BR112020026682A2 - Método para aumentar a precisão de medição de bombas ou válvulas microfluídicas, e dispositivo de soldagem e dispositivo de tensionamento para a realização do método - Google Patents

Abstract

a invenção refere-se a método para aumentar a precisão de medição de bombas e válvulas microfluídicas com base em um filme/membrana de cobertura flexível, e uma calha de válvula, em que a superfície da membrana que é voltada para a calha de válvula é aquecida com o uso de um feixe de laser; refere-se ainda a aparelhos (dispositivos de tensionamento e soldagem) associados ao método.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para “MÉTODO

PARA AUMENTAR A PRECISÃO DE MEDIÇÃO DE BOMBAS OU VÁLVULAS MICROFLUÍDICAS, E DISPOSITIVO DE SOLDAGEM E DISPOSITIVO DE TENSIONAMENTO PARA A REALIZAÇÃO DO MÉTODO”.

[0001] A produção técnica de substâncias ativas, vitaminas, peptídeos ou proteínas por microrganismos geneticamente modificados ganhou enorme importância econômica nas últimas três décadas. Na produção industrial dessas substâncias, os sistemas celulares de produção são cultivados em um biorreator que pode conter muitos metros cúbicos de volume. Isso garante que as células possam produzir de forma otimizada, controlando-se o valor do pH, a concentração de nutrientes, o teor de oxigênio da solução e alguns outros parâmetros relevantes para o crescimento e metabolismo das células.

[0002] Em geral, o controle de parâmetros vitais em uma cultura de microrganismos ou cultura de células exige que esses parâmetros sejam medidos em tempo real ou pelo menos em tempo hábil com o uso de um método de medição adequado. Um desvio de um parâmetro vital do valor alvo, então, exige intervenção apropriada. Isso pode ser implantado de forma totalmente automática ou manual pelo operador. Em ambos os casos, é feita uma tentativa de ajustar o parâmetro vital correspondente para o seu valor alvo, pela dosagem de um agente adequado. Por exemplo, um valor de pH que diminui durante o cultivo de células é normalmente corrigido pela dosagem de uma quantidade adequada de uma base adequada; um aumento do valor de pH é corrigido adicionando-se um ácido, adequadamente. O fornecimento de energia dos microrganismos ou células é geralmente realizado pela adição controlada de uma fonte de carbono adequada, frequentemente solução de glicose. Muitas vezes é crucial aqui que os agentes necessários sejam adicionados em quantidades medidas com precisão.

Um excesso ou falta de um agente pode prejudicar a qualidade do produto da substância produzida biotecnologicamente, paralisar totalmente a produção ou, pelo menos, comprometer o rendimento espaço-temporal.

[0003] Em uma escala técnica, ou seja, quando as células são cultivadas em várias centenas ou mesmo muitos milhares de litros de fluido de cultura, a dosagem de agentes para ajustar as condições de cultura não é um problema particular, além do fato de que a adição geralmente deve ser realizada em condições completamente estéreis: a quantidade exigida de agente é na faixa de alguns mililitros a litros e, portanto, há diversas técnicas que permitem que os agentes sejam medidos e dosados com alta exatidão e precisão.

[0004] No entanto, o método descrito acima de primeiro estabelecer as condições de cultura para a produção biotecnológica geralmente exige outras técnicas durante o desenvolvimento do produto, nas quais os parâmetros vitais usados durante a produção devem primeiro ser determinados. Durante esse processo de otimização, os organismos potencialmente adequados gerados por mutagênese aleatória ou manipulação genética direcionada são primeiro triados. Os organismos mais promissores são selecionados e, na próxima etapa, as condições de cultura são variadas, primeiro em etapas mais amplas, depois cada vez mais em etapas menores. É óbvio para todos que não faz sentido realizar tais otimizações em uma escala de milhares, centenas ou mesmo apenas alguns litros. Os custos de cada experimento de otimização individual são substancialmente proporcionais à sua escala. Os custos para agentes, equipamentos e requisitos de espaço no laboratório são fortemente correlacionados ao volume de cultura. O tempo que um operador tem para se dedicar a uma cultura individual também depende em grande parte do seu volume.

[0005] Portanto, não é surpreendente que os cientistas que otimizam uma cultura de células ou micro-organismos e produção biotécnica, que muitas vezes exige centenas ou milhares de experimentos diferentes, se esforcem para realizar esses experimentos em paralelo sempre que possível e na menor escala possível, ou seja, em um volume pequeno.

[0006] Por esse motivo, microbiorreatores paralelos estão sendo usados cada vez com mais frequência na biotecnologia. Os recipientes do reator são muitas vezes dispostos na forma de uma placa de microtitulação, o que, consequentemente, leva a uma matriz de reatores de volume pequeno ou muito pequeno. Isso torna possível executar 6, 24, 48, 96, 384 ou mesmo 1536 culturas simultaneamente em apenas uma placa de microtitulação, muitas vezes no formato padrão de 128 x 85 mm. As condições de reação otimizadas nesse microvolume podem muitas vezes ser transferidas para um formato macroscópico com adaptações relativamente pequenas. Variando-se o número de reatores em uma placa de microtitulação, os volumes de trabalho variam significativamente de acordo: embora mesmo escalas de menos de 10 ml sejam, em geral, denominadas como microrreatores, uma redução adicional do volume para menos de 1 ml, menos de 500 µl, 100 μl ou até menos de 10 μl permite considerável economia de tempo e custo, especialmente na otimização das condições de cultura com diversas variáveis manipuladas, devido à possibilidade de realizar os experimentos em paralelo. No entanto, a dosagem de agentes, muitas vezes denominados aqui como agentes de controle, que são necessários para manter as condições de cultura dentro da faixa alvo, muitas vezes representa um grande desafio. Em reatores com volumes abaixo de 1 ml, os agentes de controle geralmente têm que ser dosados lentamente em volumes de µl ou mesmo nl sem qualquer redução significativa nos requisitos em relação à precisão e reprodutibilidade dos experimentos em comparação com as condições em grandes reatores.

[0007] Muitos fabricantes, portanto, gostam de usar tecnologias comprovadas, como seringas ou bombas peristálticas, ao desenvolver tecnologias para a adição de agentes de controle em escala média. Essas tecnologias permitem uma taxa de entrega estável e reproduzível, pelo menos em uma escala de µl, com certas restrições, mesmo em uma escala de nl. No entanto, o uso dessas bombas na tecnologia de microbioprocessos tem a desvantagem de que as condições estéreis geralmente só podem ser garantidas se os tubos e seringas forem cuidadosamente limpos e esterilizados antes do uso ou se forem usados como artigos de uso único preparados apropriadamente. A configuração de apenas um experimento está associada a um custo e tempo consideráveis, especialmente se o grau de paralelização envolver mais de uma ou duas dúzias de culturas simultâneas. Outros fabricantes de microbiorreatores usam válvulas de dosagem de alta precisão (Applikon) para alimentar líquidos nas câmaras de reação. Também aqui os líquidos entram em contato com as peças das válvulas e essas, portanto, devem ser limpas e esterilizadas antes do uso. Além disso, essa dosagem deve ocorrer através da tampa da placa de microtitulação e, portanto, deve potencialmente romper a barreira estéril. Um sistema descartável de baixo custo e fácil de usar com entrega através do fundo de uma placa de microtitulação seria, portanto, um benefício considerável para o usuário de microbiorreatores.

