BR112020015421A2 - Método para o diagnóstico de angioedema hereditário - Google Patents

Abstract

A presente invenção refere-se a um método para diagnóstico diferencial de angioedema hereditário, em que o método compreende a determinação do nível de proteína C4, proteína C1-INH e proteína C1q em uma amostra de um indivíduo, em que a amostra é uma amostra de mancha de sangue seco e em que o nível é determinado pela espectrometria de massa.

Description

UTI Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODO PARA O DIAGNÓSTICO DE ANGIOEDEMA HEREDITÁRIO".

[0001] A presente invenção refere-se a um método para diagnósti- cos diferenciais de angioedema hereditário em um indivíduo e a um kit adequado para uso em diagnósticos diferenciais de angioedema here- ditário.

[0002] O angioedema hereditário é um distúrbio herdado raro ca- racterizado por episódios recorrentes do acúmulo de fluidos fora dos vasos sanguíneos, bloqueando o fluxo normal de sangue ou fluido lin- fático e provocando inchaço rápido dos tecidos nas mãos, pés, mem- bros, face, trato intestinal ou vias aéreas. Geralmente, esse inchaço não é acompanhado de coceira, como pode ocorrer com uma reação alérgica. O inchaço do trato gastrointestinal leva a cólicas. O inchaço das vias aéreas pode levar à obstrução, uma complicação potencial- mente muito grave. Esses sintomas se desenvolvem como o resultado da deficiência ou do funcionamento inadequado de certas proteínas que ajudam a manter o fluxo normal de fluidos através de vasos san- guíneos muito pequenos, isto é, capilares. Em alguns casos, o líquido pode se acumular em outros órgãos internos.

[0003] A gravidade da doença varia muito entre os indivíduos afe- tados. Existem três tipos principais de angioedema hereditário, tipo |, tipo Il e tipo Ill, com o tipo | sendo a forma mais comum. O angioede- ma hereditário tipo | e Il é provocado por uma mutação no gene SER- PING1 que produz a proteína inibidora C1, que normalmente suprime a ativação do sistema complemento, enquanto que o tipo Ill é frequen- temente devido a uma mutação no gene do fator XII.

[0004] O angioedema hereditário é herdado como uma caracterís- tica autossômica dominante. O gene mutante pode ser herdado de qualquer um dos pais ou pode ser o resultado de uma nova mutação espontânea no indivíduo afetado.

[0005] O tratamento de pacientes com ataques agudos inclui a administração de um inibidor de C1 esterase derivado de plasma ("Be- rinert&", CSL Behring), um inibidor de calicreína ("Kalbitor&", Dyax Corporation) ou um antagonista de bradicinina ("FirazyrO", Shire). O tratamento de pacientes para profilaxia a longo prazo inclui a adminis- tração de um inibidor da C1 esterase tal como "Cinryze€O" (Virophar- ma) e ou de um andrógeno 17-a-alquilado, tal como o Danazol (dispo- nível sob as marcas registradas "Danatrol", "Danocrine", "Danol" e "Danoval")

[0006] O angioedema hereditário pode ser diagnosticado medindo os níveis de C1-INH utilizando um ensaio cromogênico ou um ELISA complexo. Tais testes de laboratório, isto é, ensaio cromogênico ou um ELISA complexo, são inespecíficos, demorados e exigem altos níveis de demanda ou recursos tais como amostra biológica, tempo e materi- ais de laboratório.

[0007] O problema subjacente da presente invenção é o forneci- mento de um método e meios para o diagnóstico diferencial de angio- edema hereditário.

[0008] Esses e outros problemas são resolvidos pela presente ma- téria das reivindicações independentes anexas. As modalidades prefe- ridas podem ser tomadas a partir das reivindicações dependentes em anexo.

[0009] Mais especificamente, o problema subjacente da presente invenção é resolvido em um primeiro aspecto por um método para di- agnóstico diferencial de angioedema hereditário, em que o método compreende determinar o nível de proteína C4, proteína C1-INH e pro- teina C1q em uma amostra de um indivíduo, em que a amostra é uma amostra de mancha de sangue seco e em que o nível é determinado por espectrometria de massa.

[0010] O problema subjacente da presente invenção é resolvido em um segundo aspecto por um kit adequado para uso em um método para diagnóstico diferencial de angioedema hereditário, de preferência um método para diagnóstico diferencial de angioedema hereditário de acordo com o primeiro aspecto, em que o Kit compreende pelo menos um elemento selecionado do grupo que compreende um parceiro de interação de um biomarcador, um biomarcador, instruções de uso do kit e um ou mais recipientes, em que o biomarcador é selecionado do grupo que compreende a proteína C4, um peptídeo de fragmento da proteína CA4, proteína C1-INH, um peptídeo de fragmento da proteína C1-INH, proteína C1q e um peptídeo de fragmento de C1q.

[0011] O presente inventor identificou surpreendentemente um conjunto de biomarcadores que é útil no diagnóstico diferente de angi- oedema hereditário. Esse conjunto de biomarcadores compreende (a) proteína C4 ou um peptídeo de fragmento de C4, (b) proteína C1-INH ou um peptídeo de fragmento de C1-INH e (c) proteína C1iqg ou um peptídeo de fragmento de C1q.

[0012] De acordo com cada um e qualquer aspecto da presente invenção, o biomarcador é selecionado do grupo que compreende a proteína C4, um peptídeo derivado da proteína C4 que é, em uma mo- dalidade, um peptídeo de fragmento de C4, proteína C1-INH, um pep- tídeo derivado da proteína C1-INH que é, em uma modalidade, um peptídeo de fragmento de C1-INH, uma proteína C1iq e um peptídeo derivado da proteína C1q que é, em uma modalidade, um peptídeo de fragmento de C1q. É assim dentro da presente invenção que, na práti- ca dos vários métodos da presente invenção, incluindo qualquer as- pecto e sua modalidade, o nível de proteína C4, proteína C1-INH e/ou proteína C1qg é determinado. Mais especificamente, está dentro da presente invenção que, na prática dos vários métodos da presente in- venção, incluindo qualquer aspecto e modalidade da mesma, o nível de proteína C4, proteína C1-INH e proteína C1q é determinado.

[0013] Em uma modalidade de cada um e qualquer aspecto da presente invenção, um peptídeo derivado da proteína C1q é um peptí- deo obtido ou obtenível da digestão enzimática da proteína C1q, de preferência digestão da proteína C1iq através da digestão tríptica da proteína C1q. Em uma modalidade, esse peptídeo não é quimicamen- te convertido, transformado ou derivatizado.

[0014] O subcomponente C1q do sistema de complemento se liga aos complexos de imunoglobulina com a ativação serial resultante de C1r (enzima), C1s (pró-enzima) e os outros 8 componentes do com- plemento. C1q é composto por 3 espécies diferentes de cadeias, cha- madas A, B e C. De preferência, qualquer referência nessa invenção a C1q ou proteína C1q refere-se ao subcomponente C1q e cada uma e qualquer de suas cadeias individuais A, B e C, a menos que indicado de maneira diferente.

[0015] A sequência de aminoácido da cadeia A de C1iq é como se segue:

MEGPRGWLVLCVLAISLASMVTEDLCRAPDGKKGEAGRPGRRGRP GLKGEQGEPGAPGIRTGIQGLKGDQGEPGPSGNPGKVGYPGPSGP LGARGIPGIKGTKGSPGNIKDQPRPAFSAIRRNPPMGGNVVIFDTVIT NQEEPYQNHSGRFVCTVPGYYYFTFQVLSQWEICLSIVSSSRGQVR

RSLGFCDTTNKGLFQVVSGGMVLALAQGDAVWVEKDPKKGHIYAG SEADSVFSGFLIFPSA (SEQ ID NO: 1)

[0016] A sequência de aminoácido da cadeia B de C1iqg é como se segue:

MMMKIPWGSIPVLMLLLLLGLIDISQAQLSCTGPPAIPGIPGIPGTPGP DGQPGTPGIKGEKGLPGLAGDHGEFGEKGDPGIPGNPGKVGPKGP MGPKGGPGAPGAPGPKGESGDYKATQKIAFSATRTINVPLRRDQOTIR FDHVITNMNNNYEPRSGKFTCKVPGLYYFTYHASSRGNLCVNLMRG

RERAQKVVTFCDYAYNTFQVTTGGMVLKLEQGENVFLQATDKNSLL GMEGANSIFSGFLLFPDMEA (SEQ ID NO: 2)

[0017] A sequência de aminoácido da cadeia C de C1q é como se segue:

MDVGPSSLPHLGLKLLLLLLLLPLRGQANTGCYGIPGMPGLPGAPGK DGYDGLPGPKGEPGIPAIPGIRGPKGQAOKGEPGLPGHPGKNGPMGPP GMPGVPGPMGIPGEPGEEGRYKQKFQSVFTVTRQTHQPPAPNSLIR FNAVLTNPQGDYDTSTGKFTCKVPGLYYFVYHASHTANLCVLLYRSG

VKVVTFCGHTSKTNQVNSGGVLLRLQVGEEVWLAVNDYYDMVGIAG SDSVFSGFLLFPD (SEQ ID NO: 3)

[0018] Em uma modalidade de cada um e qualquer aspecto da presente invenção, o peptídeo de fragmento derivado de C1q é aquele selecionado da seguinte tabela. oa fig ASS SA C1g-A [123-150] NO: 6) orar iam SS SO C1g-A [151-180] ID NO: 7) C1g-A [151- FVCTVPGYYYFTFQVLSQWEICLSIVSSSR — (SEQ 180] Cys CAM: 153, 172 ID NO: 8) C1q-A [186-195] SLGFCDTTNK (SEQ ID NO: 9) oa a SST SSS C1g-A [196-219] 11) C1q-A [28-32] APDGK (SEQ ID NO: 14) C1g-A [34-41] | GEAGRPGR (SEQ ID NO: 15) C1q-A [49-60] GEQGEPGAPGIR (SEQ ID NO: 16) C1q-A [82-94] VGYPGPSGPLGAR (SEQ ID NO: 17) C1q-B [118-121] ATQK (SEQ ID NO: 18) C1q-B [137-141] DQTIR (SEQ ID NO: 19)

C1qg-B [178-186] GNLCVNLMR (SEQ ID NO: 22) C1q9-B [178-186] Cys CAM: 181 | GNLCVNLMR (SEQ ID NO: 23) VVTFCDYAYNTFQVTTGGMVLK (SEQ ID NO: 24) C1q9-B [194-215] Cys CAM: 198 | VWVTFCDYAYNTFQVTTGGMVLK (SEQ ID NO: 25) C1q-B [216-229] LEQGENVFLQATDK (SEQ ID NO: 26) NSLLGMEGANSIFSGFLLFPDMEA (SEQ ID NO: C1q-B [230-253] 27)

QLSCTGPPAIPGIPGIPGTPGPDGQPGTPGIK C1q9-B [28-59] (SEQ ID NO: 28)

QLSCTGPPAIPGIPGIPGTPGPDGQPGTPGIK C1q-B [28-59] Cys CAM: 31 (SEQ ID NO: 29) C1q9-B [63-77] GLPGLAGDHGEFGEK (SEQ ID NO: 30) C1qg-B [78-88] GDPGIPGNPGK (SEQ ID NO: 31) C1q-B [93-98] GPMGPK (SEQ ID NO: 32) C1qg-B [99-110] GGPGAPGAPGPK (SEQ ID NO: 33) C1g-C [118-126] FQSVFTVTR (SEQ ID NO: 34) C1g-C [127-139] QTHQPPAPNSLIR (SEQ ID NO: 35) C1g-C [140-157] FNAVLTNPQGDYDTSTGK (SEQ ID NO: 36) C19-C [162-184] VPGLYYFVYHASHTANLCVLLYR (SEQ ID NO: 37) C1q-C [162-184] Cys CAM: 179 | VPGLYYFVYHASHTANLCVLLYR (SEQ ID NO: 38) C1q-C [189-198] | VVTFCGHTSK (SEQ ID NO: 39) C1q-C [189-198] Cys CAM: 193 | VVTFCGHTSK (SEQ ID NO: 40) C1q-C [199-210] TNQVNSGGVLLR (SEQ ID NO: 41) LQVGEEVWLAVNDYYDMVGIQGSDSVFSG- C19-C [211-245] FLLFPD (SEQ ID NO: 42) C1q-C [29-47] NTGCYGIPGMPGLPGAPGK (SEQ ID NO: 43) C1q-C [29-47] Cys CAM: 32 NTGCYGIPGMPGLPGAPGK (SEQ ID NO: 44) C1q-C [48-57] DGYDGLPGPK (SEQ ID NO: 45) C1q-C [76-86] GEPGLPGHPGK (SEQ ID NO: 47) NGPMGPPGMPGVPGPMGIPGEPGEEGR (SEQ ID C19-C [87-113] NO: 48)

[0019] Um peptídeo particularmente preferido derivado de C1iq é C1qgB [178-186], que é um composto tendo uma massa molecular

7ITI m/z de 510,26 conforme medido com um espectrômetro de massa de mobilidade iônica de alta resolução e pode ser medido com MRM-MS e a sequência de aminoácido do qual é como se segue: GNLCVNLMR. Este peptídeo é preferivelmente utilizado como um controle e/ou para distinguir entre HAE e AAE.

