BR112020025699A2 - Método para produção de um queijo com quantidade reduzida de galactose - Google Patents
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Abstract
a presente invenção refere-se a um método para produção de um queijo com quantidade reduzida de galactose compreendendo inocular leite com bactérias streptococcus thermophilus gal(+) e bactérias lactobacillus gal(+) lac(-) bactéria.
Description
Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODO PARA PRODUÇÃO DE UM QUEIJO COM QUANTIDADE REDUZIDA DE GALACTOSE".
[0001] A presente invenção refere-se a um método para produção de um queijo com quantidade reduzida de galactose compreendendo inocular leite com bactérias Streptococcus thermophilus Gal(+) e bactérias Lactobacillus Gal(+) Lac(-).
[0002] A indústria de alimentos usa numerosas bactérias, em particular, bactéria láctica, de modo a aperfeiçoar, por exemplo, o sabor e a textura dos alimentos. No caso da indústria leiteira, bactérias de ácido láctico são usadas intensivamente de modo a proporcionar a acidificação do leite (por fermentação), mas também de modo a, por exemplo, texturizar o produto em que elas são incorporadas.
[0003] Composição/mistura de cultura inicial para produzir queijo mussarela geralmente compreende a bactéria de ácido láctico (LAB) Streptococcus thermophilus (ST) – ela pode as vezes também compreender, por exemplo, estirpes relevantes de Lactobacillus-.
[0004] Uma concentração relativamente alta de galactose pode resultar em "douramento" durante aquecimento de queijos à medida que é frequentemente descrito quando, por exemplo, queijo mussarela é produzido por S. thermophilus (ST) para, por exemplo, produção de pizza.
[0005] O fenômeno de douramento é acreditado ser devido à reação de Maillard onde galactose como açúcar de redução está reagindo com amino ácidos/peptídeos.
[0006] Além deste maior problema durante queijo para produção de pizza, quantidades em excesso de galactose livre podem também conduzir a problemas de pós acidificação e desequilíbrio na flora de outro produto de leiteria, tal como, por exemplo, queijos macios.
[0007] Conforme conhecido na técnica, na espécie S. Thermophilus, galactose é excretada via o sistema lactose/galactose (ver desenho esquemático de metabolismo lac/gal na Figura 1 aqui). Para 1 mol de lactose ocupado pela célula, 1 mol de galactose pode ser excretado.
[0008] Muitos produtores de pizza assam pizza a temperaturas >260°C. Nestas altas temperaturas, a propensidade do queijo dourar excessivamente tem se tornado um problema particular para a indústria de mussarela.
[0009] O artigo de Hassan et al. (International Journal of Food Microbiology 64 (2001) 199-203) descreve que a capacidade de algumas estirpes de S. thermophilus (ST) usar galactose na produção de cápsula pode reduzir o douramento do queijo mussarela durante assamento por remoção de uma fonte de açúcar de redução.
[0010] WO2011/026863A1 (Chr. Hansen) e W02011/092300A1 (Chr. Hansen) descrevem que estirpes S. thermophilus (ST) com mutações no gene GalK (galactocinase) gera uma viscosidade mais alta no leite fermentado. Nenhuma destas duas publicações WO descritas acima discute problema de douramento relacionado a queijo mussarela.
[0011] W02013/160413A1 (Chr. Hansen) aqui descrito discute estirpe Streptococcus thermophilus (ST) CHCC14994, que foi depositada em 3 de abril de 2012 sob o No. de acesso DSM 25838. A estirpe CHCC14994 é descrita como a assim denominada "estirpe mãe" adequada para ser usada como uma estirpe de partida para ser mutada de modo a obter novas estirpes mutadas com "mutação na sequência de DNA do gene glcK". Consequentemente, a estirpe CHCC14994/DSM25838 não é revelada estar presente/compreendida em uma composição de cultura inicial não para ser usada na manufatura de um alimento ou produto de alimentação de interesse (por exemplo, um produto de leiteria).
[0012] O resumo do artigo de Mukherjee et al. (1994, J Dairy Sei 77:2839-2849) lê: "Os objetivos deste estudo foram isolar fermentação de galactose, estirpes de não-liberação de galactose de Streptococcus e Lactobacillus, e usar estas estirpes como culturas iniciais na manufatura de Queijo mussarela de baixo douramento". Conforme discutido no artigo, as estirpes Streptococcus thermophilus e Lactobacillus isoladas são caracterizadas como fermentação de galactose [Gal(+)] (ver, por exemplo, Tabela 2).
[0013] Conforme conhecido na técnica, Lactobacillus é normalmente/naturalmente capaz de fermentar lactose [isto é, Lac(+)], e no artigo discutido acima de Mukherjee não foi classificado/selecionado especificamente para "não capacitar fermentar lactose" [isto é, estirpes Lac(-)] Lactobacillus – consequentemente, não existe razão para acreditar que as estirpes de Lactobacillus isoladas (por exemplo, JM21 e JM31 – ver, por exemplo, Tabela 2) do artigo de Mukherjee são estirpes de Lactobacillus Lac(-).
[0014] O artigo de Mukherjee lê na página 2847, coluna direita: "Durante tratamentos de controle e experimental neste estudo, o teor de lactose também caiu marcadamente" – isto implicitamente pode ser visto como demonstrando que as estirpes isoladas de Lactobacillus do artigo de Mukherjee são estirpes Lactobacillus Lac(+).
[0015] Em resumo, nenhum dos documentos da técnica anterior acima discutidos descreve um método para produção de um queijo com quantidade reduzida de galactose compreendendo inocular leite com bactérias Streptococcus thermophilus (ST) Gal(+) e bactérias Lactobacillus (Lb.) Gal(+) Lac(-).
[0016] O problema a ser solucionado pela presente invenção é proporcionar um método aperfeiçoado para produção de um queijo com quantidade reduzida de galactose (para, por exemplo, obter menos douramento durante tratamento térmico).
[0017] A solução é baseada em que os presentes inventores identificaram que por inoculação de leite com bactérias Streptococcus thermophilus (ST) Gal(+) e bactérias Lactobacillus (Lb.) Gal(+) Lac(-), é possível obter uma redução significante de galactose conforme comparado a uso de ST Gal(+) e Lb. Gal(+) Lac(+) conforme descrito na técnica anterior (ver, por exemplo, discussão acima do artigo de Mukherjee et al.).
[0018] Conforme discutido em, por exemplo, Exemplo de operação 3 aqui – pelo uso de ST Gal(+) e Lb. Gal(+) Lac(-), de acordo com a presente invenção, foi possível obter 64% de redução de galactose conforme comparado ao uso de ST Gal(+) e Lb. Gal(+) Lac(+) conforme descrito na técnica anterior.
[0019] É submetido que sem o conhecimento da presente invenção relacionado a esta redução significante de galactose, a pessoa versada na técnica não teria considerado usar bactéria Lb. Gal(+) Lac(-), de acordo com a presente invenção.
[0020] Sem estar limitado à teoria – uma razão para qual seria prima facie considerada indesejado usar bactéria Lb. Lac(-) se relaciona àquela capacidade de fermentar lactose (Lac(+)) é geralmente considerada uma propriedade útil de Lactobacillus devido a ele poder ajudar na assim denominada acidificação (redução de pH).
[0021] Uma teoria para explanar a redução significante aqui discutida de galactose pode ser que os Lac(-) Lactobacillus são "forçados" a usar galactose para crescimento e, desse modo, remover mais galactose – isto é, ambos ST Gal(+) e Lb. Gal(+) Lac(-) removem a galactose.
[0022] Em relação a esta teoria, pode-se no presente contexto denotar a bactéria Lb. Gal(+) Lac(-) como assim denominada "sequestrantes" de galactose.
[0023] Conforme discutido nos Exemplos de operação aqui – estirpe aqui depositada ST CHCC4323 (número de registro DSM 32826) é aqui uma assim denominada estirpe de referência, que em resumo pode ser visto como uma estirpe de referência de galactose negativa ST Gal (-) que corresponde a uma hoje comercialmente relevante usada estirpe ST para produção de queijo mussarela.
