BR112020015168A2 - Composição compreendendo novas cepas de lactobacillus salivarius e método para a prevenção e o tratamento de otite e infecções das vias aéreas superiores - Google Patents

Abstract

uma cepa de lactobacillus salivarius como um produto probiótico e o seu uso no tratamento e/ou na prevenção de otite e infecções das vias aéreas superiores.

Description

“COMPOSIÇÃO COMPREENDENDO NOVAS CEPAS DE LACTOBACILLUS SALIVARIUS E MÉTODO PARA A PREVENÇÃO E O TRATAMENTO DE OTITE E INFECÇÕES DAS VIAS AÉREAS SUPERIORES” CAMPO DA INVENÇÃO

[0001] A invenção refere-se ao campo de cepas probióticas, em particular a novas cepas probióticas de Lactobacillus salivarius, às composições que as compreendem, sua obtenção e seu uso para a prevenção e o tratamento de doenças, em particular otite e infecções das vias aéreas superiores.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0002] A otite média aguda (OMA) é uma das infecções bacterianas mais comuns e o principal motivo para o tratamento com antibióticos na infância (Hendley, 2002). A trompa de Eustáquio é mais curta nas crianças do que nos adultos, o que permite a fácil entrada de bactérias e vírus no ouvido médio, resultando em otite média aguda. As bactérias, como a Streptococcus pneumoniae (strep) e a Hemophilus influenzae (H. flu), são responsáveis por cerca de 85% dos casos de otite média aguda e os vírus os 15% restantes. Aproximadamente 70% das crianças experimentam pelo menos um episódio de otite aos 2 anos de idade e 20 a 30% sofrem de OMA recorrente (Pichichero, 2000). A OMA recorrente (rOMA) causa desconforto nas crianças e em suas famílias e representa um ônus econômico para a sociedade (Klein, 2001).

[0003] As infecções das vias aéreas superiores (IVAS), também conhecidas como o resfriado comum, são uma das doenças mais comuns, levando a mais visitas de profissionais de saúde e ausências na escola e no trabalho do que qualquer outra doença, a cada ano. A maioria das crianças com menos de 2 anos experimenta várias IVASs durante o primeiro ano de vida e um quarto sofre de infecções recorrentes ou prolongadas nos países desenvolvidos. Causados por um vírus que inflama as membranas no revestimento do nariz e da garganta, os resfriados podem ser o resultado de mais de 200 vírus diferentes. No entanto, entre todos os vírus do resfriado, os rinovírus causam a maioria dos resfriados. Os outros tipos de vírus incluem o coronavírus, o parainfluenza, o adenovírus, o enterovírus e o vírus sincicial respiratório. Os vírus causam uma reação imune. Por sua vez, isso causa aumento na produção de muco, inchaço do revestimento do nariz, dificultando a respiração e causando congestão, espirro e tosse devidos ao aumento de muco que escorre pela garganta. As infecções das vias aéreas superiores também são um importante fator de risco para otite média aguda.

[0004] IVASs levam à prescrição inadequada de antibióticos na prática pediátrica, porque os antibióticos não são eficazes contra os vírus. O uso inadequado e amplo de antibióticos pode levar ao desenvolvimento de resistência bacteriana e perturbar o equilíbrio normal da microbiota humana, facilitando a colonização de patógenos e reduzindo a disponibilidade de vacinas contra os vírus.

[0005] Da mesma forma, o tratamento com antibióticos e a profilaxia contra a recorrência da OMA inevitavelmente levam ao desenvolvimento de microrganismos resistentes a antibióticos e distúrbios no equilíbrio da microbiota normal do trato respiratório superior, o que facilita ainda mais a colonização de patógenos (Brook e

Gober, 2000).

[0006] Os probióticos são definidos pela Organização Mundial da Saúde como microrganismos vivos que, quando administrados em quantidades adequadas, conferem ao hospedeiro um benefício à saúde. Os probióticos mais comumente usados são as espécies Lactobacillus e Bifidobacterium, seguidas pelos gêneros Streptococcus, Enterococcus, Propionibacterium, Bacillus e Escherichia coli. Além disso, algumas espécies de leveduras são usadas como probióticos, por exemplo, a Saccharomyces boulardii e a Saccharomyces cerevisiae são frequentemente usadas para tratar os distúrbios gastrointestinais. Os produtos probióticos podem ser formulados como cápsulas, comprimidos, pós (que são regulados como um suplemento dietético) e um ingrediente alimentar (por exemplo, iogurtes, kefirs) ou como um fármaco. Os probióticos podem exercer uma ampla gama de efeitos benéficos, como equilibrar a microbiota intestinal do hospedeiro e interagir com o sistema imunológico inato e adaptativo, o que pode promover resistência contra patógenos.

[0007] Nos últimos anos, os probióticos têm sido amplamente utilizados em condições de saúde de infecções respiratórias, gastrointestinais e do trato urogenital, alergias, enterocolite necrosante em prematuros, cólicas infantis, doenças autoimunes e síndrome do intestino irritável (SII). As terapias probióticas oferecem uma opção atraente para restabelecer o equilíbrio microbiano e prevenir doenças infecciosas, incluindo a otite (Niittynen et al., 2012). Os mecanismos dos probióticos que contribuem para a interferência microbiana com os patógenos podem incluir a competição por nutrientes essenciais e locais de adesão sobre a superfície epitelial, a produção de bacteriocinas e outras substâncias inibidoras e o aumento da imunidade mucosa e sistêmica (Popova et al., 2012).

[0008] O WO2006/007526 descreve um método para o tratamento ou a prevenção de infecções respiratórias e otite média aguda em bebês, compreendendo a administração de uma cepa de Bifidobacteria e um probiótico promotor da adesão, como uma espécie de Lactobacillus.

[0009] O WO2016/0077190 descreve o uso de espécies de Lactobacillus em uma composição para a administração respiratória para prevenir as sequelas inflamatórias patogênicas de infecções por vírus respiratórios.

[0010] O WO2015/093937 descreve o uso de uma cepa de Lactobacillus salivarius para o tratamento de mastite.

[0011] A otite, em particular a Otite Média Aguda (OMA), e a Infecção das Vias Aéreas Superiores (IVAS) são um problema de saúde generalizado entre as crianças pequenas, e são urgentemente necessárias estratégias de prevenção e tratamento. Os estudos anteriores mostraram que os probióticos reduzem a ocorrência de IVASs e OMA em crianças saudáveis, porém as mesmas cepas não conseguiram prevenir tais condições ou reduzir o transporte nasofaríngeo de patógenos causais em crianças altamente propensas à otite. Portanto, há necessidade por novos tratamentos de otite e infecções das vias aéreas superiores, particularmente em crianças propensas à otite.

BREVE DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

[0012] Nós isolamos e caracterizamos uma cepa probiótica de Lactobacillus salivarius, isolada de um suabe vaginal de uma mulher saudável, útil para a prevenção e/ou o tratamento de otite e outras condições do trato respiratório superior, como as infecções das vias aéreas superiores. Como mostrado nos exemplos, a cepa de Lactobacillus salivarius PS7 da invenção é capaz de reduzir a ocorrência de episódios de otite média aguda (OMA) em crianças que sofrem de OMA recorrente (crianças propensas à otite) e/ou o transporte pelo canal auditivo externo de patógenos da otite, mostrando um alto potencial para a prevenção em uma população altamente predisposta. A cepa de Lactobacillus salivarius PS7 foi depositada e recebeu o número de acesso CECT9422.

[0013] Em um aspecto, a presente invenção é dirigida a uma cepa de Lactobacillus salivarius PS7 ou uma cepa tendo pelo menos 95 % de identidade com essa cepa, ou suas cepas mutantes, em que as cepas mutantes são obtidas usando a cepa depositada como material de partida, e em que as cepas mutantes conservam ou melhoram ainda mais a atividade da cepa de Lactobacillus salivarius PS7 no tratamento de prevenção da otite e das infecções das vias aéreas superiores. De preferência, a cepa tem pelo menos 97% de identidade com a cepa de Lactobacillus salivarius PS7.

[0014] Em outro aspecto, a cepa é Lactobacillus salivarius PS7.

[0015] A invenção também é dirigida a uma composição compreendendo uma cepa como definida acima, e seu uso como um probiótico.

[0016] Em outro aspecto, a invenção é dirigida às cepas ou à composição, conforme definidas acima, para a prevenção e/ou o tratamento de Otite ou Infecções das Vias Aéreas Superiores (IVAS), preferivelmente no tratamento e/ou na prevenção de Otite Média Aguda (OMA).

[0017] As cepas e as composições da invenção são especialmente úteis para o tratamento e/ou a prevenção de Otite ou Infecções das Vias Aéreas Superiores em crianças propensas à otite.

[0018] Em outro aspecto, a invenção é dirigida aos produtos farmacêuticos compreendendo uma quantidade efetiva das cepas conforme definidas anteriormente, juntamente com excipientes farmaceuticamente aceitáveis.

[0019] Em outro aspecto, a invenção é dirigida a um produto comestível que compreende uma quantidade efetiva da cepa como definida acima, juntamente com outros ingredientes comestíveis. De preferência, o produto comestível é selecionado a partir de um suplemento dietético, um nutracêutico ou um produto lácteo.

FIGURAS Figura 1.- Ensaio de PCR para a detecção do gene estrutural da bacteriocina Abp118. Caminho 1: marcador (Hyperladder® 100 pb, BIOLINE). Caminho 2: controle positivo. Caminho 3: controle negativo. Caminhos 4, 5 e 6: L. salivarius PS7. Figura 2.- Estabilidade das culturas de L. salivarius PS7 liofilizadas (linha vermelha) quando armazenadas na temperatura ambiente. Figura 3.- Estabilidade das culturas de L. salivarius PS7 liofilizadas quando armazenadas a 4ºC.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO Definições

[0020] Na presente descrição: O termo "probiótico" significa um microrganismo que exerce efeitos benéficos sobre a saúde do hospedeiro. Ele pode ser um suplemento ou medicamento alimentado microbiano vivo que afeta beneficamente o hospedeiro melhorando o seu equilíbrio microbiano, uma preparação microbiana que contém bactérias vivas ou mortas ou uma combinação de ambos.

