BR112020026458A2 - proteínas imunodominantes e fragmentos na esclerose múltipla - Google Patents

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Abstract

PROTEÍNAS IMUNODOMINANTES E FRAGMENTOS NA ESCLEROSE MÚLTIPLA. A revelação está relacionada ao tratamento, diagnóstico e/ou prevenção de esclerose múltipla (MS) por utilização de uma proteína ou peptídeo imunodominante. Mais particularmente, a invenção está relacionada ao campo de antígeno imunoterapias específicas, por exemplo, a indução de tolerância.

Description

PROTEÍNAS IMUNODOMINANTES E FRAGMENTOS NA ESCLEROSE MÚLTIPLA CAMPO DA INVENÇÃO
[001] A revelação está relacionada ao tratamento, diagnóstico e/ou prevenção de esclerose múltipla por utilização de uma proteína ou peptídeo imunodominante. Mais particularmente, a invenção está relacionada ao campo de imunoterapias antígeno-específicas, por exemplo, da indução de tolerância.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
[002] A esclerose múltipla (MS) é uma doença inflamatória autoimune devastadora que afeta principalmente adultos jovens. A MS é um exemplo prototípico de uma doença autoimune órgão-específica (AID), na medida em que a resposta autoimune visa apenas o sistema nervoso central (SNC), que consiste no cérebro e medula espinhal. AID órgão-específica significa que o sistema imune do paciente danifica um tecido ou tipo de célula específico por células T e/ou anticorpos autorreativos.
[003] A MS afeta preferencialmente adultos jovens entre 20 e 40 anos, mas crianças e indivíduos mais velhos também podem desenvolver MS. A doença é cerca de 2-3 vezes mais frequente em mulheres do que em homens. A MS normalmente se manifesta clinicamente por problemas temporários com a visão (neurite óptica aguda), sensação, ou função motora e autônoma, mas pode levar a uma ampla gama de sintomas neurológicos.
[004] No momento da primeira manifestação, quando diagnósticos diferenciais foram excluídos, a doença é referida como síndrome clinicamente isolada (CIS), desde que os achados no líquido cefalorraquidiano (LCR) e no imageamento por ressonância magnética (MRI) sejam consistentes com o diagnóstico. MRI revela lesões em localizações típicas para MS, ou seja, justacorticais, periventriculares, no tronco cerebral ou medula espinhal. Se certos critérios são preenchidos, que podem ser resumidos como disseminação em espaço (mais de uma lesão ou sintoma/sinal clínico) e tempo (mais de um evento), então o diagnóstico de esclerose múltipla remitente-recorrente (RRMS) pode ser feito. Um cenário especial é a descoberta acidental de lesões na MRI compatíveis com MS sem sintomas clínicos. Isso é denominado síndrome radiologicamente isolada (RIS) e pode ser considerado um pré-estágio de CIS e RRMS. Mais de 80% dos pacientes sofrem de uma dessas, e a maioria dos pacientes desenvolve mais tarde o que é denominada MS progressiva secundária (SPMS). Nesse momento, recidivas/exacerbações se tornam menos frequentes ou param completamente e a deficiência neurológica aumenta firmemente entre recidivas ou sem estas.
[005] Uma forma especial de MS é a MS progressiva primária (PPMS), que nunca apresenta recidivas, mas sim começa com piora firme de sintomas neurológicos, por exemplo, da habilidade para caminhar. A PPMS afeta aproximadamente 10% dos pacientes com MS e homens e mulheres com frequência igual. Seu surgimento normalmente ocorre mais tarde do que CIS ou RRMS. Com relação às causas e mecanismos de doença, PPMS é considerada similar às RIS-CIS-RRMS-SPMS acima.
[006] Tipicamente, MS é diagnosticada de acordo com os critérios revisados de McDonald ou recentemente de Lublin. Esses critérios também permitem a distinção entre as diferentes formas e atividade da doença de MS (Thompson e cols., 2018, Lancet Neurol., 17 (2): 162-173).
[007] A MS é uma doença com um fundo genético complexo. Mais do que 200 alelos de risco ou traços quantitativos (variantes de genes comuns detectadas como polimorfismos de nucleotídeo único, SNPs) para MS foram identificados na última década; no entanto, de longe, o mais importante é o haplótipo antígeno leucocitário humano (HLA)-DR15. Além disso, vários fatores de risco ambientais/de estilo de vida foram encontrados. Estes incluem infecção com vírus de Epstein-Barr (EBV), tabagismo, níveis baixos de vitamina D3 e obesidade, sendo aqueles mais importantes.
[008] Todos os fatores de risco genéticos e ambientais são comuns e compartilhados por muitos indivíduos na população saudável. As razões exatas, por que a doença começa em indivíduos com certos fatores de risco genéticos e ambientais, não são claras, mas supõe-se que infecções virais e bacterianas, por exemplo, por alterações na microbiota intestinal, possam ser gatilhos. A taxa de concordância de gêmeos monozigóticos de 10-30% e o risco de parentes de primeiro grau de um paciente com MS de aproximadamente 2-4%, comparados com um risco de 1/1.000 na população geral, fornecem uma estimativa do risco genético versus o risco ambiental, embora a interação entre os dois também seja complexa.
[009] A fim de identificar os componentes do SNC contra os quais a resposta autoimune na MS é dirigida, os pesquisadores dirigiram seus esforços contra as células e estruturas que são afetadas na MS, particularmente mielina e axônios/neurônios, e às proteínas que são específicas para essas células/estruturas. Durantes os últimos trinta anos,
várias proteínas de mielina como, por exemplo, proteína básica de mielina (MBP), proteína proteolipídica (PLP) e glicoproteína oligodendroglial de mielina (MOG), foram identificadas como encefalitogênicas em modelos animais (encefalomielite autoimune experimental; EAE), ou seja, sua injeção em cepas de roedores suscetíveis leva a uma doença com similaridades com MS, mas também por exame de células imunes de pacientes com MS (Sospedra e Martin, 2005, Annu. Rev. Immunol., 23: 683-747). Os autoantígenos acima são SNC- específicos e exclusivamente (PLP e MOG) ou quase exclusivamente (MBP) expressas no cérebro. Na MS, poucos autoantígenos que não são SNC-específicos como, por exemplo, alfa-B cristalina e transaldolase-H, também foram descritos como alvos potenciais.
[0010] Evidência atuais sugerem células T CD4+ autorreativas como um fator central para a patogênese autoimune de MS provavelmente relevante não apenas para a indução e manutenção da resposta autoimune, mas também durante dano tecidual (Sospedra e Martin, 2005). A frequência de células T CD4+ de alta avidez reativas aos constituintes principais da bainha de mielina, por exemplo, MBP, PLP e MOG, está aumentada nos pacientes com MS (Bielekova e cols., 2004, J. Immunol., 172: 3.893-3.904). Em função de seu envolvimento na patogênese da doença, células T CD4+ são um alvo para intervenções terapêuticas.
[0011] Investigação detalhada da resposta imune contra as proteínas SNC-específicas mostrou que certos peptídeos destas são reconhecidos por uma grande fração de pacientes e no contexto das moléculas HLA-DR associadas à doença. Esses peptídeos são citados como imunodominantes (Bielekova e cols., 2004).
[0012] As seguintes características indicam que certo peptídeo de uma proteína é imunodominante no contexto de MS: a) reconhecimento frequente desse peptídeo por células T, ou seja, por aproximadamente 10% ou mais de pacientes com MS, frequentemente no contexto de um alelo ou haplótipo HLA associado à doença (Sospedra e Martin, 2005), e b) reconhecimento desse peptídeo por células T relevantes para doença, tais como aquelas que respondem aos peptídeos em concentrações baixas (células T de alta avidez) (Bielekova e cols., 2004) e são, portanto, consideradas particularmente perigosas, e/ou possuem um fenótipo pró- inflamatório, e/ou são isoladas do órgão ou compartimento- alvo (SNC), no caso de MS, células T infiltrantes no cérebro, medula espinhal ou LCR.
[0013] No entanto, o reconhecimento com alta avidez não é um pré-requisito, na medida em que células T mielina- específicas de baixa avidez também demonstraram que são patogênicas em modelos em camundongo transgênico humanizado (Quandt e cols. 2012, J. Immunol., 189 (6): 2.897-2.908).
[0014] Foi demonstrado recentemente que células T de pacientes com MS exibem proliferação aumentada in vitro na ausência de an antígeno exógeno (Mohme e cols., 2013, Brain, 136: 1.783-1.798). Essas células T “autoproliferantes” são enriquecidas para células que se dirigem para o compartimento do SNC de pacientes com MS e podem, dessa forma, ser consideradas como uma fonte do sangue periférico de células T que infiltram o cérebro/LCR (Jelcic e cols., 2018, Cell, 175(1): 85-100.e23).
[0015] Quando dados de testagem de células T in vitro não estão disponíveis ou, além dessas testagens, o reconhecimento imune de peptídeos também pode ser previsto/inferido a partir daqueles peptídeos que irão se ligar bem aos alelos HLA-classe I ou -classe II do indivíduo e para células T CD8+ e CD4+, respectivamente. As predições de ligação a peptídeos são bem conhecidas por aqueles habilitados na técnica. Elas podem ser realizadas por algoritmos de predição bem estabelecidos (NetMHCII - www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCII/; IEDB - www.iedb.org/) e análise dos motivos de ligação de HLA (SYFPEITHI - www.syfpeithi.de/).
[0016] Peptídeos imunodominantes podem ser usados em imunoterapias antígeno-específicas como, por exemplo, indução de tolerância. Um exemplo é EP 2 205 273 B1, que revela peptídeos imunodominantes de MBP, PLP e MOG e sua aplicação para o tratamento de MS. Na abordagem nele revelada, os peptídeos são acoplados às células sanguíneas brancas ou vermelhas.
[0017] A indução de tolerância é antígeno-específica e torna as células T autorreativas não-funcionais ou anérgicas ou induz células T regulatórias (Treg) que suprimem especificamente autoimunidade indesejável aos referidos antígenos-alvo. A indução de tolerância aos autoantígenos- alvo é um objetivo terapêutico altamente importante em doenças autoimunes. Ela oferece a oportunidade para atenuar especificamente a resposta autoimune patogênica de uma forma eficaz com poucos efeitos colaterais. A indução de tolerância também pode ser obtida por aplicação de uma proteína inteira ao invés de ou em adição a um peptídeo imunodominante que é um fragmento da proteína (Kennedy MK e cols., 1990, J.
Immunol., 144 (3): 909-15).
[0018] Algumas características patológicas de MS são refletidas no modelo de EAE, um modelo animal paradigmático de doença autoimune dirigida por célula Th1/Th17. Estudos em EAE recidivante (R-EAE) nos camundongos SJL demonstraram claramente que a desmielinização crônica envolve a ativação de respostas de célula T a um peptídeo imunodominante de mielina, ou seja, PLP 139-154, ao qual a primeira exacerbação da doença é dirigida. Subsequentemente, a resposta imune se amplia para outros peptídeos de mielina de PLP, MBP e MOG, um processo que é denominado disseminação de epitopo. A não responsividade de células T, ou seja, tolerância, pode, por exemplo, ser induzida quando células apresentadoras de antígeno (APC) pulsadas com peptídeo antigênico são, por exemplo, tratadas com o ligante cruzado 1-etil-3-(3- dimetilaminopropil)-carbodiimida (ECDI; também abreviado EDC).
[0019] Experimentos pré-clínicos provaram que uma única injeção i.v. de esplenócitos murídeos naïve pulsados com uma mistura de peptídeos de mielina encefalitogênicos e fixados com o ligante cruzado EDC é altamente eficiente na indução de tolerância peptídeo-específica in vivo. Em EAE, esse protocolo não apenas protegeu os animais da doença, mas até mesmo reduziu eficazmente o surgimento e severidade de todas as recidivas subsequentes quando dado após indução da doença, indicando que a tolerância específica pode infra-regular uma resposta autoimune em andamento (Miller e cols., 1991, Acad. Sci., 636: 79-94). Mais relevante para o tratamento de MS, estudos em EAE demonstraram que a tolerância pode ser induzida simultaneamente a múltiplos epitopos usando um coquetel de peptídeos de mielina encefalitogênicos fornecendo, dessa forma, a capacidade para direcionar células T autorreativas com múltiplas especificidades.
[0020] A tolerização de células T humanas por células acopladas a um antígeno autólogo, por exemplo, APCs (Vandenbark e cols., 2000, Int. Immunol., 12: 57-66) ou células não nucleadas, ou seja, células sanguíneas vermelhas (RBCs), tratadas com EDC, é eficaz in vitro, como demonstrado por incapacidade das células T tolerizadas para proliferar ou para produzir citocinas Th1 e uma expressão diminuída de moléculas coestimulatórias nessas células.
[0021] Há evidência de que pelo menos dois mecanismos distintos estão envolvidos na indução de tolerância antígeno-específica por esse regime: 1) Tolerância direta na qual clones de Th1 que encontram complexos nominais antígeno/MHC em APCs acopladas a antígeno foram anergizados como resultado de incapacidade para receber coestimulação mediada por CD28 adequada, e 2) mecanismos indiretos como, por exemplo, tolerância cruzada, nos quais a tolerância é induzida por reprocessamento e reapresentação de antígenos por APCs tolerogênicas do hospedeiro e/ou expansão de células Treg.
[0022] Essa última, tolerância cruzada, provavelmente envolve a indução e/ou expansão de células Treg antígeno- específicas cuja suposição também é apoiada por dados obtidos em um experimento de Fase Ib, como revelado nesse relatório descritivo. Além disso, o tratamento de células com EDC induz apoptose em uma percentagem substancial de células tratadas. Dessa forma, um mecanismo indireto que envolve APCs fixadas passando por apoptose, que são então processadas e representadas por APCs do hospedeiro, é provável. Isso ainda é apoiado por indução eficaz de tolerância em camundongos deficientes em MHC e alogênicos. Células dendríticas derivadas da medula óssea in vitro fagocitam e processam eficazmente APCs fixadas pulsadas com antígeno.
[0023] As terapias para MS aprovadas atualmente envolvem várias estratégias imunomoduladoras ou imunossupressoras antígeno-não-específicas, que são apenas parcialmente eficazes. Todos os produtos terapêuticos atuais precisam ser tomados oralmente diariamente ou injetados/infundidos em vários intervalos de tempo e por períodos de tempo longos. Além disso, eles estão associados com efeitos colaterais numerosos e, algumas vezes, severos.
[0024] Uma terapia que aborde a patogênese de MS em sua raiz deve visar deletar ou funcionalmente inibir especificamente células autorreativas patogênicas, sem alterar o sistema imune “normal”. Isso é de importância, pois a imunomodulação e/ou imunossupressão global vêm ao custo da inibição de células regulatórias e células imunes benéficas que servem funções protetoras contra patógenos. Idealmente, a tolerância imune peptídeo-específica, que é a correção específica da resposta autoimune dirigida erroneamente contra tecido do cérebro/medula espinhal, deve ser obtida precocemente na fase inflamatória da doença, quando o bloqueio da resposta imune autorreativa pode inibir a disseminação e propagação da doença e a incapacidade irreversível pode ser evitada. Portanto, o grupo de pacientes visado preferido consiste em pacientes com MS remitente- recorrente no início da evolução da doença ou até mesmo pacientes que se apresentam com um primeiro evento clínico sugestivo de MS, ou seja, CIS, ou pacientes nos quais a doença é descoberta ainda mais cedo no estágio de RIS. Nesse ponto do tempo, pacientes com MS geralmente possuem um grau baixo de incapacidade neurológica, o que permite que eles participem em todas as atividades da vida cotidiana e trabalhem sem comprometimento significante.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[0025] É um objetivo da presente invenção identificar antígenos relevantes para MS adequados para uso no tratamento, diagnóstico e/ou prevenção de MS, em particular em uma abordagem de tolerização. Um aspecto adicional da presente invenção é a identificação de um indivíduo humano que seja adequado para tolerização.
[0026] A presente invenção se baseia em uma nova abordagem para identificação de antígenos relevantes para MS: foram examinadas células T expandidas clonalmente no cérebro de um paciente com MS (homozigoto para o haplótipo HLA-DR15, que sabidamente é o principal fator de risco genético na MS), que morreu de uma forma muito agressiva de MS. Desse modo, pela primeira vez, células T que se originam e expandidas clonalmente no órgão-alvo foram analisadas com o objetivo de identificação de antígeno. Em todas as abordagens prévias, linfócitos do sangue periférico foram analisados para identificar antígenos imunodominantes.
[0027] A expansão clonal de um clone de célula T (TCC) nas lesões cerebrais de MS sugere que as células são relevantes para MS. Nesse relatório descritivo, os antígenos-alvo de um TCC específico que foi descrito previamente em Planas e cols. (Planas e cols., 2015, Ann. Clin. Transl. Neurol., 2 (9): 875-893), TCC21.1, foram identificados. Além disso, os antígenos-alvo de outro TCC (TCC14) do mesmo paciente foram identificados. No caso de TCC14, o clone foi isolado de uma população de células T do sangue periférico que foi identificada como relevante para doença por demonstração de proliferação espontânea (autotproliferação) aumentada e enriquecimento para células T autorreativas que se dirigem ao cérebro. Especificamente, foi verificado que TCC14 está expandido clonalmente nas lesões cerebrais de MS, embora tenha sido isolado do sangue periférico. O isolamento e identificação de células T relevantes para doença como TCC21.1 e TCC14 estão retratados esquematicamente na Fig. 1.
[0028] Epitopos-alvo que são reconhecidos por células T biologicamente relevantes (por exemplo, infiltrantes de tecidos) podem então ser identificados (Fig. 2).
[0029] Essa nova abordagem revelou as proteínas GDP-L- fucose sintase (abreviação do gene: TSTA3; também conhecida como: GDP-L-fucose:NADP+ 4-oxidorredutase (epimerização- 3,5) ou GDP-4-ceto-6-desóxi-D-manose-3,5-epimerase-4- redutase) e proteínas da família RASGRP (proteína de liberação de guanil RAS), incluindo RASGRP1, RASGRP2, RASGRP3 e RASGRP4, bem como variantes de splicing e isoformas destas como particularmente relevantes na MS. RASGRP2 é especialmente preferida. Dessa forma, foi verificado que essas proteínas são imunodominantes na MS e são autoantígenos.
[0030] A relevância também foi testada em células T CD4+ infiltrantes no LCR de pacientes com CIS/MS para GDP-L-fucose sintase e em células mononucleares derivadas do sangue periférico para RASGRP2. Em uma análise adicional, tanto
GDP-L-fucose sintase quanto RASGRP2 foram testadas em células T CD4+ infiltrantes no LCR de pacientes com CIS/MS.
[0031] Dessa forma, os antígenos como descritos nesse relatório descritivo nos exemplos são os primeiros antígenos imunodominantes na MS que foram descobertos por exame da especificidade de células T que são expandidas clonalmente nas lesões cerebrais de MS e, portanto, supostamente estão envolvidos na reação autoimune deletéria no cérebro. A metodologia que pode levar à sua identificação, bibliotecas combinatórias de peptídeos, não envolve o foco mencionado acima em proteínas de mielina/cérebro, mas é completamente livre de vieses. Os antígenos não haviam sido descritos como implicados na MS anteriormente. Além disso, o sequenciamento de RNA e proteômica demonstraram que autoantígenos, GDP-L- fucose sintase e RASGRP2 e as proteínas RASGRP1 e -3 relacionadas, são expressos no tecido cerebral da MS.
[0032] Os antígenos identificados podem ser usados no tratamento, diagnóstico e/ou prevenção de MS, em particular em uma abordagem de tolerização, e para identificação de um indivíduo humano que seja adequado para tolerização. Por identificação de um indivíduo humano que seja adequado para tolerização, o indivíduo humano pode ser diagnosticado in vitro com MS. Em outras palavras, os autoantígenos identificados podem ser usados no diagnóstico in vitro de MS. Essa testagem in vitro pode ser complementada com achados clínicos e de imageamento, ou seja, o diagnóstico de MS de acordo com o estado da técnica, em particular de acordo com os critérios de McDonald revisados. Dessa forma, os autoantígenos identificados podem servir para o diagnóstico de MS em um indivíduo humano com ou sem testes diagnósticos adicionais.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[0033] Figura 1 Isolamento de células T relevantes para doença
[0034] Figura 2 Descoberta de epitopo-alvo
[0035] Figura 3 Misturas de varredura posicional de decapeptídeos de definição simples e dupla em combinação com análise biométrica para identificar a especificidade de TCC21.1
[0036] Figura 4 Resumo de decapeptídeos humanos preditos com a abordagem biométrica, sintetizados e testados para capacidade estimulante
[0037] Figura 5 Transcritos e peptídeos de GDP-L-fucose sintase identificados em tecido cerebral
[0038] Figura 6 Peptídeos de GDP-L-fucose sintase, mielina e CEF (peptídeos de controle de citomegalovírus, vírus de Epstein-Barr e vírus influenza)
[0039] Figura 7 Reconhecimento de peptídeos de GDP-L- fucose sintase por células T CD4+ infiltrantes no LCR de pacientes com CIS/MS
[0040] Figura 8 Isolamento de células T autoproliferantes e células T autoproliferantes encontradas nas lesões cerebrais de MS
[0041] Figura 9 Procedimento de seleção para identificação de ligante de peptídeo do TCC14 dirigido ao cérebro autoproliferante, isolado do sangue periférico, usando uma biblioteca de varredura posicional
[0042] Figura 10 Reatividade de RASGRP2 de células T de memória derivadas do sangue periférico
[0043] Figura 11 Expressão de RASGRPs em células B do sangue periférico e cérebro
[0044] Figura 12 Identificação de peptídeo de proteínas RASGRP1, 2 e 3 em tecido cerebral
[0045] Figura 13 Coloração de células acopladas à biotina-PLP1
[0046] Figura 14 Reconhecimento de peptídeos de GDP-L- fucose sintase e mielina por células T CD4+ infiltrantes no LCR de 105 pacientes com MS
[0047] Figura 15 Reconhecimento de peptídeos de RASGRP2 e mielina por células T CD4+ infiltrantes no LCR de 57 pacientes com MS
[0048] Figura 16 Indução de tolerância in vivo com células sanguíneas vermelhas acopladas aos peptídeos de mielina
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[0049] As células T usadas para identificação de peptídeos imunodominantes e da proteína correspondente são idealmente aquelas células T que são patogeneticamente relevantes para a doença. Em relação à última característica, aquelas células T que estão expandidas clonalmente nos tecidos de MS-alvo, o cérebro, medula espinhal e LCR, são de interesse maior para identificação de antígenos-alvo relevantes para doença. De acordo com um método como descrito por Planas e cols. (2015), o sequenciamento de próxima geração de sequências de DNA complementar ou genômico da cadeia beta do receptor de célula T (TCR) tem sido usado para identificar células T expandidas clonalmente em lesões em autópsias do cérebro de pacientes com MS e isolar essas células T como TCC de LCR e/ou tecido autólogo (que compreende células vivas e obtidas por, por exemplo, biópsia ou autópsia inicial) e sua caracterização com relação ao fenótipo funcional e especificidade de antígeno. Desse modo, foram isolados TCCs relevantes para doença. Especificamente, TCC21.1 foi identificado e caracterizado: TCC21.1 exibiu um fenótipo Th2 que libera principalmente citocinas Th2 e foi capaz de fornecer célula B auxiliar para produção de anticorpos. Essa estratégia levou à identificação da relevância da proteína GDP-L-fucose sintase.
[0050] A estratégia acima, ou seja, sequenciamento profundo de TCR de células T infiltrantes do cérebro/medula espinhal/LCR, também foi usada para isolar células T relevantes para doença do sangue periférico e clonar células T identificadas de células mononucleares autoproliferantes (PBMC) do sangue periférico. Essa estratégia levou à identificação da relevância da família de proteínas RASGRP.
[0051] Os presentes estudos com células T que infiltram o LCR (para GDP-L-fucose sintase e em uma análise adicional tanto para GDP-L-fucose sintase quanto para RASGRP2) e com células T do sangue periférico (para RASGRP2), dessa forma, demonstram que estas são alvos imunodominantes da resposta autoimune na MS, e tanto GDP-L-fucose sintase quanto RASGRP2 (e outros membros da família RASGRP) são reconhecidas por células T infiltrantes no cérebro na MS, incluindo CIS, RRMS e SPMS. Os algoritmos de predição de ligação a peptídeos in silico NetMHCII e IEDB também foram usados para identificar regiões imunodominantes dentro da respectiva proteína (como descrito nos “Exemplos”).