[0024] Consequentemente, um primeiro aspecto da invenção se relaciona a um método para produção de um queijo com quantidade reduzida de galactose compreendendo as seguintes etapas:
[0025] (a): inocular leite com:
[0026] (I): bactérias Streptococcus thermophilus (ST), caracterizadas pelo que as bactérias ST são capazes de reduzirem por pelo menos 10% as quantidades de galactose excretada no leite conforme comparado a bactéria de referência ST CHCC4323 (DSM 32826) (aqui denominada " bactéria ST Gal(+)");
[0027] em que o teste comparativo é realizado pelo que as bactérias ST são inoculadas em leite de vaca desnatado 1% de culturas noturnas e incubadas por 18 horas a 37°C e no final da fermentação, amostras são tomadas para medir teor de galactose no leite fermentado, e, desse modo, medir a redução de galactose excretada comparado à CHCC4323 de referência; e
[0028] (II): bactérias Lactobacillus (Lb.), caracterizadas pelo que as bactérias Lb. são capazes de fermentar galactose, mas não capazes de fermentar lactose (aqui denominada "bactéria Lb. Gal(+) Lac(-)");
[0029] em que "capacidade de fermentar galactose" é medida pelo que as bactérias Lb. são inoculadas em meio MRS (De Man, Rogosa e Sharpe) contendo 1% de galactose como hidrato de carbono único 1% de culturas noturnas e incubadas por 24 horas a 37°C e no final da fermentação, amostras são tomadas para medir pH, e se o pH diminuiu por pelo menos 0,5, então é o Lb, "capacidade de fermentar galactose" (aqui denominada "bactéria LB. Gal(+)"); e no qual "não capacidade de fermentar lactose" é medida pelo que as bactérias Lb. são inoculadas em meio MRS contendo 1% de lactose como hidrato de carbono único 1% de culturas noturnas e incubadas por 18 horas a 37°C e no final da fermentação, amostras são tomadas para medir pH, e se o pH não diminuiu por mais do que 1,0, então é o Lb, "não capacidade de fermentar lactose" (aqui denominada "bactéria LB. Lac(-)"); e
[0030] (b):fermentar o leite com a bactéria de (a); e
[0031] (c): produzir etapas adequadas adicionais para finalmente acabar com o queijo produzido com quantidade reduzida de galactose.
[0032] O teste de bactéria ST Gal(+) de acordo com "(a) (I)" do primeiro aspecto pode ser considerado um teste Padrão aqui relevante que rotineiramente pode ser realizado pela pessoa versada na técnica.
[0033] Acredita-se que um número da bactéria ST Gal(+) descrita na técnica anterior acima discutida cumpriria com o teste de ST Gal(+) – isto é, baseado na técnica anterior e aqui- na informação técnica proporcionada, pode ser considerado como trabalho relativamente de rotina obter bactéria ST Gal(+) que cumpre com o teste comparativo de "(a) (I)" do primeiro aspecto.
[0034] No Exemplo de operação 1 aqui é descrito um método para obter bactérias diferentes ST Gal(+) que cumprem com o teste comparativo da etapa "(a) (I)" do primeiro aspecto – isto é, o teste comparativo da etapa "(a) (I)" do primeiro aspecto é, de preferência, realizado de acordo com o Exemplo 1.
[0035] O teste de bactéria Lb. Gal(+) Lac(-) de acordo com "(a) (II)" do primeiro aspecto pode ser considerado um teste Padrão aqui relevante que rotineiramente pode ser realizado pela pessoa versada na técnica.
[0036] Acredita-se que um número da bactéria Lb. Gal(+) descrita na técnica anterior acima discutida (por exemplo, artigo acima discutido Mukherjee et al.) cumpriria com o teste de Lb. Gal(+) - isto é, baseado na técnica anterior e informação técnica aqui proporcionada pode ser considerada como trabalho relativamente de rotina para obter bactéria Lb. Gal(+) que cumpre com o teste comparativo de "(a) (II)" do primeiro aspecto.
[0037] O Exemplo de Operação 2 aqui descreve um método para obter "bactéria Lb. Gal(+) Lac(-)" da etapa "(a) (II)" do primeiro aspecto, e o método pode ser considerado como baseado em técnicas de rotina do técnico no assunto - isto é, baseado na técnica anterior e informação técnica aqui proporcionada pode ser considerada como trabalho relativamente de rotina para obter bactéria Lb. Gal(+) Lac(-) que cumpre com o teste comparativo de "(a) (II)" do primeiro aspecto. O teste da etapa "(a) (II)" do primeiro aspecto é, de preferência, realizado de acordo com o Exemplo 2.
[0038] Meio MRS (De Man, Rogosa e Sharpe) é um meio bem conhecido para crescimento de bactéria Lactobacillus (Lb.) (ver, por exemplo, de Man, J.D.; Rogosa, M.; Sharpe, M.E. (1960). "A Medium for the Cultivation of Lactobacilli". J Appl Bact. 23 (130-135)).
[0039] Conforme conhecido na técnica, o meio MRS normalmente contém (p/v): 1,0% de peptona 1,0% de extrato de carne bovina
0,4% de extrato de levedura 2,0% de glicose 0,5% de tri-hidrato de acetato de sódio 0,1% de polisorbato 80 (também conhecido como Tween 80) 0,2% de hidrogenofosfato dipotássico 0,2% de citrato de triamônio 0,02% de sulfato de magnésio heptahidrato 0,005% de sulfato de manganês heptahidrato 1,0% de agar.
[0040] Consequentemente e conforme compreendido pela pessoa versada na técnica no presente contexto - "meio MRS contendo 1% de galactose como hidrato de carbono único" é simplesmente meio MRS conforme acima, no qual os "2,0% de glicose" é mudado para "1% de galactose", e "meio MRS contendo 1% de lactose como hidrato de carbono único" é simplesmente meio MRS conforme acima, no qual os "2,0% de glicose" é mudado para "1% de lactose". No exemplo de operação 2 aqui foi usado MRS com um pH de ao redor de 6,8, que pode ser considerado um valor de pH normal/padrão para MRS no presente contexto - isto é, o valor do pH do MRS deve estar ao redor de pH 6,8.
[0041] A Etapa (b) "fermentação do leite com a bactéria de (a)" e etapa (c) "produção de etapas adequadas adicionais para finalmente acabar com o queijo produzido com quantidade reduzida de galactose" do primeiro aspecto podem ser feitas de acordo com a técnica - isto é, estas etapas são bem conhecidas ao técnico no assunto, e o técnico no assunto sabe como realizá-las em relação a produzir um queijo preferido de interesse (por exemplo, queijo mussarela).
[0042] A Concretização da presente invenção é descrita abaixo, por meio de exemplos somente.
[0043] Figura 1: Desenho esquemático de metabolismo de lac/gal;
[0044] Figura 2: A fotografia mostra uma diferença evidente no douramento entre CFICC4323 de controle e a cultura de redução de douramento CFICC27912/CFICC3402 da presente invenção. Para detalhes adicionais ver Exemplo 4 aqui.
[0045] Figura 3: A fotografia mostra uma diferença evidente no douramento entre o CFICC9861 de referência e a cultura experimental com CFICC27912/CFICC27906. Para detalhes adicionais ver Exemplo 5 aqui.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO Estirpes/células depositadas
[0046] Uma amostra da célula de Streptococcus thermophilus CHCC14994 foi depositada no DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffen- str. 7B, D-38124 Braunschweig) sob o número de acesso DSM 25838 com uma data de depósito de 3 de abril de 2012. O depósito foi feito sob as condições do Tratado de Budapeste no Reconhecimento Internacional do Depósito de Microorganismos para Fins de Procedimento de Patente.
[0047] Uma amostra da célula de Streptococcus thermophilus CHCC19097 foi depositada no DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffen- str. 7B, D-38124 Braunschweig) sob o número de acesso DSM 32594 com uma data de depósito de 22 de agosto de 2017. O depósito foi efetuado sob as condições do Tratado de Budapeste no Reconhecimento Internacional do Depósito de Microorganismos para Fins de Procedimento de Patente.
[0048] Uma amostra da célula de Streptococcus thermophilus CHCC19100 foi depositada no DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffen- str. 7B, D-38124
Braunschweig) sob o número de acesso DSM 32595 com a data de depósito de 22 de agosto de 2017. O depósito foi efetuado sob as condições do Tratado de Budapeste no Reconhecimento Internacional do Depósito de Microorganismos para Fins de Procedimento de Patente.
[0049] Uma amostra da célula de Streptococcus thermophilus CHCC27912 foi depositada no DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffen- str. 7B, D-38124 Braunschweig) sob o número de acesso DSM 32596 com a data de depósito de 22 de agosto de 2017. O depósito foi efetuado sob as condições do Tratado de Budapeste no Reconhecimento Internacional do Depósito de Microorganismos para Fins de Procedimento de Patente.
[0050] Uma amostra da célula de Streptococcus thermophilus CHCC29526 foi depositada no DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffen- str. 7B, D-38124 Braunschweig) sob o número de acesso DSM 32597 com a data de depósito de 22 de agosto de 2017. O depósito foi efetuado sob as condições do Tratado de Budapeste no Reconhecimento Internacional do Depósito de Microorganismos para Fins de Procedimento de Patente.
