BR112020019042A2 - Anticorpos de dupla especificidade contra o pd-l1 e pd-l2 e métodos para uso dos mesmos - Google Patents

Anticorpos de dupla especificidade contra o pd-l1 e pd-l2 e métodos para uso dos mesmos Download PDF

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Ashvin R. Jaiswal
Dongxin Zha
Carlo Toniatti
Bianka Prinz
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Abstract

a presente invenção refere-se a anticorpos biespecíficos que ligam-se tanto ao pd-l1 quanto ao pd-l2 e a métodos para usar esses anticorpos para tratar cânceres, tais como os que expressam ou superexpressam o pd-l1, pd-l2 ou ambos.

Description

"ANTICORPOS DE DUPLA ESPECIFICIDADE CONTRA O PD-L1 E PD-L2 E MÉTODOS PARA USO DOS MESMOS"
REIVINDICAÇÃO DE PRIORIDADE
[001]A presente matéria revelada refere-se a montagens de tubo de fornecimento, incluindo sistemas e técnicas para dispor tubagem percutânea em um paciente.
[002]O presente pedido reivindica o benefício de prioridade ao Pedido Provisório dos EUA de no de série 62/647.407, depositado no dia 23 de março de 2018, e ao Pedido Provisório dos EUA de no de série 62/755.408, depositado no dia 2 de novembro de 2018, respectivamente, cujos conteúdos incorporam-se ao presente documento por referência na íntegra.
INCORPORAÇÃO DE LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS
[003]A listagem de sequências contida no arquivo nomeado “UTFC_P1338WO_ST25”, que tem 49 KB (conforme medidos no Microsoft Windows®) e que foi criado no dia 14 de março de 2019, foi remetida junto com o depósito eletrônico e incorpora-se ao presente documento por referência.
FUNDAMENTOS
1. Campo
[004]Em termos gerais, a presente invenção refere-se ao campo da medicina, oncologia e imunologia. Mais particularmente, ela diz respeito a anticorpos humanos biespecíficos que ligam-se ao PD-L1 e PD-L2 e a seu uso em terapias contra o câncer.
2. Descrição da técnica relacionada
[005]O bloqueio da interação do receptor coinibidor de células T PD-1 com seu ligante PD-L1 tornou-se um pilar da oncologia moderna atualmente disponível mesmo em cenários de primeira linha para subconjuntos de pacientes com melanoma e câncer de pulmão (Boussiotis, 2016). Diversos anticorpos que miram a
PD-1 ou o PD-L1 encontram-se atualmente aprovados pela FDA ou em ensaios clínicos; porém, nenhum agente que mire o segundo ligante da PD-1, o PD-L2, encontra-se sob investigação clínica. O PD-L2 liga-se à PD-1 com afinidade cerca de 3 vezes superior em comparação ao PD-L1, e, assim como o PD-L1, envia um sinal inibidor que atenua a função das células T (Cheng et al., 2013; Latchman et al., 2001; Lee et al., 2016; Li et al., 2017; Youngnak et al., 2003). Ao longo da história, o PD-L2 foi largamente considerado uma molécula coinibidora induzível com expressão limitada ao estroma tumoral; porém, reagentes de detecção do PD-L2 aprimorados revelaram a expressão difundida do PD-L2 tanto no microambiente tumoral quanto nas próprias células tumorais (Baptista et al., 2016; Danilova et al., 2016; Derks et al., 2015; Dong et al., 2016; Howitt et al., 2016; Kim et al., 2015; Kim et al., 2015; Nomi et al., 2007; Obeid et al., 2016; Ohigashi et al., 2005; Roemer et al., 2016; Shi et al., 2014; Shin et al., 2015; Xu et al., 2016). Recentemente, o PD-L2 provou-se um preditor independente da resposta ao anticorpo da PD-1 pembrolizumabe em vários cânceres diferentes (Yearley et al., 2017).
[006]Descrita primeiramente na vasta maioria dos Linfomas de Hodgkin clássicos (cHL), a amplificação da região cromossômica 9p24.1 leva à suprarregulação direta do PD-L1 e PD-L2 (que residem nela), bem como à indução indireta por meio da atividade intensificada da JAK2 (Roemer et al., 2016; Shi et al., 2014; Green et al., 2010; Van Roosbroeck et al., 2016). Além de no cHL, esse ativador genético da alta coexpressão de PD-L1/PD-L2 também é encontrado na maioria dos Linfomas Primários do Mediastino de Grandes Células B (PMBL), linfomas de células T e em uma variedade de malignidades de células histiocíticas e dendríticas. Não é surpresa alguma que muitos desses cânceres tenham provado responder ao bloqueio da PD-1. Mais recentemente, a amplificação de 9p24.1 foi demonstrada em tumores sólidos, tais como o câncer de mama triplo-negativo (TNBC) (Howitt et al., 2016; Barrett et al., 2015). A coexpressão relativamente alta de PD-L1 e PD-L2 também foi observada em vários outros cânceres, tais como carcinoma gástrico, melanoma, carcinomas escamosos do pulmão, câncer de cabeça e pescoço, câncer do colo do útero e vulva, câncer de bexiga e carcinoma hepatocelular, entre outros (Baptista et al., 2016; Danilova et al., 2016; Derks et al., 2015; Dong et al., 2016; Howitt et al., 2016; Kim et al., 2015; Nomi et al., 2007; Obeid et al., 2016; Xu et al., 2016; Yearley et al., 2017; Van Roosbroeck et al., 2016; Barrett et al., 2015; Shin et al., 2016; Inoue et al., 2016; Wang et al., 2011). Além da expressão pelos próprios tumores, a expressão estromal e endotelial do PD-L2 também foi documentada para muitos desses tumores (Yearley et al., 2017). Essas descobertas sugerem limitações ao potencial terapêutico do bloqueio ao PD-L1 nesses cânceres.
[007]O receptor coinibidor PD-1 é expresso principalmente por células T e células NK ativadas e, portanto, pode ser mais bem mirado por anticorpos que liguem-se a ele e previnam o engajamento por ligantes da PD. O PD-L1, em contrapartida, é expresso por células tumorais e populações estromais supressivas e pode ser mirado por anticorpos capazes de função efetora citotóxica. Embora as vantagens teóricas desses anticorpos do PD-L1 capazes de citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC) possam ser demonstradas in vitro, não há nenhum dado que demonstre verdadeira função efetora nos pacientes ou resultado aprimorado em comparação a variantes puramente bloqueadoras (Boyerinas et al., 2015).
[008]O PD-L1 e o PD-L2 só compartilham cerca de 40% de identidade, uma vez que cada um liga-se a um receptor adicional distinto da PD-1 (Latchman et al., 2001). O PD-L1 também liga-se a B7-1 em uma interação reguladora de células T negativas adicional (Butte et al., 2007; Butte et al., 2008). Em camundongos, o PD- L2 pode ligar-se a RGMb nas células mieloides ou nas células T e regular a tolerância a antígenos inalados (Xiao et al., 2014; Nie et al., 2017). O papel da ligação de PD-L2 com RGMb nos tumores ainda carece de descrição, o que também é verdade acerca da relevância dessa interação nos seres humanos. Poderia provar- se extremamente vantajosa, do ponto de vista terapêutico, a obtenção de anticorpos biespecíficos ao PD-L1 e PD-L2.
SUMÁRIO
[009]Nesse contexto, de acordo com a presente invenção, é proposto um anticorpo ou fragmento de anticorpo que liga-se seletivamente tanto ao PD-L1 quanto ao PD-L2 e que possui sequências CDR de cadeia pesada e leve pareadas com clone das Tabelas 3 e 4, respectivamente. O anticorpo ou fragmento de anticorpo pode ser codificado por sequências variáveis pareadas com clone conforme estabelecidas na Tabela 1, pode ser codificado por sequências variáveis de cadeia leve e pesada com 70%, 80% ou 90% de identidade com sequências variáveis pareadas com clone conforme estabelecidas na Tabela 1 ou pode ser codificado por sequências variáveis de cadeia leve e pesada com 95% ou mais de identidade com sequências pareadas com clone conforme estabelecidas na Tabela
1. O anticorpo ou fragmento de anticorpo pode compreender sequências de cadeia leve e pesada de acordo com sequências pareadas com clone da Tabela 2, pode compreender sequências variáveis de cadeia leve e pesada com 70%, 80% ou 90% de identidade com sequências pareadas com clone da Tabela 2 ou pode compreender sequências variáveis de cadeia leve e pesada com 95% ou mais de identidade com sequências pareadas com clone da Tabela 2.
[010]Também é proposto um método para tratar o câncer em um paciente, o método compreendendo colocar uma célula de câncer PD-L1-positiva ou PD-L2- positiva no paciente em contato com um anticorpo conforme descrito acima. A célula de câncer PD-L1-positiva ou PD-L2-positiva pode ser uma célula de tumor sólido, tal como uma célula de câncer de pulmão, célula de câncer de cérebro, célula de câncer de cabeça e pescoço, célula de câncer de mama, célula de câncer de pele,
célula de câncer de fígado, célula de câncer de pâncreas, célula de câncer de estômago, célula de câncer de cólon, célula de câncer de reto, célula de câncer de útero, célula de câncer do colo do útero, célula de câncer de ovário, célula de câncer de testículo, célula de câncer de pele, célula de câncer de esôfago, célula de linfoma, célula de carcinoma de células renais, ou pode ser um leucemia ou mieloma, tal como leucemia mieloide aguda, leucemia mieloide crônica ou mieloma múltiplo.
[011]O método pode compreender ainda colocar a célula de câncer PD-L1- positiva ou PD-L2-positiva em contato com um segundo agente ou tratamento anticâncer, tal como quimioterapia, radioterapia, imunoterapia, terapia hormonal ou terapia com toxina. O segundo agente ou tratamento anticâncer pode inibir uma função intracelular do PD-L1 ou PD-L2. O segundo agente ou tratamento anticâncer pode ser administrado junto com o primeiro agente, ou administrado antes e/ou depois dele. A célula de câncer PD-L1-positiva ou PD-L2-positiva pode ser uma célula de câncer metastático, uma célula de câncer resistente a múltiplos fármacos ou uma célula de câncer recorrente.
[012]O anticorpo pode ser um anticorpo de cadeia única, um anticorpo de domínio único, um anticorpo quimérico ou um fragmento Fab. O anticorpo pode ser um anticorpo humano, um anticorpo murídeo, uma IgG, um anticorpo humanizado ou uma IgG humanizada. O anticorpo ou fragmento de anticorpo pode compreender ainda um identificador, tal como um marcador peptídico, uma partícula magnética, um cromóforo, uma molécula fluorescente, uma molécula quimioluminescente ou um corante. O anticorpo ou fragmento de anticorpo pode compreender ainda um fármaco antitumor ligado a ele, tal como ligado ao anticorpo ou fragmento de anticorpo por intermédio de um ligante fotolábil ou de um ligante enzimaticamente clivado. O fármaco antitumor pode ser uma toxina, um radioisótopo, uma citocina ou uma enzima. O anticorpo ou fragmento de anticorpo pode ser conjugado a uma nanopartícula ou lipossoma.
[013]Em outra modalidade, é proposto um método para tratar um câncer em um paciente, o método compreendendo distribuir ao paciente um anticorpo ou fragmento de anticorpo com sequências CDR de cadeia pesada e leve pareadas com clone das Tabelas 3 e 4, respectivamente. O fragmento de anticorpo pode ser um anticorpo scFv (fragmento variável de cadeia única) recombinante, fragmento Fab, fragmento F(ab’)2 ou fragmento Fv. O anticorpo pode ser uma IgG. O anticorpo pode ser um anticorpo quimérico. A distribuição pode compreender a administração do anticorpo ou fragmento de anticorpo ou a distribuição genética de uma sequência ou vetor de RNA ou DNA que codifique o anticorpo ou fragmento de anticorpo.
[014]O anticorpo ou fragmento de anticorpo pode ser codificado por sequências variáveis de cadeia leve e pesada pareadas com clone conforme estabelecidas na Tabela 1, pode ser codificado por sequências variáveis de cadeia leve e pesada pareadas com clone com 95% de identidade com sequências pareadas com clone conforme estabelecidas na Tabela 1 e pode ser codificado por sequências variáveis de cadeia leve e pesada com 70%, 80% ou 90% de identidade com sequências pareadas com clone conforme estabelecidas na Tabela 1. O anticorpo ou fragmento de anticorpo pode compreender sequências variáveis de cadeia leve e pesada de acordo com sequências pareadas com clone da Tabela 2, pode compreender sequências variáveis de cadeia leve e pesada com 70%, 80% ou 90% de identidade com sequências pareadas com clone da Tabela 2 ou pode compreender sequências variáveis de cadeia leve e pesada com 95% de identidade com sequências pareadas com clone da Tabela 2.
[015]Também é proposto um anticorpo monoclonal, em que o anticorpo ou fragmento de anticorpo é caracterizado por sequências CDR de cadeia pesada e leve pareadas com clone das Tabelas 3 e 4, respectivamente. O fragmento de anticorpo pode ser um anticorpo scFv (fragmento variável de cadeia única) recombinante, fragmento Fab, fragmento F(ab’)2 ou fragmento Fv. O anticorpo pode ser um anticorpo quimérico ou uma IgG.
[016]O anticorpo ou fragmento de anticorpo pode ser codificado por sequências variáveis de cadeia leve e pesada pareadas com clone conforme estabelecidas na Tabela 1, pode ser codificado por sequências variáveis de cadeia leve e pesada pareadas com clone com 95% de identidade com sequências pareadas com clone conforme estabelecidas na Tabela 1 e pode ser codificado por sequências variáveis de cadeia leve e pesada com 70%, 80% ou 90% de identidade com sequências pareadas com clone conforme estabelecidas na Tabela 1. O anticorpo ou fragmento de anticorpo pode compreender sequências variáveis de cadeia leve e pesada de acordo com sequências pareadas com clone da Tabela 2, pode compreender sequências variáveis de cadeia leve e pesada com 70%, 80% ou 90% de identidade com sequências pareadas com clone da Tabela 2 ou pode compreender sequências variáveis de cadeia leve e pesada com 95% de identidade com sequências pareadas com clone da Tabela 2.
[017]Em ainda outra modalidade, é proposto um hibridoma ou célula desenvolvida em laboratório que codifica um anticorpo ou fragmento de anticorpo, em que o anticorpo ou fragmento de anticorpo é caracterizado por sequências CDR de cadeia pesada e leve pareadas com clone das Tabelas 3 e 4, respectivamente. O fragmento de anticorpo pode ser um anticorpo scFv (fragmento variável de cadeia única) recombinante, fragmento Fab, fragmento F(ab’)2 ou fragmento Fv. O anticorpo pode ser um anticorpo quimérico ou uma IgG.
[018]O anticorpo ou fragmento de anticorpo pode ser codificado por sequências variáveis de cadeia leve e pesada pareadas com clone conforme estabelecidas na Tabela 1, pode ser codificado por sequências variáveis de cadeia leve e pesada pareadas com clone com 95% de identidade com sequências pareadas com clone conforme estabelecidas na Tabela 1 e pode ser codificado por sequências variáveis de cadeia leve e pesada com 70%, 80% ou 90% de identidade com sequências pareadas com clone conforme estabelecidas na Tabela 1. O anticorpo ou fragmento de anticorpo pode compreender sequências variáveis de cadeia leve e pesada de acordo com sequências pareadas com clone da Tabela 2, pode compreender sequências variáveis de cadeia leve e pesada com 70%, 80% ou 90% de identidade com sequências pareadas com clone da Tabela 2 ou pode compreender sequências variáveis de cadeia leve e pesada com 95% de identidade com sequências pareadas com clone da Tabela 2.
[019]Outra modalidade compreende uma vacina anticâncer que compreende um ou mais anticorpos ou fragmentos de anticorpo caracterizados por sequências CDR de cadeia pesada e leve pareadas com clone das Tabelas 3 e 4, respectivamente. Ao menos um fragmento de anticorpo pode ser um anticorpo scFv (fragmento variável de cadeia única) recombinante, fragmento Fab, fragmento F(ab’)2 ou fragmento Fv. Ao menos um dos anticorpos pode ser um anticorpo quimérico ou uma IgG. Ao menos um anticorpo ou fragmento de anticorpo pode ser codificado por sequências variáveis de cadeia leve e pesada pareadas com clone conforme estabelecidas na Tabela 1, pode ser codificado por sequências variáveis de cadeia leve e pesada pareadas com clone com 95% de identidade com sequências pareadas com clone conforme estabelecidas na Tabela 1 e pode ser codificado por sequências variáveis de cadeia leve e pesada com 70%, 80% ou 90% de identidade com sequências pareadas com clone conforme estabelecidas na Tabela 1. Ao menos um anticorpo ou fragmento de anticorpo pode compreender sequências variáveis de cadeia leve e pesada de acordo com sequências pareadas com clone da Tabela 2, pode compreender sequências variáveis de cadeia leve e pesada com 70%, 80% ou 90% de identidade com sequências pareadas com clone da Tabela 2 ou pode compreender sequências variáveis de cadeia leve e pesada com 95% de identidade com sequências pareadas com clone da Tabela 2.
[020]Em outra modalidade, é proposto um método para detectar células que expressam o PD-L1 ou PD-L2 em um paciente, o método compreendendo colocar uma amostra do referido paciente em contato com um anticorpo ou fragmento de anticorpo caracterizado por conter sequências CDR de cadeia pesada e leve pareadas com clone das Tabelas 3 e 4, respectivamente, e detectar uma célula que expressa o PD-L1 ou PD-L2 na referida amostra pela ligação do referido anticorpo ou fragmento de anticorpo com uma célula na referida amostra. A amostra pode ser um fluido corporal ou uma amostra de tecido. A célula pode ser uma célula de câncer, tal como uma célula de linfoma, célula de câncer de mama ou célula de carcinoma de células renais. A célula pode ser uma célula associada a supressão imunológica. A célula associada a supressão imunológica pode ser uma célula não cancerosa em um microambiente tumoral, tal como uma célula estromal ou célula endotelial. A detecção pode compreender ELISA, RIA ou Western blot. O método pode compreender ainda realizar o método por uma segunda vez e determinar uma mudança nos níveis de antígeno do orthopoxyvirus em comparação ao primeiro ensaio. O anticorpo ou fragmento de anticorpo pode ser codificado por sequências variáveis de cadeia leve e pesada pareadas com clone conforme estabelecidas na Tabela 1, pode ser codificado por sequências variáveis de cadeia leve e pesada pareadas com clone com 95% de identidade com sequências pareadas com clone conforme estabelecidas na Tabela 1 e pode ser codificado por sequências variáveis de cadeia leve e pesada com 70%, 80% ou 90% de identidade com sequências pareadas com clone conforme estabelecidas na Tabela 1. O anticorpo ou fragmento de anticorpo pode compreender sequências variáveis de cadeia leve e pesada de acordo com sequências pareadas com clone da Tabela 2, pode compreender sequências variáveis de cadeia leve e pesada com 70%, 80% ou 90% de identidade com sequências pareadas com clone da Tabela 2 ou pode compreender sequências variáveis de cadeia leve e pesada com 95% de identidade com sequências pareadas com clone da Tabela 2.
[021]Contempla-se que qualquer método ou composição descrito neste documento seja implementado com respeito a qualquer outro método ou composição descrito neste documento. Outros objetivos, características e vantagens da presente invenção transparecerão pela leitura da descrição detalhada a seguir. No entanto, deve-se ter em mente que, embora indiquem modalidades específicas da invenção, a descrição detalhada e os exemplos específicos são dados a título meramente ilustrativo, uma vez que várias alterações e modificações dentro do âmbito e da essência da invenção transparecerão aos versados na técnica pela leitura da presente descrição detalhada.
[022]Conforme usado neste documento, entende-se por “essencialmente isento”, em termos de um componente específico, que nenhum do componente especificado foi propositalmente formulado em uma composição e/ou só se faz presente como contaminante ou em quantidades ínfimas. A quantidade total do componente especificado decorrente de qualquer contaminação não tencionada de uma composição é preferivelmente inferior a 0,01%. Mais preferível, trata-se de uma composição na qual nenhuma quantidade do componente especificado é detectada por métodos analíticos padrão.
[023]Conforme usado neste documento no relatório descrito e nas reivindicações, o artigo indefinido "um(a)" pode significar um(a) ou mais. Conforme usado neste documento no relatório descritivo e nas reivindicações, quando junto da palavra “compreender”, o artigo indefinido “um(a)” pode significar um(a) ou mais de um(a). Conforme usados neste documento no relatório descrito e nas reivindicações, "outro(a)" e "ainda outro(a)" podem significar ao menos um(a) segundo(a) ou mais.
[024]Conforme usado neste documento no relatório descritivo e nas reivindicações, o termo “cerca de” visa a indicar que um valor inclui a margem de erro inerente ao dispositivo, ao método adotado para determinar o valor ou à variação existente entre os objetos de estudo.
[025]Outros objetivos, características e vantagens da presente invenção transparecerão pela leitura da descrição detalhada a seguir. No entanto, deve-se ter em mente que, embora indiquem certas modalidades da invenção, a descrição detalhada e os exemplos específicos são dados a título meramente ilustrativo, uma vez que várias alterações e modificações dentro do âmbito e da essência da invenção transparecerão aos versados na técnica pela leitura da presente descrição detalhada.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[026]Os desenhos a seguir fazem parte do presente relatório e são incluídos para demonstrar em mais detalhes certos aspectos da presente invenção. A invenção pode ser mais bem entendida com referência a um ou mais desses desenhos, em combinação com a descrição detalhada das modalidades específicas apresentada neste documento.
[027]Figs. 1A a 1C: Identificação de anticorpos biespecíficos ao PD-L1/PD- L2 (BiPDL) para bloquear a ligação do PD-L1/PD-L2 com a PD-1. Anticorpos candidatos identificados conforme descrito nos Exemplos foram testados quanto à sua capacidade de ligar-se ao PD-L1 ou PD-L2 e bloquear a ligação destes com a PD-1. Ligaram-se 5 µg/mL de anticorpos a células CHO-PD-L1 ou CHO-PD-L2, e, em seguida, adicionou-se PD-1 recombinante marcada com Alexafluor 532 por 1 hora. (FIG. 1A) Ilustra-se a porcentagem de células PD-1+. (FIG. 1B) Mediu-se a intensidade de fluorescência máxima da PD-1 marcada com Alexafluor 532, sendo o bloqueio do PD-L1 ou PD-L2 observado por uma redução na fluorescência de Alexa532 em uma análise por FACS. Clones de anticorpos BiPDL de 1 a 4 (ADI-
16413, ADI-16414, ADI-16415 e ADI-16418) foram avaliados em comparação a células não tingidas, anticorpos controle, Durvalumabe (anti-PD-L1) e um anticorpo anti-PD-L2 disponível na praça. (FIG. 1C) Anticorpos monoclonais BiPDL candidatos foram avaliados usando o sistema de bloqueio PD-L1:PD-1 Promega.
[028]FIGs. 2A a 2D: Identificação de subclones de anticorpos biespecíficos que ligam-se ao PD-L1 e PD-L2. Subclones de anticorpos biespecíficos BiPDL3 ou BiPDL4 foram avaliados quanto à sua ligação com células CHO-PD-L1 (FIGs. 2A e 2C) ou CHO-PD-L2 (FIGs. 2B e 2D). As concentrações indicadas de anticorpos BiPDL (IgG1 humana) foram adicionadas às células indicadas, e a ligação foi detectada pela adição do anticorpo secundário anti-IgG1 humana conjugado a PE. As reações foram realizadas na plataforma ForteBio Octet®.
[029]FIG. 3: Avaliação de anticorpos biespecíficos em comparação a composições terapêuticas de anticorpos aprovadas pela FDA. Anticorpos monoclonais BiPDL candidatos foram avaliados usando tanto o sistema de bloqueio PD-L1:PD-1 Promega quanto o sistema de bloqueio PD-L2:PD-1 Promega. Concentrações variadas dos anticorpos foram adicionadas a células CHO-PD-L1 ou CHO-PD-L2 (CHO-PD-L1/2) capazes de estimular células T Jurkat expressando estavelmente a PD-1. Quando cocultivadas, a interação entre as células CHO-PD- L1/2 e as células T Jurkat inibe a luminescência. Quando da ruptura dessa ativação pela adição de anticorpos do PD-L1, PD-L2, PD-1 ou BiPDL, a luminescência é induzida. As células T Jurkat foram incubadas com anticorpos, os anticorpos especificados às concentrações indicadas, e células CHO-PD-L1/2 por 6 horas. Os resultados foram gerados usando o kit de ensaio Bio-Glo™ (Promega).
[030]FIGs. 4A a 4F: Avaliação de anticorpos BiPDL de segunda, terceira e quarta gerações. Anticorpos monoclonais BiPDL candidatos de segunda geração (FIGs. 4A a 4B), terceira geração (FIGs. 4C a 4D) e quarta geração (FIGs. 4E a 4F) foram novamente avaliados usando o sistema de bloqueio PD-L1/PD-L2:PD-1
Promega. Keytruda foi usado como anticorpo anti-PD-L2 controle positivo (FIGs. 4B a 4D), ao passo que Darvalumabe foi usado como anticorpo anti-PD-L1 controle (FIGS. 4C a 4D). O mAb contra a PD-1 controle da Promega também foi usado como controle (FIGs. 4C a 4D).
