CN117677846A

CN117677846A - 蛋白c和活化蛋白c的测量方法

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Publication number: CN117677846A
Application number: CN202280024735.0A
Authority: CN
Inventors: 何塞·路易斯·加西亚·吉梅内斯; 费德里科·维森特·帕拉多·卡拉塔尤德; 萨尔瓦多·梅纳·莫拉; 尼维斯·卡博内尔·蒙莱翁
Original assignee: Insiriva Health Research Institute; Biomedical Network Research Consortium Center Ciber; Universitat de Valencia
Current assignee: Insiriva Health Research Institute; Biomedical Network Research Consortium Center Ciber; Universitat de Valencia
Priority date: 2021-03-01
Filing date: 2022-03-01
Publication date: 2024-03-08
Also published as: EP4302095A1; EP4053559A1; JP2024513664A; WO2022184725A1; CA3211713A1

Abstract

本发明涉及一种测量有需要的对象中蛋白C(PROC)、优选活化蛋白C(APC)水平的方法，该方法包括：对从对象分离的一个或多个生物样本进行酶促消化的步骤；和测量SEQ ID NO：1(LGEYDLR)的肽和/或SEQ ID NO：2(TFVLNFIK)的肽的水平的步骤，其中SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：2的水平对应于所述一个或多个生物样本中存在的PROC、优选APC的水平。还包括对对象进行分类和预后治疗反应的方法。

Description

蛋白C和活化蛋白C的测量方法

技术领域

本发明涉及医学领域，具体涉及利用基于质谱的方法测量生物标志物的领域。更具体地，本发明涉及使用与蛋白C、优选活化蛋白C相关的特定肽来测量/定量这些蛋白的基于质谱的方法。

背景技术

在脓毒症和脓毒性休克的第三次国际共识定义(Sepsis-3)中，脓毒症被定义为当身体对感染的反应损害其自身组织时出现的危及生命的器官功能障碍(总SOFA评分≥2分，假设在不知道先前已患有器官功能障碍的患者中基线SOFA为零)。脓毒性休克被定义为脓毒症的一个亚型，脓毒性休克中影响深刻的循环、细胞和代谢异常与相比于单纯脓毒症的死亡风险增加相关。然而，尽管在疫苗、抗生素和重症监护病房(ICU)的急性护理方面取得了进步，脓毒症影响着多达4900万人，仍然是因感染而死亡的主要原因，全世界每年有超过1100万人死亡，并且也是ICU中最常见的死亡原因。

弥散性血管内凝血(DIC)是一种获得性临床生物综合征，其特征是凝血广泛激活，导致血管系统中纤维蛋白沉积、器官功能障碍、凝血因子和血小板消耗以及危及生命的出血。

蛋白C缺乏症(PROC缺乏症)是一种罕见的遗传性疾病，其特征是缺乏蛋白C，因此受这种罕见疾病影响的对象有形成血块的风险，特别是一类称为深静脉血栓形成的血块。虽然非常罕见，但有一种重症形式在出生时就存在(先天性)，其可能会导致体内广泛出现小血块，并在婴儿期出现危及生命的并发症。蛋白C水平检测不到的患者通常在出生后数小时至数天内表现出疾病，伴有暴发性紫癜或大量静脉血栓形成。

蛋白C(PROC)具有抗血栓形成、抗炎和纤维蛋白原溶解(profibrinolytic)特性，可在限制对败血症的严重全身反应的有害影响方面发挥作用。已在脓毒症诱发的DIC实验模型和脓毒症患者中对PROC抗凝途径在DIC发病机制中的作用进行了研究。脓毒症患者经常出现蛋白C缺乏，这主要是由于消耗增加、肝脏合成受损和血管渗漏所致。

活化蛋白C(Activated protein C，APC)是一种56kDa的血液维生素K-丝氨酸蛋白酶，是蛋白C(PROC)上Arg169-Leu170肽键裂解，从重链中释放出十二肽(残基158-169)而产生的。APC具有抗凝、细胞保护、抗炎和细胞信号传导活性。在最近指定的APC的作用中，众所周知的是，APC作为凝血酶生成的主要调节剂的作用，以及它通过蛋白水解降解纤维蛋白凝块形成所必需的促凝活化辅因子来控制血液凝固的作用。此外，APC在多种自身免疫性疾病临床前模型中已被证明有助于适应性免疫反应。

多项研究证明了APC的治疗用途，因此市场上出现了使用重组人APC(rhAPC)的治疗。脓毒症引起的DIC中后天性APC缺乏与脓毒症患者的高凝状态和死亡率增加有关。已证明，APC治疗降低了重症脓毒症患者的28天死亡率，包括回顾性分配至脓毒症相关DIC亚组的患者。然而，APC治疗对其他患者组没有任何积极作用，这表明只有患有DIC的脓毒症患者才会受益于使用APC治疗(即Xigris或其他重组APC)。还发现，APC治疗增加了脓毒症患者的出血风险，这凸显了在治疗前和治疗期间测量患者PROC和/或APC水平的重要性。

因此，rhAPC(Drotrecogin alpha，DrotAA)，特别是(礼来公司(Eli LillyInc.))被制造商从市场上撤出，并努力提高APC治疗多种疾病的治疗潜力和安全性。为了降低出血风险，天然APC结构被突变：3个赖氨酸被丙氨酸(K191A、K192A、K193A)取代，消除了＞90％的抗凝活性，同时保留了多种细胞信号传导活性。这种APC形式被命名为3K3A-APC。因此，ZZ Biotech的3K3A-APC(http://zzbiotech.com/the-company/3k3a-activated-protein-c)是自然存在的APC的基因工程变体，在调节血液凝固和炎症中发挥作用。APC具有细胞保护、抗炎和抗凝特性；3K3A-APC具有降低的抗凝能力，从而使未经修饰的APC引起的出血风险最小化。在中风、肌萎缩侧索硬化症(ALS)、神经外伤和脓毒症的动物模型中，3K3A-APC疗法在增强疗效和降低出血风险方面优于重组APC。3K3A-APC对大脑血管内壁的保护作用进一步有助于防止组织纤溶酶原激活剂(tPA)有时引起的出血，tPA是目前唯一被指明用于治疗急性缺血性中风的药物，并且最近被提议用于2019冠状病毒病的严重疾病患者。

先前对重组天然或突变人APC的治疗应用的研究强化了需要用于测量内源性和外源性人PROC或/和APC以及诊断和治疗环境的检测和监测方法的想法。本发明描述了测量从人对象获得的血液中的循环PROC和APC的方法，血液包括在三级医院的重症监护病房收治的患者(包括患有脓毒症和脓毒性休克以及脑血管意外如中风的严重受影响的患者)的血浆。本文描述的方法基于多反应监测靶向质谱(MRM-MS)和特异性(加标标记的)蛋白特征性肽的使用，从而获得了高度灵敏且特异性的方法。

附图说明

图1.在MS实验中使用不同浓度(fmol)的加标(spike-in)重肽的APC所选肽的线性。

图2.APC(ng/mL)和与脓毒症病理生理学相关的不同参数之间的Spearman相关性。APC与以下各项的相关性：a)组蛋白H2B(Spearman's Rho 0.469，p＝0.021)；b)降钙素原(PCT)(Spearman's Rho 0.468，p＝0.021)；c)快速指数(Spearman's Rho 0.514，p＝0.010)；d)功能性蛋白C(Spearman's Rho 0.900，p＝0.037)。

图3.APC(ng/mL)和与脓毒性休克病理生理学相关的不同参数之间的Spearman相关性。APC与以下各项的相关性：a)血小板(Spearman's Rho0.374，p＝0.0001)；b)快速指数(Spearman'sRho 0.302，p＝0.003)；c)活化部分凝血活酶时间(Spearman's Rho-0.267，p＝0.026)；d)D-二聚体(Spearman's Rho-0.437，p＝0.002)；和e)功能性蛋白C(Spearman'sRho 0.900rho，p＜0.0001)。

图4.对诊断为CID或未诊断为CID的患者的样本中血浆APC水平的研究(p＝0.0014)。

图5.在MS实验中使用不同浓度(fmol)的加标重肽的PROC所选肽的线性。

发明内容

在第一方面，本发明涉及一种用于筛查或分类有患脓毒症或脓毒性休克的风险的对象的基于质谱的方法，该方法包括以下步骤：

i)通过执行包括以下步骤的方法来测量蛋白C(PROC)的水平：对从对象分离的一个或多个生物样本进行酶促消化的步骤；和通过使用质谱仪测量SEQ ID NO：1(LGEYDLR)的肽的水平的步骤，其中SEQ ID NO：1(LGEYDLR)的水平对应于所述一个或多个生物样本中存在的PROC的水平，以及

ii)将步骤i)中获得的水平与参考值进行比较，

其中参考值为1431.57ng/mL，并且其中至少40％的降低表明有患脓毒症或脓毒性休克的风险。优选地，该方法进一步包括临床确认患者患有脓毒症或脓毒性休克的步骤。