[0020] Outro peptídeo particularmente preferido derivado de C1iq é C1gB [63-77], que é um composto tendo uma massa molecular m/z de 742,36 ou 495,24, conforme medido com um espectrômetro de massa de mobilidade iônica de alta resolução e pode ser medido com MRM-MS, e a sequência de aminoácido do qual é como se segue: GLPGLAGDHGEFGEK. Este peptídeo é de preferência utilizado como um controle e/ou para distinguir entre HAE e AAE.

[0021] De acordo com cada um e qualquer aspecto da presente invenção, em uma modalidade de cada um e qualquer aspecto da pre- sente invenção, além do biomarcador, os métodos compreendem a etapa de determinação da presença e/ou nível de outro biomarcador, em que o outro biomarcador é a proteína C1-INH, um peptídeo deriva- do de C1-INH, proteína C4 e/ou um peptídeo derivado da proteína C4.

[0022] Em uma modalidade de cada um e qualquer aspecto da presente invenção, um peptídeo derivado da proteína C1-INH é um peptídeo obtido ou obtenível da digestão enzimática de proteína C1- INH, de preferência digestão da proteína C1-INH através da digestão tríptica da proteína C1-INH. Em uma modalidade, esse peptídeo não é quimicamente convertido, transformado ou derivatizado.

[0023] Em uma modalidade de cada um e qualquer aspecto da presente invenção, um peptídeo derivado da proteína C4 é um peptí- deo obtido ou obtenível da digestão enzimática de proteína C4, de pre- ferência digestão da proteína C4 através da digestão tríptica da proteí- na C4. Em uma modalidade, esse peptídeo não é quimicamente con- vertido, transformado ou derivatizado.

[0024] A sequência de aminoácido de C1-INH é como se segue:

MASRLTLLTLLLLLLAGDRASSNPNATSSSSQDPESLQDRGEGKVAT TVISKMLFVEPILEVSSLPTTNSTTNSATKITANTTDEPTTQPTTEPTTO PTIQPTAQPTTAQLPTDSPTQPTTGSFCPGPVTLCSDLESHSTEAVLGD ALVDFSLKLYHAFSAMKKVETNMAFSPFSIASLLTQVLLGAGENTKTN LESILSYPKDFTCVHQALKGFTTKGVTSVSQIFHSPDLAIRDTFVNASR TLYSSSPRVLSNNSDANLELINTWVAKNTNNKISRLLDSLPSDTRLVLL NAIYLSAKWKTTFDPKKTRMEPFHFKNSVIKVPMMNSKKYPVAHFID QTLKAKVGQLQLSHNLSLVILVPQNLKHRLEDMEQALSPSVFKAIMEK LEMSKFQPTLLTLPRIKVTTSQDMLSIMEKLEFFDFSYDLNLCGLTEDP

DLQVSAMQHQTVLELTETGVEAAAASAISVARTLLVFEVQQPFLFVL WDQQHKFPVYFMGRVYDPRA (SEQ ID NO: 49)

[0025] Em uma modalidade de cada um e qualquer aspecto da presente invenção, o peptídeo de fragmento derivado de C1-INH é aquele selecionado da seguinte tabela.

SerpinG1 [277-286] LLDSLPSDTR (SEQ ID NO: 59) SerpinG1 [301-306] | TTFDPK (SEQ ID NO: 60) SerpinG1 [310-316] MEPFHFK (SEQ ID NO: 61) SerpinG1 [322-328] VPMMNSK (SEQ |D NO: 62) SerpinG1 [330-341] YPVAHFIDOTLK (SEQ ID NO: 63) SerpinG1 [344-364] VGQLQLSHNLSLVILVPONLK (SEQ ID NO: 64)

LEFFDFSYDLNLCGLTEDPDLQVSAMQHOTVL

[0026] Os peptídeos de fragmento particularmente preferidos deri- vados de C1-INH são SerpinG1 [242-249] e SerpinG1 [391-400], em que SerpinG1 [242-249] com transição MRM 455,74 — 696,33 é par- ticularmente preferido.

[0027] A sequência de aminoácido de C4 é como se segue:

MRLLWGLIWASSFFTLSLQKPRLLLFSPSVVHLGVPLSVGVQLQDVP RGQVVKGSVFLRNPSRNNVPCSPKVDFTLSSERDFALLSLQVPLKDA KSCGLHQLLRGPEVQLVAHSPWLKDSLSRTTNIQGINLLFSSRRGHL FLOTDQPIYNPGAQRVRYRVFALDQKMRPSTDTITVMVENSHGLRVRK KEVYMPSSIFQDDFVIPDISEPGTWKISARFSDGLESNSSTQFEVKKY VLPNFEVKITPGKPYILTVPGHLDEMQLDIQARYIYGKPVQGVAYVRF GLLDEDGKKTFFRGLESQTKLVNGQSHISLSKAEFQDALEKLNMGITD LQGLRLYVAAAIIESPGGEMEEAELTSWYFVSSPFSLDLSKTKRHLVP GAPFLLQOALVREMSGSPASGIPVKVSATVSSPGSVPEVQDIQQNTDG SGQVSIPINIPQTISELALSVSAGSPHPAIARLTVAAPPSGGPGFLSIER PDSRPPRVGDTLNLNLRAVGSGATFSHYYYMILSRGQIVFMNREPKR TLTSVSVFVDHHLAPSFYFVAFYYHGDHPVANSLRVDVQAGACEGKL ELSVDGAKQYRNGESVKLHLETDSLALVALGALDTALYAAGSKSHKP LNMGKVFEAMNSYDLGCGPGGGDSALQVFQAAGLAFSDGDQWTLS RKRLSCPKEKTTRKKRNVNFQKAINEKLGQOYASPTAKRCCQDGVTRL PMMRSCEQRAARVQQPDCREPFLSCCQFAESLRKKSRDKGQAGLQO RALEILQEEDLIDEDDIPVRSFFPENWLWRVETVDRFOQILTLWLPDSLT TWEIHGLSLSKTKGLCVATPVQLRVFREFHLHLRLPMSVRRFEQLEL RPVLYNYLDKNLTVSVHVSPVEGLCLAGGGGLAQQVLVPAGSARPV AFSVVPTAAAAVSLKVVARGSFEFPVGDAVSKVLQIEKEGAIHREELV YELNPLDHRGRTLEIPGNSDPNMIPDGDFNSYVRVTASDPLDTLGSE GALSPGGVASLLRLPRGCGEQTMIYLAPTLAASRYLDKTEQWSTLPP ETKDHAVDLIQOKGYMRIQQFRKADGSYAAWLSRDSSTWLTAFVLKVL SLAQEQVGGSPEKLQETSNWLLSQQQADGSFQADPCPVLDRSMQGG LVGNDETVALTAFVTIALHHGLAVFQDEGAEPLKQRVEASISKANSFL GEKASAGLLGAHAAAITAYALTLTKAPVDLLGVAHNNLMAMAQETGD NLYWGSVTGSQSNAVSPTPAPRNPSDPMPQAPALWIETTAYALLHLL LHEGKAEMADQASAWLTRQGSFQGGFRSTQDTVIALDALSAYWIAS HTTEERGLNVTLSSTGRNGFKSHALQLNNRQIRGLEEELQFSLGSKIN VKVGGNSKGTLKVLRTYNVLDMKNTTCQDLQIEVTVKGHVEYTMEA NEDYEDYEYDELPAKDDPDAPLQPVTPLQLFEGRRNRRRREAPKLT SLSDRYVSHFETEGPHVLLYFDSVPTSRECVGFEAVQEVPVGLVQPA SATLYDYYNPERRCSVFYGAPSKSRLLATLCSAEVCQCAEGKCPRQ RRALERGLQDEDGYRMKFACYYPRVEYGFQVKVLREDSRAAFRLFE TKITQVLHFTKDVKAAANQMRNFLVRASCRLRLEPGKEYLIMGLDGA

TYDLEGHPQYLLDSNSWIEEMPSERLCRSTRQRAA CAQLNDFLQEYGTQGCAV (SEQ ID NO: 76)

[0028] Em uma modalidade de cada um e qualquer aspecto da presente invenção, o peptídeo de fragmento derivado de C4 é aquele selecionado da seguinte tabela.

C4Alpha [1009-

LQETSNWLLSQQQADGSFQDLSPVIHR (SEQ ID NO: GVAHNNLMAMAQETGDNLYWGSVTGSQSNA- NPSDPMPQAPALWIETTAYALLHLLLHEGK (SEQ ID [SABRE RR C4Alpha [1391- C4Alpha [702-709] Cys CAM: C4Alpha [715- C4Alpha [723-

C4Alpha [730- C4Alpha [818- NLTVSVHVSPVEGLCLAGGGGLAQQVLV- C4Alpha [862- NLTVSVHVSPVEGLCLAGGGGLAQQVLV- VTASDPLDTLGSEGALSPGGVASLLR (SEQ ID NO: LLLFSPSVVHLGVPLSVGVQLQDVPR (SEQ ID NO:

LYVAAAIIESPGGEMEEAELTSWYFVSSPFSLDLSK VSATVSSPGSVPEVQDIQQNTDGSGQVSIPINIPQTI-

TLTSVSVFVDHHLAPSFYFVAFYYHGDHPVANSLR C4Beta [560- LHLETDSLALVALGALDTALYAAGSK (SEQ |D NO: VFEAMNSYDLGCGPGGGDSALQVFQAAGLAFSD- C4Beta [624- VFEAMNSYDLGCGPGGGDSALQVFQAAGLAFSD- C4Beta [667-

C4Gamma [1466-

ECVGFEAVQEVPVGLVQPASATLYDYYNPER (SEQ ID C4Gamma [1534- ECVGFEAVQEVPVGLVQPASATLYDYYNPER (SEQ ID C4Gamma [1566- C4Gamma [1578- 1594] Cys CAM: 1583, 1588, 1 590 LLATLCSAEVCQCAEGK (SEQ ID NO: 186) C4Gamma [1595- C4Gamma [1616-

C4Gamma [1682-1716] (SEQ ID NO: 196) C4Gamma [1725-

[0029] Os peptídeos de fragmentos particularmente preferidos de- rivados de C4 são C4Beta[571-579], C4Alpha[680-685], C4Alpha[786- 791], C4Beta[294-297], em que C4Beta[571-579] com transição MRM 466,26 — 243,13 é particularmente preferido.

[0030] Em conexão com cada um e qualquer aspecto da presente invenção, a proteína C3 e/ou um peptídeo derivado da proteína C3 pode ser utilizada, de preferência como controle interno para o funcio- namento apropriado do sistema de detecção, de preferência da técnica de análise usada para a determinação do nível do biomarcador.

[0031] Um peptídeo derivado de C3 é um peptídeo obtido ou obte- nível da digestão enzimática da proteína C3, de preferência a digestão da proteína C3 através da digestão tríptica da proteína C3.

[0032] O componente C3 do sistema complemento desempenha vários papéis biológicos importantes nas vias de ativação clássica, al- ternativa e de lecitina, por exemplo, (1) formação de convertases C3 e C5, ambas essenciais para a ativação completa do sistema; (2) produ- ção de opsoninas que aumentam a fagocitose de microrganismos; (3) degranulação de mastócitos e basófilos medicados pelos fragmentos C3a e C5a; (4) solubilização e depuração de complexos imunes liga- dos a C3b; (5) função adjuvante dos fragmentos C3d e C3dg; e (6) de- puração de células apoptóticas. Pacientes com angioedema hereditá- rio normalmente possuem níveis normais de C3.