[0021] O termo "cepa" é bem conhecido no campo e significa uma variante ou subtipo genético de um microrganismo. Uma "Cepa mutante" é diferente do tipo selvagem por uma ou mais características (novas) conforme causadas por mutação(ões).

[0022] O termo "Otite" significa uma inflamação do ouvido. No caso da Otite Média, há uma inflamação do ouvido médio caracterizada pelo acúmulo de líquido infectado no ouvido médio, inchaço do tímpano, dor no ouvido e, se o tímpano for perfurado, drenagem de material purulento (pus) para o canal do ouvido.

[0023] O termo "Infecção das Vias Aéreas Superiores" significa uma infecção da parte superior do sistema respiratório que está acima dos pulmões. Uma infecção das vias aéreas superiores pode ser causada por qualquer número de infecções virais ou bacterianas. Essas infecções podem afetar a garganta (faringite), a nasofaringe (nasofaringite), os seios (sinusite), a laringe (laringite), a traqueia (traqueíte) ou os brônquios (bronquite).

[0024] O termo "quantidade efetiva", como utilizado neste documento, significa uma quantidade de um agente ativo alta o suficiente para proporcionar o benefício desejado, porém baixa o suficiente para evitar efeitos colaterais sérios. Cepa probiótica PS7

[0025] A cepa de Lactobacillus salivarius de acordo com a invenção é referida como Lactobacillus salivarius PS7 ou L. salivarius PS7. A cepa L. salivarius PS7 foi depositada pela Probisearch SLU, Calle Santiago Grisolía 2, Tres Cantos, Espanha, em conformidade com o Tratado de Budapeste sobre o Reconhecimento Internacional do Depósito de Microrganismos para o Propósito de Procedimento de Patente, na Colección Española de Cultivos Tipo (CECT), em 18 de julho de 2017 e recebeu o Número de Acesso CECT9422.

[0026] A presente invenção também se refere às cepas de L. salivarius tendo pelo menos 95% de identidade com a sequência de rRNA 16S da cepa de L. salivarius PS7, que é descrita nos exemplos (referência Stackebrandt e Goebel, 1994: “Taxonomic Note: A Place for DNA-DNA Reassociation and 16s rRNA Sequence Analysis in the Present Species Definition in Bacteriology”, Int. J. Syst. Bacteriol. 44:846-849).

[0027] Em uma modalidade preferida, a cepa de acordo com a presente invenção tem pelo menos 97 % de identidade com a sequência de rRNA 16S da cepa de L. salivarius PS7, mais preferivelmente pelo menos 98 % de identidade, mais preferivelmente pelo menos 99 % de identidade. Em outra modalidade preferida, a cepa de acordo com a presente invenção tem 100 % de identidade com a sequência de rRNA 16S do L. salivarius PS7, isto é, a cepa de acordo com a presente invenção é a cepa de Lactobacillus salivarius PS7.

[0028] A partir da cepa de Lactobacillus salivarius PS7 depositada, o especialista na técnica pode rotineiramente, por técnicas convencionais de mutagênese ou isolamento novamente, obter outros mutantes ou derivados dela que conservem as características e vantagens relevantes descritas neste documento da cepa PS7. Portanto, as cepas mutantes de Lactobacillus salivarius PS7 também fazem parte da invenção. No contexto da presente invenção, o termo "um mutante dela" refere-se às cepas mutantes obtidas utilizando as cepas depositadas como material de partida, as referidas cepas mutantes conservando ou melhorando as propriedades terapêuticas das cepas de origem. O especialista na técnica decidirá sobre o método adequado a ser empregado para determinar a atividade terapêutica das cepas, em particular o tratamento e/ou a prevenção de Otite e Infecções das Vias Aéreas Superiores, como os descritos nos exemplos do presente pedido.

[0029] As cepas da invenção, como demonstrado nos exemplos, são altamente resistentes às condições do ambiente gastrointestinal de mamíferos (ambiente ácido, altas concentrações de lisozima, sal biliar e peróxido de oxigênio), sendo assim capazes de sobreviver à passagem através do TGI. As cepas também têm boa adesão ao epitélio intestinal, o que lhes permite permanecer no trato intestinal e exercer os seus efeitos probióticos.

[0030] Na presente invenção, são preferidos os microrganismos vivos, conforme definidos acima, pois eles produzem uma série completa de antígenos, reproduzem-se para aumentar o número de tais organismos no ambiente intestinal ou em outros tecidos do corpo para promover a interação da mucosa e podem aderir ao intestino ou a outros tecidos do corpo para estimular melhor uma resposta imune da mucosa. Composição

[0031] De preferência, a cepa de L. salivarius PS7 da invenção, ou as suas cepas mutantes, está compreendida em uma composição, tal como uma composição nutricional, um suplemento nutricional, uma composição farmacêutica ou uma composição nutracêutica, preferivelmente uma composição nutricional ou um suplemento nutricional ou um medicamento. De preferência, a composição da invenção compreende a cepa de L. salivarius PS7 da invenção ou as suas cepas mutantes e um veículo ou excipiente fisiologicamente aceitável e/ou outros ingredientes, como descrito mais adiante. De preferência, a cepa de L. salivarius de acordo com a invenção está presente na forma liofilizada.

[0032] Qualquer excipiente ou veículo fisiologicamente aceitável, como conhecido na técnica, pode ser usado. Os excipientes ou os veículos adequados incluem, porém não estão limitados à, água, glicose, lactose, sacarose, manitol, maltodextrina, amido (resistente), celulose ou derivados de celulose, por exemplo, metilcelulose, estearato de magnésio, ácido esteárico, sacarina de sódio, talco, carbonato de magnésio e similares.

[0033] A composição de acordo com a invenção pode compreender outros probióticos, além da cepa de L. salivarius PS7 ou de suas cepas mutantes, como descrito acima. Os probióticos têm efeitos benéficos sobre o sistema imunológico, portanto, a combinação com probióticos terá um efeito superior sobre o sistema imunológico. De preferência, os probióticos adicionais são selecionados do grupo que consiste em Lactobacillus e Bifidobacterium.

[0034] A composição da presente invenção pode ainda conter prebióticos. Os prebióticos podem apoiar o crescimento dos probióticos, antes que eles se tornem não replicantes. Um "prebiótico" significa substâncias alimentícias não digeríveis que promovem o crescimento de microrganismos benéficos à saúde e/ou probióticos nos intestinos. Eles não são decompostos no estômago e/ou no intestino superior ou absorvidos no trato GI da pessoa que os ingere, porém são fermentados pela microbiota gastrointestinal e/ou pelos probióticos. De preferência, eles podem ser selecionados do grupo que consiste em oligossacarídeos, opcionalmente contendo frutose, galactose, manose; fibras dietéticas, em particular fibras solúveis, fibras de soja; inulina; ou suas misturas. Os prebióticos preferidos são os fruto-oligossacarídeos, galacto-oligossacarídeos, isomalto-oligossacarídeos, xilo- oligossacarídeos, arabino-xilo oligossacarídeos, mananoligossacarídeos, oligossacarídeos de soja, glicosilssacarose, lactossacarose, lactulose, palatinoseoligossacarídeos, maltoligossacarídeos, suas gomas e/ou hidrolisados, suas pectinas e/ou hidrolisados.

[0035] A quantidade efetiva de unidades formadoras de colônias (ufc) para cada cepa na composição da invenção será determinada pelo perito e dependerá da formulação final. Por exemplo, em produtos comestíveis, a cepa da invenção está presente em uma quantidade de cerca de 105 ufc/g a cerca de 1012 ufc/g, preferivelmente em uma quantidade de cerca de 107 ufc/g a cerca de 1012 ufc/g, mais preferivelmente em uma quantidade de cerca de 109 ufc/g a cerca de 1012 ufc/g. Todas as quantidades são expressas em gramas de peso seco.

[0036] O termo UFC refere-se a "Unidades Formadoras de Colônias". A quantificação das bactérias em uma determinada amostra é obtida rotineiramente contando o número total de unidades formadoras de colônias (UFCs) cultivadas sobre uma placa de ágar a partir de diluições em série, expressas como UFC por grama ou mL da amostra original. Isso produz uma estimativa do número de células presentes com base em uma interpretação hábil do número de colônias sobre uma placa.

[0037] Em uma modalidade preferida, a composição de acordo com a invenção é uma composição nutricional ou um suplemento nutricional. O suplemento de acordo com a invenção pode estar na forma de um pó, um comprimido (incluindo um comprimido mastigável) ou uma cápsula. A composição nutricional de acordo com a invenção pode ser qualquer produto alimentar ou bebida. De preferência, a composição, especialmente o suplemento nutricional, de acordo com a invenção, compreende ainda um excipiente ou veículo fisiologicamente aceitável. Em uma modalidade preferida, a composição ou o suplemento é um pó, acondicionado no recipiente (preferivelmente um sachê) compreendendo 1 a 10 g, mais preferivelmente 1,5 a 7 g,

mais preferivelmente 2 a 5 g. De preferência, cada recipiente contém uma dose única.