在其他方面，本发明涉及一种用于筛查或分类有患弥散性血管内凝血(DIC)的风险的对象的基于质谱的方法，其中，该对象已被诊断患有脓毒症或脓毒性休克，该方法包括以下步骤：

ii)将步骤i)中获得的水平与参考值进行比较，

其中所述参考值为600ng/mL，并且其中至少20％的降低表明所述对象有患DIC的风险。优选地，该方法进一步包括临床确认患者患有弥散性血管内凝血的步骤。

优选地，用于酶促消化的酶是胰蛋白酶和/或ArgC，或在消化后产生SEQ ID NO：1的LGEYDLR肽的蛋白酶的任何组合。优选地，通过加标带标记的SEQ ID NO：1(LGEYDLR)的蛋白特征性肽(proteotypic peptide)来进行SEQ ID NO：1(LGEYDLR)的肽的测量。优选地，加标的带标记的SEQ ID NO：1(LGEYDLR)的蛋白特征性肽是用至少一个或多个重氨基酸合成的，并且其中优选在C端氨基酸残基中用标签对所述肽进行标记。优选地，该方法还包括用还原剂还原一个或多个生物样本的步骤，以及用烷化剂将一个或多个生物样本烷基化的步骤，其中还原步骤和烷基化步骤都在酶促消化步骤之前进行。

优选地，一个或多个生物样本选自由血液、血清、血浆、唾液、尿液或脑脊液组成的组。

另一方面，本发明涉及一种用于预后有需要的对象对重组蛋白C(PROC)、优选重组活化蛋白C(APC)治疗的反应的基于质谱的方法，该方法包括以下步骤：

i)通过执行根据前述方面中任一项所述的方法的每个步骤来筛查对象是否有患弥散性血管内凝血(DIC)的风险；

ii)如果该对象被鉴定为有患DIC的风险或被诊断患有DIC，则将该对象分类为对所述治疗的有反应者，如果该对象没有被鉴定为有患DIC的风险或没有被诊断为患有DIC，则将该对象分类为对所述治疗的无反应者。

优选地，预后在用重组蛋白C(rPROC)、优选重组活化蛋白C治疗对象之前进行。

在进一步的方面，本发明涉及一种包含重组蛋白C(rPROC)、优选重组活化蛋白C(rAPC)的组合物，用于治疗脓毒症、脓毒性休克或中风，其中该用途包括向根据前述方面中的被分类为有反应者的对象施用所述组合物的步骤。

在进一步的方面，本发明涉及SEQ ID NO：1(LGEYDLR)的肽在从有需要的对象分离的一个或多个生物样本中的水平作为用于筛查有患脓毒症或脓毒性休克的风险的对象的生物标志物或作为用于筛查有患弥散性血管内凝血的风险的对象的生物标志物的体外用途。

在进一步的方面，本发明涉及SEQ ID NO：1(LGEYDLR)的肽在从有需要的对象分离的一个或多个生物样本中的水平作为用于预后患有脓毒症或脓毒性休克和弥散性血管内凝血(DIC)的对象对重组PROC、优选重组APC治疗的反应的生物标志物的体外用途。

具体实施方式

一般定义

必须注意的是，除非上下文另有明文说明，否则如本文所使用的单数形式“一”，“一个”和“该”包括复数指代。此外，除非另有说明，否则一系列元素之前的术语“至少”应理解为指该系列中的每个元件。本领域技术人员将认识到或能够仅使用常规实验来确定本文描述的发明的具体实施方式的许多等同物。这样的等同物旨在被本发明涵盖。

如本文所使用的，多个引用的元素之间的连接术语“和/或”被理解为涵盖单独的和组合的选项。例如，当两个元素通过“和/或”连接时，第一选项指的是在没有第二元素的情况下第一元素的适用性。第二选项是指在没有第一元素的情况下第二元素的适用性。第三选项是指第一元素和第二元素一起适用。这些选项中的任何一个都被理解为落入该含义内，并且因此满足如本文所使用的术语“和/或”的要求。多于一个选项的同时适用也被理解为落入该含义内，并且因此满足术语“和/或”的要求。

在通篇说明书以及权利要求中，除非上下文另有要求，否则词语“包含(comprise)”及变形例如“comprises”和“comprising”将被理解为暗示包括所称的整体或步骤、或整体或步骤的组，但不排除任何其他整体或步骤、或整体或步骤的组。当在本文中使用时，术语“包含”可以被术语“含有”或“包括”替代，或者有时当在本文中使用时被术语“具有”替代。任何前述术语(包含、含有、包括、具有)，无论何时在本发明的方面或实施方式的上下文中使用时，都可以用术语“由......组成”替代，尽管不太优选。

如本文所用，术语“约”是指指示值±其值的1％，或术语“约”是指指示值±其值的2％，或术语“约”是指指示值±其值的5％，术语“约”是指指示值±其值的10％，或术语“约”是指指示值±其值的20％，或术语“约”是指指示值±其值的30％；优选术语“约”精确地表示指示值(±0％)。

当本文使用“由......组成”时，排除权利要求元素中未指定的任何元素、步骤或成分。当在本文中使用时，“基本上由......组成”并不排除不会实质上影响权利要求的基本特征和新颖特征的材料或步骤。

在本发明的上下文中，术语“检测”、“定量”和“测量”被认为是同义的并且是指计算一种或多种生物样本中PROC、优选APC的水平。本文使用的术语“水平”与浓度或数量同义。因此，例如，在本发明的上下文中，PROC、优选APC的水平的测量意味着计算所述蛋白质的浓度或量。

如本文所用，术语“脓毒症”定义为疑似或证实的感染加上全身炎症反应综合征(例如发烧、心动过速、呼吸急促或白细胞增多)。重要的是，在许多脓毒症病例中，不可能确定感染的原因。

如本文所用，术语“脓毒性休克”定义为当全身感染导致危险的低血压时发生的严重病情。脓毒性休克通常与血压显著下降有关，血压显著下降可导致呼吸或心力衰竭、中风、其他器官衰竭以及死亡。

如本文所用，术语“弥散性血管内凝血(DIC)”定义为一种获得性临床生物综合征，其特征是凝血广泛激活，导致血管系统中纤维蛋白沉积、器官功能障碍、凝血因子和血小板消耗以及危及生命的出血。

如本文所用，术语“蛋白C缺乏症”定义为一种罕见的遗传性疾病，其特征是缺乏蛋白C，因此受这种罕见疾病影响的对象有形成血块的风险，特别是一类称为深静脉血栓形成的血块。

如本文所用，术语“蛋白C”(PROC)定义为维生素K依赖性糖蛋白，其是活化蛋白C(APC)的酶原(酶的无活性前体)。如本文所用，活化蛋白C(APC)定义为56kDa的血液维生素K-丝氨酸蛋白酶，是蛋白C上Arg169-Leu170肽键裂解，从重链中释放出十二肽(残基158-169)而产生的。

如本文所用，术语“内源性蛋白质”定义为源自对象的蛋白质。内源性蛋白质与“外源性蛋白质”相反，是因为外源性蛋白质起源于对象之外，例如，它们来自另一个对象。因此，内源性PROC或APC是指由对象合成的PROC或APC，而外源性PROC或APC是指不是由对象合成但已对其施用的PROC或APC，因此其可以是重组的(即通过实验室方法生成的)PROC或APC。

实施方式

Drotrecogin alfa是人活化蛋白C的重组形式。(礼来公司)是一种含有活性物质Drotrecogin alfa(活化)的药物，在特殊情况下于2002年在欧盟获准除了最佳标准护理外用于治疗患有多器官衰竭的成年患者的重症脓毒症。

后来，使用进行的PROWESS-SHOCK研究结果未能达到使用Xigris治疗的患者28天全因死亡率与安慰剂相比在统计学上显著降低的主要终点。该研究也未能达到降低重度蛋白C缺乏症患者人群死亡率的次要终点。礼来公司决定将该产品从全球市场上撤回。

开发了基于rhAPC的新开发的优化药物(包括US2010028910中公开的3K3A-APC)，其使抗凝活性明显大幅降低。此外，rhAPC疗法也被提议用于治疗中风。然而，由于强有力的证据表明APC治疗与严重出血风险增加相关，因此APC相关治疗的结果存在重大的不确定性。

由于与重组PROC或APC治疗相关的重要的次要效应，需要用灵敏度和特异性增加的其他方法或技术来替代目前使用的测量患者内源性PROC和APC水平的方法，以便改进对有患脓毒症或脓毒性休克或DIC的风险的对象的分类，并预后对重组PROC(rPROC)或重组APC(rAPC)治疗的反应。

本发明旨在通过提供有效且准确的测量PROC和APC的方法来解决上述问题，该方法基于使用本发明作者发现与内源性PROC和APC的水平相关的两种特异性肽LGEYDLR(SEQID NO：1)和TFVLNFIK(SEQ ID NO：2)进行的检测。此外，本发明还提供了包含PROC或APC的组合物，其用于治疗所述疾病以及用于患者选择。最后，还提供了肽LGEYDLR和TFVLNFIK作为生物标志物的体外用途。

用于检测PROC、优选APC的方法。

本发明的第一方面涉及一种测量有需要的对象中蛋白C(PROC)、优选活化蛋白C(APC)水平的方法，该方法包括：对从对象分离的一个或多个生物样本进行酶促消化的步骤；和测量SEQ ID NO：1(LGEYDLR)的肽和/或SEQ ID NO：2(TFVLNFIK)的肽的水平的步骤，其中SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：2的水平对应于所述一个或多个生物样本中存在的PROC、优选APC的水平。

为了提供这样的方法并选择与PROC、优选APC的水平具有显著相关性的肽，选择了两种肽(SEQ ID NO：1：LGEYDLR和SEQ ID NO：2：TFVLNFIK)并测试它们与所述蛋白的线性。本发明发现SEQ ID NO：1和2的肽的水平可用于计算PROC、优选APC的水平。这是可能的，因为肽SEQ ID NO：1和2与PROC和APC之间存在相关性，如图1所示。此外，还发现，在这两种肽中，SEQ ID NO：1的肽表现出的与PROC和APC水平的线性比SEQ ID NO：2更好，使得该肽成为测量一个或多个生物样本中PROC、优选APC水平的优选肽。