[031]FIGs. 5A a 5C: Os anticorpos BiPDL candidatos fazem-se ativos em várias reações de linfócitos mistos humanas diferentes. Anticorpos candidatos, anticorpos aprovados pela FDA ou anticorpos controle foram avaliados na presença de células dendríticas e células T induzidas de diferentes doadores e avaliados por ELISA quanto à produção de IL-2 ou IFN-γ. (FIG. 5A) iDCs magneticamente separadas foram avaliadas por citometria de fluxo quanto à expressão do PD-L1 e PD-L2 humanos. (FIG. 5B) Keytruda (anti-PD-1), Atezolizumabe (anti-PD-L1), um anticorpo BiPDL de 4ª geração e um isótipo controle foram adicionados às iDCs antes da adição a células T CD4+. (FIG. 5C) Um anticorpo BiPDL de 4ª geração diferente foi avaliado junto com Atezolizumabe e um isótipo controle. Cada um deles foi adicionado às iDCs antes da adição de células T CD4+.
[032]FIG. 6: Anticorpos BiPDL medeiam uma ADCC eficiente contra o linfoma PD-L1/PD-L2+ humano. Diversas concentrações de anticorpos BiPDL (IgG2a murídea) foram adicionadas com células NK murídeas expandidas in vitro a células de PMBL U2940 marcadas com calceína a uma razão efetoras para alvo de 15 a 1. A porcentagem de lise específica foi calculada pela diferença entre a liberação experimental e a liberação espontânea de calceína conforme medidas em um leitor de placas fluorescentes.
[033]FIGs. 7A a 7C: Os anticorpos candidatos com ADCC são altamente ativos contra o linfoma U2940 humano in vivo. Tumores de xenoenxerto de PBML foram estabelecidos em camundongos SCID e permitidos crescer até 150 mm3. (FIG. 7A) As células foram analisadas quanto à expressão de PD-L1 ou PD-L2 por citometria de fluxo. (FIGS. 7B a 7C) Os camundongos foram tratados com anticorpos controle mIgG2a, Herceptin, Rituxan ou os anticorpos BiPDL indicados 2 vezes por semanas a 10 mg/kg durante 3 semanas, e o volume tumoral foi mensurado com pinça nos dias indicados.
[034]FIGs. 8A a 8B: Os anticorpos candidatos são ativos contra o MDA-MB-
231. Tumores de xenoenxerto de câncer de mama triplo-negativo MDA-MB-231 foram estabelecidos em camundongos SCID e permitidos crescer até 150 mm3. (FIG. 8A) As células foram analisadas quanto à expressão de PD-L1 ou PD-L2 por citometria de fluxo. (FIG. 8B) Em seguida, os camundongos foram tratados com o anticorpo indicado 2 vezes por semana a 10 mg/kg durante 3 semanas. Os dados ilustrados são de um único experimento com 9 camundongos por grupo, e o volume dos tumores foi mensurado nos dias indicados.
[035]FIGs. 9A a 9C: Os anticorpos BiPDL tratam o carcinoma de cólon MC38-PD-L2 singênico com mais eficácia do que os anticorpos do PD-L1. Implantaram-se 5 × 105 células tumorais MC38-PDL2 subcutaneamente em camundongos C57BL/6J. Os camundongos foram tratados com 100 µg do anticorpo indicado nos dias 3, 6, 9, 12 e 15. (FIG. 9A) A sobrevivência é dada para um único experimento com 10 camundongos por grupo (valores p obtidos pelo teste de Gehran-Breslow-Wilcoxon). (FIG. 9B) O crescimento dos tumores MC-38-PD-L2 no flanco foi medido com pinça, e o volume dos tumores é dado para todos os grupos até que cada tumor medisse ≥ 1000 mm3. (FIG. 9C) A presença de PD-L1 e PD-L2 foi avaliada por citometria de fluxo.
[036]FIGs. 10A a 10B: Os anticorpos BiPDL com citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos (ADCC) geram razões de CD8 para Treg vantajosas em camundongos MC38-PD-L2. Implantaram-se 1,5 × 106 células de tumor MC38-PDL2 subcutaneamente em camundongos C57BL/6J em Matrigel a 30% (Corning), que foram tratados com 100 µg do anticorpo indicado injetado intraperitonealmente nos dias 7, 10 e 13. No dia 15, os tumores foram coletados.
(FIG. 10A) A presença de PD-L1 e PD-L2 foi avaliada por citometria de fluxo. (FIG. 10B) As razões de células T CD8 infiltrantes para Treg FoxP3+ foram medidas por citometria de fluxo.
[037]FIGs. 11A a 11B: Os anticorpos BiPDL tratam o linfoma de células T EL4 sistêmico com mais eficácia do que o bloqueio do PD-L1 ou PD-L2. Implantaram-se 1,5 × 105 células EL4-PD-L2, que também expressavam a Luciferase para facilitar a imagiologia bioluminescente, a fim de estabelecer a doença sistêmica em camundongos C57BL/6J. Nos dias 3, 6, 9, 12 e 15, os camundongos receberam injeções de 100 µg do anticorpo indicado. (FIG. 11A) A citometria de fluxo foi usada para avaliar a presença de PD-L1 e PD-L2. (FIG. 11B) A sobrevivência é dada para 1 a 3 experimentos independentes (dependendo do grupo) com 5 camundongos por grupo. As estatísticas de sobrevivência foram calculadas usando o teste de Gehran-Breslow-Wilcoxon.
[038]FIG. 12: Equivalência em relação ao bloqueio da PD-1 e superioridade em relação ao bloqueio do PD-L1 no ensaio PD-L1/PD-L2 Promega. O BiPDL3-14 bloqueia por inteiro o engajamento da PD-1. O ensaio Promega PD-1 composto por células CHO expressando um elemento de ativação de células T e PDL-1 e PD-L2 humanos e por células T Jurkat com um repórter NFAT-Luciferase foi usado para testar a capacidade de Keytruda, Tecentriq e BiPDL em bloquear a supressão de células T mediadas por PD-1.
[039]FIG. 13: Os dados de F16-F10-PDL2 sugerem a atividade promissora de anticorpos BiPDL3 efetores em tumores “frios”. O BiPDL3 é capaz de curar o melanoma B16 resistente à PD-1. Camundongos implantados com 5 × 104 células de melanoma B16.F10 no flanco foram tratados nos dias 3, 6, 9 e 12 com o anticorpo indicado por via intraperitoneal. GASDIE = hIgG1 com mutações T236A, S239D, I332E para intensificar a ADCC/P.
DESCRIÇÃO DE MODALIDADES ILUSTRATIVAS
[040]Os inventores geraram anticorpos monoclonais com especificidade de ligação por ambas as proteínas PD-L1 e PD-L2 humanas. Como ficou demonstrado que esses anticorpos ligam-se tanto ao PD-L1 quanto ao PD-L2, eles representam uma oportunidade para bloquear a ligação do PD-L1 ou PD-L2 com a PD-1. Eles também podem ser usados para distribuir cargas terapêuticas a células cancerosas que expressam o PD-L1 ou PD-L2. Doravante, descrever-se-ão esses e outros aspectos da invenção em ainda mais detalhes. I. PD-L1 A. Estrutura
[041]O ligante da proteína de morte celular programada 1 (PD-L1) é uma proteína codificada pelo gene CD274. O PD-L1 é uma proteína transmembrana tipo 1 de 40 kDa que exerce importante papel na supressão imunológica durante uma variedade de eventos, tais como a gravidez, aloenxertos de tecido, doença autoimune, câncer e outras enfermidades. A proteína PD-L1 humana é codificada pela sequência de aminoácidos dada abaixo:
MRIFAVFIFMTYWHLLNAFTVTVPKDLYVVEYGSNMTIECKFPVEKQLDLAA LIVYWEMEDKNIIQFVHGEEDLKVQHSSYRQRARLLKDQLSLGNAALQITDVKLQDA GVYRCMISYGGADYKRITVKVNAPYNKINQRILVVDPVTSEHELTCQAEGYPKAEVI WTSSDHQVLSGKTTTTNSKREEKLFNVTSTLRINTTTNEIFYCTFRRLDPEENHTAEL
VIPELPLAHPPNERTHLVILGAILLCLGVALTFIFRLRKGRMMDVKKCGIQDTNSKKQS DTHLEET (SEQ ID Nº: 1) B. Função
[042]O PD-L1 é um ligante para seu receptor, a PD-1. A PD-1 pode ser encontrada em células T, Células B e células mieloides ativadas. A ligação do PD-L1 com a PD-1 modula a ativação ou inibição de células T e células B e transmite um sinal inibitório que reduz a proliferação de células T CD8+ e células T auxiliares
CD4+ específicas a antígeno. A ligação do PD-L1 com a PD-1 também induz à apoptose. Acredita-se que essa redução nas células T CD8+ e células T auxiliares CD4+ ajude células que expressam o PD-L1 a esquivar-se da imunidade antitumor (Dong et al., 2002). A suprarregulação do PD-L1 está associada à evasão em relação ao sistema imunológico hospedeiro e, acredita-se, é a causa de uma maior agressividade tumoral (Thompson et al., 2004). O papel do PD-L1 na evasão em relação à imunidade antitumor faz dele um alvo atraente para a intervenção terapêutica. II. PD-L2 A. Estrutura
[043]O ligante da proteína de morte celular programada 2 (PD-L2) é uma proteína codificada pelo gene CD273. O PD-L2 é uma proteína de 31 kDa que pode exercer importante papel na supressão imunológica durante uma variedade de eventos, tais como gravidez, aloenxertos de tecido, doença autoimune, câncer e outras enfermidades. A proteína PD-L2 humana é codificada pela sequência de aminoácidos dada abaixo:
MIFLLLMLSLELQLHQIAALFTVTVPKELYIIEHGSNVTLECNFDTGSHVNLGA ITASLQKVENDTSPHRERATLLEEQLPLGKASFHIPQVQVRDEGQYQCIIIYGVAWDY KYLTLKVKASYRKINTHILKVPETDEVELTCQATGYPLAEVSWPNVSVPANTSHSRT
PEGLYQVTSVLRLKPPPGRNFSCVFWNTHVRELTLASIDLQSQMEPRTHPTWLLHIF IPFCIIAFIFIATVIALRKQLCQKLYSSKDTTKRPVTTTKREVNSAI (SEQ ID Nº: 2)
[044]O PD-L2 é produzido inicialmente com um peptídeo de sinal correspondente aos aminoácidos 1 a 19 da SEQ ID Nº: 2, que é subsequentemente removido para gerar a proteína madura. A proteína PD-L2 madura, correspondente aos aminoácidos 20 a 273 da SEQ ID Nº: 2, é composta por um domínio V semelhante a Ig, um domínio do tipo C2 semelhante a Ig, um domínio transmembrana e uma cauda citoplásmica. B. Função
[045]O PD-L2 é um ligante para seu receptor, a PD-1. A PD-1 pode ser encontrada em células T, Células B e células mieloides ativadas. A ligação do PD-L2 com a PD-1 dá início a uma cascata imunológica que debilita a proliferação, a produção de citocinas, a função citolítica e a sobrevivência de células T. A PD-1 transmite um sinal inibidor que reduz a proliferação de células T CD8+ e células T auxiliares CD4+ específicas a antígeno. O PD-L2 também provou-se um preditor independente da resposta ao anticorpo da PD-1 pembrolizumabe em vários cânceres diferentes (Yearley et al., 2017). III. Anticorpos monoclonais e produção dos mesmos A. Métodos gerais
[046]Anticorpos contra o PD-L1 e PD-L2 podem ser produzidos por métodos padrão como é de conhecimento na técnica (vide, por exemplo, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988; Patente dos EUA
4.196.265). Em termos geras, os métodos para gerar anticorpos monoclonais (mAbs) começam nas mesmas linhas que os métodos para preparar anticorpos policlonais. A primeira etapa para ambos esses métodos é a imunização de um hospedeiro apropriado ou a identificação de pacientes que sejam imunes em virtude de infecção natural prévia. Como é de conhecimento na técnica, dada composição para imunização pode variar quanto à sua imunogenicidade. Muitas vezes, portanto, é necessário reforçar o sistema imunológico hospedeiro, o que pode ser obtido acoplando-se um imunogene peptídico ou polipeptídico a um carreador. Veículos exemplificativos e preferidos incluem a hemocianina de keyhole limpet (KLH) e a albumina do soro bovino (BSA). Outras albuminas, tais como ovalbumina, albumina do soro murídeo ou albumina do soro de coelho, também podem ser usadas como carreador. Meios para conjugar um polipeptídeo a uma proteína carreadora são bem conhecidos na técnica e incluem glutaraldeído, éster de m-maleimidobencoil-N-hidroxissuccinimida, carbodiimida e benzidina bis-biazotizada. Como também é de conhecimento na técnica, a imunogenicidade de uma composição imunogênica específica pode ser intensificada pelo uso de estimulantes da resposta imunológica não específicos, conhecidos como adjuvantes. Adjuvantes exemplificativos e preferidos incluem o adjuvante de Freund (um estimulante da resposta imunológica não específico que contém Mycobacterium tuberculosis morta), adjuvantes de Freund incompletos e adjuvante hidróxido de albumina.
[047]A quantidade de composição imunogênica usada na produção dos anticorpos policlonais varia dependendo da natureza do imunogene, bem como do animal usado para imunização. Uma variedade de vias pode ser adotada para administrar o imunogene (subcutânea, intramuscular, intradérmica, intravenosa e intraperitoneal). A produção de anticorpos policlonais pode ser monitorada colhendo- se uma amostra de sangue do animal imunizado em vários pontos no tempo após a imunização. Uma segunda injeção de reforço também pode ser aplicada. Repete-se o processo de reforço e titulação até obter uma titulação adequada. Quando um nível desejado de imunogenicidade é obtido, o animal imunizado pode ser sangrado e, o soro, isolado e armazenado, e/ou o animal pode ser usado para gerar anticorpos monoclonais.
[048]Após a imunização, células somáticas com potencial para produzir anticorpos, mais especificamente linfócitos B (células B), são selecionadas para uso no protocolo de geração de mAb. Essas células podem ser obtidas de baços ou linfonodos removidos por biópsia ou do sangue circulante. Os linfócitos B produtores de anticorpo do animal imunizado são então fusionados a células de mieloma imortais, geralmente da mesma espécie do animal que foi imunizado, ou a células humanas ou células quiméricas humanas/murídeas. Linhas de células de mieloma adequadas para uso nos procedimentos de fusão produtores de hibridoma de preferência não produzem anticorpos, exibem alta eficácia de fusão e exibem deficiências enzimáticas que tornam-nas incapazes de crescer em certos meios seletivos que sustentam tão somente o crescimento das células fusionadas desejadas (hibridomas).
[049]Qualquer uma de diversas células de mieloma pode ser usada, como é de conhecimento dos versados na técnica (Goding, pp. 65-66, 1986; Campbell, pp. 75-83, 1984). Por exemplo, quando o animal imunizado é um camundongo, podem- se usar P3-X63/Ag8, X63-Ag8.653, NS1/1.Ag 4 1, Sp210-Ag14, FO, NSO/U, MPC-11, MPC11-X45-GTG 1.7 e S194/5XX0 Bul; no caso de ratos, podem-se usar R210.RCY3, Y3-Ag 1.2.3, IR983F e 4B210; ao passo que U-266, GM1500-GRG2, LICR-LON-HMy2 e UC729-6 são todas úteis no que tange a fusões de células humanas. Uma célula de mieloma murídea específica é a linha de células de mieloma NS-1 (também chamada P3-NS-1-Ag4-1), que encontra-se prontamente disponível junto ao Repositório de Células Mutantes Genéticas Humanas do NIGMS mediante solicitação do número de repositório de linha celular GM3573. Outra linha de células de mieloma murídeas que pode ser usada é a linha de células não produtoras SP2/0 do mieloma murídeo de camundongos resistentes à 8-azaguanina. Mais recentemente, descreveram-se linhas parceiras de fusão adicionais para uso junto com células B humanas, inclusive a KR12 (ATCC CRL-8658; K6H6/B5 (ATCC CRL-1823 SHM-D33 (ATCC CRL-1668) e a HMMA2.5 (Posner et al., 1987). Os anticorpos nesta revelação foram gerados usando a linha celular SP2/0/mIL-6, um derivado secretor de IL-6 da linha SP2/0.
[050]Métodos para gerar híbridos de células produtoras de anticorpo dos linfonodos e do baço e células de mieloma tipicamente compreendem misturar células somáticas a células de mieloma a uma proporção de 2:1, embora esta possa variar de cerca de 20:1 a cerca de 1:1, respectivamente, na presença de um agente ou agentes (químicos ou elétricos) que promovam a fusão das membranas celulares. Métodos de fusão usando o vírus Sendai foram descritos por Kohler e Milstein (1975; 1976), e os que usam polietileno glicol (PEG), tal como PEG a 37% (v/v), foram descritos por Gefter et al. (1977). O uso de métodos de fusão eletricamente induzida também é apropriado (Goding, pp. 71-74, 1986).
[051]Os procedimentos de fusão tipicamente produzem híbridos viáveis a frequências baixas, cerca de 1  10-6 a 1  10-8. No entanto, isso não impõe um problema, uma vez que os híbridos fusionados viáveis são diferenciados das células não fusionadas mãe (em particular, das células de mieloma não fusionadas que, em condições normais, continuariam dividindo-se indefinidamente) por cultivo em um meio seletivo. O meio seletivo geralmente é tal que contém um agente que bloqueia a síntese de novo de nucleotídeos no meio de cultura de tecido. Agentes exemplificativos e preferidos incluem a aminopterina, o metotrexato e a azasserina. A aminopterina e o metotrexato bloqueiam a síntese de novo tanto das purinas quanto das pirimidinas, ao passo que a azasserina bloqueia somente a síntese das purinas. Quando utilizam-se a aminopterina ou o metotrexato, o meio é suplementado com hipoxantina e timidina como fonte de nucleotídeos (meio HAT). Quando utiliza-se a azasserina, o meio é suplementado com hipoxantina. Adiciona- se ouabaína se a fonte de células B for uma linha de células B humanas transformada pelo vírus Epstein Barr (EBV) a fim de eliminar as linhas transformadas pelo EBV que não se fundiram ao mieloma.
[052]O meio de seleção preferido é HAT ou HAT com ouabaína. Somente células capazes de operar vias de salvamento de nucleotídeos operacionais são capazes de sobreviver em meio HAT. As células de mieloma são deficientes em enzimas chave da via de salvamento, por exemplo, hipoxantina fosforribosil transferase (HPRT), e não sobrevivem. As células B podem operar essa via, mas têm uma expectativa de vida limitada em cultura e geralmente morrem dentro de cerca de duas semanas. Logo, as únicas células capazes de sobreviver no meio seletivo são os híbridos compostos por células de mieloma e células B. Quando a fonte de células B usada na fusão é uma linha de células B transformadas pelo EBV, como aqui, também utiliza-se a ouabaína para a seleção por fármaco de híbridos uma vez que as células B transformadas pelo EBV são susceptíveis à morte por fármaco, ao passo que as parceiro do mieloma usado é escolhido para que seja resistente à ouabaína.
[053]A cultura produz uma população de hibridomas da qual hibridomas específicos são selecionados. Tipicamente, a seleção de hibridomas é realizada cultivando as células por diluição em clone único em placas de microtitulação e, em seguida, testando os sobrenadantes clonais individuais (após cerca de duas a três semanas) quanto à reatividade desejada. O ensaio deve ser sensível, simples e rápido, tal como radioimunoensaios, imunoensaios enzimáticos, ensaios de citotoxicidade, ensaios em placas, ensaios de imunoligação dot, e seus semelhantes.
[054]Os hibridomas selecionados são então diluídos em série ou separados em células simples por separação por citometria de fluxo e clonados em linhas celulares produtoras de anticorpo individuais, cujos clones podem ser então propagados indefinidamente para obter mAbs. As linhas celulares podem ser exploradas para a produção de mAbs de duas maneiras básicas. Uma amostra do hibridoma pode ser injetada (tipicamente na cavidade peritoneal) em um animal (por exemplo, camundongo). Como opção, os animais são preparados com um hidrocarboneto, em especial óleos tais como pristano (tetrametilpentadecano), antes da injeção. Quando hibridomas humanos são usados dessa maneira, o ideal é injetá-los em camundongos imunocomprometidos, tais como camundongos SCID, a fim de prevenir a rejeição do tumor. O animal que recebe a injeção desenvolve tumores que secretam o anticorpo monoclonal específico produzido pela célula híbrida fusionada. Os fluidos corporais do animal, tais como soro ou fluido ascítico, podem ser então puncionados para obter mAbs em alta concentração. As linhas celulares individuais também poderiam ser cultivadas in vitro, onde os mAbs são secretados naturalmente no meio de cultura, do qual podem ser prontamente obtidos em altas concentrações. Como alternativa, linhas de células de hibridoma humanas podem ser usadas in vitro para produzir imunoglobulinas no sobrenadante celular. As linhas celulares podem ser adaptadas para crescimento em meio isento de soro a fim de otimizar a capacidade de recuperar imunoglobulinas monoclonais humanas de alta pureza.
[055]Os anticorpos monoclonais produzidos por qualquer um dos meios podem ser adicionalmente purificados, se desejado, por filtragem, centrifugação e vários métodos cromatográficos, tais como FPLC ou cromatografia de afinidade. Fragmentos dos anticorpos monoclonais da invenção podem ser obtidos a partir dos anticorpos monoclonais purificados por métodos que incluem digestão com enzimas, tais como pepsina ou papaína, e/ou clivagem de ligações dissulfeto por redução química. Como alternativa, fragmentos de anticorpos monoclonais abrangidos pela presente invenção podem ser sintetizados usando um sintetizador peptídico automatizado.
[056]Também contempla-se o uso de uma abordagem de clonagem molecular para gerar anticorpos monoclonais. Para tanto, o RNA pode ser isolado da linha de hibridoma, e os genes de anticorpo podem ser obtidos por RT-PCR e clonados em um vetor de expressão de imunoglobulina. Como alternativa, bibliotecas combinatórias de imunoglobulinas e fagomídeos são preparadas a partir do RNA isolado das linhas celulares, e fagomídeos expressando os anticorpos apropriados são selecionados por panning usando antígenos virais. As vantagens dessa abordagem em relação às técnicas convencionais de hibridoma são que cerca de 104 vezes mais anticorpos podem ser produzidos e triados em uma única rodada e que novas especificidades são geradas pela combinação de cadeias H e L, o que aumenta ainda mais a chance de encontrar anticorpos apropriados.
[057]Bibliotecas de anticorpos à base de levedura podem ser desenvolvidas de maneira racional, e os anticorpos podem ser selecionados e/ou isolados a partir dessas bibliotecas de apresentação de anticorpos à base de levedura como revelado, por exemplo, na WO2012/009568; WO2009/036379; WO2010/105256; WO2003/074679; Patente dos EUA 8.691.730; e Patente dos EUA 9.354.228. Os anticorpos podem ser expressos como IgGs de comprimento total de qualquer tipo celular desejado, conforme revelado acima, e purificados.
[058]Outras patentes dos EUA, cada uma incorporada a este documento por referência, que ensinam a produção de anticorpos úteis na presente invenção incluem a Patente dos EUA 5.565.332, que descreve a produção de anticorpos quiméricos usando uma abordagem combinatória; a Patente dos EUA 4.816.567, que descreve preparados de imunoglobulina recombinante; e a Patente dos EUA
4.867.973, que descreve conjugados anticorpo-agente terapêutico. B. Anticorpos da presente invenção
[059]Anticorpos de acordo com a presente invenção podem ser definidos, no primeiro caso, por sua especificidade de ligação, isto é, ligação com o PD-L1 e PD- L2. Os versados na técnica, ao avaliar a especificidade/afinidade de ligação de dado anticorpo usando técnicas bem conhecidas dos mesmos, podem determinar se esses anticorpos enquadram-se no âmbito das reivindicações da presente invenção. Em um aspecto, são propostos anticorpos monoclonais com CDRs pareadas com clone dentre as cadeias pesadas e leves conforme ilustradas nas Tabelas 3 e 4, respectivamente. Esses anticorpos podem ser produzidos pelos clones discutidos abaixo na seção Exemplos usando métodos descritos neste documento.
