BR112020017645A2 - Compostos que incluem uma sequência kras mutante e um lipídio e usos dos mesmos - Google Patents

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Peter C. DeMuth
Julian Adams
Martin Steinbuck
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Elicio Therapeutics Inc.
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Abstract

a presente invenção refere-se a um composto que inclui uma sequência kras mutante e um lipídio, onde a sequência kras mutante é conjugada ao lipídio através de um ligante e (i) o ligante inclui um ou mais blocos de polietileno glicol, (ii) o lipídio é 1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (dspe) e (iii) a sequência kras mutante compreende ou consiste na sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em seq id nos: 1-7 e 22-30. a invenção se especifica por uma composição que inclui um ou mais compostos da invenção e um veículo farmaceuticamente aceitável. a invenção também se especifica por um método de tratamento de um câncer em um paciente humano, o método incluindo administrar a composição ao paciente. ainda, a invenção se especifica por um kit que compreende o composto.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "COM- POSTOS QUE INCLUEM SEQUÊNCIA DE KRAS MUTANTE E LIPÍ- DIO E USOS DOS MESMOS".
LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS
[0001] O presente pedido contém uma Listagem de Sequências que foi enviada eletronicamente em formato ASCII e é aqui incorporada por referência na íntegra. A dita cópia ASCII, criada em ______________, é denominada __________________________ e tem _______ bytes.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[0002] As proteínas RAS são componentes essenciais das vias de sinalização celular. A ativação oncogênica de proteínas RAS através de mutação é frequentemente detectada em vários tipos de câncer, inclu- indo câncer pancreático. Continua a haver a necessidade de tratamen- tos adicionais e mais eficazes contra o câncer.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[0003] A invenção fornece compostos que podem ser usados em métodos terapêuticos.
[0004] Consequentemente, no primeiro aspecto, a invenção se ca- racteriza por um composto que inclui uma sequência KRAS mutante e um lipídio, onde a sequência KRAS mutante é conjugada ao lipídio atra- vés de um ligante e (i) o ligante inclui um ou mais blocos de polietileno glicol, (ii) o lipídio é 1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DSPE) e (iii) a sequência KRAS mutante compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que con- siste em YKLVVVGADGVGKSALTI (SEQ ID NO: 23), YKLVVVGAVGVGKSALTI (SEQ ID NO: 24), YKLVVVGARGVGKSALTI (SEQ ID NO: 25), YKLVVVGAAGVGKSALTI (SEQ ID NO: 26), YKLVVVGASGVGKSALTI (SEQ ID NO: 25), YKLVVVGAAGVGKSALTI (SEQ ID NO: 26), YKLVVVGASGVGKSLQV (SEQ ID NO: 27),
YKLVVVVGASGVGKSLQV (SEQ ID NO: 27), YKLVTIVVGVATAL- GVALGV (SEQ ID NO: 27), YGVALGV (SEQ ID NO: 27GVALGVALGV: 27), YKLVTI SEQ ID NO: 29) e YKLVVVGAGDVGKSALTI (SEQ ID NO: 30).
[0005] No segundo aspecto, a invenção se caracteriza por um com- posto que inclui uma sequência KRAS mutante e um lipídio, em que a sequência KRAS mutante é conjugada ao lipídio através de um ligante e (i) o ligante inclui um ou mais blocos de polietileno glicol, (ii) o lipídio é 1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DSPE) e (iii) a sequên- cia KRAS mutante compreende ou consiste em uma sequência de ami- noácidos selecionada a partir do grupo que consiste em CYKLVVVGA- DGVGKSALTI (SEQ ID NO: 1), CYKLVVVGAVGVGKSALTI (SEQ ID NO: 2), CYKLVVVGARGVGKSALTI (SEQ ID NO: 3), CYKLVVVGAAGVGKSALTI (SEQ ID NO: 4), CYKLVVVGAS- GVGKSALTI (SEQ ID NO: 3), CYKLVVVGAAGVGKSALTI (SEQ ID NO: 4), CYKLVVVGASGVGKSALTI (SEQ ID NOQ. SEQV: 5), CYKLVD NO: 22) e CYKLVVVGAGDVGKSALTI (SEQ ID NO: 7).
[0006] Em uma modalidade dos primeiro e segundo aspectos da in- venção, a sequência KRAS mutante, em seu N-término, é conjugada ao ligante através de uma ligação de cisteína-maleimida.
[0007] Em outra modalidade dos primeiro e segundo aspectos da invenção, o ligante inclui 48 unidades de repetição de polietileno glicol.
[0008] Em uma modalidade adicional dos primeiro e segundo as- pectos da invenção, a sequência de KRAS mutante, em sua extremi- dade N-terminal, é conjugada à seguinte estrutura:
[0009] No terceiro aspecto, a invenção se caracteriza por uma com- posição que inclui um ou mais compostos de acordo com os primeiro e segundo aspectos da invenção e um carreador farmaceuticamente acei- tável.
[0010] Em uma modalidade do terceiro aspecto da invenção, a com- posição inclui (1) um composto que inclui a sequência de aminoácidos YKLVVVGADGVGKSALTI (SEQ ID NO: 23), (2) um composto que inclui a sequência de aminoácidos YKLVVVGAVGVGKSALTI (SEQ ID NO: 24), (3) um composto que inclui a sequência de aminoácidos YKLVVVGARGVGKSALTI (SEQ ID NO: 25), (4) um composto que inclui a sequência de aminoácidos YKLVVVGAAGVGKSALTI (SEQ ID NO: 26), (5) um composto que inclui a sequência de aminoácidos YKLVVVGASGVGKSALTI (SEQ ID NO: 27), (6) um composto que inclui a sequência de aminoácidos YKLVVVGACGVGKSALTI (SEQ ID NO: 28) ou um composto que inclui a sequência de aminoácidos YKLVVVGATGVGKSALTI (SEQ ID NO: 29) e (7) um composto que in- clui a sequência de aminoácidos YKLVVVGAGDVGKSALTI (SEQ ID NO: 30).
[0011] Em uma modalidade do terceiro aspecto da invenção, a com- posição inclui (1) um composto que inclui a sequência de aminoácidos YKLVVVGADGVGKSALTI (SEQ ID NO: 23), (2) um composto que inclui a sequência de aminoácidos YKLVVVGAVGVGKSALTI (SEQ ID NO: 24), (3) um composto que inclui a sequência de aminoácidos YKLVVVGARGVGKSALTI (SEQ ID NO: 25), (4) um composto que inclui a sequência de aminoácidos YKLVVVGAAGVGKSALTI (SEQ ID NO: 26), (5) um composto que inclui a sequência de aminoácidos YKLVVVGASGVGKSALTI (SEQ ID NO: 27), (6) um composto que inclui a sequência de aminoácidos YKLVVVGACGVGKSALTI (SEQ ID NO: 28) e (7) um composto que inclui a sequência de aminoácidos YKLVVVGAGDVGKSALTI (SEQ ID NO: 30).
[0012] Em outra modalidade do terceiro aspecto da invenção, a composição inclui (1) um composto que inclui a sequência de aminoáci- dos CYKLVVVGADGVGKSALTI (SEQ ID NO: 1), (2) um composto que inclui a sequência de aminoácidos CYKLVVVGAVGVGKSALTI (SEQ ID NO: 2), (3) um composto que inclui a sequência de aminoácidos CYKLVVVGARGVGKSALTI (SEQ ID NO: 3), (4) um composto que in- clui a sequência de aminoácidos CYKLVVVGAAGVGKSALTI (SEQ ID NO: 4), (5) um composto que inclui a sequência de aminoácidos CYKLVVVGASGVGKSALTI (SEQ ID NO: 5), (6) um composto que in- clui a sequência de aminoácidos CYKLVVVGACGVGKSALTI (SEQ ID NO: 6) ou um composto que inclui a sequência de aminoácidos CYKLVVVGATGVGKSALTI (SEQ ID NO: 22) e (7) um composto que inclui a sequência de aminoácidos CYKLVVVGAGDVGKSALTI (SEQ ID NO: 7).