因此，当PROC或APC的浓度在1至250fmol之间时，SEQ ID NO：1的肽不仅呈现出比SEQ ID NO：2的肽更好的线性(R² 0.99 vs 0.963，参见图1的下图)，而且它是唯一与较低浓度范围的PROC或APC仍然相关的肽(图1中的上图，其中SEQ ID NO：2的肽与1至10fmol范围内的APC的水平不相关)。这些结果通过包括第三种肽(SEQ ID NO：7，ANSFLEEFR)而得到进一步证实，并且得出的结论是SEQ ID NO：1是唯一在低浓度范围内显示线性的肽(参见图5，上图)。最后，表6示出了PROC或APC浓度范围在0.8-84fmol/μl之间的对象群体(n＝86)，其中包括患有脓毒性休克的患者(n＝66)，其中9名患有DIC，表明这些患者组只能使用SEQID NO：1的肽来鉴定，因为它们的PROC或APC水平超出了其他肽例如SEQ ID NO：2和7的检测限。

总而言之，这些结果表明SEQ ID NO：1的肽是覆盖更广泛的患有脓毒症或脓毒性休克并且有患DIC的风险的对象的肽，同时其保持高特异性和灵敏度。值得注意的是，PROC或APC水平较低的患者是呈现出最重型疾病的患者，因此他们是非常脆弱的人群，患DIC的风险增加。在这些情况下，只有使用SEQ ID NO：1的肽的基于MS的方法才能够将它们分类为患有DIC或有患DIC的高风险。

最后，在脓毒症或脓毒性休克组中还发现功能性蛋白C还与通过质谱测定的APC浓度相关(见图2和图3)。重要的是，在脓毒症患者中，PROC/APC还与组蛋白H2B(从中性粒细胞释放时的细胞损伤介质)、PCT(降钙素原，在活动性感染的情况下升高)、快速指数(与凝血有关的参数)相关。在脓毒性休克患者组中，PROC/APC水平与血小板(参与凝血过程)、活化凝血活酶时间(用于评估人适当形成血块的能力)和D-二聚体(其水平有助于排除严重血块的存在)相关。

因此，在实施方式中，SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：2、优选SEQ ID NO：1(LGEYDLR)的肽的水平与存在于所述一个或多个生物样本中的PROC、优选APC的水平线性相关。在另一个实施方式中，所述线性相关性介于-1.0和1.0之间，并且其通过Y＝bX形式的等式将变量关联起来，其中X对应于SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：2的肽的水平，Y对应于PROC、优选APC的水平，b是1。优选地，当所述蛋白质以低于5600ng/ml、优选低于2800ng/ml、最优选低于560ng/ml的浓度存在于样本中时，SEQ ID NO：1的肽的水平与PROC、优选APC的水平线性相关。

因此，在实施方式中，对象优选选自PROC或APC水平低于14000ng/ml(＝250fmol/μl)、低于6000ng/ml、低于2800ng/ml、优选低于800ng/ml、低于600ng/ml或最优选低于500ng/ml的对象组。优选地，对象选自PROC或APC水平为14000-20ng/ml、12000-20ng/ml、11500-20ng/ml、10000-20ng/ml、8000-20ng/ml、6000-20ng/ml、5000-20ng/ml、3000-20ng/ml、2800-20ng/ml、2500-20ng/ml、2000-20ng/ml、1500-20ng/ml、1000-20ng/ml、900-20ng/ml、800-20ng/ml、700-20ng/ml、650-20ng/ml、600-20ng/ml、500-20ng/ml、400-20ng/ml、300-20ng/ml、200-20ng/ml、100-20ng/ml、50-20ng/ml的对象组。将以ng/ml为单位的值除以56(PROC的分子量)即可转换为fmol/μl。

第一方面或其任何实施方式的酶促消化步骤对于该方法来说都是非常重要的。该步骤在测量步骤之前进行，因为在测量之前需要将一个或多个生物样本转化或消化成分离的肽。可用于酶促消化的酶的实例是胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、金黄色葡萄球菌(V8)蛋白酶、颌下蛋白酶、菠萝蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、天冬氨酸内肽酶、或ArgC，或其任何组合。优选地，用于酶促消化的酶是消化PROC和APC蛋白从而产生许多肽的酶，这些肽中包括SEQ ID NO：1和/或2的肽。在优选的实施方式中，使用胰蛋白酶、ArgC和/或在消化后产生SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：2的肽的蛋白酶的任何组合用于酶促消化步骤。最佳消化条件例如时间和温度是本领域已知的。

可选地，酶促消化过程中可以使用微波辅助消化来加速肽的形成(P MuralidharReddy,etal.Digestion Completeness of Microwave-Assisted and ConventionalTrypsin-Catalyzed Reactions.Journal of the American Society for MassSpectrometry.Volume 21,Issue 3,March 2010,Pages 421–424)。在优选的实施方式中，酶促消化是微波辅助的用胰蛋白酶和/或ArgC和/或在消化后产生SEQ ID NO：1和/或SEQID NO：2的肽的蛋白酶的任何组合进行的消化。

此外，甚至在酶促消化之前，一个或多个生物样本可以可选地用还原剂和/或用烷化剂处理。“还原剂”是指在氧化还原化学反应中失去(或给予)电子给电子受体从而导致还原剂氧化和受体化合物还原的任何元素或化合物。还原剂的实例是二硫苏糖醇(DTT)、Tris(2-羧乙基膦)(TCEP)、抗坏血酸、盐酸半胱氨酸、2-巯基乙醇、亚硫酸钠或巯基乙酸钠。“烷化剂”是指将烷基转移至另一个化合物的任何元素或化合物。用于肽谱目的的烷化剂的实例是碘乙酰胺。

因此，在第一方面的进一步优选的实施方式中，该方法还可包括用还原剂还原一个或多个生物样本的步骤，和/或用烷化剂将一个或多个生物样本烷基化的步骤，其中还原和/或烷基化步骤都在酶促消化步骤之前进行，因此也在测量步骤之前进行。

在实施方式中，用于测量PROC、优选APC水平的一个或多个生物样本选自由血液、血清、血浆、唾液、尿液或脑脊液组成的组。优选地，一个或多个生物样本选自由血液、血清或血浆组成的组。

在实施方式中，根据第一方面或其任何优选实施方式的对象是哺乳动物，优选人。在另一个实施方式中，人对象选自重症监护室(ICU)的患者。

应当注意的是，第一方面或其任何实施方式中描述的方法能够测量内源性或外源性蛋白C、和活化蛋白C(APC)，因为所有这些蛋白变体都包含SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的肽。此外，本发明第一方面或其任何实施方式的方法还可以测量所述蛋白质的任何片段或变体，只要该片段或变体包含测量的SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：2的肽。因此，在第一方面的实施方式中，测量的PROC或APC来自外源和/或内源。在另一个实施方式中，测量的PROC、优选APC是外源性3K3A-APC或药物中包含的活化的drotrecogin alfa。

尽管SEQ ID NO：2(TFVLNFIK)的肽没有表现出与SEQ ID NO：1(LGEYDLR)的肽一样好的线性，但在本发明的实施方式中，可以组合两种肽以获得更稳健的方法，该方法包括这两种测量，以更好地计算PROC、优选APC的水平。可选择地，它们可以单独使用。在第一方面或其任何实施方式的优选实施方式中，仅用SEQ ID NO：1的肽进行测量步骤。

关于第一方面或其任何实施方式中存在的测量步骤中使用的技术，任何技术都可以使用，只要其特异性检测SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：2的肽，因为如上所述且在图1中所示的，这些肽与PROC和APC的水平相关。因此，例如，用于测量步骤的技术可以是放射免疫测定(RIA)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、化学发光或比色ELISA、免疫荧光测定(IFA)、斑点印迹、蛋白质印迹、流式细胞术、Luminex测定和ProQuantum免疫测定法，或者优选地，质谱法。

在优选的实施方式中，第一方面涉及一种测量有需要的对象中蛋白C(PROC)、优选活化蛋白C(APC)水平的基于质谱的方法，该方法包括：对从对象分离的一个或多个生物样本进行酶促消化的步骤；和通过使用质谱仪测量SEQ ID NO：1的肽和/或SEQ ID NO：2的肽的水平的步骤，其中SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：2的水平对应于所述一个或多个生物样本中存在的PROC、优选APC的水平。

在进一步优选的实施方式中，使用基于液相色谱串联质谱法(LC-MS/MS)和多反应监测法(MRM)(MRM-MS)的方法。MRM-MS为生物标志物发现和生物标志物验证提供了潜在的方法。此外，该方法提供了生物标志物临床验证所需的灵敏度、准确性和高通量，从而消除了执行不同发现和验证方法的必要性。血浆是诊断测定的生物标志物的来源，但它也是蛋白质组学研究中具有挑战性的生物基质，因为这种液体中存在宽动态范围的蛋白质(10¹⁰)。已提出监测每个肽的单个转变，因为对于复杂混合物(例如血浆)中的肽定量具有足够的特异性。另一方面，在预测脓毒症患者的结果方面，经典生物标志物并没有比通用评分添加更多信息。尽管有C反应蛋白(CRP)和降钙素原(PCT)来补充脓毒症的诊断，并且PCT作为预后生物标志物是有用的，但未来对脓毒症的评估需要寻找可以是灵敏的、特异性的且经济适用的新生物标志物。