[0008] Um método interessante para o transporte altamente paralelo de agentes de controle em microbiorreatores é descrito na Patente Europeia EP3055065: Por meio de um sistema microfluídico que consiste em canais de cerca de 100 µm de diâmetro e bombas e válvulas integradas nesses canais, os agentes de controle podem ser bombeados de reservatórios integrados em uma placa de microtitulação, através do fundo de uma placa de microtitulação, para os microrreatores. O uso de válvulas e bombas microfluídicas promete uma boa integrabilidade de muitos microbiorreatores individuais em um sistema de microbiorreator, permitindo assim muitos experimentos paralelos em um espaço de instalação relativamente pequeno. Por meio de um grande número de válvulas, bombas e canais, até 32 câmaras de reação, cada uma com duas vias de dosagem, podem ser controladas simultaneamente e, assim, processos com alto rendimento podem ser executados. Um número superior de até aproximadamente 2.000 câmaras de reação ou mais também pode ser atingido com essa tecnologia.

[0009] A função das bombas e válvulas integradas no chip é baseada no fato de que a maioria das calhas circulares conectadas aos canais são vedadas com um filme ou diafragma flexível. Por meio de pressão de ar, o filme pode ser pressionado para as calhas, o que faz com que o canal seja interrompido e o líquido seja pressionado para fora da calha. Dependendo da disposição dessas calhas/válvulas umas em relação às outras e dependendo da sequência e duração com que o filme é pressionado nessas calhas/válvulas, o líquido pode ser bombeado em uma direção definida em vazões que são definidas em princípio.

[0010] Essas válvulas e bombas microfluídicas (bombas de diafragma) são agora usadas regularmente no setor de ciências biológicas, pois as mesmas podem ser acionadas de forma simples e relativamente barata com o uso de ar comprimido. Se uma câmara de bomba for colocada entre duas válvulas, um movimento peristáltico do líquido pode ser alcançado por uma certa sequência de comutação, o que permite um movimento quase contínuo do líquido sem que as propriedades físicas dos líquidos tenham uma influência significativa no desempenho de bombeamento. Somente com vazões baixas a entrega das bombas se torna visivelmente descontínuo, uma vez que o volume da câmara da bomba é o menor volume distinto de líquido que pode ser movido em uma unidade de tempo. O desafio dessa tecnologia está na cobertura da calha de válvula com um diafragma flexível. Uma ampla variedade de métodos é usada aqui, os quais podem ser divididos em princípio em técnicas de conexão indiretas (conexão ou fixação adesiva) e diretas (união adesiva, união à base de solvente, soldagem térmica ou soldagem ultrassônica) (Tsao et al. 2008).

[0011] O método mais comum de cobrir a calha de válvula é a termofusão ou soldagem térmica do diafragma ao corpo principal por meio de temperatura aumentada ou ultrassom e pressão. Esse método não exige nenhum outro aditivo que possa vazar e ser prejudicial às células. Antes da fixação, o mesmo tem a vantagem de não exigir auxiliares mecânicos. Na soldagem térmica, os substratos são muito aproximados de sua temperatura de transição vítrea e pressionados juntos com a ajuda de um punção de prensagem. A interação de pressão e temperatura gera fluxo de polímero suficiente para criar interdifusão entre as cadeias de polímero das camadas individuais, criando assim uma forte conexão semelhante à força de conexão coesiva do material de base. Um grande desafio na termofusão, no entanto, é a redução da deformação estrutural: A fim de cobrir com precisão as válvulas ou câmaras de bomba com um diafragma flexível, as válvulas devem ter bordas definidas às quais o diafragma é unido. Isso significa que essas válvulas ou câmaras de bomba devem ser relativamente profundas para evitar deformação estrutural significativa causada pelo aquecimento e pressão sobre o filme. A fim de permitir volumes de entrega baixos, o projeto da geometria das válvulas é, portanto, normalmente baseado em áreas de seção transversal pequena com uma profundidade relativamente alta e, portanto, um grande volume morto, o que torna mais difícil a vedação das válvulas. Por outro lado, para atingir uma taxa de vazamento baixa com volume morto baixo, seria útil alcançar uma grande razão entre largura e profundidade da válvula: Quanto mais larga a válvula, menos pressão pneumática é necessária para pressionar o filme de cobertura na válvula durante a operação vedando ou preenchendo, desse modo, a válvula ou, no caso de uma bomba, para transportar todo o volume. Infelizmente, é muito mais difícil soldar termicamente o filme de cobertura nessas calhas de válvula largas e planas do que nas calhas profundas descritas acima. Devido à sua flexibilidade e seu próprio peso, o filme do diafragma pode se assentar nas válvulas e também aderir às mesmas. Isso resulta em válvulas e câmaras de bomba cobertas de forma irregular. O resultado são válvulas de bomba com uma variação alta no volume da câmara da bomba. Isso tem um efeito negativo sobre a reprodutibilidade do processo de bombeamento de bomba para bomba: Uma vez que o volume de entrega da bomba é diretamente proporcional ao volume da câmara, um volume variável da câmara significa diretamente uma reprodutibilidade mais baixa do processo de dosagem ou uma precisão de entrega mais baixa de bomba para bomba.

[0012] Para soldar termicamente um filme flexível em válvulas planas (diâmetro grande, profundidade rasa), mostrou-se, portanto, útil realizar o processo de soldagem, que é caracterizado por temperatura e pressão elevadas, com o auxílio de um punção aquecido que tem rebaixos no local das cavidades da válvula e da câmara da bomba. Isso reduz a transferência de calor para a calha de válvula, o que significa que os filmes flexíveis na calha de válvula se unem com menos facilidade e as bordas das calhas de válvula são deformadas com menos facilidade. Na prática, no entanto, foi demonstrado que a transferência de calor para a câmara da bomba nem sempre pode ser reduzida a tal ponto que a aderência do filme flexível na câmara não seja completamente eliminada. Por outro lado, os rebaixos da válvula no punção de união exigem que o punção seja alinhado de forma extremamente precisa em relação às calhas de válvula. Independentemente dos problemas geralmente associados ao alinhamento mecânico de dois componentes um em relação ao outro, mesmo um aquecimento ligeiramente desigual do punção de união pode resultar em expansão anisotrópica em direções diferentes. A consequência é que as calhas de válvula em um chip microfluídico e os rebaixos no punção de união, mesmo com perfeito alinhamento mecânico, nem sempre ficam concêntricos. Da mesma forma que as válvulas com diafragma de cobertura parcialmente colado, isso também pode levar a uma variação considerável no volume da câmara da bomba. Aqui, também, o desempenho de bombeamento mostra uma variação considerável de bomba para bomba.

[0013] Mesmo que os sistemas de bomba microfluídica com filme de cobertura flexível sejam, em princípio, bem adequados para uso em microbiorreatores pelas razões acima mencionadas (excelente capacidade paralelização, fácil esterilização, baixos custos, uso simples em um artigo de uso único/descartável), a variação alta na taxa de entrega de bombas diferentes de projeto idêntico de acordo com a técnica anterior atual significa que seu uso para triagem de organismos ou otimização de condições em culturas de células não é possível se o sistema reagir com sensibilidade a ligeiras mudanças nas condições de cultura. Esses sistemas exigem sistemas de dosagem mais precisos.

[0014] A invenção se refere a um método para aumentar a precisão de dosagem de bombas microfluídicas e/ou válvulas com base em um filme de cobertura flexível, denominado como um diafragma, e uma calha de válvula, de acordo com a reivindicação 1.

[0015] Aperfeiçoamentos preferencias são a matéria das reivindicações dependentes.