[0013] Em outra modalidade do terceiro aspecto da invenção, a composição inclui (1) um composto que inclui a sequência de aminoáci- dos CYKLVVVGADGVGKSALTI (SEQ ID NO: 1), (2) um composto que inclui a sequência de aminoácidos CYKLVVVGAVGVGKSALTI (SEQ ID NO: 2), (3) um composto que inclui a sequência de aminoácidos CYKLVVVGARGVGKSALTI (SEQ ID NO: 3), (4) um composto que in- clui a sequência de aminoácidos CYKLVVVGAAGVGKSALTI (SEQ ID NO: 4), (5) um composto que inclui a sequência de aminoácidos CYKLVVVGASGVGKSALTI (SEQ ID NO: 5), (6) um composto que in- clui a sequência de aminoácidos CYKLVVVGACGVGKSALTI (SEQ ID NO: 6) e (7) um composto que inclui a sequência de aminoácidos CYKLVVVGAGDVGKSALTI (SEQ ID NO: 7).
[0014] Em algumas modalidades, 700 µg de cada composto estão incluídos na composição.
[0015] Em uma modalidade adicional do terceiro aspecto da inven- ção, a composição inclui ainda um composto que consiste na sequência de nucleotídeos 5'-TCGTCGTTTTGTCGTTTTTGTCGTT-3' (SEQ ID
NO: 8) a qual, em sua extremidade 5', está ligada ou unida através de um ligante ao seguinte lipídio: , ou um sal do mesmo, em que X é O ou S. Em uma modalidade, a se- quência de nucleotídeos está ligada ao lipídio. Em outra modalidade, todos os grupos internucleosídeos que conectam os nucleosídeos em 5'-TCGTCGTTTTGTCGTTTTTGTCGTT-3' (SEQ ID NO: 8) são fosforo- tioatos.
[0016] No quarto aspecto, a invenção se caracteriza por um método de tratamento de um câncer em um paciente humano, o método inclu- indo administrar a composição de acordo com o terceiro aspecto da in- venção ao paciente.
[0017] Em uma modalidade do quarto aspecto da invenção, o mé- todo inclui ainda administrar um adjuvante, tal como um adjuvante que inclui uma sequência de nucleotídeos CpG (por exemplo, 5'-TCGTCG- TTTTGTCGTTTTTGTCGTT-3'; SEQ ID NO: 8).
[0018] Em algumas modalidades, são administrados 0,1 mg, 0,5 mg ou 2,5 mg do adjuvante.
[0019] Em uma modalidade do quarto aspecto da invenção, o mé- todo inclui ainda administrar ao paciente um composto que consiste na sequência de nucleotídeos 5'-TCGTCGTTTTGTCGTTTTTGTCGTT-3' (SEQ ID NO: 8) a qual, em sua extremidade 5', é ligada ou unida através de um ligante ao seguinte lipídio: ,
ou um sal do mesmo, em que X é O ou S. Em uma modalidade, a se- quência de nucleotídeos está ligada ao lipídio. Em uma modalidade, são administrados 0,1 mg, 0,5 mg ou 2,5 mg do composto.
[0020] Em outra modalidade, todos os grupos internucleosí- deos que conectam os nucleosídeos em 5'-TCGTCGTTTTGTCG- TTTTTGTCGTT-3' (SEQ ID NO: 8) são fosforotioatos.
[0021] Em uma modalidade do quarto aspecto da invenção, o cân- cer é um câncer pancreático, um câncer de pulmão ou um câncer color- retal.
[0022] No quinto aspecto, a invenção se caracteriza por um kit que inclui (i) um composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, ou uma composição de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 6-8 e (ii) um composto que consiste na sequência de nucleotídeos 5' -TCGTCGTTTTTGTCGTTTTGTCGTT-3' (SEQ ID NO: 8) a qual, em sua extremidade 5', está ligada ou unida através de um ligante ao se- guinte lipídio: , ou um sal do mesmo, em que X é O ou S. Em uma modalidade, a se- quência de nucleotídeos está ligada ao lipídio. Em outra modalidade, todos os grupos internucleosídeos que conectam os nucleosídeos em 5'-TCGTCGTTTTGTCGTTTTTGTCGTT-3' (SEQ ID NO: 8) são fosforo- tioatos. Definições
[0023] Uma "carbonila", conforme usado aqui, se refere a um grupo –C(O)-.
[0024] Um "carboxilato", conforme usado aqui, se refere a um grupo –C(O)–OH ou um sal do mesmo.
[0025] Conforme usado aqui, "conjugado" se refere a uma ligação covalente de uma sequência KRAS mutante a um ligante e, opcional- mente, outra ligação covalente do ligante a um lipídio. Em vários exem- plos, as ligações covalentes que conectam o ligante à sequência KRAS mutante ou ao lipídio podem ser uma ligação covalente entre um átomo de enxofre e um átomo de carbono com hibridização sp3 em succini- mida, entre um átomo de nitrogênio e um átomo de carbono de uma carbonila ou entre o átomo de oxigênio e o átomo de fósforo de uma ti- ofosforila ou fosforila. Em vários exemplos, cada um da sequência KRAS e do lipídio pode conter um grupo para ligação a um grupo com- plementar no ligante. Por exemplo, o polipeptídeo de KRAS pode incluir um átomo de enxofre (por exemplo, o átomo de enxofre em um resíduo de cisteína) ligado a um grupo complementar, por exemplo, succinimida, no ligante. A ligação do átomo de enxofre no polipeptídeo de KRAS à succinimida no ligante pode ser formada por meio de uma reação de um tiol (por exemplo, um tiol em um resíduo de cisteína) no polipeptídeo de KRAS e uma maleimida no ligante. Alternativamente, o polipeptídeo de KRAS pode incluir um átomo de nitrogênio ou um grupo carbonila ligado a um grupo carbonila ou um átomo de nitrogênio, respectivamente, no ligante. A ligação entre o grupo carbonila e o átomo de nitrogênio pode ser formada por meio de uma reação entre uma amina ou carboxilato no polipeptídeo de KRAS e um carboxilato ou uma amina, respectiva- mente, no ligante.
[0026] Um "lipídio" é qualquer um de um grupo de compostos orgâ- nicos que são gordurosos ao toque, insolúveis em água e solúveis em solventes orgânicos, e, em geral, inclui ácidos graxos e seus deriva- dos. Um exemplo de um lipídio usado na invenção é 1,2-diestearoil-sn- glicero-3-fosfoetanolamina (DSPE).
[0027] Um "ligante", conforme usado aqui, se refere a um grupo mo- novalente ou divalente, em que uma valência é covalentemente ligada a um grupo biologicamente funcional e a outra valência é covalente- mente ligada a outro grupo biologicamente funcional. Em um exemplo, um ligante conecta uma sequência KRAS a um lipídio, conforme obser- vado acima. Opcionalmente, tal ligante pode incluir um ou mais blocos de polietileno glicol. Em outro exemplo, um ligante conecta uma sequên- cia de nucleotídeos, por exemplo, de um oligonucleotídeo CpG, a um lipídio (por exemplo, -P(X)(OH)-O-CH(CH2NHCO-(CH2)16-CH3)2, ou um sal do mesmo, em que X é O ou S, conforme descrito aqui). Tais ligantes podem incluir opcionalmente um ou mais nucleotídeos, por exemplo, um dinucleotídeo (por exemplo, GG).
[0028] Um "carreador farmaceuticamente aceitável", conforme usado aqui, se refere a um veículo capaz de suspender ou dissolver um composto ativo e ter as propriedades de ser não tóxico e não inflamató- rio em um indivíduo (por exemplo, um paciente humano) ao qual ele é administrado. Além disso, um carreador farmaceuticamente aceitável pode incluir um aditivo farmaceuticamente aceitável, tal como um con- servante, antioxidante, fragrância, emulsificante, corante ou excipiente conhecido ou usado no campo da formulação de fármacos e que não interfere significativamente com a eficácia terapêutica da atividade bio- lógicoa do agente ativo e que não é tóxico para o indivíduo.
[0029] Uma "fosforila", conforme usado aqui, se refere a um grupo –P(O)(ORA)(ORB), onde RA é H e RB é uma valência.