[0038] Se a composição de acordo com a invenção for usada como um suplemento dietético, ela pode ser administrada sozinha, pode ser misturada com um líquido bebível adequado, como a água, o iogurte, o leite ou o suco de frutas, ou pode ser misturada com alimentos sólidos ou líquidos. Neste contexto, o suplemento dietético pode estar na forma de comprimidos, pílulas, cápsulas, grânulos, pós, suspensões, sachês, pastilhas, doces, barras, xaropes e formas de administração correspondentes, normalmente na forma de uma dose unitária. Modo de administração

[0039] A composição utilizada no presente método é preferivelmente administrada por via entérica, mais preferivelmente por via oral. A composição de acordo com a invenção pode ser administrada em uma dose diária única ou em doses múltiplas por dia, como pelo menos 2 doses por dia, pelo menos 3 doses por dia, pelo menos 4 doses por dia. De preferência, a composição de acordo com a invenção é administrada mais de uma vez por dia. Em uma modalidade especialmente preferida, a composição de acordo com a invenção é administrada em 2 ou 3 doses por dia, mais preferivelmente em 3 doses por dia. De preferência, a cepa da invenção ou os seus mutantes são administrados em uma quantidade de 105 ufc/dose a cerca de 1012 ufc/dose, preferivelmente em uma quantidade de cerca de 107 ufc/dose a cerca de 1012 ufc/dose, mais preferivelmente em uma quantidade de cerca de 109 ufc/dose a cerca de 1012 ufc/dose. O termo "por dose" significa que esta quantidade de microrganismo é proporcionada a um paciente por dia ou por ingestão, preferivelmente por dia. O especialista na técnica será capaz de ajustar a dose terapeuticamente eficaz e/ou a dose profilática eficaz apropriadamente.

[0040] Em aplicações profiláticas, as composições de acordo com a invenção são administradas a uma pessoa suscetível a, ou de outra forma correndo o risco de, um distúrbio em uma quantidade que seja suficiente para pelo menos reduzir parcialmente o risco de desenvolver esse distúrbio. Essa quantidade é definida para ser "uma dose profilática eficaz". Novamente, as quantidades precisas dependem de vários fatores, como o estado de saúde e peso da criança, e do efeito da matriz alimentar.

[0041] Em uma modalidade da invenção, a cepa ou a composição da invenção é administrada a uma criança. Em uma modalidade preferida, a criança está em idade pré- escolar. Em algumas modalidades preferidas, a criança tem entre cerca de 3 anos e cerca de 5 anos de idade.

[0042] Em uma modalidade, a criança é uma criança propensa à otite. De preferência, a criança sofre ou é suscetível a sofrer de Otite e/ou Infecções das Vias Aéreas Superiores. Efeitos Benéficos

[0043] Como evidenciado pelos exemplos abaixo, as cepas e as composições da invenção são seguras e têm um efeito benéfico importante. Em um estudo clínico, as cepas da invenção diminuíram em 86% o número de episódios de OMA, durante uma intervenção de 6 meses, em crianças propensas à otite, em comparação com o período de 6 meses antes da intervenção. Elas também reduziram a duração mediana dos episódios de OMA quando a OMA ocorreu. Finalmente, as cepas da invenção reduziram o número de episódios de Infecções das Vias Aéreas Superiores em crianças que receberam o probiótico.

EXEMPLOS Exemplo 1: Identificação e caracterização da cepa PS7

1.1 Isolamento do suabe vaginal e identificação (espécie e cepa)

[0044] O Lactobacillus salivarius PS7 foi isolado na estrutura de um estudo para avaliar a diversidade bacteriana do grupo de Lactobacillus no leite humano e na vagina de mulheres saudáveis e entender o seu deslocamento potencial do intestino. As mulheres foram incluídas neste estudo de acordo com os seguintes critérios: (a) mulheres saudáveis sem condições subjacentes presentes ou passadas (incluindo mastite); (b) gravidez de duração normal; e (c) ausência de problemas perinatais infantis e/ou maternos (incluindo mastite). As amostras de leite, os suabes vaginais e os suabes retais foram coletadas assepticamente em tubos e suabes estéreis no dia 7 após o parto e mantidos a 4ºC até a liberação para o laboratório, o que ocorreu nas primeiras três horas após a coleta. O estudo a partir do qual essa cepa foi isolada foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa Clínica do Hospital Clínico (Madri).

[0045] O material biológico contido nos suabes vaginais e retais foi suspenso novamente em 1 ml de água de peptona. As diluições das amostras com água de peptona foram preparadas, em triplicata, sobre placas de ágar com de Man, Rogosa e Sharpe (MRS, Oxoid, Basingstoke, UK) suplementadas com L-cisteína (0,5 g/L) (MRS-Cys), que foram incubadas anaerobicamente (85% de nitrogênio, 10% de hidrogênio, 5% de dióxido de carbono) em uma estação de trabalho anaeróbica (MINI-MACS, DW Scientific, Shipley, UK), a 37ºC, por 48 h.

[0046] Os isolados foram examinados por microscopia de contraste de fase para determinar a morfologia celular e a reação de coloração de Gram, e testados quanto às atividades de oxidase e catalase e, também, quanto a um bom crescimento (>108 UFC/ml) em caldo MRS, incubados a 37ºC por até 24 h.

[0047] A cepa foi isolada de um suabe vaginal e identificada no nível da espécie como Lactobacillus salivarius através de amplificação por PCR de uma seção de uma região variável do gene de rRNA 16S usando os primers pbl16 (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3', SEQ ID NO: 1) e mbl16 (5'-GGCTGCTGGCACGTAGTTAG-3', SEQ ID NO: 2) (Kullen et al. 2000). As condições da PCR foram as seguintes: 96ºC por 30 s, 50ºC por 30 s e 72ºC por 45 s (35 ciclos) e uma extensão final a 72ºC por 4 min. Os fragmentos amplificados foram purificados utilizando o NucleoSpin Extract II (Macherey- Nagel Gmb; Düren, Alemanha) e sequenciados usando os primers citados acima em um sequenciador automático ABI 377A (Applied Biosystems, Foster City, EUA). As sequências foram comparadas com as depositadas no banco de dados EMBL usando o algoritmo BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST).

[0048] A identificação foi confirmada por espectrometria de massa por Ionização Dessorção a Laser

Assistida por Matriz-Tempo de Voo (MALDI-TOF) usando um instrumento Vitek-MS® (BioMérieux, Marcy l'Etoile, França) nas instalações da Probisearch (Tres Cantos, Espanha). Resumidamente, uma parte de uma colônia bacteriana (~1 µL) foi diretamente manchada sobre uma placa de amostra de MALDI. Em seguida, ela foi coberta com 1 µL de uma solução saturada de ácido α-ciano-4-hidroxicinâmico em acetonitrila (28%) e deixada secar na temperatura ambiente. Um espectro médio foi construído com perfis de espectros de pelo menos 50 m/z e usado para a identificação por comparação com os espectros contidos no banco de dados Myla (Biomerieux). A identificação foi definida como uma correspondência de 99- 100% aos valores de m/z específicos da espécie no banco de dados.

[0049] A cepa pode ser diferenciada de outras cepas de L. salivarius de nossa própria coleção por genotipagem por análise de DNA polimórfico amplificado aleatoriamente (RAPD) e eletroforese em gel de campo pulsado (PFGE).

1.2 Sobrevivência após trânsito através de um modelo gastrointestinal in vitro

[0050] A sobrevivência da cepa foi testada em um modelo in vitro do estômago e intestino delgado humanos, com base no descrito por Marteau et al. (1997). O leite humano tratado com UHT (25 ml), contendo aproximadamente 109 UFC/ml da cepa testada, foi diluído em 5 ml de uma solução eletrolítica estéril contendo 6,2 g/l de NaCl, 2,2 g/l de KCl, 0,22 g/l de CaCl2 e 1,2 g/l de NaHCO3, para simular a diluição in vivo pela saliva. Em seguida, foram adicionados 5 ml de suco gástrico suíno e a mistura foi incubada a 37ºC, com agitação. A curva de pH no compartimento semelhante ao estômago foi controlada para reproduzir os valores encontrados nos monogástricos após o consumo de iogurte (Conway et al. 1987): pH 5,0 no início, pH 4,1 a 20 min, pH 3,0 a 40 min e pH 2,1 a 60 min. As frações foram retiradas sucessivamente deste compartimento aos 20, 40, 60 e 80 min, em um modo que simulasse o esvaziamento gástrico normal (Marteau et al. 1997). Após ajustar seu pH para 6,5 ± 0,2 com NaHCO3 1 M, elas foram misturadas com 10 ml de uma solução eletrolítica estéril contendo 5 g/l de NaCl, 0,6 g/l de KCl, 0,3 g/l de CaCl2, 4% de bile de suínos e 7% de pancreatina (Sigma), que simula o conteúdo do suco duodenal. Após 120 min de exposição sucessiva a essas condições, a sobrevivência bacteriana foi determinada preparando as amostras sobre placas de ágar com MRS, que foram incubadas anaerobicamente a 37ºC, por 48 h. Todos estes ensaios foram realizados em quadruplicata e os valores foram expressos como a média ± DP.

[0051] Resultados: a viabilidade da cepa após exposição a condições que simulavam as encontradas no trato gastrointestinal foi alta (51,53%; Tabela 1). Tabela 1. Porcentagem (%) das células inoculadas (109 UFC/ml) no leite que sobreviveram a condições que simulavam as do trato gastrointestinal humano Simulação gástrica 0-20 min 20-40 min 40-60 min 60-80 min (pH 5,0) (pH 4,1) (pH 3,0) (pH 2,1) % Total 12,11 ± 16,01 ± 16,33 ± 07,08 ± 51,53 2,21 2,97 3,03 1,55

1.3. Determinação do espectro antimicrobiano

[0052] Um método de cobertura descrito anteriormente (Magnusson & Schnürer, 2001; Martín et al.,

2005; Martín et al., 2006) foi usado para determinar a capacidade da cepa de inibir o crescimento de diferentes bactérias envolvidas nos casos de otite média aguda, incluindo várias cepas (n = 55) das seguintes espécies: Haemophilus influenza, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Moraxella catharralis, Alloiococcus otitis, Actinomyces europaeus, Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Escherichia coli e Pseudomonas aeruginosa. Algumas das cepas pertenciam à nossa própria coleção, enquanto o restante das cepas foi proporcionado pela Dra. Patricia Ruiz Garbajosa (Servicio de Microbiología, Hospital Universitario Ramón y Cajal (Madri). As placas cobertas com os indicadores bacterianos foram incubadas a 37ºC, por 48 h, e, em seguida, foram examinadas quanto às zonas de inibição ao redor das manchas de cepas. Todas as experiências que testaram a atividade inibitória foram realizadas em triplicata.