[060]Em um segundo aspecto, os anticorpos podem ser definidos por sua sequência variável, o que inclui regiões de “framework” adicionais. Nas Tabelas 1 e
2, são propostas sequências que codificam ou representam regiões variáveis completas. Além disso, as sequências de anticorpos podem variar em relação a essas sequências, opcionalmente usando métodos discutidos em mais detalhes abaixo. Por exemplo, sequências de ácidos nucleicos podem variar das definidas acima no que (a) as regiões variáveis podem ser removidas por segregação dos domínios constantes das cadeias leves e pesadas, (b) os ácidos nucleicos podem variar em relação aos definidos acima, embora sem afetar os resíduos codificados por eles, (c) os ácidos nucleicos podem variar em relação aos definidos acima em dada porcentagem, por exemplo, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de homologia, (d) os ácidos nucleicos podem variar em relação aos definidos acima em virtude da capacidade de hibridizar em condições de alta estringência, conforme exemplificado por condições de baixo teor de sal e/ou alta temperatura, tal como permitido por cerca de 0,02 M a cerca de 0,15 M de NaCl a temperaturas de cerca de 50° C a cerca de 70° C, (e) os aminoácidos podem variar em relação aos definidos acima em dada porcentagem, por exemplo, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de homologia, ou (f) os aminoácidos podem variar em relação aos definidos acima ao permitir substituições conservadoras (discutidas abaixo). Cada um dos supracitados aplica-se às sequências de ácido nucleico conforme estabelecidas na Tabela 1 e às sequências de aminoácidos da Tabela 2. C. Engenharia das sequências de anticorpo
[061]Em várias modalidades, pode-se optar por modificar sequências dos anticorpos identificados por uma variedade de motivos, tais como expressão aprimorada, reatividade cruzada aprimorada ou menor ligação fora do alvo. A seguir, apresenta-se uma discussão geral de técnicas relevantes para a engenharia de anticorpos.
[062]Hibridomas podem ser cultivados, em seguidas as células lisadas e o RNA total extraído. Hexâmeros aleatórios podem ser usados com RT para gerar cópias cDNA de RNA, e, em seguida, realizar-se a PCR usando uma mistura multiplex de iniciadores de PCR, cuja expectativa é de que amplifiquem todas as sequências gênicas variáveis humanas. O produto da PCR pode ser então clonado no vetor pGEM-T Easy e, em seguida, sequenciado por sequenciamento de DNA automatizado usando iniciadores de vetor padrão. O ensaio de ligação e neutralização pode ser realizado usando anticorpos coletados de sobrenadantes de hibridoma e purificados por FPLC, usando colunas de Proteína G.
[063]Anticorpos IgG recombinantes de comprimento total podem ser gerados subclonando Fv DNAs de cadeia pesada e leve do vetor de clonagem em um vetor plasmídeo de IgG, transfectando em células 293 Freestyle ou células CHO e coletando e purificando os anticorpos a partir do sobrenadante de células 293 ou CHO.
[064]A rápida disponibilidade de anticorpos produzidos na mesma célula hospedeira e processo de cultura celular que o processo de fabricação final cGMP tem potencial para reduzir a duração dos programas de desenvolvimento de processo. A Lonza desenvolveu um método genético usando transfectantes aglomerados cultivados em meio CDACF para a rápida produção de pequenas quantidades (até 50 g) de anticorpos em células CHO. Embora levemente mais lento do que um verdadeiro sistema transiente, as vantagens incluem maior concentração do produto e o uso do mesmo hospedeiro e processo que a linha celular de produção. Exemplo do crescimento e produtividade de aglomerados GS-CHO, expressando um anticorpo modelo, em um biorreator descartável: em uma cultura de biorreator em bolsa descartável (volume de trabalho de 5 L) operada em modo batelada alimentada, obteve-se uma concentração do anticorpo coletado de 2 g/L dentro de 9 semanas de transfecção.
[065]Anticorpos, e bibliotecas de anticorpos das quais esses anticorpos podem ser selecionados e/ou isolados, podem ser desenvolvidos e sintetizados de maneira racional, tal como pela tecnologia Adimab®, conforme revelado, por exemplo, na WO2012/009568; WO2009/036379, WO2010/105256, WO2003/074679, Patente dos EUA 8.691.730 e Patente dos EUA 9.354.228. Esse método de anticorpos sintéticos requer que a codificação da sequência de nucleotídeo para o anticorpo desejado ou desenvolvido seja inserida em um vetor para a expressão ectópica. Em seguida, os anticorpos desejados podem ser expressos como moléculas de IgG de cadeia total e purificados.
[066]As moléculas de anticorpo compreenderão fragmentos (tais como F(ab’), F(ab’)2) que são produzidos, por exemplo, pela clivagem proteolítica dos mAbs, ou imunoglobulinas de cadeia única produzíveis, por exemplo, via meio recombinante. Esses derivados de anticorpo são monovalentes. Em uma modalidade, esses fragmentos podem ser combinados uns aos outros, ou a outros fragmentos de anticorpo ou ligantes receptores para formar moléculas de ligação "quiméricas". Significativamente, essas moléculas quiméricas podem conter substituintes capazes de ligar-se a diferentes epítopos da mesma molécula.
[067]Em modalidades relacionadas, o anticorpo é um derivado dos anticorpos revelados, por exemplo, um anticorpo que compreende sequências CDR idênticas às sequências nos anticorpos revelados (por exemplo, um anticorpo quimérico ou enxertado com CDR). Como alternativa, pode-se desejar fazer modificações, tais como introduzir mudanças conservadoras em uma molécula de anticorpo. Ao fazer essas mudanças, leva-se em consideração o índice hidropático dos aminoácidos. A importância do índice hidropático dos aminoácidos em conferir função biológica interativa a uma proteína é largamente entendido na técnica (Kyte e Doolittle, 1982). Aceita-se que o caráter hidropático relativo dos aminoácidos contribui para a estrutura secundária da proteína resultante, que, por sua vez, define a interação da proteína com outras moléculas, por exemplo, enzimas, substratos, receptores, DNA, anticorpos, antígenos e seus semelhantes.
[068]Também entende-se na técnica que a substituição de aminoácidos similares pode ser realizada com eficiência com base na hidrofilia. A Patente dos EUA 4.554.101, incorporada ao presente documento por referência, afirma que a maior hidrofilia média local de uma proteína, conforme regida pela hidrofilia de seus aminoácidos adjacentes, correlaciona-se a uma propriedade biológica da proteína. Conforme detalhado na Patente dos EUA 4.554.101, os valores de hidrofilia a seguir foram atribuídos a resíduos de aminoácido: aminoácidos básicos: arginina (+3,0), lisina (+3,0) e histidina (-0,5); aminoácidos ácidos: aspartato (+3,0 ± 1), glutamato (+3,0 ± 1), asparagina (+0,2) e glutamina (+0,2); aminoácidos não iônicos hidrófilos: serina (+0,3), asparagina (+0,2), glutamina (+0,2) e treonina (-0,4), aminoácidos contendo enxofre: cisteína (-1,0) e metionina (-1,3); aminoácidos não aromáticos hidrófobos: valina (-1,5), leucina (-1,8), isoleucina (-1,8), prolina (-0,5 ± 1), alanina (- 0,5) e glicina (0); aminoácidos aromáticos hidrófobos: triptofano (-3,4), fenilalanina (- 2,5) e tirosina (-2,3).
[069]Entende-se que um aminoácido pode ser substituído por outro com hidrofilia semelhante e produzir uma proteína biológica ou imunologicamente modificada. Nessas mudanças, a substituição de aminoácidos cujos valores de hidrofilia encontram-se dentro de ±2 é preferida, daqueles cujos valores encontram- se dentro de ±1 é particularmente preferida, e daqueles cujos valores encontram-se dentro de ±0,5 é ainda mais particularmente preferida.
[070]Conforme delineado acima, as substituições de aminoácidos geralmente baseiam-se na similaridade relativa dos substituintes de cadeia lateral dos aminoácidos, por exemplo, em sua hidrofobia, hidrofilia, carga, tamanho e seus semelhantes. Substituições exemplificativas que levam em conta as várias características acima são bem conhecidas dos versados na técnica e incluem:
arginina e lisina; glutamato e aspartato; serina e treonina; glutamina e asparagina; e valina, leucina e isoleucina.
[071]A presente invenção também contempla a modificação do isótipo. Ao modificar a região Fc para que tenha um isótipo diferente, diferentes funcionalidades podem ser obtidas. Por exemplo, a mudança para IgG1 pode aumentar a citotoxicidade celular dependente de anticorpos, a troca para a classe A pode aprimorar a distribuição nos tecidos e a troca para a classe M pode aprimorar a valência.
[072]Anticorpos modificados podem ser obtidos por qualquer técnica conhecida pelos versados na técnica, inclusive expressão através de técnicas biológicas moleculares padrão, ou a síntese química de polipeptídeos. Métodos para a expressão recombinante são tratados em outras partes neste documento. D. Anticorpos de cadeia única
[073]Um Fragmento Variável de Cadeia Única (scFv) é uma fusão das regiões variáveis das cadeias pesadas e leves de imunoglobulinas, interligadas com um ligante curto (tipicamente serina, glicina). Essa molécula quimérica retém a especificidade da imunoglobulina original, apesar da remoção das regiões constantes e da introdução de um peptídeo ligante. Essa modificação tipicamente mantém a especificidade inalterada. Essas moléculas foram criadas historicamente para facilitar o phage display, onde é altamente conveniente expressar o domínio de ligação com antígeno como um peptídeo único. Como alternativa, o scFv pode ser criado diretamente a partir de cadeias pesadas e leves subclonadas derivadas de um hibridoma. Os fragmentos variáveis de cadeia única carecem da região Fc constante encontrada em moléculas de anticorpo inteiras e, portanto, nos sítios de ligação em comum (por exemplo, proteína A/G) usados para purificar anticorpos. Frequentemente, esses fragmentos podem ser purificados/imobilizados usando a Proteína L, visto que esta interage com a região variável de cadeias leves kappa.
[074]Ligantes flexíveis geralmente são compostos por resíduos de aminoácido promotores de hélices ou voltas, tais como alaína, serina e glicina. No entanto, outros resíduos também podem funcionar. Tang et al. (1996) usaram o phage display como um meio para selecionar rapidamente ligantes sob medida para anticorpos de cadeia única (scFvs) em bibliotecas de ligantes de proteína. Construiu- se uma biblioteca de ligantes aleatórios, na qual os genes para os domínios variáveis de cadeia pesada e leve foram ligados por um segmento que codificava um polipeptídeo de 18 aminoácidos de composição variável. O repertório de scFv (cerca de 5 × 106 membros diferentes) foi exibido em um fago filamentoso e submetido a seleção por afinidade com hapteno. A população de variantes selecionados exibiu aumentos significativos na atividade de ligação, mas manteve considerável diversidade nas sequências. A triagem de 1054 variantes individuais subsequentemente produziu um scFv cataliticamente ativo, que foi produzido com eficiência em forma solúvel. A análise de sequências revelou uma prolina conservada nos dois resíduos ligantes após o terminal C VH e abundância de argininas e prolinas em outras posições como as únicas características em comum dos tethers selecionados.
[075]Os anticorpos recombinantes da presente invenção também podem envolver sequências ou grupamentos que permitam a dimerização ou multimerização dos receptores. Essas sequências incluem as derivadas da IgA, que permitem a formação de multímeros junto com a cadeia J. Outro domínio de multimerização é o domínio de dimerização Gal4. Em outras modalidades, as cadeias podem ser modificadas com agentes, tais como biotina/avidina, que permitem a combinação de dois anticorpos.
[076]Em uma modalidade diferente, um anticorpo de cadeia única pode ser criado unindo cadeias leves e pesadas receptoras por meio de um ligante não peptídico ou unidade química. Em termos gerais, as cadeias leves e pesadas serão produzidas em diferentes células, purificadas e, subsequentemente, unidas de maneira apropriada (isto é, o terminal N da cadeia pesada sendo ligado ao terminal C da cadeia leve através de uma ponte química apropriada).
[077]Utilizam-se reagentes reticulantes para formar pontes moleculares que unem grupos funcionais de duas moléculas diferentes, por exemplo, um agente estabilizante e coagulante. No entanto, contempla-se a criação de dímeros ou multímeros dos mesmos complexos analógicos ou heteroméricos compostos por diferentes análogos. Para ligar dois compostos diferentes de maneira em etapas, podem-se utilizar reticulantes heterobifuncionais, os quais eliminam a formação indesejada de homopolímeros.
[078]Um exemplo de reticulante heterobifuncional contém dois grupos reativos: um que reage com o grupo amina primário (por exemplo, N-hidróxi succinimida) e o outro que reage com um grupo tiol (por exemplo, piridil dissulfeto, maleimidas, halogênios etc.). Através do grupo reativo amina primário, o reticulante pode reagir com o(s) resíduo(s) de lisina de uma proteína (por exemplo, o anticorpo ou fragmento selecionado) e, através do grupo reativo tiol, o reticulante, já vinculado à primeira proteína, reage com o resíduo de cisteína (grupo sulfidrila livre) da outra proteína (por exemplo, o agente seletivo).
[079]É preferível que empregue-se um reticulante com estabilidade razoável no sangue. Há conhecimento de inúmeros tipos de ligantes contendo ligação dissulfeto que podem ser empregados com êxito para conjugar agentes de direcionamento e agentes terapêuticos/preventivos. Ligantes contendo uma ligação dissulfeto que é estericamente impedida podem provar conferir maior estabilidade in vivo, prevenindo a liberação do peptídeo de direcionamento antes que ele chegue ao sítio de ação. Esses ligantes constituem, portanto, um grupo de agentes ligantes.
[080]Outro reagente reticulante é o SMPT, que é um reticulante bifuncional com uma ligação dissulfeto "estericamente impedida" por um anel benzeno e grupos metila adjacentes. Acredita-se que o impedimento estérico da ligação dissulfeto serve à função de proteger a ligação do ataque por ânions tiolatos, tais como glutationa, que podem se fazer presentes nos tecidos e no sangue, e, com isso, ajuda a prevenir o desacoplamento do conjugado antes da liberação do agente ligado ao sítio alvo.
[081]O reagente reticulante SMPT, tal como com muitos outros reagentes reticulantes conhecidos, empresta a capacidade de reticular grupos funcionais como o SH da cisteína ou aminas primárias (por exemplo, o grupo ε-amino da lisina). Outro tipo possível de reticulante inclui as fenilazidas fotorreativas heterobifuncionais contendo uma ligação dissulfeto clivável, tal como sulfossuccinimidil-2-(p- azidossalicilamido)etil-1,3'-ditiopropionato. O grupo N-hidróxi-succinimidila reage com os grupos amino primários, e a fenilazida (quando da fotólise) reage não seletivamente com qualquer resíduo de aminoácido.
[082]Além de reticulantes impedidos, ligantes não impedidos também podem ser empregados de acordo com o aqui exposto. Outros reticulantes úteis, que não acredita-se que contenham ou gerem um dissulfeto protegido, incluem SATA, SPDP e 2-iminotiolana (Wawrzynczak & Thorpe, 1987). O uso desses reticulantes é bem conhecido na técnica. Outra modalidade envolve o uso de ligantes flexíveis.
[083]A Patente dos EUA 4.680.338 descreve ligantes bifuncionais úteis para produzir conjugados de ligantes com polímeros e/ou proteínas que contêm amina, em especial para formar conjugados de anticorpos com quelantes, fármacos, enzimas, identificadores detectáveis e seus semelhantes. As Patentes dos EUA
5.141.648 e 5.563.250 revelam conjugados cliváveis que contêm uma ligação lábil que é clivável em uma variedade de condições brandas. Esse ligante é particularmente útil porque o agente de interesse pode ligar-se diretamente ao ligante, a clivagem resultando na liberação do agente ativo. Usos específicos incluem adicionar um grupo amino livre ou sulfidrila livre a uma proteína, tal como um anticorpo, ou a um fármaco.
[084]A Patente dos EUA 5.856.456 propõe ligantes peptídicos para uso na conexão de constituintes polipeptídicos a fim de obter proteínas de fusão, por exemplo, anticorpos de cadeia única. O ligante possui até cerca de 50 aminoácidos de comprimento, contém ao menos uma ocorrência de um aminoácido carregado (de preferência arginina ou lisina), seguido por uma prolina, e é caracterizado por maior estabilidade e menor agregação. A Patente dos EUA 5.880.270 revela ligantes contendo amino-óxi úteis em uma variedade de técnicas imunodiagnósticas e separativas. E. Purificação
[085]Em certas modalidades, os anticorpos da presente invenção podem ser purificados. Entende-se pelo termo “purificado”, conforme usado neste documento, uma composição, isolável dos demais componentes, em que a proteína é purificada em qualquer grau em relação a seu estado obtenível na natureza. Uma proteína purificada, portanto, também se refere a uma proteína livre do ambiente no qual ocorre naturalmente. Quando a expressão “substancialmente purificado” é usada, ela se refere a uma composição na qual a proteína ou peptídeo constitui o principal componente da composição, tal como respondendo por cerca de 50%, cerca de 60%, cerca de 70%, cerca de 80%, cerca de 90%, cerca de 95% ou mais das proteínas na composição.
[086]Técnicas de purificação de proteína são bem conhecidas pelos versados na técnica. Essas técnicas envolvem, em um nível, o fracionamento bruto do meio celular em frações polipeptídicas e não polipeptídicas. Tendo separado o polipeptídeo das demais proteínas, o polipeptídeo de interesse pode ser adicionalmente purificado usando técnicas cromatográficas e eletroforéticas para obter a purificação parcial ou total (ou purificação à homogeneidade). Métodos analíticos particularmente adequados ao preparo de um peptídeo puro incluem cromatografia de troca iônica, cromatografia de exclusão, eletroforese em gel de poliacrilamida, focalização isoelétrica. Outros métodos para a purificação de proteínas incluem precipitação com sulfato de amônio, PEG, anticorpos e seus semelhantes ou por desnaturação térmica, seguida por centrifugação; cromatografia de filtragem em gel, fase reversa, hidroxiapatita e afinidade; e combinações dessas e outras técnicas.
[087]Ao purificar um anticorpo da presente invenção, pode ser desejável expressar o polipeptídeo em um sistema de expressão procarionte ou eucarionte e extrair a proteína usando condições desnaturantes. O polipeptídeo pode ser purificado a partir de outros componentes celulares usando uma coluna de afinidade, que liga-se a uma porção marcada do peptídeo. Como é de conhecimento geral na técnica, acredita-se que a ordem de condução das várias etapas de purificação pode ser alterada, ou que certas etapas podem ser omitidas, e ainda assim resultar em um método adequado para o preparo de uma proteína ou peptídeo substancialmente purificado.
[088]Com frequência, anticorpos inteiros são fracionados utilizando agentes (isto é, a proteína A) que ligam-se à porção Fc do anticorpo. Como alternativa, podem-se usar antígenos para simultaneamente purificar e selecionar anticorpos apropriados. Esses métodos frequentemente utilizam o agente de seleção ligado a um suporte, tal como uma coluna, filtro ou conta. Os anticorpos são ligados a um suporte, os contaminantes são removidos (por exemplo, por lavagem), e os anticorpos são liberados por condições de aplicação (de sal, calor etc.).
[089]Vários métodos para quantificar o grau de purificação da proteína ou peptídeo serão reconhecidos pelos versados na técnica à luz da presente revelação. Esses incluem, por exemplo, determinar a atividade específica de uma fração ativa, ou avaliar a quantidade de polipeptídeos dentro de uma fração por análise
SDS/PAGE. Outro método para avaliar a pureza de uma fração consiste em calcular a atividade específica da fração, compará-la à atividade específica do extrato inicial e, então, calcular o grau de pureza. As unidades reais usadas para representar a quantidade de atividade certamente dependerão da técnica de ensaio específica escolhida para seguir a purificação e de se a proteína ou peptídeo expresso exibe ou não atividade detectável.
[090]Sabe-se que a migração de um polipeptídeo pode variar, por vezes significativamente, em diferentes condições de SDS/PAGE (Capaldi et al., 1977). Apreciar-se-á, portanto, que, em diferentes condições de eletroforese, os pesos moleculares aparentes dos produtos de expressão purificados ou parcialmente purificados variarão. IV. Fórmulas farmacêuticas e tratamento do câncer A. Cânceres
[091]O câncer decorre do supercrescimento de uma população clonal de células de tecido. O desenvolvimento do câncer, chamado de carcinogênese, pode ser modelado e caracterizado de diversas maneiras. Uma associação entre o desenvolvimento do câncer e a inflamação é contemplada faz tempo. A resposta inflamatória está envolvida na defesa do hospedeiro contra infecções microbianas e também orienta o reparo e a regeneração de tecidos. Evidências consideráveis sugerem uma conexão entre a inflamação e o risco de desenvolver câncer, isto é, uma inflamação crônica pode levar a displasia.
[092]Células cancerosas às quais os métodos da presente invenção podem ser aplicados incluem em geral qualquer célula que expresse PD-L1 ou PD-L2 e, mais particularmente, que superexpresse ou PD-L1 ou PD-L2. Uma célula cancerosa apropriada pode ser uma célula de câncer de mama, câncer de pulmão, câncer de cólon, câncer de pâncreas, câncer de rim, câncer de estômago, câncer de fígado, câncer de osso, câncer hematológico (por exemplo, leucemia ou linfoma), câncer de tecidos neurais, melanoma, câncer de ovário, câncer de testículo, câncer de próstata, câncer do colo do útero, câncer de vagina ou câncer de bexiga. Além disso, os métodos da invenção podem ser aplicados a uma ampla variedade de espécies, por exemplo, seres humanos, primatas não humanos (por exemplo, macacos, babuínos ou chimpanzés), equinos, bovinos, suínos, ovelhas, caprinos, cães, gatos, coelhos, preás, ratos-do-deserto, hamsters, ratos e camundongos. Os cânceres também podem ser recorrentes, metastáticos e/ou resistentes a múltiplos fármacos, e os métodos da presente invenção podem ser particularmente aplicados a esses cânceres a fim de torná-los ressecáveis, de prolongar ou reinduzir a remissão, de inibir a angiogênese, de prevenir ou limitar a metástase, e/ou de tratar cânceres resistentes a múltiplos fármacos. No nível celular, isso pode traduzir-se no extermínio de células cancerosas, na inibição ao crescimento de células cancerosas, ou então na reversão ou redução do fenótipo maligno nas células tumorais. B. Formulação e Administração
[093]A presente invenção propõe composições farmacêuticas que compreendem anticorpos biespecíficos dirigidos ao PD-L1 e PD-L2 (BiPDL). Em uma modalidade específica, o termo "farmaceuticamente aceitável" significa aprovado por um órgão regulador do governo federal ou estadual ou listado na Farmacopeia dos EUA ou em outra farmacopeia fundamentalmente reconhecida para uso em animais e, mais especificamente, em seres humanos. O termo "carreador" refere-se a um diluente, excipiente ou veículo com que o composto terapêutico é administrado. Esses carreadores farmacêuticos podem ser líquidos estéreis, tais como água e óleos, inclusive os originários do petróleo ou de origem animal, vegetal ou sintética, tal como óleo de amendoim, óleo de soja, óleo mineral, óleo de sésamo e seus semelhantes. Outros excipientes farmacêuticos adequados incluem amido, glicose, lactose, sacarose, solução salina, dextrose, gelatina, malte, arroz, farinha, greda, sílica-gel, estearato de sódio, monoestearato de glicerol, talco,
cloreto de sódio, leite desnatado em pó, glicerol, propileno glicol, água, etanol e seus semelhantes.
[094]As composições podem ser formuladas como formas neutras ou salinas. Sais farmaceuticamente aceitáveis incluem os formados com ânions, tais como os derivados dos ácidos clorídrico, fosfórico, acético, oxálico, tartático etc., e os formados com cátions, tais como os derivados de sódio, potássio, amônio, cálcio, hidróxidos férricos, isopropilamina, trietilamina, 2-etilamino etanol, histidina, procaína etc.
[095]Os anticorpos da presente invenção podem incluir preparados farmacêuticos clássicos. A administração dessas composições de acordo com a presente invenção dar-se-á através de qualquer via habitual, contanto que o tecido alvo faça-se disponível através dessa via. Isso inclui as vias oral, nasal, bucal, retal, vaginal ou tópica. Como alternativa, a administração pode se dar por injeção intradérmica, subcutânea, intramuscular, intraperitoneal ou intravenosa. Essas composições normalmente seriam administradas como composições farmaceuticamente aceitáveis, descritas acima. São de particular interesse a administração intratumoral direta, a perfusão de um tumor ou a administração local ou regional a um tumor, por exemplo, no sistema vascular ou linfático local ou regional, ou em um leito tumoral ressecado.
[096]Os compostos ativos também podem ser administrados parentérica ou intraperitonealmente. Soluções dos compostos ativos como bases livres ou sais farmaceuticamente aceitáveis podem ser preparadas em água misturada adequadamente a um tensoativo, tal como hidroxipropilcelulose. Dispersões também podem ser preparadas em glicerol, polietileno glicóis líquidos, e misturas desses, e em óleos. Em condições normais de armazenamento e uso, esses preparados contêm um conservante para impedir o desenvolvimento de micro-organismos.
C. Terapias combinadas
[097]No contexto da presente invenção, também contempla-se que anticorpos biespecíficos ao PD-L1 e PD-L2 (BiPDL) descritos neste documento sejam utilizados outrossim junto com intervenção quimioterápica ou radioterápica, ou outros tratamentos. Também pode provar-se eficiente, em particular, combinar anticorpos biespecíficos contra o PD-L1 e PD-L2 a outras terapias que mirem diferentes aspectos da função do PD-L1 ou PD-L2, tais como peptídeos e moléculas pequenas que mirem o domínio citoplásmico do PD-L1 ou PD-L2.