[0052] A enzima citosólica GDP-L-fucose sintase converte GDP-4-ceto-6-desóxi-D-manose em GDP-L-fucose, que é então usada por fucosiltransferases para a fucosilação de todos os oligossacarídeos. Em mamíferos, glicanos fucosilados desempenham papéis importantes em muitos processos biológicos, incluindo reações a transfusões de sangue, interações hospedeiro-micróbio, patogênese do câncer e manutenção de um ambiente não inflamatório no cérebro.
[0053] As proteínas RASGR existem em pelo menos quatro variantes: RASGRP1, RASGRP2, RASGRP3 e RASGRP4. RASGRP1, RASGRP2, RASGRP3, em particular, foram implicadas na presente invenção. A família de proteínas é caracterizada pela presença de um domínio do fator de troca de nucleotídeo guanina (GEF) da superfamília Ras que funciona como um fator de troca de nucleotídeo regulado por diacilglicerol (DAG) que ativa especificamente Ras por meio da troca de GDP ligado por GTP. As proteínas da família de proteínas ativam a cascata de Erk/MAP quinase. Elas estão envolvidas em apoptose reduzida e tumorigênese de células B infectadas por EBV, sinalização, adesão, motilidade de células B e T, e são cruciais para a manutenção de homeostasia da célula B-T. Pelo menos quatro isoformas, ou seja, variantes de splicing, de RASGRP2, existem.
[0054] Os antígenos identificados GDP-L-fucose sintase e RASGRP2 (bem como RASGRP1, RASGRP3 e RASGRP4) não foram implicados na etiologia ou patogênese de MS ou seu modelo animal, EAE, anteriormente. O presente achado de que ambas as proteínas ou fragmentos, derivados ou variantes de splicing destas são um alvo imunodominante da resposta autoimune na MS permite a utilização delas no tratamento, diagnóstico e/ou prevenção de MS.
[0055] Uma proteína visa significar oligopeptídeos, polipeptídeos, bem como proteínas como tais. Uma sequência de proteínas pode ser definida por uma entrada de GenBank. Uma sequência de proteínas também pode ser definida por uma entrada de UniProtKB/Swiss-Prot e/ou por uma entrada de GenPept. Uma entrada pode ser definida por um número, por exemplo, um número de acesso. Quando aplicável, as entradas em banco de dados incluem o respectivo número de acesso (ou seja, um número de entrada) e número de versão. Uma proteína também pode ser definida por qualquer outro banco de dados conhecido por aqueles habilitados na técnica. Podem existir diferentes isoformas, derivados e/ou variantes de splicing que também são englobados pela presente invenção. Desse modo, a sequência pode variar da sequência conhecida, por exemplo, da entrada de GenBank ou UniProtKB/Swiss-Prot.
[0056] “Uma” proteína ou “a” proteína de acordo com a presente invenção se refere a uma proteína GDP-L-fucose sintase ou a uma proteína da família de proteínas RASGRP, preferivelmente RASGRP2, ou se refere tanto a uma proteína GDP-L-fucose sintase quanto a uma proteína da família de proteínas RASGRP, preferivelmente RASGRP2, salvo quando explicitamente mencionado o contrário.
[0057] Uma variante de splicing surge de splicing alternativo durante expressão gênica. A variante de splicing de acordo com a invenção é preferivelmente imunodominante.
[0058] Um fragmento é preferivelmente qualquer parte da proteína que é mais curta, ou seja, possui menos aminoácidos, do que a proteína-mãe. Um fragmento pode ser um peptídeo. Em uma modalidade, o fragmento compreende 5 a 50, preferivelmente 5 a 20, mais preferivelmente 10 a 15 aminoácidos, ainda mais preferivelmente 15 aminoácidos. O fragmento de acordo com a invenção é preferivelmente imunodominante.
[0059] Também é possível usar mais do que um fragmento de acordo com a invenção. De preferência, mais do que três, mais do que cinco, mais do que 10, mais do que 15 ou até mesmo mais do que 20 fragmentos diferentes são usados. Em uma modalidade preferida, entre cinco e 20, preferivelmente entre cinco e 15 fragmentos diferentes são usados. Um fragmento é diferente de outro fragmento se ele não consiste na mesma sequência de aminoácidos.
[0060] Em outra modalidade, pelo menos um fragmento de cada proteína de acordo com a presente invenção (uma proteína GDP-L-fucose sintase ou uma proteína da família de proteínas RASGRP, preferivelmente RASGRP2) são usados em combinação. É particularmente vantajoso combinar pelo menos um fragmento de cada proteína de acordo com a presente invenção com pelo menos um peptídeo conhecido do estado da técnica, em particular com pelo menos um peptídeo de mielina, em particular com pelo menos um ou todos os peptídeos de mielina como definidos pelos IDS. DE SEQ. Nos: 261 a 267.
[0061] Um derivado de uma sequência é preferivelmente definido como uma sequência de aminoácidos que compartilha uma homologia ou identidade sobre seu comprimento inteiro com uma parte correspondente da sequência de aminoácidos de referência de pelo menos 75%, mais preferivelmente pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 93%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%. A “parte correspondente” no sentido da presente invenção preferivelmente se refere ao mesmo trecho de aminoácidos da mesma sequência-mãe. Por exemplo, se um derivado com um comprimento de 100 aminoácidos difere de um trecho de aminoácidos do ID. DE SEQ. Nº: 1 (aminoácidos 1 a 100 do ID. DE SEQ. Nº: 1) por 20 aminoácidos, esse derivado particular compartilha uma identidade de 80% sobre seu comprimento inteiro com a parte correspondente, ou seja, aminoácidos 1 a 100, da sequência de aminoácidos de referência, ou seja, ID. DE SEQ. Nº: 1. O derivado de acordo com a invenção é preferivelmente imunodominante.
[0062] Uma “homologia” ou “identidade” de uma sequência de aminoácidos é preferivelmente determinada de acordo com a invenção sobre o comprimento inteiro da sequência de aminoácidos de referência ou sobre o comprimento inteiro da parte correspondente da sequência de aminoácidos de referência que corresponde à sequência cuja homologia ou identidade é definida.
[0063] Uma “identidade” é definida como aminoácidos idênticos, uma “homologia” compreende aminoácidos idênticos, bem como substituições conservativas. Aqueles habilitados na técnica têm conhecimento de substituições conservativas, por exemplo: - F aromático e W/Y aromáticos - R carregado positivamente e K/H carregados positivamente - E e D carregados negativamente ou - V alifático e L/M/I, ou A e S/T.
[0064] A sequência de nucleotídeos que codifica qualquer uma das proteínas da presente invenção ou fragmento, derivado ou variante de splicing desta se refere a qualquer sequência de nucleotídeos codificadora, por exemplo, RNA ou DNA, em particular mRNA ou cDNA. Em uma modalidade, a sequência de nucleotídeos é um plasmídeo ou qualquer tipo de vetor conhecido por aqueles habilitados na técnica. Em uma modalidade preferida, as sequências de nucleotídeos não compreendem íntrons e as sequências gênicas compreendem éxons e íntrons.
[0065] Em um aspecto da invenção, a proteína para uso no tratamento, diagnóstico e/ou prevenção de esclerose múltipla (MS) é GDP-L-fucose sintase ou um fragmento, derivado ou variante de splicing desta. Em outro aspecto da invenção, a proteína é um membro da família RASGRP ou um fragmento, derivado ou variante de splicing desta. A invenção também se refere a uma sequência de nucleotídeos que codifica qualquer uma das proteínas ou fragmento, derivado ou variante de splicing destas, para uso no tratamento, diagnóstico e/ou prevenção de esclerose múltipla (MS).
[0066] Em uma modalidade preferida, as proteínas são proteínas humanas e/ou as sequências de nucleotídeos e/ou sequências gênicas são sequências humanas.
[0067] Em uma modalidade, a GDP-L-fucose sintase mostra atividade enzimática de conversão de GDP-4-ceto-6-desóxi-D- manose em GDP-L-fucose.
[0068] Em outra modalidade, o membro da família RASGRP ativa Ras por meio da troca de GDP ligado por GTP. Adicionalmente ou alternativamente, a proteína ativa a cascata de Erk/MAP quinase.
[0069] Em uma modalidade preferida, a proteína GDP-L- fucose sintase: a) possui a sequência de aminoácidos como apresentada no ID. DE SEQ. Nº: 1 ou
[0070] b) possui uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 85%, preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 95% idêntica à sequência de aminoácidos como apresentada no ID. DE SEQ. Nº: 1 ou c) possui uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70%, preferivelmente pelo menos 80%, mais preferivelmente pelo menos 90% homóloga à sequência de aminoácidos como apresentada no ID. DE SEQ. Nº: 1 ou d) possui uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 60%, preferivelmente pelo menos 70%, mais preferivelmente pelo menos 80%, ainda mais preferivelmente pelo menos 90% homóloga à sequência de aminoácidos como apresentada no ID. DE SEQ. Nº: 1 e a proteína ou fragmento ou variante de splicing desta se liga a um alelo HLA autólogo, é reconhecido por uma célula T e/ou é reconhecido por um anticorpo que se liga ou reconhece a sequência de aminoácidos como apresentada no ID. DE SEQ. Nº: 1 ou um fragmento deste ou e) é codificada por um gene TSTA3, em particular por uma sequência do gene do nucleotídeo 143612618 ao 143618048 de NC_000008.11, ou é codificada por um gene que é pelo menos 80%, preferivelmente pelo menos 90%, ainda mais preferivelmente pelo menos 95% idêntico à sequência do gene do nucleotídeo 143612618 ao 143618048 de NC_000008.11.
[0071] Em outra modalidade preferida, o membro da família de proteínas RASGRP: f) possui a sequência de aminoácidos como apresentada em qualquer um do ID. DE SEQ. Nº: 2, ID. DE SEQ. Nº: 3, ID. DE SEQ. Nº: 4, ID. DE SEQ. Nº: 5, ID. DE SEQ. Nº: 6, ID. DE SEQ. Nº: 7, ID. DE SEQ. Nº: 8 ou ID. DE SEQ. Nº: 9 ou g) possui uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 85%, preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 95% idêntica à sequência de aminoácidos como apresentada em qualquer um do ID.
DE SEQ.
Nº: 2, ID.
DE SEQ.
Nº: 3, ID.
DE SEQ.
Nº: 4, ID.
DE SEQ.
Nº: 5, ID.
DE SEQ.
Nº: 6, ID.
DE SEQ.
Nº: 7, ID.
DE SEQ.
Nº: 8 ou ID.
DE SEQ.
Nº: 9 ou h) possui uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70%, preferivelmente pelo menos 80%, mais preferivelmente pelo menos 90% homóloga à sequência de aminoácidos como apresentada em qualquer um do ID.
DE SEQ.
Nº: 2, ID.
DE SEQ.
Nº: 3, ID.
DE SEQ.
Nº: 4, ID.
DE SEQ.
Nº: 5, ID.
DE SEQ.
Nº: 6, ID.
DE SEQ.
Nº: 7, ID.
DE SEQ.
Nº: 8 ou ID.
DE SEQ.
Nº: 9 ou i) possui uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 60%, preferivelmente pelo menos 70%, mais preferivelmente pelo menos 80%, ainda mais preferivelmente pelo menos 90% homóloga à sequência de aminoácidos como apresentada em qualquer um do ID.
DE SEQ.
Nº: 2, ID.
DE SEQ.
Nº: 3, ID.
DE SEQ.
Nº: 4, ID.
DE SEQ.
Nº: 5, ID.
DE SEQ.
Nº: 6, ID.
DE SEQ.
Nº: 7, ID.
DE SEQ.
Nº: 8 ou ID.
DE SEQ.
Nº: 9 e a proteína ou fragmento ou variante de splicing desta se liga a um alelo HLA autólogo, é reconhecido por uma célula T e/ou é reconhecido por um anticorpo que se liga ou reconhece a respectiva sequência de aminoácidos como apresentada em qualquer um do ID.
DE SEQ.
Nº: 2, ID.
DE SEQ.
Nº: 3, ID.
DE SEQ.
Nº: 4, ID.
DE SEQ.
Nº: 5, ID.
DE SEQ.
Nº: 6, ID.
DE SEQ.
Nº: 7, ID.
DE SEQ.
Nº: 8 ou ID.
DE SEQ.
Nº: 9 ou um fragmento deste ou j) é codificada por um gene RASGRP, em particular por uma sequência do gene do nucleotídeo - 38488101 a 38565575 de NC_000015.10, - 64726911 a 64745456 de NC_000011.10,
- 33436324 a 33564750 de NC_000002.12, ou - 38409051 a 38426305 de NC_000019.10, ou é codificada por um gene que é pelo menos 80%, preferivelmente pelo menos 90%, ainda mais preferivelmente pelo menos 95% idêntico à sequência do gene do nucleotídeo - 38488101 a 38565575 de NC_000015.10, - 64726911 a 64745456 de NC_000011.10, - 33436324 a 33564750 de NC_000002.12, ou - 38409051 a 38426305 de NC_000019.10.
[0072] A ligação a um alelo HLA autólogo, reconhecimento por uma célula T e/ou o reconhecimento por um anticorpo pode indicar imunodominância da proteína ou fragmento ou variante de splicing desta. A imunodominância também pode ser testada como revelado abaixo.
[0073] Em uma modalidade particularmente preferida, uma GDP-L-fucose sintase ou proteína RASGRP2 ou variante de splicing desta, preferivelmente a GDP-L-fucose sintase ou proteína RASGRP2, é usada na presente invenção. A proteína GDP-L-fucose sintase possui, por exemplo, a sequência como apresentada no ID. DE SEQ. Nº: 1, a proteína RASGRP2 possui, por exemplo, a sequência como apresentada no ID. DE SEQ. Nº: 2, ID. DE SEQ. Nº: 6, ID. DE SEQ. Nº: 7, ID. DE SEQ. Nº: 8 ou ID. DE SEQ. Nº: 9.
[0074] Em uma modalidade, o fragmento compreende 5 a 50, preferivelmente 5 a 20, mais preferivelmente 10 a 15, ainda mais preferivelmente 15 aminoácidos.
[0075] Em outra modalidade, o fragmento é: a) pelo menos 85%, preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 95% idêntico a uma respectiva sequência de aminoácidos correspondente ou b) pelo menos 70%, preferivelmente pelo menos 80%, mais preferivelmente pelo menos 90% homólogo a uma respectiva sequência de aminoácidos correspondente ou c) pelo menos 60%, preferivelmente pelo menos 70%, mais preferivelmente pelo menos 80%, ainda mais preferivelmente pelo menos 90% homólogo a uma respectiva sequência de aminoácidos correspondente e se liga a um alelo HLA autólogo, é reconhecido por uma célula T e/ou é reconhecido por um anticorpo que se liga ou reconhece a respectiva sequência de aminoácidos.
[0076] A “respectiva sequência de aminoácidos correspondente” se refere ao respectivo fragmento da sequência de aminoácidos correspondente (ou seja, ID. DE SEQ. Nº: 1) com o mesmo comprimento que o fragmento homólogo (veja também a definição de “parte correspondente” supra). Um fragmento com essas identidades e/ou homologias pode compreender 5 a 50, preferivelmente 5 a 20, mais preferivelmente 10 a 15, ainda mais preferivelmente 15 aminoácidos. A identidade e/ou homologia é determinada sobre o comprimento inteiro do respectivo fragmento. Em outras palavras, a “sequência de aminoácidos correspondente” se refere à sequência inalterada, ou seja, quando um fragmento de uma sequência como apresentada no ID. DE SEQ. Nº: 1 é 85% idêntico a um respectivo aminoácido correspondente, o fragmento é 85% idêntico (sobre o comprimento inteiro do fragmento) ao fragmento inalterado como “excisado”, ou seja, retirado ou copiado diretamente do ID. DE SEQ. Nº: 1.
[0077] Portanto, em uma modalidade, a proteína (GDP-L- fucose sintase ou um membro da família de proteínas RASGRP) possui uma sequência de aminoácidos com certa homologia (pelo menos 60%, preferivelmente pelo menos 70%, mais preferivelmente pelo menos 80%, ainda mais preferivelmente pelo menos 90%) da respectiva sequência retratada como apresentada nos Nos DE IDS. DE SEQ. com a exigência adicional de que a proteína ou fragmento ou variante de splicing desta se ligue a um alelo HLA autólogo, seja reconhecida por uma célula T e/ou seja reconhecida por um anticorpo que se liga ou reconhece a sequência de aminoácidos como apresentada no respectivo Nº DE ID. DE SEQ. ou um fragmento deste. Em outra modalidade, a proteína ou fragmento ou variante de splicing desta se liga a um alelo HLA autólogo e é reconhecida por uma célula T que se liga ou reconhece a sequência de aminoácidos como apresentada no respectivo Nº DE ID. DE SEQ. ou um fragmento deste.
[0078] Ensaios para a medição e/ou predição da ligação a um alelo HLA autólogo, reconhecimento por uma célula T ou reconhecimento por um anticorpo são bem conhecidos por aqueles habilitados na técnica. A ligação de um peptídeo a um alelo HLA pode ser prevista, por exemplo, pela utilização dos algoritmos de predição de ligação a peptídeos in silico bem aceitos NetMHCII (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCII/) ou IEDB (http://www.iedb.org/). O reconhecimento por célula T pode ser medido, por exemplo, por um ensaio de proliferação de célula T, por exemplo, por medição da radioatividade incorporada. A ligação de um peptídeo e/ou uma proteína a um anticorpo pode ser medida por ensaios padronizados conhecidos por aqueles habilitados na técnica, por exemplo, por ELISA. A ligação a um alelo HLA autólogo, reconhecimento por uma célula T ou reconhecimento por um anticorpo podem indicar imunodominância de um peptídeo ou proteína. A imunodominância também pode ser testada como revelado abaixo.
[0079] Em uma modalidade, o fragmento representa um trecho de aminoácidos consecutivos (por exemplo, 20 a 30 aminoácidos) que são pelo menos 90% idênticos ou homólogos entre proteínas da família RASGRP.
[0080] Em uma modalidade preferida, os peptídeos usados para o tratamento de acordo com a invenção são fragmentos de GDP-L-fucose sintase ou de uma proteína da família de proteínas RASGRP e compreendem uma sequência selecionada do grupo que consiste nos IDS. DE SEQ. Nos: 10 a 98. Em modalidades especialmente preferidas os peptídeos consistem em sequências de aminoácidos como retratadas em um dos IDS. DE SEQ. Nos: 10 a 98. As sequências dos IDS. DE SEQ. Nos: 10 a 35 são preferidas.
[0081] As sequências de acordo com IDS. DE SEQ. Nos: 10 a 35 foram identificadas como peptídeos imunodominantes em função de serem reconhecidas por células T relevantes para doença, e subsequente validação do reconhecimento por células T em grande volume que infiltram o LCR para GDP-L- fucose sintase e PBMC para RASGRP2, (veja “Exemplos”). As sequências de aminoácidos de acordo com IDS. DE SEQ. Nos: 36 e 37 representam um trecho de sequências idênticas entre RASGRP2 e RASGRP3 (alinhamento de UniProtKB/Swiss-Prot Q7LDG7-1 e UniProtKB/Swiss-Prot Q8IV61). Os aminoácidos de acordo com IDS. DE SEQ. Nos 38 a 98 estão compreendidos em pools de peptídeos que deram origem às reações de células T de memória de pacientes com MS (veja 9 dos Exemplos e Figura 10). Sequências com IDS. DE SEQ. Nos: 12, 21, 23, 28 e 32
(GDP-L-fucose sintase) e com o ID. DE SEQ. Nº: 46 (RASGRP2) foram validadas em uma análise adicional com células T CD4+ que infiltram o LCR (veja 13 dos “Exemplos” e Figs. 14 e 15).
