BR112020026641A2 - Derivados de piridopirimidinona para o uso como inibidores de axl - Google Patents

Abstract

“derivados de piridopirimidinona para o uso como inibidores de axl''. derivados de piridopirimidinona e composições farmacêuticas compreendendo os mesmos para o uso como um inibidor de axl para o tratamento de uma doença ou condição mediada por axl tal como múltiplos tipos de câncer e metástase, são divulgados. também são divulgados métodos para tratar uma doença ou condição mediada por axl administrando-se a um sujeito uma quantidade terapeuticamente eficaz dos derivados de piridopirimidinona.

Description

“DERIVADOS DE PIRIDOPIRIMIDINONA PARA O USO COMO INIBIDORES DE AXL” Campo da Técnica

[001] A presente invenção se refere a derivados de piridopirimidinona e composições compreendendo o mesmo, que são úteis como inibidores de Axl para o tratamento de uma doença ou condição mediada por Axl.

Fundamentos da Técnica

[002] As proteínas quinases desempenham um papel central na regulação de uma ampla variedade de processos celulares e na manutenção do controle sobre a função celular. As proteínas quinases catalisam e regulam o processo de fosforilação, por meio do qual as quinases anexam covalentemente grupos fosfato a proteínas ou alvos lipídicos em resposta a uma variedade de sinais extracelulares. Estímulos extracelulares, como hormônios, neurotransmissores, fatores de crescimento e diferenciação, eventos do ciclo celular, estresses ambientais e nutricionais, podem afetar uma ou mais respostas celulares relacionadas ao crescimento celular, migração, diferenciação, secreção de hormônios, ativação de fatores de transcrição, contração muscular , metabolismo da glicose, controle da síntese de proteínas e regulação do ciclo celular.

[003] Axl é um membro da família TAM (Tyro3-Axl-Mer) de receptores tirosina quinases que, quando ativados, podem regular a sobrevivência, proliferação, migração e invasão de células tumorais, angiogênese e interações tumor-hospedeiro.

A superexpressão de Axl foi descrita em várias doenças malignas de origem epitelial e hematológica e está frequentemente associada a um prognóstico ruim. Além disso, a expressão de Axl está associada à transição epitelial para mesenquimal (EMT), uma característica frequente de tumores metastáticos frequentemente correlacionados à resistência aos fármacos.

[004] A maior parte da sinalização de Axl ocorre de uma maneira dependente de ligante mediada por uma parada de crescimento específica 6 (GAS6). Após a ligação de GAS6 a Axl, Axl subsequentemente ativa as vias de sinalização a jusante, como fosfoinositídeo 3-quinase (PI3K), sarcoma RAt (RAS) e quinase regulada por sinal extracelular (ERK). No câncer, a sinalização de Axl pode ser ativada por GAS6 de maneira autócrina ou parácrina.

[005] Clinicamente, o Axl é altamente expresso em tumores primários e metástases em comparação aos tecidos normais. A análise imuno-histoquímica de tumores primários revelou que a expressão de Axl se correlaciona com metástases e/ou sobrevida pobre em pacientes com adenocarcinoma de pulmão, glioblastoma multiforme, mama, pâncreas, carcinoma de células renais, adenocarcinoma de esôfago, carcinoma escamoso oral, mesotelioma pleural, adenocarcinoma de ovário, câncer de ovário carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço, carcinoma urotelial, carcinoma de células esofágicas e carcinoma hepatocelular. Além disso, a expressão de Axl se correlaciona com a resistência aos fármacos em pacientes com câncer de mama, melanoma, leucemia mieloide, câncer de pulmão e carcinoma de células renais (ver Rankin e Giaccia, Cancers, 2016, 103: 1-16). Portanto, a sinalização GAS6/Axl como uma via importante que leva ao crescimento do tumor, metástase e resistência aos fármacos.

[006] Além disso, o Axl é um fator chave regulado positivamente por células tumorais para promover resistência a múltiplas estratégias anticâncer, incluindo leucemia mieloide, câncer de pulmão de células não pequenas, câncer de mama triplo negativo (TNBC), esofágico e câncer de ovário. Por exemplo, o nível de Axl está altamente correlacionado com a resistência ao inibidor do receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR) em câncer de pulmão de células não pequenas, resistência ao inibidor de proteína quinases ativadas por mitogênio (MAPK) em melanoma e inibição de EGFR tipo 2 (HER2) humano em pacientes com câncer de mama. Mais importante ainda, a inibição genética e terapêutica de Axl é suficiente para sensibilizar a essas inibições, sugerindo que a inibição de Axl pode melhorar a resposta a terapias anticâncer ser uma estratégia eficaz para prevenir e inibir a resistência aos fármacos e a recorrência em vários tipos de câncer.

[007] Enquanto isso, a Publicação PCT Nº WO 2013/142382 divulga derivados de 4-fenilamino-pirido[4,3,-d]pirimidin-5-ona e seus usos como inibidores de FLT3, entretanto, não divulga seus usos como inibidores de Axl ou para o tratamento de doenças mediadas por Axl.

Divulgação da Invenção Problema da Técnica

[008] Os inventores da presente invenção têm estudado compostos que podem ser usados como um inibidor de Axl e realizaram a presente invenção confirmando que derivados de 4-fenilamino-pirido[4,3,-d]pirimidin-5-ona tendo estruturas específicas inibem efetivamente a atividade do receptor tirosina quinase de Axl e, portanto, podem ser efetivamente usadas para o tratamento de doenças associadas com este.

[009] Consequentemente, um objetivo da presente invenção é fornecer derivados de piridopirimidinona e composições compreendendo os mesmos, que são úteis como inibidores de Axl para o tratamento de uma doença ou condição mediada por Axl tal como múltiplos tipos de câncer e metástase.

Solução para o Problema

[010] Em um aspecto, a presente invenção fornece um uso de um composto representado pela Fórmula (I) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, como um inibidor de Axl para o tratamento de uma doença ou condição mediada por Axl:

(I) em que R1 é arila C6-C10, arila C6-C10 alquila C1-C6, cicloalquila C5-C6 ou cicloalquilmetila C5-C6, opcionalmente substituída com um ou dois R3s; R3 é independentemente fluoro, cloro, bromo, iodo, alquila C1-C6, ou trifluorometila; X é H, fluoro, cloro, bromo, iodo, metila, ou trifluoroetila; Y é cloro, bromo, iodo, alquila C1-C3, ou fenila; R2 é cicloalquila C3-C6 ou heterocicloalquila de 4 a 7 membros, em que a cicloalquila C3-C6 é opcionalmente substituída nos átomos de carbono com um ou dois R4s, e em que a heterocicloalquila de 4 a 7 membros tem 1 ou 2 heteroátomos selecionados a partir do grupo que consiste em nitrogênio, oxigênio, enxofre, sulfona e sulfóxido, e é opcionalmente substituído no átomo de carbono com R4 ou no átomo de nitrogênio com R5; R4 é independentemente hidróxi, hidroxialquila C1-C6, amino, aminoalquila C1-C6, -NH(-alquila C1-C3), -N(-alquila C1-C3)2, alquila C1-C3 ou halo; e R5 é H, alquila C1-C3 ou -C(=O)(-alquila C1-C3), em que a alquila C1-C3 é opcionalmente substituída com 1 a 3 fluoros.

[011] Em um outro aspecto, a presente invenção fornece um uso de estereoisômeros individuais, mistura de estereoisômeros, derivados de pró-fármaco, derivados protegidos, derivados de N-óxido, solvatos ou hidretos de um composto da Fórmula (I) conforme definido acima, como um inibidor de Axl para o tratamento de uma doença ou condição mediada por Axl.

[012] Em um outro aspecto, a presente invenção fornece um uso de um composto conforme definido acima ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, para preparar um medicamento para o tratamento de uma doença ou condição mediada por Axl.

[013] Em um outro aspecto, a presente invenção fornece uma composição farmacêutica compreendendo um composto da Fórmula (I) conforme definido acima ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em combinação com um portador, diluente, adjuvante ou excipiente farmaceuticamente aceitável.

[014] Em um outro aspecto, a presente invenção fornece uma composição farmacêutica compreendendo um composto da Fórmula (I) conforme definido acima ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo como um ingrediente ativo, para o tratamento de uma doença ou condição mediada por Axl.

[015] Em um outro aspecto, a presente invenção fornece um método para tratar uma doença ou condição mediada por Axl, compreendendo administrar a um sujeito em necessidade do mesmo uma quantidade eficaz de um composto da Fórmula (I) conforme definido acima ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

[016] Em um outro aspecto, a presente invenção fornece um método para inibir receptor tirosina cinase de Axl ou para inibir crescimento de células de câncer.

Efeitos Vantajosos da Invenção

[017] Um composto da Fórmula (I) conforme definido acima ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, e uma composição farmacêutica compreendendo o mesmo, inibem o receptor tirosina cinase de Axl e são úteis para o tratamento de uma doença ou condição mediada por Axl, por exemplo, doenças proliferativas celulares tais como múltiplos tipos de câncer e metástase.

Breve Descrição dos Desenhos

[018] As Figuras 1a a 1c mostram resultados em ensaios de migração e invasão de compostos 238 e R428.

[019] As Figuras 2a e 2b mostram uma atividade antitumoral de composto 238 em modelos de câncer de mama 4T1 singênico in vivo.

[020] As Figuras 3a a 3c mostram a atividade anti-metastática de composto 226 em modelo de metástase de pulmão B16F10 in vivo.

[021] As Figuras 4a e 4b mostram a atividade anti-metastática de composto 226 em modelo de metástase de peritoneal CT26 in vivo.

[022] A Figura 5a mostra modelo de metástase espontânea 4T1.

[023] As Figuras 5b e 5c mostram efeito de combinação com anticorpo anti- PD-1 no modelo de metástase ortotrópica 4T1.

[024] A Figura 6 mostra a inibição do crescimento do tumor no local primário (almofada de gordura mamária) no modelo de metástase ortotrópica 4T1.

Melhor Modo para Realizar a Invenção

[025] Em seguida, a presente invenção será descrita em detalhes.

[026] O termo “alquila,” usado sozinho ou como parte de uma porção maior tal como “arilalquila” ou “cicloalquila” se refere a um radical hidrocarboneto linear ou ramificado tendo de 1 a 15 átomos de carbono ou de 1 a 8 átomos de carbono (a menos que indicado de outro modo) e inclui, por exemplo, metila, etila, n-propila, i- propila, n-butila, sec-butila, i-butila, terc-butila, n-pentila, i-pentila, n-hexila e semelhantes. Uma alquila pode ser não substituída ou substituída com um ou mais substituintes adequados.

[027] O termo “cicloalquila” se refere a um grupo do anel de hidrocarboneto monocíclico ou policíclico e inclui, por exemplo, ciclopropila, cicloheptila, ciclooctila, ciclodecila, ciclobutila, adamantila, norpinanila, decalinila, norbornila, ciclohexila, ciclopentila, e semelhantes. Um grupo cicloalquila pode ser não substituído ou substituído com um ou mais substituintes adequados.