[0033] A sequência de aminoácido de C3 é como se segue:

MGPTSGPSLLLLLLTHLPLALGSPMYSIITPNILRLESEETMVLEAHDA QGDVPVTVTVHDFPGKKLVLSSEKTVLTPATNHMGNVTFTIPANREF KSEKGRNKFVTVQATFGTQVVEKVVLVSLOSGYLFIQTDKTIYTPGST VLYRIFTVNHKLLPVGRTVMVNIENPEGIPVKQDSLSSQNQLGVLPLS WDIPELVNMGQWKIRAYYENSPQQVFSTEFEVKEYVLPSFEVIVEPT EKFYYIYNEKGLEVTITARFLYGKKVEGTAFVIFGIQDGEQRISLPESLK RPIEDGSGEVVLSRKVLLDGVQNPRAEDLVGKSLYVSATVILHSGSD MVQAERSGIPIVTSPYQIHFTKTPKYFKPGMPFDLMVFVTNPDGSPAY RVPVAVOGEDTVOSLTAGDGVAKLSINTHPSQKPLSITVRTKKQELS EAEQATRTMQALPYSTVGNSNNYLHLSVLRTELRPGETLNVNFLLRM DRAHEAKIRYYTYLIMNKGRLLKAGRQVREPGQDLVVLPLSITTDFIPS FRLVAYYTLIGASGQREVVADSVWVDVKDSCVGSLVVKSGQSEDRQ PVPGQQMTLKIEGDHGARVVLVAVDKGVFVLNKKNKLTOSKIWDVVE KADIGCTPGSGKDYAGVFSDAGLTFTSSSGQQTAQRAELQCPQPAA RRRRSVOLTEKRMDKVGKYPKELRKCCEDGMRENPMRFSCOQRRTR FISLGEACKKVFLDCCNYITELRRQHARASHLGLARSNLDEDIIAEENI VSRSEFPESWLWNVEDLKEPPKNGISTKLMNIFLKDSITTWEILAVSM SDKKGICVADPFEVTVMQDFFIDLRLPYSVVRNEQVEIRAVLYNYRQN QELKVRVELLHNPAFCSLATTKRRHQQTVTIPPKSSLSVPYVIVPLKT GLQEVEVKAAVYHHFISDGVRKSLKVVPEGIRMNKTVAVRTLDPERL GREGVQKEDIPPADLSDQVPDTESETRILLAGTPVAQMTEDAVDAER LKHLIVTPSGCGEQNMIGMTPTVIAVHYLDETEQWEKFGLEKRQGAL ELIKKGYTQQLAFRQPSSAFAAFVKRAPSTWLTAYVVKVFSLAVNLIAI DSQVLCGAVKWLILEKQKPDGVFQEDAPVIHQEMIGGLRNNNEKDM

ALTAFVLISLOEAKDICEEQVNSLPGSITKAGDFLEANYMNLQRSYTV AIlAGYALAQMGRLKGPLLNKFLTTAKDKNRWEDPGKQLYNVEATSYA

LLALLAQLKDFDFVPPVWVRWLNEQRYYGGGYGSTQAATFMVFQALAQY QKDAPDHQELNLDVSLQLPSRSSKITHRIHWESASLLRSEETKENEG FTVTAEGKGQGTLSVVTMYHAKAKDQLTCNKFDLKVTIKPAPETEKR PQDAKNTMILEICTRYRGDQDATMSILDISMMTGFAPDTDDLKQLAN GVDRYISKYELDKAFSDRNTLIIYLDKVSHSEDDCLAFKVHQYFNVEL] QPGAVKVYAYYNLEESCTRFYHPEKEDGKLNKLCRDELCRCAEENC FIOKSDDKVTLEERLDKACEPGVDYVYKTRLVKVOQLSNDFDEYIMAIE QTIKSGSDEVAQVGQARTFISPIKCREALKLEEKKHYLMWGLSSDFWG

EKPNLSYIIGKDTWVEHWPEEDECQDEENQKQCQDLGAFTESMVVF GCPN (SEQ ID NO: 199)

[0034] Em uma modalidade de cada um e qualquer aspecto da presente invenção, o peptídeo de fragmento derivado de C3 é aquele selecionado da seguinte tabela. QDSLSSQNQLGVLPLSWDIPELVNMGOWK (SEQ ID C3Beta [177-205] meme Jara CSS SO LESEETMVLEAHDAQGDVPVTVTVHDFPGK (SEQ ID C3Beta [36-65] eee fugas SSOOOS SS

[SER RR C3Beta [557- DSCVGSLVVK (SEQ ID NO: 232) Lcancmeç — fosmrementent ta C3Beta [658- 7 AELQCPQPAA (SEQ ID NO: 239) [mon eme fomeeameenate sa mos emes — [onvememmenTa na A GICVADPFEVTVMODFFIDLR (SEQ ID NO: 248) 834] Cys CAM: 816

C3cAlpha1 [905-913] TGLQEVEVK (SEQ ID NO: 255) C3cAlpha1 [914-926] AAVYHHFISDGVR (SEQ ID NO: 256) C3cAlpha1 [941-945] TVAVR (SEQ ID NO: 257) C3cAlpha1 [946-951] TLDPER (SEQ ID NO: 258) C3cAlpha2 [1321-1325] SEETK (SEQ ID NO: 259) C3cAlpha2 [1326-1337] ENEGFTVTAEGK (SEQ |D NO: 260) C3cAlpha2 [1338-1351] GQGTLSVVTMYHAK (SEQ ID NO: 261) C3cAlpha2 [1354-1360] DQLTCNK (SEQ ID NO: 262) C3cAlpha2 [1354- DQLTCNK (SEQ ID NO: 263) 1360] Cys CAM: 1358 C3cAlpha2 [1361-1364] FDLK (SEQ ID NO: 264) C3cAlpha2 [1365-1375] VTIKPAPETEK (SEQ ID NO: 265) C3cAlpha2 [1376-1381] RPQDAK (SEQ ID NO: 266) C3cAlpha2 [1382-1391] NTMILEICTR (SEQ ID NO: 267) C3cAlpha2 [1382- NTMILEICTR (SEQ ID NO: 268) 1391] Cys CAM: 1389 GDQDATMSILDISMMTGFAPDTDDLK (SEQ ID NO: C3cAlpha2 [1394-1419] 269) C3cAlpha2 [1420-1427] QLANGVDR (SEQ ID NO: 270) C3cAlpha2 [1428-1431] YISK (SEQ ID NO: 271) C3cAlpha2 [1432-1436] YELDK (SEQ |D NO: 272) C3cAlpha2 [1437-1441] AFSDR (SEQ ID NO: 273) C3cAlpha2 [1442-1450] NTLIIYLDK (SEQ ID NO: 274) C3cAlpha2 [1451-1462] VSHSEDDCLAFK (SEQ ID NO: 275) C3cAlpha2 [1451- VSHSEDDCLAFK (SEQ ID NO: 276) 1462] Cys CAM: 1458 C3cAlpha2 [1463-1478] VHQOYFNVELIQPGAVK (SEQ ID NO: 277) C3cAlpha2 [1479-1491] VYAYYNLEESCTR (SEQ |D NO: 278) C3cAlpha2 [1479- VYAYYNLEESCTR (SEQ |D NO: 279) 1491] Cys CAM: 1489 C3cAlpha2 [1492-1497] FYHPEK (SEQ ID NO: 280) C3cAlpha2 [1505-

LCR 1507] Cys CAM: 1506 sore msm ACEPGVDYVYK (SEQ ID NO: 291) 1546] Cys CAM: 1537 |MSsca ameno | oTmeerDA cana c (ssa in A a) DTWVEHWPEEDECQDEENQK (SEQ ID NO: 290) 1644] Cys CAM: 1637

[0035] Um peptídeo particularmente preferido derivado de C3 é C3Beta [489-497], que é um composto tendo uma massa molecular m/z de 604,81, conforme medido com um espectrômetro de massa de mobilidade iônica de alta resolução, transição MRM 604,8 — 327,22 e que pode ser medido com MRM -MS, e cuja sequência de aminoácido é como se segue: YYTYLIMNK. Outro peptídeo de fragmento preferido de C3 é C3cAlpha1[814-834] Cys CAM: 816 com transição MRM 824,74 — 798,44.

[0036] Outro peptídeo particularmente preferido derivado de C3 é C3cAlpha [814-834]Cys CAM816, que é um composto tendo uma massa molecular m/z de 495,25, conforme medido com um espectrô- metro de massa de mobilidade iônica de alta resolução e pode ser medido com MRM-MS, e cuja sequência de aminoácido é como se se- gue: GICVADPFEVTVMOQDFFIDLR. "CAM" refere-se à carbamidometi- la e é o resultado da alquilação dos grupos SH livres após a clivagem de C3 em peptídeos.

[0037] Como preferivelmente utilizado nessa invenção, um peptí- deo de fragmento é um peptídeo de uma proteína gerada através da digestão, de preferência digestão completa da proteína através de uma enzima proteolítica.

[0038] Deve-se reconhecer que em vez de utilizar tripsina para a geração de um peptídeo a partir das proteínas C1q, C1-INH, C4 e C3, respectivamente, outra enzima proteolítica pode ser utilizada, de prefe- rência a enzima proteolítica é uma protease ou peptidase que, após digestão completa da proteína, fornece uma mistura de peptídeos, em que cada espécie do peptídeo está presente apenas uma vez. Isto ga- rante que exista uma estequiometria 1:1 entre a proteína e cada um e qualquer peptídeo obtido por tal digestão completa da proteína utili- zando a protease. Em outra modalidade, a reação de digestão ou pro- tease é selecionada do grupo que compreende Arg-C, Asp-N, Asp-N (Glu N-terminal), BNPS ou NCS/ureia, Caspase-1, Caspase-10, Cas- pase-2, Caspase-3, Caspase-4, Caspase-5, Caspase-6, Caspase-7, Caspase-8, Caspase-9, Quimotripsina, Quimotripsina (baixa especifi- cidade), Clostripain, CNBr, CNBr (metil-Cys), CNBr (com ácidos), Ente- rocinase, Fator Xa, Ácido fórmico, Glu-C (tampão AmAc, Glu-C (tam- pão Phos), Granzima B, HRV3C protease, Hidroxilamin, Ácido iodoso- benzoico, Lys-C, Lys-N, Lys-N (Cys modificada), Hidrólise ácida sua- ve, NBS (longa exposição), NBS (curta exposição), NTCB, Elastase pancreática, Pepsina A, Pepsina A (baixa especificidade), Prolil endo- peptidase, Proteinase K, TEV protease, Termolisina, Trombina.

[0039] Será ainda reconhecido por uma pessoa versada na técnica que, embora, em princípio, todos os peptídeos derivados de proteínas sejam adequados para uso em qualquer método de qualquer aspecto da presente invenção, o uso de diferentes peptídeos pode ser preferí- vel dependendo da técnica utilizada para a detecção do biomarcador. Consequentemente, em uma modalidade de cada um dos aspectos da invenção, o biomarcador é um peptídeo derivado de qualquer uma das proteínas C1g, C1-INH e C4 que é particularmente adequado para de- tecção por meio de espectrometria de massa, particularmente no caso de detecção por espectrometria de massa. Também conforme for, em uma modalidade de cada um dos aspectos da invenção, o biomarca- dor é um peptídeo derivado de qualquer uma das proteínas C1iq, C1- INH e C4 contra o qual um anticorpo ou um ácido nucleico funcional pode ser gerado com o anticorpo e o ácido nucleico funcional forne- cendo uma detecção e/ou quantificação altamente específica e/ou al- tamente seletiva da referida proteína, particularmente no caso da de- tecção ser feita por meio de ensaio utilizando tal anticorpo ou ácido nucleico funcional como um parceiro de interação de dito peptídeo.

[0040] O termo "angioedema hereditário" (HAE), ao qual também é referido nessa invenção como "a doença", é um distúrbio hereditário raro caracterizado por episódios recorrentes do acúmulo de fluidos fo- ra dos vasos sanguíneos, bloqueando o fluxo normal de sangue ou líquido linfático e provocando inchaço rápido dos tecidos nas mãos, pés, pálpebras, lábios, membros, face, trato intestinal, vias aéreas e genitais. Geralmente, esse inchaço não é acompanhado de coceira, como pode ocorrer com uma reação alérgica. O inchaço do trato gas- trointestinal leva a cólicas. O inchaço das vias aéreas pode levar à obstrução, uma complicação potencialmente muito grave. Esses sin- tomas se desenvolvem como o resultado da deficiência ou do funcio- namento inadequado de certas proteínas que ajudam a manter o fluxo normal de fluidos através de vasos sanguíneos muito pequenos (capi- lares).

[0041] Em alguns casos, o fluido pode se acumular em outros ór- gãos internos. A gravidade da doença varia muito entre os indivíduos afetados. O edema também pode ocorrer nas mucosas que revestem os tratos respiratórios e digestivos, o que é mais comum em pessoas com angioedema hereditário do que naquelas que possuem outras formas de angioedema (isto é, adquiridas ou traumáticas). As pessoas com esse distúrbio geralmente possuem áreas de inchaço difíceis e dolorosas, não vermelhas e com coceira (pruriginosas). Uma erupção cutânea (urticária) raramente está presente.

[0042] Os sintomas do angioedema hereditário podem se repetir e se tornar mais graves. Lesões, dores intensas, cirurgia, procedimentos dentários, doenças virais e/ou estresse podem desencadear ou piorar os sintomas recorrentes.

[0043] Os sintomas associados ao inchaço no sistema digestivo (trato gastrointestinal) incluem náusea, vômito, dor abdominal aguda e/ou outros sinais de obstrução. O edema da garganta (faringe) ou la- ringe pode resultar em dor, dificuldade em engolir (disfagia), dificulda- de em falar (disfonia), respiração ruidosa (estridor) e asfixia potencial- mente fatal.

[0044] Existem três formas de angioedema hereditário, a saber, angioedema hereditário tipo |, angioedema hereditário tipo Il e angioe- dema hereditário tipo Ill.

[0045] A forma mais comum do distúrbio é o angioedema hereditá- rio tipo |, que é o resultado de uma deficiência de uma proteína conhe- cida como inibidor da esterase do componente C1 do complemento. No angioedema hereditário tipo |, que representa 85% dos pacientes, os níveis séricos do inibidor da C1 esterase são inferiores a 35% do normal. No tipo Il, os níveis são normais ou elevados, mas a proteína não é funcional. Os dois tipos são clinicamente indistinguíveis. O angi- oedema hereditário tipo Ill é provocado pela mutação no gene que co- difica o fator XIl da coagulação (F12; 610619) no cromossomo 5q.