[0016] É, portanto, vantajoso que o diafragma seja soldado ao corpo de válvula por meio do feixe de laser. Além disso, o diafragma ou o corpo de válvula podem ser dotados de um adesivo termoativável. Faz sentido usar o feixe para fixar o diafragma ao corpo de válvula como uma junção ao longo da borda da calha de válvula. A superfície do diafragma voltada para a calha de válvula pode ser aquecida pela radiação que incide sobre o diafragma. Isso é particularmente fácil se a radiação incidir sobre a superfície através do diafragma. No entanto, a radiação também pode atingir a superfície através do corpo de válvula. A fim de obter uma superfície particularmente lisa de encontro à qual o diafragma está em contato, a superfície do corpo de válvula pode ser polida antes da fixação. A superfície do corpo de válvula pode ter sido gravada com plasma antes da fixação, gravada com um feixe de íons, alisada por modificação química e/ou a superfície do corpo de válvula pode ter sido hidrofilizada antes da fixação. O objetivo aqui é garantir que a superfície do corpo de válvula tenha um valor médio de rugosidade (valor Ra) inferior a 100 nm, de preferência inferior a 50 nm e muito preferencialmente inferior a 20 nm antes de ser fixada em torno da calha de válvula. Para determinar esse valor medido, a superfície é submetida à varredura ao longo de uma distância de medição definida e todas as diferenças de altura e profundidade da superfície são registradas. Depois de calcular a integral determinada dessa curva de rugosidade ao longo da distância de medição, o resultado é dividido pelo comprimento da distância de medição.

[0017] A bomba deve ser usada para bombear líquidos com vazões abaixo de 1 ml/h; mas particularmente com vazões abaixo de 100 µl/h e muito particularmente na faixa de 0,01 a 80 µl/h. Também é vantajoso se a bomba for usada para entregar líquidos com um volume de bomba por curso de bomba entre 5 nl/curso e 1 µl/curso, mas particularmente com um volume de bomba entre 25 nl/curso e 500 nl/curso e muito particularmente na faixa de 75 a 250 nl/curso. A variação reduzida de bomba para bomba da taxa de entrega em comparação com uma bomba produzida por termofusão com um punção de união aquecido é obtida soldando-se o lado superior da calha de válvula com um diafragma flexível com o uso de um feixe de laser. A imprecisão da orientação do feixe de laser na direção x-y deve ser inferior a 1 milímetro, preferencialmente inferior a 50 micrômetros e muito preferencialmente inferior a 5 micrômetros. A fim de poder soldar também filmes/diafragmas de cobertura produzidos de polímeros transparentes em calhas de válvula que também são produzidas de polímeros transparentes, o que permite medições ópticas em diferentes partes do espectro dentro da bomba ou ao redor da bomba, polímeros diferentes com faixas de transmissão diferentes podem ser usados, os quais são soldados com lasers UV, feixes de laser visíveis ou com lasers infravermelhos. A faixa de comprimento de onda preferencial desse laser é entre 0,1 e 1.000 micrômetros, preferencialmente entre 0,4 e 50 micrômetros e muito preferencialmente entre 0,78 e 3 micrômetros. Nessa faixa espectral (próxima ao infravermelho), muitos polímeros têm bandas de absorção características e podem, portanto, ser aquecidos por um feixe de laser focado além de seu ponto de amolecimento em pontos definidos precisamente, sem o uso de absorvedores adicionais no plástico ou na superfície do plástico (solda de transmissão sem absorvedor). Plásticos como poliestireno ou copolímeros de etileno- norborneno (COC ou COP), que são altamente transparentes à luz visível, também podem ser soldados sem absorvedores. A potência do feixe laser está entre 0,01 e 1.000 watts, preferencialmente entre 0,1 e 100 watts e muito preferencialmente entre 3 e 50 watts.

[0018] A vantagem de soldar filme de diafragma e calha de válvula com um laser em vez de uni-los termicamente com um punção de união é que o laser pode ser ajustado muito melhor do que um punção de união aquecida e que o processo de soldagem não ocorre sobre uma área grande, mas é limitado a uma linha de uma junção cuja geometria e curso podem ser determinados por uma orientação exata do laser com uma imprecisão x-y de menos de 3 µm. A largura da junção de solda aqui é inferior a 1 milímetro, preferencialmente entre 250 e 20 micrômetros. É vantajoso que a fixação seja realizada ao longo de uma linha cuja largura é de 20 micrômetros a 3 milímetros, preferencialmente entre 30 e 500 micrômetros e, de forma particularmente preferencial, entre 50 e 300 micrômetros. Devido à orientação precisa do laser e à pequena largura da junção, a descentralização da calha de válvula e da borda entre o filme de diafragma soldado e não soldado, o que é difícil de evitar no caso de colagem térmica com punções de junção, bem como a aderência do filme de diafragma na calha de válvula devido à soldagem não intencional são evitados.

[0019] A orientação precisa da junção de solda e a baixa entrada de calor resultante na calha de válvula, no entanto, nem sempre impede a união não térmica do filme de diafragma e da calha de válvula. Isso é particularmente verdadeiro se a espessura do filme de válvula for maior do que a profundidade da calha de válvula ou se a espessura do filme e a profundidade do canal forem pelo menos de uma ordem de magnitude semelhante. Nesse caso, pressionar o filme pré-tensionado sobre o chip de plástico, o que é preferencial para uma solda forte, pode resultar em que o filme de diafragma também seja pressionado na calha de válvula. Embora uma orientação local precisa do feixe de laser e uma dosagem exata de sua potência evitem com segurança a soldagem do filme na calha de válvula, a interação hidrofílica da superfície menos polar da calha de válvula no chip de plástico e a superfície igualmente menos polar do filme de diafragma pode fazer com que o filme e o chip adiram um ao outro. Uma possível carga eletrostática das superfícies menos eletricamente condutoras também pode promover tal adesão. Além disso, a rugosidade da superfície da calha de válvula, que pode parecer uma lixa irregular quando observada com um microscópio com ampliação adequada, pode fazer com que um filme de diafragma relativamente macio fique emaranhado com essas estruturas semelhantes a uma lixa quando pressionado para soldagem nessa rugosidade microscópica da válvula. Todos os efeitos acima, sozinhos ou em combinação, podem levar a uma interação entre o filme de diafragma e a calha de válvula, fazendo com que o processo de bombeamento seja prejudicado. Isso pode resultar em um desempenho de bombeamento reduzido ou falha da bomba de diafragma. Em contraste com uma soldagem térmica acidental da calha de válvula e do filme de diafragma, que é um efeito colateral frequente, especialmente no caso da união/soldagem térmica com um punção de metal aquecido descrito acima, as interações entre o diafragma e o filme descritas no caso de soldagem a laser são pelo menos parcialmente reversíveis. As mesmas podem, portanto, ser parcialmente revertidas durante o processo de bombeamento. No entanto, a força com a qual o filme de diafragma e a calha de válvula podem interagir é às vezes tão substancial que devem ser tomadas contramedidas adequadas.

[0020] Um método fundamentalmente simples para reduzir as interações mecânicas entre o chip e o filme de diafragma, que podem resultar da microrrugosidade da calha de válvula, é alisar a superfície das calhas de válvula. Uma vez que o chip com suas calhas de válvula é produzido preferencialmente por moldagem por injeção, é, portanto, particularmente adequado alisar as calhas de válvula no molde de injeção, que em princípio representam estruturas convexas facilmente acessíveis ali, por polimento. Dessa forma, as rugosidades podem ser reduzidas a uma granulometria de alguns nanômetros. As interações do filme de diafragma e da calha de válvula podem, portanto, ser significativamente reduzidas em comparação com as interações produzidas por um chip cujo molde de injeção correspondente foi apenas fresado e alisado.