[028] O termo “hetero” se refere à substituição de pelo menos um membro de átomo de carbono em um sistema de anel com pelo menos um heteroátomo tal como nitrogênio, enxofre, sulfona, sulfóxido e oxigênio.

[029] O termo “heterocicloalquila” significa um anel monocíclico ou policíclico não aromático compreendendo átomos de carbono e hidrogênio e pelo menos um heteroátomo, de preferência, 1 a 4 heteroátomos selecionados de nitrogênio, enxofre, oxigênio, sulfona, ou sulfóxido. Um grupo heterocicloalquila pode ter um ou mais ligações duplas carbono-carbono ou ligações duplas carbono-heteroátomo no grupo de anel desde que o grupo de anel não seja tornado aromático por sua presença.

[030] Exemplos de grupos heterocicloalquila incluem azetidinila, aziridinila, pirrolidinila, piperidinila, piperazinila, homopiperazinila, morfolino, thiomorfolino, tetra- hidrofuranila, tetrahidrotiofuranila, tetra-hidropiranila, piranila, e semelhantes. Um grupo heterocicloalquila pode ser não substituído ou substituído com um ou mais substituintes adequados.

[031] Como usado aqui, o termo “halo” inclui fluoro, cloro, bromo, e iodo.

[032] Como usado aqui, o termo “alcóxi” se refere aos grupos alquila acima ligados através de oxigênio, exemplos dos quais incluem metóxi, etóxi, i-propóxi, terc- butóxi, e semelhantes. Além disso, alcóxi também se refere a poliéteres tal como -O- (CH2)2-O-CH3, e semelhantes. Um alcóxi pode ser não substituído ou substituído com um ou mais substituintes adequados.

[033] Como usado aqui, o termo “arila” se refere a grupos monocíclicos ou policíclicos aromáticos não substituídos ou substituídos e inclui, por exemplo, fenila e naftila. O termo “arila” também inclui um anel fenila fundido a um anel carbocíclico ou heterocíclico não aromático. O termo “arila” pode ser permutavelmente usado com “anel arila,” “grupo aromático,” e “anel aromático”. Grupos heteroarila têm 4 a 14 átomos, 1 a 9 dos quais são independentemente selecionados a partir do grupo que consiste em oxigênio, enxofre e nitrogênio. Uma arila ou heteroarila pode ser um grupo aromático mono- ou bicíclico. Grupos heteroarila e arila típicos incluem, por exemplo,

fenila, quinolinila, indazoila, indolila, dihidrobenzodioxinila, 3-clorofenila, 2,6- dibromofenila, piridila, pirimidinaila, 3-metilpiridila, benzotienila, 2,4,6-tribromofenila, 4-etilbenzotienila, furanila, 3,4-dietilfuranila, naftila, 4,7-dicloronaftila, pirrolila, pirazolila, imidazolila, tiazolila, e semelhantes. Uma arila ou heteroarila pode ser não substituída ou substituída com um ou mais substituintes adequados.

[034] Como usado aqui, o termo “haloalquila” se refere a qualquer radical alquila tendo um ou mais átomos de hidrogênio substituídos por um átomo de halogênio. Exemplos de haloalquila incluem -CF3, -CFH2, -CF2H, e semelhantes.

[035] Como usado aqui, o termo “hidroxila” ou “hidróxi” se refere a -OH.

[036] Como usado aqui, o termo “amino” se refere a -NH2.

[037] Como usado aqui, o termo “hidroxialquila” se refere a qualquer derivado de hidroxila de radical alquila. O termo “hidroxialquila” inclui qualquer radical alquila tendo um ou mais átomos de hidrogênio substituídos por um grupo hidróxi.

[038] Um “substituinte,” como usado aqui, se refere a uma porção molecular que é covalentemente ligada a um átomo dentro de uma molécula de interesse. Por exemplo, um anel substituinte pode ser uma porção tal como um halogênio, alquila grupo, grupo haloalquila ou outro grupo que é covalentemente ligado a um átomo (de preferência um átomo de carbono ou nitrogênio) que é um membro de anel.

Substituintes de grupos aromáticos são geralmente covalentemente ligados a um átomo de carbono do anel. O termo “substituição” se refere a substituição de um átomo de hidrogênio em uma estrutura molecular com um substituinte, de modo que a valência no átomo designado não seja excedida, e de modo que um composto quimicamente estável (ou seja, um composto que pode ser isolado, CARACTERIZADO, e testado quanto à atividade biológica) resulta da substituição.

[039] Como descrito acima, certos grupos podem ser não substituídos ou substituídos com um ou mais substituintes adequados por outro que não hidrogênio em uma ou mais posições disponíveis, tipicamente 1, 2, 3, 4 ou 5 posições, por um ou mais grupos adequados (que podem ser iguais ou diferentes). Certos grupos, quando substituídos, são substituídos com 1, 2, 3 ou 4 substituintes selecionados independentemente. Substituintes adequados incluem halo, alquila, haloalquila, arila, hidróxi, alcóxi, hidroxialquila, amino, e semelhantes.

[040] Como usado aqui, o termo “quinase” se refere a Axl. Os ensaios de quinase contendo as quinases aqui descritas estão disponíveis comercialmente para o perfil bioquímico de inibidores de quinase quanto à sua seletividade. Em certas modalidades, uma quinase é uma quinase de mamífero, como uma quinase humana.

[041] Como usado aqui, o termo “transtorno dermatológico” se refere a um transtorno de pele. Tais transtornos dermatológicos incluem, mas não estão limitados a, transtornos proliferativos ou inflamatórios da pele, tais como dermatite atópica, transtornos bolhosos, colagenoses, dermatite de contato, eczema, Doença de Kawasaki, rosácea, Síndrome de Sjogren-Larsso e urticária.

[042] Como usado aqui, o termo “doença respiratória” refere-se a doenças que afetam os órgãos que estão envolvidos na respiração, como nariz, garganta, laringe, traqueia, brônquios e pulmões. As doenças respiratórias incluem, mas não estão limitadas a, asma, síndrome da dificuldade respiratória do adulto e asma alérgica (extrínseca), asma não alérgica (intrínseca), asma aguda grave, asma crônica, asma clínica, asma noturna, asma induzida por alérgeno, asma sensível à aspirina, asma induzida por exercício, hiperventilação isocápnica, asma de início infantil, asma de início adulto, asma variante de tosse, asma ocupacional, asma resistente a esteróides, asma sazonal, rinite alérgica sazonal, alérgico perene rinite, doença pulmonar obstrutiva crônica, incluindo bronquite crônica ou enfisema, hipertensão pulmonar, fibrose pulmonar intersticial e/ou inflamação das vias aéreas e fibrose cística e hipóxia.

[043] Como usado aqui, o termo “câncer” se refere a um crescimento anormal de células que tendem a proliferar de forma descontrolada e, em alguns casos, metastatizar. Os tipos de câncer incluem, mas não estão limitados a, tumores sólidos,

tais como os da bexiga, intestino, cérebro, mama, endométrio, coração, rim, pulmão, tecido linfático (linfoma), ovário, pâncreas ou outro órgão endócrino (tireóide), próstata, pele (melanoma) ou tumores hematológicos (como as leucemias).

[044] Como usado aqui, o termo “transtornos inflamatórios” se refere às doenças ou condições que são caracterizadas por um ou mais dos sinais de dor (dolor, da geração de substâncias nocivas e da estimulação dos nervos), calor (calor, de vasodilatação), vermelhidão (rubor, por vasodilatação e aumento do fluxo sanguíneo), inchaço (tumor, por influxo excessivo ou fluxo restrito de fluido) e perda de função, que pode ser parcial ou completa, temporária ou permanente. A inflamação assume muitas formas e inclui, mas não está limitada a, inflamação que é uma ou mais das seguintes, aguda, adesiva, atrófica, catarral, crônica, cirrótica, difusa, disseminada, exsudativa, fibrinosa, fibrosante, focal, granulomatosa, hiperplásica , hipertrófico, intersticial, metastático, necrótico, obliterativo, parenquimatoso, plástico, produtivo, proliferativo, pseudomembranoso, purulento, esclerosante, seroplástico, seroso, simples, específico, subagudo, supurativo, tóxico, traumático e/ou ulcerativo. Os transtornos inflamatórios incluem ainda, sem estar limitado àqueles que afetam os vasos sanguíneos (poliarterite, arterite temporar); articulações (artrite: cristalina, osteo-, psoriática, reativa, reumatóide, Reiter); trato gastrointestinal; pele (dermatite); ou múltiplos órgãos e tecidos (lúpus eritematoso sistêmico).

[045] Como usado aqui, o termo “doença cardiovascular” se refere a doenças que afetam o coração ou os vasos sanguíneos ou ambos, incluindo mas não se limitando a aterosclerose, arritmia, angina, isquemia do miocárdio, enfarte do miocárdio, aneurisma cardíaco ou vascular, vasculite, acidente vascular cerebral, obstrução periférica arteriopatia de um membro, órgão ou tecido, lesão por reperfusão após isquemia de um órgão ou tecido, choque endotóxico, cirúrgico ou traumático, hipertensão, doença cardíaca valvular, insuficiência cardíaca, pressão arterial anormal, vasoconstrição, anormalidade vascular ou inflamação.

[046] Como usado aqui, o termo “inibidor” se refere a um composto que inibe uma ou mais quinases descritas aqui. Por exemplo, o termo “inibidor de Axl” se refere a um composto que inibe o receptor de Axl ou reduz o efeito de sinalização.

[047] Como usado aqui, o termo “farmaceuticamente aceitável” se refere a um material, tal como um portador ou diluente, que não anula a atividade biológica ou propriedades dos compostos descritos neste documento. Tais materiais são administrados a um indivíduo sem causar efeitos biológicos indesejáveis ou interagir de forma deletéria com qualquer um dos componentes da composição na qual está contido.

[048] Como usado aqui, o termo “sal farmaceuticamente aceitável” se refere a uma formulação de um composto que não causa irritação significativa a um organismo ao qual é administrado e não anula a atividade biológica e as propriedades dos compostos aqui descritos.

[049] Como usado aqui, o termo “combinação farmacêutica” significa um produto que resulta a partir da mistura ou combinação de mais do que um ingrediente ativo.

[050] Como usado aqui, o termo “composição farmacêutica” se refere a uma mistura de um composto descrito aqui com outros componentes químicos, tais como portadores, estabilizadores, diluentes, agentes dispersantes, agentes de suspensão, agentes espessantes e/ou excipientes.

[051] Como usado aqui, o termo “pró-fármaco” se refere a um agente que é convertido em um fármaco ativo ou “precursor” in vivo.

[052] Como usado aqui, o termo “solvato” se refere a um complexo de estequiometria variável formado por um soluto (nesta invenção, um composto de Fórmula (I) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo) e um solvente. Tais solventes para o propósito da invenção podem não interferir com a atividade biológica do soluto. Exemplos não limitativos de solventes adequados incluem água, acetona,

metanol, etanol e ácido acético. De preferência, o solvente utilizado é um solvente farmaceuticamente aceitável. Exemplos não limitativos de solventes farmaceuticamente aceitáveis adequados incluem água, etanol e ácido acético.

