTEÍNAS DE NOVO”.

REFERÊNCIA A UMA LISTAGEM DE SEQUÊNCIA

[001] Este pedido incorpora, a título de referência, a Listagem de Sequência submetida na Forma Legível por Computador como arquivo 10478WO01-Sequence.txt, criado em 16 de agosto de 2019 e que con- tém 7747 bytes.

CAMPO DA INVENÇÃO

[002] A presente invenção pertence a produtos biofarmacêuticos, e se refere à determinação do novo de sequências de proteínas ou po- lipeptídeos.

ANTECEDENTES

[003] A sequenciação de proteína dependeu, tradicionalmente, da detecção sequencial de aminoácidos de terminal N individualmente cli- vados com o uso de química de degradação de Edman e da detecção e identificação dos diferentes derivados de aminoácido Edman, por exem- plo, com o uso de técnicas, tais como retenção de HPLC diferencial e absorção UV. Mais recentemente, a espectrometria de massa foi usada para sequenciar e/ou identificar proteínas ou polipeptídeos com veloci- dade, precisão e sensibilidade aumentados. No entanto, esses métodos são geralmente de baixo rendimento e ainda dependem da degradação de Edman. Embora melhoramentos expressivos tenham sido feitos em plataformas de sequenciação de DNA massivamente paralelas de alto rendimento que têm capacidade para sequenciar altos números de di- ferentes moléculas de ácido nucleico simultaneamente, avanços em de- sempenho de espectrômetro de massa foram incrementais. Progresso relativamente pequeno foi feito em relação ao desenvolvimento de pla- taformas da “próxima geração” para sequenciação de proteína global no nível de resíduo de aminoácido único individual.

[004] Consequentemente, permanece uma necessidade por méto- dos e ensaios inovadores para sequenciação de polipeptídeo único.

BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[005] Em um aspecto, a presente invenção fornece um método para a determinação de novo de uma sequência de aminoácidos de um polipeptídeo de interesse, em que o método inclui: colocar uma primeira amostra que contém o polipeptídeo de interesse em contato com uma primeira protease que cliva ligações peptídicas após um aminoácido bá- sico sob condições que permitam que a primeira protease digerir o poli- peptídeo de interesse para produzir um primeiro conjunto de fragmentos de peptídeo digeridos; fragmentar o primeiro conjunto de fragmentos de peptídeo digeridos para produzir um primeiro conjunto de íons de peptí- deo fragmentados que correspondem aos peptídeos no primeiro con- junto de fragmentos de peptídeo digeridos; determinar massas do pri- meiro conjunto de íons de peptídeo fragmentados; colocar uma segunda amostra que contém o polipeptídeo de interesse em contato com se- gunda protease que cliva ligações peptídicas antes de um aminoácido básico, sob condições que permitam a segunda protease digerir o poli- peptídeo de interesse para produzir um segundo conjunto de fragmen- tos de peptídeo digeridos; fragmentar o segundo conjunto de fragmen- tos de peptídeo digeridos para produzir um segundo conjunto de íons de peptídeo fragmentados que correspondem aos peptídeos no se- gundo conjunto de fragmentos de peptídeo digeridos; determinar mas- sas do segundo conjunto de íons de peptídeo fragmentados; selecionar pares de íons de peptídeo a partir do primeiro conjunto de íons de pep- tídeo fragmentados e do segundo conjunto de íons de peptídeo frag- mentados que diferem em massa por uma massa de um aminoácido arginina ou uma massa de um aminoácido lisina; atribuir um tipo de íon (seja íon de peptídeo de terminal N ou íon de peptídeo de terminal C) aos pares selecionados dos íons de peptídeo a partir de dois conjuntos de íons de peptídeo fragmentados; selecionar uma escada de massa dos íons de peptídeo do mesmo tipo no conjunto de íons de peptídeo fragmentados com massa incremental pela massa de resíduo (ou resí- duos) de aminoácido e montar os resíduos de aminoácido identificados a partir da escada de massa de íons de peptídeo para determinar a se- quência de aminoácidos do polipeptídeo de interesse.

[006] Em algumas modalidades do método, a primeira protease é Tripsina.

[007] Em algumas modalidades do método, a segunda protease é Tryp-N.

[008] Em algumas modalidades, o método inclui selecionar um pri- meiro fragmento de peptídeo digerido a partir do primeiro conjunto de fragmentos de peptídeo digeridos; e selecionar um segundo fragmento de peptídeo digerido a partir do segundo conjunto de fragmentos de peptídeo digeridos com uma massa idêntica ao primeiro fragmento de peptídeo digerido.

[009] Em algumas modalidades, o método inclui, adicionalmente, selecionar um primeiro fragmento de peptídeo digerido a partir do pri- meiro conjunto de fragmentos de peptídeo digeridos; e selecionar um segundo fragmento de peptídeo digerido a partir do segundo conjunto de fragmentos de peptídeo digeridos com uma massa que tem uma di- ferença de massa igual à diferença de massa entre um resíduo de ami- noácido lisina e um resíduo de aminoácido arginina em relação ao pri- meiro fragmento de peptídeo digerido.

[010] Em várias modalidades do método, atribuir os pares de íons de peptídeo fragmentados para derivar sequências de aminoácidos in- clui: selecionar um primeiro fragmento de peptídeo digerido a partir do primeiro conjunto de fragmentos de peptídeo digeridos; fragmentar o primeiro fragmento de peptídeo digerido para produzir uma primeira sé- rie de íons de peptídeo fragmentados que correspondem ao primeiro fragmento de peptídeo digerido; selecionar um segundo fragmento de peptídeo digerido a partir do segundo conjunto de fragmentos de peptí- deo digeridos que correspondem ao primeiro fragmento de peptídeo di- gerido; fragmentar o segundo fragmento de peptídeo digerido para pro- duzir uma segunda série de íons de peptídeo fragmentados que corres- pondem ao segundo fragmento de peptídeo digerido; atribuir um tipo de íon (seja íon de peptídeo de terminal N ou íon de peptídeo de terminal C) aos pares selecionados dos íons de peptídeo a partir de dois conjun- tos de íons de peptídeo fragmentados; selecionar escada de massa dos íons de peptídeo do mesmo tipo no conjunto de íons de peptídeo frag- mentados com massa incremental pela massa de resíduo (ou resíduos) de aminoácido; e determinar resíduos de aminoácido individuais do pri- meiro e segundo fragmentos de peptídeo digeridos a partir da escada de massa selecionada de íons de peptídeo para produzir uma sequência de aminoácidos do primeiro e/ou segundo peptídeo fragmentado.

[011] Em várias modalidades, os pares de íons de peptídeo a partir do primeiro conjunto de íons de peptídeo fragmentados e do segundo conjunto de íons de peptídeo fragmentados são selecionados que dife- rem em massa pela massa de um resíduo de aminoácido arginina. Em várias modalidades, uma diferença negativa em massa de um resíduo de aminoácido arginina nos pares de íons de peptídeo a partir do pri- meiro conjunto de íons de peptídeo fragmentados e do segundo con- junto de íons de peptídeo fragmentados indica que o peptídeo tem um resíduo de arginina de terminal N. Em várias modalidades, uma dife- rença positiva em massa de um resíduo de arginina nos pares de íons de peptídeo a partir do primeiro conjunto de íons de peptídeo fragmen- tados e do segundo conjunto de íons de peptídeo fragmentados indica que o peptídeo tem um resíduo de arginina de terminal C. Em várias modalidades, os pares de íons de peptídeo a partir do primeiro conjunto de íons de peptídeo fragmentados e do segundo conjunto de íons de peptídeo fragmentados são selecionados que diferem em massa pela massa de um resíduo de aminoácido lisina. Em modalidades, uma dife- rença negativa em massa de um resíduo de aminoácido lisina nos pares de íons de peptídeo a partir do primeiro conjunto de íons de peptídeo fragmentados e do segundo conjunto de íons de peptídeo fragmentados indica que o peptídeo tem um resíduo de lisina de terminal N. Em mo- dalidades, uma diferença positiva em massa de um resíduo de aminoá- cido lisina nos pares de íons de peptídeo a partir do primeiro conjunto de íons de peptídeo fragmentados e do segundo conjunto de íons de peptídeo fragmentados indica que o peptídeo tem um resíduo de lisina de terminal C.

[012] Em várias modalidades do método, os íons de peptídeo fra- gmentados selecionados a partir do primeiro conjunto de íons de peptí- deo fragmentados correspondem aos íons de peptídeo fragmentados selecionados a partir do segundo conjunto de íons de peptídeo fragmen- tados.

[013] Em várias modalidades do método, os íons de peptídeo fra- gmentados selecionados a partir do primeiro conjunto de íons de peptí- deo fragmentados são íons b e os íons de peptídeo fragmentados sele- cionados a partir do segundo conjunto de íons de peptídeo fragmenta- dos são íons b que têm uma diferença em massa de um resíduo de aminoácido arginina ou uma massa de um resíduo de aminoácido lisina.

[014] Em várias modalidades do método, os íons de peptídeo fra- gmentados selecionados a partir do primeiro conjunto de íons de peptí- deo fragmentados são íons y e os íons de peptídeo fragmentados sele- cionados a partir do segundo conjunto de íons de peptídeo fragmenta- dos são íons y que têm uma diferença em massa de um aminoácido arginina ou uma massa de um aminoácido lisina.

[015] Em várias modalidades do método, a massa é determinada com o uso de espectrometria de massa.

[016] Em várias modalidades do método, os íons de fragmento são produzidos com o uso de espectrometria de massa em tandem.

[017] Em várias modalidades do método, o polipeptídeo de inte- resse compreende uma proteína.

[018] Em várias modalidades do método, o polipeptídeo de inte- resse compreende um anticorpo, tal como um anticorpo monoclonal, um anticorpo monoespecífico ou um anticorpo biespecífico.

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[019] As Figuras 1A e 1B mostram a cobertura de sequência de albumina de soro bovino (BSA) com o uso de uma digestão de Tryp-N protease. A cobertura de sequência é de 91,4%. Vários fragmentos de peptídeo gerados a partir de uma digestão de Tryp-N de BSA são mos- trados abaixo da sequência de proteínas de BSA (SEQ ID NO: 1).

[020] As Figuras 2A e 2B mostram a cobertura de sequência de BSA com o uso de uma digestão de Tripsina protease. A cobertura de sequência é de 94,2%. Vários fragmentos de peptídeo gerados a partir de uma digestão de Tripsina de BSA são mostrados abaixo da sequên- cia de proteínas de BSA (SEQ ID NO: 1).

