BR112020014052A2 - Dosagem subcutânea de anticorpos anti-cd38 - Google Patents

Abstract

são divulgados métodos de administração de anticorpos anti-cd38 isolados em doses baixas por via subcutânea. os métodos fornecem um tratamento eficaz para doenças autoimunes e cânceres, incluindo doenças hematológicas. também são divulgadas formas de dosagem unitárias para os anticorpos anti-cd38.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "DOSA- GEM SUBCUTÂNEA DE ANTICORPOS ANTI-CD38".

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[0001] Este pedido reivindica prioridade nos termos de 35 USC $ 119(e) do Pedido Provisório Número de Série US 62/617.146 deposi- tado em 12 de janeiro de 2018, cuja divulgação inteira do mesmo é incorporada neste documento a título de referência. INCORPORAÇÃO A TÍTULO DE REFERÊNCIA DE MATERIAL SUB-

METIDO ELETRONICAMENTE

[0002] É incorporada, a título de referência em sua totalidade, uma listagem de sequências de nucleotídeos/aminoácidos legíveis por computador, submetida simultaneamente e identificada da seguinte forma: Arquivo ASCII (texto) de 20 kilobytes chamado “101588-5009- WO-Sequence-Listing.txt”, criado em 04 de dezembro de 2018.

CAMPO DA INVENÇÃO

[0003] São divulgados métodos de administração de anticorpos anti-CD38 isolados em doses baixas e em volumes baixos por admi- nistração subcutânea (SC).

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0004] CD38, também conhecida como ADP ribose hidrolase cícli- ca, é uma glicoproteína transmembranar do tipo Il com um domínio extracelular longo C-terminal e um domínio citoplasmático curto N- terminal. A CD38 é um membro de um grupo de enzimas relacionadas ligadas à membrana ou solúveis que compreende CD157 e Aplysia ADPR ciclase. Esta família de enzimas tem a capacidade única de converter NAD em ribose ADP cíclica ou em fosfato de dinucleotídeo de adenina e ácido nicotínico. A CD38 está envolvida na mobilização de Ca? e na transdução de sinal através da fosforilação da tirosina de numerosas moléculas sinalizadoras, incluindo a fosfolipase Cy, ZAP- 70, syk e c-cbl. Com base nessas observações, a CD38 é uma molé-

cula sinalizadora importante na maturação e ativação das células lin- foides durante o desenvolvimento normal das mesmas. Entre as célu- las hematopoiéticas, uma variedade de efeitos funcionais foi atribuída à sinalização mediada por CD38, incluindo proliferação de linfócitos, liberação de citocinas, regulação do desenvolvimento e sobrevivência de células B e mieloides e indução da maturação de células dendríti- cas (DC).

[0005] A CD38 é expressa em células hematopoiéticas imaturas, reguladas de modo descendente em células hematopoiéticas maduras e re-expressas em níveis altos em linfócitos ativados e células plasmá- ticas. Por exemplo, alta expressão de CD38 é vista em células B ativa- das, células plasmáticas, células T CD4+ ativadas, células T CD8+ ati- vadas, células NK, células NKT, DCs maduras e monócitos ativados (Patente No. US 8.362.211). A deficiência de CD38 em camundongos foi associada a níveis reduzidos de células NKT reguladoras e invari- antes T periféricas, defeitos nas respostas humorais das células B e na diapedese de DC e uma forma atenuada de artrite induzida por co- lágeno (CIA) (Chiba et al. (2005) Arthrit. Rhneum. 52: 1941 a 1948).

[0006] A presença de autoanticorpos na CD38 foi associada a vá- rias doenças, incluindo diabetes, tireoidite autoimune crônica e doença de Graves (Antonelli et al. (2001) Clin. Exp. Immunol. 126: 426 a 431; Mallone et al. (2001) Diabetes 50: 752 e Antonelli et al. (2004) J. En- docrinol. Invest. 27, 695 a 707).

[0007] A expressão aumentada de CD38 foi documentada em uma variedade de doenças, incluindo doenças autoimunes e cânceres. Tais doenças incluem lúpus eritematoso sistêmico (SLE), artrite reumatoide (RA), doença inflamatória intestinal (IBD), colite ulcerativa (UC), mias- tenia gravis (MG) (Yilmaz et a/. (2018) Ann. Clin. Transl. Neurol. 5 (11): 1408 a 1414), neuromielite óptica (NMO) (Chihara et al. (2011) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 108 (9): 3701 a 3706), púrpura trombocitopênica imune (ITP), púrpura trombocitopênica trombótica (TTP) (Behzad et al. (2018) APMIS 126 (6): 523 a 532), síndrome antifosfolípide (APS) (Al- varez-Rodriguez et al. (2018) Int. J. Mol. Sci. 19(2): pi), pênfigo vulgar (PV), pênfigo foliáceo (PF), encefalite ant'NMDAR (NMDR), anemia hemolítica autoimune (AIHA), doença de Grave, nefropatia membrano- sa, síndrome de Sjogren (SS), vasculite ANCA, epidermólise bolhosa adquirida (EBA), penfigoide bolhoso (BP), tiroidite de Hashimoto, es- clerodermia, e doença relacionada ao IgGa. Em pacientes com RA, as células plasmáticas são aumentadas no tecido articular em compara- ção aos controles. Em pacientes com SLE, os blastos de plasma au- mentam no sangue periférico em pacientes com doença mais ativa. No entanto, as terapias atuais de depleção de células B baseadas em CD?20, tais como o rituximab, esgotam efetivamente as células B CD20+, mas não podem esgotar direta e efetivamente as células plasmáticas ou os blastos de plasma, porque não expressam CD20. Assim, é improvável que pacientes com RA ou SLE com altos níveis de células plasmáticas ou blastos de plasma obtenham benefícios clí- nicos substanciais com terapias baseadas em CD20.

[0008] A terapêutica que alveja CD38, que é altamente expressa em células plasmáticas, blastos de plasma, células NK, linfócitos B ati- vados, células dendríticas plasmocitoides e células T ativadas, pode fornecer um tratamento eficaz para RA e SLE, bem como outras doen- ças caracterizadas pela expressão de CD38. O nível de blastos de plasma que expressam CD38 no sangue periférico de pacientes adul- tos com SLE tratados com rituximabe e esteroides orais foi o melhor preditor de tempo de recidiva. Além disso, células secretoras de imu- noglobulina (Ig) circulantes que expressam altos níveis de CD38 foram identificadas no sangue periférico de pacientes com SLE com doença ativa, e o nível desse subconjunto foi associado a reduções induzidas pelo tratamento nos níveis de anticorpos, proteinúria e atividade da doença de anti-DNA de fita dupla (anticdsDNA) (Grammer et al. (2003) J. Clin. Invest. 112: 1506 a 1520). Além disso, as células plasmáticas são sensíveis à inibição do proteassoma e são reduzidas no sangue periférico de pacientes com SLE altamente refratários expostos ao bor- tezomibe (Alexander et a/. (2015) Ann. Rheum. Dis. 74 (7): 1474 a 1478). Essa redução correspondeu a uma diminuição nos anticorpos anti-dsDNA e a uma melhoria correspondente na atividade da doença em cada paciente. Infelizmente, a terapia foi associada a eventos ad- versos emergentes do tratamento (TEAEs; por exemplo, neuropatia, diarreia) que podem ter resultado da inibição do proteassoma em célu- las não linfoides (por exemplo, neurônios, epitélio). Coletivamente, es- ses dados indicam que a redução específica de células plasmáticas que expressam CD38 poderia produzir um benefício aprimorado ao perfil de risco para pacientes com SLE refratários. Como as terapias atuais para RA e SLE produzem respostas clínicas importantes e re- missão sustentada em apenas uma minoria de pacientes, há uma ne- cessidade urgente de explorar mecanismos adicionais de tratamento.

[0009] A expressão aumentada de CD38 foi documentada em uma variedade de doenças de origem hematopoiética, bem como em linhas celulares derivadas da mesma, e foi descrita como um marcador prog- nóstico negativo em cânceres hematológicos. Essas doenças incluem, mas não estão limitadas a, mieloma múltiplo (MM), leucemia linfoblás- tica crônica, leucemia linfocítica crônica de células B (B-CLL), incluindo leucemia linfocítica aguda de células B, leucemia linfocítica aguda de B e T (LLA), leucemia linfoblástica aguda, macroglobulinemia de Wal- denstrom, linfoma de células do manto, leucemia pró-linfocítica/mielo- cítica, leucemia mieloide aguda (AML), leucemia mieloide crônica (CML), linfoma folicular, leucemia de células NK, leucemia de células plasmáticas, linfoma não-Hodgkin (NHL), linfoma de Burkitt (BL), linfo- ma de células T (TCL), leucemia de células pilosas (HCL) e linfoma de

Hodgkin (HL). Além disso, a expressão de CD38 é um indicador prog- nóstico para pacientes com afecções tais como, por exemplo, B-CLL (Dúrig et a/. (2002) Leukemia 16: 30 a 35; e Morabito et al. (2001) Leukemia Res. 25: 927 a 932) e leucemia mielogênica aguda (Keyhani et al. (1999) Leukemia Res. 24: 153 a 159). O CD38 fornece, portanto, um alvo útil para o tratamento de doenças do sistema hematopoiético.

[0010] Vários anticorpos anti-CD38 estão em ensaios clínicos para o tratamento de cânceres associados a CD38. No entanto, estes anti- corpos terapêuticos anti-CD38 da técnica anterior ligam-se a glóbulos vermelhos (RBCs) e plaquetas, o que pode explicar por que é requeri- da uma dose mais alta necessária para superar esse coletor criado pela aglutinação aos RBCs. Por exemplo, o tratamento com daratu- mumab (mAb anti-CD38 IgG1 DarzalexO, que é aprovado pela FDA e está disponível comercialmente junto à Janssen Oncology) requer uma dose muito alta (216 mg/kg) e um regime intensivo (8 vezes por sema- na, 8 vezes a cada duas semanas, depois mensalmente) para ativida- de antitumoral ideal (Xu et al. (2017) Clin. Pharmacol. Ther. 101 (6): 721 a 724). A aglutinação do daratumumab à CD38 em RBCs e pla- quetas resulta em um teste positivo de antiglobulina (teste indireto de Coombs), que pode persistir por até 6 meses após a última infusão de daratumumab (Sullivan et a/. (2017) Blood 129 (22): 3033 a 3037). Es- ta é uma propriedade significativa do daratumumab e de outros anti- corpos que se aglutinam aos RBCs. Embora o CD38 seja expresso nas RBCs em um nível aproximadamente 1.000 vezes menor que o das células do mieloma (deWeers et al. (2011) J. Immunol. 186 (3): 1840 a 1848), existem aproximadamente 36.000 RBCs para cada célu- la de mieloma no sangue de um paciente com MM com doença ativa (Witzig et al. (1993) Cancer 72 (1): 108 a 113). Como tal, existem 36 vezes mais moléculas CD38 expressas pela população de RBCs em comparação com uma população de células tumorais. Assim, foi levan-

tada a hipótese de que os RBCs se ligam a uma quantidade significati- va de qualquer anticorpo anti-CD38 que é administrado, resultando na necessidade de administrar grandes doses para ter níveis suficientes de anticorpo anti-CD38 para alcançar um efeito terapêutico nas células tumorais.

[0011] Consequentemente, os tratamentos que utilizam anticorpos anti-CD38 estão atualmente focados na administração intravenosa (IV) devido ao alto volume de anticorpo requerido para alcançar a eficácia terapêutica, pois esses grandes volumes não são adequados para administração subcutânea e há um limite de quão concentrado o Abs pode ser formulado. Por exemplo, é aprovada uma dose de 1.200 mg de daratumumab, administrada por via intravenosa, por pelo menos 2 horas, para o tratamento de mieloma múltiplo recidivado e refratário (RRMM) e mieloma múltiplo recém-diagnosticado (NDMM). Uma for- mulação subcutânea (SC) de daratumumab, que consiste em 1.800 mg em 15 ml, que deve ser uma coformulação com Enhance'" (con- tendo Halozyme, para acelerar a absorção) e administrada 8 vezes por semana, 8 vezes a cada duas semanas e depois uma vez por mês, está atualmente em testes de Ph3 para RRMM.

[0012] Outro anticorpo anti-CD38, o isatuximabe (disponível co- mercialmente junto à Sanofi Genzyme e atualmente em ensaios clíni- cos de Fase 3), é administrado em 10 mg/kg e 20 mg/Kg, o que cor- responde a 700 a 1.400 mg por paciente com 70 kg, com um volume de injeção projetado de 3,5 a 14 ml.

[0013] As doses e volumes mais altos exigidos dos anticorpos anti- CD38 da técnica anterior atualmente na clínica também podem causar efeitos colaterais graves, como, por exemplo, anemia hemolítica, uma afecção na qual os RBCs são destruídos mais rapidamente do que podem ser substituídos. Em um estudo aberto, de braço único, o isatu- ximabe foi administrado por via intravenosa a 97 pacientes no total a 3 mg/kg a cada 2 semanas (Q2W; n = 23), 10 mg/kg Q2W por 2 ciclos seguidos por Q4W (n = 25), 10 mg/kg Q2W (n = 24) e 20 mg/kg a cada semana para 4 doses (1 ciclo) seguido de Q2W (n = 25). O evento ad- verso grave mais comum (grau 3/4) foi a anemia, que afetou 24% dos pacientes (consulte http://www.onclive.com/conference-coverage/asco- 2016/isatuximab-monotherapy-effective-for-heavily-pretreated- myeloma, the 2016 ASCO Annual Meeting; Richter et a/. (2016) J. Clin. Oncol. 34 (supl): abstr 8005). Em um estudo com daratumumab, 45% de todos os pacientes apresentaram anemia (19% dos quais eram de grau 3) e 48% dos pacientes apresentaram trombocitopenia (10% dos quais eram de grau 3 e 8% dos quais foram de grau 4) (consulte, por exemplo, https://www.rxlist.com/darzalex-side-effects-drug-center.htm; Costello (2017) Ther. Adv. Hematol. 8 (1): 28 a 37). Assim, pacientes em tratamento com isatuximab ou daratumumab devem ser cuidado- samente monitorados quanto a esses efeitos de riscos de vida e outros efeitos colaterais graves.

[0014] Os desafios físicos na administração de grandes quantida- des de mAbs anti-CD38 a pacientes subcutaneamente ilustram a ne- cessidade na técnica de anticorpos anti-CD38 mais potentes, porque um anticorpo mais potente poderia alcançar os efeitos farmacológicos desejados em uma quantidade/volume menor e, assim, permitir formas mais eficazes de administração. Um anticorpo mais potente poderia resultar na formulação de volumes mais baixos que seriam administra- dos por via SC de maneira mais eficaz que o daratumumab (Darzalex) em pacientes nos quais é justificada a depleção de células que ex- pressam CD38, como para o tratamento de doenças autoimunes e formas hematológicas de câncer. As vantagens de administrar uma quantidade menor de fármaco incluiriam a administração que levou segundos em comparação aos minutos para daratumumab adminis- trado por via SC e horas para daratumumab, isatuximab ou MOR202 administrados por via IV, bem como menos reações à infusão (como foi observado na administração por via SC de daratumumab). Reduzir o tempo que um paciente precisa gastar em um centro de infusão permitiria a opção de terapia em casa, eficiência da administração e produtividade dos centros de infusão aumentadas; menores gastos com assistência médica por paciente como resultado da eficiência ins- titucional aumentada; e maior utilidade se o fármaco puder ser usado por pacientes sem acesso a um centro de infusão.

[0015] O AB79 é um anticorpo monoclonal IgG1 de imunoglobulina totalmente humano que se aglutina especificamente a CD38 com alta afinidade (Kd = 3,5 nM) (Patente No. US 8.362.211, cujo conteúdo é incorporado neste documento a título de referência em sua totalidade). O AB79 inibe o crescimento de células tumorais que expressam CD38 por depleção celular por citotoxicidade celular dependente de anticor- po (ADCC) e citotoxicidade dependente de complemento (CDC). O AB79 também reduz o nível de células plasmáticas e blastos de plas- ma no sangue isolado de sujeitos saudáveis e em pacientes com lúpus eritematoso sistêmico (SLE). No caso do SLE, 80% da população de células plasmáticas, incluindo células plasmáticas de vida curta e lon- ga, é reduzida. Além disso, o número de células produtoras de autoan- ticorpos patogênicos também foi reduzido, incluindo anticorpos VH4-34 9G4+ (redução de 70%), anticorpo anti-Ro (redução de 70%) e anti- corpo anti-dsDNA (redução de 80%). O mAb CD38 anti-humano dara- tumumab também esgota os blastos de plasma e células plasmáticas que expressam CD38 em amostras de pacientes com SLE e RA de maneira dependente da dose in vitro. Em contraste com o daratumu- mab, o AB79 reage de maneira cruzada com CD38 expresso por ma- cacos cynomolgus, fornecendo uma oportunidade única de determinar se a redução do nível de células que expressam CD38 afetaria a in- flamação e os danos nos tecidos em um modelo de doença autoimune de primatas não humanos. Em macacos cynomolgus saudáveis, a efi- ciência da depleção de linfócitos e células B, T e NK correlacionou-se positivamente com o nível de expressão de CD38 e o nível de dose de AB79 (Pedido PCT No. PCT/US2017/042128; Patente No. US

8.362.211).

[0016] Visto que muitos anticorpos CD38 na clínica não são ade- quados para administração subcutânea de baixa dosagem ou baixo volume e possuem efeitos colaterais perigosos, permanece uma ne- cessidade na técnica de formulações de anticorpos que sejam mais seguras, mais convenientes e mais eficazes para o tratamento de do- enças em que aglutinação à CD38 é indicada, tais como doenças au- toimunes e formas hematológicas de câncer.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0017] São fornecidos neste documento métodos para o tratamen- to de doenças nas quais a aglutinação à CD38 é indicada, como, por exemplo, doenças autoimunes e cânceres hematológicos compreen- dendo a administração subcutânea de anticorpos anti-CD38 isolados em doses inesperadamente baixas e/ou volumes pequenos.

[0018] Em um aspecto, a invenção fornece um método para o tra- tamento de uma doença na qual a aglutinação à CD38 é indicada em um sujeito, o método compreendendo a etapa de administração subcu- tânea a um sujeito com uma doença na qual a aglutinação à CD38 é indicada uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo an- ti-CD38 humano isolado suficiente para tratar a doença, em que o an- ticorpo anti-CD38 compreende uma região da cadeia pesada variável (VH) que compreende uma CDR1 com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3, uma CDR2 com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 4 e uma CDR3 com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 5; e uma região da cadeia leve variável (VL) compreendendo uma CDR1 com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 6, uma CDR2 com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 7 e uma CDR3 com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 8.

[0019] Em outro aspecto, a invenção fornece um método para o tratamento de uma doença na qual a aglutinação à CD38 é indicada em um sujeito, o método compreendendo a etapa de administração subcutânea a um sujeito com uma doença na qual a aglutinação à CD38 é indicada uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anti- corpo anti-CD38 humano isolado suficiente para tratar a doença, em que o anticorpo anti-CD38 compreende uma região da cadeia VH que compreende uma CDR1 com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3, uma CDR2 com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 4 e uma CDR3 com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 5; e uma região da cadeia VL que compreende uma CDR1 com a sequên- cia de aminoácidos da SEQ ID NO: 6, uma CDR2 com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 7 e uma CDR3 com a sequência de ami- noácidos da SEQ ID NO: 8, em que o anticorpo anti-CD38 é adminis- trado em um volume de 3 mililitros ou menos.

[0020] Em outro aspecto, a invenção fornece um método para o tratamento de uma doença na qual a aglutinação à CD38 é indicada em um sujeito, o método compreendendo a etapa de administração subcutânea a um sujeito com uma doença na qual a aglutinação à CD38 é indicada de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo anti-CD38 humano isolado suficiente para tratar a doença, em que o anticorpo anti-CD38 compreende uma região da cadeia VH que compreende uma CDR1 com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3, uma CDR2 com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 4 e uma CDR3 com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 5; e uma região da cadeia VL que compreende uma CDR1 com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 6, uma CDR2 com a se- quência de aminoácidos da SEQ ID NO: 7 e uma CDR3 com a se-

quência de aminoácidos da SEQ ID NO: 8, em que o anticorpo anti- CD38 é administrado em uma dosagem de 0,03 a 0,6 miligrama por quilograma de peso corporal.

[0021] Em um aspecto, o anticorpo anti-CD38 não causa anemia hemolítica ou trombocitopenia.

[0022] Em um aspecto, a administração do anticorpo anti-CD38 resulta em menos de 60%, menos de 50%, menos de 40%, menos de 30%, menos de 25%, menos de 20%, menos de 15%, menos de 10 % ou menos de 5% de incidência de grau 3 ou 4 de um ou mais eventos adversos emergentes do tratamento (TEAEs) selecionados do grupo que consiste em anemia, anemia hemolítica, trombocitopenia, fadiga, reações relacionadas à infusão (IRRs), leucopenia e linfopenia.

[0023] Em um aspecto, o anticorpo anti-CD38 resulta em menos de 10%, menos de 20%, menos de 30%, menos de 40%, menos de 50% de depleção de RBCs.

[0024] Em um aspecto, o anticorpo anti-CD38 resulta em menos de 10%, menos de 20%, menos de 30%, menos de 40%, menos de 50% de depleção de plaquetas.

[0025] Em um aspecto, a doença é selecionada do grupo que con- siste em uma doença autoimune e um câncer.

[0026] Em um aspecto, a doença autoimune é selecionada do gru- po que consiste em lúpus eritematoso sistêmico (SLE), artrite reuma- toide (RA), doença inflamatória intestinal (IBD), colite ulcerativa, mias- tenia gravis (MG), neuromielite óptica (NMO), púrpura trombocitopêni- ca imune (ITP), púrpura trombocitopênica trombótica (TTP), síndrome antifosfolipídica (APS), pênfigo vulgar (PV), pênfigo foliáceo (PF), en- cefalite antinMDAR (NMDR), anemia hemolítica autoimune (AIHA), doença de Grave, nefropatia membranosa, síndrome de Sjogren (SS), vasculite ANCA, epidermólise bolhosa adquirida (EBA), penfigoide bo- lhoso (BP), tireoidite de Hashimoto, esclerodermia, doença relacionada a IgG, e doença do enxerto contra hospedeiro. (Yilmaz V, et. al., Ann Clin Transl Neurol. 22 de setembro de 2018; 5 (11): 1408 a 1414; Chi- hara N, Aranami T, Sato W, Miyazaki Y, Miyake S, Okamoto T, Ogawa M, Toda T, Yamamura T. Proc Natl Acad Sci U S A. 1 de março de 2011; 108 (9): 3701 a 3706; Behzad MM, et a/., APMIS. Junho de 2018; 126 (6): 523 a 532; ou Alvarez-Rodriguez L., et a/., Int J Mol Sci. 16 de fevereiro de 2018; 19 (2).

[0027] Em um aspecto, o câncer hematológico é selecionado do grupo que consiste em mieloma múltiplo, linfoma de células NK/T, leu- cemia linfoblástica crônica, leucemia linfocítica crônica, leucemia de células plasmáticas, leucemia mieloide aguda, leucemia mieloide crô- nica, linfoma de células B e linfoma de Burkitt.

[0028] Em um aspecto, o câncer hematológico é o mieloma múlti- plo. Em certas modalidades, o mieloma múltiplo é selecionado do gru- po que consiste em RRMM e EDMM.

[0029] Em um aspecto, em que a região da cadeia VH tem a se- quência de aminoácidos da SEQ ID NO: 9 e a região da cadeia VL tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10.

[0030] Em um aspecto, o anticorpo anti-CD38 compreende uma sequência de aminoácidos da cadeia pesada da SEQ ID NO: 11 e uma sequência de aminoácidos da cadeia leve da SEQ ID NO: 12.

[0031] Em um aspecto, a quantidade terapeuticamente eficaz é uma dosagem de 0,03 a 0,6 miligrama por quilograma de peso corpo- ral.

[0032] Em um aspecto, a quantidade terapeuticamente eficaz está em um volume de 3 mililitros ou menos.

[0033] Em um aspecto, a quantidade terapeuticamente eficaz está em um volume de 2 mililitros ou menos.

[0034] Em um aspecto, a quantidade terapeuticamente eficaz está em um volume de 1 mililitro ou menos.

[0035] Em um aspecto, o anticorpo anti-CD38 humano é adminis- trado na forma de uma composição farmaceuticamente aceitável.

[0036] Em outro aspecto, a invenção fornece um método para o tratamento de um câncer hematológico em um sujeito, o método com- preende a etapa de administração subcutânea a um sujeito com um câncer hematológico de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo anti-CD38 humano isolado suficiente para tratar o câncer hematológico, em que o anticorpo anti-CD38 compreende uma região da cadeia VH que compreende uma CDR1 com a sequência de ami- noácidos da SEQ ID NO: 3, uma CDR2 com a sequência de aminoáci- dos da SEQ ID NO: 4 e uma CDR3 com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 5; e uma região de cadeia variável VL que compreen- de uma CDR1 com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 6, uma CDR?2 com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 7 e uma CDR3 com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 8.

[0037] Em outro aspecto, a invenção fornece um método para o tratamento de um câncer hematológico em um sujeito, o método com- preende a etapa de administração subcutânea a um sujeito com um câncer hematológico de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo anti-CD38 humano isolado suficiente para tratar o câncer hematológico, em que o anticorpo anti-CD38 compreende uma região da cadeia VH que compreende uma CDR1 com a sequência de ami- noácidos da SEQ ID NO: 3, uma CDR2 com a sequência de aminoáci- dos da SEQ ID NO: 4 e uma CDR3 com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 5; e uma região da cadeia VL que compreende uma CDR1 com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 6, uma CDR2 com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 7 e uma CDR3 com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 8 em que o anticorpo an- ti-CD38 é administrado em um volume de 3 ml! ou menos, 2 ml ou me- nos ou 1 ml ou menos.

[0038] Em outro aspecto, a invenção fornece um método para o tratamento de um câncer hematológico em um sujeito, o método com- preende a etapa de administração subcutânea a um sujeito com um câncer hematológico de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo anti-CD38 humano isolado suficiente para tratar o câncer hematológico, em que o anticorpo anti-CD38 compreende uma região da cadeia VH que compreende uma CDR1 com a sequência de ami- noácidos da SEQ ID NO: 3, uma CDR2 com a sequência de aminoáci- dos da SEQ ID NO: 4 e uma CDR3 com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 5; e uma região da cadeia VL que compreende uma CDR1 com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 6, uma CDR2 com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 7 e uma CDR3 com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 8 em que o anticorpo an- ti-CD38 é administrado em uma dosagem de 0,03 a 0,6 miligrama por quilograma de peso corporal.

[0039] Em um aspecto, o anticorpo anti-CD38 não causa anemia hemolítica ou trombocitopenia.

[0040] Em um aspecto, a administração do anticorpo anti-CD38 resulta em menos de 60%, menos de 50%, menos de 40%, menos de 30%, menos de 25%, menos de 20%, menos de 15%, menos de 10 % ou menos de 5% de incidência de grau 3 ou 4 de um ou mais TEAEs selecionados do grupo que consiste em anemia, incluindo anemia he- molítica, trombocitopenia, fadiga, reações relacionadas à infusão (IRRs), leucopenia e linfopenia.

[0041] Em um aspecto, o anticorpo anti-CD38 resulta em menos de 10%, menos de 20%, menos de 30%, menos de 40% ou menos de 50% de depleção de RBCs.

[0042] Em um aspecto, o anticorpo anti-CD38 resulta em menos de 10%, menos de 20%, menos de 30%, menos de 40% ou menos de 50% de depleção de plaquetas.

[0043] Em um aspecto, o câncer hematológico é selecionado do grupo que consiste em mieloma múltiplo, leucemia linfoblástica crôni- ca, leucemia linfocítica crônica, leucemia de células plasmáticas, leu- cemia mieloide aguda, leucemia mieloide crônica, linfoma de células B, linfoma de células NK/T e linfoma de Burkitt.

[0044] Em um aspecto, o câncer hematológico é o mieloma múlti- plo. Em certas modalidades, o mieloma múltiplo é selecionado do gru- po que consiste em RRMM e EDMM.

[0045] Em um aspecto, a região da cadeia VH tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 9 e a região da cadeia VL tem a sequên- cia de aminoácidos da SEQ ID NO: 10.

[0046] Em um aspecto, o anticorpo anti-CD38 compreende uma sequência de aminoácidos da cadeia pesada da SEQ ID NO: 11 e uma sequência de aminoácidos da cadeia leve da SEQ ID NO: 12.

[0047] Em um aspecto, a quantidade terapeuticamente eficaz é uma dosagem de 0,03 a 0,6 miligrama por quilograma de peso corpo- ral.

[0048] Em um aspecto, a quantidade terapeuticamente eficaz está em um volume de 3 mililitros ou menos.

[0049] Em um aspecto, a quantidade terapeuticamente eficaz está em um volume de 2 mililitros ou menos.

[0050] Em um aspecto, a quantidade terapeuticamente eficaz está em um volume de 1 mililitro ou menos.

[0051] Em um aspecto, o anticorpo anti-CD38 humano é adminis- trado na forma de uma composição farmaceuticamente aceitável.

[0052] Em outro aspecto, a invenção fornece uma forma de dosa- gem unitária que compreende um anticorpo isolado que compreende uma sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 9 e uma sequência de aminoácidos da região variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 10, em que o anticorpo isolado se liga a

CD38, em que a forma de dosagem unitária é formulada para adminis- tração subcutânea do anticorpo em uma dosagem de 0,03 a 0,6 mili- grama por quilograma de peso corporal.

[0053] Em um aspecto, a cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11 e a cadeia leve compreende a se- quência de aminoácidos da SEQ ID NO: 12.

[0054] Em um aspecto, a forma de dosagem unitária está em um volume de 3 mililitros ou menos.

[0055] Em um aspecto, a forma de dosagem unitária está em um volume de 2 mililitros ou menos.

[0056] Em um aspecto, a forma de dosagem unitária está em um volume de 1 mililitro ou menos.

[0057] Em um aspecto, a forma de dosagem unitária é formulada para administração subcutânea do anticorpo no tratamento de um câncer hematológico selecionado do grupo que consiste em mieloma múltiplo, leucemia linfoblástica crônica, leucemia linfocítica crônica, leucemia de células plasmáticas, leucemia mieloide aguda, mieloide crônica leucemia, linfoma de células B e linfoma de Burkitt.

[0058] Em um aspecto, o câncer hematológico é o mieloma múlti- plo. Em certas modalidades, o mieloma múltiplo é selecionado do gru- po que consiste em RRMM e EDMM.

[0059] Em um aspecto, o anticorpo anti-CD38 não causa anemia hemolítica ou trombocitopenia.

[0060] Em um aspecto, o anticorpo anti-CD38 resulta em menos de 10%, menos de 20%, menos de 30%, menos de 40% ou menos de 50% de depleção de RBCs.

[0061] Em um aspecto, o anticorpo anti-CD38 resulta em menos de 10%, menos de 20%, menos de 30%, menos de 40% ou menos de 50% de depleção de plaquetas.

[0062] Estas e outras modalidades, características e vantagens potenciais se tornarão aparentes com referência à seguinte descrição e desenhos.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0063] Os objetos e características da invenção podem ser melhor compreendidos por referência aos desenhos descritos abaixo nos quais,

[0064] A Figura 1 mostra os dados PK do macaco cynomolgus (cyno) dos grupos de doses SC descritos na Tabela 2. Os anticorpos antifármaco (ADA) foram detectados com um ensaio eletroquimilumi- nescente qualitativo validado (ECL). A incidência aumentou com o tempo e afetou a PK quando atingiu um título de limiar específico de cerca de 1.000 (log (7)).

[0065] A Figura 2 mostra os dados PK de cyno e os modelos PK para AB79. Os painéis A e B mostram os dados PK brutos dos dados IV dos 8 estudos com macacos; painel A, nos primeiros 7 dias após a primeira dose e painel B durante todo o período de observação. Os dados do SC foram omitidos (consulte a Figura 1 para dados do SC). O painel C retrata a estrutura final do modelo PK, incluindo a disposi- ção de fármacos mediada pelo alvo (TMDD) marcada com uma caixa azul. Vc designa o volume do compartimento central onde as concen- trações de AB79 são observadas (marcadas com Conc). Vp designa o volume do compartimento periférico. Rita representa o compartimento do receptor CD38 aglutinado e não aglutinado ao anticorpo. Ksyn e KpecG designam as constantes da taxa de produção e degradação do receptor e Kinr a constante da taxa de internalização (constante da ta- xa de eliminação complexa). Kss é a constante de estado estacionário, definida como Kss = (KorF + Kint)/Kon, em que Korr é a taxa constante de dissociação e Kon de aglutinação. Os painéis D a F mostram as so- breposições das previsões lineares do modelo com 2 compartimentos (mediana, intervalo de 95% de previsão) sem um componente TMDD e os dados observados das 3 doses mais baixas (Estudo 8). Observe as diferentes escalas de tempo entre os painéis D, E F.

[0066] A Figura 3 mostra os efeitos da ADA e a PK em um estudo de toxicologia de cyno de 13 semanas. A avaliação refere-se ao mode- lo de PK da população final (Figura 2, Tabela 2). A seguir, são apre- sentadas as seguintes plotagens de qualidade de ajuste (GOF) estrati- ficadas por dose e via de administração (Keiser et al. (2013) CPT Pharmacometrics Syst. Pharmacol. 2: e50): (1) Resíduos ponderados condicionais (CWRES) versus tempo; (2) Concentração observada versus previsão do modelo populacional; (3) CWRES versus previsão do modelo populacional; e (4) Concentração observada versus previ- são de modelo individual.

[0067] A Figura 4 mostra gráficos de GOF para o modelo PK da população final estratificados por dose e via de administração (IV - cruzes, SC - triângulos). Figura 4A - em geral; Figura 4B - dose 0,03 mg/kg; Figura 4C - dose 0,1 mg/kg; Figura 4D - dose 0,3 mg/kg; Figura 4E - dose 1,0 mg/kg; Figura 4F - dose 2,0 mg/kg; Figura 4G - dose 3,0 mg/kg; Figura 4H - dose 30 mg/kg; Figura 41 - dose 80 mg/kg; e Figura 4J - dose 100 mg/kg.

[0068] A Figura 5 mostra uma comparação da expressão de CD38 na superfície das células NK, B e T humanas e de macaco. As medi- ções citométricas de fluxo foram padronizadas e os sinais são relata- dos em moléculas de fluorescência solúvel equivalente (MOEF). Os linfócitos do sangue humano e de macaco aglutinam níveis semelhan- tes de AB79. Comparação direta dos níveis de expressão de CD38 em células NK de macaco (CD3-, CD159a+), células B (CD3-, CD20+) e células T (CD3+) e células NK humanas (CD3-, CD16/CD56+), células B (CD3-, CD19+) e células T (CD3 +) foram avaliadas por citometria de fluxo. A intensidade mediana de fluorescência (MFI) para um tingimen- to de AB79 para cada população de células foi convertida em unidades

MOEF com uso de uma curva padrão gerada com uso de Rainbow Beads (Spherotech; Lake Forest, IL). Os dados mostrados são de 3 indivíduos de cada espécie e mostram o MOEF + SD para cada tipo de célula. Existem diferenças na expressão de CD38 entre os linfócitos sanguíneos, com um nível mais alto de aglutinação ao AB79 nas célu- las NK > células B > células T. O padrão de aglutinação ao AB79 é semelhante nas células sanguíneas dos macacos, mas o nível de aglutinação ao AB79/expressão de CD38 é mais baixo.

[0069] A Figura 6 mostra a variabilidade inter e intraindividual nos dados de contagem de células T, células B e células NK dos animais tratados com placebo do estudo retratado na Figura 5. Figura 6A - cé- lulas NK; Figura 6B - células B; e Figura 6C - células T.

[0070] A Figura 7 mostra as contagens de células NK, B e T pré- dose (células por uL) estratificadas por estudo (linha superior) ou sexo (linha inferior). Figura 7A - células NK por estudo; Figura 7B - células B por estudo; Figura 7C - células T por estudo; Figura 7D - células NK por macho/fêmea; Figura 7E - células B por macho/fêmea; e Figura 7F - células T por macho/fêmea.

[0071] A Figura 8 mostra a depleção de célula NK, célula B e célu- las T dependente de AB79. Os gráficos focam as alterações que ocor- reram nos primeiros 7 dias após o tratamento com a primeira dose de AB79. Foi possível reunir dados de estudos de dose única e múltipla com um esquema de administração semanal ou quinzenal. Figura 8A - Depleção de células Nadir para células NK; Figura 8B - 1 semana após a 1º dose para células NK; Figura 8C - perfil médio por grupo de dose para células NK; Figura 8D - Depleção de células Nadir para cé- lulas B; Figura 8E - 1 semana após a 1º dose para as células B; Figura 8F - perfil médio por grupo de dose para células B; Figura 8G - Deple- ção de células Nadir para células T; Figura 8H - 1 semana após a 1º dose para células T; e Figura 81 - perfil médio por grupo de dose para células T. Os gráficos A C mostram as contagens mínimas individuais de células (isto é, o efeito máximo de PD), as contagens de célula in- dividual 7 dias após a primeira dose e a média por dose dos perfis de depleção celular e estrutura do modelo PK-PD das células NK, respec- tivamente. Os gráficos D a F mostram as mesmas informações para as células B e os gráficos G a | mostram as mesmas informações para as células T.

[0072] A Figura 9 mostra o efeito do tratamento com AB79 nos RBCs dois dias após a dose (Figura 9A) e a contagem total de linfóci- tos no primeiro dia após a dose no Estudo 7 (Tabela 2) (Figura 9B).

[0073] A Figura 10 mostra perfis simulados de depleção de célu- las PK e NK humanas, células B e células T de AB79. Com base nos modelos de PK e PK-PD de macaco em escala, foram simulados 5 perfis de PK de dose única IV e SC e depleção de células (de 0,0003 a 1 mg/kg). Os gráficos à esquerda mostram os dados após a adminis- tração IV e os gráficos à direita mostram os dados após a administra- ção SC. A primeira linha de plotagens exibe os perfis de PK. O limite inferior de quantificação (LLOQ) de 0,05 pg/ml é indicado por uma |i- nha tracejada horizontal. A PK da dose mais baixa foi completamente sobreposta pelo ruído e apenas em doses de 0,03 mg/kg a PK atingiu níveis acima do LLOQ. Figura 9A - AB79 via IV; Figura 9B - AB79 via SC; Figura 9C -via IV em células NK; Figura 9D - via SC em células NK; Figura 9E -via IV em células B; Figura 9F - via SC em células B; Figura 9G - via IV em células T; e Figura 9H - via SC em células T.

[0074] A Figura 11 mostra o plano para um estudo de toxicidade de dose única crescente de AB79 em voluntários saudáveis. Um total de 6 coortes IV e 4 coortes SC em 74 sujeitos foram randomizados e receberam uma dose única de AB79. Os dados extensos de seguran- ça cega, PK e PD foram analisados após cada coorte antes do aumen- to da dose. Os critérios de parada incluíram a depleção de células-alvo para evitar potencial imunossupressão de voluntários saudáveis. Cada sujeito foi acompanhado por 92 dias após a administração.

[0075] A Figura 12 mostra gráficos GOF para modelos PK-PD, estratificados na rota de administração (IV - vermelho; SC - azul) com Figura 12A - células NK; Figura 12B - células B; e Figura 12C - células T.

[0076] A Figura 13 mostra que AB79 medeia a depleção de linfóci- tos de macaco. AB79 dependente de dose esgotou células NK > célu- las B > células T no sangue em macacos cynomolgus fêmeas (n = 4/grupo de doses) após uma única dose IV de AB79 quantificada com fluorosferas Flow-Count"M (Beckman-Coulter) usando citometria de fluxo. As amostras foram coletadas no pré-tratamento (Semana -1), Dia 1: pré-dose, pós-dose aos 15, 30 minutos, 1, 4, 8, 24, 48, 96 e 168 horas, nos Dias 10, 15, 22, 29, 36, 43, 50 e 57. Apenas 2 semanas de dados são mostradas para maior clareza. Os valores médios do núme- ro de células foram calculados em cada ponto no tempo e foram usa- dos para calcular a % da contagem de linha de base. Figura 13A - cé- lulas T; Figura 13B - células B; e Figura 13C - células NK.

[0077] A Figura 14 mostra que as respostas de recall do toxoide tetânico humano (TTd) são reduzidas pelo tratamento com AB79. Ca- mundongos CB17/SCID foram tratados com GM1 antiasialo para eli- minar as células NK e, em seguida, receberam 25 x 10º de linfócitos do sangue periférico humano. Após 7 a 10 dias, amostras de soro fo- ram coletadas para avaliação de lg humana e o nível de lg foi a base para a randomização. Os camundongos receberam TTd para induzir a resposta de recall e foram tratados com os anticorpos indicados duas vezes/semana durante 10 dias. Três dias após o último tratamento, o soro foi coletado e analisado quanto a anticorpos anti-TTd. O AB79 suprimiu de forma dependente da dose a resposta de recall do TTd, em uma extensão semelhante ao Rituxan (Rtx) (Isótipo (Iso), Rix e

AB79, todos em 10 mg/kg).

[0078] A Figura 15 mostra que AB79 não induz a indução de cito- cinas. O AB79 não aumentou os níveis de IL-6 em PBMCs coletadas de 4 sujeitos diferentes após incubação de 24 horas em comparação com o controle do isótipo IgG1. Os controles positivos PHA e anti-CD3 aumentaram os níveis de citocinas em todos os sujeitos, demonstran- do que as células tinham capacidade para produzir IL-6. Resultados semelhantes foram observados com PBMCs estimulados por 48 horas quando foram testados IL-2, IL-4, IL.-10, GM-CSF, IFNy e TNFa (dados não mostrados). As barras são da seguinte forma para cada sujeito: (i) Sem Ab; (ii) controle de isótipo; (ili) AB79; (iv) anti-CD3; (v) PHA. Cada valor é uma média de poços triplicados + SD medidos 24 horas após a incubação.

[0079] A Figura 16A mostra a configuração do experimento de aglutinação a seco, aglutinação a úmido e solúvel da Figura 16B (mo- dificado de Stebbings et a/. (2007) J. Imnmunol. 179, 3325 a 3331).

[0080] A Figura 16B mostra que AB79 não possui atividade ago- nista. O AB79 estava altamente concentrado quando foi adicionado aos poços em solução e o líquido deixado evaporar (Aglutinação a Se- co) versus o AB79 permitido ligar-se aos poços em solução (Aglutina- ção Úmida) ou adicionado diretamente aos PBMCs (Solúvel). O AB79 não estimulou IL-6 ou IL-2, IL-4, IL-8, I1L-10, GM-CSF, IFNy ou TNFa em nenhuma das condições testadas após 24 horas. A IL-8 foi produ- zida constitutivamente por PBMCs e não foi alterada por nenhum tra- tamento (dados não mostrados). Cada medida é uma média de poços triplicados medidos 24 horas após a incubação de um único sujeito.

[0081] A Figura 17 mostra uma avaliação da aglutinação de AB79 a RBCs humanos. Não foi observada neste estudo aglutinação do AB79 (histograma sólido) ou controle de isótipo (histograma hachura- do) à RBC no sangue total de trinta voluntários humanos. Dados re-

presentativos de 15 de 30 voluntários humanos são mostrados.

[0082] A Figura 18 mostra uma avaliação da aglutinação de AB79 a RBCs de macaco cynomolgus. Não foi observada neste estudo aglu- tinação de AB79 (histograma sólido) ou controle de isótipo (histograma hachurado) à RBC no sangue total de trinta macacos cynomolgus. Da- dos representativos de 15 de 30 cynos são mostrados.

[0083] A Figura 19 mostra uma avaliação da aglutinação de AB79 a plaquetas humanas. Não foi observada neste estudo aglutinação de AB79 (histograma sólido) ou controle de isótipo (histograma hachura- do) a plaquetas bloqueadas por CD61+ no sangue total de trinta volun- tários humanos. Dados representativos de 15 de 30 voluntários huma- nos são mostrados.