[053] Como usado aqui, o termo “doença mediada por proteína quinase” ou um “transtorno ou doença ou condição mediada por atividade inadequada de proteína quinase” se refere a qualquer estado de doença mediado ou modulado por proteína quinases aqui descrito. Tais estados de doença incluem, mas não estão limitados a, linfoma, osteossarcoma, melanoma, câncer de mama, câncer renal, câncer de próstata, câncer colorretal, câncer de tireóide, câncer de ovário, câncer pancreático, câncer neuronal, câncer de pulmão, câncer uterino e câncer gastrointestinal.

[054] Como usado aqui, o termo “doença mediada por Axl” ou um “transtorno ou doença ou condição mediada por atividade inadequada de Axl” se refere a qualquer estado de doença mediado ou modulado por mecanismos de quinase de Axl. Tais estados de doença incluem, mas não estão limitados a, AML, ALL, tumores sólidos, outros transtornos proliferativos ou uma condição associada a níveis aberrantemente aumentados de quinase de Axl.

[055] Como usado aqui, o termo “tratar,” “tratando” ou “tratamento” se refere a métodos de alívio, redução ou melhoria de sintomas de uma doença ou condição, prevenção de sintomas adicionais, melhoria ou prevenção das causas metabólicas subjacentes dos sintomas, inibição da doença ou condição, interrompendo o desenvolvimento da doença ou condição, aliviando a doença ou condição, causando a regressão da doença ou condição, aliviando uma condição causada pela doença ou condição, ou parando os sintomas da doença ou condição profilática e/ou terapeuticamente.

[056] O termo “um sujeito em necessidade” como usado aqui se refere a qualquer animal, no qual uma doença associada à atividade da proteína quinase foi ou pode ser desenvolvida, tal como um macaco, uma vaca, um cavalo, uma ovelha,

um porco, uma galinha, um peru, uma codorna, um gato, um cachorro, um camundongo, um rato, um coelho e uma cobaia, bem como um ser humano (um paciente); e especificamente, pode significar um mamífero. Além disso, o sujeito em necessidade pode ser uma amostra biológica.

[057] Como usado aqui, o termo “quantidade eficaz” ou “quantidade terapeuticamente eficaz” se refere a uma quantidade suficiente de um composto descrito neste documento sendo administrado que irá aliviar até certo ponto um ou mais dos sintomas da doença ou condição a ser tratada. O resultado pode ser a redução e/ou o alívio dos sinais, sintomas ou causas de uma doença, ou qualquer outra alteração desejada de um sistema biológico. Por exemplo, uma “quantidade eficaz” para usos terapêuticos é a quantidade da composição que compreende um composto conforme divulgado neste documento, necessário para fornecer uma diminuição clinicamente significativa nos sintomas da doença. Uma quantidade “eficaz” apropriada em qualquer caso individual pode ser determinada usando técnicas, como um estudo de escalonamento de dose. A título de exemplo apenas, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto de Fórmula (I) pode estar na faixa de, por exemplo, cerca de 0,01 mg/kg/dia a cerca de 100 mg/kg/dia, ou cerca de 0,1 mg/kg/dia a cerca de 10 mg/kg/dia.

[058] Em um aspecto, a presente invenção fornece um uso de um composto representado pela Fórmula (I) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, como um inibidor de Axl para o tratamento de uma doença ou condição mediada por Axl: (I)

em que R1 é arila C6-C10, arila C6-C10 alquila C1-C6, cicloalquila C5-C6 ou cicloalquilmetila C5-C6, opcionalmente substituída com um ou dois R3s; R3 é independentemente fluoro, cloro, bromo, iodo, alquila C1-C6, ou trifluorometila; X é H, fluoro, cloro, bromo, iodo, metila, ou trifluoroetila; Y é cloro, bromo, iodo, alquila C1-C3, ou fenila; R2 é cicloalquila C3-C6 ou heterocicloalquila de 4 a 7 membros, em que a cicloalquila C3-C6 é opcionalmente substituída nos átomos de carbono com um ou dois R4s, e em que a heterocicloalquila de 4 a 7 membros tem 1 ou 2 heteroátomos selecionados a partir do grupo que consiste em nitrogênio, oxigênio, enxofre, sulfona, ou sulfóxido, e é opcionalmente substituído no átomo de carbono com R4 ou no átomo de nitrogênio com R5; R4 é independentemente hidróxi, hidroxialquila C1-C6, amino, aminoalquila C1-C6, -NH(-alquila C1-C3), -N(-alquila C1-C3)2, alquila C1-C3 ou halo; e R5 é H, alquila C1-C3 ou -C(=O)(-alquila C1-C3), em que a alquila C1-C3 é opcionalmente substituída com 1 a 3 fluoros.

[059] Em certas modalidades, R1 é fenila, benzila, ciclopentila, ciclohexila, ciclopentilmetila, ou ciclohexilmetila, opcionalmente substituída com um ou dois R3s.

[060] Em certas modalidades, R3 é independentemente fluoro, cloro, metila, ou isopropila.

[061] Em certas modalidades, R3 é independentemente cloro, fluoro ou metila.

[062] Em certas modalidades, R3 é independentemente cloro ou fluoro.

[063] Em certas modalidades, X é fluoro ou metila.

[064] Em certas modalidades, Y é cloro, bromo, iodo, metila ou fenila.

[065] Em modalidades adicionais, Y é cloro ou bromo.

[066] Em modalidades adicionais, Y é bromo.

[067] Em certas modalidades, R2 é pirrolidinila, ou piperidinila.

[068] Em certas modalidades, R2 é N-metilpirrolidinila ou N-metilpiperidinila.

[069] Em certas modalidades, R2 é piperidinila ou pirrolidinila substituída no átomo de nitrogênio com R5.

[070] Em certas modalidades, R5 é metila, etila, trifluoroetila, ou i-propila.

[071] Em certas modalidades, R5 é metila.

[072] Em certas modalidades, R4 é independentemente hidróxi, amino, ou N- metilamino.

[073] Em certas modalidades, o composto da Fórmula (I) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo é cloridreto de 8-bromo-2-((1-metilpiperidin- 4-il)amino)-4-((3-fenoxifenil)amino)pirido[4,3-d]pirimidin-5(6H)-ona, ou cloridreto de 8- bromo-4-((4-(3-fluorofenoxi)fenil)amino)-2-((1-metilpiperidin-4-il)amino)pirido[4,3- d]pirimidin-5(6H)-ona.

[074] Em certas modalidades, o composto da Fórmula (I) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo é cloridreto de 8-bromo-4-((3-fluoro-4- fenoxifenil)amino)-2-((1-metilpiperidin-4-il)amino)pirido[4,3-d]pirimidin-5(6H)-ona.

[075] Em um outro aspecto, a presente invenção fornece um uso de estereoisômeros individuais, mistura de estereoisômeros, derivados de pró-fármaco, derivados protegidos, derivados de N-óxido, solvatos ou hidretos de um composto da Fórmula (I) conforme definido acima, como um inibidor de Axl para o tratamento de uma doença ou condição mediada por Axl. Em certas modalidades, o composto da Fórmula (I) compreende um estereoisômero do mesmo.

[076] Em um outro aspecto, a presente invenção fornece um uso de um composto da Fórmula (I) conforme definido acima ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, para preparar um medicamento para o tratamento de uma doença ou condição mediada por Axl.

[077] Compostos da Fórmula (I) conforme definidos acima ou sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos são úteis para tratar para o tratamento de doenças hiperproliferativas associadas com, acompanhadas por e/ou causadas por hiperfunção de Axl, particularmente doenças hiperproliferativas induzidas por receptor de tirosina quinase de Axl.

[078] Compostos da Fórmula (I) conforme definidos acima ou sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos são capazes de inibir a proliferação celular e, portanto, são adequados para o tratamento e/ou prevenção de doenças hiperproliferativas induzidas por receptor tirosina quinase de Axl, particularmente cânceres selecionados e metástase de tumor primário.

[079] Em certas modalidades, a doença ou condição são múltiplos tipos de câncer mediada por Axl.

[080] Em certas modalidades, a doença ou condição é leucemia linfoblástica aguda, leucemia mieloide aguda, carcinoma adrenocortical, cânceres relacionados à aids, linfoma relacionado à aids, câncer anal, câncer de apêndice, astrocitomas, tumor teratóide/rabdóide atípico, carcinoma de células basais, câncer das vias biliares, câncer de bexiga, câncer ósseo, osteossarcoma e histiocitoma fibroso maligno, glioma de tronco cerebral, tumor cerebral, tumor teratóide/rabdóide atípico do sistema nervoso central, astrocitomas, craniofaringioma, ependimoblastoma, ependimoma, meduloblastoma, meduloepitelioma, tumores do parênquima pineal de diferenciação intermediária, tumores neuroectodérmicos primitivos supratentoriais e pineoblastoma, tumores do cérebro e da medula espinhal, câncer de mama, tumores brônquicos, linfoma de burkitt, tumor carcinoide, câncer gastrointestinal, linfoma do sistema central nervoso (CNS), câncer cervical, cordoma, leucemia linfocítica crônica, leucemia mielógena crônica, transtornos mieloproliferativos crônicos, câncer de cólon, colocâncer de reto, craniofaringioma, linfoma cutâneo de células t, micose fungoide, síndrome de sezary, câncer do endométrio, ependimoblastoma, ependimoma, câncer de esôfago, estesioneuroblastoma, família de tumores de sarcoma de ewing, tumor de células germinativas extracranianas, tumor de células germinativas extragonadais,

câncer do tubo bílico extra-hepático, melanoma intraocular, retinoblastoma, câncer da vesícula biliar, câncer gástrico (estômago), tumor carcinoide gastrointestinal, tumor estromal gastrointestinal (gist), tumor de células estromais gastrointestinais, tumor de células germinativas extracranianas, tumor de células germinativas extragonadais,

tumor de células germinativas ovarianas, tumor trofoblástico gestacional, glioma,

leucemia de células pilosas, câncer de cabeça e pescoço, câncer de coração, câncer hepatocelular (fígado), histiocitose, linfoma de Hodgkin, câncer hipofaríngeo,

melanoma intraocular, tumores de células das ilhotas (pâncreas endócrino), sarcoma de kaposi, câncer de células renais, câncer de rim, Histiocitose de células de

