BR112020024772A2 - rebaudiosídeo n2, rebaudiosídeo o4, produto consumível, e, métodos para produzir um rebaudiosídeo n2 altamente purificado, para produzir rebaudiosídeo o4 altamente purificado, para melhorar a doçura de uma bebida ou um produto alimentício, para modificar o sabor de uma bebida ou um produto alimentício e para suprimir a formação de espuma de uma bebida ou um produto alimentício - Google Patents

rebaudiosídeo n2, rebaudiosídeo o4, produto consumível, e, métodos para produzir um rebaudiosídeo n2 altamente purificado, para produzir rebaudiosídeo o4 altamente purificado, para melhorar a doçura de uma bebida ou um produto alimentício, para modificar o sabor de uma bebida ou um produto alimentício e para suprimir a formação de espuma de uma bebida ou um produto alimentício Download PDF

Info

Publication number
BR112020024772A2
BR112020024772A2 BR112020024772-3A BR112020024772A BR112020024772A2 BR 112020024772 A2 BR112020024772 A2 BR 112020024772A2 BR 112020024772 A BR112020024772 A BR 112020024772A BR 112020024772 A2 BR112020024772 A2 BR 112020024772A2
Authority
BR
Brazil
Prior art keywords
rebaudioside
udp
glucosyltransferase
amino acid
acid sequence
Prior art date
Application number
BR112020024772-3A
Other languages
English (en)
Inventor
Avetik Markosyan
Saravanan A/L Ramandach
Mohamad Afzaal Bin HASIM
Kristina CHKHAN
Khairul Nizam Bin Nawi
Siew Yin Chow
Original Assignee
Purecircle Usa Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Purecircle Usa Inc. filed Critical Purecircle Usa Inc.
Publication of BR112020024772A2 publication Critical patent/BR112020024772A2/pt

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H15/00—Compounds containing hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
    • C07H15/20—Carbocyclic rings
    • C07H15/24—Condensed ring systems having three or more rings
    • C07H15/256—Polyterpene radicals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23G—COCOA; COCOA PRODUCTS, e.g. CHOCOLATE; SUBSTITUTES FOR COCOA OR COCOA PRODUCTS; CONFECTIONERY; CHEWING GUM; ICE-CREAM; PREPARATION THEREOF
    • A23G1/00—Cocoa; Cocoa products, e.g. chocolate; Substitutes therefor
    • A23G1/30—Cocoa products, e.g. chocolate; Substitutes therefor
    • A23G1/32—Cocoa products, e.g. chocolate; Substitutes therefor characterised by the composition containing organic or inorganic compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23G—COCOA; COCOA PRODUCTS, e.g. CHOCOLATE; SUBSTITUTES FOR COCOA OR COCOA PRODUCTS; CONFECTIONERY; CHEWING GUM; ICE-CREAM; PREPARATION THEREOF
    • A23G1/00—Cocoa; Cocoa products, e.g. chocolate; Substitutes therefor
    • A23G1/30—Cocoa products, e.g. chocolate; Substitutes therefor
    • A23G1/32—Cocoa products, e.g. chocolate; Substitutes therefor characterised by the composition containing organic or inorganic compounds
    • A23G1/40—Cocoa products, e.g. chocolate; Substitutes therefor characterised by the composition containing organic or inorganic compounds characterised by the carbohydrates used, e.g. polysaccharides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23G—COCOA; COCOA PRODUCTS, e.g. CHOCOLATE; SUBSTITUTES FOR COCOA OR COCOA PRODUCTS; CONFECTIONERY; CHEWING GUM; ICE-CREAM; PREPARATION THEREOF
    • A23G3/00—Sweetmeats; Confectionery; Marzipan; Coated or filled products
    • A23G3/34—Sweetmeats, confectionery or marzipan; Processes for the preparation thereof
    • A23G3/36—Sweetmeats, confectionery or marzipan; Processes for the preparation thereof characterised by the composition containing organic or inorganic compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23G—COCOA; COCOA PRODUCTS, e.g. CHOCOLATE; SUBSTITUTES FOR COCOA OR COCOA PRODUCTS; CONFECTIONERY; CHEWING GUM; ICE-CREAM; PREPARATION THEREOF
    • A23G3/00—Sweetmeats; Confectionery; Marzipan; Coated or filled products
    • A23G3/34—Sweetmeats, confectionery or marzipan; Processes for the preparation thereof
    • A23G3/36—Sweetmeats, confectionery or marzipan; Processes for the preparation thereof characterised by the composition containing organic or inorganic compounds
    • A23G3/38—Sucrose-free products
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23G—COCOA; COCOA PRODUCTS, e.g. CHOCOLATE; SUBSTITUTES FOR COCOA OR COCOA PRODUCTS; CONFECTIONERY; CHEWING GUM; ICE-CREAM; PREPARATION THEREOF
    • A23G3/00—Sweetmeats; Confectionery; Marzipan; Coated or filled products
    • A23G3/34—Sweetmeats, confectionery or marzipan; Processes for the preparation thereof
    • A23G3/36—Sweetmeats, confectionery or marzipan; Processes for the preparation thereof characterised by the composition containing organic or inorganic compounds
    • A23G3/42—Sweetmeats, confectionery or marzipan; Processes for the preparation thereof characterised by the composition containing organic or inorganic compounds characterised by the carbohydrates used, e.g. polysaccharides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23G—COCOA; COCOA PRODUCTS, e.g. CHOCOLATE; SUBSTITUTES FOR COCOA OR COCOA PRODUCTS; CONFECTIONERY; CHEWING GUM; ICE-CREAM; PREPARATION THEREOF
    • A23G4/00—Chewing gum
    • A23G4/06—Chewing gum characterised by the composition containing organic or inorganic compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23G—COCOA; COCOA PRODUCTS, e.g. CHOCOLATE; SUBSTITUTES FOR COCOA OR COCOA PRODUCTS; CONFECTIONERY; CHEWING GUM; ICE-CREAM; PREPARATION THEREOF
    • A23G4/00—Chewing gum
    • A23G4/06—Chewing gum characterised by the composition containing organic or inorganic compounds
    • A23G4/10—Chewing gum characterised by the composition containing organic or inorganic compounds characterised by the carbohydrates used, e.g. polysaccharides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23G—COCOA; COCOA PRODUCTS, e.g. CHOCOLATE; SUBSTITUTES FOR COCOA OR COCOA PRODUCTS; CONFECTIONERY; CHEWING GUM; ICE-CREAM; PREPARATION THEREOF
    • A23G9/00—Frozen sweets, e.g. ice confectionery, ice-cream; Mixtures therefor
    • A23G9/32—Frozen sweets, e.g. ice confectionery, ice-cream; Mixtures therefor characterised by the composition containing organic or inorganic compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23G—COCOA; COCOA PRODUCTS, e.g. CHOCOLATE; SUBSTITUTES FOR COCOA OR COCOA PRODUCTS; CONFECTIONERY; CHEWING GUM; ICE-CREAM; PREPARATION THEREOF
    • A23G9/00—Frozen sweets, e.g. ice confectionery, ice-cream; Mixtures therefor
    • A23G9/32—Frozen sweets, e.g. ice confectionery, ice-cream; Mixtures therefor characterised by the composition containing organic or inorganic compounds
    • A23G9/34—Frozen sweets, e.g. ice confectionery, ice-cream; Mixtures therefor characterised by the composition containing organic or inorganic compounds characterised by carbohydrates used, e.g. polysaccharides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L2/00—Non-alcoholic beverages; Dry compositions or concentrates therefor; Their preparation
    • A23L2/52—Adding ingredients
    • A23L2/60—Sweeteners
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L27/00—Spices; Flavouring agents or condiments; Artificial sweetening agents; Table salts; Dietetic salt substitutes; Preparation or treatment thereof
    • A23L27/30—Artificial sweetening agents
    • A23L27/33—Artificial sweetening agents containing sugars or derivatives
    • A23L27/36—Terpene glycosides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/20—Reducing nutritive value; Dietetic products with reduced nutritive value
    • A23L33/21—Addition of substantially indigestible substances, e.g. dietary fibres
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H1/00—Processes for the preparation of sugar derivatives
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12N9/1051—Hexosyltransferases (2.4.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/44—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides
    • C12P19/56—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides having an oxygen atom of the saccharide radical directly bound to a condensed ring system having three or more carbocyclic rings, e.g. daunomycin, adriamycin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/185—Escherichia
    • C12R2001/19—Escherichia coli

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Seasonings (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Non-Alcoholic Beverages (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)

Abstract

São descritos métodos de preparação de glicosídeos de esteviol altamente purificados, particularmente esteviolmonosídeo, esteviolmonosídeo A, esteviolbiosídeo A, esteviolbiosídeo B, esteviolbiosídeo C, esteviolbiosídeo D, esteviolbiosídeo E, rubusosídeo, dulcosídeo A, dulcosídeo C, dulcosídeo D, esteviosídeo A, esteviosídeo B, esteviosídeo C, esteviosídeo G, esteviosídeo H, rebaudiosídeo B2, rebaudiosídeo A4, rebaudiosídeo C, rebaudiosídeo C3, rebaudiosídeo C4, rebaudiosídeo C5, rebaudiosídeo C6, rebaudiosídeo E3, rebaudiosídeo E4, rebaudiosídeo E5, rebaudiosídeo E6, rebaudiosídeo E7, rebaudiosídeo D5, rebaudiosídeo D6, rebaudiosídeo D7, rebaudiosídeo D8, rebaudiosídeo H2, rebaudiosídeo H3, rebaudiosídeo H4, rebaudiosídeo H5, rebaudiosídeo H6, rebaudiosídeo K, rebaudiosídeo N2, rebaudiosídeo N3, rebaudiosídeo N4, rebaudiosídeo N5, rebaudiosídeo M3 e/ou rebaudiosídeo O4. Os métodos incluem a utilização de preparações de enzimas e microorganismos recombinantes para converter várias composições iniciais em glicosídeos de esteviol alvo. Os glicosídeos de esteviol altamente purificados são úteis como adoçante não calórico, intensificador de sabor, intensificador de doçura e supressor de espuma em composições comestíveis e mastigáveis, como bebidas, confeitos, produtos de padaria, biscoitos e gomas de mascar.