Embora muito simples em princípio, as exigências manuais sobre o polimento fino de um molde de injeção produzido de metal, as vezes metal duro, na faixa nanométrica são muito altas.

Alisar as calhas de válvula no corpo do chip é tecnicamente menos exigente.

Devido ao material muito mais macio usado aqui, normalmente poliestireno, poliolefina ou outro plástico, polir as calhas de válvula é mais fácil do que polir o molde de injeção, mas ao preço de ter que retrabalhar cada chip injetado e não apenas um molde.

Além do polimento, a superfície nas calhas de válvula dos chips também pode ser alisada quimicamente.

Aqui, é preferencial usar solventes, que atacam o polímero a partir do qual o chip é produzido, de forma limitada.

Estruturas finas, como o microgrão de uma calha de válvula, podem ser niveladas.

Para chips de poliolefina, são usadas misturas de tetra- hidrofurano (THF) com água (preferencialmente 5 a 70% de teor de THF) ou misturas de metiletilcetona (MEK) com água (preferencialmente 5 a 25% de teor de MEK). Para poliestireno, isopropanol misturado com água é recomendado.

Em geral, uma mistura de um solvente que ataca o polímero do qual a calha de válvula é produzida e um solvente ao qual a calha de válvula é resistente deve ser usada.

Isso permite que sejam produzidas misturas às quais a calha de válvula é relativamente resistente, mas não inerte.

Dessa forma, as estruturas muito finas que causam a rugosidade da calha de válvula podem ser alisadas sem comprometer significativamente as estruturas muito mais grosseiras que representam os canais no chip e as cavidades das calhas de válvula.

Misturas de solventes contendo componentes que não são miscíveis com água também podem ser usadas para alisar as calhas de válvula.

Misturas de solventes clorados, como clorofórmio ou diclorometano com etanol ou isopropanol são particularmente adequadas para o alisamento de superfícies de poliolefinas.

Métodos físico-químicos, como gravação com plasma,

também podem ser usados para nivelar as calhas de válvula após a moldagem por injeção ou de chips e válvulas fresados individualmente. Aqui, o chip com as válvulas é exposto em um vácuo (0,001 a 0,1 mbar) a um plasma de oxigênio ou plasma de ar gerado por alta tensão. No processo, as rugosidades finas são atacadas oxidativamente e assim alisadas. Além disso, o plasma provoca a deposição de radicais de oxigênio na superfície do polímero e a formação de produtos de oxidação do polímero. Em particular, são formados ácidos carboxílicos, álcoois, aldeídos, cetonas, epóxidos, oxetanos, peróxidos e outros adutos de oxigênio radical parcialmente mal caracterizados. Todos esses compostos, além de um possível alisamento da superfície das cavidades de válvula, provocam um aumento considerável na polaridade da superfície. Isso reduz as interações hidrofóbicas entre o filme de diafragma e a cavidade da válvula e, portanto, reduz consideravelmente a adesão entre a válvula e o filme.

[0021] Outro método muito bom para reduzir as interações entre a cavidade da válvula e o filme é revestir o interior das válvulas com compostos químicos polares. Os detergentes são particularmente adequados para esse propósito, uma vez que os mesmos se ligam firmemente à superfície do polímero da calha de válvula com sua estrutura parcial lipofílica e, com seu grupo cabeça polar, reduzem a adesão do filme de válvula à calha de válvula quase a zero. Detergentes aniônicos, catiônicos e neutros são adequados para esse propósito. Na prática, esses detergentes são aplicados a partir de uma solução aquosa do detergente na concentração de 0,001 a 1%. Para isso, o chip com as calhas de válvula é imerso brevemente (por pelo menos cerca de um segundo) na solução aquosa do detergente. As extremidades lipofílicas do detergente se orientam automaticamente na superfície do chip/calha de válvula e formam uma camada densa, com os grupos cabeças polares do detergente que se orientam na direção do meio aquoso, a partir do qual os detergentes se difundem da solução em direção ao chip/calha de válvula.

Detergentes adequados para esse propósito são sabões convencionais, isto é, sais alcalinos de ácidos carboxílicos superiores, mas especialmente ácidos carboxílicos poliméricos, como poliacrilatos (Sigma-Aldrich), os quais aderem mais firmemente à superfície do chip ou calha de válvula devido à sua acidez mais alta.

São igualmente adequados os sulfatos ou ácidos sulfônicos, como dodecilsulfatos de sódio (SDS, Sigma-Aldrich) ou análogos poliméricos dos mesmos.

Substâncias naturais de peso molecular mais alto, como lecitina ou compostos semelhantes a lecitina purificados quimicamente (por exemplo, fosfolipon G90, Lipoid AG, Colônia) também provaram ser particularmente adequadas.

A funcionalidade aniônica desses compostos é representada por um grupo fosfato.

Polímeros catiônicos adequados são sais de amônio quaternário com pelo menos um radical alquil superior ("sabões invertidos"), como cloreto de tetradeciltriamônio.

Da forma similar aos polímeros aniônicos, a adsorção no chip/calha de válvula também pode ser aumentada aqui, com o uso de estruturas poliméricas.

A polietileno imina (Sigma-Aldrich) e as poliaminas de alto peso molecular com ou sem grupos amino quaternários provaram ser particularmente adequadas.

Detergentes neutros também são muito adequados para o revestimento hidrofílico da superfície do chip/calha de válvula.

Além de compostos de baixo peso molecular, como Tween 20 (Sigma-Alrich), a classe dos surfynols (por exemplo, Surfynol 61, Surfynol 104, Surfynol AD01, Surfynol AS 5020, Surfynol AS 5040, Surfynol AS 5060, Surfynol AS 5080, Surfynol AS 5180), bem como o Tegopren (Tegopren 5840, Tegopren 5860, Tegopren 5885), provou ser adequado.

Os Surfynols e Tegopren mencionados acima estão todos disponíveis na Evonik, Essen.

Alguns desses compostos são solúveis em água; em alguns casos, é recomendado para o revestimento do chip microfluídico que primeiro se prepare uma solução estoque do polímero neutro com uma concentração de cerca de 10% em isopropanol e, em seguida, se dilua com água até a concentração alvo de 0,001 a 1%.

[0022] Como o revestimento de detergente da borda da válvula à qual o filme de diafragma deve ser soldado pode levar a uma estabilidade reduzida da junção de solda, é recomendado evitar o revestimento da borda da válvula ou reduzir a espessura do revestimento ou não soldar o filme de diafragma, mas, em vez disso, colá-lo a quente. Em qualquer caso, a capacidade muito boa de dosagem da entrada de energia e a precisão de posicionamento de um laser também devem ser usadas para a união adesiva, de modo que um processo de colagem a quente é preferencial à união adesiva convencional.

