BR112020013805A2 - domínio extracelular da subunidade alfa do receptor de ige fc, composição farmacêutica compreendendo o mesmo e método para produzir o mesmo - Google Patents
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Abstract
A presente invenção fornece uma proteína dimérica polipeptídica contendo dois monômeros, cada um dos quais contém um domínio extracelular (FceRIa-ECD) de uma subunidade alfa de um receptor de IgE Fc. A proteína dimérica, de acordo com a presente invenção, apresenta as vantagens de que uma excelente capacidade de ligação à IgE é exibida em comparação a um agente terapêutico convencional contendo um anticorpo anti-IgE e menos efeitos colaterais são exibidos, devido à falta de funções de ADCC e CDC. Assim, a proteína dimérica pode ser aplicada a um produto médico para tratar ou prevenir uma doença alérgica mediada por IgE.
Description
[001]A presente invenção refere-se aos receptores de IgE Fc modificados e aos usos dos mesmos.
[002]As doenças alérgicas, tais como rinite alérgica, dermatite atópica e alergia alimentar, incluindo asma, estão se espalhando em uma alta taxa em sociedades modernas industrializadas e ocidentalizadas, e o desenvolvimento de anafilaxia, uma doença alérgica grave, também está aumentando. Estas doenças imunes crônicas prejudicam severamente a qualidade de vida dos indivíduos e os custos socioeconômicos estão, consequentemente, aumentando. assim, há uma necessidade desesperada quanto às medidas para superar tais doenças.
[003]A maioria das doenças alérgicas é causada por uma resposta imune excessiva de imunoglobulina E (IgE). IgE é um anticorpo que está presente no soro em uma concentração muito baixa sob uma condição normal. A IgE também é usualmente produzida por antígenos inócuos. Há um caso em que o número de IgE é aumentado sem qualquer estímulo particular. Tal caso pode levar às doenças alérgicas. O número anormalmente aumentado de IgE pode se ligar aos receptores de IgE Fc de alta afinidade (FεRIs) que são expressados sobre a superfície de mastócitos, basófilos e semelhantes. Tal ligação faz com que os mastócitos ou basófilos liberem mediadores químicos, tais como histamina, leucotrieno, prostaglandina, bradicinina e fatores de ativação de plaquetas. A liberação destes mediadores químicos resulta em sintomas alérgicos. Em particular, as doenças alérgicas podem exibir sintomas agravados, devido à ligação entre IgE e FcεRI.
Sabe-se que as células que expressam FcεRI aumentam em pacientes alérgicos.
[004]Correntemente, vários métodos, tais como prevenção de alérgenos, administração de fármacos antialérgicos, modulação da síntese de IgE no corpo e desenvolvimento de anticorpos anti-IgE, foram propostos para tratar doenças alérgicas. Entretanto, métodos terapêuticos conhecidos até o momento apresentam muitas drawbacks, tais como incapacidade de curar uma causa subjacente de alergia, eficácia insuficiente do fármaco e ocorrência de efeitos colaterais graves.
[005]Além disso, composições de imunoglobulina capazes de se ligar a IgE e a FcγRIIb com alta afinidade e inibir células que expressam IgE foram estudadas (KR10-1783272B1). Foi relatado que tais composições são úteis para tratar transtornos mediados por IgE, incluindo alergia e asma. Além disso, omalizumabe (nome comercial: Xolair), que alveja uma porção Fc de um anticorpo IgE, foi desenvolvido e usado como um agente terapêutico para asma grave intratável e urticária intratável.
[006]Entretanto, uma administração de alta dose de omalizumabe para manter efeitos terapêuticos leva a um alto custo e efeitos colaterais, tais como angioedema e reação anafilática (The Journal of Clinical Investigation Volume 99, Número 5, Março 1997, 915 a 925). Além disso, a partir dos resultados pós- comercialização, vasculite granulomatosa alérgica e trombocitopenia grave idiopática foram relatadas. Consequentemente, há uma necessidade crescente quanto ao desenvolvimento de agentes terapêuticos capazes de tratar eficazmente doenças alérgicas sem efeitos colaterais.
[007]Um objetivo da presente invenção é fornecer uma proteína dimérica polipeptídica para tratar uma doença alérgica mediada por IgE. Outro objetivo da presente invenção é fornecer uma molécula de ácido nucleico que codifica a proteína, um vetor de expressão contendo a molécula de ácido nucleico e uma célula hospedeira contendo o vetor de expressão. Ainda outro objetivo da presente invenção é fornecer um método para preparar o dímero polipeptídico.
[008]De modo a obter os objetivos acima, é fornecido um dímero polipeptídico, compreendendo dois monômeros, cada um dos quais contém um domínio extracelular de uma subunidade alfa de um receptor de IgE Fc. O monômero contém uma região Fc modificada e a região Fc modificada e o domínio extracelular da subunidade alfa do receptor de IgE Fc são ligados por intermédio de uma dobradiça de um anticorpo IgD. Em outro aspecto, é fornecida uma composição farmacêutica para tratar ou prevenir uma doença alérgica, compreendendo o dímero polipeptídico como um ingrediente ativo.
[009]A proteína dimérica polipeptídica, de acordo com a presente invenção, não apenas apresenta segurança e persistência excelentes no corpo em comparação aos anticorpos anti-IgE convencionalmente usados, mas, também, se liga à IgE muito fortemente, devido a uma capacidade de ligação à IgE que é 70 vezes maior do que o anticorpo anti-IgE convencionalmente usado, omalizumabe, que permite um ciclo de administração prolongado. Além disso, a proteína dimérica polipeptídica, de acordo com a presente invenção, é uma substância obtida por meio da aplicação de uma Fc modificada, que apresenta IgE sozinha como um alvo único e não se liga a um receptor Fc gama e, assim, é desprovida de funções de citotoxicidade celular dependente do anticorpo (ADCC) e citotoxicidade dependente do complemento (CDC). Portanto, ao contrário dos anticorpos anti-IgE convencionais contendo uma região Fc de IgG1, a proteína dimérica polipeptídica não se liga a um receptor Fc gama e, assim, pode inibir a liberação de mediadores causados por estarem ligados ao receptor Fc gama sobre a superfície de mastócitos, de modo que efeitos colaterais graves, tais como ocorrência de anafilaxia que pode ser causada por ligação entre IgG1 e o receptor Fc gama III em mastócitos, podem ser minimizados. Portanto, a proteína dimérica polipeptídica, de acordo com a presente invenção, pode ser utilizada como uma nova composição farmacêutica que pode substituir agentes terapêuticos contendo um anticorpo anti-IgE convencional.
[010]A FIG. 1 mostra resultados de SDS-PAGE e focalização isoelétrica em gel (IEF) para proteínas produzidas em cada linhagem celular. Neste relatório, pode ser observado que uma forma truncada não é gerada em condições de redução e não redução e que um teor de proteínas ácidas é aumentado, devido a um aumento no teor de ácido siálico causado pela introdução de um gene de ácido siálico transferase.
[011]A FIG. 2 ilustra os resultados de SDS-PAGE para formas não reduzidas e reduzidas da proteína dimérica polipeptídica, de acordo com uma forma de realização da presente invenção. Em particular, pode ser observado que o dímero polipeptídico apresenta alta pureza mesmo no sobrenadante de cultura que corresponde ao Input.
[012]A FIG. 3 ilustra um gráfico que mostra uma capacidade de ligação de omalizumabe à IgE. O gráfico mostra os resultados obtidos por meio da imobilização de omalizumabe e análise de sua capacidade de ligação, dependendo das concentrações de IgE tratadas.
[013]A FIG. 4 ilustra um gráfico que mostra uma capacidade de ligação, à IgE, da proteína dimérica polipeptídica, de acordo com uma forma de realização da presente invenção. O gráfico mostra os resultados obtidos por meio da imobilização da proteína dimérica e análise de sua capacidade de ligação, dependendo das concentrações de IgE tratada.
[014]A FIG. 5 ilustra resultados obtidos por meio da identificação de interações da proteína dimérica polipeptídica (IgETRAP), uma forma de realização da presente invenção, e omalizumabe com receptores de IgG FcγRI (FIG. 5A), FcγRIIA
(FIG. 5B), FcγRIIB (FIG. 5C), FcγRIIIA (FIG. 5D) e FcγRIIIB (FIG. 5E) por ensaio de interferometria de biocamada (BLI).
[015]A FIG. 6 ilustra um gráfico obtido por meio da quantificação de uma capacidade de ligação entre IgETRAP e receptores de IgG e entre omalizumabe e receptores de IgG.
