BR112020019012A2 - Glicosídeos de esteviol de alta pureza - Google Patents

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Abstract

métodos para a preparação de glicosídeos de esteviol altamente purificados, particularmente esteviolmonosídeo, esteviolmonosídeo a, esteviolbiosídeo, esteviolbiosídeo a, esteviolbiosídeo b, rubusosídeo, esteviosídeo, esteviosídeo a (rebaudiosídeo ka), esteviosídeo b, esteviosídeo c, rebaudiosídeo e, rebaudiosídeo e2, rebaudiosídeo e3, e rebaudiosídeo am são descritos. os métodos incluem a utilização de preparações de enzimas e microrganismos recombinantes para converter várias composições iniciais em glicosídeos de esteviol alvo. os rebaudiosídeos altamente purificados são úteis como adoçante não calórico, intensificador de sabor, intensificador de doçura e supressor de espuma em composições comestíveis e mastigáveis, tais como quaisquer dentre bebidas, confeitarias, produtos de panificação, biscoitos e gomas de mascar.

Description

“GLICOSÍDEOS DE ESTEVIOL DE ALTA PUREZA” CAMPO TÉCNICO
[001] A presente invenção se refere a um processo para preparar composições compreendendo glicosídeos de esteviol, incluindo composições de glicosídeos de esteviol altamente purificadas.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[002] Os adoçantes de alta intensidade possuem um nível de doçura muitas vezes maior do que o nível de doçura da sacarose. Eles são essencialmente não calóricos e são comumente usados em produtos dietéticos e com baixas calorias, incluindo alimentos e bebidas. Os adoçantes de alta intensidade não provocam uma resposta glicêmica, tornando-os adequados para uso em produtos direcionados a diabéticos e outros interessados em controlar a ingestão de carboidratos.
[003] Os glicosídeos de esteviol são uma classe de compostos encontrados nas folhas de Estévia, rebaudiana Bertoni, um arbusto perene da família Asteraceae (Compositae) nativo de certas regiões da América do Sul. São caracterizados estruturalmente por uma única base, o esteviol, diferindo pela presença de resíduos de carboidratos nas posições C 13 e C 19. Eles se acumulam nas folhas de Estévia, compondo aproximadamente 10% a 20% do peso seco total. Em uma base de peso seco, os quatro principais glicosídeos encontrados nas folhas de Estévia incluem tipicamente esteviosídeo (9,1%), rebaudiosídeo A (3,8%), rebaudiosídeo C (0,6-1,0%) e dulcosídeo A (0,3%). Outros glicosídeos de esteviol conhecidos incluem rebaudiosídeo B, C, D, E, F e M, esteviolbiosídeo e rubusosídeo. Embora sejam conhecidos métodos para preparar glicosídeos de esteviol de Stevia rebaudiana, muitos desses métodos são inadequados para uso comercial.
[004] Consequentemente, permanece a necessidade de métodos simples, eficientes e econômicos para a preparação de composições compreendendo glicosídeos de esteviol, incluindo composições de glicosídeo de esteviol altamente purificadas.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[005] A presente invenção fornece um processo para preparar uma composição compreendendo um glicosídeo de esteviol alvo por contato de uma composição de partida compreendendo um substrato orgânico com uma célula microbiana e/ou preparação de enzima, produzindo assim uma composição compreendendo um glicosídeo de esteviol alvo.
[006] A composição de partida pode ser qualquer composto orgânico compreendendo pelo menos um átomo de carbono. Em uma modalidade, a composição de partida é selecionada a partir do grupo que consiste em glicosídeos de esteviol, polióis ou álcoois de açúcar, vários carboidratos.
[007] O glicosídeo de esteviol alvo pode ser qualquer glicosídeo de esteviol. Em uma modalidade, o glicosídeo de esteviol alvo é esteviolmonosídeo, esteviolmonosídeo A, esteviolbiosídeo, esteviolbiosídeo A, esteviolbiosídeo B, rubusosídeo, esteviosídeo, esteviosídeo A (rebaudiosídeo KA), esteviosídeo B, esteviosídeo, rebaudiosídeo E, rebaudiosídeo E2, rebaudiosídeo E3, rebaudiosídeo AM ou um glicosídeo de esteviol sintético.
[008] Em uma modalidade, o glicosídeo de esteviol alvo é o rebaudiosídeo AM.
[009] Em algumas modalidades preferidas, são utilizadas preparações de enzimas que compreendem uma ou mais enzimas, ou uma célula microbiana que compreende uma ou mais enzimas, capazes de converter a composição de partida em glicosídeos de esteviol alvo. A enzima pode estar localizada na superfície e/ou dentro da célula. A preparação de enzima pode ser fornecida na forma de uma suspensão de células inteiras, um lisado bruto ou como enzima(s) purificada(s). A preparação enzimática pode estar na forma livre ou imobilizada em um suporte sólido feito de materiais inorgânicos ou orgânicos.
[010] Em algumas modalidades, uma célula microbiana compreende as enzimas e genes que as codificam para converter a composição de partida em glicosídeos de esteviol alvo. Consequentemente, a presente invenção também fornece um processo para preparar uma composição compreendendo um glicosídeo de esteviol alvo por contato de uma composição de partida que compreende um substrato orgânico com uma célula microbiana que compreende pelo menos uma enzima capaz de converter a composição de partida em glicosídeos de esteviol alvo, produzindo assim um meio compreendendo pelo menos um glicosídeo de esteviol alvo.
[011] As enzimas necessárias para converter a composição de partida em glicosídeos de esteviol alvo incluem as enzimas de biossíntese de esteviol, UDP- glucosiltransferases (UGTs) e/ou enzima de reciclagem de UDP. Em uma modalidade, as enzimas de biossíntese de esteviol incluem enzimas da via do mevalonato (MV A).
[012] Em outra modalidade, as enzimas de biossíntese de esteviol incluem enzimas da via 2-C-metil-D-eritritol-4-fosfato não mevalonato (MEP/DOXP). Em uma modalidade, as enzimas de biossíntese de esteviol são selecionadas a partir do grupo que inclui geranilgeranil difosfato sintetase, copalil difosfato sintetase, caureno sintetase, caureno oxidase, ácido 13-hidroxilase caurenoico (KAH), esteviol sintetase, desoxixilulose 5-fosfato sintase (DXR), D-1-desoxixilulose 5-fosfato reductoisomerase (DXR), 4-difosfocitidil-2-C-metil-D eritritol sintase (CMS), 4-difosfocitidil-2-C-metil-D- eritritol quinase (CMK), 4-difosfocitidil-2-C-metil-D-eritritol 2,4-ciclodifosfato sintase (MCS), 1-hidróxi-2-metil-2(E)-butenil 4-difosfato sintase (HDS), 1-hidróxi-2-metil-2(E)- butenil 4-difosfato redutase (HDR), acetoacetil-CoA tiolase, HMG-CoA redutase truncada, mevalonato quinase, fosfomevalonato quinase, mevalonato pirofosfato decarboxilase, citocromo P450 redutase, etc.
[013] A UDP-glucosiltransferase pode ser qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar pelo menos uma unidade de glicose ao esteviol e/ou um substrato de glicosídeo de esteviol para fornecer o glicosídeo de esteviol alvo.
[014] Conforme usado a seguir, o termo "SuSy_AT", a menos que especificado de outra forma, se refere à sacarose sintase com a sequência de aminoácidos "SEQ ID 1", conforme descrito no Exemplo 1.
[015] Conforme usado a seguir, o termo "UGTS12", a menos que especificado de outra forma, se refere a UDP-glucosiltransferase com sequência de aminoácidos "SEQ ID 2", conforme descrito no Exemplo 1.
[016] Conforme usado a seguir, o termo "UGT76G1", a menos que especificado de outra forma, se refere a UDP-glucosiltransferase com sequência de aminoácidos "SEQ ID 3", conforme descrito no Exemplo 1.
[017] Em uma modalidade, as enzimas de biossíntese de esteviol e UDP- glucosiltransferases são produzidas em uma célula microbiana. A célula microbiana pode ser, por exemplo, E. coli, Saccharomyces sp., Aspergillus sp., Pichia sp., Bacillus sp., Yarrowia sp. etc. Em outra modalidade, as UDP-glucosiltransferases são sintetizadas.
[018] Em uma modalidade, a UDP-glucosiltransferase é selecionada do grupo que inclui UGT74G1, UGT85C2, UGT76G1, UGT91D2, UGTS12, EUGT11 e UGTs tendo identidade de sequência de aminoácidos substanciais (> 85%,> 86%,> 87%,> 88%,> 89%,> 90%,> 91%,> 92%,> 93%,> 94%,> 95%,> 96%,> 97%,> 98%,> 99%) para estes polipeptídeos, bem como moléculas de ácido nucleico isoladas que codificam essas UGTs.
[019] Em uma modalidade, as enzimas de biossíntese de esteviol, UGTs e sistema de reciclagem de UDP-glicose estão presentes em um microrganismo (célula microbiana). O microrganismo pode ser, por exemplo, E. coli, Saccharomyces sp., Aspergillus sp., Pichia sp., Bacillus sp., Yarrowia sp.
[020] Em uma modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP- glucosiltransferase capaz de adicionar pelo menos uma unidade de glicose ao esteviol ou qualquer glicosídeo de esteviol de partida contendo um grupo funcional -OH em C13 para produzir um glicosídeo de esteviol alvo tendo uma ligação glicosídica beta - O-glicose glucopiranosídeo em C13. Em uma modalidade particular, a UDP- glucosiltransferase é UGT85C2, ou uma UGT tendo > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT85C2.
[021] Em outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP- glucosiltransferase capaz de adicionar pelo menos uma unidade de glicose ao esteviol ou qualquer glicosídeo de esteviol de partida contendo um grupo funcional -COOH em C19 para produzir um glicosídeo de esteviol alvo tendo um ligação glicosídica beta - COO-glicose glucopiranosídeo em C19. Em uma modalidade particular, a UDP- glucosiltransferase é UGT74G1, ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT74G1.
[022] Em outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP- glucosiltransferase capaz de adicionar pelo menos uma unidade de glicose à glicose existente em C19 de qualquer glicosídeo de esteviol de partida para produzir um glicosídeo de esteviol alvo com pelo menos uma glicose adicional contendo pelo menos uma ligação(ões) glicosídica(s) beta 1-2 glucopiranosídeo na(s) ligação(ões) glicosídica(s) recém-formada(s). Em uma modalidade particular, a UDP- glucosiltransferase é UGTS12, ou uma UGT tendo > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGTS12. Em uma outra modalidade particular, a UDP- glucosiltransferase é EUGT11, ou uma UGT tendo > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com EUGT11. Em ainda uma outra modalidade particular, a UDP- glucosiltransferase é UGT91D2, ou uma UGT tendo > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT91D2.
[023] Em outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP- glicosiltransferase capaz de adicionar pelo menos uma unidade de glicose à glicose existente em C19 de qualquer glicosídeo de esteviol de partida para produzir um glicosídeo de esteviol alvo com pelo menos uma glicose adicional contendo pelo menos uma ligação(ões) glicosídica(s) beta 1— >3 glucopiranosídeo na(s) ligação(ões) glicosídica(s) recém-formada(s). Em uma modalidade particular, a UDP- glucosiltransferase é UGT76G1, ou uma UGT tendo > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT76G1.
[024] Em outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP- glucosiltransferase capaz de adicionar pelo menos uma unidade de glicose à glicose existente em C13 de qualquer glicosídeo de esteviol de partida para produzir um glicosídeo de esteviol alvo com pelo menos uma glicose adicional contendo pelo menos uma beta ligação (ões) glicosídica(s) beta 1-2 glucopiranosídeo na(s) ligaçã (ões) glicosídica(s) recém-formada(s). Em uma modalidade particular, a UDP- glucosiltransferase é UGTS12, ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGTS12. Em uma outra modalidade particular, a UDP- glucosiltransferase é EUGT11, ou uma UGT tendo > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com EUGT11. Em ainda uma outra modalidade particular, a UDP- glucosiltransferase é UGT91D2, ou uma UGT tendo > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT91D2.
[025] Em uma modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP- glucosiltransferase capaz de adicionar pelo menos uma unidade de glicose ao esteviol para formar esteviolmonosídeo. Em uma modalidade particular, a UDP- glucosiltransferase é UGT85C2 ou uma UGT tendo > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT85C2 ou uma UGT tendo > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT85C2.
[026] Em outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP- glucosiltransferase capaz de adicionar pelo menos uma unidade de glicose ao esteviol para formar o esteviolmonosídeo A. Em uma modalidade particular, a UDP- glucosiltransferase é UGT74G1 ou uma UGT tendo > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT74G1.
[027] Em outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP- glucosiltransferase capaz de adicionar pelo menos uma unidade de glicose ao esteviolmonosídeo A para formar esteviolbiosídeo B. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT76G1 ou uma UGT tendo > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT76G1.
[028] Em outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP- glucosiltransferase capaz de adicionar pelo menos uma unidade de glicose ao esteviolmonosídeo A para formar o esteviolbiosídeo A. Em uma modalidade particular, a UDP-glucosiltransferase é UGTS12 ou uma UGT tendo > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGTS12. Em outra modalidade particular, a UDP- glucosiltransferase é EUGT11, ou uma UGT tendo > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com EUGT11. Em ainda uma outra modalidade particular, a UDP- glucosiltransferase é UGT91D2, ou uma UGT tendo > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT91D2.
[029] Em outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP- glucosiltransferase capaz de adicionar pelo menos uma unidade de glicose ao esteviolmonosídeo A para formar rubusosídeo. Em uma modalidade particular, a UDP- glucosiltransferase é UGT85C2, ou uma UGT tendo > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT85C2.
[030] Em outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP- glucosiltransferase capaz de adicionar pelo menos uma unidade de glicose ao esteviolmonosídeo para formar rubusosídeo. Em uma modalidade particular, a UDP- glucosiltransferase é UGT74G1, ou uma UGT tendo > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT74G1.
[031] Em outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP- glucosiltransferase capaz de adicionar pelo menos uma unidade de glicose ao esteviolmonosídeo para formar esteviolbiosídeo.
[032] Em outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP- glucosiltransferase capaz de adicionar pelo menos uma unidade de glicose ao esteviolbiosídeo B para formar esteviosídeo B. Em uma modalidade particular, a UDP- glucosiltransferase é UGT85C2 ou uma UGT tendo > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT85C2.
[033] Em outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP- glucosiltransferase capaz de adicionar pelo menos uma unidade de glicose ao esteviolbiosídeo B para formar o esteviosídeo C. Em uma modalidade particular, a UDP-glucosiltransferase é UGTS12 ou uma UGT tendo > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGTS12. Em uma outra modalidade particular, a UDP-glucosiltransferase é EUGT11, ou uma UGT tendo > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com EUGT11. Em ainda uma outra modalidade particular, a UDP-glucosiltransferase é UGT91D2, ou uma UGT tendo > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT91D2.
[034] Em outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP- glucosiltransferase capaz de adicionar pelo menos uma unidade de glicose ao esteviolbiosídeo A para formar esteviosídeo A. Em uma modalidade particular, a UDP- glucosiltransferase é UGT85C2 ou uma UGT tendo > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT85C2.
[035] Em outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP- glucosiltransferase capaz de adicionar pelo menos uma unidade de glicose ao esteviolbiosídeo A para formar o esteviosídeo C. Em uma modalidade particular, a UDP-glucosiltransferase é UGT76G1 ou uma UGT tendo > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT76G1.
[036] Em outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP- glucosiltransferase capaz de adicionar pelo menos uma unidade de glicose ao rubusosídeo para formar o esteviosídeo B. Em uma modalidade particular, a UDP- glucosiltransferase é UGT76G1 ou uma UGT tendo > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT76G1.
[037] Em outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP- glucosiltransferase capaz de adicionar pelo menos uma unidade de glicose ao rubusosídeo para formar o esteviosídeo A (rebaudiosídeo KA). Em uma modalidade particular, a UDP-glucosiltransferase é UGTS12, ou uma UGT tendo > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGTS12. Em uma outra modalidade particular, a UDP-glucosiltransferase é EUGT11, ou uma UGT tendo > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com EUGT11. Em ainda uma outra modalidade particular, a UDP-glucosiltransferase é UGT91D2, ou uma UGT tendo > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT91D2.
[038] Em outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP- glucosiltransferase capaz de adicionar pelo menos uma unidade de glicose ao rubusosídeo para formar esteviosídeo.
[039] Em outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP- glucosiltransferase capaz de adicionar pelo menos uma unidade de glicose ao esteviolbiosídeo para formar esteviosídeo. Em uma modalidade particular, a UDP- glucosiltransferase é UGT74G1, ou uma UGT tendo > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT74G1. Em outra modalidade, a UDP- glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar pelo menos uma unidade de glicose ao esteviosídeo B para formar rebaudiosídeo E3. Em uma modalidade particular, a UDP-glucosiltransferase é UGTS12, ou uma UGT tendo > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGTS12. Em uma outra modalidade particular, a UDP-glucosiltransferase é EUGT11, ou uma UGT tendo > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com EUGT11. Em ainda uma outra modalidade particular, a UDP-glucosiltransferase é UGT91D2, ou uma UGT tendo >
85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT91D2.
[040] Em outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP- glucosiltransferase capaz de adicionar pelo menos uma unidade de glicose ao esteviosídeo B para formar rebaudiosídeo E2.
[041] Em outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP- glucosiltransferase capaz de adicionar pelo menos uma unidade de glicose ao esteviosídeo A (rebaudiosídeo KA) para formar rebaudiosídeo E3. Em uma modalidade particular, a UDP-glucosiltransferase é UGT76G1 ou uma UGT tendo > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT76G1. Em outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar pelo menos uma unidade de glicose ao esteviosídeo A (rebaudiosídeo KA) para formar rebaudiosídeo E.