[0023] Um método prático de restringir o revestimento de detergente ao interior do corpo de válvula, isto é, não revestir hidrofilicamente toda a superfície do chip, é cobrir a região da válvula no chip com uma fita adesiva que é perfurada na posição das calhas de válvula. Dessa forma, durante o tratamento de plasma do chip, apenas o interior das calhas de válvula é exposto ao plasma de oxigênio ou ar, enquanto as bordas da válvula são protegidas pela fita adesiva. Mergulhar o chip assim preparado em uma das soluções de detergente mencionadas acima faz com que apenas o interior das calhas de válvula seja revestido hidrofilicamente, enquanto o revestimento hidrofílico nas bordas da válvula é removido descolando-se a fita adesiva de proteção. A soldagem subsequente é, portanto, possível sem problemas. O uso de detergentes que se ligam preferencialmente na parte da superfície ativada por plasma, mas não na parte que permanece nativa, permite que a fita adesiva protetora seja removida primeiro após a ativação do plasma e então todo o chip seja tratado com solução detergente. O Tegopren 5840 é particularmente adequado para esse tipo de tratamento, o mesmo se liga principalmente à parte ativada por plasma do chip, permitindo assim o tratamento com detergente do chip após a remoção da fita adesiva protetora sem afetar a resistência da soldagem a laser subsequente. Essa propriedade do Tegopren 5840, mas também do Surfynol AS50xx, torna possível dispensar a fita adesiva ao cobrir as bordas da válvula durante a ativação do plasma e usar, em vez disso, uma máscara de cobertura rígida, que é mais fácil de posicionar, mas só pode ser tratada parcialmente ou não pode ser tratada, junto com o chip na solução de detergente. Outros detergentes, como o Phospholipon G90, aderem de forma igualmente boa a um chip ativado por plasma, bem como a um chip não ativado por plasma, permitindo assim o revestimento hidrofílico sem ativação por plasma.

[0024] Para colar os chips a quente, deve-se usar um filme revestido com adesivo termoativável. Revestir o corpo do chip com adesivo só faz sentido se o processo de revestimento garantir que o mínimo possível, mas preferencialmente nenhum adesivo possa penetrar nas calhas de válvula. Isso torna o uso de adesivo diretamente no corpo do chip possível, mas relativamente elaborado. Portanto, revestir o filme com adesivo é normalmente preferencial a revestir o corpo do chip. Para colagem a quente ativada por laser de filme de diafragma e chips, filmes de cola quente comerciais podem ser usados (por exemplo, MH-92824, 93025 ou 92804; Adhesive Research, Dublin, Irlanda) ou filmes de poliolefina revestidos com cola quente à base de poliuretano (filme: Denz BioMedical GmbH, Mäder, Áustria); adesivo: Dispercoll U53 mesclado com 7,5% de Desmodur Ultra DA-L, ambos Covestro AG, Leverkusen). Para a união, o filme de diafragma deve ter uma espessura de 30 a 300 µm. Cerca de 100 µm é preferencial. As espessuras da camada adesiva entre 2 e 100 µm são práticas. Uma espessura de cerca de 7 µm é preferencial. Devido à pós-reticulação de Dispercoll e Desmodur após colagem a quente assistida por laser, a junção adesiva deve ser curada por pelo menos 12 horas antes de atingir a resistência final.

[0025] Além disso, a invenção se refere a um aparelho no qual um laser é movido de forma controlada por computador com as coordenadas de início e fim sendo automaticamente gravadas por uma câmera digital de uma forma tal que o filme/diafragma de cobertura seja vedado nas posições corretas nas proximidades de todas as válvulas e bombas. Além disso, a invenção se refere a um aparelho de tensionamento para tensionar o filme/diafragma de cobertura sem rugas com o pré-estiramento correto e nivelado com o lado superior da válvula, de modo que a pressão exercida pelo filme no lado superior da válvula seja a mesma em todos os lugares de modo a obter uma junção de solda uniforme. No caso de múltiplas ou numerosas calhas de válvula integradas em um chip microfluídico, o aparelho de tensionamento de acordo com a invenção é capaz de tensionar o filme/diafragma da tampa sem rugas, com o pré-estiramento correto e nivelado com a superfície do chip, de modo que o a pressão exercida pelo filme na superfície do chip seja a mesma em todos os lugares para obter uma vedação uniforme.

[0026] Além disso, a invenção se refere a um método e um aparelho para usar as bombas e válvulas descritas para a dosagem ou descarga individual de pequenas quantidades de líquidos ou gases em microrreatores e arranjos de microrreatores, tais como placas de microtitulação.

[0027] As modalidades são mostradas no desenho e são descritas abaixo. No desenho:

[0028] A Figura 1 mostra uma bomba microfluídica com uma pluralidade de válvulas e calhas de válvula vazias,

[0029] A Figura 2 mostra a bomba mostrada na Figura 1 com duas calhas de válvula preenchidas,

[0030] A Figura 3 mostra a bomba mostrada na Figura 1 com uma calha de válvula preenchida,

[0031] A Figura 4 mostra um aparelho de tensionamento para aplicar um diafragma,

[0032] A Figura 5 mostra uma vista lateral de um aparelho de soldagem,

[0033] A Figura 6 é uma vista plana do aparelho de soldagem mostrado na Figura 5,

[0034] A Figura 7 mostra a posição dos parafusos de ajuste no aparelho de soldagem mostrado na Figura 5,

[0035] A Figura 8 mostra a posição dos parafusos de ajuste mostrados na Figura 7 em uma vista plana,

[0036] A Figura 9 mostra a posição dos sensores de força e pinos de posicionamento no aparelho de soldagem mostrado na Figura 5,

[0037] A Figura 10 mostra uma vista de uma câmara de vácuo de vidro,

[0038] A Figura 11 mostra um corte através da câmara de vácuo mostrada na Figura 10,

[0039] A Figura 12 mostra um contorno de válvula sem junção de solda,

[0040] A Figura 13 mostra um contorno de solda, e

[0041] A Figura 14 mostra o contorno de válvula com junção de solda.

[0042] As Figuras 1 a 3 mostram uma sequência de bombeamento de uma pluralidade de bombas microfluídicas 1, 2, 3, em que um diafragma flexível 4 cobre as calhas de válvula 5, 6, 7 de um corpo de válvula 8. Para fixar o diafragma flexível 4 ao corpo de válvula 8, a superfície 9 do diafragma 4 voltada para as calhas de válvula 5, 6, 7 foi aquecida com um feixe de laser. Uma vez que, no presente caso, uma pluralidade de calhas de válvula 5, 6, 7 estão localizadas próximas umas das outras, o diafragma 4 está fixado apenas ao corpo de válvula 8 na área de borda 10.

[0043] Na modalidade, o corpo de válvula 8 é um chip microfluídico 11, acima do qual é disposta uma placa de microtitulação 12. Essa placa de microtitulação 12 contém reservatórios 13 e poços 14. A placa de microtitulação 12 é movida por uma matriz de agitação 15, na qual os canais 16, 17, 18 de um sistema pneumático que atua no diafragma estão dispostos.

[0044] A Figura 2 mostra como o líquido flui do reservatório 13 para as calhas de válvula 5 e 6, e a Figura 3 mostra como o líquido na calha de válvula 7 está conectado ao poço 14.

[0045] A Figura 4 mostra uma mesa de pistão 20 com uma mesa de posicionamento 21 disposta acima da mesma, sobre a qual um diafragma 22 é tensionado. O diafragma 22 repousa sobre um corpo principal de polímero 23 e é mantido em ambos os lados por ímãs 24 e 25, que podem ser movidos ao longo de um trilho na direção das setas 26, 27 para tensionar o diafragma 22.