[0082] As sequências dos IDS. DE SEQ. Nos: 1-98 também estão listadas na Tabela 1 seguinte: Tabela 1: Sequências de proteínas, posição e entrada no banco de dados. A sequência Q7LDG7-1 é a sequência canônica da proteína RASGRP2 e também se refere à Isoforma 1 de RASGRP2. Proteínas e peptídeos retratados de acordo com esse relatório descritivo são modalidades particularmente preferidas da invenção. ID. DE Sequência Posição Banco de dados SEQ. (aminoácidos) Nº: 1 MGEPQGSMRILVTGGSGLVGK 1-321 GenBank AIQKVVADGAGLPGEDWVFVS (proteína AAH93061.1 SKDADLTDTAQTRALFEKVQP inteira) ou THVIHLAAMVGGLFRNIKYNL UniProtKB/ DFWRKNVHMNDNVLHSAFEVG Swiss-Prot: ARKVVSCLSTCIFPDKTTYPI Q13630 (GDP L- DETMIHNGPPHNSNFGYSYAK fucose RMIDVQNRAYFQQYGCTFTAV sintase)
IPTNVFGPHDNFNIEDGHVLP GLIHKVHLAKSSGSALTVWGT GNPRRQFIYSLDLAQLFIWVL REYNEVEPIILSVGEEDEVSI KEAAEAVVEAMDFHGEVTFDT TKSDGQFKKTASNSKLRTYLP DFRFTPFKQAVKETCAWFTDN
YEQARK 2 AAAAARPAGGSARRWGRPGRC 1-662 GenBank GLLAAGPKRVRSEPGGRLPER (proteína AAI10307.1 SLGPAHPAPAAMAGTLDLDKG inteira) (RASGRP2)
CTVEELLRGCIEAFDDSGKVR DPQLVRMFLMMHPWYIPSSQL AAKLLHIYQQSRKDNSNSLQV KTCHLVRYWISAFPAEFDLNP ELAEQIKELKALLDQEGNRRH SSLIDIDSVPTYKWKRQVTQR NPVGQKKRKMSLLFDHLEPME LAEHLTYLEYRSFCKILFQDY HSFVTHGCTVDNPVLERFISL FNSVSQWVQLMILSKPTAPQR ALVITHFVHVAEKLLQLQNFN TLMAVVGGLSHSSISRLKETH SHVSPETIKLWEGLTELVTAT GNYGNYRRRLAACVGFRFPIL GVHLKDLVALQLALPDWLDPA RTRLNGAKMKQLFSILEELAM VTSLRPPVQANPDLLSLLTVS LDQYQTEDELYQLSLQREPRS KSSPTSPTSCTPPPRPPVLEE WTSAAKPKLDQALVVEHIEKM VESVFRNFDVDGDGHISQEEF QIIRGNFPYLSAFGDLDQNQD GCISREEMVSYFLRSSSVLGG RMGFVHNFQESNSLRPVACRH CKALILGIYKQGLKCRACGVN CHKQCKDRLSVECRRRAQSVS LEGSAPSPSPMHSHHHRAFSF SLPRPGRRGSRPPEIREEEVQ
TVEDGVFDIHL 3 MGTLGKAREAPRKPSHGCRAA 1-797 GenBank SKARLEAKPANSPFPSHPSLA (proteína AAC97349.1 HITQFRMMVSLGHLAKGASLD inteira) ou DLIDSCIQSFDADGNLCRSNQ UniProtKB/ LLQVMLTMHRIVISSAELLQK Swiss-Prot: VITLYKDALAKNSPGLCLKIC O95267 YFVRYWITEFWVMFKMDASLT (RASGRP1)
DTMEEFQELVKAKGEELHCRL IDTTQINARDWSRKLTQRIKS NTSKKRKVSLLFDHLEPEELS EHLTYLEFKSFRRISFSDYQN YLVNSCVKENPTMERSIALCN GISQWVQLMVLSRPTPQLRAE VFIKFIQVAQKLHQLQNFNTL MAVIGGLCHSSISRLKETSSH VPHEINKVLGEMTELLSSSRN YDNYRRAYGECTDFKIPILGV HLKDLISLYEAMPDYLEDGKV NVHKLLALYNHISELVQLQEV APPLEANKDLVHLLTLSLDLY YTEDEIYELSYAREPRNHRAP PLTPSKPPVVVDWASGVSPKP DPKTISKHVQRMVDSVFKNYD HDQDGYISQEEFEKIAASFPF SFCVMDKDREGLISRDEITAY FMRASSIYSKLGLGFPHNFQE TTYLKPTFCDNCAGFLWGVIK QGYRCKDCGMNCHKQCKDLVV FECKKRAKNPVAPTENNTSVG PVSNLCSLGAKDLLHAPEEGP FTFPNGEAVEHGEESKDRTIM LMGVSSQKISLRLKRAVAHKA TQTESQPWIGSEGPSGPFVLS SPRKTAQDTLYVLPSPTSPCP SPVLVRKRAFVKWENKDSLIK SKEELRHLRLPTYQELEQEIN TLKADNDALKIQLKYAQKKIE
SLQLEKSNHVLAQMEQGDCS 4 MGSSGLGKAATLDELLCTCIE 1-690 GenBank MFDDNGELDNSYLPRIVLLMH (proteína AAY15037.1 RWYLSSTELAEKLLCMYRNAT inteira) ou GESCNEFRLKICYFMRYWILK UniProtKB/ FPAEFNLDLGLIRMTEEFREV Swiss-Prot ASQLGYEKHVSLIDISSIPSY Q8IV61 DWMRRVTQRKKVSKKGKACLL (RASGRP3)
FDHLEPIELAEHLTFLEHKSF RRISFTDYQSYVIHGCLENNP TLERSIALFNGISKWVQLMVL SKPTPQQRAEVITKFINVAKK LLQLKNFNTLMAVVGGLSHSS ISRLKETHSHLSSEVTKNWNE MTELVSSNGNYCNYRKAFADC DGFKIPILGVHLKDLIAVHVI FPDWTEENKVNIVKMHQLSVT LSELVSLQNASHHLEPNMDLI NLLTLSLDLYHTEDDIYKLSL VLEPRNSKSQPTSPTTPNKPV VPLEWALGVMPKPDPTVINKH IRKLVESVFRNYDHDHDGYIS QEDFESIAANFPFLDSFCVLD KDQDGLISKDEMMAYFLRAKS QLHCKMGPGFIHNFQEMTYLK PTFCEHCAGFLWGIIKQGYKC KDCGANCHKQCKDLLVLACRR FARAPSLSSGHGSLPGSPSLP PAQDEVFEFPGVTAGHRDLDS RAITLVTGSSRKISVRLQRAT TSQATQTEPVWSEAGWGDSGS HTFPKMKSKFHDKAAKDKGFA KWENEKPRVHAGVDVVDRGTE
FELDQDEGEETRQDGEDG 5 MNRKDSKRKSHQECTGKIGGR 1-673 UniProtKB/ GRPRQVRRHKTCPSPREISKV (proteína Swiss-Prot MASMNLGLLSEGGCSEDELLE inteira) Q8TDF6 KCIQSFDSAGSLCHEDHMLNM ou VLAMHSWVLPSADLAARLLTS GenPept YQKATGDTQELRRLQICHLVR NP_733749.1 YWLMRHPEVMHQDPQLEEVIG (RASGRP4)
RFWATVAREGNSAQRRLGDSS DLLSPGGPGPPLPMSSPGLGK KRKVSLLFDHLETGELAQHLT YLEFRSFQAITPQDLRSYVLQ GSVRGCPALEGSVGLSNSVSR WVQVMVLSRPGPLQRAQVLDK FIHVAQRLHQLQNFNTLMAVT GGLCHSAISRLKDSHAHLSPD STKALLELTELLASHNNYARY RRTWAGCAGFRLPVLGVHLKD LVSLHEAQPDRLPDGRLHLPK LNNLYLRLQELVALQGQHPPC SANEDLLHLLTLSLDLFYTED EIYELSYAREPRCPKSLPPSP FNAPLVVEWAPGVTPKPDRVT LGRHVEQLVESVFKNYDPEGR GTISQEDFERLSGNFPFACHG LHPPPRQGRGSFSREELTGYL LRASAICSKLGLAFLHTFHEV TFRKPTFCDSCSGFLWGVTKQ GYRCRECGLCCHKHCRDQVKV ECKKRPGAKGDAGPPGAPVPS TPAPHASCGSEENHSYTLSLE PETGCQLRHAWTQTESPHPSW ETDTVPCPVMDPPSTASSKLD
S 6 MAGTLDLDKGCTVEELLRGCI 1-609 UniProtKB/ EAFDDSGKVRDPQLVRMFLMM (proteína Swiss-Prot HPWYIPSSQLAAKLLHIYQQS inteira) Q7LDG7-1 RKDNSNSLQVKTCHLVRYWIS ou AFPAEFDLNPELAEQIKELKA GenPept LLDQEGNRRHSSLIDIDSVPT NP_722541.1 YKWKRQVTQRNPVGQKKRKMS (Isoforma 1 de LLFDHLEPMELAEHLTYLEYR RASGRRP2)
SFCKILFQDYHSFVTHGCTVD NPVLERFISLFNSVSQWVQLM ILSKPTAPQRALVITHFVHVA EKLLQLQNFNTLMAVVGGLSH SSISRLKETHSHVSPETIKLW EGLTELVTATGNYGNYRRRLA ACVGFRFPILGVHLKDLVALQ LALPDWLDPARTRLNGAKMKQ LFSILEELAMVTSLRPPVQAN PDLLSLLTVSLDQYQTEDELY QLSLQREPRSKSSPTSPTSCT PPPRPPVLEEWTSAAKPKLDQ ALVVEHIEKMVESVFRNFDVD GDGHISQEEFQIIRGNFPYLS AFGDLDQNQDGCISREEMVSY FLRSSSVLGGRMGFVHNFQES NSLRPVACRHCKALILGIYKQ GLKCRACGVNCHKQCKDRLSV ECRRRAQSVSLEGSAPSPSPM HSHHHRAFSFSLPRPGRRGSR
PPEIREEEVQTVEDGVFDIHL 7 MGTQRLCGRGTQGWPGSSEQH 1-671 UniProtKB/ VQEATSSAGLHSGVDELGVRS (proteína Swiss-Prot EPGGRLPERSLGPAHPAPAAM inteira) Q7LDG7-2 AGTLDLDKGCTVEELLRGCIE ou AFDDSGKVRDPQLVRMFLMMH GenPept PWYIPSSQLAAKLLHIYQQSR AAF07219.1 KDNSNSLQVKTCHLVRYWISA (Isoforma 2 de FPAEFDLNPELAEQIKELKAL RASGRRP2)
LDQEGNRRHSSLIDIDSVPTY KWKRQVTQRNPVGQKKRKMSL LFDHLEPMELAEHLTYLEYRS FCKILFQDYHSFVTHGCTVDN PVLERFISLFNSVSQWVQLMI LSKPTAPQRALVITHFVHVAE KLLQLQNFNTLMAVVGGLSHS SISRLKETHSHVSPETIKLWE GLTELVTATGNYGNYRRRLAA CVGFRFPILGVHLKDLVALQL ALPDWLDPARTRLNGAKMKQL FSILEELAMVTSLRPPVQANP DLLSLLTVSLDQYQTEDELYQ LSLQREPRSKSSPTSPTSCTP PPRPPVLEEWTSAAKPKLDQA LVVEHIEKMVESVFRNFDVDG DGHISQEEFQIIRGNFPYLSA FGDLDQNQDGCISREEMVSYF LRSSSVLGGRMGFVHNFQESN SLRPVACRHCKALILGIYKQG LKCRACGVNCHKQCKDRLSVE CRRRAQSVSLEGSAPSPSPMH SHHHRAFSFSLPRPGRRGSRP
PEIREEEVQTVEDGVFDIHL 8 MAGTLDLDKGCTVEELLRGCI 1-144 UniProtKB/ EAFDDSGKVRDPQLVRMFLMM (proteína Swiss-Prot HPWYIPSSQLAAKLLHIYQQS inteira) Q7LDG7-3 RKDNSNSLQVKTCHLVRYWIS (Isoforma 3 de AFPAEFDLNPELAEQIKELKA RASGRRP2)
LLDQEGNRRHSSLIDIDSVCV
GAEHRGLGGHSVSYTICA 9 MAGTLDLDKGCTVEELLRGCI 1-610 UniProtKB/ EAFDDSGKVRDPQLVRMFLMM (proteína Swiss-Prot HPWYIPSSQLAAKLLHIYQQS inteira) Q7LDG7-4 RKDNSNSLQVKTCHLVRYWIS ou
AFPAEFDLNPELAEQIKELKA GenPept LLDQEGNRRHSSLIDIDSVPT XP_011543022.1 YKWKRQVTQRNPVGQKKRKMS (Isoforma 4 de LLFDHLEPMELAEHLTYLEYR RASGRRP2)
SFCKILFQDYHSFVTHGCTVD NPVLERFISLFNSVSQWVQLM ILSKPTAPQRALVITHFVHVA EKLLQLQNFNTLMAVVGGLSH SSISRLKETHSHVSPETIKLW EGLTELVTATGNYGNYRRRLA ACVGFRFPILGVHLKDLVALQ LALPDWLDPARTRLNGAKMKQ LFSILEELAMVTSLRPPVQAN PDLLSLLTVSLDQYQTEDELY QLSLQREPRSKSSPTSPTSCT PPPRPPVLEEWTSAAKPKLDQ ALVVEHIEKMVESVFRNFDVD GDGHISQEEFQIIRGNFPYLS AFGDLDQNQDGCISREEMVSY FLRSSSVLGGRMGFVHNFQES NSLRPVACRHCKALILGIYKQ GLKCRACGVNCHKQCKDRLSV ECRRRAQSVSLEGSAPSPSPM HSHHHRAFSFSLPRPGRRGSR PPAEIREEEVQTVEDGVFDIH
L 10 MGEPQGSMRILVTGG 1-15 GenBank AAH93061.1 (GDP L-fucose sintase)
11 VVADGAGLPGEDWVF 26-40 GenBank AAH93061.1 (GDP L-fucose sintase) 12 TAQTRALFEKVQPTH 51-65 GenBank AAH93061.1 (GDP L-fucose sintase) 13 LFRNIKYNLDFWRKN 76-90 GenBank AAH93061.1 (GDP L-fucose sintase) 14 VHMNDNVLHSAFEVG 91-105 GenBank AAH93061.1 (GDP L-fucose sintase) 15 DNVLHSAFEV 95-104 GenBank AAH93061.1 (GDP L-fucose sintase) 16 NVLHSAFEVG 96-105 GenBank AAH93061.1 (GDP L-fucose sintase) 17 NVLHSAFEVGARKVV 96-110 GenBank AAH93061.1 (GDP L-fucose sintase) 18 VLHSAFEVGA 97-106 GenBank AAH93061.1
(GDP L-fucose sintase) 19 KTTYPIDETMIHNGP 121-135 GenBank AAH93061.1 (GDP L-fucose sintase) 20 IHNGPPHNSNFGYSY 131-145 GenBank AAH93061.1 (GDP L-fucose sintase) 21 PHNSNFGYSYAKRMI 136-150 GenBank AAH93061.1 (GDP L-fucose sintase) 22 AYFQQYGCTFTAVIP 156-170 GenBank AAH93061.1 (GDP L-fucose sintase) 23 YGCTFTAVIPTNVFG 161-175 GenBank AAH93061.1 (GDP L-fucose sintase) 24 LFIWVLREYNEVEPI 226-240 GenBank AAH93061.1 (GDP L-fucose sintase) 25 LREYNEVEPIILSVG 231-245 GenBank AAH93061.1 (GDP L-fucose sintase)
26 EVEPIILSVGEEDEV 236-250 GenBank AAH93061.1 (GDP L-fucose sintase) 27 ILSVGEEDEVSIKEA 241-255 GenBank AAH93061.1 (GDP L-fucose sintase) 28 EEDEVSIKEAAEAVV 246-260 GenBank AAH93061.1 (GDP L-fucose sintase) 29 SIKEAAEAVVEAMDF 251-265 GenBank AAH93061.1 (GDP L-fucose sintase) 30 AEAVVEAMDFHGEVT 256-270 GenBank AAH93061.1 (GDP L-fucose sintase) 31 FDTTKSDGQFKKTAS 271-285 GenBank AAH93061.1 (GDP L-fucose sintase) 32 FRFTPFKQAVKETCA 296-310 GenBank AAH93061.1 (GDP L-fucose sintase) 33 LVRYWISAFP 131-140 GenBank AAI10307.1 ou (RASGRP2) ou 78-87 UniProtKB/ Swiss-Prot Q7LDG7-1 (Isoforma 1 de RASGRP2) 34 FVRYWITEFW 128-137 GenBank AAC97349.1 (RASGRP1) 35 FMRYWILKFP 77-86 GenBank BAA74869.3 (RASGRP3) 36 LLFDHLEPMELAEHLTYLEYR 148-170 UniProtKB/ SF Swiss-Prot Q7LDG7-1 (Isoforma 1 de RASGRP2) 37 NFNTLMAVVGGLSHSSISRLK 239-266 UniProtKB/ ETHSHVS Swiss-Prot Q7LDG7-1 (Isoforma 1 de RASGRP2) 38 PAAMAGTLDLDKGCT 1-12 e os UniProtKB/ aminoácidos Swiss-Prot adicionais Q7LDG7-1 PAA na ou extremidade GenPept do NP_722541.1 terminal-N (Isoforma 1 de
RASGRRP2) 39 DKGCTVEELLRGCIE 8-22 UniProtKB/ Swiss-Prot Q7LDG7-1 ou GenPept NP_722541.1 (Isoforma 1 de RASGRRP2) 40 RGCIEAFDDSGKVRD 18-32 UniProtKB/ Swiss-Prot Q7LDG7-1 ou GenPept NP_722541.1 (Isoforma 1 de RASGRRP2) 41 GKVRDPQLVRMFLMM 28-42 UniProtKB/ Swiss-Prot Q7LDG7-1 ou GenPept NP_722541.1 (Isoforma 1 de RASGRRP2) 42 MFLMMHPWYIPSSQL 38-52 UniProtKB/ Swiss-Prot Q7LDG7-1 ou GenPept
NP_722541.1 (Isoforma 1 de RASGRRP2) 43 PSSQLAAKLLHIYQQ 48-62 UniProtKB/ Swiss-Prot Q7LDG7-1 ou GenPept NP_722541.1 (Isoforma 1 de RASGRRP2) 44 HIYQQSRKDNSNSLQ 58-72 UniProtKB/ Swiss-Prot Q7LDG7-1 ou GenPept NP_722541.1 (Isoforma 1 de RASGRRP2) 45 SNSLQVKTCHLVRYW 68-82 UniProtKB/ Swiss-Prot Q7LDG7-1 ou GenPept NP_722541.1 (Isoforma 1 de RASGRRP2) 46 LVRYWISAFPAEFDL 78-92 UniProtKB/ Swiss-Prot Q7LDG7-1 ou GenPept NP_722541.1 (Isoforma 1 de RASGRRP2) 47 AEFDLNPELAEQIKE 88-102 UniProtKB/ Swiss-Prot Q7LDG7-1 ou GenPept NP_722541.1 (Isoforma 1 de RASGRRP2) 48 EQIKELKALLDQEGN 98-112 UniProtKB/ Swiss-Prot Q7LDG7-1 ou GenPept NP_722541.1 (Isoforma 1 de RASGRRP2) 49 DQEGNRRHSSLIDID 108-122 UniProtKB/ Swiss-Prot Q7LDG7-1 ou GenPept NP_722541.1 (Isoforma 1 de RASGRRP2) 50 LIDIDSVPTYKWKRQ 118-132 UniProtKB/
Swiss-Prot Q7LDG7-1 ou GenPept NP_722541.1 (Isoforma 1 de RASGRRP2) 51 KWKRQVTQRNPVGQK 128-142 UniProtKB/ Swiss-Prot Q7LDG7-1 ou GenPept NP_722541.1 (Isoforma 1 de RASGRRP2) 52 PVGQKKRKMSLLFDH 138-152 UniProtKB/ Swiss-Prot Q7LDG7-1 ou GenPept NP_722541.1 (Isoforma 1 de RASGRRP2) 53 LLFDHLEPMELAEHL 148-162 UniProtKB/ Swiss-Prot Q7LDG7-1 ou GenPept NP_722541.1 (Isoforma 1 de
RASGRRP2) 54 LAEHLTYLEYRSFCK 158-172 UniProtKB/ Swiss-Prot Q7LDG7-1 ou GenPept NP_722541.1 (Isoforma 1 de RASGRRP2) 55 RSFCKILFQDYHSFV 168-182 UniProtKB/ Swiss-Prot Q7LDG7-1 ou GenPept NP_722541.1 (Isoforma 1 de RASGRRP2) 56 YHSFVTHGCTVDNPV 178-192 UniProtKB/ Swiss-Prot Q7LDG7-1 ou GenPept NP_722541.1 (Isoforma 1 de RASGRRP2) 57 VDNPVLERFISLFNS 188-202 UniProtKB/ Swiss-Prot Q7LDG7-1 ou GenPept
NP_722541.1 (Isoforma 1 de RASGRRP2) 58 SLFNSVSQWVQLMIL 198-212 UniProtKB/ Swiss-Prot Q7LDG7-1 ou GenPept NP_722541.1 (Isoforma 1 de RASGRRP2) 59 QLMILSKPTAPQRAL 208-222 UniProtKB/ Swiss-Prot Q7LDG7-1 ou GenPept NP_722541.1 (Isoforma 1 de RASGRRP2) 60 PQRALVITHFVHVAE 218-232 UniProtKB/ Swiss-Prot Q7LDG7-1 ou GenPept NP_722541.1 (Isoforma 1 de RASGRRP2) 61 VHVAEKLLQLQNFNT 228-242 UniProtKB/ Swiss-Prot Q7LDG7-1 ou GenPept NP_722541.1 (Isoforma 1 de RASGRRP2) 62 QNFNTLMAVVGGLSH 238-252 UniProtKB/ Swiss-Prot Q7LDG7-1 ou GenPept NP_722541.1 (Isoforma 1 de RASGRRP2) 63 GGLSHSSISRLKETH 248-262 UniProtKB/ Swiss-Prot Q7LDG7-1 ou GenPept NP_722541.1 (Isoforma 1 de RASGRRP2) 64 LKETHSHVSPETIKL 258-272 UniProtKB/ Swiss-Prot Q7LDG7-1 ou GenPept NP_722541.1 (Isoforma 1 de RASGRRP2) 65 ETIKLWEGLTELVTA 268-282 UniProtKB/
Swiss-Prot Q7LDG7-1 ou GenPept NP_722541.1 (Isoforma 1 de RASGRRP2) 66 ELVTATGNYGNYRRR 278-292 UniProtKB/ Swiss-Prot Q7LDG7-1 ou GenPept NP_722541.1 (Isoforma 1 de RASGRRP2) 67 NYRRRLAACVGFRFP 288-302 UniProtKB/ Swiss-Prot Q7LDG7-1 ou GenPept NP_722541.1 (Isoforma 1 de RASGRRP2) 68 GFRFPILGVHLKDLV 298-312 UniProtKB/ Swiss-Prot Q7LDG7-1 ou GenPept NP_722541.1 (Isoforma 1 de
RASGRRP2) 69 LKDLVALQLALPDWL 308-322 UniProtKB/ Swiss-Prot Q7LDG7-1 ou GenPept NP_722541.1 (Isoforma 1 de RASGRRP2) 70 LPDWLDPARTRLNGA 318-332 UniProtKB/ Swiss-Prot Q7LDG7-1 ou GenPept NP_722541.1 (Isoforma 1 de RASGRRP2) 71 RLNGAKMKQLFSILE 328-342 UniProtKB/ Swiss-Prot Q7LDG7-1 ou GenPept NP_722541.1 (Isoforma 1 de RASGRRP2) 72 FSILEELAMVTSLRP 338-352 UniProtKB/ Swiss-Prot Q7LDG7-1 ou GenPept
NP_722541.1 (Isoforma 1 de RASGRRP2) 73 TSLRPPVQANPDLLS 348-362 UniProtKB/ Swiss-Prot Q7LDG7-1 ou GenPept NP_722541.1 (Isoforma 1 de RASGRRP2) 74 PDLLSLLTVSLDQYQ 358-372 UniProtKB/ Swiss-Prot Q7LDG7-1 ou GenPept NP_722541.1 (Isoforma 1 de RASGRRP2) 75 LDQYQTEDELYQLSL 368-382 UniProtKB/ Swiss-Prot Q7LDG7-1 ou GenPept NP_722541.1 (Isoforma 1 de RASGRRP2) 76 YQLSLQREPRSKSSP 378-392 UniProtKB/ Swiss-Prot Q7LDG7-1 ou GenPept NP_722541.1 (Isoforma 1 de RASGRRP2) 77 SKSSPTSPTSCTPPP 388-402 UniProtKB/ Swiss-Prot Q7LDG7-1 ou GenPept NP_722541.1 (Isoforma 1 de RASGRRP2) 78 CTPPPRPPVLEEWTS 398-412 UniProtKB/ Swiss-Prot Q7LDG7-1 ou GenPept NP_722541.1 (Isoforma 1 de RASGRRP2) 79 EEWTSAAKPKLDQAL 408-422 UniProtKB/ Swiss-Prot Q7LDG7-1 ou GenPept NP_722541.1 (Isoforma 1 de RASGRRP2) 80 LDQALVVEHIEKMVE 418-432 UniProtKB/
Swiss-Prot Q7LDG7-1 ou GenPept NP_722541.1 (Isoforma 1 de RASGRRP2) 81 EKMVESVFRNFDVDG 428-442 UniProtKB/ Swiss-Prot Q7LDG7-1 ou GenPept NP_722541.1 (Isoforma 1 de RASGRRP2) 82 FDVDGDGHISQEEFQ 438-452 UniProtKB/ Swiss-Prot Q7LDG7-1 ou GenPept NP_722541.1 (Isoforma 1 de RASGRRP2) 83 QEEFQIIRGNFPYLS 448-462 UniProtKB/ Swiss-Prot Q7LDG7-1 ou GenPept NP_722541.1 (Isoforma 1 de
RASGRRP2) 84 FPYLSAFGDLDQNQD 458-472 UniProtKB/ Swiss-Prot Q7LDG7-1 ou GenPept NP_722541.1 (Isoforma 1 de RASGRRP2) 85 DQNQDGCISREEMVS 468-482 UniProtKB/ Swiss-Prot Q7LDG7-1 ou GenPept NP_722541.1 (Isoforma 1 de RASGRRP2) 86 EEMVSYFLRSSSVLG 478-492 UniProtKB/ Swiss-Prot Q7LDG7-1 ou GenPept NP_722541.1 (Isoforma 1 de RASGRRP2) 87 SSVLGGRMGFVHNFQ 488-502 UniProtKB/ Swiss-Prot Q7LDG7-1 ou GenPept
NP_722541.1 (Isoforma 1 de RASGRRP2) 88 VHNFQESNSLRPVAC 498-512 UniProtKB/ Swiss-Prot Q7LDG7-1 ou GenPept NP_722541.1 (Isoforma 1 de RASGRRP2) 89 RPVACRHCKALILGI 508-522 UniProtKB/ Swiss-Prot Q7LDG7-1 ou GenPept NP_722541.1 (Isoforma 1 de RASGRRP2) 90 LILGIYKQGLKCRAC 518-532 UniProtKB/ Swiss-Prot Q7LDG7-1 ou GenPept NP_722541.1 (Isoforma 1 de RASGRRP2) 91 KCRACGVNCHKQCKD 528-542 UniProtKB/ Swiss-Prot Q7LDG7-1 ou GenPept NP_722541.1 (Isoforma 1 de RASGRRP2) 92 KQCKDRLSVECRRRA 538-552 UniProtKB/ Swiss-Prot Q7LDG7-1 ou GenPept NP_722541.1 (Isoforma 1 de RASGRRP2) 93 CRRRAQSVSLEGSAP 548-562 UniProtKB/ Swiss-Prot Q7LDG7-1 ou GenPept NP_722541.1 (Isoforma 1 de RASGRRP2) 94 EGSAPSPSPMHSHHH 558-572 UniProtKB/ Swiss-Prot Q7LDG7-1 ou GenPept NP_722541.1 (Isoforma 1 de RASGRRP2) 95 HSHHHRAFSFSLPRP 568-582 UniProtKB/
Swiss-Prot Q7LDG7-1 ou GenPept NP_722541.1 (Isoforma 1 de RASGRRP2) 96 SLPRPGRRGSRPPEI 578-592 UniProtKB/ Swiss-Prot Q7LDG7-1 ou GenPept NP_722541.1 (Isoforma 1 de RASGRRP2) 97 RPPEIREEEVQTVED 588-602 UniProtKB/ Swiss-Prot Q7LDG7-1 ou GenPept NP_722541.1 (Isoforma 1 de RASGRRP2) 98 EEVQTVEDGVFDIHL 595-609 UniProtKB/ Swiss-Prot Q7LDG7-1 ou GenPept NP_722541.1 (Isoforma 1 de
RASGRRP2)
[0083] As seguintes sequências gênicas (Tabela 2) representam as sequências gênicas das proteínas GDP-L fucose sintase (gene: TSTA3), RASGRP1, RASGRP2, RASGRP3 e RASGRP4 (Tabela 2). As proteínas ou derivados ou variantes de splicing destas são preferivelmente codificadas pelo respectivo gene. Tabela 2: Sequências gênicas e entrada no banco de dados. Nome do Banco de dados entrada gene TSTA3 Sequência de Referência em NCBI: NC_000008.11 REGIÃO: 143612618..143618048 RASGRP1 Sequência de Referência em NCBI: NC_000015.10 REGIÃO: 38488101..38565575 RASGRP2 Sequência de Referência em NCBI: NC_000011.10 REGIÃO: 64726911..64745456 RASGRP3 Sequência de Referência em NCBI: NC_000002.12 REGIÃO: 33436324..33564750 RASGRP4 Sequência de Referência em NCBI: NC_000019.10 REGIÃO: 38409051..38426305
[0084] As seguintes sequências de nucleotídeos (Tabela 3) representam sequências de nucleotídeos preferidas que codificam qualquer uma das proteínas ou fragmento, derivado ou variante de splicing destas da presente invenção. A tabela também compreende sequências codificadoras (CDS), ou seja,
proteínas ou peptídeos, que também podem ser usados no tratamento, diagnóstico e/ou prevenção de esclerose múltipla (MS). Tabela 3: Sequências de nucleotídeos e sequências de proteínas e as respectivas entradas em banco de dados (Números de Acesso em Genbank). Nome do Banco de dados entrada gene TSTA3 RNA: XM_011517269.1 NM_003313.3 NM_001317783.1 XM_005251051.3 proteína: XP_011515571.1 NP_003304.1 NP_001304712.1 XP_005251108.2 RASGRP1 RNA: NM_001306086.1 NM_001128602.1 NM_005739.3 XM_017021860 XM_005254114.3 XM_011521151.3 XR_001751485.2 XR_001751486.2 proteína: NP_001293015.1 NP_001122074.1
NP_005730.2 XP_016877349.1 XP_005254171.1 XP_011519453.1 RASGRP2 RNA: XM_011544722.2 NM_153819 XM_011544723.3 XM_011544721.1 NM_001098670.1 XM_017017084.2 XM_011544720.2 XM_011544718.2 XM_017017082.2 XM_005273707.4 XM_017017083.2 NM_001318398.1 NM_001098671.1 XM_011544725.2 XM_017017085.2 XM_017017086.1 XR_001747720.2 XR_001747719.2 proteína: XP_011543024.1 NP_722541.1 XP_011543025.1 XP_011543023.1 NP_001092140.1 XP_016872573.1
XP_011543022.1 XP_011543020.1 XP_016872571.1 XP_005273764.3 XP_016872572.1 NP_001305327.1 NP_001092141.1 XP_011543027.1 XP_016872574.1 XP_016872575.1 RASGRP3 RNA: NM_001349975.1 NM_170672.2 NM_001349978.1 XM_017003759.2 XM_011532746.3 XM_011532748.3 NM_001349979.1 NM_001349977.1 NM_001349980.1 NM_001139488.1 NM_001349981.1 NM_001349976.1 XM_017003761.2 NM_015376.2 XR_001738693.2 XR_001738692.2 XR_001738691.2 NR_146505.1 proteína:
NP_001336904.1 NP_733772.1 NP_001336907.1 XP_016859248.1 XP_011531048.1 XP_011531050.2 NP_001336908.1 NP_001336906.1 NP_001336909.1 NP_001132960 NP_001336910.1 NP_001336905.1 XP_016859250.1 NP_056191.1 RASGRP4 RNA: NM_001146202.1 NM_001146206.1 NM_001146207.1 NM_001146205.1 NM_001146203.1 NM_001146204.1 NM_170604.2 XR_935732.2 proteína: NP_001139674.1 NP_001139678.1 NP_001139679.1 NP_001139677.1 NP_001139675.1 NP_001139676.1
NP_733749.1
[0085] Todas as sequências foram retiradas dos respectivos bancos de dados online em 22 de junho de 2018.