[016]A FIG. 7 ilustra um gráfico que mostra uma capacidade inibitória, na atividade de mastócitos derivados de camundongo, da proteína dimérica polipeptídica (IgETRAP), de acordo com uma forma de realização da presente invenção, dependendo de suas concentrações.
[017]A FIG. 8 ilustra um gráfico que mostra uma comparação entre as capacidades inibitórias, na atividade de mastócitos derivados de camundongo que expressam FcεRI humanos, da proteína dimérica polipeptídica (IgE TRAP), de acordo com uma forma de realização da presente invenção, e Xolair (omalizumabe), dependendo de suas concentrações.
[018]A FIG. 9 ilustra um gráfico que mostra os efeitos de administração da proteína dimérica polipeptídica, de acordo com uma forma de realização da presente invenção, em um modelo de alergia alimentar.
[019]A presente invenção refere-se a um dímero polipeptídico, compreendendo dois monômeros, cada um dos quais contém um domínio extracelular (FcεRIa-ECD) de uma subunidade alfa de um receptor de IgE Fc, em que o monômero contém uma região Fc modificada e a região Fc modificada e o FcεRIa-ECD são ligados por intermédio de uma dobradiça de um anticorpo IgD.
[020]Conforme usado neste relatório, o termo “IgE” significa uma proteína de anticorpo conhecida como imunoglobulina E. A IgE apresenta uma afinidade para mastócitos, basófilos do sangue ou semelhantes. Além disso, a reação entre um anticorpo IgE e um antígeno (alérgeno) correspondente ao mesmo causa uma reação inflamatória. Além disso, sabe-se que a IgE é um anticorpo que causa anafilaxia que ocorre, devido à secreção repentina de mastócitos ou basófilos.
[021]Conforme usado neste relatório, o termo “receptor de IgE Fc” também é referido como receptor de Fcε e se liga a uma porção Fc de IgE. Existem dois tipos para o receptor. O receptor que apresenta alta afinidade à IgE Fc é chamado receptor de Fcε I (FcεRI). O receptor que apresenta baixa afinidade para IgE Fc é chamado receptor de Fcε II (FcεRII). FcεRI é expressado em mastócitos e basófilos.
Em um caso em que os anticorpos IgE ligados a FcεRI são reticulados por antígenos polivalentes, a desgranulação ocorre em mastócitos ou basófilos, desse modo, liberando várias substâncias transmissoras químicas, incluindo histamina. Esta liberação leva a uma reação alérgica imediata.
[022]O FcεRI é uma proteína de membrana composta de uma cadeia α, uma cadeia β e duas cadeias γ ligadas por uma ligação dissulfeto. Entre estas cadeias, uma porção a qual IgE se liga é a cadeia α (FcεRIα). FcεRIα apresenta um tamanho de cerca de 60 kDa e é composto de um domínio hidrofóbico existente dentro da membrana celular e um domínio hidrofílico existente fora da membrana celular. Em particular, IgE se liga a um domínio extracelular da cadeia α.
[023]Especificamente, a subunidade alfa do receptor de IgE Fc pode apresentar a sequência de aminoácidos apresentada em NP_001992,1. Além disso, o domínio extracelular (FcεRIa-ECD) da subunidade alfa do receptor de IgE Fc pode apresentar a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1. No presente relatório descritivo, o domínio extracelular da subunidade alfa do receptor de IgE Fc pode ser um fragmento ou variante do domínio extracelular da subunidade alfa do receptor de IgE Fc, contanto que o fragmento ou variante seja capaz de se ligar à IgE.
[024]A variante pode ser preparada através de um método de substituição, deleção ou adição de uma ou mais proteínas no FcεRIa-ECD do tipo selvagem (domínio extracelular), contanto que o método não altere uma função da cadeia α de
FcεRI. Tais várias proteínas ou peptídeos podem ser 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou mais idênticas à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1. Além disso, o FcεRIa-ECD da SEQ ID NO: 1 pode ser codificado por um polinucleotídeo que apresenta a sequência da SEQ ID NO: 5.
[025]Além disso, conforme usado neste relatório, o termo “região Fc modificada” significa uma região em que uma parte de uma porção Fc de um anticorpo foi modificada. Neste relatório, o termo “região Fc” refere-se a uma proteína que contém região constante de cadeia pesada 2 (CH2) e região constante de cadeia pesada 3 (CH3) de uma imunoglobulina e não contém regiões variáveis de cadeias pesadas e leves e região constante de cadeia leve 1 (CH1) de uma imunoglobulina. Em particular, a região Fc modificada significa uma região obtida por meio da substituição de alguns aminoácidos na região Fc ou por combinação de tipos diferentes de regiões Fc. Especificamente, a região Fc modificada pode apresentar a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2. Além disso, a região Fc modificada da SEQ ID NO: 2 pode ser codificada por um polinucleotídeo que apresenta a sequência da SEQ ID NO: 6.
[026]Além disso, a “região Fc modificada” da presente invenção pode apresentar cadeias de açúcar em uma forma nativa, cadeias de açúcar aumentadas em relação a uma forma nativa ou cadeias de açúcar diminuídas em relação a uma forma nativa, ou pode ser na forma of sendo açúcar cadeia-removido.
Imunoglobulina Fc cadeias de açúcar podem ser modificadas por métodos convencionais, tais como métodos químicos, métodos enzimáticos e métodos de engenharia genética usando micro-organismos.
[027]Neste relatório, a “região Fc modificada” da presente invenção pode ser uma região que é desprovida de funções de citotoxicidade celular dependente do anticorpo (ADCC) e citotoxicidade dependente do complemento (CDC), devido a não apresentar um sítio de ligação para FcγR ou C1q. Além disso, a região Fc modificada e o FcεRIα-ECD podem ser ligados por intermédio de uma dobradiça de um anticorpo IgD. A dobradiça do anticorpo IgD é composta de 64 aminoácidos e pode conter seletivamente 20 a 60 aminoácidos consecutivos, 25 a 50 aminoácidos consecutivos ou 30 a 40 aminoácidos. Em uma forma de realização, a dobradiça do anticorpo IgD pode ser composta de 30 ou 49 aminoácidos, conforme mostrado abaixo. Além disso, a dobradiça do anticorpo IgD pode ser uma variante de dobradiça obtida por meio da modificação da região da dobradiça, em que a dobradiça pode conter pelo menos uma cisteína. Neste relatório, a variante de dobradiça pode ser obtida por meio da modificação de some em uma dobradiça sequência do anticorpo IgD, de modo a minimizar a geração de formas truncadas durante um processo de produção de proteína.
[028]Em uma forma de realização, a dobradiça pode conter a seguinte sequência:
[029]Arg Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Xaa1 Xaa2 Lys Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro (SEQ ID NO: 17), onde Xaa1 pode ser Lys ou Gly e Xaa2 pode ser Glu, Gly ou Ser. Especificamente, a dobradiça pode apresentar a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3 ou da SEQ ID NO: 19, desse modo, minimizando a geração de formas truncadas durante um processo de produção de proteína.
[030]Em outra forma de realização, a dobradiça pode conter a seguinte sequência:
[031]Ala Gln Pro Gln Ala Glu Gly Ser Leu Ala Lys Ala Thr Thr Ala Pro Ala Thr Thr Arg Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Xaa3 Xaa4 Lys Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro (SEQ ID NO: 18), onde Xaa3 pode ser Lys ou Gly e Xaa4 pode ser Glu, Gly ou Ser. Especificamente, a dobradiça pode apresentar a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 4, desse modo, minimizando a geração de formas truncadas durante um processo de produção de proteína.
[032]Em particular, na dobradiça que apresenta a sequência da SEQ ID NO: 4, pelo menos uma entre Thr’s pode ser glicosilada. Especificamente, entre os aminoácidos da SEQ ID NO: 18, a 13a, 14a, 18a ou 19a Thr’s podem ser glicosiladas.
Preferivelmente, todos os quatro aminoácidos podem ser glicosilados. Neste relatório, a glicosilação pode ser O-glicosilação.
[033]Além disso, conforme descrito acima, o dímero polipeptídico fornecido pela presente invenção pode estar em uma forma em que dois monômeros são ligados entre si e cada monômero é obtido por ligação entre um domínio extracelular de uma subunidade alfa de um receptor de IgE Fc e uma região Fc modificada. O dímero polipeptídico pode estar em uma forma em que os mesmos dois monômeros são ligados entre si por cisteína localizada em um sítio da dobradiça. Além disso, o dímero polipeptídico pode estar em uma forma em que dois monômeros diferentes são ligados entre si. Por exemplo, em um caso em que os dois monômeros são diferentes um do outro, o dímero polipeptídico pode estar em uma forma em que um monômero contém o domínio extracelular da subunidade alfa do receptor de IgE Fc e o outro monômero contém um fragmento do domínio extracelular da subunidade alfa do receptor de IgE Fc. Neste relatório, uma forma de realização do monômero pode apresentar a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, ou SEQ ID NO: 22.