[0084] A Figura 20 mostra uma avaliação da aglutinação de AB79 a plaquetas de macaco cynomolgus. Não foi observada neste estudo aglutinação do AB79 (histograma sólido) ou controle de isótipo (histo- grama hachurado) às plaquetas bloqueadas por CD61+ no sangue to- tal de trinta macacos cynomolgus. Dados representativos de 15 de 30 cynos são mostrados.

[0085] A Figura 21 mostra uma avaliação da aglutinação de AB79 a linfócitos CD45+ de macaco cynomolgus. A aglutinação de AB79 a linfócitos CD45+ no sangue total de macacos cynomolgus não lisados. Os linfócitos CD45+ são bloqueados e, em seguida, a aglutinação de AB79 (histograma sólido) ou controle de isótipo (histograma hachura- do) foi avaliado. A aglutinação AB79 foi detectada em um subconjunto dos linfócitos, conforme ilustrado na fração de células à direita da linha tracejada vertical. Observa-se pouca ou nenhuma aglutinação do con- trole do isótipo aos linfócitos.

[0086] A Figura 22 mostra a hierarquia de bloqueio para (A) identi- ficação de RBC e (B) identificação de linfócitos de RBCs humanas.

[0087] A Figura 23 mostra a capacidade de aglutinação de anti-

corpos para biotina-estreptavidina-BV421 AB79 e biotina-estreptavi- dina-BV421 daratumumab. As barras representam (i) esferas negati- vas, (ii) somente controle negativo Sav-Bv421, (iii) AB79-biotina/Sav- BV421 (5 pg/ml), (iv) daratumumabe-biotina/Sav-BV421 (5 pg/ml), (v) AB79-biotina/Sav-BV421 (10 ug/ml), (vi) daratumumab-biotina/Sav- BV421 (10 pg/ml). MFI = fluorescência mediana, Sav = estreptavidina. Foi utilizada uma voltagem do tubo fotomultiplicador (PMT) de 275.

[0088] A Figura 24 mostra a aglutinação de biotina-estreptavidina- BV421 AB79 e biotina-estreptavidina-BV421 daratumumab aos linfóci- tos CD38+. As barras representam (i) AB79-biotina-estrep-BV421 (O ug/ml), (ii) AB/79 e AB79-biotina-estrep-BV421 não marcados (10 pg/ml), (iii) AB79-biotina-estrep-BV421 (10 pg/ml), (iv) daratumumab- biotina-estrep-BV421 (0 pg/ml), (v) daratumumab e daratumumab- biotina-estrep-BV421 não marcados (10 pg/ml), (vi) daratumumabe- biotina-strep-BV421 (10 pg/ml). As linhas verticais representam o des- vio padrão; n = 4 doadores (3 doadores para condições não marca- das). MFI = fluorescência mediana.

[0089] A Figura 25 mostra a aglutinação de AB79 e daratumumab a RBCs humanas (% de resultados positivos de doadores individuais). Sangue periférico de quatro voluntários saudáveis incubados com bio- tina-estreptavidina-BV421 AB79 (0, 0,1, 10, 100 pg/ml) ou biotina- estreptavidina-BV421 daratumumab (0, 0,1, 1, 10, 100 pg/ml) por 3 horas à RT em um agitador suave na presença ou ausência de AB79 não marcado (500 pg/ml) ou daratumumab não marcado (500 pg/ml). Chave: —*- AB79-biotina-estrep-BV421; -4-AB79 frio e AB79- biotina-estrep-BV421; tt daratumumabe-biotina-estrep-BV421; - = - daratumumab frio e daratumumabe-biotina-estreptavidina BV421.

[0090] A Figura 26 mostra a aglutinação do AB79 e do daratumu- mab às RBCs humanas (resumo da % de dados positivos). Sangue periférico de quatro voluntários saudáveis incubados com biotina-

estreptavidina-BV421 AB79 (0, 0,1, 10, 100 pg/ml) ou biotina-estrepta- vidina-BV421 daratumumab (0, 0,1, 1, 10, 100 pg/ml) por 3 horas à RT em um agitador suave na presença ou ausência de AB79 não marcado (500 pg/ml) ou daratumumab não marcado (500 pg/ml). Chave: ==> AB79-biotina-estrep-BV421; = AB79 frio e AB79-biotina-estrep- BV421; tt daratumumabe-biotina-estrep-BV421; >— daratumumab frio e daratumumab-biotina-strep-BV421.

[0091] A Figura 27 mostra a aglutinação de AB79 e daratumumab às RBCs humanas (fluorescência mediana do doador individual). San- gue periférico de quatro voluntários saudáveis incubados com biotina- estreptavidina-BV421 AB79 (O, 0,1, 10, 100 pg/ml) ou biotina-estrepta- vidina-BV421 daratumumab (0, 0,1, 1, 10, 100 pg/ml) por 3 horas à RT em um agitador suave na presença ou ausência de AB79 não marcado (500 pg/ml) ou daratumumab não marcado (500 pg/ml). Chave: Ar AB79-biotina-estrep-BV421; -&- AB79 frio e AB79-biotina-estrep- BV421; to daratumumabe-biotina-estrep-BV421; -=- daratumu- mab frio e daratumumab-biotina-strep-BV421.

[0092] A Figura 28 mostra a aglutinação de AB79 e daratumumab às RBCs humanas (resumo da fluorescência mediana). Sangue perifé- rico de quatro voluntários saudáveis incubados com biotina-estreptavi- dina-BV421 AB79 (0, 0,1, 10, 100 pg/ml) ou biotina-estreptavidina- BV421 daratumumab (0, 0,1, 1, 10, 100 pg/ml) por 3 horas à RT em um agitador suave na presença ou ausência de AB79 não marcado (500 pg/ml) ou daratumumab não marcado (500 pg/ml). Chave: => AB79-biotina-estrep-BV421; = AB79 frio e AB79-biotina-estrep- BV421; tt daratumumabe-biotina-estrep-BV421; >— daratumumab frio e daratumumab-biotina-strep-BV421.

[0093] A Figura 29 mostra a hemólise (% normalizada) das células de glóbulos vermelhos humanos por: O controle de isótipo I9gG1 hu- mano, õ daratumumab, É AB79, e % controle de saponina em pg/ml.

Cada símbolo representa a média de 3 réplicas de humanos (n = 5 do- adores).

[0094] A Figura 30 mostra a hemólise (% normalizada) das células de glóbulos vermelhos de macacos cynomolgus por: O controle de isótipo I9G1 humano, a daratumumab, Ô AB79, e S controle de sa- ponina em ug/ml. Cada símbolo representa a média de 3 réplicas de cyno (n = 5 doadores).

[0095] A Figura 31 mostra (A) a concentração média de AB79 no soro de macacos com infusão IV com AB79 e a variação percentual da linha de base pré-dose nas contagens médias absolutas de células (B) células CD20/CD3/CD16*NK; (C) células B CD3/CD20*; e (D) células T CD3* no sangue periférico de macacos após infusão IV de AB79. Controle de veículo (quadrados abertos), 0,1 mg/kg (diamantes aber- tos), 0,3 mg/kg (triângulos abertos), 1,0 mg/kg (círculos abertos), 3,0 mg/kg (quadrados fechados), 30,0 mg/kg (diamantes fechados) e 80,0 mg/kg (triângulos fechados) de AB79. Coortes denotadas com símbo- los abertos (n = 7 animais) foram dosadas semanalmente e símbolos fechados (n = 5 animais) a cada duas semanas durante 3 meses. As barras de erro indicam o desvio padrão.

[0096] A Figura 32 mostra a aglutinação dependente da concen- tração de AB79 (A) a células CHO que expressam CD38 recombinante de macaco cynomolgus; e (B) a CD38 de macaco cynomolgus endó- geno expresso em linfócitos T CD3+, linfócitos B CD3-CD20+ e células CD3-/CD20-/CD16+ NK. Níveis de células NK no sangue total de ma- cacos cynomolgus (n = 3) após incubação com AB79 por 48 horas em cultura estão retratados na Figura 22C.

[0097] A Figura 33 mostra o cronograma da estratégia de dosa- gem para o Exemplo 7.

[0098] A Figura 34 mostra as (A) medidas de peso corporal nor- malizadas para variação percentual a partir do momento da inscrição:

Um animal de controle não artrítico (círculos abertos); animais artríti- cos não tratados (círculos fechados); animais tratados profilaticamente com AB79 (quadrados abertos); animais tratados terapeuticamente com AB79 (quadrados fechados); animais tratados terapeuticamente com dexametasona (triângulos abertos); (B) Escore clínico médio de artrite de 16 articulações: animais artríticos não tratados (círculos fe- chados); animais tratados profilaticamente com AB79 (quadrados abertos); animais tratados terapeuticamente com AB79 (quadrados fechados); animais tratados terapeuticamente com dexametasona (tri- ângulos abertos); (C) o número de articulações PIP com edema articu- lar; e (D) a área oval média de 16 articulações PIP calculada e relata- da como o edema médio articular de cada animal. O exame radiográfi- co foi realizado após a radiografia para todas as articulações de (E) DIP e (F) MCP. Os dados são a média + erro padrão para cada grupo. * p <0,05 ** p <0,01 em comparação com o grupo não tratado (Teste de Comparação Múltipla de One-ANOVAWDunn).

[0099] A Figura 35 mostra as medições do peso corporal (A) nor- malizadas para a variação percentual a partir do momento da inscri- ção: Um animal de controle não artrítico (círculos abertos); animais artríticos não tratados (círculos fechados); animais tratados profilati- camente com AB79 (quadrados abertos); animais tratados terapeuti- camente com AB79 (quadrados fechados); animais tratados terapeuti- camente com dexametasona (triângulos abertos). Níveis químicos no soro de (B) PCR e (C) ALP ao longo do tempo: Os dados são a média + erro padrão para cada grupo. * p <0,05 ** p <0,01 em comparação com o grupo não tratado (Teste de Comparação Múltipla de One- ANOVAWDUunn).

[00100] A Figura 36 mostra histomorfometria quantitativa da área articular e da superfície das articulações DIP realizadas às cegas por um histopatologista ósseo usando lâminas tingidas com azul de tolui-

dina (32 x 22 animais = 704 lâminas). Os resultados individuais de ca- da animal foram plotados como a média + erro padrão para cada gru- po. A análise estatística foi conduzida conforme especificado no gráfi- co acima. (A) área total da cartilagem articular; (B) espessura da carti- lagem articular danificada; (C) por cento da superfície articular danifi- cada; e (D) área osteófita. Os dados são a média + erro padrão para cada grupo. * p <0,05 ** p <0,01 em comparação com o grupo não tra- tado (Teste de Comparação Múltipla de One-ANOVAWDunn).

[00101] A Figura 37 mostra os níveis químicos de soro de (A) CRP e (B) ALP ao longo do tempo. Um animal de controle não artrítico (cír- culos abertos); animais artríticos não tratados (círculos fechados); animais tratados profilaticamente com AB79 (quadrados abertos); ani- mais tratados terapeuticamente com AB79 (quadrados fechados); animais tratados terapeuticamente com dexametasona (triângulos abertos). Os dados são a média + erro padrão para cada grupo. * p <0,05 ** p <0,01 em comparação com o grupo não tratado (Teste de Comparação Múltipla de One-ANOVAWDunn).

[00102] A Figura 38 mostra os níveis de (A) células vermelhas do sangue; (B) hematócrito; (C) reticulócitos, (D) plaquetas, (E) neutrófilos e (F) linfócitos em animais ao longo do tempo: um animal de controle não artrítico (círculos abertos); animais artríticos não tratados (círculos fechados); animais tratados profilaticamente com AB79 (quadrados abertos); animais tratados terapeuticamente com AB79 (quadrados fechados); animais tratados terapeuticamente com dexametasona (tri- ângulos abertos). Os dados são a média + erro padrão para cada gru- po. * p <0,05 ** p <0,01 em comparação com o grupo não tratado (Teste de Comparação Múltipla de One-ANOVAWDunn).

[00103] A Figura 39 mostra os níveis de (A) células NK; (B) células B; (C) células T e; (D) monócitos no sangue periférico ao longo do tempo: Um animal de controle não artrítico (círculos abertos); animais artríticos não tratados (círculos fechados); animais tratados profilati- camente com AB79 (quadrados abertos); animais tratados terapeuti- camente com AB79 (quadrados fechados); animais tratados terapeuti- camente com dexametasona (triângulos abertos). Os dados são a mé- dia + erro padrão para cada grupo. * p <0,05 ** p <0,01 em compara- ção com o grupo não tratado (Teste de Comparação Múltipla de One- ANOVAIWDunn).

[00104] A Figura 40 mostra as concentrações de soro de AB79 em macacos individuais quando administradas (A) profilaticamente ou (B) terapeuticamente. Concentrações de soro de anticorpos anti-AB79 em macacos individuais quando administradas (C) profilaticamente ou (D) terapeuticamente.

[00105] A Figura 41 mostra os perfis médios de concentração de soro-tempo de AB79 após uma infusão única IV de 2 horas de AB79 a 0,03 (quadrados) e 0,06 (triângulos) mg ou uma injeção única SC de AB79 a 0,6 mg kg” (círculos) em sujeitos saudáveis. As barras de erro representam o desvio padrão (n = 6). IV, intravenoso; SC, subcutâneo.

[00106] As Figura 42A a 42B mostram níveis de células NK no sangue periférico de sujeitos saudáveis após uma única administração IV ou SC de AB79. IV, intravenoso; SC, subcutâneo.

[00107] A Figura 43 mostra níveis de blastos de plasma, monóci- tos, células B, T e NK no sangue periférico de sujeitos saudáveis após uma única injeção de controle de placebo, 0,1, 0,3 ou 0,6 mg kg de AB79 SC. —— Monócitos absolutos (células/uL), “Células NK (células/UuL), = = Total de células T (células/uL), - - - «Células B (célu- las/ uL), 7 células de blastos de plasma (células/ yL). As curvas centralizadas representam a mediana. NK, exterminador natural (célu- la); SC, subcutâneo.

[00108] A Figura 44 mostra a alteração dos níveis de linha de base de IgA total, IgG e IgM no soro de sujeitos saudáveis após uma única administração de placebo ou de 0,003 a 0,06 mg kg” de AB79 IV, pla- cebo ou de 0,03 a 0,6 mg kg" de AB79 SC. Os símbolos representam o valor médio da coorte e as barras de erro representam o erro padrão da média. O placebo, O AB790,0003 mg/kg & AB79 0,001 mg/kg + AB79 0,003 mg/kg X AB79 0,01 mg/kg O AB790,03 mg/kg & AB79 0,06 mg/kg = AB790,1mg/kg * AB790,3mg/kg * AB79 0,6 mg/kg. Ig, imunoglobulina; IV, intravenoso; SC, subcutâneo.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[00109] A presente invenção refere-se a métodos para o tratamento de doenças relacionadas ao CD38 pela administração subcutânea de doses baixas (< 600 mg) e volumes (< 3 ml) de anticorpos anti-CD38.

[00110] AB79, daratumumab, isatuximab e MOR202 são IgG1s que exterminam principalmente tumores por citotoxicidade celular depen- dente de anticorpo (ADCC). Este mecanismo requer que as células efetoras, tais como as células NK, se aglutinem a anticorpos nas célu- las-alvo e formem uma sinapse lítica para secretar agentes citotóxicos de maneira focalizada. A frequência dessas células efetoras no san- gue é de magnitude inferior à das RBCs e plaquetas. Por exemplo, a razão entre RBCs e células NK no sangue é de 20.000:1. Além disso, existem aproximadamente 36 vezes mais moléculas CD38 expressas em RBCs do que em células de mieloma de pacientes com doença ativa. Postulou-se que a atividade efetora do daratumumab, isatuximab e MOR202 é desviada dos tumores porque as células efetoras são principalmente aglutinadas pelos anticorpos anti-CD38 aglutinados às RBCs e plaquetas, impedindo a formação de uma sinapse lítica com os tumores, o que resulta em uma baixa eficiência do ADCC. Em con- traste, a RBC e plaqueta diminuída ou mais transitória aglutinada pelo AB79 em relação ao daratumumab podem permitir que as células efe- toras se concentrem no tumor, o que resulta em ADCC mais eficiente, maior atividade tumoricida e menor dose eficaz.

[00111] O tratamento de pacientes com anticorpos anti-CD38 que se ligam a glóbulos vermelhos e plaquetas também pode resultar em efeitos colaterais com risco de vida. Por exemplo, o tratamento de RRMM com MORZ202 resultou em vários eventos adversos emergen- tes ao tratamento (TEAEs) (consulte, por exemplo, Raab et al. (2015) Blood 126: 3035). Os TEAEs mais comuns em qualquer grau foram anemia (15 pacientes, 34%), fadiga (14 pacientes, 32%), reações rela- cionadas à infusão (IRRs) e leucopenia (13 pacientes, 30% cada), lin- fopenia e náusea (11 pacientes, 25% cada). Os TEAEs de grau 23 fo- ram relatados para 28 pacientes (64%); os mais comuns incluíram lin- fopenia (8 pacientes, 18%), leucopenia (5 pacientes, 11%) e hiperten- são (4 pacientes, 9%). As IRRs surgiram principalmente durante a pri- meira infusão; todas eram de grau 1 a 2, exceto em um paciente (grau 3). Infecções foram comumente relatadas (26 pacientes, 59%), mas na maioria dos casos não foram consideradas relacionados ao tratamen- to. O MORZ20?2 foi utilizado apenas clinicamente por infusão IV. Isto contrasta com a presente invenção que permite a administração sub- cutânea de AB79 em doses baixas e em volumes baixos, conforme descrito neste documento.

[00112] São conhecidos outros anticorpos Morphosys que alvejam CD38 (consultar, por exemplo, documento WO 2006/125640, que divulga quatro anticorpos humanos: MORO3077, MORO3079, MORO3080 e MORO3100 e dois anticorpos murinos: OKT10 e IB4). Estes anticorpos da técnica anterior são inferiores ao AB79 por uma variedade de ra- zões. MORO3080 se aglutina a CD38 humano e CD38 de cynomolgus mas com uma baixa afinidade para o CD38 humano (Biacore Kp = 27,5 nm). OKT10 se aglutina a CD38 humano e CD38 de cynomolgus mas com uma afinidade baixa/moderada para o CD38 humano (Biaco- re Ko = 8,28 nm). MORO3079 se aglutina a CD38 humano com uma afinidade elevada (Kp Biacore = 2,4 nm), mas não se aglutina a CD38 de cynomolgus. MORO3100 e MORO3077 se aglutinam a CD38 huma- no com uma afinidade moderada ou baixa (Biacore Ko = 10 nm e 56 nm, respectivamente). Por comparação, Ab79 se aglutina a CD38 hu- mano e de cynomolgus com uma alta afinidade (para o CD38 humano com Biacore Kp = 5,4 nm). Além disso, os anticorpos da técnica anteri- or apresentam fraca atividade de ADCC e CDC.

[00113] Uma vantagem do ADCC mais eficiente é a capacidade de administrar um terapêutico anti-CD38 como uma injeção de baixo vo- lume. Se o AB79 for formulado em uma concentração de 135 mg/ml, uma dose eficaz para um paciente de 80 kg com mieloma pode ser administrada como uma injeção única SC de <2,5 ml. Por outro lado, a dose SC de daratumumab sendo testada em ensaios clínicos Ph3 é de

1.800 mg suspensa em uma coformulação de 15 ml de Enhance'v" (Halozyme).

[00114] A segurança, tolerabilidade, farmacocinética e farmacodi- nâmica do AB79 administrado IV e SC foram inicialmente caracteriza- das em macacos. O AB79 foi administrado como uma dose única por bolus IV ou injeção SC a macacos cynomolgus em solução salina es- téril (IV) ou solução de diluição SC a 0,03, 0,1 e 0,3 mg/kg (4 fê- meas/grupo). Para a via IV, a Cmax foi aproximadamente proporcional à dose de 0,03 a 0,3 mg/kg AB79, e a AUC(0-t) foi maior que a propor- cional à dose de 0,03 a 0,1 mg/kg AB79, mas foi aproximadamente proporcional à dose de 0,1 a 0,3 mg/kg AB79. Para a via SC, a Cmax e a AUC(0-t) aumentaram com a dose, mas AUC(0-t) aumentou mais que a dose proporcionalmente após a dose SC na faixa de 0,03 a 0,3 mg/kg. O T12 foi estimado entre 120 e 144 horas. A biodisponibilidade média para a via SC foi de aproximadamente 100% (120%, 73% e 120% para 0,03, 0,1 e 0,3 mg/kg, respectivamente). A administração de AB79 a 0,03, 0,1 ou 0,3 mg/kg através de uma única injeção intra- venosa ou subcutânea em macacos cynomolgus fêmeas foi bem tole-

rada. Efeitos farmacológicos previstos de reduções leves a moderadas nos linfócitos (linfócitos T, linfócitos B) e reduções dependentes da do- se nas populações de células NK foram observados em todos os ní- veis de dose e por ambas as vias; os efeitos máximos de depleção ce- lular após a administração SC foram semelhantes ou ligeiramente infe- riores aos observados após a administração IV no mesmo nível de do- se (Roepcke et al. (2018) Pharmacol. Res. Perspect. 6 (3): e00402). Com base nos resultados deste estudo, o nível de efeito adverso não observado (NOAEL) foi considerado como 0,3 mg/kg pelas vias IV e SC. Alterações nos linfócitos e células NK foram resolvidas após um período de 56 dias sem AB79. A AUC e Cmax séricas associadas ao NOAEL foram 574 h*ug/ml e 7,94 ug/ml para IV e 698 h*ug/ml e 2,15 ug/ml para SC, respectivamente.

[00115] A segurança, tolerabilidade, farmacocinética e farmacodi- nâmica do AB79 foram então caracterizadas clinicamente em um es- tudo randomizado, duplo-cego, controlado por placebo, de uma única infusão intravenosa (IV) ou injeção de 1 ml subcutânea (SC) em coor- tes de doses crescentes de sujeitos humanos saudáveis. O AB79 foi bem tolerado, todos os eventos adversos (AEs) foram leves ou mode- rados e não houve retiradas devido aos AEs ou reações à infusão (Fedyk et al. (2018) Blood 132: 3249). Em coortes de doses mais altas, aumentos transitórios, leves a moderados nos níveis de citocinas coin- cidiram com reduções nas células que expressam CD38; os sintomas clínicos incluíram principalmente pirexia, dor de cabeça e hipotensão postural. Não foram relatadas constatações notáveis para exames la- boratoriais, eletrocardiogramas, sinais vitais ou exames físicos relacio- nados ao tratamento com o AB79. O AB79 reduziu os níveis de jatos de plasma e células exterminadoras naturais (NK) em doses seme- lhantes, com 50% da dose eficaz máxima (EDso) de 0,003 mg/kg na IV e de 0,1 mg/kg na SC. Reduções nas imunoglobulinas totais (Id) Me À ocorreram sem alterações comparáveis na IgG. As contagens totais de células brancas do sangue, granulócitos, linfócitos, células vermelhas do sangue e plaquetas permaneceram dentro da faixa normal para to- dos os níveis de dose. Em suma, o AB79 reduziu seletivamente o nível de blastos de plasma e células NK no sangue periférico de sujeitos saudáveis quando administrado IV ou SC e foi, de modo geral, seguro e bem tolerado. Esse perfil plasmocitolítico pode ser útil no tratamento de distúrbios causados pelo plasma ou células NK, contrapartes ma- lignas (por exemplo, mieloma múltiplo e leucemia de células NK) e an- ticorpos ou Igs patogênicos.

[00116] O AB79 pode induzir uma resposta terapêutica (por exem- plo, remissão da doença) em doenças mediadas por anticorpos ou Ig de modo relativamente rápido, porque direciona diretamente as células plasmáticas, diferentemente da terapêutica que visa os progenitores das células B das células plasmáticas (por exemplo, mAbs anti-BAFF (por exemplo, belimumab), mAbs anti-CD20 (por exemplo, rituximab) e inibidores de BTK (por exemplo, baricitinib)). Essas últimas estratégias visam indiretamente as células plasmáticas, eliminando essencialmen- te a geração de novo de células plasmáticas, inibindo a diferenciação de antecessores. Os conjuntos de células plasmáticas pré-existentes permanecem relativamente inalterados e continuam produzindo anti- corpos/lgs patogênicos durante toda a sua vida útil. Assim, a vida útil das células plasmáticas pré-existentes, algumas das quais sobrevivem por décadas, conduziria a uma possível redução no anticorpo/lg pato- gênico, razão pela qual estratégias indiretas podem exibir um início mais lento de atividade e eficácia do que o AB79. A única outra tera- pêutica demonstrada para reduzir diretamente as células plasmáticas são os inibidores do proteassoma (por exemplo, bortezomib) e essa classe de agentes é relativamente pouco tolerada e inclui eventos ad- versos limitantes da dose (por exemplo, neuropatia, diarreia) atribuídos à inibição do proteassoma em células não plasmáticas (por exemplo, neurônios, células epiteliais), porque o proteassoma é expresso ubi- quamente nesses tecidos. Assim, a especificidade de AB79 para CD38 combinada com o perfil de expressão restrita de CD38, cria um meca- nismo de ação que atinge diretamente as células plasmáticas, minimi- zando os efeitos das células não plasmáticas e tem o potencial de for- necer rápida eficácia em doenças causadas por células plasmáticas, contrapartes transformadas e/ou anticorpos/lgs patogênicos.

[00117] Os métodos anti-CD38 e dosagens unitárias da divulgação fornecem, pela primeira vez, administração subcutânea de doses e volumes baixos terapeuticamente eficazes de anticorpos anti-CD38, proporcionando benefícios inesperados e impedindo os efeitos colate- rais, inconveniências e despesas da administração de altas doses, te- rapias sistêmica com anticorpos anti-CD38.

[00118] A presente invenção fornece métodos e formas de dosa- gem unitária para administração subcutânea de uma quantidade tera- peuticamente eficaz de um anticorpo anti-CD38 isolado a um paciente que necessita do mesmo para tratar doenças nas quais a aglutinação à CD38 é indicada, incluindo cânceres hematológicos. Em algumas modalidades, o anticorpo para administração subcutânea compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende SEQ ID NO: 9 e uma região variável de cadeia leve que compreende SEQ ID NO: 10. O anticorpo anti-CD38 fornecido neste documento é capaz de ser te- rapeuticamente eficaz quando administrado em doses inesperadamen- te baixas e, como tal, pode ser administrado em um volume surpreen- dentemente pequeno, facilitando a administração subcutânea.

[00119] Outra vantagem dos anticorpos anti-CD38 da invenção é que, diferentemente de outros anticorpos anti-CD38 na clínica, os anti- corpos anti-CD38 da presente invenção (por exemplo, AB79) são ca- pazes de se aglutinar ao macaco cynomolgus (cyno) CD38, fornecen-

do um modelo animal útil para avaliação pré-clínica da tolerabilidade, toxicidade e eficácia da dose, etc.

[00120] Outra vantagem dos anticorpos anti-CD38 da invenção é que eles podem ser usados para triar outros anticorpos que competem pela aglutinação à CD38 no mesmo epítopo e podem ser úteis nos métodos e dosagens unitárias da invenção.

[00121] Outra vantagem dos anticorpos anti-CD38 da invenção é que eles podem ser usados para triar outros anticorpos com aglutina- ção diminuída ou alternativa (por exemplo, mais transitória) a RBCs e/ou plaquetas em relação ao daratumumab e podem ser úteis nos métodos e dosagens unitárias da invenção, por exemplo, um anticorpo que compita ou se aglutine ao mesmo epítopo que AB79.

[00122] A menos que definido de outro modo neste documento, os termos científicos e técnicos usados em conjunto com a presente in- venção deverão ter os significados que são comumente entendidos por aqueles versados na técnica. O significado e o escopo dos termos devem ser claros. No entanto, no caso de qualquer ambiguidade laten- te, as definições proporcionadas neste documento têm preferência em relação a qualquer dicionário ou definição extrínseca. Adicionalmente, a menos que de outro modo requerido pelo contexto, os termos singu- lares deverão incluir pluralidades e os termos plurais deverão incluir o singular. O termo "ou" inclui "e/ou", salvo indicação em contrário. Além disso, o uso do termo "incluindo", "inclui" ou "incluído" não é limitativo. Termos tais como “elemento” ou “componente” englobam tanto ele- mentos e componentes que compreendem uma unidade e elementos e componentes que compreendem mais do que uma subunidade a não ser que especificamente apresentado de outro modo.

[00123] Os métodos e técnicas da presente invenção são geralmen- te realizados de acordo com métodos convencionais bem conhecidos na técnica e conforme descrito em várias referências gerais e mais es-

pecíficas que são citadas e discutidas ao longo do presente relatório descritivo, salvo indicação em contrário. As nomenclaturas usadas em conexão com, e os procedimentos e técnicas laboratoriais de cultura de células e tecidos, biologia molecular, imunologia, microbiologia, ge- nética, química e hibridização de proteínas e ácidos nucleicos, química analítica, química orgânica sintética e química medicinal e farmacêuti- ca descritos neste documento são os bem conhecidos e comumente usados na técnica. Técnicas padrão são usadas para sínteses quími- cas, análises químicas, preparação farmacêutica, formulação, adminis- tração e tratamento de pacientes. As reações enzimáticas e as técni- cas de purificação comerciais são realizadas de acordo com as especi- ficações do fabricante, como comumente realizado na técnica ou como descrito neste documento.

[00124] Todos os títulos e designações de seção são usados para fins de clareza e referência apenas e não serão considerados limitati- vos de qualquer maneira. Por exemplo, aqueles versados na técnica apreciarão a utilidade de combinar vários aspectos da divulgação de diferentes títulos e seções, conforme apropriado, de acordo com o es- pírito e escopo da invenção descrita no presente documento.

[00125] Os termos selecionados são definidos abaixo para que a presente invenção seja mais facilmente entendida.

[00126] Os termos "CD38 humano" e "antígeno CD38 humano" re- ferem-se à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1, ou a uma fra- ção funcional da mesma, como um epítopo, conforme definido neste documento (Tabela 1). Em geral, o CD38 possui uma cauda intracito- plasmática curta, um domínio transmembranar e um domínio extrace- lular. Os termos “CD38 de cynomolgus" e "antígeno de CD38 de cynomolgus" referem-se à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2, que é 92% idêntica à sequência de aminoácidos de CD38 humano (Tabela 1). Sinônimos para CD38 incluem ADP ribose hidrolase cíclica;

ADP cíclico ribose-hidrolase 1; ADP ribosil ciclase; ADP-ribosil ciclase 1; cADPr hidrolase 1; CD38-rs1; 1-19; antígeno NIM-R5; 2'-fosfo- cíclico-ADP-ribose transferase; 2'-fosfo-ADP-ribosil ciclase; 2'-fosfo- cíclico-ADP-ribose transferase; 2'-fosfo-ADP-ribosil ciclase; e T10. TABELA 1. SEQUÊNCIA DE AMINOÁCIDOS DE CD38 HUMANO E

DE MACACO CYNOMOLGUS Sequência de aminoácidos 1234567890123456789012345678901234567890 CD38 MANCEFSPVSGDKPCCRLSRRAQLCLGVSILVLILVWLAVVYWPRWROQWSG | 1 humano PGTTKRFPETVLARCVKYTEIHPEMRHVDCQSVWDAFKGAFISKHPCNITEED

YQPLMKLGTQTVPCNKILLWSRIKDLAHQFTQVQRDMFTLEDTLLGYLADDLT WCGEFNTSKINYOSCPDWRKDCSNNPVSVFWKTVSRRFAEAACDVVHVML NGSRSKIFDKNSTFGSVEVHNLQPEKVOTLEAWVIHGGREDSRDLCQDPTIK

ELESIISKRNIQFSCKNIYRPDKFLQCVKNPEDSSCTSEI CD38 Cyno | MANCEFSPVSGDKPCCRLSRRAQVCLGVCLLVLULVVWAVWLPRWROQW |2

SGSGTTSRFPETVLARCVKYTEVHPEMRHVDCQSVWDAFKGAFISKYPCNIT EEDYQPLVKLGTQTVPCNKTLLWSRIKDLAHQFTQVARDMFTLEDMLLGYLA DDLTWCGEFNTFEINYQSCPDWRKDCSNNPVSVFWKTVSRRFAETACGVVH VMLNGSRSKIFDKNSTFGSVEVHNLQPEKVQALEAWVIHGGREDSRDLCQD

PTIKELESIISKRNIRFFCKNIYRPDKFLQCVKNPEDSSCLSGI CD157 MAAQGCAASRLLQLLLQLLLLLLLLAAGGARARWRGEGTSAHLRDIFLGRCA | 13 humano EYRALLSPEQRNKNCTAIWEAFKVALDKDPCSVLPSDYDLFINLSRHSIPRDK

SLFWENSHLLVNSFADNTRRFMPLSDVLYGRVADFLSWCRQKNDSGLDYQS CPTSEDCENNPVDSFWKRASIQYSKDSSGVIHVMLNGSEPTGAYPIKGFFAD YEIPNLOQKEKITRIEIWVMHEIGGPNVESCGEGSMKVLEKRLKDMGFQYSCIN DYRPVKLLQCVDHSTHPDCALKSAAAATQRKAPSLYTEQRAGLIIPLFLVLAS RTQL

[00127] Os termos “quantidade terapeuticamente eficaz" e “dosa- gem terapeuticamente eficaz” referem-se a uma quantidade de uma terapia que é suficiente para reduzir ou melhorar a severidade e/ou duração de um distúrbio ou um ou mais sintomas do mesmo; prevenir o avanço de um distúrbio; causar regressão de um distúrbio; prevenir a recorrência, desenvolvimento, início ou progressão de um ou mais sin- tomas associados a um distúrbio; ou intensificar ou aperfeiçoar o efeito profilático ou terapêutico (ou os efeitos profiláticos ou terapêuticos) de outra terapia (por exemplo, agente profilático ou terapêutico), em do- sagens e por períodos de tempo necessários para alcançar um resul- tado terapêutico desejado. Uma quantidade terapeuticamente eficaz pode variar de acordo com fatores, tais como o estado de doença, ida- de, sexo e peso do indivíduo, e a capacidade dos medicamentos em elicitar uma resposta desejada no indivíduo. Uma quantidade terapeu- ticamente eficaz de um anticorpo é uma em que quaisquer efeitos tóxi- cos ou prejudiciais do anticorpo ou da porção de anticorpo são com- pensados pelos efeitos terapeuticamente benéficos. Uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo para terapia tumoral também pode ser medida por sua capacidade em estabilizar a progressão da doença. A capacidade de um composto em inibir câncer pode ser ava- liada em um sistema de modelo animal preditivo de eficácia em câncer humano.

[00128] Os termos "paciente" e "sujeito" incluem seres humanos e outros animais. Assim, as composições, dosagens e métodos divulga- dos neste documento são aplicáveis a terapias humanas e veteriná- rias. Em uma modalidade, o paciente é um mamífero, por exemplo, um ser humano.

[00129] O termo "doença na qual a aglutinação à CD38 é indicada" significa uma doença na qual a aglutinação de um parceiro de agluti- nação (por exemplo, um anticorpo anti-CD38 da divulgação) a CD38 fornece um efeito profilático ou curativo, incluindo a melhoria de um ou mais sintomas da doença. Essa aglutinação pode resultar no bloqueio de outros fatores ou parceiros de aglutinação a CD38, neutralização de CD38, ADCC, CDC, ativação do complemento ou algum outro me- canismo pelo qual a doença é prevenida ou tratada. Fatores e parcei- ros de aglutinação para CD38 incluem autoanticorpos para CD38, que são bloqueados pelos anticorpos anti-CD38 da invenção. Essa agluti- nação pode ser indicada como consequência da expressão de CD38 por células ou um subconjunto de células, por exemplo, células MM, pelo qual fornecer um parceiro de aglutinação de CD38 ao sujeito re- sulta na remoção, por exemplo, da lise, dessas células, por exemplo, por meio de hemólise ou apoptose. Essa expressão de CD38 pode ser, por exemplo, normal, sobrexpressa, expressa de maneira inade-

quada ou uma consequência da ativação de CD38, em relação às cé- lulas normais ou em relação a outros tipos de células durante um es- tado de não doença ou estado de doença.

[00130] O termo "câncer hematológico" refere-se a neoplasias ma- lignas de tecidos formadores de sangue e abrange leucemias, linfomas e mielomas múltiplos. Exemplos não limitativos de afecções associa- das à expressão aberrante de CD38 incluem, mas não estão limitados a, mieloma múltiplo (MM) (Jackson et a/. (1988) Clin. Exp. Immunol. 72: 351-356) incluindo MM refratários recidivantes (RRMM) ou MM re- cém-diagnosticados (NDMM); Leucemia linfocítica crônica de células B (B-CLL) (Dúrig et a/. (2002) Leukemia 16: 30 a 35; Morabito et al. (2001) Leukemia Res. 25: 927 a 932; Marinov et a/. (1993) Neoplasma 40 (6): 355 a 358 e Jelinek et a/. (2001) Br. J. Haematol. 115: 854 a 861); leucemia linfoblástica aguda (Keyhani et a/. (1999) Leukemia Res. 24: 153 a 159; e Marinov et a/. (1993) Neoplasma 40 (6): 355 a 358); leucemia mieloide crônica (Marinov et a/. (1993) Neoplasma 40 (6): 355 a 358); leucemia mieloide aguda (Keyhani et al. (1999) Leukemia Res. 24: 153 a 159); leucemia linfocítica crônica (LLC); leu- cemia mieloide crônica ou leucemia mieloide crônica (LMC); leucemia mieloide aguda ou leucemia mieloide aguda (LMA); leucemia linfocítica aguda (LLA); leucemia de células pilosas (HCL); Linfoma de células NK/T, síndromes mielodisplásicas (MDS) (Nurulhuda et a/. (2017) Blo- od 130: 2814); e todos os subtipos e estágios (por exemplo, fase blás- tica de CML (BP), fase crônica (CP) ou fase acelerada (AP)) dessas leucemias e outras doenças hematológicas, definidas por técnicas morfológicas, histoquímicas e imunológicas bem conhecidas para aqueles versados na técnica.

[00131] Os termos "neoplasia" e “afecção neoplásica" referem-se a uma afecção associada à proliferação de células caracterizada por uma perda de controles normais que resulta em um ou mais sintomas,

incluindo crescimento não regulado, falta de diferenciação, desdiferen- ciação, invasão local de tecidos e metástase.

[00132] O termo "anticorpo isolado" refere-se a um anticorpo que é substancialmente livre de outros anticorpos com especificidades anti- gênicas diferentes. Por exemplo, um anticorpo isolado que se liga es- pecificamente a CD38 está substancialmente livre de anticorpos que se ligam especificamente a antígenos que não sejam CD38. Um anti- corpo isolado que se aglutina especificamente a um epítopo, isoforma ou variante de CD38 humano ou CD38 de cynomolgus pode, no entan- to, ter reatividade cruzada com outros antígenos relacionados, por exemplo, de outras espécies, como homólogos de espécies CD38. Além disso, um anticorpo isolado pode ser substancialmente livre de outro material celular e/ou substâncias químicas.

[00133] Os termos “células vermelhas do sangue”, “RBCs” e “eritró- citos” referem-se às células sanguíneas contendo hemoglobina deri- vadas da medula óssea que transportam oxigênio para as células e tecidos e transportam dióxido de carbono de volta aos órgãos respira- tórios. Os RBCs também são referidos como células vermelhas, cor- púsculos vermelhos do sangue, hematídeos e células eritroides.

[00134] Os termos “aglutinação específica", “aglutina-se especifi- camente a" e "é específico para" em referência à interação de um de- terminado anticorpo, proteína ou peptídeo com um antígeno, epítopo ou outra espécie química significa aglutinação que é diferente de for- ma mensurável de uma interação não específica. A aglutinação espe- cífica pode ser medida, por exemplo, determinando-se a aglutinação de uma molécula em comparação à aglutinação de uma molécula de controle, que geralmente é uma molécula de estrutura semelhante que não tem atividade de aglutinação. Por exemplo, a aglutinação especiífi- ca pode ser determinada por competição com uma molécula de con- trole que é semelhante ao alvo. Os anticorpos anti-CD38 da presente invenção aglutinam especificamente a ligantes CD38. Os termos “aglu- tinação específica", "se aglutinam especificamente a", e "é específico para" também significam que a interação depende da presença de uma estrutura específica (por exemplo, um determinante antigênico ou epítopo) nas espécies químicas; por exemplo, um anticorpo reconhece e se liga a uma estrutura proteica específica, e não às proteínas em geral. Se um anticorpo é específico ao epítopo "A", a presença de uma molécula contendo o epítopo A (ou A livre e não marcado) em uma reação que contém "A" marcado e o anticorpo reduzirá a quantidade de A marcado ligado ao anticorpo. A aglutinação específica para um antígeno particular ou um epítopo pode ser exibida, por exemplo, por um anticorpo que tem uma KD para um antígeno ou epítopo de pelo menos cerca de 10º M, pelo menos cerca de 10º M, pelo menos cerca de 10º M, pelo menos cerca de 107 M, pelo menos cerca de 10º M, pelo menos cerca de 10º M, alternativamente, pelo menos cerca de 107º M, pelo menos cerca de 10 M, pelo menos cerca de 10? M, ou maior, em que KD refere-se a uma taxa de dissociação de uma intera- ção particular entre anticorpo e antígeno. Tipicamente, um anticorpo que se liga especificamente a um antígeno terá uma KD que é 20, 50, 100, 500, 1.000, 5.000, 10.000 vezes superior ou mais para uma mo- lécula de controle em relação ao antígeno ou epítopo. Além disso, a aglutinação específica a um antígeno particular ou epítopo particular pode ser exibida, por exemplo, por um anticorpo que tem uma KA ou Ka para um antígeno ou epítopo pelo menos 20, 50, 100, 500, 1.000,

5.000, 10.000 vezes superior ou mais para o epítopo em relação a um controle, em que KA ou Ka refere-se a uma taxa de associação de uma interação particular entre anticorpo e antígeno.

[00135] O termo "durante um período de tempo" refere-se a qual- quer período de tempo, por exemplo, minutos, horas, dias, meses ou anos. Por exemplo, durante um período de tempo pode se referir a pe-

lo menos 10 minutos, pelo menos 15 minutos, pelo menos 30 minutos, pelo menos 60 minutos, pelo menos 75 minutos, pelo menos 90 minu- tos, pelo menos 105 minutos, pelo menos 120 minutos, pelo menos 3 horas, pelo menos 4 horas, pelo menos 5 horas, pelo menos 6 horas, pelo menos 7 horas, pelo menos 8 horas, pelo menos 9 horas, pelo menos 10 horas, pelo menos 12 horas, pelo menos 14 horas, pelo menos 16 horas, pelo menos 18 horas, pelo menos 20 horas, pelo menos 22 horas, pelo menos um dia, pelo menos dois dias, pelo me- nos três dias, pelo menos 4 dias, pelo menos 5 dias, pelo menos 6 di- as, pelo menos uma semana, pelo menos no mês, pelo menos um ano ou qualquer intervalo de tempo entre os citados. Em outras palavras, o anticorpo da composição pode ser absorvido pelo indivíduo a quem o mesmo é administrado por um período de pelo menos 10 minutos, pe- lo menos 15 minutos, pelo menos 30 minutos, pelo menos 60 minutos, pelo menos 75 minutos, pelo menos pelo menos 90 minutos, pelo me- nos 105 minutos, pelo menos 120 minutos, pelo menos 3 horas, pelo menos 4 horas, pelo menos 5 horas, pelo menos 6 horas, pelo menos 7 horas, pelo menos 8 horas, pelo menos 9 horas, em pelo menos 10 horas, pelo menos 12 horas, pelo menos 14 horas, pelo menos 16 ho- ras, pelo menos 18 horas, pelo menos 20 horas, pelo menos 22 horas, pelo menos um dia, pelo menos dois dias, pelo menos três dias, pelo menos 4 dias, pelo menos 5 dias, pelo menos 6 dias, pelo menos uma semana, pelo menos no mês, pelo menos um ano ou qualquer interva- lo de tempo entre eles.

[00136] Uma composição que "substancialmente" compreende um componente significa que a composição contém mais de cerca de 80% em peso, em algumas modalidades mais de cerca de 90% em peso, em algumas modalidades mais de cerca de 95% em peso, em algu- mas modalidades mais do que cerca de 97% em peso, em algumas modalidades mais do que cerca de 98% em peso, em algumas moda-

lidades mais do que cerca de 99% em peso do componente.