Description

1 / 135 REBAUDIOSÍDEO N2, REBAUDIOSÍDEO O4, PRODUTO CONSUMÍVEL, E, MÉTODOS PARA PRODUZIR UM REBAUDIOSÍDEO N2 ALTAMENTE PURIFICADO, PARA PRODUZIR REBAUDIOSÍDEO O4 ALTAMENTE PURIFICADO, PARA MELHORAR A DOÇURA DE UMA BEBIDA OU UM PRODUTO ALIMENTÍCIO,
PARA MODIFICAR O SABOR DE UMA BEBIDA OU UM PRODUTO ALIMENTÍCIO E PARA SUPRIMIR A FORMAÇÃO DE ESPUMA DE UMA BEBIDA OU UM PRODUTO ALIMENTÍCIO CAMPO TÉCNICO
[001] A presente invenção se refere a um processo para preparar composições que compreendem glicosídeos de esteviol, incluindo composições de glicosídeo de esteviol altamente purificadas.
LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS
[002] O arquivo de texto intitulado "PC_78PROV.txt", criado em 8 de junho de 2018, com 19 quilobites de dados e depositado simultaneamente, está aqui incorporado a título de referência em sua totalidade.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[003] Os adoçantes de alta intensidade têm um nível de doçura que é muitas vezes maior que o nível de doçura da sacarose. Eles são essencialmente não calóricos e são comumente usados em produtos para dietas e que têm teor calórico reduzido, incluindo alimentos e bebidas. Os adoçantes de alta intensidade não produzem uma resposta glicêmica, tornando-os adequados para uso em produtos direcionados a diabéticos e outros interessados em controlar a ingestão de carboidratos.
[004] Glicosídeos de esteviol são uma classe de compostos encontrados nas folhas de Stevia rebaudiana Bertoni, uma planta perene da família Asteraceae (Compositae) nativa de certas regiões da América do Sul. Eles são estruturalmente caracterizados por uma base única, esteviol, diferindo pela presença de resíduos de carboidrato nas posições C13 e C19.
2 / 135 Eles se acumulam em folhas de Stevia, compondo aproximadamente de 10% a 20% do peso a seco total. Em uma base de peso seco, os quatros principais glicosídeos encontrados nas folhas de Stevia incluem tipicamente esteviosídeo (9,1%), rebaudiosídeo A (3,8%), rebaudiosídeo C (0,6 a 1,0%) e dulcosídeo A (0,3%). Outros glicosídeos de esteviol conhecidos incluem rebaudiosídeo B, C, D, E, F e M, esteviolbiosídeo e rubusosídeo.
[005] Embora métodos sejam conhecidos para a preparação de glicosídeos de esteviol a partir de Stevia rebaudiana, muitos desses métodos são inadequados para uso comercial.
[006] Consequentemente, existe uma necessidade de métodos simples, eficientes e econômicos para preparar composições que compreendem glicosídeos de esteviol, incluindo composições de glicosídeo de esteviol altamente purificadas.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[007] A presente invenção fornece um processo para o preparo de uma composição que compreende um glicosídeo de esteviol-alvo colocando uma composição inicial que compreende um substrato orgânico em contato com uma célula microbiana e/ou preparação de enzima, produzindo, assim, uma composição que compreende um glicosídeo de esteviol-alvo.
[008] A composição inicial pode ser qualquer composto orgânico que compreende pelo menos um átomo de carbono. Em uma modalidade, a composição inicial é selecionada do grupo que consiste em glicosídeos de esteviol, polióis ou álcoois de açúcar, vários carboidratos.
[009] O glicosídeo de esteviol-alvo pode ser qualquer glicosídeo de esteviol. Em uma modalidade, o glicosídeo de esteviol-alvo é esteviolmonosídeo, esteviolmonosídeo A, esteviolbiosídeo A, esteviolbiosídeo B, esteviolbiosídeo C, esteviolbiosídeo D, esteviolbiosídeo E, rubusosídeo, dulcosídeo A, dulcosídeo C, dulcosídeo D, esteviosídeo A, esteviosídeo B, esteviosídeo C, esteviosídeo G, esteviosídeo H, rebaudiosídeo B2,
3 / 135 rebaudiosídeo A4, rebaudiosídeo C, rebaudiosídeo C3, rebaudiosídeo C4, rebaudiosídeo C5, rebaudiosídeo C6, rebaudiosídeo E3, rebaudiosídeo E4, rebaudiosídeo E5, rebaudiosídeo E6, rebaudiosídeo E7, rebaudiosídeo D5, rebaudiosídeo D6, rebaudiosídeo D7, rebaudiosídeo D8, rebaudiosídeo H2, rebaudiosídeo H3, rebaudiosídeo H4, rebaudiosídeo H5, rebaudiosídeo H6, rebaudiosídeo K, rebaudiosídeo N2, rebaudiosídeo N3, rebaudiosídeo N4, rebaudiosídeo N5, rebaudiosídeo M3, rebaudiosídeo O4 ou um glicosídeo de esteviol sintético.
[0010] Em uma modalidade, o glicosídeo de esteviol-alvo é rebaudiosídeo N2.
[0011] Em uma modalidade, o glicosídeo de esteviol-alvo é rebaudiosídeo O4.
[0012] Em algumas modalidades preferenciais, são usadas uma preparação de enzima que compreende uma ou mais enzimas, ou uma célula microbiana que compreende uma ou mais enzimas, capaz de converter a composição inicial em glicosídeos de esteviol-alvo. A enzima pode estar situada sobre a superfície e/ou dentro da célula. A preparação de enzima pode ser fornecida sob a forma de uma suspensão de células inteiras, um lisado bruto ou como enzima(s) purificada(s). A preparação de enzima pode estar na forma livre ou imobilizada em um suporte sólido feito de materiais inorgânicos ou orgânicos.
[0013] Em algumas modalidades, uma célula microbiana compreende as enzimas necessárias e os genes que codificam as mesmas para converter a composição inicial em glicosídeos de esteviol-alvo. Consequentemente, a presente invenção também fornece um processo para preparar uma composição que compreende um glicosídeo de esteviol-alvo colocando uma composição inicial que compreende um substrato orgânico em contato com uma célula microbiana que compreende ao menos uma enzima capaz de converter a composição inicial em glicosídeos de esteviol como alvo,
4 / 135 produzindo, assim, um meio que compreende pelo menos um glicosídeo de esteviol-alvo.
[0014] As enzimas necessárias para converter a composição inicial em glicosídeos de esteviol-alvo incluem as enzimas de biossíntese do esteviol, UDP-glucosiltransferases (UGTs), UDP-glicosiltransferases (deste ponto em diante UGlyTs) e/ou enzima de reciclagem de UDP.
[0015] Em uma modalidade, as enzimas de biossíntese do esteviol incluem enzimas da via do mevalonato (MVA).
[0016] Em uma outra modalidade, as enzimas de biossíntese do esteviol incluem as enzimas da via do não mevalonato 2-C-metil-D-eritritol- 4-fosfato (MEP/DOXP).
[0017] Em uma modalidade, as enzimas de biossíntese do esteviol são selecionadas a partir do grupo que inclui geranilgeranil difosfato sintase, copalil difosfato sintase, caureno sintase, caureno oxidase, ácido caurenoico 13-hidroxilase (KAH), esteviol sintetase, desóxi-xilulose 5-fosfato-sintase (DXS), D-1-desóxi-xilulose 5-fosfato reductoisomerase (DXR), 4- difosfocitidil-2-C-metil-D-eritritol sintase (CMS), 4-difosfocitidil-2-C-metil- D-eritritol quinase (CMK), 4-difosfocitidil-2-C-metil-D-eritritol 2,4- ciclodifosfato sintase (MCS), l-hidróxi-2-metil-2(E)- butenil 4-difosfato sintase (HDS), l-hidróxi-2-metil-2(E)-butenil 4-difosfato redutase (HDR), acetoacetil-CoA tiolase, HMG-CoA redutase truncada, mevalonato quinase, fosfomevalonato quinase, mevalonato pirofosfato descarboxilase, citocromo P450 redutase, etc.
[0018] A UDP-glucosiltransferase pode ser qualquer UDP- glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao esteviol e/ou um substrato de glicosídeo de esteviol para fornecer o glicosídeo de esteviol-alvo.
[0019] A UDP-glicosiltransferase pode ser qualquer UDP- glicosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de ramnose a
5 / 135 esteviol e/ou um substrato de glicosídeo de esteviol para fornecer o glicosídeo de esteviol-alvo.
[0020] Conforme utilizado deste ponto em diante, o termo "SuSy_AT", a menos que especificado de outro modo, refere-se à sacarose sintase que tem uma sequência de aminoácidos "SEQ ID 1" conforme descrita no Exemplo 1, ou um polipeptídeo que tem uma identidade de sequência de aminoácidos substancial (> 85%, > 86%, > 87%, > 88%, > 89%, > 90%, > 91%, > 92%, > 93%, > 94%, > 95%, > 96%, > 97%, > 98%, > 99%) com o polipeptídeo da SEQ ID 1, bem como moléculas de ácido nucleico isoladas que codificam esses polipeptídeos.
[0021] Conforme utilizado deste ponto em diante, o termo "UGTS12", a menos que especificado de outro modo, refere-se à UDP- glicosiltransferase que tem uma sequência de aminoácidos "SEQ ID 2" conforme descrita no Exemplo 1, ou um polipeptídeo que tem uma identidade de sequência de aminoácidos substancial (> 85%, > 86%, > 87%, > 88%, > 89%, > 90%, > 91%, > 92%, > 93%, > 94%, > 95%, > 96%, > 97%, > 98%, > 99%) com o polipeptídeo da SEQ ID 2, bem como moléculas de ácido nucleico isoladas que codificam esses polipeptídeos.
[0022] Conforme utilizado deste ponto em diante, o termo "UGT76G1", a menos que especificado de outro modo, refere-se à UDP- glicosiltransferase que tem uma sequência de aminoácidos "SEQ ID 3" conforme descrita no Exemplo 1, ou um polipeptídeo que tem uma identidade de sequência de aminoácidos substancial (> 85%, > 86%, > 87%, > 88%, > 89%, > 90%, > 91%, > 92%, > 93%, > 94%, > 95%, > 96%, > 97%, > 98%, > 99%) com o polipeptídeo da SEQ ID 3, bem como moléculas de ácido nucleico isoladas que codificam esses polipeptídeos.
[0023] Conforme utilizado deste ponto em diante, o termo "UGlyT91C1", a menos que especificado de outro modo, refere-se à UDP- glicosiltransferase que tem uma sequência de aminoácidos "SEQ ID 4"
6 / 135 conforme descrita no Exemplo 1, ou um polipeptídeo que tem uma identidade de sequência de aminoácidos substancial (> 85%, > 86%, > 87%, > 88%, > 89%, > 90%, > 91%, > 92%, > 93%, > 94%, > 95%, > 96%, > 97%, > 98%, > 99%) com o polipeptídeo da SEQ ID 4, bem como moléculas de ácido nucleico isoladas que codificam esses polipeptídeos.
[0024] Em uma modalidade, as enzimas de biossíntese do esteviol, UDP-glucosiltransferases e UDP-glicosiltransferases, são produzidas em uma célula microbiana. A célula microbiana pode ser, por exemplo, E. coli, Saccharomyces sp., Aspergillus sp., Pichia sp., Bacillus sp., Yarrowia sp. etc. Em uma outra modalidade, as UDP-glucosiltransferases são sintetizadas.
[0025] Em uma modalidade, a UDP-glucosiltransferase é selecionada do grupo que inclui UGT74G1, UGT85C2, UGT76G1, UGT91D2, UGTSl2, EUGT11 e UGTs com uma identidade de sequência de aminoácidos substancial (> 85%, > 86%, > 87%, > 88%, > 89%, > 90%, > 91%, > 92%, > 93%, > 94%, > 95%, > 96%,> 97%, > 98%, > 99%) com esses polipeptídeos, bem como com as moléculas de ácido nucleico isoladas que codificam essas UGTs.
[0026] Em uma modalidade, a UDP-glicosiltransferase é selecionada do grupo que inclui UGlyT91C1 e UGlyTs com uma identidade de sequência de aminoácido substancial (> 85%, > 86%, > 87%, > 88%, > 89%, > 90%, > 91%, > 92%, > 93%, > 94%, > 95%, > 96%,> 97%, > 98%, > 99%) com esses polipeptídeos, bem como com as moléculas de ácido nucleico isoladas que codificam essas UGlyTs.
[0027] Em uma modalidade, as enzimas de biossíntese do esteviol, UGTs, UGlyTs, sistema de reciclagem da UDP-glicose e sistema de reciclagem da UDP-ramnose estão presentes em um micro-organismo (célula microbiana). O micro-organismo pode ser, por exemplo, E. coli, Saccharomyces sp., Aspergillus sp., Pichia sp., Bacillus sp., Yarrowia sp.
[0028] Em uma modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer
7 / 135 UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao esteviol ou qualquer glicosídeo de esteviol inicial que tem um grupo funcional -OH em C13 para fornecer um glicosídeo de esteviol-alvo com uma ligação glicosídica de -O-glicose beta-glicopiranosídeo em C13. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT85C2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT85C2.
[0029] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao esteviol ou qualquer glicosídeo de esteviol inicial que tem um grupo funcional -COOH em C19 para fornecer um glicosídeo de esteviol-alvo que tem uma ligação glicosídica de -COO-glicose beta-glicopiranosídeo em C19. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT74G1 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT74G1.
[0030] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose à glicose existente em C19 de qualquer glicosídeo de esteviol inicial para fornecer um glicosídeo de esteviol-alvo com ao menos uma glicose adicional contendo pelo menos uma ligação glicosídica beta-1®2 glicopiranosídeo na(s) ligação(ões) glicosídica(s) recém-formada(s). Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGTSl2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGTSl2. Em uma outra modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é EUGT11 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com EUGT11. Em ainda outra modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT91D2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT91D2.
[0031] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade
8 / 135 de glicose à glicose existente em C19 de qualquer glicosídeo de esteviol inicial para fornecer um glicosídeo de esteviol-alvo com ao menos uma glicose adicional contendo pelo menos uma ligação glicosídica beta-1®3 glicopiranosídeo na(s) ligação(ões) glicosídica(s) recém-formada(s). Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT76G1 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT76G1.
[0032] Em uma outra modalidade, a UDP-glicosiltransferase é qualquer UDP-glicosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de ramnose à glicose existente em C13 de qualquer glicosídeo de esteviol inicial para fornecer um glicosídeo de esteviol-alvo com ao menos uma ramnose adicional contendo pelo menos uma ligação glicosídica alfa-1®2 glicopiranosídeo na(s) ligação(ões) glicosídica(s) recém-formada(s). Em uma modalidade específica, a UDP-glicosiltransferase é UGlyT91C1 ou uma UGlyT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGlyT91C1.
[0033] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose à glicose existente em C13 de qualquer glicosídeo de esteviol inicial para fornecer um glicosídeo de esteviol-alvo com ao menos uma glicose adicional contendo pelo menos uma ligação glicosídica beta-1®3 glicopiranosídeo na(s) ligação(ões) glicosídica(s) recém-formada(s). Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT76G1 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT76G1.
[0034] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose à glicose existente em C13 de qualquer glicosídeo de esteviol inicial para fornecer um glicosídeo de esteviol-alvo com ao menos uma glicose adicional contendo pelo menos uma ligação glicosídica beta-1®6 glicopiranosídeo na(s) ligação(ões) glicosídica(s) recém-formada(s). Em uma
9 / 135 modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGTSl2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGTSl2. Em uma outra modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é EUGT11 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com EUGT11. Em ainda outra modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT91D2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT91D2.
[0035] Em uma modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao esteviol para formar esteviolmonosídeo. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT85C2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT85C2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT85C2.
[0036] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao esteviol para formar esteviolmonosídeo A. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT74G1 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT74G1.
[0037] Em uma outra modalidade, a UDP-glicosiltransferase é qualquer UDP-glicosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de ramnose ao esteviolmonosídeo para formar esteviolbiosídeo C. Em uma modalidade específica, a UDP-glicosiltransferase é UGlyT91C1 ou uma UGlyT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGlyT91C1.
[0038] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao esteviolmonosídeo para formar esteviolbiosídeo D. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT76G1 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT76G1.
10 / 135
[0039] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao esteviolmonosídeo para formar esteviolbiosídeo E. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGTSl2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGTSl2. Em uma outra modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é EUGT11 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com EUGT11. Em ainda outra modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT91D2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT91D2.
[0040] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao esteviolmonosídeo para formar rubusosídeo. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT74G1 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT74G1.
[0041] Em uma modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao esteviolmonosídeo A para formar rubusosídeo. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT85C2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT85C2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT85C2.
[0042] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao esteviolmonosídeo A para formar esteviolbiosídeo A. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGTSl2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGTSl2. Em uma outra modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é EUGT11 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com EUGT11. Em ainda outra modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é
11 / 135 UGT91D2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT91D2.
[0043] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao esteviolmonosídeo A para formar esteviolbiosídeo B. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT76G1 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT76G1.
[0044] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao esteviolbiosídeo C para formar dulcosídeo C. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT76G1 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT76G1.
[0045] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao esteviolbiosídeo C para formar dulcosídeo D. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGTSl2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGTSl2. Em uma outra modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é EUGT11 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com EUGT11. Em ainda outra modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT91D2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT91D2.
[0046] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao esteviolbiosídeo C para formar dulcosídeo A. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT74G1 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT74G1.
[0047] Em uma outra modalidade, a UDP-glicosiltransferase é qualquer UDP-glicosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade
12 / 135 de ramnose ao esteviolbiosídeo D para formar dulcosídeo C. Em uma modalidade específica, a UDP-glicosiltransferase é UGlyT91C1 ou uma UGlyT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGlyT91C1.
[0048] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao esteviolbiosídeo D para formar rebaudiosídeo B2. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGTSl2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGTSl2. Em uma outra modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é EUGT11 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com EUGT11. Em ainda outra modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT91D2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT91D2.
[0049] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao esteviolbiosídeo D para formar esteviosídeo G. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT74G1 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT74G1.
[0050] Em uma outra modalidade, a UDP-glicosiltransferase é qualquer UDP-glicosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de ramnose ao esteviolbiosídeo E para formar dulcosídeo D. Em uma modalidade específica, a UDP-glicosiltransferase é UGlyT91C1 ou uma UGlyT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGlyT91C1.
[0051] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao esteviolbiosídeo E para formar rebaudiosídeo B2. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT76G1 ou uma UGT
13 / 135 com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT76G1.
[0052] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao esteviolbiosídeo E para formar esteviosídeo H. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT74G1 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT74G1.
[0053] Em uma outra modalidade, a UDP-glicosiltransferase é qualquer UDP-glicosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de ramnose ao rubusosídeo para formar dulcosídeo A. Em uma modalidade específica, a UDP-glicosiltransferase é UGlyT91C1 ou uma UGlyT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGlyT91C1.
[0054] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao rubusosídeo para formar esteviosídeo G. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT76G1 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT76G1.
[0055] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao rubusosídeo para formar esteviosídeo H. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGTSl2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGTSl2. Em uma outra modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é EUGT11 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com EUGT11. Em ainda outra modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT91D2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT91D2.
[0056] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao rubusosídeo para formar esteviosídeo A. Em uma modalidade
14 / 135 específica, a UDP-glucosiltransferase é UGTSl2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGTSl2. Em uma outra modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é EUGT11 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com EUGT11. Em ainda outra modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT91D2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT91D2.
[0057] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao rubusosídeo para formar esteviosídeo B. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT76G1 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT76G1.
[0058] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao esteviolbiosídeo A para formar esteviosídeo A. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT85C2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT85C2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT85C2.
[0059] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao esteviolbiosídeo A para formar esteviosídeo C. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT76G1 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT76G1.
[0060] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao esteviolbiosídeo B para formar esteviosídeo B. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT85C2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT85C2 ou
15 / 135 uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT85C2.
[0061] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao esteviolbiosídeo B para formar esteviosídeo C. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGTSl2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGTSl2. Em uma outra modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é EUGT11 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com EUGT11. Em ainda outra modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT91D2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT91D2.
[0062] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao dulcosídeo C para formar rebaudiosídeo C3. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGTSl2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGTSl2. Em uma outra modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é EUGT11 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com EUGT11. Em ainda outra modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT91D2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT91D2.
[0063] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao dulcosídeo C para formar rebaudiosídeo C. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT74G1 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT74G1.
[0064] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade
16 / 135 de glicose ao dulcosídeo D para formar rebaudiosídeo C3. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT76G1 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT76G1.
[0065] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao dulcosídeo D para formar rebaudiosídeo C4. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT74G1 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT74G1.
[0066] Em uma outra modalidade, a UDP-glicosiltransferase é qualquer UDP-glicosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de ramnose ao rebaudiosídeo B2 para formar rebaudiosídeo C3. Em uma modalidade específica, a UDP-glicosiltransferase é UGlyT91C1 ou uma UGlyT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGlyT91C1.
[0067] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao rebaudiosídeo B2 para formar rebaudiosídeo A4. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT74G1 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT74G1.
[0068] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao dulcosídeo A para formar rebaudiosídeo C. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT76G1 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT76G1.
[0069] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao dulcosídeo A para formar rebaudiosídeo C4. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGTSl2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGTSl2. Em
17 / 135 uma outra modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é EUGT11 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com EUGT11. Em ainda outra modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT91D2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT91D2.
[0070] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao dulcosídeo A para formar rebaudiosídeo C5. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGTSl2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGTSl2. Em uma outra modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é EUGT11 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com EUGT11. Em ainda outra modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT91D2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT91D2.
[0071] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao dulcosídeo A para formar rebaudiosídeo C6. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT76G1 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT76G1.
[0072] Em uma outra modalidade, a UDP-glicosiltransferase é qualquer UDP-glicosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de ramnose ao esteviosídeo G para formar rebaudiosídeo C. Em uma modalidade específica, a UDP-glicosiltransferase é UGlyT91C1 ou uma UGlyT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGlyT91C1.
[0073] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao esteviosídeo G para formar rebaudiosídeo A4. Em uma
18 / 135 modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGTSl2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGTSl2. Em uma outra modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é EUGT11 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com EUGT11. Em ainda outra modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT91D2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT91D2.
[0074] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao esteviosídeo G para formar rebaudiosídeo E4. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGTSl2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGTSl2. Em uma outra modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é EUGT11 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com EUGT11. Em ainda outra modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT91D2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT91D2.
[0075] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao esteviosídeo G para formar rebaudiosídeo E6. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT76G1 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT76G1.
[0076] Em uma outra modalidade, a UDP-glicosiltransferase é qualquer UDP-glicosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de ramnose ao esteviosídeo H para formar rebaudiosídeo C4. Em uma modalidade específica, a UDP-glicosiltransferase é UGlyT91C1 ou uma UGlyT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGlyT91C1.
[0077] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é
19 / 135 qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao esteviosídeo H para formar rebaudiosídeo A4. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT76G1 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT76G1.
[0078] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao esteviosídeo H para formar rebaudiosídeo E5. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGTSl2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGTSl2. Em uma outra modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é EUGT11 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com EUGT11. Em ainda outra modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT91D2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT91D2.
[0079] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao esteviosídeo H para formar rebaudiosídeo E7. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT76G1 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT76G1.
[0080] Em uma outra modalidade, a UDP-glicosiltransferase é qualquer UDP-glicosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de ramnose ao esteviosídeo A para formar rebaudiosídeo C5. Em uma modalidade específica, a UDP-glicosiltransferase é UGlyT91C1 ou uma UGlyT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGlyT91C1.
[0081] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao esteviosídeo A para formar rebaudiosídeo E4. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT76G1 ou uma UGT
20 / 135 com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT76G1.
[0082] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao esteviosídeo A para formar rebaudiosídeo E5. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGTSl2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGTSl2. Em uma outra modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é EUGT11 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com EUGT11. Em ainda outra modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT91D2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT91D2.
[0083] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao esteviosídeo A para formar rebaudiosídeo E3. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT76G1 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT76G1.
[0084] Em uma outra modalidade, a UDP-glicosiltransferase é qualquer UDP-glicosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de ramnose ao esteviosídeo B para formar rebaudiosídeo C6. Em uma modalidade específica, a UDP-glicosiltransferase é UGlyT91C1 ou uma UGlyT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGlyT91C1.
[0085] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao esteviosídeo B para formar rebaudiosídeo E6. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT76G1 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT76G1.
[0086] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade
21 / 135 de glicose ao esteviosídeo B para formar rebaudiosídeo E7. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGTSl2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGTSl2. Em uma outra modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é EUGT11 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com EUGT11. Em ainda outra modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT91D2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT91D2.
[0087] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao esteviosídeo B para formar rebaudiosídeo E3. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGTSl2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGTSl2. Em uma outra modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é EUGT11 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com EUGT11. Em ainda outra modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT91D2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT91D2.
[0088] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao esteviosídeo C para formar rebaudiosídeo E3. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT85C2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT85C2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT85C2.
[0089] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao rebaudiosídeo C3 para formar rebaudiosídeo H2. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT74G1 ou uma UGT
22 / 135 com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT74G1.
[0090] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao rebaudiosídeo C para formar rebaudiosídeo H2. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGTSl2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGTSl2. Em uma outra modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é EUGT11 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com EUGT11. Em ainda outra modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT91D2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT91D2.
[0091] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao rebaudiosídeo C para formar rebaudiosídeo K. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGTSl2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGTSl2. Em uma outra modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é EUGT11 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com EUGT11. Em ainda outra modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT91D2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT91D2.
[0092] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao rebaudiosídeo C para formar rebaudiosídeo H4. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT76G1 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT76G1.
[0093] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao rebaudiosídeo C4 para formar rebaudiosídeo H2. Em uma
23 / 135 modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT76G1 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT76G1.
[0094] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao rebaudiosídeo C4 para formar rebaudiosídeo H3. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGTSl2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGTSl2. Em uma outra modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é EUGT11 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com EUGT11. Em ainda outra modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT91D2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT91D2.
[0095] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao rebaudiosídeo C4 para formar rebaudiosídeo H5. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT76G1 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT76G1.
[0096] Em uma outra modalidade, a UDP-glicosiltransferase é qualquer UDP-glicosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de ramnose ao rebaudiosídeo A4 para formar rebaudiosídeo H2. Em uma modalidade específica, a UDP-glicosiltransferase é UGlyT91C1 ou uma UGlyT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGlyT91C1.
[0097] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao rebaudiosídeo A4 para formar rebaudiosídeo D5. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGTSl2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGTSl2. Em uma outra modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é EUGT11 ou
24 / 135 uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com EUGT11. Em ainda outra modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT91D2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT91D2.
[0098] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao rebaudiosídeo A4 para formar rebaudiosídeo D6. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT76G1 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT76G1.
[0099] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao rebaudiosídeo C5 para formar rebaudiosídeo K. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT76G1 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT76G1.
[00100] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao rebaudiosídeo C5 para formar rebaudiosídeo H3. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGTSl2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGTSl2. Em uma outra modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é EUGT11 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com EUGT11. Em ainda outra modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT91D2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT91D2.
[00101] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao rebaudiosídeo C5 para formar rebaudiosídeo H6. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT76G1 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT76G1.
25 / 135
[00102] Em uma outra modalidade, a UDP-glicosiltransferase é qualquer UDP-glicosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de ramnose ao rebaudiosídeo E4 para formar rebaudiosídeo K. Em uma modalidade específica, a UDP-glicosiltransferase é UGlyT91C1 ou uma UGlyT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGlyT91C1.
[00103] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao rebaudiosídeo E4 para formar rebaudiosídeo D5. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGTSl2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGTSl2. Em uma outra modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é EUGT11 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com EUGT11. Em ainda outra modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT91D2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT91D2.
[00104] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao rebaudiosídeo E4 para formar rebaudiosídeo D7. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT76G1 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT76G1.
[00105] Em uma outra modalidade, a UDP-glicosiltransferase é qualquer UDP-glicosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de ramnose ao rebaudiosídeo E5 para formar rebaudiosídeo H3. Em uma modalidade específica, a UDP-glicosiltransferase é UGlyT91C1 ou uma UGlyT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGlyT91C1.
[00106] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade
26 / 135 de glicose ao rebaudiosídeo E5 para formar rebaudiosídeo D5. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT76G1 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT76G1.
[00107] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao rebaudiosídeo E5 para formar rebaudiosídeo D8. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT76G1 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT76G1.
[00108] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao rebaudiosídeo C6 para formar rebaudiosídeo H4. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT76G1 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT76G1.
[00109] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao rebaudiosídeo C6 para formar rebaudiosídeo H5. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGTSl2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGTSl2. Em uma outra modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é EUGT11 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com EUGT11. Em ainda outra modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT91D2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT91D2.
[00110] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao rebaudiosídeo C6 para formar rebaudiosídeo H6. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGTSl2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGTSl2. Em uma outra modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é EUGT11 ou
27 / 135 uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com EUGT11. Em ainda outra modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT91D2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT91D2.
[00111] Em uma outra modalidade, a UDP-glicosiltransferase é qualquer UDP-glicosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de ramnose ao rebaudiosídeo E6 para formar rebaudiosídeo H4. Em uma modalidade específica, a UDP-glicosiltransferase é UGlyT91C1 ou uma UGlyT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGlyT91C1.
[00112] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao rebaudiosídeo E6 para formar rebaudiosídeo D6. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGTSl2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGTSl2. Em uma outra modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é EUGT11 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com EUGT11. Em ainda outra modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT91D2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT91D2.
[00113] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao rebaudiosídeo E6 para formar rebaudiosídeo D7. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGTSl2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGTSl2. Em uma outra modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é EUGT11 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com EUGT11. Em ainda outra modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT91D2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de
28 / 135 aminoácidos com UGT91D2.
[00114] Em uma outra modalidade, a UDP-glicosiltransferase é qualquer UDP-glicosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de ramnose ao rebaudiosídeo E7 para formar rebaudiosídeo H5. Em uma modalidade específica, a UDP-glicosiltransferase é UGlyT91C1 ou uma UGlyT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGlyT91C1.
[00115] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao rebaudiosídeo E7 para formar rebaudiosídeo D6. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT76G1 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT76G1.
[00116] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao rebaudiosídeo E7 para formar rebaudiosídeo D8. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGTSl2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGTSl2. Em uma outra modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é EUGT11 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com EUGT11. Em ainda outra modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT91D2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT91D2.
[00117] Em uma outra modalidade, a UDP-glicosiltransferase é qualquer UDP-glicosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de ramnose ao rebaudiosídeo E3 para formar rebaudiosídeo H6. Em uma modalidade específica, a UDP-glicosiltransferase é UGlyT91C1 ou uma UGlyT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGlyT91C1.
[00118] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é
29 / 135 qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao rebaudiosídeo E3 para formar rebaudiosídeo D7. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT76G1 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT76G1.
[00119] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao rebaudiosídeo E3 para formar rebaudiosídeo D8. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGTSl2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGTSl2. Em uma outra modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é EUGT11 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com EUGT11. Em ainda outra modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT91D2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT91D2.