[0051] Uma amostra da célula de Streptococcus thermophilus CHCC29530 foi depositada no DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffen- str. 7B, D-38124 Braunschweig) sob o número de acesso DSM 32598 com uma data de depósito de 22 de agosto de 2017. O depósito foi efetuado sob as condições do Tratado de Budapeste no Reconhecimento Internacional do Depósito de Microorganismos para Fins de Procedimento de Patente.
[0052] Uma amostra da célula Lactobacillus paracasei CHCC6272 foi depositada no DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig) sob o número de acesso DSM 16572 com a data de depósito de 13 de julho de 2004. O depósito foi efetuado sob as condições do Tratado de Budapeste no Reconhecimento Internacional do Depósito de Microorganismos para Fins de Procedimento de Patente.
[0053] Uma amostra da célula de Lactobacillus rhamnosus CHCC3402 foi depositada sob o número de acesso ATCC53103. Esta estirpe é comercialmente disponível sob a marca LGG® (https://www.lgq.com/) - isto é, comercialmente disponível de, por exemplo, Chr. Hansen A/S, Denmark.
[0054] As estirpes depositadas abaixo são estirpes que pela primeira vez foram depositadas em relação ao presente pedido - isto é, elas são novas estirpes como tal.
[0055] Uma amostra da nova célula de Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis CHCC27906 foi depositada no DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig) sob o número de acesso DSM 32831 com a data de depósito de 5 de junho 2018. O depósito foi efetuado sob as condições do Tratado de Budapeste no Reconhecimento Internacional do Depósito de Microorganismos para Fins de Procedimento de Patente.
[0056] Uma amostra da nova célula de Streptococcus thermophilus CHCC4323 foi depositada no DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig) sob o número de acesso DSM 32826 com a data de depósito de 5 de junho de 2018. O depósito foi efetuado sob as condições do Tratado de Budapeste no Reconhecimento Internacional do Depósito de Microorganismos para Fins de Procedimento de Patente.
[0057] Um aspecto da invenção se relaciona a uma célula de Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis CHCC27906 depositada com número de registro DSM 32831.
[0058] Um aspecto da invenção se relaciona a um método para obter uma célula de estirpe mutante Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis CHCC27906 depositada com número de registro DSM 32831 compreendendo usar a estirpe depositada como estirpe de partida, produzindo mutantes da estirpe depositada e isolando uma nova estirpe mutante, no qual a estirpe mutante retêm a propriedade de ser Lb. Gal(+) Lac(-) da estirpe depositada. Queijo
[0059] De preferência, o queijo é produzido pelo uso de leite de vaca ou leite de cabra (de preferência, leite de vaca) - isto é, a etapa (a) do primeiro aspecto, de preferência, se relaciona a inoculação de leite de vaca ou cabra (de preferência, vaca) com a bactéria ST Gal(+) e a bactéria Lb. Gal(+) Lac(-).
[0060] Em uma concretização preferida, o queijo é queijo mole, cheddar queijo, queijo de pasta filata, queijo para pizza, ou queijo mussarela - mais de preferência, o queijo é queijo de pasta filata, queijo cheddar, queijo para pizza, ou queijo mussarela – mais de preferência, o queijo é queijo mussarela (de preferência, usado para fazer pizza), queijo para pizza, ou queijo cheddar (de preferência, usado para fazer pizza).
[0061] Conforme discutido acima, uma concentração relativamente alta de galactose pode resultar em "douramento" durante aquecimento dos queijos.
[0062] Consequentemente, o queijo pode, de preferência, ser um queijo usado em um processo (por exemplo, para fazer pizza) envolvendo uma etapa de aquecimento a uma temperatura acima de 40°C, tal como acima de 50°C, ou tal como acima 70°C.
[0063] Conforme conhecido na técnica, por exemplo, queijo de pasta filata, queijo para pizza, e/ou queijo mussarela são exemplos de queijos que podem ser usados em um processo envolvendo uma etapa de aquecimento a uma temperatura acima de 50°C.
[0064] Conforme discutido acima, muitos fabricantes de pizza assam pizza a temperaturas >260°C.
[0065] Consequentemente, em uma concretização preferida, o queijo (de preferência, queijo para pizza) é um queijo usado em um processo envolvendo uma etapa de aquecimento a uma temperatura acima de 100°C, tal como acima de 150°C, ou tal como acima de 200°C. Bactéria ST Gal(+) da etapa "(a) (I)" do primeiro aspecto
[0066] No Exemplo de operação 1 aqui é descrito um método para obter bactéria diferente de ST Gal(+) que cumpre com o teste comparativo da etapa "(a) (I)" do primeiro aspecto.
[0067] Conforme pode ser visto na Tabela 1 do Exemplo 1, pelo uso deste Exemplo descrito método especial para isolamento de mutantes de hiper-fermentação de galactose de S. thermophilus foi possível obter bactéria ST capaz de reduzir ao redor de 50% (ver, por exemplo, CHCC27912 e CHCC29526) as quantidades de galactose excretada no leite conforme comparada à bactéria de referência ST CHCC4323.
[0068] Bactéria ST capaz de reduzir por pelo menos 20% das quantidades de galactose excretada no leite conforme comparada a bactéria de referência ST CHCC4323 pode aqui ser denominada bactéria ST Gal( ++).
[0069] Sem estar limitado pela teoria – no Exemplo 1 descrito, método especial para isolamento de mutantes de hiper-fermentação de galactose ST Gal( ++) de S. thermophilus pode ser considerado especial devido ao fato que o nível de redução de galactose é dramaticamente aumentado comparado a uma aqui denominada estirpe Gal(+). Conforme descrito no Exemplo 1, o nível de redução de galactose para CHCC14993, um mutante Gal(+) de CHCC4323, é 17%, considerando que o nível de redução de galactose de CHCC14994, um mutante Gal( ++) de CHCC4323, é 30%, comparado ao CHCC4323 tipo selvagem. O nível de redução de galactose de CHCC29526, um mutante Gal( ++) de CHCC4459, é ainda 52%, comparado ao CHCC4323 de referência. Pelo uso do método recentemente desenvolvido, não previamente descrito, de subcultura em caldo M17-gal, foi, portanto, possível isolar mutantes de hiper- fermentação de galactose com uma capacidade de redução de galactose única.
[0070] De preferência, as bactérias ST da etapa "(a) (I)" do primeiro aspecto são bactérias ST caracterizadas pelo que as bactérias ST são capazes de reduzirem por pelo menos 20% (tal como pelo menos 25%, mais de preferência, pelo menos 30%, e ainda mais de preferência, pelo menos 40%) das quantidades de galactose excretada no leite conforme comparada à bactéria de referência ST CHCC4323.
[0071] De preferência, a célula de bactéria Streptococcus thermophilus (ST) é pelo menos uma célula selecionada a partir do grupo consistindo de: uma célula de Streptococcus thermophilus CHCC19097 depositada com número de registro DSM 32594; uma célula de Streptococcus thermophilus CHCC19100 depositada com número de registro DSM 32595; uma célula de Streptococcus thermophilus CHCC27912 depositada com número de registro DSM 32596; uma célula de Streptococcus thermophilus CHCC29526 depositada com número de registro DSM 32597;
uma célula de Streptococcus thermophilus CHCC29530 depositada com número de registro DSM 32598; e uma célula de Streptococcus thermophilus CHCC14994 depositada com número de registro DSM 25838.
[0072] De preferência, na etapa "(a) (I)" do primeiro aspecto, o leite é inoculado com de 104 a 1015 cfu (ou de 104 a 1014 cfu) (unidades de formação de colônia) células de bactéria ST viáveis por grama de leite, incluindo pelo menos 105 cfu por grama leite, tal como pelo menos 105 cfu/g de leite, tal como pelo menos 107 cfu/g de leite, tal como pelo menos 108 cfu/g de leite, tal como pelo menos 109 cfu/g de leite, tal como pelo menos 1010 cfu/g de leite, ou tal como pelo menos 1011 cfu/g de leite.
[0073] As células de bactéria ST podem ser uma mistura de estirpes de ST diferentes (por exemplo, uma mistura de aqui discutidos CHCC27912 e CHCC29526) - por exemplo, 108 cfu/g de leite de uma estirpe ST (por exemplo, CHCC27912) + 108 cfu/g de leite de outra estirpe ST (por exemplo, CHCC29526), que, em suma, implicaria que o leite é inoculado com 2xl08 cfu/g de leite de células de bactéria ST viáveis.
[0074] Tipicamente, as bactérias (por exemplo, uma composição de cultura inicial) estão em uma forma concentrada incluindo concentrados congelados, secados, ou secados-congelados. Bactérias Lb. Gal(+) Lac(-) da etapa "(a) (IIV' do primeiro aspecto
[0075] De preferência, as bactérias Lactobacillus (Lb.) da etapa "(a) (II)" do primeiro aspecto são bactérias Lb. helveticus, bactérias Lb. delbrueckii, bactérias Lb. paracasei, bactérias Lb. Rhamnosus, ou uma mistura destas.