[021] A Figura 3 mostra os fragmentos de peptídeo resultantes ge- rados a partir de digestões de polipeptídeos modelos pela Tryp-N pro- tease e Tripsina protease. Os quatro diferentes modelos de sequência de proteínas primários são considerados.

[022] A Figura 4 mostra a análise de um peptídeo a partir de BSA gerada conforme descrito no caso (1) da Figura 3. Para um polipeptídeo que inclui a sequência KLVNELTEFAK (SEQ ID NO: 2), a digestão com Tripsina rende o peptídeo LVNELTEFAK (SEQ ID NO: 3). Digestão com Tryp-N rende o peptídeo KLVNELTEFA (SEQ ID NO: 4). Os dois peptí- deos têm a mesma massa. No entanto, quando fragmentados durante Análise de Espectrometria de Massa, íons b resultantes de cada peptí- deo ou íons y de cada peptídeo se diferem pela massa de um único resíduo de aminoácido lisina.

[023] As Figuras 5A a 5C mostram os espectros de massa resul- tantes da análise mostrados na Figura 4 para a digestão de Tripsina e a digestão de Tryp-N, e a geração da sequência primária do peptídeo a partir de mapas iônicos de Tripsina e Tryp-N gerados a partir dos es- pectros de massa. A Figura 5A é um espectro de massa exemplificativo do peptídeo LVNELTEFAK (SEQ ID NO: 3) submetido à espectrometria de massa em tandem que mostra os íons b e y detectados. A Figura 5B é um espectro de massa exemplificativo do peptídeo KLVNELTEFA (SEQ ID NO: 4) submetido à espectrometria de massa em tandem que mostra os íons b e y detectados. A Figura 5C mostra a geração da se- quência primária LVNELTEFA (SEQ ID NO: 5) com o uso dos mapas iônicos determinados para a digestão de Tripsina e a digestão de Tryp- N.

[024] A Figura 6 mostra a análise de um peptídeo a partir de BSA gerada conforme descrito no caso (2) da Figura 3. Para um polipeptídeo que inclui a sequência RHPEYAVSVLLR (SEQ ID NO: 6), a digestão com Tripsina rende o peptídeo HPEYAVSVLLR (SEQ ID NO: 7). Diges- tão com Tryp-N rende o peptídeo RHPEYAVSVLL (SEQ ID NO: 8). Os dois peptídeos têm a mesma massa. No entanto, quando fragmentados durante análise de espectrometria de massa, íons b resultantes de cada peptídeo ou íons y de cada peptídeo se diferem pela massa de um único resíduo de aminoácido arginina.

[025] As Figuras 7A a 7C mostram os espectros de massa resul- tantes da análise mostrados na Figura 6 para a digestão de Tripsina e a digestão de Tryp-N, e a geração da sequência primária do peptídeo a partir dos mapas iônicos de Tripsina e Tryp-N gerados a partir dos es- pectros de massa. A Figura 7A é um espectro de massa exemplificativo do peptídeo HPEYAVSVLLR (SEQ ID NO: 7) submetido à espectrome- tria de massa em tandem que mostra os íons b e y detectados. A Figura

7B é um espectro de massa exemplificativo do peptídeo RHPEYAVSVLL (SEQ ID NO: 8) submetido à espectrometria de massa em tandem que mostra os íons b e y detectados. A Figura 7C mostra a geração da sequência primária HPEYAVSVLL (SEQ ID NO: 9) com o uso dos mapas iônicos determinados para a digestão de Tripsina e a digestão de Tryp-N.

[026] A Figura 8 mostra a análise de um peptídeo a partir de BSA gerada conforme descrito no caso (3) da Figura 3. Para um polipeptídeo que inclui a sequência KCCTESLVNR (SEQ ID NO: 10), a digestão com Tripsina rende o peptídeo CCTESLVNR (SEQ ID NO: 11). Digestão com Tryp-N rende o peptídeo KCCTESLVN (SEQ ID NO: 12). No caso de os dois peptídeos não terem a mesma massa. No entanto, quando frag- mentados durante a Análise de Espectrometria de Massa, os íons b re- sultantes de cada peptídeo ou íons y de cada peptídeo se diferem pela massa de um único resíduo de aminoácido lisina (íons b) ou um único resíduo de aminoácido arginina (íons y).

[027] As Figuras 9A a 9C mostram os espectros de massa resul- tantes da análise mostrados na Figura 8 para a digestão de Tripsina e a digestão de Tryp-N, e a geração da sequência primária do peptídeo a partir dos mapas iônicos de Tripsina e Tryp-N gerados a partir dos es- pectros de massa. A Figura 9A é um espectro de massa exemplificativo do peptídeo CCTESLVNR (SEQ ID NO: 11) submetido à espectrometria de massa em tandem que mostra os íons b e y detectados. A Figura 9B é um espectro de massa exemplificativo do peptídeo KCCTESLVN (SEQ ID NO: 12) submetido à espectrometria de massa em tandem que mostra os íons b e y detectados. A Figura 9C mostra a geração da se- quência primária CCTESLVN (SEQ ID NO: 13) com o uso dos mapas iônicos determinados para a digestão de Tripsina e a digestão de Tryp- N.

[028] A Figura 10 mostra a análise de um peptídeo a partir de BSA gerada conforme descrito no caso (4) da Figura 3. Para um polipeptídeo que inclui a sequência RFKDLGEEHFK (SEQ ID NO: 14), a digestão com Tripsina rende o peptídeo FKDLGEEHFK (SEQ ID NO: 15). Diges- tão com Tryp-N rende o peptídeo RFKDLGEEHF (SEQ ID NO: 16). No caso de os dois peptídeos não terem a mesma massa. No entanto, quando fragmentados durante a análise de espectrometria de massa, os íons b resultantes de cada peptídeo ou íons y de cada peptídeo se diferem em massa por um único resíduo de aminoácido lisina (íons y) ou um único resíduo de aminoácido arginina (íons b).

[029] As Figuras 11A a 11C mostram os Espectros de Massa re- sultantes da análise mostrados na Figura 10 para a digestão de Tripsina e a digestão de Tryp-N, e a geração da sequência primária do peptídeo a partir dos mapas iônicos de Tripsina e Tryp-N gerados a partir dos espectros de massa. A Figura 11A é um espectro de massa exemplifi- cativo do peptídeo FKDLGEEHFK (SEQ ID NO: 15) submetido à espec- trometria de massa em tandem que mostra os íons b e y detectados. A Figura 11B é um espectro de massa exemplificativo do peptídeo RFK- DLGEEHF (SEQ ID NO: 16) submetido à espectrometria de massa em tandem que mostra os íons b e y detectados. A Figura 11C mostra a geração da sequência primária FKDLGEEHF (SEQ ID NO: 17) com o uso dos mapas iônicos determinados para a digestão de Tripsina e a digestão de Tryp-N.

[030] A Figura 12 é um diagrama de blocos que representa um método para determinar a sequência de um polipeptídeo, de acordo com determinadas modalidades exemplificativas.

[031] A Figura 13 é um sistema de computação exemplificativo que pode ser usado para realizar várias etapas de um método de sequenci- ação de polipeptídeo de novo, de acordo com determinadas modalida- des exemplificativas.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[032] Antes da presente invenção ser descrita, deve-se entender que esta invenção não se limita aos métodos particulares e às condi- ções experimentais descritas, dessa forma métodos e condições podem variar. Deve-se, ainda, entender que a terminologia usada neste docu- mento é para o propósito de, apenas, descrever modalidades específi- cas e não se destina a ser limitadora, devido ao fato de que o escopo da presente invenção será limitado, apenas, pelas reivindicações ane- xas. Quaisquer modalidades ou recursos de modalidades podem ser combinados uns com os outros, e tais combinações estão expressa- mente englobadas no escopo da presente invenção.

[033] A menos que seja definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos usados no presente documento têm o mesmo sig- nificado conforme comumente entendido por um indivíduo de habilidade comum na técnica à qual esta invenção pertence. Conforme usado no presente documento, o termo "cerca de", quando usado em referência a um valor numérico recitado particular, significa que o valor pode variar do valor recitado em não mais que 1%. Por exemplo, conforme usado no presente documento, a expressão "cerca de 100" inclui 99 e 101 e todos os valores entre os mesmos (por exemplo, 99,1, 99,2, 99,3, 99,4, etc.)

[034] Embora quaisquer métodos e materiais similares ou equiva- lentes àqueles descritos no presente documento possam ser usados na prática ou teste da presente invenção, os métodos e materiais preferen- ciais são descritos agora. Todos os documentos de patente, pedidos e publicações de não patente mencionados neste relatório descritivo são incorporados no presente documento a título de referência em suas to- talidades.

ABREVIAÇÕES USADAS NO PRESENTE DOCUMENTO

[035] MS/MS: Espectrometria de Massa em Tandem

[036] mAb: Anticorpo Monoclonal

[037] IgG: Imunoglobulina G

[038] LC: Cadeia Leve

[039] HC: Cadeia Pesada

[040] MS: Espectrometria de Massa

DEFINIÇÕES

[041] O termo "anticorpo", conforme usado no presente docu- mento, deve se referir às moléculas de imunoglobulina compreendidas por quatro cadeias de polipeptídeo, duas cadeias pesadas (H) e duas cadeias leves (L) interligadas por ligações de dissulfeto (isto é, "molé- culas de anticorpo completas"), assim como multímeros das mesmas (por exemplo, IgM) ou fragmentos de ligação ao antígeno das mesmas. Cada cadeia pesada é compreendida por uma região variável de cadeia pesada (“HCVR” ou “VH”) e uma região constante de cadeia pesada (compreendida por domínios CH1, CH2 e CH3). Em várias modalidades, a cadeia pesada pode ser um isótopo de IgG. Em alguns casos, a cadeia pesada é selecionada a partir de IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4. Em algumas modalidades, a cadeia pesada é do isótopo IgG1 ou IgG4, que inclui, opcionalmente, uma região de dobradiça quimérica do isótopo IgG1/IgG2 ou IgG4/IgG2. Cada cadeia leve é compreendida por uma região variável de cadeia leve (“LCVR ou “VL”) e uma região constante de cadeia leve (CL). As regiões VH e VL podem ser adicionalmente sub- divididas em regiões de hipervariabilidade, denominadas regiões de de- terminação de complementaridade (CDRs), intercaladas com regiões que são mais conservadas, denominadas regiões de framework (FR). Cada VH e VL é composta por três CDRs e quatro FRs, dispostas a partir da terminação amino até a terminação carbóxi na seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. O termo “anticorpo” inclui refe- rência a ambas imunoglobulinas glicosiladas e não glicosiladas de qual- quer isótopo ou subclasse. O termo “anticorpo” inclui moléculas de an-

ticorpo preparadas, expressas, criadas ou isoladas através de meios re- combinantes, tais como anticorpos isolados de uma célula hospedeira transfectada para expressar o anticorpo. Para uma revisão sobre a es- trutura de anticorpo, consultar Lefranc et al., IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains, 27(1) Dev. Comp. Immunol. 55-77 (2003); e M. Pot- ter, Structural correlates of immunoglobulin diversity, 2(1) Surv. Immu- nol. Res. 27-42 (1983).