[042] Em outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP- glucosiltransferase capaz de adicionar pelo menos uma unidade de glicose ao esteviosídeo C para formar rebaudiosídeo E3. Em uma modalidade particular, a UDP- glucosiltransferase é UGT85C2, ou uma UGT tendo > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT85C2.
[043] Em outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP- glucosiltransferase capaz de adicionar pelo menos uma unidade de glicose ao esteviosídeo para formar rebaudiosídeo E2. Em uma modalidade particular, a UDP- glucosiltransferase é UGT76G1, ou uma UGT tendo > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT76G1.
[044] Em outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP- glucosiltransferase capaz de adicionar pelo menos uma unidade de glicose ao esteviosídeo para formar o rebaudiosídeo E. Em uma modalidade particular, a UDP- glucosiltransferase é UGTS12 ou uma UGT tendo > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGTS12. Em outra modalidade particular, a UDP-
glucosiltransferase é EUGT11, ou uma UGT tendo > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com EUGT11. Em ainda uma outra modalidade particular, a UDP- glucosiltransferase é UGT91D2, ou uma UGT tendo > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT91D2.
[045] Em outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP- glucosiltransferase capaz de adicionar pelo menos uma unidade de glicose ao rebaudiosídeo E3 para formar rebaudiosídeo AM.
[046] Em outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP- glucosiltransferase capaz de adicionar pelo menos uma unidade de glicose ao rebaudiosídeo E2 para formar rebaudiosídeo AM. Em uma modalidade particular, a UDP-glucosiltransferase é UGTS12, ou uma UGT tendo > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGTS12. Em outra modalidade particular, a UDP- glucosiltransferase é EUGT11, ou uma UGT tendo > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com EUGT11. Em ainda outra modalidade particular, a UDP- glucosiltransferase é UGT91D2, ou uma UGT tendo > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT91D2.
[047] Em outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP- glucosiltransferase capaz de adicionar pelo menos uma unidade de glicose ao rebaudiosídeo E para formar rebaudiosídeo AM. Em uma modalidade particular, a UDP-glucosiltransferase é UGT76G1, ou uma UGT tendo > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT76G1.
[048] Opcionalmente, o método da presente invenção compreende ainda o uso de mais de uma UGT em uma composição de partida, para produzir um glicosídeo(s) de esteviol alvo com mais de uma unidade de glicose do que a composição de partida. Em uma modalidade particular, as UDP- glucosiltransferases são UGT74G1, UGT85C2, UGT76G1, UGTS12, EUGT11 e/ou UGT91D2 ou qualquer UGT tendo > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT74G1,
UGT85C2, UGT76G1, UGTS12, EUGT11 e/ou UGT91D2 ou qualquer combinação dos mesmos, capaz de adicionar mais de uma unidade de glicose a uma composição de partida para produzir um(s) glicosídeo(s) de esteviol tendo mais de uma unidade de glicose do que a composição de partida.
[049] Em uma modalidade, as UDP-glucosiltransferases são quaisquer UDP- glucosiltransferases capazes de adicionar duas unidades globais de glicose ao esteviosídeo para formar rebaudiosídeo AM. Em uma modalidade particular, as UDP- glucosiltransferases são selecionadas de UGTS12, EUGT11, UGT91D2, UGT76G1 ou qualquer UGT tendo > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGTS12, EUGT1 1, UGT91D2, UGT76G1 ou qualquer combinação dos mesmos. Em outra modalidade particular, as UDP-glucosiltransferases são UGTS12 e UGT76G1. Opcionalmente, o método da presente invenção compreende ainda reciclar a UDP para fornecer UDP-glicose. Em uma modalidade, o método compreende a reciclagem de UDP, fornecendo um catalisador de reciclagem e um substrato de reciclagem, de modo que a biotransformação de esteviol e/ou o substrato de glicosídeo de esteviol para o glicosídeo de esteviol alvo seja realizada usando quantidades catalíticas de UDP-glucosiltransferase e UDP- glicose. Em uma modalidade, o catalisador de reciclagem é a sacarose sintase SuSy_At ou uma sacarose sintase tendo > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com SuSy_At.
[050] Em uma modalidade, o substrato de reciclagem é sacarose.
[051] Opcionalmente, o método da presente invenção compreende ainda o uso de transglicosidases que usam oligo- ou polissacarídeos como o doador de açúcar para modificar as moléculas de glicosídeo de esteviol alvo receptoras. Exemplos não limitativos incluem ciclodextrina glicosiltransferase (CGTase), frutofuranosidase, amilase, sacarase, glucosucrase, beta-h-frutosidase, beta-frutosidase, sacarase. frutosilinvertase, invertase alcalina, invertase ácida, frutofuranosidase. Em algumas modalidades, glicose e açúcar(es) além da glicose, incluindo, mas não se limitando a,
frutose, xilose, ramnose, arabinose, desoxiglicose, galactose são transferidos para os glicosídeos de esteviol alvo receptores. Em uma modalidade, o glicosídeo de esteviol receptor é rebaudiosídeo AM.
[052] Opcionalmente, o método da presente invenção compreende ainda a separação do glicosídeo de esteviol alvo do meio para fornecer uma composição de glicosídeo de esteviol alvo altamente purificada. O glicosídeo de esteviol alvo pode ser separado por pelo menos um método adequado, tal como, por exemplo, cristalização, separação por membranas, centrifugação, extração, separação cromatográfica ou uma combinação de tais métodos.
[053] Em uma modalidade, o glicosídeo de esteviol alvo pode ser produzido dentro do microrganismo. Em outra modalidade, o glicosídeo de esteviol alvo pode ser secretado no meio. Em uma outra modalidade, o glicosídeo de esteviol liberado pode ser continuamente removido do meio. Em ainda outra modalidade, o glicosídeo de esteviol alvo é separado após a conclusão da reação de conversão.
[054] Em uma modalidade, a separação produz uma composição compreendendo mais do que cerca de 80% em peso do glicosídeo de esteviol alvo em uma base anidra, isto é, uma composição de glicosídeo de esteviol altamente purificada. Em outra modalidade, a separação produz uma composição que compreende mais do que cerca de 90% em peso do glicosídeo de esteviol alvo. Em modalidades particulares, a composição compreende mais do que cerca de 95% em peso do glicosídeo de esteviol alvo. Em outras modalidades, a composição compreende mais do que cerca de 99% em peso do glicosídeo de esteviol alvo. O glicosídeo de esteviol alvo pode estar em qualquer forma polimórfica ou amorfa, incluindo hidratos, solvatos, anidridos ou combinações dos mesmos.
[055] Os glicosídeos de esteviol alvo purificados podem ser usados em produtos consumíveis como adoçante, modificador de sabor, sabor com propriedades modificadoras e/ou supressor de formação de espuma. Os produtos consumíveis adequados incluem, mas não estão limitados a, alimentos, bebidas, composições farmacêuticas, produtos de tabaco, composições nutracêuticas, composições de higiene oral e composições cosméticas.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[056] A FIG. 1 mostra a estrutura química do rebaudiosídeo AM.
[057] A FIG. 2 mostra as vias de produção de rebaudiosídeo AM e vários glicosídeos de esteviol a partir do esteviol.
[058] A FIG. 3 mostra a produção biocatalítica de rebaudiosídeo AM de esteviosídeo usando as enzimas UGTS12 e UGT76G1 e reciclagem concomitante de UDP para UDP-glicose via sacarose sintase SuSy_At.
[059] A FIG. 4 mostra a produção biocatalítica de rebausiosídeo AM a partir do rebaudiosídeo E usando a enzima UGT76G1 e a reciclagem concomitante de UDP para UDP-glicose via sacarose sintase SuSy_At.
[060] A FIG. 5 mostra o cromatograma de HPLC de esteviosídeo. O pico com tempo de retenção de 25,992 minutos corresponde ao esteviosídeo. A FIG. 6 mostra o cromatograma de HPLC do produto da produção biocatalítica de rebaudiosídeo AM de esteviosídeo. O pico com tempo de retenção de 10,636 minutos corresponde ao rebaudiosídeo AM.
[061] A FIG. 7 mostra o cromatograma de HPLC do rebaudiosídeo E. O pico com tempo de retenção de 10,835 minutos corresponde ao rebaudiosídeo E.
[062] A FIG. 8 mostra o cromatograma de HPLC do produto da produção biocatalítica de rebaudiosídeo AM do rebaudiosídeo E. Os picos com tempo de retenção de 10,936 e 11,442 minutos correspondem ao rebaudiosídeo E e rebaudiosídeo AM respectivamente.
[063] A FIG. 9 mostra o cromatograma de HPLC de rebaudiosídeo AM após purificação por cristalização de metanol. O pico com tempo de retenção de 10,336 minutos corresponde ao rebaudiosídeo AM.
[064] A FIG. 10 mostra o espectro de RMN de 1H de rebaudiosídeo A (500 MHz, piridina-d5).
[065] A FIG. 11 mostra o espectro de HSQC de rebaudiosídeo AM (500 MHz, piridina-d5).
[066] A FIG. 12 mostra o espectro de H, H COSY do rebaudiosídeo AM (500 MHz, piridina-d5).
[067] A FIG. 13 mostra o espectro HMBC de rebaudiosídeo AM (500 MHz, piridina-d5).
[068] A FIG. 14 mostra o espectro de HSQC-TOCSY de rebaudiosídeo AM (500 MHz, piridina-d5).
[069] A FIG. 15a e a FIG. 15b mostram o cromatograma LC e o espectro de massa do rebaudiosídeo AM respectivamente.
DESCRIÇÃO DETALHADA
[070] A presente invenção fornece um processo para preparar uma composição compreendendo um glicosídeo de esteviol alvo por contato de uma composição de partida compreendendo um substrato orgânico com uma célula microbiana e/ou preparação de enzima, produzindo assim uma composição compreendendo um glicosídeo de esteviol alvo. Um objetivo da invenção é fornecer um método biocatalítico eficiente para preparar glicosídeos de esteviol alvos, particularmente esteviolmonosídeo, esteviolmonosídeo A, esteviolbiosídeo, esteviolbiosídeo A, esteviolbiosídeo B, rubusosídeo, esteviosídeo, esteviosídeo A (rebaudiosídeo KA), esteviosídeo B, esteviosídeo C, rebaudiosídeo E, rebaudiosídeo E2, rebaudiosídeo E3, rebaudiosídeo AM ou um glicosídeo de esteviol sintético de várias composições de partida.
[071] Conforme usado na presente invenção, a abreviatura de "reb" se refere a "rebaudiosídeo". Ambos os termos têm o mesmo significado e podem ser usados indistintamente.
[072] Como usado na presente invenção, "biocatálise" ou "biocatalítico" se refere ao uso de biocatalisadores naturais ou geneticamente modificados, como enzimas ou células, incluindo microrganismos, compreendendo uma ou mais enzimas, capazes de transformações químicas em uma ou várias etapas em compostos orgânicos. Os processos de biocatálise incluem processos de fermentação, biossíntese, bioconversão e biotransformação. Ambos os métodos de enzima isolada e de biocatálise de célula inteira são conhecidos na técnica. As enzimas de proteínas biocatalisadoras podem ser proteínas de ocorrência natural ou recombinantes.
[073] Como usado na presente invenção, o termo "glicosídeo(s) de esteviol" se refere a um glicosídeo de esteviol, incluindo, mas não se limitando a, glicosídeos de esteviol de ocorrência natural, por exemplo, esteviolmonosídeo, esteviolmonosídeo A, esteviolbiosídeo, esteviolbiosídeo A, esteviolbiosídeo B, rubusosídeo, esteviosídeo, esteviosídeo A (rebaudiosídeo KA), esteviosídeo B, esteviosídeo C, rebaudiosídeo E, rebaudiosídeo E2, rebaudiosídeo E3, rebaudiosídeo AM, glicosídeos de esteviol sintéticos, por exemplo, glicosídeos de esteviol enzimaticamente glucosilados e combinações dos mesmos. Composição de Partida
[074] Como usado na presente invenção, "composição de partida" se refere a qualquer composição (geralmente uma solução aquosa) contendo um ou mais compostos orgânicos compreendendo pelo menos um átomo de carbono.
[075] Em uma modalidade, a composição de partida é selecionada a partir do grupo que consiste em esteviol, glicosídeos de esteviol, polióis e vários carboidratos.
[076] O glicosídeo de esteviol da composição de partida é selecionado a partir do grupo que consiste em esteviolmonosídeo, esteviolmonosídeo A, esteviolbiosídeo, esteviolbiosídeo A, esteviolbiosídeo B, rubusosídeo, esteviosídeo, esteviosídeo A (rebaudiosídeo KA), esteviosídeo B, esteviosídeo C, rebaudiosídeo E, rebaudiosídeo E2, rebaudiosídeo E3 ou outro glicosídeo de esteviol que ocorre na planta Stevia rebaudiana, glicosídeos de esteviol sintéticos, por exemplo, glicosídeos de esteviol enzimaticamente glucosilados e combinações dos mesmos.
[077] Em uma modalidade, a composição de partida é o esteviol.
[078] Em outra modalidade, o glicosídeo de esteviol da composição de partida é esteviolmonosídeo.
[079] Em ainda outra modalidade, o glicosídeo de esteviol da composição de partida é esteviolmonosídeo A.
[080] Em ainda outra modalidade, o glicosídeo de esteviol da composição de partida é rubusosídeo.
[081] Em ainda outra modalidade, o glicosídeo de esteviol da composição de partida é esteviolbiosídeo.
[082] Em ainda outra modalidade, o glicosídeo de esteviol da composição de partida é esteviolbiosídeo A.
[083] Em ainda outra modalidade, o glicosídeo de esteviol da composição de partida é esteviolbiosídeo B.
[084] Em ainda outra modalidade, o glicosídeo de esteviol da composição de partida é esteviosídeo.
[085] Em ainda outra modalidade, o glicosídeo de esteviol da composição de partida é esteviosídeo
[086] A também conhecido como rebaudiosídeo KA.
[087] Em ainda outra modalidade, o glicosídeo de esteviol da composição de partida é o esteviosídeo B.
[088] Em ainda outra modalidade, o glicosídeo de esteviol da composição de partida é esteviosídeo C.
[089] Em outra modalidade, a composição de glicosídeo de esteviol de partida é rebaudiosídeo E. Em outra modalidade, a composição de glicosídeo de esteviol de partida é rebaudiosídeo E2.
[090] Em outra modalidade, o glicosídeo de esteviol da composição de partida é rebaudiosídeo E3.
[091] O termo "poliol" se refere a uma molécula que contém mais de um grupo hidroxila. Um poliol pode ser um diol, triol ou um tetraol que contém 2, 3 e 4 grupos hidroxila, respectivamente. Um poliol também pode conter mais de quatro grupos hidroxila, como um pentaol, hexaol, heptaol ou semelhantes, que contêm 5, 6 ou 7 grupos hidroxila, respectivamente. Além disso, um poliol também pode ser um álcool de açúcar, álcool poli-hídrico ou poliálcool que é uma forma reduzida de carboidrato, em que o grupo carbonil (aldeído ou cetona, açúcar redutor) foi reduzido a um grupo hidroxil primário ou secundário. Exemplos de polióis incluem, mas não estão limitados a, eritritol, maltitol, manitol, sorbitol, lactitol, xilitol, inositol, isomalte, propileno glicol, glicerol, treitol, galactitol, isomaltulose hidrogenada, isomalto-oligossacarídeos reduzidos, xilo- oligossacarídeos reduzidos, gentio-oligossacarídeos, xarope de maltose reduzido, xarope de glicose reduzido, hidrolisados de amido hidrogenado, poliglicitóis e álcoois de açúcar ou quaisquer outros carboidratos capazes de serem reduzidos.
[092] O termo "carboidrato" se refere a compostos de aldeído ou cetona substituídos por múltiplos grupos hidroxila, da fórmula geral (CH20)n, em que n é de 3 a 30, bem como seus oligômeros e polímeros. Os carboidratos da presente invenção podem, além disso, ser substituídos ou desoxigenados em uma ou mais posições. Os carboidratos, como usados na presente invenção, abrangem carboidratos não modificados, derivados de carboidratos, carboidratos substituídos e carboidratos modificados. Como usado na presente invenção, as frases "derivados de carboidratos", "carboidratos substituídos" e "carboidratos modificados" são sinônimas. Carboidrato modificado significa qualquer carboidrato em que pelo menos um átomo foi adicionado, removido ou substituído, ou combinações dos mesmos. Assim, os derivados de carboidratos ou carboidratos substituídos incluem monossacarídeos substituídos e não substituídos, dissacarídeos, oligossacarídeos e polissacarídeos. Os derivados de carboidratos ou carboidratos substituídos opcionalmente podem ser desoxigenados em qualquer posição C correspondente e/ou substituídos por uma ou mais porções, tais como hidrogênio, halogênio, haloalquila, carboxila, acila, acilóxi, amino, amido, derivados de carboxila, alquilamino, dialquilamino, arilamino, alcóxi, arilóxi, nitro, ciano, sulfo, mercapto, imino, sulfonila, sulfenila, sulfinila, sulfamoíla, carboalcóxi, carboxamido, fosfonila, fosfinila, fosforila, fosfino, tioéster, tioéter, oximino, hidrazino, carbamila, fosfo, fosfonato, ou qualquer outro grupo funcional viável desde que o derivado de carboidrato ou funções de carboidrato substituído melhorem o sabor doce da composição adoçante.