[0086] Em uma modalidade, a proteína, fragmento, derivado ou variante de splicing de acordo com a presente invenção pode ser usado para identificação de um indivíduo humano que é adequado para tolerização aos autoantígenos na MS, preferivelmente MS inicial. Identificação de um indivíduo humano que seja adequado para tolerização aos autoantígenos na MS, preferivelmente MS inicial, preferivelmente compreende a medição da reatividade positiva das células T e/ou anticorpos aos autoantígenos no indivíduo humano. Desse modo, o indivíduo humano também pode ser diagnosticado in vitro com MS. Em outras palavras, os autoantígenos identificados também podem ser usados no diagnóstico in vitro de MS.
[0087] O diagnóstico in vitro de MS preferivelmente compreende as seguintes etapas: o isolamento de células T, preferivelmente células T CD4+, e/ou anticorpos do sangue, LCR ou outro fluido corporal do indivíduo, e medição da reatividade das células T e/ou anticorpos contra uma proteína ou fragmento, derivado ou variante de splicing desta de acordo com a presente invenção. Aqueles habilitados na técnica têm conhecimento de métodos para o isolamento de células T e/ou anticorpos do sangue, LCR ou outro fluido corporal do indivíduo e medição da reatividade das células T e/ou anticorpos contra a proteína, fragmento, derivado ou variante de splicing. A reatividade das células T, preferivelmente células T CD4+, e/ou de anticorpos para a proteína testada, ou fragmento, derivado ou variante de splicing desta, pode indicar que o indivíduo sofre de MS. O diagnóstico também pode ser combinado com achados clínicos e de imageamento, ou seja, o diagnóstico de MS de acordo com o estado da técnica, em particular de acordo com os critérios de McDonald revisados.
[0088] Em outra modalidade, uma proteína, fragmento, derivado ou variante de splicing de acordo com a presente invenção pode ser usada para a distinção entre subgrupos de MS. Em particular, a proteína, fragmento, derivado ou variante de splicing de acordo com a presente invenção pode ser usada para o diagnóstico de MS padrão II em um indivíduo humano.
[0089] As seguintes características indicam que certo peptídeo de uma proteína é imunodominante no contexto de MS: a) reconhecimento frequente desse peptídeo por células T, ou seja, por aproximadamente 10% ou mais de pacientes com MS, frequentemente no contexto de um alelo ou haplótipo HLA associado à doença (Sospedra e Martin, 2005), e b) reconhecimento desse peptídeo por células T relevantes para doença, tais como aquelas que respondem aos peptídeos em concentrações baixas (células T de alta avidez) (Bielekova e cols., 2004) e são, portanto, consideradas particularmente perigosas, e/ou possuem um fenótipo pró- inflamatório, e/ou são isoladas do órgão ou compartimento- alvo (SNC), no caso de MS, células T infiltrantes no cérebro, medula espinhal ou LCR.
[0090] No entanto, o reconhecimento com alta avidez não é um pré-requisito, na medida em que células T mielina- específicas de baixa avidez também demonstraram que são patogênicas em modelos em camundongo transgênico humanizado
(Quandt e cols. 2012).
[0091] Dessa forma, pode ser testado se uma proteína ou fragmento, derivado ou variante de splicing desta é imunodominante no contexto de MS. Um teste desse tipo é preferivelmente um teste in vitro. É particularmente adequado um teste in vitro que permita a medição da reatividade de células T e/ou anticorpos obtidos do sangue, LCR ou outro fluido corporal de um indivíduo humano que foi diagnosticado com MS, preferivelmente células T CD4+ que infiltram o LCR, para a proteína testada ou fragmento, derivado ou variante de splicing. Aqueles habilitados na técnica têm conhecimento de métodos de testagem da reatividade de células T, preferivelmente células T CD4+, e/ou anticorpos. Por exemplo, a proliferação de células T CD4+ e/ou sua secreção de IFN-γ ou reatividade em um ensaio ELISPOT/FLUOROSPOT ou reatividade contra tetrâmeros HLA- peptídeo pode ser testada. Se a proteína testada ou fragmento, derivado ou variante de splicing desta, induz reatividade em um indivíduo humano que foi diagnosticado com MS, em caso de reatividade de célula T, em particular com um índice de estimulação (SI) acima de 2 e/ou uma secreção de IFN-γ acima de 20 pg/ml, a proteína testada ou fragmento, derivado ou variante de splicing, pode ser denominada imunodominante. Também é possível selecionar 10 pacientes que foram diagnosticados com MS para um teste desse tipo. Se reatividade é induzida em pelo menos 2 pacientes, a proteína testada ou fragmento, derivado ou variante de splicing, pode ser denominada imunodominante. De preferência, os 10 pacientes foram diagnosticados com RRMS de acordo com os critérios de McDonald revisados estabelecidos.
[0092] Foi demonstrado recentemente que células T de pacientes com MS exibem proliferação in vitro aumentada na ausência de um antígeno exógeno (Mohme e cols., 2013; Jelcic e cols., 2018). Essas células T “autoproliferantes” são enriquecidas para células que se dirigem para o compartimento do SNC de pacientes com MS e podem, dessa forma, ser consideradas como uma fonte do sangue periférico de células T que infiltram o cérebro/LCR.
[0093] Quando dados de testagem de células T in vitro não estão disponíveis ou, além dessas testagens, o reconhecimento imune de peptídeos também pode ser previsto/inferido a partir daqueles peptídeos que irão se ligar bem aos alelos HLA-classe I ou -classe II do indivíduo e para células T CD8+ e CD4+, respectivamente. As predições de ligação a peptídeos são bem conhecidas por aqueles habilitados na técnica. Elas podem ser realizadas por algoritmos de predição bem estabelecidos (NetMHCII - www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCII/; IEDB - www.iedb.org/) e análise dos motivos de ligação de HLA (SYFPEITHI - www.syfpeithi.de/), veja “Exemplos”, sob 11.
[0094] De acordo com a presente invenção, as proteínas GDP-L-fucose sintase e um membro da família de proteínas RASGRP, em particular RASGRP2, foram identificados como imunodominante na MS e, dessa forma, foram identificados como autoantígenos.
[0095] Não é necessário que a ligação ao alelo HLA seja particularmente forte. Na verdade, a imunodominância também pode ocorrer para peptídeos que se ligam fracamente ao alelo HLA (Muraro e cols., 1997, J. Clin. Invest.; 100 (2): 339- 349).
[0096] A indução de tolerância é antígeno-específica e torna as células T autorreativas não-funcionais ou anérgicas ou induz células Treg que suprimem especificamente autoimunidade indesejável para os referidos antígenos-alvo. A indução de tolerância aos autoantígenos-alvo é um objetivo terapêutico altamente importante em doenças autoimunes. Ela oferece a oportunidade para atenuar especificamente a resposta autoimune patogênica de uma forma eficaz com poucos efeitos colaterais. A indução de tolerância também pode ser obtida por aplicação de uma proteína inteira ao invés de ou em adição a um peptídeo imunodominante que é um fragmento da proteína (Kennedy MK e cols., 1990). Foi demonstrado nesse relatório descritivo que alterações imunológicas consistentes com tolerância podem ser induzidas em pacientes humanos mediante injeção i.v. de peptídeos imunodominantes acoplados às células sanguíneas vermelhas (14 dos Exemplos). Dessa forma, peptídeos imunodominantes podem ser usados para indução de tolerância.
[0097] Dessa forma, a imunodominância das proteínas e/ou fragmentos permite a utilização da proteína e/ou de um fragmento, derivado ou variante de splicing desta para imunoterapias antígeno-específicas como, por exemplo, indução de tolerância.
[0098] De acordo com a presente invenção, a tolerização antígeno-específica pode ser usada em todas as formas de MS: No momento da primeira manifestação, quando diagnósticos diferenciais foram excluídos, a doença é referida como CIS desde que os achados no LCR e MRI sejam consistentes com o diagnóstico. MRI revela lesões em localizações típicas para MS, ou seja, justacorticais, periventriculares, no tronco cerebral ou medula espinhal. Se certos critérios são preenchidos, que podem ser resumidos como disseminação em espaço (mais de uma lesão ou sintoma/sinal clínico) e tempo (mais de um evento), então o diagnóstico de RRMS pode ser feito. Um cenário especial é a descoberta acidental de lesões na MRI compatíveis com MS sem sintomas clínicos. Isso é denominado RIS e pode ser considerado um pré-estágio de CIS e RRMS. Mais de 80% dos pacientes sofrem de uma dessas, e a maioria dos pacientes desenvolve mais tarde o que é denominada SPMS. Nesse momento, recidivas/exacerbações se tornam menos frequentes ou param completamente e deficiência neurológica aumenta firmemente entre recidivas ou sem estas.
[0099] Uma forma especial de MS é PPMS, que nunca apresenta recidivas, mas sim começa com piora firme de sintomas neurológicos, por exemplo, da habilidade para caminhar. PPMS afeta aproximadamente 10% dos pacientes com MS e homens e mulheres com frequência igual. Seu surgimento normalmente ocorre mais tarde do que CIS ou RRMS. Com relação às causas e mecanismos de doença PPMS é considerada similar às RIS-CIS-RRMS-SPMS acima.
[00100] Tipicamente, MS é diagnosticada de acordo com os critérios de McDonald revisados. Esses critérios também permitem a distinção entre as diferentes formas e atividade da doença de MS (Thompson e cols., 2018, Lancet Neurol., 17 (2): 162-173).
[00101] De preferência, a abordagem de tolerização é aplicada em um estágio inicial, ou seja, RIS, CIS e RRMS inicial, na medida em que se supõe que os processos imunes nesse estágio sejam mediados primariamente por linfócitos T autorreativos, enquanto dano tecidual, as denominadas alterações degenerativas, se tornam gradualmente mais importantes quando a doença avança. No entanto, a tolerização é significativa desde que haja uma resposta de células T autorreativas contra os antígenos usados para tolerização, o que também poderia ser durante SPMS e PPMS.
[00102] Em uma modalidade particularmente preferida, uma GDP-L-fucose sintase ou proteína RASGRP2 ou variante de splicing desta, preferivelmente a GDP-L-fucose sintase ou proteína RASGRP2, é usada em uma abordagem de tolerização em um estágio inicial, ou seja, RIS, CIS e RRMS inicial. A proteína GDP-L-fucose sintase possui, por exemplo, a sequência como apresentada no ID. DE SEQ. Nº: 1, a proteína RASGRP2 possui, por exemplo, a sequência como apresentada no ID. DE SEQ. Nº: 2, ID. DE SEQ. Nº: 6, ID. DE SEQ. Nº: 7, ID. DE SEQ. Nº: 8 ou ID. DE SEQ. Nº: 9.
[00103] Em um aspecto da invenção, é fornecido um método para indução de tolerância antígeno-específica aos autoantígenos em um indivíduo humano que sofre ou está em risco para o desenvolvimento de MS. O método compreende a etapa de aplicação a um paciente necessitado, ou seja, ao indivíduo humano, de pelo menos uma proteína selecionada do grupo que consiste em GDP-L-fucose sintase e membros da família de proteínas RASGRP, fragmento (peptídeo), derivado e/ou variante de splicing destes, de uma sequência de nucleotídeos que codifica qualquer uma das proteínas ou fragmento, derivado ou variante de splicing destas e/ou de uma sequência gênica como descrita nesse relatório descritivo ou aplicação de pelo menos um carreador que compreende pelo menos uma proteína, fragmento, derivado, variante de splicing, sequência de nucleotídeos e/ou sequência gênica como descritos nesse relatório descritivo.
[00104] Em uma modalidade, a sequência de nucleotídeos ou sequência gênica é aplicada ao paciente por meio de um carreador, por exemplo, uma célula. O antígeno pode então ser expresso por um carreador, por exemplo, uma célula. A transferência de RNA/DNA que codifica um autoantígeno em um carreador, por exemplo, uma célula e, dessa forma, que codifica os autoantígenos acima também é concebível similar às abordagens de vacinação de tumor que empregam RNAs codificadores de antígeno.
[00105] É particularmente preferido usar a proteína inteira de GDP-L-fucose sintase (ID. DE SEQ. Nº: 1) ou a proteína inteira de RASGRP2 (ID. DE SEQ. Nº: 2 ou ID. DE SEQ. Nº: 6, 7, 8 ou 9) para indução de tolerância antígeno- específica. Em outra modalidade preferida, é usado um fragmento de qualquer uma dessas proteínas. É particularmente preferido usar um fragmento como apresentado em qualquer um dos IDS. DE SEQ. Nos: 10 a 98. Ainda mais preferido é um peptídeo como apresentado em qualquer um dos IDS. DE SEQ. Nos: 10 a 35.
[00106] A (pelo menos uma) proteína, fragmento, derivado, variante de splicing, sequência de nucleotídeos e/ou sequência gênica pode ser aplicada por administração nasal, inalada, oral, subcutânea (s.c.), intracelômica (i.c), intramuscular (i.m.), intradérmica (i.d.), transdérmica (t.d.) ou intravenosa (i.v.), preferivelmente por vias de administração que são consideradas tolerogênicas, por exemplo, por administração i.v., s.c., i.d., t.d., oral, inalada, nasal ou acoplada a um carreador tolerogênico, preferivelmente uma RBC.
[00107] Em particular, o método pode ser usado para indução de tolerância antígeno-específica aos autoantígenos na MS inicial ou até mesmo em estágios pré-clínicos da doença.
[00108] O protocolo de tolerância antígeno-específica fornecido nesse relatório descritivo pode visar seletivamente células T autorreativas tanto ativadas quanto naïve específicas para múltiplos epitopos encefalitogênicos potenciais que perpetuam a doença.
[00109] A abordagem de tolerização também pode ser usada para prevenir MS. Essa abordagem pode incluir a identificação daqueles indivíduos (por exemplo, em uma família com um paciente com MS) que estão em um risco elevado para o desenvolvimento de MS. Por exemplo, é possível tolerizar, por exemplo, as crianças de uma mãe com MS ou o gêmeo idêntico de um paciente com MS, no qual o risco de desenvolvimento de MS seria particularmente elevado.
[00110] O diagnóstico de MS ou de uma de suas formas é feito por demonstração de déficits neurológicos e/ou lesões na MRI compatíveis com MS que estão disseminados em espaço e tempo. A testagem laboratorial positiva para uma resposta autoimune contra as novas proteínas-alvo GDP-L-fucose sintase e da família RASGRP e/ou fragmentos, derivados e/ou variantes de splicing destas pode ser usado para identificar pacientes que particularmente têm probabilidade de se beneficiar da indução de tolerância antígeno-específica, ou seja, permite a personalização de abordagens de tolerância antígeno-específica. Por identificação de pacientes que particularmente têm probabilidade de se beneficiar da indução de tolerância antígeno-específica, um paciente pode ser diagnosticado in vitro com MS. Em outras palavras, os autoantígenos identificados de GDP-L-fucose sintase e da família RASGRP (in particular RASGRP2) e/ou fragmentos, e/ou derivados e/ou variantes de splicing destes podem ser usados no diagnóstico in vitro de MS. Dessa forma, essa testagem in vitro pode ser complementada com achados clínicos e de imageamento, ou seja, o diagnóstico de MS de acordo com o estado da técnica, em particular de acordo com os critérios de McDonald revisados.
[00111] Em outro aspecto da invenção, é fornecido um método para identificação de um indivíduo humano adequado para tolerização aos autoantígenos na MS, preferivelmente MS inicial. Desse modo, um paciente individual, que se beneficiaria ou é elegível para o tratamento, é identificado. Esse método também pode ser usado para o diagnóstico in vitro de MS. Pacientes com CIS, provavelmente também RIS e RRMS, são os mais adequados para tolerização, embora a tolerização pareça significativa em qualquer forma de MS, incluindo SPMS e PPMS, desde que o paciente responda pelo menos a um dos peptídeos antigênicos que estão incluídos no tratamento de tolerização. As etapas desse método compreendem o isolamento de células T, preferivelmente células T CD4+, e/ou de anticorpos do sangue, LCR ou outro fluido corporal do indivíduo e a medição da reatividade das células T e/ou anticorpos contra a proteína ou fragmento, derivado ou variante de splicing desta de acordo com a presente invenção. Aqueles habilitados na técnica têm conhecimento de métodos para o isolamento de células T e/ou de anticorpos do sangue, LCR ou outro fluido corporal do indivíduo e para a medição da reatividade das células T e/ou anticorpos contra a proteína, fragmento, derivado ou variante de splicing.
[00112] Se um indivíduo possui uma resposta contra uma das proteínas ou fragmentos, ele poderia, dessa forma, ser diagnosticado in vitro com MS e seria elegível e um bom candidato para tratamento. Uma etapa de seleção adicional poderia ser a tipagem de HLA classe II e a presença dos MS- alelos HLA-DR associados.
[00113] Proteínas, em particular a proteína GDP-L- fucose-sintase ou uma proteína da família RASGRP, em particular RASGRP2, ou fragmentos, derivados ou variantes de splicing destas, derivadas de antígenos relevantes para doença poderiam, dessa forma, ser usadas para identificar aqueles pacientes ou subgrupos de pacientes com uma resposta de células T ou de anticorpo pró-inflamatória (potencialmente prejudicial) existente e/ou particularmente forte contra o respectivo autoantígeno. Por identificação daqueles pacientes ou subgrupos de pacientes com uma resposta de células T ou de anticorpo pró-inflamatória (potencialmente prejudicial) existente e/ou particularmente forte contra o respectivo autoantígeno, o paciente pode, dessa forma, ser diagnosticado in vitro com MS. Nessa situação, a pré-testagem do paciente com um teste adequado para avaliar a reatividade contra o autoantígeno também permitiria a customização do tratamento de tolerização (por exemplo, composição dos peptídeos/proteínas usados para tolerização) para o paciente ou subgrupo de pacientes individuais com o objetivo de tornar a tolerização tão específica quanto possível e também evitar efeitos adversos potenciais. A tolerização antígeno-específica, no entanto, também pode ser realizada em pacientes nos quais uma resposta de célula T ao antígeno de tolerização não foi demonstrada. Dessa forma, em uma modalidade, a proteína, fragmento, derivado e/ou variante de splicing de acordo com a invenção pode ser usada na pré-testagem in vitro de um indivíduo humano diagnosticado com MS ou um indivíduo humano em risco para o desenvolvimento de MS.
[00114] Em um aspecto da invenção, é fornecido um carreador, que compreende pelo menos uma proteína, fragmento, derivado, variante de splicing, sequência de nucleotídeos e/ou sequência gênica como descritos nesse relatório descritivo. O carreador pode estar acoplado à (pelo menos uma) proteína, fragmento, derivado e/ou variante de splicing e/ou o carreador pode conter a (pelo menos uma) proteína, fragmento, derivado, variante de splicing, sequência de nucleotídeos e/ou sequência gênica. Em uma modalidade, o termo “contém” significa que a proteína, fragmento, derivado, variante de splicing, sequência de nucleotídeos e/ou sequência gênica está dentro do carreador e não em sua superfície. Uma proteína, fragmento, derivado e/ou variante de splicing também pode estar acoplado e contido dentro do carreador, o que significa que uma parte da proteína, fragmento, derivado e/ou variante de splicing está acoplada ao carreador e outra parte da proteína, fragmento, derivado e/ou variante de splicing está contida dentro do carreador.
[00115] Aqueles habilitados na técnica estão familiarizados com carreadores possíveis. Por exemplo, o carreador pode ser qualquer célula, proteína, lipídeo, glicolipídeo, glóbulo, nanopartícula, partícula vírus-like (VLP) ou molécula, por exemplo, uma molécula de açúcar, ou qualquer combinação destes, que seja adequado para aplicação em humanos e aos quais as proteínas e/ou fragmentos podem ser acopladas por um processo de acoplamento, por exemplo, por um processo de acoplamento químico, preferivelmente por EDC. O carreador pode ser derivado de um existente na natureza ou pode ser sintético. De preferência, a célula, molécula, glóbulo, nanopartícula ou VLP é biodegradável in vivo ou é pelo menos aplicável a pessoas vivas e degradado in vivo ou é eliminado do corpo ao qual o carreador é aplicado. O termo “célula” também inclui precursores de células, por exemplo, precursores de RBC. De preferência, o carreador é uma célula sanguínea, ainda mais preferivelmente uma célula sanguínea vermelha ou branca. A célula sanguínea branca pode ser um esplenócito ou uma PBMC ou, geralmente, uma APC.
[00116] Em uma modalidade, a proteína, fragmento, derivado e/ou variante de splicing é expresso pela célula, preferivelmente pela célula sanguínea. Desse modo, a informação genética que codifica a proteína, fragmento, derivado e/ou variante de splicing é introduzida na célula antes da proteína, fragmento, derivado e/ou variante de splicing ser expressa pela célula.