[00137] O termo “cerca de" refere-se a uma extensão próxima em número, grau, volume, tempo, etc., com apenas variações diminutas na dimensão de até 10%.

[00138] O termo “carreador farmaceuticamente aceitável" refere-se a um material, composição ou veículo farmaceuticamente aceitável, adequado para administrar compostos da presente invenção a mamí- feros. Os carreadores incluem material de enchimento líquido ou sóli- do, diluente, excipiente, solvente ou material de encapsulamento, en- volvidos no transporte ou condução do composto em questão de um órgão, ou porção do corpo, para outro órgão ou porção do corpo. Cada carreador deve ser “aceitável” no sentido de ser compatível com os outros ingredientes da formulação e não prejudicial ao paciente. Em uma modalidade, o carreador farmaceuticamente aceitável é adequa- do para administração intravenosa. Em outra modalidade, o carreador farmaceuticamente aceitável é adequado para injeção locorregional. Em outra modalidade, o carreador farmaceuticamente aceitável é ade- quado para administração subcutânea. Em outra modalidade, o carre- ador farmaceuticamente aceitável é adequado para injeção subcutãà- nea.

[00139] O termo "composição farmacêutica" refere-se a prepara- ções adequadas para administração a um sujeito e tratamento de do- ença. Quando os anticorpos anti-CD38 da presente invenção são ad- ministrados como produtos farmacêuticos para mamíferos, por exem- plo, humanos, eles podem ser administrados "como são" ou como uma composição farmacêutica contendo o anticorpo anti-CD38 em combi- nação com um carreador farmaceuticamente aceitável e/ou outros ex- cipientes. A composição farmacêutica pode ser na forma de uma forma de dosagem unitária para administração de uma dosagem específica do anticorpo anti-CD38 em uma concentração específica, uma quanti-

dade específica ou um volume específico. São fornecidas composi- ções farmacêuticas que compreendem os anticorpos anti-CD38, isola- damente ou em combinação com agentes profiláticos, agentes tera- pêuticos e/ou carreadores farmaceuticamente aceitáveis.

[00140] As unidades estruturais tradicionais de anticorpo compre- endem tipicamente um tetrâmero. Cada tetrâmero é tipicamente com- posto por dois pares idênticos de cadeias polipeptídicas, sendo que cada par tem uma cadeia “leve” (que tem tipicamente um peso molecu- lar de cerca de 25 kDa) e uma cadeia “pesada” (que tem tipicamente um peso molecular de cerca de 50 a 70 kDa). As cadeias leves huma- nas são classificadas como cadeias leves de kappa e lambda. As ca- deias pesadas são classificadas como mu, delta, gama, alfa ou epsilon e definem o isótipo do anticorpo como IgM, 1gD, IgG, IgA e IgE, res- pectivamente. O IgG possui várias subclasses, incluindo, porém sem limitação, I9G1, I9gG2, IgG3 e IgG4. O IgM possui subclasses, incluin- do, porém sem limitação, IgM1 e IgM2. Desse modo, “isótipo” refere-se a qualquer uma das subclasses de imunoglobulinas definidas pelas características químicas e antigênicas das regiões constantes das mesmas. Os isótipos de imunoglobulina humana conhecidos são I9G1, I9G2, 1963, IgG4, IgA1, IgA2, IgM1, IgM2, IgD e IgE. Os anticorpos terapêuticos também podem compreender híbridos de isótipos e/ou subclasses.

[00141] Cada região variável pesada (VH) e variável leve (VL) (com cerca de 100 a 110 aminoácidos de comprimento) é composta por três regiões hipervariáveis chamadas “regiões determinantes de comple- mentaridade” (CDRs) e quatro regiões estruturais (FRs) (cerca de 15 a aminoácidos de comprimento), dispostas a partir do terminal amino ao terminal carbóxi na seguinte ordem: FR1I-CDR1-FR2-CDR2-FR3- CDR3-FRA4. "Variável" refere-se ao fato de que as CDRs diferem ex- tensivamente em sequência entre os anticorpos e, assim, determina um sítio de aglutinação ao antígeno exclusivo.

[00142] A região hipervariável abrange, de modo geral, resíduos de aminoácidos de cerca de resíduos de aminoácidos de 24 a 34 (LCDR1; “L” denota cadeia leve), 50 a 56 (LCDR2) e 89 a 97 (LCDR3) na região variável de cadeia leve e cerca de 31 a 35B (HCDR1; “H” denota cadeia pesada), 50 a 65 (HCDR2) e 95 a 102 (HCDR3) na re- gião variável de cadeia pesada (Kabat et a/., (1991) Sequences Of Proteins Of Immunological Interest, 5º Ed. Public Health Service, Nati- onal Institutes of Health, Bethesda, MD) e/ou esses resíduos formam um laço hipervariável (por exemplo, resíduos 26 a 32 (LCDR1, 50 a 52 (LCDR2) e 91 a 96 (LCDR3) na região variável de cadeia leve e 26 a 32 (HCDR1), 53 a 55 (HCDR2) e 96 a 101 (HCDR3) na região variável de cadeia pesada (Chothia and Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196: 901 a 917).

[00143] O sistema de numeração de Kabat é geralmente usado quando se refere a um resíduo no domínio variável (aproximadamente, resíduos 1 a 107 da região variável de cadeia leve e resíduos 1 a 113 da região variável de cadeia pesada) (por exemplo, Kabat et a/. (1991) Sequences Of Proteins Of Immunological Interest, 5º Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD), com o sistema de números da EU usado para a região Fc.

[00144] O termo "domínio de imunoglobulina (Ig)" refere-se a uma região de uma imunoglobulina com uma estrutura terciária distinta. Além dos domínios variáveis, cada cadeia pesada e leve possui domí- nios constantes: domínios pesados constantes (CH); domínios leves constantes (CL) e domínios de dobradiça. No contexto dos anticorpos IgG, os isótipos IgG têm, cada um, três regiões de CH. A porção car- bóxi-terminal de cada HC e LC define uma região constante primaria- mente responsável pela função efetora. Consequentemente, os domí- nios “CH” no contexto da IgG são da seguinte forma: “CH1” refere-se às posições 118 a 220 de acordo com o índice EU conforme em Ka- bat. "CH2" refere-se às posições 237 a 340, de acordo com o índice EU, conforme em Kabat, e "CH3" refere-se às posições 341 a 447, de acordo com o índice EU, conforme em Kabat.

[00145] — Outro tipo de domínio de Ig da cadeia pesada é a região de dobradiça. O termo "região de dobradiça" refere-se ao polipeptídeo flexível que compreende os aminoácidos entre o primeiro e o segundo domínios constantes de um anticorpo. Estruturalmente, o domínio CH1 de IgG termina na posição EU 220 e o domínio CH2 de IgG começa no resíduo da posição EU 237. Desse modo, para a IgG, a dobradiça de anticorpo é definida no presente documento para incluir as posições 221 (D221 em IgG1) a 236 (G236 em IgG1), sendo que a numeração é de acordo com o índice EU, conforme em Kabat. Em algumas modali- dades, por exemplo, no contexto de uma região Fc, a dobradiça inferi- or é incluída, com “dobradiça inferior" que se refere geralmente às po- sições 226 ou 230.

[00146] O termo “região Fc” refere-se ao polipeptídeo que compre- ende a região constante de um anticorpo que exclui o primeiro domínio de imunoglobulina de região constante e, em alguns casos, partes da dobradiça. Desse modo, Fc refere-se aos últimos dois domínios de imunoglobulina de região constante de IgA, IgD e IgG, aos últimos três domínios de imunoglobulina de região constante de IgE e IgM, e ao N- terminal de dobradiça flexível a esses domínios. Para IgA e IgM, o Fc pode incluir a cadeia J. Para a IgG, o domínio de Fc compreende do- mínios de imunoglobulina Cy2 e Cy3 (Cy2 e Cy3) e a região de dobra- diça inferior entre Cy1 (Cy1) e Cy2 (Cy2). Embora os limites da região Fc possam variar, a região Fc de cadeia pesada de IgG humana é normalmente definida para incluir resíduos C226 ou P230 ao terminal carboxila da mesma, sendo que a numeração é de acordo com o índi- ce EU, conforme em Kabat. Em algumas modalidades, conforme des-

crito mais completamente abaixo, as modificações de aminoácido são feitas à região Fc, por exemplo, para alterar a aglutinação a um ou mais receptores de FcyR ou ao receptor FcRn. ANTICORPOS CD38

[00147] Por conseguinte, a presente invenção fornece anticorpos anti-CD38 isolados que se aglutinam especificamente à proteína CD38 humana e primata e que diminuíram ou menos de 10%, menos de 20%, menos de 30%, menos de 40%, menos de 50% de aglutinação a RBCs humanas em comparação com o daratumumab e, assim, encon- tram uso em métodos de administração subcutânea e formas de dosa- gem unitárias. De uso particular na presente invenção são os anticor- pos que se ligam às proteínas CD38 humana e primata, particularmen- te primatas usados em testes clínicos, tais como macacos cynomolgus (Macaca fascicularis, macaco comedor de caranguejo, também referi- do neste documento como "cyno").

[00148] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-CD38 da in- venção interagem com CD38 em vários resíduos de aminoácidos, in- cluindo K121, F135, Q139, D141, M142, D202, V203, H205, 0236, E239, W241, S274, C275, K276, F284, C287, V288, K289, N290, P291, E292 e D293, o epítopo de AB79. Qualquer anticorpo que inte- raja com esses resíduos também encontra uso em métodos terapêuti- cos e dosagens unitárias da invenção.

[00149] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-CD38 da in- venção interagem com CD38 em vários resíduos de aminoácidos, in- cluindo K121, F135, Q139, D141, M142, E239, W241, S274, C275, K276, F284, V288, K289, N290, P291, E292 e D293. Deve-se notar que esses resíduos são idênticos em seres humanos e em macacos cynomolgus, com a exceção de que S274 é realmente F274 nos ma- cacos cynomolgus. Estes resíduos podem representar o epítopo imu- nodominante e/ou resíduos dentro da dimensão do peptídeo específico de aglutinação ao antígeno.

[00150] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD38 compre- ende uma cadeia pesada que compreende as seguintes sequências de aminoácidos de CDR: GFTFDDYG (SEQ ID NO: 3; HCDR1 AB79), ISWNGGKT (SEQ ID NO: 4; HCDR2 AB79), e ARGSLFHDSSG- FYFGH (SEQ ID NO: 5; HCDR3 AB79). Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma cadeia leve que compreende as seguintes sequências de aminoácidos de CDR: SSNIGDNY (SEQ ID NO: 6; LCDR1 AB79), RDS (SEQ ID NO: 7; LCDR2 AB79) e OSYDSSLSGS (SEQ ID NO: 8; LCDR3 AB79). Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma cadeia pesada que compreende as seguintes se- quências de aminoácidos de CDR: GFTFDDYG (SEQ ID NO: 3; HCDR1 AB79), ISWNGGKT (SEQ ID NO: 4; HCDR2 AB79), ARGSLFHDSSG- FYFGH (SEQ ID NO: 5; HCDR3 AB79) e uma cadeia leve que compre- ende as seguintes sequências de aminoácidos de CDR: SSNIGDNY (SEQ ID NO: 6; LCDR1 AB79), RDS (SEQ ID NO: 7; LCDR2 AB79) e QSYDSSLSGS (SEQ ID NO: 8; LCDR3 AB79). Em algumas modalida- des, o anticorpo compreende uma cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos da cadeia pesada variável (VH) da SEQ ID NO: 9.

EVOLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDDYGMSWVRQAPGKGL EWVSDISWNGGKTHYVDSVKGQFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDT

AVYYCARGSLFHDSSGFYFGHWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLA (SEQ ID NO: 9).

[00151] Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da cadeia leve variável (VL) da SEQ ID NO: 10.

QSVLTAPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGDNYVSWYQQLPGTAPK LLIYRDSQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCQSYD SSLSGSVFGGGTKLTVLGQPKANPTVTLFPPSSEEL (SEQ ID NO:

10).

[00152] Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos da ca- deia VH da SEQ ID NO: 9 e uma cadeia leve que compreende a se- quência de aminoácidos da cadeia VL da SEQ ID NO: 10.

[00153] Como será apreciado pelos especialistas na técnica, as cadeias pesada e leve variáveis podem ser unidas a sequências de domínio constante de IgG humano, geralmente IgG1, IgG2 ou IgG4.

[00154] Em algumas modalidades, o anticorpo compreende a se- quência de aminoácidos da cadeia pesada (HC) da SEQ ID NO: 11.

EVOLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDDYGMSWVRQAPGKGL EWVSDISWNGGKTHYVDSVKGQFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDT AVYYCARGSLFHDSSGFYFGHWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPS SKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLOSS GLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTH TCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDP EVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNG KEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQV

SLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKL TVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 11).

[00155] Em algumas modalidades, o anticorpo compreende a se- quência de aminoácidos da cadeia leve (LC) da SEQ ID NO: 12.

QSVLTAPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGDNYVSWYQQLPGTAPK LLIVYRDSQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCQSYD SSLSGSVFGGGTKLTVLGQPKANPTVTLFPPSSEELQANKATLVCLIS

DFYPGAVTVAWKADGSPVKAGVETTKPSKQSNNKYAASSYLSLTPE QWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS (SEQ ID NO: 12). Em algumas modalidades, o anticorpo compreende a sequência de aminoácidos de HC da SEQ ID NO: 11 e a sequência de aminoácidos de LC da SEQ ID NO: 12.

[00156] A presente invenção engloba anticorpos que se aglutinam ao CD38 humano e cyno e interagem com pelo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% desses re- síduos de aminoácidos.

[00157] Em algumas modalidades, os anticorpos são de compri- mento total. Por "anticorpo de comprimento total" entende-se, no pre- sente documento, a estrutura que constitui a forma biológica natural de um anticorpo, incluindo regiões variáveis e constantes, incluindo uma ou mais modificações conforme destacado neste documento.

[00158] “Como alternativa, os anticorpos podem ser uma variedade de estruturas, incluindo, porém sem limitação, fragmentos de anticor- po, anticorpos monoclonais, anticorpos biespecíficos, minicorpos, anti- corpos de domínio, anticorpos sintéticos (algumas vezes referidos nes- te documento como "miméticos de anticorpos"), anticorpos quiméricos, anticorpos humanizados, fusões de anticorpos (às vezes chamados de "conjugados de anticorpos") e fragmentos de cada um, respectivamen- te. Fragmentos de anticorpo específicos incluem, mas não estão limi- tados a, (i) o fragmento Fab que consiste nos domínios VL, VH, CL e CH1, (ii) o fragmento Fd que consiste nos domínios VH e CH1, (iii) o fragmento Fv que consiste nos domínios VL e VH de um único anticor- Po; (iv) o fragmento dAb (Ward et a/. (1989) Nature 341: 544 a 546) que consiste em uma única variável, (v) regiões CDR isoladas, (vi) fra- gmentos F(ab')2, um fragmento bivalente que compreende dois frag- mentos Fab enlaçados (vii) moléculas de Fv de cadeia única (scFv), em que um domínio VH e um domínio VL são enlaçados por um enla- ce peptídico que permite que os dois domínios se associem para for- mar um sítio de aglutinação ao antígeno (Bird et a/. (1988) Science 242: 423 a 426, Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879 a 5883), (vili) cadeia única biespecífica Fv (WO 03/11161) e (ix)

“diacorpos" ou “triacorpos", fragmentos multivalentes ou multiespecífi- cos construídos por fusão genética (Tomlinson et a/. (2000) Methods Enzymol. 326: 461 a 479; WOS94/13804; Holliger et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444 a 6448).

MODIFICAÇÕES DE ANTICORPOS

[00159] A presente invenção fornece ainda anticorpos anti-CD38 variantes. Ou seja, há várias modificações que podem ser feitas nos anticorpos da divulgação, incluindo, porém sem limitação, modifica- ções de aminoácidos nas CDRs (maturação por afinidade), modifica- ções de aminoácidos na região Fc, variantes de glicosilação, modifica- ções covalentes de outros tipos, etc.

[00160] O termo "variante" significa um polipeptídeo que difere da- quele de um polipeptídeo parental. As variantes de aminoácidos po- dem incluir substituições, inserções e deleções de aminoácidos. Em geral, as variantes podem incluir qualquer número de modificações, desde que a função da proteína ainda esteja presente, conforme des- crito neste documento. Ou seja, no caso de variantes de aminoácidos geradas com as CDRs de qualquer AB79, por exemplo, o anticorpo ainda deve se aglutinar especificamente ao CD38 humano e do cyno- molgus e não se ligar aos RBCs ou ter diminuído ou menos de 10%, menos de 20%, menos de 30%, menos de 40%, menos de 50% de aglutinação às RBCs em comparação com o daratumumab. O termo "região Fc variante" significa uma sequência Fc que difere da sequên- cia Fc do tipo selvagem ou parental em virtude de pelo menos uma modificação de aminoácidos. A variante Fc pode se referir ao próprio polipeptídeo Fc, às composições que compreendem o polipeptídeo variante Fc ou à sequência de aminoácidos. Se variantes de aminoá- cidos forem geradas com a região Fc, por exemplo, os anticorpos vari- antes devem manter as funções necessárias para a aplicação ou indi- cação específica do anticorpo. Por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6,7, 8, 92 ou substituições de aminoácidos podem ser utilizadas, por exemplo, 1 a 10,1a5,1a4,1a3e1a? substituições. Modificações adequadas podem ser feitas em uma ou mais posições, como é descrito de modo geral, por exemplo, nas Patentes Nos US 6.086.875; 6.737.056;

7.317.091; 7.670.600; 8.084.582; 8.188.231; 8.367.805; 8.937.158; e

9.040.041; todos os quais são expressamente incorporados por refe- rência em sua totalidade e, em particular, para substituições especiífi- cas de aminoácidos que aumentam a aglutinação aos receptores Fc.

[00161] Pode ser desejável ter de 1 a 5 modificações na região Fc de proteínas do tipo selvagem ou geneticamente modificadas, bem como de 1 a 5 modificações na região Fv, por exemplo. Uma sequên- cia polipeptídica variante terá preferencialmente pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com as sequências parentais (por exemplo, as regiões variáveis, as regiões constantes e/ou as sequências de cadeia pesada e leve para AB79).

[00162] O termo "substituição de aminoácidos" significa a substitui- ção de um aminoácido em uma posição específica em uma sequência polipeptídica parental por outro aminoácido. Por exemplo, a substitui- ção S100A refere-se a um polipeptídeo variante, em que a serina na posição 100 é substituída por alanina. O termo "inserção de aminoáci- do" significa a adição de um aminoácido em uma posição específica em uma sequência polipeptídica parental. O termo “deleção de amino- ácido" significa a remoção de um aminoácido em uma posição especí- fica em uma sequência polipeptídica parental.

[00163] Os termos "anticorpo parental" e "anticorpo precursor" signi- ficam um anticorpo não modificado que é subsequentemente modifi- cado para gerar uma variante. Em uma modalidade, o anticorpo paren- tal neste documento é AB79. O anticorpo parental pode se referir ao próprio polipeptídeo, às composições que compreendem o anticorpo parental ou à sequência de aminoácidos que codifica o mesmo. Por conseguinte, o termo "polipeptídeo Fc parental" significa um polipeptí- deo Fc que é modificado para gerar uma variante.

[00164] Os termos “tipo selvagem”, “WT” e “nativo” significam uma sequência de aminoácidos ou uma sequência nucleotídica que é en- contrada na natureza, que inclui variações alélicas. Uma proteína, po- lipeptídeo, anticorpo, imunoglobulina, IgG, etc de WT tem uma se- quência de aminoácidos ou uma sequência de nucleotídeos que não foi intencionalmente modificada.

[00165] Em algumas modalidades, uma ou mais modificações de aminoácidos são feitas em uma ou mais das CDRs do anticorpo anti- CD38. De modo geral, apenas 1 ou 2 ou 3 aminoácidos são substituí- dos em qualquer CDR simples, e geralmente não mais que 4, 5, 6,7,8 9 ou 10 mudanças são feitas em um conjunto de CDRs. No entanto, deve ser observado que qualquer combinação de nenhuma substitui- ção, 1, 2 ou 3 substituições em qualquer CDR pode ser combinada de modo independente e opcional com qualquer outra substituição.

[00166] Em alguns casos, as modificações de aminoácidos nas CDRs são denominadas "maturação de afinidade". Um anticorpo de “afinidade maturada” é um que tem uma ou mais mudanças em uma ou mais CDRs, o que resulta em um aperfeiçoamento na afinidade do anticorpo para o antígeno, em comparação a um anticorpo parental que não possuiu essa alteração (ou alterações). Em alguns casos, po- de ser desejável diminuir a afinidade de um anticorpo ao antígeno do mesmo.

[00167] A maturação de afinidade pode ser feita para aumentar a afinidade de aglutinação do anticorpo para o antígeno em pelo menos cerca de 10% a 50%, 100%, 150% ou mais, ou de 1 a 5 vezes em comparação ao anticorpo "parental". Os anticorpos de afinidade matu- rada preferenciais terão afinidades nanomolares ou mesmo picomola-

res com o antígeno-alvo. Os anticorpos de afinidade maturada são produzidos por procedimentos conhecidos (por exemplo, Marks et al. (1992) Biotechnol. 10: 779 a 783; Barbas et al. (1994) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 91: 3809 a 3813; Shier et al. (1995) Gene 169: 147 a 155; Yelton et al. (1995) J. Immunol. 155: 1.994 a 2.004; Jackson et al. (1995) J. Immunol. 154 (7): 3310 a 3319; e Hawkins et a/. (1992) J. Mol. Biol. 226: 889 a 896).

[00168] Alternativamente, podem ser feitas modificações de amino- ácidos em uma ou mais das CDRs dos anticorpos da invenção que são "silenciosas", por exemplo, que não alteram significativamente a afinidade do anticorpo para o antígeno. As mesmas podem ser reali- zadas por várias razões, incluindo a otimização da expressão (confor- me pode ser feito para os ácidos nucleicos que codificam os anticor- pos da invenção).

[00169] Desse modo, estão incluídos na definição das CDRs e dos anticorpos da invenção as CDRs e anticorpos variantes; isto é, os anti- corpos da invenção podem incluir modificações de aminoácidos em uma ou mais das CDRs de AB79. Além disso, conforme descrito abai- xo, as modificações de aminoácidos também podem ser realizadas de modo independente e opcional em qualquer região fora das CDRs, in- cluindo regiões de framework e constantes.

[00170] Em algumas modalidades, anticorpos variantes de AB79 que são específicos para CD38 humano (SEQ ID NO: 1) e CD38 de cynomolgus (SEQ ID NO: 2) são descritos. Este anticorpo é composto por seis CDRs, em que cada CDR deste anticorpo pode diferir da SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 e/ou SEQ ID NO: 8 por substituições de O, 1, 2 ou mais aminoácidos sem alterar ou inibir significativamente a função.

[00171] Além das modificações descritas acima, outras modifica- ções podem ser feitas. Por exemplo, as moléculas podem ser estabili-

zadas através da incorporação de pontes de dissulfeto que aglutinam os domínios VH e VL (Reiter et al. (1996) Nature Biotech. 14: 1.239 a

1.245). Além disso, há uma variedade de modificações covalentes de anticorpos que podem ser feitas conforme descrito abaixo.

[00172] Modificações covalentes de anticorpos estão incluídas no escopo desta invenção e são geralmente, mas nem sempre, feitas após a tradução. Por exemplo, vários tipos de modificações covalentes do anticorpo são introduzidos na molécula por reação de resíduos de aminoácidos específicos do anticorpo com um agente de derivação orgânico que é capaz de reagir com cadeias laterais selecionadas ou com os resíduos N ou C-terminais.

[00173] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD38 da pre- sente invenção se aglutina especificamente a um ou mais resíduos ou regiões em CD38, mas também não reage de maneira cruzada com outras proteínas com homologia a CD38, tais como BST-1 (antígeno-1 de células estromais da medula óssea) e Mo5, também chamado CD157.

[00174] Tipicamente, uma falta de reatividade cruzada significa me- nos que cerca de 5% de inibição competitiva relativa entre as molécu- las quando avaliada por análise ELISA e/ou FACS com uso de quanti- dades suficientes das moléculas sob condições adequadas de ensaio. INIBIÇÃO DA ATIVIDADE CD38 E REDUÇÃO DE EFEITOS COLA-

TERAIS

[00175] Os anticorpos divulgados podem ser úteis no bloqueio de uma interação ligante-receptor ou na inibição da interação de compo- nente receptor. Os anticorpos anti-CD38 da invenção podem ser "blo- queadores" ou "neutralizantes". O termo "anticorpo neutralizante" refe- re-se a um anticorpo cuja aglutinação ao CD38 resulta na inibição da atividade biológica do CD38, por exemplo, sua capacidade de interagir com ligantes, atividade enzimática, capacidade de sinalização e, em particular, sua capacidade de causar linfócitos ativados. A inibição da atividade biológica de CD38 pode ser avaliada por um ou mais de vá- rios ensaios padrão in vitro ou in vivo conhecidos na técnica.

[00176] Os termos "inibe a aglutinação" e "bloqueia a aglutinação" (por exemplo, quando se refere à inibição/bloqueio da ligação de um anticorpo CD38 a CD38) abrangem inibição/bloqueio parcial e total. À inibição/bloqueio da aglutinação de um anticorpo CD38 ao CD38 pode reduzir ou alterar o nível normal ou o tipo de sinalização celular que ocorre quando um anticorpo CD38 se liga ao CD38 sem inibição ou bloqueio. A inibição e o bloqueio também devem incluir qualquer dimi- nuição mensurável na afinidade de aglutinação de um anticorpo CD38 ao CD38 quando em contato com um anticorpo anti-CD38, em compa- ração com o ligante que não está em contato com um anticorpo anti- CD38, por exemplo, um bloqueio de aglutinação de um anticorpo CD38 a CD38 em pelo menos cerca de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 99% ou 100%.

[00177] Os anticorpos anti-CD38 divulgados também podem inibir o crescimento celular. O termo "inibe o crescimento" refere-se a qual- quer diminuição mensurável no crescimento celular quando em conta- to com um anticorpo anti-CD38, em comparação com o crescimento das mesmas células que não estão em contato com um anticorpo anti- CD38, por exemplo, uma inibição do crescimento de uma cultura de células em pelo menos cerca de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 99% ou 100%.

[00178] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-CD38 divul- gados são capazes de esgotar linfócitos ativados e células plasmáti- cas. O termo "depleção", neste contexto, significa uma diminuição mensurável nos níveis séricos de linfócitos ativados e/ou células plas- máticas em um sujeito em comparação com sujeitos não tratados. Em geral, são observadas depleções de pelo menos cerca de 10%, 20%,

30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 99% ou 100%. Como mostra- do abaixo nos Exemplos, uma vantagem particular que os anticorpos da presente invenção exibem é a capacidade de recuperação dessas células após a dosagem; isto é, como é conhecido em alguns trata- mentos (por exemplo, com anticorpos anti-CD20, por exemplo), a de- pleção celular pode durar por longos períodos de tempo, causando efeitos colaterais indesejados. Conforme mostrado neste documento, os efeitos nos linfócitos ativados e/ou células plasmáticas são recupe- ráveis.

[00179] Os anticorpos anti-CD38 da presente invenção permitem efeitos colaterais reduzidos em comparação com os anticorpos anti- CD38 da técnica anterior. Em algumas modalidades, AB79 não induz TEAEs. Em algumas modalidades, AB79 permite uma redução de TEAEs em comparação com outros anticorpos anti-CD38, tais como MORZ202. Os TEAEs são normalmente referidos pelos graus 1, 2, 3,4 e 5, sendo o grau | o menos grave e o grau 5 o TEAE mais grave. Com base em FDA e outras diretrizes para os padrões de Critérios Comuns de Terminologia para Eventos Adversos (CTCAE) para fárma- cos oncológicos (consulte, por exemplo, https://evs.nci.nih.gov/fto1/ CTCAE/CTCAE 4.03 2010-06-14 QuickReference 5x7.pdf, assim co- mo https://ctep.cancer.gov/protocoldevelopment/electronic applications/ ctc.htm; e Nilsson e Koke (2001) Drug Inform. J. 35: 1289 a 1299) a seguir é como esses graus geralmente são determinados. O grau 1 é leve: assintomáticos ou sintomas leves; apenas observações clínicas ou de diagnóstico; nenhuma intervenção indicada. O grau 2 é modera- do: indicação de intervenção mínima, local ou não invasiva; limitando as ADL instrumentais apropriadas à idade. O grau 3 é grave ou clini- camente significativo, mas não imediatamente com risco de vida: indi- cação de hospitalização ou prolongamento da hospitalização; incapaci- tante; limitando ADL de autocuidado. Grau 4 é consequência com risco de vida: indicação de intervenção urgente. Grau 5 é a morte relaciona- daa AE.

[00180] Em algumas modalidades, o AB79 permite uma redução no grau dos TEAEs em comparação com outros anticorpos anti-CD38, tais como MOR202. Em algumas modalidades, o AB79 permite uma redução no grau dos TEAEs em comparação com outros anticorpos anti-CD38 do grau 5 ao grau 4. Em algumas modalidades, o AB79 permite uma redução no grau dos TEAEs em comparação com outros anticorpos anti-CD38 do grau 4 ao grau 3. Em algumas modalidades, o AB79 permite uma redução no grau dos TEAEs em comparação com outros anticorpos anti-CD38 do grau 3 ao grau 2. Em algumas modali- dades, o AB79 permite uma redução no grau dos TEAEs em compara- ção com outros anticorpos anti-CD38 do grau 2 ao grau 1.

[00181] Em algumas modalidades, o AB79 permite uma redução no grau de um ou mais TEAEs selecionados do grupo que consiste em anemia (incluindo anemia hemolítica), trombocitopenia, fadiga, rea- ções relacionadas à infusão (IRRs), leucopenia, linfopenia e náusea. Em algumas modalidades, o AB79 permite uma redução na ocorrência de um ou mais TEAEs selecionados do grupo que consiste em anemia (incluindo anemia hemolítica), trombocitopenia, fadiga, reações relaci- onadas à infusão (IRRs), leucopenia, linfopenia e náusea.

[00182] Em algumas modalidades, um teste de diagnóstico é usado para determinar a presença e/ou grau de anemia, incluindo anemia hemolítica. Testes de diagnóstico para anemia, incluindo anemia he- molítica, incluindo medição do nível de hemoglobina. Geralmente, os níveis de hemoglobina são interpretados da seguinte forma: (i) anemia muito leve/ausente: 212,0 g/dl, (ii) leve: 10 a 129g/dl, (iii) moderada: 8 a 109g/dl, (iv) grave: 6 a 8 g/dl e (v) muito grave: < 6g/dl. Outros testes de diagnóstico para anemia, incluindo anemia hemolítica, incluem a medi- ção do nível de haptoglobina. Geralmente, um nível de haptoglobina <

25mg/dl é indicativo da presença de anemia, incluindo anemia hemolí- tica. Outros testes gnósticos incluem o teste de antiglobulina direto (DAT) (também conhecido como Teste de Coombs direto), que é usa- do para determinar se os glóbulos vermelhos foram revestidos in vivo com imunoglobulina, complemento ou ambos.

[00183] Em algumas modalidades, um teste de diagnóstico é usado para determinar a presença e/ou o grau de trombocitopenia. Geral- mente, o teste de diagnóstico de trombocitopenia inclui a medição do número de plaquetas por microlitro (ul) de sangue. Normalmente, exis- tem 150 x 10º a 450 x 10º plaquetas por ul de sangue. Geralmente, a trombocitopenia é diagnosticada quando há <150 x 10º plaquetas por ul de sangue. A trombocitopenia leve é geralmente diagnosticada se houver 70 a 150 x 10? por ul de sangue. A trombocitopenia moderada é geralmente diagnosticada se houver 20 a 70 x 10º por ul. A trombo- citopenia grave é geralmente diagnosticada se houver <20 x 10º por ul de sangue.

INDICAÇÕES DE DOENÇA

[00184] Os anticorpos, métodos e unidades de dosagem da inven- ção encontram uso em uma variedade de aplicações, incluindo trata- mento ou melhoria de doenças relacionadas a CD38.

[00185] O CD38 é expresso em células hematopoiéticas imaturas, regulado de modo descendente em células maduras e re-expresso em altos níveis em linfócitos ativados e células plasmáticas. Por exemplo, alta expressão de CD38 é vista em células B ativadas, células plasmá- ticas, células T CD4+ ativadas, células T CD8+ ativadas, células NK, células NKT, células dendríticas maduras (DCs) e monócitos ativados. Certas afecções estão associadas a células que expressam CD38 e certas afecções estão associadas à sobrexpressão, expressão de alta densidade ou expressão regulada de modo ascendente de CD38 nas superfícies das células. O fato de uma população de células expressar ou não CD38 pode ser determinado por métodos conhecidos na técni- ca, por exemplo, determinação de citometria de fluxo da porcentagem de células em uma determinada população que é marcada por um an- ticorpo que se aglutina especificamente a CD38 ou ensaios imuno- histoquímicos, são geralmente como descrito abaixo para aplicações de diagnóstico. Por exemplo, uma população de células na qual a ex- pressão de CD38 é detectada em cerca de 10 a 30% das células pode ser considerada como tendo fraca positividade para CD38; e uma po- pulação de células em que a expressão de CD38 é detectada em mais de cerca de 30% das células pode ser considerada como positividade definitiva para CD38 (como em Jackson et a/. (1988) Clin. Exp. Immu- nol. 72: 351 a 356), embora outros critérios possam ser usados para determinar se uma população de células expressa CD38. A densidade de expressão na superfície das células pode ser determinada usando métodos conhecidos na técnica, como, por exemplo, medição de cito- metria de fluxo da intensidade média de fluorescência de células que foram marcadas com fluorescência com uso de anticorpos que se aglutinam especificamente a CD38.

[00186] Os anticorpos terapêuticos anti-CD38 da presente invenção se aglutinam a células positivas de CD38, resultando na depleção dessas células através de múltiplos mecanismos de ação, incluindo as vias CDC e ADCC.

[00187] Sabe-se na técnica que certas afecções estão associadas a células que expressam CD38 e que certas afecções estão associadas à sobrexpressão, expressão de alta densidade ou expressão regulada de modo ascendente de CD38 nas superfícies das células. O fato de uma população de células expressar ou não CD38 pode ser determi- nado por métodos conhecidos na técnica, por exemplo, determinação por citometria de fluxo da porcentagem de células em uma determina- da população que é marcada por um anticorpo que se liga especifica-

mente a CD38 ou ensaios imuno-histoquímicos, como são geralmente descritos abaixo para aplicações de diagnóstico. Por exemplo, uma população de células na qual a expressão de CD38 é detectada em cerca de 10 a 30% das células pode ser considerada como tendo fraca positividade para CD38; e uma população de células na qual a expres- são de CD38 é detectada em mais de cerca de 30% das células pode ser considerada positividade definitiva para CD38 (Jackson et al. (1988) Clin. Exp. Immunol. 72: 351 a 356), embora outros critérios possam ser usados para determinar se uma população de células ex- pressa CD38. A densidade de expressão nas superfícies das células pode ser determinada usando métodos conhecidos na técnica, como, por exemplo, medição de citometria de fluxo da intensidade média de fluorescência de células que foram marcadas com fluorescência usan- do anticorpos que se aglutinam especificamente a CD38.

[00188] Emum aspecto, a invenção fornece métodos de tratamento de uma afecção associada à proliferação de células que expressam CD38, compreendendo a administração a um paciente de uma quanti- dade farmaceuticamente eficaz de um anticorpo divulgado. Em algu- mas modalidades, a afecção é câncer e, em modalidades particulares, o câncer é um câncer hematológico. Em algumas modalidades, a afecção é mieloma múltiplo, leucemia linfoblástica crônica, leucemia linfocítica crônica, leucemia linfocítica aguda, leucemia mieloide crôni- ca, leucemia mieloide aguda e leucemia de células plasmáticas, leu- cemia mieloide aguda, leucemia mieloide crônica, linfoma de células B ou linfoma de Burkitt.

[00189] Em algumas modalidades, a afecção é mieloma múltiplo e o anticorpo terapêutico anti-CD38 não se aglutina a ou diminuiu a agluti- nação às RBCs humanas em comparação com o daratumumab. Em algumas modalidades, a afecção é mieloma múltiplo e o anticorpo te- rapêutico anti-CD38 não se aglutina a ou diminuiu a aglutinação a

RBCs de cynomolgus em comparação com daratumumab. Em algu- mas modalidades, a afecção é mieloma múltiplo e o anticorpo terapêu- tico anti-CD38 não se aglutina a ou diminuiu a aglutinação a RBCs humanas ou de cynomolgus.

[00190] ACLL é a leucemia mais comum de adultos no mundo oci- dental. A CLL envolve expansão clonal de linfócitos de aparência ma- dura, envolvendo linfonodos e outros tecidos linfoides, com infiltração progressiva da medula óssea e presença no sangue periférico. A for- ma de célula B (B-CLL) representa a maioria dos casos. FORMA DE CÉLULA B DA LEUCEMIA LINFOCÍTICA CRÔNICA (B- CLL)

[00191] AB-CLL é uma doença incurável caracterizada por um au- mento progressivo das células monoclonais B da linhagem anérgica que se acumulam na medula óssea e no sangue periférico de maneira prolongada por muitos anos. A expressão de CD38 é considerada co- mo um fator prognóstico ruim independente para B-CLL (Hamblin et al. (2002) Blood 99: 1023 a 1029).

[00192] B-CLL é caracterizada por dois subtipos, indolente e agres- sivo. Esses fenótipos clínicos se correlacionam com a presença ou au- sência de mutações somáticas no gene da região variável de cadeia pesada da imunoglobulina (IQgVH). Conforme utilizado neste documen- to, B-CLL indolente refere-se a um distúrbio em um sujeito com um gene IgVH mutado e/ou apresentando um ou mais fenótipos clínicos associados com B-CLL indolente. Conforme utilizado neste documen- to, a expressão B-CLL agressiva refere-se a um distúrbio em um sujei- to com um gene IgVH não-mutado e/ou apresentando um ou mais fe- nótipos clínicos associados com B-CLL agressiva.

[00193] A terapia padrão atual de B-CLL é paliativa e é realizada principalmente com o agente citostático clorambucil ou fludarabina. Quando ocorrem recaídas, uma terapia combinada usando fludarabi-

na, ciclofosfamida em combinação com rituximab (anticorpo monoclio- nal contra CD20) ou alemtuzumab (anticorpo monoclonal contra CD52) é frequentemente iniciada. Em um estudo, trinta e cinco pacientes com NHL de células B agressivas recidivado ou refratário foram submetidos à quimioterapia com altas doses (HCT), seguida por rituximab 375 mg/m? semanalmente por 4 doses a partir do dia 40 e repetidas por mais quatro doses a partir do dia 180. As infusões de rituximab foram bem toleradas com apenas uma toxicidade relacionada à infusão de grau 3/4. O evento adverso inesperado observado neste estudo atra- sou a neutropenia em mais da metade dos pacientes (19/35 pacientes com 46 episódios de neutropenia grau 3 ou 4; Kosmas et al. (2002) Leukemia 16: 2004 a 2015, que pode ser encontrada online em https://www.nature .com/articles/2402639). Em outro estudo, seis paci- entes receberam alemtuzumab por infusão intravenosa em dias alter- nados, três vezes por semana, durante 12 semanas. A dose foi gradu- almente aumentada diariamente (3, 10 e então 30 mg) até o paciente tolerar. Os principais TEAEs foram anemia, neutropenia (6/6 pacientes cada) e trombocitopenia (5/6 pacientes) em eventos adversos hemato- lógicos (Ishizawa et al. (2017) Jpn. J. Clin. Oncol. 47(1): 54 a 60). As- sim, existe uma necessidade médica não atendida crítica para o trata- mento da B-CLL com diminuição dos eventos adversos hematológicos. Em algumas modalidades, são fornecidos métodos para o tratamento de B-CLL com uso dos anticorpos anti-CD38 divulgados e, conforme descrito abaixo, isso pode ser feito usando terapias combinadas, inclu- indo opcional e independentemente qualquer um dos fármacos acima. MIELOMA MÚLTIPLO (MM)

[00194] O mieloma múltiplo é um distúrbio maligno da linhagem de células B, caracterizado pela proliferação neoplásica de células plas- máticas na medula óssea e/ou sítios extramedulares. A proliferação das células do mieloma causa uma variedade de efeitos, incluindo le-

sões ósseas líticas (orifícios), danos nos órgãos, anemia (número re- duzido de células vermelhas do sangue), produção de proteínas anor- mais (com danos nos rins, nervos e outros órgãos), função reduzida do sistema imunológico, insuficiência renal e níveis elevados de cálcio no sangue (hipercalcemia). Atualmente, as opções de tratamento incluem quimioterapia, preferencialmente associada quando possível ao trans- plante autólogo de células-tronco (ASCT). Esses regimes de tratamen- to exibem taxas de resposta moderadas. No entanto, apenas mudan- ças irrelevantes na sobrevida global são observadas e a sobrevida média é de aproximadamente 3 anos. Assim, existe uma necessidade médica não atendida crítica para o tratamento do mieloma múltiplo. Em algumas modalidades, são fornecidos métodos para o tratamento de mieloma múltiplo usando os anticorpos divulgados.

[00195] O MM recém-diagnosticado (NDMM) distingue-se de MM recidivado ou MM recidivado e refratário (RRMM). O MM recidivado é considerado uma recorrência da doença após resposta prévia e foi de- finido com base em critérios laboratoriais e radiológicos objetivos: au- mento de > 25% da proteína monoclonal sérica ou urinária (proteína M) ou diferença de > 25% entre cadeias leves livres séricas envolvidas e não envolvidas do nadir das mesmas, respectivamente, ou o desen- volvimento de novos plasmocitomas ou hipercalcemia. Em pacientes com doença não secretora, recidiva é definida como um aumento das células plasmáticas da medula óssea. Em geral, uma indicação para o tratamento de recidiva foi definida como o aparecimento ou reapareci- mento de um ou mais sintomas de MM descritos acima ou uma recidi- va bioquímica rápida e consistente. MM recidivado/refratário (RRMM) é definido como uma doença que não responde ou é progressiva na te- rapia ou nos 60 dias após o último tratamento em pacientes que al- cançaram uma resposta mínima (MR) ou melhor na terapia anterior (Sonneveld e Broijl (2016) Haematologica 101 (4): 396 a 406).

GAMOPATIA MONOCLONAL DE SIGNIFICADO INDETERMINADO (MGUS) E MIELOMA MÚLTIPLO LATENTE (SMM)

[00196] Gamopatia monoclonal de significado indeterminado (MGUS) e mieloma múltiplo latente (SMM) são distúrbios pré-malignos assinto- máticos, caracterizados por proliferação monoclonal de células plas- máticas na medula óssea e ausência de danos nos órgãos-finais.

[00197] O mieloma múltiplo latente (SMM) é um distúrbio proliferati- vo assintomático das células plasmáticas com alto risco de progressão para mieloma múltiplo sintomático ou ativo (Kyle et a/. (2007) N. Engl. J. Med. 356 (25): 2582 a 2590). Os critérios de consenso internacional que definem SMM foram adotados em 2003 e exigem que um paciente tenha um nível de proteína M > 30 g/l e/ou células plasmáticas clonais da medula óssea > 10% (Internat. Myeloma Working Group (2003) Br. J. Haematol. 121, 749 a 757). Os pacientes não devem ter comprome- timento de órgãos ou tecidos relacionados, tal como lesões ou sinto- mas ósseos. Estudos recentes identificaram dois subconjuntos de SMM: i) pacientes com doença em evolução e ii) pacientes com doen- ça em não evolução (Internat. Myeloma Working Group (2003) Br. J. Haematol. 121, 749 a 757).

[00198] O SMM se assemelha a gamopatia monoclonal de signifi- cado indeterminado (MGUS), uma vez que o dano no órgão final está ausente (Kyle et al. (2007) N. Engl. J. Med. 356 (25): 2582 a 2590). Clinicamente, no entanto, o SMM tem muito mais probabilidade de progredir para mieloma múltiplo ativo ou amiloidose aos 20 anos (pro- babilidade de 78% para SMM contra 21% para MGUS) (Kyle et al. (2007) N. Engl. J. Med. 356 (25): 2582 a 2590).