[034]Além disso, o dímero polipeptídico fornecido pela presente invenção exibe uma capacidade de ligação à IgE que é 10 a 100 vezes, 20 a 90 vezes, 20 a 70 vezes, 30 a 70 vezes ou 40 a 70 vezes maior do que aquela de omalizumabe, um anticorpo anti-IgE, e pode, preferivelmente, exibir uma capacidade de ligação à IgE que é 70 vezes maior do que aquela de omalizumabe.
[035]Ainda em outro aspecto da invenção, é fornecido um polinucleotídeo que codifica um monômero que contém um domínio extracelular de uma subunidade alfa de um receptor de IgE Fc a qual uma região Fc modificada é ligada.
[036]Por enquanto, o polinucleotídeo pode conter adicionalmente uma sequência sinal ou uma sequência líder. Conforme usado neste relatório, o termo “sequência sinal” significa um ácido nucleico que codifica um peptídeo sinal que direciona a secreção de uma proteína alvo. O peptídeo sinal é traduzido e depois clivado em uma célula hospedeira. Especificamente, a sequência sinal da presente invenção é um nucleotídeo que codifica uma sequência de aminoácidos que inicia a translocação da proteína através da membrana do retículo endoplasmático (ER).
Sequências sinais úteis na presente invenção incluem sequências sinais da cadeia leve do anticorpo, por exemplo, anticorpo 14,18 (Gillies et al., J. Immunol. Meth 1989.
125:191 a 202), sequências sinais da cadeia pesada do anticorpo, por exemplo, a MOPC141 sequência sinal da cadeia pesada do anticorpo (Sakano et al., Nature,
1980. 286:676 a 683), e outras sequências sinais conhecidas na técnica (veja, por exemplo, Watson et al., Nucleic Acid Research, 1984. 12:5145 a 5164).
[037]As sequências sinais são bem conhecidas na técnica quanto às suas características. As sequências sinais tipicamente contêm 16 a 30 resíduos de aminoácidos e podem conter mais ou menos resíduos de aminoácidos. Um peptídeo sinal típico consiste de três regiões que são uma região N-terminal básica, uma região hidrofóbica central e uma região C-terminal mais polar. A região hidrofóbica central contém 4 a 12 resíduos hidrofóbicos que imobilizam a sequência sinal através da bicamada lipídica da membrana durante a translocação de um polipeptídeo imaturo.
[038]Depois da iniciação, uma sequência sinal é clivada no lúmen de ER por enzimas celulares comumente conhecidas como peptidases sinais. Neste relatório, a sequência sinal pode ser uma sequência sinal secretora para o ativador de plasminogênio tecidual (tPA), glicoproteína D do vírus do herpes simples (HSV gD), ou hormônio do crescimento. Preferivelmente, sequências sinais secretoras usadas em células eucarióticas superiores, incluindo mamíferos e semelhantes, podem ser usadas. Além disso, a sequência sinal secretora pode ser substituída por um códon que apresenta uma alta frequência de expressão em uma célula hospedeira e usada.
[039]Por enquanto, o monômero de domínio extracelular da subunidade alfa do receptor de IgE Fc ao qual uma sequência sinal e uma região Fc modificada são ligadas, pode apresentar a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11 ou SEQ ID NO: 13. As proteínas da SEQ ID NO: 11 e SEQ ID NO: 13 podem ser codificadas por polinucleotídeos que apresentam as sequências da SEQ ID NO: 12 e SEQ ID NO: 14, respectivamente.
[040]Ainda em outro aspecto da presente invenção, é fornecido um vetor de expressão carregado com um polinucleotídeo que codifica o monômero. Neste relatório, o polinucleotídeo pode apresentar a sequência da SEQ ID NO: 12 ou SEQ ID NO: 14.
[041]Conforme usado neste relatório, o termo “vetor” pretende ser introduzido em uma célula hospedeira e ser capaz de ser recombinado com um genoma de célula hospedeira e inserido no mesmo. Alternativamente, o vetor é um epissoma e é entendido como uma unidade de ácido nucleico contendo uma sequência de nucleotídeos que pode ser autonomamente replicada. Os vetores incluem ácidos nucleicos lineares, plasmídeos, fagemídeos, cosmídeos, vetores de RNA, vetores virais e análogos dos mesmos. Exemplos dos vetores virais incluem, mas não são limitados aos retrovírus, adenovírus e vírus adeno-associados. Além disso, os plasmídeos podem conter um marcador selecionável, tal como um gene resistente ao antibiótico, e células hospedeiras que abrigam os plasmídeos podem ser cultivadas sob condições seletivas.
[042]Conforme usado neste relatório, o termo “expressão genética” ou “expressão” de uma proteína alvo é entendida como uma transcrição de uma sequência de DNA, tradução de um transcrito de mRNA e secreção de um produto de proteína de fusão ou um fragmento do mesmo. Um vetor de expressão útil pode ser RcCMV (Invitrogen, Carlsbad) ou uma variante do mesmo. O vetor de expressão pode conter o promotor do citomegalovírus (CMV) humano para promover a transcrição contínua de um gene alvo em células de mamíferos, e uma sequência sinal de poliadenilação do hormônio do crescimento bovino para aumentar um nível de estabilidade do RNA depois da transcrição.
[043]Ainda em outro aspecto da presente invenção, é fornecida uma célula hospedeira em que o vetor de expressão é introduzido. Conforme usado neste relatório, o termo “célula hospedeira” refere-se a uma célula procariótica ou eucariótica em que um vetor de expressão recombinante pode ser introduzido.
Conforme usado neste relatório, os termos “transduzido”, “transformado” e “transfectado” significam a introdução de um ácido nucleico (por exemplo, um vetor) em uma célula usando técnicas conhecidas no ramo.
[044]Células hospedeiras preferidas que podem ser usadas na presente invenção incluem células de hibridoma imortais, células de mieloma NS/0, células 293, células de ovário de hamster Chinês (células CHO), células HeLa, células derivadas de líquido amniótico humano (células CapT) ou células COS.
Preferivelmente, as células hospedeiras podem ser células CHO. Por outro lado, a célula hospedeira pode ser aquela em que o vetor e um vetor carregado com um gene de ácido siálico transferase são introduzidos. Neste relatório, a ácido siálico transferase pode ser 2,3-ácido siálico transferase ou 2,6-ácido siálico transferase.
Neste relatório, a 2,6-ácido siálico transferase pode apresentar a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 15.
[045]Ainda em outro aspecto da presente invenção, é fornecida uma composição farmacêutica para tratar ou prevenir uma doença alérgica, compreendendo o dímero polipeptídico como um ingrediente ativo.
[046]No presente relatório descritivo, o termo “doença alérgica” significa um sintoma patológico causado por uma reação alérgica mediada pela ativação de mastócitos, tal como desgranulação de mastócitos. Tais doenças alérgicas incluem alergia alimentar, dermatite atópica, asma, rinite alérgica, conjuntivite alérgica, dermatite alérgica, dermatite de contato alérgica, anafilaxia, urticária, prurido, alergia a insetos, urticária idiopática crônica, alergia a fármacos e semelhantes. Em particular, as doenças alérgicas podem ser mediadas por IgE.
[047]Na composição para tratar ou prevenir doença alérgica da presente invenção, um ingrediente ativo pode estar contido em qualquer quantidade (quantidade eficaz) dependendo do uso, formulação, propósito da mistura e semelhantes, contanto que o ingrediente ativo possa exibir atividade antialérgica.
Uma quantidade eficaz típica do ingrediente ativo será determinada dentro de uma faixa de 0,001 % em peso a 20,0 % em peso com base em um peso total da composição. Neste relatório, “quantidade eficaz” refere-se a uma quantidade de um ingrediente ativo que é capaz de induzir um efeito antialérgico. Tal quantidade eficaz pode ser determinada experimentalmente dentro dos conhecimentos dos técnicos no assunto.
[048]Neste relatório, a composição farmacêutica pode ainda conter um portador farmaceuticamente aceitável. Para o portador farmaceuticamente aceitável, qualquer portador pode ser usado, contanto que o portador seja uma substância não tóxica adequada para a liberação a um paciente. Água destilada, álcool, gordura, cera e um sólido inerte podem estar contidos como portadores. Adjuvantes farmaceuticamente aceitáveis (tampões e dispersantes) também podem estar contidos na composição farmaceuticamente aceitável.