[0030] Um "polietileno glicol", conforme usado aqui, se refere a um bloco –(OCH2CH2)n–, onde n é um número de unidades de repetição e é um número inteiro a partir de 2 a 50 (por exemplo, 24 ou 48).
[0031] Um "tiol", conforme usado aqui, se refere a um grupo –SH.
[0032] Uma "tiofosforila", conforme usado aqui, se refere a um grupo –P(S)(ORA)(ORB), onde RA é H e RB é uma valência.
[0033] Os termos "tratar", "tratamento" e "tratando" se referem a abordagens terapêuticas nas quais o objetivo é reverter, aliviar, melho- rar, inibir, desacelerar ou parar a progressão ou gravidade de uma con- dição associada a uma doença ou transtorno, por exemplo, câncer. Es- tes termos incluem reduzir ou aliviar pelo menos um efeito adverso ou sintoma de uma condição, doença ou transtorno. O tratamento geral- mente é "eficaz" se um ou mais sintomas ou marcadores clínicos forem reduzidos ou se uma resposta desejada (por exemplo, uma resposta imune específica) for induzida. Alternativamente, o tratamento é "eficaz" se a progressão da doença for reduzida ou interrompida.
[0034] A invenção oferece várias vantagens. Por exemplo, ao incluir porções DSPE, determinados compostos da invenção se ligam à albu- mina endógena em indivíduos aos quais eles são administrados, o que aumenta a distribuição dos compostos aos nódulos linfáticos dos indiví- duos. Isto facilita a indução de uma resposta imune terapêutica contra as sequências KRAS dos compostos, levando a um tratamento eficaz do câncer.
[0035] Outras características e vantagens da invenção serão evi- dentes a partir da descrição detalhada a seguir, dos desenhos e das reivindicações.
DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0036] A Figura 1 mostra que o anfifilo-KRas (aKRas), em combina- ção com um anfifilo-CpG (aCpG), ativou esplenócitos, enquanto que KRas solúvel, em combinação com aCpG, e os grupos de con- trole KRas solúvel e poliIC (pIC) e não tratados, não.
[0037] A Figura 2 mostra que tanto aKRas G12R e G12V, em com- binação com aCpG, ativaram os esplenócitos, enquanto que nem Kras G12R nem G12V solúvel em combinação com aCpG e os grupos de controle KRAS solúvel e plC e não tratados, não.
[0038] A Figura 3 mostra uma resposta de células T CD8+ específi- cas para KRas para camundongos imunizados com a combinação de aKRas G12D e aCpG, mas não para KRas G12D solúvel em combi- nação com CpG ou KRas de tipo selvagem solúvel em combinação com CpG.
[0039] A Figura 4 mostra uma resposta de células T CD8+ específi- cas para KRas (9 meros) e resposta de células T CD8+ ou CD4+ (18 mero) para camundongos imunizados com a combinação de aKRas G12D e aCpG, mas não para KRas G12D solúvel em combi- nação com CpG ou o controle não tratado.
[0040] A Figura 5 mostra que vacinas do anfifilo-Kras (Amph-KRAS) e anfifilo-CpG (Amph-CpG) induzem a respostas de células T endóge- nas superiores comparado com vacinas de Kras solúvel, conforme indi- cado pelo aumento da produção de citocinas por esplenócitos em um arranjo de esferas de citocina. KRAS solúvel G12D = = YKLVVVGAD- GVGKSALTI (SEQ ID NO: 23); Amph-KRAS G12D = DSPE-amido- dPEG24-amido-dPEG24-CYKLVVVGADGVGKSALTI (SEQ ID NO: 1); KRAS G12D 18-mer = YKLVVVGADGVGKSALTI (SEQ ID NO:23); CBA = arranjo de esferas de citocina; IFN = interferon; IL = interleu- cina; KRAS = Sarcoma de Kirsten de Rato.
[0041] A Figura 6 mostra a estrutura do anfifilo-peptídeo G12D 4-21 (SEQ ID NO: 1).
[0042] A Figura 7 mostra a estrutura do anfifilo-CpG-7909. Todos os açúcares são desoxirribose. Todas as ligações internucleosídicas são fosforotioato. A estrutura é apresentada como sal de sódio.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[0043] A invenção fornece compostos que podem ser usados em métodos terapêuticos. Cada um dos compostos da invenção inclui uma sequência KRAS mutante (por exemplo, qualquer uma de SEQ ID NOS: 1-7 e 22; consulte a Tabela 1, abaixo, ou qualquer uma de SEQ ID NOS: 23-30, consulte a Tabela 2, abaixo) e um lipídio (por exemplo, 1,2-dies-
tearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DSPE)). Estas porções (a se- quência KRAS mutante e o lipídio) são ligadas entre si através de um ligante, por exemplo, um ligante que inclui um ou mais blocos de polie- tileno glicol. Em um exemplo, o ligante é: .
[0044] Em um exemplo específico, uma sequência KRAS mutante (por exemplo, qualquer uma de SEQ ID NOS: 1-7 ou 22 ou qualquer uma de SEQ ID NOS: 23-30) é ligada, em seu N-término, através de um resíduo Cys a um ligante e o ligante é ligado a um lipídio, onde o ligante é: e o lipídio é: , ou um sal do mesmo.
[0045] A invenção também fornece composições que incluem um ou mais compostos da invenção, juntamente com um carreador ou dilu- ente farmaceuticamente aceitável. Opcionalmente, as composições po- dem incluir sete compostos diferentes, conforme descrito acima, onde cada um dos sete compostos diferentes inclui uma sequência diferente selecionada a partir de SEQ ID NOS: 1-7 e 23 ou SEQ ID NOS: 23-
30. Composições que incluem subconjuntos (por exemplo, 2, 3, 4, 5 ou 6) destes compostos também estão incluídas na invenção. Diferentes compostos incluídos nas composições da invenção podem, opcional- mente, incluir cada uma das mesmas ou diferentes sequências KRAS,
ligantes e/ou lipídios.
[0046] As composições da invenção podem ser usadas em métodos para induzir respostas imunes às sequências KRAS dos compos- tos. Consequentemente, as composições podem ser denominadas como composições imunogênicas ou de vacina. As composições po- dem, assim, opcionalmente incluir ou ser administradas com um ou mais adjuvantes. Em um exemplo, o adjuvante usado pode incluir um oligo- nucleotídeo CpG (por exemplo, 5'-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT- 3'; SEQ ID NO: 8; CpG-7909) o qual, em sua extremidade 5', está ligado ou unido através de um ligante a um lipídio, tal como o seguinte: , ou um sal do mesmo, em que X é O ou S. De preferência, X é S.
[0047] O oligonucleotídeo CpG pode ser diretamente ligado ao lipí- dio. Alternativamente, o ligante ligado ao oligonucleotídeo CpG e ao li- pídio pode ser GG. No oligonucleotídeo CpG, todos os grupos internu- cleosídeos são fosforotioatos (por exemplo, todos os grupos internu- cleosídicos no composto podem ser fosforotioatos).
[0048] Os compostos e composições da invenção podem ser usa- dos em métodos terapêuticos. Em particular, as sequências KRAS dos compostos podem induzir a uma resposta imune à KRAS, a qual é ex- pressa em determinadas células cancerosas. Consequentemente, a in- venção fornece métodos de tratamento de câncer em um indivíduo (por exemplo, um paciente humano) através da administração de um ou mais compostos ou composições da invenção ao indivíduo. A invenção tam- bém inclui métodos de indução de uma resposta imune contra KRAS em um indivíduo (por exemplo, um paciente humano) através da admi- nistração de um ou mais compostos ou composições da invenção ao indivíduo. Em vários exemplos, o câncer é selecionado a partir do grupo que consiste em câncer pancreático, câncer de pulmão e câncer color- retal. Opcionalmente, os métodos da invenção podem incluir ainda ad- ministrar um composto ou composição da invenção em combinação com uma segunda (ou outras) abordagem de tratamento diferente.