[0046] O sistema completo do aparelho para soldar uma calha de válvula ou calha de bomba e o filme de cobertura/diafragma de cobertura é mostrado na Figura 5: o aparelho de soldagem 30 contém uma fonte de radiação 31 (por exemplo, laser de fibra de túlio) e um sistema de eixo com os eixos 32 e 33, que permite deslocar o aparelho tensor em um plano, mas pelo menos em uma direção, sob o laser, a fim de gerar uma junção de solda com uma posição definida. O próprio aparelho de tensionamento torna possível fixar pelo menos uma calha de válvula, mas normalmente duas ou mais calhas de válvula ou calhas de bomba integradas em um chip/corpo de polímero 37 ao sistema de eixo móvel. Um diafragma flexível transparente 38 também é tensionado sobre o corpo principal de polímero 37. O aparelho de tensionamento consiste em um cilindro 39 com uma mesa de pistão 40, uma mesa de posicionamento 36, pelo menos quatro parafusos de ajuste 41 e pelo menos quatro sensores de força 42. Os sensores de força 42 permitem que o filme seja tensionado isotropicamente com o auxílio de um colar de tensionamento 34. O aparelho de tensionamento com corpo principal de polímero e diafragma tensionado é pressionado de encontro a uma placa de vidro 35 levantando-se a mesa de pistão. A placa de vidro exerce assim uma pressão sobre o corpo principal de polímero com chip. Ao introduzir a energia do laser através da placa de vidro no diafragma tensionado sobre o corpo principal de polímero, tanto o diafragma quanto o corpo principal de polímero são amolecidos ou fundidos termicamente. A pressão entre a placa de vidro e o corpo principal de polímero induz um fluxo de material entre o diafragma e o corpo principal de polímero, que, após a solidificação dos polímeros fundidos, leva a uma junção de solda estreita, exatamente posicionada e mecanicamente muito durável.

[0047] O corpo principal de polímero é alinhado precisamente na mesa de posicionamento por meio de um aparelho de centralização que consiste, por exemplo, em 2 pinos de posicionamento 43, que se encaixam em orifícios de encaixe correspondentes no corpo principal e é, portanto, trazido para uma posição fixa (Figura 9). A mesa de posicionamento repousa sobre quatro sensores de força 42, que são embutidos na mesa de pistão, que é conectada firmemente a um cilindro. Os quatro sensores de força medem as forças aplicadas aos quatro cantos da mesa de posicionamento retangular quando a mesa de posicionamento pressiona o corpo principal de polímero com o filme tensionado sobre a mesma de encontro à placa de vidro 35 a partir de baixo. A distribuição de força pode ser ajustada por meio de quatro parafusos 41a, 41b, 41c, 41d nos cantos (Figura 7), que são fixados na mesa de posicionamento 36 por meio de uma rosca. Os parafusos reduzem ou aumentam a distância entre a mesa de posicionamento e a mesa de pistão de forma que a pressão de contato naquele ponto seja reduzida ou aumentada, garantindo assim que a pressão de contato seja distribuída uniformemente por todo o corpo principal de polímero.

[0048] A fonte de radiação 31 é posicionada a uma distância com um determinado plano de posição de foco paralelo ao chip 37, de modo que o foco do laser esteja no ou próximo ao plano coberto pelo corpo principal de polímero e pelo filme. Quanto mais próximo o foco do laser estiver desse plano, mais estreita se torna a junção de solda e menor pode ser a potência do feixe do laser. A posição do foco também determina a entrada de energia no corpo de polímero e no filme de diafragma nas posições a serem soldadas e, portanto, a precisão do processo de soldagem. A posição do foco pode ser fixa ou ajustada de forma variável por meio de um sistema de eixo com os eixos 32 e 33, o que permite que o laser seja movido perpendicularmente ao arranjo do corpo principal de polímero com o filme.

[0049] O corpo de polímero 37 e o diafragma 44 são pressionados a partir de baixo por meio do cilindro 39 de encontro a uma placa de vidro 35, que tem uma alta transmissão espectral na faixa de comprimento de onda do laser. Especialmente em uma faixa de comprimento de onda de 1940 nm, o vidro é altamente adequado como um material para pressionar o corpo de polímero de encontro ao filme de diafragma, uma vez que o vidro absorve minimamente a radiação eletromagnética na faixa do infravermelho próximo abaixo do comprimento de onda de 3 µm. Essa placa de vidro é fixada por uma estrutura ou colar de tensionamento 34 e orientada paralelamente à fonte de radiação 31. A distância também é determinada pela posição do foco do laser no corpo de polímero 37.

[0050] Por meio de um sistema de eixos com os eixos 32 e 33, a fonte de radiação 31 pode ser movida paralelamente ao corpo principal de polímero 37 e, assim, percorrer os contornos a serem soldados. A potência e a taxa de avanço do laser podem ser ajustadas de forma variável.

[0051] O movimento do cilindro 39 em relação à fonte de radiação 31 é realizado através de pelo menos dois eixos 32 e 33, que movem o cilindro 39 por meio de uma mesa móvel 45 ou a fonte de radiação 31 no espaço.

[0052] O diafragma flexível 44 pode ser tensionado em paralelo sobre o corpo microfluídico principal 37 por meio de um aparelho de reforço.

[0053] O diafragma flexível pode ser tensionado de várias maneiras. A fim de conseguir uma aplicação paralela ao plano do filme na placa de vidro da melhor maneira possível, é possível gravar microcanais 46 na placa de vidro 35 (Figura 10 com a câmara de vácuo 47 produzida de vidro) por meio de gravação a laser seletiva (Meineke et al. 2016), tornando assim possível criar um vácuo nesses canais por uma bomba de vácuo conectada e, assim, sugar o diafragma flexível de encontro à placa de vidro (Figura 11) antes que o corpo principal microfluídico seja pressionado de encontro à mesma. Isso reduz as irregularidades do diafragma flexível.

[0054] Outra opção de tensionamento usa ímãs que são embutidos na mesa de pistão. O filme é pré-tensionado manualmente sobre o corpo principal e, em seguida, mantido no lugar por outros ímãs de polos opostos. Os ímãs são montados em um trilho fixável que pode ser movido em uma direção para que o filme de diafragma possa ser esticado ainda mais e então fixado na posição desejada (Figura 4). Isso aumenta a precisão do tensionamento.

[0055] Outras formas de tensionar o diafragma flexível são cilindros pneumáticos. Aqui, o diafragma é fixado em um lado (por exemplo, com ímãs), depois tensionado sobre o corpo principal e fixado no lado oposto com um cilindro pneumático, sendo que esse cilindro é fixado em um cilindro adicional montado ortogonalmente, de modo que o diafragma possa ser estirado ou tensionado adicionalmente estendendo-se o cilindro na direção x com desenvolvimento de força definido. Isso resulta em uma tensão homogênea por toda a área de soldagem.

[0056] O corpo principal de polímero contém microestruturas que, em sua totalidade, formam uma pluralidade de bombas e sistemas de válvula em interação com o filme de diafragma. Um grande número de válvulas, câmaras de bomba e canais, bem como entradas e saídas, criam uma matriz microfluídica que permite o transporte de líquido ou gás a partir das entradas de fluido individualmente para os microrreatores.

[0057] Essa matriz pode consistir em um bloco terminal atuador, conforme descrito na Patente Europeia EP3055065, e na matriz de microrreator com chip microfluídico integrado. O chip microfluídico consiste em válvulas que consistem em um segmento esférico com uma vedação de linha concêntrica e um diafragma flexível. Os microcanais levam ao centro da válvula e à circunferência do segmento esférico. O diafragma flexível pode ser movido por meio de um atuador e pode ser fechado e aberto.

[0058] O controle das válvulas de diafragma individuais pode ser realizado por métodos diferentes. Entre outros, canais de controle pneumáticos são possíveis aqui, mas comutadores ativados ótica, térmica, hidráulica, eletromecânica ou magneticamente também podem ser usados para controle de canal de fluido.