[049]Especificamente, a composição farmacêutica da presente invenção contém, além de um ingrediente ativo, um portador farmaceuticamente aceitável, e pode ser preparada em uma formulação oral ou parenteral, dependendo de uma via de administração por um método convencional conhecido na técnica. Neste relatório,
o termo “farmaceuticamente aceitável” significa não ter mais toxicidade do que um indivíduo a ser aplicado (prescrito) pode acomodar sem inibir a atividade do ingrediente ativo.
[050]Em um caso em que a composição farmacêutica da presente invenção é preparada em uma formulação oral, a composição farmacêutica pode ser preparada em formulações, tais como pós, grânulos, tabletes, pílulas, tabletes com revestimento de açúcar, cápsulas, líquidos, géis, xaropes, suspensões e envoltórios, juntamente com portadores adequados, de acordo com métodos conhecidos na técnica. Neste relatório, exemplos de portadores farmaceuticamente aceitáveis adequados podem incluir açúcares, tais como lactose, glicose, sacarose, dextrose, sorbitol, manitol e xilitol, amidos, tais como amido de milho, amido de batata e amido de trigo, celuloses, tais como celulose, metilcelulose, etilcelulose, carboximetil celulose de sódio e hidroxipropilmetil celulose, polivinilpirrolidona, água, metilhidroxibenzoato, propilhidroxibenzoato, estearato de magnésio, óleo mineral, malte, gelatina, talco, poliol, óleo vegetal e semelhantes. Em um caso de fabricação, as preparações podem ser realizadas, conforme necessário, incluindo diluentes e/ou excipientes, tais como um enchedor, um extensor, um aglutinante, um agente umectante, um desintegrante e um tensoativo.
[051]Em um caso em que a composição farmacêutica da presente invenção é preparada em uma formulação parenteral, a composição farmacêutica pode ser preparada na forma de injeções, fármacos transdérmicos, inaladores nasais e supositórios, juntamente com portadores adequados, de acordo com métodos conhecidos na técnica. Em um caso de preparação em injeções, água esterilizada, etanol, poliol, tal como glicerol e propileno glicol, ou uma mistura dos mesmos, podem ser usados como um portador adequado. Para o portador, soluções isotônicas, tais como solução de Ringer, solução salina tamponada com fosfato (PBS) contendo trietanolamina, água estéril para injeção e dextrose 5 %, e semelhantes podem ser preferivelmente usadas.
[052]A preparação da composição farmacêutica é conhecida na técnica e, especificamente, referência pode ser feita a Remington's Pharmaceutical Sciences (19a ed., 1995) e semelhantes. O documento é considerado parte do presente relatório descritivo.
[053]Uma dosagem diária preferível da composição farmacêutica da presente invenção varia de 0,01 ug/kg a 10 g/kg, e, preferivelmente, de 0,01 mg/kg a 1 g/kg, dependendo da condição do paciente, peso corpóreo, sexo, idade, gravidade da doença ou via de administração. A administração pode ser realizada uma ou várias vezes ao dia. Tal dosagem não deve, de forma alguma, ser interpretada como limitante do escopo da presente invenção.
[054]O indivíduo ao qual a composição da presente invenção pode ser aplicada (prescrita) é um mamífero e um ser humano, com um ser humano particularmente preferido. A composição para anti-alérgicos da presente invenção pode ainda compreender, além do ingrediente ativo, qualquer composto ou extrato natural, sobre o qual a segurança já foi verificada e que é conhecido por apresentar atividade antialérgica, para o propósito de aumentar e reforçar a atividade antialérgica.
[055]Em outro aspecto da presente invenção, é fornecida uma composição alimentar para melhorar e aliviar um sintoma alérgico, compreendendo o dímero polipeptídico como um ingrediente ativo.
[056]Neste relatório, o dímero polipeptídico pode ser ligado a uma unidade de liberação apropriada para a liberação eficaz nos intestinos. A composição alimentar da presente invenção pode ser preparada em qualquer forma e pode ser, por exemplo, preparada na forma de bebidas, tais como chá, suco, bebida carbonatada e bebida iônica, produtos lácteos processados, tais como leite e iogurte, preparações alimentares funcionais para a saúde, tais como tabletes, cápsulas,
pílulas, grânulos, líquidos, pós, flocos, pastas, xaropes, géis, geleias e barras ou semelhantes. Além disso, a composição alimentar da presente invenção pode se enquadrar em qualquer categoria de produto na classificação legal ou funcional, contanto que a composição alimentar esteja em conformidade com os regulamentos de execução no momento de ser fabricada e distribuída. Por exemplo, a composição alimentar pode ser um alimento funcional para a saúde, de acordo com a Lei de Alimentos Funcionais para Saúde, ou pode se enquadrar na confeitaria, feijões, chás, bebidas, alimentos para fins especiais ou semelhantes, de acordo com cada tipo alimentar no Código de Alimentos da Lei de Saneamento de Alimentos (padrões e especificações para alimentos, notificadas pela Food and Drug Administration). Com respeito a outros aditivos alimentares que podem estar contidos na composição alimentar da presente invenção, referência pode ser feita ao Código de Alimentos ou ao Código de Aditivos Alimentares, de acordo com a Lei de Saneamento de Alimentos.
[057]Ainda em um outro aspecto da presente invenção, é fornecido um método para produzir um dímero polipeptídico, compreendendo uma etapa de cultivar uma célula hospedeira na qual um polinucleotídeo que codifica um monômero e um gene de ácido siálico transferase foram introduzidos; e uma etapa de recuperar um dímero polipeptídico.
[058]Neste relatório, o polinucleotídeo que codifica o monômero pode ser introduzido na célula hospedeira na forma de ser carregado em um vetor de expressão. Além disso, o gene de ácido siálico transferase pode ser introduzido na célula hospedeira na forma de ser carregado em um vetor.
[059]Primeiro, uma etapa de introduzir, em uma célula hospedeira, um vetor carregado com um polinucleotídeo que codifica um monômero e um vetor carregado com um gene de ácido siálico transferase é realizada. Neste relatório, a ácido siálico transferase pode ser 2,3-ácido siálico transferase ou 2,6-ácido siálico transferase.
[060]Em seguida, uma etapa de cultivar a célula transformada é realizada.
[061]Finalmente, uma etapa de recuperar um dímero polipeptídico é realizada. Neste relatório, o dímero polipeptídico pode ser purificado a partir de um meio de cultura ou de um extrato celular. Por exemplo, depois de obter o sobrenadante de um meio de cultura no qual o dímero polipeptídico é secretado, o sobrenadante pode ser concentrado usando um filtro de concentração de proteínas comercialmente disponível, por exemplo, uma unidade de ultrafiltração Amicon ou Millipore Pellicon. Então, o concentrado pode ser purificado por métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, a purificação pode ser obtida usando uma matriz acoplada à proteína A.
[062]Ainda em outro aspecto da presente invenção, é fornecido um dímero polipeptídico produzido pelo método descrito acima para produzir um dímero.
[063]Neste relatório, o dímero polipeptídico apresenta um teor alto de ácido siálico, e, assim, apresenta um teor muito alto de proteínas ácidas em relação ao valor pI teórico.
[064]Ainda em outro aspecto da presente invenção, é fornecida uma composição farmacêutica para tratar ou prevenir uma doença alérgica, compreendendo, como um ingrediente ativo, o dímero polipeptídico produzido pelo método descrito acima para produzir um dímero.
[065]Ainda em outro aspecto da presente invenção, é fornecida uma composição alimentar para melhorar ou aliviar um sintoma alérgico compreendendo, como um ingrediente ativo, o dímero polipeptídico produzido pelo método descrito acima para produzir um dímero.
[066]Ainda em outro aspecto da presente invenção, é fornecido um método para tratar ou prevenir uma doença alérgica, compreendendo uma etapa de administrar a um indivíduo um dímero polipeptídico que contém dois monômeros, cada um dos quais contém o domínio extracelular (FcεRIa-ECD) da subunidade alfa do receptor de IgE Fc.
[067]O indivíduo pode ser um mamífero, preferivelmente, um ser humano.
Neste relatório, a administração pode ser oral ou parenteralmente obtida. Neste relatório, a administração parenteral pode ser realizada por métodos, tais como administração subcutânea, administração intravenosa, administração mucosal e administração muscular.
[068]Em seguida, a presente invenção será descrita em mais detalhes com referência aos exemplos seguintes. Entretanto, os exemplos seguintes se destinam a ilustrar meramente a presente invenção e o escopo da presente invenção não é limitado apenas aos mesmos.
Exemplo 1. Preparação de polipeptídeo contendo FcεRIα-ECD e região Fc modificada
[069]Um polipeptídeo modificado C-terminal do domínio extracelular (FcεRIα-ECD) da subunidade alfa do receptor de IgE Fc foi preparado, de acordo com o método divulgado na Patente U.S. No 7.867.491.