[0046] O angioedema hereditário é herdado como uma caracterís- tica autossômica dominante. O defeito genético subjacente ao angioe- dema hereditário é uma mutação heterozigótica no gene inibidor da C1 esterase (C1NH, SERPING1) no cromossomo 119. Os pacientes com angioedema hereditário do tipo | parecem ter uma supressão do gene inibidor da C1 esterase ou um transcrito truncado por causa de um có-

don de parada, enquanto que os pacientes com angioedema hereditá- rio do tipo |l possuem uma substituição de base única. As duas formas são clinicamente indistinguíveis. Mutações no gene inibidor de C1 es- terase associado ao angioedema hereditário e de mutações no gene inibidor de C1 esterase testadas no diagnóstico de angioedema here- ditário são conhecidas da pessoa versada na técnica e podem ser re- cuperadas de documentos científicos utilizando medidas de rotina. As mutações na proteína inibidora de C1 esterase associada ao angioe- dema hereditário e das mutações na proteína inibidora de C1 esterase testadas no diagnóstico de angioedema hereditário são conhecidas da pessoa versada na técnica e podem ser recuperadas de documentos científicos utilizando medidas de rotina. As alterações conhecidas do DNA no gene inibidor da C1 esterase são c.550G>A, c.671T>A, c.551 685del, c.-191 51del / del de éxon 1 e 2, c.1081C>T, c.106 107 del e c.1397G>A.

[0047] Em uma modalidade de cada um e qualquer aspecto da presente invenção, o angioedema hereditário é o angioedema heredi- tário do tipo |.

[0048] O termo "amostra", como aqui utilizado significa preferivel- mente uma quantidade limitada de material de um indivíduo, em que o material do dito indivíduo faz parte ou foi retirado de um indivíduo e/ou do corpo de um indivíduo. De preferência, o dito material é seleciona- do do grupo que compreende fluidos corporais tais como sangue, um produto sanguíneo, urina, saliva, fluido cefalorraquidiano e linfa, assim como fezes ou qualquer tipo de tecido e/ou material celular que faça parte de um indivíduo e/ou corpo de um indivíduo. Será reconhecido por uma pessoa versada na técnica que a presença e/ou um nível do biomarcador da invenção na referida amostra se destina a ser seme- lhante e representar a presença e/ou o nível do biomarcador em uma quantidade maior do material desse indivíduo. Mais precisamente e como um exemplo ilustrativo e não limitativo, um nível do biomarcador da invenção determinado em uma amostra de, por exemplo, alguns ml de sangue de um indivíduo também representa um nível do referido biomarcador no sangue do corpo do indivíduo. Além disso, em uma modalidade dos métodos de cada um e qualquer aspecto da invenção, uma amostra do indivíduo compreende o material do referido indivíduo em uma forma, por exemplo, processada, fixa e/ou conservada, de tal modo que a referida amostra seja adequada para uso nos métodos de cada um e qualquer aspecto da invenção, pelo qual esse processa- mento, fixação e/ou conservação preferivelmente não gera o biomar- cador, pelo menos não involuntariamente, que não estava presente no sangue do paciente. O material do indivíduo na amostra pode assim ser diluído, por exemplo, com um solvente adequado para o método de cada um e qualquer aspecto da invenção, tal como metanol e/ou água, pode ser seco, por exemplo, em um cartão de filtro, pode ser separado depois de ter sido seco, por exemplo, com um solvente ade- quado para o método da invenção, tal como metanol e/ou água, ou uma substância pode ser adicionada, em que a referida substância impede a coagulação do sangue tal como, por exemplo, EDTA ou he- parina.

[0049] Uma amostra como preferivelmente utilizada em conexão com cada um e qualquer aspecto da presente invenção, uma amostra como utilizada em tais métodos, é preparada a partir de uma fonte primária tal como o sangue total. Outras amostras incluem, mas não são limitadas a estas, amostras de soro e amostras de plasma.

[0050] Em uma modalidade dos vários aspectos da invenção, a amostra primária é sangue total que é, em uma modalidade, proces- sado de tal modo que é coletado em um cartão de filtro de sangue se- co; de preferência, aproximadamente 3 ul de sangue total são coleta- dos numa mancha de dito cartão de filtro de sangue seco com um di-

âmetro de 3 mm. Uma pessoa versada na técnica reconhecerá que o volume exato assim coletado pode variar dependendo do hematócrito do paciente específico.

[0051] Em uma modalidade de cada um e qualquer aspecto da presente invenção em que a amostra é sangue ou manchas de sangue seco ou outros líquidos ou tecidos e em que o biomarcador é um pep- tídeo derivado da proteína C4, proteína C1q e/ou proteína C1-INH, a amostra pode ser processada como se segue: - extração de componentes sanguíneos; - submeter o extrato in situ a uma reação com agente redu- tor, de preferência ditiotreitol (DDT), para reduzir as pontes de dissulfe- to nas proteínas, e a um agente de alquilação, de preferência iodace- tamida (IAA), para alquilar os grupos de —SH livres; - digerir a mistura em peptídeos, de preferência através do uso de uma protease, mais preferivelmente através do uso da pro- tease tripsina; e - analisar a mistura contendo fragmentos peptídicos das proteínas por espectrometria de massa, de preferência análise por es- pectrometria de massa LC, e mais preferivelmente na presença de um padrão interno.

[0052] Em uma modalidade de cada um e qualquer aspecto do método da invenção, em que um padrão interno é adicionado na amostra, o padrão interno pode ser adicionado à amostra antes ou após a etapa de digestão de tripsina, isto é, o padrão interno pode ser adicionado na amostra imediatamente após a amostra ser retirada do indivíduo, ou pode ser adicionado ao sobrenadante que é submetido à HPLC, assim como entre esses momentos. Está dentro das habilida- des de uma pessoa da técnica determinar como e quando um padrão interno deve ser adicionado à amostra para alcançar uma detecção e determinação precisa de um nível do biomarcador, em que de acordo com a presente invenção, de preferência o padrão interno é adiciona- do a uma amostra que contém o biomarcador.

[0053] Será reconhecido por uma pessoa versada na técnica que através de referida adição de padrão interno, também aqui referido como |S, na amostra, isto é, reforço da amostra, a ser submetida a es- se método de acordo com a presente invenção, a concentração de IS na amostra é conhecida e, por exemplo, através da determinação da área sob o pico, ou seja, a área máxima, do padrão interno em, por exemplo, um cromatograma espectrométrico de HPLC-massa, a rela- ção entre uma área máxima e uma concentração de uma substância, por exemplo, de IS, e/ou do biomarcador da presente invenção, é es- tabelecida e, portanto, um meio fornecido para determinar o nível do biomarcador na amostra. Uma pessoa versada na técnica ainda reco- nhecerá que várias moléculas podem ser utilizadas como um IS. No entanto, um IS tendo uma estrutura química semelhante em compara- ção com a molécula tal como o biomarcador é preferível. Em uma mo- dalidade preferida, a molécula sendo o IS pode ser distinguida do bio- marcador da presente invenção. Este último aplica-se em particular às modalidades de cada um e qualquer aspecto da presente invenção em que o biomarcador é uma proteína C4 derivada de peptídeo, proteína C1-INH e/ou proteína C1q. Em uma outra modalidade preferida de ca- da um e qualquer aspecto da presente invenção, o IS é selecionado de tal modo que uma molécula que não esteja idealmente presente ou de natureza rara, está transportando isótopos pesados (tais como as ver- sões C13, N15 do biomarcador), compreendendo aminoácidos modifi- cados tais como D-aminoácidos ou + ou - aminoácidos, ou dextro pep- tídeos. Em uma modalidade preferida de cada um e qualquer aspecto da presente invenção, a leucina-encefalina é utilizada como um padrão interno que não está presente como tal na natureza.

[0054] Em uma modalidade dos vários aspectos da presente in-

venção em que o padrão interno é adicionado a uma amostra de um indivíduo, é preferível que o IS seja adicionado de tal modo que seja dissolvido em um solvente, por exemplo, antes da referida adição à amostra.

[0055] De acordo com a presente invenção, incluindo qualquer as- pecto e sua modalidade, um biomarcador é detectado.

[0056] Como de preferência aqui utilizado, o termo "detecção" sig- nifica métodos que incluem a detecção da presença ou ausência de uma substância em uma amostra e/ou qualificação do tipo da dita substância. Em uma modalidade, a substância é um biomarcador, um controle e/ou um padrão interno. A detecção pode ser executada por métodos conhecidos na técnica e aqueles aqui descritos mais adiante. Esses métodos incluem, sem limitação, análise espectrométrica de massa, conjunto de biochips, ácidos nucleicos funcionais e/ou imuno- ensaio. De preferência, o biomarcador é detectado e/ou quantificado por meio da análise espectrométrica de massa. Em uma modalidade mais preferida, a análise espectrométrica de massa é selecionada do grupo que compreende SELDI MS, MALDI MS, ES! MS, DESI MS e MS de mobilidade iônica. Em uma modalidade, a análise espectromé- trica de massa utiliza um analisador selecionado do grupo que com- preende ToF, QToF, armadilha de íons, Triple Quad, orbitrap, FT-ICR, mobilidade iônica e qualquer combinação dos mesmos. Em uma mo- dalidade da presente invenção, incluindo qualquer aspecto e sua mo- dalidade, o nível do biomarcador é determinado por meio de análise espectrométrica de massa após a separação por HPLC.

[0057] Em outra modalidade de cada um e qualquer aspecto da presente invenção, o biomarcador é detectado por meio de um parcei- ro de interação. Esse parceiro de interação é aquele selecionado do grupo que compreende um anticorpo, uma anticalina e um ácido nu- cleico funcional. Está dentro das habilidades de uma pessoa da técni-

ca gerar um anticorpo que se liga ao biomarcador. Os anticorpos po- dem ser gerados como conhecido pela pessoa versada na técnica e descrito, por exemplo, por Harlow, E., and Lane, D., "Antibodies: A La- boratory Manual," Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, (1988). Está dentro das habilidades de uma pessoa da técnica ge- rar uma ligação anticalina ao biomarcador. A geração de anticalinas é, por exemplo, descrita no pedido de patente alemã DE 197 42 706. Em uma modalidade, o ácido nucleico funcional é um aptâmero. Está den- tro das habilidades de uma pessoa da técnica gerar um aptâmero. Os aptâmeros são ácidos D-nucleicos que são de fita simples ou de fita dupla e que interagem especificamente com uma molécula alvo. A ge- ração de aptâmeros é, por exemplo, descrita na patente européia EP O 533 838. Em uma modalidade, o ácido nucleico funcional é um Spie- gelmer. Está dentro das habilidades de uma pessoa da técnica gerar um Spiegelmer. Spiegelmers são ácidos L-nucleicos que são de fita simples ou fita dupla e que interagem especificamente com uma molé- cula alvo. A geração de aptâmeros é, por exemplo, descrita no pedido de patente internacional WO 98/08856.

[0058] Será entendido por uma pessoa versada na especialidade que as técnicas e métodos acima indicados para detectar o biomarca- dor podem ser igualmente utilizados para quantificar o biomarcador.

[0059] Em uma modalidade da presente invenção, incluindo qual- quer aspecto e sua modalidade, o "nível" ou "nível de um biomarcador" como preferivelmente utilizado nessa invenção, significa a concentra- ção ou concentração de um biomarcador, de preferência em uma amostra de um indivíduo. O nível pode ser um nível absoluto, expres- so, por exemplo, em ng/ml (ng do composto e biomarcador, respecti- vamente, em ml de uma/da amostra). O nível pode ser um nível relati- vo. Esse nível relativo é, em uma modalidade, a relação de um/do bi- omarcador com um padrão interno. Em uma modalidade da presente invenção, incluindo qualquer aspecto e suas modalidades, é determi- nado como se segue, de preferência após a clivagem dos fragmentos de peptídeo de proteína C4, C1qg e/ou C1-INH, e mais preferivelmente após a alquilação dos grupos SH livres do peptídeo. Na configuração analítica, conforme descrito na parte do exemplo com maiores deta- lhes, um padrão interno é adicionado à amostra a ser analisada. No decurso dessa análise, é obtido um cromatograma indicando como picos individuais os vários compostos detectados na amostra. Os vá- rios compostos incluem, entre outros, um fragmento de proteína CA, proteína C1q e/ou C1-INH e o padrão interno. Para determinar de tal cromatograma e dos picos nele indicados, a concentração ou o nível de um/do peptídeo do fragmento, a área máxima do pico correspon- dente a um/ao fragmento de peptídeo e a área máxima do pico corres- pondente ao padrão interno são determinadas. Com base na área má- xima dos peptídeos do fragmento e na área máxima do padrão interno, a relação dos peptídeos do fragmento para o padrão interno pode ser determinada. A concentração de um/do peptídeo do fragmento é obti- da utilizando uma curva padrão de um/do peptídeo do fragmento em diferentes concentrações na presença do padrão interno em concen- trações conhecidas.

[0060] Na modalidade da presente invenção, incluindo qualquer aspecto e sua modalidade, o nível de um/do biomarcador é comparado com um nível do mesmo ou de outro biomarcador da presente inven- ção, determinado em outra amostra, por exemplo, do mesmo paciente, de outro paciente, de um controle e/ou dos mesmos ou diferentes momentos, e/ou um nível de controle e/ou um nível de um IS. Em co- nexão com isso "comparando" ou "comparado a" conforme aqui utili- zado, preferivelmente significa a comparação matemática dos dois ou mais valores dos níveis ou relações dos biomarcadores. Assim será imediatamente evidente que um dos referidos valores é maior, menor ou idêntico se pelo menos dois desses valores ou relações forem comparados entre si. Em uma modalidade, essa comparação pode ser realizada utilizando um/o nível absoluto. Em uma modalidade alternati- va, essa comparação pode ser realizada usando um/o nível relativo.