[0076] Mais de preferência, as bactérias Lactobacillus (Lb.) da etapa "(a) (II)" de primeiro aspecto são bactérias Lb. delbrueckii, bactérias Lb. paracasei, bactérias Lb. Rhamnosus, ou uma mistura destas.
[0077] Ainda mais de preferência, as bactérias Lactobacillus (Lb.) da etapa "(a) (II)" do primeiro aspecto são bactérias Lb. delbrueckii – em particular, bactérias Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis.
[0078] Conforme discutido acima, o exemplo de operação 2 aqui descreve um método para obter "bactéria Lb. Gal(+) Lac(-)" da etapa "(a) (II)" do primeiro aspecto, e o método pode ser considerado como baseado em técnica de rotina do técnico no assunto - isto é, baseado na técnica anterior, e informação técnica aqui proporcionada, pode ser considerada como operação relativamente de rotina para obter bactéria Lb. Gal(+) Lac(-) que cumpre com o teste comparativo de "(a) (II)" do primeiro aspecto.
[0079] O teste da etapa "(a) (II)" do primeiro aspecto é, de preferência, realizado de acordo com o Exemplo 2.
[0080] Com relação ao elemento da etapa "(a) (II)" da Lb. Gal(+), do primeiro aspecto, pode geralmente ser preferido que as bactéria sejam tão boas possível para serem capazes de fermentar galactose.
[0081] Consequentemente, em uma concretização preferida, a Lb. Gal(+), o critério relacionado "capaz de fermentar galactose" da etapa "(a) (II)" do primeiro aspecto é somente preenchido "se o pH diminuiu por pelo menos 0,7", mais de preferência, "se o pH diminuiu por pelo menos 0,9".
[0082] Com relação ao elemento da etapa "(a) (II)" da Lb. Lac(-) do primeiro aspecto, pode geralmente ser preferido que as bactérias sejam essencialmente não capazes de fermentar lactose no todo.
[0083] Consequentemente, em uma concretização preferida a Lb. Lac(-), o critério relacionado "não capaz de fermentar lactose" da etapa "(a) (II)" do primeiro aspecto é somente preenchido "se o pH não diminuiu por mais do que 0,9", mais de preferência, "se o pH não diminuiu por mais do que 0,6" e, ainda mais de preferência, "se o pH não diminuiu por mais do que 0,3".
[0084] De preferência, a célula de bactéria Lactobacillus (Lb.) é pelo menos uma célula selecionada a partir do grupo consistindo de:
[0085] Lactobacillus rhamnosus CHCC3402, número de depósito ATCC53103 (LGG® (https://www.lgg.com/));
[0086] Lactobacillus paracasei CHCC6272, número de depósito DSM 16572; e
[0087] Lactobacillus delbrueckii ssp. lactis CHCC27906, número de depósito DSM 32831.
[0088] De preferência, na etapa "(a) (II)" do primeiro aspecto, o leite é inoculado com de 104 a 1015 cfu (ou de 104 a 1014 cfu) (unidades de formação de colônia) de células de bactéria Lb. viáveis por grama de leite, including pelo menos 105 cfu por grama de leite, tal como pelo menos 105 cfu/g de leite, tal como pelo menos 107 cfu/g de leite, tal como pelo menos 108 cfu/g de leite, tal como pelo menos 109 cfu/g de leite, tal como pelo menos 1010 cfu/g de leite, ou tal como pelo menos 1011 cfu/g de leite.
[0089] As células de bactéria Lb. podem ser uma mistura de estirpes de Lb. diferentes- por exemplo, 108 cfu/g de leite de uma estirpe Lb. + 108 cfu/g de leite de outra estirpe Lb., que, em suma, implicaria que o leite é inoculado com 2xl08 cfu/g de células de bactéria Lb. Viáveis de leite.
[0090] Tipicamente, as bactérias (por exemplo, uma composição de cultura inicial) estão em uma forma concentrada incluindo concentrados congelados, secados ou secados-congelados.
[0091] De preferência, as bactérias ST Gal(+) e bactérias Lb. Gal(+) Lac(-) são inoculadas juntas (por exemplo, juntas em uma única composição – alternativamente denominada uma co-cultura) para o leite. Fermentação do leite com a bactéria - Etapa (b) do primeiro aspecto
[0092] A Etapa (b) do primeiro aspecto se relaciona a fermentação do leite com a bactéria de (a).
[0093] Conforme discutido acima, a pessoa versada na técnica sabe como fermentar leite com relevante bactéria para produzir um queijo de interesse - consequentemente, não existe no presente contexto necessidade de descrever isto em maiores detalhes.
[0094] De acordo com a técnica, o tempo de fermentação na etapa (b) do primeiro aspecto pode ser de 1 a 96 horas, tal como de 2 a 72 horas, ou tal como de 3 a 48 horas. Etapas adequadas adicionais para produzir queijo de interesse - Etapa (c) do primeiro aspecto
[0095] Etapa (c) do primeiro aspecto se relaciona a produção de etapas adequadas adicionais para finalmente acabar com o queijo produzido de interesse.
[0096] Conforme discutido acima, o técnico no assunto sabe como produzir um queijo preferido de interesse (por exemplo, queijo mussarela) - consequentemente, não existe necessidade de descrever isto em maiores detalhes no presente contexto. Aspecto separado da invenção
[0097] Conforme discutido acima, uma teoria para explanar na redução significante aqui discutida de galactose pode ser que os Lac(-) Lactobacillus são "forçados" a usar galactose para crescimento e, desse modo, remover mais galactose - isto é, ambos ST Gal(+) e Lb. Gal(+) Lac(-) removem a galactose.
[0098] Em relação a esta teoria, pode-se no presente contexto denotar a bactéria Lb. Gal(+) Lac(-) como assim denominada "sequestrantes" de galactose.
[0099] Sem estar limitado pela teoria – pode-se dizer que prima facie não existe razão imediatamente evidente para que a teoria de "sequestrantes" acima não deve também ser aplicável para outra bactéria de ácido láctico, tal como, por exemplo, bactéria Streptococcus thermophilus (ST).
[00100] Consequentemente, um aspecto separado da invenção se relaciona a um método para produção de um queijo com quantidade reduzida de galactose compreendendo as seguintes etapas:
[00101] (a): inocular leite com:
[00102] (I): bactérias Streptococcus thermophilus (ST), caracterizadas pelo que as bactérias ST são capazes de reduzir por pelo menos 10% as quantidades de galactose excretada no leite conforme comparadas a bactéria de referência ST CHCC4323 (DSM 32826) (aqui denominada " bactéria ST Gal(+)");
[00103] em que o teste comparativo é realizado pelo que as bactérias ST são inoculadas em leite de vaca desnatado 1% de culturas noturnas, e incubadas por 18 horas a 37°C e no final da fermentação, amostras são tomadas para medir teor de galactose no leite fermentado e, desse modo, medir a redução de galactose excretada comparada a CHCC4323 de referência;
[00104] e
[00105] (B): bactérias ST, caracterizadas pelo que as bactérias ST são capazes de fermentar galactose, mas não fermentar lactose (aqui denominada " bactéria ST Gal(+) Lac(-)");
[00106] em que "capacidade de fermentar galactose" é medida pelo que as bactérias ST são inoculadas em meio M17 contendo 2% de galactose como hidrato de carbono único 1% de culturas noturnas e incubadas por 16 horas a 37°C e no final da fermentação, amostras são tomadas para medir pH, e se o pH diminuiu por pelo menos 1,0, então é a ST "capaz de fermentar galactose" (aqui denominada " bactéria ST Gal(+)");
[00107] e em que "não capaz de fermentar lactose" é medida pelo que as bactérias ST são inoculadas em leite sem adição de sacarose 1% de culturas noturnas e incubadas por 18 horas a 37°C e no final da fermentação, amostras são tomadas para medir pH, e se o pH não diminuiu por mais do que 0,5, então é a ST "não capaz de fermentar lactose" (aqui denominada "bactéria "ST Lac(-)");
[00108] e
[00109] fermentar o leite com a bactéria de (a); e
[00110] produzir etapas adequadas adicionais para finalmente acabar com o queijo produzido com quantidade reduzida de galactose.
[00111] Similar a bactéria Lb. Gal(+) Lac(-), é trabalho relativamente de rotina para o técnico no assunto obter bactérias ST Gal(+) Lac(-). No Exemplo de operação 6, é mostrado dados para uma bactéria ST Gal(+) Lac(-) cumprindo com a etapa "(a) (B)" do aspecto separado e obtida por um método de classificação/seleção de rotina que pode-se dizer é similar ao Exemplo 2 aqui.