[00120] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao rebaudiosídeo H2 para formar rebaudiosídeo N3. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGTSl2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGTSl2. Em uma outra modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é EUGT11 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com EUGT11. Em ainda outra modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT91D2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT91D2.
[00121] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao rebaudiosídeo H2 para formar rebaudiosídeo N4. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT76G1 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT76G1.
30 / 135
[00122] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao rebaudiosídeo K para formar rebaudiosídeo N3. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGTSl2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGTSl2. Em uma outra modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é EUGT11 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com EUGT11. Em ainda outra modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT91D2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT91D2.
[00123] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao rebaudiosídeo K para formar rebaudiosídeo N2. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT76G1 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT76G1.
[00124] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao rebaudiosídeo H3 para formar rebaudiosídeo N3. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT76G1 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT76G1.
[00125] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao rebaudiosídeo H3 para formar rebaudiosídeo N5. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT76G1 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT76G1.
[00126] Em uma outra modalidade, a UDP-glicosiltransferase é qualquer UDP-glicosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de ramnose ao rebaudiosídeo D5 para formar rebaudiosídeo N3. Em uma modalidade específica, a UDP-glicosiltransferase é UGlyT91C1 ou uma
31 / 135 UGlyT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGlyT91C1.
[00127] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao rebaudiosídeo D5 para formar rebaudiosídeo M3. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT76G1 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT76G1.
[00128] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao rebaudiosídeo H4 para formar rebaudiosídeo N4. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGTSl2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGTSl2. Em uma outra modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é EUGT11 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com EUGT11. Em ainda outra modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT91D2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT91D2.
[00129] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao rebaudiosídeo H4 para formar rebaudiosídeo N2. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGTSl2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGTSl2. Em uma outra modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é EUGT11 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com EUGT11. Em ainda outra modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT91D2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT91D2.
[00130] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade
32 / 135 de glicose ao rebaudiosídeo H5 para formar rebaudiosídeo N4. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT76G1 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT76G1.
[00131] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao rebaudiosídeo H5 para formar rebaudiosídeo N5. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGTSl2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGTSl2. Em uma outra modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é EUGT11 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com EUGT11. Em ainda outra modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT91D2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT91D2.
[00132] Em uma outra modalidade, a UDP-glicosiltransferase é qualquer UDP-glicosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de ramnose ao rebaudiosídeo D6 para formar rebaudiosídeo N4. Em uma modalidade específica, a UDP-glicosiltransferase é UGlyT91C1 ou uma UGlyT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGlyT91C1.
[00133] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao rebaudiosídeo D6 para formar rebaudiosídeo M3. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGTSl2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGTSl2. Em uma outra modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é EUGT11 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com EUGT11. Em ainda outra modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT91D2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT91D2.
33 / 135
[00134] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao rebaudiosídeo H6 para formar rebaudiosídeo N2. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT76G1 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT76G1.
[00135] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao rebaudiosídeo H6 para formar rebaudiosídeo N5. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGTSl2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGTSl2. Em uma outra modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é EUGT11 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com EUGT11. Em ainda outra modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT91D2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT91D2.
[00136] Em uma outra modalidade, a UDP-glicosiltransferase é qualquer UDP-glicosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de ramnose ao rebaudiosídeo D7 para formar rebaudiosídeo N2. Em uma modalidade específica, a UDP-glicosiltransferase é UGlyT91C1 ou uma UGlyT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGlyT91C1.
[00137] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao rebaudiosídeo D7 para formar rebaudiosídeo M3. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGTSl2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGTSl2. Em uma outra modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é EUGT11 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com EUGT11. Em ainda outra modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é
34 / 135 UGT91D2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT91D2.
[00138] Em uma outra modalidade, a UDP-glicosiltransferase é qualquer UDP-glicosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de ramnose ao rebaudiosídeo D8 para formar rebaudiosídeo N5. Em uma modalidade específica, a UDP-glicosiltransferase é UGlyT91C1 ou uma UGlyT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGlyT91C1.
[00139] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao rebaudiosídeo D8 para formar rebaudiosídeo M3. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT76G1 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT76G1.
[00140] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao rebaudiosídeo N3 para formar rebaudiosídeo O4. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT76G1 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT76G1.
[00141] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao rebaudiosídeo N4 para formar rebaudiosídeo O4. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGTSl2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGTSl2. Em uma outra modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é EUGT11 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com EUGT11. Em ainda outra modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT91D2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT91D2.
[00142] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é
35 / 135 qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao rebaudiosídeo N2 para formar rebaudiosídeo O4. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGTSl2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGTSl2. Em uma outra modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é EUGT11 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com EUGT11. Em ainda outra modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT91D2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT91D2.
[00143] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao rebaudiosídeo N5 para formar rebaudiosídeo K4. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT76G1 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT76G1.
[00144] Em uma outra modalidade, a UDP-glicosiltransferase é qualquer UDP-glicosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de ramnose ao rebaudiosídeo M3 para formar rebaudiosídeo O4. Em uma modalidade específica, a UDP-glicosiltransferase é UGlyT91C1 ou uma UGlyT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGlyT91C1.
[00145] Opcionalmente, o método da presente invenção compreende adicionalmente reciclar UDP para fornecer UDP-glicose. Em uma modalidade, o método compreende reciclar UDP mediante o fornecimento de um catalisador de reciclagem e um substrato de reciclagem, de modo que a biotransformação do esteviol e/ou do substrato de glicosídeo de esteviol em glicosídeo de esteviol-alvo seja executada com o uso de quantidades catalíticas de UDP-glucosiltransferase e UDP-glicose.
[00146] Opcionalmente, o método da presente invenção compreende adicionalmente reciclar UDP para fornecer UDP-ramnose. Em uma
36 / 135 modalidade, o método compreende reciclar UDP mediante o fornecimento de um catalisador de reciclagem e um substrato de reciclagem, de modo que a biotransformação do esteviol e/ou do substrato de glicosídeo de esteviol em glicosídeo de esteviol-alvo seja executada com o uso de quantidades catalíticas de UDP-glicosiltransferase e UDP-ramnose.
[00147] Em uma modalidade, o catalisador de reciclagem é sacarose sintase SuSy_At ou uma sacarose sintase com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com SuSy_At.
[00148] Em uma modalidade, o substrato para reciclagem para o catalisador da reciclagem da UDP-glicose é sacarose.
[00149] Em uma modalidade, o substrato de reciclagem para o catalisador da reciclagem da UDP-ramnose é uma molécula que compreende um resíduo de ramnosil.
[00150] Opcionalmente, o método da presente invenção compreende adicionalmente o uso de transglicosidases que usam oligo ou polissacarídeos como doador de açúcar para modificar moléculas de glicosídeo de esteviol- alvo. Exemplos não limitadores incluem ciclodextrina glicosiltransferase (CGTase), frutofuranosidase, amilase, sacarase, glicossucrase, beta-h- frutosidase, beta-frutosidase, sucrase, frutossilinvertase, invertase alcalina, invertase ácida, frutofuranosidase. Em algumas modalidades, glicose e outro(s) açúcar(es) além da glicose, incluindo, mas não se limitando a, frutose, xilose, ramnose, arabinose, desoxiglicose, galactose, são transferidos para os glicosídeos de esteviol-alvo receptores. Em uma modalidade, o glicosídeo de esteviol receptor é rebaudiosídeo N2. Em uma outra modalidade, o glicosídeo de esteviol receptor é rebaudiosídeo O4.
[00151] Opcionalmente, o método da presente invenção compreende adicionalmente separar o glicosídeo de esteviol-alvo do meio para fornecer uma composição de glicosídeo de esteviol-alvo altamente purificada. O glicosídeo de esteviol-alvo pode ser separado por pelo menos um método
37 / 135 adequado, como, por exemplo, cristalização, separação por membranas, centrifugação, extração, separação cromatográfica ou uma combinação de tais métodos.
[00152] Em uma modalidade, o glicosídeo de esteviol-alvo pode ser produzido dentro do micro-organismo. Em uma outra modalidade, o glicosídeo de esteviol-alvo pode ser secretado para o meio. Em uma outra modalidade, o glicosídeo de esteviol liberado pode ser continuamente removido do meio. Em ainda outra modalidade, o glicosídeo de esteviol-alvo é separado após a conclusão da reação de conversão.
[00153] Em uma modalidade, a separação produz uma composição que compreende mais que cerca de 80%, em peso, do glicosídeo de esteviol-alvo em uma base anidra, isto é, uma composição de glicosídeo de esteviol altamente purificada. Em uma outra modalidade, a separação produz uma composição que compreende mais que cerca de 90%, em peso, do glicosídeo de esteviol-alvo. Em modalidades específicas, a composição compreende mais que cerca de 95%, em peso, do glicosídeo de esteviol-alvo. Em outras modalidades, a composição compreende mais que cerca de 99%, em peso, do glicosídeo de esteviol-alvo.
[00154] O glicosídeo de esteviol-alvo pode estar em qualquer forma polimórfica ou amorfa, incluindo hidratos, solvatos, anidros ou combinações dos mesmos.
[00155] Os glicosídeos de esteviol-alvo purificados podem ser usados em produtos consumíveis como um adoçante, modificador de sabor, flavorizante com propriedades de modificação e/ou supressor de espuma. Produtos adequados ao consumidor incluem, mas não se limitam a, alimentos, bebidas, composições farmacêuticas, produtos de tabaco, composições nutracêuticas, composições para higiene bucal e composições cosméticas.
[00156] As informações anteriormente mencionadas descreveram amplamente os recursos e as vantagens técnicas da presente invenção para
38 / 135 que a descrição detalhada da invenção a seguir possa ser mais bem compreendida. Recursos e vantagens adicionais da presente invenção que formam o assunto das reivindicações da invenção serão descritas mais adiante neste documento. Deve ser entendido pelos versados na técnica que a concepção e a modalidade específica reveladas podem ser prontamente usadas como base para modificar ou projetar outras estruturas destinadas à realização dos mesmos propósitos da presente invenção. Também deve ser compreendido pelos versados na técnica que tais construções equivalentes não se afastam do espírito e escopo da invenção, conforme apresentado nas reivindicações em anexo. Os recursos inovadores que se acredita serem característicos da invenção, em relação à sua organização e ao método de operação, juntamente com objetivos e vantagens adicionais, serão mais bem compreendidos a partir da descrição a seguir quando considerados em conexão com as figuras em anexo. Deve-se entender expressamente, entretanto, que cada uma das figuras é fornecida com o propósito apenas de ilustração e descrição e não se destina a consistir em uma definição dos limites da presente invenção.
[00157] BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[00158] As Figuras 1a e 1b mostram a estrutura química do rebaudiosídeo N2. As Figuras 1c e 1d mostram a estrutura química do rebaudiosídeo O4. A Figura 1e mostra a estrutura química de um glicosídeo de esteviol com uma estrutura de aglicona.
[00159] A Figura 2a até a Figura 2 l mostram as rotas de produção de rebaudiosídeo N2, rebaudiosídeo O4 e vários glicosídeos de esteviol a partir de esteviol e dos vários glicosídeos de esteviol intermediários.
[00160] A Figura 3a mostra a produção biocatalítica de rebaudiosídeo N2 a partir do rebaudiosídeo C usando as enzimas UGTSl2 e UGT76G1 e a reciclagem concomitante de UDP em UDP-glicose através da sacarose sintase SuSy_At. A Figura 3b mostra a produção biocatalítica de rebaudiosídeo O4 a
39 / 135 partir do rebaudiosídeo C usando as enzimas UGTSl2 e UGT76G1 e a reciclagem concomitante de UDP em UDP-glicose através da sacarose sintase SuSy_At.
[00161] A Figura 4 mostra o cromatograma HPLC de rebaudiosídeo C. O pico com tempo de retenção de 24,535 minutos corresponde ao rebaudiosídeo C.
[00162] A Figura 5 mostra o cromatograma HPLC do produto da produção biocatalítica de rebaudiosídeo N2 e rebaudiosídeo O4 a partir do rebaudiosídeo C. Os picos com o tempo de retenção de 11,317 minutos e 8,603 minutos correspondem ao rebaudiosídeo N2 e ao rebaudiosídeo O4, respectivamente. O pico em 12,567 minutos corresponde ao rebaudiosídeo K.
[00163] A Figura 6a mostra o cromatograma HPLC do rebaudiosídeo N2 após a purificação por HPLC. O pico com tempo de retenção de 10,745 minutos corresponde ao rebaudiosídeo N2. A Figura 6b mostra o cromatograma HPLC do rebaudiosídeo O4 após a purificação por HPLC. O pico com tempo de retenção de 8,185 minutos corresponde ao rebaudiosídeo O4.
[00164] As Figura 7a e 7b mostram o espectro de RMN-1H do rebaudiosídeo N2 e do rebaudiosídeo O4 (500 MHz, piridina-d5), respectivamente.
[00165] As Figuras 8a e 8b mostram o espectro HSQC do rebaudiosídeo N2 e do rebaudiosídeo O4 (500 MHz, piridina-d5), respectivamente.
[00166] As Figuras 9a e 9b mostram o espectro COSY H,H do rebaudiosídeo N2 e do rebaudiosídeo O4 (500 MHz, piridina-d5), respectivamente.
[00167] As Figuras 10a e 10b mostram o espectro HMBC do rebaudiosídeo N2 e do rebaudiosídeo O4 (500 MHz, piridina-d5), respectivamente.
40 / 135
[00168] As Figuras 11a e 11b mostram o espectro HSQC-TOCSY do rebaudiosídeo N2 e rebaudiosídeo O4 (500 MHz, piridina-d5), respectivamente.
[00169] As Figuras 12a e 12b mostram o cromatograma LC e o espectro de massa do rebaudiosídeo N2, respectivamente.
[00170] As Figuras 13a e 13b mostram o cromatograma LC e o espectro de massa do rebaudiosídeo O4, respectivamente.
DESCRIÇÃO DETALHADA
[00171] A presente invenção fornece um processo para o preparo de uma composição que compreende um glicosídeo de esteviol-alvo colocando uma composição inicial que compreende um substrato orgânico em contato com uma célula microbiana e/ou preparação de enzima, produzindo, assim, uma composição que compreende um glicosídeo de esteviol-alvo.
[00172] Um objetivo da invenção é fornecer um método biocatalítico eficiente para preparar glicosídeos de esteviol-alvo, particularmente, esteviolmonosídeo, esteviolmonosídeo A, esteviolbiosídeo A, esteviolbiosídeo B, esteviolbiosídeo C, esteviolbiosídeo D, esteviolbiosídeo E, rubusosídeo, dulcosídeo A, dulcosídeo C, dulcosídeo D, esteviosídeo A, esteviosídeo B, esteviosídeo C, esteviosídeo G, esteviosídeo H, rebaudiosídeo B2, rebaudiosídeo A4, rebaudiosídeo C, rebaudiosídeo C3, rebaudiosídeo C4, rebaudiosídeo C5, rebaudiosídeo C6, rebaudiosídeo E3, rebaudiosídeo E4, rebaudiosídeo E5, rebaudiosídeo E6, rebaudiosídeo E7, rebaudiosídeo D5, rebaudiosídeo D6, rebaudiosídeo D7, rebaudiosídeo D8, rebaudiosídeo H2, rebaudiosídeo H3, rebaudiosídeo H4, rebaudiosídeo H5, rebaudiosídeo H6, rebaudiosídeo K, rebaudiosídeo N2, rebaudiosídeo N3, rebaudiosídeo N4, rebaudiosídeo N5, rebaudiosídeo M3 e/ou rebaudiosídeo O4 ou um glicosídeo de esteviol sintético de várias composições iniciais.
[00173] Como usado aqui, o termo abreviado "reb" se refere a "rebaudiosídeo". Ambos os termos têm o mesmo significado e podem ser
41 / 135 usados de forma intercambiável.
[00174] Para uso na presente invenção, "biocatálise" ou "biocatalítico" se refere ao uso de biocatalisadores naturais ou geneticamente modificados, como enzimas, ou células que compreendem uma ou mais enzimas, capazes de transformações químicas de etapas múltiplas ou únicas em compostos orgânicos. Os processos de biocatálise incluem fermentação, biossíntese, bioconversão e biotransformação. Tanto o método de biocatálise de enzima isolada quanto de células inteiras são conhecidos na técnica. As enzimas de proteínas biocatalisadoras podem ser de ocorrência natural ou proteínas recombinantes.
[00175] Como usado aqui, o termo "glicosídeo(s) de esteviol" se refere a um glicosídeo de esteviol, incluindo, mas não se limitando a, glicosídeos de esteviol de ocorrência natural, por exemplo, esteviolmonosídeo, esteviolmonosídeo A, esteviolbiosídeo A, esteviolbiosídeo B, esteviolbiosídeo C, esteviolbiosídeo D, esteviolbiosídeo E, rubusosídeo, dulcosídeo A, dulcosídeo C, dulcosídeo D, esteviosídeo A, esteviosídeo B, esteviosídeo C, esteviosídeo G, esteviosídeo H, rebaudiosídeo B2, rebaudiosídeo A4, rebaudiosídeo C, rebaudiosídeo C3, rebaudiosídeo C4, rebaudiosídeo C5, rebaudiosídeo C6, rebaudiosídeo E3, rebaudiosídeo E4, rebaudiosídeo E5, rebaudiosídeo E6, rebaudiosídeo E7, rebaudiosídeo D5, rebaudiosídeo D6, rebaudiosídeo D7, rebaudiosídeo D8, rebaudiosídeo H2, rebaudiosídeo H3, rebaudiosídeo H4, rebaudiosídeo H5, rebaudiosídeo H6, rebaudiosídeo K, rebaudiosídeo N2, rebaudiosídeo N3, rebaudiosídeo N4, rebaudiosídeo N5, rebaudiosídeo M3, rebaudiosídeo O4, glicosídeos de esteviol sintéticos, por exemplo, glicosídeos de esteviol enzimaticamente glicosilados, e combinações dos mesmos. Composição inicial
[00176] Como usado aqui, "composição inicial" se refere a qualquer composição (geralmente uma solução aquosa) contendo um ou mais
42 / 135 compostos orgânicos que compreendem ao menos um átomo de carbono.
[00177] Em uma modalidade, a composição inicial é selecionada do grupo que consiste em esteviol, glicosídeos de esteviol, polióis e vários carboidratos.
[00178] A composição inicial de glicosídeo de esteviol é selecionada do grupo que consiste em esteviolmonosídeo, esteviolmonosídeo A, esteviolbiosídeo A, esteviolbiosídeo B, esteviolbiosídeo C, esteviolbiosídeo D, esteviolbiosídeo E, rubusosídeo, dulcosídeo A, dulcosídeo C, dulcosídeo D, esteviosídeo A, esteviosídeo B, esteviosídeo C, esteviosídeo G, esteviosídeo H, rebaudiosídeo B2, rebaudiosídeo A4, rebaudiosídeo C, rebaudiosídeo C3, rebaudiosídeo C4, rebaudiosídeo C5, rebaudiosídeo C6, rebaudiosídeo E3, rebaudiosídeo E4, rebaudiosídeo E5, rebaudiosídeo E6, rebaudiosídeo E7, rebaudiosídeo D5, rebaudiosídeo D6, rebaudiosídeo D7, rebaudiosídeo D8, rebaudiosídeo H2, rebaudiosídeo H3, rebaudiosídeo H4, rebaudiosídeo H5, rebaudiosídeo H6, rebaudiosídeo K, rebaudiosídeo N2, rebaudiosídeo N3, rebaudiosídeo N4, rebaudiosídeo N5, rebaudiosídeo M3 ou outro glicosídeo de esteviol de ocorrência na planta Stevia rebaudiana, glicosídeos de esteviol sintéticos, por exemplo, glicosídeos de esteviol enzimaticamente glicosilados, e combinações dos mesmos.
[00179] Em uma modalidade, a composição inicial é esteviol.
[00180] Em uma outra modalidade, a composição inicial de glicosídeo de esteviol é esteviolmonosídeo.
[00181] Em ainda outra modalidade, a composição inicial de glicosídeo de esteviol é esteviolmonosídeo A.
[00182] Em uma outra modalidade, a composição inicial de glicosídeo de esteviol é esteviolbiosídeo B.
[00183] Em uma outra modalidade, a composição inicial de glicosídeo de esteviol é esteviolbiosídeo C.
[00184] Em outra modalidade, a composição inicial de glicosídeo de
43 / 135 esteviol é esteviolbiosídeo D.
[00185] Em uma outra modalidade, a composição inicial de glicosídeo de esteviol é esteviolbiosídeo E.
[00186] Em uma outra modalidade, a composição inicial de glicosídeo de esteviol é rubusosídeo.
[00187] Em uma outra modalidade, a composição inicial de glicosídeo de esteviol é dulcosídeo A.
[00188] Em uma outra modalidade, a composição inicial de glicosídeo de esteviol é dulcosídeo C.
[00189] Em uma outra modalidade, a composição inicial de glicosídeo de esteviol é dulcosídeo D.
[00190] Em uma outra modalidade, a composição inicial de glicosídeo de esteviol é esteviosídeo A.
[00191] Em uma outra modalidade, a composição inicial de glicosídeo de esteviol é esteviosídeo B.
[00192] Em uma outra modalidade, a composição inicial de glicosídeo de esteviol é esteviosídeo C.
[00193] Em uma outra modalidade, a composição inicial de glicosídeo de esteviol é esteviosídeo G.
[00194] Em uma outra modalidade, a composição inicial de glicosídeo de esteviol é esteviosídeo H.
[00195] Em uma outra modalidade, a composição inicial de glicosídeo de esteviol é rebaudiosídeo B2.
[00196] Em uma outra modalidade, a composição inicial de glicosídeo de esteviol é rebaudiosídeo B2.
[00197] Em uma outra modalidade, a composição inicial de glicosídeo de esteviol é rebaudiosídeo A4.
[00198] Em uma outra modalidade, a composição inicial de glicosídeo de esteviol é rebaudiosídeo C.
44 / 135
[00199] Em uma outra modalidade, a composição inicial de glicosídeo de esteviol é rebaudiosídeo C3.
[00200] Em uma outra modalidade, a composição inicial de glicosídeo de esteviol é rebaudiosídeo C4.
[00201] Em uma outra modalidade, a composição inicial de glicosídeo de esteviol é rebaudiosídeo C5.
[00202] Em uma outra modalidade, a composição inicial de glicosídeo de esteviol é rebaudiosídeo C6.
[00203] Em uma outra modalidade, a composição inicial de glicosídeo de esteviol é rebaudiosídeo E3.
[00204] Em uma outra modalidade, a composição inicial de glicosídeo de esteviol é rebaudiosídeo E4.
[00205] Em uma outra modalidade, a composição inicial de glicosídeo de esteviol é rebaudiosídeo E5.
[00206] Em uma outra modalidade, a composição inicial de glicosídeo de esteviol é rebaudiosídeo E6.
[00207] Em uma outra modalidade, a composição inicial de glicosídeo de esteviol é rebaudiosídeo E7.
[00208] Em uma outra modalidade, a composição inicial de glicosídeo de esteviol é rebaudiosídeo D5.
[00209] Em uma outra modalidade, a composição inicial de glicosídeo de esteviol é rebaudiosídeo D6.
[00210] Em uma outra modalidade, a composição inicial de glicosídeo de esteviol é rebaudiosídeo D7.
[00211] Em uma outra modalidade, a composição inicial de glicosídeo de esteviol é rebaudiosídeo D8.
[00212] Em uma outra modalidade, a composição inicial de glicosídeo de esteviol é rebaudiosídeo H2.
[00213] Em uma outra modalidade, a composição inicial de glicosídeo
45 / 135 de esteviol é rebaudiosídeo H3.
[00214] Em uma outra modalidade, a composição inicial de glicosídeo de esteviol é rebaudiosídeo H4.
[00215] Em uma outra modalidade, a composição inicial de glicosídeo de esteviol é rebaudiosídeo H5.
[00216] Em uma outra modalidade, a composição inicial de glicosídeo de esteviol é rebaudiosídeo H6.
[00217] Em uma outra modalidade, a composição inicial de glicosídeo de esteviol é rebaudiosídeo K.
[00218] Em uma outra modalidade, a composição inicial de glicosídeo de esteviol é rebaudiosídeo N2.
[00219] Em uma outra modalidade, a composição inicial de glicosídeo de esteviol é rebaudiosídeo N3.
[00220] Em uma outra modalidade, a composição inicial de glicosídeo de esteviol é rebaudiosídeo N4.
[00221] Em uma outra modalidade, a composição inicial de glicosídeo de esteviol é rebaudiosídeo N5.
[00222] Em uma outra modalidade, a composição inicial de glicosídeo de esteviol é rebaudiosídeo M3.
[00223] O termo "poliol" se refere a uma molécula que contém mais de um grupo hidroxila. Um poliol pode ser um diol, triol ou um tetraol que contém 2, 3 e 4 grupos hidroxila, respectivamente. Um poliol também pode conter mais do que quatro grupos hidroxila, como um pentaol, hexaol, heptaol, ou similares, que contêm 5, 6, ou 7 grupos hidroxila, respectivamente. Adicionalmente, um poliol também pode ser um álcool de açúcar, álcool poli-hídrico ou poliálcool que é uma forma reduzida de carboidrato, sendo que o grupo carbonila (aldeído ou cetona, açúcar redutor) foi reduzido a um grupo hidroxila primário ou secundário. Exemplos de polióis incluem, mas não se limitam a, eritritol, malitol, manitol, sorbitol,
46 / 135 lactitol, xilitol, inositol, isomalte, propilenoglicol, glicerol, treitol, galactitol, isomaltulose hidrogenada, isomalto-oligossacarídeos reduzidos, xilo- oligossacarídeos reduzidos, gentio-oligossacarídeos reduzidos, xarope de maltose reduzida, xarope de glicose reduzido, hidrolisados de amido hidrogenado, poliglicitóis e álcoois de açúcar ou quaisquer outros carboidratos capazes de serem reduzidos.
[00224] O termo "carboidrato" se refere a compostos de aldeído ou cetona substituídos com múltiplos grupos hidroxila, com a seguinte fórmula geral (CH2,O)n, em que n é 3 a 30, bem como seus oligômeros e polímeros. Os carboidratos da presente invenção podem, além disso, ser substituídos ou desoxigenados em uma ou mais posições. Os carboidratos, para uso na presente invenção, abrangem carboidratos não modificados, derivados de carboidratos, carboidratos substituídos e carboidratos modificados. Para uso na presente invenção, as expressões "derivados de carboidratos", "carboidrato substituído" e "carboidratos modificados" são sinônimas. Carboidrato modificado significa qualquer carboidrato em que ao menos um átomo foi adicionado, removido ou substituído, ou suas combinações. Dessa forma, derivados de carboidratos ou carboidratos substituídos incluem monossacarídeos, dissacarídeos, oligossacarídeos e polissacarídeos substituídos ou não substituídos. Os derivados de carboidrato ou carboidratos substituídos podem ser opcionalmente desoxigenados em qualquer posição C correspondente e/ou substituídos com uma ou mais porções como hidrogênio, halogênio, haloalquila, carboxila, acila, aciloxila, amino, amida, derivados de carboxila, alquilamino, dialquilamino, arilamino, alcóxi, arilóxi, nitro, ciano, sulfo, mercapto, imino, sulfonila, sulfenila, sulfinila, sulfamoíla, carboalcóxi, carboxamido, fosfonila, fosfinila, fosforila, fosfina, tioéster, tioéter, oximina, hidrazino, carbamila, fosfo, fosfonato ou qualquer outro grupo funcional viável desde que o carboidrato derivado ou o carboidrato substituído funcione para melhorar o sabor doce da composição adoçante.
47 / 135
[00225] Exemplos de carboidratos que podem ser usados de acordo com esta invenção incluem, mas não se limitam a, tagatose, trealose, galactose, ramnose, várias ciclodextrinas, oligossacarídeos cíclicos, vários tipos de maltodextrinas, dextrano, sacarose, glicose, ribulose, frutose, treose, arabinose, xilose, lixose, alose, altrose, manose, idose, lactose, maltose, açúcar invertido, isotrealose, neotrealose, isomaltulose, eritrose, desoxirribose, gulose, idose, talose, eritrulose, xilulose, psicose, turanose, celobiose, amilopectina, glicosamina, manosamina, fucose, ácido glicurônico, ácido glicônico, glucono-lactona, abequose, galactosamina, oligossacarídeos de beterraba, isomalto-oligossacarídeos (isomaltose, isomaltotriose, panose e similares), xilo-oligossacarídeos (xilotriose, xilobiose e similares), oligossacarídeos com terminação em xilo, gentio-oligossacarídeos (gentiobiose, gentiotriose, gentiotetraose e similares), sorbose, nigero- oligossacarídeos, palatinose-oligossacarídeos, fruto-oligosacarídeos (cestose, nistose e similares), maltotetraol, maltotriol, malto-oligossacarídeos (maltotriose, maltotetraose, maltopentaose, maltoexaose, malto-heptaose e similares), amido, inulina, inulo-oligossacarídeos, lactulose, melibiose, rafinose, ribose, açúcares líquidos isomerizados, como xaropes de milho com alto teor de frutose, açúcares de acoplamento e oligossacarídeos de soja. Adicionalmente, os carboidratos como usados aqui podem ser em qualquer configuração D ou L.
[00226] A composição inicial pode ser sintética ou purificada (parcial ou totalmente), comercialmente disponível ou preparada.
[00227] Em uma modalidade, a composição inicial é glicerol.
[00228] Em uma outra modalidade, a composição inicial é glicose.
[00229] Em uma outra modalidade, a composição inicial é ramnose.
[00230] Em ainda uma outra modalidade, a composição inicial é sacarose.
[00231] Em ainda outra modalidade, a composição inicial é amido.
48 / 135
[00232] Em uma outra modalidade, a composição inicial é maltodextrina.
[00233] Em ainda outra modalidade, a composição inicial é celulose.
[00234] Em mais uma outra modalidade, a composição inicial é amilose.
[00235] O(s) composto(s) orgânico(s) da composição inicial serve(m) como substrato(s) para a produção de glicosídeo(s) de esteviol-alvo, conforme descrito na presente invenção. Glicosídeo de esteviol-alvo
[00236] O glicosídeo de esteviol-alvo do presente método pode ser qualquer glicosídeo de esteviol que pode ser preparado pelo processo aqui revelado. Em uma modalidade, o glicosídeo de esteviol-alvo é selecionado do grupo que consiste em esteviolmonosídeo, esteviolmonosídeo A, esteviolbiosídeo A, esteviolbiosídeo B, esteviolbiosídeo C, esteviolbiosídeo D, esteviolbiosídeo E, rubusosídeo, dulcosídeo A, dulcosídeo C, dulcosídeo D, esteviosídeo A, esteviosídeo B, esteviosídeo C, esteviosídeo G, esteviosídeo H, rebaudiosídeo B2, rebaudiosídeo A4, rebaudiosídeo C, rebaudiosídeo C3, rebaudiosídeo C4, rebaudiosídeo C5, rebaudiosídeo C6, rebaudiosídeo E3, rebaudiosídeo E4, rebaudiosídeo E5, rebaudiosídeo E6, rebaudiosídeo E7, rebaudiosídeo D5, rebaudiosídeo D6, rebaudiosídeo D7, rebaudiosídeo D8, rebaudiosídeo H2, rebaudiosídeo H3, rebaudiosídeo H4, rebaudiosídeo H5, rebaudiosídeo H6, rebaudiosídeo K, rebaudiosídeo N2, rebaudiosídeo N3, rebaudiosídeo N4, rebaudiosídeo N5, rebaudiosídeo M3, rebaudiosídeo O4 ou outro glicosídeo de esteviol de ocorrência na planta Stevia rebaudiana, glicosídeos de esteviol sintéticos, por exemplo, glicosídeos de esteviol enzimaticamente glicosilados, e combinações dos mesmos.
[00237] Em uma modalidade, o glicosídeo de esteviol-alvo é esteviolmonosídeo.
[00238] Em uma outra modalidade, o glicosídeo de esteviol-alvo é
49 / 135 esteviolmonosídeo A.
[00239] Em uma outra modalidade, o glicosídeo de esteviol-alvo é esteviolbiosídeo A.
[00240] Em uma outra modalidade, o glicosídeo de esteviol-alvo é esteviolbiosídeo B.
[00241] Em uma outra modalidade, o glicosídeo de esteviol-alvo é esteviolbiosídeo C.
[00242] Em uma outra modalidade, o glicosídeo de esteviol-alvo é esteviolbiosídeo D.
[00243] Em uma outra modalidade, o glicosídeo de esteviol-alvo é esteviolbiosídeo E.
[00244] Em uma outra modalidade, o glicosídeo de esteviol-alvo é rubusosídeo.
[00245] Em uma outra modalidade, o glicosídeo de esteviol-alvo é dulcosídeo A.
[00246] Em uma outra modalidade, o glicosídeo de esteviol-alvo é dulcosídeo C.
[00247] Em uma outra modalidade, o glicosídeo de esteviol-alvo é dulcosídeo D.
[00248] Em uma outra modalidade, o glicosídeo de esteviol-alvo é esteviosídeo A.
[00249] Em uma outra modalidade, o glicosídeo de esteviol-alvo é esteviosídeo B.
[00250] Em uma outra modalidade, o glicosídeo de esteviol-alvo é esteviosídeo C.
[00251] Em uma outra modalidade, o glicosídeo de esteviol-alvo é esteviosídeo G.
[00252] Em uma outra modalidade, o glicosídeo de esteviol-alvo é esteviosídeo H.
50 / 135
[00253] Em uma outra modalidade, o glicosídeo de esteviol-alvo é rebaudiosídeo B2.
[00254] Em uma outra modalidade, o glicosídeo de esteviol-alvo é rebaudiosídeo A4.
[00255] Em uma outra modalidade, o glicosídeo de esteviol-alvo é rebaudiosídeo C.
[00256] Em uma outra modalidade, o glicosídeo de esteviol-alvo é rebaudiosídeo C3.
[00257] Em uma outra modalidade, o glicosídeo de esteviol-alvo é rebaudiosídeo C4.
[00258] Em uma outra modalidade, o glicosídeo de esteviol-alvo é rebaudiosídeo C5.
[00259] Em uma outra modalidade, o glicosídeo de esteviol-alvo é rebaudiosídeo C6.
[00260] Em uma outra modalidade, o glicosídeo de esteviol-alvo é rebaudiosídeo E3.
[00261] Em uma outra modalidade, o glicosídeo de esteviol-alvo é rebaudiosídeo E4.
[00262] Em uma outra modalidade, o glicosídeo de esteviol-alvo é rebaudiosídeo E5.
[00263] Em uma outra modalidade, o glicosídeo de esteviol-alvo é rebaudiosídeo E6.
[00264] Em uma outra modalidade, o glicosídeo de esteviol-alvo é rebaudiosídeo E7.
[00265] Em uma outra modalidade, o glicosídeo de esteviol-alvo é rebaudiosídeo D5.
[00266] Em uma outra modalidade, o glicosídeo de esteviol-alvo é rebaudiosídeo D6.
[00267] Em uma outra modalidade, o glicosídeo de esteviol-alvo é
51 / 135 rebaudiosídeo D7.
[00268] Em uma outra modalidade, o glicosídeo de esteviol-alvo é rebaudiosídeo D8.
[00269] Em uma outra modalidade, o glicosídeo de esteviol-alvo é rebaudiosídeo H2.
[00270] Em uma outra modalidade, o glicosídeo de esteviol-alvo é rebaudiosídeo H3.
[00271] Em uma outra modalidade, o glicosídeo de esteviol-alvo é rebaudiosídeo H4.
[00272] Em uma outra modalidade, o glicosídeo de esteviol-alvo é rebaudiosídeo H5.
[00273] Em uma outra modalidade, o glicosídeo de esteviol-alvo é rebaudiosídeo H6.
[00274] Em uma outra modalidade, o glicosídeo de esteviol-alvo é rebaudiosídeo K.
[00275] Em uma outra modalidade, o glicosídeo de esteviol-alvo é rebaudiosídeo N2.
[00276] Em uma outra modalidade, o glicosídeo de esteviol-alvo é rebaudiosídeo N3.
[00277] Em uma outra modalidade, o glicosídeo de esteviol-alvo é rebaudiosídeo N4.
[00278] Em uma outra modalidade, o glicosídeo de esteviol-alvo é rebaudiosídeo N5.
[00279] Em uma outra modalidade, o glicosídeo de esteviol-alvo é rebaudiosídeo M3.
[00280] Em uma outra modalidade, o glicosídeo de esteviol-alvo é rebaudiosídeo O4.
[00281] O glicosídeo de esteviol-alvo pode estar em qualquer forma polimórfica ou amorfa, incluindo hidratos, solvatos, anidros ou combinações
52 / 135 dos mesmos.
[00282] Em uma modalidade, a presente invenção é um processo biocatalítico para a produção de esteviolmonosídeo.
[00283] Em uma modalidade, a presente invenção é um processo biocatalítico para a produção de esteviolmonosídeo A.
[00284] Em uma modalidade, a presente invenção é um processo biocatalítico para a produção de esteviolbiosídeo A.
[00285] Em uma modalidade, a presente invenção é um processo biocatalítico para a produção de esteviolbiosídeo B.
[00286] Em uma modalidade, a presente invenção é um processo biocatalítico para a produção de esteviolbiosídeo C.
[00287] Em uma modalidade, a presente invenção é um processo biocatalítico para a produção de esteviolbiosídeo D.
[00288] Em uma modalidade, a presente invenção é um processo biocatalítico para a produção de esteviolbiosídeo E.
[00289] Em uma modalidade, a presente invenção é um processo biocatalítico para a produção de rubusosídeo.
[00290] Em uma modalidade, a presente invenção é um processo biocatalítico para a produção de dulcosídeo A.
[00291] Em uma modalidade, a presente invenção é um processo biocatalítico para a produção de dulcosídeo C.
[00292] Em uma modalidade, a presente invenção é um processo biocatalítico para a produção de dulcosídeo D.
[00293] Em uma modalidade, a presente invenção é um processo biocatalítico para a produção de esteviosídeo A.
[00294] Em uma modalidade, a presente invenção é um processo biocatalítico para a produção de esteviosídeo B.
[00295] Em uma modalidade, a presente invenção é um processo biocatalítico para a produção de esteviosídeo C.
53 / 135
[00296] Em uma modalidade, a presente invenção é um processo biocatalítico para a produção de esteviosídeo G.
[00297] Em uma modalidade, a presente invenção é um processo biocatalítico para a produção de esteviosídeo H.
[00298] Em uma modalidade, a presente invenção é um processo biocatalítico para a produção de rebaudiosídeo B2.
[00299] Em uma modalidade, a presente invenção é um processo biocatalítico para a produção de rebaudiosídeo A4.
[00300] Em uma modalidade, a presente invenção é um processo biocatalítico para a produção de rebaudiosídeo C.
[00301] Em uma modalidade, a presente invenção é um processo biocatalítico para a produção de rebaudiosídeo C3.
[00302] Em uma modalidade, a presente invenção é um processo biocatalítico para a produção de rebaudiosídeo C4.
[00303] Em uma modalidade, a presente invenção é um processo biocatalítico para a produção de rebaudiosídeo C5.
[00304] Em uma modalidade, a presente invenção é um processo biocatalítico para a produção de rebaudiosídeo C6.
[00305] Em uma modalidade, a presente invenção é um processo biocatalítico para a produção de rebaudiosídeo E3.
[00306] Em uma modalidade, a presente invenção é um processo biocatalítico para a produção de rebaudiosídeo E4.
[00307] Em uma modalidade, a presente invenção é um processo biocatalítico para a produção de rebaudiosídeo E5.
[00308] Em uma modalidade, a presente invenção é um processo biocatalítico para a produção de rebaudiosídeo E6.
[00309] Em uma modalidade, a presente invenção é um processo biocatalítico para a produção de rebaudiosídeo E7.
[00310] Em uma modalidade, a presente invenção é um processo
54 / 135 biocatalítico para a produção de rebaudiosídeo D5.
[00311] Em uma modalidade, a presente invenção é um processo biocatalítico para a produção de rebaudiosídeo D6.
[00312] Em uma modalidade, a presente invenção é um processo biocatalítico para a produção de rebaudiosídeo D7.
[00313] Em uma modalidade, a presente invenção é um processo biocatalítico para a produção de rebaudiosídeo D8.
[00314] Em uma modalidade, a presente invenção é um processo biocatalítico para a produção de rebaudiosídeo H2.
[00315] Em uma modalidade, a presente invenção é um processo biocatalítico para a produção de rebaudiosídeo H3.
[00316] Em uma modalidade, a presente invenção é um processo biocatalítico para a produção de rebaudiosídeo H4.
[00317] Em uma modalidade, a presente invenção é um processo biocatalítico para a produção de rebaudiosídeo H5.
[00318] Em uma modalidade, a presente invenção é um processo biocatalítico para a produção de rebaudiosídeo H6.
[00319] Em uma modalidade, a presente invenção é um processo biocatalítico para a produção de rebaudiosídeo K.
[00320] Em uma modalidade, a presente invenção é um processo biocatalítico para a produção de rebaudiosídeo N2.
[00321] Em uma modalidade, a presente invenção é um processo biocatalítico para a produção de rebaudiosídeo N3.
[00322] Em uma modalidade, a presente invenção é um processo biocatalítico para a produção de rebaudiosídeo N4.
[00323] Em uma modalidade, a presente invenção é um processo biocatalítico para a produção de rebaudiosídeo N5.
[00324] Em uma modalidade, a presente invenção é um processo biocatalítico para a produção de rebaudiosídeo M3.
55 / 135
[00325] Em uma modalidade, a presente invenção é um processo biocatalítico para a produção de rebaudiosídeo O4.
[00326] Em uma modalidade específica, a presente invenção fornece o processo biocatalítico para a produção de rebaudiosídeo N2 a partir de uma composição inicial que compreende rebaudiosídeo C e UDP-glicose.
[00327] Em uma outra modalidade específica, a presente invenção fornece o processo biocatalítico para a produção de rebaudiosídeo O4 a partir de uma composição inicial que compreende rebaudiosídeo C e UDP-glicose.
[00328] Opcionalmente, o método da presente invenção compreende adicionalmente separar o glicosídeo de esteviol-alvo do meio para fornecer uma composição de glicosídeo de esteviol-alvo altamente purificada. O glicosídeo de esteviol-alvo pode ser separado por meio de qualquer método adequado, como, por exemplo, cristalização, separação por membranas, centrifugação, extração, separação cromatográfica ou uma combinação de tais métodos.
[00329] Em modalidades específicas, o processo aqui descrito resulta em uma composição de glicosídeo de esteviol-alvo altamente purificada. O termo "altamente purificada", como usado aqui, se refere a uma composição que tem mais que cerca de 80%, em peso, do glicosídeo de esteviol-alvo em uma base anidra (seca). Em uma modalidade, a composição de glicosídeo de esteviol-alvo altamente purificada contém mais que cerca de 90%, em peso, do glicosídeo de esteviol-alvo em uma base anidra (seca), como, por exemplo, mais que cerca de 91%, mais que cerca de 92%, mais que cerca de 93%, mais que cerca de 94%, mais que cerca de 95%, mais que cerca de 96%, mais que cerca de 97%, mais que cerca de 98% ou mais que cerca de 99% de teor de glicosídeo de esteviol-alvo em uma base seca.
[00330] Em uma modalidade, quando o glicosídeo de esteviol-alvo é reb N2, o processo aqui descrito fornece uma composição que tem um teor de cerca de 90%, em peso, de reb N2 em uma base seca. Em uma outra
56 / 135 modalidade específica, quando o glicosídeo de esteviol-alvo é reb N2, o processo descrito na presente invenção fornece uma composição que compreende um teor maior que cerca de 95%, em peso, de reb N2 em uma base seca.
[00331] Em uma modalidade, quando o glicosídeo de esteviol-alvo é reb O4, o processo aqui descrito fornece uma composição que tem um teor maior que cerca de 90%, em peso, de reb O4 em uma base seca. Em uma outra modalidade específica, quando o glicosídeo de esteviol-alvo é reb O4, o processo aqui descrito fornece uma composição que compreende um teor de 95%, em peso, de reb O4 em uma base seca. Preparações de micro-organismos e enzima