Iangerhans, câncer de laringe, leucemia linfoblástica aguda, leucemia mieloide aguda,

leucemia linfocítica crônica, leucemia mielógena crônica, leucemia, câncer de lábio e cavidade oral, câncer de fígado, câncer de pulmão, câncer de pulmão de células não pequenas, câncer de pulmão de células pequenas, linfoma relacionado à aids, linfoma de burkitt, linfoma cutâneo de células t, Linfoma de hodgkin, linfoma de não hodgkin,

linfoma do sistema nervoso central primário, macroglobulinemia, histiocitoma fibroso maligno do osso e osteossarcoma, meduloblastoma, meduloepitelioma, melanoma,

melanoma intraocular (olho), carcinoma de células de merkel, mesotelioma, câncer de pescoço de células escamosas metastático com início oculto, câncer de boca,

síndromes da neoplasia endócrina múltipla, mieloma múltiplo, neoplasma de células plasmáticas, síndromes mielodisplásicas, neoplasias mielodisplásicas/mieloproliferativas, leucemia mielógena, leucemia mielóide,

transtornos mieloproliferativos, câncer da cavidade nasal e seio paranasal, câncer de nasofaringe, neuroblastoma, linfoma de não hodgkin, câncer de pulmão de células não pequenas, câncer oral, câncer da cavidade oral, câncer de orofaringe,

osteossarcoma e histiocitoma fibroso maligno do osso, câncer ovariano, câncer epitelial ovariano, tumor de células germinativas ovarianas, tumor de ovário de baixo potencial maligno, câncer pancreático, papilomatose, paracâncer da tireoide, câncer de pênis, câncer de faringe, pineoblastoma e tumores neuroectodérmicos primitivos supratentoriais, tumor pituitário, blastoma pleuropulmonar, gravidez e câncer de mama, câncer de próstata, câncer de reto, câncer de células renais (rins), câncer de células transicionais, câncer do trato respiratório, retinoblastoma, rabdomiossarcoma, câncer de glândulas salivares, sarcoma, sarcoma de ewing, sarcoma de kaposi, sarcoma uterino, câncer de pele não melanoma, câncer de pele melanoma, carcinoma de pele, câncer de pulmão de células pequenas, câncer de intestino delgado, sarcoma de tecidos moles, carcinoma de células escamosas, câncer de pescoço escamoso, câncer de estômago (gástrico), tumores neuroectodérmicos primitivos supratentoriais, linfoma de célula t, câncer testicular, câncer de garganta, timoma e carcinoma tímico, câncer da tireoide, câncer de células transicionais de pelve renal e ureter, tumor trofoblástico, câncer gestacional, câncer de ureter e pélvis renal, câncer de células transicionais, câncer de uretra, câncer uterino, câncer do endométrio, sarcoma uterino, câncer vaginal, câncer vulvar, Macroglobulinemia de Waldenstrom, ou Tumor de wilms.

[081] Em um outro aspecto, a presente invenção fornece uma composição farmacêutica compreendendo um composto da Fórmula (I) conforme definido acima ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em combinação com um portador, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável.

[082] Em um outro aspecto, a presente invenção fornece uma composição farmacêutica compreendendo um composto da Fórmula (I) conforme definido acima ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo como um ingrediente ativo, para o tratamento de uma doença ou condição mediada por Axl.

[083] Em certas modalidades, a composição farmacêutica compreende estereoisômeros individuais, mistura de estereoisômeros, derivados de pró-fármaco, derivados protegidos, derivados de N-óxido, solvatos ou hidretos de um composto da

Fórmula (I) conforme definido acima.

[084] As formas de sal farmaceuticamente aceitáveis incluem sais ácidos/aniônicos ou básicos/catiônicos farmaceuticamente aceitáveis. Os sais ácidos/aniônicos farmaceuticamente aceitáveis incluem acetato, benzenossulfonato, benzoato, bicarbonato, bitartarato, brometo, edetato de cálcio, camsilato, carbonato, cloreto, citrato, dicloridrato, edetato, edisilato, estolato, esilato, fumarato, glicolilato, gluconato, glutamato hexilresorcinato, bromidrato, cloridrato, hidroxinaftoato, iodeto, isetionato, lactato, lactobionato, malato, maleato, malonato, mandelato, mesilato, metilsulfato, mucato, napsilato, nitrato, pamoato, pantotenato, fosfato/difosfato, poligalacturonato, salicilato, estearato, subacetato, succinato, sulfato, hidrogenossulfato, tanato, tartarato, teoclato, tosilato e sais de trietiodeto. Sais básicos/catiônicos farmaceuticamente aceitáveis incluem sódio, potássio, cálcio, magnésio, dietanolamina, N-metil-D-glucamina, L-lisina, L-arginina, amônio, etanolamina, piperazina e sais de trietanolamina.

[085] Um sal de adição de ácido farmaceuticamente aceitável é formado pela reação da forma de base livre de um composto de Fórmula (I) com um ácido inorgânico ou orgânico adequado, incluindo, mas não se limitando a, um ácido bromídrico, clorídrico, sulfúrico, nítrico, fosfórico, succínico, maleico, fórmico, acético, propiônico, fumárico, cítrico, tartárico, láctico, benzóico, salicílico, glutâmico, aspártico, p-toluenossulfônico, benzenossulfônico, metanossulfônico, etanossulfônico, naftalenossulfônico (por exemplo, ácido 2-naftalenossulfônico) ou hexanóico.

[086] Um sal de adição de ácido farmaceuticamente aceitável de um composto de fórmula (I) pode compreender ou ser, por exemplo, um bromidrato, cloridrato, sulfato, nitrato, fosfato, succinato, maleato, formato, acetato, propionato, fumarato, citrato, tartarato, lactato , benzoato, salicilato, glutamato, aspartato, p- toluenossulfonato, benzenossulfonato, metanossulfonato, etanossulfonato,

naftalenossulfonato (por exemplo, 2-naftalenossulfonato) ou sal hexanoato.

[087] As formas de ácido livre ou base livre dos compostos de Fórmula (I) podem ser preparadas a partir do sal de adição de base correspondente ou do sal de adição de ácido, respectivamente. Por exemplo, um composto de Fórmula (I) em uma forma de sal de adição de ácido pode ser convertido na base livre correspondente por tratamento com uma base adequada (por exemplo, solução de hidróxido de amônio, hidróxido de sódio e semelhantes). Um composto de Fórmula (I) em uma forma de sal de adição de base pode ser convertido no ácido livre correspondente por tratamento com um ácido adequado (por exemplo, ácido clorídrico, etc.).

[088] Os derivados pró-fármacos dos compostos de Fórmula (I) podem ser preparados por métodos conhecidos pelos versados na técnica (por exemplo, para mais detalhes, ver Saulnier et al., (1994), Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters, Vol. 4, 1985; todos os ensinamentos dos quais são incorporados neste documento por referência).

[089] Os derivados protegidos dos compostos de Fórmula (I) podem ser produzidos por meios conhecidos dos especialistas na técnica. Uma descrição detalhada das técnicas aplicáveis à criação de grupos de proteção e sua remoção pode ser encontrada em TW Greene, “Protecting Groups in Organic Chemistry”, 3ª edição, John Wiley and Sons, Inc., 1999, cujos ensinamentos inteiros são incorporados aqui por referência.

[090] Os compostos de Fórmula (I) podem ser preparados como seus estereoisômeros individuais por reação de uma mistura racêmica do composto com um agente de resolução opticamente ativo para formar um par de compostos diastereoisoméricos, separando os diastereômeros e recuperando os enantiômeros opticamente puros. A resolução de enantiômeros pode ser realizada usando derivados diastereoméricos covalentes dos compostos de Fórmula (I), ou usando complexos dissociáveis (por exemplo, sais diastereoméricos cristalinos). Os diastereômeros têm propriedades físicas distintas (por exemplo, pontos de fusão, pontos de ebulição, solubilidade, reatividade, etc.) e podem ser facilmente separados aproveitando-se dessas diferenças. Os diastereômeros podem ser separados por cromatografia ou por técnicas de separação/resolução com base nas diferenças de solubilidade. O enantiômero opticamente puro é então recuperado, junto com o agente de resolução, por qualquer meio prático que não resulte em racemização. Uma descrição mais detalhada das técnicas aplicáveis à resolução de estereoisômeros de compostos de sua mistura racêmica pode ser encontrada em Jean Jacques, Andre Collet, Samuel H. Wilen, “Enantiomers, Racemates and Resolutions”, John Wiley And Sons, Inc., 1981, todos os ensinamentos dos quais são incorporados neste documento por referência.

[091] A composição farmacêutica é formulada como comprimidos, pílulas, cápsulas, um líquido, um inalante, uma solução para pulverização nasal, um supositório, uma solução, um gel, uma emulsão, uma pomada, gotas oftálmicas ou gotas para ouvidos.

[092] Os portadores, diluentes, adjuvantes ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis adequados para uso nas composições farmacêuticas da invenção incluem comprimidos (comprimidos revestidos) feitos de, por exemplo, colidona ou goma-laca, goma arábica, talco, dióxido de titânio ou açúcar, cápsulas (gelatina), soluções (solução aquosa ou aquosa-etanólica), xaropes contendo as substâncias ativas, emulsões ou pós inaláveis (de vários sacarídeos, como lactose ou glicose, sais e mistura destes excipientes entre si) e aerossóis (contendo propulsor ou soluções para inalação livre).

[093] Excipientes que podem ser usados incluem, por exemplo, água, solventes orgânicos farmaceuticamente aceitáveis, tais como parafinas (por exemplo, frações de petróleo), óleos vegetais (por exemplo, óleo de amendoim ou gergelim), álcoois monofuncionais ou polifuncionais (por exemplo, etanol ou glicerol),

transportadores tais como pós minerais naturais (por exemplo, caulino, argilas, talco, giz), pós minerais sintéticos (por exemplo, ácido silícico altamente disperso e silicatos), açúcares (por exemplo, açúcar de cana, lactose e glicose), emulsificantes (por exemplo, lignina, gasto licores de sulfito, metilcelulose, amido e polivinilpirrolidona) e lubrificantes (por exemplo, estearato de magnésio, talco, ácido esteárico e laurilsulfato de sódio).

[094] Em um outro aspecto, a presente invenção fornece um método para tratar uma doença ou condição mediada por Axl, compreendendo administrar a um sujeito em necessidade do mesmo uma quantidade eficaz de um composto da Fórmula (I) conforme definido acima ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

[095] Em um outro aspecto, a presente invenção fornece um método para inibir receptor tirosina quinase de Axl ou para inibir o crescimento de células de câncer.

[096] Além disso, o composto é administrado isoladamente ou em combinação com um ou mais agentes terapêuticos adicionais, como imunoterapia (anti-PD-1 e/ou anti-CTLA4), quimioterapia e irradiação.

[097] Em certas modalidades, o composto é administrado isoladamente ou em combinação com um ou mais bloqueadores de checkpoint imunológico (anti-PD-1, anti-PDL, anti-CLTA4) e agentes quimioterápicos adicionais.

[098] Os métodos de administração de tais compostos e composições incluem, mas não estão limitados a, administração intravenosa, inalação, administração oral, administração retal, administração parenteral, administração intravítrea, administração subcutânea, administração intramuscular, administração intranasal, administração dérmica, administração tópica, administração oftálmica , administração bucal, administração traqueal, administração brônquica, administração sublingual ou administração ótica. Os compostos fornecidos neste documento são administrados por meio de formulações farmacêuticas conhecidas, incluindo comprimidos, cápsulas ou elixires para administração oral, supositórios para administração retal, soluções estéreis ou suspensões para administração parenteral ou intramuscular, loções, géis, pomadas ou cremes para administração tópica, e semelhantes.