[042] O termo anticorpo também engloba um “anticorpo biespecí- fico”, que inclui uma imunoglobulina heterotetramérica que pode se ligar a mais de um epítopo diferente. Uma metade do anticorpo biespecífico, que inclui uma cadeia pesada única e uma cadeia leve única e seis CDRs, se liga a um antígeno ou epítopo, e a outra metade do anticorpo se liga a um antígeno ou epítopo diferente. Em alguns casos, o anticorpo biespecífico pode se ligar ao mesmo antígeno, porém, em diferentes epítopos ou epítopos não sobrepostos. Em alguns casos, ambas meta- des do anticorpo biespecífico têm cadeias leves idênticas enquanto re- têm especificidade dupla. Os anticorpos biespecíficos são descritos, de modo geral, na Publicação de Pedido de Patente nº U.S. 2010/0331527(30 de dezembro de 2010).

[043] O termo “porção de ligação ao antígeno” de um anticorpo (ou “fragmento de anticorpo”), se refere a um ou mais fragmentos de um anticorpo que retêm a habilidade em se ligar especificamente a um an- tígeno. Exemplos de fragmentos de ligação englobados no termo “por- ção de ligação ao antígeno” de um anticorpo incluem (i) um fragmento de Fab, um fragmento monovalente que consiste nos domínios VL, VH, CL e CH1; (ii) a fragmento de F(ab′)2, um fragmento bivalente que com- preende dois fragmentos de Fab ligados por uma ponte de dissulfeto na região de dobradiça; (iii) um fragmento de Fd que consiste nos domínios VH e CH1; (iv) um fragmento de Fv que consiste nos domínios VL e VH de um único braço de um anticorpo, (v) um fragmento de dAb (Ward et al. (1989) Nature 241:544-546), que consiste num domínio VH, (vi) uma CDR isolada e (vii) um scFv, que consiste nos dois domínios do frag- mento de Fv, VL e VH, unidos por um ligante sintético para formar uma única cadeia de proteína na qual as regiões VL e VH se pareiam para formar moléculas monovalentes. Outras formas de anticorpos de cadeia única, tais como diacorpos também são englobadas sob o termo “anti- corpo” (consultar, por exemplo, Holliger et at. (1993) 90 PNAS U.S.A. 6444-6448; e Poljak et at. (1994) 2 Structure 1121-1123).

[044] Além disso, anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos podem ser obtidos com o uso de técnicas de DNA recom- binante padrão normalmente conhecidas na arte (consultar Sambrook et al., 1989).

[045] O termo "anticorpo humano", pretende incluir anticorpos que têm regiões variáveis e constantes derivadas de sequências de imuno- globulina de linha germinativa humana. Os mAbs humanos da invenção podem incluir resíduos de aminoácido não codificados pelas sequências de imunoglobulina de linha germinativa humana (por exemplo, muta- ções introduzidas através de mutagênese aleatória ou de sítio especí- fico in vitro ou através de mutação somática in vivo), por exemplo nas CDRs e, em particular, CDR3. No entanto, o termo "anticorpo humano", conforme usado no presente documento, não pretende incluir mAbs nos quais sequências de CDR derivadas da linha germinativa de outra es- pécie de mamífero (por exemplo, camundongo), foram enxertadas em sequências de FR humano. O termo inclui anticorpos produzidos de ma- neira recombinante num mamífero não humano, ou em células de um mamífero não humano. O termo não pretende incluir anticorpos isolados a partir de um indivíduo humano ou gerados no mesmo.

[046] O termo “amostra”, conforme usado no presente documento, se refere a uma mistura de moléculas que compreende pelo menos um polipeptídeo de interesse, tal como um anticorpo monoclonal, que é sub- metido à manipulação de acordo com os métodos da invenção, que in- cluem, por exemplo, separação, análise, extração, concentração ou per- filagem.

[047] Os termos “análise” ou “analisar”, conforme usados no pre- sente documento, são usados intercambiavelmente e se referem a qual- quer um dos vários métodos para separar, detectar, isolar, purificar, so- lubilizar, detectar e/ou caracterizar moléculas de interesse (por exem- plo, polipeptídeos, tais como anticorpos monoclonais). Exemplos in- cluem, porém, sem limitação, extração de fase sólida, microextração de fase sólida, eletroforese, espectrometria de massa, por exemplo, espec- trometria de massa em tandem, cromatografia líquida, por exemplo, de alto desempenho, por exemplo, de fase reversa, fase normal ou exclu- são de tamanho, cromatografia líquida de par iônico, extração de lí- quido-líquido, por exemplo, extração de fluido acelerado, extração de fluido supercrítico, extração auxiliada por micro-onda, extração por membrana, extração por soxhlet, precipitação, clarificação, detecção eletroquímica, tingimento, análise elementar, ressonância magnética nuclear, análise infravermelha, análise de injeção de fluxo, eletrocroma- tografia capilar, detecção ultravioleta e combinações dos mesmos.

[048] “Cromatografia”, conforme usado no presente documento, se refere ao processo de separação de uma mistura, por exemplo, uma mistura que contêm peptídeos, proteínas, polipeptídeo e/ou anticorpos, tais como anticorpos monoclonais. A mesma envolve passar uma mis- tura através de uma fase estacionária, que separa moléculas de inte- resse de outras moléculas na mistura e permite que uma ou mais molé- culas de interesse sejam isoladas. Exemplos de métodos de separação cromatográfica incluem cromatografia de ação capilar, tal como croma- tografia de papel, cromatografia de camada fina (TLC), cromatografia de coluna, cromatografia líquida de proteína rápida (FPLC), cromatogra- fia líquida de fase nano-inversa, cromatografia de troca iônica, cromato- grafia em gel, tal como cromatografia de filtração de gel, cromatografia de exclusão de tamanho, cromatografia de afinidade, cromatografia lí- quida de alto desempenho (HPLC), cromatografia líquida de interação hidrofílica (HILIC), e cromatografia líquida de alto desempenho de fase inversa (RP-HPLC) dentre outras.

[049] “Contato”, conforme usado no presente documento, inclui co- locar juntas pelo menos duas substâncias em solução ou fase sólida, por exemplo, colocar uma amostra em contato com uma protease.

[050] O termo "correspondente" é um termo relativo que indica si- milaridade em posição, propósito ou estrutura, e pode incluir peptídeos de estrutura idêntica, porém, para a presença ou ausência de um resí- duo de aminoácido arginina ou lisina na terminação N ou C. Em algumas modalidades, sinais espectrais de massa num espectro de massa que são decorrentes de peptídeos correspondentes de estrutura idêntica, porém, para a presença ou ausência de um resíduo de aminoácido ar- ginina ou lisina na terminação N ou C são "correspondentes" aos sinais espectrais de massa. Um sinal espectral de massa devido a um peptí- deo particular também é denominado um sinal correspondente ao pep- tídeo. Em determinadas modalidades, uma sequência de peptídeos par- ticular ou conjunto de aminoácidos podem ser atribuídos a uma massa de peptídeo correspondente.

[051] Os termos “peptídeo de fragmento” ou “fragmento de peptí- deo”, conforme usados no presente documento, se referem a um peptí- deo que é derivado do polipeptídeo de comprimento completo, tal como uma proteína e/ou anticorpo monoclonal, através de processos que in- cluem fragmentação, proteólise enzimática ou hidrólise química. Tais peptídeos proteolíticos incluem peptídeos produzidos através do trata- mento de uma proteína com uma ou mais proteases, tais como Tripsina ou Tryp-N. Um peptídeo de fragmento, ou fragmento de peptídeo, pode ser um peptídeo digerido.

[052] O termo "isolado”, conforme usado no presente documento, se refere a um componente biológico (tal como um ácido nucleico, pep- tídeo, proteína, lipídio ou metabólito) que foi substancialmente sepa- rado, produzido separado ou purificado distante de outros componentes biológicos na célula do organismo no qual o componente ocorre natu- ralmente ou é transgenicamente expresso, isto é, outros DNA e RNA cromossômicos e extracromossômicos, proteínas, lipídios e metabóli- tos. Ácidos nucleicos, peptídeos, proteínas, lipídios e metabólitos foram, cada um, "isolados", assim, incluem ácidos nucleicos, peptídeos, prote- ínas, lipídios e metabólitos purificados através de métodos de purifica- ção padrão ou não padrão O termo também engloba ácidos nucleicos, peptídeos, proteínas, lipídios e metabólitos preparados através de ex- pressão recombinante numa célula hospedeira, assim como peptídeos, lipídios, metabólitos e ácidos nucleicos quimicamente sintetizados.

[053] “Espectrometria de massa” é um método em que uma amos- tra é analisada gerando-se íons de fase gasosa a partir da amostra, que são, então, separados de acordo com sua razão de massa para carga (m/z) e detectados. Métodos para gerar íons de fase gasosa a partir de uma amostra incluem ionização por eletropulverização (ESI), ionização de dessorção a laser auxiliada por matriz (MALDI), ionização de dessor- ção a laser de superfície aprimorada (SELDI), ionização química e ioni- zação de impacto de elétrons (EI). Separação de íons de acordo com sua razão m/z pode ser realizada com qualquer tipo de analisador de massa que inclui analisadores de massa quadrupolos (Q), analisadores de massa de tempo de voo (TOF), analisadores de massa de setor mag- nético, armadilhas de íon 3D e lineares (IT), analisador de massa orbi- trap, analisadores de ressonância de ciclotron de íon de transformada de Fourier (FT-ICR), e combinações dos mesmos (por exemplo, um analisador de tempo de voo quadrupolo, ou analisador Q-TOF). Antes da separação, a amostra pode ser submetida a uma ou mais dimensões de separação cromatográfica, por exemplo, uma ou mais dimensões da cromatografia líquida ou de exclusão de tamanho.