[070]Primeiro, de modo a expressar uma proteína (FcεRIαECD-Fc1), uma proteína (FcεRIαECD-Fc2) e uma proteína (FcεR1αECD-Fc3), em que o domínio extracelular da cadeia α de FcεRI que apresenta a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1 e a Fc da imunoglobulina modificada da SEQ ID NO: 2 são ligados por intermédio de uma dobradiça de SEQ ID NO: 19, de uma dobradiça da SEQ ID NO: 3 e de uma dobradiça da SEQ ID NO: 4, respectivamente, cassetes obtidos pela ligação do gene que codifica cada proteína foram clonados nos vetores pAD15 (Genexin, Inc.) para construir os vetores de expressão da proteína FcεRIαECD-Fc.
Depois, cada um dos vetores de expressão foi transduzido em células CHO DG44 (a partir do Dr. Chasin, Columbia University, USA).
[071]Neste relatório, no momento da transdução na linhagem celular, um vetor de expressão obtido por meio da clonagem de um gene de α-2,6-ácido siálico transferase no vetor pCI Hygro (Invitrogen) foi simultaneamente transduzido para preparar separadamente as linhagens celulares que são capazes de expressar as proteínas FcεRIαECD-Fc2ST e FcεRIα ECD-Fc3ST às quais o ácido siálico é adicionado.
[072]Como um procedimento de triagem primário, a seleção de HT foi realizada usando meio dFBS 10 % livre de 5-hidroxitriptamina (HT) (Gibco, USA, 30067-334), meio MEMα (Gibco, 12561, USA, Cat No 12561-049) e meio HT+ (Gibco, USA, 11067-030). Depois, a amplificação por metotrexato (MTX) foi realizada usando clones selecionados por HT para amplificar a produtividade usando o sistema di-hidrofolato redutase (DHFR).
[073]Depois da conclusão da amplificação de MTX, a subcultura foi realizada cerca de 1 a 5 vezes para estabilização celular para o propósito de avaliação de produtividade. Posteriormente, a avaliação da produtividade unitária das células amplificadas por MTX foi realizada. Os resultados são mostrados na Tabela 1 abaixo.
Tabela 1 Versão Meio Concentração Produtividade de MTX Cultura de 3 dias Cultura em lote ug/mL ug/106células (mg/ml) FcεRIαECD-Fc2 Ex- 500 nM 37,23 20,9 225 FcεRIαECD-Fc2 cellDHFR 100 nM 45,4 25,1 338,2 + a2,6-ST FcεRIαECD-Fc3 2 uM 27,0 16,9 180,4 FcεRIαECD-Fc3 1 uM 17,5 10,2 101,7 + a2,6-ST
[074]Conforme mostrado na Tabela 1, a linhagem celular FcεRIαECD-Fc3 exibiu produtividade de 16,9 ug/106 células depois da amplificação por metotrexato em 2 uM. Por outro lado, a linhagem celular FcεRIαECD-Fc3 (FcεRIαECD-Fc3ST) cotransduzida com 2,6-ácido siálico transferase exibiu produtividade de 17,5 ug/106 células depois da amplificação por metotrexato em 1 uM. Além disso, a linhagem celular FcεRIαECD-Fc2 exibiu produtividade de 20,9 ug/106 células sob a condição de amplificação por metotrexato em 0,5 uM. Além disso, a linhagem celular FcεRIαECD-Fc2 (FcεRIαECD-Fc2ST) cotransduzida com 2,6-ácido siálico transferase exibiu produtividade de 25,1 ug/10 6 células depois da amplificação por metotrexato em 0,1 uM. Isto é, foi identificado que a linhagem celular FcεRIαECD- Fc2 cotransfectada com 2,6-ácido siálico transferase, que foi selecionada sob a condição de amplificação por metotrexato em 0,1 uM, exibiu a produtividade mais excelente.
Exemplo 2. Purificação da proteína de fusão FcεRIα ECD e identificação de pureza da mesma
[075]Entre as linhagens celulares selecionadas no Exemplo 1 acima, i) FcεRIαECD-Fc3, ii) FcεRIαECD-Fc3ST e iii) FcεRIαECD-Fc2ST foram cultivadas em uma escala de 60 ml por um método de cultura em lote. As culturas resultantes foram purificadas usando uma coluna de afinidade com Proteína A e, depois, as proteínas purificadas foram submetidas à SDS-PAGE e HPLC de exclusão por tamanho (SE-HPLC) para identificar a pureza das proteínas.
[076]Conforme mostrado na FIG. 1, foi identificado que todas as proteínas respectivas purificadas pelo método SE-HPLC apresentam pureza de 93 % ou maior.
Além disso, como um resultado da análise de SDS-PAGE, foi identificado que as proteínas que apresentam tamanhos de cerca de 150 kDa e cerca de 75 kDa são detectadas, respectivamente, nas condições de não redução e redução (FIG. 1, Bandas 1 a 6). A partir disto, foi descoberto que a FcεRIαECD ligada à Fc forma um dímero. Além disso, nenhuma impureza, tal como uma forma truncada, foi observada nos resultados de SDS-PAGE. Em particular, mesmo depois do processo de descongelamento/congelamento (FIG. 1, Bandas 7 a 8), foi identificado que todas as proteínas apresentam pureza de 93 % ou maior, e não apresentam impurezas. A partir disto, foi descoberto que a produção de formas de proteína truncada é diminuída em relação à FcεRIαECD-Fc1 à qual a dobradiça de IgD do tipo selvagem foi aplicada.
[077]Neste relatório, Gel-IEF foi realizado sob as seguintes condições de teste para identificar um grau de teor de ácido siálico nas proteínas após a introdução da ácido siálico transferase. A partir disto, foi identificado que um teor de proteínas ácidas é aumentado, devido ao teor de ácido siálico aumentado.
Tabela 2 Condições de Teste Gel gel pH3 a 10 IEF 1,0 mm Tampão de Amostra Tampão de Amostra IEF (2X) Condição de Carregamento 100 V 1 h, 200 V 1 h, 500 V 2 h
[078]De modo a identificar a reprodutibilidade do rendimento de purificação, a linhagem celular FcεRIαECD-Fc2ST foi cultivada em lote em um frasco de 1 L em uma escala de 250 ml e purificada usando uma coluna de afinidade com Proteína A.
Subsequentemente, o sobrenadante de cultura e o produto purificado foram submetidos à condução em um gel TGXTM 4 % a 15 % (Bio-Rad Laboratories, Inc.) durante 30 minutos em uma condição de tampão Tris-Glicina SDS (TGS) e 200 V e, depois, submetidos à análise de SDS PAGE. Como um resultado, foi identificado que não apenas as proteínas com pureza muito alta (98 % ou maior) são purificadas mesmo apenas pela purificação da primeira etapa, mas, também, as proteínas são expressadas com pureza muito alta mesmo no sobrenadante de cultura. Isto indica que as etapas de desenvolvimento do processo podem ser simplificadas no desenvolvimento da proteína FcεRIαECD-Fc, que foi expressada na linhagem celular em questão, em um produto médico, e, como um resultado, é altamente provável que o custo de desenvolvimento do produto médico seja consideravelmente diminuído.
Exemplo 3. Identificação da capacidade de ligação da proteína de fusão FcεRIα ECD à IgE
[079]Uma capacidade de ligação à IgE foi comparativamente medida para as quatro proteínas, i) FcεRIαECD-Fc2, ii) FcεRIαECD-Fc2ST, iii) FcεRIαECD-Fc3 e iv) FcεRIαECD-Fc3ST que foram purificadas através do método do Exemplo 2 acima, e o anticorpo anti-IgE comercialmente disponível, omalizumabe (nome comercial: Xolair). Especificamente, a capacidade de ligação à IgE foi medida revestindo-se IgE no canal do chip sensor de proteína GLC (Bio-Rad Laboratories, Inc., Cat # 176- 5011), e causando omalizumabe ou cada proteína FceR1αECD-Fc em várias concentrações para fluir em uma taxa de 30 μl por minuto.
[080]Os experimentos foram conduzidos por meio da identificação da base zero usando NaOH 25 mM como um tampão de regeneração e, depois, repetição das etapas acima. Posteriormente, uma curva de ligação foi identificada usando um analisador de ligação de proteínas (ProteOn XPR36, Bio-Rad Laboratories, Inc., USA). Os resultados são mostrados na Tabela 3 e FIGS. 3 e 4.