[00112] Com relação ao elemento da etapa "(a) (II)" da ST Gal(+) do aspecto separado, pode geralmente ser preferido que as bactérias sejam tão boas possíveis para serem capazes de fermentar galactose.
[00113] Consequentemente, em uma concretização preferida, a ST Gal(+), o critério relacionado "capaz de fermentar galactose" da etapa "(a) (II)" de aspecto separado é somente preenchido "se o pH diminuiu por pelo menos 1,3", mais de preferência, "se o pH diminuiu por pelo menos 1,6".
[00114] Com relação ao elemento de etapa "(a) (II)" da ST Lac(-) de aspecto separado, pode geralmente ser preferido que as bactérias sejam essencialmente não capazes de fermentar lactose no todo.
[00115] Consequentemente, em uma concretização preferida, a ST Lac(-), critério relacionado "não capaz de fermentar lactose" da etapa "(a) (II)" do primeiro aspecto é somente preenchido "se o pH não diminuiu por mais do que 0,4", mais de preferência, "se o pH não diminuiu por mais do que 0,3" e, ainda mais de preferência, "se o pH não diminuiu por mais do que 0,1".
[00116] Conforme compreendido pela pessoa versada na técnica no presente contexto – aqui concretizações preferidas relevantes (por exemplo, queijo preferido, céu por grama de leite preferida, etc) do ponto "(a) (II)" do primeiro aspecto são também concretizações preferidas do ponto "(a) (B)" do aspecto separado.
[00117] Por exemplo, também para o aspecto separado - em uma concretização preferida, o queijo é queijo mole, cheddar queijo, queijo de pasta filata, queijo para pizza, ou queijo mussarela - mais de preferência, o queijo é queijo de pasta filata, queijo cheddar, queijo para pizza, ou queijo mussarela – mais de preferência, o queijo é queijo mussarela (de preferência, usado para fazer pizza), queijo para pizza, ou queijo cheddar (de preferência, usado para fazer pizza).
[00118] De preferência, na etapa "(a) (B)" do aspecto separado, o leite é inoculado com de 104 a 1015 cfu (ou de 104 a 1014 cfu) (unidades de formação de colônia) de células de bactéria ST viáveis por grama de leite, incluindo pelo menos 105 cfu por grama leite, tal como pelo menos 105 cfu/g de leite, tal como pelo menos 107 cfu/g de leite, tal como pelo menos 108 cfu/g de leite, tal como pelo menos 109 cfu/g de leite, tal como pelo menos 1010 cfu/g de leite, ou tal como pelo menos 1011 cfu/g de leite.
[00119] EXEMPLO 1: Bactérias ST Gal(+) – capazes de reduzirem extraordinariamente a liberação de galactose também na presença de altas quantidades de lactose (como no leite) - isto é, bactérias ST Gal(+) da etapa "(a) (I)" do primeiro aspecto
[00120] Estirpes de referência:
[00121] - Estirpe ST CHCC4323: Tem o que pode ser denominado uma sequência tipo selvagem natural GalK (aqui denominada GalK(-)), e pode ser vista como uma estirpe de referência ST que corresponde a uma Estirpe ST usada hoje comercialmente relevante para produção de queijo mussarela;
[00122] - Estirpe ST 4323-2 (CHCC14993): Ela compreende uma mutação no gene GalK (galactokinase) (aqui denominada Gal(+)), e pode ser vista como uma estirpe de referência que corresponde a uma estirpe produzida de acordo com a descrição dos acima discutidos WO2011/026863A1 (Chr. Hansen) e W02011/092300A1 (Chr. Hansen).
[00123] Estirpes depositadas:
[00124] CHCC14994: Estirpe SSM 25838 ST - descrita no W02013/160413A1 (Chr. Hansen).
[00125] CHCC19097: Nova Estirpe DSM 32594 ST conforme aqui descrita.
[00126] CHCC19100: Nova Estirpe DSM 32595 ST conforme aqui descrita.
[00127] CHCC27912: Nova Estirpe DSM 32596 ST conforme aqui descrita.
[00128] CHCC29526: Nova Estirpe DSM 32597 ST conforme aqui descrita.
[00129] CHCC29530: Nova Estirpe DSM 32598 ST conforme aqui descrita. Isolamento de mutantes de hiper-fermentação de galactose de S. Thermoohilus:
[00130] Antes do isolamento do mutante, as estirpes foram espalhadas em placas agar M17 com 2% de galactose (placas M17- gal). As estirpes tipo selvagem (wt) não se desenvolveram significantemente na galactose como fonte de hidrato de carbono único.
[00131] Culturas noturnas foram então colocadas em placas M17- gal e várias colônias podem ser isoladas após dois dias de crescimento a 37°C. Vários mutantes foram purificados em placas M17-gal e re-testados em caldo M17 contendo 2% de galactose como hidrato de carbono único. Dos mutantes positivos de galactose purificada, mutantes positivos de mutantes de hiperfermentação de galactose de segunda geração foram isolados por subcultura em caldo M17-gal com 1% re-inoculação diariamente a partir da cultura noturna totalmente superada; incubação ocorreu a 37°C.
[00132] Após diluição, 100 colônias únicas foram isoladas de placas M17-gal e inoculadas em placas de microtitulação com caldo M17-gal. O OD foi seguido por uma leitora de OD e os clones mostrando um melhor aumento de OD durante 16 horas de incubação a 37°C como o wt estirpe foram ainda purificados e caracterizados.
[00133] As estirpes wt S. thermophilus das quais mutantes de hiperfermentação de galactose foram isolados são: CHCC9861 CHCC4459 CHCC4426 CHCC4323 CHCC7018 CHCC3050
[00134] Os mutantes de hiperfermentação de galactose mostrando uma não-usualmente alta capacidade de fermentação de galactose e excreção reduzida de galactose no meio são (mutante/wt): CHCC27912 / CHCC9861 CHCC29526 / CHCC4459 CHCC29530 / CHCC4426 CHCC14994 / CHCC4323 CHCC19100 / CHCC7018 CHCC19097 / CHCC3050
[00135] O exemplo inclui também uma estirpe positiva de galactose típica, isolada como mutante de primeira geração de CHCC4323, denominado CHCC14993. CHCC14993 mostrou uma redução típica de galactose no leite de 17% (redução de excreção de galactose no leite comparada a wt CHCC4323). Fermentação de leite
[00136] Estirpes mutantes foram inoculadas em leite de vaca desnatado 1% de culturas noturnas e incubadas por 24 horas a 37°C. A atividade de acidificação de mutantes foi similar a estirpe wt. No final da fermentação, amostras foram tomadas para medir teor de galactose no leite fermentado, e com isto a redução de galactose excretada comparada à estirpe de referência negativa de galactose CHCC4323 e estirpe de referência 4323-2 (CHCC14993). Resultados – análise de acidificação e galactose excretada no leite fermentado
[00137] Todas as estirpes ST testadas tem perfis de acidificação similares - isto é, as estirpes ST depositadas da presente invenção não perderam sua capacidade de acidificar rápido no leite.
[00138] As quantidades de galactose excretada para as estirpes testadas diferentes são mostradas na Tabela 1 abaixo:
[00139] A Tabela 1 indica a quantidade de galactose em leite de vaca desnatado fermentado e a redução de galactose comparada a CHCC4323 de referência. Considerando que o típico gal + mutante CHCC14993 mostrou uma redução de galactose de menos do que 20%, a hiper-fermentação de mutantes mostrou uma redução muito mais alta de até 52%, significando que a quantidade de galactose livre é muito mais baixa quando, por exemplo, queijo para pizza é produzido com os novos mutantes, que está conduzindo a douramento reduzido durante assamento.
Estirpe Galactose Redução de galactose (%) CHCC4323 7,1 0 CHCC14933 5,9 17
CHCC27912 3,4 52 CHCC29526 3,4 52 CHCC29530 4,9 31 CHCC14994 5,0 30 CHCC19100 4,1 42 CHCC19097 5,1 28 Tabela 1. Média de duas medições de análise de hidrato de carbono. Resultados são mostrados em mg/g. Conclusões
[00140] Os resultados demonstraram que as estirpes aqui depositadas da presente invenção são capazes de reduzirem a liberação de galactose também na presença de altas quantidades de lactose (como no leite) a um grau, que é extraordinariamente aperfeiçoado conforme comparado às estirpes de referência discutidas.