[0061] Em uma modalidade da presente invenção, incluindo qual- quer aspecto e suas modalidades, o nível do biomarcador também é determinado em um controle. Como aqui utilizado, um controle é de preferência uma amostra de um indivíduo, em que o status de angioe- dema hereditário do referido indivíduo é conhecido. Em uma modali- dade, um controle é uma amostra de um paciente saudável. Em uma modalidade adicional, uma quantidade do referido biomarcador é adi- cionada à dita amostra de um paciente saudável antes de determinar o nível do referido biomarcador na dita amostra de um paciente saudável que compreende o dito biomarcador adicionado, de preferência na prá- tica de um método da presente invenção. Em uma outra modalidade, o controle é uma amostra de pelo menos um indivíduo com um status de angioedema hereditário conhecido, por exemplo, um paciente de con- trole e em uma modalidade ainda mais preferida também compreende o status genético em relação às mutações do gene afetado na referida doença, compreendendo a proteína inibidora da C1 esterase, isto é, compreendendo o indivíduo tendo mutações homozigotas e/ou hetero- zigotas compostas, o indivíduo sendo portador de uma mutação. Em uma outra modalidade preferida, o controle é uma amostra de um indi- víduo que não está sendo tratado com relação à doença. Em uma mo- dalidade ainda mais preferida, o controle é uma amostra de um único indivíduo ou um conjunto de amostras de diferentes indivíduos e/ou amostras colhidas dos indivíduos em diferentes momentos.

[0062] Em uma modalidade da presente invenção, incluindo qual- quer aspecto e suas modalidades, um indivíduo é considerado ser saudável em relação à doença, se o indivíduo não sofre de sintomas associados a essa doença. Mais especificamente, e em uma modali- dade da presente invenção, incluindo qualquer aspecto e sua modali- dade, um indivíduo será considerado saudável em relação ao angioe- dema hereditário, se não houver mutação das partes funcionais do ge- ne inibidor da C1 esterase, resultando em uma redução ou deficiência da respectiva proteína ou da sua atividade, o que resulta em sintomas associados ao angioedema hereditário.

[0063] Em conexão com a presente invenção, incluindo qualquer aspecto e suas modalidades, um "paciente" é um indivíduo que mostra pelo menos um sintoma da doença. Mais preferivelmente, um paciente é um indivíduo que apresenta uma mutação homozigótica ou múltiplas mutações heterozigotas do gene inibidor da C1 esterase, resultando em redução ou deficiência da respectiva proteína e/ou atividade de proteína, resultando em sintomas associados ao angioedema hereditá- rio. Além disso, em conexão com isto, um "veículo" é um indivíduo que apresenta uma mutação heterozigótica do gene inibidor da C1 estera- se, resultando ou não na redução ou deficiência da respectiva proteína e/ou atividade de proteína, geralmente ou de preferência não resultan- do em sintomas associados ao angioedema hereditário.

[0064] Na modalidade da presente invenção, incluindo qualquer aspecto e sua modalidade, o nível de um/do biomarcador é comparado a um ponto de corte (cujo termo é utilizado como sinônimo para os termos valor de corte ou nível de corte). O termo "valor de corte" como de preferência aqui utilizado, é um nível (ou concentração) que pode ser um nível absoluto ou um nível relativo, que é indicativo de que uma pessoa está sofrendo de uma doença e/ou está em risco de sofrer de uma doença. Dependendo do biomarcador, um indivíduo é considera- do como sofrendo da doença ou estando em risco de sofrer da doença se o nível do biomarcador detectado e determinado, respectivamente, for menor do que o valor de corte, ou o nível do biomarcador detectado e determinado, respectivamente, é maior do que o valor de corte. Co- mo de preferência utilizado nessa invenção, o valor de corte é ajustado no valor médio de uma coorte de indivíduos saudáveis + 2x desvio pa- drão.

[0065] O valor de corte para alguns dos peptídeos de fragmento utilizados no método para diagnóstico diferencial de angioedema he- reditário é como se segue. SerpinG1 [242-249] C4Alpha [680-685] C4Alpha [786-791]

[0066] Será entendido por uma pessoa versada na técnica que, com base nos valores de corte acima, os valores de corte correspon- dentes podem ser calculados para qualquer um dos outros peptídeos de fragmento com base no peso molecular dos peptídeos de fragmen- to acima e ditos outros peptídeos de fragmento. O mesmo se aplica ao valor de corte de qualquer uma das proteínas C4, proteína C1-INH e proteína C1q e dos polipeptídeos individuais que formam as mesmas. Os valores de corte calculados dessa maneira também são aqui referi- dos como valores de corte correspondentes, em que, de preferência, é feita referência a um ou mais dos valores de corte acima para os pep- tídeos de fragmento indicados.

[0067] Um "limite de detecção" de uma substância tal como um biomarcador de controle, como preferivelmente aqui utilizado, é um nível da substância determinado por um método para determinar um nível da substância, em que um nível menor ou mais baixo que o refe- rido limite de detecção não pode ser determinado pelo dito método.

Desta maneira, fica imediatamente claro que um "valor de corte" e um "limite de detecção", como aqui utilizados, não são de preferência ne- cessariamente idênticos, embora ambos reflitam um certo nível de uma substância, por exemplo, de um biomarcador da presente inven- ção.

Além disso, ficará imediatamente entendido que um valor de corte será selecionado de preferência de tal modo que a seletividade e a sensibilidade do método sejam tão elevadas quanto possíveis.

Em contraste com isso, um limite de detecção representa um nível absolu- to do biomarcador da presente invenção que reflete o nível mínimo de biomarcador que pode ser detectado com um método para determinar o nível do referido biomarcador.

Assim, fica imediatamente claro que um limite de detecção depende do método para determinar um nível de uma substância e sobre a substância cujo nível deve ser determi- nado pelo método.

Uma pessoa versada entenderá imediatamente que um alto limite de detecção, por exemplo, maior que um valor de corte ideal, possivelmente resultaria em uma baixa sensibilidade do método, uma vez que a porcentagem de verdadeiros positivos previstos por um teste como positivos também depende se um nível do biomarcador possa ser determinado para os ditos verdadeiros positivos.

Em outras palavras, se o limite de detecção for maior do que um valor de corte ideal, os verdadeiros positivos com um nível de biomarcador ligeira- mente mais alto que o valor de corte não poderão ser distinguidos dos verdadeiros negativos tendo um nível de biomarcador menor do que o valor de corte, uma vez que nenhum nível do biomarcador pode ser determinado para ambos verdadeiros positivos tendo um nível do bio- marcador ligeiramente mais elevado do que o valor de corte e negati- vos tendo um nível do biomarcador mais baixo do que o valor de corte.

Dessa maneira fica imediatamente claro que um baixo limite de detec- ção é vantajoso. De preferência, um "valor de corte ideal", como aqui utilizado, é um valor de corte que possui a seletividade e a sensibilida- de mais elevadas.

[0068] Está dentro da presente invenção que o método para diag- nóstico da doença de um indivíduo para o primeiro aspecto da presen- te invenção, em uma modalidade, inclui que o indivíduo do qual a amostra foi retirada é um indivíduo de quem uma amostra foi submeti- da ao referido método anteriormente. Em uma modalidade preferida, a diferença de tempo entre ditas duas amostras é de 2 semanas, um mês, dois meses ou três meses; de preferência a diferença de tempo entre ditas duas amostras é de um mês. De acordo com isso, o méto- do do primeiro aspecto, incluindo qualquer modalidade do mesmo, compreende determinar o nível de um/do biomarcador em uma amos- tra do indivíduo, e uma outra etapa para determinar o nível de um/do biomarcador em uma segunda amostra do indivíduo, em que a segun- da amostra foi retirada do indivíduo após dita diferença de tempo.

[0069] Está dentro da presente invenção que o método para diag- nosticar a doença do indivíduo para o primeiro aspecto da presente invenção, em uma modalidade, utiliza uma amostra tirada de um indi- víduo ao qual uma terapia foi aplicada antes do momento quando a amostra foi coletada ou ao qual uma terapia foi aplicada no momento em que a amostra foi coletada.

[0070] Está dentro da presente invenção que o método para diag- nóstico da doença do indivíduo para o primeiro aspecto da presente invenção, em uma modalidade, utiliza uma amostra tirada de um indi- víduo ao qual nenhuma terapia foi aplicada antes do momento em que a amostra foi coletada ou a quem nenhuma terapia foi aplicada no momento em que a amostra foi coletada.

[0071] Em um segundo aspecto, a presente invenção está relacio-

nada a um kit, em que o kit compreende pelo menos um elemento se- lecionado do grupo que compreende um parceiro de interação de um ou do biomarcador, um ou o biomarcador, instruções de uso para o kit e uma ou mais recipientes. Em uma modalidade, o kit é para uso em um método de acordo com o primeiro aspecto da presente invenção. Em uma modalidade preferida, o kit compreende um parceiro de inte- ração de um ou do biomarcador, de preferência um parceiro de intera- ção para um peptídeo do fragmento de cada uma de C4, C1iq e C1- IHN ou uma parte de interação para cada uma de C4, C1q e C1-IHN, e instruções de uso e, opcionalmente, um ou mais recipientes. Em outra modalidade preferida, o kit compreende um ou o biomarcador, de pre- ferência um parceiro de interação para um peptídeo do fragmento de cada uma de C4, C1q e C1-IHN ou uma parte de interação para cada uma de C4, C1iq e C1-IHN e instruções de uso e, opcionalmente, um ou mais recipientes.

[0072] Em uma modalidade do segundo aspecto, o parceiro de interação é aquele selecionado do grupo que compreende um anticor- po, uma anticalina, um aptâmero e um spiegelmer, em que qualquer um do anticorpo, anticalina, aptâmero e spiegelmer é capaz de se ligar a um ou no biomarcador, preferivelmente a ligação é tal que um com- plexo é formado entre o biomarcador e o parceiro de interação que permite a detecção e, respectivamente, a quantificação do complexo ou do biomarcador, de preferência após a dissolução do complexo.

[0073] O termo "estar em risco de desenvolver uma doença" como aqui utilizado preferivelmente significa que é provável que um indiví- duo sofra da referida doença e/ou desenvolva a dita doença ou sinto- mas associados à dita doença, particularmente se nenhum tratamento for aplicado. Em conexão com isso, deve-se reconhecer que o angioe- dema hereditário é um distúrbio genético e, portanto, a ocorrência de parentes, particularmente os pais tendo dita doença ou tendo uma mu-

tação conhecida de ser a causa de dita doença, são indicativos para um indivíduo, por exemplo, o filho de dois pacientes com angioedema hereditário ou dois portadores de angioedema hereditário, corre o risco de desenvolver a referida doença. Além disso, será reconhecido que a progressão de uma doença está ligada à ocorrência de sintomas, as- sim como à gravidade dos referidos sintomas. Consequentemente, uma pessoa que não sofre de sintomas no momento, no entanto, pode estar em risco de desenvolver a doença, por exemplo, porque embora mutações genéticas de um gene conhecidas de provocar uma doença estejam presentes, nenhum sintoma ou sintoma grave ocorre. No en- tanto, ficará imediatamente entendido que os métodos e os biomarca- dores da presente invenção, particularmente se o nível de dito biomar- cador de acordo com a presente invenção for reduzido ou aumentado, dependendo do biomarcador, levam em conta o fato de que o diagnós- tico de que tal indivíduo está em risco de desenvolver a doença inde- pendente da presença ou ausência de sintomas. Consequentemente, os métodos de acordo com a presente invenção levam em conta a de- terminação se um indivíduo está em risco de sofrer da doença. Tam- bém está dentro da presente invenção que uma terapia é aplicada, mantida, reduzida, elevada ou não aplicada com base sobre se o sujei- to está em risco de sofrer da doença ou não.

[0074] O termo "qualificação do status de angioedema hereditário" em um indivíduo como aqui utilizado, de preferência significa uma classificação do perfil de biomarcador de um indivíduo selecionado do grupo que compreende identificar ou detectar a presença ou ausência de angioedema hereditário no indivíduo, prever o início ou o risco de desenvolvimento de angioedema hereditário no indivíduo, determinar o curso do angioedema hereditário em um indivíduo, determinar se um indivíduo sofre de um status inicial de angioedema hereditário ou de um status avançado ou progredido de angioedema hereditário ou de-

terminar se o nível de um biomarcador em um indivíduo mudou signifi- cativamente ao longo do tempo.

[0075] O termo "gerenciamento do tratamento do indivíduo" ou "gerenciamento do indivíduo", conforme aqui utilizado, refere-se de preferência ao comportamento do clínico ou médico subsequente à determinação do status de angioedema hereditário. Por exemplo, se o resultado dos métodos de acordo com a presente invenção for incon- clusivo ou houver razões de que a confirmação do status é necessária, o médico poderá solicitar novos testes, tais como testes da função das proteínas afetadas e/ou sequenciamento do gene inibidor da C1 este- rase. Como alternativa, se o status indicar que o tratamento para angi- oedema hereditário é apropriado, o médico pode agendar o indivíduo para o tratamento de angioedema hereditário. Da mesma forma, se o status for negativo ou se os resultados mostrarem que o tratamento foi bem-sucedido, nenhum gerenciamento adicional será necessário. No entanto, uma pessoa versada na técnica reconhecerá imediatamente que, além da terapia genética, qualquer terapia adequada e/ou eficaz pode ser aplicada, incluindo a terapia aqui divulgada. Além disso, é uma modalidade da presente invenção que gerenciar o tratamento do indivíduo compreende a titulação de uma dose de um fármaco aplica- do como um tratamento para angioedema hereditário, por exemplo, quantidade de um inibidor de C1 esterase, um inibidor de calicreína ou um antagonista de bradicinina, aplicado ou administrado a um paciente e/ou indivíduo. Em algumas modalidades dos métodos da presente invenção, em que um nível de um biomarcador presente em uma amostra de um indivíduo é determinado em vários momentos, ou é comparado a outros níveis do biomarcador, um valor de corte e/ou um nível de dito biomarcador em um controle e/ou outro valor de uma re- lação dos níveis de dois biomarcadores, uma pessoa versada aplicará ou não uma terapia, ou irá corrigir uma terapia já aplicada para tratar ou não tratar, ou para continuar o tratamento do angioedema hereditá- rio.