[00332] Em uma modalidade da presente invenção, uma preparação de micro-organismo (célula microbiana) e/ou enzima é colocada em contato com um meio contendo a composição inicial para produzir glicosídeos de esteviol- alvo.
[00333] A enzima pode ser fornecida sob a forma de uma suspensão de células inteiras, um lisado bruto, uma enzima purificada ou uma combinação dos mesmos. Em uma modalidade, o biocatalisador é uma enzima purificada capaz de converter a composição inicial em um glicosídeo de esteviol-alvo. Em uma outra modalidade, o biocatalisador é um lisado bruto que compreende ao menos uma enzima capaz de converter a composição inicial em glicosídeo de esteviol-alvo. Em ainda outra modalidade, o biocatalisador é uma suspensão de células inteiras que compreende ao menos uma enzima capaz de converter a composição inicial no glicosídeo de esteviol-alvo.
[00334] Em uma outra modalidade, o biocatalisador é uma ou mais células microbianas que compreendem enzima(s) capaz(es) de converter a composição inicial no glicosídeo de esteviol-alvo. A enzima pode estar situada sobre a superfície da célula, no interior da célula ou tanto sobre a superfície da célula quanto no interior da célula.
57 / 135
[00335] As enzimas adequadas para converter a composição inicial em glicosídeos de esteviol-alvo incluem, mas não se limitam a, enzimas de biossíntese de esteviol, UDP-glicosiltransferases (UGTs) e UDP- glicosiltransferases (UGlyTs). Opcionalmente, isso pode incluir enzima(s) de reciclagem de UDP.
[00336] Em uma modalidade, as enzimas de biossíntese do esteviol incluem enzimas da via do mevalonato (MVA).
[00337] Em uma outra modalidade, as enzimas de biossíntese do esteviol incluem as enzimas da via do não-mevalonato 2-C-metil-D-eritritol- 4-fosfato (MEP/DOXP).
[00338] Em uma modalidade, as enzimas de biossíntese do esteviol são selecionadas a partir do grupo que inclui geranilgeranil difosfato sintase, copalil difosfato sintase, caureno sintase, caureno oxidase, ácido caurenoico 13-hidroxilase (KAH), esteviol sintetase, desóxi-xilulose 5-fosfato-sintase (DXS), D-1-desóxi-xilulose 5-fosfato reductoisomerase (DXR), 4- difosfocitidil-2-C-metil-D-eritritol sintase (CMS), 4-difosfocitidil-2-C-metil- D-eritritol quinase (CMK), 4-difosfocitidil-2-C-metil-D-eritritol 2,4- ciclodifosfato sintase (MCS), l-hidróxi-2-metil-2(E)- butenil 4-difosfato sintase (HDS), l-hidróxi-2-metil-2(E)-butenil 4-difosfato redutase (HDR), acetoacetil-CoA tiolase, HMG-CoA redutase truncada, mevalonato quinase, fosfomevalonato quinase, mevalonato pirofosfato descarboxilase, citocromo P450 redutase, etc.
[00339] A UDP-glucosiltransferase pode ser qualquer UDP- glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao esteviol e/ou um substrato de glicosídeo de esteviol para fornecer o glicosídeo de esteviol-alvo.
[00340] A UDP-glicosiltransferase pode ser qualquer UDP- glicosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de ramnose a esteviol e/ou um substrato de glicosídeo de esteviol para fornecer o glicosídeo
58 / 135 de esteviol-alvo.
[00341] Em uma modalidade, as enzimas de biossíntese do esteviol, UDP-glucosiltransferases e UDP-glicosiltransferases, são produzidas em uma célula microbiana. A célula microbiana pode ser, por exemplo, E. coli, Saccharomyces sp., Aspergillus sp., Pichia sp., Bacillus sp., Yarrowia sp. etc. Em uma outra modalidade, as UDP-glucosiltransferases são sintetizadas.
[00342] Em uma modalidade, a UDP-glucosiltransferase é selecionada do grupo que inclui UGT74G1, UGT85C2, UGT76G1, UGT91D2, UGTSl2, EUGT11 e UGTs com uma identidade de sequência de aminoácidos substancial (> 85%, > 86%, > 87%, > 88%, > 89%, > 90%, > 91%, > 92%, > 93%, > 94%, > 95%, > 96%,> 97%, > 98%, > 99%) com esses polipeptídeos, bem como com as moléculas de ácido nucleico isoladas que codificam essas UGTs.
[00343] Em uma modalidade, a UDP-glicosiltransferase é selecionada do grupo que inclui UGlyT91C1 e UGlyTs com uma identidade de sequência de aminoácido substancial (> 85%, > 86%, > 87%, > 88%, > 89%, > 90%, > 91%, > 92%, > 93%, > 94%, > 95%, > 96%,> 97%, > 98%, > 99%) com esses polipeptídeos, bem como com as moléculas de ácido nucleico isoladas que codificam essas UGlyTs.
[00344] Em uma modalidade, as enzimas de biossíntese do esteviol, UGTs, UGlyTs, sistema de reciclagem da UDP-glicose e sistema de reciclagem da UDP-ramnose estão presentes em um micro-organismo (célula microbiana). O micro-organismo pode ser, por exemplo, E. coli, Saccharomyces sp., Aspergillus sp., Pichia sp., Bacillus sp., Yarrowia sp.
[00345] Em uma modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao esteviol ou qualquer glicosídeo de esteviol inicial que tem um grupo funcional -OH em C13 para fornecer um glicosídeo de esteviol-alvo com uma ligação glicosídica de -O-glicose beta-glicopiranosídeo em C13. Em uma
59 / 135 modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT85C2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT85C2.
[00346] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao esteviol ou qualquer glicosídeo de esteviol inicial que tem um grupo funcional -COOH em C19 para fornecer um glicosídeo de esteviol-alvo que tem uma ligação glicosídica de -COO-glicose beta-glicopiranosídeo em C19. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT74G1 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT74G1.
[00347] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose à glicose existente em C19 de qualquer glicosídeo de esteviol inicial para fornecer um glicosídeo de esteviol-alvo com ao menos uma glicose adicional contendo pelo menos uma ligação glicosídica beta-1®2 glicopiranosídeo na(s) ligação(ões) glicosídica(s) recém-formada(s). Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGTSl2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGTSl2. Em uma outra modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é EUGT11 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com EUGT11. Em ainda outra modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT91D2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT91D2.
[00348] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose à glicose existente em C19 de qualquer glicosídeo de esteviol inicial para fornecer um glicosídeo de esteviol-alvo com ao menos uma glicose adicional contendo pelo menos uma ligação glicosídica beta-1®3 glicopiranosídeo na(s) ligação(ões) glicosídica(s) recém-formada(s). Em uma
60 / 135 modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT76G1 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT76G1.
[00349] Em uma outra modalidade, a UDP-glicosiltransferase é qualquer UDP-glicosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de ramnose à glicose existente em C13 de qualquer glicosídeo de esteviol inicial para fornecer um glicosídeo de esteviol-alvo com ao menos uma ramnose adicional contendo pelo menos uma ligação glicosídica alfa-1®2 glicopiranosídeo na(s) ligação(ões) glicosídica(s) recém-formada(s). Em uma modalidade específica, a UDP-glicosiltransferase é UGlyT91C1 ou uma UGlyT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGlyT91C1.
[00350] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose à glicose existente em C13 de qualquer glicosídeo de esteviol inicial para fornecer um glicosídeo de esteviol-alvo com ao menos uma glicose adicional contendo pelo menos uma ligação glicosídica beta-1®3 glicopiranosídeo na(s) ligação(ões) glicosídica(s) recém-formada(s). Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT76G1 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT76G1.
[00351] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose à glicose existente em C13 de qualquer glicosídeo de esteviol inicial para fornecer um glicosídeo de esteviol-alvo com ao menos uma glicose adicional contendo pelo menos uma ligação glicosídica beta-1®6 glicopiranosídeo na(s) ligação(ões) glicosídica(s) recém-formada(s). Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGTSl2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGTSl2. Em uma outra modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é EUGT11 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com
61 / 135 EUGT11. Em ainda outra modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT91D2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT91D2.
[00352] Em uma modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao esteviol para formar esteviolmonosídeo. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT85C2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT85C2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT85C2.
[00353] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao esteviol para formar esteviolmonosídeo A. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT74G1 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT74G1.
[00354] Em uma outra modalidade, a UDP-glicosiltransferase é qualquer UDP-glicosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de ramnose ao esteviolmonosídeo para formar esteviolbiosídeo C. Em uma modalidade específica, a UDP-glicosiltransferase é UGlyT91C1 ou uma UGlyT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGlyT91C1.
[00355] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao esteviolmonosídeo para formar esteviolbiosídeo D. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT76G1 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT76G1.
[00356] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao esteviolmonosídeo para formar esteviolbiosídeo E. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGTSl2 ou uma UGT
62 / 135 com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGTSl2. Em uma outra modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é EUGT11 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com EUGT11. Em ainda outra modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT91D2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT91D2.
[00357] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao esteviolmonosídeo para formar rubusosídeo. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT74G1 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT74G1.
[00358] Em uma modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao esteviolmonosídeo A para formar rubusosídeo. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT85C2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT85C2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT85C2.
[00359] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao esteviolmonosídeo A para formar esteviolbiosídeo A. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGTSl2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGTSl2. Em uma outra modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é EUGT11 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com EUGT11. Em ainda outra modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT91D2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT91D2.
[00360] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade
63 / 135 de glicose ao esteviolmonosídeo A para formar esteviolbiosídeo B. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT76G1 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT76G1.
[00361] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao esteviolbiosídeo C para formar dulcosídeo C. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT76G1 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT76G1.
[00362] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao esteviolbiosídeo C para formar dulcosídeo D. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGTSl2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGTSl2. Em uma outra modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é EUGT11 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com EUGT11. Em ainda outra modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT91D2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT91D2.
[00363] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao esteviolbiosídeo C para formar dulcosídeo A. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT74G1 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT74G1.
[00364] Em uma outra modalidade, a UDP-glicosiltransferase é qualquer UDP-glicosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de ramnose ao esteviolbiosídeo D para formar dulcosídeo C. Em uma modalidade específica, a UDP-glicosiltransferase é UGlyT91C1 ou uma UGlyT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGlyT91C1.
64 / 135
[00365] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao esteviolbiosídeo D para formar rebaudiosídeo B2. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGTSl2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGTSl2. Em uma outra modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é EUGT11 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com EUGT11. Em ainda outra modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT91D2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT91D2.
[00366] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao esteviolbiosídeo D para formar esteviosídeo G. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT74G1 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT74G1.
[00367] Em uma outra modalidade, a UDP-glicosiltransferase é qualquer UDP-glicosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de ramnose ao esteviolbiosídeo E para formar dulcosídeo D. Em uma modalidade específica, a UDP-glicosiltransferase é UGlyT91C1 ou uma UGlyT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGlyT91C1.
[00368] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao esteviolbiosídeo E para formar rebaudiosídeo B2. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT76G1 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT76G1.
[00369] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao esteviolbiosídeo E para formar esteviosídeo H. Em uma
65 / 135 modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT74G1 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT74G1.
[00370] Em uma outra modalidade, a UDP-glicosiltransferase é qualquer UDP-glicosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de ramnose ao rubusosídeo para formar dulcosídeo A. Em uma modalidade específica, a UDP-glicosiltransferase é UGlyT91C1 ou uma UGlyT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGlyT91C1.
[00371] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao rubusosídeo para formar esteviosídeo G. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT76G1 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT76G1.
[00372] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao rubusosídeo para formar esteviosídeo H. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGTSl2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGTSl2. Em uma outra modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é EUGT11 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com EUGT11. Em ainda outra modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT91D2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT91D2.
[00373] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao rubusosídeo para formar esteviosídeo A. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGTSl2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGTSl2. Em uma outra modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é EUGT11 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com EUGT11. Em
66 / 135 ainda outra modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT91D2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT91D2.
[00374] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao rubusosídeo para formar esteviosídeo B. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT76G1 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT76G1.
[00375] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao esteviolbiosídeo A para formar esteviosídeo A. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT85C2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT85C2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT85C2.
[00376] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao esteviolbiosídeo A para formar esteviosídeo C. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT76G1 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT76G1.
[00377] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao esteviolbiosídeo B para formar esteviosídeo B. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT85C2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT85C2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT85C2.
[00378] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade
67 / 135 de glicose ao esteviolbiosídeo B para formar esteviosídeo C. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGTSl2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGTSl2. Em uma outra modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é EUGT11 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com EUGT11. Em ainda outra modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT91D2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT91D2.
[00379] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao dulcosídeo C para formar rebaudiosídeo C3. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGTSl2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGTSl2. Em uma outra modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é EUGT11 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com EUGT11. Em ainda outra modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT91D2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT91D2.
[00380] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao dulcosídeo C para formar rebaudiosídeo C. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT74G1 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT74G1.
[00381] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao dulcosídeo D para formar rebaudiosídeo C3. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT76G1 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT76G1.
[00382] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é
68 / 135 qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao dulcosídeo D para formar rebaudiosídeo C4. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT74G1 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT74G1.
[00383] Em uma outra modalidade, a UDP-glicosiltransferase é qualquer UDP-glicosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de ramnose ao rebaudiosídeo B2 para formar rebaudiosídeo C3. Em uma modalidade específica, a UDP-glicosiltransferase é UGlyT91C1 ou uma UGlyT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGlyT91C1.
[00384] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao rebaudiosídeo B2 para formar rebaudiosídeo A4. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT74G1 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT74G1.
[00385] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao dulcosídeo A para formar rebaudiosídeo C. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT76G1 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT76G1.
[00386] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao dulcosídeo A para formar rebaudiosídeo C4. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGTSl2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGTSl2. Em uma outra modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é EUGT11 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com EUGT11. Em ainda outra modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT91D2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de
69 / 135 aminoácidos com UGT91D2.
[00387] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao dulcosídeo A para formar rebaudiosídeo C5. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGTSl2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGTSl2. Em uma outra modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é EUGT11 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com EUGT11. Em ainda outra modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT91D2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT91D2.
[00388] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao dulcosídeo A para formar rebaudiosídeo C6. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT76G1 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT76G1.
[00389] Em uma outra modalidade, a UDP-glicosiltransferase é qualquer UDP-glicosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de ramnose ao esteviosídeo G para formar rebaudiosídeo C. Em uma modalidade específica, a UDP-glicosiltransferase é UGlyT91C1 ou uma UGlyT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGlyT91C1.
[00390] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao esteviosídeo G para formar rebaudiosídeo A4. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGTSl2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGTSl2. Em uma outra modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é EUGT11 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com
70 / 135 EUGT11. Em ainda outra modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT91D2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT91D2.
[00391] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao esteviosídeo G para formar rebaudiosídeo E4. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGTSl2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGTSl2. Em uma outra modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é EUGT11 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com EUGT11. Em ainda outra modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT91D2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT91D2.
[00392] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao esteviosídeo G para formar rebaudiosídeo E6. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT76G1 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT76G1.
[00393] Em uma outra modalidade, a UDP-glicosiltransferase é qualquer UDP-glicosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de ramnose ao esteviosídeo H para formar rebaudiosídeo C4. Em uma modalidade específica, a UDP-glicosiltransferase é UGlyT91C1 ou uma UGlyT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGlyT91C1.
[00394] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao esteviosídeo H para formar rebaudiosídeo A4. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT76G1 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT76G1.
71 / 135
[00395] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao esteviosídeo H para formar rebaudiosídeo E5. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGTSl2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGTSl2. Em uma outra modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é EUGT11 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com EUGT11. Em ainda outra modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT91D2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT91D2.
[00396] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao esteviosídeo H para formar rebaudiosídeo E7. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT76G1 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT76G1.
[00397] Em uma outra modalidade, a UDP-glicosiltransferase é qualquer UDP-glicosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de ramnose ao esteviosídeo A para formar rebaudiosídeo C5. Em uma modalidade específica, a UDP-glicosiltransferase é UGlyT91C1 ou uma UGlyT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGlyT91C1.
[00398] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao esteviosídeo A para formar rebaudiosídeo E4. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT76G1 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT76G1.
[00399] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao esteviosídeo A para formar rebaudiosídeo E5. Em uma
72 / 135 modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGTSl2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGTSl2. Em uma outra modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é EUGT11 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com EUGT11. Em ainda outra modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT91D2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT91D2.
[00400] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao esteviosídeo A para formar rebaudiosídeo E3. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT76G1 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT76G1.
[00401] Em uma outra modalidade, a UDP-glicosiltransferase é qualquer UDP-glicosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de ramnose ao esteviosídeo B para formar rebaudiosídeo C6. Em uma modalidade específica, a UDP-glicosiltransferase é UGlyT91C1 ou uma UGlyT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGlyT91C1.
[00402] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao esteviosídeo B para formar rebaudiosídeo E6. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT76G1 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT76G1.
[00403] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao esteviosídeo B para formar rebaudiosídeo E7. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGTSl2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGTSl2. Em uma outra modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é EUGT11 ou
73 / 135 uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com EUGT11. Em ainda outra modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT91D2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT91D2.
[00404] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao esteviosídeo B para formar rebaudiosídeo E3. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGTSl2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGTSl2. Em uma outra modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é EUGT11 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com EUGT11. Em ainda outra modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT91D2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT91D2.
[00405] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao esteviosídeo C para formar rebaudiosídeo E3. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT85C2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT85C2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT85C2.
[00406] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao rebaudiosídeo C3 para formar rebaudiosídeo H2. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT74G1 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT74G1.
[00407] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao rebaudiosídeo C para formar rebaudiosídeo H2. Em uma
74 / 135 modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGTSl2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGTSl2. Em uma outra modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é EUGT11 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com EUGT11. Em ainda outra modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT91D2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT91D2.
[00408] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao rebaudiosídeo C para formar rebaudiosídeo K. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGTSl2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGTSl2. Em uma outra modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é EUGT11 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com EUGT11. Em ainda outra modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT91D2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT91D2.
[00409] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao rebaudiosídeo C para formar rebaudiosídeo H4. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT76G1 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT76G1.
[00410] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao rebaudiosídeo C4 para formar rebaudiosídeo H2. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT76G1 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT76G1.
[00411] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade
75 / 135 de glicose ao rebaudiosídeo C4 para formar rebaudiosídeo H3. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGTSl2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGTSl2. Em uma outra modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é EUGT11 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com EUGT11. Em ainda outra modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT91D2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT91D2.
[00412] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao rebaudiosídeo C4 para formar rebaudiosídeo H5. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT76G1 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT76G1.
[00413] Em uma outra modalidade, a UDP-glicosiltransferase é qualquer UDP-glicosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de ramnose ao rebaudiosídeo A4 para formar rebaudiosídeo H2. Em uma modalidade específica, a UDP-glicosiltransferase é UGlyT91C1 ou uma UGlyT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGlyT91C1.
[00414] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao rebaudiosídeo A4 para formar rebaudiosídeo D5. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGTSl2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGTSl2. Em uma outra modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é EUGT11 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com EUGT11. Em ainda outra modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT91D2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT91D2.
76 / 135
[00415] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao rebaudiosídeo A4 para formar rebaudiosídeo D6. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT76G1 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT76G1.
[00416] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao rebaudiosídeo C5 para formar rebaudiosídeo K. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT76G1 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT76G1.
[00417] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao rebaudiosídeo C5 para formar rebaudiosídeo H3. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGTSl2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGTSl2. Em uma outra modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é EUGT11 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com EUGT11. Em ainda outra modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT91D2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT91D2.
[00418] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao rebaudiosídeo C5 para formar rebaudiosídeo H6. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT76G1 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT76G1.
[00419] Em uma outra modalidade, a UDP-glicosiltransferase é qualquer UDP-glicosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de ramnose ao rebaudiosídeo E4 para formar rebaudiosídeo K. Em uma modalidade específica, a UDP-glicosiltransferase é UGlyT91C1 ou uma
77 / 135 UGlyT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGlyT91C1.
[00420] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao rebaudiosídeo E4 para formar rebaudiosídeo D5. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGTSl2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGTSl2. Em uma outra modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é EUGT11 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com EUGT11. Em ainda outra modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT91D2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT91D2.
[00421] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao rebaudiosídeo E4 para formar rebaudiosídeo D7. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT76G1 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT76G1.
[00422] Em uma outra modalidade, a UDP-glicosiltransferase é qualquer UDP-glicosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de ramnose ao rebaudiosídeo E5 para formar rebaudiosídeo H3. Em uma modalidade específica, a UDP-glicosiltransferase é UGlyT91C1 ou uma UGlyT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGlyT91C1.
[00423] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao rebaudiosídeo E5 para formar rebaudiosídeo D5. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT76G1 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT76G1.
[00424] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é
78 / 135 qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao rebaudiosídeo E5 para formar rebaudiosídeo D8. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT76G1 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT76G1.
[00425] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao rebaudiosídeo C6 para formar rebaudiosídeo H4. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT76G1 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT76G1.
[00426] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao rebaudiosídeo C6 para formar rebaudiosídeo H5. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGTSl2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGTSl2. Em uma outra modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é EUGT11 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com EUGT11. Em ainda outra modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT91D2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT91D2.
[00427] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao rebaudiosídeo C6 para formar rebaudiosídeo H6. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGTSl2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGTSl2. Em uma outra modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é EUGT11 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com EUGT11. Em ainda outra modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT91D2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT91D2.
79 / 135
[00428] Em uma outra modalidade, a UDP-glicosiltransferase é qualquer UDP-glicosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de ramnose ao rebaudiosídeo E6 para formar rebaudiosídeo H4. Em uma modalidade específica, a UDP-glicosiltransferase é UGlyT91C1 ou uma UGlyT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGlyT91C1.
[00429] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao rebaudiosídeo E6 para formar rebaudiosídeo D6. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGTSl2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGTSl2. Em uma outra modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é EUGT11 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com EUGT11. Em ainda outra modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT91D2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT91D2.
[00430] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao rebaudiosídeo E6 para formar rebaudiosídeo D7. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGTSl2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGTSl2. Em uma outra modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é EUGT11 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com EUGT11. Em ainda outra modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT91D2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT91D2.
[00431] Em uma outra modalidade, a UDP-glicosiltransferase é qualquer UDP-glicosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de ramnose ao rebaudiosídeo E7 para formar rebaudiosídeo H5. Em uma
80 / 135 modalidade específica, a UDP-glicosiltransferase é UGlyT91C1 ou uma UGlyT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGlyT91C1.
[00432] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao rebaudiosídeo E7 para formar rebaudiosídeo D6. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT76G1 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT76G1.
[00433] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao rebaudiosídeo E7 para formar rebaudiosídeo D8. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGTSl2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGTSl2. Em uma outra modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é EUGT11 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com EUGT11. Em ainda outra modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT91D2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT91D2.
[00434] Em uma outra modalidade, a UDP-glicosiltransferase é qualquer UDP-glicosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de ramnose ao rebaudiosídeo E3 para formar rebaudiosídeo H6. Em uma modalidade específica, a UDP-glicosiltransferase é UGlyT91C1 ou uma UGlyT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGlyT91C1.
[00435] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao rebaudiosídeo E3 para formar rebaudiosídeo D7. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT76G1 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT76G1.
81 / 135
[00436] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao rebaudiosídeo E3 para formar rebaudiosídeo D8. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGTSl2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGTSl2. Em uma outra modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é EUGT11 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com EUGT11. Em ainda outra modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT91D2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT91D2.
[00437] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao rebaudiosídeo H2 para formar rebaudiosídeo N3. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGTSl2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGTSl2. Em uma outra modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é EUGT11 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com EUGT11. Em ainda outra modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT91D2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT91D2.
[00438] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao rebaudiosídeo H2 para formar rebaudiosídeo N4. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT76G1 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT76G1.
[00439] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao rebaudiosídeo K para formar rebaudiosídeo N3. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGTSl2 ou uma UGT
82 / 135 com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGTSl2. Em uma outra modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é EUGT11 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com EUGT11. Em ainda outra modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT91D2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT91D2.
[00440] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao rebaudiosídeo K para formar rebaudiosídeo N2. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT76G1 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT76G1.
[00441] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao rebaudiosídeo H3 para formar rebaudiosídeo N3. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT76G1 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT76G1.
[00442] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao rebaudiosídeo H3 para formar rebaudiosídeo N5. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT76G1 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT76G1.
[00443] Em uma outra modalidade, a UDP-glicosiltransferase é qualquer UDP-glicosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de ramnose ao rebaudiosídeo D5 para formar rebaudiosídeo N3. Em uma modalidade específica, a UDP-glicosiltransferase é UGlyT91C1 ou uma UGlyT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGlyT91C1.
[00444] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade
83 / 135 de glicose ao rebaudiosídeo D5 para formar rebaudiosídeo M3. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT76G1 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT76G1.
[00445] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao rebaudiosídeo H4 para formar rebaudiosídeo N4. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGTSl2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGTSl2. Em uma outra modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é EUGT11 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com EUGT11. Em ainda outra modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT91D2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT91D2.
[00446] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao rebaudiosídeo H4 para formar rebaudiosídeo N2. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGTSl2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGTSl2. Em uma outra modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é EUGT11 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com EUGT11. Em ainda outra modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT91D2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT91D2.
[00447] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao rebaudiosídeo H5 para formar rebaudiosídeo N4. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT76G1 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT76G1.
[00448] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é
84 / 135 qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao rebaudiosídeo H5 para formar rebaudiosídeo N5. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGTSl2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGTSl2. Em uma outra modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é EUGT11 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com EUGT11. Em ainda outra modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT91D2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT91D2.
[00449] Em uma outra modalidade, a UDP-glicosiltransferase é qualquer UDP-glicosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de ramnose ao rebaudiosídeo D6 para formar rebaudiosídeo N4. Em uma modalidade específica, a UDP-glicosiltransferase é UGlyT91C1 ou uma UGlyT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGlyT91C1.
[00450] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao rebaudiosídeo D6 para formar rebaudiosídeo M3. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGTSl2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGTSl2. Em uma outra modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é EUGT11 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com EUGT11. Em ainda outra modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT91D2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT91D2.
[00451] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao rebaudiosídeo H6 para formar rebaudiosídeo N2. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT76G1 ou uma UGT
85 / 135 com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT76G1.
[00452] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao rebaudiosídeo H6 para formar rebaudiosídeo N5. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGTSl2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGTSl2. Em uma outra modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é EUGT11 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com EUGT11. Em ainda outra modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT91D2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT91D2.
[00453] Em uma outra modalidade, a UDP-glicosiltransferase é qualquer UDP-glicosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de ramnose ao rebaudiosídeo D7 para formar rebaudiosídeo N2. Em uma modalidade específica, a UDP-glicosiltransferase é UGlyT91C1 ou uma UGlyT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGlyT91C1.
[00454] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao rebaudiosídeo D7 para formar rebaudiosídeo M3. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGTSl2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGTSl2. Em uma outra modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é EUGT11 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com EUGT11. Em ainda outra modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT91D2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT91D2.