[00199] Os critérios de consenso internacional que definem a MGUS exigem que um paciente tenha um nível de proteína M <30 g/l, células plasmáticas da medula óssea <10% e a ausência de compro- metimento de órgãos ou tecidos relacionados, incluindo lesões ou sin-

tomas ósseos (Internat. Myeloma Working Group (2003) Br. J. Haema- tol. 121, 749 a 757). AFECÇÕES RELACIONADAS A CD38

[00200] Os anticorpos, métodos e unidades de dosagem da inven- ção encontram uso em uma variedade de aplicações, incluindo trata- mento ou melhoria de doenças relacionadas a CD38, tais como doen- ças e afecções associadas à inflamação e doenças imunológicas, par- ticularmente doenças associadas a linfócitos ativados. Os anticorpos anti-CD38 da presente invenção se ligam a células positivas de CD38, resultando na depleção dessas células, tais como linfócitos ativados, através de múltiplos mecanismos de ação, incluindo as vias CDC e ADCC.

[00201] Assim, qualquer doença autoimune que exiba expressão aumentada de CD38 ou número aumentado de células que expressam CD38 como um componente da doença pode ser tratada com uso dos anticorpos da invenção. Estes incluem, mas não estão limitados a, re- jeição do enxerto alogênico de ilhotas, alopecia areata, espondilite an- quilosante, síndrome antifosfolípide, doença autoimune de Addison, autoanticorpos citoplasmáticos antineutrófilos (ANCA), doenças autoi- munes da glândula adrenal, anemia hemolítica autoimune, hepatite autoimune, miocardite autoimune, neutropenia autoimune, ooforite e oquite autoimunes, trombocitopenia autoimune, urticária autoimune, doença de Behcet, penfigoide bolhoso, cardiomiopatia, síndrome de Castleman, dermatite celíaca, síndrome da disfunção imune à fadiga crônica, polineuropatia desmielinizante inflamatória crônica, síndrome de Churg-Strauss, penfigoide cicatricial, síndrome de CREST, doença de aglutinina fria, doença de Crohn, dermatomiosite, lúpus discoide, crioglobulinemia mista essencial, deficiência de fator VIII, fibromialgia- fibromiosite, glomerulonefrite, doença de Grave, Guillain-Barre, sín- drome de Goodpasture, doença de enxerto contra hospedeiro (GVHD),

tireoidite de Hashimoto, hemofilia A, fibrose pulmonar idiopática, trom- bocitopenia púrpura idiopática (ITP), neuropatia IgA, polineuropatias IgM, trombocitopenia mediada imune, artrite juvenil, doença de Kawa- saki, líquen plantar, lúpus eritematoso, doença de Meniere, doença mista do tecido conjuntivo, esclerose múltipla, diabetes mellitus tipo 1, miastenia gravis, pênfigo vulgar, anemia perniciosa, poliarterite nodo- sa, policrondrite, síndromes poliglandulares, polimialgia reumática, po- limiosite e dermatomiosite, agamaglobulinemia primária, cirrose biliar primária, psoríase, artrite psoriática, fenômeno de Reynauld, síndrome de Reiter, artrite reumatoide, sarcoidose, esclerodermia, síndrome de Sjorgen, rejeição de transplante de órgão sólido, síndrome do homem rígido, lúpus eritematoso sistêmico, arterite de takayasu, arterite tem- poral/arterite de células gigantes, púrpura trombocitopenia trombótica, colite ulcerativa, uveiíte, vasculites tais como vasculite de dermatite herpetiforme, vitiligo e granulomatose de Wegner.

[00202] De uso particular em algumas modalidades é o uso dos presentes anticorpos para o uso no diagnóstico e/ou tratamento de vá- rias doenças, incluindo, porém sem limitação, doenças autoimunes, incluindo, porém sem limitação, lúpus eritematoso sistêmico (SLE), artrite reumatoide (RA), doença inflamatória intestinal (IBD), colite ulce- rosa e doença do enxerto contra hospedeiro.

[00203] Assim, por exemplo, pacientes com alto teor de células plasmáticas podem ser tratados, tais como pacientes com SLE que exibem altos níveis de células plasmáticas, bem como pacientes com RA que demonstram não responder às terapias baseadas em CD20. COMPOSIÇÕES DE ANTICORPO PARA ADMINISTRAÇÃO /N VIVO

[00204] —“Formulações dos anticorpos usados em conformidade com a presente invenção são preparadas para armazenamento misturando- se um anticorpo que tem o grau de pureza desejado com carreadores, excipientes ou estabilizadores farmaceuticamente aceitáveis opcionais

(Remington's Pharmaceutical Sciences 16º edição (1980) Osol, A. Ed.), na forma de formulações liofilizadas ou soluções aquosas.

[00205] As formulações contidas neste documento também podem conter mais de um composto ativo conforme necessário para a indica- ção particular a ser tratada, preferencialmente aquelas com atividades complementares que não se afetam de modo adverso. Por exemplo, pode ser desejável fornecer anticorpos com outras especificidades. De modo alternativo ou adicional, a composição pode compreender um agente citotóxico, citocina, agente inibidor de crescimento e/ou anta- gonista de pequenas moléculas. Tais moléculas estão adequadamente presentes em combinação em quantidades que são eficazes para o propósito pretendido.

ADMINISTRAÇÃO SUBCUTÂNEA

[00206] A presente invenção se baseia na descoberta inesperada de que os anticorpos anti-CD38 descritos neste documento, tais como AB79, podem ser administrados em dosagens suficientemente baixas que são terapeuticamente eficazes, permitindo assim a administração subcutânea de baixos volumes de formulações líquidas. A administra- ção subcutânea é um modo de administração minimamente invasivo e é considerada o modo de administração mais versátil e, portanto, de- sejável, que pode ser usado para terapias de curto e longo prazo. Em algumas modalidades, a administração subcutânea pode ser realizada por injeção. Em algumas modalidades, o sítio da injeção ou dispositivo pode ser girado quando múltiplas injeções ou dispositivos são neces- sários.

[00207] —Consequentemente, as formulações subcutâneas são muito mais fáceis para um paciente se autoadministrar, especialmente por- que a formulação pode ter que ser tomada regularmente durante toda a vida do paciente (por exemplo, começando no primeiro ano de vida da criança). Além disso, a facilidade e a velocidade da administração subcutânea permitem maior adesão do paciente e acesso mais rápido ao medicamento quando necessário. Assim, as formulações subcutâà- neas dos anticorpos anti-CD38 fornecidos neste documento proporcio- nam um benefício substancial sobre a técnica anterior e resolvem cer- tas necessidades não atendidas.

[00208] Em algumas modalidades, os anticorpos da invenção são administrados a um sujeito de acordo com métodos conhecidos por meio de uma via subcutânea. Em algumas modalidades, os anticorpos da presente invenção podem ser administrados por injeção subcutã- nea. Em modalidades específicas, a formulação subcutânea é injetada de forma subcutânea no mesmo sítio em um paciente (por exemplo, administrada no braço, superfície anterior da coxa, porção inferior do abdômen ou parte superior das costas) para injeções repetidas ou contínuas. Em outras modalidades, a formulação subcutânea é injeta- da de forma subcutânea em um sítio diferente ou rotativo de um paci- ente. Podem ser utilizadas administrações únicas ou múltiplas das formulações.

[00209] Em algumas modalidades, as formas de dosagem unitária subcutânea descritas neste documento podem ser usadas para o tra- tamento de câncer. Em algumas modalidades, as formas de dosagem unitária subcutânea descritas neste documento podem ser usadas pa- ra o tratamento de um câncer hematológico. Em algumas modalida- des, as formas de dosagem unitária subcutânea descritas neste do- cumento podem ser usadas para o tratamento de mieloma múltiplo.

[00210] Em algumas modalidades, os anticorpos da invenção que se aglutinam a RBCs humanas transitoriamente têm biodisponibilidade aumentada. Em algumas modalidades, a biodisponibilidade dos anti- corpos da presente invenção que se aglutinam a RBCs transitoriamen- te é aumentada em 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 100% ou mais. Em algumas modalidades, a biodisponibilidade dos

7T1/179 anticorpos da presente invenção que se aglutinam a RBCs humanas transitoriamente é de 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200%, 250% ou 300% ou mais.

[00211] Em algumas modalidades, o aumento da biodisponibilidade permite a administração subcutânea. Em algumas modalidades, o au- mento da biodisponibilidade é devido ao fato de que os anticorpos da invenção se aglutinam às RBCs transitoriamente. Em algumas modali- dades, o aumento da biodisponibilidade humana é devido ao fato de que os anticorpos da invenção se aglutinam de maneira diferente às RBCs humanas.

[00212] Em algumas modalidades, os anticorpos da invenção levam à depleção de células NK, células B e/ou células T. Em algumas mo- dalidades, os anticorpos da invenção permitem a depleção aumentada de células NK em comparação com a depleção de células B ou células T. Em algumas modalidades, os anticorpos da invenção permitem a depleção aumentada de células NK em comparação com as células B, bem como a depleção aumentada de células NK em comparação com as células T. Em algumas modalidades, os anticorpos da invenção permitem a depleção aumentada de células NK em comparação com as células B, bem como a depleção aumentada de células B em com- paração com as células T. Em algumas modalidades, os anticorpos da invenção permitem a depleção aumentada de células NK em compa- ração com as células B e a depleção aumentada de células B em comparação com as células T.

[00213] Em certas modalidades, a biodisponibilidade dos anticorpos anti-CD38 descritos neste documento após administração subcutânea está entre pelo menos 50% e pelo menos 80% em comparação com a administração intravenosa normalizada para a mesma dose. Em certas modalidades, a biodisponibilidade dos anticorpos anti-CD38 descritos neste documento após administração subcutânea está entre pelo me-

nos 60% e pelo menos 80% em comparação com a administração in- travenosa normalizada para a mesma dose. Em certas modalidades, a biodisponibilidade dos anticorpos anti-CD38 descritos neste documen- to após administração subcutânea está entre pelo menos 50% e 70% em comparação com a administração intravenosa normalizada para a mesma dose. Em certas modalidades, a biodisponibilidade dos anti- corpos anti-CD38 descritos neste documento após administração sub- cutânea está entre pelo menos 55% e 65% em comparação com a administração intravenosa normalizada para a mesma dose. Em certas modalidades, a biodisponibilidade dos anticorpos anti-CD38 descritos neste documento após administração subcutânea está entre pelo me- nos 55% e 70% em comparação com a administração intravenosa normalizada para a mesma dose.

[00214] Em certas modalidades, a biodisponibilidade dos anticorpos anti-CD38 descritos neste documento após administração subcutânea é de pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 51%, pelo menos 52%, pelo menos 53%, pelo menos 54%, pelo me- nos 55%, pelo menos 56%, pelo menos 57%, pelo menos 58%, pelo menos 59%, pelo menos 60%, pelo menos 61%, pelo menos 62%, pe- lo menos 63%, pelo menos 64%, pelo menos 65%, pelo menos 66%, pelo menos 67%, pelo menos 68%, pelo menos 69%, pelo menos 70%, pelo menos 71%, pelo menos 72%, pelo menos 73%, pelo me- nos 74%, pelo menos 75%, pelo menos 76%, pelo menos 77%, pelo menos 78%, pelo menos 79%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pe- lo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84% ou pelo menos 85% em comparação com a administração intravenosa normalizada para a mesma dose.

[00215] Em algumas modalidades, a presente divulgação fornece um método em que a biodisponibilidade dos anticorpos da invenção que se aglutinam a RBCs humanas transitoriamente após administra-

ção subcutânea é de 50% a 80% em comparação com a administra- ção intravenosa normalizada para a mesma dose.

[00216] Em algumas modalidades, a presente divulgação fornece um método em que a biodisponibilidade dos anticorpos da invenção que se aglutinam a RBCs humanas transitoriamente após administra- ção subcutânea é de pelo menos 50% em comparação com a adminis- tração intravenosa normalizada para a mesma dose.

[00217] Em algumas modalidades, a presente divulgação fornece um método em que a biodisponibilidade dos anticorpos da invenção que se aglutinam a RBCs humanas transitoriamente após administra- ção subcutânea é de pelo menos 55% em comparação à administra- ção intravenosa normalizada para a mesma dose.

[00218] Em algumas modalidades, a presente divulgação fornece um método em que a biodisponibilidade dos anticorpos da invenção que se aglutinam a RBCs humanas transitoriamente após administra- ção subcutânea é de pelo menos 60% em comparação com a adminis- tração intravenosa normalizada para a mesma dose.

[00219] Em algumas modalidades, a presente divulgação fornece um método em que a biodisponibilidade dos anticorpos da invenção que se aglutinam a RBCs humanas transitoriamente após administra- ção subcutânea é de pelo menos 65% em comparação com a adminis- tração intravenosa normalizada para a mesma dose.

[00220] Em algumas modalidades, a presente divulgação fornece um método em que a biodisponibilidade dos anticorpos da invenção que se aglutinam a RBCs humanas transitoriamente após administra- ção subcutânea é de pelo menos 70% em comparação com a adminis- tração intravenosa normalizada para a mesma dose.

[00221] Em algumas modalidades, a presente divulgação fornece um método em que a biodisponibilidade dos anticorpos da invenção que se aglutinam a RBCs humanas transitoriamente após administra-

7T4/179 ção subcutânea é de pelo menos 75% em comparação com a adminis- tração intravenosa normalizada para a mesma dose.

[00222] Em algumas modalidades, a presente divulgação fornece um método em que a biodisponibilidade dos anticorpos da invenção que se aglutinam a RBCs humanas transitoriamente após administra- ção subcutânea é de pelo menos 80% em comparação com a adminis- tração intravenosa normalizada para a mesma dose.

[00223] Em certas modalidades, os anticorpos anti-CD38 descritos neste documento são administrados por via subcutânea em uma única injeção em bolus. Em certas modalidades, os anticorpos anti-CD38 descritos neste documento são administrados por via subcutânea mensalmente. Em certas modalidades, os anticorpos anti-CD38 descri- tos neste documento são administrados por via subcutânea uma vez a cada três semanas. Em certas modalidades, os anticorpos anti-CD38 descritos neste documento são administrados por via subcutânea a cada duas semanas. Em certas modalidades, os anticorpos anti-CD38 descritos neste documento são administrados por via subcutânea se- manalmente. Em certas modalidades, os anticorpos anti-CD38 descri- tos neste documento são administrados por via subcutânea duas ve- zes por semana. Em certas modalidades, os anticorpos anti-CD38 descritos neste documento são administrados por via subcutânea dia- riamente. Em certas modalidades, os anticorpos anti-CD38 descritos neste documento são administrados por via subcutânea a cada 12 ho- ras. Em certas modalidades, os anticorpos anti-CD38 descritos neste documento são administrados por via subcutânea a cada 8 horas. Em certas modalidades, os anticorpos anti-CD38 descritos neste docu- mento são administrados por via subcutânea a cada seis horas. Em certas modalidades, os anticorpos anti-CD38 descritos neste docu- mento são administrados por via subcutânea a cada quatro horas. Em certas modalidades, os anticorpos anti-CD38 descritos neste docu-

mento são administrados por via subcutânea a cada duas horas.

[00224] Em algumas modalidades, as formas de dosagem unitária subcutânea são administradas em uma dosagem de cerca de 0,01 mg por quilograma de peso corporal a cerca de 0,8 miligrama por quilo- grama de peso corporal. Em algumas modalidades, as formas de do- sagem unitária subcutânea compreendem uma quantidade suficiente para administrar uma dosagem de cerca de 0,02 mg por quilograma de peso corporal a cerca de 0,75 miligrama por quilograma de peso cor- poral. Em algumas modalidades, as formas de dosagem unitária sub- cutânea compreendem uma quantidade suficiente para administrar uma dosagem de cerca de 0,02 mg por quilograma de peso corporal a cerca de 0,7 miligrama por quilograma de peso corporal. Em algumas modalidades, as formas de dosagem unitária subcutânea compreen- dem uma quantidade suficiente para administrar uma dosagem de cer- ca de 0,03 mg por quilograma de peso corporal a cerca de 0,6 mili- grama por quilograma de peso corporal. Em algumas modalidades, a quantidade é formulada em um volume entre cerca de 0,25 mililitro (ml) e cerca de 3,5 mililitro (ml). Em algumas modalidades, a quantidade é formulada em um volume entre cerca de 0,5 ml e cerca de 3 ml. Em algumas modalidades, a quantidade é formulada em um volume entre cerca de 0,5 ml e cerca de 2,5 ml. Em algumas modalidades, a quanti- dade é formulada em um volume entre cerca de 0,5 ml e cerca de 2 ml. Em algumas modalidades, a quantidade é formulada em um volu- me entre cerca de 1 ml e cerca de 2 ml. Em algumas modalidades, a quantidade é formulada em um volume entre cerca de 0,25 ml e cerca de 1,25 ml. Em algumas modalidades, a quantidade é formulada em um volume entre cerca de 0,5 ml e cerca de 1,25 ml. Em algumas mo- dalidades, a quantidade é formulada em um volume entre cerca de 0,75 ml e cerca de 1,25 ml. Em algumas modalidades, a quantidade é formulada em um volume entre cerca de 0,75 ml e cerca de 1 ml. Em algumas modalidades, a quantidade é formulada em um volume entre cerca de 0,9 ml e cerca de 1,5 ml. Em algumas modalidades, a quanti- dade é formulada em um volume entre cerca de 0,9 ml e cerca de 1,1 ml. Em algumas modalidades, a quantidade é formulada em um volu- me entre cerca de 1 ml e cerca de 1,0 ml. Em algumas modalidades, a quantidade é formulada em um volume entre cerca de 0,95 ml e cerca de 1,05 ml. Em algumas modalidades, a quantidade é formulada em um volume de cerca de 3,5 ml. Em algumas modalidades, a quantida- de é formulada em um volume de cerca de 3 ml. Em algumas modali- dades, a quantidade é formulada em um volume de cerca de 2,5 ml. Em algumas modalidades, a quantidade é formulada em um volume de cerca de 2 ml. Em algumas modalidades, a quantidade é formulada em um volume de cerca de 1,5 ml. Em algumas modalidades, a quan- tidade é formulada em um volume de cerca de 1 ml. Em algumas mo- dalidades, a quantidade é formulada em um volume de cerca de 0,5 ml. Em algumas modalidades, a quantidade é formulada em um volu- me de cerca de 0,25 ml.

FORMAS DE DOSAGEM UNITÁRIA

[00225] Em algumas modalidades, os anticorpos terapêuticos anti- CD38 são formulados como parte de uma forma de dosagem unitária. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma cadeia pesa- da que compreende as seguintes sequências de aminoácidos CDR: GFTFDDYG (SEQ ID NO: 3; HCDR1 AB79), ISWNGGKT (SEQ |D NO: 4; HCDR2 AB79) e ARGSLFHDSSGFYFGH (SEQ ID NO: 5; HCDR3 AB79). Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma ca- deia leve que compreende as seguintes sequências de aminoácidos CDR: SSNIGDNY (SEQ ID NO: 6; LCDR1 AB79), RDS (SEQ ID NO: 7; LCDR2 AB79) e OSYDSSLSGS (SEQ ID NO: 8; LCDR3 AB79). Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma cadeia pesada que compreende as seguintes sequências de aminoácidos CDR:

TTI179 GFTFDDYG (SEQ ID NO: 3; HCDR1 AB79), ISWNGGKT (SEQ |D NO: 4; HCDR2 AB79), ARGSLFHDSSGFYFGH (SEQ ID NO: 5; HCDR3 AB79) e uma cadeia leve que compreende as seguintes sequências de aminoácidos CDR: SSNIGDNY (SEQ ID NO: 6; LCDR1 AB79), RDS (SEQ ID NO: 7; LCDR2 AB79) e OSYDSSLSGS (SEQ |D NO: 8; LCDR3 AB79). Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos da cadeia pesada variável (VH) da SEQ ID NO: 9.

EVOLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDDYGMSWVRQAPGKGL EWVSDISWNGGKTHYVDSVKGQFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDT

AVYYCARGSLFHDSSGFYFGHWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLA (SEQ ID NO: 9).

[00226] Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da cadeia leve variável (VL) da SEQ ID NO: 10.

QSVLTQAPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGDNYVSWYQQLPGTAPK

LLIVYTRDSQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCQSYD SSLSGSVFGGGTKLTVLGQPKANPTVTLFPPSSEEL (SEQ ID NO: 10).

[00227] Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos da ca- deia VH da SEQ ID NO: 9 e uma cadeia leve que compreende a se- quência de aminoácidos da cadeia VL da SEQ ID NO: 10.

[00228] “Como será apreciado pelos especialistas na técnica, as ca- deias pesada e leve variáveis podem ser unidas a sequências de do- mínio constante de IgG humano, geralmente IgG1, IgG2 ou IgG4. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende a sequência de aminoácidos da cadeia pesada (HC) da SEQ ID NO: 11.

EVOLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDDYGMSWVRQAPGKGL EWVSDISWNGGKTHYVDSVKGQFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDT AVYYCARGSLFHDSSGFYFGHWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPS SKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLOSS GLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTH TCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDP EVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNG KEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQV

SLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKL TVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 11).

[00229] Em algumas modalidades, o anticorpo compreende a se- quência de aminoácidos da cadeia leve (LC) da SEQ ID NO: 12.

QSVLTQAPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGDNYVSWYQQLPGTAPK LLIYRDSQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCQSYD SSLSGSVFGGGTKLTVLGQAQPKANPTVTLFPPSSEELQANKATLVCLIS

DFYPGAVTVAWKADGSPVKAGVETTKPSKQSNNKYAASSYLSLTPE QWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS (SEQ ID NO: 12).

[00230] Em algumas modalidades, o anticorpo compreende a se- quência de aminoácidos de HC da SEQ ID NO: 11 e a sequência de aminoácidos de LC da SEQ ID NO: 12.

[00231] Em algumas modalidades, a formulação que compreende o anticorpo anti-CD38 é uma forma de dosagem unitária. Em algumas modalidades, a forma de dosagem unitária compreende uma quanti- dade suficiente para administrar uma dosagem de cerca de 0,01 mg por quilograma de peso corporal a cerca de 0,8 miligrama por quilo- grama de peso corporal. Em algumas modalidades, a forma de dosa- gem unitária compreende uma quantidade suficiente para administrar uma dosagem de cerca de 0,02 mg por quilograma de peso corporal a cerca de 0,75 miligrama por quilograma de peso corporal. Em algumas modalidades, a forma de dosagem unitária compreende uma quanti- dade suficiente para administrar uma dosagem de cerca de 0,02 mg por quilograma de peso corporal a cerca de 0,7 miligrama por quilo-

grama de peso corporal.

Em algumas modalidades, a forma de dosa- gem unitária compreende uma quantidade suficiente para administrar uma dosagem de cerca de 0,03 mg por quilograma de peso corporal a cerca de 0,6 miligrama por quilograma de peso corporal.

Em algumas modalidades, a quantidade é formulada em um volume entre cerca de 0,25 mililitro (ml) e cerca de 3,5 mililitro (ml). Em algumas modalida- des, a quantidade é formulada em um volume entre cerca de 0,5 ml e cerca de 3 ml.

Em algumas modalidades, a quantidade é formulada em um volume entre cerca de 0,5 ml e cerca de 2,5 ml.

Em algumas modalidades, a quantidade é formulada em um volume entre cerca de 0,5 ml e cerca de 2 ml.

Em algumas modalidades, a quantidade é for- mulada em um volume entre cerca de 1 ml e cerca de 2 ml.

Em algu- mas modalidades, a quantidade é formulada em um volume entre cer- ca de 0,25 ml e cerca de 1,25 ml.

Em algumas modalidades, a quanti- dade é formulada em um volume entre cerca de 0,5 ml e cerca de 1,25 ml.

Em algumas modalidades, a quantidade é formulada em um volu- me entre cerca de 0,75 ml e cerca de 1,25 ml.

Em algumas modalida- des, a quantidade é formulada em um volume entre cerca de 0,75 mle cerca de 1 ml.

Em algumas modalidades, a quantidade é formulada em um volume entre cerca de 0,9 ml e cerca de 1,5 ml.

Em algumas modalidades, a quantidade é formulada em um volume entre cerca de 0,9 ml e cerca de 1,1 ml.

Em algumas modalidades, a quantidade é formulada em um volume entre cerca de 1 ml e cerca de 1,1 ml.

Em algumas modalidades, a quantidade é formulada em um volume entre cerca de 0,95 ml e cerca de 1,05 ml.

Em algumas modalidades, a quantidade é formulada em um volume de cerca de 3,5 ml.

Em algu- mas modalidades, a quantidade é formulada em um volume de cerca de 3 ml.

Em algumas modalidades, a quantidade é formulada em um volume de cerca de 2,5 ml.

Em algumas modalidades, a quantidade é formulada em um volume de cerca de 2 ml.

Em algumas modalidades,

a quantidade é formulada em um volume de cerca de 1,5 ml. Em al- gumas modalidades, a quantidade é formulada em um volume de cer- ca de 1 ml. Em algumas modalidades, a quantidade é formulada em um volume de cerca de 0,5 ml. Em algumas modalidades, a quantida- de é formulada em um volume de cerca de 0,25 ml.

[00232] Em algumas modalidades, as formas de dosagem unitárias de anticorpo anti-CD38 fornecidas neste documento podem ainda compreender um ou mais excipientes, carreadores e/ou diluentes far- maceuticamente aceitáveis.

[00233] Os regimes de dosagem são ajustados para fornecer a res- posta ideal desejada (por exemplo, uma resposta terapêutica). Por exemplo, um único bolus pode ser administrado, várias doses divididas podem ser administradas ao longo do tempo ou a dose pode ser pro- porcionalmente reduzida ou aumentada como indicado pelas exigên- cias da situação terapêutica. As composições podem ser formuladas na forma de dosagem unitária para facilitar administração e uniformi- dade de dosagem. As formas de dosagem unitária, conforme usado no presente documento, podem, em algumas modalidades, se referir a unidades fisicamente distintas adequadas como dosagens unitárias para os sujeitos a serem tratados, em que cada unidade contém uma quantidade predeterminada de composto ativo calculada para produzir o efeito terapêutico desejado em associação ao carreador farmacêuti- co requerido.

[00234] As especificações para as formas de dosagem unitária da presente invenção são ditadas por, e são diretamente dependentes (a) das características únicas do composto ativo e do efeito terapêutico particular a ser alcançado, e (b) das limitações inerentes à técnica de composição de tal composto ativo para o tratamento da sensibilidade em um indivíduo.

[00235] As dosagens eficientes e os regimes de dosagem para os anticorpos anti-CD38 usados na presente invenção dependem do tipo e gravidade da doença ou afecção a ser tratada e podem ser determi- nados pelas pessoas versadas na técnica.

[00236] As formas de dosagem fornecidas neste documento se ba- seiam em uma administração subcutânea que é alcançada, pelo me- nos em parte, com base em uma menor capacidade de se aglutinar ou permanecer aglutinado a RBCs em comparação com daratumumab. Sem se ater a nenhuma teoria em particular, mas essa atividade de aglutinação pode ser devido à natureza transitória da aglutinação de AB79 a RBCs. Em algumas modalidades, os anticorpos terapêuticos se aglutinam a RBCs humanos transitoriamente. Em algumas modali- dades, os anticorpos terapêuticos anti-CD38 se aglutinam a RBCs de cynomolgus transitoriamente. Em algumas modalidades, os anticorpos terapêuticos anti-CD38 se aglutinam a RBCs humanos ou de cynomo- Igus transitoriamente. Em algumas modalidades, os anticorpos tera- pêuticos anti-CD38 se aglutinam a RBCs humanos e de cynomolgus transitoriamente.

[00237] Em uma modalidade, o anticorpo anti-CD38 é administrado por administração subcutânea em uma dosagem semanal de cerca de 0,01 a cerca de 1 mg/kg, tal como de cerca de 0,02 a cerca de 0,8 mg/kg. Essa administração pode ser repetida, por exemplo, de 1 a 14 vezes, tais como de 3 a 5 vezes. Uma faixa não limitativa exemplifica- tiva para uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo an- ti-CD38 usado na presente invenção é de cerca de 0,01 a 1 mg/kg, tal como cerca de 0,01 a 0,8 mg/kg, cerca de 0,02 a 0,75 mg/kg, cerca de 0,02 a 0,7 mg/kg ou cerca de 0,03 a 0,6 mg/kg.

[00238] Como exemplos não limitativos, o tratamento de acordo com a presente invenção pode ser fornecido como uma dosagem diá- ria de um anticorpo em uma quantidade de cerca de 0,01 a cerca de 1 mg/kg, tal como 0,009, 0,01, 0,03, 0,05, 0,07, 0,09, 0,11, 0,13, 0,15,

0,17, 0,19, 0,21, 0,23, 0,25, 0,27, 0,29, 0,31, 0,33, 0,35, 0,37, 0,39, 0,41, 0,43, 0,45, 0,47, 0,49, 0,51, 0,53, 0,55, 0,57, 0,59, 0,61 0,63, 0,65, 0,67, 0,69, 0,71, 0,72, 0,73, 0,75, 0,77, 0,79, 0,81, 0,83, 0,85, 0,87, 0,89, 0,91, 0,93, 0,95, 0,97 ou 0,99, 1,0 ou 1,1 mg/kg, por dia, em pelo menos um dentre os dias 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 ou 40 ou, alternativamente, em pelo me- nos uma dentre as semanas 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 após o início do tratamento, ou qualquer com- binação dos mesmos, com uso de doses únicas ou divididas em cada 24,18, 12, 8, 6, 4 ou 2 horas ou qualquer combinação dos mesmos.

[00239] Em uma modalidade, o anticorpo anti-CD38 é administrado em uma dosagem semanal de cerca de 0,01 a cerca de 1 mg/kg, tal como cerca de 0,02 a cerca de 0,8 mg/kg. Essa administração pode ser repetida, por exemplo, de 1 a 14 vezes, tais como de 3 a 5 vezes. A administração pode ser realizada por infusão contínua durante um período de 2 a 24 horas, tal como de 2 a 12 horas. Esse regime pode ser repetido uma ou mais vezes conforme necessário, por exemplo, após 6 meses ou 12 meses. À dosagem pode ser determinada ou ajustada medindo a quantidade de composto da presente invenção no sangue após administração, por exemplo, colhendo uma amostra bio- lógica e usando anticorpos anti-idiotípicos que têm como alvo a região de aglutinação ao antígeno do anticorpo anti-CD38.

[00240] Em uma modalidade adicional, o anticorpo anti-CD38 é administrado uma vez por semana por 2 a 12 semanas, tal como por 3 a 10 semanas, tal como por 4 a 8 semanas.

[00241] Em uma modalidade, o anticorpo anti-CD38 é administrado por terapia de manutenção, tal como, por exemplo, uma vez por se- mana por um período de 6 meses ou mais.

[00242] Em uma modalidade, o anticorpo anti-CD38 é administrado por um regime incluindo uma infusão de um anticorpo anti-CD38 se- guido por uma infusão de um anticorpo anti-CD38 conjugado a um ra- dioisótopo. O regime pode ser repetido, por exemplo, de 7 a 9 dias de- pois.

[00243] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD38 da inven- ção é usado em combinação com um ou mais agentes terapêuticos adicionais, por exemplo, um agente quimioterápico. Exemplos não limi- tativos de agentes quimioterápicos prejudiciais ao DNA incluem inibi- dores da topoisomerase | (por exemplo, irinotecano, topotecano, camptotecina e análogos ou metabólitos dos mesmos e doxorrubicina); inibidores da topoisomerase || (por exemplo, etoposido, teniposido e daunorrubicina); agentes alquilantes (por exemplo, melfalano, cloram- bucil, bussulfano, tiotepa, ifosfamida, carmustina, lomustina, semusti- na, estreptozocina, decarbazina, metotrexato, mitomicina C e ciclofos- famida); intercaladores de DNA (por exemplo, cisplatina, oxaliplatina e carboplatina); intercaladores de DNA e geradores de radicais livres, como bleomicina; e miméticos de nucleosídeos (por exemplo, 5- fluorouracil, capecitibina, gencitabina, fludarabina, citarabina, mercap- topurina, tioguanina, pentostatina e hidroxiureia).

[00244] Os agentes quimioterápicos que interrompem a replicação celular incluem: paclitaxel, docetaxel e análogos relacionados; vincris- tina, vinblastina e análogos relacionados; talidomida, lenalidomida e análogos relacionados (por exemplo, CC-5013 e CC-4047); inibidores de proteína tirosina quinase (por exemplo, mesilato de imatinib e gefi- tinib); inibidores de proteassoma (por exemplo, bortezomib); inibidores de NF-«B, incluindo inibidores da IKB quinase; anticorpos que se aglu- tinam a proteínas sobrexpressas, expressas inadequadamente ou ati- vadas em cânceres e, assim, regulam de forma decrescente a replica- ção celular (por exemplo, trastuzumab, rituximab, cetuximab e bevaci- zumab); e outros inibidores de proteínas ou enzimas conhecidas por serem reguladas de forma crescente, sobrexpressas, expressas ina- dequadamente ou ativadas em cânceres, cuja inibição regula de forma decrescente a replicação celular.

[00245] Em algumas modalidades, os anticorpos da invenção po- dem ser utilizados antes, simultaneamente ou após o tratamento com Velcade& (bortezomib).

MODALIDADES DE TRATAMENTO

[00246] Nos métodos da invenção, terapia é usada para fornecer uma resposta terapêutica positiva com relação a uma doença ou afec- ção. O termo “resposta terapêutica positiva” refere-se a uma melhora em uma doença ou afecção, e/ou uma melhora nos sintomas associa- dos à doença ou afecção. Por exemplo, uma resposta terapêutica po- sitiva refere-se a uma ou mais dentre as seguintes melhoras na doen- ça: (1) uma redução no número de células neoplásticas; (2) um au- mento de mortes de célula neoplástica; (3) inibição de sobrevivência de célula neoplástica; (5) inibição (isto é, retardo até certo ponto, pre- ferencialmente suspensão) de crescimento tumoral; (6) uma taxa de sobrevivência de paciente aumentada; e (7) algum alívio de um ou mais sintomas associados à doença ou afecção.

[00247] Respostas terapêuticas positivas em qualquer dada doença ou afecção podem ser determinadas por critérios de resposta padroni- zados específicos para aquela doença ou afecção. A resposta tumoral pode ser avaliada quanto a alterações em morfologia tumoral (isto é, carga tumoral geral, tamanho de tumor e semelhantes) com o uso de técnicas de triagem, tais como varredura de imagem por ressonância magnética (MRI), imagem por raios X, exame tomográfico computado- rizado (CT), imagem de exame ósseo, endoscopia e amostragem de biopsia tumoral que inclui coleta de medula óssea (BMA) e contagem de células tumorais na circulação.

[00248] Além daquelas respostas terapêuticas positivas, o sujeito que passa por terapia pode sentir o efeito benéfico de uma melhora nos sintomas associados à doença. Para tumores de células B, o su- jeito pode experimentar uma diminuição nos chamados sintomas B, por exemplo, suores noturnos, febre, perda de peso e/ou urticária. Pa- ra afecções pré-malignas, a terapia com um anticorpo terapêutico anti- CD38 pode bloquear e/ou prolongar o tempo antes do desenvolvimen- to de uma afecção maligna relacionada, por exemplo, desenvolvimento de mieloma múltiplo em sujeitos que sofrem de gamopatia monoclional de significado indeterminado (MGUS).

[00249] “Uma melhora na doença pode ser caracterizada como uma resposta completa. O termo "resposta completa" refere-se à ausência de doença clinicamente detectável com normalização de estudos radi- ográficos anteriormente anormais, medula óssea e líquido cefalorra- quidiano (CSF) ou proteína monoclonal anormal no caso de mieloma.

[00250] Essa resposta pode persistir por pelo menos 4 a 8 sema- nas, ou pelo menos 6 a 8 semanas, após o tratamento de acordo com os métodos da invenção. Alternativamente, uma melhora na doença pode ser classificada como uma resposta parcial. O termo "resposta parcial" refere-se a pelo menos uma redução de cerca de 50% em to- da a carga mensurável do tumor (isto é, o número de células malignas presentes no sujeito, ou o volume medido de massas tumorais ou a quantidade de proteína monoclonal anormal) na ausência de novas lesões, que pode persistir por 4 a 8 semanas ou 6 a 8 semanas.

[00251] O tratamento de acordo com a presente invenção inclui uma “quantidade terapeuticamente eficaz" dos medicamentos usados. Uma “quantidade terapeuticamente eficaz” refere-se a uma quantidade eficaz, em dosagens e por períodos de tempo necessários, para al- cançar um resultado terapêutico desejado.

[00252] Os termos “quantidade terapeuticamente eficaz" e “dosa- gem terapeuticamente eficaz” referem-se a uma quantidade de uma terapia que é suficiente para reduzir ou melhorar a gravidade e/ou du- ração de um distúrbio ou um ou mais sintomas do mesmo; prevenir o avanço de um distúrbio; causar regressão de um distúrbio; prevenir a recorrência, desenvolvimento, início ou progressão de um ou mais sin- tomas associados a um distúrbio, ou intensificar ou aperfeiçoar o efeito profilático ou terapêutico (ou os efeitos profiláticos ou terapêuticos) de outra terapia (por exemplo, agente profilático ou terapêutico), em do- sagens e por períodos de tempo necessários para alcançar um resul- tado terapêutico desejado. Uma quantidade terapeuticamente eficaz pode variar de acordo com fatores, tais como o estado de doença, ida- de, sexo e peso do indivíduo, e a capacidade dos medicamentos em elicitar uma resposta desejada no indivíduo. Uma quantidade terapeu- ticamente eficaz também é uma na qual quaisquer efeitos tóxicos ou prejudiciais do anticorpo ou porção de anticorpo são compensados pe- los efeitos terapeuticamente benéficos. Uma “quantidade terapeutica- mente eficaz" de um anticorpo para terapia tumoral também pode ser medida por sua capacidade em estabilizar a progressão da doença. À capacidade de um composto em inibir câncer pode ser avaliada em um sistema de modelo animal preditivo de eficácia em tumores huma- nos.

[00253] —Alternativamente, essa propriedade de uma composição pode ser avaliada examinando-se a capacidade do composto em inibir crescimento celular ou em induzir apoptose por ensaios in vitro conhe- cidos por aqueles versados. Uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto terapêutico pode diminuir o tamanho tumoral ou, de outra forma, melhorar sintomas em um sujeito. Uma pessoa versada na técnica seria capaz de determinar tais quantidades com base em fatores, tais como o tamanho do sujeito, a gravidade dos sintomas do sujeito e a composição particular ou via de administração selecionada. KITS DE ANTICORPOS ANTI-CD38

[00254] Em outro aspecto da invenção, são fornecidos kits para o tratamento de uma doença ou afecção associada a cânceres hemato- lógicos. Em uma modalidade, o kit compreende uma dose de um anti- corpo anti-CD38 descrito neste documento, tal como AB79. Em algu- mas modalidades, os kits fornecidos neste documento podem conter uma ou mais doses de uma formulação líquida ou liofilizada, conforme aqui fornecido. Quando os kits compreendem uma formulação liofiliza- da de um anticorpo anti-CD38 descrito neste documento, tal como AB79, geralmente os kits também contêm um líquido adequado para a reconstituição da formulação líquida, por exemplo, água estéril ou um tampão farmaceuticamente aceitável. Em algumas modalidades, os kits podem compreender uma formulação de anticorpo anti-CD38 des- crita neste documento pré-acondicionada em uma seringa para admi- nistração subcutânea por um profissional de saúde ou para uso do- méstico.

[00255] Em certas modalidades, o kit será para uma única adminis- tração ou dose de um anticorpo anti-CD38 descrito neste documento, tal como AB79. Em outras modalidades, o kit pode conter múltiplas doses de um anticorpo anti-CD38 descrito neste documento, tal como AB79, para administração subcutânea. Em uma modalidade, o kit pode compreender uma formulação de anticorpo anti-CD38 descrita neste documento pré-acondicionada em uma seringa para administração subcutânea por um profissional de saúde ou para uso doméstico.

ARTIGOS DE FABRICAÇÃO

[00256] Em outras modalidades, um artigo de fabricação contendo materiais úteis para o tratamento dos distúrbios descritos acima é for- necido. O artigo de fabricação compreende um recipiente e um rótulo. Recipientes adequados incluem, por exemplo, garrafas, frascos, serin- gas e tubos de ensaio. Os recipientes podem ser formados a partir de uma variedade de materiais, tais como vidro ou plástico. O recipiente retém uma composição que é eficaz para o tratamento da afecção e pode ter uma porta de acesso estéril (por exemplo, o recipiente pode ser uma bolsa de solução intravenosa ou um frasco com uma rolha perfurável por uma agulha de injeção hipodérmica). O agente ativo na composição é o anticorpo. O rótulo no, ou associado ao, recipiente in- dica que a composição é usada para tratar a afecção de escolha. O artigo de fabricação pode ainda compreender um segundo recipiente que compreende um tampão farmaceuticamente aceitável, tal como solução salina tamponada com fosfato, solução de Ringer ou solução de dextrose. O artigo pode ainda incluir outros materiais desejáveis do ponto de vista comercial e do usuário, incluindo outros tampões, dilu- entes, filtros, agulhas, seringas e bulas com instruções de uso.

EXEMPLOS EXEMPLO 1: CARACTERIZAÇÃO BASEADA EM MODELOS DE AN- TICORPO ANTI-CD38 EM MACACOS CYNOMOLGUS

[00257] O anticorpo AB79 anti-CD38 se aglutina ao CD38 de maca- co cynomolgus (cyno), distinguindo-o do daratumumab (Darzalex'"), um anticorpo monoclonal CD38 citolítico recentemente aprovado para o tratamento de mieloma múltiplo. Esta função única apoiou o uso do cyno em estudos pré-clínicos para caracterizar a farmacocinética (PK) do AB79, farmacodinâmica (PD) e segurança. Para este fim, foram de- senvolvidos ensaios para medir as concentrações de fármaco, imuno- genicidade e para quantificar linfócitos T, B e NK no sangue de maca- cos cyno. Esses parâmetros foram avaliados em 8 estudos pré-clínicos farmacológicos e toxicológicos. Dentre as populações celulares testa- das, o CD38 é mais altamente expresso nas células NK; portanto, foi assumido que o efeito do fármaco nas células NK se aproxima mais do efeito nas células-alvo consideradas, nos blastos plasmáticos, nas cé- lulas plasmáticas e em outros linfócitos ativados.

[00258] Os dados foram reunidos a partir de 8 estudos em macacos saudáveis com uso de uma faixa de doses de 0,03 a 100 mg/kg e fo- ram desenvolvidos modelos matemáticos que descrevem a farmacoci- nética e a relação de efeito e exposição para cada um dos tipos de célu- las. A depleção de células NK foi identificada como o efeito farmacodi- nâmico mais sensível do AB79. Esta depleção foi descrita com um mode- lo de rotatividade (EC50 = 34,8 ug/ml na taxa de depleção) e a depleção completa foi alcançada com uma dose IV de 0,3 mg/kg. Também foram observados efeitos intermediários nas contagens de células T com uso de um modelo de resposta direta (EC50 = 9,43 ug/ml) e nas contagens de células B com uso de um modelo de 4 compartimentos de trânsito (EC50 = 19,3 ug/ml na taxa de depleção). Essas análises substancia- ram a observação de que cada um dos subconjuntos de linfócitos me- didos foi eliminado pelo AB79 em taxas diferentes e exigiu diferentes períodos de tempo para esgotar o compartimento sanguíneo.

[00259] Modelos matemáticos que descrevem os dados PK e PD são ferramentas úteis para obter visões quantitativas e mecanicistas das relações entre exposição e efeito de fármacos (Friberg et al. (2002) J. Clin. Oncol. 20: 4713 a 4721; Mager et al. (2003) Drug Metab. Dispos. 31: 510 a 518; Han and Zhou (2011) Ther. Deliv. 2: 359 a 368). Características típicas PK de anticorpos IgG, incluindo distri- buição e eliminação, semelhanças fisiológicas e genéticas entre ma- caco e humano podem ser aproveitadas para explicar a farmacologia do AB79 (Glassman and Balthasar (2014) Cancer Biol. Med. 11: 20 a 33; Kamath (2016) Drug Discov. Today Technol. 21 a 22: 75 a 83). Além disso, esses modelos foram aplicados com sucesso para prever concentrações PK e efeitos PD em sujeitos humanos saudáveis (Han e Zhou (2011) Ther. Deliv. 2: 359 a 368).