优选地，第一方面的质谱仪是三重四极杆或混合三重四极杆-线性离子阱质谱仪，优选配备有色谱系统，更优选配备有纳米-LC或微米-LC色谱系统。优选地，根据本发明第一方面的用于测量对象的PROC、优选APC的基于质谱的方法，PROC、优选APC的水平或浓度相当于肽SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：2的量。优选地，为了测量生物样本中PROC或APC的水平或浓度，获得SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：2的平均比率，该比率理解为目标信号肽/信号肽加标的比率。更优选地，在根据本发明第一方面或其任何优选实施方式的方法中，所选择的SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：2的肽序列可以优选地制备为SpikeTidesTM_TQ(重同位素标记，例如Arg:¹³C6、¹⁵N4；Lys:Arg:¹³C6、¹⁵N2)，用于PROC、优选APC的绝对定量。

在优选的实施方式中，通过测量SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：2的肽来测量PROC、优选APC是通过加标带标记的SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：2的蛋白特征性肽来进行的。在其他优选实施方式中，加标的带标记的SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：2的蛋白特征性肽是用至少一个或多个重氨基酸合成的，并且其中优选在C端氨基酸残基中用标签对所述肽进行标记。

在本发明的上下文中，术语“标签”被理解为稳定的带同位素标记的氨基酸，其与其未带标记的氨基酸对应物具有相同的生理化学性质和相同的化学活性。标签也可以是小的化学修饰，在之前的MS实验中用胰蛋白酶或其他蛋白酶处理时被切割。使用与蛋白特征性肽相关的标签在靶向MS实验中进行肽定量。

在本发明的上下文中，术语“重氨基酸”涉及掺入到含有重原子(例如¹³C、¹⁵N、¹⁷O和/或³⁴S)的标签中的同位素原子，其可以通过MS区分。

在本发明的上下文中，术语“用至少一种或多种重氨基酸合成”应理解为含有至少一种或多种重原子¹³C、¹⁵N、¹⁷O和/或³⁴S的“标签”在对应于SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：2的加标氨基酸序列中。

脓毒症或脓毒性休克患者的筛查或分类方法

第一方面或其任何实施方式中定义的方法还允许根据在所述患者中测量的PROC、优选APC的水平对有患脓毒症或脓毒性休克的风险的患者进行筛查或分类。如实施例中所示，特别是表2中所示，对157份血浆样本进行了分析，发现脓毒症或脓毒性休克患者与未患有这些疾病的患者之间存在统计学上显著的差异。特别地，当PROC、优选APC的水平低于800ng/ml时，这些差异在统计学上显著，表明使用第一方面或其任何实施方式中定义的方法测量PROC、优选APC的水平可以可用于筛查和分类有患所述疾病风险的患者。

鉴于此，本发明的第二方面涉及一种基于质谱的方法，优选地基于多反应监测靶向质谱(MRM-MS)和多反应监测法的方法，用于对有患脓毒症或脓毒性休克的风险的对象进行筛查或分类，该方法包括以下步骤：

i)通过执行第一方面或其任何实施方式中定义的方法来测量蛋白C(PROC)、优选活化蛋白C(APC)的水平，和

ii)将步骤i)中获得的水平与参考值进行比较，

其中步骤i)的测量值与ii)的参考值的统计学上显著的变化表明对象有患脓毒症或脓毒性休克的风险。

如第一方面所示，测量步骤可以用允许对SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：2的肽进行定量的任何分析技术来进行，其中优选质谱法。因此，虽然第二方面和任何以下实施方式具体涉及质谱法，但是应当理解，该技术可以被任何其他技术替代，例如放射免疫测定(RIA)、化学发光或比色酶联免疫吸附测定(ELISA)、免疫荧光测定(IFA)、斑点印迹、蛋白质印迹、流式细胞术或优选地质谱。

在优选的实施方式中，第二方面的步骤ii)的参考值从健康对象或健康对象群体获得(在这种情况下参考值是平均值)。可选择地，第二方面的参考值从在重症监护病房(UCI)但未患有脓毒症或脓毒性休克的对象或对象群体获得。为了获得所述参考值，可以使用本发明第一方面或其任何实施方式中描述的方法。可选择地，可以使用本领域已知的用于测量健康对象或健康对象群体中PROC、优选APC水平的其他方法。

还优选地，步骤i)中测量的水平(PROC、优选APC的水平)的统计学上显著的变化是与参考值相比统计学上显著降低。这种显著降低表明对象有患脓毒症或脓毒性休克的风险。显著降低被定义为SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：2的肽的水平的降低，这又意味着当通过统计检验的方式比较所述水平与参考水平时，生物样本中PROC或APC的显著降低。统计检验可以是参数的，或者优选地是非参数的，并且显著性阈值(定义为区分显著结果和非显著结果的阈值)可以设置为低于或等于0.05、低于或等于0.005、或者低于或等于0.001。

据估计，人体内循环的PROC或APC的平均量在3000-5000ng/ml之间(例如，参见https://diapharma.com/protein-c/，https://emedicine.medscape.com/article/2085992-overview)。在具体实施方式中，PROC、优选APC的参考值是约4000ng/mL，其中降低至少约10％、至少约20％、至少约30％、优选至少约40％、至少约45％、至少50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少95％、至少100％则表明存在患脓毒症或脓毒性休克的风险。如先前在定义部分中所定义的，术语“约”可以指的是指示值±10％。

如表2所示，通过Mann Whitney U检验(非参数)获得的显著降低表明有患脓毒症或脓毒性休克的风险是APC水平为613.70ng/ml(相比对照水平1431.57ng/ml(参考值))。这一降低对应于相比参考水平降低约40％(0.4倍)。

因此，在优选的实施方式中，PROC、优选APC的参考值是约1431.57ng/mL，其中降低至少约10％、至少约20％、至少约30％、优选至少约40％、至少约45％、至少50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少95％，至少约100％，表明存在患脓毒症或脓毒性休克的风险。如先前在定义部分中所定义的，术语“约”可以指的是指示值±10％。

此外，还如通过比较患有脓毒症或脓毒性休克的对象与对照(参考群体+ICU对照)获得的ROC曲线(表4，实施例5)所示，所述降低的最佳截止值计算为约800ng/ml，灵敏度为79.5％，特异性为97.1％(p＜0.0001)。因此，在另一个实施方式中，显著降低是指PROC、优选APC降低至少低于800ng/ml的水平，根据本文示例的ROC曲线选择作为截止值。优选地，参考值在900-800ng/ml之间，优选800ng/ml，使得低于所述参考值的PROC或APC水平表明对象有患脓毒症或脓毒性休克的风险。

值得注意的是，一旦执行了本发明的第二方面或其任何优选实施方式的方法并且已经鉴定了有患脓毒症或脓毒性休克的风险的对象，优选的是进行临床确认方法如CRP或PCT，以确认所鉴定的对象是否确实患有脓毒症或脓毒性休克。因此，在优选的实施方式中，第二方面的方法或其任何实施方式还包括临床确认患者患有脓毒症或脓毒性休克的步骤。

在进一步的实施方式中，本发明还涉及SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：2的肽在从有需要的对象分离的一个或多个生物样本中的水平作为用于筛查有患脓毒症或脓毒性休克的风险的对象的生物标志物的体外用途。

在另一个具体实施方式中，根据第二方面或其任何实施方式的方法也可用于将有患脓毒症或脓毒性休克的风险的患者分类为两种亚表型(内型)，即脓毒症反应特征1(SRS1)和脓毒症反应特征2(SRS2)。这种内型分类对于选择治疗非常重要，特别是在Antcliffe和Gordon2019[David B.Antcliffe,Anthony C.Gordon.2019 WhyUnderstanding Sepsis Endotypes Is Important for Steroid Trials in SepticShock.Society of Critical Care Medicine and Wolters Kluwer Health,Inc.Volume47.Number 12.DOI:10.1097/CCM.0000000000003833]所描述的皮质类固醇治疗中。

与第一方面类似，对象优选选自PROC或APC水平低于14000ng/ml(＝250fmol/μl)、低于6000ng/ml、低于2800ng/ml、优选低于800ng/ml、低于600ng/ml或最优选低于500ng/ml的对象组。优选地，对象选自PROC或APC水平为14000-20ng/ml、12000-20ng/ml、11500-20ng/ml、10000-20ng/ml、8000-20ng/ml、6000-20ng/ml、5000-20ng/ml、3000-20ng/ml、2800-20ng/ml、2500-20ng/ml、2000-20ng/ml、1500-20ng/ml、1000-20ng/ml、900-20ng/ml、800-20ng/ml、700-20ng/ml、650-20ng/ml、600-20ng/ml、500-20ng/ml、400-20ng/ml、300-20ng/ml、200-20ng/ml、100-20ng/ml、50-20ng/ml的对象组。将以ng/ml为单位的值除以56(PROC的分子量)即可转换为fmol/μl。

本发明中描述的方法的另一个优点是，患者进入重症监护病房(UCI)后马上或在进行其他验证性诊断测试之前就可以使用该方法。这很重要，因为该方法可以让医生提前推断患者可能的病情发展，从而允许提前准备重症监护和治疗。因此，优选的是，该方法在刚刚进入强化治疗病房或ICU的患者中进行。优选地，该方法在患者住院后最初4小时、5小时、优选6小时内进行。