[0049] A invenção também fornece kits que contêm, cada um, por exemplo, um primeiro recipiente que inclui um ou mais compostos da invenção, opcionalmente em conjunto com um segundo recipiente que inclui um adjuvante, tal como um adjuvante conforme descrito aqui. Tabela 1 (SEQ ID NOS: 1-7 e 22) Amph-peptí- Peptí- MW Resí- Nome Sequência deo deo (Da) duos MW (Da) 1 G12D 4-21 CYKLVVVGADGVGKSALTI 1893 19 5049 2 G12V 4-21 CYKLVVVGAVGVGKSALTI 1877 19 5033 3 G12R 4-21 CYKLVVVGARGVGKSALTI 1934 19 5090 4 G12A 4-21 CYKLVVVGAAGVGKSALTI 1849 19 5005 5 G12S 4-21 CYKLVVVGASGVGKSALTI 1865 19 5021 G12C 4-21 YKLVVVGACGVGKSALTI 19 6 ou ou 1778 4934 G12T 4-21 CYKLVVVGATGVGKSALTI 19 7 G13D 4-21 CYKLVVVGAGDVGKSALTI 1790 19 5049
[0050] Para cada um dos " Amph-peptídeos" citados na Tabela 1, a porção lipídica de (poli)etileno glicol foi conjugada através de um aco- plamento de maleimida (MAL)-cisteína com o peptídeo com a seguinte sínton: DSPE-amido-dPEG24-amido-dPEG24-MAL Tabela 2 (SEQ ID NOS: 23-30) Peptideo Nome Sequência MW (Da) Resíduos 1 G12D 4-21 YKLVVVGADGVGKSALTI 1790 18 2 G12V 4-21 YKLVVVGAVGVGKSALTI 1774 18 3 G12R 4-21 YKLVVVGARGVGKSALTI 1831 18 4 G12A 4-21 YKLVVVGAAGVGKSALTI 1746 18 5 G12S 4-21 YKLVVVGASGVGKSALTI 1762 18
YKLVVVGACGVGKSALTI 18 G12C 4-21 ou 6 ou 1778 G12T 4-21 YKLVVVGATGVGKSALTI 18 7 G13D 4-21 YKLVVVGAGDVGKSALTI 1790 18
[0051] Um composto da invenção pode ser preparado a partir de um polipeptídeo de KRAS mutante, um precursor de ligante e um lipídio usando métodos conhecidos na técnica. Em algumas variações, um precursor de ligante é primeiro ligado a um lipídio, por exemplo, da se- guinte forma: .
[0052] Condições de reação de amidação são conhecidas na téc- nica, por exemplo, condições de amidação típicas incluem o uso de re- agentes, tais como EDC/DMAP, HATU/HOAt ou HBTU/HOAt. Alternati- vamente, o carboxilato pode ser substituído por um éster de O-succini- mida, éster pentrafluorofenílico ou éster tetrafluorofenílico. O produto desta reação pode, então, ser reagido com um polipeptídeo de KRAS mutante, por exemplo, como segue:
.
[0053] A reação de adição 1,4 pode ser realizada em um solvente apropriado, por exemplo, um solvente orgânico polar ou água.
[0054] Alternativamente, um composto da invenção pode ser prepa- rado como segue. Um precursor de ligante pode ser primeiro ligado a um lipídio, por exemplo, como segue: .
[0055] O produto pode, então, ser reagido com um grupo amina (por exemplo, amina N-terminal) no polipeptídeo de KRAS mutante para pro- duzir um composto da invenção:
[0056] Um oligonucleotídeo CpG pode ser ligado diretamente ou li- gado através de um ligante ao lipídio. Estes compostos podem ser pro- duzidos usando a química comum de fosforamidita conhecida na téc- nica. Em alguns exemplos, o oligonucleotídeo CpG ou oligonucleotídeo
CpG o qual, em sua extremidade 5', está ligado a GG pode ser reagido com o seguinte composto: para produzir um intermediário o qual, após oxidação (por exemplo, mé- todos de oxidação de fosfito conhecidos na técnica, por exemplo, um agente de sulfurização, tal como 3-((N,N-dimetilaminometili- deno)amino)-3H-1,2,4-ditiazol-5-tiona) e hidrólise do grupo cianoetila, pode produzir um composto que consiste em um oligonucleotídeo CpG o qual, em sua extremidade 5', está ligado ou unido através de um li- gante ao lipídio: , ou um sal do mesmo, em que X é O ou S. Dosagem
[0057] A dose de cada peptídeo de KRAS administrada pode estar na faixa a partir de 100-5000 g por peptídeo (por exemplo, 700 μg/pep- tídeo, a qual produziria uma dose de peptídeo de 4900 g para um grupo de 7 peptídeos).
[0058] Se um adjuvante for administrado com o peptídeo de KRAS, a dose do adjuvante pode ser, com base no peso corporal, tão alta quanto 0,48 mg/kg. Regimes de dosagem exemplificativos são mostra- dos abaixo na Tabela 3.
Tabela 3 Dosagem Adjuvante (por exemplo, Amph-CpG-7909; Figura 6) Peptídeo Dose 1 (baixa) 0,1 mg 700 μg para cada um dos 7 peptídeos Dose 2 (média) 0,5 mg 700 μg para cada um dos 7 peptídeos Dose 3 (alta) 2,5 mg 700 μg para cada um dos 7 peptídeos
[0059] Para que a presente invenção seja mais completamente compreendida, são apresentados os exemplos a seguir. Estes exem- plos são apenas para fins ilustrativos e não devem ser interpretados como limitando o escopo da invenção de qualquer forma.
EXEMPLOS Exemplo 1: Anfifilo KRas G12D Estimula uma Resposta Imune
[0060] A eficácia de sequências mutantes de KRas solúvel (KRas) ou anfifilo-Kras (aKRas) (Figura 6) e um adjuvante de anfifilo-CpG (aCpG) de induzir a uma resposta imune foi determinada. Nestes expe- rimentos, cinco vezes mais aCpG do que anfifilo-KRas foi usado porque os experimentos de escalonamento de CpG sugeriram que esta dose pode ser mais eficaz.
[0061] A concepção experimental incluiu os seguintes 4 grupos de camundongos C57BL/6 imunizados com os compostos listados (n = 5 para cada grupo):
1. KRas G12D + aCpG
2. aKRas G12D + aCpG
3. KRas G12D + pIC
4. Sem imunização
[0062] PoliIC (pIC) foi usado como um controle de adjuvante de re- ferência.
[0063] O adjuvante, bem como as soluções mãe de peptídeos, fo- ram dissolvidos em H2O. As injeções finais foram diluídas com 1X PBS (solução salina tamponada com fosfato).
[0064] Os peptídeos de aKRas usados foram sequências de 18 mero de sequências mutantes com uma substituição G12D (aminoáci- dos 4-21 de tipo selvagem  YKLVVVGAGGVGKSALTI (SEQ ID NO:
9)). 20 μg em 100 μl foram usados para cada injeção.
[0065] A sequência de aCpG usada foi a sequência CpG1826 (5'- tccatgacgttcctgacgtt-3'; SEQ ID NO: 10) com duas guaninas adiciona- das na extremidade 5' (5'-gg tccatgacgttcctgacgtt-3'; SEQ ID NO: 11) em uma concentração de 5 nmol para cada injeção de 100 μl. CpG1826 é uma sequência ideal para camundongo, enquanto que CpG7909 é ideal para seres humanos e pouco ativa em camundongos. CpG1826 e CpG7909 estão na mesma classe de CpG (Classe B) e têm, em geral, perfis de atividade similares em suas respectivas espécies.
[0066] 50 μg de pIC foram usados para cada injeção de 100 μl.
[0067] As imunizações iniciais foram administradas através da via subcutânea (sc) na base da cauda (dia 0) com uma dose de reforço após 2 semanas (dia 14). Análise ELISpot para IFNγ em esplenócitos foi realizada, usando protocolos padrão, 8 dias após administração da dose de reforço (dia 21). Os esplenócitos (106 células/cavidade) foram ativados com 5 μg/cavidade de sequência de 18 mero de G12D (aa4- 21)  YKLVVVGADGVGKSALTI (SEQ ID NO: 1). Conforme mostrado na Figura 1, aKRas em combinação com aCpG ativou os esplenócitos, enquanto que KRas solúvel em combinação com aCpG e os grupos de controle não tratados e KRas solúvel e pIC, não. Exemplo 2: Anfifilos de KRas G12R e G12V Estimulam uma Resposta Imune
[0068] Foi determinada a eficácia de sequências mutantes de KRas (KRas) ou anfifilo-KRas (aKRas) solúveis adicionais e um ad- juvante de anfifilo-CpG (aCpG) ou CpG solúvel (CpG) de induzir a uma resposta imune.