[098]Para exterminar células, inibir o crescimento celular, inibir a metástase, inibir a angiogênese ou então reverter ou reduzir o fenótipo maligno de células tumorais usando os métodos e composições da presente invenção, em geral coloca- se uma célula "alvo" em contato com um anticorpo biespecífico anti-PD-L1 e anti- PD-L2 de acordo com a presente invenção e ao menos outro agente. Essas composições seriam fornecidas em uma quantidade combinada eficaz para exterminar ou inibir a proliferação da célula. Esse processo pode envolver colocar as células em contato com o anticorpo biespecífico anti-PD-L1 e anti-PD-L2 de acordo com a presente invenção e o(s) outro(s) agente(s) ou fator(es) simultaneamente. Isso pode ser obtido colocando a célula em contato com uma composição simples ou fórmula farmacológica que inclui ambos os agentes, ou colocando a célula em contato com duas composições ou fórmulas diferentes ao mesmo tempo, em que uma composição inclui o anticorpo biespecífico anti-PD-L1 e anti-PD-L2 de acordo com a presente invenção e a outra inclui o outro agente.
[099]Como alternativa, a terapia com anticorpos biespecíficos anti-PD-L1 e anti-PD-L2 pode preceder ou suceder o tratamento com outro agente em intervalos que variam de minutos a semanas. Em modalidades em que o outro agente e o anticorpo biespecífico anti-PD-L1 e anti-PD-L2 são aplicados separadamente à célula, em geral garante-se que um intervalo de tempo significativo não transcorra entre cada distribuição, de tal modo que o agente e constructo de expressão ainda possam exercer um efeito vantajosamente combinado sobre a célula. Nesses casos, contempla-se colocar a célula em contato com ambas as modalidades espaçadas em cerca de 12 a 24 horas uma da outra e, mais preferencialmente, espaçadas em cerca de 6 a 12 horas uma da outra, sendo um tempo de demora de apenas cerca de 12 horas mais preferível. Em algumas situações, pode ser desejável prolongar significativamente o intervalo de tempo de tratamento, porém, com um lapso de vários dias (2, 3, 4, 5, 6 ou 7) a várias semanas (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8) entre as respectivas administrações.
[0100]Também é concebível que mais de uma administração do anticorpo biespecífico anti-PD-L1 e anti-PD-L2 ou do outro agente seja desejada. Várias combinações podem ser empregadas, onde um anticorpo biespecífico anti-PD-L1 e anti-PD-L2 de acordo com a terapia da presente invenção é “A” e a outra terapia é “B”, conforme exemplificado abaixo: A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B B/A/A A/B/B B/B/B/A B/B/A/B A/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/A B/A/B/A B/A/A/B B/B/B/A A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A A/B/B/B B/A/B/B B/B/A/B
[0101]A administração dos agentes terapêuticos da presente invenção a um paciente respeitarão protocolos gerais para a administração dessa terapia secundária específica, levando-se em conta a toxicidade, se alguma, do tratamento com anticorpos. Espera-se que os ciclos de tratamento sejam repetidos de acordo com o necessário. Também contempla-se que várias terapias padrão, bem como intervenção cirúrgica, possam ser aplicadas em combinação a terapias contra o câncer descritas.
[0102]Os versados na técnica são remetidos a “Remington’s Pharmaceutical Sciences”, 15ª Edição, Capítulo 33, especificamente nas páginas 624 a 652. Alguma variação na dosagem ocorrerá necessariamente dependendo da condição do paciente em tratamento. O responsável pela administração determinará, em qualquer circunstância, a dose apropriada para dado paciente. Ademais, na administração humana, os preparados devem respeitar os padrões de esterilidade, pirogenicidade, segurança geral e pureza conforme exigidos pelo Escritório de Padrões Biológicos da FDA.
1. Quimioterapia
[0103]As terapias contra o câncer também incluem uma variedade de terapias combinadas a tratamentos à base tanto de compostos químicos como de radiação. Quimioterapias combinadas incluem, por exemplo, cisplatina (CDDP), carboplatina, procarbazina, mecloretamina, ciclofosfamida, camptotecina, ifosfamida, melfalano, clorambucila, bussulfano, nitrosoureia, dactinomicina, daunorrubicina, doxorrubicina, bleomicina, plicomicina, mitomicina, etoposido (VP16), tamoxifeno, raloxifeno, agentes de ligação com o receptor de estrogênio, taxol, gemcitabieno, navelbina, inibidores da proteína farnesil transferase, transplatina, 5-fluorouracila, vincristina, vinblastina e metotrexato, Temozolomida (uma forma aquosa de DTIC), ou qualquer análogo ou variante derivada dos anteriores. A combinação de quimioterapia com terapia biológica é conhecida como bioquimioterapia. A presente invenção contempla qualquer agente quimioterápico que possa ser empregado para ou que seja conhecido na técnica por tratar ou prevenir o câncer.
2. Radioterapia
[0104]Outros fatores que causam dano ao DNA e foram usados extensivamente incluem os comumente conhecidos como raios gama, raios x e/ou distribuição dirigida de radioisótopos a células tumorais. Outras formas de fatores danosos ao DNA também são contempladas, tais como micro-ondas e radiação UV. É mais provável que todos esses fatores causem uma ampla faixa de danos ao DNA, aos precursores de DNA, à replicação e reparo do DNA e ao agrupamento e manutenção dos cromossomos. As faixas de dosagem para raios x variam de doses diárias de 50 a 200 Röentgens por períodos prolongados de tempo (de 3 a 4 semanas) a doses únicas de 2.000 a 6.000 Röentgens. As faixas de dosagem para radioisótopos variam em grande medida e dependem da meia-vida do isótopo, da força e do tipo da radiação emitida, e da absorção pelas células neoplásicas.
[0105]Os termos "colocar em contato" e "expor", quando aplicados a uma célula, são usados neste documento para descrever o processo pelo qual um agente terapêutico e um agente quimioterápico ou radioterápico são distribuídos a uma célula alvo ou são colocados em justaposição direta com a célula alvo. Para obter o extermínio ou estase celular, ambos os agentes são distribuídos a uma célula em uma quantidade combinada eficaz para exterminar a célula ou impedi-la de dividir- se.
3. Imunoterapia
[0106]Agentes imunoterápicos geralmente contam com o uso de moléculas e células efetoras de imunidade para mirar e destruir células cancerosas. A célula efetora de imunidade pode ser, por exemplo, um anticorpo específico a algum marcador na superfície de uma célula tumoral. O anticorpo sozinho pode servir como efetor da terapia ou pode recrutar outras células para efetuar o extermínio celular de fato. O anticorpo também pode ser conjugado a um fármaco ou toxina (agente quimioterápico, radionuclídeo, cadeia de ricina A, toxina do cólera, toxina da coqueluche etc.) e atuar meramente como agente direcionador. Como alternativa, o efetor pode ser um linfócito portando uma molécula de superfície que interage, ou direta ou indiretamente, com uma célula tumoral alvo. Várias células efetoras incluem células T e células NK citotóxicas. A combinação de modalidades terapêuticas, isto é, atividade citotóxica direta e inibição ou redução de Fortilina, proveria benefício terapêutico no tratamento contra o câncer.
[0107]A imunoterapia também pode ser adotada como parte de uma terapia combinada. A abordagem geral para a terapia combinada é discutida abaixo. Em um aspecto de imunoterapia, a célula tumoral deve portar algum marcador que viabilize o direcionamento, isto é, que não se faça presente na maioria das outras células. Há muitos marcadores tumorais e qualquer um deles pode ser adequado para o direcionamento no contexto da presente invenção. Marcadores celulares habituais incluem antígeno carcinoembrionário, antígeno específico da próstata, antígeno associado a tumor urinário, antígeno fetal, tirosinase (p97), gp68, TAG-72, HMFG, Antígeno Sialil Lewis, MucA, MucB, PLAP, receptor de estrógeno, receptor de laminina, erb B e p155. Um aspecto de imunoterapia alternativo refere-se a efeitos anticâncer com efeitos de estímulo da imunidade. Moléculas estimulantes da imunidade também existem, incluindo: citocinas tais como IL-2, IL-4, IL-12, GM-CSF, IFN gama, quimiocinas tais como MIP-1, MCP-1, IL-8 e fatores de crescimento tais como o ligante FLT3. A combinação de moléculas estimulantes da imunidade, ou como proteínas ou usando distribuição gênica em combinação a um supressor tumoral tal como mda-7, provaram intensificar os efeitos antitumorais (Ju et al., 2000).
[0108]Conforme já discutido antes, exemplos de imunoterapias atualmente em investigação ou em uso incluem adjuvantes imunológicos (por exemplo, Mycobacterium bovis, Plasmodium falciparum, dinitroclorobenzeno e compostos aromáticos) (Patente dos EUA 5.801.005, Patente dos EUA 5.739.169; Hui e Hashimoto, 1998; Christodoulides et al., 1998), terapia com citocinas (por exemplo, interferons, e; IL-1, GM-CSF e TNF) (Bukowski et al., 1998; Davidson et al., 1998; Hellstrand et al., 1998), terapia gênica (por exemplo, TNF, IL-1, IL-2, p53) (Qin et al., 1998; Austin-Ward e Villaseca, 1998; Patente dos EUA 5.830.880 e Patente dos EUA 5.846.945) e anticorpos monoclonais (por exemplo, anti-gangliosídeo GM2, anti-HER-2, anti-p185) (Pietras et al., 1998; Hanibuchi et al., 1998; Patente dos EUA
5.824.311). O Herceptin (trastuzumabe) é um anticorpo monoclonal quimérico (murídeo-humano) que bloqueia o receptor de HER2-neu. Ele possui atividade antitumoral e foi aprovado para uso no tratamento de tumores malignos (Dillman, 1999). A terapia combinada contra o câncer com herceptin e quimioterapia provou- se mais eficaz do que as terapias individuais. Logo, contempla-se que uma ou mais terapias anticâncer sejam empregadas com as terapias com peptídeo restringido por HLA associado a tumor descritas neste documento.
[0109]Na imunoterapia adotiva, os linfócitos circulantes do paciente, ou linfócitos infiltrados em tumor, são isolados in vitro, ativados por linfocinas tais como IL-2 ou transduzidos com genes para a necrose tumoral, e readministrados (Rosenberg et al., 1988; 1989). Para tanto, administra-se a um animal, ou paciente humano, uma quantidade imunologicamente eficaz de linfócitos ativados em combinação a uma composição peptídica incorporada com adjuvante conforme descrita neste documento. Os linfócitos ativados mais preferivelmente serão as próprias células do paciente que foram anteriormente isoladas de uma amostra sanguínea ou tumoral e ativadas (ou "expandidas") in vitro. Essa forma de imunoterapia produziu vários casos de regressão do melanoma e carcinoma renal, mas a porcentagem de pacientes que responderam a ela foi baixa em comparação aos que não responderam.
[0110]Há várias abordagens diferentes para a imunoterapia passiva do câncer. Elas podem ser categorizadas, em linhas gerais, entre as seguintes: injeção tão somente de anticorpos; injeção de anticorpos junto com toxinas ou agentes quimioterápicos; injeção de anticorpos junto com isótopos radioativos; injeção de anticorpos anti-idiotípicos; e, por fim, purgação de células tumorais na medula óssea.
[0111]Anticorpos monoclonais humanos são empregados na imunoterapia passiva, uma vez que produzem poucos ou nenhum efeito colateral no paciente. No entanto, a aplicação deles é um tanto limitada por causa de sua escassez e até hoje só foi administrada intralesionalmente. Anticorpos monoclonais humanos contra antígenos gangliosídeos foram administrados intralesionalmente a pacientes que sofriam de melanoma cutâneo recorrente (Irie & Morton, 1986). Observou-se regressão em seis de dez pacientes após injeções intralesionais diárias ou semanais. Em outro estudo, obteve-se sucesso moderado com base em injeções intralesionais de dois anticorpos monoclonais humanos (Irie et al., 1989). Possíveis anticorpos terapêuticos incluem anti-TNF, anti-CD25, anti-CD3, anti-CD20, CTLA-4- IG e anti-CD28.
[0112]Pode ser favorável administrar mais de um anticorpo monoclonal dirigido contra dois antígenos diferentes ou mesmo anticorpos com especificidade a múltiplos antígenos. Protocolos de tratamento também podem incluir a administração de linfocinas ou de outros intensificadores de imunidade, conforme descritos por Bajorin et al. (1988). O desenvolvimento de anticorpos monoclonais humanos é descrito em mais detalhes em outras partes neste relatório descritivo.
4. Terapia gênica
[0113]Em ainda outra modalidade, o tratamento secundário é uma terapia gênica em que um polinucleotídeo terapêutico é administrado antes, depois ou ao mesmo tempo que o peptídeo restringido por HLA associado a tumor é administrado. A distribuição de um vetor que codifica o peptídeo restringido por HLA associado a tumor junto com um segundo vetor que codifica um dos produtos gênicos a seguir terá um efeito anti-hiperproliferativo combinado nos tecidos alvo. Como alternativa, pode-se usar um único vetor que codifique ambos os genes. Uma variedade de proteínas encontra-se no âmbito da presente invenção, algumas das quais são descritas abaixo. Vários genes que podem ser mirados por terapia gênica de alguma forma em combinação à presente invenção são bem conhecidos pelos versados na técnica e podem compreender qualquer gene envolvido no câncer.
[0114]Indutores da proliferação celular. As proteínas que induzem à proliferação celular enquadram-se ainda em várias categorias dependendo da função. O que todas essas proteínas têm em comum é sua capacidade de regular a proliferação celular. Por exemplo, uma forma de PDGF, o oncogene sis, é um fator de crescimento secretado. Os oncogenes raramente decorrem de genes que codificam fatores de crescimento, e, atualmente, o sis é o único fator de crescimento oncogênico de ocorrência natural conhecido. Em uma modalidade da presente invenção, contempla-se que mRNA antissentido dirigido a um indutor da proliferação celular específico seja usado para prevenir a expressão do indutor da proliferação celular.
[0115]As proteínas FMS, ErbA, ErbB e neu são receptores de fatores de crescimento. Mutações a esses receptores resultam em perda da função regulável. Por exemplo, uma mutação pontual que afete o domínio transmembrana da proteína receptora Neu resulta no oncogene neu. O oncogene erbA deriva do receptor intracelular para o hormônio da tireoide. Acredita-se que o receptor de ErbA oncogênico modificado compete com o receptor do hormônio da tireoide endógeno, provocando assim o crescimento descontrolado.
[0116]A maior classe de oncogenes inclui as proteínas transdutoras de sinais (por exemplo, Src, Abl e Ras). A proteína Src é uma proteína tirosina quinase citoplásmica, e sua transformação de proto-oncogene em oncogene, em alguns casos, decorre via mutações no resíduo 527 da tirosina. Em contrapartida, a transformação da proteína ras GTPase de proto-oncogene em oncogene, em um exemplo, decorre de uma mutação de valina em glicina no aminoácido 12 na sequência, reduzindo assim a atividade da ras GTPase. As proteínas Jun, Fos e Myc são proteínas que exercem seus efeitos diretamente sobre funções nucleares como fatores de transcrição.
[0117]Inibidores da proliferação celular. Os oncogenes supressores de tumor atuam para inibir a proliferação celular excessiva. A inativação desses genes destrói sua atividade inibidora, resultando assim na proliferação descontrolada. Os supressores tumorais mais comuns são Rb, p53, p21 e p16. Outros genes que podem ser empregados de acordo com a presente invenção incluem APC, DCC, NF- 1, NF-2, WT-1, MEN-I, MEN-II, zac1, p73, VHL, C-CAM, MMAC1/PTEN, DBCCR-1, FCC, rsk-3, p27, fusões p27/p16 e fusões p21/p27.
[0118]Reguladores da morte celular programada. A apoptose, ou morte celular programada, é um processo essencial ao desenvolvimento embrionário normal, mantendo a homeostasia nos tecidos adultos e suprimindo a carcinogênese (Kerr et al., 1972). A família Bcl-2 de proteínas e as proteases similares a ICE provaram-se importantes reguladores e efetores da apoptose em outros sistemas. A proteína Bcl-2, descoberta em associação ao linfoma folicular, exerce papel proeminente no controle da apoptose e na intensificação da sobrevivência celular em resposta a diversos estímulos apoptóticos (Bakhshi et al., 1985; Cleary e Sklar, 1985; Cleary et al., 1986; Tsujimoto et al., 1985; Tsujimoto e Croce, 1986). A proteína Bcl-2 evolucionariamente conservada é reconhecida como membro de uma família de proteínas relacionadas que podem ser categorizadas como agonistas da morte ou antagonistas à morte.
[0119]Subsequentemente a sua descoberta, ficou demonstrado que a Bcl-2 atua para suprimir a morte celular provocada por uma variedade de estímulos. Além disso, agora transparece que há uma família de proteínas reguladoras da morte celular Bcl-2 que compartilha de homologias estruturais e sequenciais em comum. Esses diferentes membros da família provaram ou possuir funções semelhantes à Bcl-2 (ou exemplo, BclXL, BclW, BclS, Mcl-1, A1, Bfl-1) ou contrapor a função da Bcl-2 e promover a morte celular (por exemplo, Bax, Bak, Bik, Bim, Bid, Bad, Harakiri).
5. Cirurgia
[0120]Cerca de 60% das pessoas com câncer passarão por algum tipo de cirurgia, o que inclui cirurgia preventiva, diagnóstica ou definidora de estágio, curativa e paliativa. A cirurgia curativa é um tratamento contra o câncer que pode ser usado junto com outras terapias, tais como o tratamento da presente invenção,
quimioterapia, radioterapia, terapia hormonal, terapia com genes, imunoterapia e/ou terapias alternativas.
[0121]A cirurgia curativa inclui ressecção, em que todo ou parte do tecido canceroso é fisicamente removido, extirpado e/ou destruído. A ressecção tumoral refere-se à remoção física de ao menos parte de um tumor. Além da ressecção tumoral, o tratamento por cirurgia inclui cirurgia a laser, criocirurgia, eletrocirurgia e cirurgia microscopicamente controlada (cirurgia de Moh). Contempla-se também que a presente invenção seja usada junto com a remoção de cânceres superficiais, pré- cânceres ou quantidades incidentais de tecido normal.
[0122]Quando da extirpação de parte ou de todas as células, tecido ou tumor cancerosos, uma cavidade pode formar-se no corpo. O tratamento pode ser acompanhado por perfusão, injeção direta ou aplicação local de uma terapia anticâncer adicional nessa área. Esse tratamento pode ser repetido, por exemplo, a cada 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7 dias, a cada 1, 2, 3, 4 e 5 semanas ou a cada 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12 meses. Esses tratamentos também podem variar no que diz respeito à dosagem. V. Conjugados de anticorpo
[0123]Os anticorpos podem ser ligados a ao menos um agente para formar um conjugado de anticorpo. A fim de aumentar a eficácia das moléculas de anticorpo como agentes diagnósticos ou terapêuticos, é de praxe ligar ou ligar covalentemente ou complexar ao menos uma molécula ou grupamento desejados. Essa molécula ou grupamento pode ser, entre outros, ao menos uma molécula efetora ou repórter. Moléculas efetoras compreendem moléculas com uma atividade desejada, por exemplo, imunossupressão/anti-inflamação. Exemplos não exaustivos dessas moléculas são dados acima. Essas moléculas ligam-se opcionalmente via ligantes cliváveis desenvolvidos para permitir que as moléculas sejam liberadas no sítio alvo ou próximas a ele.
[0124]Em contrapartida, define-se uma molécula repórter como qualquer grupamento que possa ser detectado por um ensaio. Exemplos não exaustivos de moléculas repórter são conjugadas a anticorpos incluem enzimas, radiomarcadores, haptenos, marcadores fluorescentes, moléculas fosforescentes, moléculas quimioluminescentes, cromóforos, moléculas fotoafins, partículas coloridas ou ligantes, tais como biotina.
[0125]Em geral, os conjugados de anticorpo são preferidos para uso como agentes diagnósticos. Os agentes diagnósticos de anticorpo enquadram-se grosso modo em duas classes: aqueles para uso em diagnósticos in vitro, tal como em uma variedade de imunoensaios, e aqueles para uso em protocolos diagnósticos in vivo, conhecidos geralmente como "imaginadores dirigidos por anticorpo”. Muitos agentes imaginadores são conhecidos na técnica, assim como métodos para sua ligação com anticorpos (vide, por exemplo, as Patentes dos EUA 5.021.236, 4.938.948 e
4.472.509). Os grupamentos imaginadores usados podem ser íons paramagnéticos, isótopos radioativos, fluorocromos, substâncias detectáveis por RMN e agentes imaginadores de raios X.
[0126]No caso de íons paramagnéticos, pode-se mencionar, à guisa de exemplo, íons tais como cromo (III), manganês (II), ferro (III), ferro (II), cobalto (II), níquel (II), cobre (II), neodímio (III), samário (III), itérbio (III), gadolínio (III), vanádio (II), térbio (III), disprósio (III), hólmio (III) e/ou érbio (III), sendo o gadolínio particularmente preferível. Íons úteis em outros contextos, tais como imagiologia de raios X, incluem, entre outros, lantânio (III), ouro (III), chumbo (II) e especialmente bismuto (III).
[0127]No caso de isótopos radioativos para aplicação terapêutica e/ou diagnóstica, podem-se mencionar a astatina211, 14carbono, 51cromo, 36cloro, 57cobalto, 58cobalto, cobre67, 152Eu, gálio67, 3hidrogênio, iodo123, iodo125, iodo131, índio111, 59ferro, 32fósforo, rênio186, rênio188, 75selênio, 35enxofre, tecnécio99m e/ou ítrio90. O 125I é muitas vezes preferível para uso em certas modalidades, e o tecnécio99m e/ou índio111 também são frequentemente preferidos graças à sua baixa energia e à sua adequabilidade à detecção a longa distância. Anticorpos monoclonais radioativamente marcados podem ser produzidos de acordo com métodos bem conhecidos na técnica. Por exemplo, anticorpos monoclonais podem ser iodados por contato com iodeto de sódio e/ou potássio e um agente oxidante químico, tal como hipoclorito de sódio, ou um agente oxidante enzimático, tal como lactoperoxidase. Anticorpos monoclonais podem ser marcados com tecnécio99m por um processo de troca de ligantes, por exemplo, reduzindo-se o pertecnato com solução estanosa, quelando-se o tecnécio reduzido em uma coluna Sephadex e aplicando-se o anticorpo a essa coluna. Como alternativa, técnicas de marcação direta podem ser adotadas, por exemplo, incubando-se o pertecnato, um agente redutor tal como SNCl2, uma solução-tampão, tal como solução de ftalato de sódio- potássio, e o anticorpo. Grupos funcionais intermediários que frequentemente são usados para ligar radioisótopos ao anticorpo e que existem como íons metálicos incluem o ácido dietilenotriaminapentacético (DTPA) ou ácido etileno diamina tetracético (EDTA).
[0128]Dentre os marcadores fluorescentes contemplados para uso como conjugados estão o Alexa 350, Alexa 430, AMCA, BODIPY 630/650, BODIPY 650/665, BODIPY-FL, BODIPY-R6G, BODIPY-TMR, BODIPY-TRX, Cascade Blue, Cy3, Cy5,6-FAM, Isotiocianato de Fluoresceína, HEX, 6-JOE, Oregon Green 488, Oregon Green 500, Oregon Green 514, Pacific Blue, REG, Rhodamine Green, Rhodamine Red, Renografina, ROX, TAMRA, TET, Tetrametilrodamina e/ou Texas Red.
[0129]Outro tipo de conjugados de anticorpo contemplado inclui os destinados principalmente ao uso in vitro, onde o anticorpo é ligado a um ligante secundário e/ou a uma enzima (uma marca enzimática) que gerará um produto colorido quando do contato com um substrato cromogênico. Exemplos de enzimas adequadas incluem a urease, fosfatase alcalina, hidrogeno peroxidase (raiz-forte) ou glicose oxidase. Ligantes secundários preferidos incluem a biotina e a avidina e compostos de estreptavidina. O uso desses marcadores é bem conhecido pelos versados na técnica e é descrito, por exemplo, nas Patentes dos EUA 3.817.837,
3.850.752, 3.939.350, 3.996.345, 4.277.437, 4.275.149 e 4.366.241.
[0130]Ainda outro método conhecido de ligação de moléculas com anticorpos em um sítio específico compreende a reação de anticorpos com marcadores de afinidade à base de hapteno. Em essência, os marcadores de afinidade à base de hapteno reagem com aminoácidos no sítio de ligação com antígeno, destruindo assim esse sítio e bloqueando a reação do antígeno específico. No entanto, isso pode não ser vantajoso porque resulta na perda de ligação com o antígeno por parte do conjugado de anticorpo.
[0131]Moléculas contendo grupos azido também podem ser usadas para formar ligações covalentes com proteínas através de intermediários nitreno reativos que são gerados por luz ultravioleta de baixa intensidade (Potter e Haley, 1983). Em particular, análogos 2-azido e 8-azido de nucleotídeos purina foram usados como fotossondas dirigidas ao sítio para identificar proteínas de ligação com nucleotídeo em extratos celulares brutos (Owens & Haley, 1987; Atherton et al., 1985). Os nucleotídeos 2-azido e 8-azido também foram usados para mapear domínios de ligação com nucleotídeo de proteínas purificadas (Khatoon et al., 1989; King et al., 1989; Dholakia et al., 1989) e podem ser usados como agentes de ligação com anticorpo.