[00117] Qualquer agente de acoplamento ou método para acoplamento de uma proteína e/ou um fragmento desta a um carreador pode ser usado. Por exemplo, um ligante sintético ou natural pode ser empregado para acoplamento. Um exemplo de um ligante desse tipo é glicoforina A, presente na superfície de RBC. Em uma modalidade, é realizada reticulação química. Em uma modalidade preferida, é usado o reticulante químico EDC que catalisa a formação de ligações peptídicas entre grupos amino e carboxil livres. Particularmente na presença de EDC, múltiplos peptídeos podem ser acoplados à superfície do carreador permitindo, dessa forma, o direcionamento simultâneo de múltiplas especificidades de célula T. De preferência, mais do que três, mais do que cinco, mais do que 10, mais do que 15, ou até mesmo mais do que 20 peptídeos diferentes são acoplados à superfície do carreador. Em uma modalidade preferida, entre cinco e 20, preferivelmente entre cinco e 15 peptídeos diferentes são usados. Um peptídeo é diferente de outro peptídeo se ele não consiste na mesma sequência de aminoácidos. O carreador é preferivelmente, mas não necessariamente, uma célula. EDC pode ser usado para o acoplamento a qualquer carreador as dede que um grupo amino livre esteja presente.
[00118] Em outra modalidade, pelo menos um peptídeo de cada proteína de acordo com a presente invenção (uma proteína GDP-L-fucose sintase ou uma proteína da família de proteínas RASGRP, preferivelmente RASGRP2) é usado em combinação e acoplado a um carreador. É particularmente vantajoso combinar pelo menos um peptídeo de cada proteína de acordo com a presente invenção com pelo menos um peptídeo do estado da técnica conhecido, em particular com pelo menos um peptídeo de mielina, em particular com pelo menos um ou todos os peptídeos de mielina, como definidos pelos IDS. DE SEQ. Nos: 261 a 267.
[00119] Em uma modalidade preferida, o carreador é uma célula sanguínea, e a célula sanguínea é quimicamente acoplada por um agente de acoplamento, preferivelmente por EDC, à (pelo menos uma) proteína, fragmento, derivado e/ou variante de splicing. Um método de fabricação dessa célula sanguínea quimicamente acoplada, ou seja, acoplada a um antígeno, também é fornecido, que compreende o isolamento da célula sanguínea de um indivíduo humano, a adição da (pelo menos uma) proteína, fragmento, derivado e/ou variante de splicing, ou seja, do antígeno e, subsequentemente, a adição do agente de acoplamento, preferivelmente EDC.
[00120] O mecanismo de ação de células acopladas com peptídeo por EDC não é totalmente compreendido, mas envolve a ligação covalente de grupos amino e carbóxi de peptídeo e moléculas da superfície celular, subsequente morte celular programada (apoptose, no caso de células nucleadas; eriptose, no caso de RBC) das células acopladas a peptídeo, ou seja, acopladas ao antígeno, e depois apresentação tolerogênica das células morrendo in vivo.
[00121] A dose de EDC usada para a reação de acoplamento pode ser titulada para obter um máximo de segurança com a melhor eficácia. Em altas concentrações, EDC pode levar à lise de células, em particular de RBC. Para estabilidade ótima da RBC, uma concentração final de EDC de menos do que 15 mg/ml, preferivelmente menos do que 10 mg/ml, ainda mais preferivelmente menos do que 5 mg/ml, ainda mais preferivelmente de cerca de 3 mg/ml, pode ser usada. A dose ótima também pode variar. Aqueles habilitados na técnica sabem como determinar a estabilidade ótima da RBC e a dose ótima de EDC.
[00122] A proteína, fragmento, derivado e/ou variante de splicing a ser acoplada pode ser adicionada em uma quantidade a ser prontamente determinada por aqueles habilitados na técnica. Aqueles habilitados na técnica têm conhecimento de medidas para determinar a quantidade ótima reciprocamente com a quantidade ótima de EDC.
[00123] O tempo de incubação pode ser variado e customizado para cada reação de acoplamento específica (por exemplo, 15 min, 30 min, 45 min, 60 min, 120 min). A eficiência de acoplamento pode ser melhor com um tempo de incubação mais longo. Em uma modalidade, um máximo é alcançado após 60 min.
[00124] A temperatura de incubação também pode variar. Por exemplo, 15-25°C ou 2-8°C podem ser usados. Em uma modalidade, a eficiência de acoplamento foi maior quando a reação de acoplamento era realizada a 15-25°C.
[00125] Qualquer excipiente que permita a reação de acoplamento pode ser usado. Em uma modalidade, o excipiente é estéril e livre de endotoxina. Em uma modalidade preferida, o excipiente é solução salina (NaCl 0,9%) estéril, livre de endotoxina. Solução salina é aprovada para uso em humanos e fornece um máximo de segurança.
[00126] Aqueles habilitados na técnica sabem como determinar um tempo e temperatura de incubação ótimos e como determinar os excipientes possíveis.
[00127] Em um aspecto da invenção, é fornecida uma composição farmacêutica que compreende pelo menos uma proteína, fragmento, derivado, variante de splicing, sequência de nucleotídeos e/ou sequência gênica, como descritos nesse relatório descritivo, e um carreador farmaceuticamente aceitável.
[00128] Em outro aspecto da invenção, é fornecido um método para o tratamento terapêutico, a prevenção ou diagnóstico de MS em um indivíduo humano, que compreende a administração no referido indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficaz da proteína, fragmento, derivado, variante de splicing, sequência de nucleotídeos e/ou sequência gênica, como descritos nesse relatório descritivo, e/ou do carreador como descrito nesse relatório descritivo. Dessa forma, o carreador que compreende a (pelo menos uma) proteína, fragmento, derivado, variante de splicing, sequência de nucleotídeos e/ou sequência gênica de acordo com a presente invenção, em particular o carreador acoplado à (pelo menos uma) proteína, fragmento, derivado e/ou variante de splicing de acordo com a invenção, e/ou o carreador que contém a (pelo menos uma) proteína, fragmento, derivado, variante de splicing, sequência de nucleotídeos e/ou sequência gênica de acordo com a invenção, pode ser usado no tratamento, diagnóstico e/ou prevenção de MS.
[00129] Em um aspecto adicional da invenção, um peptídeo de acordo com a presente invenção, preferivelmente um peptídeo que compreende 5 a 50, preferivelmente 5 a 20, mais preferivelmente 10 a 15, ainda mais preferivelmente 15 aminoácidos, é usado como um medicamento.
[00130] A peptídeo preferido para uso como um medicamento é: a) pelo menos 85%, preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 95% idêntico a uma respectiva sequência de aminoácidos correspondente ou b) pelo menos 70%, preferivelmente pelo menos 80%, mais preferivelmente pelo menos 90% homólogo a uma respectiva sequência de aminoácidos correspondente ou c) pelo menos 60%, preferivelmente pelo menos 70%, mais preferivelmente pelo menos 80%, ainda mais preferivelmente pelo menos 90% homólogo a uma respectiva sequência de aminoácidos correspondente e se liga a um alelo HLA autólogo, é reconhecido por uma célula T e/ou é reconhecido por um anticorpo que se liga ou reconhece a respectiva sequência de aminoácidos.
[00131] Ainda mais preferido para uso como um medicamento é um peptídeo com uma sequência selecionada do grupo que compreende os IDS. DE SEQ. Nos: 10 a 98, preferivelmente os IDS. DE SEQ. Nos: 10 a 35, ainda mais preferivelmente um peptídeo que consiste em uma sequência selecionada do grupo que compreende o ID. DE SEQ. Nº: 10 a 98, preferivelmente os IDS. DE SEQ. Nos: 10 a 35.
[00132] Como um aspecto adicional, os motivos de peptídeo da Figura 3 (ii) E (ID. DE SEQ. Nº: 99), os peptídeos de GDP-L-fucose sintase como retratados na Figura 5 (IDS. DE SEQ. Nos: 199-215), os peptídeos de GDP-L-fucose sintase da tabela na Figura 6 (I e II) (IDS. DE SEQ. Nos: 10-14, 19-20, 22-23, 25-32 e 216-290) e os peptídeos de RASGRP1, RASGRP2 e RASGRP3 da tabela na Figura 12 (IDS. DE SEQ. Nos: 291-309) são todos o tema da presente invenção e podem ser usados de acordo com a presente invenção.
EXEMPLOS Especificidade de GDP-L-fucose sintase
1. Caracterização de TCC21.1
[00133] A abordagem imparcial de identificação de antígeno-alvo com o uso das bibliotecas combinatórias sintéticas de varredura posicional (ps-SCL) é mostrada esquematicamente na Fig. 2. O clone TCC21.1 foi identificado como descrito em Planas e cols. (2015). TCC21.1 é um TCC CD4+ isolado de células infiltrantes do LCR e expandidas clonalmente em duas lesões desmielinizantes ativas da matéria branca (LI e LIII) de MS de um paciente com SPMS (1154SA) com desmielinização de padrão II. TCC21.1 libera citocinas Th2 e ajuda na proliferação e produção de anticorpos por células B autólogas mediante ativação inespecífica. A fim de estudar os peptídeos reconhecidos por esse TCC de especificidade desconhecida com o uso de uma biblioteca de varredura posicional de decapeptídeos, primeiro foi identificada a molécula HLA classe II usada por TCC21.1 para reconhecer as misturas de peptídeos. Isso é um pré-requisito para utilização da abordagem de biblioteca de peptídeos/análise biométrica para identificação imparcial de antígenos-alvo (Zhao e cols., 2001, J. Immunol., 167: 2.130-
2.141; Sospedra e cols., 2010, J. Immunol. Methods, 353 (1- 2): 93-101). Como o paciente 1154SA era homozigoto para o haplótipo DR15, TCC21.1 foi inicialmente testado com as misturas com aminoácidos (AAs) definidos na posição 5, apresentadas por células da linhagem de célula B (BCL) da síndrome de linfócito exposto (BLS) imortalizadas em EBV transfectadas com diferentes moléculas autólogas únicas HLA DR/DQ (DRA*01:01/DRB5*01:01 = DR2a, DRA*01:01/DRB1*15:01 = DR2b, e DQA1*01:02/DQB1*06:02). Como leitura da ativação de célula T, foi usada a produção de GM-CSF, na medida em que TCC21.1 libera essa citocina após estimulação inespecífica com anti-CD3 e PMA (Planas e cols., 2015). Somente misturas apresentadas por BCL que expressam moléculas classe II DRB1*15:01 (DR2b) eram estimulantes (dados não mostrados).
2. Biblioteca combinatória sintéticas de varredura posicional como um método para identificação de antígenos / identificação de GDP-L-fucose sintase
[00134] TCC21.1 foi então testado com a biblioteca completa de decapeptídeos de varredura posicional (200 misturas; ou seja, misturas que representam as 10 posições de um 10-mer e em cada uma das posições fixas um dos 20 L- aminoácidos), apresentadas por BCL que expressam moléculas classe II DRB1*15:01. A liberação de GM-CSF em resposta à biblioteca completa é mostrada na Fig. 3A.
Um padrão de resposta similar foi obtido com a liberação de IL-10. A seguir, uma matriz de pontuação de análise biométrica foi gerada por atribuição de valores numéricos ao potencial estimulante de cada um dos 20 AAs definidos em cada uma das dez posições da biblioteca de decapeptídeos, como descrito previamente (Zhao e cols., 2001). Aqui, os valores foram calculados como o log de base 10 da secreção mediana de GM- CSF (pg/ml) de três experimentos independentes na presença de misturas, menos a secreção na ausência de misturas (Fig. 3B). Com base em um modelo de contribuição independente de AAs individuais para o reconhecimento de antígeno peptídico, a pontuação estimulante predita de certo peptídeo é a soma dos valores da matriz de cada AA contido no peptídeo em cada posição (Zhao e cols., 2001). Essa abordagem de pontuação foi aplicada para classificar, de acordo com sua pontuação estimulante que é preditiva de sua potência estimulante, todos os peptídeos de 10-mers naturais sobrepostos das sequências de proteínas dentro do banco de dados de proteínas humanas UniProt.
Com base nesses valores preditos, os 50 peptídeos humanos naturais preditos com as maiores pontuações foram sintetizados e testados a 5 μg/ml (Fig. 4). Inesperadamente, nenhum dos peptídeos foi claramente estimulante (Fig. 3C). A capacidade preditiva da abordagem acima que combina uma biblioteca de varredura posicional e análise biométrica foi menor para esse TCC do que para outros em estudos prévios.
As misturas mais estimulantes, como mostrado na Fig. 3B, possuem AAs definidos idênticos em posições consecutivas, sugerindo um possível reconhecimento de um motivo de AA em múltiplos quadros.
Para sermos capazes de analisar os dados usando a abordagem descrita na Fig. 2, um conjunto de 22 misturas duplas definidas (ou seja, misturas de varredura posicional com duas posições definidas) foi projetado, sintetizado e testado (Fig. 3D); os resultados confirmaram a presença de um motivo de reconhecimento único (LHSXFEV, ID.
DE SEQ.
Nº: 99) com diferentes resíduos flanqueadores (Fig. 3E). A fim de aplicar esse motivo de reconhecimento nos dois quadros à matriz derivada de GM-CSF original e realizar análise biométrica, o modelo de média harmônica (HM) foi usado para integrar as respostas estimulantes de algumas das misturas duplas definidas (Fig. 3D, misturas do Quadro 1/2-HM) na matriz original.
Usando as novas matrizes de “reforço harmônico” do quadro 1 e quadro 2, todos os peptídeos de 10-mers naturais sobrepostos derivados do banco de dados de proteínas humanas UniProt foram pontuados e classificados, como mostrado esquematicamente na Fig. 2. Os 50 peptídeos naturais preditos com as maiores pontuações para ambas as matrizes foram sintetizados e testados para liberação de GM-CSF (Fig. 4). Essas duas matrizes permitiram a identificação de três peptídeos nitidamente estimulantes (Fig. 3F). Os dois peptídeos mais estimulantes, NVLHSAFEVG (ID.
DE SEQ.
Nº: 16) predito com quadro 1 do reforço harmônico e DNVLHSAFEV (ID.
DE SEQ.
Nº: 15) predito com quadro 2 do reforço harmônico, pertencem à GDP-L-fucose sintase codificada pelo gene TSTA3,
e sobreposto por 9 AAs.
[00135] Em detalhe, a Figura 3 mostra: A. Produção de GM- CSF por TCC21.1 em resposta a uma biblioteca completa de decapeptídeos de varredura posicional (200 misturas) apresentada por células BLS que expressam somente DRB1*15:01. B. Matriz de pontuação projetada com a mediana log10 da produção de GM-CSF de três experimentos independentes. Bordas em negrito mostram misturas selecionadas para misturas duplas definidas. C. Produção de GM-CSF por TCC21.1 em resposta aos 50 peptídeos com as maiores pontuações preditas usando a matriz de pontuação baseada em GM-CSF. D. Produção de GM-CSF por TCC21.1 em resposta a 22 misturas duplas definidas. Em cinza, misturas com AAs definidos do motivo de TCR no quadro 1 e em preto no quadro 2. Respostas estimulantes de misturas em negrito (Quadro 1/2-HM) foram integradas na matriz original usando o modelo de média harmônica. E. Motivo de TCR e valores de atividade da mistura definida dupla selecionados com base no modelo de média harmônica e incorporados na matriz original, Quadro 1-HM em cinza e Quadro 2-HM em preto. F. Produção de GM-CSF por TCC21.1 em resposta aos 50 peptídeos com pontuações preditas maiores usando matrizes de pontuação dos quadros 1 e 2 do reforço harmônico. Biblioteca de decapeptídeos completa, misturas duplas definidas e decapeptídeos individuais foram apresentados por células BLS que expressam DRB1*15:01. As misturas foram testadas a 200 μg/ml e decapeptídeos individuais a 5 μg/ml. Histogramas mostram média ± erro-padrão da média (SEM) e média de gráficos de pontos de três experimentos independentes. A citocina liberada é sempre expressa como pg/ml liberados por
TCC21.1 em resposta a estímulos menos pg/ml liberados na ausência de estímulos (controle negativo).
[00136] A Figura 4 mostra um resumo de decapeptídeos humanos preditos com a abordagem biométrica, que foram sintetizados e depois testados quanto à capacidade estimulante a 5 mg/ml com base na liberação de GM-CSF. Os peptídeos são classificados de 1 a 50 para os Quadros 1 e 2 de Reforço HM, respectivamente.
3. Dados de RNASeq/transcriptoma e proteoma que demonstram expressão de GDP-L-fucose-sintase em tecido cerebral
[00137] O nível de transcrito, expresso como “leituras por quilobase de modelo de éxon por milhão leituras mapeadas” (RPKM), de GDP-L-fucose sintase nas LI e LIII cerebrais autólogas é mostrado na Fig. 5. Os valores de transcrito para outros genes específicos para o cérebro também são mostrados como controle de qualidade das amostras e como referência para genes expressos em nível alto (MBP, PLP1) e médio (glicoproteína associada à mielina (MAG), proteína básica associada à mielina de oligodendrócito (MOBP) e glicoproteína de mielina de oligodendrócito (OMG)).
[00138] Dezessete peptídeos de GDP-L-fucose sintase foram identificados em tecido cerebral da matéria branca e cinzenta de outros pacientes com MS e controles sem MS por análise proteômica. As sequências de peptídeos estão listadas na Fig. 5, bem como as compatibilidades de espectro do peptídeos (PSM) nas diferentes amostras. A percentagem da sequência de AAs de GDP-L-fucose sintase coberta pelos peptídeos identificados foi de 56%. A posição se refere à sequência de UniProtKB/Swiss-Prot: Q13630.1. A análise de outras proteínas específicas do cérebro como referência também está incluída (Fig. 5).
[00139] Na soma, foi demonstrado que GDP-L-fucose- sintase é expressa no cérebro (RNA e proteína).
4. GDP-L-fucose sintase como o autoantígeno principal para um TCC que infiltra o cérebro
[00140] A fim de identificar autoantígenos reconhecidos por TCC21.1 nas duas lesões cerebrais autólogas, dentro das quais TCC21.1 sabidamente está expandido clonalmente (LI e III (Planas e cols., 2015)), as matrizes do quadro 1 e quadro 2 do reforço harmônico foram então usadas para pontuar e classificar, de acordo com sua pontuação estimulante, todos os peptídeos 10-mer naturais sobrepostos nas sequências de proteínas dentro de um sub-banco de dados de proteínas do cérebro criado com dados do transcriptoma baseados em RNASeq dessas duas lesões (GSE60943). Dos 40 peptídeos cerebrais naturais preditos com as maiores pontuações para a matriz do quadro 1, 38 peptídeos já eram preditos pelo banco de dados humano imparcial UniProt. Para a matriz do quadro 2, os 40 peptídeos principais eram preditos previamente (Fig. 4). Os dois novos peptídeos para o quadro 1 foram sintetizados e testados. Foi verificado que NVLHSAFEVG (GDP-L-fucose sintase 96-105, ID. DE SEQ. Nº: 16) e DNVLHSAFEV (95-104, ID. DE SEQ. Nº: 15) estimulam TCC21.1 (Fig. 4).
5. Caracterização de reconhecimento de GDP-L-fucose sintase / caracterização de resposta
[00141] Como mencionado acima, os dois peptídeos de GDP- L-fucose sintase reconhecidos por TCC21.1 tinham 9 AAs sobrepostos. Em células BCL que expressam DRB1*15:01, nove peptídeos 10-mer adicionais que sobrepõem 9 AAs foram sintetizados e testados e um peptídeo adicional foi identificado, VLHSAFEVGA (97-106, ID. DE SEQ. Nº: 18), que induzia liberação de GM-CSF. O peptídeo NVLHSAFEVG (96-105, ID. DE SEQ. Nº: 16) gerou a resposta ótima com uma EC50 de 0,2 μg/ml e era apresentado por moléculas DRB1*15:01 e DQB1*06:02. Os AAs comuns dos três peptídeos estimulantes são VLHSAFEV (97-104) (dados não mostrados).
[00142] A seguir, a resposta de TCC21.1 aos peptídeos de GDP-L-fucose sintase apresentados por PBMCs e BCL autólogas irradiadas foi caracterizada. Peptídeos de GDP-L-fucose sintase apresentados pelos dois tipos de APCs foram capazes de induzir proliferação. O fenótipo funcional dessa resposta também foi analisado. TCC21.1 exibiu um fenótipo Th2, que libera principalmente citocinas Th2 e níveis menores de IL- 22 e IL-10. Inesperadamente, quando os peptídeos foram apresentados por BCL autólogas, eles induziram níveis maiores de IFNγ. Além disso, TCC21.1 também liberou GM-CSF e IL-3 em resposta aos peptídeos de GDP-L-fucose sintase. A liberação dessas duas citocinas parece ser uma característica específica desse TCC, comparado com outros TCCs Th1, Th1* ou Th1/2 que foram gerados de pacientes com condições diferentes. A coloração intracelular de citocina confirmou o fenótipo funcional Th2 de TCC21.1 em resposta à GDP-L-fucose sintase (96-105, ID. DE SEQ. Nº: 16). Mais do que 60% das células TCC21.1 eram IL-4+ após estimulação com GDP-L-fucose sintase (96-105, ID. DE SEQ. Nº: 16), enquanto apenas cerca de 12% eram IFNγ+. Em torno de 60% das células eram GM-CSF+ e 47,7% dessas também IL-4+. Caracterização adicional de TCC21.1 demonstrou expressão de CD28 e do receptor de quimiocina CRTh2 (dados não mostrados).
6. Reconhecimento de GDP-L-fucose sintase por células T
CD4+ que infiltram o LCR do paciente 1154SA
[00143] Sessenta de dois peptídeos 15-mer sobrepostos por 10 AAs e cobrindo toda a proteína GDP-L-fucose sintase (Figura 6) foram sintetizados e testados quanto à sua habilidade para induzir proliferação de TCC21.1 quando apresentados por PBMCs autólogas. Sete peptídeos de mielina imunodominantes/encefalitogênicos (Bielekova e cols., 2004), um pool de peptídeos CEF (citomegalovírus, EBV, vírus influenza e toxóide tetânico) e glóbulos de controle foram testados em paralelo (Figura 6). TCC21.1 reconheceu dois peptídeos de GDP-L-fucose sintase sobrepostos, 91-105 (ID. DE SEQ. Nº: 14) e 96-110 (ID. DE SEQ. Nº: 17), contendo os três decapeptídeos estimulantes (95-104 (ID. DE SEQ. Nº: 15), 96-105 (ID. DE SEQ. Nº: 16) e 97-106 (ID. DE SEQ. Nº: 18)) que foram identificados previamente.
7. Reconhecimento de GDP-L-fucose sintase por células T CD4+ que infiltram o LCR de pacientes com CIS/MS
[00144] A fim de verificar se o reconhecimento específico de GDP-L-fucose sintase ocorre em células T CD4+ que infiltram o LCR em pacientes com formas diferentes de MS (a maioria CIS e RRMS), um novo protocolo foi desenvolvido para expandir células T CD4+ frescas que infiltram o LCR até números elevados em uma única rodada para minimizar variações no repertório original de células T. Células T CD4+ em repouso que infiltram o LCR expandidas por PHA, células T que também são derivadas do compartimento do SNC, de 31 pacientes com CIS/MS foram testadas em quadruplicata com os 62 peptídeos de GDP-L-fucose sintase sobrepostos apresentados por PBMCs autólogas irradiadas, bem como com os sete peptídeos de mielina, pool de peptídeos CEF e glóbulos de controle. Todos os índices de estimulação (SIs; exceto glóbulos de controle) foram reunidos em pool e os valores de SI menores que um foram tratados como tendo valor unitário. Análise de agrupamento k-Means foi realizada para determinar o valor de corte ótimo para diferenciar valores de SI de responsivos de não responsivos nessa população de pacientes. O agrupamento K-Means resultou em um valor do valor de corte de 1,455 para diferenciar respostas positivas de negativas. Subsequentemente, para cada paciente, todos os peptídeos que possuem um SI mediano (dos poços em quadruplicata) maior do que 1,455 foram identificados como respostas positivas.
[00145] A seguir, foram construídas pontuações dos pacientes por cálculo da soma de cada SI mediano de peptídeo responsivo, ponderada pelo número de pacientes totais que responderam àquele peptídeo. Dessa forma, tanto os próprios valores de SI para cada peptídeo, quanto a imunogenicidade relativa de cada peptídeo foram contabilizados para avaliar a frequência e potência da resposta imune contra os antígenos específicos. Análise de três agrupamentos k-Means foi realizada com base nas pontuações de 10 pacientes e os pacientes foram claramente agrupados em três categorias: “não responsivos”, “responsivos moderados” e “responsivos altos”. Dezenove pacientes (61,3%) foram, portanto, caracterizados como não responsivos à GDP-L-fucose sintase, seis (19,35%) como responsivos moderados e seis (19,35%) como responsivos altos (dados não mostrados). Nenhuma diferença significante entre os três grupos foi encontrada para respostas a CEF ou para os controles positivo ou negativo. Peptídeos imunodominantes foram definidos como peptídeos capazes de induzir respostas positivas em pelo menos 10% dos pacientes. Os 14 peptídeos de GDP-L-fucose que obtêm esse critério são mostrados na Figura 7. A análise funcional das respostas mais fortes a alguns peptídeos imunodominantes revelou um fenótipo Th1 com produção principalmente de IFN-γ (dados não mostrados).