[099] Em certas modalidades, o composto é administrado via administração intravenosa, administração subcutânea, inalação, administração oral, administração retal, administração parenteral, administração intravítrea, administração intramuscular, administração intranasal, administração dérmica, administração tópica, administração óptica, administração oftálmica, administração bucal, administração traqueal, administração brônquica ou administração sublingual.

[0100] Nos métodos acima, um composto de Fórmula (I) conforme definido acima ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo é administrado a um sistema que compreende células ou tecidos. Em certas modalidades, um composto de Fórmula (I) conforme definido acima ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo é administrado a um sujeito humano ou animal.

[0101] A quantidade terapeuticamente eficaz irá variar dependendo, entre outros, da doença indicada, a gravidade da doença, a idade e saúde relativa do sujeito, a potência do composto administrado, o modo de administração e o tratamento desejado.

[0102] A dosagem necessária também irá variar dependendo do modo de administração, a condição particular a ser tratada e o efeito desejado.

[0103] O composto da Fórmula (I) conforme definido acima é preparado por: (a) opcionalmente converter um composto da Fórmula (I) em um sal farmaceuticamente aceitável; (b) opcionalmente, a conversão de uma forma de sal de um composto de Fórmula (I) em uma forma não sal; (c) opcionalmente, a conversão de uma forma não oxidada de um composto de Fórmula (I) em um N-óxido farmaceuticamente aceitável; (d) opcionalmente resolver um isômero individual de um composto de Fórmula (I) a partir de uma mistura de isômeros; (e) opcionalmente converter um composto não derivatizado da Fórmula (I) em um derivado de pró-fármaco farmaceuticamente aceitável; e (f) opcionalmente converter um pró-fármaco derivado de um composto da Fórmula (I) na sua forma não derivatizada.

Modos para a Invenção

[0104] Em seguida, a presente invenção será descrita em detalhes com referência aos exemplos. No entanto, os seguintes exemplos são apenas para fins ilustrativos e não pretendem limitar o âmbito da invenção. As pessoas versadas na técnica apreciarão que variações e modificações podem ser feitas sem alterar o escopo da invenção.

[0105] Método de cromatografia líquida-espectrometria de massa (LC-MS):

1. As amostras são conduzidas no sistema Agilent Technologies 6120 MSD com uma coluna de fase reversa Zorbax Eclipse XDB-C18 (3,5 µm) (4,6 x 50 mm) conduzidoa na temperatura ambiente com taxa de fluxo de 1,5 ml/minuto.

2. A fase móvel usa solvente A (água/ácido fórmico 0,1 %) e solvente B (acetonitrila/ácido fórmico 0,1 %): 95 %/5 % a 0 %/100 % (A/B) por 5 minutos.

3. Os espectros de massa (m/z) foram registrados usando ionização por electrospray (ESI).

4. Os dados de ionização foram arredondados para o número inteiro mais próximo.

[0106] A preparação de compostos da Fórmula (I) ou sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos conforme definidos acima é descrita no exemplo e Tabela 1 de Publicação PCT Nº WO 2013/142382, que foi depositada em 15 de março de 2013, e em pedidos equivalentes e patentes em numerosos outros países, por exemplo na

Patente US Nº 8.877.763, Patente Australiana Nº 2013235344, Patente Japonesa Nº 6101341, e Patente Chinesa Nº 104428298. Os ensinamentos de todas as patentes, pedidos publicados e referências aqui citadas são incorporados por referência na sua totalidade.

[0107] Certos compostos da Fórmula (I) ou sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos são nomeados como a seguir:

221. 4-((4-(benziloxi)fenil)amino)-8-bromo-2-((1-metilpiperidin-4- il)amino)pirido[4,3-d]pirimidin-5(6H)-ona;

222. 8-bromo-2-((1-metilpiperidin-4-il)amino)-4-((4- fenoxifenil)amino)pirido[4,3-d]pirimidin-5(6H)-ona;

223. 8-bromo-4-((4-(ciclopentiloxi)fenil)amino)-2-((1-metilpiperidin-4- il)amino)pirido[4,3-d]pirimidin-5(6H)-ona;

224. 8-bromo-4-((4-(ciclohexilmetoxi)fenil)amino)-2-((1-metilpiperidin-4- il)amino)pirido[4,3-d]pirimidin-5(6H)-ona;

225. 8-bromo-2-((1-metilpiperidin-4-il)amino)-4-((4-(p- toliloxi)fenil)amino)pirido[4,3-d]pirimidin-5(6H)-ona;

226. cloridreto de 8-bromo-2-((1-metilpiperidin-4-il)amino)-4-((4- fenoxifenil)amino)pirido[4,3-d]pirimidin-5(6H)-ona;

227. 8-bromo-4-((4-(ciclopentilmetoxi)fenil)amino)-2-((1-metilpiperidin-4- il)amino)pirido[4,3-d]pirimidin-5(6H)-ona;

228. 8-bromo-4-((4-(ciclohexiloxi)fenil)amino)-2-((1-metilpiperidin-4- il)amino)pirido[4,3-d]pirimidin-5(6H)-ona;

229. 8-cloro-4-((4-(ciclohexiloxi)fenil)amino)-2-((1-metilpiperidin-4- il)amino)pirido[4,3-d]pirimidin-5(6H)-ona;

230. 8-bromo-4-((4-(4-isopropilfenoxi)fenil)amino)-2-((1-metilpiperidin-4- il)amino)pirido[4,3-d]pirimidin-5(6H)-ona;

231. cloridreto de 8-bromo-2-((1-metilpiperidin-4-il)amino)-4-((4-(p-

toliloxi)fenil)amino)pirido[4,3-d]pirimidin-5(6H)-ona;

232. cloridreto de 8-bromo-4-((4-(4-fluorofenoxi)fenil)amino)-2-((1- metilpiperidin-4-il)amino)pirido[4,3-d]pirimidin-5(6H)-ona;

233. cloridreto de 8-bromo-4-((4-(ciclohexiloxi)fenil)amino)-2-((1- metilpiperidin-4-il)amino)pirido[4,3-d]pirimidin-5(6H)-ona;

234. cloridreto de 4-((4-(benziloxi)fenil)amino)-8-bromo-2-((1-metilpiperidin-4- il)amino)pirido[4,3-d]pirimidin-5(6H)-ona;

235. cloridreto de 8-bromo-4-((4-(ciclopentilmetoxi)fenil)amino)-2-((1- metilpiperidin-4-il)amino)pirido[4,3-d]pirimidin-5(6H)-ona;

236. cloridreto de 8-bromo-4-((4-(4-isopropilfenoxi)fenil)amino)-2-((1- metilpiperidin-4-il)amino)pirido[4,3-d]pirimidin-5(6H)-ona;

237. cloridreto de 8-bromo-4-((4-(ciclopentiloxi)fenil)amino)-2-((1- metilpiperidin-4-il)amino)pirido[4,3-d]pirimidin-5(6H)-ona;

238. cloridreto de 8-bromo-4-((4-(3-fluorofenoxi)fenil)amino)-2-((1- metilpiperidin-4-il)amino)pirido[4,3-d]pirimidin-5(6H)-ona;

239. cloridreto de 8-bromo-2-((1-metilpiperidin-4-il)amino)-4-((4-(o- toliloxi)fenil)amino)pirido[4,3-d]pirimidin-5(6H)-ona;

240. 8-bromo-4-((4-(3-fluorofenoxi)fenil)amino)-2-((1-metilpiperidin-4- il)amino)pirido[4,3-d]pirimidin-5(6H)-ona;

241. cloridreto de 8-bromo-4-((4-(3,4-difluorofenoxi)fenil)amino)-2-((1- metilpiperidin-4-il)amino)pirido[4,3-d]pirimidin-5(6H)-ona;

242. cloridreto de 8-bromo-4-((4-(4-chlorofenoxi)fenil)amino)-2-((1- metilpiperidin-4-il)amino)pirido[4,3-d]pirimidin-5(6H)-ona;

243. cloridreto de 8-bromo-4-((4-(3,5-difluorofenoxi)fenil)amino)-2-((1- metilpiperidin-4-il)amino)pirido[4,3-d]pirimidin-5(6H)-ona;

244. cloridreto de 8-bromo-4-((4-(3-fluorofenoxi)-3-metilfenil)amino)-2-((1- metilpiperidin-4-il)amino)pirido[4,3-d]pirimidin-5(6H)-ona;

245. cloridreto de 8-bromo-4-((3-fluoro-4-fenoxifenil)amino)-2-((1- metilpiperidin-4-il)amino)pirido[4,3-d]pirimidin-5(6H)-ona;

246. cloridreto de 8-bromo-4-((3-metila-4-fenoxifenil)amino)-2-((1- metilpiperidin-4-il)amino)pirido[4,3-d]pirimidin-5(6H)-ona;

247. cloridreto de 8-bromo-4-((3-fluoro-4-(3-fluorofenoxi)fenil)amino)-2-((1- metilpiperidin-4-il)amino)pirido[4,3-d]pirimidin-5(6H)-ona;

248. 8-bromo-2-(1-isopropilapiperidin-4-ilamino)-4-(4- fenoxifenilamino)pirido[4,3-d]pirimidin-5(6H)-ona;

249. 8-bromo-2-(1-etilpiperidin-4-ilamino)-4-(4-fenoxifenilamino)pirido[4,3- d]pirimidin-5(6H)-ona; e

250. 8-bromo-4-(4-fenoxifenilamino)-2-(1-(2,2,2-trifluoroetil)piperidin-4- ilamino)pirido[4,3-d]pirimidin-5(6H)-ona.

[0108] Tabela 1 mostra as estruturas de compostos da Fórmula (I).

[0109] Todos os dados são listados em uma faixa de valor de IC50 (Axl). Cada ++++, +++, ++ e + indicados 1 a 10 nM, 11 a 100 nM, 101 a 1000 nM, 1001 a 10000 nM, respectivamente. Tabela 1

MS MS Axl Axl (ESI+ (ESI+ Nº Estrutura (IC50 Nº Estrutura (IC50 ) ) ) ) m/z m/z Br NH Br

NH N O N O HN N NH

HN N NH 22 22 535 ++ 521 +++ 1 2

N N O O

Br

NH Br

NH N O N O HN N NH

HN N NH 22 22 513 ++ 541 ++ 3 4

N N O

O Br Br

NH NH N O N O

HN N NH HN N NH 22 22 535 +++ 521 +++ 5 6

N N O HCl O Br NH Br

NH N O N O HN N NH

HN N NH 22 22 527 ++ 527 ++ 7 8

N N O

O Br Cl NH

NH N O N O HN N NH

HN N NH 22 23 483 ++ 563 +++ 9 0

N N O O

Br Br

NH NH N O N O

HN N NH HN N NH 23 23 535 +++ 539 +++ 1 2

N N HC l HCl O O

F Br Br NH

NH N O N O HN N NH

HN N NH 23 23 527 ++ 535 ++ 3 4

N

N HCl O HCl O Br

NH N O

HN N NH 23 23 527 ++ 563 +++ 5 6

N HCl

O Br Br

NH NH N O N O

HN N NH HN N NH 23 23 513 ++ 539 +++ 7 8

N N HCl HCl

O O F

Br Br

NH NH N O N O

HN N NH HN N NH 23 24 535 +++ 539 +++ 9 0

N N HCl O F

O Br Br

NH NH N O N O

HN N NH HN N NH 24 24 557 +++ 555 +++ 1 2

N N HCl O F HCl O F Cl Br

NH Br

NH N O N O HN N NH

HN N NH 24 24 557 +++ 553 +++ 3 4

N N O F HCl

O F HCl

F 24 24 539 +++ 535 +++ 5 6

Br

NH N O

HN N NH 24 24 557 +++ 549 +++ 7 8

N

O Br Br

NH NH N O N O

HN N NH HN N NH 24 25 535 +++ 589 ++ 9 0

N N

O O CF3

[0110] Os conteúdos de todas as patentes, pedido de patentes, e publicações listados aqui são incorporados neste documento por referência.