[093] Exemplos de carboidratos que podem ser usados de acordo com esta invenção incluem, mas não estão limitados a, tagatose, trealose, galactose, ramnose, várias ciclodextrinas, oligossacarídeos cíclicos, vários tipos de maltodextrinas, dextrano, sacarose, glicose, ribulose, frutose, treose, arabinose, xilose, lixose, alose, altrose, manose, idose, lactose, maltose, açúcar invertido, isotrealose, neotrealose, isomaltulose, eritrose, desoxirribose, gulose, idose, talose, eritrulose, xilulose, psicopectose, turanose, celopiose glucosamina, manosamina, fucose, ácido glucurônico, ácido glucônico, glucono-lactona, abequose, galactosamina, oligossacarídeos de beterraba, isomalto-oligossacarídeos (isomaltose, isomaltotriose, panose e semelhantes), xilo-oligossacarídeos (xilotriose, xilobiose e semelhantes), oligossacarídeos terminados com xilo, oligossacarídeos terminados com gentio (gentiobiose, gentiotriose, gentiotetraose e semelhantes), sorbose, nigero- oligossacarídeos, palatinose oligossacarídeos, fruto-oligossacarídeos (cestose, nistose e semelhantes), maltotetraol, maltotriol, malto-oligossacarídeos (maltotriose, maltotetraose, maltopentaose, maltohexaose, maltoheptaose e semelhantes), amido, inulina, inulo-oligossacarídeos, lactose, melibiose, raffmose ribose, açúcares líquidos isomerizados, como xaropes de milho com alto teor de frutose, açúcares de acoplamento e oligossacarídeos de soja. Além disso, os carboidratos, conforme usados aqui, podem estar na configuração D ou L
[094] A composição de partida pode ser sintética ou purificada (parcial ou totalmente), comercialmente disponível ou preparada.
[095] Em uma modalidade, a composição de partida é o glicerol.
[096] Em outra modalidade, a composição de partida é glicose.
[097] Em ainda outra modalidade, a composição de partida é sacarose.
[098] Em ainda outra modalidade, a composição de partida é amido. Em outra modalidade, a composição de partida é maltodextrina.
[099] Em ainda outra modalidade, a composição de partida é celulose.
[0100] Em ainda outra modalidade, a composição de partida é amilose.
[0101] O(s) composto(s) orgânico(s) da composição de partida servem como substrato(s) para a produção do(s) glicosídeo(s) de esteviol alvo(s), como aqui descrito. Glicosídeo de Esteviol Alvo
[0102] O glicosídeo de esteviol alvo do presente método pode ser qualquer glicosídeo de esteviol que pode ser preparado pelo processo aqui divulgado. Em uma modalidade, o glicosídeo de esteviol alvo é selecionado do grupo que consiste em esteviolmonosídeo, esteviolmonosídeo A, esteviolbiosídeo, esteviolbiosídeo A, esteviolbiosídeo B, rubusosídeo, esteviosídeo, esteviosídeo A (rebaudiosídeo KA), esteviosídeo B, esteviosídeo C, rebaudiosídeo E, rebaudiosídeo E2, rebaudiosídeo E3, rebaudiosídeo AM ou outro glicosídeo de esteviol que ocorre na planta Stevia rebaudiana, glicosídeos de esteviol sintéticos, por exemplo, glicosídeos de esteviol enzimaticamente glucosilados e combinações dos mesmos
[0103] Em uma modalidade, o glicosídeo de esteviol alvo é o esteviolmonosídeo.
[0104] Em outra modalidade, o glicosídeo de esteviol alvo é o esteviolmonosídeo A.
[0105] Em outra modalidade, o glicosídeo de esteviol alvo é o esteviolbiosídeo.
[0106] Em outra modalidade, o glicosídeo de esteviol alvo é o esteviolbiosídeo A. Em outra modalidade, o glicosídeo de esteviol alvo é o esteviolbiosídeo B.
[0107] Em outra modalidade, o glicosídeo de esteviol alvo é rubusosídeo.
[0108] Em outra modalidade, o glicosídeo de esteviol alvo é o esteviosídeo.
[0109] Em outra modalidade, o glicosídeo de esteviol alvo é o esteviosídeo A (rebaudiosídeo KA). Em outra modalidade, o glicosídeo de esteviol alvo é o esteviosídeo B.
[0110] Em outra modalidade, o glicosídeo de esteviol alvo é o esteviosídeo C. Em outra modalidade, o glicosídeo de esteviol alvo é o rebaudiosídeo E.
[0111] Em outra modalidade, o glicosídeo de esteviol alvo é rebaudiosídeo E2.
[0112] Em outra modalidade, o glicosídeo de esteviol alvo é rebaudiosídeo E3.
[0113] Em outra modalidade, o glicosídeo de esteviol alvo é rebaudiosídeo AM. O glicosídeo de esteviol alvo pode estar em qualquer forma polimórfica ou amorfa, incluindo hidratos, solvatos, anidridos ou combinações dos mesmos.
[0114] Em uma modalidade, a presente invenção é um processo biocatalítico para a produção de esteviolmonosídeo.
[0115] Em uma modalidade, a presente invenção é um processo biocatalítico para a produção de esteviolmonosídeo A.
[0116] Em uma modalidade, a presente invenção é um processo biocatalítico para a produção de esteviolbiosídeo.
[0117] Em uma modalidade, a presente invenção é um processo biocatalítico para a produção de esteviolbiosídeo A. Em uma modalidade, a presente invenção é um processo biocatalítico para a produção de esteviolbiosídeo B.
[0118] Em uma modalidade, a presente invenção é um processo biocatalítico para a produção de rubusosídeo.
[0119] Em uma modalidade, a presente invenção é um processo biocatalítico para a produção de esteviosídeo.
[0120] Em uma modalidade, a presente invenção é um processo biocatalítico para a produção de esteviosídeo A (rebaudiosídeo KA).
[0121] Em uma modalidade, a presente invenção é um processo biocatalítico para a produção de esteviosídeo B. Em uma modalidade, a presente invenção é um processo biocatalítico para a produção de esteviosídeo C. Em uma modalidade, a presente invenção é um processo biocatalítico para a produção de rebaudiosídeo E. Em uma modalidade, a presente invenção é um processo biocatalítico para a produção de rebaudiosídeo E2.
[0122] Em uma modalidade, a presente invenção é um processo biocatalítico para a produção de rebaudiosídeo E3.
[0123] Em uma modalidade, a presente invenção é um processo biocatalítico para a produção de rebaudiosídeo AM.
[0124] Em uma modalidade particular, a presente invenção fornece o processo biocatalítico para a produção de rebaudiosídeo AM a partir de uma composição de partida compreendendo esteviosídeo e UDP-glicose. Em outra modalidade particular, a presente invenção fornece o processo biocatalítico para a produção de rebaudiosídeo AM a partir de uma composição de partida compreendendo rebaudiosídeo E e UDP-glicose.
[0125] Opcionalmente, o método da presente invenção compreende ainda a separação do glicosídeo de esteviol alvo do meio para fornecer uma composição de glicosídeo de esteviol alvo altamente purificada. O glicosídeo de esteviol alvo pode ser separado por qualquer método adequado, tal como, por exemplo, cristalização, separação por membranas, centrifugação, extração, separação cromatográfica ou uma combinação de tais métodos.
[0126] Em modalidades particulares, o processo aqui descrito resulta em uma composição de glicosídeo de esteviol alvo altamente purificada. O termo "altamente purificado", como usado na presente invenção, se refere a uma composição tendo mais do que cerca de 80% em peso do glicosídeo de esteviol alvo em uma base anidra (seca). Em uma modalidade, a composição de glicosídeo de esteviol alvo altamente purificada contém mais do que cerca de 90% em peso do glicosídeo de esteviol alvo em uma base anidra (seca), tal como, por exemplo, mais do que cerca de 91%, mais do que cerca de 92%, mais do que cerca de 93%, mais do que cerca de 94%, mais do que cerca de 95%, mais do que cerca de 96%, mais do que cerca de 97%, mais do que cerca de 98% ou mais do que cerca de 99% do teor de glicosídeo de esteviol alvo em uma base seca.
[0127] Em uma modalidade, quando o glicosídeo de esteviol alvo é reb AM, o processo aqui descrito fornece uma composição com mais do que cerca de 90% de teor de reb AM em peso em uma base seca. Em outra modalidade particular, quando o glicosídeo de esteviol alvo é reb AM, o processo aqui descrito fornece uma composição que compreende mais do que cerca de 95% de teor de reb AM em peso em uma base seca. Microrganismos e preparações enzimáticas
[0128] Em uma modalidade da presente invenção, um microrganismo (célula microbiana) e/ou preparação de enzima é colocada em contato com um meio contendo a composição de partida para produzir glicosídeos de esteviol alvos.
[0129] A enzima pode ser fornecida na forma de uma suspensão de células inteiras, um lisado bruto, uma enzima purificada ou uma combinação dos mesmos. Em uma modalidade, o biocatalisador é uma enzima purificada capaz de converter a composição de partida no glicosídeo de esteviol alvo. Em outra modalidade, o biocatalisador é um lisado em bruto que compreende pelo menos uma enzima capaz de converter a composição de partida no glicosídeo de esteviol alvo. Em ainda outra modalidade, o biocatalisador é uma suspensão de células inteiras compreendendo pelo menos uma enzima capaz de converter a composição de partida no glicosídeo de esteviol alvo.
[0130] Em outra modalidade, o biocatalisador é uma ou mais células microbianas compreendendo enzima(s) capazes de converter a composição de partida no glicosídeo de esteviol alvo. A enzima pode estar localizada na superfície da célula, dentro da célula ou localizada tanto na superfície da célula quanto dentro da célula.
[0131] As enzimas adequadas para converter a composição de partida em glicosídeos de esteviol alvo incluem, mas não estão limitadas a, as enzimas de biossíntese de esteviol e UDP-glucosiltransferases (UGTs). Opcionalmente, pode-se incluir enzima(s) de reciclagem de UDP.
[0132] Em uma modalidade, as enzimas de biossíntese de esteviol incluem enzimas da via do mevalonato (MV A). Em outra modalidade, as enzimas de biossíntese de esteviol incluem enzimas da via de 2-C-metil-D-eritritol-4-fosfato não- mevalonato (MEP/DOXP). Em uma modalidade, as enzimas de biossíntese de esteviol são selecionadas a partir do grupo que inclui geranilgeranil difosfato sintetase, copalil difosfato sintetase, caureno sintetase, caureno oxidase, ácido 13-hidroxilase caurenoico (KAH), esteviol sintetase, desoxixilulose 5-fosfato sintase (DXR), D-1- desoxixilulose 5-fosfato reductoisomerase (DXR), 4-difosfocitidil-2-C-metil-D eritritol sintase (CMS), 4-difosfocitidil-2-C-metil-D-eritritol quinase (CMK), 4-difosfocitidil-2-C- metil-D-eritritol 2,4-ciclodifosfato sintase (MCS), 1-hidróxi-2-metil-2(E)-butenil 4- difosfato sintase (HDS), 1-hidróxi-2-metil-2(E)-butenil 4-difosfato redutase (HDR), acetoacetil-CoA tiolase, HMG-CoA redutase truncada, mevalonato quinase, fosfomevalonato quinase, mevalonato pirofosfato decarboxilase, citocromo P450 redutase, etc.
[0133] A UDP-glucosiltransferase pode ser qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar pelo menos uma unidade de glicose ao esteviol e/ou um substrato de glicosídeo de esteviol para fornecer o glicosídeo de esteviol alvo.
[0134] Em uma modalidade, as enzimas de biossíntese de esteviol e UDP- glucosiltransferases são produzidas em uma célula microbiana. A célula microbiana pode ser, por exemplo, E. coli, Saccharomyces sp., Aspergillus sp., Pichia sp., Bacillus sp., Yarrowia sp. etc. Em outra modalidade, as UDP-glucosiltransferases são sintetizadas.
[0135] Em uma modalidade, a UDP-glucosiltransferase é selecionada do grupo que inclui UGT74G1, UGT85C2, UGT76G1, UGT91D2, UGTS12, EUGT11 e UGTs tendo identidade de sequência de aminoácidos substanciais (> 85%,> 86%,> 87%,> 88%,> 89%,> 90%,> 91%,> 92%,> 93%,> 94%,> 95%,> 96%,> 97%,> 98%,> 99%) para estes polipeptídeos, bem como moléculas de ácido nucleico isoladas que codificam essas UGTs.
[0136] Em uma modalidade, as enzimas de biossíntese de esteviol, UGTs e sistema de reciclagem de UDP-glicose estão presentes em um microrganismo (célula microbiana). O microrganismo pode ser, por exemplo, E. coli, Saccharomyces sp., Aspergillus sp., Pichia sp., Bacillus sp., Yarrowia sp.
[0137] Em uma modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP- glucosiltransferase capaz de adicionar pelo menos uma unidade de glicose ao esteviol ou qualquer glicosídeo de esteviol de partida contendo um grupo funcional -OH em 3 para produzir um glicosídeo de esteviol alvo tendo uma ligação glicosídica beta -O- glicose glucopiranosídeo em C13. Em uma modalidade particular, a UDP- glucosiltransferase é UGT85C2, ou uma UGT tendo > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT85C2.
[0138] Em outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP- glucosiltransferase capaz de adicionar pelo menos uma unidade de glicose ao esteviol ou qualquer glicosídeo de esteviol de partida contendo um grupo funcional -COOH em
C19 para produzir um glicosídeo de esteviol alvo tendo um ligação glicosídica beta - COO-glicose glucopiranosídeo em C19. Em uma modalidade particular, a UDP- glucosiltransferase é UGT74G1, ou uma UGT tendo > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT74G1.
[0139] Em outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP- glicosiltransferase capaz de adicionar pelo menos uma unidade de glicose à glicose existente em C19 de qualquer glicosídeo de esteviol de partida para produzir um glicosídeo de esteviol alvo com pelo menos uma glicose adicional contendo pelo menos uma ligação(ões) glicosídica(s) beta 1— >2 glucopiranosídeo na(s) ligação(ões) glicosídica(s) recém-formada(s). Em uma modalidade particular, a UDP- glucosiltransferase é UGTS12, ou uma UGT tendo > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGTS12. Em outra modalidade particular, a UDP- glucosiltransferase é EUGT11, ou uma UGT tendo > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com EUGT11. Em ainda uma outra modalidade particular, a UDP- glucosiltransferase é UGT91D2, ou uma UGT tendo > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT91D2.
[0140] Em outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP- glicosiltransferase capaz de adicionar pelo menos uma unidade de glicose à glicose existente em C19 de qualquer glicosídeo de esteviol de partida para produzir um glicosídeo de esteviol alvo com pelo menos uma glicose adicional contendo pelo menos uma ligação(ões) glicosídica(s) beta 1— >3 glucopiranosídeo na(s) ligação(ões) glicosídica(s) recém-formada(s). Em uma modalidade particular, a UDP- glucosiltransferase é UGT76G1, ou uma UGT tendo > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT76G1.
[0141] Em outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP- glicosiltransferase capaz de adicionar pelo menos uma unidade de glicose à glicose existente em C13 de qualquer glicosídeo de esteviol de partida para produzir um glicosídeo de esteviol alvo com pelo menos uma glicose adicional contendo pelo menos uma ligação(ões) glicosídica(s) beta 1— >2 de glucopiranosídeo na(s) ligação(ões) glicosídica(s) recém-formada(s). Em uma modalidade particular, a UDP- glucosiltransferase é UGTS12, ou uma UGT tendo > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGTS12. Em uma outra modalidade particular, a UDP- glucosiltransferase é EUGT11, ou uma UGT tendo > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com EUGT11. Em ainda uma outra modalidade particular, a UDP- glucosiltransferase é UGT91D2, ou uma UGT tendo > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT91D2.
[0142] Em uma modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP- glucosiltransferase capaz de adicionar pelo menos uma unidade de glicose ao esteviol para formar esteviolmonosídeo. Em uma modalidade particular, a UDP- glucosiltransferase é UGT85C2 ou uma UGT tendo > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT85C2 ou uma UGT tendo > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT85C2.
[0143] Em outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP- glucosiltransferase capaz de adicionar pelo menos uma unidade de glicose ao esteviol para formar o esteviolmonosídeo A. Em uma modalidade particular, a UDP- glucosiltransferase é UGT74G1 ou uma UGT tendo > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT74G1.
[0144] Em outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP- glucosiltransferase capaz de adicionar pelo menos uma unidade de glicose ao esteviolmonosídeo A para formar esteviolbiosídeo B. Em uma modalidade específica, a UDP-glucosiltransferase é UGT76G1 ou uma UGT tendo > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT76G1.
[0145] Em outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP- glucosiltransferase capaz de adicionar pelo menos uma unidade de glicose ao esteviolmonosídeo A para formar o esteviolbiosídeo A. Em uma modalidade particular, a UDP-glucosiltransferase é UGTS12 ou uma UGT tendo > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGTS12. Em uma outra modalidade particular, a UDP-glucosiltransferase é EUGT11, ou uma UGT tendo > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com EUGT11. Em ainda uma outra modalidade particular, a UDP-glucosiltransferase é UGT91D2, ou uma UGT tendo > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT91D2.
[0146] Em outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP- glucosiltransferase capaz de adicionar pelo menos uma unidade de glicose ao esteviolmonosídeo A para formar rubusosídeo. Em uma modalidade particular, a UDP- glucosiltransferase é UGT85C2, ou uma UGT tendo > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT85C2. Em outra modalidade, a UDP- glucosiltransferase é qualquer UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar pelo menos uma unidade de glicose ao esteviolmonosídeo para formar rubusosídeo. Em uma modalidade particular, a UDP-glucosiltransferase é UGT74G1, ou uma UGT tendo > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT74G1.
[0147] Em outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP- glucosiltransferase capaz de adicionar pelo menos uma unidade de glicose ao esteviolmonosídeo para formar esteviolbiosídeo.
[0148] Em outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP- glucosiltransferase capaz de adicionar pelo menos uma unidade de glicose ao esteviolbiosídeo B para formar esteviosídeo B. Em uma modalidade particular, a UDP- glucosiltransferase é UGT85C2 ou uma UGT tendo > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT85C2.