[00146] Em detalhe, a Figura 7 mostra: Número de pacientes com CIS/MS com células T CD4+ que infiltram o LCR que responderam aos peptídeos de GDP-L-fucose sintase. Peptídeos imunodominantes que eram positivos em pelo menos três pacientes são mostrados em preto. Quadrados pretos são responsivos altos e quadrados brancos pacientes responsivos moderados.
[00147] Em conclusão, cerca de 20-25% dos pacientes com MS (CIS, RRMS, SPMS) exibem uma resposta imune aos peptídeos imunodominantes diferentes de GDP-L-fucose sintase; a maioria dessas células T GDP-L-fucose sintase-específicas possui um fenótipo Th1 (fenótipo mais frequente nos pacientes com MS). Uma comparação com a reação a 7 peptídeos de mielina (peptídeos ETIMS) mostra que significantemente menos pacientes reagem a esses peptídeos, comparado com GDP-L- fucose sintase. Especificidade de RASGRP2
8. Identificação de TCC14 e testagem de ps-SCL com TCC14 para identificar RASGRP2
[00148] TCC14 foi identificado em abordagem análoga de paciente com MS 1 (homozigoto para HLA-DR15), no entanto, nesse caso, da fração de células T autoproliferantes (proliferação sem estimulação) do sangue periférico, que é enriquecido para células T dirigidas ao cérebro. TCC14 também foi demonstrado por sequenciamento profundo de TCR das células que infiltram as lesões cerebrais do paciente que está expandido clonalmente no cérebro. TCC14 foi gerado como mostrado esquematicamente na Fig. 1 (parte da direita). O isolamento de células T autoproliferantes é mostrado em mais detalhe na Fig. 8A. Em detalhe, células mononucleares do sangue periférico são semeadas em poços replicados após marcação com o corante N-succinimidil éster de diacetato de carboxifluoresceína (CFSE) sem estímulo. Após 7 dias de cultura, células proliferantes (CFSEdim) e não-proliferantes (CFSEhi) são identificadas por citometria de fluxo e as células T autoproliferantes (CFSEdim) isoladas por classificação de células. As sequências de TCRβV são comparadas entre lesões cerebrais de MS e a população CFSEdim (autoproliferante). Também foram encontrados mais de 20% de sequências de TCRβV da população CFSEdim nas lesões cerebrais de MS (Fig. 8B).
[00149] TCC14 foi então expandido e testado como mostrado na Fig. 2, usando uma abordagem imparcial para identificar o antígeno(s)-alvo de TCC14 usando bibliotecas combinatórias de varredura posicional de peptídeos e análise biométrica, como descrito acima. TCC14 expandiu suficientemente bem para ser testado com o conjunto completo de 200 misturas de uma biblioteca de varredura posicional. A restrição de TCC14 foi testada com células BLS transfectadas com haplótipo HLA-DR15 que expressa alelos HLA classe II (DR2a, DR2b ou DQw6), na medida em que os TCCs são derivados de um paciente com MS homozigoto para HLA-DR15. Após determinação de sua restrição de HLA classe II (DRB1*15:01), a reatividade contra todas as 200 amostras foi testada usando células BLS transfectadas com DRB1*15:01 e mostrou respostas positivas contra aminoácidos (aa) únicos ou múltiplos em cada uma das 10 posições.
A proliferação (índice de estimulação = SI; linha pontilhada SI = 2) com base no ensaio de incorporação de timidina foi usada após 72 h como leitura para a resposta de TCC (Figura 9 painel I). Com o uso de matrizes de pontuação para resumir a reatividade de TCC14 contra todos os 20 L-aa em cada uma das 10 posições da biblioteca de decapeptídeos após testagem de múltiplas doses, os peptídeos a serem reconhecidos por TCC14 (Figura 9 painel II) foram preditos usando o processo de análise biométrica (Zhao e cols., 2001). Respostas médias de três experimentos repetitivos foram usadas para gerar uma matriz para combinações de aminoácidos ótimas de um ligante de peptídeo potencial.
Os dados do cérebro do transcriptoma e das respectivas proteínas do paciente 1, do qual o TCC foi isolado, foram usados como banco de dados de pesquisa.
Noventa e duas sequências foram sintetizadas e testadas para reconhecimento por TCC14 com base em seu aparecimento nos 50 peptídeos preditos principais para pelo menos uma das matrizes usadas (resposta estimulante com SI > 3) (Figura 9 painel III). Como mostrado previamente para outros TCCs, há um bom relacionamento entre classificação de altos preditos e resposta de célula T (Sospedra e cols., 2010; Zhao e cols., 2001), na medida em que TCC14 reconheceu muitos dos peptídeos com pontuação elevada.
Para avaliar a avidez funcional para esses, foram realizados experimentos de titulação de dose com os 33 peptídeos que geraram respostas positivas.
Entre esses estavam os peptídeos com os IDS.
DE SEQ.
Nos: 33 a 35. Os peptídeos estimulantes foram testados em concentrações decrescentes para a resposta proliferativa de TCC14 usando
BLS DR2b após 72 h. (Figura 9 painel IV). Um peptídeo de RASGRP2 foi reconhecido com avidez elevada para o antígeno (EC50 = 0,012 µM) (ID. DE SEQ. Nº: 33), mas peptídeos de várias outras isoformas de RASGRP (RASGRP1, -3, 4) e outros peptídeos também geraram respostas positivas (Figura 9 painel IV). O reconhecimento do peptídeo de RASGRP2 por TCC14 resultou em secreção de citocinas Th2 e também de IFN-γ (dados não mostrados).
[00150] Em conclusão, múltiplas versões de RASGRP são reconhecidas pelo clone TCC14 com RASGRP2 com a maior avidez de longo (ou seja, nas menores concentrações de antígeno), sublinhando sua relevância biológica.
9. Reatividade de RASGRP2 de células sanguíneas periféricas
[00151] A fim de testar a reatividade para RASGRP2 em células T de memória derivadas do sangue periférico, PBMCs criopreservadas (1 x 108 células) de pacientes com MS tratados com natalizumab (NAT; n = 8) foram descongeladas e a seguir depletadas para células que expressam CD45RA usando classificação magnética de células (Miltenyi). 2 x 105 PBMCs depletadas de CD45RA foram semeadas por poço (10-15 poços replicados por condição) em meio X-Vivo e foram tratadas com veículo (DMSO), com glóbulos CD2/CD3/CD28 ou pulsadas com pools de peptídeos de RASGRP2 (concentração final do pool de 10 µM) ou proteína RASGRP2 inteira purificada (Origene; 0,3 µg/ml). Os peptídeos 15mer sobrepostos que cobrem a proteína RASGRP2 inteira (ID. DE SEQ. Nº:s 38-98) foram organizados em 9 pools de peptídeos com 7 peptídeos por pool que cobrem a sequência de RASGRP2 do terminal-N (pool 1) para o terminal-C (pool 9). O ensaio de incorporação de timidina foi usado para medir as respostas de proliferação à RASGRP2. No dia 7, as células foram pulsadas com 1 µCi de metil-3H- timidina por poço (Hartmann Analytic) e colhidas após 15 h em uma membrana (Tomtec). A incorporação foi medida por contagem de cintilação β (Wallac 1450, PerkinElmer). Os resultados são mostrados como pontos (média ± SEM). O índice de estimulação (SI) foi calculado como a proporção de estimulação de peptídeo ou proteína vs. controle de veículo. Valores de SI > 2 foram considerados como positivos (Figura 10).
[00152] Na soma, a Figura 10 mostra que células T de memória de pacientes com MS com autoproliferação elevada reagem com RASGRP2. Todos os 8 doadores responderam a um pool individual ou a vários pools de peptídeos de RASGRP2 (incluindo pool 2, que contém o peptídeo com o ID. DE SEQ. Nº: 46 que se sobrepõe com um peptídeo de TCC 14-alvo (ID. DE SEQ. Nº: 33)) e/ou toda a proteína, demonstrando que RASGRP2 é um autoantígeno que é amplamente reconhecido por pacientes com MS com um alto grau de autoproliferação.
10. Dados de RNASeq/transcriptoma e proteoma que demonstram expressão de RASGRP2 em células B e no cérebro
[00153] A expressão de RASGRP1-4 foi testada no nível de RNA e proteína em células B periféricas e no cérebro (Fig. 11). RASGRP1-3 são expressos tanto no cérebro do paciente 1 quanto no transcriptoma de células B de memória autoproliferantes (Fig. 11).
[00154] Em detalhe, a Figura 11 mostra: (A) O nível de expressão de transcritos originários do peptídeo estimulante na lesão III ativa do cérebro do paciente com MS 1 (RPKM) e células B autoproliferantes (CFSEdim) do sangue periférico
(RPKM) de 6 pacientes com RRMS (REM). Níveis de expressão abaixo de 0,1 ou ausência de expressão de transcrito foram configurados como 0,1. A expressão de transcritos de controle para cérebro (MOBP) e células B (CD19) também é mostrada. (B) Análise por espectrometria de massa de células B do sangue periférico de RRMS (REM, zero; n = 4) e tecido cerebral (matéria cinzenta, em pool, n = 6) de pacientes com MS. A cobertura de proteína (colunas) e contagens espectrais (números) de RASGRP1-4 são retratadas como medida da abundância de proteína.
[00155] Tecido cerebral (matéria branca e cinzenta) de controles e pacientes com MS também foi testado com proteômica usando espectrometria de massa. Peptídeos de proteínas RASGRP1, 2 e 3 foram identificados em tecido cerebral, em particular com uma alta abundância de RASGRP2 (Figura 12). A posição se refere à sequência de: GenBank AAC97349.1 (RASGRP1), GenBank AAI10307.1 (RASGRP2), e GenBank AAY15037.1 (RASGRP3).
[00156] Além disso, foram realizados estudos de imunoistoquímica (IHC) e mostraram expressão de proteína RASGRP2 na matéria cinzenta do cérebro, especificamente em neurônios corticais, e baço (dados não mostrados).
11. Identificação de peptídeos imunodominantes adicionais dentro das sequências de GDP-L-fucose sintase e RASGRP2
[00157] Além disso, peptídeos foram identificados com base em algoritmos de pesquisa comumente usados e suposições para serem potencialmente imunogênicos. A abordagem foi adotada a partir do contexto de vacinação de tumor, na qual a pesquisa por peptídeos imunogênicos em auto-proteínas (de um tumor) é um procedimento-padrão. Nesse cenário, uma sequência de proteínas é avaliada quanto a peptídeos que são preditos por se ligarem a alelos HLA relevantes para doença (ou os alelos HLA de certo paciente com tumor). Portanto, as sequências de GDP-L-fucose sintase e RASGRP2 foram tomadas e peptídeos de ligação forte (SB) ou fraca (WB) foram preditos usando os algoritmos de predição de ligação a peptídeos in silico bem aceitos de NetMHCII (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCII/) e IEDB (http://www.iedb.org/). Detalhes sobre como realizar as pesquisas estão prontamente disponíveis nos websites dos dois algoritmos de pesquisa. Resumidamente, a pesquisa envolve a cópia da sequência da proteína de interesse na ferramenta da web e escolha de um alelo HLA-classe II de interesse (ou classe I, se de interesse). O algoritmo irá então gerar as sequências de peptídeos e sua respectiva ligação predita ao alelo HLA-classe II. Para os alelos para os quais as pesquisas em NetMHCII não eram possíveis, IEDB foi usado. Alelos HLA que sabidamente estão associados com MS foram usados. Caso agora se considerem todas as regiões das duas proteínas que são preditas como sendo WB (essas são de maior interesse no contexto de autoantígenos) ou SB (pesquisas em NetMHCII) ou possuem uma classificação de ligação predita de 25% ou menor (IEDB), esses trechos de aminoácidos cobrirão quase todas as proteínas GDP-L-fucose sintase e RASGRP2:
[00158] Para a proteína GDP-L-fucose sintase, peptídeos que transpõem a área dos aminoácidos 1 a 315 foram preditos para se ligarem.
[00159] Para a proteína RASGRP2, peptídeos que transpõem as áreas dos aminoácidos 9 a 449 e 457 a 659 foram preditos para se ligarem.
[00160] Os seguintes alelos foram usados: - HLA-DRB1*15:01 (NetMHCII); - HLA-DRB5*01:01 (NetMHCII); - HLA-DRB1*03:01 (NetMHCII); - HLA-DRB1*13:03 (IEDB); - HLA-DRB1*08:01 (IEDB); - HLA-DRB3*02:02 (IEDB); - HLA-DRB1*04:01 (NetMHCII); - HLA-DRB1*04:04 (NetMHCII); - HLA-DQw6 (DQA1*01:01; DQB1*06:02) (IEDB).
[00161] As seguintes sequências de proteínas foram usadas: GDP-L-fucose sintase: GenBank: AAH93061.1; RASGRP2: GenBank: AAI10307.1.
[00162] Em conclusão, proteínas e peptídeos imunodominantes inteiros são adequados para uso no tratamento, diagnóstico e/ou prevenção de MS.
12. Fabricação de a célula sanguínea vermelha acoplada quimicamente EDC como ligante químico cruzado
[00163] Um peptídeo que foi sintetizado com um resíduo de biotina (biotina-PLP1; PLP1 = PLP 139-154) foi usado para permitir detecção altamente específica do peptídeo usando estreptavidina conjugada a fluoróforo. Resumidamente, células mononucleares do sangue periférico foram pulsadas com biotina-PLP1 (concentração final 0,05 mg/ml), EDC (concentração final 10 mg/ml), ambos em PBS por 1 hora a 4°C. Após duas etapas de lavagem, as células foram coradas com estreptavidina conjugada a fluoróforo e analisadas por citometria de fluxo (Estreptavidina-APC).
[00164] Como mostrado na Figura 13, só foi observada ligação de peptídeo eficiente na presença de ambos (biotina- peptídeo de PLP e EDC).
13. Análise adicional com 105 pacientes com MS (para GDP-L-fucose sintase) e 57 pacientes com MS (para RASGRP2)
[00165] Uma análise adicional com 105 pacientes com MS (para GDP-L-fucose sintase) e 57 pacientes com MS (para RASGRP2) foi realizada para validar a imunodominância de peptídeos de GDP-L-fucose sintase 51-65, 136-150, 161-175, 246-260 e 296-310 (IDS. DE SEQ. Nos: 12, 21, 23, 28 e 32) e peptídeo de RASGRP2 78-92 (ID. DE SEQ. Nº: 46). A reatividade de células T CD4+ que infiltram o LCR, que são altamente relevantes para a patogenicidade de MS, para os peptídeos testados foi comparada com a reatividade para os peptídeos imunodominantes de referência conhecidos MBP 13-32, MBP 83- 99, MBP 111-129, MBP 146-170, MOG 1-20, MOG 35-55 e PLP 139-
154.
[00166] Os resultados são mostrados nas Figuras 14 e 15. Os dados mostram que os peptídeos testados, que são fragmentos das proteínas GDP-L-fucose sintase e RASGRP2 identificadas nesse relatório descritivo, são tão reativos ou ainda mais reativos do que os peptídeos imunodominantes de referência conhecidos. Dessa forma, os peptídeos testados foram, novamente, confirmados como imunodominantes. O estudo de células T que infiltram o LCR e sua resposta a um suposto autoantígeno são particularmente significativos, pois células T autorreativas que infiltraram o órgão-alvo, ou seja, cérebro, medula espinhal ou LCR, são consideradas provavelmente biologicamente relevantes.
[00167] As respostas proliferativas e a secreção de IFN- γ foram testadas como descrito acima sob 7 e abaixo sob 15. Materiais e métodos, salvo especificação em contrário.
[00168] Em detalhe, a Figura 14 mostra: A. Respostas proliferativas expressas como índices de estimulação (SI) e secreção de IFN-γ (pg/ml) de células T CD4+ que infiltram o LCR (rodada única de expansão de PHA) a cinco peptídeos de GDP-L-fucose sintase (51-65, 136-150, 161-175, 246-260 e 296-310), quatro peptídeos de MBP (13-32, 83-99, 111-129 e 146-170), dois peptídeos de MOG (1-20 e 35-55), um peptídeo de PLP (139-154) e peptídeos de CEF, apresentados por PBMCs autólogas. Todos os peptídeos foram testados em quatro poços por paciente. Cada ponto representa um poço e cada peptídeo foi testado em 420 poços (4 poços x 105 pacientes). Poços positivos são poços com SIs acima de 2 (linha pontilhada) ou com IFN-γ acima de 20 pg/ml (linha pontilhada). Também são mostradas percentagens de poços positivos, bem como a proporção entre a percentagem de poços positivos para IFN-γ e SI. B. Percentagem de pacientes positivos com células T CD4+ que infiltram o LCR específicas para os diferentes peptídeos ou sem especificidade identificada. Pacientes positivos são definidos como pacientes com mais do que 2 dos 4 poços positivos para SI (histograma da esquerda), IFN-γ (histograma do meio) e SI ou IFN-γ (histograma da direita).
[00169] Em detalhe, a Figura 15 mostra: A. Respostas proliferativas expressas como índices de estimulação (SI) e secreção de IFN-γ (pg/ml) de células T CD4+ que infiltram o LCR (rodada única de expansão de PHA) a um peptídeo de RASGRP2 (78-92), quatro peptídeos de MBP (13-32, 83-99, 111-
129 e 146-170), dois peptídeos de MOG (1-20 e 35-55), um peptídeo de PLP (139-154) e peptídeos de CEF, apresentados por PBMCs autólogas. Todos os peptídeos foram testados em quatro poços por paciente. Cada ponto representa um poço e cada peptídeo foi testado em 228 poços (4 poços x 57 pacientes). Poços positivos são poços com SIs acima de 2 (linha pontilhada) ou com IFN-γ acima de 20 pg/ml (linha pontilhada). Também são mostradas percentagens de poços positivos, bem como a proporção entre a percentagem de poços positivos para IFN-γ e SI. B. Percentagem de pacientes positivos com células T CD4+ que infiltram o LCR específicas para os diferentes peptídeos ou sem especificidade identificada. Pacientes positivos são definidos como pacientes com mais do que 2 dos 4 poços positivos para SI (histograma da esquerda), IFN-γ (histograma do meio) e SI ou IFN-γ (histograma da direita).
14. Indução de tolerância in vivo com peptídeos de mielina em um experimento de Fase Ib
[00170] Dez pacientes que foram diagnosticados com MS foram testados para indução de tolerância. Em particular, eles foram testados para segurança e tolerabilidade de células sanguíneas vermelhas fixadas com EDC, acopladas com peptídeo, e para indicadores de indução de tolerância in vivo por injeção i.v. de células sanguíneas vermelhas autólogas acopladas quimicamente (por EDC) a um conjunto de peptídeos de mielina (MBP 13-32, MBP 83-99, MBP 111-129, MBP 146-170, MOG 1-20, MOG 35-55 e PLP 139-154) (IDS. DE SEQ. Nos: 261-267) no contexto de um experimento de Fase Ib. Resumidamente, sangue é retirado de cada paciente e células sanguíneas vermelhas são separadas. As células sanguíneas vermelhas são então acopladas quimicamente aos peptídeos de mielina ex vivo sob condições estéreis e injetadas i.v. no paciente. Dois pacientes receberam 1 x 1010 células, 3 pacientes receberam 1 x 1011 células e 5 pacientes receberam 3 x 1011 células. O dia da injeção foi definido como Dia 0.
[00171] Sangue também foi retirado 6 semanas antes da injeção (= Pré-tolerização) e 12 semanas após injeção (= Pós-tolerização). Nessas datas, os linfócitos do sangue periférico foram obtidos e examinados por citometria de fluxo com anticorpos marcados de forma fluorescente quanto à presença de uma ampla gama de diferentes tipos de células, incluindo várias subpopulações de células T, células B, monócitos e células dendríticas, células natural killer, incluindo aquelas que expressam marcadores de células T regulatórias induzidas (Tr1) ou células T regulatórias naturais (nTregs). Os últimos dois tipos de células podem ser caracterizados pelos seguintes marcadores: - Células T regulatórias 1 (Tr1) (CD3+ CD4+ CD45RA- CD49b+ LAG3+); - Células T regulatórias naturais (nTreg) FoxP3+ (CD4+ CD25hi FOXP3+).
[00172] Além disso, a reatividade de célula T a todos os sete peptídeos individualmente foi medida para células T do sangue periférico e para células T que infiltram o LCR, como descrito abaixo sob “Testagem de células T derivadas do LCR em grande volume de pacientes com CIS- e RRMS contra peptídeos de GDP-L-fucose sintase e mielina” e “estimulação de célula T” nas mesmas datas, ou seja, 6 semanas antes da injeção e 12 semanas após injeção.
[00173] A Figura 16 mostra que sinais de indução de tolerância antígeno-específica mediante injeção das células sanguíneas vermelhas acopladas eram detectáveis, como medidos por um aumento em células nTreg Tr1 e FoxP3+ e uma diminuição da reatividade de célula T peptídeo-específica. Esses dados indicam que, por administração de peptídeos imunodominantes, pode ser induzida tolerância aos respectivos peptídeos imunodominantes.
[00174] Em detalhe, a Figura 16 mostra: A. Percentagem de células Tr1 de células de memória CD4+ 6 semanas antes da injeção (= Pré-tolerização) e 12 semanas após injeção (= Pós-tolerização). B. Percentagem de FoxP3+ células nTreg de células de memória CD4+ 6 semanas antes da injeção (= Pré-tolerização) e 12 semanas após injeção (= Pós-tolerização). C. Reatividade de célula T em cinco pacientes que receberam 3 x 1011 células 6 semanas antes da injeção e 12 semanas após injeção (pontos cinzas: antes da injeção; pontos pretos: após injeção). O gráfico superior mostra a percentagem de células que respondem a todos os peptídeos. O gráfico inferior mostra a proliferação de cada micropoço individual (60 no total).
15. Materiais e métodos Material – Pacientes GDP-L-fucose sintase
[00175] Paciente 1154SA: células mononucleares e PBMCs derivadas do LCR foram obtidas de um paciente com SPMS com lesões desmielinizantes de padrão II, como descrito previamente (Planas e cols., 2015). Os tipos de HLA-classe I e II desse paciente foram: A*32:01, A*33:01, B*14:02, B*51:01, DRB1*15:01, DRB5* 01:01, DQB1*06:02 e DQA1*01:02.
[00176] LCR de punção lombar diagnóstica e sangue periférico pareado foram coletados de 31 pacientes com MS não tratados: 8 pacientes com CIS, 20 pacientes com RRMS e 3 pacientes com SPMS. Os pacientes foram recrutados pela clínica ambulatorial e day hospital no “University Medical Center Hamburg-Eppendorf” e pela “Neurology Clinic, University Hospital Zurich”. O diagnóstico de MS foi baseado nos critérios de McDonald revisados. Todos os pacientes de CIS tinham bandas oligoclonais LCR-específicas detectadas por focagem isoelétrica (IEF). Os pacientes que não receberam esteróides pelo menos 4 semanas antes da inclusão ou qualquer agente imunomodulador ou imunossupressor durante os últimos 3 meses foram considerados não tratados e incluídos no estudo. Células frescas do LCR desses pacientes foram expandidas in vitro (veja abaixo). PBMCs foram recém isoladas de tubos de sangue contendo EDTA por centrifugação por gradiente de densidade Ficoll (PAA, Pasching, Áustria) e criopreservadas. O “Ethik Kommission der Ärztekammer Hamburg”, protocolo Nº 2758 e o “Cantonal Ethical Comitee of Zurich”, EC-Nº do projeto de pesquisa 2013-0001 aprovaram os procedimentos do estudo. Autorização informada foi obtia de todos os pacientes ou parentes.
[00177] Tecido de autópsia do cérebro de 13 pacientes com MS (7 SPMS, 5 com PPMS e 1 com MS primária recidivante (PR)) e 7 controles sem MS foi obtido do “UK Multiple Sclerosis Tissue Bank” (“UK Multicentre Research Ethics Comitee”, MREC/02/2/39).
[00178] Para a análise adicional de GDP-L-fucose sintase (13 dos “Exemplos”), LCR de 105 pacientes foi coletado. Entre os 105 pacientes, a proporção de mulheres para homens foi de 1,9, a idade média foi de 35,68 (faixa 17-58), 4 pacientes foram diagnosticados com RIS, 10 pacientes foram diagnosticados com CIS, 82 pacientes foram diagnosticados com RRMS, 4 pacientes foram diagnosticados com SPMS e 5 pacientes foram diagnosticados com PPMS. RASGRP2
[00179] PBMC foram isoladas do paciente 1154SA por centrifugação de densidade Ficoll.