[00141] EXEMPLO 2: Um método para obter "bactéria Lb. Gal(+) Lac(-)" da etapa "(a) (II)" do primeiro aspecto – critério MRS
[00142] Lactobacillus delbrueckii ssp. lactis CHCC27906 foi isolada como mutante negativa de lactose da estirpe tipo selvagem de lactose positiva (e galactose positiva) Lactobacillus delbrueckii ssp. lactis CHCC14951. Células de CHCC14951 foram mutagenizadas por UV com um ligador de UV-cruzado (Energy 120MJ). As células que alcançaram uma letalidade de 99% (60 min de tratamento de UV) foram depositadas em placas MRS-agar contendo X-Gal. Devido a atividade de beta-galactosidase, colônias de lactose positiva parecem azul, considerando que mutantes de lactose negativa crescem como colônias brancas.
[00143] Uma faixa de colônias de lactose negativa putativas foram purificadas e re-testadas em MRS onde 1% de lactose, respectivamente 1% de glicose, foi adicionada como hidrato de carbono único. Com um pH de partida de 6,8, CHCC14951 e o mutante de lactose negativa CHCC27906 alcançam um pH final de 4,2 após 18 horas a 37°C na MRS-glicose. CHCC14951 acidificada em um modo similar em caldo de MRS-lactose, mas o pH final para CHCC27906 em MRS-lactose foi 6,6 após 18 horas, mostrando que CHCC27906 é um mutante de lactose negativa. A análise do genoma de CHCC27906 revelou uma mutação na posição 733 de lacZ (eliminação de um nucleotídeo A), resultando em um gene truncado lacZ que explana o fenótipo de lactose negativa.
[00144] Quando crescendo em MRS-galactose (MRS com 1% de galactose como hidrato de carbono único) sob as condições dadas acima - CHCC27906 alcançou um pH de 5,8 após 24 horas a 37°C.
[00145] Conclusão:
[00146] Os resultados demonstram que o mutante CHCC27906 é uma bactéria Lb. Gal(+) Lac(-), que cumpre com o critério de (a)(II) do primeiro aspecto (reivindicação 1) aqui. A estirpe tipo selvagem Lb. CHCC14951 é bactéria Lb. Gal(+) Lac(+) - isto é, ela não cumpre com o critério "não capaz de fermentar lactose" de (a)(II) do primeiro aspecto (reivindicação 1).
[00147] EXEMPLO 3: Uso de uma co-cultura de ST Gai(+) e Lb. Gai(+) Lac(-) de acordo com a presente invenção dada uma % de redução significante mais alta de galactose em leite conforme comparado ao uso de ST Gat(+) sozinho, ou uso de uma co-cultura de ST Gat(+) e Lb. Gat(+) Lac(+) de acordo com a técnica. Fermentação de leite
[00148] Estirpes ST foram crescidas como cultura noturna em M17, considerando estirpes Lb de lactose negativa foram pré-incubadas durante a noite em caldo de MRS para receber uma cultura totalmente crescida. Para os experimentos de co-cultura, as estirpes ST foram inoculadas 1% em leite (pasteurizadas a 98°C/30 min, 9,5% de sólidos totais) das culturas noturnas quando crescidas sozinhas. Em culturas misturadas, a percentagem de inoculação foi 0,75% para a ST mais 0,25% para as estirpes Lb Gal(+) Lac(-) ou Lb Gal(+)Lac(+).
[00149] Incubação ocorreu por 16 horas a 37°C. No final da fermentação, amostras foram tomadas para medir teor de galactose no leite fermentado e, com isto, a redução de galactose excretada comparada à estirpe de referência de galactose negativa CHCC4323.
[00150] As estirpes de lactose negativa Lactobacillus não são capazes de acidificar o leite significante. Elas podem somente crescer em galactose excretada devido ao antiporter lac/gal das STs. Portanto, elas são "forçadas" para metabolizar galactose disponível. Na presença de ambos hidratos de carbono, lactose e galactose como açúcar fermentável, a lactose é frequentemente preferida metabolizada por bactéria de ácido láctico que resultaria em menor redução de galactose como um tempo específico. Resultados – análise de acidificação e galactose excretada no leite fermentado
[00151] As quantidades de galactose excretada para as estirpes testadas diferentes são mostradas na Tabela 1 abaixo:
[00152] A Tabela 1 indica a quantidade de galactose em leite e a redução de galactose comparada a CHCC4323 de referência. A adição dos sequestrantes de lactose negativa CHCC3402, CHCC6272 ou CHCC27906 conduz a uma redução de galactose por 11%, 11%, e 9% respectivamente comparado a CHCC4323 de referência. A adição dos sequestrantes de lactose negativa CHCC3402, CHCC6272 ou CHCC27906 a CHCC27912, que já tem a capacidade extraordinária para diminuir redução de galactose por 50% comparado a CHCC4323, conduz a uma redução de galactose por 66%, 73%, e 64%
respectivamente, comparada a CHCC4323 de referência. Comparada ao uso de CHCC27912, o teor de galactose no final da fermentação pode, desse modo, ser reduzido por adicional 16%, 23% e 16%, respectivamente. O uso dos sequestrantes de lactose negativa é então ainda mais eficiente quando co-cultivada junto com uma estirpe de hiperfermentação de galactose comparada a uma ST negativa de galactose. Quando CHCC4323 ou CHCC27912 é usada em combinação com CHCC14951, a estirpe mãe de lactose positiva da CHCC27906, nenhuma redução de galactose foi medida.
[00153] Neste Exemplo foi usado um isolado de colônia único da CHCC14951 que é a estirpe mãe direta para CHCC27906.
[00154] Como um resultado, a quantidade de galactose livre é muito mais baixa quando, por exemplo, queijo para pizza é produzido com culturas misturadas incluindo os sequestrantes da Lac(-) Gal(+) que está conduzindo a douramento reduzido durante assamento. Estirpe Galactose Redução de galactose (%) CHCC4323 7,0 0 CHCC27912 3,5 50 CHCC3402 <0,4 Nenhuma acidificação CHCC6272 <0,4 Nenhuma acidificação CHCC27906 <0,4 Nenhuma acidificação CHCC4323 + CHCC14951 8,4 0 CHCC27912 + CHCC14951 6,9 0 CHCC4323 + CHCC3402 6,2 11 CHCC4323 + CHCC6272 6,2 11 CHCC4323 + CHCC27906 6,4 9 CHCC27912 + CHCC3402 2,4 66 CHCC27912 + CHCC6272 1,9 73 CHCC27912 + CHCC27906 2,5 64 Tabela 1. Média de duas medições de análise de hidrato de carbono. Resultados são mostrados em mg/g. Conclusões
[00155] Os resultados demonstram que as estirpes aqui usadas da presente invenção são capazes de reduzir a liberação de galactose também na presença de altas quantidades de lactose (como no leite) a um grau, que é extraordinariamente aperfeiçoado conforme comparado a estirpe de referência acima discutida.
[00156] CHCC27912 é uma "bactéria ST Gal(+)" de (a)(I) do primeiro aspecto (reivindicação 1); CHCC27906 é uma "bactéria Lb. Gal(+) Lac(-)" de (a)(I) do primeiro aspecto (reivindicação 1); CHCC14951 é a estirpe não direta "Gal(+) Lac(+)" para CHCC27906.
[00157] Desde que a "CHCC27912+CHCC27906" resulta de "2,5 mg/g de Galactose", está significantemente abaixo "6,9 mg/g de Galactose" resulta para "CHCC27912+CHCC14951" – este Exemplo 3 demonstra que pelo uso de ST Gal( + ) e Lb. Gal( + ) Lacf-1 de acordo com a presente invenção, foi possível obter 64% de redução de galactose conforme comparado ao uso de ST Gal(+) e Lb. Gal(+) Lac( + ) conforme descrito na técnica anterior.
[00158] EXEMPLO 4: Queijo para pizza produzido usando uma co- cultura de ST Gal(+) e Lb. rhamnosus Gal(+) Lac(-) de acordo com a presente invenção
[00159] Estirpes Streptococcus thermophilus (ST) CHCC4323 (galactose negativa) e CHCC27912 (galactose positiva) foram propagadas em meio M17 adicionado 2% de galactose e incubadas durante a noite a 37°C. Cada pré-inoculum foi então inoculado 0,05% em leite-B (pasteurizado a 98°C/30 min, 9,5% de sólidos totais) e incubado 16 horas a 37°C.
[00160] Em paralelo, Lactobacillus rhamnosus CHCC3402 (lactose negativa, galactose positiva) foi propagada em meio MRS adicionado com 2% de galactose e incubada durante a noite a 37°C. Cada pré- inoculum foi então usado para inocular 0,05% no mesmo meio e incubado 40 horas a 37°C.