[0059] Uma possibilidade é criar um movimento peristáltico, no qual o fluido é primeiro pressionado através da entrada para as válvulas de entrada abertas e a câmara da bomba aberta. Ao fechar subsequentemente as válvulas de entrada, um volume preciso de fluido é retido dentro da câmara da bomba. Ao abrir uma válvula de saída e fechar a câmara da bomba, o volume da câmara da bomba pode ser transportado na direção da saída do canal (Figuras 1 a 3). O volume transportado é amplamente determinado pela precisão da câmara da bomba, que é gerada a partir da estrutura do corpo de polímero e da cobertura pelo filme de diafragma. Com essa técnica também é possível controlar uma pluralidade de canais fluídicos por meio de uma entrada e uma câmara de bomba (Figura 11).

[0060] A invenção descrita aumenta significativamente a precisão da cobertura da válvula; primariamente, a mesma reduz a variação do volume do volume encerrado pela calha de válvula e filme de cobertura, melhorando assim a precisão do processo de dosagem. A razão mecanicista para isso é que a soldagem por transmissão a laser permite uma geometria mais precisa da borda de solda, ou junção de solda. Isso é obtido por uma entrada de energia estritamente limitada localmente e, portanto, amolecimento do substrato apenas em pontos precisamente definidos ou ao longo de junções definidas precisamente. Uma transferência de calor relevante não intencional fora das áreas definidas, especialmente uma entrada de energia na calha de bomba/válvula, é, portanto, quase completamente evitada.

[0061] O corpo de polímero (m2p-labs GmbH, Baesweiler, MTP- MF32-BOH 1 da Topas®) é fixado na mesa de posicionamento conforme descrito e o filme de diafragma (Topas® ELASTOMER E-140, 100 µm de espessura) é tensionado sobre a área para ser soldado. Um exemplo do contorno da válvula antes da soldagem é mostrado na Figura 12. Com o uso de um programa CAD (por exemplo, Autodesk AutoCAD), é criado um contorno de solda correspondente (por exemplo, contorno de solda da Figura 13). Esse contorno de solda pode então ser carregado no programa de soldagem. A velocidade de deslocamento em pontos individuais, a potência do feixe e a posição para ativar e desativar o laser também podem ser definidos. O corpo a ser soldado é então pressionado de encontro à placa de vidro 35 por meio do cilindro

(Festo ADN-100-60-APA) a uma pressão de 0,1 a 5 bar, preferencialmente 0,75 bar. Uma pressão muito alta faz com que o filme de diafragma se deforme e seja pressionado nas válvulas. Uma pressão muito baixa retarda o fluxo de material dentro da junção de solda e, portanto, reduz a resistência da junção de solda. Através da leitura dos sensores de força (ME-Messtechnik KM26), é garantido que a distribuição da força é homogênea ou deve ser reajustada por meio dos parafusos de ajuste. Uma distribuição de força não homogênea leva a um direcionamento não homogêneo do laser.

[0062] Para soldagem pode ser usado um laser de fibra de túlio da empresa "IPG Laser" com comprimento de onda de 1.940 nm. Esse comprimento de onda é adequado devido ao polímero usado (COC, copolímero de ciclo-olefina; um copolímero de norborneno e eteno) ser absorvente nessa faixa de comprimento de onda. Um sistema óptico correspondente com uma distância focal de 20 mm direciona o feixe de laser. Dependendo da taxa de avanço, uma potência do laser de 2 a 50 W é exigida para o processo de soldagem; são preferenciais 5 a 25 watts a uma taxa de avanço do laser de 10 mm/min a 2.000 mm/min, e 8 watts a uma taxa de alimentação de 200 mm/min são particularmente preferenciais. A potência do laser moderada exigida permite a escolha entre um grande número de lasers, como um laser de fibra de túlio da Keopsys (CW_Laser CTFL-TERA) ou o laser IPG (TLM-200 Thulium CW Fiber Laser Module).

[0063] No entanto, o método descrito aqui pode ser usado não só para COC (Topas®), mas também para outros polímeros que absorvem na faixa do infravermelho. Exemplos são poliestireno, metacrilato de polimetila, policarbonato, polietileno, etc.

[0064] A fonte de radiação pode ser movida sobre a área de soldagem nas direções x, y e z por meio de um sistema de eixo (por exemplo, sistemas lineares Bosch Rexroth) para mover a válvula individual, o canal e os contornos da bomba a uma velocidade de, por exemplo, 200 mm/min a uma potência de laser de aproximadamente 8 W. O feixe de laser é ativado aqui apenas nos contornos designados, evitando assim a entrada de energia indesejada. Com uma distância focal de 20 mm, a fonte de radiação é posicionada a uma altura de aproximadamente 17 mm em relação à superfície do corpo de polímero. Essa altura deve ser ajustada alterando-se a distância focal. A fim de não derreter os canais pelo aumento da entrada de energia local, o contorno da solda deve ser gerado a uma distância precisa do canal de aproximadamente 0,3 mm. A Figura 14 mostra um contorno da válvula com junção de solda.

[0065] O diafragma flexível é amolecido apenas nos pontos onde o feixe de laser penetra e é conectado ao corpo principal por fusão térmica. Devido à alta velocidade de deslocamento da fonte de radiação, a fusão dos contornos da válvula ou do canal é evitada e a junção de solda é definida. Uma variação da potência do feixe pode influenciar adicionalmente essa junção. Uma alta precisão do contorno da válvula pode, assim, ser alcançada por uma exatidão suficiente do sistema de eixo. Isso se reflete diretamente na precisão do processo de dosagem.

[0066] Para medir a precisão do fluxo, o chip microfluídico é colado de forma adesiva como a parte inferior de uma placa de microtitulação de 48 poços de uma maneira vedada a ar e líquido. A placa de microtitulação é colocada em um agitador orbital, que mistura os líquidos dentro da placa de microtitulação a até 1.500 rpm (rotações por minuto). A transparência da parte inferior de polímero ou chip microfluídico permite medições ópticas do líquido dentro de cada câmara de reação individual. Por exemplo, os sinais de fluorescência de proteína fluorescente verde, fluoresceína ou riboflavina podem ser detectados. Essa configuração de medição é implantada no BioLector Pro da m2p-labs GmbH, Baesweiler, Alemanha.

[0067] Para medir a vazão, uma mistura de solução tampão aquosa 50 mM (K2HPO4) foi preenchida com fluoresceína 70 µM por meio do canal de entrada do chip microfluídico descrito no documento EP3055065. Com o uso de um guia de onda óptico e filtros ópticos correspondentes com um comprimento de onda de excitação de 436 nm e um comprimento de onda de detecção de 540 nm e os componentes eletrônicos de avaliação do BioLector Pro da m2p-labs, mesmo as menores mudanças na fluorescência nas câmaras de reação acima da placa microfluídica podem ser detectadas.

A solução tampão contendo fluoresceína é transportada da entrada do canal no poço do reservatório para a saída do canal na câmara de reação por meio do atuador descrito do processo de bombeamento.

Na câmara de reação, são fornecidos 800 µl de uma solução tampão que consiste em K2HPO4 50 mM.

O BioLector Pro tem 16 poços reservatórios e 32 câmaras de reação.

A partir de cada poço de reservatório, a solução pode ser transportada através da parte inferior da placa microfluídica para quatro câmaras de reação.

Se a mesma solução tampão contendo fluoresceína for preenchida em todos os poços do reservatório e todas as bombas e válvulas no chip microfluídico forem controladas da mesma maneira, a solução de fluoresceína é transportada da mesma maneira para todas as 32 câmaras de reação.