[0132]Vários métodos são conhecidos na técnica para a ligação ou conjugação de um anticorpo com seu grupamento conjugado. Alguns métodos de ligação envolvem o uso de um complexo metal-quelato que empregue, por exemplo, um agente quelante orgânico tal como um anidrido de ácido dietilenotriaminapentacético (DTPA); ácido etilenotriaminatetracético; N-cloro-p- toluenossulfonamida; e/ou tetracloro-3α-6α-difenilglicouril-3 ligado ao anticorpo (Patentes dos EUA 4.472.509 e 4.938.948). Anticorpos monoclonais também podem ser reagidos com uma enzima na presença de um agente de acoplamento, tal como glutaraldeído ou periodato. Conjugados com marcadores de fluoresceína são preparados na presença desses agentes de acoplamento ou por reação com um isotiocianato. Na Patente dos EUA 4.938.948, a imagiologia dos tumores de mama é obtida usando anticorpos monoclonais e os grupamentos de imagiologia detectáveis são ligados ao anticorpo usando ligantes tais como metil-p-hidroxibenzimidato ou N- succinimidil-3-(4-hidroxifenil)propionato.
[0133]Em outras modalidades, contempla-se a derivatização de imunoglobulinas introduzindo seletivamente grupos sulfidrila na região Fc de uma imunoglobulina, em condições de reação que não alterem o sítio de combinação com anticorpo. Foi revelado que os conjugados de anticorpo produzidos de acordo com essa metodologia exibem longevidade, especificidade e sensibilidade aprimoradas (Patente dos EUA 5.196.066, incorporada ao presente documento por referência). A ligação em sítio específico de moléculas efetoras ou repórteres, em que a molécula repórter ou efetora é conjugada a um resíduo de carboidrato na região Fc, também foi revelada na literatura (O’Shannessy et al., 1987). Revelou-se que essa abordagem produz anticorpos diagnóstica e terapeuticamente promissores que encontram-se atualmente em avaliação clínica. VI. Métodos de imunodetecção
[0134]Em ainda outras modalidades, há métodos de imunodetecção para ligar, purificar, remover, quantificar e de alguma outra forma detectar em geral o PD- L1 ou PD-L2 e seus antígenos associados. Alguns métodos de imunodetecção incluem ensaio de imunoabsorção ligado a enzima (ELISA), radioimunoensaio (RIA), ensaio imunorradiométrico, fluoroimunoensaio, ensaio quimioluminescente, ensaio bioluminescente e Western blot, para citar alguns. Em particular, também é proposto um ensaio competitivo para a detecção e quantificação de anticorpos contra o PD-L1 e PD-L2. Etapas de vários métodos de imunodetecção úteis foram descritas na literatura científica, tal como, por exemplo, em Doolittle e Ben-Zeev (1999), Gulbis e Galand (1993), De Jager et al. (1993), e Nakamura et al. (1987). Em termos gerais, os métodos de imunoligação incluem obter uma amostra e colocá-la em contato com um primeiro anticorpo de acordo com modalidades discutidas neste documento, como venha a ser o caso, em condições eficazes para permitir a formação de imunocomplexos.
[0135]Colocar a amostra biológica escolhida em contato com o anticorpo em condições eficazes e por um intervalo de tempo suficiente para permitir a formação de complexos imunológicos (complexos imunológicos primários) geralmente é uma questão de simplesmente adicionar a composição de anticorpos à amostra e incubar a mistura por um intervalo de tempo longo o bastante para que os anticorpos formem complexos imunológicos com os PD-L1 e os PD-L2 presentes, isto é, para que os anticorpos liguem-se aos PD-L1 e aos PD-L2 presentes. Depois disso, geralmente a composição amostra-anticorpo, tal como uma seção de tecido, placa de ELISA, dot blot ou Western blot, será lavada para remover quaisquer espécies de anticorpo ligadas de maneira não específica, permitindo assim que só os anticorpos ligados de maneira específica dentro dos complexos imunológicos primários sejam detectados.
[0136]Em termos gerais, a detecção da formação de imunocomplexos é bem conhecida na técnica e pode ser obtida através da aplicação das mais diversas abordagens. Esses métodos baseiam-se em grande medida na detecção de um identificador ou marcador, tal como qualquer uma das marcas radioativas, fluorescentes, biológicas e enzimáticas. Patentes referentes ao uso desses marcadores incluem as Patentes dos EUA 3.817.837, 3.850.752, 3.939.350,
3.996.345, 4.277.437, 4.275.149 e 4.366.241. Evidentemente, podem-se descobrir vantagens adicionais no uso de um ligante secundário, tal como um segundo anticorpo e/ou um arranjo de ligação com ligante biotina/avidina, como é de conhecimento na técnica.
[0137]O anticorpo empregado na detecção pode ser ele próprio ligado a um marcador detectável, em que simplesmente detectar-se-ia esse marcador, permitindo assim determinar a quantidade dos complexos imunológicos primários na composição. Como alternativa, o primeiro anticorpo que torna-se ligado dentro desses complexos imunológicos primários pode ser detectado por meio de um segundo ligante que possui afinidade de ligação pelo anticorpo. Nesses casos, o segundo ligante pode ligar-se a um marcador detectável. O segundo ligante ele próprio é muitas vezes um anticorpo, que, portanto, poderia ser chamado de anticorpo "secundário". Os complexos imunológicos primários são colocados em contato com o ligante, ou anticorpo, secundário marcado em condições eficazes e por um intervalo de tempo suficiente para permitir a formação de complexos imunológicos secundários. Em geral, os complexos imunológicos secundários são então lavados para remover quaisquer anticorpos ou ligantes secundários marcados ligados de maneira não específica, e o marcador remanescente nos complexos imunológicos secundários é então detectado.
[0138]Outros métodos incluem a detecção de complexos imunológicos primários por uma abordagem em duas etapas. Um segundo ligante, tal como um anticorpo com afinidade de ligação pelo anticorpo, é usado para formar complexos imunológicos secundários, conforme descrito acima. Depois de lavá-los, os complexos imunológicos secundários são colocados em contato com um terceiro ligante ou anticorpo com afinidade de ligação pelo segundo anticorpo, novamente em condições eficazes e por um intervalo de tempo suficiente para permitir a formação de complexos imunológicos (complexos imunológicos terciários). O terceiro ligante ou anticorpo é ligado a um marcador detectável, permitindo assim a detecção dos complexos imunológicos terciários formados dessa maneira. Esse sistema pode permitir a amplificação de sinais, se assim for desejado.
[0139]Um método de imunodetecção utiliza dois anticorpos diferentes. Um primeiro anticorpo biotinilado é usado para detectar o antígeno alvo, e um segundo anticorpo é então usado para detectar a biotina ligada à biotina complexada. Nesse método, a amostra a ser testada é primeiramente incubada em uma solução contendo o anticorpo da primeira etapa. Se o antígeno alvo se fizer presente, parte do anticorpo liga-se ao antígeno para formar um complexo anticorpo biotinilado/antígeno. O complexo anticorpo/antígeno é então amplificado por incubação em soluções sucessivas de estreptavidina (ou avidina), DNA biotinilado e/ou DNA biotinilado complementar, cada etapa adicionando sítios de biotina adicionais ao complexo anticorpo/antígeno. As etapas de amplificação são repetidas até obter um nível adequado de amplificação, quando então a amostra é incubada em uma solução contendo o anticorpo da segunda etapa contra a biotina. Esse anticorpo da segunda etapa é marcado, tal como, por exemplo, com uma enzima que pode ser usada para detectar a presença do complexo anticorpo/antígeno por histoenzimologia usando um substrato cromógeno. Com a amplificação adequada, é possível produzir um conjugado que é macroscopicamente visível.
[0140]Outro método conhecido de imunodetecção tira proveito da metodologia da imuno-PCR (Reação em Cadeia da Polimerase). O método da PCR é parecido com o método de Cantor até a incubação com DNA biotinilado, porém, em vez de usar múltiplas rodadas de estreptavidina e incubação do DNA biotinilado, o complexo DNA/biotina/estreptavidina/anticorpo é removido por lavagem com um tampão de baixo pH e alto teor de sal que libera o anticorpo. A solução de lavagem resultante é então usada para realizar uma reação PCR com iniciadores adequados com controles apropriados. Ao menos em teoria, a enorme capacidade de amplificação e especificidade da PCR podem ser utilizadas para detectar uma única molécula de antígeno. A. ELISAs
[0141]Imunoensaios, em seu sentido mais simples, são ensaios de ligação. Certos imunoensaios preferidos são os vários tipos de ensaios de imunoabsorção ligados a enzima (ELISAs) e radioimunoensaios (RIA) conhecidos na técnica. A detecção imuno-histoquímica usando seções de tecido também é particularmente útil. No entanto, apreciar-se-á prontamente que a detecção não se limita a essas técnicas, e western blotting, dot blotting, análises FACS e seus semelhantes também podem ser usados.
[0142]Em um ELISA exemplificativo, os anticorpos da invenção são imobilizados sobre uma superfície selecionada que exibe afinidade proteica, tal como um poço em uma placa de microtitulação de poliestireno. Em seguida, uma composição teste suspeita de conter PD-L1 e/ou PD-L2 é adicionada aos poços. Após ligação e lavagem para remover complexos imunológicos ligados de maneira não específica, o antígeno ligado pode ser detectado. A detecção pode se dar pela adição de outro anticorpo biespecífico dirigido contra o PD-L1 e PD-L2 ligado a um marcador detectável, ou de um anticorpo anti-PD-L1 ou anti-PD-L2 que é ligado a uma etiqueta detectável. Esse tipo de ELISA é um simples “ELISA sanduíche”. A detecção também pode ser obtida pela adição de um segundo anticorpo biespecífico contra PD-L1 e PD-2, ou de um anticorpo anti-PD-L1 ou anti-PD-L2, seguida por um terceiro anticorpo com afinidade de ligação pelo segundo, o terceiro anticorpo sendo ligado a um marcador detectável.
[0143]Em outro ELISA exemplificativo, as amostras suspeitas de conter o antígeno PD-L1 e/ou PD-L2 são imobilizadas sobre a superfície do poço e então colocadas em contato com um anticorpo biespecífico anti-PD-L1 e anti-PD-L2. Após ligação e lavagem para remover complexos imunológicos ligados de maneira não específica, os anticorpos biespecíficos anti-PD-L1 e anti-PD-L2 são detectados. Quando os anticorpos biespecíficos anti-PD-L1 e anti-PD-L2 iniciais são ligados a um marcador detectável, os complexos imunológicos podem ser detectados diretamente. Mais uma vez, os complexos imunológicos podem ser detectados usando um segundo anticorpo com afinidade de ligação pelo primeiro anticorpo biespecífico anti-PD-L1 e anti-PD-L2, o segundo anticorpo sendo ligado a um marcador detectável.
[0144]Independentemente do formato empregado, os ELISAs têm certas características em comum, tais como revestimento, incubação e ligação, lavagem para remover espécies ligadas de maneira não específica, e detecção dos complexos imunológicos ligados. Elas são descritas abaixo.
[0145]Ao revestir uma placa com um antígeno ou anticorpo, em geral incubam-se os poços da placa com uma solução do antígeno ou anticorpo, ou de um dia para o outro ou por um período de horas especificado. Os poços da placa são então lavados para remover o material adsorvido de maneira incompleta. Quaisquer superfícies disponíveis remanescentes dos poços são então "revestidas" com uma proteína não específica que é antigenicamente neutra em relação aos antissoros de teste. Esses incluem albumina do soro bovino (BSA), caseína ou soluções de leite em pó. O revestimento permite o bloqueio de sítios de adsorção não específicos sobre a superfície imobilizante e, portanto, reduz o ruído de fundo causado pela ligação não específica dos antissoros sobre a superfície.
[0146]Nos ELISAs, provavelmente é mais habitual utilizar uma detecção secundária ou terciária em vez de um procedimento direto. Assim, depois de ligar uma proteína ou anticorpo ao poço, de revesti-lo com um material não reativo para reduzir o ruído de fundo e de lavá-lo para remover o material não ligado, a superfície imobilizante é colocada em contato com a amostra biológica a ser testada em condições eficazes para permitir a formação de um complexo imunológico
(antígeno/anticorpo). A detecção do complexo imunológico então requer um ligante ou anticorpo secundário, e um ligante ou anticorpo secundário junto com um anticorpo terciário ou terceiro ligante marcado.
[0147]“Em condições eficazes para permitir a formação de um complexo imunológico (antígeno/anticorpo)” significa que as condições incluem, de preferência, diluir os antígenos e/ou anticorpos com soluções tais como BSA, gamaglobulina bovina (BGG) ou solução salina tamponada com fosfato (PBS)/Tween. Esses agentes adicionados também tendem a ajudar na redução do ruído de fundo não específico.
[0148]Condições “adequadas” também significam que a incubação se dará a uma temperatura ou por um intervalo de tempo suficientes para permitir uma ligação eficaz. Etapas de incubação duram tipicamente de cerca de 1 a 2 a 4 horas mais ou menos, a temperaturas de preferência da ordem de 25° C a 27° C, ou podem durar de um dia para o outro a cerca de 4° C mais ou menos.
[0149]Após todas as etapas de incubação em um ELISA, a superfície em contato é lavada a fim de remover o material não complexado. Um procedimento de lavagem preferido inclui lavagem com uma solução tal como PBS/Tween ou tampão de borato. Após a formação de complexos imunológicos específicos entre a amostra de teste e o material originalmente ligado, e lavagem subsequente, a ocorrência de quantidades até mesmo ínfimas de complexos imunológicos pode ser determinada.
[0150]Para prover um meio de detecção, o segundo ou terceiro anticorpo terá um marcador associado que permita a detecção. De preferência, ele será uma enzima que gerará o desenvolvimento de cores quando da incubação com um substrato cromogênico apropriado. Assim, por exemplo, desejar-se-á incubar ou colocar o primeiro e segundo complexos imunológicos em contato com um anticorpo conjugado com urease, glicose oxidase, alcalina fosfatase ou hidrógeno peroxidase por um intervalo de tempo e em condições que favoreçam o desenvolvimento de nova formação de complexos imunológicos (por exemplo, incubação por 2 horas a temperatura ambiente em uma solução contendo PBS tal como PBS-Tween).
[0151]Depois da incubação com o anticorpo marcado, e depois da lavagem para remover o material não ligado, a quantidade do marcador é quantificada, por exemplo, por incubação com um substrato cromogênico tal como ureia, ou púrpura de bromocresol, ou ácido 2,2'-azino-di-(3-etil-benztiazolina-6-sulfônico (ABTS), ou H2O2, no caso da peroxidase como marcador enzimático. A quantificação é então obtida medindo-se o grau de coloração gerado, por exemplo, usando-se um espectrofotômetro de espectros visíveis. B. Western Blot
[0152]O Western blot (como alternativa, imunoblot de proteínas) é uma técnica analítica usada para detectar proteínas específicas em dada amostra de homogenato ou extrato de tecido. Ele faz uso da eletroforese em gel para separar proteínas nativas ou desnaturadas pela extensão do polipeptídeo (condições desnaturantes) ou pela estrutura 3D da proteína (condições nativas/não desnaturantes). Em seguida, as proteínas são transferidas a uma membrana (tipicamente nitrocelulose ou PVDF), onde elas são sondadas (detectadas) usando anticorpos específicos à proteína alvo.
[0153]As amostras podem ser coletadas do tecido inteiro ou da cultura celular. Na maioria dos casos, tecidos sólidos são primeiramente fragmentados mecanicamente por um misturador (no caso de volumes de amostra maiores), ou por um homogeneizador (volumes menores), ou por sonicação. As células também podem ser forçadas à abertura por um dos métodos mecânicos acima. No entanto, deve-se ter em mente que amostras bacterianas, virais ou ambientais podem ser a fonte de proteínas e, assim, o Western blotting não se restringe apenas a estudos celulares. Detergentes, sais e tampões sortidos podem ser empregados para estimular a lise celular e para solubilizar proteínas. Frequentemente, adicionaram-se inibidores da protease e fosfatase para prevenir a digestão da amostra por suas próprias enzimas. O preparo dos tecidos não raro se dá a temperaturas frias para evitar a desnaturação das proteínas.
[0154]As proteínas da amostra são separadas por eletroforese em gel. A separação das proteínas pode se dar por ponto isoelétrico (pI), peso molecular, carga elétrica ou uma combinação desses fatores. A natureza da separação depende do tratamento da amostra e da natureza do gel. Essa é uma maneira muito útil de determinar uma proteína. Também é possível usar um gel bidimensional (2D) que espalhe as proteínas de uma única amostra em duas dimensões. As proteínas são separadas de acordo com o ponto isoelétrico (pH no qual exibem carga líquida neutra) na primeira dimensão, e de acordo com seu peso molecular na segunda dimensão.
[0155]A fim de tornar as proteínas acessíveis à detecção de anticorpos, elas são deslocadas de dentro do gel a uma membrana feita de nitrocelulose ou difluoreto de polivinilideno (PVDF). A membrana é posicionada sobre o gel, e uma pilha de papéis-filtro posicionada sobre eles. A pilha é toda ela inserida em uma solução-tampão que eleva o papel por ação capilar, conduzindo as proteínas junto com ele. Outro método para transferir as proteínas chama-se electroblotting e utiliza uma corrente elétrica para atrair proteínas do gel à membrana de PVDF ou nitrocelulose. As proteínas deslocam-se de dentro do gel à membrana ao mesmo tempo em que mantêm a organização que detinham dentro do gel. Como resultado desse processo de blotting, as proteínas são expostas sobre uma camada de superfície fina para detecção (vide abaixo). Ambas as variedades de membrana são escolhidas por suas propriedades de ligação com proteínas não específica (isto é, ligam-se a todas as proteínas com a mesma qualidade de ligação). A ligação com as proteínas baseia-se em interações hidrófobas, bem como em interações carregadas entre a membrana e a proteína. Membranas de nitrocelulose são mais baratas do que PVDF, porém muito mais frágeis e não suportam bem sondagens repetidas. A uniformidade e a eficácia geral da transferência de proteínas do gel à membrana podem ser averiguadas tingindo-se a membrana com corantes Coomassie Brilliant Blue ou Ponceau S. Uma vez transferidas, as proteínas são detectadas usando anticorpos primários marcados, ou anticorpos primários não marcados, seguidos por detecção indireta usando a proteína A marcada ou anticorpos secundários marcados que ligam-se à região Fc dos anticorpos primários. C. Imuno-histoquímica
[0156]Os anticorpos também podem ser usados junto com blocos de tecido recém-congelados e/ou fixados em formol e embebidos em parafina preparados para um estudo por imuno-histoquímica (IHC). O método para preparar blocos de tecido desses espécimes específicos foi usado com êxito em estudos de IHC anteriores de vários fatores prognósticos, e é bem conhecido pelos versados na técnica (Brown et al., 1990; Abbondanzo et al., 1990; Allred et al., 1990).
[0157]Em suma, seções congeladas podem ser preparadas ao reidratar 50 ng de tecido “pulverizado” congelado a temperatura ambiente em solução salina tamponada com fosfato (PBS) em pequenas cápsulas plásticas; peletizar as partículas por centrifugação; ressuspendê-las em um meio de embebição viscoso (OCT); inverter a cápsula e/ou peletizar novamente por centrifugação; congelar rapidamente (snap-freezing) em isopentano a -70° C; cortar a cápsula plástica e/ou remover o cilindro de tecido congelado; proteger o cilindro de tecido em um chuck de micrótomo criostático; e/ou cortar 25 a 50 seções em série da cápsula. Como alternativa, amostras de tecido congeladas inteiras podem ser usadas para cortes em seções seriais.
[0158]Seções permanentes podem ser preparadas por um método semelhante que envolve reidratar a amostra de 50 mg em um tubo de microfuga plástico; peletizar; ressuspender em formol a 10% durante 4 horas de fixação;
lavar/peletizar; ressuspender em ágar a 2,5% morno; peletizar; resfriar em água gelada para enrijecer o ágar; remover o bloco de tecido/ágar do tubo; infiltrar e/ou embeber o bloco em parafina; e/ou cortar 50 seções permanentes em série. Mais uma vez, amostras de tecido inteiras podem ser substituídas. D. Kits de imunodetecção
[0159]Em ainda outras modalidades, são propostos kits de imunodetecção para uso com os métodos de imunodetecção descritos acima. Os kits de imunodetecção compreenderão, portanto, em um meio recipiente adequado, um primeiro anticorpo biespecífico que liga-se a antígenos PD-L1 e/ou PD-L2 e, como opção, um reagente de imunodetecção.
[0160]Em certas modalidades, o anticorpo biespecífico ao PD-L1 e PD-L2 pode ser pré-ligado a um suporte sólido, tal como uma matriz de colunas e/ou poço de uma placa de microtitulação. Os reagentes de imunodetecção do kit podem assumir qualquer uma de uma variedade de formas, inclusive os marcadores detectáveis que são associados ou ligados ao anticorpo em questão. Marcadores detectáveis que são associados ou ligados a um ligante secundário também são contemplados. Ligantes secundários exemplificativos são aqueles anticorpos secundários que têm afinidade de ligação pelo primeiro anticorpo.
[0161]Outros reagentes de imunodetecção adequados para uso nos presentes kits incluem o reagente bicomponente que compreende um anticorpo secundário com afinidade de ligação pelo primeiro anticorpo junto com um terceiro anticorpo com afinidade de ligação pelo segundo anticorpo, o terceiro anticorpo sendo ligado a um marcador detectável. Conforme observado acima, vários marcadores exemplificativos são conhecidos na técnica e todos esses marcadores podem ser empregados em conexão com modalidades discutidas neste documento.
[0162]Os kits podem compreender ainda uma composição dividida adequadamente em alíquotas dos antígenos PD-L1 e PD-L2, marcados ou não marcados, como podem ser usados para preparar uma curva padrão para um ensaio de detecção. Os kits podem conter conjugados anticorpo-marcador ou em forma totalmente conjugada, na forma de intermediários, ou como diferentes grupamentos a ser conjugados pelo usuário do kit. Os componentes dos kits podem ser embalados em meio aquoso ou em forma liofilizada.
[0163]Os meios recipientes dos kits geralmente hão de incluir ao menos uma ampola, tubo de ensaio, frasco, garrafa, seringa ou outros meios recipientes, nos quais o anticorpo pode ser inserido ou, de preferência, adequadamente dividido em alíquotas. Os kits também incluirão um meio para conter o anticorpo, antígeno, e quaisquer outros recipientes de reagentes confinados e fechados para comercialização. Esses recipientes podem incluir recipientes plásticos moldados por injeção ou por sopro dentro dos quais as ampolas desejadas são contidas. VII. Exemplos
[0164]Os exemplos a seguir são dados para demonstrar modalidades preferidas da invenção. Os versados na técnica apreciarão que as técnicas relevadas nos exemplos a seguir representam técnicas descobertas pelo inventor que funcionam bem na prática da presente invenção e que, portanto, podem ser consideradas modos preferidos à sua prática. Todavia, os versados na técnica, à luz da presente revelação, apreciarão que várias alterações podem ser feitas às modalidades específicas reveladas e, ainda assim, obter-se um resultado igual ou semelhante sem divergir do âmbito nem da essência da invenção. Exemplo 1: Materiais e Métodos
[0165]Seleção, geração e produção de anticorpos. Embora detalhes adicionais sejam dados em Exemplos subsequentes, a seleção, geração e produção dos anticorpos revelados foram realizadas em geral de acordo com o seguinte.
[0166]Preparo dos antígenos: Os antígenos foram biotinilados usando o kit EZ-Link Sulfo-NHS-Biotinylation da Pierce. Obtiveram-se a kappa-FITC anti-humana do F(ab')2 caprino (LC-FITC), a ExtrAvidina-PE (EA-PE) e a Estreptavidina-AF633 (SA-633) junto à Southern Biotech, Sigma e Molecular Probes, respectivamente. MicroContas de Estreptavidina e colunas de separação de LC MACS foram adquiridas junto à Miltenyi Biotec. A IgG-PE anti-humana caprina (Humana-PE) foi obtida junto à Southern Biotech.