[0053] O L. salivarius PS7 mostrou uma clara atividade antimicrobiana inibidora (zona de inibição >2 mm ao redor da mancha) contra todos os organismos indicadores utilizados neste estudo.

[0054] Para elucidar o(s) composto(s) responsável(eis) pela atividade antimicrobiana, a cepa foi examinada quanto à produção de bacteriocinas, peróxido de hidrogênio, lactato e/ou acetato.

1.4. Produção de bacteriocinas

[0055] A cepa L. salivarius PS7 foi cultivada em caldo MRS, a 37ºC, até a fase estacionária inicial (A620 ~1,0). A cultura foi centrifugada a 12.000 g, por 10 min, a

4ºC, e o sobrenadante foi neutralizado para 6,2 com NaOH 1 M, fervido por 5 min e esterilizado em filtro através de filtros de tamanho de poro de 0,22 µm (Millipore, Bedford, EUA). A atividade bacteriocinogênica dos sobrenadantes sem células foi determinada por um ensaio de difusão em poço de ágar. As alíquotas (100 µL) dos sobrenadantes foram colocadas em poços (7 mm de diâmetro), cortadas em placas de ágar BHI resfriadas previamente semeadas (105 ufc/ml) com as cepas indicadoras. As placas foram mantidas a 4ºC, por 2 h, e, em seguida, incubadas sob condições ideais para o crescimento do indicador. Os microrganismos empregados como indicadores da atividade bacteriocinogênica eram cepas bacterianas diferentes das seguintes espécies: Haemophilus influenza, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Moraxella catharralis, Alloiococcus otitis, Actinomyces europaeus, Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Escherichia coli e Pseudomonas aeruginosa.

[0056] Como o L. salivarius PS7 mostrou atividade bacteriocinogênica contra algumas das cepas indicadoras testadas neste trabalho, foram realizadas análises por PCR para detectar os genes estruturais relacionados à biossíntese de salivaricinas. Resumidamente, uma colônia foi suspensa novamente em 50 µl de água estéril; então, 50 μl de clorofórmio foram adicionados à suspensão; a mistura foi centrifugada a 13.000 × g, por 10 min, a 4ºC. Posteriormente, 5 μl da fase aquosa foram usados como molde de DNA nos ensaios por PCR usando os seguintes pares de primers: (i) SalB-for (5'- TGATAAGAAAGAATTGGCACATATAATTG-3', SEQ ID NO: 3) e SalB-rev

(5'-TCTGTTTAACTACAAATATTTTGATTTGAATG-3', SEQ ID NO: 4) para salivaricina B (Çataloluk, 2001); (ii) Abp118A-para (5'- AAACGTGGTCCTAACTGTGTAGG-3', SEQ ID NO: 5) e Abp118B-rev (5’-AACGGCAACTTGTAAAACCACCAG-3', SEQ ID NO: 6) para a bacteriocina Abp-118 (Flynn et al., 2002). Cada reação PCR (20 µl) continha 5 µl da mistura tampão (5 × MyTaq Red), 0,5 µl de cada primer, 0,15 µl da enzima MyTaq Red DNA polimerase (BIOLINE) e 13,85 µl de água deionizada. O programa da PCR foi como se segue: uma etapa inicial de desnaturação (95ºC por 2 min), seguida de 30 ciclos de 95 ºC por 30 s, 58 ºC por 30 s e 72 ºC por 30 s, e uma extensão final de 72 ºC por 5 min. Os amplicons foram visualizados por eletroforese em gel de agarose (2%), a 90 V, por 1 h, utilizando uma ladder de 100-1.013 pb (Hyperladder® 100 pb, BIOLINE) como um marcador e o Gel Stain Nucleic Acid Red Stain (Biotium) como o agente de coloração, em um sistema de formação de imagens em gel (Gel Doc 2000, Bio-Rad).

[0057] A cepa apresentou uma atividade notável de bacteriocina contra as cepas Gram-positivas incluídas como organismos indicadores utilizados neste estudo. A análise por PCR quanto aos genes estruturais de salivaricinas conhecidas revelou que esta cepa é capaz de produzir a bacteriocina Abp-118, como mostrado na Figura. 1

1.5. Produção de peróxido de hidrogênio

[0058] A produção de peróxido de hidrogênio pela cepa de Lactobacillus foi inicialmente testada seguindo o procedimento descrito por Song et al. (1999). As placas de ágar com MRS, suplementadas com 0,25 mg/ml de tetrametilbenzidina (TMB; Sigma, St. Louis, EUA) e 0,01 mg/ml de peroxidase de rábano silvestre (HRP, Sigma), foram inoculadas com a cepa e incubadas anaerobicamente por 2 dias, a 37ºC. Sabe-se que a HRP oxida a TMB na presença de peróxido de hidrogênio, para formar um pigmento azul na colônia produtora de H2O2. Paralelamente, o peróxido de hidrogênio também foi medido por uma modificação do método quantitativo de Yap e Gilliland (2000). A cepa foi cultivada anaerobicamente em 10 ml de caldo MRS, por 24 h, a 37ºC. As células foram coletadas por centrifugação a 12000 × g, por 10 min, a 4 ºC, lavadas duas vezes com tampão fosfato de potássio (50 mM, pH 6) e suspensas novamente em 9 ml do mesmo tampão suplementado com glicose 5 mM. A suspensão de células (0,5 ml) foi inoculada em um tubo contendo 9 ml do tampão contendo glicose. Após uma incubação aeróbica, a 37ºC, por 24 h, as células foram removidas por centrifugação a 12000 × g, por 10 min, a 4ºC, e os sobrenadantes foram testados quanto ao peróxido de hidrogênio. Resumidamente, 5 ml de sobrenadante foram misturados com 100 µL de o-dianisidina aquosa a 1% (Sigma) e 1 ml de HRP aquosa a 0,001%. Os tubos foram incubados por 10 min, a 37ºC, e a reação foi interrompida pela adição de 0,2 ml de HCl 4 N. A leitura da absorbância (A400 nm) foi determinada e o teor de peróxido foi quantificado através da comparação dos valores obtidos com os de uma curva padrão de H2O2. Em todos os ensaios de H2O2, o L. johnsonii La1 foi usado como um controle positivo.

[0059] O L. salivarius PS7 era positivo em um exame qualitativo quanto à produção de peróxido de hidrogênio; posteriormente, um ensaio quantitativo mostrou que a quantidade de H2O2 produzido por esta cepa foi 0,729 µg/ml ± 0,240, enquanto a produção da cepa de controle (L. johnsonii La1) foi maior (7,63 µg/mL ± 0,407).

1.6. Produção de ácido lático e ácido acético

[0060] A produção de ácido lático pela cepa L. salivarius foi determinada em caldo MRS (pH 6,2). Utilizou- se um por cento de inóculo de uma cultura noturna em MRS e a incubação prosseguiu por 24 horas, a 37 ºC, anaerobicamente (85% de Nitrogênio, 10% de Hidrogênio, 5% de Dióxido de carbono) em uma estação de trabalho anaeróbica MACS-MG-1000 (DW Scientific, Shipley, UK). As células foram removidas por centrifugação a 12000 × g, por 5 min, e a concentração de ácido L- e D-láctico nos sobrenadantes foi quantificada usando um kit enzimático (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemanha), seguindo as instruções do fabricante. Os valores de pH dos sobrenadantes também foram medidos. Da mesma forma, a concentração de ácido acético nos sobrenadantes da cultura foi quantificada usando outro kit enzimático (Roche Diagnostics) e seguindo as instruções do fabricante. Nesse caso, o MRS era constituído de seus diferentes ingredientes, exceto o acetato de sódio. Estes ensaios foram realizados em triplicata e os valores foram expressos como a média ± DP.

[0061] Resultados: O L. salivarius PS7 produziu uma alta concentração de ácido L-láctico, ao passo que não produziu o isômero ácido D-láctico (Tabela 2). Também foi possível detectar uma concentração significativa de ácido acético nos sobrenadantes da cultura da cepa (0,68 mg/mL ± 0,17). Tabela 2. Concentração de ácido L- e D-lático (mg/mL; média

± DP) e pH dos sobrenadantes obtidos a partir das culturas em MRS dos lactobacilos (n = 4). Cepa ácido L- Ácido D- pH láctico láctico L. salivarius PS7v 3,83 10,29 ± 0,70 Nd L. rhamnosus GG 3,97 6,44 ± 0,92 Nd L. johnsonii La1 3. 96 3,95 ± 0,41 7,86 ± 1,36 L. casei imunitass 4.02 7,05 ± 0,64 Nd Nd, não detectável.

[0062] Globalmente, esses resultados mostram que o L. salivarius PS7 é uma cepa muito singular, com um potencial muito alto para inibir as bactérias patogênicas, pois é capaz de produzir simultaneamente, pelo menos, quatro compostos antimicrobianos (uma bacteriocina, peróxido de hidrogênio, L-lactato e acetato).

1.7. Ensaios de agregação em conjunto

[0063] A capacidade da cepa de se agregar com as células das cepas relacionadas à otite citadas acima também foi investigada seguindo o procedimento de Reid et al. (1990), adaptado por Younes et al. (2012). Este ensaio é baseado em coculturas em meio de caldo e técnicas de microscopia óptica.

[0064] O L. salivarius PS7 mostrou um grande potencial para se agregar em conjunto com as cepas bacterianas envolvidas na otite média, particularmente com as pertencentes aos gêneros Streptococcus, Alloiococcus, Enterococcus e Staphylococcus. Este mecanismo pode impedir a interação de tais patógenos com suas células-alvo humanas.

