BR112020012450A2 - métodos e compostos para o tratamento ou prevenção de hipercitocinemia e influenza severa - Google Patents

Abstract

A presente invenção refere-se a um inibidor de p38 MAPK de Fórmula I ou um sal ou solvato farmaceuticamente aceitável do mesmo: Fórmula I para uso no tratamento ou prevenção de hipercitocinemia em um paciente humano; em que R é C1-3alquila, opcionalmente substituída por um ou mais halo, NR1R2 ou hidróxi e R1 e R2 são independentemente H, halo ou C1-3alquila, opcionalmente substituída por um ou mais F. São também providas composições para uso no tratamento ou prevenção de hipercitocinemia compreendendo o inibidor de p38 MAPK de Fórmula I; e métodos para tratamento ou prevenção de hipercitocinemia em um paciente humano com necessidade do mesmo compreendendo administrar ao paciente uma quantidade terapeuticamente ou profilaticamente eficaz de um inibidor de p38 MAPK de Fórmula I. A invenção também provê um inibidor de p38 MAPK e um agente antimicrobiano, tal como um agente antiviral, para uso no tratamento ou prevenção de hipercitocinemia.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTO-

DOS E COMPOSTOS PARA O TRATAMENTO OU PREVENÇÃO DE HIPERCITOCINEMIA E INFLUENZA SEVERA". Campo da Invenção

[001] A presente invenção refere-se a métodos e compostos para o tratamento ou prevenção de hipercitocinemia e, em particular, hiper- citocinemia associada com influenza severa. A invenção também pro- vê composições farmacêuticas para o tratamento ou prevenção de hi- percitocinemia e hipercitocinemia associada com influenza severa. Antecedentes da Invenção

[002] A hipercitocinemia é definida como um aumento repentino nos níveis em circulação de citocinas proinflamatórias, tais como IL-1, IL-6 e TNF (Croft, M., The role of TNF superfamily members in T-cell function and diseases, Nat. Rev. Immunol, 2009; 9: 271-85).

[003] Hipercitocinemia ou "tempestade de citocina" ou "cascata de citocina" está associada com várias condições incluindo doenças infecciosas, doenças não infecciosas, reações autoimunes e reações adversas a fármaco. Inflamação é parte da resposta biológica comple- ta de tecidos do corpo a estímulos prejudiciais, tais como vírus, células danificadas ou irritantes. Ela é uma resposta protetora que envolve o sistema imune, vasos sanguíneos e várias proteínas. O propósito da inflamação é eliminar a causa inicial de lesão celular, eliminar células mortas e que estão morrendo e iniciar reparo de tecido. Em circuns- tâncias normais, a inflamação é de curta duração e reparo a tecidos danificados normalmente começa 2 a 3 dias após o início dos sinto- mas.

[004] A hipercitocinemia se desenvolve quando a resposta infla- matória é exagerada e níveis altos de proteínas proinflamatórias (cito- cinas) são liberados, os quais podem levar a dano dos vasos sanguí- neos no pulmão e outros tecidos resultando em vazamento líquido pa-

ra tecidos (edema). Ao invés de ser protetora, a resposta inflamatória se torna destrutiva. Essa resposta inflamatória exagerada pode ser vista como um processo não linear onde há um ponto crítico – uma transição de fase, ponto de inflexão ou limiar – onde a resposta infla- matória normal se torna um processo anormal.

[005] Uma variedade de fármacos anti-inflamatórios e aborda- gens adjuntas foi adotada em uma tentativa de se direcionar à hiperci- tocinemia. Esses incluem tratamento com corticosteroides, aspirina, anticorpos monoclonais (MAbs), agentes anticitocina e antiquimiocina, troca de plasma e estatinas. Apesar desses esforços, nenhuma des- sas abordagens provou ser eficaz, e algumas pioraram o resultado (Brun-Buisson e outros, Early corticosteroids in severe influenza A/H1N1 pneumonia and acute respiratory distress syndrome, Am J Respir Crit Care Med. 2011 Maio 1;183(9):1200-6). As abordagens te- rapêuticas da presente invenção têm como objetivo equilibrar a res- posta através da atenuação da resposta inflamatória ao invés de re- movê-la, dessa maneira reduzindo os efeitos danosos causados pela resposta inflamatória exagerada enquanto preservando a resposta pro- tetora inata do hospedeiro.

[006] Hipercitocinemia é vista em infecções severas com três principais vírus influenza: a influenza H1N1 Espanhola de 1918-19 pandêmica; influenza aviária H5N1 e; a influenza H1N1 pandêmica de

2009. Quando comparado com H1N1 humano, os vírus H5N1 são in- dutores mais potentes de citocinas proinflamatórias em células epiteli- ais respiratórias humanas primárias, e essa hiperindução de citocinas é provável contribuir para a severidade da doença de H5N1. O meca- nismo exato de hipercitocinemia em influenza é desconhecido, mas células endoteliais foram identificadas como reguladores centrais de "tempestade de citocina" (Teijaro, J.R. e outros, Endothelial Cells are Central Orchestrators of Cytokine Amplification during Influenza Virus

Infection, Cell, 2011; 146: 980-991).

[007] A influenza ocorre globalmente com taxa de ataque anual estimada em 5%-10% em adultos e 20%-30% em crianças. As doen- ças podem resultar em hospitalização e morte principalmente dentre grupos de alto risco (os muito jovens, idosos e doentes crônicos). Em todo o mundo, essas epidemias anuais são estimadas resultar em cer- ca de 3 a 5 milhões de casos de doença grave, e cerca de 250.000 a

500.000 mortes (vide número da ficha OMS 211: https://web.archive.org/web/20160613040907/http://www.who.int/medi acentre/factsheets/fs211/en/).