ENSAIOS BIOLÓGICOS Quinase Inibição Ensaio (Inibição da atividade enzimática de Axl quinase)

[0111] Os compostos de Fórmula (I) como obtidos acima foram avaliados para medir a sua capacidade para inibir a Axl quinase. Axl pertence à família recentemente identificada de receptor tirosina quinase (RTK) TYRO-3, Axl, MERTK (TAM). A proteína específica de parada de crescimento 6 (GAS6) serve como um ligante comum para cada TAM quinase e mostra a maior afinidade para Axl. Após a ligação de GAS6, Axl homodimeriza e subsequentemente induz várias vias de sinalização a jusante envolvidas na proliferação celular, migração, invasão, anti-apoptose, angiogênese, metástase e resistência terapêutica. A regulação positiva de Axl foi relatada em uma ampla variedade de linhas de células de câncer, bem como em amostras de câncer de pacientes com câncer de mama, leucemia aguda, câncer colorretal, câncer de pulmão, melanoma, câncer de ovário ou câncer de próstata, entre outros.

MÉTODOS

[0112] Os compostos de Fórmula (I) conforme obtidos acima foram inicialmente diluídos para 10 mM em DMSO 100 % (CALBIOCHEMTM) para armazenamento e transformados em solução tampão de quinase para criar uma concentração de composto variando de 1 µM e 10 µM. Diluições em série dos compostos foram dispensadas em uma placa de 96 poços (GREINER BIOSCIENCESTM) a 6 µl cada. Axl humano truncado (CARNA BIOSCIENCESTM) foi diluído em tampão de quinase e adicionado às soluções do composto e pré-incubado por 30 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, ATP (TEKNOVATM) e solução de substrato (substratos de fabricação sugeridos de PerkinElmerTM, por exemplo, UlightTM-TK peptídeo) para Axl (PerkinElmerTM) foram adicionados (12 µl cada) aos poços contendo a solução de composto e enzima . A mistura reacional foi incubada durante 1 hora. Após a incubação, a solução de parada feita com EDTA, água e tampão de detecção Lance (PerkinElmerTM) foram adicionados (12 µl cada) para parar a fosforilação. Após a adição da solução de parada e 5 minutos de agitação, a solução de detecção contendo o anticorpo marcado com Europium (sugeridos substratos de fabricação de PerkinElmerTM, por exemplo, PT66 para Axl), água, e tampão de detecção Lance foram adicionados (12 µl) à mistura de reação e incubados novamente por 50 minutos. A fosforilação do substrato foi uma função da emissão de 665 nm medida após a adição da solução de detecção e 50 minutos de incubação.

RESULTADOS

[0113] Os compostos de Fórmula (I) exibiram propriedades farmacológicas úteis. Tal como aqui utilizado, uma forma de descrever a potência da atividade inibitória (nM) é uma faixa de atividade inibitória a 50 % (IC50) conforme mostrado na Tabela 2. Compostos de referência, ASP2215 (gilteritinibe, Astellas), R428 (BGB324, BerGenBio) e estaurosporina (inibidor da pan-quinase) foram usados para Axl para avaliar a atividade inibidora de compostos de Fórmula (I).

[0114] Por exemplo, o composto 238 da Fórmula (I), isto é, cloridreto de 8- bromo-4-((4-(3-fluorofenoxi)fenil)amino)-2-((1-metilpiperidin-4-il)amino)pirido[4,3- d]pirimidin-5(6H)-ona, mostrou forte inibição da atividade quinase de Axl. Sua potência em ensaios bioquímicos é comparável à dos inibidores de Axl em desenvolvimento clínico, APS2215 e R428. A Tabela 2 ilustra uma faixa de valor de IC50 de Axl pelos compostos representativos de Fórmula (I). Conforme mostrado na Tabela 2, o composto de referência, estaurosporina, é o mais potente, enquanto os compostos de Fórmula (I) conforme obtidos acima mostram melhor seletividade do que o composto de referência e exibem potência semelhante a ASP2215 e R428. Além disso, os compostos de Fórmula (I) também mostram melhor seletividade do que aqueles indicados por asterisco e descritos na Técnica Anterior de WO 2011/053861 e PCT/US2010/054853. Tomados em conjunto, estes dados sugerem que os compostos de Fórmula (I) melhoram significativamente a seletividade, bem como a potência inibitória em Axl em comparação com os inibidores de Axl conhecidos, ASP2215 e R428.

[0115] Os compostos Nos 8 e 136 descritos em WO 2011/053861 mostraram múltiplas atividades inibidoras contra várias quinases testadas incluindo JAK2. Em particular, eles não mostraram exposição ao medicamento em ratos após a administração oral de 10 mg/kg, sugerindo que não foram absorvidos no intestino ou foram eliminados extremamente rápido do corpo.

[0116] A Tabela 2 mostra a inibição bioquímica de Axl e JAK2 pelos compostos representativos de Fórmula (I).

Tabela 2 Comp A J Compost A J osto xl AK2 o xl AK2 ASP2 + + 223 + +

215 ++ ++ + + R428 + + 225 + + ++ + ++ *8 + + 226 + + ++ ++ ++ + *136 + + 228 + + ++ +++ + + *203 + + 233 + + ++ + + + 222 + + 240 + + ++ + ++ + 241 + + 238 + + ++ ++ + Estauros + + porina +++ +++

[0117] Os compostos 8, 136 e 203 foram descritos em WO 2011/053861 e PCT/US2010/054853.

[0118] Todos os dados são listados em uma faixa de valor de IC50. Cada ++++, +++, ++ e + indicados 1 a 10 nM, 11 a 100 nM, 101 a 1000 nM, 1001 a 10000 nM, respectivamente.

2. Ensaio de Viabilidade Celular: Inibição da Proliferação de Células Axl- Positivas

[0119] Os compostos de Fórmula (I) conforme obtidos acima são testados quanto aos seus efeitos na inibição da proliferação de linhas de células de câncer de mama triplo-negativas que abrigam Axl (MDA-MB-231 e Hs578T) e linhas de células de câncer de mama negativas para Axl (MCF7). Axl é um membro da família TAM

(TYRO3-Axl-MER) de tirosina quinases receptoras, que, quando ativadas, podem aumentar a sobrevivência, proliferação, migração e invasão das células tumorais, angiogênese e interações tumor-hospedeiro. Após a ligação de GAS6 a Axl, o Axl subsequentemente ativa as vias de sinalização a jusante, como fosfoinositídeo 3- quinase (PI3K), sarcoma RAt (RAS) e quinase regulada por sinal extracelular (ERK).

[0120] A superexpressão ou ativação aberrante de Axl foi descrita em várias doenças malignas de origem epitelial e hematológica e está frequentemente associada a mau prognóstico, aumento da taxa de recidiva, diminuição da sobrevida livre de doença e baixa sobrevida geral. Além disso, a expressão do Axl está associada à transição epitelial para mesenquimal (EMT), uma característica frequente de tumores metastáticos frequentemente correlacionados à resistência aos medicamentos. Portanto, o Axl é um alvo molecular atraente para vários tumores sólidos, incluindo câncer de mama.

MÉTODOS

[0121] Os compostos de Fórmula (I) conforme obtidos acima foram testados quanto ao efeito de viabilidade celular em células MDA-MB-231 e Hs578T. Para o ensaio de viabilidade celular, as células MDA-MB-231 e Hs578T que expressam Axl humano foram obtidas na American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA).

Esta linha celular foi mantida com um meio do Roswell Park Memorial Institute (RPMI) (HyCloneTM) contendo 10 % de soro bovino (BCS; HycloneTM) suplementado com ferro. As células foram semeadas em 2 x 104 células em placas de cultura de 96 poços e os compostos diluídos em série foram então adicionados. Após um período de incubação de 72 horas a 37 ºC, a viabilidade celular foi medida usando o ensaio ATPLite 1step (Perkin-ElmerTM) que é baseado na quantificação de ATP de células viáveis. As concentrações para 50 % da inibição máxima da proliferação celular (valores de GI50) foram calculadas usando regressão não linear e definidas como a concentração necessária para uma redução de 50 % na luminescência ou absorbância de células de controle tratadas versus não tratadas (PrismaTM Software).

RESULTADOS

[0122] Os dados de inibição de GI50 dos compostos representativos de Fórmula (I) são mostrados na Tabela 3. Os compostos de Fórmula (I) exibiram uma inibição da proliferação celular com valor de GI50 inferior a 3 µM. Especialmente, o composto 237, cloridreto de 8-bromo-4-((4-(ciclopentiloxi)fenil)amino)-2-((1- metilpiperidin-4-il)amino)pirido[4,3-d]pirimidin-5(6H)-ona, exibiu um nível de inibição maior do que aqueles exibidos pela referência ASP2215 e R428 em linhas de células de câncer de mama com Axl. Tal forte atividade antitumoral sugere que os compostos de Fórmula (I) têm melhor valor terapêutico do que a referência e o composto 203 indicado por asteriscos descritos na Técnica Anterior (Pedido PCT Nº PCT/US2010/054853).

[0123] A Tabela 3 mostra uma viabilidade celular por linha de células de câncer positivas para Axl pelos compostos representativos de Fórmula (I).

Tabela 3 MDA-MB- Hs578T MDA-MB- Hs578T Composto Composto 231 (GI50) (GI50) 231 (GI50) (GI50) ASP2215 ++ ++ 222 ++ ++ R428 + ++ 226 ++ ++ *203 +++ +++ 228 ++ ++ 228 +++ +++ 235 +++ +++ 233 ++ +++ 238 +++ +++ 237 +++ ++++ 241 ++ ++ 240 ++ ++

[0124] O composto 203 foi descrito em WO 2011/053861 e PCT/US2010/054853.

[0125] Todos os dados são listados em uma faixa de valor de GI50 . Cada ++++, +++, ++ e + indicados 0,1 a 1,0 µM, 1,1 a 3,0 µM, 3,1 a 10 µM, 11 a 30 µM, respectivamente.

3. Ensaio de migração e invasão: inibição do potencial metastático

[0126] De modo a testar se os compostos de Fórmula (I) mostram o efeito na inibição de metástases, os comportamentos migratórios e invasivos celulares analisados usando ensaios de invasão transwell e matrigel na linha celular de câncer de mama MDA-MB-231.