[054] Espectrometria de massa em tandem ou MS/MS é uma téc- nica para depurar íons selecionados (íons precursores) em fragmentos (íons produto). Os fragmentos, então, descrevem aspectos da estrutura química do íon precursor. Em espectrometria de massa em tandem, uma vez que as amostras são ionizadas (por exemplo, através de ESI, MALDI, EI, etc.) para gerar uma mistura de íons, íons precursores, por exemplo, peptídeos de uma digestão, de uma razão de massa para carga específica (m/z) são selecionados (MS1) e, então, fragmentados (MS2) para gerar íons produto para detecção. Instrumentos de MS em tandem típicos QqQ, QTOF, e armadilha de íon híbrida/FTMS, etc. Um exemplo de uma aplicação de espectrometria de massa em tandem é identificação de proteína. O primeiro analisador de massa isola íons de um valor de m/z particular que representa uma única espécie de peptí- deo dentre diversas introduzidas na fonte iônica e, então, que emergem da mesma. Esses íons são, então, acelerados numa célula de colisão que contém um gás inerte, tal como argônio para induzir fragmentação de íon. Esse processo é designado dissociação induzida por coli- são (CID) ou dissociação ativada por colisão (CAD). Os valores de m/z de íons de fragmento são, então, medidos num 2o analisador de massa para obter informações sobre sequência de aminoácidos. Espectrome- tria de massa em tandem pode ser usada para identificar a sequência de um peptídeo e, portanto, proteínas de comprimento completo ou par- cial, de acordo com os métodos descritos no presente documento. Uma notação foi desenvolvida para indicar fragmentos de peptídeo que sur- gem de um espectro de massa em tandem. Conforme usado no pre- sente documento, íons de fragmento de peptídeo são indicados por b se a carga for retida na terminação N e por um y se a carga for mantida na terminação C. O número depois do b ou y indica o número de ami- noácidos no fragmento. Íons precursores podem ser ativados (com energia interna aumentada) de diversas maneiras diferentes. Modelos de fragmentação dependem de como a energia é transferida para o íon precursor, da quantidade de energia transferida e de como a energia transferida é internamente distribuída. Dissociação induzida por colisão e dissociação de multifótons infravermelhos são técnicas "de aqueci- mento lento" que aumentam a temperatura de Boltzmann do íon e, as- sim, clivam preferencialmente as ligações mais fracas para produzir principalmente íons b e y.

[055] Os termos “peptídeo”, “proteína” e “polipeptídeo” se referem, intercambiavelmente, a um polímero de aminoácidos e/ou análogos de aminoácido que são unidos por ligações peptídicas ou imitações de li- gação peptídica. Os vinte aminoácidos de ocorrência natural e suas de- signações de letra única e três letras são como a seguir: Alanina A Ala; Cisteína C Cys; Ácido Aspártico D Asp; Ácido Glutâmico E Glu; Fenila- lanina F Phe; Glicina G Gly; Histidina H His; Isoleucina I He; Lisina K Lys; Leucina L Leu; Metionina M Met; Asparagina N Asn; Prolina P Pro; Glutamina Q Gin; Arginina R Arg; Serina S Ser; Treonina T Thr; Valina V Val; Triptofano w Trp; e Tirosina Y Tyr.

[056] Referências a uma massa de um aminoácido significam a massa monoisotópica ou massa média de um aminoácido em uma dada abundância isotópica, tal como uma abundância natural. Em alguns exemplos, a massa de um aminoácido pode ser enviesada, por exem- plo, identificando-se um aminoácido com um isótopo. Algum grau de va- riabilidade ao redor da massa média de um aminoácido é esperado para aminoácidos únicos individuais com base na composição isotópica exata do aminoácido. As massas, que incluem massas monoisotópicas e médias para aminoácidos são facilmente obteníveis por uma pessoa de habilidade comum na técnica.

[057] De maneira similar, referências a uma massa de um peptí- deo significam a massa monoisotópica ou massa média de um peptídeo em uma dada abundância isotópica, tal como uma abundância natural. Em alguns exemplos, a massa de um peptídeo pode ser enviesada, por exemplo, identificando-se um ou mais aminoácidos no peptídeo com um isótopo. Algum grau de variabilidade ao redor da massa média de um peptídeo é esperado para peptídeos únicos individuais com base na composição isotópica exata do peptídeo. A massa de um peptídeo par- ticular pode ser determinada por uma pessoa de habilidade comum na técnica.

DESCRIÇÃO GERAL

[058] Aspectos da presente descrição se referem a um método para determinar a sequência de aminoácidos de um polipeptídeo de in- teresse, tal como um anticorpo monoclonal ou outra proteína de inte- resse. Assim como a sequenciação de DNA, o método descrito não exige informação anterior sobre a sequência do polipeptídeo. Para refe- rência, a Figura 12 representa um fluxo de trabalho exemplificativo, em- bora não limitante, para o método descrito. Um dos recursos únicos do método descrito é o uso de um par de proteases que cortam ou clivam ligações peptídicas antes e após um aminoácido básico, respectiva- mente. A primeira protease, tal como Tripsina, cliva a ligação peptídica imediatamente após um aminoácido básico, tal como após um resíduo de arginina ou lisina, enquanto a segunda protease, tal como Tryp-N, cliva a ligação peptídica imediatamente antes do aminoácido básico, tal como antes de um resíduo de arginina ou lisina (mapas dos peptídeos produzidos numa digestão de albumina de soro bovino por cada pro- tease são mostrados nas Figuras 1 e 2). Os inventores reconheceram que tal conjunto de proteases poderia ser usado com técnicas de es- pectrometria de massa para determinar a sequência de um polipeptídeo que foi digerida com as duas enzimas separadamente.

[059] Assim, é descrito no presente documento um método para determinar uma sequência de aminoácidos de um polipeptídeo de inte- resse. Em modalidades do método, uma amostra, tal como uma primeira amostra que contém um polipeptídeo de interesse (por exemplo, de se- quência desconhecida), é colocada em contato com a primeira protease sob condições que permitam a primeira protease digerir o polipeptídeo de interesse e produzir fragmentos de peptídeo digeridos, por exemplo, um primeiro conjunto de fragmentos de peptídeo digeridos. A digestão pode ser uma digestão completa ou uma digestão incompleta, por exemplo, para produzir fragmentos sobrepostas. Em modalidades em paralelo, tal como simultaneamente, ou sequencialmente em qualquer ordem, uma amostra, tal como uma segunda amostra dividida da pri- meira amostra, que contém o polipeptídeo de interesse é colocada em contato com a segunda protease, tal como Tryp-N protease sob condi- ções que permitam a segunda protease digerir o polipeptídeo de inte- resse, e produzir fragmentos de peptídeo digeridos, por exemplo, um segundo conjunto de fragmentos de peptídeo digeridos. A digestão pode ser uma digestão completa ou uma digestão incompleta, por exemplo, para produzir fragmentos sobrepostas.

[060] A Figura 3 representa os fragmentos de peptídeo digeridos gerados para uma porção de um polipeptídeo que está ligado por dois aminoácidos básicos, tal como ligado por um resíduo de lisina e/ou um resíduo de arginina, conforme indicado. Conforme mostrado na Figura 3, oito espécies podem ser geradas (quatro para cada enzima) que são ligadas na terminação N ou C por um resíduo de lisina ou um resíduo de arginina, conforme mostrado. No caso (1), a sequência de peptídeos (no contexto de um peptídeo ou proteína maior) é ligada nas extremida- des de terminal N e C pelos resíduos de aminoácido lisina (K). Digestão por Tripsina protease resulta em peptídeos de fragmento que têm um resíduo de aminoácido lisina de terminal C, uma vez que a Tripsina pro- tease corta a cadeia de peptídeo após (isto é, terminal C para) aminoá- cidos lisina. Digestão por Tryp-N protease resulta em peptídeos de fra- gmento que têm um resíduo de aminoácido lisina de terminal N, uma vez que a Tryp-N protease corta a cadeia de peptídeo antes dos (isto é, terminal N para) aminoácidos lisina. No caso (2), a sequência de peptí- deos (no contexto de um peptídeo ou proteína maior) é ligada nas ex- tremidades de terminal N e C pelos resíduos de aminoácido arginina (R). Digestão por Tripsina protease resulta em peptídeos de fragmento que têm um resíduo de aminoácido arginina de terminal C, uma vez que a Tripsina protease corta a cadeia de peptídeo antes dos (isto é, terminal C para) aminoácidos arginina. Digestão por Tryp-N protease resulta em peptídeos de fragmento que têm um resíduo de aminoácido arginina de terminal N, uma vez que a Tryp-N protease corta a cadeia de peptídeo antes dos (isto é, terminal N para) aminoácidos arginina. No caso (3), a sequência de peptídeos (no contexto de um peptídeo ou proteína maior) é ligada na extremidade de terminal N por um resíduo de aminoácido lisina e na extremidade de terminal C por um resíduo de aminoácido arginina. Digestão por Tripsina protease resulta em peptídeos de frag- mento que têm um resíduo de aminoácido arginina de terminal C. Di- gestão por Tryp-N protease resulta em peptídeos de fragmento que têm um resíduo de aminoácido lisina de terminal N. No caso (4), a sequência de peptídeos (no contexto de um peptídeo ou proteína maior) é ligada na extremidade de terminal N por um resíduo de aminoácido arginina e na extremidade de terminal C por um resíduo de aminoácido lisina. Di- gestão por Tripsina protease resulta em peptídeos de fragmento que têm um resíduo de aminoácido lisina de terminal C. Digestão por Tryp- N protease resulta em peptídeos de fragmento que têm um resíduo de aminoácido arginina de terminal N.