[008] Na América do Norte, a influenza sazonal causa hospitali- zações em excesso em 230-1670 por 100.000 pessoas com > 65 anos, 32.000 mortes respiratórias/cardiovasculares e 43.000 de mortes de todas as causas anualmente. Pessoas com condições médicas crônicas (por exemplo, doenças pulmonares, cardiovasculares, hepáti- cas, renais e neurológicas, diabetes ou imunossupressão) têm um aumento >30 vezes em risco de hospitalização e morte.

[009] Dentre os subtipos de influenza sazonal em circulação, H3N2 é geralmente uma causa mais frequente de doença severa e hospitalização. (Vide Lee, N. e outros, Outcomes of adults hospitalised with severe influenza, Thorax, 2010; 65: 510-515).

[0010] A situação pode ser ainda pior durante pandemias de influ- enza. No início de 2009, um novo vírus influenza A/H1N1 (pH1N1) surgiu e rapidamente causou uma pandemia. Foi estimado que em al- gumas populações, até 20-40% de indivíduos foram afetados e resul- tou em hospitalizações e mortes excessivas. Nos Estados Unidos,

195.000-403.000 pessoas foram hospitalizadas por infecção por pH1N1 severa e 8.870-18.300 morreram em abril de 2010. O vírus pH1N1 continuou a cocircular com os vírus influenza sazonais na co- munidade.

[0011] Embora a maioria dos pacientes desenvolva infecção do trato respiratório superior com pH1N1, alguns progridem para desen- volver complicações do trato respiratório inferior severas, tal como, por exemplo, pneumonia, ou transição para sentir sintomas que não desa- parecem ou melhoram após vários dias (> 2 dias). Em contraste à in- fluenza sazonal, adultos jovens e indivíduos anteriormente saudáveis podem também desenvolver complicações respiratórias severas tais como, por exemplo, pneumonia e síndrome do desconforto respiratório agudo (ARDS). Dentre os adultos hospitalizados, entre 9-34% podem necessitar cuidado intensivo devido à falência respiratória progressiva, que pode estar associada com alta mortalidade (14-46%); notadamen- te, algumas das manifestações (por exemplo, pneumonia, ARDS, fa- lência múltipla dos órgãos) são bastante similares àquelas de influenza aviária H5N1. (Vide Lee, N. e outros, Cytokine response patterns in severe pandemic 2009 H1N1 and seasonal influenza among hospitali- sed adults, PloS One, 2011; 6: e26050).

[0012] O WO 01/19322 A2 (SmithKline Beecham Corp) reivindica um método de tratamento de pneumonia induzida por influenza, méto- do que compreende administrar ao humano uma quantidade eficaz de um inibidor de CBSP/p38.

[0013] As p38 MAP cinases compreendem uma subfamília de pro- teína cinase ativada por mitógeno que regula uma variedade de pro- cessos celulares incluindo processos de crescimento celular, diferen- ciação celular, apoptose e respostas celulares à inflamação. As p38 MAP cinases são reguladas por receptores de citocina e podem ser ativadas em resposta a patógenos bacterianos ou virais.

[0014] O WO 2004/076450 A1 divulga o uso de certos derivados de pirazolpiridina para o tratamento ou prevenção de doenças media- das por TNF-α, IL-1, IL-6 e/ou IL-8, incluindo doenças imunes, autoi- munes e inflamatórias, doenças cardiovasculares, doenças infeccio-

sas, distúrbios de reabsorção óssea, doenças neurodegenerativas, doenças proliferativas e processos associados com a indução de ci- clooxigease-2.

[0015] O WO 02/059083 A2 (SmithKline Beecham Corp) reivindica o uso de compostos 2,4,8-trissubstituídos-8H-pirido[2,3-d]pirimidin-7- ona substituídos e composições para tratamento de uma ampla gama de doenças mediadas por CBSP/p38 cinase, incluindo ARDS, doença pulmonar obstrutiva crônica e pneumonia induzida por influenza.

[0016] A US 2011/003848 A1 (Butcher) divulga o uso de forma polimórfica do inibidor de p38 MAP cinase, N-[3-terc-butil-1-(3-cloro-4- hidroxifenil)-1H-pirazol-5-il]-N′-{2-[(3-{2-[(2- hidroxietil)sulfanil]fenil}[1,2,4]triazol[4,3-a]piridin-6- il)sulfanil]benzil}ureia, para tratamento de doenças das vias aéreas obstrutivas, restritivas ou inflamatórias de qualquer tipo, etiologia ou patogênese.

[0017] Entretanto, o WO 2015/173788 A1 (Westfälische Wilhelms- Universität Münster) reivindica um inibidor de MEK, inibidor de p38 e/ou inibidor de NF-κB para uso em um método para a profilaxia e/ou tratamento de uma coinfecção compreendendo uma infecção bacteria- na e uma infecção pelo vírus influenza ou uma infecção bacteriana apenas.

[0018] Um inibidor de p38 MAPK é divulgado em Mihara, K. e ou- tros. A potent and selective p38 inhibitor protects against bone damage in murine collagen-induced arthritis: a comparison with neutralization of mouse TNFalpha., Br. J. Pharmacol., 2008 (Maio);154(1):153-64, e Galan-Arriero I, e outros Early treatment with UR13870, a novel inhibi- tor of p38α mitogenous activated protein kinase, prevents hyperreflexia and anxiety behaviors, in the spared nerve injury model of neuropathic pain. Neurosci. Lett. 2015 (Set) 14;604:69-74.