[0069] A concepção experimental incluiu os 7 grupos de camundon- gos C57BL/6 a seguir imunizados com os compostos listados (n = 5 para cada grupo):
1. KRas G12R + CpG
2. KRas G12V + CpG
3. KRas G12R + pIC
4. KRas G12V + pIC
5. aKRas G12R + aCpG
6. aKRas G12V + aCpG
7. Sem imunização
[0070] O adjuvante, bem como soluções mãe de peptídeos, são dis- solvidos em H2O. As injeções finais são diluídas com 1X PBS.
[0071] Os peptídeos de aKras usados eram sequências de 18 mero de sequências mutantes com substituições G12R/V (SEQ aminoácidos 4-21 de tipo selvagem  YKLVVVGAGGVGKSALTI (SEQ ID NO: 9)). 20 μg em 100 μl foram usados para cada injeção.
[0072] A sequência de aCpG usada foi a sequência CpG1826 (5'- tccatgacgttcctgacgtt-3'; SEQ ID NO: 10) com duas guaninas adiciona- das na extremidade 5' (5'-gg tccatgacgttcctgacgtt-3'; SEQ ID NO: 11) em uma concentração de 5 nmol para cada injeção de 100 μl.
[0073] 50 μg de pIC foram usados para cada injeção de 100 μl.
[0074] As imunizações iniciais foram administradas através da via subcutânea (sc) na base da cauda com uma dose de reforço após 2 semanas (d14).
[0075] Análise ELISpot para IFNγ em esplenócitos foi realizada, usando protocolos padrão, 7 dias após administração da dose de re- forço (d21). Os esplenócitos (106 células/cavidade) foram ativados com 5 μg/cavidade de: sequência de G12V de 18 mero (aa4- 21)  YKLVVVGAVGVGKSALTI (SEQ ID NO: 2) ou a sequência de G12R de 18 mero (aa4-21)  YKLVVVGARGVGKSALTI (SEQ ID NO: 3).
[0076] Conforme mostrado na Figura 2, tanto aKRas G12R como G12V em combinação com aCpG ativaram esplenócitos, enquanto que nem KRasG12R solúvel nem G12V em combinação com aCpG e os grupos de controle com KRas solúvel e não tratados e pIC, não.
Exemplo 3: Anfifilo KRas G12D Estimula uma Resposta Imune de Cé- lulas T CD8+
[0077] Em camundongos B6 de tipo selvagem, é difícil induzir a uma resposta de células T CD8+ específicas para Kras. Camundongos B6 transgênicos para o gene de HLA humano, A2.1, foram imunizados com as formas solúveis ou conjugadas com anfifilo do antígeno KRas G12D, bem como com o adjuvante (CpG ou aCpG). O alelo A2.1 é conhecido por montar respostas aos peptídeos KRas em seres humanos.
[0078] A concepção experimental incluiu os 4 grupos de camundon- gos B6 HLA-A2.1 Tg a seguir imunizados com os compostos listados (n = 5 para cada grupo):
1. KRas de tipo selvagem + CpG
2. KRas 12D + CpG
3. aKRas 12D + aCpG
4. Sem imunização
[0079] O adjuvante, bem como soluções mãe de peptídeos, foram dissolvidos em em H2O. As injeções finais foram diluídas com 1X PBS.
[0080] Os peptídeos de aKRas usados foram sequências de 18 mero de sequências mutantes com uma substituição G12D (aminoáci- dos 4-21 de tipo selvagem  YKLVVVGAGGVGKSALTI (SEQ ID NO: 9)). 20 μg em 100 μl foram usados para cada injeção.
[0081] A sequência de aCpG usada foi a sequência CpG1826 (5'- tccatgacgttcctgacgtt-3'; SEQ ID NO: 10) com duas guaninas adiciona- das na extremidade 5' (5'-gg tccatgacgttcctgacgtt-3'; SEQ ID NO: 11) em uma concentração de 5 nmol para cada injeção de 100 μl.
[0082] A vacina foi administrada através da via subcutânea a ca- mundongos fêmeas bilateralmente na base da cauda a 50 μl de cada lado. Duas doses de reforço foram administradas em intervalos de duas semanas.
[0083] Análise de coloração de citocinas intracelulares (ICS)
para IFNγ em células mononucleares de sangue periférico (PBMCs) e análise ELISpot para IFNγ em esplenócitos foram realizadas, usando protocolos padrão, 7 dias após as segunda e terceira doses de reforço, respectivamente.
[0084] PBMCs/esplenócitos (106 células/cavidade e 2x106 célu- las/cavidade) foram ativados com 5 μg/cavidade de SEQ ID NO: 1 ou uma de SEQ ID NOS: 12-20, conforme mostrado abaixo:
1. sequência 12D de 18 mero (aa4-21)  YKLVVVGADGVGKSALTI (epítopo MHCII/CD4)
2. sequência 12D de 17 mero (aa5-21)  KLVVVGADGVGKSALTI
3. sequência 12D de 10 mero (aa5-14)  KLVVVGADGV
4. sequência 12D de 9 mero (aa6-14)  LVVVGADGV
5. sequência 12D de 9 mero (aa7-15)  VVVGADGVG
6. sequência 12D de 9 mero (aa8-16)  VVGADGVGK (epítopo MHCI/CD8)
7. sequência 12D de 9 mero (aa9-17)  VGADGVGKS
8. sequência 12D de 9 mero (aa10-18)  GADGVGKSA (epítopo MHCI/CD8)
9. sequência 12D de 9 mero (aa11-19)  ADGVGKSAL
10. sequência 12D de 9 mero (aa12-20)  DGVGKSALT
[0085] Peptídeos mutantes específicos são fornecidos apenas aos camundongos que foram imunizados com o 18 mero correspondente.
[0086] A Figura 3 mostra uma resposta de células T CD8+ específi- cas para KRas para camundongos imunizados com a combinação de aKRas G12D e aCpG, mas não para KRas G12D solúvel em combi- nação com CpG ou KRas de tipo selvagem solúvel em combinação com CpG. Exemplo 4: Análise Quanto à Maior Concentração de Antí- geno e Diferentes Faixas de Dosagem
[0087] A concentração de antígeno foi aumentada de 20 μg para 50 μg e faixas de dosagem quinzenais (bw) ou semanais (w) foram testadas.
[0088] A concepção experimental incluiu os 5 grupos de camundon- gos C57BL/6 a seguir imunizados com os compostos listados (n = 5 para cada grupo):
1. KRas 12D + CpG1826 (bw)
2. KRas 12D + CpG1826 (w)
3. aKRas 12D + aCpG1826 (bw)
4. aKRas 12D + aCpG1826 (w)
5. Sem imunização
[0089] O adjuvante, bem como soluções mãe de peptídeos, foram dissolvidos em H2O. As injeções finais foram diluídas com 1X PBS.
[0090] Os peptídeos de aKRas usados foram sequências de 18 mero de sequências mutantes com uma substituição G12D (aminoáci- dos 4-21 de tipo selvagem  YKLVVVGAGGVGKSALTI (SEQ ID NO: 9)). 50 μg em 100 μl foram usados para cada injeção.
[0091] A sequência de aCpG usada foi a sequência CpG1826 (5'- tccatgacgttcctgacgtt-3'; SEQ ID NO: 10) com duas guaninas adiciona- das na extremidade 5' (5'-gg tccatgacgttcctgacgtt-3'; SEQ ID NO: 11) em uma concentração de 5 nmol para cada injeção de 100 μl.
[0092] As imunizações iniciais foram administradas através da via subcutânea (sc) na base da cauda com uma dose de reforço após 2 semanas.