1.8. Adesão às células Caco-2/HT-29

[0065] A adesão da cepa às células HT-29 e Caco- 2 foi examinada basicamente como descrito por Coconnier et al. (1992). Rotineiramente, as células foram cultivadas em meio DMEM (PAA, Linz, Áustria) contendo glicose 25 mM, piruvato de sódio 1 mM e suplementadas com soro fetal de bezerro inativado por calor a 10% (30 min, 56ºC), L- glutamina 2 mM, 1% de preparação de aminoácidos não essenciais, 100 U/mL de penicilina e 100 mg/mL de estreptomicina. Para os ensaios de adesão, a HT-29 e a Caco-2 foram cultivados até a confluência em 2 mL de meio desprovido de antibióticos. Aproximadamente 10 dias após a confluência, 1 mL do meio foi substituído por 1 mL de suspensão de Lactobacillus (108 ufc/mL em DMEM). As culturas inoculadas foram incubadas por 1 h, a 37ºC, em 5% de CO2. Em seguida, a monocamada foi lavada cinco vezes com PBS estéril, fixada com metanol, tingida com coloração de Gram e examinada microscopicamente. Os lactobacilos aderentes em 20 campos microscópicos aleatórios foram contados para cada teste.

[0066] A cepa mostrou uma alta capacidade de aderir às células Caco-2 (697,1 ± 297,6; expressa como a média ± DP do número de lactobacilos aderidos em 20 campos microscópicos aleatórios) e às células HT-29 (251,7 ± 82,3).

1.9. Produção de riboflavina/folato/cianocobalamina

[0067] As células bacterianas de L. salivarius PS7 de uma cultura noturna em MRS foram lavadas 3 vezes com solução salina, suspensas novamente nessa solução no volume original da cultura e usadas para inocular (4%; v/v) os meios de cultura sem riboflavina, folato ou vitamina B12 (Difco, EUA). Em seguida, os meios inoculados foram incubados a 37ºC, por 18 h, sem agitação. Após a incubação, este procedimento de lavagem-suspensão novamente foi repetido e a solução celular resultante foi utilizada para inocular (2%; v/v) os respectivos meios frescos e sem vitaminas. Esta última etapa foi repetida 7 vezes e, após a última incubação, foram obtidas amostras para determinar as concentrações de vitaminas extra- e intracelulares. Para a determinação da concentração de folato, uma amostra (500 µl) de meio sem vitamina, cultivado, bacteriano foi misturada com partes iguais de um tampão protetor (tampão fosfato 0,1 M, pH 6,8, contendo ácido ascórbico [1,5%; p/v]) para impedir a oxidação e a degradação das vitaminas, enquanto o ácido acético (1%; v/v) foi adicionado no caso da riboflavina. Imediatamente após a adição do tampão protetor ou do ácido acético, as misturas foram centrifugadas por 5 min, a 5.000 × g. Em seguida, o sobrenadante foi coletado (amostra extracelular) e fervido por 5 min, enquanto a pelota era suspensa novamente em 500 µl de tampão protetor, fervida por 5 min, centrifugada por 6 min a 10.000 × g e o sobrenadante correspondente também foi coletado (amostras intracelulares). Todos os sobrenadantes foram armazenados a -70 ºC até serem utilizados para a quantificação da vitamina.

[0068] As concentrações de folato foram determinadas por um ensaio microbiológico descrito anteriormente, usando o Lactobacillus rhamnosus NCIMB 10463 como o organismo indicador (Laiño et al. 2012). Resumidamente, as amostras de diferentes concentrações de ácido fólico de qualidade HPLC (Fluka BioChemica, Sigma- Aldrich, Suíça) foram preparadas com a cepa indicadora e incubadas estaticamente durante 48 h, a 37ºC, em microplacas estéreis de 96 poços contendo o meio sem folato

(Deltalab, Argentina). A densidade óptica foi lida a 580 nm (OD580) utilizando um leitora de microplacas (leitora de microplacas ajustável VERSAmax, Molecular Devices, EUA). A concentração de folato das amostras foi determinada comparando a DO com as obtidas com a curva padrão preparada usando o ácido fólico comercial. As concentrações de riboflavina foram determinadas da mesma maneira, porém usando o L. rhamnosus ATCC 7469 como a cepa indicadora cultivada no meio sem riboflavina, e confirmadas através de análise por HPLC como descrito anteriormente (Juarez del Valle et al. 2014).

[0069] Um método de referência, o ensaio de Lactobacillus delbrueckii B12 (Horwitz 2000), foi utilizado para preparar os extratos de células e, em seguida, para analisar a produção de cobalamina.

[0070] A cepa PS7 foi capaz de crescer na ausência e produzir vitaminas B2. As concentrações (média ± DP) da riboflavina intracelular e extracelular foram 165,00 ± 0,52 e 34,74 ± 3,06 ng/ml, respectivamente (concentração total: ~200 ng/ml). A cepa não produziu a vitamina B6, nem a cianocobalamina.

1.10. Adesão à mucina suína

[0071] A adesão da cepa à mucina foi determinada de acordo com o método descrito por Cohen e Laux (1995), com algumas modificações. Resumidamente, 100 µl de uma solução (1 mg/ml) de mucina suína (Sigma) em solução salina de Hanks tamponada com HEPES (HH) foram imobilizados em placas de microtítulo de poliestireno (Maxisorp; Nunc, Roskilde, Dinamarca), após incubação durante a noite, a 4ºC. Os poços foram lavados duas vezes com 250 µL de HH.

Paralelamente, as bactérias foram cultivadas durante a noite, a 37ºC, em caldo MRS e as pelotas bacterianas a partir de frações de 1 ml foram obtidas por centrifugação e lavadas com HH. Em seguida, 10 µl de carboxifluoresceína 10 mM (Sigma) foram adicionados às pelotas e as suspensões bacterianas foram incubadas por 20 min, a 37ºC. Subsequentemente, as células bacterianas foram lavadas 3 vezes com HH e, finalmente, suspensas novamente em 1 ml de HH. Em seguida, uma suspensão de 50 µl das bactérias marcadas com fluorescência (~ 5×107 UFC) foi adicionada a cada poço. Após a incubação por 1 h, a 37ºC, as placas foram lavadas duas vezes com 250 µl de HH, para remover as células não unidas e incubadas por 1 h, a 60ºC, na presença de 50 µl de dodecil sulfato de sódio (SDS) a 1%-NaOH 0,1 M, para liberar e lisar os microrganismos ligados. A fluorescência foi medida em uma leitora de microplacas de fluorescência (Tecan Austria GMBH, Salzburg, Áustria). A adesão foi avaliada como a porcentagem da fluorescência retida nos poços após as etapas de lavagem, quando comparada à presente nas alíquotas bacterianas marcadas, originalmente adicionadas aos poços. Os ensaios foram realizados em duplicata.

[0072] A cepa PS7 mostrou uma alta capacidade de aderir à mucina.

1.11, Degradação da mucina

[0073] O potencial da cepa para degradar a mucina gástrica (HGM; Sigma) in vitro foi avaliado em duplicata, seguindo o procedimento desenvolvido por Ruseler-van Embeden et al. (1995) e modificado por Zhou et al. (2001)

[0074] A cepa PS7 não foi capaz de degradar a mucina gástrica in vitro.

1.12. Antibiograma

[0075] A CIM dos 16 antibióticos incluídos neste estudo foi determinada em culturas de L. salivarius PS7 cultivadas durante a noite, em meio de teste de suscetibilidade a bactérias lácticas (LSM) (Klare et al. 2005) e diluídas para obter uma densidade correspondente ao padrão 1 de McFarland (equivalente espectrofotométrico ~ 3 x 108 UFC/ml). A suspensão foi ainda ajustada para 3 x 105 UFC/ml com LSM, e 100 µl foram inoculados em poços de placas VetMIC de microtítulo para bactérias do ácido láctico (Instituto Nacional de Veterinária da Suécia, Uppsala, Suécia). As placas foram incubadas a 37ºC, por 48 h e a CIM foi definida como a menor concentração na qual nenhum crescimento foi observado.

[0076] Paralelamente, as concentrações inibitórias mínimas (MICs) também foram determinadas pelo teste E (AB BIODISK, Solna, Suécia), seguindo as instruções do fabricante. Resumidamente, após incubação durante a noite, as culturas de ágar foram verificadas quanto à pureza. Para a preparação dos inóculos, as colônias individuais foram suspensas em um tubo de cultura de vidro estéril contendo 5 ml de solução salina estéril (solução de NaCl a 0,85%) até que fosse obtida uma densidade correspondente a um padrão de 0,5 de McFarland (McF). Um cotonete estéril foi mergulhado no inóculo padronizado e usado para inocular uma placa de ágar. As placas inoculadas foram deixadas secar por aproximadamente 15 minutos, antes da aplicação das tiras de teste E com gradientes antimicrobianos pré-formados. Após 24 h de incubação, a CIM foi definida como o valor correspondente ao primeiro ponto sobre a tira de teste E, onde o crescimento não ocorreu ao longo da elipse de inibição. Para os agentes bacteriostáticos (por exemplo, tetraciclina, eritromicina e clindamicina), a CIM foi lida no ponto em que o crescimento foi inibido em 80% (isto é, o primeiro ponto de inibição significativa, conforme avaliado a olho nu).