[0019] Em geral, como discutido em mais detalhes abaixo, vários agentes anti-inflamatórios diferentes foram propostos na técnica para tratamento de inflamação associada com infecção por influenza.

[0020] A Organização Mundial da Saúde (OMS) define influenza severa como: influenza em pacientes que apresentam sinais clínicos e/ou radiológicos de doença do trato respiratório inferior, envolvimento do sistema nervoso central (SNC), desidratação severa ou apresentam complicações secundárias, tais como falência renal, falência múltipla dos órgãos e choque séptico (outras complicações podem incluir rab- domiólise e miocardite); influenza onde há exacerbação de doença crônica subjacente; influenza onde há qualquer outra condição ou apresentação clínica que requeira internação hospitalar para tratamen- to clínico; e influenza onde há qualquer um dos sinais e sintomas que seguem de doença progressiva: Sintomas e sinais sugerindo deficiência de oxigênio ou in- suficiente cardiopulmonar: Falta de ar (com atividade ou sob descanso), dificuldade de respirar, taquipneia, presença de cianose, esputo com sangue ou colorido, dor no peito e pressão sanguínea baixa; em crianças, respiração rápida ou difícil; e hipoxia, como indicado por oximetria de pulso ou gases san- guíneos arteriais; Sintomas e sinais sugerindo complicações do SNC: estado mental al- terado, falta de consciência, sonolência ou dificuldade de acordar e convulsões recorrentes ou persistentes (ataques), confusão, fraqueza severa ou paralisia; Evidência de replicação sustentada ou disseminada de vírus ou infec- ção bacteriana secundária invasiva baseada em teste de laboratório ou sinais clínicos (por exemplo, febre alta persistente ou recorrente e outros sintomas por mais de 2 ou 3 dias sem sinais de parada); e Desidratação severa, manifestada como atividade física ou mental di- minuída, vertigem, produção de urina diminuída e letargia (Vide WHO

Guidelines for Pharmacological Management of Pandemic Influenza A(H1N1) 2009 and other Influenza Viruses, Revised February 2010, Part I Recommendations, p. 5).

[0021] Influenza não complicada é uma inflamação leve do trato respiratório superior. Inflamação é parte da resposta biológica comple- xa de tecidos corporais a células danosas de estímulos prejudiciais, tais como vírus, toxinas ou irritantes; ela é uma resposta protetora que envolve o sistema imune, vasos sanguíneos e várias proteínas. O pro- pósito da inflamação é eliminar a causa inicial de lesão celular, elimi- nar células mortas ou morrendo e iniciar reparo de tecido. Em influen- za não complicada, a inflamação é de duração curta e reparo no re- vestimento da célula epitelial danificada das vias aéreas superiores começa cerca de 2-3 dias após início dos sintomas.

[0022] Em contraste com influenza não complicada, a resposta inflamatória em influenza severa é exagerada ou prolongada, respecti- vamente. Ao invés de ser protetora, a resposta se torna destrutiva. Ní- veis altos de proteínas proinflamatórias (citocinas) no sangue são uma indicação inicial de resultados clínicos pobres em pacientes com influ- enza (Lee, N. e outros, 2011). Nesses pacientes, a resposta inflamató- ria exagerada pode levar a dano de vasos sanguíneos no pulmão e outros tecidos resultando em vazamento de líquido para o tecido (edema). Acúmulo de fluido e células imunes nos pulmões pode levar à pneumonia, lesão pulmonar aguda e ARDS em falência respiratória em casos severos. A resposta inflamatória exagerada em influenza severa pode ser vista como um processo não linear onde há um ponto crítico – uma transição de fase ou ponto de inflexão – quando a res- posta inflamatória normal se torna uma resposta anormal ou mais des- trutiva. Em influenza severa, ao invés de queda em um curso de para- da após sintomas de pico em torno do dia 3 após infecção, os pacien- tes progridem para desenvolver outras complicações respiratórias, um processo dirigido por uma resposta inflamatória exagerada.

[0023] Armstrong, S.M. e outros, Endothelial activation and dys- function in the pathogenesis of influenza A virus infection, Virulence, 2013; 4(6): 537-542, review evidence in support of endothelial activa- tion and dysfunction as a central feature preceding the development of severe influenza.

[0024] Usando microdisposições de expressão de gene para com- parar os perfis transcriptômicos de pacientes infectados com influenza com sintomas severos, moderados e leves com pacientes febris de etiologia desconhecida, Hoang e outros (Patient-based transcriptome- wide analysis identify interferon and ubiquitination pathways as poten- tial predictors of influenza A disease severity, PloS One 2014, 9: e111640e) reportaram que pacientes infectados com influenza, sem importar seus resultados clínicos, tiveram uma indução mais forte de respostas antivirais e de citocina e uma atenuação mais forte de res- postas de célula NK e T em comparação com aqueles com etiologia desconhecida e que sinalização com interferon e ubiquitinação foi for- temente atenuada em pacientes com os resultados mais severos em comparação com aqueles com resultados moderados e leves. Isso es- tá de acordo com os dados do próprio inventor, que mostram níveis de citocina elevados em soro de pacientes hospitalizados para influenza severa em relação a indivíduos infectados com influenza sem influenza severa (vide Exemplo 5 abaixo).