[0149] Em outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP- glucosiltransferase capaz de adicionar pelo menos uma unidade de glicose ao esteviolbiosídeo B para formar o esteviosídeo C. Em uma modalidade particular, a
UDP-glucosiltransferase é UGTS12 ou uma UGT tendo > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGTS12. Em outra modalidade particular, a UDP- glucosiltransferase é EUGT11, ou uma UGT tendo > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com EUGT11. Em ainda uma outra modalidade particular, a UDP- glucosiltransferase é UGT91D2, ou uma UGT tendo > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT91D2.
[0150] Em outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP- glucosiltransferase capaz de adicionar pelo menos uma unidade de glicose ao esteviolbiosídeo A para formar esteviosídeo A. Em uma modalidade particular, a UDP- glucosiltransferase é UGT85C2 ou uma UGT tendo > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT85C2.
[0151] Em outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP- glucosiltransferase capaz de adicionar pelo menos uma unidade de glicose ao esteviolbiosídeo A para formar o esteviosídeo C. Em uma modalidade particular, a UDP-glucosiltransferase é UGT76G1 ou uma UGT tendo > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT76G1.
[0152] Em outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP- glucosiltransferase capaz de adicionar pelo menos uma unidade de glicose ao rubusosídeo para formar o esteviosídeo B. Em uma modalidade particular, a UDP- glucosiltransferase é UGT76G1 ou uma UGT tendo > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT76G1.
[0153] Em outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP- glucosiltransferase capaz de adicionar pelo menos uma unidade de glicose ao rubusosídeo para formar o esteviosídeo A (rebaudiosídeo KA). Em uma modalidade particular, a UDP-glucosiltransferase é UGTS12, ou uma UGT tendo > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGTS12. Em uma outra modalidade particular, a UDP-glucosiltransferase é EUGT11, ou uma UGT tendo > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com EUGT11. Em ainda uma outra modalidade particular, a UDP-glucosiltransferase é UGT91D2, ou uma UGT tendo > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT91D2.
[0154] Em outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP- glucosiltransferase capaz de adicionar pelo menos uma unidade de glicose ao rubusosídeo para formar esteviosídeo.
[0155] Em outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP- glucosiltransferase capaz de adicionar pelo menos uma unidade de glicose ao esteviolbiosídeo para formar esteviosídeo. Em uma modalidade particular, a UDP- glucosiltransferase é UGT74G1, ou uma UGT tendo > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT74G1.
[0156] Em outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP- glucosiltransferase capaz de adicionar pelo menos uma unidade de glicose ao esteviosídeo B para formar rebaudiosídeo E3. Em uma modalidade particular, a UDP- glucosiltransferase é UGTS12, ou uma UGT tendo > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGTS12. Em uma outra modalidade particular, a UDP- glucosiltransferase é EUGT11, ou uma UGT tendo > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com EUGT11. Em ainda uma outra modalidade particular, a UDP- glucosiltransferase é UGT91D2, ou uma UGT tendo > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT91D2.
[0157] Em outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP- glucosiltransferase capaz de adicionar pelo menos uma unidade de glicose ao esteviosídeo B para formar rebaudiosídeo E2.
[0158] Em outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP- glucosiltransferase capaz de adicionar pelo menos uma unidade de glicose ao esteviosídeo A (rebaudiosídeo KA) para formar rebaudiosídeo E3. Em uma modalidade particular, a UDP-glucosiltransferase é UGT76G1, ou uma UGT tendo >
85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT76G1.
[0159] Em outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP- glucosiltransferase capaz de adicionar pelo menos uma unidade de glicose ao esteviosídeo A (rebaudiosídeo KA) para formar rebaudiosídeo E.
[0160] Em outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP- glucosiltransferase capaz de adicionar pelo menos uma unidade de glicose ao esteviosídeo C para formar rebaudiosídeo E3. Em uma modalidade particular, a UDP- glucosiltransferase é UGT85C2, ou uma UGT tendo > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT85C2.
[0161] Em outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP- glucosiltransferase capaz de adicionar pelo menos uma unidade de glicose ao esteviosídeo para formar rebaudiosídeo E2. Em uma modalidade particular, a UDP- glucosiltransferase é UGT76G1, ou uma UGT tendo > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT76G1.
[0162] Em outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP- glucosiltransferase capaz de adicionar pelo menos uma unidade de glicose ao esteviosídeo para formar o rebaudiosídeo E. Em uma modalidade particular, a UDP- glucosiltransferase é UGTS12 ou uma UGT tendo > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGTS12. Em uma outra modalidade particular, a UDP- glucosiltransferase é EUGT11, ou uma UGT com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com EUGT11. Em ainda uma outra modalidade particular, a UDP- glucosiltransferase é UGT91D2, ou uma UGT tendo > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT91D2.
[0163] Em outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP- glucosiltransferase capaz de adicionar pelo menos uma unidade de glicose ao rebaudiosídeo E3 para formar rebaudiosídeo AM.
[0164] Em outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP-
glucosiltransferase capaz de adicionar pelo menos uma unidade de glicose ao rebaudiosídeo E2 para formar rebaudiosídeo AM. Em uma modalidade particular, a UDP-glucosiltransferase é UGTS12, ou uma UGT tendo > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGTS12. Em outra modalidade particular, a UDP- glucosiltransferase é EUGT11, ou uma UGT tendo > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com EUGT11. Em ainda uma outra modalidade particular, a UDP- glucosiltransferase é UGT91D2, ou uma UGT tendo > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT91D2.
[0165] Em outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase é qualquer UDP- glucosiltransferase capaz de adicionar pelo menos uma unidade de glicose ao rebaudiosídeo E para formar rebaudiosídeo AM. Em uma modalidade particular, a UDP-glucosiltransferase é UGT76G1, ou uma UGT tendo > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT76G1.
[0166] Opcionalmente, o método da presente invenção compreende ainda o uso de mais de uma UGT em uma composição de partida, para produzir um glicosídeo(s) de esteviol alvo com mais de uma unidade de glicose do que a composição de partida. Em uma modalidade particular, as UDP-glucosiltransferases são UGT74G1, UGT85C2, UGT76G1, UGTS12, EUGT11 e/ou UGT91D2 ou qualquer UGT tendo > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGT74G1, UGT85C2, UGT76G1, UGTS12, EUGT11 e/ou UGT91D2 qualquer combinação dos mesmos, capaz de adicionar mais de uma unidade de glicose a uma composição de partida para produzir um glicosídeo(s) de esteviol tendo mais de uma unidade de glicose do que a composição de partida.
[0167] Em uma modalidade, as UDP-glucosiltransferases são quaisquer UDP- glucosiltransferases capazes de adicionar duas unidades globais de glicose ao esteviosídeo para formar rebaudiosídeo AM. Em uma modalidade particular, as UDP- glucosiltransferases são selecionadas a partir de UGTS12, EUGT11, UGT91D2,
UGT76G1 ou qualquer UGT tendo > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGTS12, EUGT11, UGT91D2, UGT76G1 ou qualquer combinação dos mesmos. Em outra modalidade particular, as UDP -glucosiltransferases são UGTS12 e UGT76G1.
[0168] Opcionalmente, o método da presente invenção compreende ainda reciclar a UDP para fornecer UDP-glicose. Em uma modalidade, o método compreende a reciclagem de UDP, fornecendo um catalisador de reciclagem e um subfato de reciclagem, de modo que a biotransformação de esteviol e/ou de substrato de glicosídeo de esteviol para o glicosídeo de esteviol alvo seja realizada usando quantidades catalíticas de UDP-glucosiltransferase e UDP- glicose. A enzima de reciclagem de UDP pode ser sacarose sintase SuSy_At ou uma sacarose sintase tendo > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com SuSy_At e o substrato de reciclagem pode ser sacarose.
[0169] Opcionalmente, o método da presente invenção compreende ainda o uso de transglicosidases que usam oligo- ou polissacarídeos como o doador de açúcar para modificar as moléculas de glicosídeo de esteviol alvo receptoras. Exemplos não limitativos incluem ciclodextrina glicosiltransferase (CGTase), frutofuranosidase, amilase, sacarase, glucosucrase, beta-h-frutosidase, beta-frutosidase, sacarase. frutosilinvertase, invertase alcalina, invertase ácida, frutofuranosidase. Em algumas modalidades, glicose e açúcar(es) além da glicose, incluindo, mas não se limitando a, frutose, xilose, ramnose, arabinose, desoxiglicose, galactose são transferidos para os glicosídeos de esteviol alvo receptores. Em uma modalidade, o glicosídeo de esteviol receptor é rebaudiosídeo AM.
[0170] Em outra modalidade, a UDP-glucosiltransferase capaz de adicionar pelo menos uma unidade de glicose à composição de partida de glicosídeo de esteviol tem > 85% de identidade de sequência de aminoácidos com UGTs selecionadas a partir da seguinte lista de números identificadores de Genlnfo, de preferência, do grupo apresentado na Tabela 1 e Tabela 2.
397567 30680413 115480946 147798902 218193594 225443294 454245 32816174 116310259 147811764 218193942 225444853 1359905 32816178 116310985 147827151 219885307 225449296 1685003 34393978 116788066 147836230 222615927 225449700 1685005 37993665 116788606 147839909 222619587 225454338 2191136 37993671 116789315 147846163 222623142 225454340 2501497 37993675 119394507 147855977 222625633 225454342 2911049 39104603 119640480 148905778 222625635 225454473 4218003 41469414 122209731 148905999 222636620 225454475 4314356 41469452 125526997 148906835 222636621 225458362 13492674 42566366 125534279 148907340 222636628 225461551 13492676 42570280 125534461 148908935 222636629 225461556 15217773 42572855 125540090 148909182 224053242 225461558 15217796 44890129 125541516 148909920 224053386 225469538 15223396 46806235 125545408 148910082 224055535 225469540 15223589 50284482 125547340 148910154 224056138 226316457 15227766 51090402 125547520 148910612 224056160 226492603 15230017 51090594 125554547 148910769 224067918 226494221 15231757 52839682 125557592 156138791 224072747 226495389 15234056 56550539 125557593 156138797 224080189 226495945 15234195 62734263 125557608 156138799 224091845 226502400 15234196 62857204 125559566 156138803 224094703 226507980 15238503 62857206 125563266 165972256 224100653 226531147 15239523 62857210 125571055 168016721 224100657 226532094 15239525 62857212 125579728 171674071 224101569 238477377 15239543 75265643 125588307 171906258 224103105 240254512 15239937 75285934 125589492 183013901 224103633 242032615 15240305 75288884 125599469 183013903 224103637 242032621 15240534 77550661 125601477 186478321 224109218 242038423 15982889 77556148 126635837 187373030 224114583 242043290 18086351 82791223 126635845 187373042 224116284 242044836 18418378 83778990 126635847 190692175 224120552 242051252 18418380 89953335 126635863 194701936 224121288 242056217 18418382 110741436 126635867 195620060 224121296 242056219 19743740 110743955 126635883 209954691 224121300 242056663 19911201 115438196 126635887 209954719 224130358 242059339 20149064 115438785 133874210 209954725 224140703 242059341 20260654 115441237 133874212 209954733 224143404 242060922 21435782 115454819 145358033 210063105 224143406 242067411 21553613 115456047 147772508 210063107 224144306 242067413 21593514 115457492 147776893 212275846 224285244 242076258 22759895 115459312 147776894 216296854 225431707 242076396 23955910 115464719 147776895 217074506 225435532 242084750 26452040 115471069 147786916 218185693 225436321 242091005 28393204 115471071 147798900 218187075 225440041 242095206 30679796 115474009 147798901 218189427 225441116 242345159
Tabela 1: Número GI Acesso Origem 190692175 ACE87855.l Stevia rebaudiana 41469452 AAS07253.l 01yza sativa 62857204 BAD95881.1 Ipomoea nil 62857206 BAD95882.1 Ipomoea purperea 56550539 BAD77944.1 Bellis Perennis 115454819 NP 001051010.1 Grupo 01yza sativa Japonica 115459312 NP 001053256.1 Grupo Oryza sativa Japonica 115471069 NP 001059133.1 Grupo 01yza sativa
Japonica 115471071 NP 001059134.1 Grupo 01yza sativa Japonica 116310985 CAH67920.l Grupo 01yza sativa Indica 116788066 ABK24743.1 Picea sitchensis 122209731 Q2V6J9.1 Fragaria x ananassa 125534461 EAY81009.1 Grupo Oryza saliva Indica 125559566 EAZ05102.l Grupo Oryza sativa Indica 125588307 EAZ28971.1 Grupo 01yza sativa Japonica 148907340 ABR16806.1 Picea sitchensis 148910082 ABR18123.1 Picea sitchensis 148910612 ABR18376.1 Picea sitchensis 15234195 NP 194486.1 Arabidopsis thaliana 15239523 NP 200210.1 Arabidopsis thaliana 15239937 NP 196793.1 Arabidopsis thaliana 1685005 AAB36653.l Nicotiana tabacum 183013903 ACC38471.1 Medicago truncatula 186478321 NP 172511.3 Arabidopsis thaliana 187373030 ACD03249.l Avena strigosa 194701936 ACF85052.l Zea mays 19743740 AAL92461.1 Solanum lycopersicum 212275846 NP 001131009.1 Zea mays 222619587 EEE55719.l Grupo Oryza sativa Japonica 224055535 XP 002298527.1 Populus trichocarpa 224101569 XP 002334266.1 Populus trichocarpa 224120552 XP 002318358.1 Populus trichocarpa 224121288 XP 002330790.1 Populus trichocarpa 225444853 XP 002281094 Vitis vinifera 225454342 XP 002275850.1 Vitis vinifera 225454475 XP 002280923.1 Vitis vinifera 225461556 XP 002285222 Vitis vin (fera 225469540 XP 002270294.1 Vitis vinifera 226495389 NP 001148083.1 Zea mays 226502400 NP 001147674.1 Zeamays 238477377 ACR43489.l Triticum aestivum 240254512 NP 565540.4 Arabidopsis thaliana 2501497 Q43716.l Petunia x Hybrida 255555369 XP 002518721.1 Ricinus communis 26452040 BAC43110.l Arabidopsis thaliana 296088529 CBI37520.3 Vitis vinifera 297611791 NP 001067852.2 Grupo 01yza sativa Japonica 297795735 XP 002865752.1 Arabidopsis lyrata subsp. lyrata 297798502 XP 002867135.1 Arabidopsis lyrata subsp. lyrata
297820040 XP 002877903.1 Arabidopsis lyrata subsp. !
yrata 297832276 XP 002884020.1 Arabidopsis! Yrata subsp. lyrata 302821107 XP 002992218.1 Selaginella moellendorfjii 30680413 NP 179446.2 Arabidopsis thaliana 319759266 ADV71369.l Pueraria montana var. ! abata 326507826 BAJ86656.l Hordeum vulgare subsp.
Vu! Gare 343457675 AEM37036.l Brassica rapa subsp. oleifera 350534960 NP 001234680.1 Solanum lycopersicum 356501328 XP 003519477.1 Glycine max 356522586 XP 003529927.1 Glycine max 356535480 XP 003536273.1 Glycine max 357445733 XP 003593144.1 Medicago truncatula 357452783 XP 003596668.1 Medicago truncatula 357474493 XP 003607531.1 Medicago truncatula 357500579 XP 003620578.1 Medicago truncatula 357504691 XP 003622634.1 Medicago truncatula 359477998 XP 003632051.1 Vitis vinifera 359487055 XP 002271587 Vitis vintfera 359495869 XP 003635104.1 Vitis vinifera 387135134 AFJ52948.l Linum usitatissimum 387135176 AFJ52969. l Linum usitatissimum 387135192 AFJ52977. l Linum usitatissimum 387135282 AFJ53022.l Linum usitatissimum 387135302 AFJ53032.l Linum usitatissimum 387135312 AFJ53037.l Linum usitatissimum 388519407 AFK47765.l Medicago truncatula 393887646 AFN26668.l Barbarea vulgaris subsp. arcuata 414888074 DAA64088.l Zeamays 42572855 NP 974524.1 Arabidopsis thaliana 449440433 XP 004137989.1 Cucumis sativus 449446454 XP 004140986.1 Cucumis sativus 449449004 XP 004142255.1 Cucumis sativus 449451593 XP 004143546.1 Cucumis sativus 449515857 XP 004164964.1 Cucumis sativus 460382095 XP 004236775.1 Solanum lycopersicum 460409128 XP 004249992.1 Solanum lycopersicum 460409461 XP 004250157.1 Solanum lycopersicum 460409465 XP 004250159.1 Solanum lycopersicum 462396388 EMJ02187.1 Prunus persica 462402118 EMJ07675.l Prunus persica 462409359 EMJ14693.l Prunus persica 462416923 EMJ21660.l Prunus persica 46806235 BAD17459.1 Grupo Oryza saliva Japonica 470104266 XP 004288529.1 Fragaria vesca subsp. vesca 470142008 XP 004306714.1 Fragaria vesca subsp. vesca
475432777 EMT01232.1 Aegilops tauschii 51090402 BAD35324.1 Grupo Oryza sativa Japonica Tabela 2: Número GI Acesso Origem Referência interna 460409128 XP.004249992.1 Solanum lycopersicum UGTSI 460386018 XP.004238697.1 Solanum lycopersicum - 460409134 XP.004249995.1 Solanum lycopersicum - 460410132 XP.004250485.1 Solanum lycopersicum UGTS12 460410130 XP.004250484.1 Solanum lycopersicum - 460410128 XP.004250483.1 Solanum lycopersicum - 460378310 XP.004234916.1 Solanum lycopersicum - 209954733 BAG80557.1 Lycium barbarum UGTLB 209954725 BAG80553.l Lycium barbarum -
[0171] Uma modalidade da presente invenção é uma célula microbiana que compreende uma enzima, isto é, uma enzima capaz de converter a composição de partida no glicosídeo de esteviol alvo. Sendo assim, algumas modalidades do presente método incluem o contato de um microrganismo com um meio contendo a composição de partida para fornecer um meio compreendendo pelo menos um glicosídeo de esteviol alvo.