[0167]Descoberta naïve: Oito bibliotecas de leveduras sintéticas humanas naïve, cada uma com ~109 de diversidade, foram propagadas conforme já descrito previamente (vide, por exemplo, Xu et al., 2013; WO2009036379; WO2010105256; e WO2012009568). Para as primeiras duas rodadas de seleção, uma técnica de separação com contas magnéticas usando o sistema MACS da Miltenyii foi realizada, conforme já descrito previamente (vide, por exemplo, Siegel et al., 2004). Em suma, células de levedura (~1010 células/biblioteca) foram incubadas com 3 ml de 10 nM de antígeno fusão-Fc biotinilado durante 15 min a 30° C em tampão de lavagem (solução salina tamponada com fosfato (PBS)/0,1% de albumina do soro bovino (BSA)). Depois de lavar uma vez com 40 ml de tampão de água gelada, o pélete celular foi ressuspenso em 20 mL de tampão de lavagem, e MicroContas de Estreptavidina (500 μl) foram adicionadas à levedura e incubadas por 15 min a 4° C. Em seguida, a levedura foi peletizada, ressuspensa em 20 mL de tampão de lavagem e carregada em uma coluna de LS da Miltenyi. Depois de carregar os 20 mL, a coluna foi lavada por 3 vezes com 3 ml de tampão de lavagem. Em seguida, a coluna foi removida do campo magnético, e a levedura foi eluída com 5 mL de meio de crescimento e, depois disso, deixada crescer de um dia para o outro. As rodadas de seleção seguintes foram realizadas por citometria de fluxo. Cerca de 2 × 107 leveduras foram peletizadas, lavadas por três vezes com tampão de lavagem e incubadas a 30° C ou com 10 nM de antígeno fusão-Fc ou, em rodadas posteriores, com concentrações decrescentes de antígeno biotinilado (100 a 1 nM) em condições de equilíbrio, ou com 100 nM de antígenos biotinilados de diferentes espécies
(murídeas) a fim de obter reatividade cruzada entre as espécies, ou com reagente de depleção de poliespecificidade (PSR) para remover anticorpos não específicos da seleção. Para a depleção por PSR, as bibliotecas foram incubadas com uma diluição a 1:10 de reagente PSR biotinilado conforme já descrito previamente (vide, e.g., Xu et al., 2013). Em seguida, as leveduras foram lavadas por duas vezes com tampão de lavagem e tingidas com os reagentes secundários LC-FITC (diluído a 1:100) e ou SA-633 (diluído a 1:500) ou EAPE (diluído a 1:50) durante 15 min a 4° C. Depois de lavar por duas vezes com tampão de lavagem, os péletes celulares foram ressuspensos em 0,3 mL de tampão de lavagem e transferidos a tubos de separação tampados com coadores. A separação foi realizada usando um classificador FACSAria (BD Biosciences) e as portas de separação foram reguladas para selecionar anticorpos com características desejadas. As rodadas de seleção foram repetidas até obter uma população com todas as características desejadas.
[0168]A fim de gerar anticorpos com reatividade cruzada, seleções conforme descritas acima usando cada antígeno alvo, independentemente, foram alternadas de rodada em rodada para enriquecimento com especificidade dupla. Depois da rodada de classificação final, as leveduras foram plaqueadas e colônias individuais foram selecionadas para caracterização.
[0169]Embaralhamento em bateladas de cadeia leve (LCBS): A descoberta primária também incluiu um protocolo de diversificação em bateladas de cadeia leve dos plasmídeos de cadeia pesada das seleções naïve: Plasmídeos de cadeia pesada de uma saída de seleção de quatro rodadas naïve foram extraídos da levedura e transformados em uma biblioteca de cadeia leve com uma diversidade de 5 × 106. Seleções foram realizadas com uma rodada de MACS e três rodadas de FACS adotando-se as mesmas condições que na descoberta naïve.
[0170]Otimização dos anticorpos: A otimização dos anticorpos foi realizada introduzindo diversidades nas regiões variáveis de cadeia pesada e cadeia leve conforme descrito abaixo. Uma combinação de algumas dessas abordagens foi usada para cada anticorpo.
[0171]Seleção de CDRH1 e CDRH2: A CDRH3 de um anticorpo simples foi recombinada em uma biblioteca pré-construída com variantes CDRH1 e CDRH2 com uma diversidade de 1 × 108, e seleções foram realizadas com uma rodada de MACS e quatro rodadas de FACS conforme descrito para a descoberta naïve. Nas rodadas de FACS, vasculharam-se as bibliotecas por ligação PSR, reatividade cruzada entre espécies, reatividade cruzada entre antígenos e pressão de afinidade, e a classificação foi realizada a fim de obter uma população com as características desejadas. Para essas seleções, aplicaram-se pressões de afinidade ou subtitulando o antígeno monomérico biotinilado ou pré-incubando o antígeno biotinilado com o Fab-pai por 30 minutos e, em seguida, aplicando essa mistura pré-complexada à biblioteca de levedura por um intervalo de tempo que permitisse que a seleção chegasse ao equilíbrio. Foi possível então classificar os anticorpos de maior afinidade.
[0172]Seleção de VH Mut: A região variável de cadeia pesada (VH) foi mutagenizada via PCR propensa a erro. A biblioteca foi então criada transformando essa VH mutagenizada e o vetor de expressão de cadeia pesada em levedura já contendo o plasmídeo de cadeia leve do pai. Seleções foram realizadas à semelhança dos ciclos anteriores usando classificação por FACS por três rodadas. Nas rodadas de FACS, vasculharam-se as bibliotecas por reatividade cruzada e pressão de afinidade, e a classificação foi realizada a fim de obter uma população com as características desejadas.
[0173]Seleção de CDRL1, CDRL2 e CDRL3: Oligos foram ordenados a partir de IDT que contivesse o CDRL3 e foram variegados via diversidade de NNK. Os oligos CDRL3 foram duplo-fitados usando iniciadores que anelaram-se à região flanqueadora do CDRL3. Esses oligos CDRL3 de fita dupla foram então recombinados em uma biblioteca pré-construída com variantes CDRL1 e CDRL2 com uma diversidade de 3 × 105, e seleções foram realizadas com uma rodada de MACS e três rodadas de FACS conforme descrito para a descoberta naïve. Nas rodadas de FACS, vasculharam-se as bibliotecas por ligação PSR, reatividade cruzada e pressão de afinidade, e a classificação foi realizada a fim de obter uma população com as características desejadas. Pressões de afinidade para essas seleções foram realizadas conforme descrito acima para a seleção de CDRH1 e CDRH2, e aplicaram-se antígenos alternantes de rodada em rodada para enriquecimento com ligantes duplos.
[0174]Produção e purificação dos anticorpos: Clones de leveduras foram cultivados à saturação e então incubados por 48 h a 30° C com agitação. Depois da indução, as células de levedura foram peletizadas, e os sobrenadantes foram coletados para purificação. As IgGs foram purificadas usando uma coluna de Proteína A e eluídas com ácido acético, pH 2,0. Fragmentos Fab foram gerados por digestão de papaína e purificados sobre KappaSelect (GE Healthcare LifeSciences).
[0175]Medições de KD ForteBio: Medições de afinidade ForteBio foram realizadas em um Octet RED384 em geral conforme já descrito previamente (vide, por exemplo, Estep et al., 2013). Em suma, medições de afinidade ForteBio foram realizadas carregando-se IgGs on-line em sensores AHQ. Os sensores foram equilibrados off-line em tampão de ensaio por 30 min e, então, monitorados on-line por 60 segundos para determinar os dados de referência. Os sensores com IgGs carregadas foram expostos a 100 nM de antígenos por 3 minutos e, depois disso, foram transferidos ao tampão de ensaio por 3 minutos para medir a dissociação. Para avaliar a afinidade monovalente, utilizaram-se Fabs em vez de IgGs. Para essa avaliação, o antígeno fusão-Fc não biotinilado foi carregado on-line nos sensores AHQ. Os sensores foram equilibrados off-line em tampão de ensaio por 30 min e, então, monitorados on-line por 60 segundos para determinar os dados de referência.
Os sensores com antígeno carregado foram expostos a 100 nM de Fab por 3 minutos e, depois disso, foram transferidos ao tampão de ensaio por 3 para medir a dissociação. Toda a cinética foi analisada usando o modelo de ligação a 1:1.
[0176]Binagem de Epítopo/Bloqueio de Ligante ForteBio: A binagem de epítopo/bloqueio de ligante foi realizada usando um ensaio de bloqueio cruzado em formato sanduíche padrão. A IgG anti-alvo controle foi carregada em sensores AHQ, e sítios de ligação com Fc desocupados no sensor foram bloqueados com um anticorpo da IgG1 humana irrelevante. Em seguida, os sensores foram expostos a 100 nM de antígenos alvo, seguidos por um segundo anticorpo ou ligante anti-alvo. A ligação adicional com o segundo anticorpo ou ligante depois da associação com o antígeno indica um epítopo não ocupado (não competidor), ao passo que a ausência de ligação indica o bloqueio do epítopo (competidor ou bloqueio por ligante).
[0177]Medições de KD MSD-SET: Medições do equilíbrio de afinidade de anticorpos com alta afinidade selecionados foram realizadas em geral conforme já descrito previamente (Estep et al., 2013). Em suma, titulações de equilíbrio em solução (SET) foram realizadas em PBS + 0,1% de BSA sem IgG (PBSF) com o antígeno mantido constante a 50 pM e incubado com diluições seriais de Fab de 3 a 5 vezes começando a 20 nM. Os anticorpos (20 nM em PBS) foram revestidos em placas MSD-ECL de ligação padrão de um dia para o outro a 4° C ou a temperatura ambiente por 30 min. Em seguida, as placas foram bloqueadas por BSA durante 30 min com agitação a 700 rpm, seguidos por três lavagens com tampão de lavagem (PBSF + 0,05% de Tween 20). As amostras de SET foram aplicadas e incubadas nas placas por 150 s com agitação a 700 rpm, seguidos por uma lavagem. O antígeno capturado em uma placa foi detectado com 250 ng/mL de estreptavidina marcada com sulfotag em PBSF por incubação na placa por 3 min. As placas foram lavadas por três vezes com tampão de água e, em seguida, lidas no instrumento MSD Sector Imager 2400 usando 1x Tampão de Leitura T com tensoativo. A porcentagem de antígeno livre foi representada em gráfico em função do anticorpo titulado em Prisma e ajustada a uma equação quadrática para extrair o KD. Para aprimorar o desempenho, utilizaram-se robôs de manuseio de líquidos ao longo de todo os experimentos MSD-SET, inclusive no preparo das amostras de SET.
[0178]Análise da ligação celular: Cerca de 100.000 células superexpressando o antígeno foram lavadas com tampão de lavagem e incubadas com 100 µl de IgG a 100 nM durante 5 minutos a temperatura ambiente. Em seguida, as células foram lavadas por duas vezes com tampão de lavagem e incubadas com 100 μl de 1:100 PE Humana por 15 minutos em gelo. Depois disso, as células foram lavadas por duas vezes com tampão de lavagem e analisadas em um analisador FACS Canto II (BD Biosciences.)
[0179]Triagem e Caracterização dos Anticorpos. Anticorpos candidatos gerados pelos métodos de apresentação descritos acima foram testados quanto à sua capacidade em ligar-se ao PD-L1 e ao PD-L2 e em bloquear a ligação destes com a PD-1. Ligaram-se 5 µg/mL de anticorpos a células CHO-PD-L1 ou CHO-PD- L2, e, em seguida, adicionou-se PD-1 recombinante (RnD Systems) marcado com Alexa 532 (ThermoFisher) por 1 hora. Mediu-se a intensidade de fluorescência máxima da PD-1. Mediu-se o bloqueio da ligação com a PD-1 pela redução na fluorescência de Alexa 532 via citometria de fluxo. Para obter a afinidade KD pelo PD-L1 ou PD-L2 humanos, Abs BiPDL foram carregados em Biossensores de Captura de Fc Anti-Humana (AHC) a 100 nM (15 µg/mL), e a associação e dissociação das proteínas PD-L1 ou PD-L2 humanas foi testada em séries de diluição de 30 a 0,37 nM. A ligação e a liberação do analito são registradas pelo instrumento Octet em tempo real e, então, usadas para calcular Kd, Kon e Kdis; os resultados são derivados da Modelagem de Ajuste Global a 2:1 com subtração do poço de referência. Para obter a afinidade KD pelo PD-L1 ou PD-L2 murídeos, Abs BiPDL foram covalentemente imobilizados em 100 nM (15 µg/mL) de Biossensores de 2ª Geração Reativos a Amina (AR2G) ativados (temperados com etanolamina a 1 M pH 8,5 após o carregamento da proteína), e a associação e dissociação das proteínas PD-L1 e PD-L2 murídeas foram testadas em séries de diluição de 300-1 nM. A ligação e a liberação do analito são registradas pelo instrumento Octet em tempo real e, então, usadas para calcular Kd, Kon e Kdis; os resultados são derivados da Modelagem de Ajuste Global a 2:1 com subtração do poço de referência.
[0180]Atividade dos anticorpos. Concentrações variadas de anticorpos BiPDL, com backbones da IgG1 humana, foram adicionadas a células CHO expressando ou PD-L1 ou PD-L2 humano ou murídeo (células CHO-PD-L1 ou CHO- PD-L2). A ligação foi detectada pela adição do anticorpo secundário anti-IgG1 humana conjugado a ficoeritrina (PE). A análise por FACS foi realizada detectando- se a ficoeritrina para determinar a atividade de fluorescência a uma variedade de concentrações de anticorpo. A EC50 foi calculada usando o software GraphPad Prism®.
[0181]Anticorpos candidatos previnem a ligação PD-1/PD-L2. Anticorpos BiPDL candidatos e anticorpos aprovados pela FDA foram avaliados usando o sistema expressão dupla de PD-L1/PD-L2:bloqueio da PD-1 Promega. Concentrações variadas do anticorpo foram adicionadas a células CHO-PD-L1/L2. Células efetoras PD-1 são células T Jurkat que podem ser estimuladas por células CHO-PD-L1/L2. As células efetoras PD-1, que produzem a Luciferase de vagalume em resposta à ativação, foram incubadas com o anticorpo e células CHO durante 6 horas e, em seguida, os resultados foram lidos em um luminômetro usando o kit de ensaio Bio-Glo™ (Promega) de acordo com as instruções da fabricante. Para ensaios de competição, a proteína Biotina-rhPD-1-Fc foi adicionada às células e anticorpos, seguida pela adição do conjugado Estreptavidina-APC. O bloqueio foi avaliado como um aumento no sinal da luciferase. A análise foi conduzida usando o software GraphPad Prism®. Para o ensaio de competição, X foi transformado em
LogX e analisado por regressão não linear (ajuste da curva), inibição dose-resposta e Log(inibidor) vs. resposta.
[0182]Atividade de BiPDL em reações de linfócitos mistos. Monócitos CD14+ foram isolados de células mononucleares do sangue periférico usando microcontas de CD14. As células foram semeadas a 1 milhão/ml em e estimuladas com IL-4 e GM-CSF em meio de cultura celular FCS/RPMI/P/S a 10%. As células foram cultivadas por 7 dias para diferenciá-las em células dendríticas imaturas (IDCs), e adicionaram-se concentrações variadas de BiPDL ou anticorpos comerciais. IDCs foram então usadas para estimular células T CD4+ a uma razão a 10:1 de CD4:IDCs. IL-2 e IFN-γ foram ensaiados por ELISA seguindo-se os protocolos estabelecidos pela R&D systems.
[0183]Atividade dos anticorpos contra tumores de xenoenxerto. Tumores de xenoenxerto de PMBL U2940 ou câncer de mama tripo-negativo MDA-MB-231 foram estabelecidos em camundongos imunodeficientes. Permitiu-se que os tumores atingissem um volume de 150 mm3. Depois de atingir 150 mm3, os camundongos foram tratados com compostos terapêuticos de anticorpo administrados duas vezes por semana a uma taxa de 10 mg/kg durante 3 semanas com 9 camundongos por grupo de tratamento. Medições com pinça da largura, comprimento e profundidade do tumor foram usadas para calcular o volume do tumor.
[0184]Sobrevivência e crescimento do tumor em camundongos recebendo injeção de MC38-PD-L2. Mediu-se a sobrevivência para camundongos C57BL/6J implantados com células de tumor MC38-PD-L2. Implantaram-se 5 × 105 células de tumor MC38-PD-L2 subcutaneamente, as quais foram tratadas com 100 µg por via intraperitoneal dos anticorpos indicados ou tampão nos dias 3, 6, 9, 12 e 15. Medições com pinça da largura, comprimento e profundidade do tumor foram usadas para calcular o volume do tumor. As estatísticas de sobrevivência foram calculadas usando o teste de Gehran-Breslow-Wilcoxon. Para determinar as razões CD8/Treg,
implantaram-se 1,5 × 106 células de tumor MC38-PDL2 subcutaneamente em camundongos C57BL/6J em Matrigel a 30% (Corning), que foram tratadas com 100 µg do anticorpo indicado injetado intraperitonealmente nos dias 7, 10 e 13. No dia 15, os tumores foram coletados e as razões de células T CD8 infiltrantes para Treg FoxP3+ foram medidas por citometria de fluxo.
[0185]Sobrevivência de Modelo em Camundongo do Linfoma EL4. Células de linfoma de células T EL4 expressam endogenamente o PD-L1 e foram modificadas retroviralmente para expressar o PD-L2 murídeo. A expressão tanto de PD-L1 quanto de PD-L2 foi verificada por citometria de fluxo. A sobrevivência foi medida para camundongos injetados com células EL4 expressando o PD-L2 e a luciferase. Injetaram-se 1,5 × 105 células EL4-PD-L2, que também expressavam a luciferase, na veia caudal dos camundongos para estabelecer a doença sistêmica em camundongos C57BL/6J. Os camundongos foram tratados com 100 µg administrados por via intraperitoneal do anticorpo indicado nos dias 3, 6, 9, 12 e 15.
[0186]Binagem de epítopo de anticorpos BiPDL. A especificidade de ligação de uma variedade de anticorpos BiPDL foi comparada usando um ensaio de competição de ligação conduzido usando a plataforma ForteBio Octet®. A proteína marcada com His alvo (PD-L1 ou PD-L2 humano) é carregada em Biossensores Ni- NTA pré-carregados a 1 µg/mL. O primeiro anticorpo, Ab1, é saturado sobre o biossensor carregado com alvo a 100 nM, e um poço de referência (só com tampão) é incluído para determinar o sinal de ligação maximal de Ab2. O segundo anticorpo é triado quanto ao sinal de ligação também a 100 nM, e Ab1 é incluído para determinar o sinal de autobloqueio de fundo. Um software Data Analysis HT 9.0 é usado para gerar uma matriz de resposta de sinais brutos da ligação com Ab2, que é então transformada para ser expressa pela porcentagem do sinal de ligação com Ab2 não bloqueada. Menos de 15% das respostas são consideradas um bloqueio competitivo.
Exemplo 2: Resultados
[0187]Seleção de anticorpos BiPDL que ligam-se tanto ao PD-L1 quanto ao PD-L2 humanos. Dado que tanto o PD-L1 quanto o PD-L2 ligam-se à PD-1 e compartilham cerca de 40% de identidade dos aminoácidos, desenvolveu-se a hipótese de que seria possível derivar anticorpos que se ligassem a ambos os ligantes e prevenissem seu engajamento com o receptor coinibidor de células T PD-
1. Como acreditava-se que encontrar anticorpos de alta afinidade capazes da ligação bivalente com ambos os ligantes seria raro, esses anticorpos foram descobertos através de um processo de seleção iterativa do sistema de apresentação de biblioteca de anticorpos humanos totalmente à base de leveduras conforme descrito acima. Primeiramente, selecionaram-se anticorpos que se ligassem tanto ao PD-L1 quanto ao PD-L2, conforme descrito no Exemplo 1 acima, usando ligantes recombinantes fusionados a regiões constantes Fc da IgG1 humana que dimerizassem (isto é, ligassem-se avidamente), e então os maiores resultados de afinidade foram adicionalmente enriquecidos pela seleção daqueles capazes de ligar-se aos Ligantes-PD monoméricos. Essa rodada inicial de triagem produziu quatro linhagens de anticorpos diferentes capazes de ligar-se tanto ao PD-L1 quanto ao PD-L2 e bloquear a ligação destes com a PD-1 (FIGs. 1A-B). Os anticorpos foram nomeados BiPDL e utilizou-se a nomenclatura BiPDLX-YZ, onde X é a família BiPDL (Boussiotis, 2016; Cheng et al., 2013; Latchman et al., 2001; Lee et al., 2016), Y é o número de clones dentro dessa família dentro de dada geração, e Z é a geração que representa sucessivas rodadas de maturação da afinidade (Boussiotis, 2016; Cheng et al., 2013; Latchman et al., 2001; Lee et al., 2016). Clones de anticorpos individuais também são identificados pelo número de clone experimental. A Tabela 5 traz tanto a nomenclatura de BiPDL quanto o número de clones para cada um. Embora cada um desses anticorpos tenha demonstrado avidez razoavelmente alta (usando ligantes diméricos) pelo PD-L2 (Kd ≤ 2 × 10-9), somente BiPDL4 exibiu uma avidez quantificável (Kd ≤ 1 × 10-9) pelo PD-L1 humano, conforme medida por Octet (ForteBio). Vários anticorpos foram testados adicionalmente quanto à sua capacidade em atenuar a inibição de células T Jurkat pela PD-1 usando o sistema de ensaio da PD-1 Promega ao longo de uma variedade de concentrações de anticorpo e descobriu-se que somente o BiPDL4 poderia bloquear a supressão de células T induzida pelo PD-L1 (FIG. 1C)
[0188]A maturação da afinidade aumenta a capacidade funcional de BiPDL em reverter a inibição pelo PD-L1 e PD-L2 à ativação de células T. Cada um dos líderes de primeira geração, BiPDL1-11, BiPDL2-11, BiPDL3-11 e BiPDL4-11, foi submetido a maturação de afinidade de cadeia pesada para enriquecimento da ligação dos clones tanto com o PD-L1 quanto com o PD-L2 através da seleção de sequências CDR1 e CDR2 otimizadas descritas no Exemplo 1 acima. Adicionaram- se concentrações variadas de anticorpos BiPDL3 e BiPDL4 (IgG1 humana) a células CHO-PD-L1 ou CHO-PD-L2. A ligação de BiPDL3 e BiPDL4 de afinidade maturada foi detectada pela adição do anticorpo secundário anti-IgG1 humana conjugado a PE (FIGs. 2A-D). Todos os anticorpos BiPDL3 e BiPDL4 mantiveram sua capacidade em ligar-se ao PD-L1 (FIGs. 2A e 2C), embora BiPDL3-12 tenha exibido pouca atividade de ligação com o PD-L2 (FIG. 2B).
[0189]O sistema de ensaio de expressão dupla de PD-L1/PD-L2:PD-1 Promega foi utilizado para avaliar a capacidade dos clones de BiPDL4 de quarta geração em restaurar a atividade de células T Jurkat (FIG. 3). BiPDL4-11, BiPDL4-14, BiPDL4-24, BiPDL4-34 e BiPDL4-44, todos exibiram níveis semelhantes de atividade em comparação a Keytruda (anti-PD1) e superaram o Atezolizumabe e o Avelumabe. Também avaliou-se a ligação de outras famílias independentes (FIGs. 4A-F). A capacidade de BiPDL4-12 em reverter a inibição de células T Jurkat no sistema Promega aumentou tanto para PD-L1 quanto para PD-L2 em relação ao BiPDL4-pai, ao passo que BiPDL4-22 não exibiu ganho algum em sua capacidade de reverter a inibição mediada por PD-L1, mas foi capaz de reverter plenamente a supressão mediada pelo PD-L2 (FIGs. 4E-F). As medições de atividade Octet para BiPDL3-12 foram de Kd = 2,71 × 10-8 PD-L1 e 8,85 × 10-8 PD-L2 (ligante dimérico) (Tabela 5). BiPDL4-12 mediu 6,22 × 10-10 para PD-L1 e 1,74 × 10-9 para PD-L2, ao passo que BiPDL4-22 mediu 8,42 × 10-9 para PD-L1 e 3,5 × 10-10 para PD-L2 (Tabela 5).
[0190]Apesar da melhora em relação à primeira geração de BiPDL, nem BiPDL3-12 nem BiPDL4-12 nem BiPDL4-22 exibiram afinidades clinicamente relevantes por ambos PD-L1 e PD-L2. Por essa razão, realizou-se uma terceira rodada de maturação da afinidade de cadeia pesada focada em BiPDL3-12 e BiPDL4-22. Esse processo produziu anticorpos BiPDL de terceira geração com afinidades significativamente intensificadas por ambos os ligantes. As medições de afinidade Octet para BiPDL3-13 foram de Kd = 3,28 × 10-9 para PD-L1 e 4,31 × 10-10 para PD-L2 (ligante dimérico). BiPDL4-13 mediu 6,9 × 10-10 para PD-L1 e 4,9 × 10-10 para PD-L2, ao passo que BiPDL4-23 mediu 1,12 × 10-9 para PD-L1 e 3,4 × 10-10 para PD-L2. BiPDL4-13 também demonstrou afinidade mensurável por PD-L1 (Kd = 5,04 × 10-8) e por PD-L2 monovalente (Kd = 8,36 × 10-9). As afinidades monovalentes para BiPDL4-23 foram de Kd = 8,4 × 10-8 para PD-L1 e Kd = 1,66 × 10-9 para PD-L2. Todos os líderes de terceira geração puderam reverter potentemente a inibição de células T Jurkat decorrente do engajamento com PD-L2; porém, os anticorpos BiPDL4 exibiram capacidade substancialmente mais alta em reverter a supressão induzida por PD-L1 (FIG. 2C).