[0025] Hoang e outros, 2014 verificaram sinalização de p38 MAPK ser suprarregulada em pacientes moderados bem como severos. MMP9, SOCS3, IFITMs, TLR10, RIG-I, CD244 e NCR3 foram propos- tos como genes candidatos para estudos adicionais. No entanto, dire- cionamento a citocinas individuais é improvável ter efeitos anti- inflamatórios amplos que são requeridos, e redundância no sistema de resposta inflamatória significa que inativação de citocinas múltiplas si-

multaneamente é provável ser necessária para uma terapia ser eficaz.

[0026] A US 2010/0151042 A1 (Liang e outros) reivindica um mé- todo para redução da severidade, intensidade ou duração de compli- cações ou sintomas associados com uma infecção por influenza, em que o método compreende diagnóstico de um indivíduo com a infec- ção por influenza; e concomitantemente administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um composto cisteamina e um segundo agente terapêutico viral. As complicações associadas com a infecção viral por influenza podem compreender rinite, infecções bacterianas, complica- ções cardíacas, complicações neurológicas, miosite, falência renal, fibrose pulmonar, exacerbações de asma, exacerbações de doença pulmonar obstrutiva crônica, enfisema ou insuficiência cardíaca. O se- gundo agente terapêutico viral pode ser selecionado do grupo consis- tindo em: amantadina, rimantadina, ribavirina, idoxuridina, trifluridina, vidarabina, aciclovir, ganciclovir, foscarnete, zidovudina, didanosina, zalcitabina, estavudina, famciclovir, fosfato de oseltamivir, zanamivir, valaciclovir, antitussígenos, mucolíticos, expectorantes, antipiréticos, analgésicos e descongestionantes nasais.

[0027] Terapia imunomoduladora para influenza severa foi revista por Hui e outros, Adjunctive Therapies and Immunomodulatory Agents in the Management of Severe Influenza, Antiviral Research, 2013; 98: 410-416; Hui & Lee, Adjunctive Therapies and Immunomodulatory Agents for Severe Influenza, Influenza and Other Respiratory Viruses, 2013; 7 (suppl. 3): 52-59; e Liu e outros, Cellular & Molecular Immuno- logy, 2015; 1-8, doi: 10.1038/cmi.2015.74.

[0028] Darwish e outros, Immunomodulatory Therapy for Severe Influenza, Expert Rev Anti Infect Ther., 2011 (Jul); 9(7): 807-22, doi:

10.1586/eri.11.56, descrevem os determinantes de patogenicidade vi- ral e de hospedeiro de influenza, apresentam a evidência dando supor- te ao uso de terapia imunomoduladora para se direcionar à resposta inflamatória de hospedeiro como um meio para melhorar o resultado clínico em influenza severa, e reveem os dados experimentais sobre agentes imunomoduladores investigacionais se direcionando à respos- ta inflamatória de hospedeiro em influenza severa, incluindo terapia anti-TNF, estatinas, glucocorticoides, inibidores de ciclooxigenase-2, macrólidos, agonistas de receptor ativado por proliferador de peroxis- soma, agonistas de proteína cinase ativada por AMP e antagonistas do grupo box 1 de alta mobilidade, concluindo com uma justificativa para o uso de células (tronco) estromais mesenquimais e terapia com angiopoietina-1 contra respostas de hospedeiro induzidas por influen- za prejudiciais que fazem a mediação de lesão e disfunção de órgão final.

[0029] Fedson, D.S., Confronting an influenza pandemic with inex- pensive generic agents: can it be done?, Lancet Infect. Dis., 2008; 8: 571-76, propõe pesquisa para determinar se estatinas, fibratos, cloro- quinas e outros agentes genéricos poderiam mitigar os efeitos de uma pandemia por influenza A aviária H5N1. Vide também Fedson, D.S., Confronting the next influenza pandemic with anti-inflammatory and immunomodulatory agents: why they are needed and how they might work, Influenza and Other Respiratory Viruses, 2009; 3(4): 129-142 e Fedson, D.S., Treating influenza with statins and other immunomodula- tory agents, Antiviral Research, 2013; 99(3): 417-435.

[0030] An, S.C. e outros, Triple combinations of neuraminidase inhibitors, statins and fibrates benefit the survival of patients with lethal avian influenza pandemic, Medical Hypotheses, 2011; 77(6): 1054-157, tomam como hipótese que estatinas e fibratos, ambos têm efeitos anti- inflamatórios e imunomoduladores e outras atividades biológicas múl- tiplas, podem exibir efeitos sinérgico quando eles são combinados com inibidores de neuraminidase para tratar as infecções pelo vírus A (H5N1) por meio da inibição da produção ou dos mediadores inflama-

tórios precoces (por exemplo, muitas citocinas/quimiocinas) ou media- dores tardios (por exemplo, Proteína do Grupo Box 1 de Alta Mobilida- de), até mesmo mostrando as atividades antivirais com a prevenção do desenvolvimento de resistência antiviral.

[0031] Como descrito por Bermejo-Martin, J.F. e outros, Macroli- des for the treatment of severe respiratory illness caused by novel H1N1 swine influenza viral strains, J. Infect. Developing Countries, 2009; 3(3): 159-161, macrólidos são moléculas com atividade antibac- teriana que também têm propriedades anti-inflamatórias notáveis. Eles exercem ambos os efeitos estimuladores e inibidores sobre leucócitos. Esses efeitos parecem estar relacionados ao estado de ativação dos leucócitos, facilitando a morte bacteriana bem como resolução de in- flamação local. O uso de macrólidos no tratamento de doença severa causada pelos vírus influenza de rearranjo da gripe suína H1N1 novo é proposto, particularmente em combinação com antivirais, a fim de di- minuir a resposta inflamatória sistêmica levando à pneumonia e resul- tado fatal.