DIC患者的筛查或分类方法

如上所述，之前的研究表明重组APC治疗对大多数脓毒症患者没有任何效果。然而，有趣的是，只有患有弥散性血管内凝血(DIC)的患者才对重组APC治疗有反应。因此，未来关于重组APC相关治疗的安全性和有效性的研究将需要鉴定患有脓毒症或脓毒性休克以及有患DIC风险的患者，因为他们反过来可以是所述治疗的真正有反应者。在这方面，本发明已发现诊断为DIC的患者中APC的平均水平低于未患有DIC的患者，如图4所示。特别地，发现PROC、优选APC的水平低于468ng/mL表明患有脓毒症或脓毒性休克的患者有患DIC的风险。

鉴于这一发现，本发明的第三方面涉及一种用于筛查或分类有患弥散性血管内凝血(DIC)的风险的对象的基于质谱的方法，该方法包括以下步骤：

ii)将步骤i)中获得的水平与参考值进行比较，

其中步骤i)的测量值与ii)的参考值的统计学上显著的变化表明对象有患DIC的风险。

在可选择的第三方面，本发明涉及一种用于诊断患有弥散性血管内凝血(DIC)的对象的基于质谱的方法，该方法包括以下步骤：

ii)将步骤i)中获得的水平与参考值进行比较，

其中步骤i)的测量值与ii)的参考值的统计学上显著的变化表明对象患有DIC。

如第一和第二方面所示，测量步骤可以用允许对SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：2的肽进行定量的任何分析技术来进行，其中优选质谱法。因此，虽然第三方面和任何以下实施方式具体涉及质谱法，但是应当理解，该技术可以被任何其他技术(放射免疫测定(RIA)、化学发光或比色酶联免疫吸附测定(ELISA)、免疫荧光测定(IFA)、斑点印迹、蛋白质印迹、流式细胞术、Luminex测定、ProQuantum免疫测定或优选地质谱)替代。

在第三方面的优选实施方式中，步骤ii)的参考值从患有脓毒症或脓毒性休克但未患有弥散性血管内凝血(DIC)的对象或对象群体获得。该参考值可以通过执行根据第一或第二方面或其任何实施方式的方法从所述对象获得。

还优选地，步骤i)中测量的水平(PROC、优选APC的水平)的统计学上显著的变化是与参考值相比统计学上显著的降低。这种显著降低表明对象有患DIC的风险。统计学上显著的变化可以通过先前针对第二方面或其任何实施方式所定义的统计检验来计算，但要考虑到，在这种情况下，参考值来自与第二方面(健康或在ICU但未患有脓毒症)不同的对象或对象群体(患有脓毒症或脓毒性休克)。

如图4所示，与没有DIC的对象水平(平均600ng/ml)相比，诊断为DIC的患者样本中的APC水平(平均468ng/ml)在统计学上降低(p＝0.0014)。这一降低对应于相比参考水平降低约20％(0.2倍)。

因此，在实施方式中，患有脓毒症或脓毒性休克但未患有DIC的患者的PROC、优选APC的参考值是约600ng/mL，其中降低至少约10％、优选至少约20％、至少25％、至少约30％、至少约40％、至少约45％、至少50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少95％，至少约100％，表明存在患DIC的风险。如先前在定义部分中所定义的，术语“约”可以指的是指示值±10％。优选地，参考值在500-400ng/ml之间，优选468ng/ml，从而低于所述参考值的PROC或APC水平表明对象有患DIC的风险。

与第一和第二方面类似，对象优选选自PROC或APC水平低于14000ng/ml(＝250fmol/μl)、低于6000ng/ml、低于2800ng/ml、优选低于800ng/ml、低于600ng/ml或最优选低于500ng/ml的对象组。优选地，对象选自PROC或APC水平为14000-20ng/ml、12000-20ng/ml、11500-20ng/ml、10000-20ng/ml、8000-20ng/ml、6000-20ng/ml、5000-20ng/ml、3000-20ng/ml、2800-20ng/ml、2500-20ng/ml、2000-20ng/ml、1500-20ng/ml、1000-20ng/ml、900-20ng/ml、800-20ng/ml、700-20ng/ml、650-20ng/ml、600-20ng/ml、500-20ng/ml、400-20ng/ml、300-20ng/ml、200-20ng/ml、100-20ng/ml、50-20ng/ml的对象组。将以ng/ml为单位的值除以56(PROC的分子量)即可转换为fmol/μl。

与上述类似，优选的是，该方法在刚刚进入强化治疗病房或ICU的患者中进行。优选地，该方法在患者住院后最初4小时、5小时、优选6小时内进行。

此外，如实施例7中所示，用于鉴定脓毒症对象的DIC的ROC曲线(表5b)提供了约468ng/ml的所述降低的最佳截止值，灵敏度为71.4％，特异性为71.4％(p＝0.00013)。因此，在另一个实施方式中，表明患者有患DIC的风险的显著降低是指PROC、优选APC降低至少低于468ng/ml的水平，根据本文示例的ROC曲线选择作为截止值。

在优选的实施方式中，在执行根据该方面或其任何实施方式的方法之前，对象先前已被诊断患有脓毒症或脓毒性休克。

与第二方面中定义的类似，一旦执行了本发明的第三方面或其任何优选实施方式的方法并且将对象分类为有患DIC的风险，则优选的是进行临床确认方法以确认所鉴定的对象是否患有DIC。因此，在优选的实施方式中，第三方面的方法还包括临床确认患者患有DIC的步骤。

预后外源性PROC、优选重组PROC(rPROC)和外源性APC、优选重组APC(rAPC)治疗反应的方法。

如上所述，为了评估个体患者对重组PROC或APC治疗的反应，重要的是了解正在治疗或待治疗的对象是否有患DIC的风险。与此相一致，本发明的第四方面涉及一种用于预后有需要的对象对重组蛋白C(rPROC)、优选重组活化蛋白C(rAPC)治疗的反应的基于质谱的方法，该方法包括以下步骤：

i)通过执行根据第三方面或其任何实施方式中定义的方法的每个步骤来筛查对象是否有

患弥散性血管内凝血(DIC)的风险；

ii)如果该对象被鉴定为有患DIC风险或被诊断患有DIC，则将该对象分类为对所述治疗的有反应者，如果该对象没有被鉴定为有风险或没有被诊断为患有DIC，则将该对象分类为对所述治疗的无反应者。

如第一、第二和第三方面或其任何实施方式中所示，测量步骤可以用允许对SEQID NO：1和/或SEQ ID NO：2的肽进行定量的任何分析技术来进行，其中优选质谱法。因此，虽然第四方面和任何以下实施方式具体涉及质谱法，但是应当理解，该技术可以被任何其他技术(例如放射免疫测定(RIA)、化学发光或比色酶联免疫吸附测定(ELISA)、免疫荧光测定(IFA)、斑点印迹、蛋白质印迹、流式细胞术、Luminex测定、ProQuantum免疫测定或优选地质谱)替代。

在本发明的上下文中，“有反应者”应理解为特定治疗引起待治疗疾病的结果改善的对象。“无反应者”是治疗不会引起任何预期改善或者可能甚至使对象的临床状况更糟的对象。

在该方面的优选实施方式中，在用重组蛋白C治疗对象之前、优选在用重组活化蛋白C治疗之前进行预后。

在另一个实施方式中，本发明还涉及SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：2的肽在从患有脓毒症或脓毒性休克的对象分离的一个或多个生物样本中的水平作为用于筛查有患弥散性血管内凝血(DIC)的风险的对象的生物标志物的体外用途。

在另一个实施方式中，本发明还涉及SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：2的肽在从有需要的对象分离的一个或多个生物样本中的水平作为用于预后患有脓毒症或脓毒性休克和弥散性血管内凝血(DIC)的对象对重组PROC、优选重组APC治疗的反应的生物标志物的体外用途。在优选的实施方式中，这种体外用途在用重组PROC、优选重组APC治疗对象之前进行。

组合物和试剂盒

如上所述，APC治疗用于不同的病理状况，例如脓毒症、脓毒性休克或中风。鉴于此，本发明的第五方面涉及包含重组蛋白C(rPROC)、优选重组活化蛋白C(rAPC)的组合物，其用于治疗其中内源性PROC和内源性APC水平降低至低于其生理水平的任何病理生理病况，其中该用途包括向根据如上定义的第四方面或其任何实施方式被分类为有反应者的对象施用所述组合物的步骤。优选地，待治疗的病理生理学病况是脓毒症、脓毒性休克、DIC或中风。

还优选地，第五方面涉及一种包含重组蛋白C(rPROC)、优选重组活化蛋白C(rAPC)的组合物，其用于治疗脓毒症或脓毒性休克或DIC，其中该用途包括向根据如上定义的第四方面或其任何实施方式被分类为有反应者的对象施用所述组合物的步骤。

在第六方面，本发明涉及包含重组蛋白C(rPROC)、优选重组活化蛋白C(rAPC)的组合物，其用于治疗以患有脓毒症或脓毒性休克和弥散性血管内凝血(DIC)为特征而被选择的患者。

在第七方面，本发明涉及适用于筛查或分类对象的脓毒症或脓毒性休克或DIC和/或适用于预测(预后)对象对重组蛋白C(rPROC)、优选活化蛋白C(rAPC)治疗的反应的试剂盒或装置，该试剂盒或装置包含SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：2的肽，其中所述肽优选地用至少一个或多个重氨基酸合成，并且其中优选在C端氨基酸残基用标签对所述肽进行标记。

该试剂盒还可以包含指示如何可使用该试剂盒内的材料的说明。

可选地(额外地)，试剂盒可以包括裂解酶，例如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、金黄色葡萄球菌(V8)蛋白酶、颌下蛋白酶、菠萝蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、天冬氨酸内肽酶和/或ArgC。试剂盒还可以包括化学试剂例如DTT或IAM，或用于化学生成蛋白衍生的多肽的其他化学试剂。