[0172] O microrganismo pode ser qualquer microrganismo que possua a(s) enzima(s) necessária(s) para converter a composição de partida em glicosídeo(s) de esteviol alvo. Essas enzimas são codificadas no genoma do microrganismo.
[0173] Os microrganismos adequados incluem, mas não estão limitados a, E. coli, Saccharomyces sp., Aspergillus sp., Pichia sp., Bacillus sp., Yarrowia sp. etc.
[0174] Em uma modalidade, o microrganismo está livre quando em contato com a composição de partida. Em outra modalidade, o microrganismo é imobilizado quando em contato com a composição de partida. Por exemplo, o microrganismo pode ser imobilizado em um suporte sólido feito de materiais inorgânicos ou orgânicos. Exemplos não limitativos de suportes sólidos adequados para imobilizar o microrganismo incluem celulose derivatizada ou vidro, cerâmica, óxidos metálicos ou membranas. O microrganismo pode ser imobilizado no suporte sólido, por exemplo,
por fixação covalente, adsorção, reticulação, aprisionamento ou encapsulamento.
[0175] Em ainda outra modalidade, a enzima capaz de converter a composição de partida no glicosídeo de esteviol alvo é segregada para fora do microrganismo e para o meio de reação. O glicosídeo de esteviol alvo é opcionalmente purificado. A purificação do glicosídeo de esteviol alvo do meio de reação pode ser alcançada por pelo menos um método adequado para fornecer uma composição de glicosídeo de esteviol alvo altamente purificada. Os métodos adequados incluem cristalização, separação por membranas, centrifugação, extração (fase líquida ou sólida), separação cromatográfica, HPLC (preparativa ou analítica) ou uma combinação de tais métodos. Usos
[0176] Glicosídeo(s) alvo(s) altamente purificado(s), particularmente esteviolmonosídeo, esteviolmonosídeo A, esteviolbiosídeo, esteviolbiosídeo A, esteviolbiosídeo B, rubusosídeo, esteviosídeo, esteviosídeo A (rebaudiosídeo KA), esteviosídeo B, esteviosídeo C, rebaudiosídeo E, rebaudiosídeo E2, rebaudiosídeo E3 e/ou rebaudiosídeo AM obtido de acordo com esta invenção pode ser usado "como está" ou em combinação com outros adoçantes, sabores, ingredientes alimentícios e combinações dos mesmos.
[0177] Exemplos não limitativos de sabores incluem, mas não se limitam a, lima, limão, laranja, fruta, banana, uva, pêra, abacaxi, manga, baga, amêndoa amarga, cola, canela, açúcar, algodão doce, baunilha e combinações dos mesmos.
[0178] Exemplos não limitativos de outros ingredientes alimentícios incluem, mas não se limitam a, acidulantes, orgânicos e aminoácidos, agentes corantes, agentes de volume, amidos modificados, gomas, texturizantes, conservantes, cafeína, antioxidantes, emulsionantes, estabilizantes, espessantes, agentes gelificantes e as combinações dos mesmos.
[0179] Glicosídeo(s) alvo(s) altamente purificado(s), particularmente esteviolmonosídeo, esteviolmonosídeo A, esteviolbiosídeo, esteviolbiosídeo A, esteviolbiosídeo B, rubusosídeo, esteviosídeo, esteviosídeo A (rebaudiosídeo KA), esteviosídeo B, esteviosídeo C, rebaudiosídeo E, rebaudiosídeo E2, rebaudiosídeo E3 e/ou rebaudiosídeo AM, obtido de acordo com esta invenção, pode ser preparado em várias formas polimórficas, incluindo, mas não se limitam a, hidratos, solvatos, formas anidras, amorfas e as combinações dos mesmos.
[0180] Glicosídeo(s) alvo(s) altamente purificado(s), particularmente esteviolmonosídeo, esteviolmonosídeo A, esteviolbiosídeo, esteviolbiosídeo A, esteviolbiosídeo B, rubusosídeo, esteviosídeo, esteviosídeo A (rebaudiosídeo KA), esteviosídeo B, esteviosídeo C, rebaudiosídeo E, rebaudiosídeo E2, rebaudiosídeo E3 e/ou rebaudiosídeo AM, obtido de acordo com esta invenção pode ser incorporado como um adoçante natural de alta intensidade em alimentos, bebidas, composições farmacêuticas, cosméticos, gomas de mascar, produtos de mesa, cereais, produtos lácteos, pastas de dentes e outras composições da cavidade oral, etc.
[0181] Glicosídeo(s) alvo(s) altamente purificado(s) particularmente, esteviolmonosídeo, esteviolmonosídeo A, esteviolbiosídeo, esteviolbiosídeo A, esteviolbiosídeo B, rubusosídeo, esteviosídeo, esteviosídeo A (rebaudiosídeo KA), esteviosídeo B, esteviosídeo C, rebaudiosídeo E, rebaudiosídeo E2 e rebaudiosídeo E3 e/ou rebaudiosídeo AM obtido de acordo com esta invenção pode ser empregado como um composto adoçante como o único adoçante, ou pode ser usado junto com pelo menos um adoçante de alta intensidade de ocorrência natural, como rebaudiosídeo A, rebaudiosídeo A2, rebaudiosídeo A3, rebaudiosídeo B, rebaudiosídeo C, rebaudiosídeo C2, rebaudiosídeo D, rebaudiosídeo D2, rebaudiosídeo F, rebaudiosídeo F2, rebaudiosídeo F3, rebaudiosídeo G, rebaudiosídeo H, rebaudiosídeo I, rebaudiosídeo I2, rebaudiosídeo I3, rebaudiosídeo J, rebaudiosídeo K, rebaudiosídeo L, rebaudiosídeo M, rebaudiosídeo M2, rebaudiosídeo N, rebaudiosídeo O, rebaudiosídeo O2, rebaudiosídeo Q,
rebaudiosídeo Q2, rebaudiosídeo Q3, rebaudiosídeo R, rebaudiosídeo S, rebaudiosídeo T, rebaudiosídeo T1, rebaudiosídeo U, rebaudiosídeo U2, rebaudiosídeo V, rebaudiosídeo W, rebaudiosídeo W2, rebaudiosídeo W3, rebaudiosídeo Y, rebaudiosídeo Z1, rebaudiosídeo Z2, dulcosídeo A, dulcosídeo C, esteviosídeo D, esteviosídeo E, esteviosídeo E2, esteviosídeo F, mogrosídeos, brazzeína, neoesperidina di-hidrocalcona, ácido glicirrízico e seus sais, taumatina, perilartina, pernandulcina, mucuroziosídeos, baiiunosídeo, flomisosídeo I, dimetil- hexahidrofluoreno-dicarboxílico, abrusosídeos, periandrina, carnosiflosídeos, ciclocariosídeo, pterocariosídeos, polipodosídeo A, brazilina, hernandulcina, filodulcina, glicifilina, florizina, trilobatina, di-hidroflavonol, di-hidroquercetina-3- acetato, neoastilibina, trans-cinamaldeído, monatina e seus sais, seligueaína A, hematoxilina, monelina, oslinadina, pterocariosídeo A, pterocariosídeo B, mabinlina, pentadina, miraculina, curculina, neoculina, ácido clorogênico, cinarina, adoçante Luo Han Guo, mogrosídeo V, siamenosídeo e combinações dos mesmos.
[0182] Em uma modalidade particular, esteviolmonosídeo, esteviolmonosídeo A, esteviolbiosídeo, esteviolbiosídeo A, esteviolbiosídeo B, rubusosídeo, esteviosídeo, esteviosídeo A (rebaudiosídeo KA), esteviosídeo B, esteviosídeo C, rebaudiosídeo E, rebaudiosídeo E2, rebaudiosídeo E3 ou rebaudiosídeo AM pode ser usado em uma composição adoçante que compreende um composto selecionado do grupo que consiste em rebaudiosídeo A, rebaudiosídeo A2, rebaudiosídeo A3, rebaudiosídeo B, rebaudiosídeo C, rebaudiosídeo C2, rebaudiosídeo D, rebaudiosídeo D2, rebaudiosídeo F, rebaudiosídeo F2, rebaudiosídeo F3, rebaudiosídeo G, rebaudiosídeo H, rebaudiosídeo I, rebaudiosídeo I2, rebaudiosídeo I3, rebaudiosídeo J, rebaudiosídeo K, rebaudiosídeo K2, rebaudiosídeo L, rebaudiosídeo M, rebaudiosídeo M2, rebaudiosídeo N, rebaudiosídeo O, rebaudiosídeo O2, rebaudiosídeo Q, rebaudiosídeo Q2, rebaudiosídeo Q3, rebaudiosídeo R, rebaudiosídeo S, rebaudiosídeo T, rebaudiosídeo T1, rebaudiosídeo U, rebaudiosídeo
U2, rebaudiosídeo V, rebaudiosídeo W, rebaudiosídeo W2, rebaudiosídeo W3, rebaudiosídeo Y, rebaudiosídeo Z1, rebaudiosídeo Z2, dulcosídeo A, dulcosídeo C, esteviosídeo D, esteviosídeo E, esteviosídeo E2, esteviosídeo F, NSF-02, Mogrosídeo V, Luo Han Guo, alulose, alose, D-tagatose, eritritol e as combinações dos mesmos.
[0183] Glicosídeo(s) alvo(s) altamente purificado(s), particularmente esteviolmonosídeo, esteviolmonosídeo A, esteviolbiosídeo, esteviolbiosídeo A, esteviolbiosídeo B, rubusosídeo, esteviosídeo, esteviosídeo A (rebaudiosídeo KA), esteviosídeo B, esteviosídeo C, rebaudiosídeo E, rebaudiosídeo E2, rebaudiosídeo E3 ou rebaudiosídeo AM também pode ser usado em combinação com adoçantes sintéticos de alta intensidade, tais como sucralose, acessulfame de potássio, aspartame, alitame, sacarina, neoesperidina di-hidrocalcona, ciclamato, neotame, dulcina, suosan Advantame, sais dos mesmos e combinações dos mesmos.
[0184] Além disso, glicosídeo(s) de esteviol alvo(s) altamente purificado(s), particularmente esteviolmonosídeo, esteviolmonosídeo A, esteviolbiosídeo, esteviolbiosídeo A, esteviolbiosídeo B, rubusosídeo, esteviosídeo, esteviosídeo A (rebaudiosídeo KA), esteviosídeo B, esteviosídeo C, rebaudiosídeo E, rebaudiosídeo E2, rebaudiosídeo E3 ou rebaudiosídeo AM pode ser usado em combinação com supressores de adoçantes naturais, como ácido gimnêmico, hodulcina, zizifina, lactisol e outros. Esteviolmonosídeo, esteviolmonosídeo A, esteviolbiosídeo, esteviolbiosídeo A, esteviolbiosídeo B, rubusosídeo, esteviosídeo, esteviosídeo A (rebaudiosídeo KA), esteviosídeo B, esteviosídeo C, rebaudiosídeo E, rebaudiosídeo E2, rebaudiosídeo E3 e/ou rebaudiosídeo AM também pode ser combinado com vários intensificadores de sabor umami. Esteviolmonosídeo, esteviolmonosídeo A, esteviolbiosídeo, esteviolbiosídeo A, esteviolbiosídeo B, rubusosídeo, esteviosídeo, esteviosídeo A (rebaudiosídeo KA), esteviosídeo B, esteviosídeo C, rebaudiosídeo E, rebaudiosídeo E2, rebaudiosídeo E3 e/ou rebaudiosídeo AM pode ser misturado com sabor umami e aminoácidos doces, tais como glutamato, ácido aspártico, glicina, alanina, treonina,
prolina, serina, glutamato, lisina, triptofano e combinações dos mesmos.
[0185] Glicosídeo(s) de esteviol alvo(s) altamente purificado(s) particularmente, esteviolmonosídeo, esteviolmonosídeo A, esteviolbiosídeo, esteviolbiosídeo A, esteviolbiosídeo B, rubusosídeo, esteviosídeo, esteviosídeo A (rebaudiosídeo KA), esteviosídeo B, esteviosídeo C, rebaudiosídeo E, rebaudiosídeo E2, rebaudiosídeo E3 e/ou rebaudiosídeo AM pode ser usado em combinação com um ou mais aditivos selecionados do grupo que consiste em carboidratos, polióis, aminoácidos e seus sais correspondentes, poli-aminoácidos e seus sais correspondentes, ácidos de açúcar e seus sais correspondentes, nucleotídeos, ácidos orgânicos, ácidos inorgânicos, sais orgânicos incluindo sais de ácidos orgânicos e sais de bases orgânicas, sais inorgânicos, compostos amargos, aromatizantes e ingredientes aromatizantes, compostos adstringentes, proteínas ou hidrolisados de proteína, surfactantes, emulsificantes, flavonoides, álcoois, polímeros e as combinações dos mesmos.
[0186] Glicosídeo(s) de esteviol alvo(s) altamente purificado(s), particularmente esteviolmonosídeo, esteviolmonosídeo A, esteviolbiosídeo, esteviolbiosídeo A, esteviolbiosídeo B, rubusosídeo, esteviosídeo, esteviosídeo A (rebaudiosídeo KA), esteviosídeo B, esteviosídeo C, rebaudiosídeo E, rebaudiosídeo E2, rebaudiosídeo E3 e/ou rebaudiosídeo AM também pode ser combinado com vários álcoois de açúcar. O termo "poliol" se refere a uma molécula que contém mais de um grupo hidroxila. Um poliol pode ser um diol, triol ou um tetraol que contém 2, 3 e 4 grupos hidroxila, respectivamente. Um poliol também pode conter mais de 4 grupos hidroxila, como um pentaol, hexaol, heptaol, ou similares, que contêm 5, 6 ou 7 grupos hidroxila, respectivamente. Adicionalmente, um poliol também pode ser um álcool de açúcar, álcool poli-hídrico, ou poliálcool que é uma forma reduzida de carboidrato, em que o grupo carbonila (aldeído ou cetona, açúcar redutor) foi reduzido a um grupo hidroxila primário ou secundário. Exemplos de polióis incluem, mas não se limitam a, eritritol, maltitol, manitol, sorbitol, lactitol, xilitol, inositol, isomalte, propileno glicol, glicerol, treitol, galactitol, isomaltulose hidrogenada, isomalto- oligossacarídeos reduzidos, xilo-oligossacarídeos reduzidos, gentio-oligossacarídeos reduzidos, xarope de maltose reduzido, xarope de glicose reduzido, hidrolisados de amido hidrogenado, poliglicitóis e álcoois de açúcar ou quaisquer outros carboidratos capazes de sere reduzidos que não afetem adversamente o sabor da composição adoçante.
[0187] Glicosídeo(s) de esteviol alvo(s) altamente purificado(s), particularmente esteviolmonosídeo, esteviolmonosídeo A, esteviolbiosídeo, esteviolbiosídeo A, esteviolbiosídeo B, rubusosídeo, esteviosídeo, esteviosídeo A (rebaudiosídeo KA), esteviosídeo B, esteviosídeo C, rebaudiosídeo E, rebaudiosídeo E2, rebaudiosídeo E3 ou rebaudiosídeo AM pode ser combinado com adoçantes de calorias reduzidas, tais como, por exemplo, D-tagatose, L-açúcares, L-sorbose, L- arabinose e as combinações dos mesmos.
[0188] Glicosídeo(s) de esteviol alvo(s) altamente purificado(s), particularmente esteviolmonosídeo, esteviolmonosídeo A, esteviolbiosídeo, esteviolbiosídeo A, esteviolbiosídeo B, rubusosídeo, esteviosídeo, esteviosídeo A (rebaudiosídeo KA), esteviosídeo B, esteviosídeo C, rebaudiosídeo E, rebaudiosídeo E2, rebaudiosídeo E3 ou rebaudiosídeo AM também pode ser combinado com vários carboidratos. O termo "carboidrato" geralmente se refere a compostos de aldeído ou cetona substituídos por vários grupos hidroxila, da fórmula geral (CH2O)n, em que n é 3-30, bem como seus oligômeros e polímeros. Os carboidratos da presente invenção podem, além disso, ser substituídos ou desoxigenados em uma ou mais posições. Carboidratos, Como usado na presente invenção, abrangem carboidratos não modificados, derivados de carboidratos, carboidratos substituídos e carboidratos modificados. Como usado na presente invenção, as frases "derivados de carboidratos", "carboidratos substituídos" e "carboidratos modificados" são sinônimas.
Carboidrato modificado significa qualquer carboidrato em que pelo menos um átomo foi adicionado, removido ou substituído, ou as combinações dos mesmos. Assim, derivados de carboidratos ou carboidratos substituídos incluem monossacarídeos substituídos e não substituídos, dissacarídeos, oligossacarídeos e polissacarídeos. Os derivados de carboidratos ou carboidratos substituídos opcionalmente podem ser desoxigenados em qualquer posição C correspondente e/ou substituídos por uma ou mais porções, tais como hidrogênio, halogênio, haloalquila, carboxila, acila, acilóxi, amino, amido, derivados de carboxila, alquilamino, dialquilamino, arilamino, alcóxi, arilóxi, nitro, ciano, sulfo, mercapto, imino, sulfonila, sulfenila, sulfinila, sulfamoila, carboalcóxi, carboxamido, fosfonila, fosfinila, fosforila, fosfino, tioéster, tioéter, oximino, hidrazino, carbamila, fosfonato, ou qualquer outro grupo funcional viável desde o derivado de carboidrato ou funções de carboidrato substituído para melhorar o sabor adoçante da composição adoçante.