MATERIAIS E MÉTODOS

[00260] Um resumo dos estudos com macacos é mostrado na Ta- bela 2 em ordem cronológica. Os estudos de dose única 2, 7 e 8 foram conduzidos principalmente para avaliar PK e PD de AB79 administrado por via intravenosa (IV) e subcutânea (SC) (Figura 1). Os estudos de dose repetida foram realizados para avaliar a segurança, farmacociné- tica e DP, incluindo dois estudos de 4 semanas (estudos 1 e 3) e três estudos de 13 semanas sob condições de GLP (estudos 4, 5 e 6). No estudo 5 de 13 semanas, ocorreu um erro de dosagem. Os animais do grupo de dose mais baixa receberam 0,01 mg/kg em vez do 0,1 mg/kg pretendido em uma ocasião (a segunda dose) e depois continuaram com 0,1 mg/kg. Esses dados foram adicionados ao conjunto de dados com as informações corretas das quantidades de dosagem realmente administradas. O estudo 6 repetiu a dose baixa de 0,1 mg/kg sema- nalmente do grupo do Estudo 5. Todos os estudos em animais foram realizados de acordo com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório, adotado e promulgado pelos Institutos Nacionais de Saú- de dos EUA.

TABELA 2. ESTUDOS DE AB79 EM MACACOS EM ORDEM CRO-

NOLÓGICA Número — de Número de go aaa E Te EE 1 [021 (mota) + Da 26TE mato) W. PR 28 (2 mo/kg), IV, PK, [665 —) DR [esta 12. [186 2 Dose VPRPDO SO se 5 : 4 : ;

FT 8 IV: infusão intravenosa de 30 minutos (estudos 1 a 4) ou bolus (estu- dos 5 a 8), SC: injeção subcutânea (grupo 4 do estudo 7 e 3 grupos do estudo 8), PK: amostra densa de PK, PD: amostragem densa de san- gue total para análises por citometria de fluxo, produzindo dados de contagem de células T, B e NK. plc - placebo, “4 semanas” ou “13 se- manas” descreve a duração do período de tratamento, tox: estudo de toxicologia, q2wk: cronograma de dosagem a cada duas semanas.

BIOANALÍTICA

[00261] A PK foi analisada usando um método validado desenvolvi- do e realizado por Charles River Laboratories (Reno, NV). Resumida- mente, a concentração de AB79 foi medida no soro de macaco com uso de um ensaio imunossorvente indireto ligado à enzima (ELISA). Um formato de microtitulação de 96 poços foi revestido com um anti- corpo anti-idiotípico contra AB79. Amostras em branco, padrões e de controle de qualidade (QC) que contêm AB79 em várias concentra- ções foram adicionadas à placa e incubadas por 55 a 65 minutos em temperatura ambiente (RT). Após a lavagem da placa de microtitula- ção, um IgG anti-humano de affinipure de camundongo conjugado com peroxidase (Peroxidase AffiniPure Mouse Anti-Human IgG, Fcy Frag- ment Specific; Jackson ImmunoResearch) foi adicionado e incubado na placa por mais 55 a 65 minutos. A placa foi lavada novamente e foi adicionada tetrametilbenzidina (TMB) aos poços para gerar um cromó- foro, e o desenvolvimento da cor foi interrompido pela adição de uma solução de parada (ácido sulfúrico 2N). A absorvância a 450 nm foi medida utilizando um leitor de microplacas SPECTRAmaxO 190 (Mo- lecular Devices) e as concentrações de Ab79 foram calculadas utili- zando uma curva de calibração padrão (1/yº) de logística de 4- parâmetros ponderados. No estudo 1 (Tabela 2), o limite inferior de quantificação (LLOQ) de AB79 no soro foi de 0,061 pg/ml e em todos os outros estudos foi de 0,05 ug/ml. DETERMINAÇÃO DE ANTICORPOS ANTI-AB79 (IMUNOGENICIDADE)

[00262] A triagem de anticorpos antifármacos (ADA) do soro de macaco foi analisada com uso de um método eletroquimiluminescente qualitativo (ECL), validado e realizado por Charles River Laboratories (Reno, NV). Resumidamente, amostras de soro não diluídas foram in- cubadas com ácido acético 300 mM. As amostras dissociadas por áci-

do foram incubadas em uma mistura de AB79 biotinilado, AB79 etique- tado com SULFO-TAG (Meso Scale Diagnostics, etiquetada nos Labo- ratórios Charles River) e 1,5 M de base de Trizma para neutralizar o ácido e formar um complexo imune. Este complexo foi então adiciona- do a uma placa MSD revestida com estreptavidina (Meso Scale Diag- nostics) e deixado para aglutinar. Após a lavagem, o complexo foi de- tectado pela adição do tampão T de leitura de MSD (Meso Scale Diag- nostics) à placa e subsequente excitação do SULFO-TAGTY por meio de uma reação eletroquímica de Ru(bpy)3 para gerar luminescência (luz), que foi lida com uso do MSD Sector 6000 (Meso Scale Diagnostics). À quantidade de luminescência correlacionou-se com o nível de anticorpos anti-AB79 de macaco presentes no soro de amostras individuais.

CARACTERIZAÇÃO DAS CÉLULAS SANGUÍNEAS

[00263] Para avaliar e comparar o nível de aglutinação ao AB79 en- tre humanos e macacos, amostras de sangue de cada um foram cole- tadas em tubos de heparina de sódio. Uma alíquota de sangue (100 ul) foi misturada com o volume apropriado de um anticorpo caracterizador (Tabela 3) e incubada por 15 a 20 minutos em RT no escuro. Após a incubação, 1 ml de BD FACS lise (1X; BD Biosciences; San Jose, CA) foi adicionado para lisar as células vermelhas do sangue e as células foram incubadas por 10 minutos em RT no escuro, depois centrifuga- das, decantadas e ressuspensas em 1 ml de tampão de tingimento com albumina sérica bovina (BD Biosciences). As células foram centri- fugadas uma segunda vez, decantadas e 250 ul de Flow Fix (1% de paraformaldeído em Dulbecco's-PBS (Life Technologies, Carisbad, CA) isento de cálcio e magnésio) e fluorescência medida por análises de citometria de fluxo com uso de um citômetro de fluxo FACSCanto'T" 11 (BD Biosciences). Foram medidas células NK de macaco (CD3-, CD159a+), células B (CD3-, CD20+) e células T (CD3+) e células NK humanas (CD3-, CD16/CD56+), células B (CD3-, CD19+) e células T

(CD3+). A intensidade média da fluorescência para o tingimento de AB79 para cada população de células foi convertida em unidades de moléculas de fluorescência solúvel equivalente (MOEF) com uso de uma curva padrão gerada usando Rainbow Beads (Spherotech; Lake Forest, IL). TABELA 3. ANTICORPOS USADOS PARA CARACTERIZAR CÉLU-

LAS SANGUÍNEAS Volume de anticorpo por Anticorpo amostra (ul/100 ul de Fornecedor amostra AB79-AF488 CD56-PE (B159)" * usado apenas para tingir células humanas

[00264] Nos estudos descritos na Tabela 2, as células foram tingi- das e analisadas com uso de um método validado desenvolvido e rea- lizado por Charles River Laboratories (Reno, NV). Amostras de sangue de macaco foram coletadas em tubos de heparina sódica antes e vá- rias vezes após o tratamento com AB79 e populações específicas de linfócitos medidas por análises de citometria de fluxo com uso do citô- metro de fluxo FACSCanto'" II (BD Biosciences). Anticorpos comerci- ais e um anticorpo CD38 (AB19; Tabela 3); Patente No. US 8.362.211) foram titulados para concentrações ideais de tingimento. As populações de CD38+/-, célula T (CD3+), célula B (CD3-/CD20+) de macaco e célu- las (CD3-/CD20-/CD16+) exterminadoras naturais (NK) foram identifica- das e os linfócitos quantificados com uso de tubos CD45TruCountty

(BD Biosciences). Alíquotas de aproximadamente 100 ul de cada amostra de sangue foram colocadas em um poço apropriado de uma placa de 96 poços e os anticorpos foram adicionados no volume indi- cado, misturados e incubados por um mínimo de 30 minutos em RT no escuro. Após a incubação, as células vermelhas do sangue foram lisa- das, as amostras foram misturadas e incubadas em RT por mais 10 minutos no escuro. A placa foi centrifugada e o sobrenadante foi de- cantado. O sedimento celular foi então ressuspenso em 1.800 ul de tampão de tingimento, as amostras foram misturadas, centrifugadas e o sobrenadante decantado. O sedimento celular foi ressuspenso em 500 ul de tampão de tingimento com soro bovino fetal e aproximada- mente 300 ul da suspensão celular foram transferidos para uma placa de fundo em v de 96 poços para análise. As porcentagens de células NK, bem como as do total de células T e células B, foram aplicadas aos valores de contagem de células obtidos com tubos TruCount'y (BD Biosciences; San Jose, CA) e usadas para determinar a contagem absoluta de células para cada população de células. Nos estudos 1 a 4, os subconjuntos de células CD38+ NK, B e T foram avaliados na linha de base com os anticorpos anti-CD38 marcados AB79 ou AB19. Embora o AB19 se aglutine a um epítopo diferente, os resultados fo- ram muito semelhantes e, portanto, não são apresentados separada- mente. As amostras processadas foram analisadas imediatamente.

DESENVOLVIMENTO DO MODELO PK

[00265] Durante o desenvolvimento do modelo PK, estruturas de modelo de um, dois e três compartimentos foram investigadas. O mo- delo de dois compartimentos foi claramente superior ao modelo de um compartimento, julgado pelas plotagens de qualidade de ajuste (GOF) e uma diminuição no valor da função objetivo (OFV). Com base nas inspeções visuais das plotagens de diagnóstico, a introdução de um terceiro compartimento não foi necessária para descrever os dados adequadamente. A biodisponibilidade (F) foi modelada com uso da transformação de logit F = exp (PARY/(1+exp (PAR)), em que PAR de- signa o parâmetro do modelo, para garantir que as estimativas sejam delimitadas entre O e 1. A PK não linear em baixas concentrações foi modelada com o modelo de aproximação em estado quase estacioná- rio (QSS) do processo de disposição de fármacos mediada por alvo (TMDD) (Gibiansky e Gibiansky (2009) Expert Opin. Drug Metab. Toxi- col. 5: 803 a 812).

[00266] Uma representação esquemática do modelo é fornecida na Figura 2C. Para a aproximação em QSS, foi assumido que as concen- trações no estado estacionário do fármaco livre C, o alvo R e o com- plexo do alvo do fármaco RC são estabelecidas muito rapidamente em comparação com todos os outros processos. Isso implica que o pro- cesso de aglutinação é equilibrado com os processos de dissociação e internalização e que a seguinte equação se aplica nas unidades apro- priadas: Kon*C*R = (KorF + Kint) * RC, em que Kon designa a constan- te da taxa de aglutinação e Korr a constante da taxa de dissociação e Kimwr a constante da taxa de internalização.

[00267] A variabilidade entre sujeitos (BSV) foi investigada para to- dos os parâmetros e modelada com modelos exponenciais do seguinte tipo: PAR; = TVPAR * efTAPAR,, em que PAR; é o indivíduo e TVPAR a típica estimativa de parâmetro ETAPAR; é a estimativa do desvio do indivíduo i. Os valores de ETAPAR; foram assumidos como seguindo uma distribuição normal com média zero. Os resíduos foram descritos com um modelo combinado de aditivo e erro proporcional (Beal e Sheiner (1992) NONMEM User Guides, na University of California CA).

[00268] Os seguintes parâmetros foram investigados para identificar possíveis efeitos covariáveis na PK do AB79: peso corporal, sexo, do- se, via de administração e estudo. DESENVOLVIMENTO DE MODELO PK-PD

[00269] Para cada um dos três tipos de células, o desenvolvimento do modelo PK-PD foi realizado separadamente. Observa-se que, para o desenvolvimento do modelo, as medições próximas à administração do fármaco (<8 horas após a dose) não foram utilizadas porque foram influenciadas por um efeito não específico independente do fármaco, potencialmente devido a várias amostras de sangue coletadas em um curto período de tempo. O modelo PK e as estimativas de parâmetro foram fixos. Foram testados modelos de rotatividade, compartimento de trânsito e de resposta direta de várias formas (Friberg et a/. (2002) J. Clin. Oncol. 20: 4713 a 4721; Mager et al. (2003) Drug Metab. Dis- pos. 31: 510 a 518). Nos modelos de rotatividade, o efeito do fármaco foi introduzido na taxa de eliminação de células na forma de um mode- lo do tipo Emax, com ou sem fatores de Hill. Na notação deste estudo, um modelo Emax é uma função f da concentração de fármaco c da seguinte forma: f(o)=EMAX*cH/(cH+C50"), EMAX indica o efeito máxi- mo, C50 a concentração na qual metade do efeito máximo é alcança- do e H o fator Hill. No modelo do compartimento de trânsito (TCM), o efeito do fármaco foi introduzido e testado em diferentes posições: na taxa de proliferação, nas células circulantes e no terceiro compartimen- to de trânsito. Também foram testadas combinações desses efeitos e se os dados suportam a presença de um mecanismo de feedback da circulação até a taxa de proliferação. Além disso, modelos de resposta direta do tipo Emax com e sem fatores de Hill foram testados para descrever a curva concentração-efeito do fármaco.

[00270] Parâmetros de efeito aleatório foram introduzidos para es- timar a variabilidade entre sujeitos na contagem de células da linha de base, na taxa de produção celular (KIN), no tempo de trânsito no mo- delo de compartimento de trânsito (MTT), no C50 e no EMAX. Os ní- veis médios individuais das células de linha de base foram fornecidos no conjunto de dados (coluna BL). Isso foi usado como valor típico no modelo. Um parâmetro de efeito aleatório foi adicionado para permitir o ajuste da estimativa da linha de base individual com base em todas as medições do indivíduo. Os resíduos PD foram descritos com um modelo de erro proporcional.

[00271] Para validação de modelo durante o curso de modelagem (PK e PK-PD) OFV, erros padrão, gráficos GOF e previsão individual versus gráficos de dados foram utilizados para avaliar os modelos e compará-los com os alternativos.

[00272] Os seguintes pacotes de software foram utilizados: NON- MEM (Versão 7.2), KIWI (Versão 1.6), Berkeley Madonna (versão

8.3.14), PSN (Versão 4) e R (Versão 3.3.0).

PREPARAÇÃO DO CONJUNTO DE DADOS

[00273] Os conjuntos de dados dos 8 estudos com macacos foram coletados, reorganizados em um único formato e mesclados em três conjuntos de dados separados PK-PD legíveis por NONMEM. Cada um dos três conjuntos de dados continha características individuais dos macacos (estudo, ID, grupo, peso corporal, sexo), as informações de dosagem, a PK e os dados das células NK, B ou T. Para animais dos grupos controle, apenas a contagem de células, mas nenhum da- do PK foi adicionada aos conjuntos de dados, assumindo implicitamen- te que não há níveis séricos de AB79. Informações resolvidas no tem- po sobre o status de imunogenicidade antifármaco (ADA), ou seja, TI- TER contendo o resultado quantitativo da medição e a variável de si- nalização 0/1 ADAF (ADAF = 1 se ADA afeta a concentração de AB79, ADAF = O se não o fizer), foram adicionadas em colunas separadas a cada observação. Os títulos de ADA foram medidos com especifica- ções de métodos diferentes nos diferentes estudos e, portanto, entre os estudos, os valores não são quantitativamente comparáveis de mo- do direto. Para utilizar as informações de ADA de maneira consistente em todos os estudos, o seguinte procedimento foi aplicado para cada animal separadamente: os títulos de ADA que aumentaram em perío- dos de tempo posteriores a 7 dias nos níveis inicialmente medidos fo- ram considerados positivos para ADA e sinalizados no conjunto de da- dos (ADAF = 1). Se uma amostra em um ponto no tempo foi sinalizada como positiva para ADA, todas as amostras que foram colhidas após esse ponto no tempo também foram sinalizadas como positivas para ADA neste animal, independentemente do título medido. As observa- ções positivas da ADA não foram usadas para estimativa de parâme- tros durante o desenvolvimento do modelo. Observa-se que também as medições PD dos pontos de tempo de amostragem das concentra- ções PK afetadas por ADA foram sinalizadas com ADAF = 1.

[00274] Para os dados de contagem de células, os valores de linha de base individuais para cada tipo de célula (células NK, B e T) foram calculados como valor médio de todas as medições pré-doses dispo- níveis de um determinado animal. Na maioria dos estudos, essa foi uma medição única. O valor da linha de base de cada animal foi então adicionado como uma observação no momento do primeiro evento de dosagem (TEMPO= 0) e como um valor constante na coluna BL para cada observação do respectivo animal. Com base nesse valor da linha de base, a porcentagem da linha de base para cada contagem de cé- lulas observada foi calculada e adicionada ao conjunto de dados.

ESCALONAMENTO DE PARÂMETROS PK DE MACACO

[00275] Os modelos finais PK e PK-PD foram usados como ponto de partida para simular perfis de PK e PK-PD pela primeira vez em en- saios clínicos em seres humanos. Embora nunca conclusivas, análises comparativas de dados de anticorpos monoclonais terapêuticos mos- traram que os parâmetros PK derivados de estudos em macacos po- dem ser escalonados para ajudar a prever perfis de PK humana com precisão aceitável (Han e Zhou (2011) Ther. Deliv. 2: 359 a 368) À publicação indicou que, usando um expoente fixo de 0,85, é possível prever de forma confiável as depurações humanas de anticorpos mo- noclonais. Consequentemente, essa relação foi aplicada à escala de parâmetros de depuração humana (CL, Q), enquanto os parâmetros de volume (VC, VP) foram escalonados com uso de uma relação direta entre os pesos corporais (BW): 05 Chremne CLaina| | ae ma Es

RESULTADOS FARMACOCINÉTICA DE AB79

[00276] O conjunto de dados de PK foi reunido de todos os 8 estu- dos em macacos saudáveis, excluindo os grupos placebo (Tabela 2). No total, o conjunto continha dados de 140 animais, 58 dos quais eram machos e 82 eram fêmeas. Os pesos corporais dos animais estudados variaram de 2,1 a 4,7 kg e as doses variaram de 0,03 a 100 mg por kg de peso corporal (mg/kg). Em um grupo de estudo 7 e três grupos de estudo 8, doses de 0,03, 0,1, 0,3 e 1 mg/kg foram administradas por via SC (15 animais no total). O conjunto de dados agrupados continha

2.199 observações PK mensuráveis maiores que LLOQ (Figuras 2A e 2B). A PK foi amostrada mais densamente após a primeira dose e, mesmo nos estudos toxicológicos de longo prazo, a maioria dos ani- mais foi finalizada antes do dia 98. Apenas o estudo 4 incluiu grupos de recuperação e só foi possível coletar dados de PK de 4 animais, 2 do grupo de 80 mg/kg e um de cada um dos grupos de 30 mg/kg e 3 mg/kg (Figura 2B). Paralelamente às concentrações de AB79, o ADA foi avalia- do. 229 observações de PK foram afetadas por ADA (Figura 3).

[00277] Inicialmente, para cada um dos estudos em macacos, as análises de PK foram realizadas com uso de técnicas não comparti- mentais padrão (NCA). Com base nos estudos de dose única (injeção de bolus IV ou infusão IV de 30 minutos), o volume de distribuição du- rante a fase terminal (Vz) foi calculado na faixa de 64 a 116 ml/kg, a depuração de 6,04 a 14,7 ml/kg/dia, e a meia-vida de eliminação ter- minal (T1/2) de 4,75 a 11,2 dias. Verificou-se que a área sob a curva do tempo e concentração (AUC) e os valores de concentração máxima (Cmax) aumenta proporcionalmente com a dose em uma ampla faixa. Somente os perfis de PK dos grupos de dose mais baixa (<1 mg/kg, Figuras 2D a 2F) fornecem evidências de depuração aumentada não linearmente em concentrações abaixo de 0,5 pg/ml, provavelmente causadas por mecanismos mediados pelo alvo (DTM) (Kamath (2016) Drug Discov. Today Technol. 21-22: 75 a 83). Com base nos dados de todos os estudos em macacos, excluindo os dois grupos de doses mais baixas (dose> 0,3 mg/kg), foi construído um modelo linear de 2 compartimentos. Quando a PK dos grupos de doses mais baixas foi simulada e sobreposta às concentrações medidas, ficou evidente que o modelo linear prediz as concentrações (Figuras 2D a 2F).

[00278] Os dados de PK disponíveis após a administração de dose única SC revelaram que a Cmax era 70 a 80% menor nos grupos SC versus IV da mesma dose e que as AUCs eram comparáveis. Não fo- ram observadas diferenças nos parâmetros PK entre macacos machos e fêmeas. Os resultados dessas análises iniciais foram utilizados como ponto de partida para o desenvolvimento do modelo.

DESENVOLVIMENTO DO MODELO DE PK

[00279] O desenvolvimento do modelo começou com dados de do- se única IV e, em seguida, o modelo inicial foi gradualmente ampliado, utilizando dados mais complexos. Semelhante a outros anticorpos te- rapêuticos, a PK segue grosseiramente um modelo linear de 2 com- partimentos (Kamath (2016) Drug Discov. Today Technol. 21-22: 75 a 83). O componente de eliminação não linear (TMDD) que descreve a depuração acelerada em baixas concentrações foi modelado com a aproximação do estado quase estacionário (QSS) (Gibiansky e Gibiansky (2009) Expert Opin.

Drug Metab.

Toxicol. 5: 803 a 812). À suposição de que o processo de associação fármaco-alvo é muito mais rápido que os processos de dissociação, distribuição e elimina- ção de fármaco e eliminação do complexo alvo e fármaco-alvo leva ao modelo simplificado de TMDD (Figura 2, Tabela 4). A quantidade de dados em baixas concentrações foi relativamente pequena, de modo que todos os parâmetros não fossem estimados em uma única execu- ção de estimativa do programa de software.

Portanto, os parâmetros do modelo de TMDD foram estimados pela primeira vez, concentran- do-se nos dados dos estudos de dose única baixa 7 e 8. As estimati- vas dos parâmetros TMDD resultantes foram então mantidas fixas du- rante as estimativas finais em todo o conjunto de dados (Tabela 4). TABELA 4. RESULTADOS DA MODELAGEM PK DA POPULAÇÃO ESTIMATIVAS DE PARÂMETROS E ERROS PADRÃO EM POR- CENTAGEM (% SEM)

Variabilidade — Interindivi-

Estimativa Final dos Parâmetros | dual/Variabilidade Residual

; Bo Tm E vo au mo ao NE sta sr Ta Re e [tida Tosa sor NE 1 [spotaemv [om — ns asenev |

*Ksyn é a taxa de síntese do receptor CD38. Visto que as medições de concentração real ou as informações sobre a síntese ou taxa de de- gradação in vivo de CD38 não estavam disponíveis, "u" foi usado co- mo unidade para uma certa quantidade desconhecida de CD38. *As estimativas e erros padrão para os parâmetros TMDD foram obti- dos a partir de uma execução separada que focou nos dados dos gru- pos de doses baixas, e depois foram fixos para a estimativa final dos outros parâmetros de PK. NE: Não Estimado.

[00280] As estimativas para os parâmetros de absorção Ka e F fo- ram obtidas quando os dados dos grupos SC foram adicionados. To- dos os dados do SC vieram de quatro grupos de dose única mais bai- xa dos estudos 7 e 8. Essas doses mais baixas (<1 mg/kg) abrange- ram a faixa clinicamente relevante, mas podem limitar a generalização das estimativas dos parâmetros para doses mais altas.

[00281] A variabilidade entre sujeitos (BSV) para os parâmetros PK foi descrita com modelos exponenciais. A taxa de absorção (Ka), a de- puração (CL) e o volume periférico de distribuição (Vr) têm um BSV estimado em cerca de 40% e o volume central de distribuição (Vc) em cerca de 20% (Tabela 4). Análise covariável identificou um efeito da via de administração em Vc. O valor típico para o Vc foi de 0,141 | se administrado por via IV e 0,043 | (cerca de 70% menor), se administra- do por via SC. Outros efeitos covariáveis significativos não foram iden- tificados. Devido à quantidade limitada de dados em baixas concentra- ções, a variabilidade entre os sujeitos e as previsões individuais dos parâmetros de TMDD foram estimadas apenas para a taxa de interna- lização Kint (BSV: 49%). A avaliação do modelo com base em erros residuais, OFV, erros padrão, gráficos GOF e ajustes de curva indivi- dual corroborou que o modelo final descreveu adequadamente a PK de AB79 em macacos saudáveis (Tabela 4, Figuras 4A a 4J).

FARMACODINÂMICA

[00282] O nível de aglutinação de AB79 em células NK, células T e células B de sangue humano e de macaco foi comparado por análise de citometria de fluxo. Conforme mostrado na Figura 5, os linfócitos de macaco tinham níveis de expressão de CD38, com base nas molécu- las AB79 de fluorescência equivalente (MOEF), que eram ligeiramente mais baixos em comparação com as contrapartes humanas, mas com uma relação semelhante entre os tipos de células, por exemplo, ex- pressão de CD38 nas células NK > Células B > células T. Esses dados apoiam o uso dessas espécies de primatas não humanos como um modelo relevante para ajudar a prever o potencial do AB79 para a ati- vidade da PD em seres humanos.

[00283] Para as análises quantitativas aprofundadas das relações entre a exposição ao fármaco (PK) e a extensão e duração da deple- ção celular (PD), foram compilados conjuntos de dados das concen- trações de PK, célula NK, célula B e contagem de células T de todos os 8 estudos em macacos, incluindo os animais tratados com placebo, quando disponíveis (Tabela 2). A caracterização inicial do conjunto de dados mostrou que, na linha de base, as células T apresentavam um valor mediano de 3.732 células por yuL (faixa interquartil (IQR): 2.881 a

5.176) e eram o subtipo de linfócitos mais abundante em comparação às células B com 1.279 células por ul (IQR: 860,8 a 1.890) e células NK com 685 células por ul (IQR: 482,8 a 970,1). A expressão de linha de base de CD38 nessas populações de células foi avaliada nos estu- dos 1 a 4 (Tabela 2, n = 67). 86,7% (SD 11,3) das células NK expres- saram CD38 com menor variabilidade. Em contraste, 58,7% (SD 27,0) das células B e 34,5% (SD 24,5) das células T expressaram CD38 com maior variabilidade.

[00284] Os dados dos animais tratados com placebo mostraram que o número médio de cada um dos tipos de células variou ao longo do tempo entre animais individuais, mais do que se esperaria da varia- bilidade dentro de um indivíduo (Figura 6). Por exemplo, o coeficiente médio de variação das contagens de células B das curvas individuais de placebo foi de 27%, mas os níveis médios individuais de células B variaram de 436,6 a 4.389. Além disso, também houve diferenças en- tre os números médios de linfócitos de linha de base de animais ma- chos e fêmeas e de animais de diferentes estudos, contribuindo para a variabilidade (Figura 7). Com base nesses resultados, cada contagem de células pós-tratamento foi calculada em relação ao seu valor de li- nha de base individual em porcentagem, em vez dos números absolu- tos de células em cada ponto no tempo. Por exemplo, um valor de 33% significa que na amostra a contagem de célula era 1/3 da conta- gem de células da linha de base. Isso forneceu valores padronizados que poderiam ser comparados em todo o conjunto de dados.

[00285] O rápido início da depleção das células de aglutinação ao AB79 sugere que a concentração inicial de sangue conduz à diminui- ção da contagem de linfócitos (Figura 8). Em doses |V de 0,3 mg/kg de AB79, o efeito máximo médio nas células NK foi depleção de 93,9% (isto é, 6,1% das contagens de células da linha de base restantes). À 0,1 mg/kg, o pico de depleção foi de 71% (29% da linha de base res- tante). Em doses > 0,3 mg/kg, as células NK foram quase completa- mente esgotadas no compartimento sanguíneo (Nadir (faixa): 1,06% da linha de base (0,17, 6,23); Figura 8A). Após uma dose única de 0,3 mg/kg, foram necessários aproximadamente 7 dias para as células NK se recuperarem a uma média de 50% da linha de base, embora a ciné- tica da recuperação fosse altamente variável entre os indivíduos (Figu- ras 8B e 8C). Em concordância com esses resultados, a função NK também foi testada em um subconjunto de animais do estudo 7 (n = 3/grupo; Tabela 2). Esta experiência mostrou uma redução dependen- te da dose com alterações mínimas na atividade de NK no sangue 48 horas após o tratamento em animais tratados com 0,1 mg/kg de AB79 (% de lise em uma razão efetor:alvo de 100:1 + SD; 44,5% + 23,6% vs. 41,4% + 25,8%) e perda quase completa da atividade de NK em ani- mais tratados com 1,0 mg/kg (% de lise em uma razão efetor:alvo de 100:1 + SD; 37,4% + 10,3% vs. 6,8% + 12,5%). A função das células NK mostrou recuperação aos 57 dias, no próximo ponto no tempo me- dido (% de lise em uma razão efetor:alvo de 100:1 + SD; 16,0% + 11,9%).

[00286] As células B e células T foram esgotadas em menor exten- são quando comparadas às células NK, o que é consistente com seus níveis mais baixos de expressão de CD38 (Figura 5). A 0,3 mg/kg IV de AB79, por exemplo, as células B tinham um nível máximo médio de depleção para 45% da linha de base, e as células T foram esgotadas para 43% da linha de base (Figuras 8D e 8G). Neste nível de dose, não foi alcançada uma redução de 50% da linha de base das conta- gens de células B em todos os animais. Somente nas doses mais altas de >30 mg/kg as células B estavam quase completamente esgotadas (Figura 8D). As células T foram esgotadas em uma extensão seme- lhante às células B, mas a recuperação foi mais rápida (Figuras 8G a 81).

[00287] Nos dois estudos 7 e 8, as dosagens IV e SC (Figuras 8C, 8F e 81) foram comparadas. Não houve diferenças evidentes em de- pleção celular entre as vias de administração. Nas doses mais baixas (estudo 8), uma depleção celular sustentada (> 24 horas) de 50% abaixo dos valores de linha de base foi observada apenas na popula- ção de células NK e não nas células T e B; embora todas as células tenham demonstrado depleção celular específica nos primeiros pontos no tempo. O momento do início da depleção de células NK pareceu semelhante entre os grupos de dose, independentemente da via de administração e a duração da depleção foi dependente da dose. A re-

cuperação celular em todos os grupos de teste foi observada no dia

57. MODELOS PK-PD

[00288] “Modelos separados de PK-PD foram desenvolvidos para descrever os efeitos da exposição de AB79 em células NK, B e T. Du- rante a modelagem PK-PD, os parâmetros PK foram mantidos fixos às estimativas do modelo PK final e uma variedade de modelos PD foi testada. A população de células NK no sangue periférico foi adequa- damente descrita com um modelo de rotatividade e o efeito de deple- ção do fármaco foi ligado através da concentração de PK com um mo- delo do tipo Emax à taxa de depleção. Neste modelo, o EMAX repre- senta a taxa máxima de depleção de células NK adicional e o C50 a concentração na qual a taxa de depleção de células NK adicional é metade do máximo. O modelo estrutural PK-PD para células NK tinha a seguinte forma: DE o Ha = Kour NR = NR AE dt C50 +c

[00289] Na fórmula, NK representa a contagem real de células NK, Kmw a taxa de produção e Kour a taxa de eliminação quando nenhum fármaco está presente. Observa-se que, com a medição da linha de base fornecida, BL Kour é definido pela equação Kour = Kw / BL. c re- presenta a concentração de AB79 no compartimento central. Quando todos os parâmetros foram estimados de uma só vez, o programa de software não produziu resultados estáveis. As estimativas individuais de KIN, EMAX e C50 foram altamente correlacionadas. Além disso, devido à diferenciação limitada entre os efeitos máximos das diferen- tes doses (consulte a seção anterior) e a grande variabilidade interin- dividual, não eram esperadas estimativas precisas de todos os parâ- metros. Em uma série de estimativas, um ou dois dos três parâmetros KIN, EMAX e C50 foram fixados em valores diferentes e estimaram os demais. Foi alcançada uma execução estável e uma boa qualidade de ajuste com um KIN fixo de 10.000 e um EMAX de 322. A estimativa típica de C50 foi de 29,0 ug/ml (Tabela 5). Além disso, a sensibilidade dos valores selecionados de KIN e EMAX foi testada escolhendo dife- rentes combinações de valores mais altos e mais baixos. A variabilida- de entre sujeitos foi grande, com 113% para a taxa de produção Kw de NK e com 149% para o C50, o que está de acordo com as grandes diferenças individuais na linha de base e entre os animais tratados. O modelo foi avaliado com base em erros residuais, OFV, erros padrão, gráficos GOF e ajustes de curvas individuais (Tabela 5, Figura 9).

TABELA 5. RESULTADOS DA MODELAGEM DE PD, ESTIMATIVAS DE PARÂMETROS E ERROS PADRÃO EM PORCENTAGEM (% SEM) Estimativa Final dos | Variabilidade Interindividu- Parâmetros al/Variabilidade Residual emo a xo Ne Linha de base (célu- [iam o NE amv a [céruas Nk residuais (0297 [242 [mo | Emo er [fo qe E Linha de base (célu- NE 24,1% CV 10,7 las B)* [ceras Bresiduais fo186 [220 [B69mOv [2 C50 (uglm) Linha de base (célu- NE - 29,08% CV 15,50 las T)* [cenas residuais jo1345 — [2206 [aeee | |

* Para cada animal individual, o valor típico da linha de base foi calcu- lado como a média de todas as medições pré-dose; NE: Não estimado

[00290] O modelo do compartimento de trânsito foi superior aos modelos de resposta direta ou de rotatividade para descrever a depleção de células B induzida por AB79. Quatro compartimentos de trânsito mos- traram-se adequados e o efeito do fármaco foi descrito com um modelo do tipo Emax na taxa de depleção. Semelhante ao modelo de depleção de células NK, o EMAX representa a taxa máxima e o C50 a concentra- ção na qual a taxa é metade do máximo. Assim, o modelo estrutural PK- PD para as células B é dado pelas seguintes cinco equações: aros = Kpros — RKrg' TR, dt = = Kra" TR, Kia" TR,parai = 2,3,4 Bo ga TR, Kage: = B-2MAEOE dt C50 +c

[00291] TR; (i=1-4) representa os quatro compartimentos de trânsi- to. Ktrr, KPror e Kcirco são definidos pelas seguintes equações Krr=Kprot=Kcirc=24/MTT, em que MTT é o tempo médio de trânsito (Friberg et al. (2002) J. Clin. Oncol. 20: 4713 a 4721). B representa a contagem de células B no sangue e c a concentração de AB79 no compartimento central.

[00292] “Comum EMAX fixo de 2,37, o C50 típico foi de 19,5 ug/ml e o tempo típico de trânsito médio (MTT) foi de 8,48 dias (Tabela 5). O atraso do efeito máximo em relação à concentração máxima de AB79 foi bem capturado. O modelo indica que o AB79 afeta principalmente as células B circulantes. Não foram necessários efeitos adicionais nem laço de feedback nas células progenitoras para descrever os dados disponíveis das células B de macaco. A variabilidade entre sujeitos no MTT de 135% e nos níveis de linha de base de células B (BASE) de

24,1% indica grandes diferenças individuais entre os animais.

[00293] A depleção induzida por fármaco de células T com uma re- cuperação rápida foi adequadamente descrita com um modelo de res- posta direta: T(c) = BLr * (1 - EMAX*c/(c+C50)), em que T representa a contagem real de células T, BL: a contagem de células T na linha de base e c a concentração Ab79 no compartimento central. O C50 típico foi estimado em 11,86 ug/ml e o EMAX típico foi de 0,47, indicando que, neste caso, apenas cerca de metade das células T pode ser es- gotada pelo AB79 (Tabela 5). Nota-se, no entanto, que a variabilidade entre sujeitos no EMAX foi de quase 70%. Nesse modelo, diferente dos modelos de depleção de células NK e B, o C50 representa a con- centração na qual a depleção de células T era metade da máxima.

[00294] “Quanto às células NK, a avaliação do modelo dos modelos finais PK-PD para as células B e T com base em erros residuais, OFV, erros padrão, gráficos GOF e ajustes de curva individual corrobora que eles descreveram adequadamente os dados disponíveis dos macacos (Tabela 5, Figura 9).

SIMULAÇÃO DE PK HUMANA E DEPLEÇÃO CELULAR

[00295] Os modelos PK e PK-PD de macaco foram usados como ponto de partida para a simulação baseada em modelo de dados de PK e contagem de células humanas para apoiar o projeto e justificar as doses selecionadas para o primeiro ensaio clínico humano (FIH) em voluntários saudáveis. Para este fim, assumiu-se que as estruturas do modelo, incluindo TMDD derivadas dos dados do macaco, também descrevem as principais características da PK humana e da conse- quente depleção de linfócitos. Para obter previsões para os parâme- tros PK humanos, foram escalonadas as estimativas dos seguintes parâmetros PK de macaco: volume central e periférico de distribuição (Vc, VP) e depuração (CL) e depuração intercompartimental (Q) com uma abordagem direta para anticorpos monoclonais (Han e Zhou

(2011) Ther. Deliv. 2: 359 a 368). O AB79 é um anticorpo monoclonal totalmente humano e, portanto, espera-se menos imunogenicidade em seres humanos do que a observada em macacos. Consequentemente, para modelagem e simulação, excluiu-se amostras positivas para ADA do conjunto de dados.

[00296] “Com uso do modelo escalonado, a exposição foi simulada e os perfis de depleção de células NK, B e T para doses únicas por meio de uma infusão de 2 horas (IV) ou por injeção subcutânea (SC) de 0,0003 a 1,0 mg/kg, conforme planejado para o estudo FIH (Figura 10). De acordo com as simulações, após uma dose IV de 0,0003 mg/kg, não seriam esperados efeitos observáveis induzidos por fárma- cos na contagem de linfócitos e nem mesmo concentrações mensurá- veis de PK acima de LLOQ. Devido à variabilidade e devido ao tama- nho limitado dos grupos de doses, assumiu-se que o efeito mínimo de- tectável do fármaco na contagem de células NK seria uma redução de pelo menos 10%. Em doses de 0,01 mg/kg IV e 0,03 mg/kg SC, pre- viu-se que as células NK fossem esgotadas para menos do que os 90% restantes da linha de base.

[00297] Em uma dose IV de 0,3 mg/kg, foi prevista depleção de cé- lulas NK para 17% remanescentes da linha de base dentro de 3 horas após o final da infusão e a recuperação para mais de 50% após 11 dias (Figura 10). Na mesma dose, o modelo prevê que as células B são esgo- tadas ao máximo para 67% da linha de base após 2,5 dias e as células T são imediatamente esgotadas para 86% da linha de base. Para a admi- nistração subcutânea da mesma dose de 0,3 mg/Kkg, o modelo previu que leva a menor e mais tardia depleção máxima (nadirs em relação à linha de base: células NK 37%, células B 74%, células T 94%).

[00298] Estes estudos pré-clínicos in vitro e in vivo demonstram que o macaco é um modelo animal apropriado para estudar a farmacologia de AB79. Dados de PK e contagem de células densamente amostra-

dos de linfócitos NK, B e T de oito estudos em macacos com doses e regime de dosagem fornecem uma fonte de dados rica para uma com- preensão abrangente e quantitativa das relações entre a dose de AB79, exposição e depleção celular. Os modelos PK e PK-PD da po- pulação gerada descrevem adequadamente os dados observados e fornecem uma ferramenta poderosa para prever a exposição e a de- pleção de linfócitos, não apenas para estudos futuros em macacos, mas também para ensaios clínicos em sujeitos humanos.

[00299] Foirealizado o primeiro teste de dose única crescente huma- na (FIH) em voluntários saudáveis (www .clinicaltrials.gov: NCT02219256) (Figura 11). O efeito farmacológico pretendido do AB79 é a depleção de linfócitos ativados. Uma depleção profunda e duradoura de linfócitos (farmacologia aprimorada), no entanto, pode levar a comprometimen- tos do sistema imunológico, o que não seria tolerável para pacientes ou participantes saudáveis do estudo. Portanto, uma dose inicial IV segura de 0,0003 mg/kg foi escolhida para o teste FIH.

[00300] Os dados do macaco sugeriram que a depleção de células NK foi determinada como o efeito biológico mais sensível. Os resulta- dos da simulação PK-NK ajudaram a determinar o nível mínimo de do- se de 0,01 mg/kg IV no qual seria esperado que o efeito farmacológico mais sensível (depleção de células NK) fosse detectável em seres hu- manos. Os dados emergentes do teste FIH revelaram que o padrão geral dos efeitos esgotadores dependentes da dose e específicos do tipo celular de AB79 estão de acordo com as previsões baseadas em modelo (manuscrito em preparação). O AB79 parece ser ainda mais eficiente do que o previsto. Por exemplo, a uma dose |V de 0,03 mg/kg, as células NK em seres humanos foram esgotadas para per- manecerem abaixo de 10% da linha de base. O nadir mediano (menor ponto de depleção) nos macacos nesta dose foi de 20,0% (Figura 8).

[00301] Três anticorpos monoclonais citolíticos anti-CD38 (daratu-

mumab, SAR650984 e MORZ202) estão em desenvolvimento clínico para mieloma múltiplo (van de Donk et al. (2016) Immunol. Rev. 270: 95 a 112). O daratumumab (Darzalex'Y, administrado por infusão in- travenosa) foi recentemente aprovado para mieloma múltiplo nos Es- tados Unidos e para linfoma não Hodgkin na Europa. Ao contrário do AB79, o daratumumab não reage de maneira cruzada com o CD38 do macaco. Portanto, não foi possível uma comparação dos resultados deste estudo com o AB79 no macaco cynomolgus com daratumumab. Além disso, pacientes com mieloma múltiplo têm altos níveis de célu- las malignas CD38 positivas, o que poderia exigir concentrações maio- res de anticorpo eficaz para essa indicação de câncer (de Weers et al. (2011) J. Immunol. 186: 1840 a 1848).

[00302] No entanto, é notável que o daratumumab é aprovado com uma dose IV semanal de 16 mg/kg em mieloma múltiplo, embora o AB79 tenha alcançado a depleção completa das células NK periféricas em cerca de 1 mg/kg e de células B a cerca de 3 mg/kg (Figura 8).

[00303] — Apesar do rico banco de dados de 8 estudos com macacos, várias limitações foram reconhecidas. O AB79 esgota efetivamente as células NK, mesmo na dose mais baixa estudada de 0,03 mg/kg. Em doses tão baixas, a PK cai rapidamente abaixo do limite de quantifica- ção do ensaio bioanalítico, o que impedia a resolução da relação efeito de exposição em doses mais baixas. Além disso, durante o desenvol- vimento pré-clínico, foi reconhecido que a depleção celular máxima ocorre logo após a concentração máxima do fármaco, mas a resolução da fase inicial da depleção é tecnicamente limitada pelo número total da amostra e potencialmente pela depleção celular não específica de- vido a repetidas coletas de sangue (efeito coletor de sangue). O efeito de coleta de sangue foi observado como uma pancitopenia transitória caracterizada pela depleção de tipos de células que não se ligam ao AB79 (por exemplo, RBCs) e não era dependente da dose, sugerindo que isso ocorreu devido à perda de volume de sangue como resultado de múltiplas coletas de sangue, em vez de quaisquer efeitos especiífi- cos do AB79 (Figura 12). Consequentemente, o poder de estimar com precisão os parâmetros do modelo, especialmente para a depleção de células NK, foi limitado e os valores típicos de KIN e EMAX exigiram fixação para alcançar resultados de estimativa estáveis e adequados.