[0077] Os resultados dos diferentes testes de susceptibilidade aos antibióticos foram interpretados de acordo com os níveis de corte propostos pela Autoridade Europeia para a Segurança dos Alimentos (EFSA, 2012). De acordo com esses valores, o lactobacilo era sensível a todos os antibióticos testados neste estudo, com a exceção da canamicina e da vancomicina (um fato que era esperado, uma vez que todas as cepas da espécie L. salivarius são intrinsecamente resistentes a esses dois antibióticos) (Tabela 3). Tabela 3. Concentrações inibitórias mínimas (CIMs) e valores de corte (μg/ml) dos antibióticos contra o L. salivarius PS7. Antibióticos CIMs (L. salivarius Valores de corte* PS7) Ampicilina 4 0,5 Clindamicina 1 0,5 Cloranfenicol 4 2.0 Eritromicina 1 0,12 Estreptomicina 64 32 Gentamicina 16 0,12 Canamicina 64 128 Tetraciclina 8 2 Vancomicina n.r. >128 Linezolida 2 1 Penicilina 1 0,25 *EFSA (2012); Klare et al. (2007) para linezolida e penicilina. n.r.: não requerido

1.13. Formação de aminas biogênicas

[0078] A capacidade de formar aminas biogênicas (tiramina, histamina, putrescina e cadaverina) foi avaliada utilizando o caldo de descarboxilase e o método descrito por Bover-Cid e Holzapfel (1999) e, também, por cromatografia a gás-espectrometria de massa. Os aminoácidos precursores (tirosina, histidina, ornitina e lisina, respectivamente) foram adquiridos da Sigma.

[0079] A cepa PS7 não foi capaz de produzir aminas biogênicas.

1.14. Estimulação das células dendríticas imaturas

[0080] As células dendríticas (DC) imaturas de camundongo foram isoladas do baço de camundongos fêmeos C57BL/6 (6-10 semanas de idade) e caracterizadas como descrito anteriormente (Lu et al. 1995). Para a propagação das DC isoladas, elas foram rotineiramente cultivadas a 37ºC, em uma atmosfera umidificada de CO2 a 5%, em meio IMDM, com 10% de FBS inativado pelo calor, L-glutamina 2 mM, 100 UI/ml de penicilina G, 100 µg/ml de estreptomicina e β-mercaptoetanol 20 pM (IMDM completo; todos os componentes eram da Sigma) e suplementadas com 0,4 ng/ml de rGM-CSF de camundongo (R&D Systems). O meio de cultura foi trocado a cada quatro dias e os granulócitos e as DCs maduras foram removidos por lavagens suaves, após o que as culturas foram reabastecidas com novo meio contendo rGM-CSF fresco (Lu et al. 1995).

[0081] Os anticorpos monoclonais anti- camundongos IA/Ed (2G9) e CD86/B7.2 (GL1), que reconhecem especificamente MHC II e B7.2 de camundongo, respectivamente, foram adquiridos da PharMingen (San Diego, EUA). A ficoeritrina e a estreptavidina foram obtidas da Sigma.

[0082] As culturas noturnas em MRS-Cys de L. salivarius PS7 foram recuperadas por centrifugação a 6.000 × g por 5 min e lavadas duas vezes com PBS. Em seguida, 2 × 107 ufc foram distribuídos em alíquotas de 100 µl do meio da Dulbecco modificado de Isocove (IMDM) desprovido de antibióticos e adicionados a 10 ml das culturas de DC frescas contendo 2 × 106 células. As coculturas foram incubadas por 90 min, a 37ºC e as culturas de DC não inoculadas foram incluídas como controle negativo. Após o período de incubação, as células foram lavadas com PBS e EDTA 2 mM e mantidas por 18 h, a 37ºC, em IMDM completo, suplementado com gentamicina (250 μg/ml) e tetraciclina (10 μg/ml), para matar as bactérias restantes. Em seguida, as células foram lavadas duas vezes com PBS e tingidas com os anticorpos anti-MHC classe II e anti-B7.2, a fim de detectar tanto as DC quanto a ativação potencial dos marcadores de superfície. A coloração foi realizada de acordo com técnicas padrão de imunofluorescência, enquanto a marcação dos anticorpos com ficoeritrina foi realizada seguindo as instruções do fabricante (Sigma). Finalmente, a análise por citometria de fluxo foi realizada com uma varredura por FACS (Becton Dickinson, San Jose, CA) e os dados resultantes foram analisados com o software WinMDI

2.8. Um total de 10.000 células foi analisado através de uma porta celular viável, determinada por parâmetros de dispersão da luz em ângulos reto e dianteiro para excluir partículas subcelulares (Langa et al., 2013).

[0083] Foram avaliadas as alterações fenotípicas das DC relacionadas à ação estimuladora potencial do L. salivarius CECT 5713. Após a incubação das coculturas de bactérias-DC (razão 10:1) por 90 min, a morfologia das células DC mudou dramaticamente. Elas se tornaram mais irregulares, com prolongamentos visíveis ou dendritos, que são as principais características das DCs ativadas. Essas alterações morfológicas foram observadas por pelo menos 24 horas após a exposição às células bacterianas. Além disso, os lactobacilos aumentaram fortemente a apresentação da molécula coestimuladora B7.2 (CD86) e MHC classe II sobre as superfícies das DC. Esses marcadores foram detectados em 66,2 e 68,9%, respectivamente, das DC cocultivadas. Por outro lado, os valores correspondentes às DC que não foram expostas às cepas bacterianas foram significativamente menores (10,7 e 8,8%, respectivamente).

1.15. Estabilidade após a liofilização

[0084] O L. salivarius PS7 foi cultivado em caldo MRS, a 37 ºC, em aerobiose. As células foram coletadas das culturas em fase estacionária por centrifugação a 10.000 × g, por 10 min, a 4 ºC. As pelotas bacterianas foram suspensas novamente em leite desnatado reconstituído (10% p/v), a uma concentração final variando de 109 a 1010 UFC/ml. As suspensões bacterianas foram congeladas a -80 ºC e, subsequentemente, liofilizadas sob as seguintes condições: 2 h a -20 ºC, 20 h a -15 ºC e, finalmente, 24 h a 15 ºC. As culturas liofilizadas foram armazenadas na temperatura ambiente (~25 ºC) e a 4 ºC e a sua viabilidade foi verificada mensalmente por um período de 8 meses.

[0085] Não houve diferenças em relação às contagens de bactérias vivas entre as culturas frescas iniciais (9,3-8,8 log10 ufc/g) e as culturas liofilizadas (9,3-8,7 log10 ufc/g), imediatamente após o processo de liofilização. Em seguida, a estabilidade das culturas de L. salivarius PS7 liofilizadas, durante o armazenamento na temperatura ambiente ou a 4 ºC, foi verificada mensalmente por 8 meses (ver as Figuras 2 e 3, respectivamente; pontos/linhas vermelhas). A contagem de células viáveis de L. salivarius PS7 foi ~8,0-8,6 log10 ufc/g após 3-4 meses, na temperatura ambiente. A viabilidade caiu acentuadamente após 5 meses sob essas condições. Por outro lado, a viabilidade ainda era ~6,8 log log10 ufc/g após 8 meses a 4ºC. Exemplo 2: Ensaios de toxicidade em animais

2.1. Estudos da toxicidade oral agudos e de dose repetida (4 semanas)

[0086] Os ratos e as ratas Wistar (Charles River Inc., Marget, Kent, UK) foram aclimatados por 7 dias, antes do início do estudo, com uma avaliação do estado de saúde. Os ratos foram alojados individualmente em gaiolas de policarbonato com forragem de serragem e mantidos em espaços controlados ambientalmente (22 ± 2 ºC e 50% ± 10% de umidade relativa) com um ciclo claro-escuro de 12 horas (luz das 08:00 h às 20:00 h). A ração (dieta para roedores A03, Scientific Animal Food and Engineering, Villemoisson- sur-Orge, França) e a água estavam disponíveis ad libitum. Os ratos tinham 56 dias de idade no início do tratamento. Os estudos agudos (teste de limite) e de dose repetida (4 semanas) foram conduzidos de acordo com as diretrizes da União Europeia (Regulamento do Conselho da CE No. 440, 2008a,b). Ambos os estudos foram realizados de acordo com os requisitos de ética e autorizados pelo Comitê de Ética Oficial da Universidade Complutense.

[0087] No estudo agudo (teste de limite), 24 ratos (12 machos, 12 fêmeas) foram distribuídos em dois grupos de 6 machos e 6 fêmeas, cada. Após um jejum noturno, cada rato recebeu leite desnatado (500 µl) oralmente (grupo de controle ou Grupo 1) ou uma dose oral única de 1 × 1010 unidades formadoras de colônias (ufc) de L. salivarius PS7 dissolvido em 500 µl de leite desnatado (grupo tratado ou Grupo 2). As doses dos artigos de teste e controle foram administradas por gavagem. Os animais foram verificados quanto aos sinais clínicos e mortalidade duas vezes por dia (manhã e tarde). Ao final de um período de observação de 14 dias, os ratos foram pesados, sofreram eutanásia por inalação de CO2, exsanguinados e necropsiados.

[0088] O estudo de dose repetida (4 semanas) (teste de limite) foi realizado em 48 ratos (24 machos, 24 fêmeas) divididos em quatro grupos de 6 machos e 6 fêmeas, cada (grupo de controle ou Grupo 3; grupo tratado ou Grupo 4; grupo de controle secundário ou Grupo 5; e grupo tratado secundário ou Grupo 6). Os ratos receberam uma dose diária de leite desnatado (Grupos 3 e 5) ou 1 × 109 ufc de L. salivarius PS7 dissolvido em 500 µl de leite desnatado (Grupos 4 e 6) oralmente, uma vez ao dia, durante 4 semanas. As doses dos artigos de teste e controle foram administradas por gavagem. Os animais foram dosados aproximadamente ao mesmo tempo, cada dia (aproximadamente

4-6 h no ciclo claro). A ração, porém, não a água, foi retida a partir de 4 horas antes até 2 horas após a administração dos artigos de controle e teste. Os animais foram verificados quanto aos sinais clínicos e mortalidade duas vezes por dia (manhã e tarde). Todos os ratos dos Grupos 3 e 4 foram privados de ração por 18 h, pesados, sofreram eutanásia por inalação de CO2, exsanguinados e necropsiados no Dia 29. Todos os animais dos grupos secundários (Grupos 5 e 6) foram mantidos por mais 14 dias sem tratamento, para detectar a ocorrência ou a persistência ou a recuperação tardia dos efeitos tóxicos. Todos os ratos dos Grupos 5 e 6 foram privados de ração por 18 h, pesados, sofreram eutanásia por inalação de CO2, exsanguinados e necropsiados no dia 42.