[0189] Exemplos de carboidratos que podem ser usados de acordo com esta invenção incluem, mas não estão limitados a, tagatose, trealose, galactose, ramnose, várias ciclodextrinas, oligossacarídeos cíclicos, vários tipos de maltodextrinas, dextrano, sacarose, glicose, ribulose, frutose, treose, arabinose, xilose, lixose, alose, altrose, manose, idose, lactose, maltose, açúcar invertido, isotrehalose, neotrehalose, isomaltulose, eritrose, desoxirribose, gulose, idose, talose, eritrulose, xilulose, psicopectose, turanose, celopiose glucosamina, manosamina, fucose, ácido glucurônico, ácido glucônico, glucono-lactona, abequose, galactosamina, oligossacarídeos de beterraba, isomalto-oligossacarídeos (isomaltose, isomaltotriose, panose e semelhantes), xilo-oligossacarídeos (xilotriose, xilobiose e semelhantes) xilo-oligossacarídeos terminados, gentio-oligossacarídeos (gentiobiose, gentiotriose, gentiotetraose e semelhantes), sorbose, nigero-oligossacarídeos, palatinose oligossacarídeos, frutooligossacarídeos arides (cestose, nistose e semelhantes), maltotetraol, maltotriol, malto-oligossacarídeos (maltotriose, maltotetraose,
maltopentaose, maltohexaose, maltoheptaose e semelhantes), amido, inulina, inulo- oligossacarídeos, lactose, melibiose líquida, rafmose açúcares, como xaropes de milho com alto teor de frutose, açúcares de acoplamento e oligossacarídeos de soja. Além disso, os carboidratos, conforme usados pelo presente documento, podem estar na configuração D ou L.
[0190] Glicosídeo(s) alvo(s) altamente purificado(s), particularmente esteviolmonosídeo, esteviolmonosídeo A, esteviolbiosídeo, esteviolbiosídeo A, esteviolbiosídeo B, rubusosídeo, esteviosídeo, esteviosídeo A (rebaudiosídeo KA), esteviosídeo B, esteviosídeo C, rebaudiosídeo E, rebaudiosídeo E2, rebaudiosídeo E3 e/ou rebaudiosídeo AM obtido de acordo com esta invenção pode ser usado em combinação com várias substâncias fisiologicamente ativas ou ingredientes funcionais. Os ingredientes funcionais geralmente são classificados em categorias como carotenoides, fibra alimentar, ácidos graxos, saponinas, antioxidantes, nutracêuticos, flavonóides, isotiocianatos, fenóis, esteróis vegetais e estanóis (fitoesteróis e fitoestanóis); polióis; prebióticos, probióticos; fitoestrogênios; proteína de soja; sulfuretos/tióis; aminoácidos; proteínas; vitaminas; e minerais. Ingredientes funcionais também podem ser classificados com base em seus benefícios à saúde, como cardiovasculares, redutores do colesterol e anti-inflamatórios. Ingredientes funcionais exemplificadores são fornecidos no documento WO2013/096420, o conteúdo do qual é incorporado por referência pelo presente documento.
[0191] Glicosídeo(s) de esteviol alvo(s) altamente purificado(s), particularmente esteviolmonosídeo, esteviolmonosídeo A, esteviolbiosídeo, esteviolbiosídeo A, esteviolbiosídeo B, rubusosídeo, esteviosídeo, esteviosídeo A (rebaudiosídeo KA), esteviosídeo B, esteviosídeo C, rebaudiosídeo E, rebaudiosídeo E2, rebaudiosídeo E3 e/ou rebaudiosídeo AM obtido de acordo com esta invenção pode ser aplicado como um adoçante de alta intensidade para produzir bebidas com zero calorias, calorias reduzidas ou diabéticas e produtos alimentícios com características de sabor intensificadas. Também pode ser usado em bebidas, alimentos, produtos farmacêuticos e outros produtos nos quais o açúcar não pode ser usado. Além disso, Glicosídeo(s) de esteviol alvo(s) altamente purificado(s), particularmente esteviolmonosídeo, esteviolmonosídeo A, esteviolbiosídeo, esteviolbiosídeo A, esteviolbiosídeo B, rubusosídeo, esteviosídeo, esteviosídeo A (rebaudiosídeo KA), esteviosídeo B, esteviosídeo C, rebaudiosídeo E, rebaudiosídeo E2, rebaudiosídeo E3 e/ou rebaudiosídeo AM pode ser usado como adoçante não só para bebidas, alimentos e outros produtos destinados ao consumo humano, mas também em rações e forragens com características intensificadas.
[0192] Glicosídeo(s) de esteviol alvo(s) altamente purificado(s), particularmente esteviolmonosídeo, esteviolmonosídeo A, esteviolbiosídeo, esteviolbiosídeo A, esteviolbiosídeo B, rubusosídeo, esteviosídeo, esteviosídeo A (rebaudiosídeo KA), esteviosídeo B, esteviosídeo C, rebaudiosídeo E, rebaudiosídeo E2, rebaudiosídeo E3 e/ou rebaudiosídeo AM obtido de acordo com esta invenção pode ser aplicado como um modificador de sabor para produzir zero calorias, calorias reduzidas ou bebidas para diabéticos e produtos alimentícios com sabor modificado. Quando usado como um modificador de sabor, ou um sabor com propriedades modificadoras (FMP), o glicosídeo de esteviol alvo altamente purificado é usado em um produto consumível abaixo do nível de detecção do modificador de sabor ou FMP. O modificador de sabor ou FMP, portanto, não confere um sabor ou sabor detectável próprio ao produto consumível, mas em vez disso, serve para modificar a detecção do consumidor de sabores e/ou sabores de outros ingredientes no produto consumível. Um exemplo de modificação de sabor e gosto é o aumento da doçura, em que o modificador de sabor ou o próprio FMP não contribui para a doçura do produto consumível, mas intensifica a qualidade da doçura provada pelo consumidor.
[0193] Exemplos de produtos consumíveis em que Glicosídeo(s) de esteviol alvo(s) altamente purificado(s), particularmente esteviolmonosídeo,
esteviolmonosídeo A, esteviolbiosídeo, esteviolbiosídeo A, esteviolbiosídeo B, rubusosídeo, esteviosídeo, esteviosídeo A (rebaudiosídeo KA), esteviosídeo B, esteviosídeo C, rebaudiosídeo E, rebaudiosídeo E2, rebaudiosídeo E3 e/ou rebaudiosídeo AM pode ser usado como um modificador de sabor ou sabor com propriedades modificadoras incluem, mas não estão limitados a, bebidas alcoólicas como vodka, vinho, cerveja, licor e saquê, etc.; sucos naturais; bebidas refrescantes; refrigerantes carbonatados; bebidas dietéticas; bebidas com zero calorias; bebidas e alimentos com redução de calorias; bebidas à base de iogurte; sucos instantâneos; café instantâneo; tipos de bebidas instantâneas em pó; produtos enlatados; xaropes; pasta de soja fermentada; molho de soja; vinagre; curativos; maionese; ketchups; Curry; sopa; caldo instantâneo; molho de soja em pó; vinagre em pó; tipos de biscoitos; biscoito de arroz; biscoitos; pão; chocolates; caramelo; doce; goma de mascar; geleia; pudim; frutas e vegetais em conserva; natas frescas; geleia; marmelada; pasta de flores; leite em pó; sorvete; sorvete; vegetais e frutas embalados em garrafas; feijão enlatado e cozido; carne e alimentos cozidos em molho adoçado; produtos alimentares vegetais agrícolas; frutos do mar; presunto; linguiça; presunto de peixe; salsicha de peixe; pasta de peixe; produtos de peixe frito; produtos secos do mar; produtos alimentares congelados; algas marinhas preservadas; carne em conserva; tabaco; medicamentos; e muitos outros. Em princípio, ele pode ter aplicações ilimitadas.
[0194] Glicosídeo(s) de esteviol alvo(s) altamente purificado(s), particularmente esteviolmonosídeo, esteviolmonosídeo A, esteviolbiosídeo, esteviolbiosídeo A, esteviolbiosídeo B, rubusosídeo, esteviosídeo, esteviosídeo A (rebaudiosídeo KA), esteviosídeo B, esteviosídeo C, rebaudiosídeo E, rebaudiosídeo E2, rebaudiosídeo E3 e/ou rebaudiosídeo AM obtido de acordo com esta invenção pode ser aplicado como um supressor de formação de espuma para produzir bebidas e produtos alimentares com zero caloria, calorias reduzidas ou diabéticas.
[0195] Exemplos de produtos consumíveis em que Glicosídeo(s) de esteviol alvo(s) altamente purificado(s), particularmente esteviolmonosídeo, esteviolmonosídeo A, esteviolbiosídeo, esteviolbiosídeo A, esteviolbiosídeo B, rubusosídeo, esteviosídeo, esteviosídeo A (rebaudiosídeo KA), esteviosídeo B, esteviosídeo C, rebaudiosídeo E, rebaudiosídeo E2, rebaudiosídeo E3 e/ou rebaudiosídeo AM pode ser usado como um composto adoçante incluem, mas não estão limitados a, bebidas alcoólicas como vodka, vinho, cerveja, licor e saquê, etc.; sucos naturais; bebidas refrescantes; refrigerantes carbonatados; bebidas dietéticas; bebidas com zero calorias; bebidas e alimentos com redução de calorias; bebidas à base de iogurte; sucos instantâneos; café instantâneo; tipos de bebidas instantâneas em pó; produtos enlatados; xaropes; pasta de soja fermentada; molho de soja; vinagre; curativos; maionese; ketchups; Curry; sopa; caldo instantâneo; molho de soja em pó; vinagre em pó; tipos de biscoitos; biscoito de arroz; biscoitos; pão; chocolates; caramelo; doce; goma de mascar; geleia; pudim; frutas e vegetais em conserva; natas frescas; geleia; marmelada; pasta de flores; leite em pó; sorvete; sorvete; vegetais e frutas embalados em garrafas; feijão enlatado e cozido; carne e alimentos cozidos em molho adoçado; produtos alimentares vegetais agrícolas; frutos do mar; presunto; linguiça; presunto de peixe; salsicha de peixe; pasta de peixe; produtos de peixe frito; produtos secos do mar; produtos alimentares congelados; algas marinhas preservadas; carne em conserva; tabaco; medicamentos; e muitos outros. Em princípio, ele pode ter aplicações ilimitadas.
[0196] Durante a fabricação de produtos como alimentos, bebidas, produtos farmacêuticos, cosméticos, produtos de mesa e goma de mascar, os métodos convencionais, tais como mistura, amassamento, dissolução, decapagem, permeação, percolação, aspersão, atomização, infusão e outros métodos podem ser usados.
[0197] Além disso, o(s) glicosídeo(s) de esteviol alvo altamente purificado(s)
esteviolmonosídeo, esteviolmonosídeo A, esteviolbiosídeo, esteviolbiosídeo A, esteviolbiosídeo B, rubusosídeo, esteviosídeo, esteviosídeo A (rebaudiosídeo KA), esteviosídeo B, esteviosídeo C, rebaudiosídeo E, rebaudiosídeo E2, rebaudiosídeo E3 e/ou rebaudiosídeo AM obtido nesta invenção pode ser usado na forma seca ou líquida.
[0198] O glicosídeo de esteviol alvo altamente purificado pode ser adicionado antes ou depois do tratamento térmico de produtos alimentícios. A quantidade de Glicosídeo(s) de esteviol alvo(s) altamente purificado(s), particularmente esteviolmonosídeo A, esteviolbiosídeo, esteviolbiosídeo A, esteviolbiosídeo B, rubusosídeo, esteviosídeo, esteviosídeo A (rebaudiosídeo KA), esteviosídeo B, esteviosídeo C, rebaudiosídeo E, rebaudiosídeo E2, rebaudiosídeo E3 e/ou rebaudiosídeo AM depende da finalidade do uso. Conforme discutido acima, pode ser adicionado sozinho ou em combinação com outros compostos.
[0199] A presente invenção também é direcionada à intensificação da doçura em bebidas usando esteviolmonosídeo, esteviolmonosídeo A, esteviolbiosídeo, esteviolbiosídeo A, esteviolbiosídeo B, rubusosídeo, esteviosídeo, esteviosídeo A (rebaudiosídeo KA), esteviosídeo B, esteviosídeo C, rebaudiosídeo E, rebaudiosídeo E2, rebaudiosídeo E3 e/ou rebaudiosídeo AM. Consequentemente, a presente invenção fornece uma bebida compreendendo um adoçante e esteviolmonosídeo, esteviolmonosídeo A, esteviolbiosídeo, esteviolbiosídeo A, esteviolbiosídeo B, rubusosídeo, esteviosídeo, esteviosídeo A (rebaudiosídeo KA), esteviosídeo B, esteviosídeo C, rebaudiosídeo E, rebaudiosídeo E2, rebaudiosídeo E3 ou e/ou rebaudiosídeo AM como um intensificador de doçura, em que esteviolmonosídeo A, esteviolbiosídeo, esteviolbiosídeo A, esteviolbiosídeo B, rubiosídeo, esteviosídeo A), esteviosídeo B, esteviosídeo C, rebaudiosídeo E, rebaudiosídeo E2, rebaudiosídeo E3 e/ou rebaudiosídeo AM estão presentes em uma concentração igual ou abaixo de seus respectivos limites de reconhecimento de doçura.
[0200] Como usado na presente invenção, o termo "intensificador de doçura" se refere a um composto capaz de aumentar ou intensificar a percepção do sabor doce em uma composição, como uma bebida. O termo "intensificador de doçura" é sinônimo dos termos "potencializador de sabor doce", "potencializador de doçura", "amplificador de doçura" e "intensificador de doçura". O termo "concentração limite de reconhecimento de doçura", como geralmente usado pelo presente documento, é a menor concentração conhecida de um composto doce que é perceptível pelo sentido do paladar humano, normalmente em torno de 1,0% de equivalência de sacarose (1,0% SE). Em geral, os intensificadores de doçura podem intensificar ou potencializar o sabor doce de adoçantes sem fornecer qualquer sabor doce perceptível por si próprios, quando presentes em ou abaixo da concentração limite de reconhecimento de doçura de um determinado intensificador de doçura; no entanto, os intensificadores de doçura podem fornecer o sabor doce em concentrações acima de sua concentração limite de reconhecimento de doçura. A concentração limite de reconhecimento de doçura é específica para um intensificador particular e pode variar com base na matriz da bebida. A concentração limite de reconhecimento de doçura pode ser facilmente determinada por testes de sabor, aumentando as concentrações de um determinado intensificador até ser detectada uma equivalência de sacarose superior a 1,0% em uma determinada matriz de bebida. A concentração que fornece cerca de 1,0% de equivalência de sacarose é considerada o limite de reconhecimento de doçura.
[0201] Em algumas modalidades, o adoçante está presente na bebida em uma quantidade de cerca de 0,5% a cerca de 12% em peso, tal como, por exemplo, cerca de 1,0% em peso, cerca de 1,5% em peso, cerca de 2,0% em peso, cerca de 2,5 % em peso, cerca de 3,0% em peso, cerca de 3,5% em peso, cerca de 4,0% em peso, cerca de 4,5% em peso, cerca de 5,0% em peso, cerca de 5,5% em peso, cerca de 6,0% em peso, cerca de 6,5% em peso, cerca de 7,0% em peso, cerca de 7,5%
em peso, cerca de 8,0% em peso, cerca de 8,5% em peso, cerca de 9,0% em peso, cerca de 9,5% em peso, cerca de 10,0% em peso, cerca de 10,5% em peso, cerca de 11,0% em peso, cerca de 1,15% em peso ou cerca de 12,0% em peso.
[0202] Em uma modalidade particular, o adoçante está presente na bebida em uma quantidade de cerca de 0,5% a cerca de 10%, tal como, por exemplo, de cerca de 2% a cerca de 8%, de cerca de 3% a cerca de 7% ou de cerca de 4 % a cerca de 6% em peso. Em uma modalidade particular, o adoçante está presente na bebida em uma quantidade de cerca de 0,5% a cerca de 8% em peso. Em outra modalidade particular, o adoçante está presente na bebida em uma quantidade de cerca de 2% a cerca de 8% em peso.
[0203] Em uma modalidade, o adoçante é um adoçante calórico tradicional. Adoçantes adequados incluem, mas não se limitam a sacarose, frutose, glicose, xarope de milho com alto teor de frutose e xarope de amido com alto teor de frutose.
[0204] Em outra modalidade, o adoçante é eritritol.
[0205] Em ainda outra modalidade, o adoçante é um açúcar raro. Açúcares raros adequados incluem, mas não se limitam a, D-alose, D-psicose, D-ribose, D- tagatose, L-glicose, L-fucose, L-arabinose, D-turanose, D-leucrose e as combinações dos mesmos.
[0206] É contemplado que um adoçante pode ser usado sozinho ou em combinação com outros adoçantes.
[0207] Em uma modalidade, o açúcar raro é D-alose. Em uma modalidade mais particular, a D-alose está presente na bebida em uma quantidade de cerca de 0,5% a cerca de 10% em peso, tal como, por exemplo, de cerca de 2% a cerca de 8%.
[0208] Em outra modalidade, o açúcar raro é D-psicose. Em uma modalidade mais particular, a D-psicose está presente na bebida em uma quantidade de cerca de 0,5% a cerca de 10% em peso, tal como, por exemplo, de cerca de 2% a cerca de 8%.
[0209] Em outra modalidade, o açúcar raro é D-ribose. Em uma modalidade mais particular, a D-ribose está presente na bebida em uma quantidade de cerca de 0,5% a cerca de 10% em peso, tal como, por exemplo, de cerca de 2% a cerca de 8%.
[0210] Em outra modalidade, o açúcar raro é D-tagatose. Em uma modalidade mais particular, a D-tagatose está presente na bebida em uma quantidade de cerca de 0,5% a cerca de 10% em peso, tal como, por exemplo, de cerca de 2% a cerca de 8%.