[00180] Para a análise adicional de RASGRP2 (13 dos “Exemplos”), LCR de 57 pacientes foi coletado. Os 57 pacientes estavam entre os 105 pacientes testados para GDP- L-fucose sintase. Entre os 57 pacientes, a proporção de mulheres para homens foi de 2,5, a idade média foi de 35,33 (faixa 17-55), 2 pacientes foram diagnosticados com RIS, 8 pacientes foram diagnosticados com CIS, 43 pacientes foram diagnosticados com RRMS, 1 paciente foi diagnosticado com SPMS e 3 pacientes foram diagnosticados com PPMS. Ensaios de autoproliferação
[00181] PBMCs foram descongeladas com meio IMDM completo (GE Healthcare) contendo 100 U/ml de penicilina/estreptomicina (Corning), 50 μg/ml de gentamicina (Sigma-Aldrich), 2 mmol/l de L-glutamina (PAA) e soro humano descomplementado termicamente 5% (HS, PAA) e a seguir lavadas uma vez com meio AIM-V livre de soro (GIBCO, Thermo Fisher Scientific), contendo albumina humana. As células foram incubadas por 15 min em meio AIM-V contendo 50 U/ml de DNAse (Roche) a 37°C para evitar a formação de grumos de células. Após duas etapas de lavagem com PBS contendo HS 0,1%, as células foram ressuspensas em uma concentração de 10 x 106 células/ml em PBS/HS 0,1% e foram então marcadas em uma concentração final de 0,5 μM de CFSE(Sigma-Aldrich) por 3 min em temperatura ambiente.
A marcação foi interrompida por extinção com volume em excesso de 5x de meio RPMI completo frio (PAN Biotech) contendo HS 10%. Após uma etapa de lavagem adicional com AIM-V, as células marcadas com CFSE foram semeadas a 2 x 105 PBMCs/200 μl por poço em AIM-V (10-12 poços replicados por doador e condição) em placas de microtitulação de 96 poços com fundo em “U” (Greiner Bio- One) a 37°C, CO2 5%, na ausência de estímulos exógenos (= autoproliferação). Para reações convencionais de célula T, para o PHA dos mesmos doadores (0,5 µg/ml) que o estímulo TCR-independente, toxóide tetânico (TTx, 5 µg/ml, Novartis Behring) como estímulo de antígeno estranho e reação de linfócitos misturados (MLR) como estímulo de antígeno alogênico, foram usados.
Após 7 dias, as células marcadas com CFSE foram coletadas e reunidas em pool de poços replicados, lavadas com PBS, Fc-bloqueado com IgG humana (Sigma-Aldrich) e marcadas com Live/Dead® Aqua (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific) a 4°C.
Após lavagem com PBS gelado contendo 2 mM de EDTA e FCS 2%, as células foram coradas diretamente para marcadores de superfície usando os anticorpos conjugados a fluorcromo (Key Resource Table). As medições foram realizadas em um citômetro de fluxo LSR Fortessa (BD Biosciences), e os dados foram analisados com FlowJo (Tree Star). Esse ensaio foi ainda usado para testar a competição de autoproliferação por incubação de PBMCs marcadas com CFSE na presença de anticorpos anti-HLA-DR, anti-CD4, anti-IFN-γ e anti-GM-CSF (10 µg/ml) ou controles de isótipo apropriados por 7 dias.
Para o ensaio de incorporação de timidina, 2 x 105 PBMCs/poço (10-12 poços replicados por doador e condição) foram cultivadas com meio
AIM-V livre de soro em placas de microtitulação de 96 poços com fundo em “U” a 37°C, CO2 5% e no dia 7 pulsadas com 1 µCi de metil-3H-timidina por poço (Hartmann Analytic) e células coletadas após 15 h (Tomtec). A incorporação foi medida por contagem de cintilação β (Wallac 1450, PerkinElmer). Clonagem de célula T
[00182] A fim de gerar TCCs do compartimento autoproliferante, 500 células CFSEdim do pool de células separadas de células CFSEdim (20.000 células) do paciente com MS 1 (para o sequenciamento de TCRVβ, descrito acima) foram divididas e foi realizada diluição limitante como descrito previamente (Aly e cols., 2011). TCCs foram enriquecidos usando um protocolo de expansão com PHA (Sigma) e IL-2 humana (Aly e cols., 2011). O sequenciamento de rearranjos de TCR dos TCCs gerados foi analisado, como descrito previamente (Yousef e cols., 2012). Para avaliar a resposta de citocina dos TCCs, partículas MACSibead carregadas com anticorpo anti-CD2/CD3/CD28 (Miltenyi) foram usadas para estimular cada TCC em 7 poços replicados com cada 200.000 células em meio X-Vivo (Lonza). Após 48 h, os sobrenadantes foram coletados e as respostas de citocina medidas, como descrito acima. Para expressão de receptor de quimiocina, TCCs foram corados com Live/Dead Aqua e anticorpos contra CXCR3 e CCR6 após descongelamento e repouso das células de um dia para o outro. Análise transcriptômica
[00183] A análise transcriptômica de lesões cerebrais foi realizada como descrito previamente (Planas e cols., 2015). Os dados discutidos foram depositados em “NCBI's Gene
Expression Omnibus” e são acessíveis por meio do “GEO Series” número de acesso GSE60943. Análise proteômica
[00184] Para análise proteômica, extração assistida por pressão e digestão de proteínas foram realizadas com um barociclador (2320EXT, BioSciences, Inc, South Easton, MA). Redução e alquilação foram aplicadas no homogeneizado antes da digestão das amostras com Lys-C e tripsina. Os peptídeos foram dessalinizados em colunas de extração de fase sólida (C18 Finisterre, Wicom, Alemanha), secos a vácuo, redissolvidos e medidos (Nanodrop 1000, espectrofotômetro (Thermo Scientific, Wilmington, DE, EUA). Os peptídeos resultantes foram purificados e separados por cromatografia por interação hidrofílica (HILIC, Agilent LC1200 equipado com uma coluna Polyamin II 250 x 3,0 mm 120 Å, 5 μm) antes de terem sido injetados em um sistema de cromatografia líquida nano Easy-nLC ligado a um instrumento Orbitrap Fusion (Thermo Fisher). A análise dos dados foi realizada com o software MASCOT usando um banco de dados de proteínas humanas UniProtKB/Swiss-Prot (22 de março de 2016 com 40912 entradas). Os parâmetros de pesquisa foram tolerância de massa de fragmento de 0,05 Da e massa de precursor de 10 ppm, número mínimo de peptídeos 2 e FDR (taxa de descoberta falsa) de 0,1%, permitindo 2 erros de clivagem em fragmentos de tripsina. A carbamidometilação em cisteína foi configurada como uma modificação fixa, e oxidação de metionina, acetilação do terminal N como modificações variáveis. Bibliotecas de peptídeos de varredura posicional e peptídeos individuais
GDP-L-fucose sintase
[00185] Uma biblioteca combinatória de decapeptídeos sintéticos de C-amida L-aminoácidos (AA) N-acetilados, em um formato de varredura posicional (200 misturas) e vinte e duas misturas duplas definidas foram preparadas. Peptídeos individuais (Fig. 4 e Fig. 6) foram sintetizados por “Peptides and Elephants GmbH” (Potsdam, Alemanha). RASGRP2
[00186] Uma biblioteca de decapeptídeos de L-AA de varredura posicional (N-acetilados e C-amida TPI 2040) foi preparada por métodos padronizados. Cada uma das 200 misturas da biblioteca foi testada quanto à sua atividade proliferativa por TCC14 a 40, 120 e 200 µg/ml usando o ensaio de incorporação de timidina. A restrição de TCC14 foi testada com células BLS transfectadas com haplótipo HLA-DR15 que expressam alelos HLA classe II (DR2a (= DRB5*01:01), DR2b (= DRB1*15:01) ou DQw6 (= DQB1*0602)), na medida em que o TCC é derivado de um paciente com MS homozigoto para HLA-DR15. A expressão de HLA classe II de linhagens de células BLS foi verificada com anticorpos específicos contra DR2a, DR2b e DQ e as células foram testadas negativas para micoplasma. Os resultados foram organizados em quatro matrizes (dados não mostrados): três matrizes, cada uma representando a atividade em uma das doses acima, e uma matriz usando a concentração para obter proliferação de 3 vezes para combinar todas as três doses e uma atividade única. Usando o processo de análise biométrica (Zhao e cols., 2001) contra o banco de dados de proteínas do transcriptoma do cérebro do paciente com MS 1154SA, foram geradas listas de peptídeos preditos para cada uma das quatro matrizes. Em função da grande quantidade de concordância entre as listas de preditos, um total de 92 peptídeos decaméricos distintos ocorreu dentro dos 50 peptídeos preditos principais em pelo menos uma lista de predição da matriz. Esses peptídeos foram escolhidos para serem sintetizados (por “Peptides and Elephants GmbH”, Potsdam, Alemanha) e testados. Células e condições de cultura
[00187] Células mononucleares derivadas do LCR em grande volume do paciente 1154SA foram expandidas como relatado previamente (Planas e cols., 2015). Resumidamente, 2.000 células por poço foram semeadas em placas de microtitulação de 96 poços com fundo em “U” junto com 2 x 105 PBMCs alogênicas irradiadas (45 Gy), 1 μg/ml de PHA-L (Sigma, St. Louis, MO) e sobrenadante de IL-2 (500 U/ml). O meio consistiu em IMDM (PAA) contendo 100 U/ml de penicilina/estreptomicina (PAA), 50 μg/ml de gentamicina (BioWhittaker, Cambrex), 2 mM de L-glutamina (Gibco, Invitrogen, Carlsbad, CA) e soro humano descomplementado termicamente 5% (PAA). Mais IL-2 era adicionada a cada 3-4 dias. Células T CD4+ que infiltram o LCR foram selecionadas positivamente usando glóbulos magnéticos anti-CD4 (“CD4 Micro Beads Human MACS”, Miltenyi Biotec Inc, CA, EUA) e reestimuladas mais uma vez com PHA-L, IL-2 e PBMCs alogênicas irradiadas.
[00188] TCC21.1 foi estabelecido de células infiltrantes do LCR e TCC14 de células T autoproliferantes derivadas de PBMCs, como descrito previamente (Planas e cols., 2015). Testagem de células T derivadas do LCR em grande volume de pacientes com CIS- e RRMS contra peptídeos de GDP-L-fucose sintase e mielina
[00189] Células mononucleares derivadas do LCR frescas em grande volume dos 31 pacientes com CIS/MS foram misturadas com 5 x 106 PBMCs alogênicas irradiadas e células T CD4+ foram selecionadas positivamente com glóbulos magnéticos anti-CD4. As frações CD4+ foram então semeadas a 1.500 células por poço em placas de microtitulação de 96 poços com fundo em “U” junto com 1,5 x 105 PBMCs alogênicas irradiadas, 1 μg/ml de PHA-L e sobrenadante de IL-2. O meio consistiu em RPMI 1640 sem Hepes (Pan-Biotech, Aidenbach, Alemanha) suplementado com 2 mM de glutamina (Pan-Biotech), aminoácidos não essenciais 1% (vol/vol) (Gibco), piruvato de sódio 1% (vol/vol) (Gibco), 50 μg/ml de penicilina- estreptomicina (Corning, NY, EUA), β-mercaptoetanol 0,00001% (Gibco) e soro humano 5% (Banco de Sangue da Basiléia). Mais IL-2 era adicionada a cada 4 dias. Os poços em crescimento foram transferidos para placas de 48 poços e finalmente para frasco de 75 cm3 até que as células ficassem totalmente em repouso (20-25 dias). As células foram altamente expandidas em uma rodada única de estimulação.
[00190] Para a análise adicional de peptídeos de GDP-L- fucose sintase e um peptídeo de RASGRP2 (13 dos “Exemplos”), o mesmo método foi realizado.
[00191] Uma BCL autóloga do paciente 1154SA foi gerada por transformação em EBV. As células BLS foram transfectadas com moléculas HLA classe II únicas, DR2a (DRA1*01:01, DRB5*01:01), DR2b (DRA1*01:01, DRB1*15:01) e DQw6 (DQA1*01:02, DQB1*06:02). Estimulação de célula T
[00192] As respostas de TCC às misturas únicas/duplas definidas de peptídeos ou decapeptídeos individuais foram testadas por semeadura em duplicata de 2 x 104 células T e 5 x 104 linhagens de células BLS ou BCL autólogas irradiadas ou 1 x 105 PBMCs irradiadas (como indicado) com ou sem misturas combinatórias de peptídeos ou decapeptídeos individuais. 2,5 μg/ml PHA e 10-7 M de PMA (Sigma), 1 μg/ml de anti-CD3 revestido na superfície (OKT3, Ortho Biotech Products, Raritan, NJ) e 0,5 μg/ml de anti-CD28 solúvel (Biolegend, San Diego, CA), e um Kit de Ativação de Célula T (glóbulos anti-CD3, anti-CD28, anti-CD2) (Miltenyi Biotec) serviram como controles positivos, como indicado.
[00193] A resposta de células T CD4+ que infiltram o LCR expandidas por PHA aos peptídeos de GDP-L-fucose sintase, de mielina e de CEF (Figura 6) foi testada por semeadura em quadruplicata de 6 x 104 células T e 2 x 105 PBMCs irradiadas autólogas com ou sem peptídeos. Para experimentos de EdU, BLS DRB1*15:01 foram usadas como APCs. O Kit de Ativação de Célula T foi usado como controle positivo.
[00194] Para a análise adicional de peptídeos de GDP-L- fucose sintase e de um peptídeo de RASGRP2 (13 dos “Exemplos”), o mesmo método foi realizado como para a resposta de células T CD4+ que infiltram o LCR expandidas por PHA à GDP-L-fucose sintase. Medição de citocina GDP-L-fucose sintase
[00195] Citocinas no sobrenadante de TCC21.1 estimulado e células do LCR expandidas foram medidas 48 h após estimulação usando o imunoensaio baseado em glóbulos “Human T Helper Cytokine Panel LEGENDplex” (Biolegend), ELISA de GM-CSF (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ) e ELISA de IL-3 (Biolegend) de acordo com as instruções do fabricante.
[00196] Para coloração intracelular de citocina, TCC21.1 foi analisado 48 h após estimulação. Após 5 h na presença do inibidor de transporte de proteína GolgiStop (BD Biosciences), células T foram marcadas com Live/Dead® Aqua (Invitrogen). Após fixação e permeabilização com Cytofix/Cytoperm (BD Biosciences), as células foram coradas com anticorpos contra CD4 (APC-Cy7, Biolegend), IFN-γ (FITC, Biolegend), IL-4 (PE, BD Bioscience), GM-CSF (APC, Biolegend) e IL-3 (PE, Biolegend) em PBS contendo saponina e BSA, e analisadas por citometria de fluxo.
[00197] Para a análise adicional de peptídeos de GDP-L- fucose sintase e um peptídeo de RASGRP2 (13 dos “Exemplos”), a secreção de IFN-γ no sobrenadante de células T que infiltram o LCR expandidas estimuladas e não estimuladas foi medida após 48 h de cultura usando ELISA de IFN-γ (Biolegend) por duplicata em todos os poços únicos de acordo com as instruções do fabricante. Respostas proliferativas GDP-L-fucose sintase
[00198] A proliferação foi medida 72 h após estimulação por incorporação de 3H-timidina (Hartmann Analytic, Braunschweig, Alemanha) em um contador de cintilação (Wallac 1450, PerkinElmer, Rodgau-Jurgesheim, Alemanha). O índice de estimulação (SI) foi calculado da seguinte forma: SI = Mediana (cpm de réplicas de peptídeo) / Mediana (cpm de réplicas sem peptídeo). A proliferação também foi medida usando um Kit de Ensaio de Citometria de Fluxo Click-iTTM EdU (APC, Molecular Probes, Invitrogen) seguindo as instruções do fabricante. As células foram coradas com os seguintes anticorpos anti-CD3 (PE-Cy-7, e-Bioscience, San
Diego, CA) e anti-TRBV-21 (FITC, Beckman Coulter, Brea, CA) e analisadas por citometria de fluxo. RASGRP2
[00199] As respostas proliferativas foram testadas como descrito sob 9.
[00200] Para a análise adicional de peptídeos de GDP-L- fucose sintase e um peptídeo de RASGRP2 (13 dos “Exemplos”), as respostas proliferativas foram medidas como descrito para GDP-L-fucose sintase acima. Expressão de receptor de superfície
[00201] TCC21.1 em repouso foi corado com anticorpos contra CD4 (PE-Texas Red, Thermo Fischer, Waltham, MA), TRBV21 (FITC, Beckman Coulter), CD28 (PE-Cy7, BioLegend), CCR4 (APC, BioLegend), CCR6 (BV785, BioLegend) e CRTh2 (PE, BioLegend) e analisado por citometria de fluxo. Análise citométrica de fluxo
[00202] A aquisição de amostras foi realizada usando um citômetro de fluxo LSR Fortessa (BD Biosciences) com o software Diva, e os dados foram analisados com FlowJo (Tree Star, Ashland, OR). RT-PCR e sequenciamento de rearranjos de TCR
[00203] A extração de RNA, transcrição reversa e sequenciamento de TCRα/β-cadeia (TRA/BV) de TCC21.1 foram avaliados como relatado previamente (Planas e cols., 2015). As designações do gene de TCR estão de acordo com a nomenclatura de IMGT (ImMunoGeneTics, www.IMGT.org).
HLA
[00204] Os indivíduos foram tipados para moléculas HLA- classe I e II em Histogenetics LLC, NY, EUA. O isolamento de DNA de sangue total com uma concentração final de 15 ng/μl foi realizado com um protocolo-padrão de isolamento de DNA usando um tampão de lise Triton e tratamento com proteinase K. As amostras foram tipadas para HLA classe I (A* e B*) e HLA classe II (DRB1*, DRB3*, DRB4*, DRB5*, DQA1* e DQB1*) usando tipagem de HLA baseada em sequência de alta resolução (SBT). As predições de ligação de HLA classe II foram feitas usando a ferramenta de consenso de recurso de análise IEDB. Análise estatística
[00205] A análise de três agrupamentos k-Means foi realizada nas pontuações dos pacientes para pacientes do grupo em três categorias. As associações entre níveis de resposta de peptídeos, pacientes e estado HLA foram todas efetuadas usando Teste Exato de Fisher com correção de Bonferroni-Holm aplicada como apropriado, com significância de 5%.
MODALIDADES
[00206] 1. Uma proteína GDP-L-fucose sintase ou uma proteína da família de proteínas RASGRP, ou um fragmento, derivado ou variante de splicing desta, ou uma sequência de nucleotídeos que codifica qualquer uma das proteínas ou fragmento, derivado ou variante de splicing destas, para uso no tratamento, diagnóstico e/ou prevenção de esclerose múltipla (MS).
[00207] Uma proteína GDP-L-fucose sintase ou uma proteína da família de proteínas RASGRP, em particular RASGRP2, ou um fragmento destas. É especialmente preferida.
[00208] 2. A proteína, fragmento, derivado ou variante de splicing de acordo com a modalidade 1,
[00209] em que a proteína GDP-L-fucose sintase: a) possui a sequência de aminoácidos como apresentada no
ID. DE SEQ.
Nº: 1 ou b) possui uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 85%, preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 95% idêntica à sequência de aminoácidos como apresentada no ID.
DE SEQ.
Nº: 1 ou c) possui uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70%, preferivelmente pelo menos 80%, mais preferivelmente pelo menos 90% homóloga à sequência de aminoácidos como apresentada no ID.
DE SEQ.
Nº: 1 ou d) possui uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 60%, preferivelmente pelo menos 70%, mais preferivelmente pelo menos 80%, ainda mais preferivelmente pelo menos 90% homóloga à sequência de aminoácidos como apresentada no ID.
DE SEQ.
Nº: 1 e a proteína ou fragmento ou variante de splicing desta se liga a um alelo HLA autólogo, é reconhecido por uma célula T e/ou é reconhecido por um anticorpo que se liga ou reconhece a sequência de aminoácidos como apresentada no ID.
DE SEQ.
Nº: 1 ou um fragmento deste ou e) é codificada por um gene TSTA3, em particular por uma sequência do gene do nucleotídeo 143612618 ao 143618048 de NC_000008.11, ou é codificada por um gene que é pelo menos 80%, preferivelmente pelo menos 90%, ainda mais preferivelmente pelo menos 95% idêntico à sequência do gene do nucleotídeo 143612618 ao 143618048 de NC_000008.11 e/ou em que o membro da família de proteínas RASGRP f) possui a sequência de aminoácidos como apresentada em qualquer um do ID.
DE SEQ.
Nº: 2, ID.
DE SEQ.
Nº: 3, ID.
DE SEQ.
Nº: 4, ID.
DE SEQ.
Nº: 5, ID.
DE SEQ.
Nº: 6, ID.
DE SEQ.
Nº: 7, ID.
DE SEQ.
Nº: 8 ou ID.
DE SEQ.
Nº: 9 ou g) possui uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 85%, preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 95% idêntica à sequência de aminoácidos como apresentada em qualquer um do ID.
DE SEQ.
Nº: 2, ID.
DE SEQ.
Nº: 3, ID.
DE SEQ.
Nº: 4, ID.
DE SEQ.
Nº: 5, ID.
DE SEQ.
Nº: 6, ID.
DE SEQ.
Nº: 7, ID.
DE SEQ.
Nº: 8 ou ID.
DE SEQ.
Nº: 9 ou h) possui uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70%, preferivelmente pelo menos 80%, mais preferivelmente pelo menos 90% homóloga à sequência de aminoácidos como apresentada em qualquer um do ID.
DE SEQ.
Nº: 2, ID.
DE SEQ.
Nº: 3, ID.
DE SEQ.
Nº: 4, ID.
DE SEQ.
Nº: 5, ID.
DE SEQ.
Nº: 6, ID.
DE SEQ.
Nº: 7, ID.
DE SEQ.
Nº: 8 ou ID.
DE SEQ.
Nº: 9 ou i) possui uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 60%, preferivelmente pelo menos 70%, mais preferivelmente pelo menos 80%, ainda mais preferivelmente pelo menos 90% homóloga à sequência de aminoácidos como apresentada em qualquer um do ID.
DE SEQ.
Nº: 2, ID.
DE SEQ.
Nº: 3, ID.
DE SEQ.
Nº: 4, ID.
DE SEQ.
Nº: 5, ID.
DE SEQ.
Nº: 6, ID.
DE SEQ.
Nº: 7, ID.
DE SEQ.
Nº: 8 ou ID.
DE SEQ.
Nº: 9 e a proteína ou fragmento ou variante de splicing desta se liga a um alelo HLA autólogo, é reconhecido por uma célula T e/ou é reconhecido por um anticorpo que se liga ou reconhece a respectiva sequência de aminoácidos como apresentada em qualquer um do ID.
DE SEQ.
Nº: 2, ID.
DE SEQ.
Nº: 3, ID.
DE SEQ.
Nº: 4, ID.
DE SEQ.
Nº: 5, ID.
DE SEQ.
Nº: 6, ID.
DE SEQ.
Nº: 7, ID.
DE SEQ.
Nº: 8 ou ID.
DE SEQ.
Nº: 9 ou um fragmento deste ou j) é codificada por um gene RASGRP, em particular por uma sequência do gene do nucleotídeo: - 38488101 a 38565575 de NC_000015.10, - 64726911 a 64745456 de NC_000011.10, - 33436324 a 33564750 de NC_000002.12, ou - 38409051 a 38426305 de NC_000019.10, ou é codificada por um gene que é pelo menos 80%, preferivelmente pelo menos 90%, ainda mais preferivelmente pelo menos 95% idêntico à sequência do gene do nucleotídeo: - 38488101 a 38565575 de NC_000015.10, - 64726911 a 64745456 de NC_000011.10, - 33436324 a 33564750 de NC_000002.12, ou - 38409051 a 38426305 de NC_000019.10.
[00210] A proteína GDP-L-fucose sintase com a sequência de aminoácidos como apresentada no ID. DE SEQ. Nº: 1 ou uma proteína com pelo menos 90% identidade ou um fragmento desta é especialmente preferida. Uma proteína RASGRP2 com a sequência de aminoácidos como apresentada no ID. DE SEQ. Nº: 2, ID. DE SEQ. Nº: 6, ID. DE SEQ. Nº: 7, ID. DE SEQ. Nº: 8 ou ID. DE SEQ. Nº: 9 ou uma proteína com pelo menos 90% identidade ou um fragmento desta também é especialmente preferida.