[0093] Análise ELISpot para IFNγ e análise CBA (arranjo de esferas citométricas) para IL6, IL10, IL12, TNFα, IFNγ e MCP1 foram realizadas em esplenócitos, usando protocolos padrão, 7 dias após administração da dose de reforço. Os esplenócitos (106 células/cavidade) foram ativa- dos com 5 μg/cavidade de SEQ ID NO: 1 ou uma de SEQ ID NOS: 12- 21 conforme mostrado abaixo:
1. sequência 12D de 18 mero (aa4-21)  YKLVVVGADGVGKSALTI (epítopo MHCII/CD4)
2. sequência 12D de 17 mero (aa5-21)  KLVVVGADGVGKSALTI
3. sequência 12D de 10 mero (aa5-14)  KLVVVGADGV
4. sequência 12D 9mer (aa5-13)  KLVVVGA D G
5. sequência 12D de 9 mero (aa6-14)  LVVVGADGV
6. sequência 12D de 9 mero (aa7-15)  VVVGADGVG
7. sequência 12D de 9 mero (aa8-16)  VVGADGVGK (epítopo MHCI/CD8)
8. sequência 12D de 9 mero (aa9-17)  VGADGVGKS
9. sequência 12D de 9 mero (aa10-18)  GADGVGKSA (epítopo MHCI/CD8)
10. sequência 12D de 9 mero (aa11-19)  ADGVGKSAL
11. sequência 12D de 9 mero (aa12-20)  DGVGKSALT
[0094] Peptídeos mutantes específicos foram fornecidos apenas aos camundongos que foram imunizados com o 18 meros correspon- dente.
[0095] Placas separadas foram preparadas para estímulos de pep- tídeos curtos (9 meros e 10 meros) ou longos (17 meros e 18 meros). As células de camundongos de controle "sem imunização" foram estimula- das com todos os estímulos.
[0096] A Figura 4 mostra uma resposta de células T CD8+ específi- cas para KRas (9 meros) e resposta de células T CD8+ ou CD4+ (18 me- ros) para camundongos imunizados com a combinação de aKRas G12D e aCpG, mas não para KRas G12D solúvel em combi- nação com CpG ou o controle não tratado. Exemplo 5: Análise Adicional de Anfifilos de KRAS
[0097] Conforme descrito nos Exemplos acima, a imunogenicidade potencial de uma vacina de peptídeo de anfifilo-KRAS mutante com ad- juvante aCpG foi demonstrada em um modelo de camundongo C57BL/6. Estes estudos e outros estudos estão resumidos na Tabela 4 e demonstram que, embora os camundongos montem historicamente respostas imunes mais pobres do que os seres humanos aos peptídeos de KRAS mutantes, em virtude das diferenças de espécies quanto à ligação ao MHC:
[0098]  a administração subcutânea de Amph-Peptídeos de KRAS mutantes (G12D (Figura 6), G12R e G12V) é eficaz na indução de célu- las T esplênicas específicas para KRAS em camundongos, conforme identificado por ELISPOT e arranjo de esferas de citocinas (Figura 1, Figura 2, Figura 4 e Figura 5)
[0099]  Amph-Peptídeos de KRAS mutantes (G12D, G12R e G12V) combinados com aCpG como o adjuvante são mais eficazes na indução de células T esplênicas específicas para KRAS do que peptí- deos de KRAS mutantes combinadas com qualquer um de CpG ou ácido poli-inosínico:policitidílico solúvel (poli IC) como o adjuvante (Fi- gura 1, Figura 2 e Figura 5) e
[0100]  Amph-Peptídeos de KRAS mutantes (GD12) combinados com aCpG são mais eficazes do que os peptídeos de KRAS solúveis combinados com CpG solúvel em induzir tanto respostas de células T CD4 como CD8, conforme demonstrado pelas respostas de citocina efe- tora após nova estimulação com epítopos peptídicos longos (18-mero) ou curtos (9-meros) (Figura 4). Tabela 4 Doses do artigo de teste/Volume da ROA/regime de tratamento Resultados dose 4 grupos: 1) KRAS G12D + CpG; 2) Amph-KRAS G12D + aCpG; 3) KRAS G12D + Poli IC; 4) Sem tratamento Resultados ELISPOT (IFNγ): Os peptídeos de KRAS (anfifílicos ou Amph-peptídeo G12D + aCpG pro- solúveis) foram dosados a ROA: SC duziu respostas de células T esplê- 20 µg; aCpG-1826 a 5 nmL; e Poli IC a Inicial: Dia 0 nicas de qualidade superior quando 50 µg; as soluções mãe foram dissolvi- Reforço: Dia 14 comparado com qualquer um de das em água e as soluções de dose fi- G12D solúvel + CpG solúvel ou poli nal em solução salina tamponada com IC fosfato (PBS). Volume de dose: 100 µL administrados divididos como uma injeção SC em cada lado da base da cauda (50 µL por local de injeção) 7 grupos: 1) KRAS G12R + CpG; 2) KRAS G12V + CpG 3) KRAS G12R + Poli IC; 4) KRAS G12V + Poli IC; 5) Amph-KRAS G12R + aCpG; 6) Amph-KRAS G12V + aCpG; 7) Sem tratamento Resultados ELISPOT (IFNγ): ROA: SC Sequências peptídicas de KRAS são Os peptídeos de KRAS (anfifílicos ou Inicial: Dia 0 mais imunogênicas quando conjuga- solúveis) foram dosados a Reforço: Dia 14 das com uma porção lipídica que 20 µg; aCpG-1826 a 5 nmL; e Poli IC a são peptídeos solúveis 50 µg; as soluções mãe foram dissolvi- das em água e as soluções de dose fi- nal em PBS.
Volume de dose: 100 µL administrados divididos como uma injeção SC em cada lado da base da cauda (50 µL por local de injeção) 5 grupos: ROA: SC Resultados ELISPOT (IFNγ) e CBA:
Doses do artigo de teste/Volume da ROA/regime de tratamento Resultados dose 1) KRAS G12D + CpG (bw); 2 doses (inicial + reforço) fo- Os anfifilos estimularam respostas 2) KRAS G12D + CpG (w); ram administradas aos ani- de células T CD8 e CD4 endógenas 3) Amph-KRAS G12D + aCpG (BW); mais tratados quinzenal- contra KRAS mutantes em camun- 4) Amph-KRAS G12D + aCpG (w); mente (bw) e 3 doses (inicial dongos C57BL/6, conforme avaliado 5) Sem tratamento + 2 reforços) foram adminis- por ELISPOT (IFNγ) e/ou arranjo de tradas aos animais tratados esferas de citocina (IFNγ, TNFα e IL- Os peptídeos de KRAS (anfifílicos ou semanalmente (w): 6) solúveis) foram dosados a 50 µg; aCpG-1826 a 5 nmol; as solu- Inicial: Dia 0 (w e bw) ções mãe foram dissolvidas em água e Reforço: Dia 7 (w) as soluções de dose final em PBS. Reforço: Dia 14 (w e bw) Volume de dose: 100 µL administrados divididos como uma injeção SC em cada lado da base da cauda (50 µL por local de injeção)
[0101] CBA = arranjo de esferas citométricas; ELISPOT = Immu- nospot ligado à enzima; IFNγ = interferon gama; IL-6 = interleucina 6; KRAS = Sarcoma de Kirsten de Rato; poli IC = ácido poli-inosí- nico:policitidílico; ROA = via de administração; SC = subcutâneo; TNFα = fator de necrose tumoral alfa Outras Modalidades
[0102] Embora a invenção tenha sido descrita em relação a moda- lidades específicas da mesma, será entendido que ela é capaz de mo- dificações adicionais e o presente pedido se destina a cobrir quaisquer variações, usos ou adaptações da invenção seguindo, em geral, os prin- cípios da invenção e incluindo desvios da presente invenção que pro- vêm da prática conhecida ou habitual dentro da técnica à qual a inven- ção pertence e podem ser aplicadas às características essenciais apre- sentadas aqui.
[0103] Todas as publicações, patentes e pedidos de patentes são aqui incorporados por referência na íntegra até o mesmo ponto como se cada publicação, patente ou pedido de patente individual fosse especí- fica e individualmente indicado como sendo incorporado por referência na íntegra.