[0076] Em uma modalidade da presente invenção, os termos "es- tar em risco de desenvolver a doença" e "estar em risco de sofrer da doença" são utilizados de modo trocável nesta invenção, a não ser que indicado ao contrário.

[0077] A presente invenção é agora ainda ilustrada pelas seguin- tes figuras e exemplos, dos quais outras características, modalidades e vantagens podem ser obtidas.

[0078] Mais especificamente, as Figs. 1 a 9 são diagramas de cai- xa indicando níveis do peptídeo indicado; o eixo y demonstra os níveis logaritmizados do referido peptídeo indicado em ng/ml, conforme de- terminado a partir de uma mancha de sangue seco em um cartão de filtro como descrito na parte do Exemplo; o eixo x representa grupos de indivíduos que foram agrupados conforme descrito na parte de Exemplo. O diagrama de caixa representa os 25º e 75º percentis de cada grupo de indivíduos pela parte inferior e superior da caixa, res- pectivamente; a banda perto do meio da caixa representa o 50º per- centil (isto é, a mediana) de cada grupo; os filamentos representam um desvio padrão acima e abaixo da média dos dados; quaisquer dados não incluídos entre os filamentos são mostrados como um valor atípico com um pequeno círculo ou estrela. A linha horizontal representa o nível de corte expresso em ng/ml para o peptídeo indicado.

[0079] A Fig. 1 é um diagrama de caixa do fragmento peptídico C4Beta [571-579] da proteína C4 beta que ilustra um ponto de corte de 500 ng/ml. Esse ponto de corte permite distinguir entre controles saudáveis e pacientes que sofrem de HAE tipo 1 e HAE tipo 2.

[0080] A Fig. 2 é um diagrama de caixa do fragmento peptídico SerpinG1 [242-249] da proteína C1-INH que ilustra um ponto de corte de 835 ng/ml. Esse ponto de corte permite distinguir entre controles saudáveis e pacientes que sofrem de HAE tipo 1.

[0081] A Fig. 3 é um diagrama de caixa do fragmento peptídico C1q Beta [178-186] da proteína C1ig beta que ilustra um ponto de cor- te de 800 ng/ml. Este fragmento peptídico pode ser utilizado como um controle.

[0082] A Fig. 4 é um diagrama de caixa do fragmento peptídico C4Alpha [680-685] da proteína C4alpha que ilustra um ponto de corte de 260 ng/ml. Esse ponto de corte permite distinguir entre controles saudáveis e pacientes que sofrem de HAE tipo 1 ou HAE tipo 2.

[0083] A Fig. 5 é um diagrama de caixa do fragmento peptídico C4Alpha [786-791] da proteína C4alpha que ilustra um ponto de corte de 100 ng/ml. Esse ponto de corte permite distinguir entre controles saudáveis e pacientes que sofrem de HAE tipo 1 ou HAE tipo 2.

[0084] A Fig. 6 é um diagrama de caixa do fragmento peptídico C4Beta [294-297] da proteína C4beta que ilustra um ponto de corte de 201 ng/ml. Esse ponto de corte permite distinguir entre controles sau- dáveis e pacientes que sofrem de HAE tipo 1 ou HAE tipo 2.

[0085] A Fig. 7 é um diagrama de caixa do fragmento peptídico C4Gamma [1638-1641] da proteína C4gamma que ilustra um ponto de corte de 920 ng/ml. Esse ponto de corte permite distinguir entre controles saudáveis e pacientes que sofrem de HAE tipo 1 ou HAE tipo

2.

[0086] A Fig. 8 é um diagrama de caixa do fragmento peptídico SerpinG1 [391-400] da proteína C1-INH que ilustra um ponto de corte de 392 ng/ml. Esse ponto de corte permite distinguir entre controles saudáveis e pacientes com HAE tipo 1.

[0087] A Fig. 9 é um diagrama de caixa do fragmento peptídico C1q-Beta [63-77] da proteína C1iq beta que ilustra um ponto de corte de 1690 ng/ml. Este fragmento peptídico pode ser utilizado como con- trole.

Exemplos

[0088] Nos Exemplos descritos a seguir, uma mancha de sangue seco (abrev. DBS) em um cartão de filtro foi utilizada como amostra de um indivíduo. Exemplo 1: Método para diagnóstico de HAE com base na fragmenta- ção de C3, Cia, C4 e C1-INH em peptídeos e sua espectrometria de massa

[0089] Para quantificar o teor/níveis de C3, C1ig, C4 e C1-INH em extratos de sangue seco (DBS), foi utilizado um protocolo conforme descrito. Após a extração dos componentes sanguíneos, o extrato DBS foi submetido in situ à reação com ditiotreitol (DDT) para reduzir as pontes de dissulfeto nas proteínas e iodacetamida (IAA) para alqui- lar os grupos de —SH livres. A mistura de reação foi então digerida na sua totalidade com tripsina. A mistura tríptica contendo fragmentos peptídicos das proteínas a serem analisadas foi injetada na especitro- metria de massa de alta resolução LC/IM. Para todas as proteínas, os peptídeos sem modificações pós-transacionais podem ser identifica- dos na matriz sanguínea (ver a Tabela 1 — “peptídeos C3, C1iq, C4 e C1-INH identificados na mistura tríptica obtida após a digestão tríptica total do extrato DBS, peptídeos selecionados com adutos +H”). Para todos os peptídeos os espectros de fragmentação foram obtidos e, com base no padrão de fragmentação experimental, transições a se- rem utilizadas na espectrometria de massa para monitoramento de múltiplas reações.

[0090] Os peptídeos trípticos podem ser medidos a seguir por LC/MRM-MS. Abaixo estão os exemplos de peptídeos trípticos de C3, C1qg, C4 e C1-INH detectados e quantificados utilizando LC/MRM-MS.

Equipamento

[0091] Para detectar os peptídeos trípticos das proteínas a serem quantificadas em uma amostra biológica de um doador, o seguinte equipamento foi utilizado: Furador de DBS 1296-071 Delfia Perkin Elmer single and multichannel | Eppendorf Misturador de Vórtice Mixer UZUSIO VTX-300L | LMS co. LTD Processador Ultrassônico SW12H Sonoswiss UPLC Acuity iclass Waters Reagentes

[0092] Para a detecção dos peptídeos das proteínas a serem quantificadas em uma amostra de um indivíduo, os seguintes reagen- tes foram utilizados. Na medida em que os valores dependem da tem- peratura (por exemplo, o valor do pH), esses valores foram determina- dos em uma temperatura de 25 ºC. Nome Tromecedor [Press — | Acetonitrila, livre de água (max. 0,003% Hf O) VWR Grau HiPerSolv CHROMANORMO UPLC/UHPLC Placas de filtro de 96 cavidades AcroPrep'Y" Ad- vance 96 para filtração aquosa, 350 ul, 1,0 um | PALL de fibra de vidro Bicarbonato de amônio ACROS lodoacetamida, IAA Sigma Aldrich

Miscomiatte oo wells, PP, F-GREINER (100 Jog q [Frasco sateseartómE — sase | Hidrato de sal de sódio do ácido taurocólico Tripsina 20 pg/frasco TM é - osca vw Pr Sano deste puto meme | Verex'" Insert, imm Dia., 175uUL, Transparente 51, Fundo Cônico, w/ mola inferior |Phenomenx | Verex'"" Vial, g8âmMm Tampa de Rosca, 2mL, |Pnenomenes || Transparente 33, w/ Adesivo Water HiPerSolv& CHROMANORMO [Pontas de pipeta sas | Preparação da Solução Mãe de Padrão Interno

[0093] A solução mãe de padrão interno (IS 1) foi utilizada como padrão interno e foi preparada através da dissolução de 3 mg de leuci- na-encefalina (como fornecido por Waters, UK) em água até uma con- centração de 400 ug/ml. Armazenamento de Amostras e Soluções

[0094] As amostras de controle e as amostras de estudo (manchas de sangue seco) foram armazenadas na RT. As soluções de trabalho de Padrão Interno foram armazenadas na temperatura ambiente até o uso. Preparação de Amostras para Análise

[0095] 1 punção O de 3,2 mm foi cortada do cartão de filtro com manchas de sangue seco e submetida ao seguinte protocolo: Em primeiro lugar, para extração 100 ul de NHHCO;3 1 M foram adicionados às punções, pelo que o material foi submetido a vi- bração ultrassônica durante 10 min. a 60 ºC, incubado durante 30 min em um agitador (em 700 rpm) a 37 ºC.

Em segundo lugar, à solução 125 ul de DTT 1 M foram adi-

cionados e a mistura de reação foi incubada durante 3 h a 37 ºC em um agitador (700 rpm).

Em terceiro lugar, 375 ul de IAA 1 M foram adicionados e a solução foi incubada durante 1,5 hora em um agitador (700 rpm) no escuro.

Em quarto lugar, 10 ul de tripsina 0,5 ug/ul foram adiciona- dos e a solução foi incubada durante 3 a 16 horas em um agitador (700 rpm) no escuro.

[0096] A solução assim obtida contendo uma digestão do extrato sanguíneo foi transferida para uma placa de filtro de PTFE (politetra- fluoretileno) (AcroprepTM, Pall, Germany) e depois para uma placa de 96 cavidades através da centrifugação em 3,500 rpm. Posteriormente, 100 ul de padrão interno com uma concentração conhecida de 20 a 400 ng/ml foram adicionados.

Métodos

[0097] Uma pessoa versada na técnica reconhecerá que os méto- dos para detectar os peptídeos de fragmento das proteínas a serem analisadas em uma amostra de um indivíduo utilizando análise espec- trométrica de massa também podem empregar outros peptídeos trípti- cos, transições específicas e fragmentos específicos que levam em conta a detecção e/ou quantificação específica de fragmentos peptídi- cos relevantes para HAE e suas isoformas em dita amostra de um in- divíduo.

[0098] As análises de LC/IM-QToF-MS dos fragmentos peptídicos das proteínas a serem analisadas de extratos DBS foram executadas utilizando uma Waters Acquity iclass UPLC (Waters, UK) acoplada ao espectrômetro de massa Vion (Waters, UK) como se segue.

1. A operação cromatográfica foi executada em uma coluna Kinetex EVO C18 (Phenomenex, Germany). 10 ul do extrato foram in- jetados na coluna e os compostos do extrato foram eluídos utilizando um gradiente linear de 0% A (ácido fórmico 50 mM em água) a 100% B (ácido fórmico 50 mM em acetonitrila:metanol vol. 1:1)

2. O padrão interno foi injetado continuamente em uma concentração de 200 ng/ml em água e o sinal foi utilizado para norma- lizar o sinal de amostra em todo o lote.

[0099] As análises IM-QToF MS foram executadas no modo iônico positivo, utilizando os seguintes parâmetros: - Modo analisador: sensibilidade - Modo MS: MSE de alta definição - Tensão capilar: 1,2 kV - Temperatura da fonte: 150 ºC - Temperatura de dessolvatação: 600 ºC - gás de dessolvatação; 1000 L/h - gag em forma de cone: 50 L/h - Baixa energia de colisão: 6 eV - Reforço de energia de alta colisão: 20-40 eV - Massa de varredura: 50-1000 m/z - Tempo de varredura: 0,5s

[00100] As análises LC/MRM-MS dos fragmentos peptídicos das proteínas a serem analisadas para os extratos DBS foram executadas utilizando uma Waters Acquity iclass UPLC (Waters, UK) acoplada a um espectrômetro de massa TQ-S micro (Waters, UK).

[00101] Para os exemplos, os seguintes parâmetros foram utiliza- dos na quantificação dos fragmentos de peptídeo:

1. A operação cromatográfica foi executada em uma coluna Kinetex EVO C18 (Phenomenex, Germany). O extrato de 10 ul foi inje- tado na coluna e os compostos foram eluídos utilizando um gradiente linear de 0% A (ácido fórmico 50 MM em água) a 100% B (ácido fórmi- co 50 mM em acetonitrila:metano! vol. 1:1).

2. Para o padrão interno, a transição MRM 556,24 —

119,97 foi monitorada. Para cada peptídeo, a transição específica foi utilizada como mostrada no Exemplo 2.

[00102] As análises MRM-MS foram executadas no modo iônico positivo utilizando os seguintes parâmetros: - Tensão capilar: 1,2 kV - Tensão do cone: 20 V - Temperatura da fonte: 150 ºC - Temperatura de dessolvatação: 600 ºC - Gás de dessolvatação: 1000 L/h - gag em forma de cone: 50 L/h - Energia de colisão: 20 V - Entrada de células de colisão: 30 eV - Saída de células de colisão: 30 eV. Exemplo 2: Quantificação de fragmentos peptídicos das proteínas C1q, C4, C1-INH e C3 em manchas de sangue seco de doadores sau- dáveis

[00103] Utilizando os métodos delineados no Exemplo 1, os diferen- tes fragmentos peptídicos das proteínas C1q, C4, C1-INH e C3 foram quantificados utilizando DBS de um total de 270 indivíduos saudáveis.