[00211] 3. A proteína, fragmento, derivado ou variante de splicing de acordo com a modalidade 1 ou 2, em que o fragmento compreende 5 a 50, preferivelmente 5 a 20, mais preferivelmente 10 a 15 aminoácidos, ainda mais preferivelmente 15 aminoácidos.
[00212] Um fragmento de um comprimento de 10 a 15 aminoácidos é particularmente preferido.
[00213] 4. A proteína, fragmento, derivado ou variante de splicing de acordo com a modalidade 2 ou 3, em que o fragmento é: a) pelo menos 85%, preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 95% idêntico a uma respectiva sequência de aminoácidos correspondente ou b) pelo menos 70%, preferivelmente pelo menos 80%, mais preferivelmente pelo menos 90% homólogo a uma respectiva sequência de aminoácidos correspondente ou c) pelo menos 60%, preferivelmente pelo menos 70%, mais preferivelmente pelo menos 80%, ainda mais preferivelmente pelo menos 90% homólogo a uma respectiva sequência de aminoácidos correspondente e se liga a um alelo HLA autólogo, é reconhecido por uma célula T e/ou é reconhecido por um anticorpo que se liga ou reconhece a respectiva sequência de aminoácidos.
[00214] É especialmente preferido que o fragmento seja pelo menos 90% idêntico à respectiva sequência de aminoácidos correspondente.
[00215] 5. A proteína, fragmento, derivado ou variante de splicing de acordo com qualquer uma das modalidades precedentes, em que o fragmento compreende uma sequência selecionada do grupo que compreende os IDS. DE SEQ. Nos: 10 a 98, preferivelmente os IDS. DE SEQ. Nos: 10 a 35, preferivelmente consiste em uma sequência selecionada do grupo que compreende o ID. DE SEQ. Nº: 10 a 98, preferivelmente os IDS. DE SEQ. Nos: 10 a 35.
[00216] O fragmento preferivelmente compreende uma sequência selecionada do grupo que compreende os IDS. DE SEQ. Nos: 10 a 35.
[00217] 6. A proteína, fragmento, derivado ou variante de splicing de acordo com qualquer uma das modalidades precedentes para identificação de um indivíduo humano que é adequado para tolerização aos autoantígenos na MS, preferivelmente MS inicial. É particularmente preferido usar a proteína ou fragmento desta.
[00218] 7. A proteína, fragmento, derivado ou variante de splicing de acordo com qualquer um de modalidades 1 a 5 para o diagnóstico de MS padrão II em um indivíduo humano. É particularmente preferido usar a proteína ou fragmento desta.
[00219] 8. Um carreador que compreende pelo menos uma proteína, fragmento, derivado, variante de splicing, sequência de nucleotídeos e/ou sequência gênica de acordo com qualquer um de modalidades 1 a 5. É particularmente preferido que o carreador compreenda pelo menos uma proteína, fragmento ou sequência de nucleotídeos.
[00220] 9. O carreador de acordo com a modalidade 8, em que o carreador é acoplado à (pelo menos uma) proteína, fragmento, derivado e/ou variante de splicing, e/ou o carreador contém a (pelo menos uma) proteína, fragmento, derivado, variante de splicing, sequência de nucleotídeos e/ou sequência gênica.
[00221] É particularmente preferido que o carreador seja acoplado à (pelo menos uma) proteína ou fragmento e/ou that o carreador contém a sequência de nucleotídeos.
[00222] 10. O carreador de acordo com a modalidade 8 ou 9, em que o carreador é selecionado do grupo que compreende uma célula, preferivelmente uma célula sanguínea, uma proteína, um lipídeo, um glicolipídeo, um glóbulo, uma nanopartícula, uma partícula vírus-like (VLP) e uma molécula, por exemplo, uma molécula de açúcar, e qualquer combinação destes.
[00223] O carreador é preferivelmente uma célula sanguínea.
[00224] 11. O carreador de acordo com a modalidade 10, em que a proteína, fragmento, derivado e/ou variante de splicing é expresso pela célula, preferivelmente pela célula sanguínea.
[00225] É especialmente preferido que a proteína seja expressa por uma célula sanguínea.
[00226] 12. O carreador de acordo com a modalidade 10 ou 11, em que a célula sanguínea é uma célula sanguínea vermelha ou branca.
[00227] 13. O carreador de acordo com qualquer um de modalidades 10 a 12, em que o carreador é uma célula sanguínea e a célula sanguínea é quimicamente acoplada por um agente de acoplamento, preferivelmente por 1-etil-3-(3- dimetilaminopropil)-carbodiimida (ECDI/EDC), à (pelo menos uma) proteína, fragmento, derivado e/ou variante de splicing. De preferência, a (pelo menos uma) proteína ou fragmento é acoplada por EDC a uma célula sanguínea.
[00228] 14. Um método de fabricação da célula sanguínea acoplada quimicamente da modalidade 13, que compreende o isolamento da célula sanguínea de um indivíduo humano, adição da (pelo menos uma) proteína, fragmento, derivado e/ou variante de splicing e subsequentemente adição do agente de acoplamento, preferivelmente EDC. De preferência, pelo menos uma proteína ou fragmento é adicionada.
[00229] 15. Uma composição farmacêutica que compreende pelo menos uma proteína, fragmento, derivado, variante de splicing, sequência de nucleotídeos e/ou sequência gênica de acordo com qualquer um de modalidades 1 a 5 e um carreador farmaceuticamente aceitável. A composição farmacêutica preferivelmente compreende pelo menos uma proteína ou fragmento desta ou uma sequência de nucleotídeos e um carreador farmaceuticamente aceitável.
[00230] 16. Um método para indução de tolerância antígeno-específica aos autoantígenos em um indivíduo humano que sofre ou está em risco para o desenvolvimento de MS que compreende a etapa de aplicação ao indivíduo humano de: a) pelo menos uma proteína, fragmento, derivado, variante de splicing, sequência de nucleotídeos e/ou sequência gênica de acordo com qualquer um de modalidades 1 a 5, e/ou b) pelo menos um carreador de acordo com qualquer um de modalidades 8 a 13.
[00231] É aplicado um método para indução de tolerância antígeno-específica é preferido, em que pelo menos uma proteína ou fragmento desta ou um carreador que é acoplado à (pelo menos uma) proteína ou fragmento e/ou um carreador que contém a sequência de nucleotídeos.
[00232] 17. O método de acordo com a modalidade 16, em que a (pelo menos uma) proteína, fragmento, derivado, variante de splicing, sequência de nucleotídeos e/ou sequência gênica é aplicada por administração nasal, inalada, oral, subcutânea (s.c.), intracelômica (i.c), intramuscular (i.m.), intradérmica (i.d.), transdérmica (t.d.) ou intravenosa (i.v.), preferivelmente por administração i.v., s.c., i.d., t.d., oral, inalada, nasal ou acoplada a um carreador, preferivelmente uma célula sanguínea vermelha.
[00233] 18. O método de acordo com a modalidade 16 ou 17 para indução de tolerância antígeno-específica aos autoantígenos na MS inicial.
[00234] 19. Um método para identificação de um indivíduo humano adequado para tolerização aos autoantígenos na MS, preferivelmente MS inicial, que compreende o isolamento de células T e/ou anticorpos do sangue, LCR ou outro fluido corporal do indivíduo e medição da reatividade das células T e/ou anticorpos contra a proteína, fragmento, derivado e/ou variante de splicing de acordo com qualquer um de modalidades 1 a 5. É particularmente preferido medir a reatividade das células T e/ou anticorpos contra um fragmento.
[00235] 20. O fragmento de acordo com qualquer um de modalidades 3 a 5, preferivelmente o fragmento de acordo com a modalidade 5, para uso como um medicamento. O fragmento particularmente compreende uma sequência selecionada do grupo que compreende os IDS. DE SEQ. Nos: 10 a 35.
[00236] 21. Uso da proteína, fragmento, derivado e/ou variante de splicing de acordo com qualquer um de modalidades 1 a 5 no diagnóstico in vitro de MS. É particularmente preferido usar a proteína ou um fragmento desta.
[00237] 22. Um método para diagnóstico de MS in vitro usando a proteína, fragmento, derivado e/ou variante de splicing de acordo com qualquer um de modalidades 1 a 5. É particularmente preferido usar a proteína ou um fragmento desta.
[00238] 23. Uso da proteína, fragmento, derivado e/ou variante de splicing de acordo com qualquer um de modalidades 1 a 5 na pré-testagem in vitro de um indivíduo humano diagnosticado com MS ou um indivíduo humano em risco para o desenvolvimento de MS. É particularmente preferido usar a proteína ou um fragmento desta.
[00239] 24. Uso da proteína, fragmento, derivado e/ou variante de splicing de acordo com qualquer um de modalidades 1 a 5 para a fabricação de um medicamento para o tratamento, diagnóstico e/ou prevenção de MS. É particularmente preferido usar a proteína ou um fragmento desta.
[00240] 25. Proteína, fragmento, derivado e/ou variante de splicing de acordo com qualquer um de modalidades 1 a 5, em que o derivado é uma sequência de aminoácidos que compartilha uma homologia ou identidade sobre seu comprimento inteiro com uma parte correspondente da sequência de aminoácidos de referência de pelo menos 75%, mais preferivelmente pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 93%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%.
[00241] 26. Um método in vitro para identificação de um indivíduo humano adequado para tolerização aos autoantígenos na MS, preferivelmente MS inicial, que compreende a medição da reatividade de células T e/ou anticorpos contra a proteína, fragmento, derivado e/ou variante de splicing de acordo com qualquer um de modalidades 1 a 5 com células T previamente obtidas e/ou anticorpos do sangue, LCR ou outro fluido corporal do indivíduo. É particularmente preferido usar a proteína ou um fragmento desta.
[00242] 27. A (pelo menos uma) proteína, fragmento, derivado, variante de splicing, sequência de nucleotídeos e/ou sequência gênica de acordo com qualquer um de modalidades 1 a 5, e/ou o (pelo menos um) carreador de acordo com qualquer um de modalidades 8 a 13 para uso em um método para indução de tolerância antígeno-específica aos autoantígenos em um indivíduo humano que sofre ou está em risco para o desenvolvimento de MS que compreende a etapa de aplicação ao indivíduo humano da (pelo menos uma) proteína, fragmento, derivado, variante de splicing, sequência de nucleotídeos e/ou sequência gênica de acordo com qualquer um de modalidades 1 a 5, e/ou o (pelo menos um) carreador de acordo com qualquer um de modalidades 8 a 13. É particularmente preferido usar a proteína ou um fragmento desta e/ou o (pelo menos um) carreador acoplado à proteína ou ao fragmento desta.
[00243] 28. A (pelo menos uma) proteína, fragmento, derivado, variante de splicing, sequência de nucleotídeos e/ou sequência gênica de acordo com a modalidade 27 e/ou o (pelo menos um) carreador de acordo com a modalidade 27, em que a (pelo menos uma) proteína, fragmento, derivado, variante de splicing, sequência de nucleotídeos e/ou sequência gênica é aplicada por administração nasal, inalada, oral, subcutânea (s.c.), intracelômica (i.c), intramuscular (i.m.), intradérmica (i.d.), transdérmica (t.d.) ou intravenosa (i.v.), preferivelmente por administração i.v., s.c., i.d., t.d., oral, inalada, nasal ou acoplada a um carreador, preferivelmente uma célula sanguínea vermelha. É particularmente preferido usar a proteína ou um fragmento desta e/ou o (pelo menos um) carreador acoplado à proteína ou ao fragmento desta.
[00244] 29. A (pelo menos uma) proteína, fragmento, derivado, variante de splicing, sequência de nucleotídeos e/ou sequência gênica de acordo com qualquer um de modalidades 1 a 5, e/ou o (pelo menos um) carreador de acordo com qualquer um de modalidades 8 a 13 para indução de tolerância antígeno-específica aos autoantígenos na MS inicial.
É particularmente preferido usar a proteína ou um fragmento desta e/ou o (pelo menos um) carreador acoplado à proteína ou ao fragmento desta.

Claims (20)

REIVINDICAÇÕES
1. Proteína GDP-L-fucose sintase ou uma proteína da família de proteínas RASGRP, ou um fragmento, derivado ou variante de splicing desta, ou uma sequência de nucleotídeos que codifica qualquer uma das proteínas ou fragmento, derivado ou variante de splicing desta, caracterizada por ser usada no tratamento, diagnóstico e/ou prevenção de esclerose múltipla (MS).
2. Proteína, fragmento, derivado ou variante de splicing para uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a proteína GDP-L-fucose sintase: a) possui a sequência de aminoácidos como apresentada no ID. DE SEQ. Nº: 1 ou b) possui uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 85%, preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 95% idêntica à sequência de aminoácidos como apresentada no ID. DE SEQ. Nº: 1 ou c) possui uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70%, preferivelmente pelo menos 80%, mais preferivelmente pelo menos 90% homóloga à sequência de aminoácidos como apresentada no ID. DE SEQ. Nº: 1 ou d) possui uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 60%, preferivelmente pelo menos 70%, mais preferivelmente pelo menos 80%, ainda mais preferivelmente pelo menos 90% homóloga à sequência de aminoácidos como apresentada no ID. DE SEQ. Nº: 1 e a proteína ou fragmento ou variante de splicing desta se liga a um alelo HLA autólogo, é reconhecido por uma célula T e/ou é reconhecido por um anticorpo que se liga ou reconhece a sequência de aminoácidos como apresentada no ID.
DE SEQ.
Nº: 1 ou um fragmento deste ou e) é codificada por um gene TSTA3, em particular por uma sequência do gene do nucleotídeo 143612618 ao 143618048 de NC_000008.11, ou é codificada por um gene que é pelo menos 80%, preferivelmente pelo menos 90%, ainda mais preferivelmente pelo menos 95% idêntico à sequência do gene do nucleotídeo 143612618 ao 143618048 de NC_000008.11 e/ou em que o membro da família de proteínas RASGRP: f) possui a sequência de aminoácidos como apresentada em qualquer um do ID.
DE SEQ.
Nº: 2, ID.
DE SEQ.
Nº: 3, ID.
DE SEQ.
Nº: 4, ID.
DE SEQ.
Nº: 5, ID.
DE SEQ.
Nº: 6, ID.
DE SEQ.
Nº: 7, ID.
DE SEQ.
Nº: 8 ou ID.
DE SEQ.
Nº: 9 ou g) possui uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 85%, preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 95% idêntica à sequência de aminoácidos como apresentada em qualquer um do ID.
DE SEQ.
Nº: 2, ID.
DE SEQ.
Nº: 3, ID.
DE SEQ.
Nº: 4, ID.
DE SEQ.
Nº: 5, ID.
DE SEQ.
Nº: 6, ID.
DE SEQ.
Nº: 7, ID.
DE SEQ.
Nº: 8 ou ID.
DE SEQ.
Nº: 9 ou h) possui uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70%, preferivelmente pelo menos 80%, mais preferivelmente pelo menos 90% homóloga à sequência de aminoácidos como apresentada em qualquer um do ID.
DE SEQ.
Nº: 2, ID.
DE SEQ.
Nº: 3, ID.
DE SEQ.
Nº: 4, ID.
DE SEQ.
Nº: 5, ID.
DE SEQ.
Nº: 6, ID.
DE SEQ.
Nº: 7, ID.
DE SEQ.
Nº: 8 ou ID.
DE SEQ.
Nº: 9 ou i) possui uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 60%, preferivelmente pelo menos 70%, mais preferivelmente pelo menos 80%, ainda mais preferivelmente pelo menos 90%
homóloga à sequência de aminoácidos como apresentada em qualquer um do ID. DE SEQ. Nº: 2, ID. DE SEQ. Nº: 3, ID. DE SEQ. Nº: 4, ID. DE SEQ. Nº: 5, ID. DE SEQ. Nº: 6, ID. DE SEQ. Nº: 7, ID. DE SEQ. Nº: 8 ou ID. DE SEQ. Nº: 9 e a proteína ou fragmento ou variante de splicing desta se liga a um alelo HLA autólogo, é reconhecido por uma célula T e/ou é reconhecido por um anticorpo que se liga ou reconhece a respectiva sequência de aminoácidos como apresentada em qualquer um do ID. DE SEQ. Nº: 2, ID. DE SEQ. Nº: 3, ID. DE SEQ. Nº: 4, ID. DE SEQ. Nº: 5, ID. DE SEQ. Nº: 6, ID. DE SEQ. Nº: 7, ID. DE SEQ. Nº: 8 ou ID. DE SEQ. Nº: 9 ou um fragmento deste ou j) é codificada por um gene RASGRP, em particular por uma sequência do gene do nucleotídeo: - 38488101 a 38565575 de NC_000015.10, - 64726911 a 64745456 de NC_000011.10, - 33436324 a 33564750 de NC_000002.12, ou - 38409051 a 38426305 de NC_000019.10, ou é codificada por um gene que é pelo menos 80%, preferivelmente pelo menos 90%, ainda mais preferivelmente pelo menos 95% idêntico à sequência do gene do nucleotídeo: - 38488101 a 38565575 de NC_000015.10, - 64726911 a 64745456 de NC_000011.10, - 33436324 a 33564750 de NC_000002.12, ou - 38409051 a 38426305 de NC_000019.10.
3. Proteína, fragmento, derivado ou variante de splicing para uso, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que o fragmento compreende 5 a 50, preferivelmente 5 a 20, mais preferivelmente 10 a 15 aminoácidos, ainda mais preferivelmente 15 aminoácidos.
4. Proteína, fragmento, derivado ou variante de splicing para uso, de acordo com a reivindicação 2 ou 3, caracterizada pelo fato de que o fragmento é: a) pelo menos 85%, preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 95% idêntico a uma respectiva sequência de aminoácidos correspondente ou b) pelo menos 70%, preferivelmente pelo menos 80%, mais preferivelmente pelo menos 90% homólogo a uma respectiva sequência de aminoácidos correspondente ou c) pelo menos 60%, preferivelmente pelo menos 70%, mais preferivelmente pelo menos 80%, ainda mais preferivelmente pelo menos 90% homólogo a uma respectiva sequência de aminoácidos correspondente e se liga a um alelo HLA autólogo, é reconhecido por uma célula T e/ou é reconhecido por um anticorpo que se liga ou reconhece a respectiva sequência de aminoácidos.
5. Proteína, fragmento, derivado ou variante de splicing para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que o fragmento compreende uma sequência selecionada do grupo que compreende os IDS. DE SEQ. Nos: 10 a 98, preferivelmente os IDS. DE SEQ. Nos: 10 a 35, preferivelmente consiste em uma sequência selecionada do grupo que compreende o ID. DE SEQ. Nº: 10 a 98, preferivelmente os IDS. DE SEQ. Nos: 10 a 35.
6. Proteína, fragmento, derivado ou variante de splicing para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada por ser usada para identificação de um indivíduo humano que é adequado para tolerização aos autoantígenos na MS, preferivelmente MS inicial.
7. Proteína, fragmento, derivado ou variante de splicing para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado por ser usado para o diagnóstico de MS padrão II em um indivíduo humano.
8. Transportador caracterizado por compreender pelo menos uma proteína, fragmento, derivado, variante de splicing, sequência de nucleotídeos e/ou sequência gênica conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5 para uso no tratamento, diagnóstico e/ou prevenção de MS.
9. Transportador, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o carreador é acoplado à pelo menos uma proteína, fragmento, derivado e/ou variante de splicing, e/ou o carreador contém a pelo menos uma proteína, fragmento, derivado, variante de splicing, sequência de nucleotídeos e/ou sequência gênica.
10. Transportador, de acordo com a reivindicação 8 ou 9, caracterizado pelo fato de que o carreador é selecionado do grupo que compreende uma célula, preferivelmente uma célula sanguínea, uma proteína, um lipídeo, um glicolipídeo, um glóbulo, uma nanopartícula, uma partícula vírus-like (VLP) e uma molécula, por exemplo, uma molécula de açúcar, e qualquer combinação destes.
11. Transportador, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a proteína, fragmento, derivado e/ou variante de splicing é expresso pela célula, preferivelmente pela célula sanguínea.
12. Transportador, de acordo com a reivindicação 10 ou 11, caracterizado pelo fato de que a célula sanguínea é uma célula sanguínea vermelha ou branca.
13. Transportador, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 12, caracterizado pelo fato de que o carreador é uma célula sanguínea e a célula sanguínea é quimicamente acoplada por um agente de acoplamento, preferivelmente por 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)- carbodiimida (ECDI/EDC), à pelo menos uma proteína, fragmento, derivado e/ou variante de splicing.
14. Método de fabricação da célula sanguínea acoplada quimicamente, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado por compreender o isolamento da célula sanguínea de um indivíduo humano, adição da pelo menos uma proteína, fragmento, derivado e/ou variante de splicing e subsequentemente adição do agente de acoplamento, preferivelmente EDC.
15. Composição farmacêutica, caracterizada por compreender pelo menos uma proteína, fragmento, derivado, variante de splicing, sequência de nucleotídeos e/ou sequência gênica conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 5 e um carreador farmaceuticamente aceitável.
16. Método caracterizado por ser usado para indução de tolerância antígeno-específica aos autoantígenos em um indivíduo humano que sofre de ou em risco para o desenvolvimento de MS que compreende a etapa de aplicação ao indivíduo humano de: a) pelo menos uma proteína, fragmento, derivado, variante de splicing, sequência de nucleotídeos e/ou sequência gênica conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, e/ou b) pelo menos um carreador conforme definido em qualquer uma das reivindicações 8 a 13.
17. Método, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que a pelo menos uma proteína, fragmento, derivado, variante de splicing, sequência de nucleotídeos e/ou sequência gênica é aplicada por administração nasal, inalada, oral, subcutânea (s.c.), intracelômica (i.c), intramuscular (i.m.), intradérmica (i.d.), transdérmica (t.d.) ou intravenosa (i.v.), preferivelmente por administração i.v., s.c., i.d., t.d., oral, inalada, nasal ou acoplada a um carreador, preferivelmente uma célula sanguínea vermelha.
18. Método, de acordo com a reivindicação 16 ou 17, caracterizado por ser usado para indução de tolerância antígeno-específica aos autoantígenos na MS inicial.
19. Método para identificação de um indivíduo humano adequado para tolerização aos autoantígenos na MS, preferivelmente MS inicial, caracterizado por compreender o isolamento de células T e/ou anticorpos do sangue, LCR ou outro fluido corporal do indivíduo e medição da reatividade das células T e/ou anticorpos contra a proteína, fragmento, derivado e/ou variante de splicing conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5.
20. Fragmento, de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 5, preferivelmente o fragmento de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por ser usado como um medicamento.
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Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112710843B (zh) * 2020-12-16 2022-11-04 江苏伟禾生物科技有限公司 一种测定群体反应性抗体检测的板式免疫荧光试剂盒及其制备方法
EP4119948A1 (en) * 2021-07-16 2023-01-18 Universität Zürich Method for stratification and treatment of multiple sclerosis
WO2023285617A1 (en) * 2021-07-16 2023-01-19 Universität Zürich Method for stratification and treatment of multiple sclerosis
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Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5932443A (en) * 1997-09-26 1999-08-03 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Human antigens
JP2001145488A (ja) * 1999-11-19 2001-05-29 Natl Inst Of Advanced Industrial Science & Technology Meti シロイヌナズナ由来のｇｄｐ−４−ケト−６−デオキシ−ｄ−マンノース−３，５−エピメラーゼ−４−レダクターゼ遺伝子
JP2006141297A (ja) * 2004-11-19 2006-06-08 Eiken Chem Co Ltd 血管新生を検出するためのマーカー
WO2007013359A2 (en) * 2005-07-28 2007-02-01 Oncotherapy Science, Inc. Cancer related gene rasgef1a
EP2057998A1 (en) 2007-10-31 2009-05-13 Universitätsklinikum Hamburg-Eppendorf Use of modified cells for the treatment of multiple sclerosis
EP2437060A1 (de) * 2010-10-01 2012-04-04 Protagen AG Markersequenzen für Multiple Sklerose und deren Verwendung
DE102010042359A1 (de) * 2010-10-12 2012-04-12 Protagen Ag Markersequenzen für Multiple Sklerose und deren Verwendung
CA2922958A1 (en) * 2013-09-12 2015-03-19 Teva Pharmaceutical Industries Ltd. Gene expression biomarkers of laquinimod responsiveness
CN107502615B (zh) * 2017-10-16 2020-05-05 中国海洋大学 海带中编码gdp-甘露糖-4,6-脱水酶的基因、及其蛋白质和用途

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