[0104] Algumas modalidades da invenção estão dentro dos pará- grafos numerados a seguir.
[0105] 1. Um composto que compreende uma sequência de KRAS mutante e um lipídio, em que a sequência de KRAS mutante é conju- gada ao lipídio através de um ligante e (i) o ligante compreende um ou mais blocos de polietileno glicol, (ii) o lipídio é 1,2-diestearoil-sn-glicero- 3-fosfoetanolamina (DSPE) e (iii) a sequência de KRAS mutante com- preende ou consiste em uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em YKLVVVGADGVGKSALTI (SEQ ID NO: 23), YKLVVVGAVGVGKSALTI (SEQ ID NO : 24), YKLVVVGAR- GVGKSALTI (SEQ ID NO: 25), YKLVVVGAAGVGKSALTI (SEQ ID NO: 26), YKLVVVGASGVGKSALTI (SEQ ID NO: 27), YKLVATVGA- CGVGKSLTI (SEQ ID NO: 28), YKLVVVVGASGVGKSALTI (SEQ ID NO: 27), YKLVATVGACGVGKSLTI (SEQ ID NO: 28) YKLVVVGAG- DVGKSALTI (SEQ ID NO: 30).
[0106] 2. Um composto que compreende uma sequência de KRAS mutante e um lipídio, em que a sequência de KRAS mutante é conju- gada ao lipídio através de um ligante e (i) o ligante compreende um ou mais blocos de polietileno glicol, (ii) o lipídio é 1,2-diestearoil-sn-glicero- 3-fosfoetanolamina (DSPE) e (iii) a sequência KRAS mutante compre- ende ou consiste em uma sequência de aminoácidos selecionada a par- tir do grupo que consiste em CYKLVVVGADGVGKSALTI (SEQ ID NO: 1), CYKLVVVGAVGVGKSALTI (SEQ ID NO : 2), CYKLVVVGAR- GVGKSALTI (SEQ ID NO: 3), CYKLVVVGAAGVGKSALTI (SEQ ID NO: 4), CYKLVVVGASGVGKSALTI (SEQ ID NO: 5), CYKLVVATVGA- CGVGKSLTI (SEQ ID NO: 6) (SEQ ID NO: 6) CYKLVVVGAG- DVGKSALTI (SEQ ID NO: 7).
[0107] 3. O composto de acordo com o parágrafo 1 ou 2, em que a sequência de KRAS mutante, em seu N-término, é conjugada ao ligante através de uma ligação de cisteína-maleimida.
[0108] 4. O composto de acordo com qualquer um dos parágrafos 1-3, em que o ligante compreende 48 unidades de repetição de polieti- leno glicol.
[0109] 5. O composto de acordo com o parágrafo 1 ou 2, em que a sequência KRAS mutante, em sua extremidade N-terminal, é conjugado à seguinte estrutura: .
[0110] 6. Uma composição que compreende um ou mais compostos de acordo com qualquer um dos parágrafos 1-5 e um carreador farma- ceuticamente aceitável.
[0111] 7. A composição de acordo com o parágrafo 6, em que a composição compreende (1) um composto que compreende a sequên- cia de aminoácidos YKLVVVGADGVGKSALTI (SEQ ID NO: 23), (2) um composto que compreende a sequência de aminoácidos YKLVVVGAVGVGKSALTI (SEQ ID NO: 24), (3) um composto que com- preende a sequência de aminoácidos YKLVVVGARGVGKSALTI (SEQ ID NO: 25), (4) um composto que compreende a sequência de aminoá- cidos YKLVVVGAAGVGKSALTI (SEQ ID NO: 26), (5) um composto que compreende a sequência de aminoácidos YKLVVVGASGVGKSALTI (SEQ ID NO: 27), (6) um composto que compreende a sequência de aminoácidos YKLVVVGACGVGKSALTI (SEQ ID NO: 28) ou um com- posto que compreende a sequência de aminoácidos YKLVVVGATGVGKSALTI (SEQ ID NO: 29) e (7) um composto que compreende o sequência de aminoácidos YKLVVVGAGDVGKSALTI (SEQ ID NO: 30).
[0112] 8. A composição de acordo com o parágrafo 6, em que a composição compreende (1) um composto que compreende a sequên- cia de aminoácidos CYKLVVVGADGVGKSALTI (SEQ ID NO: 1), (2) um composto que compreende a sequência de aminoácidos CYKLVVVGAVGVGKSALTI (SEQ ID NO: 2), (3) um composto que com- preende a sequência de aminoácidos CYKLVVVGARGVGKSALTI (SEQ ID NO: 3), (4) um composto que compreende a sequência de ami- noácidos CYKLVVVGAAGVGKSALTI (SEQ ID NO: 4), (5) um composto que compreende a sequência de aminoácidos CYKLVVVGAS- GVGKSALTI (SEQ ID NO: 5), (6) um composto que compreende a se- quência de aminoácidos CYKLVVVGACGVGKSALTI (SEQ ID NO: 6) ou um composto que compreende a sequência de aminoácidos CYKLVVVGATGVGKSALTI (SEQ ID NO: 22) e (7) um composto que compreende o sequência de aminoácidos CYKLVVVGAGDVGKSALTI (SEQ ID NO: 7).
[0113] 9. A composição de acordo com qualquer um dos parágrafos 6-8, em que a composição compreende ainda um composto que con- siste na sequência de nucleotídeos 5'-TCGTCGTTTTGTCGTTTTTG- TCGTT-3' (SEQ ID NO: 8) a qual, em sua extremidade 5', está ligada ou unida através de um ligante ao seguinte lipídio: , ou um sal do mesmo, em que X é O ou S.
[0114] 10. A composição de acordo com o parágrafo 6, em que a composição compreende 700 µg de cada composto.
[0115] 11. Um método de tratamento de um câncer em um paciente humano, o método compreendendo administrar a composição de qual- quer um dos parágrafos 6 a 10 ao paciente.
[0116] 12. O método de acordo com o parágrafo 11, em que o mé- todo compreende ainda administrar um adjuvante.
[0117] 13. O método de acordo com o parágrafo 12, em que o adju- vante compreende uma sequência de nucleotídeos CpG.
[0118] 14. O método de acordo com o parágrafo 13, em que a se- quência de nucleotídeos CpG compreende 5'-TCGTCGTTTTGTCG- TTTTGTCGTT-3' (SEQ ID NO: 8).
[0119] 15. O método de acordo com qualquer um dos parágrafos 12-14, em que são administrados 0,1 mg, 0,5 mg ou 2,5 mg do adju- vante.
[0120] 16. O método de acordo com o parágrafo 10, em que o mé- todo compreende ainda administrar ao paciente um composto que con- siste na sequência de nucleotídeos 5'-TCGTCGTTTTGTCGTTTTTG- TCGTT-3' (SEQ ID NO: 8) a qual, em sua extremidade 5', está ligada ou unida através de um ligante ao seguinte lipídio: , ou um sal do mesmo, em que X é O ou S.
[0121] 17. A composição de acordo com o parágrafo 9 ou o método de acordo com o parágrafo 16, em que a sequência de nucleotídeos está ligada ao lipídio.
[0122] 18. O método de acordo com o parágrafo 16 ou 17, em que são administrados 0,1 mg, 0,5 mg ou 2,5 mg do composto que consiste na sequência de nucleotídeos 5'-TCGTCGTTTTGTCGTTTTTGTCGTT- 3' (SEQ ID NO: 8) a qual, em sua extremidade 5', está ligada ou unida através de um ligante ao seguinte lipídio:
, ou um sal do mesmo, em que X é O ou S.
[0123] 19. O método, de acordo com qualquer um dos parágrafos 11-16 ou 18, em que o câncer é um câncer pancreático, um câncer de pulmão ou um câncer colorretal.
[0124] 20. O método de acordo com qualquer um dos parágrafos 11-16 ou 18, em que todos os grupos internucleosídicos que conectam os nucleosídeos em 5'-TCGTCGTTTTGTCGTTTTTGTCGTT-3' (SEQ ID NO: 8) são fosforotioatos.