MÉTODOS

[0127] Os compostos de Fórmula (I) conforme obtidos acima foram testados em ensaios de migração e invasão usando a linha celular de câncer de mama MDA- MB-231. A migração celular foi realizada pelo ensaio transwell (BD Biosciences, CA, EUA). Resumidamente, 5 x 104 células em RPMI-1640 sem soro foram semeadas em uma membrana (tamanho de poro de 8,0 μm) inserida nos poços de uma placa de 24 poços. RPMI-1640 contendo 10 % de FBS foi adicionado à câmara inferior de cada poço. Após 24 h, as células da câmara superior foram removidas com cotonete e as células que atingiram a parte inferior da membrana foram fixadas e coradas com violeta cristal (1 % em álcool metílico) por 10 min. As células localizadas na parte inferior do filtro (5 campos/filtro) foram contadas. O ensaio de invasão celular foi realizado de forma semelhante, exceto que o matrigel (BD Biosciences, CA, EUA) foi adicionado a cada poço 6 h antes das células serem semeadas na membrana. Após 48 h, matrigel e quaisquer células remanescentes na câmara superior foram removidos com cotonetes. As células na superfície inferior da membrana foram fixadas e coradas como descrito acima. O composto 238 e o composto de referência, R428, foram incubados como indicado nas Figuras 1a a 1c. Os dados são representativos dos resultados de três campos independentes de membrana corada.

RESULTADOS

[0128] Como mostrado nas Figuras 1a a 1c, o composto representativo 238 de Fórmula (I) mostra capacidades migratórias e invasivas prejudicadas das células MDA-MB-231, que é superior ao composto de referência, R428. Curiosamente, o composto representativo 238 de Fórmula (I) inibiu significativamente a migração e invasão mesmo a 0,03 µM, em comparação com R428. Estes resultados sugerem que o composto representativo tem uma atividade anti-metastática muito potente usando células MDA-MB-231. Além disso, o composto de Fórmula (I) conforme obtido acima conferiria uma opção terapêutica para metástases associadas à expressão de Axl, tal como agressivo no câncer de mama.

4. Atividade antitumoral em modelos de câncer de mama 4T1 singênico in vivo

[0129] De modo a testar se os compostos de Fórmula (I) mostram atividade antitumoral em modelos de câncer de mama 4T1 singênico in vivo, eles foram testados como a seguir.

MÉTODOS

[0130] Os compostos de Fórmula (I) conforme obtidos acima foram testados em modelo singênico usando células de câncer de mama 4T1 de camundongo. As células 4T1 foram cultivadas em meio RPMI1640 (Sigma, Cat # R6504) suplementado com 10 % de FBS (Invitrogen, Cat # 10438-026) e penicilina estreptomicina a 1 % (Thermo Fisher Scientific, Cat # 15140-122). As células foram colhidas por tripsinização quando atingiram 70 a 80 % de confluência. Um dia antes da inoculação das células, o pelo do flanco direito de camundongos BALB/C foi depilado com aparador de cabelo. No dia seguinte, a área da pele ao redor do local da injeção foi desinfetada esfregando levemente com álcool cirúrgico. Para estabelecer os aloenxertos, as células foram suspensas em meio sem soro e misturadas 1:1 com matrigel para obter 1 x 106 células/100 µl. As células suspensas em matrigel foram implantadas por via subcutânea usando uma seringa BD de 1 ml fixada a uma agulha de calibre 24 (agulhas BD Precision Glide, 0,55 mm x 25 mm, REF # 302805). Os camundongos foram randomizados com base no volume do tumor e seis camundongos foram alocados por grupo. Os enxertos tumorais foram medidos após aproximadamente 5 dias da inoculação das células, quando se tornaram palpáveis.

Os animais foram administrados por via oral com veículo de controle ou o composto

238 (QD, 30 mg/kg/dia) uma vez por dia durante 14 dias. O veículo para administração oral consiste em sulfobutiléter de sódio β-ciclodextrina (SBECD) a 10 % em tampão de citrato 50 mM (pH 3,0). A inibição do crescimento tumoral (TGI) foi calculada da seguinte forma: % TGI = [1- (Tratamento TVFinal - Tratamento TVInicial)/(Controle TVFinal - Controle TVInicial)] * 100.

RESULTADOS

[0131] O objetivo deste estudo foi testar a eficácia antitumoral do composto 238 isolado no modelo de tumor singênico de mama 4T1. Todos os tratamentos foram bem tolerados, uma vez que não houve sinais clínicos de anormalidade e alterações significativas no peso corporal do animal em comparação com o controle do veículo.

No dia 15, o volume médio do tumor do grupo de tratamento # 2 (composto 238) foi de 669 ± 60 mm3 que resultou na inibição do crescimento do tumor (TGI) de 59 % (ver Figura 2a). No geral, esses resultados sugerem que o composto 238 apresenta boa atividade antitumoral no modelo de tumor singênico imunocompetante 4T1 em camundongos BALB/C.

[0132] Curiosamente, não há efeito antitumoral de 30 mg/kg/dia do composto 238 em camundongos imunodeficientes (ver Figura 2b), indicando que pode suprimir o crescimento do tumor aumentando diretamente a resposta imune.

5. Atividade anti-metastática em modelos de câncer de mama 4T1 singênico in vivo

[0133] De modo a testar se os compostos de Fórmula (I) mostram atividade metastática anticâncer em modelos de metástase peritoneal B16F10 de pulmão e CT- 26, eles foram testados como a seguir.

MÉTODOS

[0134] Os compostos de Fórmula (I) conforme obtidos acima foram testados em modelos de metástase usando melanoma B16F10 de camundongo e células de câncer de cólon CT26-Luciferase. Ambas as células foram cultivadas em meio

RPMI1640 (Sigma, Cat # R6504) suplementado com 10 % de FBS (Invitrogen, Cat # 10438-026) e penicilina estreptomicina a 1 % (Thermo Fisher Scientific, Cat # 15140- 122). A linha celular foi colhida por tripsinização quando atingiram 70 a 80 % de confluência. Um dia antes da inoculação das células, os camundongos C57BL/6 foram mantidos em condições livres de patógenos de acordo com a diretriz SPF (temperatura ambiente, 40 a 60 % de umidade) e alojados no ABMRC da Universidade Yonsei. Para estabelecer a metástase, as células B16F10 (1 x 106 células/camundongo, n = 3/grupo) foram suspensas em meio sem soro e injetadas por via intravenosa na veia da cauda usando uma seringa BD de 1 ml conectada a uma agulha de calibre 24 (agulhas BD Precision Glide , 0,55 mm x 25 mm, REF # 302805).

As células CT-26-luciferase (1x104 células/camundongo, n = 5/grupo) foram enxertadas na cavidade intraperitoneal após 24 horas de pré-tratamento de 30 mg/kg/dia do composto 226.

[0135] Os camundongos foram randomizados e três camundongos para o modelo B16F10 e cinco camundongos para o modelo de metástase peritoneal CT26 foram alocados por grupo. A metástase de pulmão foi medida após 14 dias da inoculação das células. Os animais foram administrados por via oral com veículo de controle ou o composto 226 (30 mg/kg/dia) uma vez por dia durante os dias indicados.

O veículo para administração oral consiste em sulfobutiléter de sódio β-ciclodextrina (SBECD) a 10 % em tampão de citrato 50 mM (pH 3,0). Os animais foram monitorados quanto à mortalidade e sinais clínicos (como doença e alterações comportamentais) diariamente ao longo do estudo. No modelo B16F10, após o sacrifício dos camundongos, os órgãos foram fixados com solução de formalina a 10 % por 1 dia. O bloco FFPE foi fatiado com 4 µm de espessura em lâminas de revestimento para aplicação da coloração H&E. Em seguida, foi calculada a contagem dos nódulos tumorais. A metástase de CT26 foi determinada medindo a intensidade da luminescência na cavidade peritoneal.

RESULTADOS

[0136] O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito preventivo do composto 226 no pulmão B16F10 e nos modelos de metástase peritoneal de CT-26. Os tratamentos do composto 226 foram bem tolerados uma vez que não houve sinais clínicos de anormalidade em comparação com o controle do veículo. No dia 9, dois camundongos no grupo de veículo foram encontrados mortos no modelo de metástase CT26. No modelo de metástase B16F10, 30 mg/kg/dia oral do composto 226 inibiu dramaticamente a metástase de pulmão em todas as amostras de pulmão macroscópicas mostradas na região preta e não havia nódulos tumorais (ver Figuras 3a a 3c). Em modelos de metástase peritoneal CT-26, o tratamento com composto 226 reduziu drasticamente a intensidade de luminescência na cavidade peritoneal.

Além disso, os camundongos no grupo de veículo começaram a morrer a partir do dia 9 após o enxerto de células CT26-luciferase, enquanto os camundongos tratados com o composto 226 (QD, 30 mg/kg/dia) estavam vivos durante o período de tratamento (ver Figuras 4a e 4b ) Portanto, estes resultados sugerem que o composto 226 de Fórmula (I) teria potencial terapêutico para prevenir metástases em pacientes com câncer Axl positivo.

6. Efeito de combinação com um anticorpo anti-PD-1 no modelo de metástase

[0137] De modo a testar se os compostos de Fórmula (I) mostram efeito de combinação com anticorpo anti-PD-1 de camundongo no modelo de metástase espontânea 4T1, eles foram testados como a seguir.

MÉTODOS

[0138] Os compostos de Fórmula (I) conforme obtidos acima foram testados em modelos de metástase espontânea usando células de câncer de mama 4T1 de camundongo. As células 4T1 foram cultivadas em meio RPMI1640 (Sigma, Cat # R6504) suplementado com 10 % de FBS (Invitrogen, Cat # 10438-026) e penicilina estreptomicina a 1 % (Thermo Fisher Scientific, Cat # 15140-122). A linha celular foi colhida por tripsinização quando atingiram 70 a 80 % de confluência. Um dia antes da inoculação das células, o pelo do flanco direito de camundongos BALB/C foi depilado com aparador de cabelo. No dia seguinte, a área da pele ao redor do local da injeção foi desinfetada esfregando levemente com álcool cirúrgico. Para estabelecer os aloenxertos, camundongos fêmeas BALB/c (7 semanas de idade) foram implantados ortotopicamente na glândula mamária com 5 x 106 células 4T1 singênicas. Os camundongos foram sacrificados quando o volume médio do tumor atingiu 1500 mm3.

[0139] Os camundongos foram randomizados com base no volume do tumor (~ 50 mm3) e cinco camundongos foram alocados por grupo. Os enxertos tumorais foram medidos após aproximadamente 2 dias da inoculação das células, quando se tornaram palpáveis. Os animais foram administrados por via oral com veículo de controle ou o composto 226 de Fórmula (I) (30 mg/kg/dia) e/ou anticorpo anti-PD-1 de camundongo durante os dias indicados. O veículo para administração oral consiste em sulfobutiléter de sódio β-ciclodextrina (SBECD) a 10 % em tampão de citrato 50 mM (pH 3,0). Os animais foram monitorados quanto à mortalidade e sinais clínicos (como doença e alterações comportamentais) diariamente ao longo do estudo. Após tratamento por 28 dias, todos os camundongos foram sacrificados. A metástase de pulmão 4T1 foi determinada pela contagem dos nódulos tumorais por meio de coloração H&E. O tumor sólido 4T1 no local primário foi medido por um scanner 3D de tumor, TM900 (Peria, Bélgica). O pulmão de camundongos foi coletado e fixado com solução de formalina a 10 % por 24 horas. O bloco de FFPE foi fatiado com 4 µm de espessura em lâminas de revestimento para aplicação da coloração H&E. O nódulo metastático foi medido por observação microscópica.