[061] Os inventores reconheceram que durante fragmentação, por exemplo, num espectrômetro de massa em tandem, os íons b e y pro- duzidos a partir dos fragmentos de peptídeo digeridos individuais (con- sultar os casos 1 a 4 abordados acima) se diferenciariam na massa pela massa de um resíduo de aminoácido arginina ou um resíduo de amino- ácido lisina dependendo da possibilidade de terem sido digeridos por Tripsina ou Tryp-N. Os inventores reconheceram, adicionalmente, que essa diferença poderia ser explorada para determinar o tipo de íon de terminal N ou terminal C para os íons de fragmento e montar resíduos de aminoácido identificados a partir de uma escada de massa dos íons de fragmento do mesmo tipo com massa incremental pela massa de resíduo (ou resíduos) de aminoácido em sequências específicas de pep- tídeos e que essas sequências de peptídeos poderiam, elas mesmas, ser montadas numa sequência de aminoácidos de comprimento com- pleto de um polipeptídeo, tal como um anticorpo monoclonal. A Tabela 1 mostra a diferença em massa para os íons de fragmento b e y para a digestão de Tripsina e a digestão de Tryp-N subtraindo-se a massa do íon de fragmento de Tryp-N especificado da massa do íon de fragmento de Tripsina especificado.

[062] TABELA 1: DIFERENÇA EM MASSA PARA ÍONS DE FRA- GMENTO B E Y. Sequência Caso 1 K………K Tripsina Tryp-N Diferença b(x) - b(x+1) -K y(x) - y(x-1) +K Sequência Caso 2 R………R Tripsina Tryp-N b(x) - b(x+1) -R y(x) - y(x-1) +R

Sequência Caso 3 K………R Tripsina Tryp-N b(x) - b(x+1) -K y(x) - y(x-1) +R Sequência Caso 4 R………K Tripsina Tryp-N b(x) - b(x+1) -R y(x) - y(x-1) +K

[063] A título de exemplo, para o case (1), a massa de um íon de fragmento b6 da digestão de Tripsina, menos a massa de um íon de fragmento b7 da digestão de Tryp-N, resultaria numa massa que foi ne- gativa em relação à massa de um resíduo de lisina. Alternativamente, a subtração da massa de um íon de fragmento b6 da digestão de Tripsina, da massa de um íon de fragmento b7 da digestão de Tryp-N, resultaria numa massa que foi positiva em relação à massa de um resíduo de lisina. Da mesma maneira, a massa de um íon de fragmento y6 da di- gestão de Tripsina, menos a massa de um íon de fragmento y5 da di- gestão de Tryp-N, resultaria numa massa que foi positiva em relação à massa de um resíduo de lisina. Alternativamente, a subtração da massa de um íon de fragmento y6 da digestão de Tripsina, da massa de um íon de fragmento y5 da digestão de Tryp-N, resultaria numa massa que foi negativa em relação à massa de um resíduo de lisina.

[064] Em modalidades, os fragmentos de peptídeo digeridos a par- tir da primeira digestão de protease, por exemplo, do primeiro conjunto de fragmentos de peptídeo digeridos, são fragmentados para produzir um primeiro conjunto de íons de peptídeo fragmentados, por exemplo, com o uso de um espectrômetro de massa em tandem. As massas do primeiro conjunto de íons de peptídeo fragmentados são, então, deter- minadas, por exemplo, através de espectrometria de massa.

Em moda- lidades, os fragmentos de peptídeo digeridos a partir da segunda diges- tão de protease, por exemplo, um segundo conjunto de fragmentos de peptídeo digeridos, são fragmentados para produzir um segundo con- junto de íons de peptídeo fragmentados, por exemplo, com o uso de um espectrômetro de massa em tandem.

As massas do segundo conjunto de íons de peptídeo fragmentados são, então, determinadas, por exem- plo, através de espectrometria de massa.

Com o uso das massas do primeiro e do segundo conjuntos de íons de peptídeo fragmentados, pa- res correspondentes de íons de peptídeo a partir do primeiro conjunto de íons de peptídeo fragmentados e do segundo conjunto de íons de peptídeo fragmentados são selecionados que diferem em massa por uma massa de um resíduo de aminoácido arginina ou uma massa de um resíduo de aminoácido lisina.

Os termos pares correspondentes de íons de peptídeo devem significar um selecionado a partir do primeiro conjunto e um selecionado a partir do segundo conjunto.

Em modalida- des, o tipo de íon é determinado a partir de pares de íons de peptídeo selecionados a partir dos íons de peptídeo fragmentados e uma escada de massa dos íons de peptídeo do mesmo tipo com a massa incremen- tal pela massa de resíduo (ou resíduos) de aminoácido a partir do pri- meiro conjunto de íons de peptídeo fragmentados ou do segundo con- junto de íons de peptídeo fragmentados é gerada.

Examinando-se a di- ferença de massa de dois íons de peptídeo adjacentes na escada de massa para a massa dos 20 aminoácidos individuais, uma pessoa de habilidade comum na técnica pode determinar os aminoácidos individu- ais que constituem íons de peptídeo fragmentados particulares.

Em de- terminadas modalidades, com o uso de múltiplos íons de peptídeo frag- mentados que correspondem a um peptídeo digerido particular, por exemplo, uma série b de íons de peptídeo fragmentados e/ou uma série y de íons de peptídeo fragmentados (por exemplo, b1, b2, b3, b4, b5, etc., ou y1, y2, y3, y4, etc.) a sequência primária de um peptídeo dige- rido particular pode ser determinada com alta confiança.

A montagem de peptídeos a partir de espectrometria de massa que produziu mapas iônicos nos casos 1 a 4, conforme abordado acima, é mostrada nas Fi- guras 4 a 11C.

Em algumas modalidades do método, atribuir os pares de íons de peptídeo fragmentados para derivar sequências de aminoá- cidos inclui: selecionar um primeiro fragmento de peptídeo digerido a partir do primeiro conjunto de fragmentos de peptídeo digeridos; frag- mentar o primeiro fragmento de peptídeo digerido para produzir uma primeira série de íons de peptídeo fragmentados que correspondem ao primeiro fragmento de peptídeo digerido; selecionar um segundo frag- mento de peptídeo digerido a partir do segundo conjunto de fragmentos de peptídeo digeridos que correspondem ao primeiro fragmento de pep- tídeo digerido; fragmentar o segundo fragmento de peptídeo digerido para produzir uma segunda série de íons de peptídeo fragmentados que correspondem ao segundo fragmento de peptídeo digerido; determinar o tipo de íon para pares selecionados de íons de peptídeo a partir das duas séries de íons de peptídeo fragmentados; selecionar uma escada de massa dos íons de peptídeos do mesmo tipo com a massa incremen- tal pela massa de resíduo (ou resíduos) de aminoácido a partir de qual- quer conjunto de íons de peptídeo fragmentados e determinar resíduos de aminoácido individuais do primeiro e segundo fragmentos de peptí- deo digerido a partir da escada de massa de íons de peptídeo para pro- duzir uma sequência de aminoácidos do primeiro e/ou segundo peptí- deos fragmentados.

Uma vez que a sequência de aminoácidos dos pep- tídeos na digestão é determinada, ou uma fração da mesma, as sequên- cias de aminoácidos atribuídas aos peptídeos podem ser montadas para formar a sequência de aminoácidos do polipeptídeo de interesse, por exemplo, com o uso de um alinhamento de sequência de sequências sobrepostas ou parcialmente sobrepostas, consultar, por exemplo, as Figuras 1 e 2 para BSA.

[065] Em algumas modalidades, o método inclui selecionar um pri- meiro fragmento de peptídeo digerido a partir do primeiro conjunto de fragmentos de peptídeo digeridos; e selecionar um segundo fragmento de peptídeo digerido a partir do segundo conjunto de fragmentos de peptídeo digeridos com uma massa idêntica ao primeiro fragmento de peptídeo digerido (consultar o caso (1) e (2) nas Figuras 4 a 7C). Em modalidades, o método inclui selecionar um primeiro fragmento de pep- tídeo digerido a partir do primeiro conjunto de fragmentos de peptídeo digeridos e selecionar um segundo fragmento de peptídeo digerido a partir do segundo conjunto de fragmentos de peptídeo digeridos com uma massa que tem uma diferença de massa igual à diferença de massa entre um resíduo de aminoácido lisina e um resíduo de aminoá- cido arginina do primeiro fragmento de peptídeo digerido (consultar o caso (3) e (4) nas Figuras 8 a 11C). Em modalidades, o método inclui selecionar um primeiro peptídeo fragmentado a partir do primeiro con- junto de fragmento peptídeos e fragmentar o peptídeo fragmentado se- lecionado para produzir íons de peptídeo fragmentados que correspon- dem ao peptídeo fragmentado selecionado. Em modalidades, os primei- ros íons de peptídeo fragmentados são atribuídos a uma sequência de aminoácidos com base na massa dos íons de peptídeo fragmentados. Em modalidades, uma escada de massa dos íons de peptídeo do mesmo tipo com a massa incremental pela massa de resíduo (ou resí- duos) de aminoácido é gerada em cada conjunto de íons de peptídeo fragmentados. Em modalidades, resíduos de aminoácido individuais identificados a partir do primeiro conjunto de íons de peptídeo fragmen- tados ou do segundo conjunto de íons de peptídeo fragmentados são montados para produzir uma sequência de aminoácidos do primeiro e/ou segundo peptídeos fragmentados.

[066] Em determinadas modalidades, o método inclui selecionar pares de íons de peptídeo a partir do primeiro conjunto de íons de pep- tídeo fragmentados e do segundo conjunto de íons de peptídeo frag- mentados que diferem em massa pela massa de um resíduo de amino- ácido arginina.

Em determinadas modalidades, uma diferença negativa em massa de um resíduo de aminoácido arginina entre um íon de pep- tídeo do primeiro conjunto de íons de peptídeo fragmentados e um íon de peptídeo do segundo conjunto de íons de peptídeo fragmentados in- dica que o peptídeo tem um resíduo de arginina de terminal N.

Em de- terminadas modalidades, uma diferença positiva em massa de um resí- duo de aminoácido arginina entre um íon de peptídeo do primeiro con- junto de íons de peptídeo fragmentados e um íon de peptídeo do se- gundo conjunto de íons de peptídeo fragmentados indica que o peptídeo tem um resíduo de arginina de terminal C.

Em determinadas modalida- des, o método inclui selecionar pares de íons de peptídeo a partir do primeiro conjunto de íons de peptídeo fragmentados e do segundo con- junto de íons de peptídeo fragmentados que diferem em massa pela massa de um resíduo de aminoácido lisina.

Em determinadas modali- dades, uma diferença negativa em massa de um resíduo de aminoácido lisina entre um íon de peptídeo do primeiro conjunto de íons de peptídeo fragmentados e um íon de peptídeo do segundo conjunto de íons de peptídeo fragmentados indica que o peptídeo tem um resíduo de lisina de terminal N.