可选地，在酶促消化期间可以使用微波辅助消化，优选使用胰蛋白酶、ArgC和/或在消化后产生SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：2的肽的蛋白酶的任何组合，以加速肽的形成(PMuralidhar Reddy,et al.Digestion Completeness of Microwave-Assisted andConventional Trypsin-Catalyzed Reactions.Journal of the American Society forMass Spectrometry.Volume 21,Issue 3,March 2010,Pages 421–424)。该试剂盒可以含有胰蛋白酶、ArgC和/或在消化后产生SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：2的肽的蛋白酶的任何组合，以及用于SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：2最佳分析的特殊微波辅助消化方案。

本发明的第八方面涉及本发明第七方面或其任何实施方式中定义的试剂盒用于筛查或分类有患脓毒症、脓毒性休克或DIC的风险的对象或用于预测(预后)对象对重组蛋白C(rPROC)、优选重组活化蛋白C(rAPC)的反应的体外用途。根据第三方面或其任何实施方式，该试剂盒还可用于诊断患有DIC的患者。

本发明的第九方面涉及可直接加载到数字计算机的内部存储器中的计算机程序产品，该计算机程序产品包括用于执行以下步骤的软件代码部分：当所述产品在计算机上运行时，将来自有需要的对象的一个或多个生物样本的PROC、优选APC的水平或浓度与参考值进行比较，以及提供患脓毒症、脓毒性休克或DIC的风险或对重组PROC或APC治疗是有反应者/无反应者的预测。

本发明还包括以下条款或实施方式：

1.一种测量有需要的对象中蛋白C(PROC)、优选活化蛋白C(APC)的水平的基于质谱的方法，该方法包括：对从对象分离的一个或多个生物样本进行酶促消化的步骤；和通过使用质谱仪测量SEQ ID NO：1(LGEYDLR)的肽的水平的步骤，其中SEQ ID NO：1(LGEYDLR)的水平对应于所述一个或多个生物样本中存在的PROC、优选APC的水平。

2.根据1所述的基于质谱的方法，其中，用于酶促消化的酶是胰蛋白酶和/或ArgC，或在消化后产生SEQ ID NO：1的LGEYDLR肽的蛋白酶的任何组合。

3.根据1和2所述的基于质谱的方法，其中，通过加标带标记的SEQ ID NO：1(LGEYDLR)的蛋白特征性肽来进行SEQ ID NO：1(LGEYDLR)的肽的测量。

4.根据1至3中任一项所述的基于质谱的方法，其中，加标的带标记的SEQ ID NO：1(LGEYDLR)的蛋白特征性肽是用至少一个或多个重氨基酸合成的，并且其中优选在C端氨基酸残基中用标签对所述肽进行标记。

5.根据1至4所述的基于质谱的方法，其中，该方法还包括用还原剂还原一个或多个生物样本的步骤，以及用烷化剂将一个或多个生物样本烷基化的步骤，其中还原步骤和烷基化步骤都在酶促消化步骤之前进行。

6.根据1至5中任一项所述的基于质谱的方法，其中，一个或多个生物样本选自由血液、血清、血浆、唾液、尿液或脑脊液组成的组。

7.一种用于筛查或分类有患脓毒症或脓毒性休克的风险的对象的基于质谱的方法，该方法包括以下步骤：

i)通过执行1至6中任一项的方法来测量蛋白C(PROC)、优选活化蛋白C(APC)的水平，和

ii)将步骤i)中获得的水平与参考值进行比较，

8.根据7所述的基于质谱的方法，其中，步骤ii)的参考值是从健康对象或健康对象群体获得的，并且其中蛋白C、优选活化蛋白C的水平的统计学上显著的降低表明对象有患脓毒症或脓毒性休克的风险。

9.根据7和8中任一项所述的基于质谱的方法，其中，该方法进一步包括临床确认患者患有脓毒症或脓毒性休克的步骤。

10.一种用于筛查或分类有患弥散性血管内凝血(DIC)风险的对象的基于质谱的方法，其中，该对象已被诊断患有脓毒症或脓毒性休克，该方法包括以下步骤：

ii)将步骤i)中获得的水平与参考值进行比较，

11.根据10所述的基于质谱的方法，其中，步骤ii)的参考值是从患有脓毒症或脓毒性休克但未患有弥散性血管内凝血(DIC)的对象或对象群体获得的，并且其中蛋白C

(PROC)、优选活化蛋白C(APC)的水平的统计学上显著的降低表明对象有患DIC的风险。

12.根据10和11中任一项所述的基于质谱的方法，其中，该方法进一步包括临床确认患者患有弥散性血管内凝血的步骤。

13.一种用于预后有需要的对象对重组蛋白C(PROC)、优选重组活化蛋白C(APC)治疗的反应的基于质谱的方法，该方法包括以下步骤：

i)通过执行10至13中任一项的方法的每个步骤来筛查对象是否有患弥散性血管内凝血(DIC)的风险；

ii)如果该对象被鉴定为有风险或被诊断患有DIC，则将该对象分类为对所述治疗的有反应者，如果该对象没有被鉴定为有风险或没有被诊断为患有DIC，则将该对象分类为对所述治疗的无反应者。

14.根据13所述的方法，其中，预后在用重组蛋白C(rPROC)、优选重组活化蛋白C治疗对象之前进行。

15.一种包含重组蛋白C(rPROC)、优选重组活化蛋白C(rAPC)的组合物，用于治疗脓毒症、脓毒性休克或中风，其中该用途包括向根据13至14中任一项被分类为有反应者的对象施用所述组合物的步骤。

16.SEQ ID NO：1(LGEYDLR)的肽在从有需要的对象分离的一个或多个生物样本中的水平作为用于筛查有患脓毒症或脓毒性休克的风险的对象的生物标志物的体外用途。

17.SEQ ID NO：1(LGEYDLR)的肽在从患有脓毒症或脓毒性休克的对象分离的一个或多个生物样本中的水平作为用于筛查有患弥散性血管内凝血的风险的对象的生物标志物的体外用途。

18.SEQ ID NO：1(LGEYDLR)的肽在从有需要的对象分离的一个或多个生物样本中的水平作为用于预后患有脓毒症或脓毒性休克和弥散性血管内凝血(DIC)的对象对重组PROC、优选重组APC治疗的反应的生物标志物的体外用途。

以下实施例仅用于说明本发明但不限制本发明。

实施例

实施例1：方法

样本量

总共157份血浆样本分为如下4组：17份参考群体对照样本、17份无任何相关脓毒症过程的ICU对照样本、24份脓毒症病例和99份脓毒性休克病例。所有样本均从INCLIVA生物库的参考群体收集库和脓毒症收集库获得。

样本制备

为了制备样本和胰蛋白酶消化，测试了不同的方案。鉴于要缩短脓毒症血清分析所需的时间，我们优化了分析方案，包括用DTT还原和用胰蛋白酶进行微波消化。下面描述优化方法。

将血浆样本在15,000g下离心15分钟以脱脂。每个血浆样本2μL用8μL H2O稀释。将2μL的各1/5稀释的血浆(约25μg)与18μL 50mM Ba以及25fmol Heavy Mix肽混合，最终体积为20μL。半胱氨酸残基用2mM DTT(DL-二硫苏糖醇)在50mM ABC中的溶液在300W微波下还原3分钟。巯基用5mM IAM(碘乙酰胺)在50mM ABC中的溶液在暗处在室温下烷基化20分钟。用5μg(2.5μg/μl)测序级改良胰蛋白酶(Promega)在50mM ABC中的溶液在300W微波下对样本进行胰蛋白酶消化4分钟。用终浓度为1％的TFA(三氟乙酸)终止反应。

样本制备时间：45分钟。

质谱分析

MRM实验在配备有Micro M3 MicroLC色谱系统的5500QTRAP混合三重四极杆/线性离子阱质谱仪(SCIEX)上进行。将10μL胰蛋白酶消化物(约9μg蛋白质和25fmol每种加标肽)注入Trap柱(10X0.3mm Trap Cartridge Chromxp C18CL 5um，ABSCIEX)，然后上样并分离到分析柱上(ChromXP C18，3μm，150×0.3mm)。使用A中B占0至35％的线性梯度进行洗脱30分钟(A：0.1％FA；B：ACN，0.1％FA)，流速为5μl/min。

5500 QTRAP在MRM模式下运行。MRM数据以正向模式采集，喷雾电压为5500V，帘气：25psi，离子源气体：25psi，入口电势(EP)：10，出口电势(EXP)：16。先前对每个母子离子对(transition)的碰撞能量(CE)和去簇电压(DP)进行了优化。

使用Skyline 4.2.1.19058软件(MacCoss实验室)和估计的初始血清的轻浓度(fmol/μL)计算所有母子离子对的面积比(轻/重)。用于分析的重肽由CNB(CentroNacional de Biotecnología-CSIC)合成。