[00104] Parao Complemento C1q, os seguintes peptídeos trípticos podem ser quantificados, em que os números entre parênteses repre- sentam a posição do primeiro aminoácido e do último aminoácido do peptídeo na sequência de aminoácido de C1iq (com as sequências sendo indicadas com o N-terminal estando no lado esquerdo e o C- terminal estando no lado direito). Esses peptídeos são mostrados na Tabela 1. Tabela 1:

FLLFPD

Sequência (N-terminal -> C-terminal) C1g-C [29-47] NTGCYGIPGMPGLPGAPGK C1qg-C [29-47] Cys CAM: 32 NTGCYGIPGMPGLPGAPGK C1q-C [48-57] DGYDGLPGPK C1q-C [58-69] GEPGIPAIPGIR C1qg-C [76-86] GEPGLPGHPGK C1g-C [87-113] NGPMGPPGMPGVPGPMGIPGEPGEEGR

[00105] Todos os peptídeos trípticos do Complemento C1q podem ser utilizados para diferenciar entre indivíduos saudáveis e pacientes com angioedema hereditário. Dois dos referidos peptídeos, a saber C1g9-B [178-186] com transição MRM 510,26 — 254,58 e C1g-B [63- 77] com transição MRM 495,25 — 774,5 foram utilizados como exem- plos representativos (ver Exemplo 3).

[00106] Parao complemento C3, os seguintes peptídeos trípticos podem ser quantificados, em que os números entre parênteses repre- sentam a posição do primeiro aminoácido e do último aminoácido do peptídeo na sequência de aminoácido de C3 (com as sequências sen- do indicadas com o N-terminal estando no lado esquerdo e o C- terminal estando no lado direito). Esses peptídeos são mostrados na Tabela 2. Tabela 2 Peptídeo Sequência (N-terminal -> C-terminal) C3Beta [105-119] FVTVOATFGTQVVEK C3Beta [120136] VVLVSLOSGYLFIOTDK C3Beta [137-148] TIYTPGSTVLYR C3Beta [149-155] IFTVNHK C3Beta [156-161] LLPVGR C3Beta [162-176] TVMVNIENPEGIPVK C3Beta [177-205] QDSLSSQNQLGVLPLSWDIPELVNMGAWK C3Beta [208-225] AYYENSPQQVFSTEFEVK C3Beta [226-241] EYVLPSFEVIVEPTEK C3Beta [23-35] SPMYSIITPNILR C3Beta [242-249] FYYIYNEK C3Beta [250-258] GLEVTITAR

SB go

C3cAlpha2 [1479-1491] VYAYYNLEESCTR C3cAlpha2 [1479-1491] Cys CAM: 1489 | VYAYYNLEESCTR C3cAlpha2 [1492-1497] FYHPEK C3cAlpha2 [1527-1532] VTLEER C3cAlpha2 [1536-1546] ACEPGVDYVYK C3cAlpha2 [1536-1546] Cys CAM: 1537 | ACEPGVDYVYK C3cAlpha2 [1552-1570] VOLSNDFDEYIMAIEQTIK C3cAlpha2 [1571-1582] SGSDEVOVGAAR C3cAlpha2 [1583-1589] TFISPIK C3cAlpha2 [1592-1595] EALK C3cAlpha2 [1596-1599] LEEK C3cAlpha2 [1601-1624] HYLMWGLSSDFWGEKPNLSYIIGK C3cAlpha2 [1625-1644] DTWVEHWPEEDECQDEENQK C3cAlpha2 [1625-1644] Cys CAM: 1637 | DTWVEHWPEEDECQDEENQOK

[00107] Todos os peptídeos trípticos do Complemento C3 podem ser utilizados no ensaio. Dois dos referidos peptídeos, a saber C3Be- ta [489-497] com transição MRM 604,8 — 327,22 e C3cAlpha1 [814- 834] Cys CAM: 816 com transição MRM 824,74 — 798,44 foram utili- zados como exemplos ilustrativos (ver o Exemplo 3).

[00108] Parao complemento C4, os seguintes peptídeos trípticos podem ser quantificados, em que os números entre parênteses repre- sentam a posição do primeiro aminoácido e do último aminoácido do peptídeo na sequência de aminoácido de C4 (com as sequências sen- do indicadas com o N-terminal estando no lado esquerdo e o C- terminal estando no lado direito). Tais peptídeos são mostrados na Tabela 3.

Tabela 3: C4Alpha [1009- GVAHNNLMAMAQETGDNLYWGSVTGSQSNA- C4Alpha [1391-1404] Cys CAM:

C4Alpha [702-709] Cys CAM: 702,

C4Alpha [730- NLTVSVHVSPVEGLCLAGGGGLAQQVLV- NLTVSVHVSPVEGLCLAGGGGLAQQVLV-

LYVAAAIIESPGGEMEEAELTSWYFVSSPFS- VSATVSSPGSVPEVQDIQANTDGSGQVS]|- TLTSVSVFVDHHLAPS- VFEAMNSYDLGCGPGGGDSALQVFQAAGLA- VFEAMNSYDLGCGPGGGDSALQVFQAAGLA-

C4Gamma [1466- C4Gamma [1534- C4Gamma [1566- C4Gamma [1578- C4Gamma [1595- C4Gamma [1616-

EYLIMGLDGATYDLEGHPQYLLDSNSWIE- C4Gamma [1682-1716] EMPSER C4Gamma [1725- 1744] Cys CAM: 1727, 1742 AACAQLNDFLQEYGTQAGCQV

[00109] Todos os peptídeos trípticos do Complemento C4 podem ser utilizados para diferenciar entre indivíduos saudáveis e pacientes com angioedema hereditário. Com relação aos peptídeos, a saber C4Alpha [680-685] com transição MRM 375,2 — 536,28, C4Alpha [786-791] com transição MRM 359,69 — 490,26, C4Beta [294-297] com transição MRM 285,66 — 322,19, C4Beta [571-579 ] com transi- ção MRM 466,26 — 243,13 e C4 gamma [1638-1641] com transição MRM 232,64 — 322,19], foram utilizados como exemplos representati- vos (ver o Exemplo 3).

[00110] Parao complemento C1-INH (também referido como Ser- pinG1), os seguintes peptídeos trípticos podem ser quantificados, em que os números entre parênteses representam a posição do primeiro aminoácido e do último aminoácido do peptídeo na sequência de ami- noácido de C1- INH (com as sequências sendo indicadas com o N- terminal estando no lado esquerdo e o C-terminal estando no lado di- reito). Tais peptídeos são mostrados na Tabela 4. Tabela 4:

SerpinG1 [344-364] VGQLALSHNLSLVILVPQNLK LEFFDFSYDLNLCGLTEDPDLOQVSAMQHQTVLE- SerpinG1 [416-466] LTETGVEAAAASAISVAR

[00111] Todos os peptídeos trípticos C1-INH do complemento po- dem ser utilizados para diferenciar indivíduos saudáveis e pacientes com angioedema hereditário. Dois peptídeos, a saber SerpinG1 [242- 249] com transição MRM 455,74 — 696,33 e SerpinG1 [391-400] com transição MRM 593,35 — 455,79], foram utilizados como exemplo re- presentativo (ver o Exemplo 3). Exemplo 3: Quantificação de fragmentos peptídicos trípticos das prote- ínas C3, C1q, C4 e C1-INH no extrato DBS de indivíduos saudáveis e pacientes com angioedema hereditário com variantes patogênicas co- nhecidas no gene Serping1. Pacientes com HAE

[00112] Todos os pacientes com doença hereditária de angioedema tipo 1/2 ou dos quais foi fortemente assumido que estavam sofrendo de doença hereditária de angioedema tipo 1/2 enviados aos centros participantes foram incluídos no estudo. As mutações de SerpinG1 fo- ram confirmadas em todos os pacientes levados em consideração nesse estudo, utilizando técnicas como sequenciamento de próxima geração, sequenciamento de Sanger e/ou amplificação da sonda de- pendente de ligação multifacetada. Proteína C4

[00113] Utilizando os métodos delineados no Exemplo 1, o teor de fragmentos de peptídeo C4Alpha [680-685], C4Alpha [786-791], C4Beta [294-297], C4Beta [571-579] e C4 gamma [1638-1641] de proteína O C4 foi quantificado em DBS de um total de 270 indivíduos saudáveis. Da mesma forma, o teor de fragmentos de peptídeo C4Alpha [680-685], C4Alpha [786-791], C4Beta [294-297], C4Beta [571-579] e C4 gamma [1638-1641] da proteína C4 foi quantificado em DBS de um total de 135 pacientes com angioedema hereditário geneticamente diagnosticado antes disto.

[00114] Para este ensaio, peptídeos sintéticos puros foram obtidos e utilizados para obter uma curva padrão utilizada para quantificar os peptídeos originários das amostras de sangue. A linearidade da curva padrão é refletida nos valores de R? na seguinte Tabela 5.

+ E E gs S O or E x o | 8 SS = SEEN o Ss qe = TIS SeiaNçg| gs E E REISISTFS TF o o E EBSBERBR 86 8 3 8 lo oo o o|[3 E õ ge o - =8 < o o lo 8 2 O? E E | 8 2 " - à e 5 2 o SS ol« = 8 o” Fr Emis | 2 É o = os Oo O jo = PE EEE) 83 - es No Na 2 3 o & RES ENNIZ ES 8 & | 8 E Se 28 2 T SS BBsE SS | é SS e Elo Sd wu 2 lg Je Ss SE BEN = 8 4 RR e E SSBRRIZS8 < E SS 8 ds o NS o = PE o ço? S o oo Co o 2 7? o, = = VP = E E Ss o £ 78 ss a o <2 8 o Ss + o ZE + 14 121,2 1/0 OE E o qa m SAIR FC 5 Je 8 IS 8 Ss eo O | lo E é PP 2 Ss = os 3 E a 8 3 & > Ê CE s E n o o =o z o BIS BIS SIT Te . $ lg € = $g LS o 9 jo Ff = o x OE o . & |SINN PT | GTS 5 = ES Pv o Ca S o O ZTE o o x DES e 2 s o = EB & E $ E é es e | x |X SS ER E Es s 3 ES ke 828 E E8 o 3 EEE E e FT PG 2 Ss | d || 2 > E | e O E % E 28 2 S&S SS8 no N gs E 28 = Z/E ZÉ o = = N o W Beerz er os ç & o Mm IE | E o 2 BISTINI8/ o e Ss Cc = gg EE O g É E E [2 E & e m SS ço 8 " Ss) E gleleEvEl LS a Sl g 3 gISS|8 sOçcsmu|) E 8) e le SS o ig 2 |” SS Ss Za & S/s j|elg EB OT 28 5 2 q 8 | & jo jo 19 |O 2a or Pg

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Proteína C1-INH

[00116] Utilizando os métodos delineados no Exemplo 1, o teor dos fragmentos de peptídeo SerpinG1 [242-249] e SerpinG1 [391-400] da proteína C1-INH foi quantificado em DBS de um total de 270 indiví- duos saudáveis. Da mesma forma, o teor dos fragmentos de peptídeo SerpinG [242-249] e SerpinG1 [391400] da proteína C1-INH foi quantificado em DBS de um total de 135 pacientes com angioedema hereditário geneticamente diagnosticado antes disto.

[00117] Para este ensaio, peptídeos sintéticos puros foram obtidos e utilizados para obter uma curva padrão utilizada para quantificar os peptídeos originários de amostras de sangue. A linearidade da curva padrão é refletida nos valores de R? na seguinte Tabela 7.

E 8 o 3 so S = NS E Es lB8 > E Ss o E EB5/XS ê = oO || [PE] Pr AT o o |— O o & o 9 E uu N x 18 8 3 82 8 So < nó à E = é 5 ? = X e ló lo à o ló |N QN & TT 2º o = O ES 2 e E Sl ola | Es FejiN|r | Çqoo - = 2 E + o gl e 8 BE 2 ck Ty 2 = Oo jlM jN = |o 9 lol | 2 Oo uu 5 le E les Jos & PX/Z E E <|2 S&S ma |& tv ES O 3 o I | e — |O jo | QN | é EIS 9 E o |

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[00119] Para todas as amostras incluídas no estudo, os pacientes com HAE tipo 1 podem ser diferenciados dos controles saudáveis (sem HAE). Proteína C1qg

[00120] Utilizando os métodos delineados no Exemplo 1, o teor de fragmentos de peptídeo C1qg-B [178-186] e C1qg-B [63-77] da proteína C1q foi quantificado em DBS de um total de 270 indivíduos saudáveis.

[00121] Da mesma forma, o teor de fragmentos de peptídeo C1q- B [178-186] e C1g-B [63-77] da proteína C1iq foi determinado em DBS de um total de 135 pacientes com angioedema hereditário gene- ticamente diagnosticado antes disto.

[00122] Para este ensaio, peptídeos sintéticos puros foram obtidos e utilizados para obter uma curva padrão utilizada para quantificar os peptídeos originários das amostras de sangue. A linearidade da curva padrão é refletida nos valores de R? na seguinte Tabela 9.