[0125] 21. Um kit que compreende (i) um composto de acordo com qualquer um dos parágrafos 1-5 ou uma composição de acordo com qualquer um dos parágrafos 6-8 e (ii) um composto que consiste na se- quência de nucleotídeos 5'-TCGTCGTTTTTGTCGTTTTTGTCGTT-3' (SEQ ID NO: 8) a qual, em sua extremidade 5', está ligada ou unida através de um ligante ao seguinte lipídio: , ou um sal do mesmo, em que X é O ou S.
[0126] Outras modalidades estão dentro das reivindicações a se- guir.

Claims (22)

REIVINDICAÇÕES
1. Composto que compreende uma sequência KRAS mu- tante e um lipídio, caracterizado pelo fato de que a sequência KRAS mutante é conjugada com o lipídio através de um ligante e (i) o ligante compreende um ou mais blocos de polietileno, (ii) o lipídio é 1,2-dieste- aroil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DSPE) e (iii) a sequência KRAS mutante consiste em uma sequência de aminoácidos selecionada a par- tir do grupo que consiste em CYKLVVVGADGVGKSALTI (SEQ ID NO: 1), CYKLVVVGAVGVGKSALTI (SEQ ID NO: 2), CYKLVVVGAR- GVGKSALTI (SEQ ID NO: 3), CYKLVVVGAAGVGKSALTI (SEQ ID NO: 4), CYKLVVVGASGVGKSALTI (SEQ ID NO: 5), CYKLVVVGA- CGVGKSALTI (SEQ ID NO: 6), CYKLVVVGATGVGKSALTI (SEQ ID NO: 22) e CYKLVVVGAGDVGKSALTI (SEQ ID NO: 7).
2. Composto, de acordo com a reivindicação 1, caracteri- zado pelo fato de que a sequência KRAS mutante consiste em uma se- quência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em YKLVVVGADGVGKSALTI (SEQ ID NO: 23), YKLVVVGAVGVGKSALTI (SEQ ID NO: 24), YKLVVVGARGVGKSALTI (SEQ ID NO: 25), YKLVVVGAAGVGKSALTI (SEQ ID NO: 26), YKLVVVGASGVGKSALTI (SEQ ID NO: 27), YKLVVVGACGVGKSALTI (SEQ ID NO: 28), YKLVVVGATGVGKSALTI (SEQ ID NO: 29) e YKLVVVGAGDVGKSALTI (SEQ ID NO: 30).
3. Composto, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, carac- terizado pelo fato de que a sequência KRAS mutante, em seu N-tér- mino, é conjugada ao ligante por meio de uma ligação de cisteína-ma- leimida.
4. Composto, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, carac- terizado pelo fato de que o ligante compreende 48 unidades de repeti- ção de polietileno glicol.
5. Composto, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, carac- terizado pelo fato de que a sequência KRAS mutante, em seu N-término, é conjugada com a seguinte estrutura: .
6. Composição caracterizada pelo fato de que compreende um ou mais compostos como definidos na reivindicação 1 ou 2 e um veículo farmaceuticamente aceitável.
7. Composição, de acordo com a reivindicação 6, caracteri- zada pelo fato de que a composição compreende (1) um composto que compreende a sequência de aminoácidos YKLVVVGADGVGKSALTI (SEQ ID NO: 23), (2) um composto que compreende a sequência de aminoácidos YKLVVVGAVGVGKSALTI (SEQ ID NO: 24), (3) um com- posto que compreende a sequência de aminoácidos YKLVVVGAR- GVGKSALTI (SEQ ID NO: 25), (4) um composto que compreende a se- quência de aminoácidos YKLVVVGAAGVGKSALTI (SEQ ID NO: 26), (5) um composto que compreende a sequência de aminoácidos YKLVVVGASGVGKSALTI (SEQ ID NO: 27), (6) um composto que com- preende a sequência de aminoácidos YKLVVVGACGVGKSALTI (SEQ ID NO: 28) ou um composto que compreende a sequência de aminoá- cidos YKLVVVGATGVGKSALTI (SEQ ID NO: 29) e (7) um composto que compreende a sequência de aminoácidos YKLVVVGAG- DVGKSALTI (SEQ ID NO: 30).
8. Composição, de acordo com a reivindicação 6, caracteri- zada pelo fato de que a composição compreende (1) um composto que compreende a sequência de aminoácidos CYKLVVVGADGVGKSALTI (SEQ ID NO: 1), (2) um composto que compreende a sequência de ami- noácidos CYKLVVVGAVGVGKSALTI (SEQ ID NO: 2), (3) um composto que compreende a sequência de aminoácidos CYKLVVVGAR- GVGKSALTI (SEQ ID NO: 3), (4) um composto que compreende a se- quência de aminoácidos CYKLVVVGAAGVGKSALTI (SEQ ID NO: 4), (5) um composto que compreende a sequência de aminoácidos CYKLVVVGASGVGKSALTI (SEQ ID NO: 5), (6) um composto que com- preende a sequência de aminoácidos CYKLVVVGACGVGKSALTI (SEQ ID NO: 6) ou um composto que compreende a sequência de ami- noácidos CYKLVVVGATGVGKSALTI (SEQ ID NO: 22) e (7) um com- posto que compreende a sequência de aminoácidos CYKLVVVGAG- DVGKSALTI (SEQ ID NO: 7).
9. Composição, de acordo com a reivindicação 6, ca- racterizada pelo fato de que a composição compreende ainda um com- posto que consiste na sequência de nucleotídeos 5'-TCGTCGTTTTG- TCGTTTTGTCGTT-3' (SEQ ID NO: 8) a qual, em sua extremidade 5', está ligada ou unida através de um ligante ao seguinte lipídio: , ou um sal do mesmo, em que X é O ou S.
10. Composição, de acordo com a reivindicação 6, caracte- rizada pelo fato de que a composição compreende 700 µg de cada com- posto.
11. Composição, de acordo com a reivindicação 9, caracte- rizada pelo fato de que a sequência de nucleotídeos está ligada ao lipí- dio.
12. Método de tratamento de um câncer em um paciente hu- mano, caracterizado pelo fato de que o método compreende administrar a composição como definida na reivindicação 6 ao paciente.
13. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o método compreende ainda administrar um adjuvante.
14. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o adjuvante compreende uma sequência de nucleotí- deos CpG.
15. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que a sequência de nucleotídeos CpG compreende 5'-TCG- TCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-3' (SEQ ID NO: 8).
16. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que é administrado 0,1 mg, 0,5 mg ou 2,5 mg do adjuvante.
17. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o método compreende ainda administrar ao paciente de um composto que consiste na sequência de nucleotídeos 5'-TCG- TCGTTTTGTCGTTTTTGTCGTT-3' (SEQ ID NO: 8) a qual, em sua ex- tremidade 5', está ligada ou unida através de um ligante ao seguinte lipídio: , ou um sal do mesmo, em que X é O ou S.
18. Método, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que a sequência de nucleotídeos está ligada ao lipídeo.
19. Método, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que é administrado 0,1 mg, 0,5 mg ou 2,5 mg do composto que consiste na sequência de nucleotídeos 5'-TCGTCGTTTTGTCG- TTTTTGTCGTT-3' (SEQ ID NO: 8) a qual, em sua extremidade 5', é li- gada ou unida através de um ligante ao seguinte lipídeo:
, ou um sal do mesmo, em que X é O ou S.
20. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o câncer é um câncer pancreático, um câncer de pul- mão ou um câncer colorretal.
21. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que todos os grupos internucleosídeos que conectam os nucleosídeos em 5'-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-3' (SEQ ID NO: 8) são fosforotioatos.
22. Kit, caracterizado pelo fato de que compreende (i) um composto como definido na reivindicação 1 ou 2 e (ii) um composto que consiste na sequência de nucleotídeos 5'-TCGTCGTTTTGTCG- TTTTTGTCGTT-3' (SEQ ID NO: 8) a qual, em sua extremidade 5', está ligada ou unida através de um ligante ao seguinte lipídeo: , ou um sal do mesmo, em que X é O ou S.
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