2.2. Observações

[0089] Todos os animais foram observados duas vezes ao dia quanto à aparência geral, comportamento, sinais de morbimortalidade (uma vez antes do tratamento e uma vez ao dia depois disso). Os ratos foram observados quanto à sua condição geral e quanto à condição da pele e pelo, olhos, nariz, cavidade oral, abdômen e genitália externa, avaliados quanto à taxa de respiração e palpados quanto às massas. Os parâmetros comportamentais verificados foram os movimentos anormais (tremor, convulsão, contrações musculares), as reações ao manuseio e o comportamento em campo aberto (excitabilidade, sensibilidade ao toque e ao ruído agudo), as alterações no comportamento comum (alterações na aparência, agitação da cabeça, giro), o comportamento anormal (autofagia, movimento para trás) e a agressão. O peso corporal, o ganho de peso corporal e o consumo de ração e água foram medidos diariamente e, no final dos períodos de observação, os ratos foram examinados por necropsia e os pesos dos órgãos registrados.

2.3. Parâmetros de teste clínico

[0090] As amostras de sangue para avaliação da hematologia e da química clínica foram coletadas do plexo retro-orbital de animais, sob anestesia leve induzida por inalação de CO2, após um período de observação de 14 dias, no estudo oral agudo e alteraram-se 4 semanas de tratamento e 14 dias de recuperação para o estudo de segurança de 4 semanas de dose repetida. O EDTA foi usado como um anticoagulante para as amostras de hematologia e o citrato de sódio foi usado como um anticoagulante para a química clínica. A ração foi retida por aproximadamente 18 h antes da coleta de sangue e as amostras foram coletadas no início, no dia de trabalho9, para reduzir a variação biológica; a água foi proporcionada ad libitum.

[0091] Os parâmetros de patologia clínica (hematológicos e de bioquímica clínica) foram avaliados (Tabela 4). A maioria das variáveis da hematologia foram medidas com um analisador automatizado de sangue total Coulter/CELL-DYN 3500 (Abbott, Chicago, IL). Os esfregaços de células sanguíneas foram observados com um Olympus Microscopy BX41 (Olympus, Tóquio, Japão). Os parâmetros de química clínica (Tabela 1) foram avaliados com um espectrofotômetro Konelab PRIME 30 (Thermofisher Scientific Inc. Waltham, MA, EUA) e os parâmetros de bioquímica especiais com um analisador de química clínica AU640 (Olympus, Tóquio, Japão). Os parâmetros de coagulação foram analisados com um analisador de coagulação Coatron M1 (Teco

Medical Instruments, GMBH, Neufahrn, Alemanha).

2.4. Patologia anatômica

[0092] Todos os ratos sofreram eutanásia por inalação de CO2 e foram necropsiados. A necropsia incluiu um exame macroscópico da superfície externa do corpo, de todos os orifícios, da cavidade craniana, do cérebro e medula espinhal, da cavidade nasal e seios paranasais e das cavidades torácicas, abdominais e pélvicas e vísceras. As descrições de todas as anormalidades macroscópicas foram registradas. As amostras dos tecidos e órgãos que se seguem foram coletadas de todos os animais na necropsia e fixadas em solução neutra de formaldeído a 4%, tamponada com fosfato: glândulas suprarrenais, cérebro, coração, íleo, jejuno, ceco, cólon, duodeno, reto, estômago, esôfago, traqueia, rins, fígado, pulmões, pâncreas, baço, pele, testículos com epidídimos, ovários com ovidutos, medula óssea, timo, glândulas tireoide e paratireoide, vesículas seminais, bexiga e útero. As razões de órgão:peso corporal foram calculadas. Todas as amostras de órgãos e tecidos para exame histopatológico foram processadas, incrustadas em parafina, cortadas em uma espessura aproximada de 2 a 4 µ e tingidas com hematoxilina e eosina. As lâminas de todos os órgãos e tecidos listados acima foram coletadas de todos os animais dos grupos de controle e tratados. Tabela 4. Parâmetros hematológicos e de bioquímica clínica. (B) Parâmetros de (A) Parâmetros hematológicos bioquímica clínica Contagem de glóbulos vermelhos Glicose (RBC) Hemoglobina Ureia Hematócrito Creatinina

Volume corpuscular médio (MCV) Proteína total Hemoglobina corpuscular média Bilirrubina total (MCH) Conc. de hemoglobina Cálcio corpuscular média (MCHC) Contagem de glóbulos vermelhos Sódio nucleados (RDW) Contagem de glóbulos brancos Potássio (WBC) Contagem de neutrófilos Aspartato aminotransferase bastonetes (ASAT) Alanina aminotransferase Contagem de neutrófilos (ALAT) Contagem de eosinófilos Fosfatase alcalina Contagem de linfócitos Triglicerídeo Contagem de monócitos Colesterol Lipoproteínas de alta Contagem de basófilos densidade (HDL) Lipoproteínas de baixa Contagem de plaquetas densidade (LDL) Volume plaquetário médio (VPM) Albumina (28 dias) Tempo de protrombina (28 dias) Lipoproteína A (28 dias) Tempo parcial de tromboplastina (28 dias) Fibrinogênio (28 dias)

2.5. Deslocamento bacteriano

[0093] O deslocamento bacteriano foi analisado no sangue, fígado e baço. o sangue (50 µl) foi cultivado no meio de ágar com de Man, Rogosa, Sharpe (MRS) e incubado a 37ºC, por 48 h, anaerobicamente. As amostras de tecido foram homogeneizadas em água de peptona tamponada (1 g/ml) e 100 µl dos homogeneizados resultantes foram cultivados em ágar com MRS, como mencionado anteriormente. Após 48 h, as placas foram verificadas quanto à presença de lactobacilos. O crescimento positivo sobre as placas de ágar com MRS foi definido pela presença de até uma única colônia.

2.6. Concentração total de glutationa (GSH) do fígado

[0094] Uma parte de 100 mg do fígado de cada camundongo foi homogeneizada em uma solução de ácido tricloroacético a 7,5% e os homogeneizados foram centrifugados a 3.000 × g, por 10 min, a 4ºC. A concentração total de glutationa foi medida nos sobrenadantes usando um kit comercial colorimétrico (OxisResearch, Portland, OR). Resumidamente, 40 µl dos homogeneizados ou dos padrões foram adicionados a cada poço de uma placa de microtítulo, juntamente com 40 ml de um agente redutor (tris(2-carboxietil) fosfina em HCl), 40 ml de um cromogênio (metilsulfato de 1-metil-3-cloro-7- trifluorometilquinolínio em HCl) e 40 ml de revelador de cor (NaOH). Após uma incubação na temperatura ambiente e no escuro, por 30 min, a densidade óptica foi medida a 415 nm usando um espectrofotômetro de microplacas (Bio-Rad Laboratories, Hercules CA).

2.7 Análise estatística (estudos da toxicidade)

[0095] Todos os dados são expressos como a média ± erro padrão da média (SEM) de 6 determinações (isto é, 6 machos e 6 fêmeas). As diferenças entre os grupos de controle e tratados foram avaliadas com uma análise de variância unidirecional (ANOVA), seguida pelo teste de Dunnett (1995), e as diferenças foram consideradas significativas em P < 0,05. Resultados Toxicidade oral aguda em ratos

[0096] Não foram observados sinais clínicos anormais, alterações comportamentais, alterações no peso corporal, achados macroscópicos ou alterações no peso dos órgãos. Todos os animais sobreviveram ao período de observação de 2 semanas. Não houve diferenças estatísticas nos pesos corporais entre os grupos. Da mesma forma, não foram observadas diferenças estatisticamente significativas no ganho de peso corporal, consumo de ração e água. Desse modo, o peso corporal, o ganho diário de peso corporal, o consumo de ração e água não foram afetados pelo tratamento (dose oral única de 1 × 1010 ufc de L. salivarius PS7).

[0097] Os parâmetros hematológicos e de química clínica, avaliados 2 semanas após a administração da cepa como uma dose oral única de 1 × 1010 ufc, não foram significativamente diferentes em comparação com os dos controles. Nenhuma alteração relacionada ao tratamento foi observada.

[0098] Não houve diferenças estatísticas nas razões de peso de órgão ou tecido: peso corporal relacionadas à cepa de teste (dados não mostrados). A preparação de L. salivarius PS7 não foi associada a qualquer incidência de alterações macroscópicas e microscópicas. Não foram observadas alterações histopatológicas relacionadas ao tratamento 2 semanas após a administração da cepa como uma dose oral única de 1 × 1010 ufc. Portanto, o L. salivarius PS7 tem uma ordem baixa de toxicidade aguda e a dose letal oral (LD50) para os ratos e as ratas é superior a 1 × 1010 ufc. Toxicidade oral de dose repetida (4 semanas) em ratos

[0099] Nenhuma mortalidade foi observada. Não foram observadas alterações relacionadas ao tratamento na condição geral e na aparência externa nos ratos e ratas tratados com uma dose diária de 1 × 109 ufc de L.

salivarius PS7. O desenvolvimento dos animais durante o período experimental correspondeu à sua espécie e idade. Não houve diferença significativa no peso corporal ou no ganho de peso corporal entre os grupos tratados com L. salivarius PS7 em comparação aos grupos de controle em qualquer ponto de tempo do período experimental. Todos os grupos tratados com L. salivarius PS7 consumiram quantidades semelhantes de ração e água (dados não mostrados) à dos grupos de controle correspondentes.

[0100] Todos os dados de hematologia estavam dentro dos limites normais e não foram observadas diferenças entre os grupos. Os dados de química clínica não mostraram alterações relacionadas ao tratamento no final do período de tratamento de 4 semanas. Os valores individuais e os valores médios do grupo estavam dentro das faixas fisiológicas. Após 14 dias sem tratamento para detectar a ocorrência tardia de efeitos tóxicos potenciais, não houve alterações relacionadas ao tratamento nos parâmetros de teste hematológicos e clínicos.