[00304] O efeito do AB79 nas células plasmáticas ou nos blastos de plasma do tecido não pôde ser medido. No entanto, assim como célu- las plasmáticas e blastos de plasma, as células NK têm altos níveis de CD38 em sua superfície e a eficiência de depleção celular de um sub- conjunto específico de linfócitos dependia, pelo menos em parte, dos níveis de expressão de CD38. Portanto, o efeito citolítico de AB79 nos blastos de plasma e células plasmáticas pode ser comparável ao efeito nas células NK. Atualmente, as informações sobre os efeitos a longo prazo do tratamento com AB79 em macacos são limitadas. Apenas um pequeno subconjunto de animais nos estudos de toxicologia de 13 semanas foi investigado em um grupo de recuperação por um período mais longo de tempo e a maioria dos animais em todos os grupos de doses desenvolveu ADA (Figura 3). Além disso, os valores de linha de base e os perfis de depleção dos diferentes subconjuntos de linfócitos foram altamente variáveis entre os indivíduos. Portanto, os efeitos a longo prazo de AB79 não podem ser investigados em macacos e terão que ser estudados em seres humanos.

[00305] Com os dados humanos emergentes, será interessante comparar os dados de PK e PD de humanos e macacos em detalhes. A construção de um modelo PK com base em dados humanos e uma comparação com o modelo de macaco permitirão refinar o modelo TMDD de AB79. Os dados gerados em estudos de pacientes fornece- rão visões sobre como a depleção mediada por AB79 das células da linhagem B se compara entre pacientes com RA e SLE e aqueles de pacientes com mieloma múltiplo e sujeitos saudáveis. A investigação de sujeito ou de fatores relacionados à doença que podem influenciar a eficiência da depleção celular, além dos níveis de expressão de CD38, também é importante e pode levar a uma personalização do tratamento. Além disso, uma comparação completa de AB79 com da- ratumumab e/ou outros anticorpos CD38 in vitro e in vivo revelará in- formações valiosas sobre a farmacologia dos anticorpos anti-CD38 e a aplicação ideal dos mesmos.

[00306] Os ricos dados farmacológicos e os modelos PK e PK-PD permitiram a caracterização das relações efeito-exposição em maca- cos cynomolgus. As análises baseadas em modelos das células NK, B e T apoiaram e quantificaram a descoberta de que cada um dos sub- conjuntos de linfócitos sanguíneos é esgotado pelo anticorpo em taxas diferentes e requer diferentes períodos de tempo para substituir o compartimento sanguíneo. Os modelos provaram ser excelentes meios para simulações de dados de PK e PD em diferentes cenários de do- sagem na preparação de testes clínicos. EXEMPLO 2: DEPLEÇÃO DE CÉLULAS CD38+ POR AB79

[00307] ATabela6 mostra que AB79 medeia a depleção celular por citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) e citotoxicidade dependente de complemento (CDC). Linhas celulares com expressão aumentada de CD38 foram mais suscetíveis a ADCC. Não foi obser- vada ADCC em uma linha celular de linfoblastos humanos que não expressasse CD38 (MV-4-11) ou com uma linha celular de ovário de hamster chinês transfectada com CD157, uma molécula intimamente relacionada a CD38 (dados não mostrados). Ao contrário de outras terapias seletivas de células B que têm como alvo CD20 e não esgo- tam diretamente os blastos de plasma, que são CD20P2ixos/negativos q CD38 é expressa em altos níveis nos blastos de plasma e células plasmáticas, tornando essas células um alvo direto de AB79. Estudos in vitro com células sanguíneas e linhas celulares humanas mostraram que a aglutinação de AB79 a CD38 não resultou na ativação de citoci- nas PBMC demonstrando que o AB79 não é um agonista, conforme discutido abaixo. Em vez disso, AB79 mediou a depleção celular de linhas celulares da linhagem B humana por ADCC e CDC e, na maioria dos casos, as linhas celulares com expressão aumentada de CD38 foram mais suscetíveis à lise celular. TABELA 6. AB79 MEDEIA A DEPLEÇÃO CELULAR DE LINHAS DE CÉLULAS B HUMANAS POR ADCC E CDC. (Receptor ft) EC5so + SD (nM) ECso + SD (nM) n=6 [Loma Joe SS e) n=4 ECs5o, 50% da concentração eficaz; nd, não feito; SD, desvio padrão.

[00308] Isto é consistente com as constatações em macacos cyno- molgus saudáveis, nos quais a eficiência da depleção se correlacionou com o nível de expressão de CD38 e o nível de dose de AB79. As cé- lulas NK, que expressam altos níveis de CD38, foram esgotadas em maior extensão do que as células B CD20+ e as células T CD3+, que expressam menos CD38 (Figura 13). /n vivo, o AB79 suprimiu poten- temente as respostas de recall de células B humanas ao antígeno em um modelo de transferência adotivo de camundongo (Figura 14). Jun- tos, esses dados apoiam a investigação adicional de AB79 em doen- ças autoimunes.

[00309] “PBMCs humanas foram tratadas com AB79 sob múltiplas afecções e a liberação de citocinas inflamatórias foi medida. O macaco cynomolgus foi usado para mostrar a relação da depleção específica do tipo de célula e da dose de AB79 porque AB79 reage de modo cru- zado com a CD38 de macaco, que compartilha 91% de identidade de proteína com a proteína humana. Um segundo modelo animal, PBMCs humanas transferidas de modo adotivo para camundongo, foi usado para determinar se AB79 poderia atingir células produtoras de anticor- pos humanos. AB79 SE AGLUTINA À CD38 E MEDEIA ADCC E CDC

[00310] O número do receptor foi determinado com o FIKIT (DAKO, cat &K0078) com uso do anticorpo CD38 anti-humano de camundongo (clone HIT2) e foi calculado convertendo-se a intensidade média de fluorescência (MFI) das amostras tingidas em uma curva de calibração gerada a partir da MFI de 5 populações de esferas ligadas a um núme- ro definido de moléculas de anticorpo. O número absoluto de receptor foi calculado subtraindo a MFI de controle de isótipo (I9GG1 de camun- dongo) da MFI de anticorpo anti-CD38.

[00311] O CDC foi avaliado plaqueando linhas de células a 10.000 células/poço e adicionando AB79, IgG de controle ou meio. Uma curva dose-resposta de 5 pontos (0,001 a 10 mg/ml) foi tipicamente realiza- da. Adicionou-se complemento de coelho (2 a 15 ul; XCL 3441 Cedar- Lane Laboratories) a cada poço, exceto os poços de controle. O rea- gente CytoTox-Glo (Promega, G7571/G7573) foi usado para detectar citotoxicidade por luminescência. Grupos testados: células isoladas; células + complemento; células + IgG controle + complemento; células + AB79 + complemento. Equação de % CDC: % CDC = 100- ((RLU (teste) / RLU (somente complemento)) X 100).

[00312] O ADCC foitestado plaqueando 5.000 células-alvo/poço (T, linhas de células) com 50 ml de AB79, IgG controle, Triton X-100 (1%; Sigma Chemical) ou meio sozinho e 50 ml de PBMCs efetoras humanas

(E) em uma razão de T:E entre 1:25 e 1:50 células. Uma curva dose- resposta de anticorpo de 9 pontos (0,000001 a 100 nM) foi tipicamente realizada. Lise experimental = PBMCs + linha celular + anticorpo. Lise espontânea = PBMCs + linha celular sem anticorpo. Lise máxima = linha celular + Triton X-100. Citotoxicidade avaliada com uso do ensaio de lu- minescência de citotoxicidade CytoTox-Glo"Y (Promega). AB79 NÃO POSSUI ATIVIDADE AGONISTA

[00313] A capacidade do tratamento AB79 para induzir a produção de citocinas em PBMCs humanas foi comparada ao controle negativo do isótipo I9G1 e controles positivos, PHA, anticorpos anti-CD3 (clone OKT3) ou anti-CD52 (Campath) (Figuras 15 e 16).

[00314] O AB79 solúvel não aumentou os níveis de IL-6 (média + DP) em PBMCs coletadas de 4 sujeitos diferentes após uma incuba- ção de 24 horas em comparação com o controle do isótipo I9G1. O PHA aumentou os níveis de citocinas em todos os sujeitos, demons- trando que as células tinham capacidade para produzir IL-6 (Figura 15). Resultados semelhantes foram observados com PBMCs estimula- dos por 48 horas e quando foram testados IL-2, IL-4, IL-10, GM-CSF, IFNy e TNFa (dados não mostrados).

[00315] O método pelo qual um anticorpo é apresentado a uma célula pode contribuir para o resultado do encontro anticorpo: ligante e resposta celular (Stebbings et a/. (2007) J. Immunol. 179, 3325 a 3331). Stebbings et al. mostraram que a resposta celular máxima (liberação de citocinas) a um anticorpo agonístico ocorreu quando o anticorpo estava altamente concentrado e aderiu à superfície do poço, tal como quando o anticorpo foi adicionado a um poço em solução e o líquido foi evaporado (Aglutina- ção a Seco) em comparação a anticorpos autorizados a se aglutinarem a poços em solução (Aglutinação Úmida) ou adicionados diretamente a PBMCs (Solúvel) (Figura 16A). O AB79 não estimulou a produção de citocinas ao usar qualquer uma dessas abordagens (Figura 16B).

[00316] O AB79 (100 mg/ml) não estimulou |L-2, -4, -6, -8, -10, GM- CSF, IFNy ou TNFa em nenhuma das afecções testadas após 24 ho- ras. O AB79 não induziu IL-10 ou GM-CSF, mas ambos foram induzi- dos por anti-CD3 (não mostrado, todos os valores, exceto anti-CD3, estavam abaixo de LLOQ). A IL-8 foi produzida constitutivamente por PBMCs e não foi alterada por nenhum tratamento (dados não mostra- dos) (Tabela 7).

TABELA 7. AB79 E ESTÍMULO DE CITOCINAS anticorpos p ABT79 Anti-CD52 Anti-CcD3 EEE EE eee ser PE E Es E: 64,8 er Eee 90,1 PE EE Ee e pm ee e asma me rs fem fer e eme] e eo e e e e e eia CSA PAO SOS CAS IE 1141 is ss is os A

1.190,2 +| 857,1 + 311,7 770,1 + 203,6 1.116,9 +| 15.857 + 117,5 330,8 46148

PPA EA 385,8 339,1 564,7 medo a ses qetete lado Cóeo Caso Co [ns À 418,6 517,6 281,5 708,3 q pe qse pas me frmeeie ASA AA 1 PSA TE o E 5 o e o a 687

[00317] Um ensaio de citocinas Multiplex foi usado de acordo com as instruções do fabricante (Bio-Plex ProTM Human Cytokine Standard 8-Plex) para medir as concentrações de IL-2, 4, -6, -8, -10, GM-CSF, IFNy e TNFa. Abreviações: LLOQ, Limite inferior de quantificação; nd, não feito; PHA, fito-hemaglutinina; PBMC, célula mononuclear do san- gue periférico.

AB79 ESGOTA CÉLULAS CD38+

[00318] AB79 se aglutina a CD38 com alta afinidade e medeia CDC e ADCC. O AB79 não é um agonista e não induziu a liberação de cito- cinas a partir de PBMCs humanas. AB79 se aglutinou a CD38 humano e de macaco cynomolgus. Os linfócitos de ambas as espécies apre- sentaram padrões semelhantes específicos de célula da expressão de CD38 com células NK > células B > células T com base na intensidade fluorescente média do tingimento de AB79. Tratamento com AB79 es- gotou linfócitos de macaco de maneira reversível, específica de célula e dependente da dose. O AB79 bloqueou efetivamente a resposta de recall de anticorpos humanos em um modelo de transferência adotivo de camundongo. EXEMPLO 3: AVALIAÇÃO DA AGLUTINAÇÃO DE AB79 A CÉLULAS

VERMELHAS DO SANGUE E PLAQUETAS DE HUMANOS E DE MACACOS CYNOMOLGUS

[00319] O AB79, um Ab monoclonal IgG1 totalmente humano, de alta afinidade e não agonista, dirigido ao CD38 humano, foi avaliado para determinar a aglutinação do mesmo a células vermelhas do san- gue (RBC) ou plaquetas de humanos ou de macaco cynomolgus (cyno). Trinta amostras de sangue de voluntários humanos saudáveis e trinta amostras de sangue total de cynos saudáveis foram avaliadas quanto à aglutinação ao AB79, em comparação com um anticorpo mo- noclonal de controle pareado por isótipo, Palivizumab, de especificida- de irrelevante que não se aglutina a RBC ou plaquetas.

MÉTODOS

[00320] Amostras de sangue de 30 sujeitos humanos normais (15 homens e 15 mulheres) para plaquetas, 25 homens e 5 mulheres para RBCs) e 30 cynos de origem chinesa (15 machos e 15 fêmeas) foram adquiridas junto a Bioreclamation, (Long Island, NY). O sangue total foi coletado em tubos de citrato de sódio e enviado durante a noite em temperatura ambiente.

[00321] Paraa avaliação da aglutinação do AB79 às plaquetas, 50 ul de sangue total foram tingidos com um mAb CDG61 FITC anti- humano reativo de modo cruzado de cyno (BD Biosciences Cat 555753) para identificar plaquetas em combinação com o AB79 conju- gado Alexa Fluor 647 (AF647) ou um controle compatível com isótipo, Palivizumab conjugado com AF647 (Medlmmune cat tt 60574-4113-1), um anticorpo monoclonal humanizado que é específico contra um epí- topo no sítio antigênico A da proteína F do vírus sincicial respiratório (RSV), um antígeno não presente em RBCs ou plaquetas. A lise de RBCs foi realizada após o tingimento e as amostras analisadas usan- do um citômetro de fluxo BD Canto. As plaquetas CD61+ foram blo- queadas para análise.

[00322] Paraa avaliação da aglutinação de AB79 às RBCs, 50 ul de sangue total foram tingidos com AB79 conjugado com AF647 ou con- trole pareado por isótipo, Palivizumab conjugado com AF647. Em al- gumas experiências, um CD45 PERCP anti-humano reativo de modo cruzado de cyno (BD Biosciences Catit 552724) foi usado para tingir linfócitos, a fim de fornecer evidências de aglutinação do AB79 a um subconjunto de linfócitos, conforme observado em estudos anteriores. As amostras foram analisadas usando um citômetro de fluxo BD Can- to. Os dados foram expressos como intensidade média de fluorescên- cia (MFI) de AB79 ou controle de isótipo.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

[00323] A capacidade do AB79 de se aglutinar às RBCs de trinta voluntários humanos saudáveis e trinta cynos saudáveis foi avaliada com uso de citometria de fluxo. O tingimento de RBCs com AB79 não estava acima do nível de tingimento observado com o anticorpo de controle de isótipo em qualquer uma das amostras de sangue humano (Figura 17 e Tabela 8) ou nas amostras de sangue de cyno (Figura 18 e Tabela 8). Não foi observada aglutinação detectável em nenhuma das espécies e não foi observada diferença na proporção de MFI para o controle AB79/isótipo entre humanos e cynos. TABELA 8. RAZÃO DOS VALORES MÉDIOS DE FLUORESCÊNCIA RBC AB79/CONTROLE DE ISÓTIPO [poda | Humano [eme LB ss Tas Boss LB asa Tas Es ass TT os e o.s6o

Doador Humano [2 | os [a | ot [mea [os os [sm | oe [o

[00324] A capacidade do AB79 de se aglutinar às plaquetas CD61+ de trinta voluntários humanos saudáveis e trinta cynos saudáveis (os doadores 1 a 15 eram machos; os doadores 16 a 30 eram fêmeas) foi avaliada usando citometria de fluxo. O tingimento de AB79 de plaque- tas não estava acima do nível de tingimento observado com o controle de isótipo em qualquer amostra de sangue humano (Figura 19 e Tabela 9) ou de cyno (Figura 20 e Tabela 9). Não foi observada aglutinação de- tectável em nenhuma das espécies e não foi observada diferença na proporção de MFI para o controle AB79/isótipo entre humanos e cynos. TABELA 9. RAZÃO DOS VALORES MÉDIOS DE FLUORESCÊNCIA DA PLAQUETA AB79/CONTROLE DE ISÓTIPO poadorf Humano — Emo — pao bes Bo ze po

K

Dosdort — umano Emo — Ea fe 7 8 E e kw A 1

E O 3 6 7 po 21 Bo ba pe pa 26 Do so

[00325] “Como controle positivo para o tingimento de AB79, o tingi- mento de AB79 foi medido em uma porção das amostras de sangue. Devido à alta predominância de RBCs no sangue, 200.000 eventos foram adquiridos e uma pequena população de linfócitos CD45+ foi bloqueada para posterior avaliação. Não foi observada aglutinação pa-

ra o controle do isótipo; no entanto, o AB79 se ligou a uma pequena população de linfócitos CD45+ (Figura 21). Este AB79 confirmado foi capaz de tingir células sanguíneas sob condições em que nenhuma aglutinação detectável do AB79 foi observada em RBCs ou plaquetas. EXEMPLO 4: AVALIAÇÃO DA AGLUTINAÇÃO DE AB79 A CÉLULAS

VERMELHAS DO SANGUE E PLAQUETAS DE HUMANOS E DE MACACOS CYNOMOLGUS COM USO DE UM ENSAIO DE CITOME- TRIA DE FLUXO DE SENSIBILIDADE MAIS ALTA

[00326] Um ensaio de citometria de fluxo de sensibilidade mais alta foi desenvolvido para avaliar ainda mais se o AB79 se aglutina a RBCs humanas ou de macaco cynomolgus (cyno), caso o ensaio anterior possa não ter sido sensível o suficiente para detectar um baixo nível de expressão de CD38 nas RBCs. As amostras de sangue de 4 volun- tários humanos saudáveis foram incubadas com AB79 marcado com fluorescência ou daratumumab marcado com fluorescência, outro anti- corpo anti-CD38 que é conhecido por se aglutinar a CD38 em RBCs. Cada amostra foi pré-incubada com o respectivo fármaco não marcado para bloquear a aglutinação de CD38 aos produtos farmacêuticos marcados com fluorescência, servindo como controle negativo para o ensaio. Anticorpos contra CD45 e CD235a foram adicionados às amostras para identificar células positivas para RBC e então subse- quentemente analisados em um citômetro de fluxo. O daratumumab marcado com fluorescência foi usado como controle positivo. Os resul- tados indicaram que o AB79 e o daratumumab se aglutinam a RBCs de doadores humanos saudáveis.

MÉTODOS

[00327] Amostras de sangue de quatro doadores humanos saudá- veis (programa de doadores de sangue de Millennium) foram coleta- das de acordo com o protocolo da empresa. Resumidamente, amos- tras de sangue periférico para determinação da aglutinação de RBC foram coletadas em tubos de heparina de sódio e, para tingimento de linfócitos, amostras de sangue periférico foram coletadas em tubos BD VacutainerO6 CPT'Y (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, EUA). Um tubo separado foi usado para coletar células mononucleares do san- gue periférico (PBMCs) para confirmar a aglutinação do AB79 marcado com fluorescência e daratumumab marcado com fluorescência aos linfócitos CD38+. Para as experiências de aglutinação de RBCs e tin- gimento de linfócitos, amostras de sangue periférico foram armazena- das em RT e processadas dentro de 2 horas após a coleta para man- ter a viabilidade das células.

Para a aglutinação de RBC, as amostras de sangue periférico foram primeiro diluídas 1:10.000 em tampão de tingimento (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, EUA) para diluir o alto número de hemácias presentes na amostra.

Como a faixa normal de RBCs em amostras saudáveis de sangue humano é de aproximada- mente 5 milhões de células por microlitro, as amostras precisam ser substancialmente diluídas para que um número aceitável de hemácias seja tingido para análise por citometria de fluxo.

As amostras foram então transferidas para uma placa de 96 poços com fundo em V e in- cubadas durante a noite a 4 ºC em um agitador suave com 25 ul/poço AB79 não marcado (500 pg/ml), daratumumab não marcado (500 pg/ml) ou tampão BD somente (sem fármaco). Um agitador de placas foi utilizado para impedir o assentamento das RBCs durante o período de incubação.

As amostras de sangue periférico foram pré-incubadas com os produtos farmacêuticos não marcados, a fim de bloquear os sítios antigênicos CD38 na superfície das RBCs, que serviram como controle negativo para o ensaio.

Após esse período de incubação, concentrações clinicamente relevantes de biotina-estreptavidina- BV421 daratumumab (0, 0,1, 1, 10 e 100 pg/ml) ou biotina- estreptavidina-BV421 AB79 (O, 0,1, 1, 10 e 100 pg/ml) foram adiciona- dos às amostras por 3 horas em RT em um agitador suave.

As amos-

tras foram então lavadas várias vezes com tampão BD e tingidas com marcadores de superfície celular CD45 e CD235a para identificação de RBC (as RBCs são CD45- CD235a+) e estreptavidina-BV421 para aglutinar os anticorpos biotinilados. Com uso de biotina-estreptavidina, o baixo nível de expressão de CD38 nas RBCs pode ser amplificado. O corante fluorescente BV421 foi selecionado porque é um dos fluoró- foros mais brilhantes disponíveis comercialmente e usa o laser violeta no citômetro de fluxo, minimizando assim a quantidade de sobreposi- ção espectral com os outros canais/marcadores no painel. Juntas, es- sa abordagem de amplificação de sinal fornece uma oportunidade para detectar moléculas na superfície da célula que, de outra forma, cairiam no ruído do instrumento. As amostras foram posteriormente lavadas e adquiridas em um BD FACSCanto'"Y |l (BD Biosciences, Franklin La- kes, NJ, EUA). A aquisição da célula alvo foi estabelecida em 10.000 eventos CD235a+. Para a aglutinação de linfócitos, o sangue periférico dos mesmos doadores saudáveis coletados em tubos de CPT foi cen- trifugado e as células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) foram isoladas com uso de técnicas padrão. As células foram lavadas, tingidas e processadas como descrito para as experiências de RBC.

[00328] Para preparar anticorpos biotinilados, AB79 (21,4 mg/ml, Takeda California, EUA) e daratumumab (20 mg/ml, Janssen Biotech, Horsham, PA, EUA) foram purificados simultaneamente no mesmo dia com uso de um Kkit comercial da coluna de proteína A (Abcam, Cam- bridge, Reino Unido) para remover substâncias que potencialmente po- deriam interferir no procedimento de biotinilação. As concentrações de proteína dos produtos purificados foram determinadas por A280/260 e quantidades iguais de proteína de cada anticorpo foram conjugadas à biotina com uso de um kit de Conjugação Lightning Link Rapid Biotin (Innova Biosciences, Cambridge, Reino Unido). No final do procedi- mento, as concentrações de proteína foram medidas novamente usando A280/260. Ambos os anticorpos foram conjugados com micro- esferas de poliestireno comerciais que possuem capacidade de agluti- nação de anticorpos a qualquer isótipo de anticorpo ou a esferas iner- tes (esferas negativas). Depois de misturar as esferas com biotina- estrepavidina-BV421 AB79 ou biotina-estrepavidina-BV421 daratumu- mab, os dois componentes misturados fornecem um controle positivo de alto sinal distinto com uma população negativa apropriada que po- de ser usada para estimar a fluorescência mediana (MFI) de cada an- ticorpo de teste por citometria de fluxo.

As amostras foram adquiridas em um instrumento BD Biosciences FACSCANTOY |l com uso de um BD Biosciences FACSDiva'"" (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, EUA). Os arquivos de dados brutos foram transferidos para um servi- dor seguro e, em seguida, analisados offline com uso do FlowJoO Ver- são 10 (FlowJo, LLC; Ashland, OR, EUA). Para identificação de RBC, as células CD235a+ foram fechadas primeiro.

Em seguida, os eventos de MFI geométrica e percentual positivo de biotina-estrepavidina- BV421 AB79 e biotina-estrepavidina-BV421 daratumumab foram de- terminados para as células bloqueadas e plotados como um histogra- ma (Figura 22). Isso foi comparado com o controle de isótipo (amos- tras pré-incubadas com AB79 não marcado ou daratumumab não mar- cado e depois incubadas com seus respectivos produtos farmacêuti- cos marcados com biotina-estrepavidina-BV421). Para identificação dos linfócitos, os detritos foram excluídos primeiro com uso da disper- são direta versus lateral (FSC-A vs.

SSC-A). A população CD45 positi- va foi então bloqueada e a MFI e a porcentagem positiva de biotina- estrepavidina-BV421 AB79 e biotina-estrepavidina-BV421 daratumu- mab foram determinadas para as células bloqueadas e plotadas como um histograma (Figura 22). Isso foi comparado com o controle do isóti- po (amostras pré-incubadas com AB79 não marcado ou daratumumab não marcado e depois incubadas com seus respectivos produtos far-

macêuticos de biotina-estrepavidina-BV421). TABELA 10. SUMÁRIO DA AGLUTINAÇÃO DAS CÉLULAS VERME- LHAS DO SANGUE AB79 E DARATUMUMAB (FLUORESCÊNCIA MEDIANA GEOMÉTRICA) AB79 Biotina-Estreptavidina-BV421 Conc. Doador 1 | Doador 2º | Doador 3 | Doador 4 ua [O o fes es us Tee e e e es] Conc. Doador 1 | Doador 2º | Doador 3 | Doador 4 uau [O o fes es us cs e a e e ss

S Daratumumab Biotina-Estreptavidina-BV421 Conc. Doador 1 | Doador 2 | Doador 3 | Doador 4 ua [O o fes es us om fe e a o ass

Daratumumab frio e Daratumumab Biotina-Estreptavidina-BV421 Conc. Doador 1 | Doador 2º | Doador 3 | Doador 4 pano [7 o fts fee fe 8 o “ eo e o o ds 6% ND = não determinado; SD = desvio padrão

RESULTADOS E DISCUSSÃO

[00329] A quantidade de biotina em AB79 e daratumumab foi de- terminada com uso de um ensaio de citometria de fluxo de alta sensibi- lidade. Como os resultados mostram na Figura 23, a biotina-estrepa- vidina-BV421 daratumumab liga 1,6 a 2,0 vezes mais esferas ligadas a anticorpos do que a biotina-estrepavidina-BV421 AB79. Portanto, a biotina-estrepavidina-BV421 daratumumab é um anticorpo "mais bri- lhante" em comparação à biotina-estrepavidina-BV421 AB79. Conse- quentemente, as comparações da intensidade de MFI devem ser cali- bradas para essa diferença na rotulagem.

[00330] A confirmação da especificidade dos produtos farmacêuti- cos marcados com biotina foi uma etapa importante para garantir que os resultados observados sejam um resultado de aglutinação específi- ca à proteína-alvo. Os ensaios de competição eram uma maneira co- mum de testar a especificidade de anticorpos. Um ensaio de citometria de fluxo foi utilizado para esta avaliação da competição. Resumida- mente, amostras de sangue periférico de voluntários saudáveis foram pré-incubadas com AB79 não marcado ou daratumumab não marcado e, posteriormente, tingidas com AB79 biotinilado ou daratumumab bio- tinilado, respectivamente. Esperou-se que as amostras pré-incubadas com o produto farmacêutico não marcado bloqueassem a aglutinação dos produtos farmacêuticos biotinilados. Como demonstrado na Figura 24, o AB79 biotinilado e o daratumumab biotinilado podem ser bloque- ados nos linfócitos do sangue periférico com uso dos produtos farma- cêuticos não marcados.

[00331] A percentagem de aglutinação da biotina-estrepavidina- BV421 AB79 e da biotina-estrepavidina-BV421 daratumumab aos RBCs foi determinada utilizando um total de quatro amostras de san- gue periférico de voluntários saudáveis. Como mostrado nas Figuras e 26, o AB79 se ligou às CDBCs que expressam CD38 de maneira dependente da dose em todos os quatro doadores testados. Os níveis máximos de aglutinação às RBCs diferiram entre voluntários saudáveis e foram observados entre 1 e 10 pg/ml para ambos os produtos farmcêuticos. A 10 e 100 ug/ml de biotina-estrepavidina-BV421 AB79 ou biotina-estreptavidina-BV421 daratumumab, os níveis de RBCs eram mais baixos em 3 dos 4 doadores testados. Existem vários fatores que podem explicar o nível reduzido de aglutinação do fármaco ao CD38, incluindo aumento da hemólise de RBC ou inversão do domínio catalí- tico da parte externa da célula para o interior da célula (Yoshiga et al. (2008) Int. J. Mol. Med. 22: 369 a 374). Além disso, o daratumumab reduziu os níveis de expressão de CD38, pelo menos em parte, por meio da trogocitose (Cole et al. (2018) Arthritis Res. Ther. 20(1): 85); os complexos CD38 e a membrana celular acompanhante foram ati- vamente transferidos de células do mieloma múltiplo para monócitos e granulócitos (Kraan et a/. (1999) Rheumatology (Oxford) 38(11): 1074 a 1080). Um doador (Doador 3) tinha níveis de RBCs que aumentavam com quantidades crescentes de fármaco, talvez como resultado de ter mais expressão superficial de CD38 de RBC. Experiências adicionais precisariam ser conduzidas para entender melhor o declínio na agluti- nação do fármaco na concentração mais alta testada.

[00332] Os perfis de aglutinação de RBC de AB79 e daratumumab foram comparados. Como retratado na Tabela 10 e nas Figuras 27 e 28, parecia haver uma diferença na magnitude da aglutinação de RBC (isto é, MFI) entre os produtos farmacêuticos em 3 dos 4 doadores tes- tados; no entanto, essa diferença pode ser atribuída aos níveis dife- renciais de biotina em cada um dos anticorpos, com o daratumumab tendo 1,6 a 2,0 vezes mais biotina que o AB79. Uma análise alternati- va, que controla para uma diferença de potencial na marcação fluores- cente de anticorpos, é comparar a concentração versus o perfil de aglutinação de cada anticorpo e uma métrica útil é a concentração à qual a aglutinação máxima ocorre (isto é, a ligação específica máxima de antígeno (Bmax)). O Bmax é idêntico para ambos os anticorpos em 3 de 4 doadores (por exemplo, 1 ug/ml para o doador 1). Coletivamen- te, esses dados indicam que ambos os anticorpos se aglutinam com afinidades semelhantes, dentro do atual limite de resolução do ensaio, que é um fator de 10. Em conclusão, AB79 e daratumumab se agluti- naram às RBCs neste ensaio com afinidades que estavam dentro de vezes uma da outra; não existiu uma diferença de 10 vezes ou maior na afinidade de aglutinação desses anticorpos para as RBCs neste sistema de ensaio.

EXEMPLO 5: AVALIAÇÃO DA HEMÓLISE AB79 DE RBCs /N VITRO

HUMANAS OU DE MACACO

[00333] O sangue total fresco a partir de voluntários normais sau- dáveis humanos e macacos cynomolgus (cyno), cinco (n = 5) indiví- duos por espécie, foi avaliado in vitro para hemólise em resposta ao tratamento in vitro com AB79 (27,3 mg/ml; Takeda California, EUA), controle de isótipo I9G1 humano (7,14 mg/mL Bio X Cell) e daratumu- mab (20 mg/ml; Janssen Biotech, Horsham, PA, EUA). Uma resposta à dose para os artigos de teste de interesse foi examinada em 0, 0,03, 0,08, 0,25, 0,74, 2,2, 6,6 e 20 ug/ml. Uma diluição semilogarítmica de saponina foi avaliada a partir de uma solução de saponina a 1% superior,

usada como controle técnico positivo para a capacidade de resposta do sangue. O tratamento foi realizado durante 1 hora a 37 ºC, 5% de CO, para a medição de hemólise aguda. A absorvância foi medida no comprimento de onda de 540 nm com uso de um espectrofotômetro e a porcentagem de hemólise foi calculada da seguinte forma: fidida Hemolítica's amostra de teste de O.D. - controle negativo de O.D. médio x100 controle de hemólise de O.D. 100% - controle negativo de O.D. médio

[00334] O índice hemolítico é classificado da seguinte forma (Índice Hemolítico = Grau Hemolítico): O a 2 = não hemolítico; 2 a 5 = ligeira- mente hemolítico, > 5 = hemolítico. Resultados: as RBCs de todos os indivíduos de cada espécie, humano e cyno, exibiram hemólise aguda in vitro em resposta a uma titulação em solução de saponina a 1% com um índice hemolítico superior a 5. O con- trole de AB79, daratumumab e isótipo I9G1 humano não induziu hemóli- se detectável em nenhuma amostra de sangue vermelho nas espécies avaliadas com um índice não hemolítico zero (Figuras 29 e 30). EXEMPLO 6: AVALIAÇÃO DE AB79 EM UM MODELO ARTRÍTICO

INDUZIDO POR COLÁGENO DE MACACO CYNOMOLGUS

[00335] A expressão da ectoenzima CD38 é aumentada nos linfóci- tos em resposta a um desafio antigênico e é hipotetizado que o alve- jamento desses linfócitos ativados pode melhorar as atividades patoló- gicas em doenças autoimunes. O macaco cynomolgus é um modelo apropriado para avaliar os efeitos potenciais do alvejamento de CD38 em seres humanos porque esta espécie exibe perfis de expressão semelhantes a CD38 e o anticorpo anti-CD38 humano AB79 se agluti- na ao CD38 de macaco com uma afinidade (EC5so = 4,5 nM) que permi- te a intervenção farmacológica. A atividade potencial do AB79 foi, por- tanto, investigada em um modelo de doença autoimune da artrite indu- zida por colágeno (CIA) de macaco. A administração profilática de AB79 (3 mg/kg i.v. semanalmente) foi bem tolerada e impediu o de- senvolvimento de artrite, em contraste com os animais de controle tra-

tados com veículo, que exibiram doença progressiva com dano radio- gráfico e piora nos escores clínicos ao longo do estudo. O tratamento terapêutico de macacos artríticos com AB79 (3 mg/kg i.v. semanal- mente) também foi bem tolerado e reduziu a progressão e os sintomas da doença. Os escores de artrite e o inchaço das articulações foram significativamente menores do que o controle de veículo e isso foi acompanhado por reduções nos níveis sanguíneos de células CRP, ALP, NK, B e T. A histopatologia, morfometria e radiologia revelaram significativamente menos danos nas articulações em animais expostos profilaticamente ao tratamento com AB79 em comparação com ani- mais tratados com veículo e significativamente (p <0,05) menos danos em animais tratados terapeuticamente com AB79 ou dexametasona (0,1 mg/kg por dia), ilustrando atividade potencial de modificação da doença. Em conclusão, esses dados indicam que a depleção de célu- las que expressam CD38 poderia ser uma alternativa terapêutica para o tratamento de doenças autoimunes sem os efeitos deletérios dos esteroides.

MÉTODOS E MATERIAIS ANTICORPOS

[00336] AB79 estava disponível internamente. O IgG anticamun- dongo conjugada com fluorocromo foi adquirido junto à Jackson Immunoresearch Laboratories (West Grove, PA). O tampão Pharmlyse foi obtido junto à BD Biosciences (San Jose, CA). Os anticorpos con- jugados com fluorocromo para proteínas de macaco foram adquiridos de várias fontes: CD20 junto à BD Biosciences (San Jose, CA); anti- corpo de camundongo para CD3 junto à eBioscience (San Diego, CA); anticorpo de camundongo para CD16 junto à Miltenyi Biotech (Auburn, CA); anticorpos de camundongo para CD4 e CD8 junto à R&D Sys- tems. Anticorpos não conjugados ao AB79 e um anticorpo de controle humanizado com uma especificidade de antígeno diferente, mas os mesmos Fc IgG1 estavam disponíveis internamente, além do AB79 conjugado com Alexa Fluor 647. Os anticorpos primários para a inves- tigação de reatividade cruzada de tecido de macaco foram um coelho anti-AB79 (gerado internamente) e um IgG1 humano de controle nega- tivo (Millipore Bioscience Research Reagents, Temecula, CA). IMUNO-HISTOQUÍMICA DE TECIDOS

[00337] O perfil de expressão do antígeno CD38 foi comparado em tipos diferentes de tecidos coletados de doadores saudáveis de humanos e macacos cynomolgus com uso de imuno-histoquímica. À adequação de cada tecido para detectar CD38 foi verificada com uso de um anticorpo de controle positivo contra o receptor transmembranar CD31 relacionado (Dako North America, Inc.). Seções (5 um) foram cortadas a partir de amostras de tecido congelado fresco embebidas no Composto OCT (Sakura Finetek USA, Inc., Torrance, CA) e fixadas em acetona por 10 minutos em RT. Imediatamente antes do tingimen- to, as lâminas foram fixadas por 10 segundos em formalina 10% neu- tra tamponada. As criosseções fixadas em acetona/formalina foram enxaguadas duas vezes em solução salina tamponada com fosfato (PBS) e incubadas por 20 minutos com um bloco de proteínas (PBS; 0,5% de caseína; 5% de gama globulinas humanas; 0,02% de IgG de cabra; 1 mg/ml de IgG humano agregado por calor) projetado para re- duzir a aglutinação não específica. O AB79 não conjugado ou um |IgG1 humano de controle negativo (Reagentes de Pesquisa Millipore Bios- cience) foram aplicados em seções a 5 ou 25 pg/ml e incubados em RT por 1 hora. As lâminas foram então enxaguadas duas vezes com PBS e um procedimento indireto de imunoperoxidase foi realizado pa- ra detectar esses reagentes primários. O anticorpo secundário, anti- AB79 de coelho, foi então aplicado a 5 ug/ml por 30 minutos e enxa- guado duas vezes com PBS. A peroxidase endógena foi bloqueada incubando as lâminas por 5 minutos com a solução de peroxidase for-

necida no Dako EnVision + Kit e depois lavando duas vezes com PBS. As lâminas foram então tratadas por 30 minutos com o polímero IgG de cabra anticoelho marcado com peroxidase fornecido no Kit Dako EnVision+, enxaguadas duas vezes com PBS e tratadas por 8 minutos com a solução substrato-cromogênio (DAB+) fornecida no Kit Dako EnvVisiont+. Todas as lâminas foram enxaguadas com água da torneira, contrastadas com hematoxilina, lavadas, “azulados” em carbonato de lítio saturado, lavadas, desidratadas em álcoois, limpas em xileno e cobertas de acordo com os métodos padrão. A intensidade do tingi- mento foi avaliada semiquantitativamente por um patologista anatômi- co certificado da American College of Veterinary Pathologists (ACVP). AGLUTINAÇÃO DE AB79 AO CD38 RECOMBINANTE

[00338] CélulasK1 de ovário de hamster chinês (CHO-K1) expres- sando estavelmente CD38 humano, de camundongo ou macaco foram geradas para estudar a aglutinação da superfície celular de anticorpos anti-CD38. As células CHO-K1 (Lonza, EUA) foram transfectadas com clones de cDNA completos de CD38 humano, camundongo ou maca- co cynomolgus CD38 (Origene Technologies, Rockville, MD). Após a seleção, os conjuntos foram classificados por citometria de fluxo e os clones mais altos que expressam CD38 humano, camundongo ou ma- caco cynomolgus (intensidade média de fluorescência máxima (MFI) de 15%) foram utilizados para estudos de aglutinação. As 200.000 cé- lulas por poço foram plaqueadas em uma placa de fundo redondo de 96 poços e tingidas com 66,7 nM de Alexa Fluor& 488 diretamente conjugado a Abs em 50 ul de tampão FACS (1% de BSA em PBS) em gelo por 30 minutos a 1 hora. As células foram lavadas 3 a 4 vezes em um volume final de 200 a 250 ul de tampão FACS. O sedimento celular final foi ressuspenso em 100 ul de tampão FACS contendo 1% de para- formaldeído. As amostras foram avaliadas no FACS Canto Il HTS (BD Biosciences) e analisadas com uso do software Flojo (Tree Star, EUA).

CITOMETRIA DE FLUXO DE LINHAS CELULARES E SANGUE TOTAL

[00339] Para o tingimento das linhas celulares, as células foram ressuspensas a 2 x 10º/ml em tampão FACS (soro bovino fetal a 5% e azida de sódio a 0,05% em D-PBS (tampões fosfatos salinos da Dul- becco sem cálcio e magnésio) (VWR, West Chester, PA) e amostras de 200 ul foram tingidas com os anticorpos monoclonais apropriados a 4 ºC por 30 minutos. As amostras foram lavadas com tampão FACS e analisadas por citometria de fluxo (FACSCAalibur, BD). Para o tingimen- to do sangue total, amostras de 200 ul de macacos foram tingidas com o anticorpo monoclonal apropriado a 4 ºC por 30 minutos. As células vermelhas do sangue foram lisadas com solução de lise BD FACS e as amostras foram então lavadas com tampão FACS e analisadas por citometria de fluxo. Em todos os casos, os anticorpos foram usados em concentrações saturantes e, em muitos casos, até quatro anticorpos foram usados por amostra.

ATIVIDADE AB79 NO SANGUE TOTAL DE MACACOS CYNOMOLGUS

[00340] O sangue total do macaco Cynomolgus foi obtido nos Labo- ratórios Charles River (Wilmington, MA, EUA). Para ensaios de agluti- nação, o sangue total periférico de macaco cynomolgus anticoagulado (100 ml) foi incubado com concentrações crescentes de anticorpo AB7O9 (43 a 690 nM) por 30 minutos em RT. A aglutinação de AB79 às células foi ensaiada com uso de um anticorpo IgG Fc anti-humano de cabra marcado com PE (Thermo Fisher Scientific). Após a aglutinação dos anticorpos, as células vermelhas do sangue (RBC) foram lisadas com uso de lise de alto rendimento livre de fixador (Thermo Fisher Sci- entific). As células foram então enxaguadas duas vezes com tampão de classificação celular ativada magneticamente (MACS) contendo 0,5% de BSA (Miltenyi Biotec). Os dados de tingimento celular foram coletados por citometria de fluxo (Attune NxT Acoustic Focusing Cyto- meter) e analisados com uso do software FlowJo.

[00341] Para ensaios de citólise, 90 ul do sangue total foram pla- queados em cada poço de uma placa de fundo U de 96 poços. Imedia- tamente após o plaqueamento, o sangue total foi tratado com 0,69, 2,06, 6,17, 18,52, 55,56, 166,67 e 500 nM de controle AB79 ou PBS por 6, 24 e 48 horas. Em cada ponto do tempo, o sangue total tratado com molécula de controle e teste na placa de fundo U de 96 poços foi transferido para uma placa de poço profundo para lise de RBC. Após a lise, as células foram ressuspensas em tampão de tingimento com an- ticorpos CD16-BV605, CD56-PE e CD38-FITC para o tingimento do marcador de superfície. As células foram protegidas da luz e incuba- das a 4 ºC por 20 minutos. Após a incubação, as células foram centri- fugadas a 350 g em RT durante 5 minutos e lavadas com 1X de tam- pão de aglutinação à Anexina V. As células foram ressuspensas em 1X tampão de aglutinação à anexina V contendo anexina V Alexa Flu- or 647 à RT por 15 minutos. As células tingidas foram analisadas com uso de um citômetro de fluxo BD FACSCelesta e os dados foram regis- trados com o software BD FACSDiva, Versão 8.0.1. A viabilidade das células NK em cada concentração de teste e os valores de IC50 da depleção de células AB79 NK em cada ponto do tempo foram repre- sentados graficamente e ajustados com o GraphPad Prism 7.04.

ESTUDOS DE DETECÇÃO DE FAIXA DE DOSES EM MACACOS SAUDÁVEIS

[00342] Em uma série de investigações, macacos cynomolgus sau- dáveis, criados para fins de reprodução e experimentalmente naive receberam controle de veículo, 0,03, 0,1, 0,3 e 1 mg/kg de AB79 se- manalmente ou 3, 30 ou 80 mg/kg a cada duas semanas por meio de infusão intravenosa de 20 minutos (Charles River Laboratories). Em todas as investigações, os animais foram avaliados quanto a altera- ções nos sinais clínicos (observação lateral da gaiola duas vezes ao dia, pós-dose, exames semanais detalhados, consumo alimentar e pe-

so corporal semanal). Amostras de sangue foram coletadas antes e após a dose em todas as investigações para avaliação da farmacoci- nética, farmacodinâmica e anticorpos anti-humanos de primatas (PA- HA). As investigações foram conduzidas em macacos cynomolgus, de acordo com a instalação de testes SOP (Charles River Laboratories), que segue os regulamentos descritos na Lei de Bem-Estar Animal do USDA (9 CFR, Partes 1, 2 e 3) e as condições especificadas no Guia para o cuidado e uso de animais de laboratório (publicação ILAR, 1996, National Academy Press).