[0032] Sato, K. e outros, Therapeutic Effect of Erythromycin on In- fluenza Virus-induced Lung Injury in Mice, Am J Respir Crit Care Med, 1998; 157: 853-857, avaliaram o uso de eritromicina (EM), um antibió- tico com efeitos anti-inflamatórios potentes que é usado para tratamen- to de infecções do trato respiratório inferior crônicas, em pneumonia induzida pelo vírus influenza em camundongos. Foi constatado que a administração de EM em uma dose de 3,3 mg/kg/d (intraperitoneal- mente, a partir dos Dias 1-6 após infecção) melhorou significantemen- te a taxa de sobrevivência de camundongos infectados com vírus in- fluenza, e a taxa de sobrevivência dos camundongos infectados com vírus no Dia 20 de infecção aumentou de uma maneira dependente da dose com EM administrado aos animais, de a partir de 14% dentre controles a 42% dentre animais que receberam EM a 1,0 mg/kg/d e

57% dentre aqueles que receberam EM a 3,3 mg/kg/d.

[0033] Börgeling e outros, (Inhibition of p38 mitogen-activated pro- tein kinase impairs influenza virus-induced primary and secondary host gene responses and protects mice from lethal H5N1 infection, J. Biol. Chem. 2014 Jan 3;289(1):13-27), descrevem o uso de SB 202190, um inibidor de p38 MAPK, para controlar sinalização de interferon nos es- tágios bem iniciais de infecção por influenza, e a supressão resultante de expressão de citocina excessiva. SB 202190 é administrado ao mesmo tempo que exposição a vírus. Os efeitos de infecção viral con- comitante com administração de SB 202190 são analisados até 2 dias pós-infecção em camundongos infectados por influenza. Os dados são limitados aos efeitos de SB 202190 sobre expressão de citocina quan- do administrado no início de infecção com vírus influenza (isto é, con- comitante com a exposição a vírus). Os efeitos de primeira administra- ção de SB 202190 nos pontos de tempo seguindo exposição ao vírus não são investigados e os efeitos de SB 202190 uma vez o ponto críti- co (ou ponto de inflexão) tendo sido atingido e a resposta à citocina se torna exagerada e excessiva certamente não são considerados.

[0034] No momento da presente invenção permanece uma neces- sidade não satisfeita de um tratamento para atenuar hipercitocinemia e em particular hipercitocinemia associada com infecção pelo vírus influ- enza severa. Sumário da Invenção

[0035] Como descrito abaixo, especialmente com referência aos Exemplos, os inventores constataram que p38 MAP cinase é suprarre- gulada em várias vias de sinalização celular que são muito ativas em pacientes com influenza severa em comparação com pacientes com influenza leve ou moderada. Em particular, foi constatado que p38 MAP cinase está envolvida em várias vias de sinalização não metabó- lica diferentes compreendendo mais de três nós, em que 100% dos nós são suprarregulados em pacientes com influenza severa versus pacientes com influenza leve, e pelo menos 75% dos nós são suprar- regulados em pacientes com influenza severa versus pacientes com infecção por H1N1 ou influenza moderada.

[0036] A p38 MAP cinase é um nó que está localizado alto em uma cascata de sinalização em uma gama de tipos de célula (epitelial, endotelial e imune) que são todos importantes na patologia de influen- za severa. Devido à natureza rápida e progressiva de influenza severa, direcionamento de uma proteína alta em uma cascata de sinalização é requerido para atenuar produção de mediador inflamatório rapidamen- te e reduzir progressão da doença.

[0037] No entanto, enquanto vários outros nós segmentáveis em 95 rotas de via foram identificados pelos inventores como alvos poten- ciais para o tratamento de influenza severa, foi inesperadamente cons- tatado que inibidores de p38 MAP cinase exibem um efeito de inativa- ção dependente da dose sobre a liberação de citocinas, particularmen- te IP10, a partir de células endoteliais tratadas com um meio condicio- nado viral que simula a ação de mediadores inflamatórios produzidos a partir de células epiteliais infectadas por influenza, enquanto outros alvo potenciais promissores não mostram o mesmo efeito. Em particu- lar, como divulgado pelo Exemplo 4 abaixo, enquanto inibidores de p38 MAP cinase exibem inibição dependente da dose de IP10 em cé- lulas endoteliais, bem como efeitos inibidores sobre a liberação de mediadores inflamatórios a partir de células imunes que são compará- veis com corticosteroides e macrólidos, o próximo alvo mais promissor, a saber proteína cinase ativada por mitógeno (MEK), não é eficaz na inibição de liberação de IP10 a partir de células endoteliais e realmen- te parece aumentar os níveis de IP10 em concentrações de fármaco mais altas.

[0038] Ainda, devido ao fato da infecção pelo vírus influenza seve-

ra ser frequentemente caracterizada por hipercitocinemia, como expli- cado aqui, os Exemplos e dados apresentados abaixo dão suporte à hipótese que a via de p38 MAPK está envolvida em hipercitocinemia mais em geral, isto é, hipercitocinemia que está associada com condi- ções diferentes de infecção pelo vírus influenza severa.