[00161] A cultura inicial usada como um controle negativo para avaliação de douramento foi a cultura propagada de estirpe ST CHCC4323 em leite-B. Uma dose de 1% (p/p) deste volume foi então adicionada à cuba de fermentação 1 contendo 150 kg de leite de queijo. A cultura inicial usada para reduzir o douramento foi uma combinação de culturas propagadas de ST CHCC27912 e Lactobacillus rhamnosus CHCC3402. A dose destas culturas propagadas adicionadas à cuba 2 foram respectivamente 1,6% (p/p) e 0,4% (p/p). Contagens de célula de material tomadas imediatamente após inoculação foi 1E+07 células/mL para ST CHCC4323 e ST CHCC27912, e 1E+05 células/mL para Lactobacillus rhamnosus CHCC3402. A composição do leite foi conforme segue: 2,70 (+/- 0,05%)% de gordura, 3,60% (+/- 0,05%) de proteína total, e 4,60% (+/- 0,05%) de lactose.
[00162] A etapa de maturação quente foi 60 min a 34,5°C e a firmeza de corte foi monitorada pelo CHYMO-graph® (patented tool by Chr. Hansen®), o índice de firmeza no corte foi 6,5. Após corte, o coalho foi pré-agitado por 10 minutos antes de escaldamento a 41°C. O escaldamento leva 30 min e em seguida o coalho foi agitado por 20 min antes do soro de leite fora da etapa. O pH do coalho no soro de leite foi entre 6,00 e 6,10. Em seguida o coalho foi formado em blocos e virado 3 vezes após moagem. O pH na moagem foi 5,17 (± 0,02). Após a moagem, o coalho foi salgado com 2% de sal seco antes de esticar e resfriar o queijo.
[00163] Galactose residual medida nos queijos após 21 duas mostra uma redução de 49,4% (8,1 mg/g para estirpe CHCC4323 de controle, vs. 4,1 mg/g para a cultura misturada de CHCC27912 e CHCC3402).
[00164] Após 30 dias de armazenagem (a 4°C), a capacidade de douramento foi comparada por assamento de pizzas em um forno de pizza por 3,5 min a 242°C. Para preparar as pizzas, 40 g de molho de tomate foi espalhado na superfície de massa de pizza congelada e
135g de queijo ralado grosseiro foi distribuído uniformemente no topo. A Figura 2 aqui mistura uma diferença evidente no douramento entre CHCC4323 de controle e a cultura de redução de douramento CHCC27912/CHCC3402.
[00165] EXEMPLO 5: Queijo para produção de pizza usando uma co-cultura de ST Gal(+) e Lb. delbrueckii spp. lactis Gal(+) Lac(-) de acordo com a presente invenção
[00166] S.thermophilus CHCC9861 (galactose negativa) e S. thermophilus CHCC27912 (galactose positiva) foram propagadas em meio M17 adicionado 2% de galactose e incubadas durante a noite a 37°C. Cada pré-inoculum foi então inoculado 0,05% em leite-B (pasteurizado a 98°C/30 min, 9,5% de sólidos totais) e incubados por 16 horas a 37°C.
[00167] Em paralelo, um pré-inoculum de Lactobacillus delbrueckii ssp. lactis CHCC27906 (lactose negativa, mutante de galactose positiva isolada de uma estirpe do tipo selvagem de lactose positiva) foi propagado em meio MRS com 2% de galactose e incubado durante a noite a 37°C foi usado para inocular com 0,05% no mesmo meio e incubado 40 horas a 37°C.
[00168] A cultura inicial usada como um controle negativo para avaliação de douramento foi ST CHCC9861 (galactose negativa). Uma dose de 2% (p/p) deste volume foi adicionada à cuba 1 contendo 150 kg de leite de queijo. A cultura inicial usada para reduzir douramento foi uma combinação de culturas propagadas de ST CHCC27912 e Lactobacillus delbrueckii ssp. lactis CHCC27906. As doses destas culturas propagadas adicionadas à cuba 2 foram respectivamente 1,5% (p/p) e 0,5% (p/p). Contagens de célula de material tomadas juntas após inoculação foram 1E+07 células/mL para ST CHCC9861 e ST CHCC27912, e 1E+05 células/mL para Lactobacillus delbrueckii ssp. lactis CHCC27906.
[00169] A composição do leite foi como segue: 2,80 (+/- 0,05%)% de gordura, 3,80% (+/- 0,05%) de proteína total, e 4,80% (+/- 0,05%) de lactose.
[00170] A etapa de maturação quente foi 60 min a 34,5°C e a firmeza no corte foi monitorada pelo CHYMO-graph® (patented tool by Chr. Hansen®), o índice de firmeza no corte foi 6,5. Após corte, o coalho foi pré-agitado por 10 minutos antes do escaldamento a 41°C. O escaldamento levou 30 min e em seguida o coalho foi agitado por 20 min antes do soro de leite fora da etapa. O pH do coalho no soro de leite foi entre 6,20 e 6,25. Em seguida, o coalho foi formado em blocos e virado 3 vezes antes da moagem. O pH na moagem foi 5,20 (± 0,02). Após a moagem, o coalho foi salgado com 2% de sal seco antes de esticar e resfriar o queijo.
[00171] Galactose residual medida nos queijos após 5 semanas mostrou uma redução de 71,6% (6,7 mg/g usando estirpe CHCC9861 de controle, vs. 1,9 mg/g usando a cultura de mistura de CHCC27912 e CHCC27906).
[00172] Após 30 dias de armazenagem (a 4°C), a capacidade de douramento foi comparada por assamento de pizzas em um forno de pizza por 3,5 min a 242°C. Para preparar as pizzas, 40 g de molho de tomate foi espalhado na superfície da massa de pizza congelada e 135 g de queijo ralado grosseiro foi distribuído uniformemente no topo. A Figura 3 aqui mostra uma diferença evidente no douramento entre a CHCC9861 de referência e a cultura experimental com CHCC27912/CHCC27906.
[00173] EXEMPLO 6: Bactéria ST Gal(+) Lac(-)" da etapa "(a) (II)" – critério M17
[00174] S. thermophilus CHCC26980 foi isolada como mutante de lactose negativa da estirpe do tipo selvagem de lactose positiva S. thermophilus CHCC5354.
[00175] Células de CHCC5354 foram mutagenizadas com UV com um ligador de UV-cruzado (Energy 120MJ). Células que alcançaram uma letalidade de 99% (60 min de 6tratamento de UV) foram depositadas em placas M17-lac agar contendo X-Gal. Devido a atividade de beta-galactosidase, as colônias de lactose positiva parecem azuis, considerando que mutantes negativos crescem como colônias brancas.
[00176] Com um pH inicial de 6.6, CHCC5354 e o mutante de lactose negativa CHCC26980 alcançaram um pH final de 4,2, resp. 4,4, após 18 horas a 37°C em leite com 2% de sacarose adicionado. CHCC5354 acidificada em um modo similar em leite sem a adição de açúcar extra, mas o pH final para CHCC26980 no leite (sem adição de sacarose) permaneceu a 6,6 após 18 horas, mostrando que CHCC26980 é um mutante de lactose negativa.
[00177] A análise do genoma de CHCC26980 descreveu uma mutação dentro do gene lacZ (eliminação de um nucleotídeo A), resultando em um gene truncado lacZ que explana o fenótipo de lactose negativa.
[00178] Uma segunda etapa, um mutante de fermentação de galactose foi isolado de CHCC26980.
[00179] Antes do isolamento do mutante, a estirpe foi espalhada nas placas M17 ágar com 2% de galactose (placas M17-gal). Estirpe CHCC26980 não cresceu significantemente na galactose como finte de hidrato de carbono único.
[00180] Culturas noturnas foram então depositadas nas placas
M17-gal e várias colônias podem ser isoladas após dois dias de crescimento a 37°C. Vários mutantes foram purificados em placas M17-gal e re-testados em caldo M17 contendo 2% de galactose como hidrato de carbono único. CHCC28149 foi isolado como mutante de galactose positiva de CHCC26980 capaz de acidificar a um pH de 5,0 após 16 horas em caldo M17 com 2% de galactose, considerando que o pH de CHCC26980 diminuiu somente mínimo de um pH de partida de 6,8 a 6,6.
[00181] Conclusão:
[00182] Os resultados demonstram que o CHCC28149 mutante é uma bactéria ST. Gal(+) Lac(-), que cumpre com o critério de (a)(II) do aspecto separado aqui. A estirpe do tipo selvagem ST. CHCC5354 é uma bactéria ST. Gal(-) Lac(+) - isto é, ela não cumpre com o critério "não capaz de fermentar lactose" de (a)(II) do aspecto separado.