Tabela 3 Itens de Amostras FcεRIa ECD-Fc Omalizumabe Observações Tipo de Fármaco Proteína de fusão Fc Ab Anti-IgE Afinidade ka (taxa de Fc2 2,14 x 105 4,05 x 105 1,9 vezes mais fraco do que de Ligação associação) omalizumabe Fc2ST 2,64 x 105 1,5 vezes mais fraco do que omalizumabe Fc3 1,98 x 105 2,0 vezes mais fraco do que omalizumabe
Fc3ST 2,40 x 105 1,7 vezes mais fraco do que omalizumabe kd (taxa de Fc2 8,29 x 10-5 6,02 x 10-3 73 vezes melhor do que dissociação) omalizumabe Fc2ST 5,69 x 10-5 106 vezes melhor do que omalizumabe Fc3 1,33 x 10-4 45 vezes melhor do que omalizumabe Fc3ST 1,49 x 10-4 40 vezes melhor do que omalizumabe KD (kd/ka) Fc2 3,88 x 10-10 1,49 x 10-8 38 vezes melhor do que omalizumabe Fc2ST 2,16 x 10-10 69 vezes melhor do que omalizumabe Fc3 6,72 x 10-10 22 vezes melhor do que omalizumabe Fc3ST 6,21 x 10-10 24 vezes melhor do que omalizumabe
[081]Conforme mostrado na Tabela 3, o valor da taxa de associação (ka) do dímero polipeptídico, de acordo com uma forma de realização da presente invenção, foi medido para ser 1,5 a 2,0 vezes menor do que aquele de omalizumabe. Isto é, foi descoberto que uma capacidade de ligação do mesmo às substâncias, exceto IgE, é 1,5 a 2,0 vezes menor do que aquela de omalizumabe. Além disso, o valor da taxa de dissociação (kd) do dímero polipeptídico, de acordo com uma forma de realização da presente invenção, foi medido para ser 40 a 106 vezes maior do que aquele de omalizumabe. Além disso, conforme mostrado nas FIGS. 3 e 4, foi possível identificar que omalizumabe perde sua ligação à IgE em um caso em que um determinado período de tempo tenha passado depois da ligação, a passo que, uma vez que o dímero polipeptídico da proteína de fusão FcεRIαECD da presente invenção se liga à IgE, o dímero polipeptídico não é separado da IgE.
[082]Isto é, pode ser observado que o dímero polipeptídico da presente invenção não é facilmente separado da IgE e apresenta uma capacidade muito melhor de manter seu estado ligado do que omalizumabe. Como um resultado, pode ser observado que o dímero polipeptídico, de acordo com uma forma de realização da presente invenção, apresenta um valor de constante de dissociação de equilíbrio (KD <kd/ka>) que é 22 a 69 vezes maior do que aquele de omalizumabe. A partir disto, foi identificado que a proteína de fusão FcεRIαECD da presente invenção apresenta uma capacidade de ligação à IgE consideravelmente aumentada em comparação a omalizumabe. Em particular, foi identificado que a FcεRIαECD-Fc2 (FcεRIαECD-Fc2ST) à qual o ácido siálico é adicionado exibe a capacidade de ligação à IgE mais alta que é 69 vezes maior do que aquela de omalizumabe.
Exemplo 4. Identificação da capacidade de ligação da proteína de fusão FcεRIα ECD ao receptor de IgG
[083]Um grau de ligação of IgETRAP e omalizumabe aos receptores de IgG foi identificado usando o sistema Octet RED384 (ForteBio, CA, USA). As proteínas recombinantes FcγRI, FcγRIIA, FcγRIIB, FcγRIIIA e FcγRIIIB (R & D Systems Inc., 5 μg/ml) foram imobilizadas em tampão acetato 300 mM (pH 5) no biossensor AR2G ativado. Como um tampão de condução, PBS contendo Tween-20 0,1 % e soro bovino 1 % foi usada. Todos os experimentos foram realizados a 30 C com um agitador de placa de amostra em uma taxa de 1,000 rpm. Os resultados são mostrados nas FIGS. 5A a 5E, e as capacidades de ligação de omalizumabe e IgETRAP aos receptores de IgG são quantificadas e mostradas na FIG. 6.
Exemplo 5. Identificação da atividade da proteína de fusão FcεRIα ECD através do ensaio de beta-hexosaminidase em mastócitos derivados da medula óssea de camundongos
[084]O ensaio de beta-hexosaminidase foi realizado para a análise da atividade in vitro da proteína de fusão FcεRIαECD da presente invenção.
Especificamente, a proteína FcεRIαECD-Fc2, de acordo com uma forma de realização da presente invenção, foi misturada, em cada concentração, com IgE de camundongo (1 ug/mL) e incubada na temperatura ambiente (20 C) durante 30 minutos para preparar as amostras. Mastócitos derivados de medula óssea de camundongos na cultura para a ativação de mastócitos foram lavados com tampão solução salina balanceada de Hank (HBSS) para remover o meio, e o número de células foi medido. Depois, um ajuste foi feito, de modo que 5 × 10 5 células foram injetadas em 40 μL de tampão HBSS.
[085]Em seguida, 50 uL da solução de amostra preparada através da pré- incubação foi adicionado aos mastócitos ativados. Em seguida, o produto resultante foi incubado em uma incubadora de CO2 5 % a 37 C durante 30 minutos.
Subsequentemente, depois da adição de cada 10 μL de DNP (2,4-dinitrofenol, 100 ng/mL), que é um antígeno estranho, a incubação foi novamente realizada a 37 C durante 30 minutos em CO2 5 %, e, depois, 30 μL do sobrenadante foi separado. 30 uL do sobrenadante separado e 30 uL do substrato (4-nitrofenil N-acetil-β-D- glucosaminida, 5,84 mM) foram bem misturados e depois incubados a 37 C durante 20 minutos em CO2 5 %. Em seguida, 140 μL de tampão carbonato de sódio 0,1 M (pH 10) como uma solução de parada foram adicionados para terminar a reação.
Posteriormente, a absorvância em 405 nm foi medida para identificar uma quantidade de secreção de β-hexosaminidase secretada pelo antígeno estranho nos mastócitos ativados. Os resultados são mostrados na FIG. 7.
[086]Conforme mostrado na FIG. 7, o dímero polipeptídico de uma forma de realização da presente invenção exibiu uma razão de inibição de mastócitos de cerca de 49,4 % em um caso de ter metade (0,5 ug/mL) da concentração de IgE de camundongo e exibiu uma razão de inibição de mastócitos de cerca de 99,4 % em um caso de ter a mesma concentração (1 ug/mL) de IgE de camundongo. Isto é, pode ser observado que a atividade induzida por IgE de mastócitos derivados da medula óssea é grandemente suprimida pelo dímero polipeptídico FceRIa-ECD da presente invenção.
Exemplo 6. Comparação da atividade da proteína de fusão FcεRIα ECD e anticorpo IgE anti-humano usando ensaio de β-hexosaminidase em mastócitos derivados da medula óssea que expressam FcεRI humanos
[087]O ensaio de β-hexosaminidase foi conduzido para identificar a superioridade da proteína de fusão FcεRIα ECD em relação a Xolair através da análise da atividade in vitro. Os fármacos respectivos, FcεRIαECD-Fc2ST (IgE TRAP) e Xolair, foram preparados em cada concentração, e, depois, misturados com IgE humana (1 ug/mL). Em seguida, a incubação foi realizada na temperatura ambiente durante 30 minutos. Durante a pré-incubação do fármaco, um gene de FcεRI humano foi introduzido e os mastócitos derivados e diferenciados da medula óssea de camundongos, em que o gene de FcεRI de camundongo foi removido, foram preparados. Os mastócitos preparados foram lavados com tampão HBSS e, depois, 5 × 105 células foram injetadas em 60 μL de tampão HBSS. 20 μL da amostra pré- incubada foram adicionados aos mastócitos preparados e, depois, incubados em uma incubadora de CO2 5 % a 37C durante 30 minutos.
[088]Subsequentemente, 20 uL de anticorpo IgE anti-humano (BioLegend, Cat No 325502, 0,5 ug/mL) foram adicionados e depois o produto resultante foi novamente incubado na incubadora de CO2 5 % a 37C durante 30 minutos.
Subsequentemente, depois da centrifugação em 1.500 rpm a 4 C, 30 uL do sobrenadante foi separado. 30 uL do sobrenadante separado e 30 uL do substrato (4-nitrofenil N-acetil-β-glucosaminida, 5,84 mM) foram bem misturados e, depois,
incubados em uma incubadora CO2 5 % a 37C durante 25 minutos. Em seguida, 140 uL de tampão carbonato de sódio 0,1 M (pH 10) foram adicionados para terminar a reação.