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E EE E EE = Sie| x) x = Ss o e 2 o o o E | 2 |O E O 55 ES N OS 5 o |8 2 o o o E | Eres O" Ee Fire eis o vw EE = = CI SIEIE o | x x ei E |e o [E RX E SE 5E| ES $ E Es 2 SS 3/8 2 2 | * [E |5 8/5888 2 9? E << E E = = 2 O À (O |O 2 jo a 2 2 0 WO |O

RW Ns o o m fa 2 [S)

Proteína C3

[00124] Utilizando os métodos descritos no Exemplo 1, o teor de fragmento peptídico C3Beta [250-258] da proteína C3 foi quantificado em DBS de um total de 270 indivíduos saudáveis. Da mesma forma, o teor de fragmento de peptídeo C3Beta [250-258] da proteína C3 foi quantificado em DBS de um total de 135 pacientes com angioedema hereditário geneticamente diagnosticado antes disto.

[00125] Para este ensaio, peptídeos sintéticos puros foram obtidos e utilizados para obter uma curva padrão utilizada para quantificar os peptídeos originários de amostras de sangue. A linearidade da curva padrão é refletida nos valores de R? na seguinte Tabela 11.

Lo ss — no o S o S N o o qa =P co = 3 o = co O GO WC ss co 2 o xx o Fr E o 2 E 8 wu = 5|o S < o 3 N o OS Ii v 2 & v 2 o" NE ES | 3E S Sm o So 8 E E O E O = o o Fr Solo o aln'R AIJOjJO o 'S Wi, o gT o r-hkaxY ox o CW SS <.s2 o 0 o NrNlÁlálNio|N x e Ss Ile So Ns low NI N| o = |aN o o — o p/o e lo E & ZOO e Novo & S/S E à co o o Fr TS 2 — o Sw 2, 2 2 W o o o e o = = e) o |eo mm lo «o o = flo 0 | | NNE oo = O E e ME o 5/2 /8 | a1o/o S Q Olale= jo lo e e Nsloo|Nr S Ô o o 0 o 48 2 CN aços vs | << o o o E o 7 E 2 E so m nn o nº BB = WU OU NO o E 7 2 o 2 DEC 2 X É = o o EC o E 2 DO E o o = IES x | 6 E o B/E/e o = o à 88 o o E a Silo | | OS o o o = So SEE Vo < = Ss o E? à ojlo Ss oo Ss qN RP RS 5) s 282E SS o o o SlojS9|2 x O vo O o Gr S/2/8 ss << r$ o = =lo a iSI5S|E o = E /oIc sc Ss 2 E gg os & E 6 o 6 E = 2/0 |SIS 3 E Ss& | ESSES Selo o | E == o 0/6 º 6, Zz/ =jo a = AU OO o = sv ÇoO o O | & > E

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7TUTI Exemplo 4: Determinação dos níveis de corte de biomarcadores no extrato DBS de indivíduos saudáveis e pacientes com angioe- dema hereditário com variantes patogênicas conhecidas no gene Serping1.

[00127] Com base nos dados e resultados do Exemplo 3 e utilizan- do peptídeos sintéticos como padrões de calibração para SerpinG —[242-249], C4Alpha [680-685], C4Alpha [786-791], C4Beta [294- 297], C4Beta [571-579], Cig-Beta [178-186], C4Gamma [1638-1641], SerpinG1 [391-400] e Ciq-Beta [63-77], um nível de corte foi deter- minado empiricamente para cada peptídeo. C4Beta [571-579] 500 ng/ml C1q-Beta [178-186] 800 ng/ml C4Alpha [786-791] 100 ng/ml C4Beta [294-297] 201 ng/ml SerpinG1 [391-400] 392 ng/ml

[00128] Os resultados são mostrados nas Figs. 1a9.

[00129] Para todas as amostras incluídas no estudo, os pacientes com HAE podem ser diferenciados dos controles saudáveis (sem HAE, NC).

[00130] As características da presente invenção divulgadas no rela- tório descritivo, nas reivindicações, na listagem de sequências e/ou nos desenhos, podem tanto separadamente quanto em qualquer uma de suas combinações, serem elementos para a realização da invenção em suas várias formas.

Claims (25)

REIVINDICAÇÕES

1. Método para diagnóstico diferencial de angioedema he- reditário, caracterizado pelo fato de que o método compreende a de- terminação do nível de proteína C4, proteína C1-INH e proteína C1q em uma amostra de um indivíduo, em que a amostra é uma amostra de mancha de sangue seco e em que o nível é determinado pela es- pectrometria de massa.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a determinação do nível de proteína C4 compreende detectar e quantificar o nível de um peptídeo de fragmento C4, em que a determinação do nível de proteína C1-INH compreende detectar e quantificar o nível de um peptídeo de fragmento C1-INH, e em que a determinação do nível de proteína C1qg compreende detectar e quanti- ficar o nível de um peptídeo de fragmento C1q.

3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracteri- zado pelo fato de que se a amostra testa negativo para a proteína C4 e testa positivo para a proteína C1-INH e proteína C1q9, o indivíduo so- fre de angioedema hereditário tipo Il.

4. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracteri- zado pelo fato de que se a amostra testa negativo para a proteína C4 e proteína C1-INH e testa positivo para a proteína C1q, o indivíduo so- fre de angioedema hereditário tipo |.

5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o método é um método para dife- renciar entre angioedema hereditário tipo | e angioedema hereditário tipo Il.

6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que uma amostra testa positivo para a proteína C4 se o nível de proteína C4 ou de um peptídeo de fragmento C4 for maior do que um valor de corte, e testa negativo se o nível de proteína C4 ou de um peptídeo de fragmento C4 for menor do que um valor de corte.

7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que uma amostra testa positivo para a proteína C1-INH se o nível de proteína C1-INH ou de um peptídeo de fragmento C1-INH for maior do que um valor de corte, e testa negativo se o nível de proteína C1-INH ou de um peptídeo de fragmento C1- INH for menor do que um valor de corte.

8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a7, caracterizado pelo fato de que uma amostra testa positivo para a proteína C1iq se o nível de proteína C1q ou de um peptídeo de frag- mento C1q for maior do que um valor de corte, e testa negativo se o nível de proteína C1q ou de um peptídeo de fragmento C1q for menor do que um valor de corte.

9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o peptídeo do fragmento C4, o peptídeo do fragmento C1-INH, o peptídeo do fragmento C1qg e/ou o peptídeo do fragmento C3 é preparado a partir da amostra por uma digestão de protease ou digestão de peptidase.

10. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a protease é selecionada do grupo que compreende Arg-C, ASp-N, Asp-N (Glu N-terminal), BNPS ou NCS/ureia, Caspase- 1, Caspase-10, Caspase-2, Caspase-3, Caspase-4, Caspase-5, Cas- pase-6, Caspase-7, Caspase-8, Caspase-9, Quimotripsina, Quimotrip- sina (baixa especificidade), Clostripain, CNBr, CNBr (metil-Cys), CNBr (com ácidos), Enterocinase, Fator Xa, Ácido fórmico, Glu-C (tampão AmAc, Glu-C (tampão Phos), Granzima B, HRV3C protease, Hidroxi- lamin, Ácido iodosobenzoico, Lys-C, Lys-N, Lys-N (Cys modificada), Hidrólise ácida suave, NBS (longa exposição), NBS (curta exposição), NTCB, Elastase pancreática, Pepsina A, Pepsina A (baixa especifici-

dade), Prolil endopeptidase, Proteinase K, TEV protease, Termolisina, Trombina.

11. Método de acordo com a reivindicação 10, caracteriza- do pelo fato de que a protease é tripsina ou pepsina, de preferência tripsina.

12. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 2 a 11, caracterizado pelo fato de que o peptídeo do fragmento C4 é selecionado do grupo que consiste em [ementimo ccssammenasr Cys CAM: 1010 GCGEQTMIYLAPTLAASR [campnatiasotasar far A C4Alpha [1391-1404] Cys

ER amem CAM: 702, 703 CCQADGVTR erre [sean CAM: 716 SCEQR

ESA CAM: 728 VQOQPDCR C4Alpha [730-743] Cys Lemes James CAM: 820 GLCVATPVQLR [cmnpratmezata — JpcsaRarSvrAATAVEO o | C4Alpha [862-912] PAGSARPVAFSVVPTAATAVSLK C4Alpha [862-912] Cys NLTVSVHVSPVEGLCLAGGGGLAQQVLV-

[cama tensas LSVSRGSMPNAR O o C4Beta [405-459] LSVSAGSPHPAIAR C4Beta [560-570] Cys .

ESP LE ANA C4Beta [624-664] TLSR CAM: 635 TLSR C4Beta [64-71] Cys [emas fem CAM: 669 LSCPK C4Beta [96-

C4Gamma [1466- (Coments coverenasvevauvaPasamonaier ].Cys CAM: 1535 ECVGFEAVQEVPVGLVQPASATLYDYYNPER C4Gamma [1566-1575 [e ce 1983.1588 1590 | uuamesaeveaentor Cys CAM: 1583, 1588, 1590 | LLATLCESAEVCQCAEGK eee Je ].Cys CAM: 1595 CPR (Eae dean ].Cys CAM: 1618 FACYYPR [One trar Ie monamonaeveraaav Cys CAM: 1727, 1742 AACAQLNDFLOEYGTOGCQV

13. Método de acordo com a reivindicação 12, caracteriza- do pelo fato de que o fragmento C4 é selecionado do grupo que con- siste em C4Beta[571-579], C4Alpha[680-685], C4Alpha[786-791], C4Beta[294-297] e C4Gamma[1638-1641], de preferência o fragmento C4 é C4Beta[571-579].

14. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 2 a 13, caracterizado pelo fato de que o peptídeo de fragmento C1-INH é selecionado do grupo que consiste em SerpinG1 [202-211]. Lsemnctienaaca TOVENMARBASVAR o SerpinG1 [416-466] TGVEAAAASAISVAR

15. Método de acordo com a reivindicação 14, caracteriza- do pelo fato de que o peptídeo do fragmento C1-INH é selecionado do grupo que consiste em SerpinG1 [242-249] e SerpinG1 [391400], de preferência o fragmento C1-INH é SerpinG1 [242-249].

16. Método de acordo com qualquer uma das reivindica-

ções 2 a15, caracterizado pelo fato de que o peptídeo de fragmento C1q é selecionado do grupo que consiste em C1q-A [151-

17. Método de acordo com a reivindicação 16, caracteriza- do pelo fato de que o peptídeo de fragmento C1iq é selecionado do grupo que consiste em C1qBeta[178-186] e C1qBeta[63-77], de prefe- rência o fragmento C1qg é C1qgBeta[178-186].

18. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 6 a 17, caracterizado pelo fato de que o valor de corte para o peptídeo de fragmento de C4 C4Beta[571-579] é de 500 ng/ml; o valor de corte para o peptídeo de fragmento de C4 C4Alpha[680- 685] é de 260 ng/ml; o valor de corte para o peptídeo de fragmento de C4 C4Alpha[786- 791] é de 100 ng/ml; o valor de corte para o peptídeo de fragmento de C4 C4Beta[294-297] é de 201 ng/ml; e o valor de corte para o peptídeo de fragmento de C4 C4Gamma/[1638- 1641] é de 920 ng/ml.

19. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 7 a 18, caracterizado pelo fato de que o valor de corte para o peptídeo de fragmento de C1-INH SerpinG1[242-249] é de 835 ng/ml, e o valor de corte para o peptídeo de fragmento de C1-INH SerpinG1[391-400] é de 392 ng/ml.

20. Método de acordo com qualquer uma das reivindica-

ções 8 a 19, caracterizado pelo fato de que o valor de corte para o peptídeo de fragmento de C1q C1qBeta[178-186] é de 800 ng/ml, e o valor de corte para o peptídeo de fragmento de C1q C1qBeta[63-77] é de 1690 ng/ml.

21. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 20, caracterizado pelo fato de que a sensibilidade do método é de 100% para a detecção de indivíduos que sofrem de angioedema hereditário tipo | ou angioedema hereditário tipo Il.

22. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 21, caracterizado pelo fato de que a espectrometria de mas- sa é selecionada do grupo que compreende SELDI MS, MALDI MS, ESI MS, DESI MS e MS de mobilidade iônica.

23. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 22, caracterizado pelo fato de que a espectrometria de mas- sa utiliza um analisador selecionado do grupo que compreende Triple Quad, ToF, QToF, captura de íons, analisador de massa de armadilha de íons, mobilidade iônica e qualquer combinação dos mesmos.

24. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 23, caracterizado pelo fato de que a análise espectrométrica compreende ou utiliza MS/MS, MRM, SRM ou qualquer combinação dos mesmos, de preferência MS/MS, MSº, MS", MS/MRM ou MS/SRM.

25. Kit adequado para uso em um método para diagnóstico diferencial de angioedema hereditário, de preferência um método para diagnóstico diferencial de angioedema hereditário como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 24, caracterizado pelo fato de que o kit compreende pelo menos um elemento selecionado do grupo que compreende um parceiro de interação de um biomarcador, um bi- omarcador, instruções de uso para o kit e um ou mais recipientes, em que o biomarcador é selecionado do grupo que compreende a proteína

CA4, um peptídeo de fragmento da proteína C4, proteína C1-INH, um peptídeo de fragmento da proteína C1-INH, proteína C1q e um peptí- deo de fragmento de C1q.