RESULTADOS

[0140] Os camundongos fêmeas BALB/c (7 semanas de idade) foram implantados ortotopicamente na glândula mamária com 5 x 106 células 4T1 singénicas. Quando os tumores atingiram um tamanho de aproximadamente 50 mm3,

os camundongos foram tratados com veículo, anticorpo anti-PD-1 (100 mg duas vezes/semana), composto 226 de Fórmula (I) (30 mg/kg/dia) ou uma combinação de composto 226 de Fórmula (I) e anticorpo anti-PD-1 por 4 semanas.

Os camundongos foram sacrificados no dia 28 e a metástase de pulmão foi avaliada pela contagem de nódulos.

A metástase para o pulmão foi significativamente diminuída pelo composto

226 sozinho, e a combinação com o anticorpo anti-PD1 e o composto 226 aumentou a maior redução de nódulos tumorais em comparação com o tratamento com o composto 226 sozinho (ver Figuras 5a a 5c). O grupo tratado com anticorpo anti-PD-

1 não exibiu eficácia notável contra metástases de pulmão.

O composto 226 suprimiu significativamente a carga metastática total e o número de metástases maiores

(metástases médias + grandes, ≥ 5 mm de diâmetro; ver Figura 5c). Em relação ao crescimento do tumor no local primário, o composto 226 sozinho e os grupos de combinação mostraram a inibição do crescimento do tumor, que não houve eficácia diferente entre os grupos, sugerindo que o efeito combinacional seria jogado no tumor metastático, não no tumor primário (ver Figura 6). Tomados em conjunto, estes resultados sugerem que o composto 226 de Fórmula (I) mostra um alto potencial para aplicação imunoncológica no tratamento de metástases.

Claims (15)

REIVINDICAÇÕES

1. Uso de um composto representado pela Fórmula (I) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, como um inibidor de Axl para o tratamento de uma doença ou condição mediada por Axl: (I) CARACTERIZADO pelo fato de que R1 é arila C6-C10, arila C6-C10 alquila C1-C6, cicloalquila C5-C6 ou cicloalquilmetila C5-C6, opcionalmente substituída com um ou dois R3s; R3 é independentemente fluoro, cloro, bromo, iodo, alquila C1-C6, ou trifluorometila; X é H, fluoro, cloro, bromo, iodo, metila, ou trifluoroetila; Y é cloro, bromo, iodo, alquila C1-C3, ou fenila; R2 é cicloalquila C3-C6 ou heterocicloalquila de 4 a 7 membros, em que a cicloalquila C3-C6 é opcionalmente substituída nos átomos de carbono com um ou dois R4s, e em que a heterocicloalquila de 4 a 7 membros tem 1 ou 2 heteroátomos selecionados a partir do grupo que consiste em nitrogênio, oxigênio, enxofre, sulfona e sulfóxido, e é opcionalmente substituído no átomo de carbono com R4 ou no átomo de nitrogênio com R5; R4 é independentemente hidróxi, hidroxialquila C1-C6, amino, aminoalquila C1-C6, -NH(-alquila C1-C3), -N(-alquila C1-C3)2, alquila C1-C3 ou halo; e R5 é H, alquila C1-C3 ou -C(=O)(-alquila C1-C3), em que a alquila C1-C3 é opcionalmente substituída com 1 a 3 fluoros.

2. Uso, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que

R1 é fenila, benzila, ciclopentila, ciclohexila, ciclopentilmetila, ou ciclohexilmetila, opcionalmente substituída com um ou dois R3s; e R3 é independentemente fluoro, cloro, bromo, iodo, alquila C1-C6, ou trifluorometila.

3. Uso, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que R2 é piperidinila ou pirrolidinila substituída no átomo de nitrogênio com R5; e R5 é H, alquila C1-C3 ou -C(=O)(-alquila C1-C3).

4. Uso, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que R5 é metila, etila, trifluoroetila, ou i-propila.

5. Uso, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que R3 é independentemente cloro ou fluoro.

6. Uso, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que Y é bromo.

7. Uso, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que X é fluoro ou metila.

8. Uso, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o composto da Fórmula (I) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo é cloridreto de 8-bromo-2-((1-metilpiperidin-4-il)amino)-4-((4- fenoxifenil)amino)pirido[4,3-d]pirimidin-5(6H)-ona.

9. Uso, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o composto da Fórmula (I) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo é cloridreto de 8-bromo-4-((4-(ciclopentiloxi)fenil)amino)-2-((1-metilpiperidin-4- il)amino)pirido[4,3-d]pirimidin-5(6H)-ona; ou cloridreto de 8-bromo-4-((4-(3- fluorofenoxi)fenil)amino)-2-((1-metilpiperidin-4-il)amino)pirido[4,3-d]pirimidin-5(6H)- ona.

10. Uso, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o composto da Fórmula (I) compreende um estereoisômero do mesmo.

11. Uso de um composto da Fórmula (I), de acordo com a reivindicação 1 ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, CARACTERIZADO pelo fato de que prepara um medicamento para o tratamento de uma doença ou condição mediada por Axl.

12. Uso, de acordo com a reivindicação 1 ou 11, CARACTERIZADO pelo fato de que a doença ou condição são múltiplos tipos de câncer mediada por Axl.

13. Uso, de acordo com a reivindicação 1 ou 11, CARACTERIZADO pelo fato de que a doença ou condição é leucemia linfoblástica aguda, leucemia mieloide aguda, carcinoma adrenocortical, cânceres relacionados à aids, linfoma relacionado à aids, câncer anal, câncer de apêndice, astrocitomas, tumor teratóide/rabdóide atípico, carcinoma de células basais, câncer das vias biliares, câncer de bexiga, câncer ósseo, osteossarcoma e histiocitoma fibroso maligno, glioma de tronco cerebral, tumor cerebral, tumor teratóide/rabdóide atípico do sistema nervoso central, astrocitomas, craniofaringioma, ependimoblastoma, ependimoma, meduloblastoma, meduloepitelioma, tumores do parênquima pineal de diferenciação intermediária, tumores neuroectodérmicos primitivos supratentoriais e pineoblastoma, tumores do cérebro e da medula espinhal, câncer de mama, tumores brônquicos, linfoma de burkitt, tumor carcinoide, câncer gastrointestinal, linfoma do sistema nervoso central, câncer cervical, cordoma, leucemia linfocítica crônica, leucemia mielógena crônica, transtornos mieloproliferativos crônicos, câncer de cólon, colocâncer de reto, craniofaringioma, linfoma cutâneo de células t, micose fungoide, síndrome de sezary, câncer do endométrio, ependimoblastoma, ependimoma, câncer de esôfago, estesioneuroblastoma, família de tumores de sarcoma de ewing, tumor de células germinativas extracranianas, tumor de células germinativas extragonadais, câncer do tubo bílico extra-hepático, melanoma intraocular, retinoblastoma, câncer da vesícula biliar, câncer gástrico, tumor carcinoide gastrointestinal, tumor estromal gastrointestinal, tumor de células estromais gastrointestinais, tumor de células germinativas extracranianas, tumor de células germinativas extragonadais, tumor de células germinativas ovarianas, tumor trofoblástico gestacional, glioma, leucemia de células pilosas, câncer de cabeça e pescoço, câncer de coração, câncer hepatocelular, histiocitose, linfoma de Hodgkin, câncer hipofaríngeo, melanoma intraocular, tumores de células das ilhotas, sarcoma kaposi, câncer de células renais,

câncer renal, Histiocitose de células de Iangerhans, câncer de laringe, leucemia linfoblástica aguda, leucemia mieloide aguda, leucemia linfocítica crônica, leucemia mielógena crônica, leucemia, câncer de lábio e cavidade oral, câncer de fígado,

câncer de pulmão, câncer de pulmão de células não pequenas, câncer de pulmão de células pequenas, linfoma relacionado à aids, linfoma de burkitt, linfoma cutâneo de células t, Linfoma de hodgkin, linfoma de não hodgkin, linfoma do sistema nervoso central primário, macroglobulinemia, histiocitoma fibroso maligno do osso e osteossarcoma, meduloblastoma, meduloepitelioma, melanoma, melanoma intraocular, carcinoma de células de merkel, mesotelioma, câncer de pescoço de células escamosas metastático com início oculto, câncer de boca, síndromes da neoplasia endócrina múltipla, mieloma múltiplo, neoplasma de células plasmáticas,

síndromes mielodisplásicas, neoplasias mielodisplásicas/mieloproliferativas, leucemia mielógena, leucemia mielóide, transtornos mieloproliferativos, câncer da cavidade nasal e seio paranasal, câncer de nasofaringe, neuroblastoma, linfoma de não hodgkin, câncer de pulmão de células não pequenas, câncer oral, câncer da cavidade oral, câncer de orofaringe, osteossarcoma e histiocitoma fibroso maligno do osso,

câncer ovariano, câncer epitelial ovariano, tumor de células germinativas ovarianas,

tumor de ovário de baixo potencial maligno, câncer pancreático, papilomatose,

paracâncer da tireoide, câncer de pênis, câncer de faringe, pineoblastoma e tumores neuroectodérmicos primitivos supratentoriais, tumor pituitário, blastoma pleuropulmonar, gravidez e câncer de mama, câncer de próstata, câncer de reto,

câncer de células renais, câncer de células transicionais, câncer do trato respiratório,

retinoblastoma, rabdomiossarcoma, câncer de glândulas salivares, sarcoma, sarcoma de ewing, sarcoma de kaposi, sarcoma uterino, câncer de pele não melanoma, câncer de pele melanoma, carcinoma de pele, câncer de pulmão de células pequenas, câncer de intestino delgado, sarcoma de tecidos moles, carcinoma de células escamosas, câncer de pescoço escamoso, câncer de estômago, tumores neuroectodérmicos primitivos supratentoriais, linfoma de célula t, câncer testicular, câncer de garganta, timoma e carcinoma tímico, câncer da tireoide, câncer de células transicionais de pelve renal e ureter, tumor trofoblástico, câncer gestacional, câncer de ureter e pélvis renal, câncer de células transicionais, câncer de uretra, câncer uterino, câncer do endométrio, sarcoma uterino, câncer vaginal, câncer vulvar, Macroglobulinemia de Waldenstrom, ou Tumor de wilms.

14. Composição farmacêutica, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende um composto da Fórmula (I), de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10 ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em combinação com um portador, diluente, adjuvante ou excipiente farmaceuticamente aceitável.

15. Composição farmacêutica, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende um composto da Fórmula (I), de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10 ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo como um ingrediente ativo, para o tratamento de uma doença ou condição mediada por Axl.