Em determinadas modalidades, uma diferença positiva em massa de um resíduo de aminoácido lisina entre um íon de peptídeo do primeiro conjunto de íons de peptídeo fragmentados e um íon de peptídeo do segundo conjunto de íons de peptídeo fragmentados indica que o peptídeo tem um resíduo de lisina de terminal C.

Em determina- das modalidades, os íons de peptídeo fragmentados selecionados a partir do primeiro conjunto de íons de peptídeo fragmentados corres- pondem aos íons de peptídeo fragmentados selecionados a partir do segundo conjunto de íons de peptídeo fragmentados. Em determinadas modalidades, os íons de peptídeo fragmentados selecionados a partir do primeiro conjunto de íons de peptídeo fragmentados são íons b e os íons de peptídeo fragmentados selecionados a partir do segundo con- junto de íons de peptídeo fragmentados são íons b que têm uma dife- rença em massa de um resíduo de aminoácido arginina ou uma massa de um resíduo de aminoácido lisina. Em determinadas modalidades, os íons de peptídeo fragmentados selecionados a partir do primeiro con- junto de íons de peptídeo fragmentados são íons y e os íons de peptídeo fragmentados selecionados a partir do segundo conjunto de íons de peptídeo fragmentados são íons y que têm uma diferença em massa de um resíduo de aminoácido arginina ou uma massa de um resíduo de aminoácido lisina.

[067] Em alguns exemplos, as amostras são submetidas ao pré- processamento de amostra, por exemplo, para purificar biomoléculas de interesse, por exemplo, para análise espectral de massa. Em alguns exemplos, o pré-processamento de amostra compreende uma ou mais dentre eletroforese de gel, cromatografia líquida, cromatografia gasosa, eletroforese capilar, eletroforese de gel capilar, cromatografia de foco isoelétrico, cromatografia de papel, cromatografia de camada fina; cro- matografia de nanofluxo, cromatografia de microfluxo, cromatografia de alta taxa de fluxo, cromatografia de fase inversa, cromatografia de fase normal, cromatografia de interação hidrofílica, cromatografia de troca iô- nica, cromatografia grafítica porosa, cromatografia de exclusão de ta- manho, cromatografia com base em afinidade, microfluidos com base em chip, cromatografia líquida de alto desempenho, cromatografia lí- quida de pressão ultra alta ou cromatografia líquida de pressão baixa. Em algumas modalidades, a amostra é submetida ao pré-processa- mento de amostra para remover quaisquer modificações pós-translaci- onais, tal como glicosilação, que podem complicar a determinação da massa de um peptídeo e/ou íon de peptídeo.

[068] É previsto que determinados aspectos e/ou etapas do mé- todo descrito no presente documento possam ser realizadas numa ou mais máquinas de computação, que podem ser parte de um espectrô- metro de massa ou separadas de um espectrômetro de massa.

[069] A Figura 13 representa uma máquina de computação 2000 e um módulo 2050, de acordo com determinadas modalidades exempli- ficativas, para a determinação da sequência de aminoácidos de um po- lipeptídeo, tal como um anticorpo monoclonal ou outra proteína. A má- quina de computação 2000 pode corresponder a qualquer um dos vários computadores, servidores, dispositivos móveis, sistemas embutidos ou sistemas de computação. O módulo 2050 pode compreender um ou mais elementos de hardware ou software configurados para facilitar a máquina de computação 2000 na realização dos vários métodos e fun- ções de processamento apresentados no presente documento. A má- quina de computação 2000 pode incluir vários componentes internos ou anexos, tais como um processador 2010, barramento de sistema 2020, memória de sistema 2030, mídias de armazenamento 2040, interface de entrada/saída 2060 e uma interface de rede 2070 para comunicação com uma rede 2080. Em alguns exemplos, a máquina de computação pode ser parte de um espectrômetro de massa, conectado a um espec- trômetro de massa e/ou ter capacidade para receber dados de um es- pectrômetro de massa, tal como através de uma rede, por exemplo, re- ceber dados de espectros de massa que correspondem aos íons de fra- gmento b e y produzidos num espectrômetro de massa em tandem.

[070] A máquina de computação 2000 pode ser implantada como um sistema computacional convencional, um controlador embutido, um computador do tipo laptop, um servidor, um dispositivo móvel, um tele- fone inteligente, um ou mais processadores associados a uma televisão, uma máquina personalizada, qualquer outra plataforma de hardware, ou qualquer combinação ou multiplicidade dos mesmos. A máquina de computação 2000 pode ser um sistema distribuído configurado para fun- cionar com o uso de múltiplas máquinas de computação interligadas por meio de uma rede de dados ou sistema de barramento.

[071] O processador 2010 pode ser configurado para executar có- digo ou instruções para realizar as operações como funcionalidade des- crita no presente documento, controlar fluxo de solicitação e abordar mapeamentos, e para realizar cálculos e gerar comandos. O processa- dor 2010 pode ser configurado para monitorar e controlar a operação dos componentes na máquina de computação 2000. O processador 2010 pode ser um processador de propósito geral, um núcleo de pro- cessador, um multiprocessador, um processador reconfigurável, um mi- crocontrolador, um processador de sinal digital ("DSP"), um circuito in- tegrado de aplicação específica ("ASIC"), uma unidade de processa- mento de gráficos ("GPU"), uma matriz de portas de campo programável ("FPGA"), um dispositivo de lógica programável ("PLD"), um controla- dor, uma máquina de estado, lógica restrita, componentes de hardware discretos, qualquer outra unidade de processamento ou qualquer com- binação ou multiplicidade dos mesmos. O processador 2010 pode ser uma unidade de processamento única, múltiplas unidades de processa- mento, um único núcleo de processamento, múltiplos núcleos de pro- cessamento, núcleos de processamento de propósito especial, copro- cessadores ou qualquer combinação dos mesmos. De acordo com de- terminadas modalidades exemplificativas, o processador 2010 junta- mente com outros componentes da máquina de computação 2000 pode ser uma máquina de computação virtualizada executada dentro de uma ou mais outras máquinas de computação.

[072] A memória de sistema 2030 pode incluir memórias não volá- teis, tais como memória somente de leitura ("ROM"), memória somente de leitura programável ("PROM"), memória somente de leitura progra- mável apagável ("EPROM"), memória flash ou qualquer outro disposi- tivo que tem capacidade para armazenar instruções de programa ou da- dos com ou sem potência aplicada. A memória de sistema 2030 também pode incluir memórias voláteis, tais como memória de acesso aleatório ("RAM"), memória de acesso aleatório estática ("SRAM"), memória de acesso aleatório dinâmica ("DRAM") e memória de acesso aleatório di- nâmica síncrona ("SDRAM"). Outros tipos de RAM também podem ser usados para implantar a memória de sistema 2030. A memória de sis- tema 2030 pode ser implantada com o uso de um único módulo de me- mória ou múltiplos módulos de memória. Embora a memória de sistema 2030 seja representada como parte da máquina de computação 2000, uma pessoa versada na técnica reconhecerá que a memória de sistema 2030 pode ser separada da máquina de computação 2000 sem que se afaste do escopo da tecnologia em questão. Também deve ser verifi- cado que a memória de sistema 2030 pode incluir, ou operar em con- junto com um dispositivo de armazenamento não volátil, tal como as mídias de armazenamento 2040.

[073] As mídias de armazenamento 2040 podem incluir um disco rígido, um disquete, uma memória somente de leitura de disco compacto ("CD-ROM"), um disco versátil digital ("DVD"), um disco de Blu-ray, uma fita magnética, uma memória flash, outro dispositivo de memória não volátil, uma unidade de estado sólido ("SSD"), qualquer dispositivo de armazenamento magnético, qualquer dispositivo de armazenamento óptico, qualquer dispositivo de armazenamento elétrico, qualquer dispo- sitivo de armazenamento semicondutor, qualquer dispositivo de arma- zenamento de base física, qualquer outro dispositivo de armazena- mento de dados, ou qualquer combinação ou multiplicidade dos mes- mos. As mídias de armazenamento 2040 podem armazenar um ou mais sistemas operacionais, programas de aplicativo e módulos de pro- grama, tais como módulo 2050, dados ou quaisquer outras informações. As mídias de armazenamento 2040 podem ser parte da máquina de computação 2000 ou estar conectadas à mesma. As mídias de armaze- namento 2040 também pode ser parte de uma ou mais outras máquinas de computação que estão em comunicação com a máquina de compu- tação 2000, tal como servidores, servidores de banco de dados, arma- zenamento em nuvem, armazenamento anexo de rede e assim por di- ante.

[074] O módulo 2050 pode compreender um ou mais elementos de hardware ou software configurados para facilitar a máquina de com- putação 2000 com a realização dos vários métodos e funções de pro- cessamento apresentados no presente documento. O módulo 2050 pode incluir uma ou mais sequências de instruções armazenadas como software ou firmware em associação com a memória de sistema 2030, as mídias de armazenamento 2040 ou ambas. As mídias de armazena- mento 2040 podem, portanto, representar exemplos de mídias legíveis por máquina ou computador nas quais instruções, ou código, podem ser armazenados para execução pelo processador 2010. Mídias legíveis por máquina ou computador podem se referir, de modo geral, a qualquer mídia ou mídias usadas para fornecer instruções ao processador 2010. Tais mídias legíveis por máquina ou computador associadas ao módulo 2050 podem compreender um produto de software de computador. Deve ser verificado que um produto de software de computador que compreende o módulo 2050 também pode estar associado a um ou mais processos ou métodos para entregar o módulo 2050 na máquina de computação 2000 por meio da rede 2080, qualquer mídia que car- rega sinal, ou qualquer outra tecnologia de comunicação ou entrega. O módulo 2050 também pode compreende circuitos de hardware ou infor- mações para configurar circuitos de hardware, tais como informações de microcódigo ou configuração para uma FPGA ou outro PLD.