[0039] De acordo com um aspecto da presente invenção, portanto, é provido um inibidor de p38 MAPK para uso no tratamento ou preven- ção de hipercitocinemia. A hipercitocinemia pode estar associada com uma ou mais do que segue: infecção pelo vírus influenza severa; do- ença enxerto-versus-hospedeiro (GVHD), síndrome do desconforto respiratório agudo (ARDS); sepse; Ebola; varíola; síndrome da respos- ta inflamatória sistêmica (SIRS); infecção bacteriana; e câncer.

[0040] De acordo com um outro aspecto da presente invenção é provido um inibidor de p38 MAPK para uso no tratamento ou preven- ção de influenza severa em um paciente humano.

[0041] De acordo com um outro aspecto da presente invenção é provida uma composição farmacêutica compreendendo um inibidor de p38 MAPK para uso no tratamento ou prevenção de hipercitocinemia e/ou para uso no tratamento ou prevenção de influenza severa em um paciente humano.

[0042] Em um aspecto adicional da presente invenção é provido um método de tratamento ou prevenção de hipercitocinemia e/ou influ- enza severa em um indivíduo (por exemplo, um paciente humano ou um animal) com necessidade do mesmo compreendendo administrar ao indivíduo (por exemplo, um paciente humano ou um animal) uma quantidade farmaceuticamente eficaz de um inibidor de p38 MAPK. A hipercitocinemia pode estar associada com uma ou mais das que se- guem: infecção pelo vírus influenza severa; doença enxerto-versus- hospedeiro (GVHD), síndrome do desconforto respiratório agudo (ARDS); sepse; Ebola; varíola; síndrome da resposta inflamatória sis-

têmica (SIRS); infecção bacteriana; e câncer.

[0043] Em particular, o inibidor de p38 MAPK tem um efeito anti- inflamatório e/ou imunomodulador.

[0044] Em particular, o inibidor de p38 MAPK pode ser usado para o tratamento ou prevenção de hipercitocinemia e/ou influenza severa em um paciente humano através da inibição da liberação de mediado- res proinflamatórios a partir de células endoteliais e/ou células imunes e/ou células epiteliais (por exemplo, células endoteliais e/ou células imunes). Adequadamente, o inibidor de p38 MAP cinase pode ser ad- ministrado em uma quantidade eficaz para inibição da liberação de mediadores proinflamatórios a partir de células endoteliais e/ou células imunes e/ou células epiteliais (por exemplo, células endoteliais e/ou células imunes).

[0045] Mais especificamente, o inibidor de p38 MAPK pode ser usado para o tratamento ou prevenção de hipercitocinemia e/ou influ- enza severa em um paciente humano através da inibição da liberação de citocinas proinflamatórias a partir de células endoteliais e/ou células imunes e/ou células epiteliais (por exemplo, células endoteliais e/ou células imunes). Adequadamente, o inibidor de p38 MAP cinase pode ser administrado em uma quantidade eficaz para inibição da liberação de citocinas proinflamatórias a partir de células endoteliais e/ou células imunes e/ou células epiteliais (por exemplo, células endoteliais e/ou células imunes).

[0046] O inibidor de p38 MAPK pode inibir a liberação de uma ou mais de ou todas de: IL1-β, IL-6, IL-8, IL-10, IP10, TNFα, RANTES e/ou MIP-1a (por exemplo, uma ou mais de ou todas de: IL1-β, IL-6, IL- 8, IL-10, IP10, TNFα e/ou RANTES) a partir de células endoteliais e/ou células imunes. Em particular, o inibidor de P38 MAPK pode inibir a liberação de IL-10.

[0047] Adequadamente, o inibidor de p38 MAPK cinase pode ser administrado em uma quantidade eficaz para inibir a libração de uma ou mais de ou todos de: IL1-β, IL-6, IL-8, IL-10, IP10, TNFα, RANTES e/ou MIP-1a a partir de células endoteliais e/ou células imunes (por exemplo, uma ou mais de ou todas de: IL1-β, IL-6, IL-8, IL-10, IP10, TNFα e/ou RANTES a partir de células endoteliais e/ou células imu- nes). Em particular, o inibidor de p38 MAP cinase pode ser administra- do em uma quantidade eficaz para inibir a liberação de IL-10 a partir de células endoteliais e/ou células imunes.

[0048] Em algumas modalidades, o inibidor de p38 MAPK pode ser usado, de acordo com a presente invenção, para o tratamento ou prevenção de hipercitocinemia e/ou influenza severa em um paciente humano através da inibição da liberação de IP10 a partir de células endoteliais e/ou células imunes.

[0049] Vantajosamente, o inibidor de p38 MAPK pode exibir inibi- ção dependente da dose de liberação de citocina a partir de células endoteliais e/ou células imunes.

[0050] Assim como seus efeitos inibidores sobre liberação de cito- cina a partir de células endoteliais, o inibidor de p38 MAPK pode tam- bém agir para inibir a liberação de citocinas proinflamatórias a partir de células imunes, que estão tipicamente localizadas próximo das células endoteliais no trato respiratório inferior. Adequadamente, o inibidor de p38 MAP cinase pode ser administrado em uma quantidade eficaz pa- ra inibição de liberação de citocina a partir de células endoteliais. Em particular, o inibidor de p38 MAP cinase pode ser administrado em uma quantidade eficaz para inibição de liberação de citocina a partir de células endoteliais e inibição de liberação de citocinas proinflamatórias a partir de células imunes.