[089]Subsequentemente, a absorvância em 405 nm foi medida para comparar quantidades relativas de β-hexosaminidase secretada e um efeito inibitório de massa celular, dependendo de cada concentração de fármaco, foi identificado.
Os resultados são mostrados na FIG. 8. Conforme mostrado na FIG. 8, a IC50 da proteína de fusão FcεRIα ECD foi medida em aproximadamente 11,16 ng/mL e a IC50 da proteína Xolair foi medida em aproximadamente 649,8 ng/mL. Portanto, foi identificado que a proteína de fusão FcεRIα ECD apresenta uma capacidade inibitória 58 vezes maior sobre a atividade de mastócitos do que Xolair.
Exemplo 7. Ensaio in vivo da proteína de fusão FcεRIα ECD (modelo de alergia alimentar)
[090]50 ug de ovalbumina (OVA) e 1 mg de alume foram intraperitonealmente administrados aos camundongos Balb/c (Orientbio Inc.) duas vezes em um intervalo de 14 dias para induzir a sensibilização. Posteriormente, 50 mg de OVA foram oralmente administrados cinco vezes no total nos dias 28, 30, 32, 34, e 36, para induzir alergia alimentar nos intestinos.
[091]Depois que a OVA foi oralmente administrada duas vezes, isto é, no dia 31, os camundongos foram divididos em três grupos, cada um contendo 7 camundongos. Os três grupos divididos foram os seguintes: O primeiro grupo recebeu a proteína de fusão FcεRIαECD-Fc2ST em uma alta concentração (200 ug), o segundo grupo recebeu a proteína de fusão FcεRIαECD-Fc2ST em uma baixa concentração (20 ug), e para o terceiro grupo não houve administração. Durante a administração oral da OVA, foi identificado se ocorreu diarreia, devido à indução de alergia alimentar. Os camundongos foram sacrificados no dia 37 e o número de mastócitos no intestino delgado, a concentração de IgE no sangue e a concentração de enzima (protease-1 de mastócitos (MCPT-1)) com desgranulação de mastócitos no sangue foram analisados para os camundongos pertencentes a cada grupo.
[092]Conforme mostrado na FIG. 9, foi identificado que os camundongos pertencentes ao grupo que recebeu a FcεRIαECD-Fc2ST, que é um dímero polipeptídico, em uma alta concentração, exibiram um efeito de alívio da alergia alimentar em uma maneira dependente da concentração, em comparação aos camundongos pertencentes ao grupo que não recebeu administração.
TEXTO DA LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS SEQ ID NO: 1
KAPREKYWLQ SEQ ID NO: 2
DKSRWQEGNV FSCSVMHEAL HNHYTQKSLS LSLGK SEQ ID NO: 3
SEQ ID NO: 4
AQPQAEGSLA KATTAPATTR NTGRGGEEKK GSKEKEEQEE RETKTPECP SEQ ID NO: 5 gtgccccaga agcccaaggt gagcctgaac cctccctgga acagaatctt caagggcgag aacgtgaccc tgacctgcaa cggcaacaac ttcttcgagg tgagcagcac caagtggttc cacaatggca gcctgagcga ggagaccaac agctccctga acatcgtgaa cgccaagttc gaggacagcg gcgagtacaa gtgccagcac cagcaggtga acgagagcga gcccgtgtac ctggaggtgt tcagcgactg gctgctgctg caggccagcg ccgaggtggt gatggagggc cagcccctgt tcctgagatg ccacggctgg agaaactggg acgtgtacaa ggtgatctac tacaaggatg gcgaggccct gaagtactgg tacgagaacc acaacatctc catcaccaac gccaccgtgg aggacagcgg cacctactac tgcacaggca aggtgtggca gctggactac gagagcgagc ccctgaacat caccgtgatc aaggctccca gagagaagta ctggctgcag SEQ ID NO: 6 tgcgtggtcg tggatgtgag ccaggaagat cccgaagtgc agttcaactg gtacgtggat ggcgtggaag tgcacaacgc caagaccaag cccagagaag agcagttcaa ctccacctac agagtggtga gcgtgctgac cgtgctgcac caggactggc tgaacggcaa ggagtacaag tgcaaggtgt ccaacaaagg cctgcccagc tccatcgaga agaccatcag caaagccaaa ggccagccca gagaacccca ggtgtacacc ctgcctccca gccaggaaga gatgaccaag aaccaggtgt ccctgacctg cctggtgaaa ggcttctacc ccagcgacat cgccgtggag tgggaaagca acggccagcc cgagaacaat tacaagacaa cccctcccgt gctggatagc gatggcagct tctttctgta cagcagactg accgtggaca agagcagatg gcaggaaggc aacgtgttca gctgcagcgt gatgcacgaa gccctgcaca accactacac ccagaagagc ctgtccctga gcctgggcaa g
SEQ ID NO: 7 aggaacaccg gcagaggagg cgaggaaaag aaaggaagca aggagaagga ggagcaggag gaaagagaaa ccaagacccc cgagtgcccc agccacaccc agcccctggg cgtgttcctg ttccccccca agcccaagga caccctgatg atcagcagaa cccccgaggt gacc SEQ ID NO: 8 gcccagcccc aggccgaggg cagcctggct aaggccacca cagctcccgc caccaccagg aacaccggca gaggaggcga ggaaaagaaa ggaagcaagg agaaggagga gcaggaggaa agagaaacca agacccccga gtgccccagc cacacccagc ccctgggcgt gttcctgttc ccccccaagc ccaaggacac cctgatgatc agcagaaccc ccgaggtgac c SEQ ID NO: 9
MDAMLRGLCC VLLLCGAVFV SPSHA SEQ ID NO: 10 atggacgcca tgctgagagg cctgtgctgt gtgctgctgc tgtgcggcgc cgtgttcgtg tcccctagcc acgcc SEQ ID NO: 11
QEGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSLGK SEQ ID NO: 12 atggacgcca tgctgagagg cctgtgctgt gtgctgctgc tgtgcggcgc cgtgttcgtg tcccctagcc acgccgtgcc ccagaagccc aaggtgagcc tgaaccctcc ctggaacaga atcttcaagg gcgagaacgt gaccctgacc tgcaacggca acaacttctt cgaggtgagc agcaccaagt ggttccacaa tggcagcctg agcgaggaga ccaacagctc cctgaacatc gtgaacgcca agttcgagga cagcggcgag tacaagtgcc agcaccagca ggtgaacgag agcgagcccg tgtacctgga ggtgttcagc gactggctgc tgctgcaggc cagcgccgag gtggtgatgg agggccagcc cctgttcctg agatgccacg gctggagaaa ctgggacgtg tacaaggtga tctactacaa ggatggcgag gccctgaagt actggtacga gaaccacaac atctccatca ccaacgccac cgtggaggac agcggcacct actactgcac aggcaaggtg tggcagctgg actacgagag cgagcccctg aacatcaccg tgatcaaggc tcccagagag aagtactggc tgcagaggaa caccggcaga ggaggcgagg aaaagaaagg aagcaaggag aaggaggagc aggaggaaag agaaaccaag acccccgagt gccccagcca cacccagccc ctgggcgtgt tcctgttccc ccccaagccc aaggacaccc tgatgatcag cagaaccccc gaggtgacct gcgtggtcgt ggatgtgagc caggaagatc ccgaagtgca gttcaactgg tacgtggatg gcgtggaagt gcacaacgcc aagaccaagc ccagagaaga gcagttcaac tccacctaca gagtggtgag cgtgctgacc gtgctgcacc aggactggct gaacggcaag gagtacaagt gcaaggtgtc caacaaaggc ctgcccagct ccatcgagaa gaccatcagc aaagccaaag gccagcccag agaaccccag gtgtacaccc tgcctcccag ccaggaagag atgaccaaga accaggtgtc cctgacctgc ctggtgaaag gcttctaccc cagcgacatc gccgtggagt gggaaagcaa cggccagccc gagaacaatt acaagacaac ccctcccgtg ctggatagcg atggcagctt ctttctgtac agcagactga ccgtggacaa gagcagatgg caggaaggca acgtgttcag ctgcagcgtg atgcacgaag ccctgcacaa ccactacacc cagaagagcc tgtccctgag cctgggcaag SEQ ID NO: 13
DSDGSFFLYS RLTVDKSRWQ EGNVFSCSVM HEALHNHYTQ KSLSLSLGK SEQ ID NO: 14 atggacgcca tgctgagagg cctgtgctgt gtgctgctgc tgtgcggcgc cgtgttcgtg tcccctagcc acgccgtgcc ccagaagccc aaggtgagcc tgaaccctcc ctggaacaga atcttcaagg gcgagaacgt gaccctgacc tgcaacggca acaacttctt cgaggtgagc agcaccaagt ggttccacaa tggcagcctg agcgaggaga ccaacagctc cctgaacatc gtgaacgcca agttcgagga cagcggcgag tacaagtgcc agcaccagca ggtgaacgag agcgagcccg tgtacctgga ggtgttcagc gactggctgc tgctgcaggc cagcgccgag gtggtgatgg agggccagcc cctgttcctg agatgccacg gctggagaaa ctgggacgtg tacaaggtga tctactacaa ggatggcgag gccctgaagt actggtacga gaaccacaac atctccatca ccaacgccac cgtggaggac agcggcacct actactgcac aggcaaggtg tggcagctgg actacgagag cgagcccctg aacatcaccg tgatcaaggc tcccagagag aagtactggc tgcaggccca gccccaggcc gagggcagcc tggctaaggc caccacagct cccgccacca ccaggaacac cggcagagga ggcgaggaaa agaaaggaag caaggagaag gaggagcagg aggaaagaga aaccaagacc cccgagtgcc ccagccacac ccagcccctg ggcgtgttcc tgttcccccc caagcccaag gacaccctga tgatcagcag aacccccgag gtgacctgcg tggtcgtgga tgtgagccag gaagatcccg aagtgcagtt caactggtac gtggatggcg tggaagtgca caacgccaag accaagccca gagaagagca gttcaactcc acctacagag tggtgagcgt gctgaccgtg ctgcaccagg actggctgaa cggcaaggag tacaagtgca aggtgtccaa caaaggcctg cccagctcca tcgagaagac catcagcaaa gccaaaggcc agcccagaga accccaggtg tacaccctgc ctcccagcca ggaagagatg accaagaacc aggtgtccct gacctgcctg gtgaaaggct tctaccccag cgacatcgcc gtggagtggg aaagcaacgg ccagcccgag aacaattaca agacaacccc tcccgtgctg gatagcgatg gcagcttctt tctgtacagc agactgaccg tggacaagag cagatggcag gaaggcaacg tgttcagctg cagcgtgatg cacgaagccc tgcacaacca ctacacccag aagagcctgt ccctgagcct gggcaag SEQ ID NO: 15