PROCEDIMENTO BIOANALÍTICO PARA DETERMINAÇÃO DE CON- CENTRAÇÕES DE SORO AB79

[00343] A concentração de AB79 no soro de macaco cynomolgus foi medida com uso de um método de ensaio imunossorvente ligado a enzima (ELISA). Este método é um ELISA indireto que utiliza um for- mato de microtitulação de 96 poços. A placa foi revestida com um anti- corpo anti-idiotípico de camundongo contra AB79. Amostras em bran- co, padrão e de controle de qualidade (QC) contendo AB79 em várias concentrações, bem como amostras de soro de macaco, foram adicio- nadas à placa de microtitulação revestida e incubadas por 55 a 65 mi- nutos em RT. Após lavagem da placa de microtitulação, foi adicionado o anticorpo de detecção (IgG anti-humano de camundongo affinipure conjugado com peroxidase) e a placa foi incubada por mais 55 a 65 minutos. A placa foi lavada novamente e foi adicionada tetrametilben- zidina (TMB) aos poços para gerar um cromóforo, e o desenvolvimento da cor foi interrompido pela adição de uma solução de parada (ácido sulfúrico 2N). A absorvância a 450 nm foi medida e as concentrações de AB79 foram calculadas com uso de uma curva de calibração logís- tica padrão ponderada (1/y2) de 4 parâmetros.

PROCEDIMENTO BIOANALÍTICO PARA DETERMINAÇÃO DE AN- TICORPOS ANTI-AB79

[00344] A triagem de anticorpo anti-AB79 do soro de macaco cynomolgus foi medida com uso de um método de quimioluminescên- cia intensificada (ECL). O desenho deste método qualitativo de ECL é tal que as amostras de soro de macaco cynomolgus não diluídas fo- ram incubadas com 300 mM de ácido acético. As amostras dissocia- das por ácido foram incubadas em uma mistura de AB79 biotinilada, AB79 marcada com SULFO-TAG e 1,5M de base Trizma para neutrali- zar o ácido e formar um complexo imune. Este complexo foi então adici- onado a uma placa MSD revestida com estreptavidina e deixado para aglutinar. Após a lavagem, o complexo foi detectado pela adição de tam- pão de leitura MSD T à placa e excitação subsequente do SULFO- TAG'Y por meio de uma reação eletroquímica de Ru(bpy)3 para gerar luminescência, que foi lida com uso do MSD Sector 6000. A quantidade de luminescência correlaciona-se com o nível de anticorpos anti-AB79 de macaco cynomolgus presente no soro de amostras individuais. A diluição mínima necessária (MRD) do soro de macaco cynomolgus para este en- saio foi estabelecida em 1/30. Para representação gráfica, todos os animais foram plotados individualmente em função do título de anticor- pos e do dia da Inscrição (Figura 31). As amostras de soro com valo- res iguais ou inferiores ao ponto de corte específico da placa foram plotadas com uso de um valor de título nominal para facilitar o gráfico.

MODELO DE ARTRITE INDUZIDA POR COLÁGENO DE MACACO

[00345] O uso eticamente responsável de primatas não humanos foi assegurado modelando as respostas farmacodinâmicas de macacos cynomolgus ao AB79 e extrapolando o número mínimo de animais ne- cessários por grupo de tratamento para produzir diferenças estatisti- camente significativas nas respostas de PD. Trinta e quatro macacos cynomolgus fêmeas naive, que variam entre 3 a 4 anos, 2,5 a 3,3 kg,

foram obtidos da Biomedical Research (GZ) Ltd (SNBL China). Após o recebimento, uma inspeção sanitária foi realizada em cada animal pela organização de pesquisa contratada (PharmalLegacy Laboratories, Inc., China). Os animais foram alojados um por gaiola e aclimatados por um período mínimo de 14 dias antes do início dos procedimentos experimentais. A sala dos animais foi mantida a uma temperatura de a 29ºC, com uma umidade relativa de 40 a 70% e um ciclo de 12 horas de luz/escuridão. Os animais foram treinados para receber infu- sões intravenosas ou gavagem oral antes do início do estudo. Os ma- cacos tiveram acesso ad libitum a vegetais, frutas, ração (Shanghai Shilin Biologic Science & Technology Co. Ltd., China) e água de acor- do com um protocolo convencional. As gaiolas foram estratificadas dentro das armações para reduzir o efeito de quaisquer influências ambientais no estudo. Este projeto experimental, todos os protocolos de estudo e procedimentos experimentais foram analisados e aprova- dos pelo Comitê de Ética do hospedeiro (PharmaLegacy Laboratories Inc), de acordo com a lei chinesa sobre experimentação em animais.

[00346] Os macacos foram selecionados para o estudo com base nos critérios de pré-triagem. Um animal naive não recebeu colágeno e foi mantido como controle negativo para indução da doença. Os de- mais animais receberam colágeno bovino tipo Il (Sichuan, China) dis- solvido em 0,01N de ácido acético (SPGC Sinopharm Chemical Rea- gent Co,, Ltd; Shanghai, China) até uma concentração final de 4 mg/ml (Mihara M. et a/., Clin Immunol. 2001; 98 (3): 319 a 326; Uchiyama Y. et al., Biol Pharm Bull. 2008; 31 (6): 1159 a 1163; Uchiyama Y, Koike N, Mihara M. A anemia na artrite induzida por colágeno em macacos está correlacionada com a IL-6 sérica, mas não com o TNFa. Rheuma- tol Int 2008 28: 879 a 883; Kato A. et al., Experimental and Molecular Pathology 2008 84: 262 a 270), no Dia O e Dia 21 por via subcutânea (Mihara et a/. (2001) Clin. Immunol. 98 (3): 319 a 326; Uchiyama et al.

(2008) Biol. Pharm. Bull. 31 (6): 1159 a 1163; Uchiyama et a/. (2008) Rheumatol. Int. 28: 879 a 883; Kato et al. (2008) Experimental Mol. Path. 84: 262 a 270). O colágeno foi emulsionado com um volume igual de adjuvante de Complete Freund (CFA) (Sigma-Aldrich; St. Louis, EUA). Os animais foram pré-sedados com cetamina (4 mg/kg i.m. e anestesia adicional foi aplicada, se necessário, como 1,5% a 5% de isoflurano (máquina de anestesia por inalação, isoflurano Matrix vip3000) para produzir um fluxo de oxigênio de 0,8 a 1,5 litro. Quais- quer lesões cutâneas ulcerativas que se desenvolvam nos sítios de imunização foram tratadas com iodo cada vez que um animal foi seda- do, para prevenir a infecção.

[00347] Sete animais que receberam colágeno foram designados para o grupo profilático de AB79 no Dia O (Figura 31A). Os animais de profiláticos de AB79 receberam infusões semanais de 3 mg/kg de AB79 a partir do Dia 7, com a última dose administrada no Dia 56, pa- ra um total de 8 doses (Figura 31A). Os animais deste grupo foram sa- crificados no Dia 63. Os animais imunizados restantes foram tratados como um grupo e receberam uma infusão intravenosa semanal de 30 minutos de veículo (salino) a partir do Dia 7 até que um animal atingis- se ou excedesse 2 15% do Escore Clínico máximo de Artrite (CIA). Nesse ponto, o animal foi inscrito no grupo de controle de veículo, no grupo terapêutico de AB79 ou no grupo terapêutico de dexametasona e a inscrição continuou em uma base contínua, devido às diferenças de tempo no início da doença (Figura 31A). Para os animais inscritos no grupo de controle de veículo, foram realizadas infusões semanais de veículo por 5 semanas (Figura 31A). Os animais deste grupo foram sacrificados 7 dias após a última dose. Para os animais inscritos no grupo terapêutico de AB79, as infusões foram realizadas semanalmen- te por 5 semanas (Figura 31A). Os animais deste grupo foram sacrifi- cados 7 dias após a última dose. Os animais inscritos no grupo tera-

pêutico de dexametasona receberam gavagem oral diária por 5 sema- nas (Figura 31A) e foram sacrificados 1 dia após a última dose. Os animais foram observados diariamente quanto a sinais de problemas de saúde e reação geral aos tratamentos. Todas as exceções à apa- rência e comportamento saudáveis normais foram registradas e deta- lhadas em formulários de observações clínicas padrão.

AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ARTRÍTICA

[00348] O peso corporal dos macacos foi medido uma vez durante o período de aclimatação (5 dias antes do início do experimento), no dia anterior a cada ciclo de indução da doença e depois uma vez por semana até o final do estudo. O número de animais em um grupo com inchaço nas articulações foi registrado no Dia O e no Dia 21 e depois diariamente até o final do estudo. O número de articulações interfalân- gicas proximais (PIP) (cada mão e pé, respectivamente) com inchaço nas articulações foi registrado para cada animal no Dia 0, Dia 21 e de- pois uma vez por semana até o final do estudo. Os eixos longitudinal e transversal das articulações PIP dos membros anteriores e posteriores (sem polegar) foram medidos com pinças no Dia 0, Dia 21 e, em seguida, uma vez por semana após o início da doença até o final do estudo para todas as PIPs com artrite. A área oval média de 16 articulações PIP foi calculada e adotada como dados individuais. A área oval de cada PIP foi calculada usando a seguinte fórmula: Área oval = eixo longitudinal x eixo transversal x 3,14 x 1/4. A porcentagem de alteração da área oval e o inchaço articular foram calculados com uso da seguinte fórmula: % de alteração da área oval = (área oval média no Dia X / área oval média no dia da 1º sensibilização) x 100. Inchaço articular = (área oval média no Dia X - área oval média no dia da 1º sensibilização).

ESCORE CLÍNICO DE ARTRITE

[00349] A gravidade da artrite de cada membro em macacos foi pontuada no Dia O e no Dia 21 e depois uma vez por semana até o final do estudo, de acordo com os seguintes critérios: (0) Normal; (1) Artrite leve, sutil, mas definitiva; (2) Inchaço moderado; (3) Artrite grave com inchaço significativo e/ou deformidade articular perceptível. As seguintes articulações de cada pata foram examinadas e pontuadas: articulações no total, incluindo 5 articulações metacarpofalângicas (MCP), 4 articulações PIP (interfalângica proximal); 4 articulações DIP (interfalângicas distais), 1 articulação interfalângica de primeiro dígito; cada pulso ou tornozelo foi pontuado como uma única articulação composta. O joelho/cotovelo de cada membro também foi avaliado quanto à gravidade da doença. O escore artrítico de cada animal foi o escore total de cada articulação individual, com um escore máximo de 192 (16X3x4) (16: número total de articulações mais o joelho/cotovelo para cada membro; 3: escore máximo para cada articulação individual; 4: número de membros por macaco).

COLETA E ANÁLISE DE SANGUE

[00350] — Amostras de sangue foram usadas para hemograma com- pleto, química do sangue e preparação de soro para medições de anti- corpos, PK e ADA e foram coletadas de animais nos momentos indi- cados abaixo. Animais do grupo controle de veículo e do grupo profilá- tico de AB79: durante as Semanas 1 e 5, o sangue foi coletado duas vezes, uma vez antes da administração e uma vez no dia seguinte. Durante as Semanas 2, 3, 4, 6, 7 e 8, foram coletadas amostras de sangue imediatamente antes da administração do AB79. Durante a Semana 9, amostras de sangue foram coletadas quando os animais foram terminados. Todos os outros animais tiveram coleta semanal de sangue até o momento em que a doença atingiu o limiar de 15% da pontuação máxima na artrite. Após a atribuição ao grupo veículo, ao grupo terapêutico de AB79 ou ao grupo terapêutico de dexametasona, as amostras de sangue foram coletadas semanalmente imediatamente antes da dosagem e do término. Além disso, as amostras foram cole-

tadas no dia seguinte à primeira dose do fármaco e no dia seguinte à quinta dose. Para o controle de veículo, grupos de profilático de AB79, terapêutico de AB79 e de dexametasona, foram coletadas amostras de sangue para citometria de fluxo antes da primeira dose (no dia da infu- são), no dia seguinte à primeira dose, antes da segunda dose (no dia de dosagem), antes da quinta dose (no dia da administração) e no dia do término. Para o grupo terapêutico de AB79, foram coletadas amos- tras de sangue para citometria de fluxo antes da primeira dose do fár- maco, no dia seguinte à primeira dose, antes da 8º dose, antes da 29º dose e no dia do término.

EXAME RADIOGRÁFICO

[00351] Os exames foram realizados para cada articulação (DIP, PIP, 1º IP e MCP - sítios tipicamente envolvidos no RA humano) nas mãos e pés de animais anestesiados no término do estudo. A classificação radi- ográfica foi realizada de maneira cega, com base em um sistema de classificação de O a 4: (0) Normal; (1) Menor deformidade nas camadas da cartilagem articular e/ou regiões ósseas subcondrais; (2) Grave de- formidade nas camadas da cartilagem articular e nas regiões ósseas subcondrais, uma pequena quantidade de osteófitos presente nas super- fícies periósteos e nas margens das articulações que são confusas, mas ainda visíveis; (3) Os mesmos tipos de alterações observados no grau 2, mas avançaram mais e uma grande quantidade de osteófitos presentes nas superfícies periósteos, a cavidade articular é indistinguível ou invisí- vel; (4) O mesmo tipo de alterações que no grau 3, mas avançado ainda mais, a cavidade articular torna-se indetectável, os ossos parecem escle- róticos ou anololizantes, ocorre uma grande desfiguração. HISTOPATOLOGIA E HISTOMORFOMETRIA DE TECIDO DE MA-

CACOS ARTRÍTICOS

[00352] Os animais foram submetidos à eutanásia por exsanguina- ção sob anestesia no final do estudo. As patas, baço, cólon e linfono-

dos (mesentérico e inguinal) foram coletados e fixados em formalina tamponada neutra. As articulações PIP e articulações DIP foram des- calcificadas com EDTA a 15%, desidratadas e embebidas em parafina: (8 blocos/pata x 4 patas x 22 animais = 704 blocos). Cortes coronais frontais das articulações foram obtidos com uso de um micrótomo rota- tivo. O escore da histopatologia foi realizado com uso de seções tingi- das de azul de toluidina (32 x 22 animais = 704 lâminas) por um histo- patologista ósseo de maneira cega. As seções histológicas foram ava- liadas qualitativamente quanto às seguintes características histopato- lógicas: infiltração celular, pannus, lesão de cartilagem e reabsorção óssea. A histomorfometria quantitativa foi realizada com uso do softwa- re Osteomeasure (OsteoMetrics, Inc., Atlanta, GA) em interface com um microscópio de luz/fluorescente Nikon Eclipse E400 e subsistema de vídeo. As medidas histomorfométricas da área articular e da super- fície foram realizadas às cegas, por um histopatologista ósseo, utili- zando lâminas tingidas com azul de toluidina (704 lâminas).

ANÁLISE ESTATÍSTICA

[00353] Os dados são apresentados como Média + Erro Padrão da Média (SEM). As análises estatísticas foram conduzidas com o Gra- phPad Prism em cada parâmetro entre os grupos naive, modelo e de fármaco de referência (dexametasona) e de artigos de teste. p <0,05 foi considerado significativamente diferente.

RESULTADOS PERFIL DE EXPRESSÃO DO CD38 EM MACACO CYNOMOLGUS

[00354] Para determinar se o macaco cynomolgus poderia ser um modelo adequado para avaliar os efeitos potenciais do alvejamento de CD38 em seres humanos, o perfil de expressão do antígeno CD38 foi comparado em 15 tipos diferentes de tecidos coletados de doadores saudáveis humanos e macacos cynomolgus. A imuno-histoquímica revelou que o AB79 se aglutinou a leucócitos mononucleares no cólon,

estômago, intestino delgado, medula óssea e linfonodo, além de algum endotélio na lâmina própria do cólon, estômago e intestino delgado em ambas as espécies (Tabela 11).

TABELA 11. COMPARAÇÃO DE PERFIS DE EXPRESSÃO DE CD38

EM TECIDOS HUMANOS E DE MACACOS a uu Macaco Controle de ./Controle da IMAb anti. IMAb — anti. lhumano humano 125 |Comentários da 125 25 iComentários — dd feeio — Som fogem fogem fagim [875 gm gm [agm fogem AB75 o Células da medula Poucas células dá d 3, 24 M óssea, [1+, 14, M medula — óssea| à |possivelmente CM d Ipossivelmente lleucócitos leucócitos jeoração Neg Tea Tive Tae o oeg Neg ÍNeg Neg |) Leucócitos, incluindd sa na lamina +, ás linfócitos, na lâmina2+, cm jom própria; algumlCM SCios, alia endotélio lendotétio ILeucócitos, incluindd (Células fusifo! A linfócitos, na lâmina1+, Ina lâmina própria) Estômago lprópria; aguniom |[**º aparentemente Jendotélio Jendotélio e. à (Células na lâmina ILeucócitos, incluinda Intestino — [4 fas, linfócitos, na lâmind2+, (14, posso: delgado — [OM |om lprópria; algumCM jom eo endotélio linfócitos, —algur |Jendotélio Ina lâmina próprial Tenar— fiea eg eg fica fo tentam lies fue fea fuga | [Túbulo renal Neg Neg ÍNeg fveg SN leg ÍNeg ÍNeg Neg [| -úÚ]t 5) Fígado — Neg Neg fneg fe leg Neg ÍNeg Neg | |Células em cordões células e: Imedulares e seio: kontões z +, a, Inasais; ILinfonodo cm lom possivelmente |4+, M [3+, C imedulares e seios |células plasmáticas) canas: nenos nd |poucos no córtex eo.

3+, [3+, [Células intersticiais d pamão — fem fem fe fico fonbonquciaras fics fico fea uea | âncreas — Neg Neg Íneg fe leg Neg ÍNeg lnNeg [| Epitélio acinar) Próstata [3+, C [34, C alguns leucócitos jintersticiais Leucócits eucócitos útero - cold2+, |1+, Isubmucosos, do útero CM CM |provavelmente linfócitos utero ndométrio Intensidade de tingimento: 1+ = mínimo, 2+ = leve, 3+ = moderado, 4+ = marcado, Neg = Negativo, M = Ausente |Frequência de tingimento de um tipo de célula específico: Muito raro (VR: <25% das células); Raro (R: 25 a 50% das células), Ocasional (0: > 50 a 75% das células), Frequente (F: 76 a 100% das células) O padrão de tingimento inclui o tipo de célula ou elemento de tecido (específico desse tipo de célula (por exemplo pitélio) ou elemento de tecido (por exemplo, membrana basal) e subcelular ou extracelular (membrana, itoplasma, filamentos citoplasmáticos, membrana basal)

[00355] Por outro lado, em seres humanos, mas não em macacos, o AB79 também se aglutinou a leucócitos mononucleares no fígado,

pulmão, próstata e útero (colo do útero) e ao epitélio acinar da prósta- ta. A aglutinação ao AB79 não foi observada no coração, rim, pân- creas, pele e endométrio do útero de nenhuma das espécies. O tingi- mento com AB79 foi geralmente moderado a acentuado (3+ a 4+) em intensidade nos tecidos humanos e mínima a leve (1+ a 2+) em intensi- dade nos tecidos de macacos cynomolgus (Tabela 11), o que poderia refletir a diferença nas afinidades de AB79 para CD38 humano versus de macaco e/ou para diferenças na magnitude da expressão de CD38. O padrão de tingimento foi principalmente citoplasmático e as membranas celulares foram tingidas em algumas células (Tabela 11). No geral, con- cluiu-se que o macaco era uma espécie modelo adequada para avaliar o efeito farmacológico potencial (ou os efeitos farmacológicos potenciais) do alvejamento de CD38 em um modelo de doença autoimune.

AB79 SE AGLUTINA AO CD38 EXPRESSO POR MACACOS CYNO-

MOLGUS

[00356] A sequência de aminoácidos da proteína de CD38 humana exibe 91% de identidade de aminoácidos com o ortólogo dos mesmos de macaco cynomolgus, 59% com a de camundongo e rato e 54% com a de coelho. Uma comparação do epítopo de aglutinação do AB79 no CD38 humano com a sequência correspondente no CD38 do macaco revelou uma única substituição de aminoácidos de uma lisina com um glutamato na posição 274. Para determinar se o AB79 poderia ser utili- zado para avaliar os efeitos potenciais do alvejamento de CD38 em ma- cacos, o CD38 de macaco foi expresso em células de ovário de hamster chinês (CHO) e o AB79 aglutinado ao CD38 de macaco com uma con- centração eficaz de metade da máxima (ECs5o) de 4,5 nM (Figura 32A). Este valor é aproximadamente 10 vezes menor que a afinidade de agluti- nação de AB79 para CD38 humano expressa por células CHO (KD = 0,7 nM), indicando que AB79 se aglutina a CD38 de macaco com menos po- tência em macacos cynomolgus do que em contrapartes humanas. O

AB79 também se aglutinou às células B, NK e T do macaco no sangue total e as células NK exibiram uma intensidade fluorescente média mais alta do que as células B e células T (Figura 32B) indicando que as célu- las NK do macaco expressam uma densidade mais alta de CD38 por cé- lula. Após a incubação com sangue total de macaco in vitro, AB79 citoli- zaram células NK de maneira dependente da dose (Figura 32C), exibindo uma ECso média de 29,6 nM, que era aproximadamente 30 vezes menos potente que a citólise de células NK do sangue periférico humano por AB79 (dados não mostrados). Coletivamente, esses dados indicam que os macacos cynomolgus podem ser menos sensíveis aos efeitos farmacológicos do AB79 do que os humanos. No entanto, esse perfil de reatividade cruzada, bem como a semelhança nos perfis de ex- pressão de CD38, sugerem que o macaco cynomolgus é uma espécie modelo adequada para investigar o efeito farmacológico potencial (ou os efeitos farmacológicos potenciais) do AB79 in vivo. EFEITOS FARMACOLÓGICOS DE AB79 EM MACACOS SAUDÁVEIS

[00357] Para caracterizar os efeitos farmacológicos do AB79 in vivo, macacos cynomolgus saudáveis foram infundidos IV com AB79 em 0,03, 0,1, 0,3 e 1 mg/kg semanalmente e em 3, 30 e 80 mg/kg bisse- manalmente por 3 meses e um subconjunto de animais foi monitorado por 3 meses após a última dose (Figura 31A). As concentrações má- ximas de AB79 geralmente ocorreram no final da infusão e eram ge- ralmente proporcionais à dose (Tabela 12). TABELA 12. PARÂMETROS FARMACOCINÉTICOS SÉRICOS MÉ- DIOS DE AB79 APÓS UMA INFUSÃO INTRAVENOSA EM MACA-

COS CYNOMOLGUS FÊMEA Dose — Cronograma — daTempo daCnas — AUCxs— Tigo (mg/kg) dose amostra (pg/ml) (h*ug/ml) (h) 0,1 Semanalmente Semana 1 1,77 104 NC Semana 13 2,49 218 NC 03 Semanalmente Semana1 432 — 327 NC

Dose — Cronograma — daTempo daChns — AUCxs Tiro (mg/kg) dose amostra (pg/ml) (h*ug/ml) (h) Semana 13 7,78 665 NC Semanamente Semana1l 211 16380 NC Semana 13 28,6 2700 NC 3 — Quinzenamente Semanal 621 7600 NC Semana 13 90,1 18.400 237 — Quinzenamente Semana1 680 — 92800 NC Semana 13 962 228.000 NC 80 — Quinzenamente Semana1 1630 — 220000 NC Semana 13 3140 456.000 415

[00358] A exposição, em geral, aumentou de maneira proporcional à dose no estado gradual em animais que não exibiram anticorpos an- ti-AB79 e acumularam de 1,7 a 2,4 vezes na semana 13 (Tabela 12), o que é consistente com a depuração diminuída devido à disposição do fármaco mediado pelo alvo de AB79. A meia-vida após a última dose de animais nas coortes de 3 e 80 mg/kg que não exibiram anticorpos anti-AB79 foi de 237 e 415 horas, respectivamente (Tabela 12). Não foram observadas diferenças de gênero nas características de PK.

[00359] A população de células NK expressou CD38 com uma den- sidade alta uniforme (Figura 32B) e foi reduzida no sangue periférico após a primeira infusão de Ab79 com um EDso de 0,3 mg/kg (Figura 31B), uma Cmax correspondente de 7,63 ug/ml e uma exposição média geral de 665 h*ug/ml na semana 13 (Tabela 12). Em contraste, a po- pulação de células B expressou CD38 de maneira heterogênea, com uma densidade média de células NK menor (Figura 32B), e foi reduzi- da no sangue periférico após a infusão inicial de AB79 com um EDso de 1,0 mg/kg (Figura 31C), uma Cmax de 21,1 ug/ml e uma exposição média geral de 2.700 h*pug/ml na semana 13 (Tabela 12). A população de células T também expressou CD38 de maneira heterogênea com uma densidade mediana ainda menor do que a das células B (dados não mostrados) e foi reduzida no sangue periférico após a primeira infusão de AB79 com um EDso de 30 mg/kg (Figura 31D), uma Cmax de 62,1 ug/ml e uma exposição média geral de 18.400 h*ug/ml na sema- na 13 (Tabela 12). Coletivamente, esses dados de descoberta da faixa de doses indicaram que uma dose semanal de 3 mg/kg sustentaria a população total de células NK, B e T em mais de 80, 60 e 20% dos ní- veis de base no sangue periférico, respectivamente. PERFIL DE AB79 NA ARTRITE INDUZIDA POR COLÁGENO

[00360] A eficácia potencial do AB79 foi investigada com um mode- lo da CIA em macacos cynomolgus, uma espécie cujo sistema imuno- lógico, articulações e anatomia esquelética é semelhante o suficiente às contrapartes humanas para permitir o uso de índices clínicos. Para induzir a artrite, os macacos foram tratados por via intradérmica no Dia O e Dia 21 com colágeno tipo Il (Figura 33) e o surgimento de anticor- pos anticolágeno confirmou a imunização bem-sucedida de cada ani- mal (dados não mostrados). Um grupo de animais foi tratado no Dia 7 com um regime de tratamento profilático de AB79 de 3 mg/kg que con- tinuou por 8 semanas. Nos 3 grupos terapêuticos, os macacos com doença aberta foram randomizados e administrados um controle de veículo, 3 mg/kg de TAK 079 ou 0,1 mg/kg de dexametasona. O trata- mento terapêutico continuou por 5 semanas após o início do tratamen- to (Figura 33).

[00361] O AB79 foi bem tolerado nos regimes profilático e terapêu- tico. O macaco saudável de controle ganhou peso ao longo do tempo, enquanto os macacos imunizados com colágeno nos outros quatro grupos começaram a perder peso a partir do dia 7 (Figura 34A), indi- cando um impacto sistêmico associado ao desenvolvimento de artrite. Com base na variação percentual do peso corporal em relação ao pe- so corporal de linha de base na inscrição, verificou-se que os animais do grupo profilático de AB79, do grupo terapêutico de AB79 e do grupo terapêutico de dexametasona voltaram a ganhar peso corporal a partir de 14 dias após o início do tratamento, sugerindo um benefício tera- pêutico do AB79 e do tratamento com controle positivo de dexameta- sona.

O ganho de peso se aproximou dos níveis quase normais nos Macacos tratados com AB79 e dexametasona em comparação com um saudável de controle e não tratado; animais artríticos tratados com veículo perderam peso (Figura 34A). A gravidade da artrite foi avaliada com uso do Clinical Arthritis Score, que é uma avaliação global da ati- vidade da doença que considera todas as articulações mensuráveis do animal ao longo do estudo, usando um sistema de escore de 192 pon- tos.

Os animais tratados com veículo exibiram doença progressiva, com escores clínicos crescentes ao longo do estudo (Figura 34B). À exposição profilática ao AB79 preveniu o desenvolvimento de artrite significativamente (p <0,01) em comparação ao controle de veículo.

Da mesma forma, o tratamento terapêutico com AB79 ou dexametasona inibiu significativamente o desenvolvimento de artrite (p <0,05) em comparação ao controle de veículo e reduziu os escores de artrite nas linhas de base do pré-tratamento (Figura 34B). Efeitos semelhantes foram observados no subconjunto de articulações PIP, tanto em rela- ção ao número de articulações PIP inflamadas (Figura 34C) quanto ao aumento médio geral de todas as articulações PIP (Figura 34D). Para obter uma avaliação abrangente das articulações artríticas e do poten- cial de AB79 ter atividade de "modificação da doença” na artrite huma- na, foi realizado exame radiográfico para todas as articulações |P e MCP.

A exposição profilática ao AB79 preveniu danos nas articulações PIP (dados não mostrados), DIP (Figura 34E) e MCP (Figura 34F) sig- nificativamente (p <0,01) em comparação ao controle de veículo.

Da mesma forma, a exposição terapêutica ao AB79 ou à dexametasona resultou em significativamente (p <0,05) menos danos nas articulações PIP (dados não mostrados), DIP (Figura 34E) e MCP (Figura 34F) do que nos animais de controle de veículo. Para caracterizar os compo- nentes da artrite progressiva, as articulações DIP e PIP foram analisa- das histologicamente em relação à infiltração celular, gravidade do pannus, dano à cartilagem, reabsorção óssea e formação de osteófi- tos. A exposição profilática ao AB79 resultou em escores compostos significativamente menores (p <0,01) que o valor de controle de veícu- lo e comparáveis em magnitude aos animais não imunizados com co- lágeno (Figura 35A). O AB79 teve um efeito semelhante em cada componente; os escores foram significativamente menores (p <0,01) do que o valor de controle de veículo para pannus (Figura 35B), leucó- citos infiltrantes (Figura 35C), lesões de cartilagem (Figura 35D), reab- sorção óssea (Figura 35E) e formação de osteófitos (Figura 35F). Dife- renças semelhantes de menor magnitude também foram observadas no tratamento terapêutico com AB79 ou dexametasona (Figuras 35A a E), embora nem todas as diferenças tenham atingido significância es- tatística.

[00362] A histomorfometria quantitativa foi realizada em todas as articulações DIP e PIP em estudos cegos por um patologista veteriná- rio certificado, incluindo área da cartilagem articular (Figura 36A), es- pessura da cartilagem articular danificada (Figura 36B), porcentagem de superfície articular danificada (Figura 36C) e área osteófita versus superfície periosteal total (Figura 36D). Todos os parâmetros ilustra- ram que a exposição profilática ao AB79 impediu o desenvolvimento de dano articular significativamente. O tratamento terapêutico com AB79 reduziu a gravidade da doença, embora algumas medidas his- tomorfométricas não tenham alcançado significância estatística. Os efeitos terapêuticos do AB79 foram semelhantes à dexametasona ad- ministrada terapeuticamente.

[00363] Os níveis de proteína C-reativa (CRP) (Figura 37A), fosfa- tase alcalina (ALP) (Figura 37B) e albumina (ALB) (dados não mostra-

dos) correlacionaram-se com a gravidade da doença. O tratamento profilático com AB79 impediu os aumentos associados à inflamação em CRP (Figura 37A) e ALP (Figura 37B) observados no animal de controle de veículo. O tratamento terapêutico com AB79 causou uma rápida diminuição em CRP e ALP, enquanto o tratamento prolongado com dexametasona era necessário para reduzir os níveis de CRP e ALP (Figura 37A e 37B, respectivamente). Não foi encontrada evidên- cia de dano hepático nos parâmetros químicos séricos (por exemplo, aumento de ALT ou AST), o que sugere que a ALP aumentada foi de- vido ao desenvolvimento de doença óssea em animais com CIA, e que a ALP reduzida ocorreu devido à redução da lesão óssea em animais expostos ao AB79. Os valores da química sérica da creatinina, nitro- gênio da ureia no sangue, glicose e proteína total variaram ao longo do tempo, mas não mostraram correlação consistente com a gravidade da artrite ou o regime de tratamento (dados não mostrados).

[00364] Hematologia, contagem completa de sague e análise dife- rencial foram conduzidos durante o estudo e os principais parâmetros foram relatados. Não foi observada alteração nos níveis de hemácias após exposição ao AB79 ou dexametasona (Figura 38A). Além disso, a contagem de hematócritos diminuiu após o desenvolvimento da artri- te e aumentou de volta para os níveis de controle naive após o trata- mento com AB79 ou dexametasona (Figura 38B). Os reticulócitos es- tavam elevados após o desenvolvimento da artrite e o tratamento com AB79 e dexametasona reduziu a contagem de reticulócitos para o ní- vel normal encontrado no controle naive (Figura 38C). Os níveis de plaquetas e neutrófilos foram elevados com artrite e o tratamento com AB79 reduziu os níveis de plaquetas e neutrófilos em direção ao con- trole naive, enquanto a dexametasona não teve efeito (Figura 38D e 38E, respectivamente). Em contraste, os níveis totais de linfócitos di- minuíram com a doença em relação ao controle naive e o tratamento com AB79, conforme esperado, reduziu ainda mais os níveis de linfóci- tos, enquanto o tratamento com dexametasona não teve efeito (Figura 38F).

[00365] Entre os subconjuntos de linfócitos no sangue periférico, as células NK foram reduzidas > 95% abaixo dos níveis de linha de base (Figura 39A) dentro de 24 horas após a exposição ao AB79, enquanto os níveis de linha de base de células B (Figura 39B), células T (Figura 39C) e monócitos (Figura 39D) foram reduzidos em um máximo de 60%, 55% e 50%, respectivamente. As reduções de células NKe B foram mantidas durante a administração, enquanto as reduções de células T e monócitos foram transitórias e somente observadas após a primeira infusão. Um padrão de redução semelhante foi observado em cada população de células após o tratamento profilático de AB79, ex- ceto que este grupo de animais tinha níveis mais baixos de monócitos antes do tratamento, e os níveis de monócitos não mudaram em res- posta ao tratamento. Não foram observadas diferenças nas contagens de células B, NK, T ou monócitos entre animais tratados com veículo e dexametasona (Figura 39A, 29 D e 29F, respectivamente). Foi condu- zida bioanálise sérica para medir as concentrações de anticorpos AB79 e anti-AB79. A exposição substancial foi alcançada em cada animal doseado profilaticamente (Figura 40A) ou terapeuticamente (Figura 40B) com à Cmax variando de 24 a 97 ug/ml. Todos os animais expostos a AB79 exibiram concentrações mínimas que excederam o ECrs5o para saturação de CD38 (Figura 32A) e lise de células NK (Figu- ra 32C) in vitro. Os anticorpos anti-AB79 foram detectados em 4 de 7 animais no grupo profilático (Figura 40C) de 14 a 30 dias após a admi- nistração inicial e até o final do estudo. Dois animais exibiram altos tí- tulos que correspondiam a baixas concentrações de AB79 nesses animais no Dia 31 (Figura 40A), indicando que esses anticorpos anti- AB79 podem estar afetando a depuração. Os anticorpos anti-AB79 também foram detectados em 4 de 5 animais no grupo terapêutico (Fi- gura 40D), 21 dias após a administração inicial até o final do estudo e dois animais também exibiram altos títulos que corresponderam a bai- xas concentrações de AB79 nesses animais ao final do estudo (Figura 40B). No entanto, todos os animais foram incluídos nas análises de dados porque a maioria das células-alvo permaneceu reduzida dos níveis de linha de base durante toda a duração do estudo (Figuras 39E e 39F), com exceção das células T após a segunda dose terapêutica (Figura 39G).

DISCUSSÃO

[00366] —Foireportado que a deficiência de CD38 em camundongos resulta em formas atenuadas de CIA, ilustrando uma função não re- dundante (ou funções não redundantes) dessa molécula em um mode- lo de doença autoimune; no entanto, a função das células CD38 em modelos de primatas não foi investigada. Além disso, inúmeros estu- dos indicaram que o nível geral de expressão de CD38 nas células sanguíneas periféricas se correlaciona positivamente com a atividade da doença em pacientes com RA e SLE humanos (Cole S., et al., Ar- thritis Res Ther. 2 de maio de 2018; 20 (1): 85; Kraan MC, et al, Rheumatology (Oxford). Novembro de 1999; 38 (11): 1074 a 1080; Vi- tal EM, et al., Arthritis Rheum. Outubro de 2011; 63 (10): 3038 a 3047; ou Banchereau R,, et al., Cell. 21 de abril de 2016; 165 (3): 551 a 565). O mAb AB79 anti-CD38 esgotou as células plasmáticas em amostras de sangue ou de medula óssea de pacientes com RA ou SLE in vitro (Smithson et al. (2017) J. Immunol. 198 (1 Supplement) 224.20; Cole et al. (2018) Arthrit. Res. Ther. 20 (1): 85; Wang et al. (2016) Arthrit. Rheumatol. 68 (supl 10). Reunião Anual de ACR/ARHP 2016, 1085; Mihara M. et a/., Clin Immunol. 2001; 98 (3): 319 a 326; e Uchiyama Y. et al., Biol Pharm Bull. 2008; 31 (6): 1159 a 1163). Em contraste com outros mAbs anti-CD38 em desenvolvimento (por exemplo, daratumu-

mab, isatuximab e MOR202), o AB79 se aglutina ao CD38 expresso por macacos cynomolgus e forneceu a oportunidade única de determi- nar se a redução do nível de células que expressam CD38 impediria e/ou melhoraria a inflamação e os danos nos tecidos em um modelo de autoimunidade de primatas não humanos. O AB79 é um anticorpo monoclonal de alta afinidade que medeia efetivamente a depleção de células CD38+ (Smithson, G., et al., J] Immunol 1 de maio de 2017, 198 (1 Supplement) 224.20). A análise integrativa revela CD38 como um alvo terapêutico para pré-doença rica em células plasmáticas e artrite reumatoide estabelecida e lúpus eritematoso sistêmico (Cole S., et al., Arthritis Res Ther. 2018 2 de maio de 2018; 2 de maio de 2018; 20 (1): 85).

[00367] O macaco cynomolgus foi determinado como um modelo adequado para avaliar os efeitos potenciais do AB79 em uma doença autoimune, porque a CIA nesses macacos apresenta uma poliartrite articular pequena simétrica que se assemelha à RA humana (Mihara et al. (2001) Clin. Immunol. 98 (3): 319 a 326; Uchiyama et a/. (2008) Biol. Pharm. Bull. 31 (6): 1159 a 1163; Uchiyama et al. (2008) Rheumatol. Int. 28: 879 a 883; Kato et al. (2008) Experimental Mol. Path. 84: 262 a 270, os perfis de expressão para CD38 são semelhantes entre essas espécies (Tabela 11) e AB79 se aglutinou ao macaco CD38 com uma afinidade 10 vezes menor que a do CD38 humano (Figura 32). Conclu- iu-se que uma dose semanal de AB79 de 3 mg/kg seria adequada pa- ra avaliar a função potencial de CD38 na CIA porque os estudos de faixa de doses em macacos saudáveis indicaram que uma dose se- manal de 3 mg/kg de AB79 reduziria o total de populações de células NK, B e T em mais de 80, 60 e 20% dos níveis de base no sangue pe- riférico, respectivamente (Figuras 31B, 31C e 31D). Reduções seme- lhantes foram alcançadas nas células NK, B e T no modelo CIA para dosagem profilática (Figuras 37E, 37F e 37G), apesar do surgimento de anticorpos anti-AB79 em alguns animais (Figuras 39C e 39D). À diminuição na concentração de AB79 ao longo do tempo em 3 animais expostos profilaticamente (Figura 39A) indica que esses anticorpos podem ter uma depuração aumentada, no entanto, as células B, NKe T não haviam se recuperado aos níveis de linha de base ao término do estudo (Figuras 37E, 37F e 37G), indicando que as exposições ao AB79 foram suficientes para manter os efeitos de DP durante toda a investigação. Esses animais foram, portanto, incluídos em todas as análises. Isso também se aplica ao tratamento terapêutico com AB79. As células NK e B não haviam se recuperado até os níveis de linha de base ao término do estudo (Figuras 37E, 37F e 37G), indicando que as exposições ao AB79 eram suficientes para manter os efeitos da PD durante toda a investigação. Em contraste, as contagens de células T haviam se recuperado até os níveis de linha de base após o término do estudo (Figura 37G), sugerindo que os anticorpos anti-AB79 pode- riam confundir parcialmente a interpretação dos dados terapêuticos (isto é, subestimar a contribuição das células T que expressam CD38 na CIA de macaco).

[00368] A administração profilática de AB79 impediu o desenvolvi- mento de artrite, conforme ilustrado consistentemente em todas as avaliações, enquanto o tratamento terapêutico com AB79 inibiu o de- senvolvimento de artrite e danos articulares (Figuras 34, 35 e 36). À avaliação histológica das articulações demonstrou que o AB79 exer- ceu efeitos relativamente amplos, prevenindo a formação de pannus (Figura 35B), infiltração (Figura 35C), lesões de cartilagem (Figura 35D), erosão óssea (Figura 35E) e formação de osteófitos (Figura 35F). Vale ressaltar que o tratamento terapêutico com AB79 e dexa- metasona também inibiu essas alterações histológicas progressivas, embora em menor magnitude que a administração profilática. Os esco- res de artrite diminuíram com o tempo com o tratamento terapêutico

(Figuras 34B, 34C e 34D), indicando possível reversão do dano. Cole- tivamente, esses dados demonstraram efeitos consistentes de modifi- cação da doença com a exposição de forma profilática e terapêutica ao AB79.

[00369] O efeito desses tratamentos terapêuticos com AB79 e de- xametasona parece comparável um com o outro para os regimes in- vestigados. O uso terapêutico de esteroides, tal como a dexametaso- na, é altamente eficaz no tratamento de doenças autoimunes huma- nas, incluindo RA e SLE, porém efeitos colaterais deletérios (por exemplo, osteoporose, hipertensão, diabetes, ganho de peso, catarata, glaucoma, afinamento da pele e hematomas) restringem o uso crônico dessas terapias. O potencial da depleção alvejada de células CD38 para fornecer eficácia comparável em doenças autoimunes humanas sem os efeitos colaterais deletérios dos esteroides justifica uma inves- tigação clínica futura.

[00370] Os efeitos profiláticos e terapêuticos de AB79 foram asso- ciados a reduções sustentadas no nível sanguíneo de linfócitos totais (Figura 38F), células NK, B e T (Figuras 37C a 37E), uma redução transitória de monócitos (Figura 37F) e nenhuma alteração nas células vermelhas do sangue (Figura 38A), plaquetas (Figura 38D) e neutrófi- los (Figura 38E). Estes dados farmacodinâmicos ilustram que existem diferenças na sensibilidade das células que expressam CD38 à redu- ção por AB79. A redução geralmente se correlaciona com a densidade da expressão de CD38 pela célula; a população de células NK expres- sou uniformemente a densidade mediana mais alta de CD38 de todos os tipos de células examinados (Figura 32B) e foi mais sensível a AB79 (Figuras 31B e 37C). A densidade mais alta de CD38 expressa nas células B foi aproximadamente 3 vezes menor que nas células NK (Figura 32B) e a população de células B foi menos sensível ao AB79 do que nas células NK (Figuras 31C e 37C). A CD38 é geralmente ex-

pressa em densidades medianas mais baixas nas células T do que nas células B (Figura 32B), e as células T eram menos sensíveis à re- dução por AB79 do que as células B e NK (Figuras 31D e 37D). As células que expressam baixas densidades de CD38 (por exemplo, cé- lulas vermelhas do sangue) ou não expressam CD38 (por exemplo, neutrófilos) não foram afetadas por AB79 (Figuras 37A, 37D e 37E). Uma exceção são os monócitos, que expressam CD38 uniformemente em densidades intermediárias e foram apenas transitoriamente reduzi- dos por AB79 (Figura 37F). A cinética da redução transitória em monó- citos é distinta da redução sustentada observada nas células B/ Te NK e indica mecanismos distintos. Uma citólise direta das células NK pelo AB79 foi observada in vitro (Figura 32C) e uma redução sustenta- da nas células NK, B e T ocorre após uma dose única de AB79 in vivo (dados não mostrados), o que indica que CDC e/ou ADCC medeia es- sas reduções de células B, T e NK in vivo. Em contraste, os monócitos não foram citolisados in vitro (dados não mostrados) e não exibem re- dução sustentada in vivo (Figura 37F), o que indica que um mecanis- mo alternativo (por exemplo, marginalização) medeia reduções transi- tórias in vivo. A resistência dos monócitos humanos à citólise pelo AB79 também foi observada em sujeitos saudáveis (não publicados) e descrita para daratumumab em pacientes com mieloma múltiplo (Nijhof et al. (2016) Blood 128(7): 959 a 970). A expressão de inibidores de CDC e ADCC por monócitos humanos não se correlacionou significati- vamente com a resistência à citólise por daratumumab e permanece desconhecido o motivo pelo qual os monócitos são relativamente in- sensíveis ao daratumumab e ao AB79.