[075] A interface de entrada/saída ("I/O") 2060 pode ser configu- rada para se acoplar a um ou mais dispositivos externos, para receber dados a partir do um ou mais dispositivos externos e para enviar dados para o um ou mais dispositivos externos. Tais dispositivos externos jun- tamente com os vários dispositivos internos também podem ser conhe- cidos como dispositivos periféricos. A interface de I/O 2060 pode incluir ambas conexões elétricas e físicas para acoplar operacionalmente os vários dispositivos periféricos à máquina de computação 2000 ou ao processador 2010. A interface de I/O 2060 pode ser configurada para comunicar dados, endereços e sinais de controle entre os dispositivos periféricos, a máquina de computação 2000 ou o processador 2010. A interface de I/O 2060 pode ser configurada para implantar qualquer in- terface padrão, tal como interface de sistema computacional pequena ("SCSI"), SCSI anexada em série ("SAS"), canal de fibra, interconexão de componente periférico ("PCI"), PCI expressa (PCIe), barramento em série, barramento em paralelo, tecnologia avançada anexa ("ATA"), ATA em série ("SAT A"), barramento em série universal ("USB"), Thunder- bolt, Fire Wire, vários barramentos de vídeo, e semelhantes. A interface de I/O 2060 pode ser configurada para implantar apenas uma interface ou tecnologia de barramento. Alternativamente, a interface de I/O 2060 pode ser configurada para implantar múltiplas interfaces ou tecnologias de barramento. A interface de I/O 2060 pode ser configurada como parte do, todo ou para operar em conjunto com o barramento de sistema

2020. A interface de I/O 2060 pode incluir um ou mais armazenamentos temporários para armazenar temporariamente transmissões entre um ou mais dispositivos externos, dispositivos internos, a máquina de com- putação 2000 ou o processador 2010.

[076] A interface de I/O 2060 pode acoplar a máquina de compu-

tação 2000 aos vários dispositivos de entrada que incluem mouses, te- las sensíveis ao toque, scanners, digitalizadores eletrônicos, sensores, receptores, touchpads, trackballs, câmeras, microfones, teclados, quaisquer outros dispositivos apontadores ou quaisquer combinações dos mesmos. A interface de I/O 2060 pode acoplar a máquina de com- putação 2000 aos vários dispositivos de saída que incluem telas de ví- deo, caixas de som, impressoras, projetores, dispositivos de retroali- mentação tátil, controle de automação, componentes robóticos, atuado- res, motores, ventiladores, solenoides, válvulas, bombas, transmisso- res, emissores de sinal, luzes e assim por diante.

[077] A máquina de computação 2000 pode operar em um ambi- ente em rede com o uso de conexões lógicas através da interface de rede 2070 para um ou mais outros sistemas ou máquinas de computa- ção através da rede 2080. A rede 2080 pode incluir redes de área ampla (WAN), redes de área local (LAN), intranets, a Internet, redes de acesso sem fio, redes com fio, redes móveis, redes de telefone, redes ópticas ou combinações das mesmas. A rede 2080 pode ser comutada por pa- cote, comutada por circuito, de qualquer topologia e pode usar qualquer protocolo de comunicação. Enlaces de comunicação dentro da rede 2080 podem envolver várias mídias de comunicação digitais ou uma mí- dia de comunicação analógica, tais como cabos de fibra óptica, óptica de espaço livre, guia de onda, condutores elétricos, enlaces sem fio, antenas, comunicações de radiofrequência e assim por diante.

[078] O processador 2010 pode ser conectado aos outros elemen- tos da máquina de computação 2000 ou aos vários periféricos através do barramento de sistema 2020. Deve ser verificado que o barramento de sistema 2020 pode estar dentro do processador 2010, fora do pro- cessador 2010 ou ambos. De acordo com algumas modalidades, qual- quer um dentre o processador 2010, os outros elementos da máquina de computação 2000 ou os vários periféricos abordados no presente documento pode ser integrado num único dispositivo, tal como um sis- tema em chip ("SOC"), sistema em pacote ("SOP") ou dispositivo de ASIC.

[079] Modalidades podem compreender um programa de compu- tador que incorpora as funções descritas e ilustradas no presente docu- mento, em que o programa de computador é implantado num sistema computacional que compreende instruções armazenadas numa mídia legível por máquina e um processador que executa as instruções. No entanto, deve ser aparente que pode haver diversas maneiras diferen- tes de implantar modalidades em programação de computador, e as modalidades não devem ser interpretadas como limitadas a nenhuma do conjunto de instruções de programa de computador. Adicionalmente, um programador habilidoso teria capacidade de gravar tal programa de computador para implantar uma modalidade das modalidades descritas com base no fluxograma anexo e/ou descrição associada no texto de aplicação. Portanto, a descrição de um conjunto particular de instruções de código de programa não é considerada necessária para um entendi- mento adequado de como produzir e usar modalidades. Adicional- mente, aqueles versados na técnica verificarão que um ou mais aspec- tos de modalidades descritas no presente documento podem ser reali- zados por hardware, software, ou uma combinação dos mesmos, na medida em que podem estar incorporados num ou mais sistemas de computação. Além disso, qualquer referência a um ato que é realizado por um computador não deve ser interpretada como realizado por um único computador na medida em que mais de um computador pode re- alizar o ato.

[080] As modalidades exemplificativas descritas no presente do- cumento podem ser usadas com hardware e software de computador que realiza os métodos e funções de processamento descritas anterior- mente. Os sistemas, métodos e procedimentos descritos no presente documento podem ser incorporados num computador programável, sof- tware executável por computador ou conjunto de circuitos digital. O sof- tware pode ser armazenado em mídias legíveis por computador. Por exemplo, mídias legíveis por computador podem incluir um disquete, RAM, ROM, disco rígido, mídias removíveis, memória flash, cartão de memória, mídias ópticas, mídias magneto-ópticas, CD-ROM, etc. O con- junto de circuitos digital pode incluir circuitos integrados, matrizes de portas, lógica de bloco de construção, matrizes de porta de campo pro- gramável (FPGA), etc.

[081] Os sistemas, métodos e atos exemplificativos descritos nas modalidades apresentadas anteriormente são ilustrativos e, em modali- dades alternativas, determinados atos podem ser realizados numa or- dem diferente, em paralelo uns com os outros, inteiramente omitidos e/ou combinados entre diferentes modalidades exemplificativas, e/ou determinados atos adicionais podem ser realizados sem que se afaste do escopo e espírito de várias modalidades. Consequentemente, tais modalidades alternativas são incluídas nos exemplos descritos no pre- sente documento.

[082] Embora modalidades específicas tenham sido descritas acima em detalhes, a descrição é meramente para fins de ilustração. Deve ser verificado, portanto, que diversos aspectos descritos acima não pretendem ser necessários ou elementos essenciais a menos que seja afirmado explicitamente de outra forma. Modificações dos aspectos descritos das modalidades exemplificativas, e componentes ou atos equivalentes que correspondem aos mesmos, além daquelas descritas acima, podem ser feitas por uma pessoa de habilidade comum na téc- nica, com o benefício da presente descrição, sem que se afaste do es- pírito e escopo das modalidades definidas nas seguintes reivindicações, o escopo da mesma deve ser de acordo com a interpretação mais am- pla, de modo a englobar tais modificações e estruturas equivalentes.

[083] Os seguintes exemplos são fornecidos para ilustrar recursos particulares de determinadas modalidades. No entanto, os recursos par- ticulares descritos abaixo não devem ser considerados como limitações no escopo da invenção, mais sim como exemplos dos quais equivalen- tes serão reconhecidos por aqueles de habilidade comum na técnica.

EXEMPLO

[084] O seguinte exemplo é colocado de modo a fornecer àqueles de habilidade comum na técnica uma descrição e descrição completas de como produzir e usar os métodos da invenção, e não pretende limitar o escopo do que os inventores consideram sua invenção. Foram reali- zados esforços para garantir a precisão com relação a números usados (por exemplo, quantidades, temperatura, etc.), porém, alguns erros e desvios de experimento devem ser considerados. A menos que seja in- dicado de outra forma, partes são partes em peso, peso molecular é peso molecular médio a menos que seja indicado, temperatura está em graus Centígrados, temperatura ambiente é de cerca de 25 °C, e a pres- são é atmosférica ou próxima da mesma.

[085] Duas amostras que contêm Albumina de Soro Bovino (BSA) foram submetidas à digestão por Tripsina e Tryp-N, (uma metalopro- tease termofílica com especificidade de terminal N para arginina e lisina desenvolvida no laboratório Cold Spring Harbor e comercialmente dis- ponível pela Protifi, LLC), respeitosamente. As digestões de peptídeo resultantes foram individualmente submetidas à Espectrometria de Massa em Tandem para determinar a sequência de aminoácidos de fra- gmentos de peptídeo digeridos da BSA. A Figuras 1 mostra a cobertura de sequência de albumina de soro bovino (BSA) com o uso de uma di- gestão de Tryp-N protease. A cobertura de sequência é de 91,4%. Vá- rios fragmentos de peptídeo gerados a partir de uma digestão de Tryp- N são mostrados abaixo da sequência de proteínas de BSA (SEQ ID NO: 1). A Figura 2 mostra a cobertura de sequência de BSA com o uso de uma digestão de Tripsina protease. A cobertura de sequência é de 94,2%. Vários fragmentos de peptídeo gerados a partir da digestão de Tripsina são mostrados abaixo da sequência de proteínas de BSA (SEQ ID NO: 1).

[086] Para determinar a sequência dos peptídeos em cada uma das amostras digeridas, peptídeos individuais foram selecionados a par- tir do quadrupolo e submetidas à fragmentação induzida por colisão para produzir íons de fragmento de peptídeo b e y (consultar, por exem- plo, as Figuras, 5A, 5B, 7A, 7B, 9A, 9B, 11A e 11B).