DSACTMGAYH PLLYEKNLVK HLNQGTDEDI YLLGKATLPG FRTIHC SEQ ID NO: 16 atgatccaca ccaacctgaa gaagaagttc agctgctgcg tgctggtgtt cctgctgttc gccgtgatct gcgtgtggaa ggagaagaag aaaggcagct actacgacag cttcaagctg cagaccaagg agttccaggt gctgaagagc ctgggcaagc tggccatggg cagcgacagc cagagcgtgt ccagctcctc cacccaggat ccccacagag gcagacagac cctgggcagc ctgagaggcc tggccaaggc caagcccgag gccagcttcc aggtgtggaa caaggacagc agcagcaaga acctgatccc cagactgcag aagatctgga agaactacct gagcatgaac aagtacaagg tgagctacaa aggacccgga cccggcatca agttcagcgc cgaggccctg aggtgccacc tgagagacca cgtgaacgtg agcatggtgg aagtgaccga cttccccttc aacaccagcg agtgggaagg ctacctgccc aaggagagca tcaggaccaa ggctggcccc tggggcagat gcgccgtggt gagcagcgct ggcagcctga agagctccca gctgggcaga gagatcgacg accacgatgc cgtgctgagg ttcaatggcg ctcccaccgc caacttccag caggacgtgg gcaccaagac cacaatccgg ctgatgaaca gccagctggt gacaaccgag aagcggttcc tgaaggacag cctgtacaac gagggcatcc tgatcgtgtg ggatcccagc gtgtaccaca gcgacatccc caagtggtac cagaatcccg actacaactt cttcaacaac tacaagacct atagaaagct gcaccccaac cagcccttct acatcctgaa gccccagatg ccctgggagc tgtgggacat cctgcaggag atcagccctg aagagatcca gcccaaccct ccctccagcg gcatgctggg cattatcatc atgatgaccc tgtgcgacca ggtggacatc tacgagttcc tgcccagcaa gagaaagacc gacgtgtgct actactatca gaagttcttc gacagcgcct gcaccatggg cgcctaccac cccctgctgt acgagaagaa cctggtgaag cacctgaacc agggcaccga cgaggacatc tacctgctgg gcaaagccac cctgcccggc ttcagaacca tccactgc SEQ ID NO: 17
RNTGRGGEEK KXXKEKEEQE ERETKTPECP SEQ ID NO: 18
AQPQAEGSLA KATTAPATTR NTGRGGEEKK XXKEKEEQEE RETKTPECP SEQ ID NO: 19
RNTGRGGEEK KKEKEKEEQE ERETKTPECP SEQ ID NO: 20
LSLGK SEQ ID NO: 21
LSLGK SEQ ID NO: 22
Claims (19)
1. Dímero polipeptídico, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: dois monômeros, cada um dos quais contém um domínio extracelular (FcεRIa-ECD) de uma subunidade alfa de um receptor de IgE Fc, em que o monômero contém uma região Fc modificada, e a região Fc modificada e a FcεRIa-ECD são ligadas por intermédio de uma dobradiça.
2. Dímero polipeptídico, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o domínio extracelular da subunidade alfa do receptor de IgE Fc é a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1 ou um fragmento do mesmo.
3. Dímero polipeptídico, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que A região Fc modificada é a SEQ ID NO: 2.
4. Dímero polipeptídico, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a dobradiça é uma região da dobradiça derivada da imunoglobulina IgD ou de uma variante da mesma.
5. Dímero polipeptídico, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADO pelo fato de que a região da dobradiça ou variante da mesma derivada de imunoglobulina IgD contém pelo menos uma cisteína.
6. Dímero polipeptídico, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADO pelo fato de que a região da dobradiça derivada de imunoglobulina IgD ou de uma variante da mesma é Arg Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Xaa1 Xaa2 Lys Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro (SEQ ID NO: 17), Xaa1 é Lys ou Gly, e Xaa2 é Glu, Gly ou Ser.
7. Dímero polipeptídico, de acordo com a reivindicação 4,
CARACTERIZADO pelo fato de que a região da dobradiça derivada de imunoglobulina IgD ou de uma variante da mesma é Ala Gln Pro Gln Ala Glu Gly Ser Leu Ala Lys Ala Thr Thr Ala Pro Ala Thr Thr Arg Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Xaa3 Xaa4 Lys Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro (SEQ ID NO: 18), Xaa1 é Lys ou Gly, e Xaa2 é Glu, Gly ou Ser.
8. Dímero polipeptídico, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a dobradiça apresenta qualquer sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste da SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 e SEQ ID NO: 19.
9. Polinucleotídeo que codifica o monômero, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que contém um domínio extracelular (FcεRIa- ECD) de uma subunidade alfa de um receptor de IgE Fc.
10. Vetor de expressão, CARACTERIZADO pelo fato de que é carregado com o polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 9.
11. Célula hospedeira, CARACTERIZADA pelo fato de que o vetor de expressão, de acordo com a reivindicação 10, é introduzido.
12. Composição farmacêutica para tratar ou prevenir uma doença alérgica, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende, como um ingrediente ativo, qualquer dímero polipeptídico, de acordo com as reivindicações de 1 a 8.
13. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 12, CARACTERIZADA pelo fato de que a doença alérgica é qualquer uma selecionada a partir do grupo que consiste de alergia alimentar, dermatite atópica, asma, rinite alérgica, conjuntivite alérgica, dermatite alérgica, urticária idiopática crônica e dermatite de contato alérgica.
14. Composição alimentar para melhorar ou aliviar um sintoma alérgico,
CARACTERIZADA pelo fato de que compreende, como um ingrediente ativo, qualquer dímero polipeptídico, de acordo com as reivindicações de 1 a 8.
15. Método para produzir um dímero polipeptídico, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: uma etapa de cultivar uma célula em que o polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 9, e um gene de ácido siálico transferase são introduzidos; e uma etapa de recuperar um dímero polipeptídico.
16. Dímero polipeptídico, CARACTERIZADO pelo fato de que é obtido na reivindicação 15.
17. Composição farmacêutica para tratar ou prevenir uma doença alérgica, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende, como um ingrediente ativo, o dímero polipeptídico, de acordo com a reivindicação 16.
18. Composição alimentar para melhorar ou aliviar um sintoma alérgico, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende, como um ingrediente ativo, o dímero polipeptídico, de acordo com a reivindicação 16.
19. Método para tratar ou prevenir uma doença alérgica, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: uma etapa de administrar a um indivíduo o dímero polipeptídico, de acordo com a reivindicação 1 e/ou reivindicação 16.
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