[0051] Adequadamente, o inibidor de p38 MAPK é de Fórmula I abaixo ou um sal ou solvato farmaceuticamente aceitável do mesmo.

Fórmula I em que R é C1-3 alquila, que é opcionalmente substituída por um ou mais de halo, NR1R2 ou hidróxi e R1 e R2 são independentemente H, halo ou C1-3 alquila, que é opcionalmente substituída por um ou mais F.

[0052] Por exemplo, R pode ser opcionalmente substituído por um, dois ou três de halo, NR1R2 ou hidroxila; ou pode ser opcionalmente substituído por um ou dois de halo, NR1R2 ou hidroxila; ou pode ser opcionalmente substituído por um de halo, NR1R2 ou hidroxila. Quando R é opcionalmente substituído por mais de um (por exemplo, dois ou três) halo, NR1R2 e/ou hidroxila, esses substituintes podem ser inde- pendentemente selecionados dessa lista.

[0053] Quando R1 e/ou R2 é uma C1-3 alquila opcionalmente substi- tuída por um ou mais de F, cada C1-3 alquila pode, por exemplo, ser opcionalmente substituída por um, dois ou três F; ser opcionalmente substituído por um ou dois F; ser opcionalmente substituído por um ou três F; pode ser opcionalmente substituído por um F; ou ser opcional- mente substituído por três F.

[0054] Em algumas modalidades, R é metila ou etila. Em uma ou- tra modalidade, R pode ser propila.

[0055] R pode ser substituído por um ou mais átomos de flúor.

[0056] Em algumas modalidades, R pode ser substituído por hi- dróxi. Por exemplo, R pode ser alquila substituída por ω, isto é, ω- hidroxialquila. Portanto, em uma modalidade, R pode ser 3-propanol,

[0057] Adequadamente, R1 e R2 podem ser independentemente selecionados de H e CH3.

[0058] Em algumas modalidades, R pode ser C1-3 alquila, que é substituída por um ou mais de halo, NR1R2 ou hidróxi e R1 e R2 são independentemente H, halo ou C1-3 alquila, que é opcionalmente subs- tituída por um ou mais F. Por exemplo, R pode ser C1-3 alquila, que é substituída por um, dois ou três de halo, NR1R2 ou hidróxi, e R1 e R2 são independentemente H, halo ou C1-3 alquila, que é opcionalmente substituída por um, dois ou três F.

[0059] Em algumas modalidades, o inibidor de p38 MAPK pode ser de Fórmula II ou um sal ou solvato farmaceuticamente aceitável do mesmo: Fórmula II

[0060] Alternativamente, o inibidor de p38 MAPK pode ser de Fórmula III abaixo ou um sal ou solvato farmaceuticamente aceitável do mesmo: Fórmula III

[0061] Os compostos de Formulas II e III da presente invenção, e a síntese desses compostos, são divulgados no WO 2004/076450 A1 (vide Exemplos 18 e 8, respectivamente). Os conteúdos do WO 2004/076450 A1 são aqui incorporados a título de referência.

[0062] Em algumas modalidades, o inibidor de p38 MAPK pode ser de Fórmula I, ou um sal ou solvato farmaceuticamente aceitável do mesmo, como acima definido, contanto que o composto não seja um composto de Fórmula III, isto é, não um composto tendo a estrutura que segue: Fórmula III

[0063] Por "influenza severa" aqui quer dizer uma doença causada por um vírus influenza e levando à doença clínica do trato respiratório inferior e/ou inflamação do trato respiratório inferior e/ou hipercitoci- nemia (por exemplo, pulmão ou sistêmica). Como descrito acima, in- fluenza severa é distinta de influenza não complicada (leve ou mode- rada) em que o paciente tem tipicamente sintomas do trato respiratório superior e inferior clinicamente intoleráveis tais como, por exemplo, congestão nasal, espirro, rinorreia, pirexia (febre) e tosse e produção de esputo, e dos quais um paciente normalmente se recupera natu- ralmente sem a necessidade de intervenção terapêutica. Em influenza severa, a resposta inflamatória do paciente à infecção viral é grande- mente exagerada ou estendida, e o paciente desenvolve sintomas do trato respiratório ou complicações clínicas mais severos que podem requerer hospitalização e algumas vezes resultar em morte. Em tais casos, intervenção terapêutica precoce é criticamente importante. Co- mo indicado pela definição da OMS de influenza severa, uma faixa ampla de complicações pode ser causada por infecção pelo vírus in- fluenza do trato respiratório superior (passagens nasais, seios, gargan- ta) e trato respiratório inferior (pulmões). Pacientes diferentes com in- fluenza severa podem, desta maneira, apresentar uma ampla faixa de sintomas ou sinais diferentes da doença. Os vários sintomas ou sinais discutidos abaixo que são característicos de influenza severa podem ser observáveis ou detectáveis após 2 dias de doença; tipicamente dentro de 2-9 dias de doença.

[0064] Por exemplo, a influenza severa pode ser caracterizada por hipercitocinemia. Tipicamente, a hipercitocinemia pode envolver níveis elevados de uma ou mais citocinas.

[0065] Em algumas modalidades, as citocinas podem compreen- der uma ou mais de IL-8, IL-7, IL-6, Eotaxina, IP10, MCP1, MCP4, VEGF e MIP-1a (por exemplo, uma ou mais de IL-8, IL-7, IL-6, Eotaxi- na, IP10, MCP1, MCP4 e VEGF). Em particular, em algumas modali- dades, as citocinas podem compreender uma ou mais de IL-8, Eotaxi- na, IP10, IL-7 e MIP-1a (por exemplo, uma ou mais de IL-8, Eotaxina, IP10 e IL-7).