[087] Os mapas iônicos individuais foram, então, usados para de- terminar as sequências primárias dos peptídeos individuais, conforme mostrado nas Figuras 5C, 7C, 9C e 11C, depois do procedimento mos- trado nas Figuras 4, 6, 8 e 10, respectivamente. Brevemente, conforme mostrado na Figura 4 para um polipeptídeo que inclui a sequência KLVNELTEFAK (SEQ ID NO: 2) a digestão com Tripsina rendeu o pep- tídeo LVNELTEFAK (SEQ ID NO: 3). Digestão com Tryp-N rende o pep- tídeo KLVNELTEFA (SEQ ID NO: 4). Os dois peptídeos têm a mesma massa. No entanto, quando fragmentados durante análise de espectro- metria de massa, os íons b e os íons y da digestão de Tripsina diferiram em massa por um único resíduo de lisina dos íons b e íons y da digestão de Tryp-N De maneira similar, conforme mostrado na Figura 6, um poli- peptídeo que inclui a sequência RHPEYAVSVLLR (SEQ ID NO: 6) ren- deu o peptídeo HPEYAVSVLLR (SEQ ID NO: 7) quando digerido com Tripsina. Digestão com Tryp-N rendeu o peptídeo RHPEYAVSVLL (SEQ ID NO: 8). Os dois peptídeos têm a mesma massa. No entanto, quando fragmentados durante análise de espectrometria de massa, os íons b e os íons y da digestão de Tripsina diferiram em massa por um único resíduo de arginina dos íons b e íons y da digestão de Tryp-N Uma situação levemente diferente foi observada para peptídeos ligados por uma mistura de resíduos de arginina e lisina. Conforme mostrado na Figura 8, para um polipeptídeo que inclui a sequência KCCTESLVNR (SEQ ID NO: 10), a digestão com Tripsina rendeu o peptídeo CCTES- LVNR (SEQ ID NO: 11). Digestão com Tryp-N rendeu o peptídeo KCC- TESLVN (SEQ ID NO: 12). No caso dos dois peptídeos não terem a mesma massa. No entanto, quando fragmentados durante a análise de espectrometria de massa, os íons b resultantes de cada peptídeo ou íons y de cada peptídeo se diferem pela massa de um único resíduo de aminoácido lisina (íons b) ou um único resíduo de aminoácido arginina (íons y). A Figura 10 mostra que para um polipeptídeo que inclui a se- quência RFKDLGEEHFK (SEQ ID NO: 14), a digestão com Tripsina ren- deu o peptídeo FKDLGEEHFK (SEQ ID NO: 15). Digestão com Tryp-N rendeu o peptídeo RFKDLGEEHF (SEQ ID NO: 16). No caso de os dois peptídeos não terem a mesma massa. No entanto, quando fragmenta- dos durante a análise de espectrometria de massa, os íons b resultantes de cada peptídeo ou íons y de cada peptídeo se diferem em massa por um único resíduo de aminoácido lisina (íons y) ou um único resíduo de aminoácido arginina (íons b).

[088] Uma vez que os tipos de íon b e y são determinados, uma lista dos íons de peptídeo do mesmo tipo é gerada em cada conjunto de íons de fragmento de peptídeo e uma escada de massa de íons de pep- tídeo com massa incremental pela massa de resíduo (ou resíduos) de aminoácido é gerada a partir da lista. As diferenças de massa entre dois íons de peptídeo adjacentes na escada de massa foram atribuídas ao resíduo (ou resíduos) de aminoácido específico com base na massa dos 20 aminoácidos individuais. Com o uso de um conjunto de íons b e y para um peptídeo, tal como mostrado nas SEQ ID NOS: 2, 6, 10 e 14, tanto da digestão de Tripsina quanto da digestão de Tryp-N, resíduos de aminoácido individuais identificados a partir das mesmas foram usa- dos para montar uma sequência primária para o peptídeo a partir do qual foram derivados. Os peptídeos individuais foram, então, usados para montar a sequência primária de BSA.

[089] A presente invenção não deve ser limitada em escopo pelas modalidades específicas descritas no presente documento. De fato, vá- rias modificações da invenção além daquelas descritas no presente do- cumento se tornarão evidentes para o versado na técnica a partir da descrição anterior e das Figuras anexas. Tais modificações pretendem ser abrangidas pelo escopo das reivindicações anexas.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Método para determinar uma sequência de aminoácidos de um polipeptídeo de interesse, caracterizado pelo fato de que com- preende: colocar uma primeira amostra que contém o polipeptídeo de interesse em contato com uma primeira protease que cliva ligações peptídicas após um aminoácido básico, sob condições que permitem a primeira protease digerir o polipeptídeo de interesse para produzir um primeiro conjunto de fragmentos de peptídeo digeridos; fragmentar o primeiro conjunto de fragmentos de peptídeo digeridos para produzir um primeiro conjunto de íons de peptídeo fragmentados que correspondem aos peptídeos no primeiro conjunto de fragmentos de peptídeo digeridos; determinar massas do primeiro conjunto de íons de peptídeo fragmen- tados; colocar uma segunda amostra que contém o polipeptídeo de interesse em contato com uma segunda protease que cliva ligações peptídicas antes de um aminoácido básico, sob condições que permitem a se- gunda protease digerir o polipeptídeo de interesse para produzir um se- gundo conjunto de fragmentos de peptídeo digeridos; fragmentar o segundo conjunto de fragmentos de peptídeo digeridos para produzir um segundo conjunto de íons de peptídeo fragmentados que correspondem aos peptídeos no segundo conjunto de fragmentos de peptídeo digeridos; determinar massas do segundo conjunto de íons de peptídeo fragmen- tados; selecionar pares de íons de peptídeo a partir do primeiro conjunto de íons de peptídeo fragmentados e do segundo conjunto de íons de pep- tídeo fragmentados que se diferem em massa por uma massa de um resíduo de aminoácido arginina ou uma massa de um resíduo de ami- noácido lisina; atribuir tipo de íon aos pares de íons de peptídeo para gerar uma lista dos íons de peptídeo do mesmo tipo; selecionar uma escada de massa de íons de peptídeo com massa in- cremental pela massa de resíduo (ou resíduos) de aminoácido para identificar resíduos de aminoácido individuais e montar os resíduos de aminoácido identificados para determinar a sequência de aminoácidos do polipeptídeo de interesse.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a primeira protease é uma Tripsina protease.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracteri- zado pelo fato de que a segunda protease é uma Tryp-N protease.

4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente: selecionar um primeiro fragmento de peptídeo digerido a partir do pri- meiro conjunto de fragmentos de peptídeo digeridos; e selecionar um segundo fragmento de peptídeo digerido a partir do segundo conjunto de fragmentos de peptídeo digeridos com uma massa idêntica ao pri- meiro fragmento de peptídeo digerido.

5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente: selecionar um primeiro fragmento de peptídeo digerido a partir do pri- meiro conjunto de fragmentos de peptídeo digeridos; e selecionar um segundo fragmento de peptídeo digerido a partir do se- gundo conjunto de fragmento de peptídeo digerido com uma massa que tem uma diferença de massa igual à diferença de massa entre um resí- duo de aminoácido lisina e um resíduo de aminoácido arginina para o primeiro fragmento de peptídeo digerido.

6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações

1 a 5, caracterizado pelo fato de que o primeiro fragmento de peptídeo digerido a partir do primeiro conjunto de fragmentos de peptídeo digeri- dos é fragmentado para produzir uma primeira série de íons de peptídeo fragmentados que correspondem ao primeiro fragmento de peptídeo di- gerido e o segundo fragmento de peptídeo digerido a partir do segundo conjunto de fragmentos de peptídeo digeridos que correspondem ao pri- meiro fragmento de peptídeo digerido é fragmentado para produzir uma segunda série de íons de peptídeo fragmentados que correspondem ao segundo fragmento de peptídeo digerido; e, em que atribuir os pares de íons de peptídeo para derivar sequências de aminoácidos compreende: atribuir tipo de íon aos pares de íons de peptídeo para gerar uma lista dos íons de peptídeo do mesmo tipo; selecionar uma escada de massa de íons de peptídeo com massa in- cremental pela massa de resíduo (ou resíduos) de aminoácido para identificar resíduos de aminoácido individuais para a lista; e montar os resíduos de aminoácido identificados para determinar a se- quência de aminoácidos do polipeptídeo de interesse.

7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que os pares de íons de peptídeo a partir do primeiro conjunto de íons de peptídeo fragmentados e do se- gundo conjunto de íons de peptídeo fragmentados são selecionados que diferem em massa pela massa de um resíduo de aminoácido argi- nina.

8. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que uma diferença negativa em massa de um resíduo de aminoácido arginina entre pares de íons de peptídeo a partir do primeiro conjunto de íons de peptídeo fragmentados e do segundo conjunto de íons de peptídeo fragmentados indica que o peptídeo tem um resíduo de arginina de terminal N.

9. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que uma diferença positiva em massa de um resíduo de aminoácido arginina entre pares de íons de peptídeo a partir do primeiro conjunto de íons de peptídeo fragmentados e do segundo conjunto de íons de peptídeo fragmentados indica que o peptídeo tem um resíduo de arginina de terminal C.

10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que os pares de íons de peptídeo a partir do primeiro conjunto de íons de peptídeo fragmentados e do se- gundo conjunto de íons de peptídeo fragmentados são selecionados que diferem em massa pela massa de um resíduo de aminoácido lisina.

11. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que uma diferença negativa em massa de um resíduo de aminoácido lisina entre pares de íons de peptídeo a partir do primeiro conjunto de íons de peptídeo fragmentados e do segundo conjunto de íons de peptídeo fragmentados indica que o peptídeo tem um resíduo de lisina de terminal N.

12. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que uma diferença positiva em massa de um resíduo de aminoácido lisina entre pares de íons de peptídeo a partir do primeiro conjunto de íons de peptídeo fragmentados e do segundo conjunto de íons de peptídeo fragmentados indica que o peptídeo tem um resíduo de lisina de terminal C.

13. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que os íons de peptídeo fragmentados selecionados a partir do primeiro conjunto de íons de peptídeo fragmen- tados correspondem aos íons de peptídeo fragmentados selecionados a partir do segundo conjunto de íons de peptídeo fragmentados.

14. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que os íons de peptídeo fragmentados selecionados a partir do primeiro conjunto de íons de peptídeo fragmen- tados são íons b e os íons de peptídeo fragmentados selecionados a partir do segundo conjunto de íons de peptídeo fragmentados são íons b que têm uma diferença em massa de um resíduo de aminoácido argi- nina ou uma massa de um resíduo de aminoácido lisina.

15. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que os íons de peptídeo fragmentados selecionados a partir do primeiro conjunto de íons de peptídeo fragmen- tados são íons y e os íons de peptídeo fragmentados selecionados a partir do segundo conjunto de íons de peptídeo fragmentados são íons y que têm uma diferença em massa de um resíduo de aminoácido argi- nina ou uma massa de um resíduo de aminoácido lisina.

16. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizado pelo fato de que a massa é determinada com o uso de espectrometria de massa.

17. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizado pelo fato de que os íons de fragmento são produ- zidos com o uso de espectrometria de massa em tandem.

18. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo de interesse com- preende uma proteína.

19. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo de interesse com- preende um anticorpo monoclonal.

20. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo de interesse com- preende um anticorpo monoespecífico ou um anticorpo biespecífico.