样本分析时间：30分钟。

用于定量各蛋白质的肽如下：

注意：在所有样本中同时测量组蛋白(H2B、H3和H4)和人活化蛋白C。

加标肽的线性评估

首先，将用于含有序列SEQ ID NO：1(LGEYDLR)和SEQ ID NO：2(TFVLNFIK)的APC的商业轻肽进行胰蛋白酶处理并在5600三重TOF(SCIEX，弗雷明汉，MA，USA)中使用LC-MS/MS_DDA进行分析，以鉴定那些具有良好信号的明确的肽。MRM参数在5500QTRAP仪器(SCIEX)中通过MRM-PILOT软件(SCUEX)进行优化，从而确定每个肽的去簇电压(DP)以及每个母子离子对的停留时间(DT)和碰撞能量(CE)。随后，选择具有大量可检测母子离子对、高灵敏度和高线性动态范围的肽进行MRM-MS实验。将选定的肽序列(SEQ ID NO：1(LGEYDLR)和SEQ IDNO：2(TFVLNFIK))制备为SpikeTidesTM_TQ(重同位素标记；Arg：13C6，15N4；Lys：Arg：13C6，15N2)(JPT Peptide Technologies,，柏林，德国)进行绝对定量。

ROC曲线

构建并分析接收者操作特征(ROC)曲线，以获得：用于诊断脓毒症过程和鉴定脓毒性休克病例中的DIC的APC生物标志物的曲线下面积(AUC)、截止值、灵敏度和特异性。AUC高于0.5(p＜0.05)被认为具有统计学意义。所有分析均使用GraPhad Prism v5进行。

统计学分析

计算每组研究中APC蛋白的统计学参数(平均值、标准差、最小值、最大值)。为了进行组间比较，对组间APC变量进行了第一正态性检验(Kolmogorov-Smirnov)。随后通过使用Mann Whitney U检验(用于两组)进行组间比较，Kruskal-Wallis检验与Dunn事后检验用于3个或更多个组之间进行比较。

为了评估APC值与其他临床和生化变量之间的相关性，我们计算了Spearman等级相关系数。

当检验的p值小于0.05时，差异和关联被认为是统计学显著的。所有分析均使用GraPhad Prism v5进行。

实施例2：活化蛋白C的所选肽的质谱线性。

使用APC整个序列的序列和生物信息学胰蛋白酶消化进行的初步探索性研究提供了几种候选肽。但最终决定使用LGEYDLR和TFVLNFIK这两种肽。这两种肽(下方以灰色标记)是由peptidecutter-ExPasy[https://web.expasy.org/cgi-bin/peptide_cutter/peptidecutter.pl]使用胰蛋白酶生成的，在位置54至60切割生成LGYDLR(SEQ ID NO：1)，在位置156至164切割生成TFVLNFIK(SEQ ID NO：2)。

APC的蛋白一级序列

链C(SEQ ID NO：5)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/1AUT_C)

链L(SEQ ID NO：6)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/1AUT_L)

如上所述绘制校准曲线。根据校准曲线中获得的结果，选择LGEYDLR作为定量的优选肽，因为该肽比TFVLNFIK显示出更好的线性(图1)。

值得注意的是，LGEYDLR和TFVLNFIK肽均可用于测量PROC和APC的内源性和重组形式(Xigris和3K3A-APC)。

为了进一步证实肽LGEYDLR比其他肽表现出更好的线性，特别是在较低浓度的PROC或APC下(这是患有更严重脓毒症的对象的情况)，进行了类似的实验，将LGEYDLR和TFVLNFIK与新肽SEQ ID NO：7：ANSFLEELR进行了比较。结果如图5所示。可以看出，当测试较低浓度(1fmol/μl至10fmol/μl)时，ANSFLEELR不具有线性，并且唯一适合测量这些范围内的PROC和/或APC水平的肽是LGEYDLR。

实施例3：脓毒症过程的诊断。

APC在群体和脓毒症对照组中呈正态分布，在脓毒性休克和ICU对照组中不呈正态分布。对于要进行的所有对比，将使用非参数测试，当数据表现非正态时，非参数测试更加稳固。

计算每个研究组中APC浓度(ng/mL)的描述性统计。表2示出了病例(脓毒性休克+脓毒症)和对照(参考群体+ICU非脓毒症患者)中获得的值。

之后，我们计算了分析的每个亚组中APC浓度(ng/mL)的统计学参数(表3)。

接下来，比较不同研究组之间的APC浓度，以确定所发现值的统计学上显著的差异。

对于病例和对照之间的比较，使用Mann Whitney U检验，p＜0.0001表明观察到的差异是统计学显著的。对于4个研究组之间的对比，使用相当于ANOVA参数检验的Kruskal-Wallis检验。该检验显示p＜0.0001的值，表明不同研究组之间的PCA水平存在统计学上显著的差异。

在以下比较中发现了统计学上显著的差异：

-休克与ICU对照(p＜0.001)，休克与参考群体(p＜0.0001)

-脓毒症与ICU对照(p＜0.0001)，脓毒症与参考群体(p＜0.0001)

从这些结果可以推断，APC可用于对脓毒性过程相比于对照进行诊断。

实施例4：APC与其他临床和分析参数的相关性。

APC和/或PROC水平的分析被认为是本发明的一部分，用于制备用于脓毒症或脓毒性休克的诊断和预后的体外诊断测试。因此，准备了其中的一些临床和生化参数也从患者那里获得的数据库。接下来，我们对APC与研究过程中获得的其他临床变量进行相关性分析，以找出哪些其他参数与APC相关。结果如图2和图3所示。

在ICU对照组中，APC水平与功能性蛋白C值呈现显著相关性(rho Spearman0.882，p＜0.0001)。功能性蛋白C是通过使用Instrumentation Laboratory(A WerfenCompany)的HemosIL(R)Protein C试剂盒从巴伦西亚大学医院(Hospital UniversitarioClínico de Valencia)的临床实验室获得的。

在脓毒症组中，APC与以下各项显著相关：组蛋白H2B(Spearman's Rho 0.469，p＝0.021)、PCT(Spearman's Rho 0.468，p＝0.021)、快速指数(Spearman's Rho 0.514，p＝0.010)、功能性蛋白C(Spearman's Rho 0.900，p＝0.037)。

在脓毒性休克病例组中，APC与以下各项显著相关：血小板(Spearman'sRho0.374，p＝0.0001)、快速指数(Spearman's Rho 0.302，p＝0.003)、活化部分凝血活酶时间(Spearman'sRho-0.267，p＝0.026)、D-二聚体(Spearman's Rho-0.437，p＝0.002)和功能性蛋白C(Spearman'sRho 0.900，p＜0.0001)。

功能性蛋白C的参考值在70％至140％之间。需要强调的是，功能性蛋白C缺乏会增加DIC(弥散性血管内凝血)的风险，例如在脓毒症存在的情况下。

接下来，我们探讨了我们研究中包括的不同脓毒症和脓毒性休克患者的血浆中APC的水平(ng/mL)，我们发现诊断为DIC的患者(DIC组)的PROC/APC平均水平低于那些没有表现出这种临床功能障碍(无DIC)的患者(图4)。为了评估APC在脓毒性过程中预测DIC的潜力，临床医生查阅了临床变量，以便将脓毒症患者分类为DIC或非DIC。如图4所示，与没有DIC的对象的平均水平(平均600ng/ml)相比，诊断为DIC的患者样本中的APC平均水平(平均值468ng/ml)在统计学上降低(p＝0.0014)。基于本发明的这种分类允许通过使用凭借本发明方法的APC测量来鉴定14名患有DIC的患者和85名没有患有DIC的患者。构建并分析相应的ROC曲线(参见实施例7)。

这些发现非常重要，因为在Papageorgiou et al.,2018[Papageorgiou C,etal.Disseminated Intravascular Coagulation:An Update on Pathogenesis,Diagnosis,and Therapeutic Strategies.Clin Appl Thromb Hemost.2018；24(9_suppl):8S-28S.doi:10.1177/1076029618806424]进行的研究中证明，APC治疗降低了重度脓毒症患者的28天死亡率，包括回顾性分配至脓毒症相关DIC亚组的患者。有趣的是，APC治疗对其他患者组没有任何积极作用，这表明只有患有DIC的脓毒症患者才会受益于使用APC治疗(即Xigris或其他rhAPC)。在该研究中，还发现APC治疗增加了脓毒症患者的出血风险，因此准确诊断脓毒症并同时测量内源性APC水平非常重要。更重要的是，使用不具有出血能力的APC衍生物在脓毒症患者的治疗中将是最重要的。

实施例5：用于筛查脓毒症过程(脓毒症或脓毒性休克)相比于对照的ROC曲线。

为了评估APC在脓毒性过程相比于对照(参考群体+ICU对照)中的筛查潜力，构建并分析了相应的ROC曲线。

[1]简单诊断测试

置信度：95.0％

参考测试

由此可以看出，根据我们统计学分析中获得的灵敏度值和特异性值，基于PROC/APC生物标志物的测试是可靠的。本发明的方法能够正确分类79.5％的脓毒性病例(脓毒症或脓毒性休克)和97.06％的对照。

在这方面，当获得测试阳性结果(PPV 98.98)时，预测值可以被认为是可接受的，并且对于分类来说是可靠的。

这些结论得到远大于1的阳性似然比和远非1的阴性似然比的支持。

实施例6：用于筛查脓毒性过程(脓毒症或脓毒性休克)相比于ICU对照的ROC曲线。

为了评估APC在脓毒症过程相比于三级医院ICU中的ICU对照的诊断潜力，构建并分析了相应的ROC曲线。

/>

简单诊断测试

置信度：95.0％

参考测试

由此可以看出，根据我们统计学分析中获得的灵敏度值和特异性值，基于PROC/APC生物标志物的测试是可靠的。该测试能够正确分类79.5％的脓毒性病例和94.12％的对照。

实施例7：对有患DIC风险的患者进行分类的ROC曲线。

为了评估APC在脓毒性过程中预测DIC的潜力，临床医生查阅了临床变量，以便将脓毒症患者分类为DIC或非DIC。这种分类允许通过使用凭借MS的APC测量来鉴定14名患有DIC的患者和85名没有患有DIC的患者。构建并分析相应的ROC曲线。