[00455] Em uma outra modalidade, a UDP-glicosiltransferase é qualquer UDP-glicosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade
86 / 135 de ramnose ao rebaudiosídeo D8 para formar rebaudiosídeo N5. Em uma modalidade específica, a UDP-glicosiltransferase é UGlyT91C1 ou uma UGlyT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGlyT91C1.
[00456] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao rebaudiosídeo D8 para formar rebaudiosídeo M3. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT76G1 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT76G1.
[00457] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao rebaudiosídeo N3 para formar rebaudiosídeo O4. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT76G1 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT76G1.
[00458] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao rebaudiosídeo N4 para formar rebaudiosídeo O4. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGTSl2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGTSl2. Em uma outra modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é EUGT11 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com EUGT11. Em ainda outra modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT91D2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT91D2.
[00459] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao rebaudiosídeo N2 para formar rebaudiosídeo O4. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGTSl2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGTSl2. Em
87 / 135 uma outra modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é EUGT11 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com EUGT11. Em ainda outra modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT91D2 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT91D2.
[00460] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose ao rebaudiosídeo N5 para formar rebaudiosídeo K4. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT76G1 ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT76G1.
[00461] Em uma outra modalidade, a UDP-glicosiltransferase é qualquer UDP-glicosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de ramnose ao rebaudiosídeo M3 para formar rebaudiosídeo O4. Em uma modalidade específica, a UDP-glicosiltransferase é UGlyT91C1 ou uma UGlyT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGlyT91C1.
[00462] Opcionalmente, o método da presente invenção compreende adicionalmente reciclar UDP para fornecer UDP-glicose. Em uma modalidade, o método compreende reciclar UDP mediante o fornecimento de um catalisador de reciclagem e um substrato de reciclagem, de modo que a biotransformação do esteviol e/ou do substrato de glicosídeo de esteviol em glicosídeo de esteviol-alvo seja executada com o uso de quantidades catalíticas de UDP-glucosiltransferase e UDP-glicose. A enzima de reciclagem de UDP pode ser a sacarose sintase SuSy_At ou uma sacarose sintase com > 85% de identidade de sequência de aminoácido com SuSy_At, e o substrato de reciclagem pode ser sacarose.
[00463] Opcionalmente, o método da presente invenção compreende adicionalmente reciclar UDP para fornecer UDP-ramnose. Em uma modalidade, o método compreende reciclar UDP mediante o fornecimento de
88 / 135 um catalisador de reciclagem e um substrato de reciclagem, de modo que a biotransformação do esteviol e/ou do substrato de glicosídeo de esteviol em glicosídeo de esteviol-alvo seja executada com o uso de quantidades catalíticas de UDP-glicosiltransferase e UDP-ramnose.
[00464] Opcionalmente, o método da presente invenção compreende adicionalmente o uso de transglicosidases que usam oligo ou polissacarídeos como doador de açúcar para modificar moléculas de glicosídeo de esteviol- alvo. Exemplos não limitadores incluem ciclodextrina glicosiltransferase (CGTase), frutofuranosidase, amilase, sacarase, glicossacarase, beta-h- frutosidase, beta-frutosidase, frutossilinvertase, invertase alcalina, invertase ácida, frutofuranosidase. Em algumas modalidades, glicose e outro(s) açúcar(es) além da glicose, incluindo, mas não se limitando a, frutose, xilose, ramnose, arabinose, desoxiglicose, galactose, são transferidos para os glicosídeos de esteviol-alvo receptores. Em uma modalidade, o glicosídeo de esteviol receptor é rebaudiosídeo N2. Em uma outra modalidade, o glicosídeo de esteviol receptor é rebaudiosídeo O4.
[00465] Em uma outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar ao menos uma unidade de glicose à composição inicial de glicosídeo de esteviol tem > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGTs selecionados a partir da seguinte lista de números identificadores do GenInfo, de preferência, do grupo apresentado na Tabela 1 e na Tabela 2.
397567 30680413 115480946 147798902 218193594 225443294 454245 32816174 116310259 147811764 218193942 225444853 1359905 32816178 116310985 147827151 219885307 225449296 1685003 34393978 116788066 147836230 222615927 225449700 1685005 37993665 116788606 147839909 222619587 225454338 2191136 37993671 116789315 147846163 222623142 225454340 2501497 37993675 119394507 147855977 222625633 225454342 2911049 39104603 119640480 148905778 222625635 225454473
89 / 135
4218003 41469414 122209731 148905999 222636620 225454475 4314356 41469452 125526997 148906835 222636621 225458362 13492674 42566366 125534279 148907340 222636628 225461551 13492676 42570280 125534461 148908935 222636629 225461556 15217773 42572855 125540090 148909182 224053242 225461558 15217796 44890129 125541516 148909920 224053386 225469538 15223396 46806235 125545408 148910082 224055535 225469540 15223589 50284482 125547340 148910154 224056138 226316457 15227766 51090402 125547520 148910612 224056160 226492603 15230017 51090594 125554547 148910769 224067918 226494221 15231757 52839682 125557592 156138791 224072747 226495389 15234056 56550539 125557593 156138797 224080189 226495945 15234195 62734263 125557608 156138799 224091845 226502400 15234196 62857204 125559566 156138803 224094703 226507980 15238503 62857206 125563266 165972256 224100653 226531147 15239523 62857210 125571055 168016721 224100657 226532094 15239525 62857212 125579728 171674071 224101569 238477377 15239543 75265643 125588307 171906258 224103105 240254512 15239937 75285934 125589492 183013901 224103633 242032615 15240305 75288884 125599469 183013903 224103637 242032621 15240534 77550661 125601477 186478321 224109218 242038423 15982889 77556148 126635837 187373030 224114583 242043290 18086351 82791223 126635845 187373042 224116284 242044836 18418378 83778990 126635847 190692175 224120552 242051252 18418380 89953335 126635863 194701936 224121288 242056217 18418382 110741436 126635867 195620060 224121296 242056219 19743740 110743955 126635883 209954691 224121300 242056663 19911201 115438196 126635887 209954719 224130358 242059339 20149064 115438785 133874210 209954725 224140703 242059341
90 / 135
20260654 115441237 133874212 209954733 224143404 242060922 21435782 115454819 145358033 210063105 224143406 242067411 21553613 115456047 147772508 210063107 224144306 242067413 21593514 115457492 147776893 212275846 224285244 242076258 22759895 115459312 147776894 216296854 225431707 242076396 23955910 115464719 147776895 217074506 225435532 242084750 26452040 115471069 147786916 218185693 225436321 242091005 28393204 115471071 147798900 218187075 225440041 242095206 30679796 115474009 147798901 218189427 225441116 242345159 242345161 297724601 326492035 356523945 357140904 359486938 255536859 297725463 326493430 356523957 357165849 359487055 255538228 297728331 326500410 356523959 357165852 359488135 255541676 297738632 326506816 356523961 357168415 359488708 255547075 297745347 326507826 356523963 357437837 359493630 255552620 297745348 326508394 356524387 357442755 359493632 255552622 297795735 326509445 356524403 357442757 359493634 255555343 297796253 326511261 356527181 357445729 359493636 255555361 297796257 326511866 356533209 357445731 359493815 255555363 297796261 326512412 356533852 357445733 359495856 255555365 297797587 326517673 356534718 357446799 359495858 255555369 297798502 326518800 356535480 357446805 359495869 255555373 297799226 326521124 356542996 357452779 359495871 255555377 297805988 326525567 356543136 357452781 359497638 255556812 297807499 326525957 356543932 357452783 359807261 255556818 297809125 326526607 356549841 357452787 374256637 255563008 297809127 326527141 356549843 357452789 377655465 255564074 297811403 326530093 356554358 357452791 378405177 255564531 297820040 326534036 356554360 357452797 378829085 255572878 297821483 326534312 356558606 357452799 387135070
91 / 135
255577901 297825217 332071132 356560333 357470367 387135072 255583249 297832276 339715876 356560599 357472193 387135078 255583253 297832280 342306012 356560749 357472195 387135092 255583255 297832518 342306016 356566018 357474295 387135094 255585664 297832520 343457675 356566169 357474493 387135098 255585666 297840825 343457677 356566173 357474497 387135100 255634688 297840827 350534960 356567761 357474499 387135134 255644801 297847402 356498085 356574704 357490035 387135136 255645821 297849372 356499771 356576401 357493567 387135174 255647456 300078590 356499777 356577660 357497139 387135176 255648275 300669727 356499779 357114993 357497581 387135184 260279126 302142947 356501328 357115447 357497671 387135186 260279128 302142948 356502523 357115451 357500579 387135188 261343326 302142950 356503180 357115453 357504663 387135190 283132367 302142951 356503184 357116080 357504691 387135192 283362112 302765302 356503295 357116928 357504699 387135194 289188052 302796334 356504436 357117461 357504707 387135282 295841350 302811470 356504523 357117463 357505859 387135284 296088529 302821107 356504765 357117829 357510851 387135294 296090415 302821679 356511113 357117839 357516975 387135298 296090524 319759260 356515120 357125059 359477003 387135300 296090526 319759266 356517088 357126015 359477998 387135302 297599503 320148814 356520732 357134488 359478043 387135304 297601531 326489963 356522586 357135657 359478286 387135312 297611791 326490273 356522588 357138503 359484299 387135314 297722841 326491131 356522590 357139683 359486936 387135316 387135318 449440433 460376293 460413408 462423864 475546199 387135320 449445896 460378310 460416351 470101924 475556485 387135322 449446454 460380744 462394387 470102280 475559699
92 / 135
387135324 449447657 460381726 462394433 470102858 475578293 387135326 449449002 460382093 462394557 470104211 475591753 387135328 449449004 460382095 462395646 470104264 475593742 388493506 449449006 460382754 462395678 470104266 475612072 388495496 449451379 460384935 462396388 470106317 475622476 388498446 449451589 460384937 462396389 470106357 475622507 388499220 449451591 460385076 462396419 470115448 475623787 388502176 449451593 460385872 462396542 470130404 482550481 388517521 449453712 460386018 462397507 470131550 482550499 388519407 449453714 460389217 462399998 470136482 482550740 388521413 449453716 460394872 462400798 470136484 482550999 388827901 449453732 460396139 462401217 470136488 482552352 388827903 449457075 460397862 462402118 470136492 482554970 388827907 449467555 460397864 462402237 470137933 482555336 388827909 449468742 460398541 462402284 470137937 482555478 388827913 449495638 460403139 462402416 470140422 482556454 393887637 449495736 460403141 462404228 470140426 482557289 393887646 449499880 460403143 462406358 470140908 482558462 393887649 449502786 460403145 462408262 470141232 482558508 393990627 449503471 460405998 462409325 470142008 482558547 397746860 449503473 460407578 462409359 470142010 482561055 397789318 449515857 460407590 462409777 470142012 482561555 413924864 449518643 460409128 462411467 470143607 482562795 414590349 449519559 460409134 462414311 470143939 482562850 414590661 449522783 460409136 462414416 470145404 482565074 414591157 449524530 460409459 462414476 473923244 482566269 414879558 449524591 460409461 462415526 474114354 482566296 414879559 449528823 460409463 462415603 474143634 482566307 414879560 449528825 460409465 462415731 474202268 482568689
93 / 135
414888074 449534021 460409467 462416307 474299266 482570049 431812559 460365546 460410124 462416920 474363119 482570572 449432064 460366882 460410126 462416922 474366157 482575121 449432066 460369823 460410128 462416923 474429346 449433069 460369829 460410130 462416924 475432777 449436944 460369831 460410132 462417401 475473002 449438665 460369833 460410134 462419769 475489790 449438667 460370755 460410213 462420317 475511330 449440431 460374714 460411200 462423366 475516200 Tabela 1 Número GI Acessão Origem 190692175 ACE87855.1 Stevia rebaudiana 41469452 AAS07253.1 Oryza sativa 62857204 BAD95881.1 Ipomoea nil 62857206 BAD95882.1 Ipomoea purperea 56550539 BAD77944.1 Bellis perennis 115454819 NP_001051010.1 Oryza sativa grupo japônica 115459312 NP_001053256.1 Oryza sativa grupo japônica 115471069 NP_001059133.1 Oryza sativa grupo japônica 115471071 NP_001059134.1 Oryza sativa grupo japônica 116310985 CAH67920.1 Oryza sativa grupo indica 116788066 ABK24743.1 Picea sitchensis 122209731 Q2V6J9.1 Fragaria x ananassa 125534461 EAY81009.1 Oryza sativa grupo indica 125559566 EAZ05102.1 Oryza sativa grupo indica 125588307 EAZ28971.1 Oryza sativa grupo japônica 148907340 ABR16806.1 Picea sitchensis 148910082 ABR18123.1 Picea sitchensis 148910612 ABR18376.1 Picea sitchensis 15234195 NP_194486.1 Arabidopsis thaliana 15239523 NP_200210.1 Arabidopsis thaliana 15239937 NP_196793.1 Arabidopsis thaliana 1685005 AAB36653.1 Nicotiana tabacum 183013903 ACC38471.1 Medicago truncatula 186478321 NP_172511.3 Arabidopsis thaliana 187373030 ACD03249.1 Avena strigosa 194701936 ACF85052.1 Zea mays 19743740 AAL92461.1 Solanum lycopersicum 212275846 NP_001131009.1 Zea mays 222619587 EEE55719.1 Oryza sativa grupo japônica 224055535 XP_002298527.1 Populus trichocarpa 224101569 XP_002334266.1 Populus trichocarpa 224120552 XP_002318358.1 Populus trichocarpa 224121288 XP_002330790.1 Populus trichocarpa 225444853 XP_002281094 Vitis vinifera 225454342 XP_002275850.1 Vitis vinifera 225454475 XP_002280923.1 Vitis vinifera 225461556 XP_002285222 Vitis vinifera 225469540 XP_002270294.1 Vitis vinifera
94 / 135 Número GI Acessão Origem 226495389 NP_001148083.1 Zea mays 226502400 NP_001147674.1 Zea mays 238477377 ACR43489.1 Triticum aestivum 240254512 NP_565540.4 Arabidopsis thaliana 2501497 Q43716.1 Petunia x hybrida 255555369 XP_002518721.1 Ricinus communis 26452040 BAC43110.1 Arabidopsis thaliana 296088529 CBI37520.3 Vitis vinifera 297611791 NP_001067852.2 Oryza sativa grupo japônica 297795735 XP_002865752.1 Arabidopsis lyrata subsp. lyrata 297798502 XP_002867135.1 Arabidopsis lyrata subsp. lyrata 297820040 XP_002877903.1 Arabidopsis lyrata subsp. lyrata 297832276 XP_002884020.1 Arabidopsis lyrata subsp. lyrata 302821107 XP_002992218.1 Selaginella moellendorffii 30680413 NP_179446.2 Arabidopsis thaliana 319759266 ADV71369.1 Pueraria montana var. lobata 326507826 BAJ86656.1 Hordeum vulgare subsp. vulgare 343457675 AEM37036.1 Brassica rapa subsp. oleifera 350534960 NP_001234680.1 Solanum lycopersicum 356501328 XP_003519477.1 Glycine max 356522586 XP_003529927.1 Glycine max 356535480 XP_003536273.1 Glycine max 357445733 XP_003593144.1 Medicago truncatula 357452783 XP_003596668.1 Medicago truncatula 357474493 XP_003607531.1 Medicago truncatula 357500579 XP_003620578.1 Medicago truncatula 357504691 XP_003622634.1 Medicago truncatula 359477998 XP_003632051.1 Vitis vinifera 359487055 XP_002271587 Vitis vinifera 359495869 XP_003635104.1 Vitis vinifera 387135134 AFJ52948.1 Linum usitatissimum 387135176 AFJ52969.1 Linum usitatissimum 387135192 AFJ52977.1 Linum usitatissimum 387135282 AFJ53022.1 Linum usitatissimum 387135302 AFJ53032.1 Linum usitatissimum 387135312 AFJ53037.1 Linum usitatissimum 388519407 AFK47765.1 Medicago truncatula 393887646 AFN26668.1 Barbarea vulgaris subsp. arcuata 414888074 DAA64088.1 Zea mays 42572855 NP_974524.1 Arabidopsis thaliana 449440433 XP_004137989.1 Cucumis sativus 449446454 XP_004140986.1 Cucumis sativus 449449004 XP_004142255.1 Cucumis sativus 449451593 XP_004143546.1 Cucumis sativus 449515857 XP_004164964.1 Cucumis sativus 460382095 XP_004236775.1 Solanum lycopersicum 460409128 XP_004249992.1 Solanum lycopersicum 460409461 XP_004250157.1 Solanum lycopersicum 460409465 XP_004250159.1 Solanum lycopersicum 462396388 EMJ02187.1 Prunus persica 462402118 EMJ07675.1 Prunus persica 462409359 EMJ14693.1 Prunus persica 462416923 EMJ21660.1 Prunus persica 46806235 BAD17459.1 Oryza sativa grupo japônica 470104266 XP_004288529.1 Fragaria vesca subsp. vesca 470142008 XP_004306714.1 Fragaria vesca subsp. vesca 475432777 EMT01232.1 Aegilops tauschii 51090402 BAD35324.1 Oryza sativa grupo japônica
95 / 135 Tabela 2 Número GI Acessão Origem Referência interna 460409128 XP.004249992.1 Solanum lycopersicum UGTSl 460386018 XP.004238697.1 Solanum lycopersicum - 460409134 XP.004249995.1 Solanum lycopersicum - 460410132 XP.004250485.1 Solanum lycopersicum UGTSl2 460410130 XP.004250484.1 Solanum lycopersicum - 460410128 XP.004250483.1 Solanum lycopersicum - 460378310 XP.004234916.1 Solanum lycopersicum - 209954733 BAG80557.1 Lycium barbarum UGTLB 209954725 BAG80553.1 Lycium barbarum -
[00466] Uma modalidade da presente invenção é uma célula microbiana que compreende uma enzima, ou seja, uma enzima capaz de converter a composição inicial no glicosídeo de esteviol-alvo. Consequentemente, algumas modalidades do presente método incluem colocar um micro-organismo em contato com um meio contendo a composição inicial para fornecer um meio que compreende pelo menos um glicosídeo de esteviol-alvo.
[00467] O micro-organismo pode ser qualquer micro-organismo que possua a(s) enzima(s) necessária(s) para converter a composição inicial em glicosídeo(s) de esteviol-alvo(s). Essas enzimas são codificadas no interior do genoma do micro-organismo.
[00468] Micro-organismos adequados incluem, mas não se limitam a, E.coli, Saccharomyces sp., Aspergillus sp., Pichia sp., Bacillus sp., Yarrowia sp., etc.
[00469] Em uma modalidade, o micro-organismo é livre quando colocado em contato com a composição inicial.
[00470] Em uma outra modalidade, o micro-organismo é imobilizado quando colocado em contato com a composição inicial. Por exemplo, o micro-organismo pode ser imobilizado em um suporte sólido produzido a partir de materiais inorgânicos ou orgânicos. Exemplos não limitadores de suportes sólidos adequados para imobilizar o micro-organismo incluem celulose ou vidro derivatizado, cerâmicas, óxidos metálicos ou membranas. O micro-organismo pode ser imobilizado no suporte sólido, por exemplo, por
96 / 135 ligação covalente, adsorção, reticulação, aprisionamento ou encapsulação.
[00471] Em ainda outra modalidade, a enzima capaz de converter a composição inicial em glicosídeo de esteviol-alvo é secretada fora do micro- organismo e no meio de reação.
[00472] O glicosídeo de esteviol-alvo é opcionalmente purificado. A purificação do glicosídeo de esteviol-alvo a partir do meio de reação pode ser conseguida por pelo menos um método adequado para fornecer uma composição de glicosídeo de esteviol-alvo altamente purificada. Os métodos adequados incluem cristalização, separação por membranas, centrifugação, extração (fase líquida ou sólida), separação cromatográfica, HPLC (preparativa ou analítica) ou uma combinação de tais métodos. Usos
[00473] Glicosídeo(s)-alvo altamente purificados, particularmente, esteviolmonosídeo, esteviolmonosídeo A, esteviolbiosídeo A, esteviolbiosídeo B, esteviolbiosídeo C, esteviolbiosídeo D, esteviolbiosídeo E, rubusosídeo, dulcosídeo A, dulcosídeo C, dulcosídeo D, esteviosídeo A, esteviosídeo B, esteviosídeo C, esteviosídeo G, esteviosídeo H, rebaudiosídeo B2, rebaudiosídeo A4, rebaudiosídeo C, rebaudiosídeo C3, rebaudiosídeo C4, rebaudiosídeo C5, rebaudiosídeo C6, rebaudiosídeo E3, rebaudiosídeo E4, rebaudiosídeo E5, rebaudiosídeo E6, rebaudiosídeo E7, rebaudiosídeo D5, rebaudiosídeo D6, rebaudiosídeo D7, rebaudiosídeo D8, rebaudiosídeo H2, rebaudiosídeo H3, rebaudiosídeo H4, rebaudiosídeo H5, rebaudiosídeo H6, rebaudiosídeo K, rebaudiosídeo N2, rebaudiosídeo N3, rebaudiosídeo N4, rebaudiosídeo N5, rebaudiosídeo M3, rebaudiosídeo O4, obtidos de acordo com esta invenção podem ser usados "puros" ou em combinação com outros adoçantes, flavorizantes, ingredientes alimentícios e suas combinações.
[00474] Exemplos não limitadores de flavorizantes incluem, mas não se limitam a, limão-galego, limão amarelo, laranja, frutas, banana, uva, pera, abacaxi, manga, frutas silvestres, amêndoa amarga, noz-de-cola, canela,
97 / 135 açúcar, algodão doce, baunilha e suas combinações.
[00475] Exemplos não limitadores de outros ingredientes alimentícios incluem, mas não se limitam a, acidulantes, ácidos orgânicos e aminoácidos, agentes corantes, agentes avolumadores, amidos modificados, gomas, texturizantes, conservantes, cafeína, antioxidantes, emulsificantes, estabilizantes, espessantes, agentes gelificantes e combinações dos mesmos.
[00476] Glicosídeo(s)-alvo altamente purificados, particularmente, esteviolmonosídeo, esteviolmonosídeo A, esteviolbiosídeo A, esteviolbiosídeo B, esteviolbiosídeo C, esteviolbiosídeo D, esteviolbiosídeo E, rubusosídeo, dulcosídeo A, dulcosídeo C, dulcosídeo D, esteviosídeo A, esteviosídeo B, esteviosídeo C, esteviosídeo G, esteviosídeo H, rebaudiosídeo B2, rebaudiosídeo A4, rebaudiosídeo C, rebaudiosídeo C3, rebaudiosídeo C4, rebaudiosídeo C5, rebaudiosídeo C6, rebaudiosídeo E3, rebaudiosídeo E4, rebaudiosídeo E5, rebaudiosídeo E6, rebaudiosídeo E7, rebaudiosídeo D5, rebaudiosídeo D6, rebaudiosídeo D7, rebaudiosídeo D8, rebaudiosídeo H2, rebaudiosídeo H3, rebaudiosídeo H4, rebaudiosídeo H5, rebaudiosídeo H6, rebaudiosídeo K, rebaudiosídeo N2, rebaudiosídeo N3, rebaudiosídeo N4, rebaudiosídeo N5, rebaudiosídeo M3, rebaudiosídeo O4, obtidos de acordo com esta invenção podem ser preparados de várias formas polimórficas, incluindo, mas não se limitando a, formas amorfas e suas combinações.
[00477] Glicosídeo(s)-alvo altamente purificados, particularmente, esteviolmonosídeo, esteviolmonosídeo A, esteviolbiosídeo A, esteviolbiosídeo B, esteviolbiosídeo C, esteviolbiosídeo D, esteviolbiosídeo E, rubusosídeo, dulcosídeo A, dulcosídeo C, dulcosídeo D, esteviosídeo A, esteviosídeo B, esteviosídeo C, esteviosídeo G, esteviosídeo H, rebaudiosídeo B2, rebaudiosídeo A4, rebaudiosídeo C, rebaudiosídeo C3, rebaudiosídeo C4, rebaudiosídeo C5, rebaudiosídeo C6, rebaudiosídeo E3, rebaudiosídeo E4, rebaudiosídeo E5, rebaudiosídeo E6, rebaudiosídeo E7, rebaudiosídeo D5, rebaudiosídeo D6, rebaudiosídeo D7, rebaudiosídeo D8, rebaudiosídeo H2,
98 / 135 rebaudiosídeo H3, rebaudiosídeo H4, rebaudiosídeo H5, rebaudiosídeo H6, rebaudiosídeo K, rebaudiosídeo N2, rebaudiosídeo N3, rebaudiosídeo N4, rebaudiosídeo N5, rebaudiosídeo M3, rebaudiosídeo O4, obtidos de acordo com esta invenção podem ser incorporados como um adoçante natural de alta intensidade em produtos alimentícios, bebidas, composições farmacêuticas, cosméticos, gomas de mascar, produtos de mesa, cereais, produtos lácteos, pastas dentais e outras composições bucais, etc.
[00478] Glicosídeo(s)-alvo altamente purificados, particularmente, esteviolmonosídeo, esteviolmonosídeo A, esteviolbiosídeo A, esteviolbiosídeo B, esteviolbiosídeo C, esteviolbiosídeo D, esteviolbiosídeo E, rubusosídeo, dulcosídeo A, dulcosídeo C, dulcosídeo D, esteviosídeo A, esteviosídeo B, esteviosídeo C, esteviosídeo G, esteviosídeo H, rebaudiosídeo B2, rebaudiosídeo A4, rebaudiosídeo C, rebaudiosídeo C3, rebaudiosídeo C4, rebaudiosídeo C5, rebaudiosídeo C6, rebaudiosídeo E3, rebaudiosídeo E4, rebaudiosídeo E5, rebaudiosídeo E6, rebaudiosídeo E7, rebaudiosídeo D5, rebaudiosídeo D6, rebaudiosídeo D7, rebaudiosídeo D8, rebaudiosídeo H2, rebaudiosídeo H3, rebaudiosídeo H4, rebaudiosídeo H5, rebaudiosídeo H6, rebaudiosídeo K, rebaudiosídeo N2, rebaudiosídeo N3, rebaudiosídeo N4, rebaudiosídeo N5, rebaudiosídeo M3, rebaudiosídeo O4, obtidos de acordo com esta invenção podem ser empregados como um composto dulcificante como o único adoçante, ou podem ser usados em conjunto com pelo menos um adoçante de alta intensidade de ocorrência natural, como rebaudiosídeo A, rebaudiosídeo A2, rebaudiosídeo A3, rebaudiosídeo AM, rebaudiosídeo B, rebaudiosídeo C2, rebaudiosídeo D, rebaudiosídeo D2, rebaudiosídeo D3, rebaudiosídeo D4, rebaudiosídeo E, rebaudiosídeo E2, rebaudiosídeo F, rebaudiosídeo F2, rebaudiosídeo F3, rebaudiosídeo G, rebaudiosídeo H, rebaudiosídeo I, rebaudiosídeo I2, rebaudiosídeo I3, rebaudiosídeo J, rebaudiosídeo K2, rebaudiosídeo L, rebaudiosídeo M, rebaudiosídeo M2, rebaudiosídeo N, rebaudiosídeo O, rebaudiosídeo O2, rebaudiosídeo O3,
99 / 135 rebaudiosídeo Q, rebaudiosídeo Q2, rebaudiosídeo Q3, rebaudiosídeo R, rebaudiosídeo S, rebaudiosídeo T, rebaudiosídeo T1, rebaudiosídeo U, rebaudiosídeo U2, rebaudiosídeo V, rebaudiosídeo V2, rebaudiosídeo W, rebaudiosídeo W2, rebaudiosídeo W3, rebaudiosídeo Y, rebaudiosídeo Z1, rebaudiosídeo Z2, esteviolbiosídeo, esteviosídeo, esteviosídeo D, esteviosídeo E, esteviosídeo E2, esteviosídeo F, mogrosídeos, brazeína, neoesperidina di- hidrocalcona, ácido glicirrízico e seus sais, taumatina, perilartina, pernandulcina, mucuroziosídeos, baiyunosídeo, flomisosídeo-I, ácido dimetil- hexaidrofluoreno-dicarboxílico, abrusosídeos, periandrina, carnosiflosídeos, ciclocariosídeo, pterocariosídeos, polipodosídeo A, brazilina, hernandulcina, filodulcina, glicifilina, florizina, trilobatina, di-hidroflavonol, di- hidroquercetina-3-acetato, neoastilibina, trans-cinamaldeído, monatina e seus sais, seligueaína A, hematoxilina, monelina, osladina, pterocariosídeo A, pterocariosídeo B, mabinlina, pentadina, miraculina, curculina, neoculina, ácido clorogênico, cinarina, adoçante de Luo Han Guo, mogrosia V, siamenosídeo e suas combinações.
[00479] Em uma modalidade específica, esteviolmonosídeo, esteviolmonosídeo A, esteviolbiosídeo A, esteviolbiosídeo B, esteviolbiosídeo C, esteviolbiosídeo D, esteviolbiosídeo E, rubusosídeo, dulcosídeo A, dulcosídeo C, dulcosídeo D, esteviosídeo A, esteviosídeo B, esteviosídeo C, esteviosídeo G, esteviosídeo H, rebaudiosídeo B2, rebaudiosídeo A4, rebaudiosídeo C, rebaudiosídeo C3, rebaudiosídeo C4, rebaudiosídeo C5, rebaudiosídeo C6, rebaudiosídeo E3, rebaudiosídeo E4, rebaudiosídeo E5, rebaudiosídeo E6, rebaudiosídeo E7, rebaudiosídeo D5, rebaudiosídeo D6, rebaudiosídeo D7, rebaudiosídeo D8, rebaudiosídeo H2, rebaudiosídeo H3, rebaudiosídeo H4, rebaudiosídeo H5, rebaudiosídeo H6, rebaudiosídeo K, rebaudiosídeo N2, rebaudiosídeo N3, rebaudiosídeo N4, rebaudiosídeo N5, rebaudiosídeo M3 e/ou rebaudiosídeo O4 podem ser usados em uma composição de adoçante que compreende um composto selecionado do grupo
100 / 135 que consiste em rebaudiosídeo A, rebaudiosídeo A2, rebaudiosídeo A3, rebaudiosídeo AM, rebaudiosídeo B, rebaudiosídeo C2, rebaudiosídeo D, rebaudiosídeo D2, rebaudiosídeo D3, rebaudiosídeo D4, rebaudiosídeo E, rebaudiosídeo E2, rebaudiosídeo F, rebaudiosídeo F2, rebaudiosídeo F3, rebaudiosídeo G, rebaudiosídeo H, rebaudiosídeo I, rebaudiosídeo I2, rebaudiosídeo I3, rebaudiosídeo J, rebaudiosídeo K2, rebaudiosídeo L, rebaudiosídeo M, rebaudiosídeo M2, rebaudiosídeo N, rebaudiosídeo O, rebaudiosídeo O2, rebaudiosídeo O3, rebaudiosídeo Q, rebaudiosídeo Q2, rebaudiosídeo Q3, rebaudiosídeo R, rebaudiosídeo S, rebaudiosídeo T, rebaudiosídeo T1, rebaudiosídeo U, rebaudiosídeo U2, rebaudiosídeo V, rebaudiosídeo V2, rebaudiosídeo W, rebaudiosídeo W2, rebaudiosídeo W3, rebaudiosídeo Y, rebaudiosídeo Z1, rebaudiosídeo Z2, esteviolbiosídeo, esteviosídeo, esteviosídeo D, esteviosídeo E, esteviosídeo E2, esteviosídeo F, NSF-02, Mogrosida V, Luo Han Guo, alulose, alose, D-tagatose, eritritol e suas combinações.
[00480] Glicosídeo(s)-alvo altamente purificados, particularmente, esteviolmonosídeo, esteviolmonosídeo A, esteviolbiosídeo A, esteviolbiosídeo B, esteviolbiosídeo C, esteviolbiosídeo D, esteviolbiosídeo E, rubusosídeo, dulcosídeo A, dulcosídeo C, dulcosídeo D, esteviosídeo A, esteviosídeo B, esteviosídeo C, esteviosídeo G, esteviosídeo H, rebaudiosídeo B2, rebaudiosídeo A4, rebaudiosídeo C, rebaudiosídeo C3, rebaudiosídeo C4, rebaudiosídeo C5, rebaudiosídeo C6, rebaudiosídeo E3, rebaudiosídeo E4, rebaudiosídeo E5, rebaudiosídeo E6, rebaudiosídeo E7, rebaudiosídeo D5, rebaudiosídeo D6, rebaudiosídeo D7, rebaudiosídeo D8, rebaudiosídeo H2, rebaudiosídeo H3, rebaudiosídeo H4, rebaudiosídeo H5, rebaudiosídeo H6, rebaudiosídeo K, rebaudiosídeo N2, rebaudiosídeo N3, rebaudiosídeo N4, rebaudiosídeo N5, rebaudiosídeo M3 e/ou rebaudiosídeo O4, podem também ser usados em combinação com adoçantes sintéticos de alta intensidade, como sucralose, potássio, acessulfame, aspartame, alitame, sacarina, neoesperidina
101 / 135 di-hidrocalcona, ciclamato, neotame, dulcina, suosano advantame, sais dos mesmos e suas combinações.
[00481] Além disso, glicosídeo(s) de esteviol-alvo altamente purificado(s), particularmente, esteviolmonosídeo, esteviolmonosídeo A, esteviolbiosídeo A, esteviolbiosídeo B, esteviolbiosídeo C, esteviolbiosídeo D, esteviolbiosídeo E, rubusosídeo, dulcosídeo A, dulcosídeo C, dulcosídeo D, esteviosídeo A, esteviosídeo B, esteviosídeo C, esteviosídeo G, esteviosídeo H, rebaudiosídeo B2, rebaudiosídeo A4, rebaudiosídeo C, rebaudiosídeo C3, rebaudiosídeo C4, rebaudiosídeo C5, rebaudiosídeo C6, rebaudiosídeo E3, rebaudiosídeo E4, rebaudiosídeo E5, rebaudiosídeo E6, rebaudiosídeo E7, rebaudiosídeo D5, rebaudiosídeo D6, rebaudiosídeo D7, rebaudiosídeo D8, rebaudiosídeo H2, rebaudiosídeo H3, rebaudiosídeo H4, rebaudiosídeo H5, rebaudiosídeo H6, rebaudiosídeo K, rebaudiosídeo N2, rebaudiosídeo N3, rebaudiosídeo N4, rebaudiosídeo N5, rebaudiosídeo M3 e/ou rebaudiosídeo O4, podem ser usados em combinação com supressores de adoçante natural, como ácido gimnêmico, hodulcina, zizifina, lactisol e outros. Esteviolmonosídeo, esteviolmonosídeo A, esteviolbiosídeo A, esteviolbiosídeo B, esteviolbiosídeo C, esteviolbiosídeo D, esteviolbiosídeo E, rubusosídeo, dulcosídeo A, dulcosídeo C, dulcosídeo D, esteviosídeo A, esteviosídeo B, esteviosídeo C, esteviosídeo G, esteviosídeo H, rebaudiosídeo B2, rebaudiosídeo A4, rebaudiosídeo C, rebaudiosídeo C3, rebaudiosídeo C4, rebaudiosídeo C5, rebaudiosídeo C6, rebaudiosídeo E3, rebaudiosídeo E4, rebaudiosídeo E5, rebaudiosídeo E6, rebaudiosídeo E7, rebaudiosídeo D5, rebaudiosídeo D6, rebaudiosídeo D7, rebaudiosídeo D8, rebaudiosídeo H2, rebaudiosídeo H3, rebaudiosídeo H4, rebaudiosídeo H5, rebaudiosídeo H6, rebaudiosídeo K, rebaudiosídeo N2, rebaudiosídeo N3, rebaudiosídeo N4, rebaudiosídeo N5, rebaudiosídeo M3 e/ou rebaudiosídeo O4 podem também ser combinados com vários acentuadores de sabor umami. Esteviolmonosídeo, esteviolmonosídeo A, esteviolbiosídeo A,
102 / 135 esteviolbiosídeo B, esteviolbiosídeo C, esteviolbiosídeo D, esteviolbiosídeo E, rubusosídeo, dulcosídeo A, dulcosídeo C, dulcosídeo D, esteviosídeo A, esteviosídeo B, esteviosídeo C, esteviosídeo G, esteviosídeo H, rebaudiosídeo B2, rebaudiosídeo A4, rebaudiosídeo C, rebaudiosídeo C3, rebaudiosídeo C4, rebaudiosídeo C5, rebaudiosídeo C6, rebaudiosídeo E3, rebaudiosídeo E4, rebaudiosídeo E5, rebaudiosídeo E6, rebaudiosídeo E7, rebaudiosídeo D5, rebaudiosídeo D6, rebaudiosídeo D7, rebaudiosídeo D8, rebaudiosídeo H2, rebaudiosídeo H3, rebaudiosídeo H4, rebaudiosídeo H5, rebaudiosídeo H6, rebaudiosídeo K, rebaudiosídeo N2, rebaudiosídeo N3, rebaudiosídeo N4, rebaudiosídeo N5, rebaudiosídeo M3 e/ou rebaudiosídeo O4 podem ser misturados com sabor umami e aminoácidos doces, como glutamato, ácido aspártico, glicina, alanina, treonina, prolina, serina, lisina, triptofano e suas combinações.
[00482] Glicosídeo(s) de esteviol-alvo altamente purificado(s), particularmente, esteviolmonosídeo, esteviolmonosídeo A, esteviolbiosídeo A, esteviolbiosídeo B, esteviolbiosídeo C, esteviolbiosídeo D, esteviolbiosídeo E, rubusosídeo, dulcosídeo A, dulcosídeo C, dulcosídeo D, esteviosídeo A, esteviosídeo B, esteviosídeo C, esteviosídeo G, esteviosídeo H, rebaudiosídeo B2, rebaudiosídeo A4, rebaudiosídeo C, rebaudiosídeo C3, rebaudiosídeo C4, rebaudiosídeo C5, rebaudiosídeo C6, rebaudiosídeo E3, rebaudiosídeo E4, rebaudiosídeo E5, rebaudiosídeo E6, rebaudiosídeo E7, rebaudiosídeo D5, rebaudiosídeo D6, rebaudiosídeo D7, rebaudiosídeo D8, rebaudiosídeo H2, rebaudiosídeo H3, rebaudiosídeo H4, rebaudiosídeo H5, rebaudiosídeo H6, rebaudiosídeo K, rebaudiosídeo N2, rebaudiosídeo N3, rebaudiosídeo N4, rebaudiosídeo N5, rebaudiosídeo M3 e/ou rebaudiosídeo O4, podem ser usados em combinação com um ou mais aditivos selecionados do grupo que consiste em carboidratos, polióis, aminoácidos e seus sais correspondentes, poliaminoácidos e seus sais correspondentes, ácidos de açúcar e seus sais correspondentes, nucleotídeos, ácidos orgânicos, ácidos inorgânicos, sais
103 / 135 orgânicos incluindo sais de ácidos orgânicos e sais de bases orgânicas, sais inorgânicos, compostos amargos, flavorizantes e ingredientes flavorizantes, compostos adstringentes, proteínas ou hidrolisados de proteínas, tensoativos, emulsificantes, flavonoides, álcoois, polímeros e combinações dos mesmos.
[00483] Glicosídeo(s) de esteviol-alvo altamente purificado(s), particularmente, esteviolmonosídeo, esteviolmonosídeo A, esteviolbiosídeo A, esteviolbiosídeo B, esteviolbiosídeo C, esteviolbiosídeo D, esteviolbiosídeo E, rubusosídeo, dulcosídeo A, dulcosídeo C, dulcosídeo D, esteviosídeo A, esteviosídeo B, esteviosídeo C, esteviosídeo G, esteviosídeo H, rebaudiosídeo B2, rebaudiosídeo A4, rebaudiosídeo C, rebaudiosídeo C3, rebaudiosídeo C4, rebaudiosídeo C5, rebaudiosídeo C6, rebaudiosídeo E3, rebaudiosídeo E4, rebaudiosídeo E5, rebaudiosídeo E6, rebaudiosídeo E7, rebaudiosídeo D5, rebaudiosídeo D6, rebaudiosídeo D7, rebaudiosídeo D8, rebaudiosídeo H2, rebaudiosídeo H3, rebaudiosídeo H4, rebaudiosídeo H5, rebaudiosídeo H6, rebaudiosídeo K, rebaudiosídeo N2, rebaudiosídeo N3, rebaudiosídeo N4, rebaudiosídeo N5, rebaudiosídeo M3 e/ou rebaudiosídeo O4, podem ser combinados com polióis ou álcoois de açúcar. O termo "poliol" se refere a uma molécula que contém mais de um grupo hidroxila. Um poliol pode ser um diol, triol ou um tetraol que contém 2, 3 e 4 grupos hidroxila, respectivamente. Um poliol também pode conter mais do que quatro grupos hidroxila, tal como um pentaol, hexaol, heptaol, ou similares, que contêm 5, 6, ou 7 grupos hidroxila, respectivamente. Adicionalmente, um poliol também pode ser um álcool de açúcar, álcool poli-ídrico ou poliálcool que é uma forma reduzida de carboidrato, sendo que o grupo carbonila (aldeído ou cetona, açúcar redutor) foi reduzido a um grupo hidroxila primário ou secundário. Exemplos de polióis incluem, mas não se limitam a, eritritol, malitol, manitol, sorbitol, lactitol, xilitol, inositol, isomalte, propilenoglicol, glicerol, treitol, galactitol, isomaltulose hidrogenada, isomalto- oligossacarídeos reduzidos, xilo-oligossacarídeos reduzidos, gentio-
104 / 135 oligossacarídeos reduzidos, xarope de maltose reduzido, xarope de glicose reduzido, hidrolisados de amido hidrogenado, poliglicitóis e álcoois de açúcar ou quaisquer outros carboidratos capazes de serem reduzidos que não afetam adversamente o sabor da composição de adoçante.
[00484] Glicosídeo(s) de esteviol-alvo altamente purificado(s), particularmente, esteviolmonosídeo, esteviolmonosídeo A, esteviolbiosídeo A, esteviolbiosídeo B, esteviolbiosídeo C, esteviolbiosídeo D, esteviolbiosídeo E, rubusosídeo, dulcosídeo A, dulcosídeo C, dulcosídeo D, esteviosídeo A, esteviosídeo B, esteviosídeo C, esteviosídeo G, esteviosídeo H, rebaudiosídeo B2, rebaudiosídeo A4, rebaudiosídeo C, rebaudiosídeo C3, rebaudiosídeo C4, rebaudiosídeo C5, rebaudiosídeo C6, rebaudiosídeo E3, rebaudiosídeo E4, rebaudiosídeo E5, rebaudiosídeo E6, rebaudiosídeo E7, rebaudiosídeo D5, rebaudiosídeo D6, rebaudiosídeo D7, rebaudiosídeo D8, rebaudiosídeo H2, rebaudiosídeo H3, rebaudiosídeo H4, rebaudiosídeo H5, rebaudiosídeo H6, rebaudiosídeo K, rebaudiosídeo N2, rebaudiosídeo N3, rebaudiosídeo N4, rebaudiosídeo N5, rebaudiosídeo M3 e/ou rebaudiosídeo O4, podem ser combinados com adoçantes com teor calórico reduzido como, por exemplo, D-tagatose, L-açúcares, L-sorbose, L-arabinose e suas combinações.
[00485] Glicosídeo(s) de esteviol-alvo altamente purificado(s), particularmente, esteviolmonosídeo, esteviolmonosídeo A, esteviolbiosídeo A, esteviolbiosídeo B, esteviolbiosídeo C, esteviolbiosídeo D, esteviolbiosídeo E, rubusosídeo, dulcosídeo A, dulcosídeo C, dulcosídeo D, esteviosídeo A, esteviosídeo B, esteviosídeo C, esteviosídeo G, esteviosídeo H, rebaudiosídeo B2, rebaudiosídeo A4, rebaudiosídeo C, rebaudiosídeo C3, rebaudiosídeo C4, rebaudiosídeo C5, rebaudiosídeo C6, rebaudiosídeo E3, rebaudiosídeo E4, rebaudiosídeo E5, rebaudiosídeo E6, rebaudiosídeo E7, rebaudiosídeo D5, rebaudiosídeo D6, rebaudiosídeo D7, rebaudiosídeo D8, rebaudiosídeo H2, rebaudiosídeo H3, rebaudiosídeo H4, rebaudiosídeo H5, rebaudiosídeo H6, rebaudiosídeo K, rebaudiosídeo N2, rebaudiosídeo N3, rebaudiosídeo N4,
105 / 135 rebaudiosídeo N5, rebaudiosídeo M3 e/ou rebaudiosídeo O4, podem também ser combinados com vários carboidratos. O termo "carboidrato" se refere genericamente a compostos de aldeído ou cetona substituídos com múltiplos grupos hidroxila, com a seguinte fórmula geral (CH2,O)n, em que n é 3 a 30, bem como seus oligômeros e polímeros. Os carboidratos da presente invenção podem, além disso, ser substituídos ou desoxigenados em uma ou mais posições. Os carboidratos, para uso na presente invenção, abrangem carboidratos não modificados, derivados de carboidratos, carboidratos substituídos e carboidratos modificados. Para uso na presente invenção, as expressões "derivados de carboidratos", "carboidrato substituído" e "carboidratos modificados" são sinônimas. Carboidrato modificado significa qualquer carboidrato em que ao menos um átomo foi adicionado, removido ou substituído, ou suas combinações. Dessa forma, derivados de carboidratos ou carboidratos substituídos incluem monossacarídeos, dissacarídeos, oligossacarídeos e polissacarídeos substituídos ou não substituídos. Os derivados de carboidrato ou carboidratos substituídos podem ser opcionalmente desoxigenados em qualquer posição C correspondente e/ou substituídos com uma ou mais porções como hidrogênio, halogênio, haloalquila, carboxila, acila, aciloxila, amino, amida, derivados de carboxila, alquilamino, dialquilamino, arilamino, alcóxi, arilóxi, nitro, ciano, sulfo, mercapto, imino, sulfonila, sulfenila, sulfinila, sulfamoíla, carboalcóxi, carboxamido, fosfonila, fosfinila, fosforila, fosfina, tioéster, tioéter, oximina, hidrazino, carbamila, fosfo, fosfonato ou qualquer outro grupo funcional viável desde que o carboidrato derivado ou o carboidrato substituído funcione para melhorar o sabor doce da composição adoçante.
[00486] Exemplos de carboidratos que podem ser usados de acordo com esta invenção incluem, mas não se limitam a, tagatose, trealose, galactose, ramnose, várias ciclodextrinas, oligossacarídeos cíclicos, vários tipos de maltodextrinas, dextrano, sacarose, glicose, ribulose, frutose, treose,
106 / 135 arabinose, xilose, lixose, alose, altrose, manose, idose, lactose, maltose, açúcar invertido, isotrealose, neotrealose, isomaltulose, eritrose, desoxirribose, gulose, idose, talose, eritrulose, xilulose, psicose, turanose, celobiose, amilopectina, glicosamina, manosamina, fucose, ácido glicurônico, ácido glucônico, glucona lactona, abequose, galactosamina, oligossacarídeos de beterraba, isomalto-oligossacarídeos (isomaltose, isomaltotriose, panose e similares), xilo-oligossacarídeos (xilotriose, xilobiose e similares), oligossacarídeos com terminação em xilo, gentio-oligossacarídeos (gentiobiose, gentiotriose, gentiotetraose e similares), nigero- oligossacarídeos, palatinose-oligossacarídeos, fruto-oligosacarídeos (cestose, nistose e similares), maltotetraol, maltotriol, malto-oligossacarídeos (maltotriose, maltotetraose, maltopentaose, maltoexaose, maltoeptaose e similares), amido, inulina, inulo-oligossacarídeos, lactulose, melibiose, rafinose, ribose, açúcares líquidos isomerizados, como xaropes de milho com alto teor de frutose, açúcares de acoplamento e oligossacarídeos de soja. Adicionalmente, os carboidratos como usados aqui podem ser em qualquer configuração D ou L.
[00487] Glicosídeo(s) de esteviol-alvo altamente purificado(s), particularmente, esteviolmonosídeo, esteviolmonosídeo A, esteviolbiosídeo A, esteviolbiosídeo B, esteviolbiosídeo C, esteviolbiosídeo D, esteviolbiosídeo E, rubusosídeo, dulcosídeo A, dulcosídeo C, dulcosídeo D, esteviosídeo A, esteviosídeo B, esteviosídeo C, esteviosídeo G, esteviosídeo H, rebaudiosídeo B2, rebaudiosídeo A4, rebaudiosídeo C, rebaudiosídeo C3, rebaudiosídeo C4, rebaudiosídeo C5, rebaudiosídeo C6, rebaudiosídeo E3, rebaudiosídeo E4, rebaudiosídeo E5, rebaudiosídeo E6, rebaudiosídeo E7, rebaudiosídeo D5, rebaudiosídeo D6, rebaudiosídeo D7, rebaudiosídeo D8, rebaudiosídeo H2, rebaudiosídeo H3, rebaudiosídeo H4, rebaudiosídeo H5, rebaudiosídeo H6, rebaudiosídeo K, rebaudiosídeo N2, rebaudiosídeo N3, rebaudiosídeo N4, rebaudiosídeo N5, rebaudiosídeo M3 e/ou rebaudiosídeo O4 obtidos de acordo
107 / 135 com esta invenção, podem ser usados em combinação com várias substâncias fisiologicamente ativas ou ingredientes funcionais. Ingredientes funcionais são genericamente classificados em categorias como carotenoides, fibra dietária, ácidos graxos, saponinas, antioxidantes, nutracêuticos, flavonoides, isotiocianatos, fenóis, esteróis e estanóis vegetais (fitoesteróis e fitoestanóis); polióis; prebióticos, probióticos; fitoestrógenos; proteína de soja; sulfetos/tióis; aminoácidos; proteínas; vitaminas e minerais. Os ingredientes funcionais também podem ser classificados com base em seus benefícios de saúde, como cardiovasculares, redutores de colesterol e anti-inflamatórios. Ingredientes funcionais exemplificadores são fornecidos no documento WO2013/096420, cujo conteúdo está aqui incorporado a título de referência.
[00488] Glicosídeo(s) de esteviol-alvo altamente purificado(s), particularmente, esteviolmonosídeo, esteviolmonosídeo A, esteviolbiosídeo A, esteviolbiosídeo B, esteviolbiosídeo C, esteviolbiosídeo D, esteviolbiosídeo E, rubusosídeo, dulcosídeo A, dulcosídeo C, dulcosídeo D, esteviosídeo A, esteviosídeo B, esteviosídeo C, esteviosídeo G, esteviosídeo H, rebaudiosídeo B2, rebaudiosídeo A4, rebaudiosídeo C, rebaudiosídeo C3, rebaudiosídeo C4, rebaudiosídeo C5, rebaudiosídeo C6, rebaudiosídeo E3, rebaudiosídeo E4, rebaudiosídeo E5, rebaudiosídeo E6, rebaudiosídeo E7, rebaudiosídeo D5, rebaudiosídeo D6, rebaudiosídeo D7, rebaudiosídeo D8, rebaudiosídeo H2, rebaudiosídeo H3, rebaudiosídeo H4, rebaudiosídeo H5, rebaudiosídeo H6, rebaudiosídeo K, rebaudiosídeo N2, rebaudiosídeo N3, rebaudiosídeo N4, rebaudiosídeo N5, rebaudiosídeo M3 e/ou rebaudiosídeo O4 obtidos de acordo com esta invenção, podem ser aplicados como adoçante de alta intensidade para produzir bebidas e produtos alimentícios de zero caloria, calorias reduzidas ou produtos para diabéticos com características de sabor aprimoradas. Eles podem ser também usados em bebidas, produtos alimentícios e farmacêuticos e outros produtos nos quais o açúcar não pode ser usado. Além disso, os glicosídeo(s) de esteviol-alvo altamente