[0211] Em uma outra modalidade, o açúcar raro é L-glicose. Em uma modalidade mais particular, a L-glicose está presente na bebida em uma quantidade de cerca de 0,5% a cerca de 10% em peso, tal como, por exemplo, de cerca de 2% a cerca de 8%.
[0212] Em uma modalidade, o açúcar raro é L-fucose. Em uma modalidade mais particular, a L-fucose está presente na bebida em uma quantidade de cerca de 0,5% a cerca de 10% em peso, tal como, por exemplo, de cerca de 2% a cerca de 8%.
[0213] Em uma modalidade, o açúcar raro é L-arabinose. Em uma modalidade mais particular, a L-arabinose está presente na bebida em uma quantidade de cerca de 0,5% a cerca de 10% em peso, tal como, por exemplo, de cerca de 2% a cerca de 8%. Em outra modalidade, o açúcar raro é D-turanose. Em uma modalidade mais particular, a D-turanose está presente na bebida em uma quantidade de cerca de 0,5% a cerca de 10% em peso, tal como, por exemplo, de cerca de 2% a cerca de 8%.
[0214] Em ainda outra modalidade, o açúcar raro é D-leucrose. Em uma modalidade mais particular, a D-leucrose está presente na bebida em uma quantidade de cerca de 0,5% a cerca de 10% em peso, tal como, por exemplo, de cerca de 2% a cerca de 8%.
[0215] A adição do intensificador de doçura em uma concentração igual ou abaixo do seu limite de reconhecimento de doçura aumenta a equivalência de sacarose detectada da bebida que compreende o adoçante e o intensificador de doçura em comparação com uma bebida correspondente na ausência do intensificador de doçura. Além disso, a doçura pode ser intensificada em uma quantidade mais do que a doçura detectável de uma solução contendo a mesma concentração de pelo menos um intensificador de doçura na ausência de qualquer adoçante.
[0216] Consequentemente, a presente invenção também fornece um método para intensificar a doçura de uma bebida compreendendo um adoçante compreendendo o fornecimento de uma bebida compreendendo um adoçante e adicionar um intensificador de doçura selecionado de esteviolmonosídeo, esteviolmonosídeo A, esteviolbiosídeo, esteviolbiosídeo A, esteviolbiosídeo B, rubusosídeo, esteviosídeo, esteviosídeo A (rebaudiosídeo KA), esteviosídeo B, esteviosídeo C, rebaudiosídeo E, rebaudiosídeo E2, rebaudiosídeo E3 ou e/ou rebaudiosídeo AM ou uma combinação dos mesmos, em que esteviolmonosídeo A, esteviolbiosídeo, esteviolbiosídeo A, esteviolbiosídeo B, rubiosídeo, esteviosídeo A, esteviosídeo B, esteviosídeo C, rebaudiosídeo E, rebaudiosídeo E2, rebaudiosídeo E3 e/ou rebaudiosídeo AM estão presentes em uma concentração igual ou abaixo de seus limites de reconhecimento de doçura.
[0217] Adição de esteviolmonosídeo, esteviolmonosídeo A, esteviolbiosídeo, esteviolbiosídeo A, esteviolbiosídeo B, rubusosídeo, esteviosídeo, esteviosídeo A (rebaudiosídeo KA), esteviosídeo B, esteviosídeo C, rebaudiosídeo E, rebaudiosídeo E2, rebaudiosídeo E3 e/ou rebaudiosídeo AM em uma concentração igual ou abaixo do limite de reconhecimento de doçura para uma bebida contendo um adoçante pode aumentar a equivalência de sacarose detectada de cerca de 1,0% a cerca de 5,0%, tal como, por exemplo, cerca de 1,0%, cerca de 1,5%, cerca de 2,0%, cerca de 2,5%, cerca de 3,0%, cerca de 3,5%, cerca de 4,0%, cerca de 4,5% ou cerca de 5,0%
[0218] Os exemplos a seguir ilustram modalidades preferenciais da invenção para a preparação de Glicosídeo(s) de esteviol alvo(s) altamente purificado(s), particularmente esteviolmonosídeo, esteviolmonosídeo A, esteviolbiosídeo,
esteviolbiosídeo A, esteviolbiosídeo B, rubusosídeo, esteviosídeo, esteviosídeo A (rebaudiosídeo KA), esteviosídeo B, esteviosídeo C, rebaudiosídeo E, rebaudiosídeo E2, rebaudiosídeo E3 e/ou rebaudiosídeo AM. Será entendido que a invenção não se limita aos materiais, proporções, condições e procedimentos apresentados nos exemplos, que são apenas ilustrativos.
EXEMPLOS EXEMPLO 1 Sequências de proteínas de enzimas projetadas usadas no processo biocatalítico SEQ ID 1: > SuSy_At, variante PM1 -54-2 -E05 (sintase de sacarose manipulada; fonte do gene WT: Arabidopsis thaliana) SEQ ID 2: > UGTS12 variante 0234 (glucosiltransferase manipulada; fonte do gene WT: Solanum lycopersicum)
SEQ ID 3: > UGT76Gl variante 0042 (glucosiltransferase manipulada; fonte do gene WT: Stevia rebaudiand) EXEMPLO 2 Expressão e formulação da variante SuSy_At da SEQ ID 1
[0219] O gene que codifica para a variante SuSy_At de SEQ ID 1 (EXEMPLO 1) foi clonado no vetor de expressão pLElA17 (derivado de pRSF-lb, Novagen). O plasmídeo resultante foi usado para transformação de células E.coli BL21 (DE3).
[0220] As células foram cultivadas em meio ZYM505 (F. William Studier, Protein Expression and Purification 41 (2005) 207-234) suplementado com canamicina (50 mg /L) a 37°C. A expressão dos genes foi induzida na fase logarítmica por IPTG (0,2 mM) e realizada a 30°C e 200 rpm por 16-18 horas.
[0221] As células foram coletadas por centrifugação (3220 xg, 20 min, 4°C) e ressuspensas até uma densidade óptica de 200 (medida a 600 nm (OD6oo)) com tampão de lise celular (Tris-HCl 100 mM pH 7,0; MgCl2 mM, Nuclease de DNA 20 U/mL, lisozima 0,5 mg/mL). As células foram então interrompidas por sonicação e os extratos em bruto foram separados dos restos celulares por centrifugação (18000 xg 40 min, 4°C). O sobrenadante foi esterilizado por filtração em filtro de 0,2 µm e diluído 50:50 com água destilada, resultando em uma preparação enzimática ativa.
[0222] Para preparações ativas enzimáticas de SuSy_At, a atividade em unidades é definida como segue: 1 mU de SuSy_At transforma 1 nmol de sacarose em frutose em 1 minuto. As condições de reação para o ensaio são 30°C, tampão fosfato de potássio 50 mM pH 7,0, sacarose 400 mM a t0, MgCl2 3mM e difosfato de uridina (UDP) 15 mM. EXEMPLO 3 Expressão e formulação da variante UGTS12 de SEQ ID 2
[0223] O gene que codifica para a variante UGTS12 de SEQ ID 2 (EXEMPLO 1) foi clonado no vetor de expressão pLElAl7 (derivado de pRSF-lb, Novagen). O plasmídeo resultante foi usado para transformação de células E.coli BL2l (DE3).
[0224] As células foram cultivadas em meio ZYM505 (F. William Studier, Protein Expression and Purification 41 (2005) 207-234) suplementado com canamicina (50 mg /L) a 37°C. A expressão dos genes foi induzida na fase logarítmica por IPTG (0,1 mM) e realizada a 30°C e 200 rpm por 16-18 horas.
[0225] As células foram coletadas por centrifugação (3220 xg, 20 min, 4°C) e ressuspensas até uma densidade óptica de 200 (medida a 600 nm (OD6oo)) com tampão de lise celular (Tris-HCl 100 mM pH 7,0; MgCl2 mM, Nuclease de DNA 20 U/mL, lisozima 0,5 mg/mL). As células foram então interrompidas por sonicação e os extratos em bruto foram separados dos restos celulares por centrifugação (18000 xg 40 min, 4°C). O sobrenadante foi esterilizado por filtração através de um filtro de 0,2 μm e diluído 50:50 com solução de sacarose 1 M, resultando em uma preparação enzimática ativa.
[0226] Para preparações ativas enzimáticas de UGTS12, a atividade em unidades é definida como segue: 1 mU de UGTS12 transforma 1 nmol de rebaudiosídeo A (RebA) em rebaudiosídeo D (Reb D) em 1 minuto. As condições de reação para o ensaio são 30 °C, tampão de fosfato de potássio 50 mM pH 7,0, RebA 10 mM a t0, sacarose 500 mM, MgCl2 3 mM, difosfato de uridina (UDP) 0,25 mM e 3
U/mL de SuSy_At. EXEMPLO 4 Expressão e formulação da variante UGT76G1 de SEQ ID 3
[0227] O gene que codifica para a variante UGT76G1 de SEQ ID 3 (EXEMPLO 1) foi clonado no vetor de expressão pLElAl7 (derivado de pRSF-lb, Novagen). O plasmídeo resultante foi usado para transformação de células E.coli BL21 (DE3).
[0228] As células foram cultivadas em meio ZYM505 (F. William Studier, Protein Expression and Purification 41 (2005) 207-234) suplementado com canamicina (50 mg /L) a 37°C. A expressão dos genes foi induzida na fase logarítmica por IPTG (0,1 mM) e realizada a 30°C e 200 rpm por 16-18 horas.
[0229] As células foram coletadas por centrifugação (3220 xg, 20 min, 4°C) e ressuspensas até uma densidade óptica de 200 (medida a 600 nm (OD6oo)) com tampão de lise celular (Tris-HCl 100 mM pH 7,0; MgCl2 mM, Nuclease de DNA 20 U/mL, lisozima 0,5 mg/mL). As células foram então interrompidas por sonicação e os extratos em bruto foram separados dos restos celulares por centrifugação (18000 xg 40 min, 4°C). O sobrenadante foi esterilizado por filtração através de um filtro de 0,2 μm e diluído 50:50 com solução de sacarose 1 M, resultando em uma preparação enzimática ativa.
[0230] Para preparações ativas enzimáticas de UGT76G1, a atividade em unidades é definida como segue: 1 mU de UGT76G1 transforma 1 nmol de rebaudiosídeo D (RebD) em rebaudiosídeo M (Reb M) em 1 minuto. As condições de reação para o ensaio são 30 °C, tampão de fosfato de potássio 50 mM pH 7,0, RebA 10 mM a t0, sacarose 500 mM, MgCl2 3 mM, difosfato de uridina (UDP) 0,25 mM e 3 U/mL de SuSy_At. EXEMPLO 5 Síntese de rebaudiosídeo AM a partir de esteviosídeo em uma reação de um único recipiente, adicionando UGTSI2, SuSy_At e UGT76G1 ao mesmo tempo
[0231] O rebaudiosídeo AM (reb AM ) foi sintetizado diretamente a partir do esteviosídeo em uma reação de um único recipiente (Fig. 3), utilizando as três enzimas (ver EXEMPLOS 1, 2, 3 e 4): UGTS12 (variante de SEQ ID 2), SuSy_At- (variante de SEQ ID 1) e UGT76G1 (variante de SEQ ID 3). A solução de reação final continha 105 U/L de UGTS12, 405 U/L de SuSy_At, 3 U/L de UGT76G1, esteviosídeo 5 mM, difosfato de uridina 0,25 mM (UDP), sacarose 1 M, MgCl2 4 mM e tampão de fosfato de potássio (pH 6,6). Primeiro, 207 mL de água destilada foram misturados com 0,24 g de MgCl2.6H20, 103 g de sacarose, 9,9 mL de tampão de fosfato de potássio 1,5 M (pH 6,6) e 15 g de esteviosídeo. Após a dissolução dos componentes, a temperatura foi ajustada para 45°C e foram adicionados UGTS12, SuSy_At, UGT76G1 e 39 mg de UDP. A mistura de reação foi incubada num agitador a 45°C durante 24 horas. 39 mg adicionais de UDP foram adicionados às 8 horas e 18 horas. O conteúdo de reb AM, reb E, esteviosídeo, reb M, reb B, esteviolbiosídeo e reb/em vários pontos no tempo foi analisado por HPLC.
[0232] Para análise, as amostras de biotransformação foram inativadas ajustando a mistura de reação para pH 5,5 usando H3PO4 a 17% e então fervidas por 10 minutos. As amostras resultantes foram filtradas, os filtrados foram diluídos 10 vezes e usados como amostras para análise por HPLC. O ensaio de HPLC foi realizado no sistema HPLC Agilent HP 1200, composto por uma bomba, um termostato de coluna, um amostrador automático, um detector de UV com capacidade de correção de fundo e um sistema de aquisição de dados. Os analitos foram separados usando Agilent Poroshell 120 SB-Cl 8, 4,6 mm x 150 mm, 2,7 μm a 40°C. A fase móvel consistia em duas pré-misturas: - pré-mistura 1 contendo 75% de tampão fosfato 10 mM (pH 2,6) e 25% de acetonitrila, e - pré-mistura 2 contendo 68% de tampão fosfato 10 mM (pH 2,6) e 32% de acetonitrila.
[0233] O gradiente de eluição começou com a pré-mistura 1, mudou para a pré-mistura 2 a 50% aos 12,5 minutos, mudou para a pré-mistura 2 a 100% aos 13 minutos. O tempo total de execução foi de 45 minutos. A temperatura da coluna foi mantida a 40°C. O volume de injeção foi de 5 µL. As espécies de rebaudiosídeo foram detectadas por UV a 210 nm.
[0234] A Tabela 3 mostra para cada ponto de tempo a conversão de esteviosídeo em espécies identificadas de rebaudiosídeo (porcentagem de área). Os cromatogramas de esteviosídeo e da mistura de reação em 24 horas são mostrados na Fig. 5 e na Fig. 6, respectivamente. Aqueles versados na técnica apreciarão que os tempos de retenção podem, ocasionalmente, variar com mudanças no solvente e/ou equipamento.
Tabela 3 Biotransformação de esteviosídeo em reb AM Tempo, % de conversão de esteviosídeo h Reb Reb Reb Reb Esteviosídeo Reb Esteviolbiosídeo
E AM M I B 0 0 0 0 0 0 0 0 6 1,9 35,9 1,3 1,7 58,7 0,0 0,4 18 0,9 96,7 1,6 0,6 0,0 0,0 0,4 24 0,3 96,4 2,1 0,7 0,0 0,2 0,4 EXEMPLO 6 Síntese de rebaudiosídeo AM a partir de rebaudiosídeo E em uma reação de um único recipiente, SuSy At e UGT76G1 ao mesmo tempo
[0235] O rebaudiosídeo AM (reb AM ) foi sintetizado diretamente a partir do rebaudiosídeo E (reb E) em uma reação de um único recipiente (Fig. 4), utilizando as duas enzimas (ver EXEMPLOS 1, 2 e 4): SuSy_At- (variante de SEQ ID 1) e UGT76G1
(variante de SEQ ID 3). A solução de reação final continha 405 U/L de SuSy_At, 3 U/L de UGT76G1, 5 mM de reb E, 0,25 mM de difosfato de uridina (UDP), 1 M de sacarose, 4 mM de MgCl2.6H2O e tampão de fosfato de potássio (pH 6,6). Primeiro, 37 mL de água destilada foram misturados com 40,3 mg de MgCl2, 17,12 g de sacarose, 1,65 mL de tampão de fosfato de potássio 1,5 M (pH 6,6) e 5,04 g reb E. Depois de dissolver os componentes, a temperatura foi ajustada para 45°C e SuSy_At, UGT76G1 e 6,5 mg de UDP foram adicionados. A mistura de reação foi incubada num agitador a 45°C durante 24 horas. 6,5 mg adicionais de UDP foram adicionados às 8 horas e 18 horas. O conteúdo de reb AM, reb E, esteviosídeo, reb A, reb M, reb B e esteviolbiosídeo em vários momentos foi analisado por HPLC.
[0236] Para análise, as amostras de biotransformação foram inativadas ajustando a mistura de reação para pH 5,5 usando H3PO4 a 17% e então fervidas por 10 minutos. As amostras resultantes foram filtradas, os filtrados foram diluídos 10 vezes e usados como amostras para análise por HPLC. O ensaio de HPLC foi realizado no sistema HPLC Agilent HP 1200, composto por uma bomba, um termostato de coluna, um amostrador automático, um detector de UV com capacidade de correção de fundo e um sistema de aquisição de dados. Os analitos foram separados usando Agilent Poroshell 120 SB-Cl 8, 4,6 mm x 150 mm, 2,7 μm a 40°C. A fase móvel consistia em duas pré-misturas: - pré-mistura 1 contendo 75% de tampão fosfato 10 mM (pH 2,6) e 25% de acetonitrila, e - pré-mistura 2 contendo 68% de tampão fosfato 10 mM (pH 2,6) e 32% de acetonitrila.
[0237] O gradiente de eluição começou com a pré-mistura 1, mudou para a pré-mistura 2 a 50% aos 12,5 minutos, mudou para a pré-mistura 2 a 100% aos 13 minutos. O tempo total de execução foi de 45 minutos. A temperatura da coluna foi mantida a 40°C. O volume de injeção foi de 5 µL. As espécies de rebaudiosídeo foram detectadas por UV a 210 nm.