[00183] EXEMPLO 7: Uso de uma co-cultura de bactéria ST Gal(+) e ST Gal(+) Lac(-) de acordo com a presente invenção dada uma % de redução mais alta de galactose no leite conforme comparado ao uso de ST Gal(+) sozinha ou uso de uma co-cultura de ST Gal(+) e ST Gal(+) Lac(+). Fermentação de leite
[00184] Estirpes ST foram crescidas como cultura noturna em caldo M17 (com 2% de lactose para CHCC4323 e estirpe de referência ST Gal(+)Lac(+), e com 2% de galactose para CHCC28149) para receber uma cultura de crescimento total. Para os experimentos de co-cultura, as estirpes ST foram inoculadas 1% em leite (pasteurizado a 98°C/30 min, 9,5% de sólidos totais) das culturas noturnas quando crescidas sozinhas. Em culturas misturadas, a percentagem de inoculação foi 75% para a lactose positiva ST mais 0,25% para a ST Gal(+) Lac(-).
[00185] Incubação ocorreu por 16 horas a 37°C. No final da fermentação, amostras foram tomadas para medir teor de galactose no leite fermentado e com isto a redução de galactose excretada comparada a estirpe de referência de galactose negativa CHCC4323.
[00186] A estirpe de lactose negativa S. thermophilus não é capaz de acidificar o leite significantemente. A estirpe pode somente crescer na galactose excretada devido ao antiporter lac/gal de lactoses positivas STs. Portanto, elas são "forçadas" a metabolizar a galactose disponível. Na presença de ambos lactose de hidratos de carbono e galactose como açúcar fermentável, a lactose é frequentemente preferida metabolizada que resultaria em menor redução de galactose em um tempo específico. Resultados – análise de acidificação e galactose excretada no leite fermentado
[00187] As quantidades de galactose excretada para as estirpes testadas diferentes são mostradas na Tabela 2 abaixo:
[00188] A Tabela 2 indica a quantidade de galactose em leite e a redução de galactose comparada a CFICC4323 de referência.
[00189] A adição do sequestrante da lactose negativa CFICC28149 conduz a uma redução de galactose por 28% comparado a CFICC4323 de referência.
[00190] A adição do sequestrante de lactose negativa CFICC28149 à estirpe de referência ST Gal(+)Lac(+), que já tem boa capacidade para diminuir a redução de galactose por 20% comparado a CFICC4323, conduz a uma redução de galactose por 28%, comparado a CFICC4323 de referência. Comparado ao uso de estirpe de referência ST Gal(+)Lac(+), o teor de galactose no final da fermentação pode, desse modo, ser reduzido por adicional 4%.
[00191] Como um resultado, a quantidade de galactose livre é muito mais baixa quando, por exemplo, queijo para pizza é produzido com culturas misturadas incluindo o sequestrante da Lac(-) Gal(+) que está conduzindo a douramento reduzido durante assamento.
Estirpe Galactose Redução de galactose (%) CHCC4323 7,1 0 Estirpe de referência ST 5,4 24 Gal(+)Lac(+) Estirpe de referência ST 5,1 28 Gal(+)Lac(+) CHCC28149 Tabela 2. Média de duas medições de análise de hidrato de carbono. Os Resultados são mostrados em mg/g.
1. Mukherjee et al (1994, J Dairy Sei 77:2839-2849)
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3. WO2011/026863Al (Chr. Hansen)
4. W02011/092300A1 (Chr. Hansen)
5. W02013/160413A1 (Chr. Hansen)
Claims (15)
1. Método para produção de um queijo com quantidade reduzida de galactose, caracterizado pelo fato de que compreende as seguintes etapas: (a): inocular leite com: (I) bactérias Streptococcus thermophilus (ST), em que as bactérias ST são capazes de reduzirem por pelo menos 10% as quantidades de galactose excretada no leite conforme comparadas às bactérias ST CHCC4323 (DSM 32826) de referência (aqui denominadas "bactérias ST Gal(+)"); em que o teste comparativo é realizado pelo que as bactérias ST são inoculadas no leite de vaca desnatado 1% de culturas noturnas e incubadas por 18 horas a 37°C, e no final da fermentação, as amostras são tomadas para medir o teor de galactose no leite fermentado e, desse modo, medir a redução de galactose excretada comparada a CHCC4323 de referência; e (II): bactérias Lactobacillus (Lb.), em que as bactérias Lb. são capazes de fermentar galactose, mas não fermentar lactose (aqui denominadas "bactérias Lb. Gal(+) Lac(-)"); em que "capaz de fermentar galactose" é medida pelo que as bactérias Lb. são inoculadas em meio MRS (De Man, Rogosa e Sharpe) contendo 1% de galactose como hidrato de carbono único, 1% de culturas noturnas e incubadas por 24 horas a 37°C, e no final da fermentação, amostras são tomadas para medir pH, e se o pH diminuiu por pelo menos 0,5 então é o Lb. "capaz de fermentar galactose" (aqui denominadas bactérias "LB. Gal(+)");
e em que "não capaz de fermentar lactose" é medida pelo que as bactérias Lb. são inoculadas em meio MRS contendo 1% de lactose como hidrato de carbono único, 1% de culturas noturnas, e incubadas por 18 horas a 37°C, e no final da fermentação, amostras são tomadas para medir pH, e se o pH não diminuiu por mais do que 1,0, então é o Lb. "não capaz de fermentar lactose" (aqui denominadas "bactérias LB. Lac(-)"); e (b): fermentar o leite com a bactéria de (a); e (c): produzir etapas adequadas adicionais para finalmente acabar com o queijo produzido com quantidade reduzida de galactose.
2. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o queijo é um queijo usado em um processo (por exemplo para produção de pizza) envolvendo uma etapa de aquecimento a uma temperatura acima de 70°C, e em que o queijo é um queijo de pasta filata, um queijo para pizza, ou um queijo mussarela.
3. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o queijo é um queijo mussarela.
4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que as bactérias ST da etapa "(a) (I)", como definidas na reivindicação 1, são bactérias ST em que as bactérias ST são capazes de reduzir por pelo menos 30% as quantidades de galactose excretada no leite conforme comparadas às bactérias de referência ST CHCC4323.
5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que a célula de bactérias Streptococcus thermophilus (ST) é pelo menos uma célula selecionada a partir do grupo consistindo de: (a) uma célula de Streptococcus thermophilus
CHCC19097 depositada com número de registro DSM 32594; (b) uma célula de Streptococcus thermophilus CHCC19100 depositada com número de registro DSM 32595; (c) uma célula de Streptococcus thermophilus CHCC27912 depositada com número de registro DSM 32596; (d) uma célula de Streptococcus thermophilus CHCC29526 depositada com número de registro DSM 32597; (e) uma célula de Streptococcus thermophilus CHCC29530 depositada com número de registro DSM 32598; e (f): uma célula de Streptococcus thermophilus CHCC14994 depositada com número de registro DSM 25838.
6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que na etapa "(a) (I)", como definida na reivindicação 1, o leite é inoculado com de 104 a 1014 cfu (unidades de formação de colônia) de células de bactéria ST viáveis por grama de leite.
7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que as bactérias Lactobacillus (Lb.) da etapa "(a) (II)", como definidas na reivindicação 1, são bactérias Lb. delbrueckii, bactérias Lb. paracasei, bactérias Lb. Rhamnosus, ou uma mistura destas.
8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que as bactérias Lactobacillus (Lb.) da etapa "(a) (II)", como definidas na reivindicação 1, bactérias Lb. delbrueckii – em particular, bactérias Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis.
9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o critério de Lb. Gal(+) relacionado "capaz de fermentar galactose" da etapa "(a) (II)", como definida na reivindicação 1, é somente preenchido se o pH diminuiu por pelo menos 0,9.
10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o critério Lb. Lac(-) relacionado "não capaz de fermentar lactose" da etapa "(a) (II)", como definida na reivindicação 1, é somente preenchido se o pH não diminuiu por mais do que 0,3.
11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que a célula de bactéria Lactobacillus (Lb.) é pelo menos uma célula selecionada a partir do grupo consistindo em: Lactobacillus rhamnosus CHCC3402, número de depósito ATCC53103; Lactobacillus paracasei CHCC6272, número de depósito DSM 16572; e Lactobacillus delbrueckii ssp. lactis CHCC27906, número de depósito DSM 32831.
12. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que na etapa "(a) (II)", como definida na reivindicação 1, o leite é inoculado com de 104 a 1014 cfu (unidades de formação de colônia) de células de bactéria Lb. viáveis por grama de leite.
13. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o tempo de fermentação na etapa (b), como definida na reivindicação 1, é de 3 a 96 horas.
14. Célula de Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis CHCC27906, caracterizada pelo fato de que é depositada com número de registro DSM 32831.
15. Método para obter uma estirpe mutante do Lactobacillus delbrueckii subsp.
Lactis, estirpe depositada, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que compreende usar a estirpe depositada como estirpe de partida, produzindo mutantes da estirpe depositada e isolando uma nova estirpe mutante, em que a estirpe mutante tem retida a propriedade de ser Lb.
Gal(+) Lac(-) da estirpe depositada.
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