[0191]Uma rodada final de maturação da afinidade de cadeia leve foi realizada, conforme descrito no Exemplo 1 acima, na tentativa de aumentar a afinidade por PD-L1 de BiPDL4-13 e BiPDL4-23. Essa triagem produziu um número de líderes BiPDL com afinidades clinicamente relevantes por ambos os ligantes, sobretudo, entre eles, BiPDL4-14, BiPDL4-24, BiPDL4-34 e BiPDL4-44. As afinidades desses anticorpos pelo PD-L1 monovalente marcado com HIS medidas por Octet variaram de 2,26 a 7,90 × 10-9 para PD-L1 e 4,98 a 9,30 × 10-10 para PD-L2. Quando testados quanto à sua capacidade em restaurar células T Jurkat suprimidas no sistema Promega com células CHO estimulantes expressando tanto PD-L1 quanto PD-L2, esses anticorpos BiPDL4 de quarta geração exibiram desempenho semelhante a Keytruda (FIG. 2D). Além disso, esses BiPDL4 totalmente maturados exibiram superioridade significativa em relação a ambas as gerações anteriores de BiPDL4 e em relação aos anticorpos do PD-L1 aprovados pela FDA atezolizumabe e avelumabe.
[0192]O BiPDL4 de quarta geração engaja-se a um epítopo previamente não descrito no PD-L1. Esses anticorpos BiPDL4 de quarta geração ligam-se com alta afinidade a ambos o PD-L1 e PD-L2 humanos e cinomolgos, e também exibem reação cruzada significativa com os ligantes murídeos (Tabelas 5 e 6). Todos os quatro anticorpos BiPDL4 de quarta geração compartilham a mesma CDR3 de cadeia pesada mas diferem significativamente em outras sequências CDR de cadeia pesada e cadeia leve (Tabelas 1 a 4). Note-se que não há nenhuma semelhança significativa com nenhum dos anticorpos do PD-L1 aprovados pela FDA. Essa falta de homologia de sequência sugeriu potencial para uma especificidade de ligação exclusiva desses anticorpos de ligação com PD-L1 e PD-L2; logo, eles foram "binados” contra anticorpos do PD-L1 e PD-L2 conhecidos para determinar sua ligação com epítopo comparativa.
[0193]A binagem dos anticorpos demonstrou que todos os anticorpos BiPDL4 de quarta geração ligam-se a um epítopo no PD-L1 totalmente diferente do avelumabe e atezolizumabe (Tabela 7). Há sobreposição parcial com o epítopo do PD-L1 ligado pelo durvalumabe conforme confirmado pelos níveis de interferência intermediários. Todos os BiPDL4 ligam-se a um epítopo diferente no PD-L2 em relação aos clones disponíveis na praça 24F.10C12 e MIH18 (Tabela 8).
[0194]Os anticorpos BiPDL restauram a produção de citocinas efetoras em reações de linfócitos mistos (MLR) humanas. Anticorpos candidatos, anticorpos aprovados pela FDA ou anticorpos controle foram avaliados na presença de células dendríticas e células T induzidas de diferentes doadores e avaliados por ELISA quanto à produção de IL-2 ou IFN-γ. A expressão de PD-L1 e PD-L2 por iDC foi confirmada por citometria de fluxo (FIG. 5A). Tanto BiPDL4-14 quanto BiPDL4-34 exibiram capacidade semelhante em restaurar a secreção de IFN-γ por células T primárias humanas em comparação a anticorpos do PD-L1 e PD-1 aprovados pela FDA (FIGs. 5B e 5C). Apesar da presença de PD-L2 nesses ensaios, o efeito de PD- L1 provou-se dominante nesse contexto.
[0195]Anticorpos BiPDL com função efetora medeiam a ADCC eficiente contra células tumorais que expressam PD-L1 e PD-L2. U2940 é uma linha celular de xenoenxerto do linfoma primário do mediastino de células B (PMBL) humano que expressa altos níveis de PD-L1 (~50.000 moléculas por células) e níveis baixos a moderados de PD-L2 (~7.000 moléculas por célula). Células NK murídeas foram expandidas in vitro e incubadas por 4 horas a uma razão efetoras para alvo de 15 para 1 com células de PMBL U9240 alvo marcadas com Calceína-AM (ThermoFisher) e a concentração indicada do anticorpo. A porcentagem de lise específica foi calculada pela diferença entre a liberação experimental e a liberação espontânea sem nenhum anticorpo. Todas as gerações de BiPDL3 e BiPDL4 foram capazes de mediar a ADCC contra a U2940 (FIG. 6). BiPDL4-12 e BiPDL4-13 foram particularmente eficientes em provocar o extermínio de U2940.
[0196]BiPDL com capacidade efetora controlam o crescimento do xenoenxerto de PBML U2940 e do xenoenxerto de tumor MDA-MB-231. Implantaram-se 1 × 106 células de PMBL U2940 em camundongos SCID e permitiu- se que os tumores se estabelecessem até atingir 150 mm3. As células foram avaliadas quanto à expressão de PD-L1 e PD-L2 (FIG. 7A). Em seguida, os camundongos foram tratados duas vezes por semana com 10 mg/kg de anticorpo controle mIgG2a, Herceptin, Rituxan (U2940 é CD20+), BiPDL4-12-mIgG2a ou BiPDL4-22-mIgG2a. Ambos os anticorpos BiPDL4 retardaram significativamente o crescimento tumoral em relação ao mAb controle e também superaram o Rituxan (FIG. 7B). O mesmo experimento foi repetido com BiPDL3-13-mIgG2a e BiPDL4-13- mIgG2a e novamente demonstrou benefício terapêutico significativo de ambos os anticorpos BiPDL em comparação aos controles (FIG. 7C). Neste caso, nenhum anticorpo superou significativamente o Rituxan; porém, os únicos dois camundongos que permaneceram sem tumor (volume de tumor ≤ 20 mm3) ao fim do estudo estavam no grupo BiPDL4-13-mIgG2a.
[0197]Células de xenoenxerto de câncer de mama triplo-negativo MDA-MB- 231 (TNBC) também expressam tanto o PD-L1 quanto o PD-L2 com proporções semelhantes a U2940 (FIG. 8A). Implantaram-se 1 × 107 células de TNBC MDA-MB- 231 em camundongos SCID e permitiu-se que os tumores se estabelecessem até atingir 150 mm3. Em seguida, os camundongos foram tratados duas vezes por semana com 10 mg/kg de anticorpo controle mIgG2a, Rituxan (IgG1 humana controle), avelumabe (IgG1 humana), BiPDL4-14-hIgG1 ou BiPDL4-14-hIgG1 [S239D/I332E] modificados para uma ADCC intensificada. Neste cenário, os anticorpos BiPDL retardaram a progressão dos xenoenxertos de MDA-MB-231 com uma capacidade semelhante ao anticorpo do PD-L1 avelumabe capaz de ADCC (FIG. 8B). Essa similaridade não é surpreendente dada a alta expressão de PD-L1 em relação a PD-L2 em MDA-MB-231.
[0198]BiPDL tratam o carcinoma de cólon MC38-PD-L2 singeneico com mais eficiência do que qualquer anticorpo do PD-L1. Células de carcinoma de cólon MC38 expressam endogenamente o PD-L1 e foram modificadas retroviralmente para expressar o PD-L2 murídeo. A expressão tanto de PD-L1 quanto de PD-L2 foi confirmada por citometria de fluxo (FIG. 9C). Implantaram-se 5 × 105 MC38-PD-L2 em camundongos C57BL/6J. Nos dias 3, 6, 9, 12 e 15, os camundongos receberam injeções de 100 µg de PBS, do anticorpo anti-PD-L1 murídeo de rato 10F.9G2, dos anticorpos do PD-L1 aprovados pela FDA atezolizumabe e avelumabe ou de BiPDL4-14-hIgG1 [S239D/I332E]. A sobrevivência com o anticorpo BiPDL4 foi superior à com atezolizumabe (p = 0,026) e PBS (p = 0,004) (FIG. 9A). O crescimento tumoral também foi mais lento em camundongos tratados com BiPDL4- 14-hIgG1 [S239D/I332E] (FIG. 9B).
[0199]BiPDL geram as razões intratumorais de CD8 para Treg mais vantajosas em MC38-PD-L2. Implantaram-se 1,5 × 106 MC38-PD-L2 em camundongos C57BL/6J em Matrigel a 30% (Corning) para facilitar a recuperação de linfócitos infiltrantes. A expressão de PD-L1 e PD-L2 foi confirmada por citometria de fluxo (FIG. 10A). Os camundongos foram tratados conforme acima, salvo nos dias 7, 10 e 13, e, então, os tumores foram coletados e os linfócitos infiltrantes analisados por citometria de fluxo no dia 15. Neste caso, utilizou-se BiPDL4-14-mIgG2a em vez da variante da IgG1 humana intensificada por efetor. A razão intratumoral de células T citotóxicas CD8 para células T reguladoras FoxP3+ supressivas (Treg) foi estabelecida como um biomarcador confiável do êxito das intervenções imunoterapêuticas. Os camundongos tratados com BiPDL4-14-mIgG2a exibiram razões de CD8 para Treg médias de 10, significativamente superiores às de quaisquer animais anti-PD-L1, anti-PD-L2, anti-PD-1 ou controle (FIG. 10B).
[0200]BiPDL tratam o linfoma de células T EL4-PD-L2 singeneico com mais eficácia do que o bloqueio de anticorpos PD-L1 ou PD-L2. Células de linfoma de células T EL4 também expressam endogenamente o PD-L1 e foram modificadas retroviralmente para expressar o PD-L2 murídeo. A expressão tanto de PD-L1 quanto de PD-L2 foi confirmada por citometria de fluxo (FIG. 11A). Implantaram-se 1,5 × 105 células EL4-PD-L2, que também expressaram a Luciferase para facilitar a imagiologia bioluminescente, a fim de estabelecer a doença sistêmica em camundongos C57BL/6J.
Nos dias 3, 6, 9, 12 e 15, os camundongos receberam injeções de 100 µg de PBS, do anticorpo anti-PD-L1 murídeo de rato 10F.9G2, do anticorpo anti-PD-L2 murídeo de rato TY25, de uma combinação de 10F.9G2 e TY25, do anticorpo PD-L1 aprovado pela FDA atezolizumabe ou de BiPDL4-14- mIgG2a.
Os bloqueios de PD-L1 e PD-L2 foram ineficazes neste modelo; porém, os anticorpos BiPDL4 prolongaram significativamente a sobrevivência (p = 0,002 vs. sem tratamento; p = 0,01 vs. atezolizumabe) (FIG. 11B). Neste cenário, a função efetora do anticorpo BiPDL parece particularmente importante para a eficácia, visto que uma combinação dos anticorpos de bloqueio de PD-L1 e PD-L2 (10F.9G2 e TY25) não possui eficácia.
TABELA 1: SEQUÊNCIAS DE ÁCIDO NUCLEICO PARA REGIÕES VARIÁVEIS DE
ANTICORPO Clone Região de Sequência Variável SEQ ID Nº: 27869 CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAG 3 BiPDL4-14 CCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCGTCTGGAT de cadeia TCACCTTCGATGAGTATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGGC pesada TCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATAGGGTA
TGATGGACTGAATAAATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGC CGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGT ATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCGG TGTACTACTGCGCCAGAGCTGGAATAGAATACAGCTACGC CTATACTGATTACTGGGGACAGGGTACATTGGTCACCGTC
TCCTCA 27869 GAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGT 4 BiPDL4-14 CTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTC de cadeia AGTTCGTTTACAGCAGCGACTTAGCCTGGTACCAGCAGAA leve ACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCC
ACCAGGAAAACTGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTG GGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGA GCCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCTGCAGTTCGGAT GGTGGCCTCCTAGGACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGG
AGATCAAA 27893 CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAG 5 BiPDL4-24 CCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCGTCTGGAT de cadeia TCACCTTCGATGAGTATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGGC pesada TCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATAGGGTA
TGATGGACTGAATAAATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGC CGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGT ATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCGG TGTACTACTGCGCCAGAGCTGGAATAGAATACAGCTACGC CTATACTGATTACTGGGGACAGGGTACATTGGTCACCGTC
TCCTCA 27893 GAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGT 6 BiPDL4-24 CTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTA de cadeia ACAGTGTTGTCAGCAGCTACTTAGCCTGGTACCAGCAGAA leve ACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCAGCC
AGCAGGGCCAACGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGT GGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGG AGCCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTGTTCAGTTCGGA TGGTGGCCTCCTAGGACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTG GAGATCAAA
27907 CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGATCCAG 7 BiPDL4-34 CCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCGTCTGGAT de cadeia TCACCTTCAGTGCGTATCTTATGCACTGGGTCCGCCAGGC pesada TCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGCTATAGGTTA
TGATGGAATGAATAAATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGC CGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGT ATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCGG TGTACTACTGCGCCAGAGCTGGAATAGAATACAGCTACGC CTATACTGATTACTGGGGACAGGGTACATTGGTCACCGTC
TCCTCA 27907 GAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGT 8 BiPDL4-34 CTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTC de cadeia AGTTCGTTTACAGCAGCGACTTAGCCTGGTACCAGCAGAA leve ACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCC
GCCAGGGCCGCCGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGT GGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGG AGCCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTATGCAGTTCGGA TGGTGGCCTCCTAGGACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTT
GAGATCAAA 27924 CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGATCCAG 9 BiPDL4-44 CCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCGTCTGGAT de cadeia TCACCTTCAGTGCGTATCTTATGCACTGGGTCCGCCAGGC pesada TCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGCTATAGGTTA
TGATGGAATGAATAAATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGC CGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGT ATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCGG TGTACTACTGCGCCAGAGCTGGAATAGAATACAGCTACGC CTATACTGATTACTGGGGACAGGGTACATTGGTCACCGTC
TCCTCA 27924 GAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGT 10 BiPDL4-44 CTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTC de cadeia ACAGTGTTGTCAGCAGCTACTTAGCCTGGTACCAGCAGAA leve ACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCC
AGCAGGGAAGACGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGT GGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGG AGCCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTGTGCAGTTCGGA TGGTGGCCTCCTAGGACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTG
GAGATCAAA 21680 CAAGTACAATTACAACAGTGGGGAGCTGGTTTATTAAAGC 11 BiPDL3-13 CTTCAGAAACTTTAAGTTTGACCTGTGCTGTTTACGGTGGA de cadeia TCATTATCTGGTTATCCTTGGTCTTGGATTCGTCAACCACC pesada AGGCAAAGGATTGGAGTGGATCGGTGAGACAGACGTGTC
AGGCTGGACTGACTACAATCCAAGTTTAAAATCCAGGGTTA CTATCTCCGTAGACACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAA GCTGAGTTCTGTGACCGCCGCAGACACGGCGGTGTACTA CTGCGCCAGAGACGGCAGAAGGATGGGTACCCCTTCATT CGACATATGGGGCCAGGGTACAATGGTCACCGTCTCCTCA
21680 GACATCCAGTTGACCCAGTCTCCATCTTCCGTGTCTGCAT 12 BiPDL3-13 CTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGTCGGGCGAGTCA de cadeia GGGTATTAGCAGCTGGTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCA leve GGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCTGCATCAAGTT
TGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGAT CTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCC TGAAGATTTTGCAACTTATTACTGTCAGCAGTACGTCTACT TCCCTCCTACTTTTGGCGGAGGGACCAAGGTTGAGATCAA
A 20786 CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAG 13 BiPDL2-12 CCTGGGTCCTCGGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGA de cadeia GGCACCTTCAGCAGCTGGTTGATCAGCTGGGTGCGACAG pesada GCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAGGGATCATC
CCTATCCTGGGTACAGCACGGTACGCACAGAAGTTCCAGG GCAGAGTCACGATTACCGCGGACGAATCCACGAGCACAG CCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGG CGGTGTACTACTGCGCCAGAGTGTACAGAGCTGCTTCTTG GTTTGATCCCTGGGGACAGGGTACATTGGTCACCGTCTCC
TCA 20786 GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCAT 14 BiPDL2-12 CTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCAGGCGAGTCA de cadeia GGACATTAGCAACTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAG leve GGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTACGATGCATCCAATTT
GGAAACAGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGAAGTGGATCT GGGACAGATTTTACTTTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTG AAGATATTGCAACATATTACTGTCAGCAGCCCTTCCACCTC ATCACTTTTGGCGGAGGGACCAAGGTTGAGATCAAA
TABELA 2: SEQUÊNCIAS DE PROTEÍNA PARA REGIÕES VARIÁVEIS DE
ANTICORPO Clone Sequência Variável SEQ ID Nº: 27869
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFDEYGMHWVRQ BiPDL4-14 APGKGLEWVAVIGYDGLNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYL 15 de cadeia
QMNSLRAEDTAVYYCARAGIEYSYAYTDYWGQGTLVTVSS pesada 27869
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQFVYSSDLAWYQQKP BiPDL4-14 GQAPRLLIYGASTRKTGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDF 16 de cadeia
AVYYCLQFGWWPPRTFGGGTKVEIK leve 27893
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFDEYGMHWVRQ BiPDL4-24 APGKGLEWVAVIGYDGLNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYL 17 de cadeia
QMNSLRAEDTAVYYCARAGIEYSYAYTDYWGQGTLVTVSS pesada 27893
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASNSVVSSYLAWYQQKP BiPDL4-24 GQAPRLLIYGAASRANGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPED 18 de cadeia
FAVYYCVQFGWWPPRTFGGGTKVEIK leve 27907
QVQLVESGGGVIQPGRSLRLSCAASGFTFSAYLMHWVRQA BiPDL4-34 PGKGLEWVAAIGYDGMNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYL 19 de cadeia
QMNSLRAEDTAVYYCARAGIEYSYAYTDYWGQGTLVTVSS pesada 27907
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQFVYSSDLAWYQQKP BiPDL4-34 GQAPRLLIYGASARAAGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDF 20 de cadeia
AVYYCMQFGWWPPRTFGGGTKVEIK leve 27924
QVQLVESGGGVIQPGRSLRLSCAASGFTFSAYLMHWVRQA BiPDL4-44 PGKGLEWVAAIGYDGMNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYL 21 de cadeia
QMNSLRAEDTAVYYCARAGIEYSYAYTDYWGQGTLVTVSS pesada 27924
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASHSVVSSYLAWYQQKP BiPDL4-44 GQAPRLLIYGASSREDGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPED 22 de cadeia
FAVYYCVQFGWWPPRTFGGGTKVEIK leve 21680
QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSLSGYPWSWIRQP BiPDL3-13 PGKGLEWIGETDVSGWTDYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLK 23 de cadeia
LSSVTAADTAVYYCARDGRRMGTPSFDIWGQGTMVTVSS pesada 21680
DIQLTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPG BiPDL3-13 KAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFA 24 de cadeia
TYYCQQYVYFPPTFGGGTKVEIK leve
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSWLISWVRQA BiPDL2-12 PGQGLEWMGGIIPILGTARYAQKFQGRVTITADESTSTAYME 25 de cadeia
LSSLRSEDTAVYYCARVYRAASWFDPWGQGTLVTVSS pesada 20786
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPG BiPDL2-12 KAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIA 26 de cadeia
TYYCQQPFHLITFGGGTKVEIK leve 37464 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSLSGYPWSWIRQP BiPDL3-14 PGKGLEWIGETDVSGWTDYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLK 63 de cadeia LSSVTAADTAVYYCARDGRRMGTPSFDIWGQGTMVTVSS pesada 37464 DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGINSFLAWYQQKPG BiPDL3-14 KAPKLLIYAASSLNSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFA 64 de cadeia TYYCQKAVYFPPTFGGGTKVEIK leve 37465 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSLSGYPWSWIRQP BiPDL3-24 PGKGLEWIGETDVSGWTDYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLK 65 de cadeia LSSVTAADTAVYYCARDGRRMGTPSFDIWGQGTMVTVSS pesada 37465 DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISNFLAWYQQKPG BiPDL3-24 KAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFA 66 de cadeia TYYCQKAVYFPPTFGGGTKVEIK leve 37468 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSLSGYPWSWIRQP BiPDL3-34 PGKGLEWIGETDVSGWTDYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLK 67 de cadeia LSSVTAADTAVYYCARDGRRMGTPSFDIWGQGTMVTVSS pesada 37468 DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQDISSFLAWYQQKPG BiPDL3-34 KAPKLLIYAASSLQDGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFA 68 de cadeia TYYCQKSVYFPPTFGGGTKVEIK leve 37475 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSLSGYPWSWIRQP BiPDL3-44 PGKGLEWIGETDVSGWTDYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLK 69 de cadeia LSSVTAADTAVYYCARDGRRMGTPSFDIWGQGTMVTVSS pesada 37475 DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISTFLAWYQQKPG BiPDL3-44 KAPKLLIYAASALHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFA 70 de cadeia TYYCQRAVYFPPTFGGGTKVEIK leve 37477
QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSLSGYPWSWIRQP BiPDL3-54 PGKGLEWIGETDVSGWTDYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLK 71 de cadeia
LSSVTAADTAVYYCARDGRRMGTPSFDIWGQGTMVTVSS pesada
TABELA 3: SEQUÊNCIAS DE CADEIA PESADA DE CDR
Anticorpo CDRH1 CDRH2 CDRH3 (SEQ ID Nº: ) (SEQ ID Nº: ) (SEQ ID Nº: ) 27869 FTFDEYGMH VIGYDGLNKYYADSVKG ARAGIEYSYAYTDY BiPDL4-14 (27) (28) (29) 27893 FTFDEYGMH VIGYDGLNKYYADSVKG ARAGIEYSYAYTDY BiPDL4-24 (30) (31) (32) 27907 FTFSAYLMH AIGYDGMNKYYADSVKG ARAGIEYSYAYTDY BiPDL4-34 (33) (34) (35) 27924 FTFSAYLMH AIGYDGMNKYYADSVKG ARAGIEYSYAYTDY BiPDL4-44 (36) (37) (38) 21680 GSLSGYPWS ETDVSGWTDYNPSLKS ARDGRRMGTPSFDI BiPDL3-13 (39) (40) (41) 20786 GTFSSWLIS GIIPILGTARYAQKFQG ARVYRAASWFDP BiPDL2-12 (42) (43) (44) 37464 GSLSGYPWS ETDVSGWTDYNPSLKS ARDGRRMGTPSFDI BiPDL3-14 (72) (73) (74) 37465 GSLSGYPWS ETDVSGWTDYNPSLKS ARDGRRMGTPSFDI BiPDL3-24 (75) (76) (77) 37468 GSLSGYPWS ETDVSGWTDYNPSLKS ARDGRRMGTPSFDI BiPDL3-34 (78) (79) (80) 37475 GSLSGYPWS ETDVSGWTDYNPSLKS ARDGRRMGTPSFDI BiPDL3-44 (81) (82) (83) 37477 GSLSGYPWS ETDVSGWTDYNPSLKS ARDGRRMGTPSFDI BiPDL3-54 (84) (85) (86)
TABELA 4: SEQUÊNCIAS DE CADEIA LEVE DE CDR
Anticorpo CDRL1 CDRL2 CDRL3 (SEQ ID Nº: ) (SEQ ID Nº: ) (SEQ ID Nº: ) 27869 RASQFVYSSDLA GASTRKT LQFGWWPPRT BiPDL4-14 (45) (46) (47) 27893 RASNSVVSSYLA GAASRAN VQFGWWPPRT BiPDL4-24 (48) (49) (50) 27907 RASQFVYSSDLA GASARAA MQFGWWPPRT BiPDL4-34 (51) (52) (53) 27924 RASHSVVSSYLA GASSRED VQFGWWPPRT BiPDL4-44 (54) (55) (56) 21680 RASQGISSWLA AASSLQS QQYVYFPPT BiPDL3-13 (57) (58) (59) 20786 QASQDISNYLN DASNLET QQPFHLIT BiPDL2-12 (60) (61) (62) 37464 RASQGINSFLA AASSLNS QKAVYFPPT BiPDL3-14 (87) (88) (89) 37465 RASQGISNFLA AASSLQS QKAVYFPPT BiPDL3-24 (90) (91) (92) 37468 RASQDISSFLA AASSLQD QKSVYFPPT BiPDL3-34 (93) (94) (95) 37475 RASQGISTFLA AASALHS QRAVYFPPT BiPDL3-44 (96) (97) (98) 37477 RASKGISSFLA AADSIQS QSAVYFPPT BiPDL3-54 (99) (100) (101)
TABELA 5: NOMENCLATURA DE BiPDL
Nomenclatura de BiPDL Numeração experimental ADI BiPDL1 16413 BiPDL2 16414 BiPDL2-12 20786 BiPDL3 16415 BiPDL3-12 20780 BiPDL3-13 21680 BiPDL4-11 16418 BiPDL4-12 20769 BiPDL4-22 20775 BiPDL4-13 21661 BiPDL4-14 27869 BiPDL4-24 27893 BiPDL4-34 27907 BiPDL4-44 27924 BiPDL3-14 37464 BiPDL3-24 37465 BiPDL3-34 37468 BiPDL3-44 37475 BiPDL3-54 37477
TABELA 5: MEDIÇÕES DE AFINIDADE DA LIGAÇÃO DO ANTICORPO COM PD-L1 E PD-L2 KD Fab PD- KD IgG KD Fab PD- KD IgG KD IgG PD- KD IgG KD IgG KD IgG KD IgG KD IgG KD IgG KD Fab MSD KD Fab MSD L1-Fc PD-L2-HIS L2-Fc Família PD-L1-Fc L1-HIS PD-L2-Fc PD-L1-FC PD-L1-Fc PDL2-Fc PD-L2-Fc PD1-Fc b-PD-L1-His b-PD-L2-His Alvo Nome ADI Humana Humana Humana do clone Humana Humana Humana Cino (M) Murídea Cino (M) Murídea Humana Humana (M) Humana (M) (M) Mono- (M) Mono- (M) Mono- (M) Ávida (M) Ávida (M) Ávida Ávida (M) Ávida Ávida (M) Ávida (M) Ávida Monovalente Monovalente valente valente valente 52 PD-L1/L2 ADI-16415 7,29E-09 P.F. N.B. 7,97E-10 1,07E-07 5,34E-08 P.F. N.B. 8,24E-10 P.F. N.B. 52-g1 PD-L1/L2 ADI-20780 2,71E-08 N.D. N.B. 8,85E-08 N.D. N.B. P.F. N.B. 4,57E-08 P.F. N.B. 52-g2 PD-L1/L2 ADI-21680 3,28E-09 N.D. P.F. 4,31E-10 N.D. 1,60E-08 2,34E-09 N.B. 6,88E-10 1,22E-09 N.B.