Essa disposição torna, desse modo, possível verificar se todas as bombas e válvulas que entregam a solução de fluoresceína a partir dos poços de reservatório para os recipientes de reação transportam a solução de fluoresceína da mesma maneira e uniformemente.

Isso pode ser quantificado medindo-se a intensidade da fluorescência da fluoresceína bombeada a partir dos poços de reservatório para as câmaras de reação em intervalos regulares em todas as câmaras de reação e determinando-se a mudança na fluorescência ao longo do tempo.

Essa medição também pode ser realizada de forma totalmente automática no BioLector Pro.

Com 0,5 bar de pressão pneumática, o líquido é bombeado para o canal microfluídico por meio das válvulas de entrada e da câmara da bomba para as válvulas de saída. As válvulas de admissão fecham a 2 bar. A abertura das válvulas de saída permite que a solução de fluoresceína entre na câmara de reação associada correspondente. Ao fechar a câmara da bomba a 2,5 bar, o líquido é transportado para a câmara de reação correspondente. A válvula de saída também é depois fechada pneumaticamente a uma pressão de 1,5 bar. Esse processo de bombeamento é repetido continuamente para todas as 32 câmaras de reação, resultando em um fluxo de 5 µl/h por câmara de reação.

[0068] Durante um período de cerca de 20 h, a mudança no sinal de fluorescência de todas as 32 câmaras de reação da placa de microtitulação é registrada. Após a conclusão da medição, o valor médio da mudança no sinal de fluorescência de todos os 32 valores medidos e o desvio padrão correspondente, bem como o desvio padrão relativo, são determinados. Se todas as bombas microfluídicas no chip foram controladas da mesma maneira, uma vazão idêntica em todas as 32 câmaras de reação seria esperada e, consequentemente, um desvio padrão de zero. Desvios padrão mais altos são um indicador de diferenças entre as bombas ou seu controle, o que resulta em variações na vazão.

[0069] O teste foi realizado várias vezes tanto com chips microfluídicos onde o filme de diafragma é aplicado por termofusão, quanto com chips microfluídicos onde o filme de diafragma foi conectado ao corpo principal de polímero por soldagem a laser. Os resultados mostram para os chips microfluídicos fabricados por soldagem a laser, em comparação com os chips microfluídicos fabricados por ligação por termofusão, um aumento significativo da precisão do processo de bombeamento, ou melhor, uma redução significativa do desvio padrão do gradiente do sinal de fluorescência. O desvio padrão relativo da mudança no sinal de fluorescência ao longo do tempo foi de 12% em média no caso de chips produzidos por ligação por termofusão; para chips soldados a laser o mesmo foi inferior a 7% em média.

[0070] Os componentes acima mencionados, bem como os componentes reivindicados e descritos nas modalidades a serem usadas de acordo com a invenção não são sujeitos a quaisquer condições excepcionais especiais com relação ao seu tamanho, formato, desenho, escolha de material e conceitos técnicos e, portanto, os critérios de seleção conhecidos no campo do pedido podem ser aplicados sem restrições.

Claims (22)

REIVINDICAÇÕES

1. Método para aumentar a precisão de dosagem de bombas microfluídicas 1, 2, 3 ou válvulas que têm um diafragma flexível (4) e um corpo de válvula (8) com pelo menos uma calha de válvula (5, 6, 7), sendo que o diafragma flexível (4) é fixado ao corpo da válvula (8) a fim de cobrir a calha de válvula (5, 6, 7), caracterizado pelo fato de que a superfície (9) do diafragma (4) voltada para a calha de válvula (5, 6, 7) é aquecida com um feixe de laser.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o diafragma (4) é soldado ao corpo da válvula (8) por meio do feixe de laser.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o diafragma (4) ou o corpo da válvula (8) é dotado de um adesivo termoativável.

4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o feixe de laser é usado para produzir uma fixação do diafragma (4) ao corpo da válvula (8) como uma junção ao longo da borda da calha de válvula (5, 6, 7).

5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a superfície do diafragma (4) voltada para a calha de válvula (5, 6, 7) é aquecida por radiação que incide no diafragma (4).

6. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a radiação incide na superfície (9) através do diafragma (4).

7. Método, de acordo com a reivindicação 5 ou 6, caracterizado pelo fato de que a radiação incide na superfície (9) através do corpo da válvula (8).

8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a superfície (9) do corpo da válvula

(8) é polida antes da fixação.

9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que a superfície (9) do corpo de válvula (8) é gravada com plasma antes da fixação.

10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que a superfície (9) do corpo da válvula (8) é gravada com um feixe de íons antes da fixação.

11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que a superfície (9) do corpo da válvula (8) é alisada por uma modificação química antes da fixação.

12. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que a superfície (9) do corpo da válvula (8) é hidrofilizada antes da fixação.

13. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que a superfície (9) do corpo da válvula (8) tem um valor médio de rugosidade (valor Ra) inferior a 100 nm, preferencialmente inferior a 50 nm e muito preferencialmente inferior a 20 nm, antes da fixação em torno da calha de válvula (5, 6, 7).

14. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que a bomba é projetada para entregar líquidos com vazões entre 0,01 µl/h e 1 ml/h, mas particularmente com vazões entre 0,01 e 100 µl/h e muito particularmente na faixa de 0,1 a 80 µl/h.

15. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que a bomba para a entrega de líquidos opera com um volume de bomba por curso da bomba entre 5 nl/curso e 1 µl/curso, mas particularmente com um volume da bomba entre 25 nl/curso e 500 nl/curso e muito particularmente na faixa de 75 a 250 nl/curso.

16. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações

1 a 15, caracterizado pelo fato de que a imprecisão da orientação do feixe de laser na direção x-y é superior a 0,05 micrômetros e inferior a 1 milímetro, de preferência inferior a 50 micrômetros e muito preferencialmente inferior a 5 micrômetros.

17. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizado pelo fato de que para o diafragma (4) e a calha de válvula (5, 6, 7) são usados polímeros diferentes com faixas de transmissão diferentes e são soldados com laser UV, feixes de laser visíveis ou com laser infravermelho.

18. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, caracterizado pelo fato de que o comprimento de onda do feixe de laser se situa entre 0,1 e 1.000 micrômetros, de preferência entre 0,4 e 50 micrômetros e muito preferencialmente entre 0,78 e 3 micrômetros.

19. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, caracterizado pelo fato de que a potência do feixe de laser está entre 0,01 e 1.000 watts, de preferência entre 0,1 e 100 watts e muito preferencialmente entre 3 e 50 watts.

20. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19, caracterizado pelo fato de que a fixação é efetuada ao longo de uma linha cuja largura está entre 20 micrômetros e 3 milímetros, de preferência entre 30 e 500 micrômetros e, de modo particularmente preferencial, entre 50 e 300 micrômetros.

21. Aparelho de soldagem para realizar um método, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 20, caracterizado pelo fato de que tem um laser e um dispositivo para movimento do laser controlado por computador e com uma câmera digital para registrar automaticamente as coordenadas de início e fim do movimento, a fim de soldar o diafragma (4) na periferia de todos as calhas de válvula (5, 6, 7).

22. Aparelho de tensionamento para realizar método, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 20, caracterizado pelo fato de que se destina a tensionar o filme/diafragma de cobertura (4) sem rugas, com o pré-estiramento correto e nivelado com o lado superior da válvula, de modo que a pressão exercida pelo filme no lado superior da válvula seja a mesma em todos os lugares, a fim de obter uma junção de solda uniforme.