108 / 135 purificado(s), particularmente, esteviolmonosídeo, esteviolmonosídeo A, esteviolbiosídeo A, esteviolbiosídeo B, esteviolbiosídeo C, esteviolbiosídeo D, esteviolbiosídeo E, rubusosídeo, dulcosídeo A, dulcosídeo C, dulcosídeo D, esteviosídeo A, esteviosídeo B, esteviosídeo C, esteviosídeo G, esteviosídeo H, rebaudiosídeo B2, rebaudiosídeo A4, rebaudiosídeo C, rebaudiosídeo C3, rebaudiosídeo C4, rebaudiosídeo C5, rebaudiosídeo C6, rebaudiosídeo E3, rebaudiosídeo E4, rebaudiosídeo E5, rebaudiosídeo E6, rebaudiosídeo E7, rebaudiosídeo D5, rebaudiosídeo D6, rebaudiosídeo D7, rebaudiosídeo D8, rebaudiosídeo H2, rebaudiosídeo H3, rebaudiosídeo H4, rebaudiosídeo H5, rebaudiosídeo H6, rebaudiosídeo K, rebaudiosídeo N2, rebaudiosídeo N3, rebaudiosídeo N4, rebaudiosídeo N5, rebaudiosídeo M3 e/ou rebaudiosídeo O4, podem ser usados como um adoçante não apenas para bebidas, produtos alimentícios e outros produtos dedicados ao consumo humano, mas também em ração e forragens para animais com características aprimoradas.
[00489] Glicosídeo(s) de esteviol-alvo altamente purificado(s), particularmente, esteviolmonosídeo, esteviolmonosídeo A, esteviolbiosídeo A, esteviolbiosídeo B, esteviolbiosídeo C, esteviolbiosídeo D, esteviolbiosídeo E, rubusosídeo, dulcosídeo A, dulcosídeo C, dulcosídeo D, esteviosídeo A, esteviosídeo B, esteviosídeo C, esteviosídeo G, esteviosídeo H, rebaudiosídeo B2, rebaudiosídeo A4, rebaudiosídeo C, rebaudiosídeo C3, rebaudiosídeo C4, rebaudiosídeo C5, rebaudiosídeo C6, rebaudiosídeo E3, rebaudiosídeo E4, rebaudiosídeo E5, rebaudiosídeo E6, rebaudiosídeo E7, rebaudiosídeo D5, rebaudiosídeo D6, rebaudiosídeo D7, rebaudiosídeo D8, rebaudiosídeo H2, rebaudiosídeo H3, rebaudiosídeo H4, rebaudiosídeo H5, rebaudiosídeo H6, rebaudiosídeo K, rebaudiosídeo N2, rebaudiosídeo N3, rebaudiosídeo N4, rebaudiosídeo N5, rebaudiosídeo M3 e/ou rebaudiosídeo O4 obtidos de acordo com esta invenção, podem ser aplicados como supressor de espuma para produzir produzir bebidas e produtos alimentícios de zero caloria, calorias reduzidas ou para diabéticos.
109 / 135
[00490] Exemplos de produtos consumíveis nos quais glicosídeo(s) de esteviol-alvo altamente purificado(s), particularmente, esteviolmonosídeo, esteviolmonosídeo A, esteviolbiosídeo A, esteviolbiosídeo B, esteviolbiosídeo C, esteviolbiosídeo D, esteviolbiosídeo E, rubusosídeo, dulcosídeo A, dulcosídeo C, dulcosídeo D, esteviosídeo A, esteviosídeo B, esteviosídeo C, esteviosídeo G, esteviosídeo H, rebaudiosídeo B2, rebaudiosídeo A4, rebaudiosídeo C, rebaudiosídeo C3, rebaudiosídeo C4, rebaudiosídeo C5, rebaudiosídeo C6, rebaudiosídeo E3, rebaudiosídeo E4, rebaudiosídeo E5, rebaudiosídeo E6, rebaudiosídeo E7, rebaudiosídeo D5, rebaudiosídeo D6, rebaudiosídeo D7, rebaudiosídeo D8, rebaudiosídeo H2, rebaudiosídeo H3, rebaudiosídeo H4, rebaudiosídeo H5, rebaudiosídeo H6, rebaudiosídeo K, rebaudiosídeo N2, rebaudiosídeo N3, rebaudiosídeo N4, rebaudiosídeo N5, rebaudiosídeo M3 e/ou rebaudiosídeo O4, podem ser usados como um composto adoçante incluem, mas não se limitam a, bebidas alcoólicas, como vodca, vinho, cerveja, licor e saquê, etc., sucos naturais; bebidas refrescantes; refrigerantes gaseificados; bebidas dietéticas; bebidas com teor calórico zero; bebidas e alimentos com teor calórico reduzido; bebidas à base de iogurte; sucos instantâneos; café instantâneo; tipos de bebidas instantâneas em pó; produtos enlatados; xaropes; pasta de soja fermentada; molho de soja; vinagre; molhos; maionese; ketchups; curry; sopa; sopa instantânea; molho de soja em pó; vinagre em pó; tipos de biscoitos; biscoito de arroz; bolachas; pão; chocolates; caramelo; bala; goma de mascar; gelatina; pudim; conservas de frutas e produtos hortícolas; creme fresco; geleia; marmelada; pasta de flor; leite em pó; sorvete; gelato de frutas; legumes e frutas acondicionados em frascos; feijão enlatado e cozido; carne e alimentos cozidos em molho adocicado; produtos alimentícios vegetais agrícolas; frutos do mar; presunto; linguiça; presunto de peixe; linguiça de peixe; pasta de peixe; produtos à base de peixe fritos por imersão; produtos à base de frutos do mar secos; produtos alimentícios congelados; conservas de alga marinha; conservas de carne;
110 / 135 tabaco, produtos medicinais e muitos outros. Em princípio, eles podem ter aplicações ilimitadas.
[00491] Exemplos de produtos consumíveis em que glicosídeo(s) de esteviol-alvo altamente purificado(s), particularmente, esteviolmonosídeo, esteviolmonosídeo A, esteviolbiosídeo A, esteviolbiosídeo B, esteviolbiosídeo C, esteviolbiosídeo D, esteviolbiosídeo E, rubusosídeo, dulcosídeo A, dulcosídeo C, dulcosídeo D, esteviosídeo A, esteviosídeo B, esteviosídeo C, esteviosídeo G, esteviosídeo H, rebaudiosídeo B2, rebaudiosídeo A4, rebaudiosídeo C, rebaudiosídeo C3, rebaudiosídeo C4, rebaudiosídeo C5, rebaudiosídeo C6, rebaudiosídeo E3, rebaudiosídeo E4, rebaudiosídeo E5, rebaudiosídeo E6, rebaudiosídeo E7, rebaudiosídeo D5, rebaudiosídeo D6, rebaudiosídeo D7, rebaudiosídeo D8, rebaudiosídeo H2, rebaudiosídeo H3, rebaudiosídeo H4, rebaudiosídeo H5, rebaudiosídeo H6, rebaudiosídeo K, rebaudiosídeo N2, rebaudiosídeo N3, rebaudiosídeo N4, rebaudiosídeo N5, rebaudiosídeo M3 e/ou rebaudiosídeo O4,podem ser usados como um modificador de sabor ou um sabor com propriedades modificadoras incluem, mas não se limitam a, bebidas alcoólicas, como vodca, vinho, cerveja, licor e saquê, etc., sucos naturais; bebidas refrescantes; refrigerantes gaseificados; bebidas dietéticas; bebidas com teor calórico zero; bebidas e alimentos com teor calórico reduzido; bebidas à base de iogurte; sucos instantâneos; café instantâneo; tipos de bebidas instantâneas em pó; produtos enlatados; xaropes; pasta de soja fermentada; molho de soja; vinagre; molhos; maionese; ketchups; curry; sopa; sopa instantânea; molho de soja em pó; vinagre em pó; tipos de biscoitos; biscoito de arroz; bolachas; pão; chocolates; caramelo; bala; goma de mascar; gelatina; pudim; conservas de frutas e produtos hortícolas; creme fresco; geleia; marmelada; pasta de flor; leite em pó; sorvete; gelado de fruta; legumes e frutas acondicionados em frascos; feijão enlatado e cozido; carne e alimentos cozidos em molho adoçado; produtos alimentícios vegetais agrícolas; frutos do mar; presunto; linguiça; presunto de
111 / 135 peixe; linguiça de peixe; pasta de peixe; produtos à base de peixe fritos por imersão; produtos à base de frutos do mar secos; produtos alimentícios congelados; conservas de alga marinha; conservas de carne; tabaco, produtos medicinais e muitos outros. Em princípio, eles podem ter aplicações ilimitadas.
[00492] Durante a fabricação de produtos, como produtos alimentícios, bebidas, produtos farmacêuticos, cosméticos, produtos de mesa e goma para mascar, os métodos convencionais como misturação, amassamento, dissolução, decapagem, permeação, percolação, salpicamento de pó, atomização, infusão e outros métodos podem ser usados.
[00493] Além disso, glicosídeo(s) de esteviol-alvo altamente purificado(s), particularmente, esteviolmonosídeo, esteviolmonosídeo A, esteviolbiosídeo A, esteviolbiosídeo B, esteviolbiosídeo C, esteviolbiosídeo D, esteviolbiosídeo E, rubusosídeo, dulcosídeo A, dulcosídeo C, dulcosídeo D, esteviosídeo A, esteviosídeo B, esteviosídeo C, esteviosídeo G, esteviosídeo H, rebaudiosídeo B2, rebaudiosídeo A4, rebaudiosídeo C, rebaudiosídeo C3, rebaudiosídeo C4, rebaudiosídeo C5, rebaudiosídeo C6, rebaudiosídeo E3, rebaudiosídeo E4, rebaudiosídeo E5, rebaudiosídeo E6, rebaudiosídeo E7, rebaudiosídeo D5, rebaudiosídeo D6, rebaudiosídeo D7, rebaudiosídeo D8, rebaudiosídeo H2, rebaudiosídeo H3, rebaudiosídeo H4, rebaudiosídeo H5, rebaudiosídeo H6, rebaudiosídeo K, rebaudiosídeo N2, rebaudiosídeo N3, rebaudiosídeo N4, rebaudiosídeo N5, rebaudiosídeo M3 e/ou rebaudiosídeo O4 obtidos nesta invenção, podem ser usados nas formas secas e líquidas.
[00494] O glicosídeo de esteviol-alvo altamente purificado pode ser adicionado antes ou depois do tratamento por calor de produtos alimentícios. A quantidade de glicosídeo(s) de esteviol-alvo altamente purificado(s), particularmente, esteviolmonosídeo, esteviolmonosídeo A, esteviolbiosídeo A, esteviolbiosídeo B, esteviolbiosídeo C, esteviolbiosídeo D, esteviolbiosídeo E, rubusosídeo, dulcosídeo A, dulcosídeo C, dulcosídeo D, esteviosídeo A,
112 / 135 esteviosídeo B, esteviosídeo C, esteviosídeo G, esteviosídeo H, rebaudiosídeo B2, rebaudiosídeo A4, rebaudiosídeo C, rebaudiosídeo C3, rebaudiosídeo C4, rebaudiosídeo C5, rebaudiosídeo C6, rebaudiosídeo E3, rebaudiosídeo E4, rebaudiosídeo E5, rebaudiosídeo E6, rebaudiosídeo E7, rebaudiosídeo D5, rebaudiosídeo D6, rebaudiosídeo D7, rebaudiosídeo D8, rebaudiosídeo H2, rebaudiosídeo H3, rebaudiosídeo H4, rebaudiosídeo H5, rebaudiosídeo H6, rebaudiosídeo K, rebaudiosídeo N2, rebaudiosídeo N3, rebaudiosídeo N4, rebaudiosídeo N5, rebaudiosídeo M3 e/ou rebaudiosídeo O4, dependem do propósito de uso. Conforme discutido acima, eles podem ser adicionados sozinhos ou em combinação com outros compostos.
[00495] A presente invenção também é direcionada à intensificação da doçura em bebidas usando esteviolmonosídeo, esteviolmonosídeo A, esteviolbiosídeo A, esteviolbiosídeo B, esteviolbiosídeo C, esteviolbiosídeo D, esteviolbiosídeo E, rubusosídeo, dulcosídeo A, dulcosídeo C, dulcosídeo D, esteviosídeo A, esteviosídeo B, esteviosídeo C, esteviosídeo G, esteviosídeo H, rebaudiosídeo B2, rebaudiosídeo A4, rebaudiosídeo C, rebaudiosídeo C3, rebaudiosídeo C4, rebaudiosídeo C5, rebaudiosídeo C6, rebaudiosídeo E3, rebaudiosídeo E4, rebaudiosídeo E5, rebaudiosídeo E6, rebaudiosídeo E7, rebaudiosídeo D5, rebaudiosídeo D6, rebaudiosídeo D7, rebaudiosídeo D8, rebaudiosídeo H2, rebaudiosídeo H3, rebaudiosídeo H4, rebaudiosídeo H5, rebaudiosídeo H6, rebaudiosídeo K, rebaudiosídeo N2, rebaudiosídeo N3, rebaudiosídeo N4, rebaudiosídeo N5, rebaudiosídeo M3 e/ou rebaudiosídeo O4 como intensificador de doçura, sendo que esteviolmonosídeo, esteviolmonosídeo A, esteviolbiosídeo A, esteviolbiosídeo B, esteviolbiosídeo C, esteviolbiosídeo D, esteviolbiosídeo E, rubusosídeo, dulcosídeo A, dulcosídeo C, dulcosídeo D, esteviosídeo A, esteviosídeo B, esteviosídeo C, esteviosídeo G, esteviosídeo H, rebaudiosídeo B2, rebaudiosídeo A4, rebaudiosídeo C, rebaudiosídeo C3, rebaudiosídeo C4, rebaudiosídeo C5, rebaudiosídeo C6, rebaudiosídeo E3, rebaudiosídeo E4, rebaudiosídeo E5,
113 / 135 rebaudiosídeo E6, rebaudiosídeo E7, rebaudiosídeo D5, rebaudiosídeo D6, rebaudiosídeo D7, rebaudiosídeo D8, rebaudiosídeo H2, rebaudiosídeo H3, rebaudiosídeo H4, rebaudiosídeo H5, rebaudiosídeo H6, rebaudiosídeo K, rebaudiosídeo N2, rebaudiosídeo N3, rebaudiosídeo N4, rebaudiosídeo N5, rebaudiosídeo M3 e/ou rebaudiosídeo O4 estão presentes em uma concentração em ou abaixo de seus respectivos limites de reconhecimento de doçura.
[00496] Para uso na presente invenção, o termo "intensificador de doçura" se refere a um composto capaz de acentuar ou intensificar a percepção do sabor doce em uma composição, como uma bebida. O termo "intensificador de doçura" é sinônimo dos termos "potenciador do sabor doce", "potenciador de doçura", "amplificador de doçura" e "acentuador de doçura".
[00497] O termo "concentração limite de reconhecimento de doçura", como genericamente usado aqui, é a concentração mais baixa de um composto doce que é perceptível pelo sentido do paladar humano conhecida, tipicamente em torno de 1,0% de equivalência de sacarose (1,0% SE). De modo geral, os intensificadores de doçura podem intensificar ou potencializar o sabor doce dos adoçantes sem fornecer qualquer sabor doce perceptível em si quando presentes em ou abaixo da concentração limite de reconhecimento de doçura de um dado intensificador de doçura; no entanto, os intensificadores de doçura podem fornecer um sabor doce em concentrações acima de sua concentração limite de reconhecimento de doçura. A concentração limite de reconhecimento de doçura é específica para um determinado intensificador e pode variar com base na matriz de bebida. A concentração limite de reconhecimento de doçura pode ser facilmente determinada pelo teste de sabor aumentando-se as concentrações de um dado intensificador até que uma equivalência de sacarose maior que 1,0% em uma dada matriz de bebida seja detectada. A concentração que fornece cerca de
114 / 135 1,0% de equivalência de sacarose é considerada o limite de reconhecimento de doçura.
[00498] Em algumas modalidades, o adoçante está presente na bebida em uma quantidade de cerca de 0,5% a cerca de 12%, em peso, como, por exemplo, cerca de 1,0%, em peso, cerca de 1,5%, em peso, cerca de 2,0%, em peso, cerca de 2,5%, em peso, cerca de 3,0%, em peso, cerca de 3,5%, em peso, cerca de 4,0%, em peso, cerca de 4,5%, em peso, cerca de 5,0%, em peso, cerca de 5,5%, em peso, cerca de 6,0%, em peso, cerca de 6,5%, em peso, cerca de 7,0%, em peso, cerca de 7,5%, em peso, cerca de 8,0%, em peso, cerca de 8,5%, em peso, cerca de 9,0%, em peso, cerca de 9,5%, em peso, cerca de 10,0%, em peso, cerca de 10,5%, em peso, cerca de 11,0%, em peso, cerca de 11,5%, em peso, ou cerca de 12,0%, em peso.
[00499] Em uma modalidade específica, o adoçante está presente na bebida em uma quantidade de cerca de 0,5% a cerca de 10%, como, por exemplo, de cerca de 2% a cerca de 8%, de cerca de 3% a cerca de 7% ou de cerca de 4% a cerca de 6%, em peso. Em uma modalidade específica, o adoçante está presente na bebida em uma quantidade de cerca de 0,5% a cerca de 8%, em peso. Em uma outra modalidade específica, o adoçante está presente na bebida em uma quantidade de cerca de 2% a cerca de 8%, em peso.
[00500] Em uma modalidade, o adoçante é um adoçante calórico tradicional. Adoçantes adequados incluem, mas não se limitam a, sacarose, frutose, glicose, xarope de milho com alto teor de frutose e xarope de amido com alto teor de frutose.
[00501] Em uma outra modalidade, o adoçante é eritritol.
[00502] Em ainda outra modalidade, o adoçante é um açúcar raro. Açúcares raros adequados incluem, mas não se limitam a, D-alose, D-psicose, D-ribose, D-tagatose, L-glicose, L-fucose, L-arabinose, D-turanose, D- leucrose e suas combinações.
115 / 135
[00503] Contempla-se que um adoçante pode ser usado sozinho ou em combinação com outros adoçantes.
[00504] Em uma modalidade, o açúcar raro é D-alose. Em uma modalidade mais específica, o D-alose está presente na bebida em uma quantidade de cerca de 0,5% a cerca de 10%, em peso, como, por exemplo, de cerca de 2% a cerca de 8%.
[00505] Em outra modalidade, o açúcar raro é D-psicose. Em uma modalidade mais específica, o D-psicose está presente na bebida em uma quantidade de cerca de 0,5% a cerca de 10%, em peso, como, por exemplo, de cerca de 2% a cerca de 8%.
[00506] Em mais outra modalidade, o açúcar raro é D-ribose. Em uma modalidade mais específica, o D-ribose está presente na bebida em uma quantidade de cerca de 0,5% a cerca de 10%, em peso, como, por exemplo, de cerca de 2% a cerca de 8%.
[00507] Em ainda outra modalidade, o açúcar raro é D-tagatose. Em uma modalidade mais específica, o D-tagatose está presente na bebida em uma quantidade de cerca de 0,5% a cerca de 10%, em peso, como, por exemplo, de cerca de 2% a cerca de 8%.
[00508] Em uma outra modalidade, o açúcar raro é L-glicose. Em uma modalidade mais específica, o L-glicose está presente na bebida em uma quantidade de cerca de 0,5% a cerca de 10%, em peso, como, por exemplo, de cerca de 2% a cerca de 8%.
[00509] Em uma modalidade, o açúcar raro é L-fucose. Em uma modalidade mais específica, o L-fucose está presente na bebida em uma quantidade de cerca de 0,5% a cerca de 10%, em peso, como, por exemplo, de cerca de 2% a cerca de 8%.
[00510] Em uma outra modalidade, o açúcar raro é L-arabinose. Em uma modalidade mais específica, o L-arabinose está presente na bebida em uma quantidade de cerca de 0,5% a cerca de 10%, em peso, como, por
116 / 135 exemplo, de cerca de 2% a cerca de 8%.
[00511] Em ainda outra modalidade, o açúcar raro é D-turanose. Em uma modalidade mais específica, o D-turanose está presente na bebida em uma quantidade de cerca de 0,5% a cerca de 10%, em peso, como, por exemplo, de cerca de 2% a cerca de 8%.
[00512] Em ainda outra modalidade, o açúcar raro é D-leucrose. Em uma modalidade mais específica, o D-leucrose está presente na bebida em uma quantidade de cerca de 0,5% a cerca de 10%, em peso, como, por exemplo, de cerca de 2% a cerca de 8%.
[00513] A adição do intensificador de doçura em uma concentração em ou abaixo de seu limite de reconhecimento de doçura aumenta a equivalência de sacarose detectada da bebida que compreende o adoçante e o intensificador de doçura em comparação com uma bebida correspondente na ausência do intensificador de doçura. Além disso, a doçura pode ser aumentada em uma quantidade mais do que a doçura detectável de uma solução contendo a mesma concentração do pelo menos um intensificador de doçura na ausência de qualquer adoçante.
[00514] Consequentemente, a presente invenção também fornece um método para intensificar a doçura de uma bebida que compreende um adoçante que compreende fornecer uma bebida que compreende um adoçante e adicionar um intensificador de doçura selecionado dentre esteviolmonosídeo, esteviolmonosídeo A, esteviolbiosídeo A, esteviolbiosídeo B, esteviolbiosídeo C, esteviolbiosídeo D, esteviolbiosídeo E, rubusosídeo, dulcosídeo A, dulcosídeo C, dulcosídeo D, esteviosídeo A, esteviosídeo B, esteviosídeo C, esteviosídeo G, esteviosídeo H, rebaudiosídeo B2, rebaudiosídeo A4, rebaudiosídeo C, rebaudiosídeo C3, rebaudiosídeo C4, rebaudiosídeo C5, rebaudiosídeo C6, rebaudiosídeo E3, rebaudiosídeo E4, rebaudiosídeo E5, rebaudiosídeo E6, rebaudiosídeo E7, rebaudiosídeo D5, rebaudiosídeo D6, rebaudiosídeo D7, rebaudiosídeo D8, rebaudiosídeo H2,
117 / 135 rebaudiosídeo H3, rebaudiosídeo H4, rebaudiosídeo H5, rebaudiosídeo H6, rebaudiosídeo K, rebaudiosídeo N2, rebaudiosídeo N3, rebaudiosídeo N4, rebaudiosídeo N5, rebaudiosídeo M3 e/ou rebaudiosídeo O4 ou uma combinação dos mesmos, sendo que esteviolmonosídeo, esteviolmonosídeo A, esteviolbiosídeo A, esteviolbiosídeo B, esteviolbiosídeo C, esteviolbiosídeo D, esteviolbiosídeo E, rubusosídeo, dulcosídeo A, dulcosídeo C, dulcosídeo D, esteviosídeo A, esteviosídeo B, esteviosídeo C, esteviosídeo G, esteviosídeo H, rebaudiosídeo B2, rebaudiosídeo A4, rebaudiosídeo C, rebaudiosídeo C3, rebaudiosídeo C4, rebaudiosídeo C5, rebaudiosídeo C6, rebaudiosídeo E3, rebaudiosídeo E4, rebaudiosídeo E5, rebaudiosídeo E6, rebaudiosídeo E7, rebaudiosídeo D5, rebaudiosídeo D6, rebaudiosídeo D7, rebaudiosídeo D8, rebaudiosídeo H2, rebaudiosídeo H3, rebaudiosídeo H4, rebaudiosídeo H5, rebaudiosídeo H6, rebaudiosídeo K, rebaudiosídeo N2, rebaudiosídeo N3, rebaudiosídeo N4, rebaudiosídeo N5, rebaudiosídeo M3 e/ou rebaudiosídeo O4 estão presentes em uma concentração em ou abaixo dos seus limites de reconhecimento de doçura.
[00515] A adição de esteviolmonosídeo, esteviolmonosídeo A, esteviolbiosídeo A, esteviolbiosídeo B, esteviolbiosídeo C, esteviolbiosídeo D, esteviolbiosídeo E, rubusosídeo, dulcosídeo A, dulcosídeo C, dulcosídeo D, esteviosídeo A, esteviosídeo B, esteviosídeo C, esteviosídeo G, esteviosídeo H, rebaudiosídeo B2, rebaudiosídeo A4, rebaudiosídeo C, rebaudiosídeo C3, rebaudiosídeo C4, rebaudiosídeo C5, rebaudiosídeo C6, rebaudiosídeo E3, rebaudiosídeo E4, rebaudiosídeo E5, rebaudiosídeo E6, rebaudiosídeo E7, rebaudiosídeo D5, rebaudiosídeo D6, rebaudiosídeo D7, rebaudiosídeo D8, rebaudiosídeo H2, rebaudiosídeo H3, rebaudiosídeo H4, rebaudiosídeo H5, rebaudiosídeo H6, rebaudiosídeo K, rebaudiosídeo N2, rebaudiosídeo N3, rebaudiosídeo N4, rebaudiosídeo N5, rebaudiosídeo M3 e/ou rebaudiosídeo O4 em uma concentração em ou abaixo do limite de reconhecimento de doçura para uma bebida contendo um adoçante pode aumentar a equivalência
118 / 135 de sacarose detectada de cerca de 1,0% a cerca de 5,0%, como, por exemplo, cerca de 1,0%, cerca de 1,5%, cerca de 2,0%, cerca de 2,5%, cerca de 3,0%, cerca de 3,5%, cerca de 4,0%, cerca de 4,5% ou cerca de 5,0%.
[00516] Os exemplos a seguir ilustram as modalidades preferenciais da invenção para a preparação de glicosídeo(s) de esteviol-alvo altamente purificado(s), particularmente, esteviolmonosídeo, esteviolmonosídeo A, esteviolbiosídeo A, esteviolbiosídeo B, esteviolbiosídeo C, esteviolbiosídeo D, esteviolbiosídeo E, rubusosídeo, dulcosídeo A, dulcosídeo C, dulcosídeo D, esteviosídeo A, esteviosídeo B, esteviosídeo C, esteviosídeo G, esteviosídeo H, rebaudiosídeo B2, rebaudiosídeo A4, rebaudiosídeo C, rebaudiosídeo C3, rebaudiosídeo C4, rebaudiosídeo C5, rebaudiosídeo C6, rebaudiosídeo E3, rebaudiosídeo E4, rebaudiosídeo E5, rebaudiosídeo E6, rebaudiosídeo E7, rebaudiosídeo D5, rebaudiosídeo D6, rebaudiosídeo D7, rebaudiosídeo D8, rebaudiosídeo H2, rebaudiosídeo H3, rebaudiosídeo H4, rebaudiosídeo H5, rebaudiosídeo H6, rebaudiosídeo K, rebaudiosídeo N2, rebaudiosídeo N3, rebaudiosídeo N4, rebaudiosídeo N5, rebaudiosídeo M3 e/ou rebaudiosídeo O4. Será entendido que a invenção não está limitada aos materiais, proporções, condições e procedimentos apresentados nos exemplos, que são apenas ilustrativos. Exemplos Exemplo 1 Sequências de proteína de enzimas manipuladas usadas no processo biocatalítico SEQ ID 1: > SuSy_At, variante PM1-54-2-E05 (sacarose sintase manipulada; fonte de gene WT: Arabidopsis thaliana)
MANAERMITRVHSQRERLNETLVSERNEVLALLSRVEAKGKGILQQNQII AEFEALPEQTRKKLEGGPFFDLLKSTQEAIVLPPWVALAVRPRPGVWEYL RVNLHALVVEELQPAEFLHFKEELVDGVKNGNFTLELDFEPFNASIPRPT
119 / 135
LHKYIGNGVDFLNRHLSAKLFHDKESLLPLLDFLRLHSHQGKNLMLSEKI QNLNTLQHTLRKAEEYLAELKSETLYEEFEAKFEEIGLERGWGDNAERVL DMIRLLLDLLEAPDPSTLETFLGRVPMVFNVVILSPHGYFAQDNVLGYPD TGGQVVYILDQVRALEIEMLQRIKQQGLNIKPRILILTRLLPDAVGTTCG ERLERVYDSEYCDILRVPFRTEKGIVRKWISRFEVWPYLETYTEDAAVEL SKELNGKPDLIIGNYSDGNLVASLLAHKLGVTQCTIAHALEKTKYPDSDI YWKKLDDKYHFSCQFTADIFAMNHTDFIITSTFQEIAGSKETVGQYESHT AFTLPGLYRVVHGIDVFDPKFNIVSPGADMSIYFPYTEEKRRLTKFHSEI EELLYSDVENDEHLCVLKDKKKPILFTMARLDRVKNLSGLVEWYGKNTRL RELVNLVVVGGDRRKESKDNEEKAEMKKMYDLIEEYKLNGQFRWISSQMD RVRNGELYRYICDTKGAFVQPALYEAFGLTVVEAMTCGLPTFATCKGGPA EIIVHGKSGFHIDPYHGDQAADLLADFFTKCKEDPSHWDEISKGGLQRIE EKYTWQIYSQRLLTLTGVYGFWKHVSNLDRLEHRRYLEMFYALKYRPLAQ
AVPLAQDD SEQ ID 2: > UGTSl2 variante 0234 (glucosiltransferase manipulada; fonte de gene WT: Solanum lycopersicum)
MATNLRVLMFPWLAYGHISPFLNIAKQLADRGFLIYLCSTRINLESIIKK IPEKYADSIHLIELQLPELPELPPHYHTTNGLPPHLNPTLHKALKMSKPN FSRILQNLKPDLLIYDVLQPWAEHVANEQGIPAGKLLVSCAAVFSYFFSF RKNPGVEFPFPAIHLPEVEKVKIREILAKEPEEGGRLDEGNKQMMLMCTS RTIEAKYIDYCTELCNWKVVPVGPPFQDLITNDADNKELIDWLGTKPENS TVFVSFGSEYFLSKEDMEEIAFALEASNVNFIWVVRFPKGEERNLEDALP EGFLERIGERGRVLDKFAPQPRILNHPSTGGFISHCGWNSVMESIDFGVP IIAMPIHNDQPINAKLMVELGVAVEIVRDDDGKIHRGEIAEALKSVVTGE
TGEILRAKVREISKNLKSIRDEEMDAVAEELIQLCRNSNKSK SEQ ID 3: > UGT76G1 variante 0042 (glucosiltransferase manipulada; fonte de gene WT: Stevia rebaudiana)
120 / 135
MENKTETTVRRRRRIILFPVPFQGHINPILQLANVLYSKGFAITILHTNFNKPKTSNY PHFTFRFILDNDPQDERISNLPTHGPLAGMRIPIINEHGADELRRELELLMLASEEDE EVSCLITDALWYFAQDVADSLNLRRLVLMTSSLFNFHAHVSLPQFDELGYLDPDD KTRLEEQASGFPMLKVKDIKSAYSNWQIGKEILGKMIKQTKASSGVIWNSFKELEE SELETVIREIPAPSFLIPLPKHLTASSSSLLDHDRTVFEWLDQQAPSSVLYVSFGSTSE VDEKDFLEIARGLVDSGQSFLWVVRPGFVKGSTWVEPLPDGFLGERGKIVKWVPQ QEVLAHPAIGAFWTHSGWNSTLESVCEGVPMIFSSFGGDQPLNARYMSDVLRVGV YLENGWERGEVVNAIRRVMVDEEGEYIRQNARVLKQKADVSLMKGGSSYESLES
LVSYISSL SEQ ID 4: > UDP-glicosiltransferase 91C1 (UGlyT91C1; fonte de gene WT: Oryza sativa japonica; sequência de referência NCBI: XP_015629141.1)
MDSGYSSSYAAAAGMHVVICPWLAFGHLLPCLDLAQRLASRGHRVSFVSTPRNISRLPPV RPALAPLVAFVALPLPRVEGLPDGAESTNDVPHDRPDMVELHRRAFDGLAAPFSEFLGTA CADWVIVDVFHHWAAAAALEHKVPCAMMLLGSAHMIASIADRRLERAETESPAAAGQGRP AAAPTFEVARMKLIRTKGSSGMSLAERFSLTLSRSSLVVGRSCVEFEPETVPLLSTLRGK PITFLGLMPPLHEGRREDGEDATVRWLDAQPAKSVVYVALGSEVPLGVEKVHELALGLEL AGTRFLWALRKPTGVSDADLLPAGFEERTRGRGVVATRWVPQMSILAHAAVGAFLTHCGW NSTIEGLMFGHPLIMLPIFGDQGPNARLIEAKNAGLQVARNDGDGSFDREGVAAAIRAVA
VEEESSKVFQAKAKKLQEIVADMACHERYIDGFIQQLRSYKD Exemplo 2 Expressão e formulação da variante SuSy_At da SEQ ID 1
[00517] O gene que codifica a variante SuSy_At da SEQ ID 1 (EXEMPLO 1) foi clonado no vetor de expressão pLE1A17 (derivado de pRSF-1b, Novagen). O plasmídeo resultante foi usado para a transformação de células de E.coli BL21(DE3).
[00518] As células foram cultivadas em um meio ZYM505 (F. William Studier, Protein Expression and Purification 41 (2005) 207-234) suplementado com canamicina (50 mg/l) a 37°C. A expressão dos genes foi
121 / 135 induzida em fase logarítmica por IPTG (0,2 mM) e realizada a 30°C e 200 rpm durante 16 a 18 horas.
[00519] As células foram coletadas por centrifugação (3.220 x g, 20 min., 4°C) e ressuspensas a uma densidade óptica de 200 (medida a 600 nm (DO600)) com tampão de lise celular (100 mM de Tris-HCl pH 7,0; 2 mM de MgCl2, DNA nuclease a 20 U/ml, lisozima a 0,5 mg/ml). As células foram, então, rompidas por sonicação, e os extratos brutos foram separadas dos restos de células por centrifugação (18.000 x g 40 min., 4°C). O sobrenadante foi esterilizado por filtração através de um filtro de 0,2 µm e diluído 50:50 com água destilada, resultando em uma preparação de ativo enzimático.
[00520] Para preparações de ativo enzimático de SuSy_At, a atividade em unidades é definida conforme exposto a seguir: 1 mU de SuSy_At converte 1 nmol de sacarose em frutose em 1 minuto. As condições de reação para o ensaio são 30°C, 50 mM de tampão de fosfato de potássio pH 7,0, 400 mM de sacarose a t0, 3 mM de MgCl2 e 15 mM de difosfato de uridina (UDP). Exemplo 3 Expressão e formulação da variante UGTSl2 da SEQ ID 2
[00521] O gene que codifica a variante UGTSl2 da SEQ ID 2 (EXEMPLO 1) foi clonado no vetor de expressão pLE1A17 (derivado de pRSF-1b, Novagen). O plasmídeo resultante foi usado para a transformação de células de E.coli BL21(DE3).
[00522] As células foram cultivadas em um meio ZYM505 (F. William Studier, Protein Expression and Purification 41 (2005) 207-234) suplementado com canamicina (50 mg/l) a 37°C. A expressão dos genes foi induzida em fase logarítmica por IPTG (0,1 mM) e realizada a 30°C e 200 rpm durante 16 a 18 horas.
[00523] As células foram coletadas por centrifugação (3.220 x g, 20 min., 4°C) e ressuspensas a uma densidade óptica de 200 (medida a 600 nm (DO600)) com tampão de lise celular (100 mM de Tris-HCl pH 7,0; 2 mM de
122 / 135 MgCl2, DNA nuclease a 20 U/ml, lisozima a 0,5 mg/ml). As células foram então rompidas por sonicação e os extratos brutos foram separadas dos restos de células por centrifugação (18.000 x g 40 min., 4°C). O sobrenadante foi esterilizado por filtração através de um filtro de 0,2 µm e diluído 50:50 com solução de 1 M de sacarose, resultando em uma preparação de ativo enzimático.
[00524] Para preparações de ativo enzimático de UGTSl2, a atividade em unidades é definida conforme exposto a seguir: 1 mU de UGTSl2 converte 1 nmol de rebaudiosídeo A (Reb A) em rebaudiosídeo D (Reb D) em 1 minuto. As condições de reação para o ensaio são 30°C, 50 mM de tampão de fosfato de potássio pH 7,0, 10 mM Reb A a t0, 500 mM de sacarose, 3 mM de MgCl2, 0,25 mM de difosfato de uridina (UDP) e 3 U/ml de SuSy_At. Exemplo 4 Expressão e formulação da variante UGT76G1 da SEQ ID 3
[00525] O gene que codifica a variante UGT76G1 da SEQ ID 3 (EXEMPLO 1) foi clonado no vetor de expressão pLE1A17 (derivado de pRSF-1b, Novagen). O plasmídeo resultante foi usado para a transformação de células de E.coli BL21(DE3).
[00526] As células foram cultivadas em um meio ZYM505 (F. William Studier, Protein Expression and Purification 41 (2005) 207-234) suplementado com canamicina (50 mg/l) a 37°C. A expressão dos genes foi induzida em fase logarítmica por IPTG (0,1 mM) e realizada a 30°C e 200 rpm durante 16 a 18 horas.
[00527] As células foram coletadas por centrifugação (3.220 x g, 20 min., 4°C) e ressuspensas a uma densidade óptica de 200 (medida a 600 nm (DO600)) com tampão de lise celular (100 mM de Tris-HCl pH 7,0; 2 mM de MgCl2, DNA nuclease a 20 U/ml, lisozima a 0,5 mg/ml). As células foram então rompidas por sonicação e os extratos brutos foram separadas dos restos de células por centrifugação (18.000 x g 40 min., 4°C). O sobrenadante foi
123 / 135 esterilizado por filtração através de um filtro de 0,2 µm e diluído 50:50 com solução de 1 M de sacarose, resultando em uma preparação de ativo enzimático.
[00528] Para preparações de ativo enzimático de UGT76G1, a atividade em unidades é definida conforme exposto a seguir: 1 mU de UGT76G1 converte 1 nmol de rebaudiosídeo D (Reb D) em rebaudiosídeo M (Reb M) em 1 minuto. As condições de reação para o ensaio são 30 °C, 50 mM de tampão de fosfato de potássio pH 7,0, 10 mM Reb D a t0, 500 mM de sacarose, 3 mM de MgCl2, 0,25 mM de difosfato de uridina (UDP) e 3 U/ml de SuSy_At. Exemplo 5 Síntese de rebaudiosídeo N2 e rebaudiosídeo O4 a partir de rebaudiosídeo C em uma reação em um frasco, adicionando UGTSl2, SuSy_At e UGT76G1 ao mesmo tempo.
[00529] Rebaudiosídeo N2 (reb N2) e rebaudiosídeo O4 (reb O4) foram sintetizados diretamente a partir de rebaudiosídeo C em uma reação em um frasco (consulte a Figura 3a e a Figura 3b), utilizando as três enzimas (consulte os EXEMPLOS 1, 2, 3 e 4): UGTSl2 (variante da SEQ ID 2), SuSy_At (variante da SEQ ID 1) e UGT76G1 (variante da SEQ ID 3). A solução da reação final continha 105 U/l de UGTSl2, 405 U/l de SuSy_At, 3 U/l de UGT76G1, 5 mM de rebaudiosídeo C, 0,25 mM de uridina difosfato (UDP), 1 M de sacarose, 4 mM de MgCl2 e tampão de fosfato de potássio (pH 6,6). Primeiro, 207 ml de água destilada foram misturados com 0,24 g de MgCl2•6H2O, 103g de sucrose, 9.9 ml de 1,5 M de tampão de fosfato de potássio (pH 6,6) e 15g de rebaudiosídeo C. Após a dissolução dos componentes, a temperatura foi ajustada para 45°C e UGTSl2, SuSy_At, UGT76G1 e 39 mg de UDP foram adicionadas. A mistura de reação foi incubada em um agitador a 45 °C por 24 horas. Trinta e nove (39) mg de UDP adicionais foram adicionados em 8 horas e 18 horas. O conteúdo de reb O4,
124 / 135 reb N2, reb K e reb C em vários pontos no tempo foi analisado por HPLC.
[00530] Para análise, as amostras de biotransformação foram inativadas pelo ajuste da mistura de reação usando 17% de H3PO4 e, então, fervidas durante 10 minutos. As amostras resultantes foram filtradas, os filtrados foram diluídos 10 vezes e usados como amostras para análise por HPLC. O ensaio HPLC foi realizado em um sistema HPLC HP 1200 da Agilente, compreendido de uma bomba, um termostato de coluna, um amostrador automático, um detector de UV capaz de correção de fundo e um sistema de captura de dados. Os analitos foram separados com o uso de Poroshell 120 SB- C18 da Agilente, 4,6 mm x 150 mm, 2,7 µm a 40°C. A fase móvel consistia em duas pré-misturas: - pré-mistura 1 contendo 75% de 10 mM de tampão de fosfato (pH 2,6) e 25% de acetonitrila, e - pré-mistura 2 contendo 68% de 10 mM de tampão de fosfato (pH 2,6) e 32% de acetonitrila.
[00531] O gradiente de eluição começou com a pré-mistura 1, mudou para a pré-mistura 2 a 50% aos 12,5 minutos, mudou para a pré-mistura 2 a 100% aos 13 minutos. O tempo de operação total foi de 45 minutos. A temperatura da coluna foi mantida a 40°C. O volume de injeção foi de 5 µl. As espécies de rebaudiosídeo foram detectadas por UV a 210 nm.
[00532] A Tabela 3 mostra a conversão de Reb C em uma espécie de rebaudiosídeo identificada (porcentagem de área) para cada ponto no tempo. Os cromatogramas de rebaudiosídeo C e a mistura de reação em 96 horas são mostrados na Figura 4 e na Figura 5 respectivamente. Os versados na técnica entenderão que os tempos de retenção podem variar ocasionalmente com alterações no solvente e/ou equipamento. Tabela 3 Biotransformação de reb C em reb N2 e reb O4 % de conversão a partir de reb C Tempo, h Reb O4 Reb N2 Reb K Reb C 0 0 0 0 100
125 / 135 % de conversão a partir de reb C Tempo, h Reb O4 Reb N2 Reb K Reb C 24 4,4 34,2 31,7 29,6 96 12,5 72,4 15,1 0 Exemplo 6 Purificação de rebaudiosídeo N2 e O4
[00533] Quarenta (40) ml da mistura de reação do EXEMPLO 5 (após 96 horas) foram inativados mediante o ajuste do pH para pH 5,5 com H3PO4 e, então, fervidos durante 10 minutos e filtrados. O filtrado foi carregado em uma coluna contendo 30 ml de resina YWD03 (Cangzhou Yuanwei, China) pré-equilibrada com água. A resina foi lavada com 150 ml de água morna (35 °C) e a água efluente a partir desta etapa foi descartada.
[00534] Os glicosídeos de esteviol foram eluídos a partir da coluna de resina YWD03 por eluição com 200 ml de 70% v/v etanol/água. O efluente desta etapa foi coletado e submetido à evaporação em um evaporador giratório até que o volume da amostra fosse de aproximadamente 25 ml. Essa amostra concentrada foi submetida à purificação adicional por HPLC preparativa, usando as condições listadas na Tabela 4 abaixo.
[00535] As frações de HPLC preparativa que correspondiam aos compostos individuais de múltiplos ciclos foram combinadas de acordo com tempo de retenção. As amostras foram submetidas a secagem por congelamento para fornecer 60 mg de rebaudiosídeo N2 e 10 mg de rebaudiosídeo O4. Tabela 4 Condições para HPLC preparativa Coluna Poroshell 120 SB-C18 da Agilent, 4,6 mm x 150 mm, 2,7 µm Temperatura 40 °C B – Água Fase móvel C – Acetonitrila Gradiente Tempo (min.) C B 0 25 75 10,0 25 75 13,0 50 50 17,0 50 50 Vazão 1 ml/min Injeção 10 µl Tempo de parada 22 minutos
126 / 135 Tempo pós 10 minutos Temperatura do Ambiente autoamostrador Detecção UV a 210 nm
[00536] Os cromatogramas de reb N2 e reb O4 purificados são mostrados nas Figuras 6a e 6b, respectivamente. Os versados na técnica entenderão que os tempos de retenção podem variar ocasionalmente com alterações no solvente e/ou equipamento. Exemplo 7 Elucidação da estrutura do rebaudiosídeo N2
[00537] Experimentos de RMN foram realizados em um espectrômetro Bruker de 500 MHz, com a amostra dissolvida em piridina-d5. Juntamente com os sinais da amostra, os sinais da piridina-d5 a δC 123,5, 135,5, 149,9 ppm e δH 7,19, 7,55, 8,71 ppm foram observados.
[00538] O espectro de 1H-RMN do rebaudiosídeo N2 registrado na piridina-d5 confirmou a excelente qualidade da amostra (consulte a Figura 7a). O HSQC (consulte a Figura 8a) mostra a presença de um grupo exo- metileno na região do açúcar com um acoplamento de longo alcance em C-15, observável em H,H-COSY (Figura 9a). Outros sinais de campo profundo dos carbonos quaternários (C-13, C-16 e C-19) são detectados pelo HMBC (Figura 10a). A correlação dos sinais em HSQC, HMBC e H,H-COSY revelam a presença de glicosídeo de esteviol com a seguinte estrutura de aglicona (consulte a Figura 1e):
[00539] O espectro HSQC do rebaudiosídeo N2 também mostra a presença de um dubleto de metila (J = 6,3 Hz) com uma correlação H,H- COSY com um sinal na região de açúcar. O HSQC também mostra a presença
127 / 135 de seis sinais anoméricos, sendo que cinco desses sinais anoméricos têm constantes de acoplamento de cerca de 8 Hz, e os sinais amplos de sua ligação de açúcar possibilitam a identificação desses seis açúcares como β-D- glicosídeos. O sexto sinal anomérico é um singleto amplo, e a correlação de H,H-COSY com o dubleto de metila possibilita a identificação desse açúcar como α-L-ramnose.
[00540] A observação dos prótons anoméricos em combinação com HSQC e HMBC revela a ligação de açúcar e a correlação com a aglicona. A atribuição da sequência de açúcar foi confirmada com o uso da combinação de HSQC-TOCSY (Figura 11a) e HSQC.
[00541] No total, os resultados dos experimentos de RMN acima foram usados para atribuir os deslocamentos químicos dos prótons e carbonos da estrutura do rebaudiosídeo N2 (consulte a Tabela 5). Tabela 5 Deslocamentos químicos do rebaudiosídeo N2 Posição δC [ppm] δH [ppm] J [Hz]/ (INT) HMBC (H -> C) Porção aglicona 0,67m 1 39,9t 1,62m 1,41m 2 19,1t 2,06m 1,07m 3 37,0t 2,84m 4 44,1s - 5 56,9d 0,96m 1,92m 6 21,4t 2,17m 1,25m 7 41,2t 1,44m 8 42,8s - 9 53,8d 0,84m 10 39,0s - 1,60m 11 20,2t 1,63m 1,98m 12 37,9t 2,13m 13 86,2s - 1,95d 11,0 14 42,8t 2,39d 11,0 1,99d 15,8 15 47,6t 7, 8, 9, 14 2,10d 15,8 16 154,0s - 5,04br s 17 104,4t 13, 15, 16 5,63br s
128 / 135 Posição δC [ppm] δH [ppm] J [Hz]/ (INT) HMBC (H -> C) Porção aglicona 18 28,7q 1,41s (3H) 3, 4, 5, 19 19 175,4s - 20 16,2q 1,01s (3H) 1, 5, 9, 10
Tabela 5 (continuação) Deslocamentos químicos do rebaudiosídeo N2 Posição δC [ppm] δH [ppm] J [Hz]/ (Int) HMBC (H -> C) Porção de açúcar Açúcar I: β-D-glicopiranosídeo 1i 97,7d 4,99d 7,7 13 2i 75,3d 4,27m 3i 89,1d 4,23m 4i 69,1d 4,03m 5i 77,0d 3,63m 4,10m 6i 61,6t 4,27m Açúcar II: α-L-ramnopiranosídeo 1ii 101,1d 6,50br s 2i 2ii 71,8d 4,84m 3ii 72,0d 4,56m 4ii 73,3d 4,26m 5ii 69,0d 4,87m 6ii 18,4q 1,71d 6,3 Açúcar III: β-D-glicopiranosídeo 1iii 104,0d 5,13d 8,1 3i 2iii 74,8d 4,00m 3iii 78,0d 4,14m 4iii 71,3d 4,05m 5iii 78,0d 3,98m 4,20m 6iii 62,0t 4,54m Açúcar IV: β-D-glicopiranosídeo 1iv 92,6d 6,21d 7,7 19 2iv 77,0d 4,47m 3iv 87,7d 4,22m 4iv 68,6d 4,13m 5iv 78,3d 3,80m 4,03m 6iv 61,7t 4,23m Açúcar V: β-D-glicopiranosídeo 1v 103,4d 5,72d 8,1 2iv 2v 75,4d 3,98m 3v 78,0d 4,07m 4v 71,0d 4,10m 5v 78,3d 4,00m 4,19m 6v 61,5t 4,53m
Tabela 5 (continuação) Deslocamentos químicos do rebaudiosídeo N2 Posição δC [ppm] δH [ppm] J [Hz]/ (Int) HMBC (H -> C) Porção de açúcar Açúcar VI: β-D-glicopiranosídeo 1vi 104,3d 5,30d 7,7 3iv 2vi 75,2d 4,00m
129 / 135 Posição δC [ppm] δH [ppm] J [Hz]/ (Int) HMBC (H -> C) Porção de açúcar Açúcar VI: β-D-glicopiranosídeo 3vi 78,1d 4,17m 4vi 71,3d 4,09m 5vi 77,7d 3,97m 4,20m 6vi 61,7t 4,28m
[00542] A correlação de todos os resultados da RMN indica rebaudiosídeo N2 com cinco β-D-glicoses e uma α-L-ramnose ligadas ao esteviol aglicona, conforme representado na seguinte estrutura química (consulte as Figuras 1a e 1b):
[00543] A análise LCMS (Figura 12a e Figura 12b) do rebaudiosídeo N2 mostrou um íon [M-H]- em m/z 1.273,0 em boa concordância com a fórmula molecular esperada de C56H90O32 (calculada para o íon [C56H89O32]-: 1273,5 erro < 0,05%). Os dados de MS confirmam que o rebaudiosídeo N2 tem uma fórmula molecular de C56H90O32. A análise LCMS foi realizada nas seguintes condições listadas na Tabela 6. Tabela 6 Condições para a análise LCMS Coluna Poroshell 120 SB-C18 da Agilent, 4,6 mm x 150 mm, 2,7 µm Temperatura 40°C
130 / 135 Fase móvel A: Solução de pré-mistura da fase móvel - 25% de acetonitrila: 75% de ácido fórmico (0,1% em água) A B: Solução de pré-mistura da fase móvel - 32% de acetonitrila: 68% de ácido fórmico (0,1% em água) Gradiente Tempo (min.) A (%) B (%) 0 100 0 12,0 100 0 12,5 50 50 13,0 0 100 60,0 0 100 Vazão 0,5 ml/min. Injeção 2 µL Tempo de execução 45 min. Tempo pós 5 min. Temperatura autoamostrador Ambiente Detecção MSD no modo de varredura negativa Configuração de MSD Modo: ES-API, polaridade negativa Fluxo de gás de secagem: 13,0 l/min. Pressão do nebulizador: 30 psig Temperatura do gás de secagem: 270°C Fragmentador: 50 V Faixas de varredura: 500 a 1.500 de massa Preparação da amostra 1 mg/ml (30% de ACN em água) Exemplo 8 Elucidação de estrutura do rebaudiosídeo O4
[00544] Experimentos de RMN foram realizados em um espectrômetro Bruker de 500 MHz, com a amostra dissolvida em piridina-d5. Juntamente com sinais da amostra, sinais da piridina-d5 a δC 123,5, 135,5, 149,9 ppm e δH 7,19, 7,55, 8,71 ppm foram observados.
[00545] O espectro de 1H-RMN do rebaudiosídeo O4 registrado na piridina-d5 confirmou a excelente qualidade da amostra (consulte a Figura 7b). O HSQC (consulte a Figura 8b) mostra a presença de um grupo exo- metileno na região do açúcar com um acoplamento de longo alcance em C-15, observável em H,H-COSY (Figura 9b). Outros sinais de campo profundo dos carbonos quaternários (C-13, C-16 e C-19) são detectados pelo HMBC (Figura 10b). A correlação dos sinais em HSQC, HMBC e H,H-COSY revelam a presença de glicosídeo de esteviol com a seguinte estrutura de aglicona (consulte a Figura 1e):
131 / 135
[00546] O espectro HSQC do rebaudiosídeo O4 também mostra a presença de um dubleto de metila (J = 6,3 Hz) com uma correlação H,H- COSY com um sinal na região de açúcar. O HSQC também mostra a presença de sete sinais anoméricos, sendo que seis desses sinais anoméricos têm constantes de acoplamento de cerca de 8 Hz, e os sinais amplos de sua ligação de açúcar possibilitam a identificação desses seis açúcares como β-D- glicosídeos. O sétimo sinal anomérico é um singleto amplo, e a correlação de H,H-COSY com o dubleto de metila possibilita a identificação desse açúcar como α-L-ramnose.
[00547] A observação dos prótons anoméricos em combinação com HSQC e HMBC revela a ligação de açúcar e a correlação com a aglicona. A atribuição da sequência de açúcar foi confirmada com o uso da combinação de HSQC-TOCSY (Figura 11b) e HSQC.
[00548] Os resultados dos experimentos de RMN acima foram usados para atribuir os deslocamentos químicos dos prótons e carbonos da estrutura do rebaudiosídeo O4 (consulte a Tabela 7). Tabela 7 Deslocamentos químicos do rebaudiosídeo O4 Posição δC [ppm] δH [ppm] J [Hz]/ (INT) HMBC (H -> C) Porção aglicona 0,67m 1 40,0t 1,63m 1,40m 2 19,0t 2,06m 1,07m 3 37,0t 2,87m 4 44,4s - 5 56,9d 0,96m 1,97m 6 21,3t 2,19m
132 / 135 Posição δC [ppm] δH [ppm] J [Hz]/ (INT) HMBC (H -> C) Porção aglicona 1,28m 7 41,3t 1,46m 8 42,1s - 9 53,5d 0,84m 10 39,0s - 1,60m 11 20,0t 1,62m 2,01m 12 38,1t 2,13m 13 86,1s - 1,99d 11,2 14 42,6t 2,36d 11,2 2,01d 15,8 15 47,6t 7, 8, 9, 14 2,14d 15,8 16 153,9s - 5,05br s 17 104,5t 13, 15, 16 5,62br s 18 28,5q 1,42s (3H) 3, 4, 5, 19 19 175,3s - 20 16,1q 1,01s (3H) 1, 5, 9, 10
Tabela 7 (continuação) Deslocamentos químicos do rebaudiosídeo O4 Posição δC [ppm] δH [ppm] J [Hz]/ (Int) HMBC (H -> C) Porção de açúcar Açúcar I: β-D-glicopiranosídeo 1i 97,7d 4,92d 7,7 13 2i 75,5d 4,22m 3i 91,0d 4,02m 4i 70,1d 4,01m 5i 76,7d 3,55m 3,84m 6i 70,2t 4,98m Açúcar II: α-L-ramnopiranosídeo 1ii 101,0d 6,50br s 2i 2ii 72,1d 4,81m 3ii 72,1d 4,55m 4ii 73,2d 4,27m 5ii 69,1d 4,87m 6ii 18,5q 1,68d 6,3 Açúcar III: β-D-glicopiranosídeo 1iii 104,6d 5,02d 8,1 3i 2iii 74,6d 3,96m 3iii 77,9d 4,13m 4iii 71,6d 3,91m 5iii 78,0d 3,96m 4,30m 6iii 61,8t 4,50m Açúcar IV: β-D-glicopiranosídeo 1iv 104,1d 4,76d 7,7 6i 2iv 75,3d 3,96m 3iv 78,1d 4,21m 4iv 70,9d 4,27m 5iv 77,8d 3,88m 4,28m 6iv 61,8t 4,36m
133 / 135 Açúcar V: β-D-glicopiranosídeo 1v 92,5d 6,20d 8,1 19 2v 77,1d 4,47m 3v 88,0d 4,22m 4v 68,7d 4,14m 5v 78,2d 3,79m 4,20m 6v 61,4t 4,33m Tabela 7 (continuação) Deslocamentos químicos do rebaudiosídeo O4 Posição δC [ppm] δH [ppm] J [Hz]/ (Int) HMBC (H -> C) Porção de açúcar Açúcar VI: β-D-glicopiranosídeo 1vi 103,5 d 5,75 d 7,7 2v 2vi 75,5 d 3,96 m 3vi 78,1 d 4,28 m 4vi 72,3 d 4,08 m 5vi 78,1 d 3,95 m 4,35 m 6vi 62,8 t 4,56 m Açúcar VII: β-D-glicopiranosídeo 1 vii 104,2 d 5,31 d 7,8 3v 2vii 75,0 d 4,06 m 3vii 77,7 d 4,22 m 4vii 71,3 d 4,11 m 5vii 78,0 d 4,01 m 4,52 m 6vii 62,0 t 4,56 m
[00549] A correlação de todos os resultados da RMN indica rebaudiosídeo O4 com seis β-D-glicoses e uma α-L-ramnose ligadas ao esteviol aglicona, conforme representado na seguinte estrutura química (consulte as Figuras 1c e 1d):
134 / 135
[00550] A análise LCMS (Figura 13a e Figura 13b) do rebaudiosídeo O4 mostrou um íon [M-H]- em m/z 1.435,0 em boa concordância com a fórmula molecular esperada de C62H100O37 (calculada para o íon [C62H99O37]-:
1.435,6, erro < 0,05%). Os dados de MS confirmam que o rebaudiosídeo O4 tem uma fórmula molecular de C62H100O37. A análise LCMS foi realizada usando as condições listadas na Tabela 6.
[00551] Embora a presente invenção e suas vantagens tenham sido descritas em detalhes, deve ser entendido que várias mudanças, substituições e alterações podem ser feitas à presente invenção sem que se desvie do espírito e escopo da invenção, conforme definido pelas reivindicações em anexo. Além disso, o escopo do presente pedido não tem a intenção de ser limitado às modalidades específicas do processo, da máquina, fabricação, composição da matéria, meios, métodos e etapas descritos no relatório descritivo. Conforme um versado na técnica compreenderá prontamente a partir da revelação da presente invenção, os processos, as máquinas, a fabricação, as composições de matéria, os meios, métodos ou etapas, atualmente existentes ou a serem desenvolvidos posteriormente que realizem
135 / 135 substancialmente a mesma função ou que obtenham substancialmente os mesmos resultados que as modalidades correspondentes aqui descritas, podem ser usados de acordo com a presente invenção.
Consequentemente, as reivindicações em anexo se destinam a incluir em seu escopo tais processos, máquinas, fabricação, composições de matéria, meios, métodos ou etapas.