[00371] Embora a redução de células NK observada com AB79 seja qualitativamente consistente com a redução de células NK por dara- tumumab em pacientes com mieloma refratário, existem diferenças quantitativas. A dose de infusão IV (0,3 mg/kg), a concentração máxi-

ma (Cmax = 4,32 ug/ml) e a exposição (AUC366s = 327 pg:h/ml) de AB79 necessária para manter as células NK do sangue periférico a 50% abaixo da linha de base em macacos (Figura 31B), foi aproximada- mente 80, 116 e 297 vezes menor que a dose de infusão |V corres- pondente (24 mg/kg), a concentração máxima (Cmax — 573 ugími) e a exposição (AUCint — 97.175 upg:h/ml) necessários para reduções com- paráveis das células NK pelo daratumumab em pacientes com mielo- ma refratário (Casneuf et al. (2017) Blood Adv. 1 (23): 2105 a 2114; Clemens et al. (2017) Clin. Pharmacokinet. 56 (8): 915 a 924. Vale ressaltar que o AB79 se aglutina a linfócitos de macaco com uma afi- nidade (KD = 4 nM) semelhante à ligação do daratumumab a células que expressam CD38 humano (KD = 4 nM) (Centro de Avaliação e Pesquisa de Fármacos Número de Aplicação: 7610360orig1s00 Revi- são (ou Revisões) de Farmacologia), no entanto, não se sabe se es- sas diferenças resultam de uma diferença potencial entre as espécies, estados de doença e/ou potências dos respectivos anticorpos. Uma comparação mais definitiva, no entanto, requer dados farmacocinéti- cos e dinâmicos do AB79 em pacientes com mieloma refratário, por- que o daratumumab não reage de maneira cruzada com CD38 de ca- mundongo, rato, coelho, porco, cinomolgo e macacos rhesus (1 de abril de 2016 EMA/278085/2016 Comitê de Medicamentos para Uso Humano (CHMP) Relatório de Avaliação Darzalex Nome não proprietá- rio internacional: daratumumab Procedimento No EMEA/H/C/004077/0000).

[00372] Em conclusão, uma redução nas células que expressam CD38 com o anticorpo citolítico AB79 impediu o desenvolvimento de CIA em macacos quando administrado profilaticamente e reverteu a progressão da doença quando administrado terapeuticamente. Um es- tudo anterior utilizando amostras de sangue e de medula óssea de pa- cientes com SLE demonstrou que o AB79 esgotou 80% das células plasmáticas de vida curta e longa e reduziu autoanticorpos (por exem- plo, VH4-34 9G4+, anti-Ro e anti-dsDNA) in vitro (Wang et al. (2016) Arthritis Rheumatol. 68 (supl 10). Reunião anual de ACR/ARHP de 2016, 1085). Esses dados coletivos sugerem que essa estratégia tera- pêutica pode ser eficaz no tratamento de RA humana, de SLE e de outras doenças autoimunes. EXEMPLO 7: AVALIAÇÃO DO AB79 EM VOLUNTÁRIOS HUMANOS

SAUDÁVEIS

[00373] Esta investigação caracterizou a segurança, tolerabilidade, farmacocinética e farmacodinâmica do AB79 por um estudo randomi- zado, duplo-cego e controlado por placebo de uma única infusão intra- venosa (IV) ou injeção subcutânea (SC) de AB79 em doses crescentes em sujeitos saudáveis.

RESULTADOS

[00374] OAB79 foibem tolerado. Todos os eventos adversos (AEs) foram leves ou moderados e não houve retiradas devido a AEs ou rea- ções no sítio de infusão ou injeção nas doses IV e SC testadas até 0,06 e 0,6 mg kg”, respectivamente. Em doses mais altas, aumentos transitórios nos níveis de citocinas, principalmente após a administra- ção IV, coincidiram com a redução nas células que expressam CD38; os sintomas clínicos incluíram principalmente pirexia leve, dor de ca- beça e hipotensão postural. Não foram relatados achados notáveis pa- ra exames laboratoriais, eletrocardiogramas, sinais vitais ou exames físicos relacionados ao tratamento com o AB79. O AB79 reduziu os blastos de plasma e os níveis de células exterminadoras naturais (NK) em doses semelhantes, com 50% da dose eficaz máxima de aproxi- madamente 0,003 e 0,1 mg kg” para administração IV e SC, respecti- vamente. Reduções na imunoglobulina (Ig9)M e IgA ocorreram sem al- terações comparáveis na IgG. As contagens totais de células brancas do sangue, granulócitos, linfócitos, células vermelhas do sangue e pla-

quetas permaneceram dentro da faixa normal para todos os níveis de dose.

CONCLUSÕES

[00375] O AB79 reduziu os blastos de plasma e os níveis de células NK no sangue periférico de sujeitos saudáveis quando administrados por IV ou SC e foi, de forma geral, seguro e bem tolerado. A dosagem de SC foi melhor tolerada com depleção de células-alvo mais durável que a dosagem |V. Esse perfil plasmocitolítico pode ser útil no trata- mento de distúrbios causados pelo plasma ou células NK, contrapartes malignas (por exemplo, mieloma múltiplo e leucemia de células NK) e imunoglobulinas patogênicas.

PROJETO E OBJETIVOS DO ESTUDO

[00376] Este foio primeiro estudo em ser humano (FIH) de Fase 1, randomizado, duplo-cego, controlado por placebo e de dose única de AB79 em sujeitos adultos saudáveis. O objetivo principal do estudo foi avaliar a segurança e a tolerabilidade de doses únicas e escalonadas de AB79 após infusão IV ou injeção SC. Os objetivos secundários fo- ram avaliar a PK e PD nas populações de células sanguíneas e na imunogenicidade. Um total de 74 sujeitos foram incluídos neste estu- do. Após duas visitas de triagem, separadas por um período mínimo de cinco dias dentro de uma janela de 28 dias antes da randomização, os sujeitos foram admitidos no Dia -2 antes da dosagem para as avali- ações da linha de base. O AB79 foi administrado no Dia 1 por meio de uma infusão IV de 2 horas em doses crescentes sequenciais de 0,0003, 0,001, 0,003, 0,01, 0,03 ou 0,06 mg kg” em seis coortes, ou por meio injeção SC nas doses de 0,03, 0,1, 0,3 ou 0,6 mg kg” em ou- tras quatro coortes. A seleção da dose foi baseada em um modelo PK/PD derivado de uma série de estudos em macacos cynomolgus (Roepcke et al. (2018) Pharmacol Res Perspect. 6 (3): e00402). Em cada nível de dose, seis a oito sujeitos foram randomizados para AB79

(n = 4 a 6) ou placebo correspondente (n = 2).

[00377] A dosagem de sentinela foi usada para cada coorte com dois sujeitos iniciais recebendo AB79 ou placebo (1:1). Os dados de segurança e tolerabilidade pós-dose de 24 horas desses dois sujeitos foram analisados antes da dosagem dos demais sujeitos em cada co- orte. Os participantes foram confinados a uma Unidade de Farmacolo- gia Clínica (CPU) hospitalar até o Dia 8, seguido de visitas de acom- panhamento semanais ou quinzenais, com a última visita clínica plane- jada no Dia 78 para avaliação geral de segurança e análise de PK, PD e imunogenicidade. Uma ligação telefônica final de acompanhamento ocorreu no Dia 92.

[00378] A escalada da dose foi baseada predominantemente na gravidade do AE, conforme classificada com uso dos critérios de clas- sificação dos Critérios de Terminologia Comuns para Eventos Adver- sos. A escalada da dose deveria ser interrompida se pelo menos dois sujeitos em uma coorte com síndrome de liberação de citocinas (CRS) levar a síndromes clínicas moderadas ou reações de administração moderadas a graves. Visto que o AB79 é um anticorpo que destrói as células linfocitárias, nenhuma escalada adicional de dose foi permitida se reduções clinicamente relevantes no total ou subtipos da contagem de linfócitos (redução nominal> 50% do valor mais baixo da pré-dose do sujeito e abaixo das faixas de limite inferior da referência normal (NRRs)) fossem observadas e mantidas por 229 dias. O investigador e o patrocinador analisaram todos os dados cegos de segurança de to- dos os participantes em cada nível de dose antes de prosseguir para a próxima dose mais alta.

[00379] O estudo foi conduzido de acordo com as diretrizes de Bo- as Práticas Clínicas na CPU Parexel International Phase 1, localizada no Northwick Park Hospital, Harrow, Reino Unido. O protocolo foi ana- lisado e aprovado (número de aprovação 16/LO/2067) por um comitê de ética independente local, o Comitê de Ética em Pesquisa London- Brent (Londres, Reino Unido). Todos os sujeitos assinaram o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido antes do início de qualquer proce- dimento de estudo.

PARTICIPANTES DO ESTUDO

[00380] Os participantes elegíveis eram saudáveis, homens ou mu- lheres (sem potencial para engravidar) entre 18 e 55 anos, com peso de 50 a 100 kg e com índice de massa corporal (IMC) de 18,5 a 30 kg m?.

[00381] As contagens baseadas em citometria de fluxo de linfócitos CDA45+, células T, células T CD4+ e células B deveriam estar acima do limite inferior de NRRs e contagens de células NK dentro do percentil 50 superior do NRR, uma vez que o CD38 é altamente expresso em células NK. Os NRRs foram definidos por Takeda, que realizou as aná- lises por citometria de fluxo.

[00382] Os participantes eram excluídos caso cumprissem os crité- rios de exclusão definidos no protocolo, tal como imunodeficiência co- nhecida, risco elevado de infecção, histórico de malignidade ou uso de outro fármaco experimental antes do estudo que pudesse impactar o efeito do fármaco experimental.

[00383] Para medir as concentrações séricas de AB79, amostras de sangue em série foram coletadas antes da dosagem e até 168 horas após a dose, e amostras de sangue adicionais foram coletadas em momentos intermediários após a dose ou no término precoce (ET). As concentrações séricas de AB79 foram determinadas com uso de um ensaio imunossorvente ligado a enzima validado em ICON (Whitesbo- ro, NY).

[00384] Para avaliar a resposta PD de AB79, amostras de sangue periférico foram coletadas nas visitas de triagem, Dias -1, 1, 2 (somen- te SC), 3 (somente SC), 4 (somente IV), 5 (somente SC), 6, 8, 15, 22,

29, 50 e 78 pós-dose ou no ET. Os pontos finais primário e secundário de PD foram os blastos de plasma e a contagem de células NK medi- das no sangue, respectivamente. Avaliações adicionais incluíram con- tagem total e diferencial de células brancas do sangue, células T to- tais, subconjuntos de células T CD4 e CD8, contagem de células B, monócitos e granulócitos. Subconjuntos de linfócitos, monócitos e blastos de plasma foram medidos por citometria de fluxo em Covance (Bruxelas, Bélgica). Um ensaio eletroquimiluminescente foi validado para a detecção de anticorpos anti-AB79 no soro humano no ICON.

[00385] Parâmetros de segurança de rotina, tais como AEs, parâ- metros de laboratório clínico, exames físicos, eletrocardiogramas (ECGs) e sinais vitais foram monitorados na triagem, antes da dosa- gem e durante todo o período de confinamento e visitas de acompa- nhamento.

[00386] As reações à infusão foram relatadas em estudos clínicos de outros anticorpos anti-CD38 administrados a pacientes de MM após infusão IV (Voorhees et a/. (2015) Blood 126: 1829). Embora as expe- riências ex vivo não mostrassem evidência de atividade agonista do AB79 nas células sanguíneas humanas, e a infusão de AB79 não in- duzisse constatações observáveis sugestivas de reação à infusão em estudos não clínicos em macacos, sinais de reação à infusão ou SRC (dor de cabeça, febre, calafrios, hipotensão, náuseas e vômitos) foram monitorados de perto. Mediadores inflamatórios, incluindo proteína C reativa sérica (CRP) e fator de necrose tumoral (TNF) a e interleucinas 1 (IL-1) e 6 (IL-6), foram avaliados em vários momentos nos Dias 1 e 2 e no Dia 4 (somente coortes SC). A diminuição da taxa de infusão e/ou pré-medicações profiláticas orais com paracetamol (acetaminofeno) e anti-histamínicos (anti-H1 e anti-H2) foi permitida para minimizar os efeitos colaterais, se necessário.

[00387] Para as coortes SC, foram monitorados sinais de reações no sítio da injeção (ISR), tais como dor no sítio da injeção, queimação, vermelhidão, coceira, inchaço ou endurecimento.

[00388] Estatísticas resumidas e análise de dados foram conduzi- das com uso do SAS versão 9.2 e R versão 3.5.1. Os parâmetros de PK foram calculados com uso de análise não-compartimental. As vari- áveis de PD foram avaliadas e comparadas entre os grupos de dose ativa e entre cada nível de dose de AB79 e placebo.

RESULTADOS

[00389] Setenta e quatro sujeitos foram inscritos e receberam uma dose única de AB79 (n = 54) ou placebo (n = 20). Seis coortes IV que receberam AB79 nas doses de 0,0003, 0,001, 0,003, 0,01, 0,03 ou 0,06 mg kg” ou placebo, e quatro coortes SC que receberam AB79 nas doses de 0,03, 0,1, 0,3 ou 0,6 mg kg” ou correspondentes do pla- cebo foram monitorados por 92 dias; todos concluíram o estudo. Os participantes eram todos homens, exceto uma mulher no grupo place- bo SC. A população do estudo consistiu em etnias caucasianas (n = 51), asiáticas (n = 13), africanas (n = 4) e multirraciais (n = 6). A idade média (34,4 anos, com faixa de 19 a 55 anos) e o IMC (24 a 25 kg m?) eram semelhantes entre as coortes IV e de SC, e entre os grupos tra- tados com AB79 e placebo.

[00390] Todas as doses de AB79 foram bem toleradas neste estu- do. Os AEs foram de intensidade leve a moderada, com a maioria dos AEs sendo leves e bem equilibrados entre os grupos tratados com pla- cebo e AB79 (Tabela 13). Não houve AEs sérios (SAEs) ou mortes, e nenhum AE levou a interrupção do estudo ou da visita. Não foram rela- tadas constatações notáveis para exames laboratoriais, ECGs, sinais vitais ou exames físicos relacionados ao tratamento com o AB79.

TABELA 13. TEAES E AES TOTAIS RELATADOS EM DOIS OU MAIS

SUJEITOS EM QUALQUER GRUPO DE TRATAMENTO Número de Sujeitos (%; Placebo 0,0003 (n 0,001 0,003 0,03 0,06 a SS Je a aa a de 12) quaisquer TEAES Pirexia A r67) 1067) (36500) | Leatafrios o o 126333) | [Nasofaringite —— 2167) o J19650 0 fo jo 136333) | [Dor de cabeça — 40333) ÀÚÀÚúÚ Jo NA 125.0) [2(333) |3(500) |5(833) | [Tontura postural OU 1167) 50833) | senatêrcia O 1167) 2633) | fiesta dese o ameniaE amena o Injeção de SC Número de Sujeitos (%. o ota fa ea fica | combinado (n = 8) Sujeite qem a sea Jo — tasn[10sn | D: tio d [Bs se Bea Tea jo le om cafe 67 (1067) (2633) | [Dor orofaríngea = [1(125) Jo 126333) | o f1(667) ) Um TEAE foi definido como um AE que ocorre ou piora após o recebi- mento da primeira dose do fármaco do estudo e dentro de 94 dias após a última dose do fármaco do estudo. Sujeitos com um ou mais AEs dentro de um grupo de tratamento e nível do termo MedDRA fo- ram contados apenas uma vez nesse nível. As porcentagens são ba- seadas no número de sujeitos no conjunto de segurança por tratamen- to. O MedDRA (Versão 18.0) foi usado para codificação de AEs. AE, evento adverso; |V, intravenoso; MedDRA, Dicionário Médico para Ati- vidades Regulatórias; SC, subcutâneo; TEAE, evento adverso emer- gente do tratamento.

[00391] Como mostrado na Tabela 13, a maioria dos AEs era espo- rádica, sem tendência de relação com a dose, exceto dor de cabeça, tontura e calafrios, que eram observados com mais frequência nos grupos de doses mais altas IV de AB79, consistentes com maior inci-

dência de CRS. Esses efeitos (Tabela 14) foram observados princi- palmente em sujeitos que receberam doses mais altas (um sujeito e seis sujeitos nos 0,03 e 0,06 mg kg" IV, respectivamente; um sujeito e dois sujeitos nos 0,3 e 0,6 mg kg" SC, respectivamente). Esses sujei- tos exibiram reduções nos blastos de plasma e nas células NK, suge- rindo que esses sintomas resultam da depleção de células que ex- pressam CD38. TABELA 14. NUMERO E PORCENTAGEM DE SUJEITOS COM CRS

CLÍNICO Infusão IV AB79 (mg kg) Número de Sujeitos (%) Placebo combinado | 9:-0003 [0,001 |0,003 0,06 (n=12) (n=4) |(n=4) |(n=4) (n=6) fers o jo o 6 fo 116 )enos) Leve Todo Gravidade suave AB79 (mg kg) Injeção de SC Número de Sujeitos (%) Placebo combinado (n=8) E Pp FE E rentes) [emvenso| | | Joe [2% | Gravidade suave

[00392] Apenas ISR leves e transitórias foram observadas após in- jeções de SC, a maioria das quais foi resolvida em 7 dias. Essas rea- ções exibiram uma relação inversa do efeito da dose, pois cinco dos seis sujeitos tratados com a dose mais baixa de SC e apenas um su- jeito em cada uma das duas coortes de doses mais altas tiveram rea- ções.

[00393] As concentrações séricas de Ab79 em todos os pontos de tempo de amostragem de PK de Coortes 1 IV (0,0003 mgkg) a 4 (0,01 mgkg”) estavam abaixo do limite inferior de quantificação (LLOQ) do ensaio de detecção (isto é, 10 ng ml *), presumivelmente devido a doses baixas e na ausência de anticorpos antifármaco (dados não mostrados). Após a infusão IV de 0,03 e 0,06 mg kg” de AB79, a concentração de soro máxima observada (Cmax) foi de 21,4 e 100,4 ng ml”, respectivamente, e ocorreu 5 minutos após o final da infusão (Ta- bela 15 e Figura 41). Posteriormente, as concentrações séricas dimi- nuíram rapidamente para abaixo do LLOQ dentro de 1 ou 4 horas após o final da infusão, respectivamente, e as exposições não puderam ser calculadas com precisão. A Cmax pareceu aumentar aproximadamente cinco vezes em relação ao aumento da dose em duas vezes, de 0,03 para 0,06 mg kg”. Devido às concentrações séricas de AB79 limitadas (em um a três pontos no tempo por sujeito) disponíveis a partir de 0,03 e 0,06 mg kg" coortes IV, parâmetros de PK além de tempo para a concentração máxima de soro (tmax) € Cmax não puderam ser estimados de forma confiável. TABELA 15. SUMÁRIO DE PARÂMETROS PK DO AB79 APÓS UMA INFUSÃO ÚNICA |V DE 2 HORAS DE AB79 A 0,03 E 0,06 MG KG-1 OU UMA INJEÇÃO ÚNICA SC DE AB79 A 0,6 MG KG-1 EM SUJEI-

TOS SAUDÁVEIS e o mm Via (ng ml”) (ng dia ml) n=6 n=6 Po | FT | O am O rama (2,07, 2,67) Ma [| [semi je Troseonata raia Tim [e ema e Saara sena [asoten Tscatea º n=5. Os valores representam a média (% CV), exceto para tmax, em que as medianas (min, max) são apresentadas. AUCutima, área sob a curva de concentração sérica-tempo a partir do tempo O ao tempo da última concentração quantificável; Cmax, concentração máxima obser- vada de soro; CV, coeficiente de variância; IV, intravenoso; NA, não aplicável; PK, farmacocinética; SC, subcutâneo; tmax, tempo para con- centração sérica máxima.

[00394] As concentrações séricas de AB79 de todos os sujeitos nas coortes SC 1 (0,03 mg kg!) a 3 (0,3 mg kg!) estavam abaixo do LLOQ do ensaio de detecção em todos os pontos no tempo. Após uma única injeção SC de 0,6 mg kg" de AB79, cinco sujeitos desta coorte exibi- ram uma mediana tmax em aproximadamente 24 horas após a injeção. A Cmáx média de todos os seis sujeitos (incluindo um sujeito com as concentrações de soro inferiores a LLOQ) nesta coorte foi de 23,0 ng ml" que foi aproximadamente 23% do valor de Cmax após uma fusão |V de 2 horas a 0,06 mg kg * (um décimo da dose SC nesta coorte). As concentrações séricas de AB79 diminuíram gradualmente para abaixo do LLOQ em 3 a 14 dias após a injeção (Figura 41). Um sujeito da co- orte de 0,6 mg kg de SC não apresentou nível detectável de AB79 durante o período de amostragem de PK. Quando comparado com os parâmetros de PK das coortes IV, observou-se maior variabilidade en- tre sujeitos após injeção SC a 0,6 mg kg”. O tmax individual variou entre cerca de 8 a 96 horas (de 0,33 a 4 dias) após a injeção para os cinco sujeitos com concentrações mensuráveis nesta coorte.

[00395] Nas coortes administradas com AB79 por infusão IV, foram observadas reduções dependentes da dose nas células NK em doses > 0,003 mg kg”, com > 90% de redução em todos os sujeitos que re- ceberam uma infusão de 0,06 mg kg” (Figura 42). Ocorreu uma con- centração eficaz a 50% da resposta máxima (ECso) abaixo do LLOQ do ensaio de PK (isto é, 10 ng ml), no entanto, 75% da concentração eficaz máxima (EC75) para redução nas células NK por administração IV de AB79 foi de 21,4 ng ml (Tabela 15). Embora o nível de células NK tenha sido consistentemente reduzido da linha de base até o final da infusão, a duração da recuperação para os níveis da linha de base (<-20%) foi variável e geralmente relacionada à dose; a recuperação para os níveis de base das doses de 0,003, 0,01, 0,03 e 0,06 mg kg” exigiu uma média de 4, 4,6 e 8 dias, respectivamente (Figura 43). Não foram observadas reduções clinicamente significativas para linfócitos totais, células B e T, células T auxiliares e células T citotóxicas, granu- lócitos, células vermelhas do sangue ou plaquetas com uma adminis- tração IV de AB79 (dados não mostrados).

[00396] Nas coortes tratadas com AB79 por injeção SC, observou- se uma redução dependente da dose nas células NK (Figura 42) e blastos de plasma (Figura 43) em doses > 0,1 mg kg” com >= 90% de redução nos blastos de plasma em todos os sujeitos que receberam uma injeção de 0,6 mg kg. Uma redução de 75% nas células NK ocorreu em 0,6 mg kg” (dados não mostrados) com uma Cmax de 23,0 ng ml" (Tabela 15). Os níveis de blastos de plasma e células NK foram reduzidos a partir da linha de base dentro de 8 horas após a injeção e exibiram um tmax de 48 horas. A duração da recuperação para os ní- veis de linha de base foi variável; a recuperação para a linha de base (isto é, dentro de -20% dos níveis da linha de base) para as doses de 0,1, 0,3 e 0,6 mg kg” necessitou uma média de 4, 78 e 50 dias, res- pectivamente (dados não mostrados). Foram observadas reduções mínimas ou inexistentes para linfócitos totais, células B e T, células T citotóxicas, células T auxiliares, monócitos (Figura 43) e granulócitos, células vermelhas do sangue e plaquetas (dados não mostrados).

[00397] “Embora os níveis de lgs totais tenham permanecido dentro dos NRRs, os níveis de IgM total foram reduzidos nas coortes adminis- tradas em 0,03 e 0,06 mg kg de AB79 IV e foram significativamente (P <0,05) inferiores a uma coorte de controle placebo no mesmo perí- odo nos dias 15 a 64 (Figura 44, painéis superiores). Reduções signifi- cativas (P <0,01) nos níveis totais de IgM também foram observadas nos dias 15 a 64 para o AB79 administrado de modo SC a 0,3 e 0,6 mg kg” (Figura 44, painéis inferiores). Os níveis de IgM exibiram uma tendência de recuperação para a linha de base no dia 78. Não foi ob- servado efeito significativo nos níveis de IgA e IgG para AB79 adminis-

trado de modo IV ou SC (dados não mostrados).

[00398] “Dos 54 sujeitos que receberam Ab79, um sujeito na coorte de 0,03 mg kg SC exibiu uma titulação persistente (isto é, Dias 15, 29, e 78), mais elevada (isto é, 160, 1.280, e 320) de anticorpo anti- Ab79 (dados não mostrados). As concentrações séricas de AB79 nes- te sujeito ficaram abaixo do LLOQ durante todo o período do estudo, assim como os níveis de AB79 nos sujeitos negativos para anticorpos antifármaco (ADA) na mesma coorte, portanto, o impacto potencial do ADA na PK do AB79 não pode ser determinado. É preciso mencionar também que o ADA não coincidiu com os AEs.

[00399] “Uma estratégia terapêutica para o tratamento do SLE e da RA é reduzir o nível de linfócitos CD38+, com base em vários relató- rios que mostram uma associação entre o nível de linfócitos CD38+ e a atividade da doença (Cole et a/. (2018) Arthritis Res. Ther. 20 (1): 85; Kraan et a/. (1999) Rheumatology (Oxford) 38 (11): 1.074 a 1.080; Vital et al. (2011) Arthritis Rheum. 63 (10): 3.038 a 3.047; Banchereau et al. (2016) Cell 165 (3): 551 a 565; e Grammer et al. (2003) J. Clin. Invest. 112 (10): 1.506 a 1.520). Isso pode ser alcançado com o AB79, porque ele se liga especificamente ao CD38 e esgota as células (Smithson et al. (2017) J. Inmunol. 198 (1 Supl): 224,20). A adição de AB9 a amos- tras de sangue ou medula óssea de pacientes com SLE ou RA reduziu a população de PC e diminuiu a produção de anticorpos específicos para autoantígeno (Wang et al. (2016 ACR/ARHP Annual Meeting abs- tract 1085) Arthritis Rhneum. 68 (sup! 10). O AB79 também reduziu os linfócitos que expressam altos níveis de CD38 em macacos (Roepcke et al. (2018) Pharmacol Res Perspect. 6 (3): e00402), impediu o de- senvolvimento de CIA quando administrado profilaticamente e inibiu a progressão da artrite quando administrado terapeuticamente (Smithson et al. (2017) J. Immunol. 198 (1 Supl): 127,17). Portanto, o objetivo desta investigação foi caracterizar a segurança, tolerabilidade,

PK e PD da infusão intravenosa única e injeção SC de AB79 em sujei- tos saudáveis e determinar se é necessário um estudo clínico em pa- cientes.

[00400] Estaé a primeira caracterização da tolerabilidade, PK e PD de um anticorpo CD38 citolítico administrado a sujeitos saudáveis. To- das as doses de AB79 foram bem toleradas neste estudo. Os AE fo- ram de intensidade leve a moderada, com a maioria sendo leve (Tabe- la 13). Não houve SAEs ou mortes, e nenhum AEs levou à interrupção do estudo ou da visita. Não foram relatadas constatações notáveis pa- ra exames laboratoriais, ECGs, sinais vitais ou exames físicos relacio- nados ao tratamento com o AB79. Embora as reações relacionadas à infusão não tenham sido observadas neste estudo, a CRS foi observa- da em sete sujeitos no grupo de infusão IV de AB79 e três no grupo de AB79 SC (Tabela 14). Os casos de RSC coincidiram com reduções nos blastos de plasma e nas células NK (Figuras 42 e 43), aumentos moderados nas citocinas (por exemplo, TNF-a, IL-18 e IL-6; dados não mostrados) e proteína C reativa no sangue (dados não mostrados). Esses dados são consistentes com estudos em macacos que ilustram que a depleção celular coincidiu com uma elevação nos níveis séricos de TNF-a (Roepcke et al. (2018) Pharmacol Res Perspect. 6 (3): e00402). Em comparação com os grupos de tratamento |V, as coortes de tratamento SC apresentaram uma menor incidência de CRS e tive- ram aumentos mínimos no nível de citocinas, em concentrações com- paráveis de AB79 no sangue periférico (por exemplo, 0,03 mg kg IV versus 0,6 mg kg” SC). Esses resultados são consistentes com a me- nor incidência de reações à infusão para administração SC versus |V de daratumumab em pacientes com mieloma refratário. Utilizam-se formulações diferentes para administração IV versus SC de daratu- mumab, enquanto que a mesma formulação foi utilizada para adminis- tração de AB79 por via IV versus SC em sujeitos saudáveis. Os dados para AB79 indicam que taxas mais baixas de CRS são principalmente atribuíveis a uma via de administração SC, em oposição a diferenças na formulação.

[00401] A avaliação não clínica de AB79 em macacos sugeriu que a área sob a curva de concentração sérica-tempo aumentou mais que a dose proporcionalmente após uma única administração IV e SC de AB79 (Roepcke et al. (2018) Pharmacol Res Perspect. 6 (3): e00402). Devido à quantidade limitada de dados de concentração sérica em su- jeitos saudáveis, não foi possível realizar uma avaliação formal da proporcionalidade da dose ou da biodisponibilidade da CE de AB79. No entanto, a Cmax após a infusão IV pareceu aumentar mais do que a dose proporcionalmente (isto é, aumento de aproximadamente cinco vezes ao longo de um aumento de duas vezes na dose de 0,03 para 0,06 mg kg”), consistente com uma tendência semelhante observada em macacos com Ab79 e com aqueles publicados para outros anticor- pos monoclonais com eliminação mediada pelo alvo. A Cmax de dose normalizada após uma injeção SC foi substancialmente mais baixa do que após uma infusão |V de 2 horas. Depois que a Cmax foi atingida, as concentrações séricas diminuíram muito mais lentamente após uma injeção SC e foram mantidas acima do LLOQ por muito mais tempo em comparação com uma infusão |V.

[00402] A resposta de PD de sujeitos saudáveis ao AB/79 IV é o exemplo mais potente de depleção de células NK por um anticorpo monoclonal anti-CD38 descrito até o momento. O Ab79 a 0,06 mg kg” gerou uma Cmax média de 100,4 ng ml!" e reduziu as células NK de sangue periférico em cada sujeito saudável, pelo menos, 90% mais baixo do que os níveis de linha de base dos mesmos (Figura 42). Esta extensão da redução da célula NK não foi alcançada em pacientes de MM recidivante/refratário infundidos com daratumumab IV até 24 mg kg” e com uma Cmax média de até 573 ugml”* (Clemens et a/l. (2017)

Clin. Pharmacokinet. 56 (8): 915 a 924; Xu et al. (2017) Clin. Pharma- col. Ther. 101 (6): 721 a 724). Não se sabe se essa diferença de po- tências resulta de diferenças nas populações do estudo e/ou proprie- dades dos respectivos anticorpos. Embora sujeitos saudáveis e paci- entes com mieloma tenham um número semelhante de células NK e essas células expressam uma densidade semelhante de CD38 (Krejcik et al. (2016) Blood 128 (3): 384 a 394), pacientes com mieloma têm níveis mais altos de outras células-alvo CD38+ (isto é, células de mi- eloma) que podem contribuir para uma diferença na potência da de- pleção de células NK entre essas populações. Uma análise mais defi- nitiva requer dados de PK e PD para AB79 em uma população seme- lhante de pacientes com mieloma recidivado/refratário.

[00403] Um atributo de maior potência é que uma menor quantida- de e volume de terapia são necessários para obter efeitos compará- veis de PD. A eficácia do tratamento de pacientes com uma infusão IV de mAb anti-CD38 pode ser aperfeiçoada através da administração como uma injeção SC de baixo volume, pois pode ser administrada em um minuto, em contraste com as 2 a 4 horas normalmente necessárias para o recebimento de uma infusão |V, e na terapia crônica poderiam potencialmente ser autoadministrados pelo paciente em casa com se- gurança, com conveniência e vantagens farmacoeconômicas. Esta é a primeira demonstração de redução de células após a injeção SC de um anticorpo anti-CD38 citolítico em sujeitos humanos, o que mostrou que a injeção SC tem melhor tolerabilidade do que a infusão IV. É também o primeiro relato de que uma injeção SC de 1 ml de 0,1 a 0,6 mg kg” de um anticorpo anti-CD38 provoca atividade máxima de PD (por exemplo, redução > 90% dos blastos de plasma) no sangue peri- férico. O AB79 reduziu os blastos de plasma e as células NK de ma- neira dependente da dose em doses IV > 0,1 mg kg” (Figuras 42 e 43). O ECoo correspondente para a redução de blastos de plasma foi de aproximadamente 23,0 ng ml, enquanto que foi de 100,4 ng ml! para a redução de células NK (Tabela 15). Essa diferença potencial de sensibilidade pode estar relacionada ao nível de expressão de CD38 expresso por essas populações; os blastos de plasma expressam aproximadamente uma densidade cinco vezes maior de CD38 do que as células NK (Krejcik et al. (2016) Blood 128 (3): 384 a 394). Não se sabe se essa diferença existe nos pacientes com SLE, RA e/ou MM porque os dados que descrevem o nível de blastos de plasma e célu- las NK nessas populações de pacientes ainda não foram relatados até o momento. Se uma atividade comparável for observada nos pacien- tes, a eficiência de uma injeção SC de baixo volume pode potencial- mente fornecer terapia aos pacientes sem acesso a um centro de infu- são e reduzir as despesas gerais de assistência médica.

[00404] —Monócitos circulantes, células B e T expressam níveis mais baixos de CD38 em sujeitos saudáveis e esses tipos de células não foram reduzidos na mesma extensão que os blastos de plasma e célu- las NK por AB79. Esses dados são consistentes para os descritos para macacos cynomolgus após uma dose inicial de AB79, bem como após exposição crônica por 3 meses; as células NK expressaram uniforme- mente altos níveis de CD38 e foram mais sensíveis ao AB79 do que os linfócitos B e T, que expressam CD38 de maneira heterogênea e ge- ralmente em níveis mais baixos do que as células NK (Roepcke et al. (2018) Pharmacol Res Perspect. 6 (3): e00402). Esses dados também são consistentes com os descritos para pacientes com mieloma recidi- vador/refratário expostos cronicamente ao daratumumab; os monócitos não foram afetados e as subpopulações de células B e T CD38+ são reduzidas no sangue periférico (Krejcik et a/. (2016) Blood 128 (3): 384 a 439).

[00405] O lgé predominantemente produzido por PCs residentes em tecidos linfoides (por exemplo, medula óssea, linfonodos, baço,

etc.). Um efeito semelhante foi descrito em pacientes com SLE expos- tos a doses múltiplas do inibidor do proteassoma bortezomib; houve reduções significativas nos níveis séricos totais de IgM (34%), IgA (34%) e IgG (15%), que corresponderam a reduções em escores de blastos de plasma sanguíneo (54%), PCs da medula óssea (50%) e atividade da doença (Alexander et al. (2015) Ann. Rheum. Dis. 74 (7):

1.474 a 1.478). Coletivamente, esses dados indicam que AB79 pode ser eficaz na redução dos níveis de lg e, potencialmente, que IgM e IgA podem ser seletivamente reduzidos em relação à IgG. Esse perfil pode fornecer utilidade terapêutica nas nefropatias IgM, IgA e IgG, mi- nimizando a supressão de outros componentes do sistema imunológi- Co.

[00406] Em conclusão, uma dose única de AB79 administrada IV ou SC foi bem tolerada por sujeitos saudáveis. O AB79 esgotou os blas- tos de plasma e as células NK e reduziu os níveis séricos de IgM e IgA. Esta atividade plasmocitolítica pode ser benéfica para o tratamen- to de uma variedade de neoplasias hematológicas e/ou distúrbios imu- nológicos envolvendo PCs desregulados, anticorpos patogênicos, lgs e/ou células NK.

INCORPORAÇÃO A TÍTULO DE REFERÊNCIA

[00407] O conteúdo de todas as referências citadas (incluindo refe- rências de literatura, patentes, pedidos de patentes e sites da web) que podem ser citadas ao longo deste pedido é expressamente incor- porado a título de referência em sua totalidade para qualquer finalida- de, assim como as referências citadas, na mesma extensão como se cada referência individual fosse indicada específica e individualmente para ser incorporada a título de referência em sua totalidade para quaisquer finalidades.

EQUIVALENTES

[00408] A divulgação pode ser incorporada em outras formas espe-

cíficas sem se afastar do espírito ou das características essenciais do mesmo.

As modalidades anteriores devem, portanto, ser consideradas ilustrativas em todos os aspectos, em vez de limitativas da divulgação.

O escopo da divulgação é, portanto, indicado pelas reivindicações anexas, e não pela descrição anterior, e todas as alterações que se enquadram no significado e na faixa de equivalência das reivindica- ções devem, portanto, ser incorporadas neste documento.

Modifica- ções para conduzir a invenção que são evidentes para as pessoas versadas na técnica são destinadas a estarem inseridas no escopo das reivindicações anexas.

Claims (1)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Método para o tratamento de uma doença em um sujeito para o qual a aglutinação a CD38 é indicada, caracterizado pelo fato de que compreende a administração subcutânea ao sujeito de uma forma de dosagem unitária de um anticorpo anti-CD38 humano isola- do, em que o anticorpo anti-CD38 compreende uma região da cadeia pesada variável (VH) que compreende uma CDR1 com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3, uma CDR2 com a sequência de ami- noácidos da SEQ ID NO: 4 e uma CDR3 com a sequência de aminoá- cidos da SEQ ID NO: 5; e uma região da cadeia leve variável (VL) que compreende uma CDR1 com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 6, uma CDR2 com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 7 e uma CDR3 com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 8, em que a forma de dosagem unitária está em um volume de 3 ml ou me- nos.

   2. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é administrado em uma dosagem de 0,03 a 0,6 miligrama por quilograma de peso corporal.

   3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracteri- zado pelo fato de que a região da cadeia VH tem a sequência de ami- noácidos da SEQ ID NO: 9 e a região da cadeia VL tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10.

   4, Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1a3, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-CD38 compreen- de uma sequência de aminoácidos da cadeia pesada da SEQ ID NO: 11 e uma sequência de aminoácidos da cadeia leve da SEQ ID NO:

   12.

   5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a forma de dosagem unitária está em um volume de 2 ml ou menos.

   6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a forma de dosagem unitária está em um volume de 1 ml ou menos.

   7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a administração do anticorpo anti-CD38 não causa anemia hemolítica ou trombocitopenia.

   8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que a administração do anticorpo anti- CD38 resulta em menos de 10%, menos de 20%, menos de 30%, me- nos de 40% ou menos de 50% de incidência do grau 3 ou 4 de um ou mais eventos adversos emergentes do tratamento (TEAEs) seleciona- dos do grupo que consiste em anemia, anemia hemolítica, trombocito- penia, fadiga, reações relacionadas à infusão (IRRs), leucopenia e lin- fopenia.

   9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções anteriores, caracterizado pelo fato de que a administração do an- ticorpo anti-CD38 resulta em menos de 10%, menos de 20%, menos de 30%, menos de 40% ou menos de 50% de depleção de RBCs.

   10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções anteriores, caracterizado pelo fato de que a administração do an- ticorpo anti-CD38 resulta em menos de 10% de depleção, menos de 20%, menos de 30%, menos de 40% ou menos de 50% de depleção de plaquetas.

   11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções anteriores, caracterizado pelo fato de que a doença é seleciona- da do grupo que consiste em uma doença autoimune e um câncer.

   12. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 10, caracterizado pelo fato de que a doença é selecionada do grupo que consiste em lúpus eritematoso sistêmico (SLE), artrite reu-

   matoide (RA), doença inflamatória intestinal (IBD), colite ulcerativa (UC), miastenia grave (MG), neuromielite óptica (NMO), púrpura trom- bocitopênica imune (ITP), púrpura trombocitopênica trombótica (TTP), síndrome antifosfolipídica (APS), pênfigo vulgar (PV), pênfigo foliáceo (PF), encefalite anti-NMDAR (NMDR), anemia hemolítica autoimune (AIHA), doença de Grave, nefropatia membranosa, síndrome de Sjo- gren (SS), vasculite ANCA, epidermólise bolhosa adquirida (EBA), penfigoide bolhoso (BP), tireoidite de Hashimoto, esclerodermia, doen- ça relacionada a IgG, e doença do enxerto contra hospedeiro.

   13. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracteriza- do pelo fato de que a doença é selecionada do grupo que consiste em mieloma múltiplo, leucemia linfoblástica crônica, leucemia linfocítica crônica, leucemia de células plasmáticas, leucemia mieloide aguda, leucemia mieloide crônica, linfoma de células B e linfoma de Burkitt.

   14. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracteriza- do pelo fato de que a doença é mieloma múltiplo.

   15. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracteriza- do pelo fato de que a doença é mieloma múltiplo recidivado (RMM), mieloma múltiplo recidivado e refratário (RRMM) ou mieloma múltiplo recém-diagnosticado (NSMM).

   16. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções anteriores, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-CD38 humano é administrado na forma de uma composição farmaceutica- mente aceitável.

   17. Forma de dosagem unitária caracterizada pelo fato de que compreende um anticorpo isolado que compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende SEQ ID NO: 9 e uma regi- ão variável de cadeia leve que compreende SEQ ID NO: 10, em que o anticorpo isolado se aglutina a CD38 e em que a forma de dosagem unitária é formulada para administração subcutânea do anticorpo em uma dosagem de 0,03 a 0,6 miligrama por quilograma de peso corpo- ral.

   18. Forma de dosagem unitária, de acordo com a reivindi- cação 17, caracterizada pelo fato de que o anticorpo isolado compre- ende uma cadeia pesada que compreende SEQ ID NO: 11 e uma ca- deia leve que compreende SEQ ID NO: 12.

   19. Forma de dosagem unitária, de acordo com a reivindi- cação 17 ou 18, caracterizada pelo fato de que a forma de dosagem unitária está em um volume de 3 ml ou menos.

   20. Forma de dosagem unitária, de acordo com a reivindi- cação 17 ou 18, caracterizada pelo fato de que a forma de dosagem unitária está em um volume de 2 ml ou menos.

   21. Forma de dosagem unitária, de acordo com a reivindi- cação 17 ou 18, caracterizada pelo fato de que a forma de dosagem unitária está em um volume de 1 ml ou menos.

   22. Forma de dosagem unitária, de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 21, caracterizada pelo fato de que a for- ma de dosagem unitária é formulada para administração subcutânea do anticorpo no tratamento de um câncer hematológico selecionado do grupo que consiste em mieloma múltiplo, leucemia linfoblástica crôni- ca, leucemia linfocítica crônica, leucemia de células plasmáticas, leu- cemia mieloide aguda, leucemia mieloide crônica, linfoma de células B e linfoma de Burkitt.

   23. Forma de dosagem unitária, de acordo com a reivindi- cação 22, caracterizada pelo fato de que o câncer hematológico é mi- eloma múltiplo.

   24. Forma de dosagem unitária, de acordo com a reivindi- cação 23, caracterizada pelo fato de que a doença é mieloma múltiplo recidivante (RMM), mieloma múltiplo recidivante e refratário (RRMM) ou mieloma múltiplo recém-diagnosticado (NSMM).

   25. Forma de dosagem unitária, de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 24, caracterizada pelo fato de que a ad- ministração do anticorpo anti-CD38 não causa anemia hemolítica ou trombocitopenia.

   26. Forma de dosagem unitária, de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 24, caracterizada pelo fato de que a ad- ministração do anticorpo anti-CD38 resulta em menos de 10%, menos de 20%, menos de 30%, menos de 40% ou menos de 50% de incidên- cia de grau 3 ou 4 de um ou mais eventos adversos emergentes do tratamento (TEAEs) selecionados do grupo que consiste em anemia, anemia hemolítica, trombocitopenia, fadiga, reações relacionadas à infusão (IRRs), leucopenia e linfopenia.

   27. Forma de dosagem unitária, de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 24, caracterizada pelo fato de que a ad- ministração do anticorpo anti-CD38 resulta em menos de 10%, menos de 20%, menos de 30%, menos de 40% ou menos de 50% de deple- ção de RBCs.

   28. Forma de dosagem unitária, de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 24, caracterizada pelo fato de que a ad- ministração do anticorpo anti-CD38 resulta em menos de 10% de de- pleção, menos de 20%, menos de 30%, menos de 40% ou menos de 50% de depleção de plaquetas.