53 PD-L1/L2 ADI-16418 9,84E-10 7,69E-10 7,83E-08 2,42E-09 P.F. 1,18E-07 1,21E-08 9,45E-10 6,64E-09 N.B. N.B. 53-g1 PD-L1/L2 ADI-20769 6,22E-10 N.D. 2,79E-08 1,74E-09 N.D. 9,84E-08 6,05E-10 4,50E-10 3,22E-09 N.B. N.B. 53-g1 PD-L1/L2 ADI-20775 8,42E-09 N.D. N.B. 3,50E-10 N.D. 1,11E-08 7,33E-09 4,57E-09 8,55E-10 1,99E-08 N.B. 53-g2 PD-L1/L2 ADI-21661 6,36E-10 N.D. 5,04E-08 3,39E-10 N.D. 8,36E-09 7,10E-10 6,29E-10 6,18E-10 P.F. N.B. 53-g3 PD-L1/L2 ADI-27869 N.D. 6,92E-10 2,26E-09 N.D. 7,38E-10 4,02E-10 5,08E-10 4,00E-10 6,40E-10 7,88E-09 N.B. 1,20E-10 1,1E-10 53-g3 PD-L1/L2 ADI-27907 N.D. 2,17E-09 6,85E-09 N.D. 9,32E-10 5,60E-10 4,08E-10 5,44E-10 7,39E-10 5,69E-09 N.B. 9,60E-10 5,2E-11 88/98
TABELA 6: MEDIÇÕES DE AFINIDADE DA LIGAÇÃO DO ANTICORPO COM PD-L1 E PD-L2 KD IgG KD Fab KD IgG KD Fab KD IgG KD IgG KD IgG KD IgG KD Fab MSD b- KD Fab MSD b- ForteBio ForteBio ForteBio PD- ForteBio PD- ForteBio PD- ForteBio PD- ForteBio PD- ForteBio PD- PD-L1-His PD-L2-His Nome BiPDL PD-L1-HiS PD-L1-FC L2-HiS L2-Fc Humana L1-FC L2-FC L1-FC Cino L2 Fc Cino Humana (M) Humana (M) Humana (M) Humana (M) Humana (M) (M) Murídea (M) Murídea (M) (M) Ávida (M) Ávida Monovalente Monovalente Monovalente Monovalente Monovalente Monovalente Ávida Ávida BiPDL4-14 2,26E-09 6,92E-10 7,38E-10 4,02E-10 5,08E-10 6,40E-10 4,00E-10 7,88E-09 1,20E-10 1,1E-10 BiPDL4-24 7,24E-09 6,57E-09 4,97E-10 4,75E-10 8,38E-10 4,58E-10 6,77E-10 6,77E-09 N.D. 1,2E-10 BiPDL4-34 6,85E-09 2,17E-09 9,32E-10 5,60E-10 4,08E-10 7,39E-10 5,44E-10 5,69E-09 9,60E-10 5,2E-11 BiPDL4-44 7,89E-09 6,00E-09 8,89E-10 4,37E-10 5,55E-10 4,17E-10 7,93E-10 4,14E-09 N.D. 1,5E-10
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TABELA 7: DETERMINAÇÃO DA SOBREPOSIÇÃO DE ANTICORPOS POR BINAGEM Anticorpo PDL1-31 PDL1-41 POL1-12 BiPDL4-11 BiPDL4-12 BiPDL4-13 BiPOL4-14 Medlmmune Tecentriq Avelumabe PDL1-31 0,68% 9,67% 2,86% 3,59% 0,89% 1,40% 0,61% 1,03% 0,75% 2,39% PDL1-41 -0,07% 4,19% 0,60% 17,19% -0,14% 8,21% -042% 0,65% -0,52% 0,37% PDL1-12 2,03% 8,01% 2,24% 3,31% 1,69% 2,19% 1,62% 2,38% 1,86% 3,14% BiPDL4-11 1,73% 38,51% 1,98% 2,41% 0,99% 1,08% 0,76% 2,12% 81,22% 78,95% BiPDL4-12 3,89% 15,84% 5,48% 7,53% 1,81% 2,60% 2,04% 4,47% 83,74% 83,62% BiPDL4-13 2,68% 20,71% 4,31% 6,52% 1,25% 1,97% 1,06% 2,85% 82,45% 80,19% BiPDL4-14 4,85% 15,88% 5,90% 8,98% 2,61% 3,02% 1,65% 5,37% 81,58% 82,55% Medlmmune 1,31% 7,75% 1,69% 3,37% 0,72% 1,23% 0,95% 0,81% 0,60% 1,98% Tecentriq 1,12% 8,57% 2,28% 84,41% 87,62% 84,48% 80,19% 1,88% 0,33% 1,88% Avelumabe 0,52% 7,59% 1,67% 86,15% 85,69% 84,99% 81,03% 1,62% 0,67% 1,48%
90/98
TABELA 8: DETERMINAÇÃO DA SOBREPOSIÇÃO DE ANTICORPOS POR BINAGEM Anticorpo PDL2-21 BiPDL4-11 BiPDL4-12 BiPDL4-13 BiPDL4-14 PDL2-13 PDL2-23 MIH18 24F.10C12 PDL2-13 PDL2-21 3,94% 61,01% 60,34% 59,36% 61,96% 1,87% 2,22% 57,40% 1,92% 0,49% BiPDL4-11 70,16% 6,14% 7,10% 6,56% 5,65% 67,19% 66,57% 15,10% 51,91% 76,14% BiPDL4-12 71,50% 4,58% 4,61% 4,65% 3,44% 68,76% 65,25% 12,56% 54,25% 72,66% BiPDL4-13 73,53% 4,37% 5,12% 5,22% 4,00% 69,12% 64,50% 15,16% 60,28% 76,10% BiPDL4-14 73,14% 6,90% 7,31% 8,06% 5,52% 68,78% 64,87% 17,08% 58,89% 68,66% PDL2-13 6,06% 68,20% 65,56% 66,74% 70,90% 5,10% 5,81% 65,85% 7,44% 5,70% PDL2-23 2,25% 58,24% 59,37% 60,54% 60,75% 4,39% 3,54% 63,79% 4,39% 3,21% MIH18 74,65% 47,93% 60,62% 57,01% 63,38% 73,65% 70,26% 5,73% 71,43% 82,48% 24F.10C12 5,24% 50,46% 57,49% 56,89% 62,84% 7,11% 5,98% 63,75% 4,99% 6,30% PDL2-13 5,84% 67,97% 68,71% 67,46% 73,22% 6,40% 6,25% 66,70% 6,89% 4,64%
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TABELA 9: LIGAÇÃO E COMPETIÇÃO DOS ANTICORPOS KD IgG KD IgG Kc IgG KD IgG KD IgG da KD IgG Competidor da Competidor da Nome da PD-L1-HIS PD-L2-HIS PD-L1-Fc PD-L2-FC PD-L1-Fc PD-L2-Fc PD-1 CD80 Nome ADI Linhagem Humana (M) Humana (M) Cino (M) Cino (M) Murídea (M) Murídea (M) (PD-L1 (PD-L1 Monovalente Monovalente Ávida Ávida Ávida Ávida humano) humano) ADI-37464 BiPDL3-14 3,93E-09 6,84E-10 3,71E-10 5,43E-10 2,34E-09 5,33E-10 Sim Sim ADI-374S5 BiPDL3-24 1,34E-08 8,68E-10 3,96Е-10 6,05Е-10 2,65E-09 5,53E-10 Sim Sim ADI-3746S BiPDL3-34 1,78E-08 8,44E-10 4,31E-10 6,77E-10 3,16E-08 4,84E-10 Sim Sim ADI-37475 BiPDL3-44 3,02E-08 1,45Е-09 4,55E-10 6,03E-10 4,20E-08 5,52E-10 Sim Sim ADI-37477 BiPDL3-54 1,55E-08 2,20E-09 4,42Е-10 6,21E-10 2,97E-09 6,94E-10 Sim Sim
92/98
[0201]Todos os métodos revelados e reivindicados neste documento podem ser praticados e executados sem experimentação indevida à luz da presente revelação. Embora tenham-se descrito as composições e métodos da presente invenção em termos de modalidades preferidas, transparecerá aos versados na técnica que variações podem ser feitas aos métodos e às etapas ou à sequência de etapas dos métodos descritos neste documento sem divergir do conceito, espírito e âmbito da invenção. Mais especificamente, transparecerá que certos agentes tanto química quanto fisiologicamente relacionados podem substituir os agentes descritos neste documento e conduzir aos mesmos resultados ou a resultados semelhantes. Todos esses substitutos semelhantes e modificações evidentes aos versados na técnica são considerados dentro da essência, âmbito e conceito da invenção conforme definidos nas reivindicações anexas. VIII. REFERÊNCIAS
[0202]As referências a seguir, na medida em que indicam procedimentos exemplificativos e outros detalhes complementares aos definidos neste documento, incorporam-se especificamente ao presente documento por referência. “Antibodies: A Laboratory Manual,” Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 1988. Abbondanzo et al., Am. J. Pediatr. Hematol. Oncol., 12(4), 480-489, 1990. Allred et al., Arch. Surg., 125(1), 107-113, 1990. Atherton et al., Biol. of Reproduction, 32, 155-171, 1985. Austin et al., PLoS Pathog 8, e1002930, 2012. Baptista et al., Hum. Pathol., 47: 78-84, 2016. Barrett et al., Oncotarget, 6: 26483-26493, 2015. Boussiotis, N Engl J Med, 375: 1767-1778, 2016. Boyerinas et al., Cancer Immunol. Res., 3: 1148-1157, 2015. Brahmer et al., J. Clin. Oncolo., 28:3167-3175, 2010.
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Claims (63)

REIVINDICAÇÕES
1. Anticorpo ou fragmento de anticorpo CARACTERIZADO por compreender sequências CDR de cadeia pesada e leve pareadas com clone das Tabelas 3 e 4, respectivamente.
2. Anticorpo ou fragmento de anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido anticorpo ou fragmento de anticorpo é codificado por sequências variáveis de cadeia leve e pesada de acordo com sequências pareadas com clone da Tabela 1.
3. Anticorpo ou fragmento de anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido anticorpo ou fragmento de anticorpo é codificado por sequências variáveis de cadeia leve e pesada com ao menos 70%, 80% ou 90% de identidade com sequências pareadas com clone da Tabela 1.
4. Anticorpo ou fragmento de anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido anticorpo ou fragmento de anticorpo é codificado por sequências variáveis de cadeia leve e pesada com ao menos 95% de identidade com sequências pareadas com clone da Tabela 1.
5. Anticorpo ou fragmento de anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido anticorpo ou fragmento de anticorpo compreende sequências variáveis de cadeia leve e pesada de acordo com sequências pareadas com clone da Tabela 2.
6. Anticorpo ou fragmento de anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido anticorpo ou fragmento de anticorpo compreende sequências variáveis de cadeia leve e pesada com 70%, 80% ou 90% de identidade com sequências pareadas com clone da Tabela 2.
7. Anticorpo ou fragmento de anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido anticorpo ou fragmento de anticorpo compreende sequências variáveis de cadeia leve e pesada com 95% de identidade com sequências pareadas com clone da Tabela 2.
8. Anticorpo ou fragmento de anticorpo, de acordo com as reivindicações de 1 a 7, CARACTERIZADO pelo fato de que o fragmento de anticorpo é um anticorpo scFv (fragmento variável de cadeia única) recombinante, fragmento Fab, fragmento F(ab’)2 ou fragmento Fv.
9. Anticorpo ou fragmento de anticorpo, de acordo com as reivindicações de 1 a 7, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido anticorpo é um anticorpo quimérico.
10. Anticorpo ou fragmento de anticorpo, de acordo com as reivindicações de 1 a 9, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido anticorpo é uma IgG.
11. Anticorpo ou fragmento de anticorpo, de acordo com as reivindicações de 1 a 10, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido anticorpo ou fragmento de anticorpo compreende ainda um peptídeo penetrante em células e/ou é um intracorpo.
12. Anticorpo ou fragmento de anticorpo, de acordo com as reivindicações de 1 a 11, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido anticorpo ou fragmento de anticorpo é um anticorpo humano.
13. Anticorpo ou fragmento de anticorpo, de acordo com as reivindicações de 1 a 11, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido anticorpo ou fragmento de anticorpo é um anticorpo humanizado.
14. Método para tratar um paciente com câncer, o método sendo CARACTERIZADO por compreender distribuir ao referido paciente um anticorpo ou fragmento de anticorpo com sequências CDR de cadeia pesada e leve pareadas com clone das Tabelas 3 e 4, respectivamente.
15. Método, de acordo com a reivindicação 14, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de anticorpo é codificado por sequências variáveis de cadeia leve e pesada pareadas com clone conforme estabelecidas na Tabela 1.
16. Método, de acordo com as reivindicações 14 e 15, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido anticorpo ou fragmento de anticorpo é codificado por sequências variáveis de cadeia leve e pesada com ao menos 70%, 80% ou 90% de identidade com sequências pareadas com clone da Tabela 1.
17. Método, de acordo com as reivindicações 14 e 15, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de anticorpo é codificado por sequências variáveis de cadeia leve e pesada pareadas com clone com ao menos 95% de identidade com sequências pareadas com clone conforme estabelecidas na Tabela 1.
18. Método, de acordo com a reivindicação 14, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido anticorpo ou fragmento de anticorpo compreende sequências variáveis de cadeia leve e pesada de acordo com sequências pareadas com clone da Tabela 2.
19. Método, de acordo com a reivindicação 14, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido anticorpo ou fragmento de anticorpo compreende sequências variáveis de cadeia leve e pesada com 70%, 80% ou 90% de identidade com sequências pareadas com clone da Tabela 2.
20. Método, de acordo com a reivindicação 14, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido anticorpo ou fragmento de anticorpo é codificado por sequências variáveis de cadeia leve e pesada com 95% de identidade com sequências pareadas com clone da Tabela 2.
21. Método, de acordo com as reivindicações de 14 a 20, CARACTERIZADO pelo fato de que o fragmento de anticorpo é um anticorpo scFv (fragmento variável de cadeia única), fragmento Fab, fragmento F(ab’)2 ou fragmento Fv.
22. Método, de acordo com as reivindicações de 14 a 21, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido anticorpo é uma IgG.
23. Método, de acordo com as reivindicações de 14 a 21, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido anticorpo é um anticorpo quimérico.
24. Método, de acordo com as reivindicações de 14 a 23, CARACTERIZADO pelo fato de que distribuir compreende a administração de um anticorpo ou fragmento de anticorpo ou a distribuição genética de uma sequência ou vetor de RNA ou DNA que codifica o anticorpo ou fragmento de anticorpo.
25. Hibridoma ou célula desenvolvida em laboratório que codificam um anticorpo ou fragmento de anticorpo, o hibridoma ou célula desenvolvida em laboratório sendo CARACTERIZADOS pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de anticorpo é caracterizado por sequências CDR de cadeia pesada e leve pareadas com clone das Tabelas 3 e 4, respectivamente.
26. Hibridoma ou célula desenvolvida em laboratório, de acordo com a reivindicação 25, CARACTERIZADOS pelo fato de que o referido anticorpo ou fragmento de anticorpo é codificado por sequências variáveis de cadeia leve e pesada de acordo com sequências pareadas com clone da Tabela 1.
27. Hibridoma ou célula desenvolvida em laboratório, de acordo com a reivindicação 25, CARACTERIZADOS pelo fato de que o referido anticorpo ou fragmento de anticorpo é codificado por sequências variáveis de cadeia leve e pesada com ao menos 70%, 80% ou 90% de identidade com sequências variáveis pareadas com clone da Tabela 1.
28. Hibridoma ou célula desenvolvida em laboratório, de acordo com a reivindicação 25, CARACTERIZADOS pelo fato de que o referido anticorpo ou fragmento de anticorpo é codificado por sequências variáveis de cadeia leve e pesada com 95% de identicidade com sequências variáveis pareadas com clone da Tabela 1.
29. Hibridoma ou célula desenvolvida em laboratório, de acordo com a reivindicação 25, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido anticorpo ou fragmento de anticorpo compreende sequências variáveis de cadeia leve e pesada de acordo com sequências pareadas com clone da Tabela 2.
30. Hibridoma ou célula desenvolvida em laboratório, de acordo com a reivindicação 25, CARACTERIZADOS pelo fato de que o referido anticorpo ou fragmento de anticorpo é codificado por sequências variáveis de cadeia leve e pesada com ao menos 70%, 80% ou 90% de identidade com sequências variáveis pareadas com clone da Tabela 2.
31. Hibridoma ou célula desenvolvida em laboratório, de acordo com a reivindicação 25, CARACTERIZADOS pelo fato de que o referido anticorpo ou fragmento de anticorpo compreende sequências variáveis de cadeia leve e pesada com 95% de identidade com as sequências pareadas com clone da Tabela 2.
32. Hibridoma ou célula desenvolvida em laboratório, de acordo com as reivindicações de 25 a 31, CARACTERIZADOS pelo fato de que o fragmento de anticorpo é um anticorpo scFv recombinante (fragmento variável de cadeia única), fragmento Fab, fragmento F(ab’)2 ou fragmento Fv.
33. Hibridoma ou célula desenvolvida em laboratório, de acordo com as reivindicações de 25 a 32, CARACTERIZADOS pelo fato de que o referido anticorpo é um anticorpo quimérico.
34. Hibridoma ou célula desenvolvida em laboratório, de acordo com as reivindicações de 25 a 32, CARACTERIZADOS pelo fato de que o referido anticorpo é uma IgG.
35. Hibridoma ou célula desenvolvida em laboratório, de acordo com as reivindicações de 25 a 34, CARACTERIZADOS pelo fato de que o referido anticorpo ou fragmento de anticorpo compreende ainda um peptídeo penetrante em células e/ou é um intracorpo.
36. Fórmula de vacina CARACTERIZADA por compreender um ou mais anticorpos ou fragmentos de anticorpo caracterizados por sequências CDR de cadeia pesada e leve pareadas com clone das Tabelas 3 e 4, respectivamente.
37. Fórmula de vacina, de acordo com a reivindicação 36, CARACTERIZADA pelo fato de que ao menos um anticorpo ou fragmento de anticorpo é codificado por sequências variáveis de cadeia leve e pesada de acordo com sequências pareadas com clone da Tabela 1.
38. Fórmula de vacina, de acordo com a reivindicação 36, CARACTERIZADA pelo fato de que ao menos um anticorpo ou fragmento de anticorpo é codificado por sequências variáveis de cadeia leve e pesada com ao menos 70%, 80% ou 90% de identidade com sequências pareadas com clone da Tabela 1.
39. Fórmula de vacina, de acordo com a reivindicação 38, CARACTERIZADA pelo fato de que ao menos um anticorpo ou fragmento de anticorpo é codificado por sequências variáveis de cadeia leve e pesada com ao menos 95% de identidade com sequências pareadas com clone da Tabela 1.
40. Fórmula de vacina, de acordo com a reivindicação 36, CARACTERIZADA pelo fato de que ao menos um anticorpo ou fragmento de anticorpo compreende sequências variáveis de cadeia leve e pesada de acordo com sequências pareadas com clone da Tabela 2.
41. Fórmula de vacina, de acordo com a reivindicação 36, CARACTERIZADA pelo fato de que ao menos um anticorpo ou fragmento de anticorpo compreende sequências variáveis de cadeia leve e pesada com 95% de identidade com sequências pareadas com clone da Tabela 2.
42. Fórmula de vacina, de acordo com as reivindicações de 36 a 41, CARACTERIZADA pelo fato de que ao menos um fragmento de anticorpo é um anticorpo scFv recombinante (fragmento variável de cadeia única), fragmento Fab, fragmento F(ab’)2 ou fragmento Fv.
43. Fórmula de vacina, de acordo com as reivindicações de 36 a 41, CARACTERIZADO pelo fato de que ao menos um anticorpo é um anticorpo quimérico.
44. Fórmula de vacina, de acordo com as reivindicações de 36 a 43, CARACTERIZADA pelo fato de que ao menos um anticorpo é uma IgG.
45. Fórmula de vacina, de acordo com as reivindicações de 36 a 44, CARACTERIZADA pelo fato de que ao menos um anticorpo ou fragmento de anticorpo compreende ainda um peptídeo penetrante em células e/ou é um intracorpo.
46. Método para detectar uma célula expressando o PD-L1 ou PD-L2 em um paciente, o método sendo CARACTERIZADO por compreender ainda: (a) colocar uma amostra do referido paciente em contato com um anticorpo ou fragmento de anticorpo com sequências CDR de cadeia pesada e leve pareadas com clone das Tabelas 3 e 4, respectivamente; e (b) detectar uma célula expressando o PD-L1 ou PD-L2 na referida amostra por ligação do referido anticorpo ou fragmento de anticorpo com uma célula na referida amostra.
47. Método, de acordo com a reivindicação 46, CARACTERIZADO pelo fato de que a referida amostra é um fluido corporal.
48. Método, de acordo com as reivindicações de 46 a 47, CARACTERIZADO pelo fato de que a referida amostra é uma amostra de tecido.
49. Método, de acordo com as reivindicações de 46 a 47, CARACTERIZADO pelo fato de que a detecção compreende ELISA, RIA ou Western blot.
50. Método, de acordo com as reivindicações de 46 a 49, CARACTERIZADO por compreender ainda realizar as etapas (a) e (b) por uma segunda vez e determinar uma mudança nos níveis do antígenos orthopoxvirus em comparação ao primeiro ensaio.
51. Método, de acordo com as reivindicações de 46 a 50, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de anticorpo é codificado por sequências variáveis pareadas com clone conforme estabelecidas na Tabela 1.
52. Método, de acordo com as reivindicações de 46 a 50, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido anticorpo ou fragmento de anticorpo é codificado por sequências variáveis de cadeia leve e pesada com ao menos 70%, 80% ou 90% de identidade com sequências variáveis pareadas com clone conforme estabelecidas na Tabela 1.
53. Método, de acordo com as reivindicações de 46 a 50, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido anticorpo ou fragmento de anticorpo é codificado por sequências variáveis de cadeia leve e pesada com ao menos 95% de identidade com sequências pareadas com clone conforme estabelecidas na Tabela 1.
54. Método, de acordo com as reivindicações de 46 a 50, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido anticorpo ou fragmento de anticorpo compreende sequências variáveis de cadeia leve e pesada de acordo com sequências pareadas com clone da Tabela 2.
55. Método, de acordo com as reivindicações de 46 a 50, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido anticorpo ou fragmento de anticorpo compreende sequências variáveis de cadeia leve e pesada com 70%, 80% ou 90% de identidade com sequências pareadas com clone da Tabela 2.
56. Método, de acordo com as reivindicações de 46 a 50, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido anticorpo ou fragmento de anticorpo compreende sequências variáveis de cadeia leve e pesada com 95% de identidade com sequências pareadas com clone da Tabela 2.
57. Método, de acordo com as reivindicações de 14 a 56, CARACTERIZADO pelo fato de que o fragmento de anticorpo é um anticorpo scFv recombinante (fragmento variável de cadeia única), fragmento Fab, fragmento F(ab’)2 ou fragmento Fv.
58. Método, de acordo com as reivindicações de 46 a 57, CARACTERIZADO pelo fato de que a referida célula é uma célula de câncer.
59. Método, de acordo com a reivindicação 58, CARACTERIZADO pelo fato de que a célula de câncer é uma célula de linfoma, uma célula de câncer de mama ou uma célula de carcinoma de células renais.
60. Método, de acordo com as reivindicações de 46 a 57, CARACTERIZADO pelo fato de que a referida célula é uma célula associada à supressão imunológica.
61. Método, de acordo com a reivindicação 60, CARACTERIZADO pelo fato de que a referida célula associada à supressão imunológica é uma célula cancerosa no microambiente tumoral.
62. Método, de acordo com a reivindicação 61, CARACTERIZADO pelo fato de que a referida célula não cancerosa no microambiente tumoral é uma célula estromal ou endotelial.
63. Método para tratar a supressão imunológica em um microambiente tumoral, o método sendo CARACTERIZADO por compreender: distribuir ao referido paciente um anticorpo ou fragmento de anticorpo com sequências CDR de cadeia pesada e leve pareadas com clone das Tabelas 3 e 4, respectivamente.
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