Claims (27)

1 / 10 REIVINDICAÇÕES
1. Rebaudiosídeo N2 caracterizado por ter a seguinte fórmula:
2. Rebaudiosídeo O4 caracterizado por ter a seguinte fórmula:
3. Método para produzir um rebaudiosídeo N2 altamente purificado, como definido na reivindicação 1, caracterizado por compreender as etapas de: a. fornecer uma composição inicial que compreende um composto orgânico com pelo menos um átomo de carbono; b. fornecer uma preparação enzimática ou micro-organismo contendo ao menos uma enzima selecionada dentre as enzimas da biossíntese
2 / 10 do esteviol, UDP-glicosiltransferases e opcionalmente enzimas de reciclagem da UDP-glicose e UDP-ramnose; c. colocar a preparação enzimática ou micro-organismo em contato com um meio contendo a composição inicial para produzir um meio que compreende rebaudiosídeo N2.
4. Método para produzir rebaudiosídeo O4 altamente purificado como definido na reivindicação 2, caracterizado por compreender as etapas de: a. fornecer uma composição inicial que compreende um composto orgânico com pelo menos um átomo de carbono; b. fornecer uma preparação enzimática ou micro-organismo contendo ao menos uma enzima selecionada dentre as enzimas da biossíntese do esteviol, UDP-glicosiltransferases e opcionalmente enzimas de reciclagem da UDP-glicose e UDP-ramnose; c. colocar a preparação enzimática ou micro-organismo em contato com um meio contendo a composição inicial para produzir um meio que compreende rebaudiosídeo O4.
5. Método para produzir um rebaudiosídeo N2 altamente purificado, como definido na reivindicação 1, caracterizado por compreender as etapas de: a. fornecer uma composição inicial que compreende um composto orgânico com pelo menos um átomo de carbono; b. fornecer um biocatalisador que compreende ao menos uma enzima selecionada dentre as enzimas da biossíntese do esteviol, UDP- glicosiltransferases e opcionalmente enzimas de reciclagem da UDP-glicose e UDP-ramnose; c. colocar o biocatalisador em contato com um meio contendo a composição inicial para produzir um meio que compreende rebaudiosídeo N2.
3 / 10
6. Método para produzir rebaudiosídeo O4 altamente purificado como definido na reivindicação 2, caracterizado por compreender as etapas de: a. fornecer uma composição inicial que compreende um composto orgânico com pelo menos um átomo de carbono; b. fornecer um biocatalisador que compreende ao menos uma enzima selecionada dentre as enzimas da biossíntese do esteviol, UDP- glicosiltransferases e opcionalmente enzimas de reciclagem da UDP-glicose e UDP-ramnose; c. colocar o biocatalisador em contato com um meio contendo a composição inicial para produzir um meio que compreende rebaudiosídeo O4.
7. Método de acordo com a reivindicação 3 ou 5, caracterizado por compreender adicionalmente a etapa de: d. separar o rebaudiosídeo N2 do meio para fornecer uma composição de rebaudiosídeo N2 altamente purificada.
8. Método de acordo com a reivindicação 4 ou 6, caracterizado por compreender adicionalmente a etapa de: d. separar o rebaudiosídeo O4 do meio para fornecer uma composição de rebaudiosídeo O4 altamente purificada.
9. Método de acordo com a reivindicação 3, 4, 5 ou 6, caracterizado por a composição inicial ser selecionada do grupo que consiste em esteviol, esteviolmonosídeo, esteviolmonosídeo A, esteviolbiosídeo A, esteviolbiosídeo B, esteviolbiosídeo C, esteviolbiosídeo D, esteviolbiosídeo E, rubusosídeo, dulcosídeo A, dulcosídeo C, dulcosídeo D, esteviosídeo A, esteviosídeo B, esteviosídeo C, esteviosídeo G, esteviosídeo H, rebaudiosídeo B2, rebaudiosídeo A4, rebaudiosídeo C, rebaudiosídeo C3, rebaudiosídeo C4, rebaudiosídeo C5, rebaudiosídeo C6, rebaudiosídeo E3, rebaudiosídeo E4, rebaudiosídeo E5, rebaudiosídeo E6, rebaudiosídeo E7, rebaudiosídeo D5,
4 / 10 rebaudiosídeo D6, rebaudiosídeo D7, rebaudiosídeo D8, rebaudiosídeo H2, rebaudiosídeo H3, rebaudiosídeo H4, rebaudiosídeo H5, rebaudiosídeo H6, rebaudiosídeo K, rebaudiosídeo N2, rebaudiosídeo N3, rebaudiosídeo N4, rebaudiosídeo N5, rebaudiosídeo M3, outros glicosídeos de esteviol, polióis, carboidratos e combinações dos mesmos.
10. Método de acordo com a reivindicação 3 ou 4, caracterizado por o microorganismo ser selecionado do grupo que consiste em E.coli, Saccharomyces sp., Aspergillus sp., Pichia sp., Bacillus sp. e Yarrowia sp.
11. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por o biocatalisador ser uma enzima, ou uma célula que compreende uma ou mais enzimas, capaz de converter a composição inicial em rebaudiosídeo N2.
12. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por o biocatalisador ser uma enzima, ou uma célula que compreende uma ou mais enzimas, capaz de converter a composição inicial em rebaudiosídeo O4.
13. Método de acordo com a reivindicação 3 ou 4, caracterizado por a enzima ser selecionada do grupo que consiste em uma enzima da via do mevalonato (MVA), uma enzima da via do 2-C-metil-D- eritritol-4-fosfato (MEP/DOXP), geranilgeranil difosfato sintase, copalil difosfato sintase, caureno sintase, caureno oxidase, ácido caurenoico 13- hidroxilase (KAH), esteviol sintetase, desoxixilulose 5-fosfato sintase (DXS), D-1-desoxixilulose 5-fosfato reductoisomerase (DXR), 4-difosfocitidil-2-C- metil-D-eritritol sintase (CMS), 4-difosfocitidil-2-C-metil-D-eritritol quinase (CMK), 4-difosfocitidil-2-C-metil-D-eritritol 2,4-ciclodifosfato sintase (MCS), l-hidróxi-2-metil-2(E)-butenil 4-difosfato sintase (HDS), l-hidróxi-2- metil-2(E)-butenil 4-difosfato redutase (HDR), acetoacetil-CoA tiolase, HMG-CoA redutase truncada, mevalonato quinase, fosfomevalonato quinase, mevalonato pirofosfato descarboxilase, citocromo P450 redutase, UGT74G1, UGT85C2, UGT91D2, EUGT11, UGTSl2, UGT76G1, UGlyT91C1 ou uma
5 / 10 variante mutante destes tendo > 85% de identidade de sequência de aminoácidos, > 86% de identidade de sequência de aminoácidos, > 87% de identidade de sequência de aminoácidos, > 88% de identidade de sequência de aminoácidos, > 89% de identidade de sequência de aminoácidos, > 90% de identidade de sequência de aminoácidos, > 91% de identidade de sequência de aminoácidos, > 92% de identidade de sequência de aminoácidos, > 93% de identidade de sequência de aminoácidos, > 94% de identidade de sequência de aminoácidos, > 95% de identidade de sequência de aminoácidos, > 96% de identidade de sequência de aminoácidos, > 97% de identidade de sequência de aminoácidos, > 98% de identidade de sequência de aminoácidos, > 99% de identidade de sequência de aminoácidos.
14. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por o teor de rebaudiosídeo N2 em uma composição altamente purificada de rebaudiosídeo N2 ser maior que cerca de 95% em peso em uma base seca.
15. Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por o teor de rebaudiosídeo O4 em uma composição altamente purificada de rebaudiosídeo O4 ser maior que cerca de 95% em peso em uma base seca.
16. Produto consumível que compreende o rebaudiosídeo N2 como definido na reivindicação 1, sendo o produto caracterizado por ser selecionado do grupo que consiste em um alimento, uma bebida, uma composição farmacêutica, um produto de tabaco, uma composição nutracêutica, um composição para higiene bucal e uma composição cosmética.
17. Produto consumível que compreende o rebaudiosídeo O4 como definido na reivindicação 2, sendo o produto caracterizado por ser selecionado do grupo que consiste em um alimento, uma bebida, uma composição farmacêutica, um produto do tabaco, uma composição nutracêutica, um composição para higiene bucal e uma composição cosmética.
6 / 10
18. Produto consumível de acordo com a reivindicação 16 ou 17, sendo o produto caracterizado por ser selecionado do grupo que consiste em bebidas; sucos naturais; bebidas refrescantes; refrigerantes gaseificados; bebidas dietéticas; bebidas com teor calórico zero; bebidas e alimentos com teor calórico reduzido; bebidas à base de iogurte; sucos instantâneos; café instantâneo; tipos de bebidas instantâneas em pó; produtos enlatados; xaropes; pasta soja fermentada; molho de soja; vinagre; molhos; maionese; ketchups; caril; sopa instantânea; molho de soja em pó; vinagre em pó; tipos de biscoitos; biscoito de arroz; bolachas; pão; chocolates; caramelo; bala; goma de mascar; gelatina; pudim; conservas de frutas e produtos hortícolas; creme fresco; geleia; marmelada; pasta de flor; leite em pó; sorvete; gelado de fruta; legumes e frutas acondicionadas em frascos; feijão enlatado e cozido; carne e alimentos cozidos em molho adoçado; produtos alimentícios vegetais agrícolas; frutos do mar; presunto; linguiça; presunto de peixe; linguiça de peixe; pasta de peixe; produtos à base de peixe fritos por imersão; produtos à base de frutos do mar secos; produtos alimentícios congelados; conservas de alga marinha; conservas de carne; tabaco e produtos medicinais.
19. Produto consumível de acordo com a reivindicação 16 ou 17, caracterizado por compreender adicionalmente ao menos um aditivo selecionado do grupo que consiste em carboidratos, polióis, aminoácidos e seus sais correspondentes, poliaminoácidos e seus sais correspondentes, ácidos de açúcar e seus sais correspondentes, nucleotídeos, ácidos orgânicos, ácidos inorgânicos, sais orgânicos incluindo sais de ácidos orgânicos e sais de bases orgânicas, sais inorgânicos, compostos amargos, cafeína, flavorizantes e ingredientes flavorizantes, compostos adstringentes, proteínas ou hidrolisados de proteínas, tensoativos, emulsificantes, flavonoides, álcoois, polímeros e combinações dos mesmos.
20. Produto consumível de acordo com a reivindicação 16 ou 17, caracterizado por compreender adicionalmente pelo menos um ingrediente
7 / 10 funcional selecionado do grupo que consiste em saponinas, antioxidantes, fontes de fibras dietéticas, ácidos graxos, vitaminas, glicosamina, minerais, conservantes, agentes de hidratação, probióticos, prebióticos, agentes de controle de peso, agentes de tratamento de osteoporose, fitoestrogênios, álcoois saturados alifáticos primários de cadeia longa, fitoesteróis e combinações dos mesmos.
21. Produto consumível de acordo com a reivindicação 16 ou 17, caracterizado por compreender adicionalmente um composto selecionado do grupo que consiste em esteviolmonosídeo, esteviolmonosídeo A, esteviolbiosídeo A, esteviolbiosídeo B, esteviolbiosídeo C, esteviolbiosídeo D, esteviolbiosídeo E, rubusosídeo, dulcosídeo A, dulcosídeo C, dulcosídeo D, esteviosídeo A, esteviosídeo B, esteviosídeo C, esteviosídeo G, esteviosídeo H, rebaudiosídeo B2, rebaudiosídeo A4, rebaudiosídeo C, rebaudiosídeo C3, rebaudiosídeo C4, rebaudiosídeo C5, rebaudiosídeo C6, rebaudiosídeo E3, rebaudiosídeo E4, rebaudiosídeo E5, rebaudiosídeo E6, rebaudiosídeo E7, rebaudiosídeo D5, rebaudiosídeo D6, rebaudiosídeo D7, rebaudiosídeo D8, rebaudiosídeo H2, rebaudiosídeo H3, rebaudiosídeo H4, rebaudiosídeo H5, rebaudiosídeo H6, rebaudiosídeo K, rebaudiosídeo N2, rebaudiosídeo N3, rebaudiosídeo N4, rebaudiosídeo N5, rebaudiosídeo M3, rebaudiosídeo A, rebaudiosídeo A2, rebaudiosídeo A3, rebaudiosídeo AM, rebaudiosídeo B, rebaudiosídeo C2, rebaudiosídeo D, rebaudiosídeo D2, rebaudiosídeo D3, rebaudiosídeo D4, rebaudiosídeo E, rebaudiosídeo E2, rebaudiosídeo F, rebaudiosídeo F2, rebaudiosídeo F3, rebaudiosídeo G, rebaudiosídeo H, rebaudiosídeo I, rebaudiosídeo I2, rebaudiosídeo I3, rebaudiosídeo J, rebaudiosídeo K2, rebaudiosídeo L, rebaudiosídeo M, rebaudiosídeo M2, rebaudiosídeo N, rebaudiosídeo O, rebaudiosídeo O2, rebaudiosídeo O3, rebaudiosídeo Q, rebaudiosídeo Q2, rebaudiosídeo Q3, rebaudiosídeo R, rebaudiosídeo S, rebaudiosídeo T, rebaudiosídeo T1, rebaudiosídeo U, rebaudiosídeo U2, rebaudiosídeo V, rebaudiosídeo V2, rebaudiosídeo W,
8 / 10 rebaudiosídeo W2, rebaudiosídeo W3, rebaudiosídeo Y, rebaudiosídeo Z1, rebaudiosídeo Z2, esteviolbiosídeo, esteviosídeo, esteviosídeo D, esteviosídeo E, esteviosídeo E2, esteviosídeo F, NSF-02, Mogrosida V, Luo Han Guo, alulose, D-alose, D-tagatose, eritritol, sbrazeína, neoesperidina di-idrocalcona, ácido glicirrízico e seus sais, taumatina, perilartina, pernandulcina, mucurosiosídeos, baiunosídeo, flomisosídeo-I, dimetil-hexaidrofluoreno- ácido dicarboxílico, abrusosídeo, periandrina, carnosiflosídeos, ciclocariosídeo, pterocariosídeo, polipodosídeo A, brazilina, hernandulcina, filodulcina, glicifilina, florizina, trilobatina, di-idroflavonol, di- idroquercetina-3-acetato, neoastilibina, trans-cinamaldeído, monatina e seus sais, seligueaína A, hematoxilina, monelina, osladina, pterocariosídeo A, pterocariosídeo B, mabinlina, pentadina, miraculinaa, curculina, neoculina, ácido clorogênico, cinarina, siamenosídeo, sucralose, acessulfame de potássio, aspartame, alitame, sacarina, ciclamato, neotame, dulcina, suosan advantame, ácido gimnêmico, hodulcina, zizifina, lactisol, glutamato, ácido aspártico, glicina, alanina, treonina, prolina, serina, lisina, triptofano, maltitol, manitol, sorbitol, lactitol, xilitol, inositol, isomalte, propileno glicol, glicerol, treitol, galactitol, isomaltulose hidrogenada, isomalto-oligossacarídeos reduzidos, xilo-oligossacarídeos reduzidos, gencio-oligossacarídeos reduzidos, xarope de maltose reduzido, xarope de glicose reduzido, hidrolisados de amido hidrogenado, poliglicitóis, álcoois de açúcar, L-açúcares, L-sorbose, L- arabinose, trealose, galactose, ramnose, várias ciclodextrinas, oligossacarídeos cíclicos, vários tipos de maltodextrinas, dextrano, sacarose, glicose, ribulose, frutose, treose, xilose, lixose, altrose, manose, idose, lactose, maltose, açúcar invertido, isotrealose, neotrealose, isomaltulose, eritrose, desoxirribose, gulose, talose, eritrulose, xilulose, celobiose, amilopectina, glicosamina, manosamina, ácido glicurônico, ácido glucônico, gluconolactona, abequose, galactosamina, oligossacarídeos de beterraba, isomalto-oligossacarídeos (isomaltose, isomaltotriose, panose e similares),
9 / 10 xilo-oligossacarídeos (xilotriose, xilobiose e similares), oligossacarídeos termiados em xilo, gencio-oligossacarídeos (genciobiose, genciotriose, genciotetraose e similares), nigero-oligossacarídeos, palatinose- oligossacarídeos, fruto-oligossacarídeos (cestose, nistose e similares), maltotetraol, maltotriol, malto-oligossacarídeos (maltotriose, maltotetraose, maltopentaose, maltoexaose, maltoeptaose e similares), amido, inulina, inulo- oligossacarídeos, lactulose, melibiose, rafinose, açúcares líquidos isomerizados, como xaropes de milho com alto teor de frutose, açúcares de acoplamento, oligossacarídeos de soja, D-psicose, D-ribose, L-glicose, L- fucose, D-turanose, D-leucrose.
22. Método para melhorar a doçura de uma bebida ou um produto alimentício, caracterizado por compreender um adoçante que compreende: a. fornecer uma bebida ou um produto alimentício que compreende um adoçante; e b. adicionar um intensificador de doçura que compreende o rebaudiosídeo N2 como definido na reivindicação 1, sendo que o rebaudiosídeo N2 está presente em uma concentração em ou abaixo do limiar de reconhecimento de doçura.
23. Método para melhorar a doçura de uma bebida ou um produto alimentício, caracterizado por compreender um adoçante que compreende: a. fornecer uma bebida ou um produto alimentício que compreende um adoçante; e b. adicionar um intensificador de doçura que compreende o rebaudiosídeo O4 como definido na reivindicação 2, sendo que o rebaudiosídeo O4 está presente em uma concentração em ou abaixo do limiar de reconhecimento de doçura.
24. Método para modificar o sabor de uma bebida ou um
10 / 10 produto alimentício, caracterizado por compreender: a. fornecer um produto de bebida ou de alimento e b. adicionar uma composição que compreende rebaudiosídeo N2 como definido na reivindicação 1.
25. Método para modificar o sabor de uma bebida ou um produto alimentício, caracterizado por compreender: a. fornecer um produto de bebida ou de alimento e b. adicionar uma composição que compreende rebaudiosídeo O4 como definido na reivindicação 2.
26. Método para suprimir a formação de espuma de uma bebida ou um produto alimentício, caracterizado por compreender: a. fornecer uma bebida ou um produto alimentício e b. adicionar um supressor de espuma que compreende o rebaudiosídeo N2 como definido na reivindicação 1.
27. Método para suprimir a formação de espuma de uma bebida ou um produto alimentício, caracterizado por compreender: a. fornecer uma bebida ou um produto alimentício e b. adicionar um supressor de espuma que compreende o rebaudiosídeo O4 como definido na reivindicação 2.
BR112020024772-3A 2018-06-08 2019-06-07 rebaudiosídeo n2, rebaudiosídeo o4, produto consumível, e, métodos para produzir um rebaudiosídeo n2 altamente purificado, para produzir rebaudiosídeo o4 altamente purificado, para melhorar a doçura de uma bebida ou um produto alimentício, para modificar o sabor de uma bebida ou um produto alimentício e para suprimir a formação de espuma de uma bebida ou um produto alimentício BR112020024772A2 (pt)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201862682461P 2018-06-08 2018-06-08
US62/682,461 2018-06-08
PCT/US2019/036125 WO2019237044A1 (en) 2018-06-08 2019-06-07 High-purity steviol glycosides