[0101] A necrópsia realizada no dia 29 após a última dose de L. salivarius PS7 (Grupo 4) e no dia 42 após 14 dias sem tratamento (Grupo 6) não revelou alterações patológicas grosseiras ou diferenças nos pesos dos órgãos, em comparação aos grupos de controle correspondentes. Após 4 semanas de tratamento, não houve achados histopatológicos nos órgãos examinados, considerados serem relacionados ao tratamento, nos ratos e nas ratas. Também não houve achados histopatológicos relacionados ao tratamento no grupo tratado secundário (Grupo 6).

[0102] O nível de efeito adverso não observado neste estudo de toxicidade oral de dose repetida (4 semanas) foi a dose testada, isto é, 1 × 109 ufc de L. salivarius PS7. Concentração total de glutationa (GSH) do fígado

[0103] Para determinar as alterações na defesa antioxidante por causa do tratamento probiótico, foi determinada a concentração de GSH do fígado. Não foram observadas diferenças significativas na concentração de GSH do fígado entre os grupos de controle e tratados (9,67 ± 1,42 vs. 9,71 ± 1,56 mmol/g, P>0,1). Isso indica que o tratamento com L. salivarius PS7 não causou estresse oxidativo nos ratos e é consistente com a ausência de bacteremia, uma vez que nenhum lactobacilo pode ser isolado do sangue, fígado ou baço dos ratos. Isso sugere que a cepa testada não causa infecções locais ou sistêmicas em ratos. Exemplo 3: Tratamento e prevenção de Otite em Crianças

3.1. Pacientes

[0104] As crianças propensas à otite (n = 64) com idade entre 10 meses e 6 anos foram recrutadas (os seus pais eram principalmente professores universitários, cientistas do CSIC ou profissionais da saúde). Os critérios de inclusão foram pelo menos quatro episódios de OMA durante os 12 meses anteriores ou pelo menos três episódios durante os 6 meses anteriores (del Castillo et al., 2012). Foram excluídas as crianças em uso de medicação regular, com doenças crônicas, síndrome de Down, fenda labial ou palatina, ou que já estavam agendadas para timpanostomia ou adenoidectomia durante o estudo. Aquelas que tinham passado por timpanostomia ou adenoidectomia durante os 6 meses anteriores também foram excluídas, a menos que tivessem sofrido pelo menos três episódios de OMA desde as operações. Os pais assinaram o seu termo de consentimento livre e esclarecido após receberem informações sobre o estudo.

3.2. Intervenção com L. salivarius PS7

[0105] Este estudo foi realizado entre setembro de 2012 e abril de 2015. Durante os 6 meses de intervenção, as crianças consumiram diariamente ~1 × 109 ufc da bactéria probiótica L. salivarius PS7. Os pais foram instruídos de preferência a abrirem o sachê e esvaziar o pó no leite ou em um produto lácteo. Os pais registravam diariamente em um diário de estudo se a criança havia recebido a dose diária. A adesão (%) foi contada como o número de doses efetivamente recebidas pelas crianças dividido pelo número de dias de acompanhamento. O uso de antibióticos (com a exceção do tratamento de um episódio de OMA) ou de outros produtos contendo bactérias probióticas foi um critério de exclusão durante o estudo.

[0106] As principais variáveis de resultado foram a ocorrência e a duração dos episódios de OMA. Os pontos finais secundários foram a frequência de transporte de patógenos no canal auditivo externo.

3.3. Exames clínicos

[0107] Na linha de base, as informações básicas sobre saúde, nutrição, ambiente de vida e histórico de otite/doenças respiratórias da criança foram coletadas por um questionário preenchido pelos pais. As crianças foram examinadas por um médico sênior na linha de base, no meio (3 meses) e no final (6 meses) do estudo. Durante essas

“visitas de saúde”, que foram agendadas nos momentos quando a criança estava livre de sintomas de OMA, foram realizados um exame físico geral e uma otoscopia pneumática, e foi obtida uma amostra do canal auditivo externo para a análise bacteriana.

[0108] Os pais foram instruídos a levarem os seus filhos a seus respectivos médicos sempre que suspeitassem de OMA. A OMA foi diagnosticada de acordo com critérios clínicos definidos, quando foram observadas simultaneamente evidências de efusão no ouvido médio, anormalidades da membrana timpânica indicando uma inflamação e pelo menos um sintoma de uma infecção aguda (febre, dor de ouvido, otorreia etc.). A presença de efusão no ouvido médio foi detectada na otoscopia pneumática. A duração do episódio da OMA foi definida com base na duração dos sintomas existentes após o diagnóstico da OMA. A amoxicilina foi o antibiótico de primeira linha para o tratamento da OMA.

3.4. Métodos microbiológicos

[0109] A microbiota das amostras do canal auditivo externo foi avaliada quantitativamente (densidade) e qualitativamente. As amostras foram obtidas do canal com um suabe sem meio. Em seguida, foi adicionado 1 ml de água de peptona e o suabe, que foi redemoinhado. O suspenso novamente foi inoculado sobre diferentes meios de ágar (incluindo as placas de ágar Columbia CNA e chocolate). As placas foram incubadas por até 48 h, em aerobiose ou em 5% de CO2, a 37ºC. O número e a morfologia das colônias bacterianas foram registrados e, pelo menos, um representante de cada morfologia das colônias foi identificado através de análise por MALDI-TOF, usando um instrumento Vitek-MS® (BioMérieux, Marcy l'Etoile, França) nas instalações da Probisearch (Tres Cantos, Espanha). A identificação foi definida como uma correspondência de 99- 100% aos valores de m/z específicos da espécie no banco de dados.

RESULTADOS

[0110] Um total de 64 crianças que preencheram os critérios de inclusão foi inscrito e recebeu o tratamento probiótico. Três crianças (~4,6%) desistiram (uma devido à ingestão de antibióticos; uma devido à timpanostomia; uma devido à alergia à proteína do leite de vaca); assim, 62 crianças completaram o estudo. A adesão durante o estudo foi excelente: a porcentagem de doses ingeridas pelas crianças foi 96%.

[0111] Pelo menos um episódio de OMA foi diagnosticado em 36% das crianças. É interessante notar que essa porcentagem foi notavelmente menor dos 65-72% relatados entre as crianças propensas à otite que foram atendidas pelos mesmos médicos, no mesmo período, e que não receberam a cepa probiótica. A porcentagem também é muito menor do que a observada em estudos anteriores com outras cepas probióticas, como o L. rhamnosus GG (Hatakka et al., 2007; Tapiovaara et al., 2014). O número de episódios de OMA durante a intervenção de 6 meses, em comparação com o período de 6 meses antes da intervenção, diminuiu em 86%.

[0112] Quando a OMA ocorreu, a duração mediana dos episódios de OMA foi 3,2 dias, que também é muito menor em comparação com as crianças não tratadas (6,0 dias) ou com os resultados obtidos em ensaios probióticos anteriores

(5,6 dias). O número de tratamentos antimicrobianos diminuiu >60% nas crianças que receberam o probiótico em relação às outras crianças propensas à otite atendidas pelos mesmos médicos. O número de episódios de outras infecções do trato respiratório superior foi <2,0 entre as crianças que receberam o probiótico (comparado a >4,6 no restante das crianças).

[0113] Globalmente, a densidade microbiana no canal auditivo externo diminuiu notavelmente ao longo do período de intervenção, de 3 log10 ufc no tempo 0 (todas as culturas eram positivas neste tempo de amostragem) para ≤2 log10 ufc no final da intervenção (com 29% das culturas sendo negativos). Mais especificamente, a prevalência de Haemophilus influenza, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Moraxella catharralis, Alloiococcus otitis, Actinomyces europaeus, Staphylococcus aureus e/ou Pseudomonas aeruginosa foi drasticamente reduzida (ou desapareceu) nas crianças participantes.

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90.

Claims (12)

REIVINDICAÇÕES

1. Uso de uma composição compreendendo uma cepa de Lactobacillus salivarius PS7 ou uma cepa que tem pelo menos 99 % de identidade com a sequência de rRNA 16S da cepa de L. salivarius PS7, caracterizado por ser para a fabricação de um agente probiótico, um agente de prevenção e/ou um agente terapêutico.

2. Uso de acordo com a 1, em que a cepa é o Lactobacillus salivarius PS7.

3. Uso de uma composição conforme definido na reivindicação 1 ou 2, caracterizado por ser para a fabricação de um medicamento para a prevenção e/ou o tratamento de Otite ou Infecções das Vias Aéreas Superiores (IVAS).

4. Uso de uma composição de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo medicamento ser para a prevenção e/ou o tratamento de Otite.

5. Uso de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pela Otite ser a Otite Média Aguda (OMA).

6. Uso de acordo com as reivindicações 3, 4 ou 5, caracterizado pelo medicamento ser para o tratamento e/ou a prevenção de Otite ou Infecções das Vias Aéreas Superiores em crianças propensas à otite.

7. Uso de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo medicamento ser para a prevenção e/ou o tratamento de Infecções das Vias Aéreas Superiores.

8. Uma cepa de Lactobacillus salivarius PS7 ou uma cepa que tem pelo menos 99 % de identidade com a sequência de rRNA 16S da cepa de L. salivarius PS7.

9. A cepa de acordo com a reivindicação 8, em que a cepa é o Lactobacillus salivarius PS7.

10. Um produto farmacêutico compreendendo uma quantidade efetiva da cepa conforme definida em quaisquer das reivindicações 8 ou 9, juntamente com excipientes farmaceuticamente aceitáveis.

11. Um produto comestível compreendendo uma quantidade efetiva da cepa conforme definida em quaisquer das reivindicações 8 ou 9, juntamente com outros ingredientes comestíveis.

12. O produto comestível de acordo com a reivindicação 11, o qual é selecionado a partir de um suplemento dietético, um nutracêutico ou um produto lácteo.