[0238] A Tabela 4 mostra para cada ponto de tempo a conversão de reb E em espécies identificadas de rebaudiosídeo (porcentagem de área). Os cromatogramas de reb E e da mistura de reação em 24 horas são mostrados na Fig. 7 e na Fig. 8, respectivamente. Aqueles versados na técnica apreciarão que os tempos de retenção podem, ocasionalmente, variar com mudanças no solvente e/ou equipamento. Tabela 4 Biotransformação de reb E para reb AM Tempo, % de conversão de Reb B h Reb E Reb Reb M Reb A Estevio Reb Esteviolbiosídeo AM sídeo B 0 99,46 0 0 0,54 0 0 0 4 40,75 57,92 0 0,59 0 0,73 0 7 24,79 73,92 0 0,58 0 0,71 0 24 4,38 94,33 0 0,59 0 0,70 0 EXEMPLO 7 Purificação de rebaudiosídeo AM
[0239] A mistura de reação do EXEMPLO 5, após 24 horas, foi inativada ajustando o pH a pH 5,5 com H3PO4 e depois fervida durante 10 minutos. Após fervura, a mistura de reação foi filtrada e diluída com água RO para um teor de sólidos de 5%. A solução diluída foi passada através de uma coluna de 1L empacotada com resina de adsorção macroporosa YWD03 (Cangzhou Yuanwei, China). Os glicosídeos de esteviol adsorvidos foram eluídos com 5L de etanol a 70%. O eluato obtido foi evaporado até à secura para produzir 16 g de pó seco que foi dissolvido em 80 mL de metanol a 70%. A solução foi cristalizada a 20°C durante 3 dias. Os cristais foram separados por filtração e secos em forno a vácuo a 80°C durante 18 horas para render 10,4 g de cristais de reb AM puros com 95,92% de pureza, determinado por ensaio de HPLC. O cromatograma de reb AM é mostrado na Fig. 9. Aqueles versados na técnica apreciarão que os tempos de retenção podem, ocasionalmente, variar com mudanças no solvente e/ou equipamento.
EXEMPLO 8 Elucidação da estrutura de rebaudiosídeo AM
[0240] Os experimentos de NMR foram realizados em um espectrômetro Bruker 500 MHz, com a amostra dissolvida em piridina-d5. Juntamente com os sinais da amostra, os sinais de piridina-d5 a δC 123,5, 135,5, 149,9 ppm e δH 7,19, 7,55, 8,71 ppm foram observados.
[0241] O espectro de 1H-NMR de rebaudiosídeo AM em piridina-d5 revela a excelente qualidade da amostra (ver Fig. 10). O HSQC (ver Fig. 11) mostra a presença de um grupo exo-metileno na região do açúcar com um acoplamento de longo alcance ao C-15, observável no H, H-COSY (Fig. 12). Outros sinais de campo profundo dos carbonos quaternários (C-13, C-16 e C-19) são detectados pelo HMBC (Fig. 13). A correlação dos sinais no HSQC, HMBC e H, H-COSY revelam a presença de glicosídeo de esteviol com a seguinte estrutura de aglicona:
[0242] A correlação de sinais HSQC e HMBC revela cinco sinais anoméricos. A constante de acoplamento dos prótons anoméricos de cerca de 8 Hz e os sinais amplos de sua ligação de açúcar permitem a identificação desses cinco açúcares como β-D-glucopiranosídeos.
[0243] A observação dos prótons anoméricos em combinação com HSQC e HMBC revela a ligação do açúcar e a correlação com a aglicona. A atribuição da sequência de açúcar foi confirmada usando a combinação de HSQC-TOCSY (Fig. 14) e HSQC.
[0244] Os experimentos de NMR acima foram aplicados para atribuir os deslocamentos químicos dos prótons e carbonos, principais constantes de acoplamento e principais correlações de HMBC (ver Tabela 5). Tabela 5
Posição δc [ppm] δH [ppm] J [Hz] HMBC (H→C) Porção de Aglicona 0,68 m 1 39,9 t 1,64 m 1,39 m 2 19,4 t 2,08 m 1,05 m 3 37,4 t 2,80 m 4 44,2 s - 5 57,3 d 0,95 m 1,90 m 6 21,7 t 2,12 m 1,26 m 7 41,0 t 1,38 m 8 41,9 s - 9 53,3 d 0,85 m 10 39,2 s 1,59 m 11 20,1 t 1,61 m 1,65 m 12 36,9 t 1,92 m 13 85,9 s - 1,78 d 11,0 14 43,8 t 2,52 d 11,0 2,00 d 16,0 15 47,4 t 7, 8, 9, 14 2,06 d 16,0 16 154,6 s - 5,03 br s 17 104,3 t 13, 15, 16 5,71 br s 18 28,5 q 1,40 s 3,4, 5, 19 19 175,2 s - 20 16,2 q 1,06 s 1,5,9, 10
Tabela 5 (continuação) Mudanças químicas de rebaudiosídeo AM
Posição δc [ppm] δc [ppm] J [Hz] HMBC (H→C) Porção de açúcar Açúcar I: β-D-Glucopiranosídeo 11 97,5 J 5,13 d 7,7 13 21 84,0 d 4,14 m 1 3 77,6 d 4,20 m 41 71,3 d 4,19 m 1 5 77,6 d 3,70 m 61 62,0 t 4,23 m 4,32 m Açúcar II: β-D-Glucopiranosídeo 1II 106,3 </' 5.26 d 8,0 21
II 2 76,8 d 4,13 m 3" 77,3 d 4,21 m 4 II 71,6 J 4,18 m
II 5 77,9 c/ 3,91 m 6 II 62,4 t 4,29 m 4,41 m Açúcar III: β-D-Glucopiranosídeo l III 92,9 d 6.20 d 8,1 19
III 2 77,0 d 4,46 m
III 3 88,1 d 4,24 m 4 III 69,0 d 4,12 m
III 5 78,4 d 3,82 m 6' III 61,3 t 4,20 m 4,33 m Açúcar VI: β-D-Glucopiranosídeo 1 IV 103,4 d 5,73 d 7,7 2111
IV 2 . 75,4 d 3,98 m 3 IV 78,1 d 4,09 m 4 IV 72,6 d 4,08 m
IV 5 77,4 d 3,92 m 6iv 62,9 t 4,32 m 4,51 m Açúcar V: β-D-Glucopiranosídeo 1V 104,4 d 5,29 d 8,1 3111 2V 75,1 d 4,00 m 3V 78,2 d 4,24 m 4V 71,4 d 4,27 m 5V 78,2 d 3,99 m 6V 61,9 t 4,27 m 4,48 m
[0245] A correlação de todos os dados de NMR indica rebaudiosídeo AM com cinco β-D-glucopiranoses ligadas a uma aglicona de esteviol, conforme representado com a seguinte estrutura química:
[0246] A fórmula química do rebaudiosídeo AM é C50H80O28, que corresponde a uma massa molecular monoisotópica calculada de 1128,5. Para a análise de LCMS, o rebaudiosídeo AM foi dissolvido em metanol e analisado usando o instrumento Shimadzu Nexera 2020 UFLC LCMS em uma coluna Cortecs UPLC Cl 8 1,6µm, 50 x 2,1 mm.
O resultado de LCMS (modo ESI negativo) observado de 1127,3 (ver Fig. 15a e Fig. 15b respectivamente) é consistente com rebaudiosídeo AM e corresponde ao íon (M-FI).

Claims (14)

REIVINDICAÇÕES
1. Rebaudiosídeo AM CARACTERIZADO pelo fato de que tem a fórmula:
2. Método para a produção de um rebaudiosídeo AM altamente purificado, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende as etapas de: a. fornecer uma composição de partida compreendendo um composto orgânico com pelo menos um átomo de carbono; b. fornecer um biocatalisador selecionado do grupo que consiste em uma preparação de enzima, uma célula ou um microrganismo; o dito biocatalisador compreendendo pelo menos uma enzima capaz de converter a composição de partida em rebaudiosídeo AM; e. contatar o biocatalisador com um meio contendo a composição de partida para produzir um meio compreendendo rebaudiosídeo AM.
3. Método, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende adicionalmente a etapa de: d. separar o rebaudiosídeo AM do meio para fornecer uma composição de rebaudiosídeo AM altamente purificada.
4. Método, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que a composição de partida é selecionada a partir do grupo que consiste em esteviol, esteviolmonosídeo, esteviolmonosídeo A, esteviolbiosídeo, esteviolbiosídeo A,
esteviolbiosídeo B, rubusosídeo, esteviosídeo, esteviosídeo A (rebaudiosídeo KA), esteviosídeo B, esteviosídeo C, rebaudiosídeo E, rebaudiosídeo E2, rebaudiosídeo E3, outros glicosídeos de esteviol, polióis, carboidratos e combinações dos mesmos.
5. Método, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que o microrganismo é selecionado do grupo que consiste em E. coli, Saccharomyces sp., Aspergillus sp., Pichia sp., Bacillus sp. e Yarrowia sp.
6. Método, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que a enzima é selecionada a partir do grupo que consiste em: uma enzima de biossíntese de esteviol, uma glucosiltransferase UDP, uma enzima de reciclagem de glicose UDP, uma enzima da via de mevalonato (MVA), uma enzima da via de 2-C- metil-D-eritritol-4-fosfato (MEP/DOXP), geranilgeranil difosfato sintase, copalil difosfato sintase, caureno sintase, caureno oxidase, ácido 13-hidroxilase caurenoico (KAH), esteviol sintetase, desoxixilulose 5-fosfato sintase (DXR), D-1-desoxixilulose 5-fosfato reductoisomerase (DXR), 4-difosfocitidil-2-C-metil-D eritritol sintase (CMS), 4-difosfocitidil-2-C-metil-D-eritritol quinase (CMK), 4-difosfocitidil-2-C-metil-D-eritritol 2,4-ciclodifosfato sintase (MCS), 1-hidróxi-2-metil-2(E)-butenil 4-difosfato sintase (HDS), 1-hidróxi-2-metil-2(E)-butenil 4-difosfato redutase (HDR), acetoacetil-CoA tiolase, HMG-CoA redutase truncada, mevalonato quinase, fosfomevalonato quinase, mevalonato pirofosfato decarboxilase, citocromo P450 redutase, UGT74G1, UGT85C2, UGT91D2, EUGT11, UGTS12, UGT76G1 ou variante mutante dos mesmos com > 85% de identidade de sequência de aminoácidos, > 86% de identidade de sequência de aminoácidos, > 87% de identidade de sequência de aminoácidos, > 88% de identidade de sequência de aminoácidos, > 89% de identidade de sequência de aminoácidos, > 90% de identidade de sequência de aminoácidos, > 91% de identidade de sequência de aminoácidos, > 92% de identidade de sequência de aminoácidos, > 93% de identidade de sequência de aminoácidos, > 94% de identidade de sequência de aminoácidos, > 95% de identidade de sequência de aminoácidos, >
96% de identidade de sequência de aminoácidos, > 97% de identidade de sequência de aminoácidos, > 98% de identidade de sequência de aminoácidos, > 99% de identidade de sequência de aminoácidos; e combinações dos mesmos.
7. Método, de acordo com a reivindicação 3, CARACTERIZADO pelo fato de que o teor de rebaudiosídeo AM na composição de rebaudiosídeo AM altamente purificada é maior do que cerca de 95% em peso em uma base seca.
8. Produto consumível que compreende o rebaudiosídeo AM, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o produto é selecionado a partir do grupo que consiste em um alimento, uma bebida, uma composição farmacêutica, um produto de tabaco, uma composição nutracêutica, uma composição de higiene oral e uma composição cosmética.
9. Produto consumível, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende adicionalmente pelo menos um aditivo selecionado a partir do grupo que consiste em carboidratos, polióis, aminoácidos e seus sais, poli- aminoácidos e seus sais correspondentes, ácidos de açúcar e seus sais correspondentes, nucleotídeos, ácidos orgânicos, ácidos inorgânicos, sais orgânicos, incluindo sais de ácidos orgânicos e sais de bases orgânicas, sais inorgânicos, compostos amargos, cafeína, aromatizantes e ingredientes aromatizantes, compostos adstringentes, proteínas ou hidrolisados de proteínas, surfactantes, emulsificantes, flavonoides, álcoois, polímeros e combinações dos mesmos.
10. Produto consumível, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende adicionalmente pelo menos um ingrediente funcional selecionado a partir do grupo que consiste em saponinas, antioxidantes, fontes de fibra dietética, ácidos graxos, vitaminas, glucosamina, minerais, conservantes, agentes de hidratação, probióticos, prebióticos, agentes de gerenciamento de peso, agentes de gerenciamento de osteoporose, fitoestrogênios, álcoois alifáticos primários saturados de cadeia longa, fitoesteróis e combinações dos mesmos.
11. Produto consumível, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende adicionalmente um composto selecionado do grupo que consiste em rebaudiosídeo A, rebaudiosídeo A2, rebaudiosídeo A3, rebaudiosídeo B, rebaudiosídeo C, rebaudiosídeo C2, rebaudiosídeo D, rebaudiosídeo D2, rebaudiosídeo E, rebaudiosídeo E2, rebaudiosídeo E3, rebaudiosídeo F, rebaudiosídeo F2, rebaudiosídeo F3, rebaudiosídeo G, rebaudiosídeo H, rebaudiosídeo I, rebaudiosídeo I2, rebaudiosídeo I3, rebaudiosídeo J, rebaudiosídeo K, rebaudiosídeo K2, rebaudiosídeo KA, rebaudiosídeo L, rebaudiosídeo M, rebaudiosídeo M2, rebaudiosídeo N, rebaudiosídeo O, rebaudiosídeo O2, rebaudiosídeo Q, rebaudiosídeo Q2, rebaudiosídeo Q3, rebaudiosídeo R, rebaudiosídeo S, rebaudiosídeo T, rebaudiosídeo T1, rebaudiosídeo U, rebaudiosídeo U2, rebaudiosídeo V, rebaudiosídeo W, rebaudiosídeo W2, rebaudiosídeo W3, rebaudiosídeo Y, rebaudiosídeo Z1, rebaudiosídeo Z2, dulcosídeo A, dulcosídeo C, rubusosídeo, esteviolbiosídeo, esteviolbiosídeo A, esteviolbiosídeo B, esteviolmonosídeo, esteviolmonosídeo A, esteviosídeo, esteviosídeo A, esteviosídeo B, esteviosídeo C, esteviosídeo D, esteviosídeo E, esteviosídeo E2, esteviosídeo F, NSF-02, Mogrosídeo V, Luo Han Guo, alulose, D-alose, D-tagatose, eritritol, brazzeína, ácido neo-hesperidina di-hidrocalcona, ácido glicirrízico e seus sais, taumatina, perilartina, pernandulcina, mucuroziosídeos, baiiunosídeo, flomisosídeo-I, ácido dimetil-hexahidrofluoreno-dicarboxílico, abrusosídeos, periandrina, carnosiflosídeos, ciclocariosídeo, pterocariosídeos, polipodosídeo A, brazilina, hernandulcina, filodulcina, glicifilina, florizina, trilobatina, di-hidroflavonol, di- hidroquercina-3-acetato, neoastilibina, trans-cinamaldeído, monatina e seus sais, seligueaína A, hematoxilina, monelina, osladina, pterocariosídeo A, pterocariosídeo B, mabinlina, pentadina, miraculina, curculina, neoculina, ácido clorogênico, cinarina, siamenosídeo, sucralose, acessulfame de potássio, aspartame, alitame, sacarina, ciclamato, neotame, dulcina, suosana advantame, ácido gimnêmico, hodulcina,
zizifina, lactisol, glutamato, ácido aspártico, glicina, alanina, treonina, prolina, serina, lisina, triptofano, maltitol, manitol, sorbitol, lactitol, xilitol, inositol, isomalte, propileno glicol, glicerol, treitol, galactitol, isomaltulose hidrogenada, isomalto-oligossacarídeos reduzidos, xilo-oligossacarídeos reduzidos, gentio-oligossacarídeos reduzidos, xarope de maltose reduzido, xarope de glicose reduzido, hidrolisados de amido hidrogenado, poliglicitóis, álcoois de açúcar, L-açúcares, L-sorbose, L-arabinose, trealose, galactose, ramnose, várias ciclodextrinas, oligossacarídeos cíclicos, vários tipos de maltodextrinas, dextrana, sacarose, glicose, ribulose, frutose, treose, xilose, lixose, altrose, manose, idose, lactose, maltose, açúcar invertido, isotrealose, neotrealose, isomaltulose, eritrose, desoxirribose, gulose, talose, eritrulose, xilulose, celobiose, amilopectina, glucosamina, manosamina, ácido glicurônico, ácido glucônico, glucono-Iactona, abequose, galactosamina, oligossacarídeos de beterraba, isomalto-oligossacarídeos (isomaltose, isomaltotriose, panose e semelhantes), xilo- oligossacarídeos (xilotriose, xilobiose e semelhantes), oligossacarídeos terminados com xilo, oligossacarídeos terminados com gentio, genti-oligossacarídeos (gentiobiose, gentiotriose, gentiotetraose e semelhantes), nigero-oligossacarídeos, palatinose oligossacarídeos, fruto-oligossacarídeos (cestose, nistose e semelhantes), maltotetraol, maltotriol, malto-oligossacarídeos (maltotriose, maltotetraose, maltopentaose, malto-hexaose, malto-heptaose e semelhantes), amido, inulina, inulo- oligossacarídeos, lactulose, melibiose, rafinose, açúcares iíquidos isomerizados, como xaropes de milho de com alto teor de frutose, açúcares de acoplamento, oligossacarídeos de soja, D-psicose, D-ribose, L-glicose, L-fucose, D-turanose, D- Ieucrose.
12. Método para modificação do sabor de um consumível, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende as etapas de: a. fornecer um consumível; a b. adicionar um sabor com propriedades modificadas compreendendo rebaudiosídeo AM conforme a reivindicação 1, em que o rebaudiosídeo AM está presente no consumível em uma concentração igual ou abaixo do limite de detecção do sabor com propriedades modificadas.
13. Método, de acordo com a reivindicação 12, CARACTERIZADO pelo fato de que a modificação do sabor compreende a intensificação da doçura do consumível.
14. Método para suprimir a formação de espuma de uma bebida ou produto alimentício, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende a. fornecer uma bebida ou um produto alimentar, e b. adicionar um supressor de espuma compreendendo o rebaudiosídeo AM conforme a reivindicação 1.
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