Publications (1)

Publication Number Publication Date
BR112020024772A2 true BR112020024772A2 (pt) 2021-03-23

Family

ID=68769469

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BR112020024772-3A BR112020024772A2 (pt) 2018-06-08 2019-06-07 rebaudiosídeo n2, rebaudiosídeo o4, produto consumível, e, métodos para produzir um rebaudiosídeo n2 altamente purificado, para produzir rebaudiosídeo o4 altamente purificado, para melhorar a doçura de uma bebida ou um produto alimentício, para modificar o sabor de uma bebida ou um produto alimentício e para suprimir a formação de espuma de uma bebida ou um produto alimentício

Country Status (12)

Country Link
US (1) US20210246156A1 (pt)
EP (1) EP3801041A4 (pt)
JP (1) JP2021526521A (pt)
KR (1) KR20210027270A (pt)
CN (1) CN112367854A (pt)
AU (1) AU2019282411B2 (pt)
BR (1) BR112020024772A2 (pt)
CA (1) CA3101651A1 (pt)
CL (2) CL2020003158A1 (pt)
CO (1) CO2020016227A2 (pt)
MX (1) MX2020012557A (pt)
WO (1) WO2019237044A1 (pt)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023044365A1 (en) * 2021-09-17 2023-03-23 Doublerainbow Biosciences Inc. Use of cyclodextrin to enhance solubility of substrates and increase enzymatic glycosylation reaction efficiency
WO2023083163A1 (en) * 2021-11-12 2023-05-19 Epc Natural Products Co., Ltd. Sweetener and flavor composition comprising glycosylated high purity steviol glycosides
EP4115741B1 (en) * 2021-11-16 2024-09-25 Pompadour Ibérica S.A. A beverage composition with controlled effervescence for infusion in a cold liquid
WO2024010442A1 (en) * 2022-07-07 2024-01-11 Purecircle Sdn Bhd High-purity steviol glycosides
WO2024025407A1 (en) * 2022-07-29 2024-02-01 Purecircle Sdn Bhd Compositions with sugar-like characteristics
WO2024025408A1 (en) * 2022-07-29 2024-02-01 Purecircle Sdn Bhd Steviol glycoside compositions with improved properties

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9894922B2 (en) * 2011-05-18 2018-02-20 Purecircle Sdn Bhd Glucosyl rebaudioside C
JP6189828B2 (ja) * 2012-03-27 2017-08-30 サントリーホールディングス株式会社 ステビオール配糖体の製造方法
CN108329365B (zh) * 2013-03-15 2022-04-05 可口可乐公司 甜菊醇糖苷、其组合物以及其纯化
JP6109437B2 (ja) * 2014-09-30 2017-04-05 サントリー食品インターナショナル株式会社 炭酸飲料、炭酸飲料の調製に用いられるシロップ、炭酸飲料の製造方法、及び炭酸飲料の泡立ちを抑制する方法
SG11201705606PA (en) * 2015-01-30 2017-08-30 Evolva Sa Production of steviol glycosides in recombinant hosts
MX2017013210A (es) * 2015-04-14 2018-03-01 Conagen Inc Produccion de endulzantes no caloricos con catalizadores de celulas enteras modificadas.
US20180230505A1 (en) * 2015-08-13 2018-08-16 Dsm Ip Assets B.V. Steviol glycoside transport
EP4159050A1 (en) * 2015-11-30 2023-04-05 Cargill, Incorporated Steviol glycoside compositions for oral ingestion or use
CN109477128A (zh) * 2016-05-16 2019-03-15 埃沃尔瓦公司 在重组宿主中甜菊醇糖苷的生产
AU2016411413B2 (en) * 2016-06-17 2022-01-13 Cargill, Incorporated Steviol glycoside compositions for oral ingestion or use
SG10202012673SA (en) * 2016-06-17 2021-01-28 Cargill Inc Steviol glycoside compositions for oral ingestion or use
EP3528640A4 (en) * 2016-10-20 2020-09-16 The Coca-Cola Company DITERPENIC GLYCOSIDES ISOLATED FROM STEVIA, COMPOSITIONS AND PROCESSES
CA3041152A1 (en) * 2016-10-21 2018-04-26 Pepsico, Inc. Method for preparing rebaudioside n using enzymatic method
NZ754394A (en) * 2016-12-27 2023-04-28 Suntory Holdings Ltd Novel steviol glycoside, method for producing same, and sweetener composition containing same

Also Published As

Publication number Publication date
CO2020016227A2 (es) 2021-04-08
US20210246156A1 (en) 2021-08-12
EP3801041A1 (en) 2021-04-14
JP2021526521A (ja) 2021-10-07
CA3101651A1 (en) 2019-12-12
MX2020012557A (es) 2021-03-25
EP3801041A4 (en) 2022-05-25
WO2019237044A1 (en) 2019-12-12
CN112367854A (zh) 2021-02-12
AU2019282411A1 (en) 2021-01-14
CL2021003265A1 (es) 2022-09-30
AU2019282411B2 (en) 2024-09-19
CL2020003158A1 (es) 2021-06-11
KR20210027270A (ko) 2021-03-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US9752174B2 (en) High-purity steviol glycosides
BR112020019012A2 (pt) Glicosídeos de esteviol de alta pureza
BR112020024772A2 (pt) rebaudiosídeo n2, rebaudiosídeo o4, produto consumível, e, métodos para produzir um rebaudiosídeo n2 altamente purificado, para produzir rebaudiosídeo o4 altamente purificado, para melhorar a doçura de uma bebida ou um produto alimentício, para modificar o sabor de uma bebida ou um produto alimentício e para suprimir a formação de espuma de uma bebida ou um produto alimentício
JP7432533B2 (ja) 高純度ステビオール配糖体
US20220017557A1 (en) High-purity steviol glycosides
US20220380824A1 (en) High-purity steviol glycosides
JP2024109659A (ja) 高純度ステビオール配糖体
WO2019178471A1 (en) High-purity steviol glycosides
US20210002318A1 (en) High-purity steviol glycosides

Legal Events

Date Code Title Description
B06W Patent application suspended after preliminary examination (for patents with searches from other patent authorities) chapter 6.23 patent gazette]
B06A Patent application procedure suspended [chapter 6.1 patent gazette]