由此可以看出，根据我们统计学分析中获得的灵敏度值和特异性值，基于PROC/APC蛋白水平的测量的方法是可靠的。该测试能够正确分类71.4％的DIC病例和71.4％的对照。

实施例7：在具有低浓度PROC或APC的患者中测量PROC或APC。

如上所述，与SEQ ID NO：2或7相比，SEQ ID NO：1的肽与PROC或APC水平的相关性更好，特别是当所述蛋白质的浓度低于100fmol/μl样本时。为了证实SEQ ID NO：1在该患者组中的效用，测量了健康对照和脓毒症、脓毒性休克或DIC患者的PROC或APC水平。表6中所示的结果表明所有测试的患者(健康和脓毒性)的PROC或APC水平均低于SEQ ID NO：2或7的检测限，即低于100fmol/μl。其中，66名患者患有脓毒性休克，这66名患者中9名患有DIC。由于所有测量值均低于100fmol/μl，因此在该队列研究中唯一可用于准确测量所述蛋白水平的肽是SEQ ID NO：1。

表6：在对照以及脓毒症和脓毒性休克患者中测量的APC值。

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根据该表，可以得出结论，肽LGEYDLR能够检测非常低浓度的PROC或APC。

序列表

<110> 生物医学网络研究财团中心（CIBER）

瓦伦西亚大学

因西里瓦健康研究所

<120> 蛋白C和活化蛋白C的测量方法

<130> 906 942

<150> EP21 382 173.9

<151> 2021-03-01

<160> 7

<170> BiSSAP 1.3.6

<210> 1

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 活化蛋白C

<400> 1

Leu Gly Glu Tyr Asp Leu Arg

1 5

<210> 2

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 活化蛋白C

<400> 2

Thr Phe Val Leu Asn Phe Ile Lys

1 5

<210> 3

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 组蛋白H2B

<400> 3

Leu Leu Leu Pro Gly Glu Leu Ala Lys

1 5

<210> 4

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 组蛋白H3

<400> 4

Ser Thr Glu Leu Leu Ile Arg

1 5

<210> 5

<211> 250

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<223> APC链C的蛋白一级序列

<400> 5

Leu Ile Asp Gly Lys Met Thr Arg Arg Gly Asp Ser Pro Trp Gln Val

1 5 10 15

Val Leu Leu Asp Ser Lys Lys Lys Leu Ala Cys Gly Ala Val Leu Ile

20 25 30

His Pro Ser Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys Met Asp Glu Ser Lys

35 40 45

Lys Leu Leu Val Arg Leu Gly Glu Tyr Asp Leu Arg Arg Trp Glu Lys

50 55 60

Trp Glu Leu Asp Leu Asp Ile Lys Glu Val Phe Val His Pro Asn Tyr

65 70 75 80

Ser Lys Ser Thr Thr Asp Asn Asp Ile Ala Leu Leu His Leu Ala Gln

85 90 95

Pro Ala Thr Leu Ser Gln Thr Ile Val Pro Ile Cys Leu Pro Asp Ser

100 105 110

Gly Leu Ala Glu Arg Glu Leu Asn Gln Ala Gly Gln Glu Thr Leu Val

115 120 125

Thr Gly Trp Gly Tyr His Ser Ser Arg Glu Lys Glu Ala Lys Arg Asn

130 135 140

Arg Thr Phe Val Leu Asn Phe Ile Lys Ile Pro Val Val Pro His Asn

145 150 155 160

Glu Cys Ser Glu Val Met Ser Asn Met Val Ser Glu Asn Met Leu Cys

165 170 175

Ala Gly Ile Leu Gly Asp Arg Gln Asp Ala Cys Glu Gly Asp Ser Gly

180 185 190

Gly Pro Met Val Ala Ser Phe His Gly Thr Trp Phe Leu Val Gly Leu

195 200 205

Val Ser Trp Gly Glu Gly Cys Gly Leu Leu His Asn Tyr Gly Val Tyr

210 215 220

Thr Lys Val Ser Arg Tyr Leu Asp Trp Ile His Gly His Ile Arg Asp

225 230 235 240

Lys Glu Ala Pro Gln Lys Ser Trp Ala Pro

245 250

<210> 6

<211> 114

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<223> APC链L的蛋白一级序列

<220>

<221> VARIANT

<222> 30

<223> x = non_std_residue="BHD

<400> 6

Ser Lys His Val Asp Gly Asp Gln Cys Leu Val Leu Pro Leu Glu His

1 5 10 15

Pro Cys Ala Ser Leu Cys Cys Gly His Gly Thr Cys Ile Xaa Gly Ile

20 25 30

Gly Ser Phe Ser Cys Asp Cys Arg Ser Gly Trp Glu Gly Arg Phe Cys

35 40 45

Gln Arg Glu Val Ser Phe Leu Asn Cys Ser Leu Asp Asn Gly Gly Cys

50 55 60

Thr His Tyr Cys Leu Glu Glu Val Gly Trp Arg Arg Cys Ser Cys Ala

65 70 75 80

Pro Gly Tyr Lys Leu Gly Asp Asp Leu Leu Gln Cys His Pro Ala Val

85 90 95

Lys Phe Pro Cys Gly Arg Pro Trp Lys Arg Met Glu Lys Lys Arg Ser

100 105 110

His Leu

<210> 7

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 活化蛋白C

<400> 7

Ala Asn Ser Phe Leu Glu Glu Leu Arg

1 5

Claims

1.一种用于筛查或分类有患脓毒症或脓毒性休克的风险的对象的基于质谱的方法，所述方法包括以下步骤：

ii)将步骤i)中获得的水平与参考值进行比较，

其中所述参考值为1431.57ng/mL，并且其中至少40％的降低表明所述对象有患脓毒症或脓毒性休克的风险。

2.根据权利要求1所述的基于质谱的方法，其中，所述方法进一步包括临床确认患者患有脓毒症或脓毒性休克的步骤。

3.一种用于筛查或分类有患弥散性血管内凝血(DIC)的风险的对象的基于质谱的方法，其中，所述对象已被诊断患有脓毒症或脓毒性休克，所述方法包括以下步骤：

ii)将步骤i)中获得的水平与参考值进行比较，

其中所述参考值为600ng/mL，并且其中至少20％的降低表明所述对象有患DIC的风险。

4.根据权利要求3所述的基于质谱的方法，其中，所述方法进一步包括临床确认患者患有弥散性血管内凝血的步骤。

5.根据前述权利要求中任一项所述的基于质谱的方法，其中，用于所述酶促消化的酶是胰蛋白酶和/或ArgC，或在消化后产生SEQ ID NO：1的LGEYDLR肽的蛋白酶的任何组合。

6.根据前述权利要求中任一项所述的基于质谱的方法，其中，通过加标带标记的SEQID NO：1(LGEYDLR)的蛋白特征性肽来进行SEQ ID NO：1(LGEYDLR)的肽的测量。

7.根据前述权利要求中任一项所述的基于质谱的方法，其中，加标的带标记的SEQ IDNO：1(LGEYDLR)的蛋白特征性肽是用至少一个或多个重氨基酸合成的，并且其中优选在C端氨基酸残基中用标签对所述肽进行标记。

8.根据前述权利要求中任一项所述的基于质谱的方法，其中，所述方法还包括用还原剂还原所述一个或多个生物样本的步骤，以及用烷化剂将所述一个或多个生物样本烷基化的步骤，其中还原步骤和烷基化步骤都在酶促消化步骤之前进行。

9.根据前述权利要求中任一项所述的基于质谱的方法，其中，所述一个或多个生物样本选自由血液、血清、血浆、唾液、尿液或脑脊液组成的组。

10.一种用于预后有需要的对象对重组蛋白C(PROC)、优选重组活化蛋白C(APC)治疗的反应的基于质谱的方法，所述方法包括以下步骤：

i)通过执行权利要求3至9中任一项所述的方法的每个步骤来筛查所述对象是否有患弥散性血管内凝血(DIC)的风险；

ii)如果所述对象被鉴定为有患DIC的风险或被诊断患有DIC，则将所述对象分类为对所述治疗的有反应者，如果所述对象没有被鉴定为有患DIC的风险或没有被诊断为患有DIC，则将所述对象分类为对所述治疗的无反应者。

11.根据权利要求10所述的方法，其中，所述预后在用重组蛋白C(rPROC)、优选重组活化蛋白C治疗所述对象之前进行。

12.一种包含重组蛋白C(rPROC)、优选重组活化蛋白C(rAPC)的组合物，用于治疗脓毒症、脓毒性休克或中风，其中所述用途包括向根据权利要求10或11中任一项所述被分类为有反应者的对象施用所述组合物的步骤。

13.SEQ ID NO：1(LGEYDLR)的肽在从有需要的对象分离的一个或多个生物样本中的水平作为用于筛查有患脓毒症或脓毒性休克的风险的对象的生物标志物的体外用途。

14.SEQ ID NO：1(LGEYDLR)的肽在从患有脓毒症或脓毒性休克的对象分离的一个或多个生物样本中的水平作为用于筛查有患弥散性血管内凝血的风险的对象的生物标志物的体外用途。

15.SEQ ID NO：1(LGEYDLR)的肽在从有需要的对象分离的一个或多个生物样本中的水平作为用于预后患有脓毒症或脓毒性休克和弥散性血管内凝血(DIC)的对象对重组PROC、优选重组APC治疗的反应的生物标志物的体外用途。