[0066] Em algumas modalidades, as citocinas podem compreen- der uma ou mais de IL-6, IL-8 e IP10 (vide Lee, N. e outros, 2011; Lee, N. e outros, Viral clearance and inflammatory response patterns in adults hospitalised for pandemic 2009 influenza A (H1N1) virus pneu- monia, Antiviral Therapy, 2011; 16: 237-47).

[0067] Em algumas modalidades, a hipercitocinemia pode envolver um nível elevado de IL-6 de mais do que cerca de 1,5 ou 2 vezes sua faixa de referência no plasma (<3,1 pg/ml) – em algumas modalidades maior do que cerca de 10, 15 ou 30 vezes, até cerca de 54 vezes ou mais. Portanto, a hipercitocinemia pode envolver um nível elevado de

IL-6 de mais do que cerca de 4,7 pg/ml. Mais particularmente, a hiper- citocinemia envolve um nível elevado de IL-6 de mais do que cerca de 4,7 pg/ml no caso de gripe sazonal e mais do que cerca de 7,8 pg/ml no caso de gripe pandêmica.

[0068] Em algumas modalidades, a hipercitocinemia pode envolver um nível elevado de IL-8 de mais do que cerca de 1 ou 2 vezes sua faixa de referência no plasma (<5,0 pg/ml) – em algumas modalidades mais do que cerca de 4 vezes, até cerca de 8, 10 ou 12 vezes ou mais. Portanto, a hipercitocinemia pode envolver um nível elevado de IL-8 maior do que cerca de 5,0 pg/mL. Mais particularmente, a hipercitoci- nemia pode envolver um nível elevado de IL-8 de mais do que cerca de 5,0 pg/ml no caso de gripe sazonal, e mais do que cerca de 11,6 pg/mL no caso de gripe pandêmica.

[0069] Em algumas modalidades, a hipercitocinemia pode envolver um nível elevado de IL-10 de mais do que cerca de 1 ou 2 vezes sua faixa de referência no plasma (202-1480 pg/ml) – em algumas modali- dades mais do que 1,1 vez, mais do que 1,5 vez ou mais do que cerca de 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 vezes, até cerca de 10, 20 ou 30 vezes ou mais. Portanto, a hipercitocinemia pode envolver um nivele levado de IP-10 de mais do que cerca de 835 pg/ml. Mais particularmente, a hipercito- cinemia pode envolver um nível elevado de IP-10 ou mais do que cer- ca de 835 pg/ml no caso de gripe pandêmica, e mais do que cerca de 1476 mg/ml no caso de gripe sazonal.

[0070] Em algumas modalidades, a hipercitocinemia pode envolver um nível elevado de MCP-1 de mais do que cerca de 1 ou 2 vezes sua faixa de referência no plasma (<10,0-57,0 pg/ml) – em algumas moda- lidades maior do que cerca de 4 vezes, até cerca de 5,5 vezes ou mais. Portanto, a hipercitocinemia pode envolver um nível elevado de MCP-1 de mais do que cerca de 52,9 pg/ml. Mais particularmente, a hipercitocinemia pode envolver um nível elevado de MCP-1 de mais do que cerca de 52,9 pg/ml no caso de gripe pandêmica e mais do que cerca de 64,8 pg/ml no caso de gripe sazonal.

[0071] Em algumas modalidades, a hipercitocinemia pode envolver um nível elevado de sTNFR-1 de mais do que cerca de 1 ou 2 vezes sua faixa de referência no plasma (484-1407 pg/ml), até cerca de 2,5 vezes ou mais. Portanto, a hipercitocinemia pode envolver um nível elevado de sTNFR-1 de mais do que creca de 1099,4 pg/ml. Mais par- ticularmente, a hipercitocinemia pode envolver um nível elevado de sTNFR-1 de mais do que cerca de 1099,4 pg/ml no caso de gripe sa- zonal, e mais do que cerca de 1250,7 pg/ml no caso de gripe pandê- mica.

[0072] Em algumas modalidades, a hipercitocinemia pode envolver um nível elevado de MIG de mais do que cerca de 1 ou do que 2 ve- zes sua faixa de referência no plasma (48,0-482,0 pg/ml) – em algu- mas modalidades maior do que 1,1 vez, maior do que 1,5 vez ou maior do que 2 vezes, até cerca de 15, 40 ou 50 vezes ou mais. Portanto, a hipercitocinemia pode envolver um nível elevado de MIG de mais do que cerca de 103,8 pg/ml. Mais particularmente, a hipercitocinemia pode envolver um nível elevado de MIG de mais do que cerca de 103,8 pg/ml no caso de gripe sazonal e mais do que cerca de 118,7 pg/ml no caso de gripe pandêmica.

[0073] Em algumas modalidades, a hipercitocinemia pode envolver um nível elevado de IL-17A de mais do que cerca de 1, 1,5 ou 2 vezes sua faixa de referência no plasma (<10,0 pg/ml) – em algumas modali- dades mais do que 4 vezes, mais do que 5 vezes ou mais do que 6 vezes, até cerca de 7 vezes ou mais. Portanto, a hipercitocinemia po- de envolver um nível elevado de IL-17A de mais do que cerca de 5,0 pg/ml. Mais particularmente, a hipercitocinemia pode envolver um nível elevado de IL-17A de mais do que cerca de 5,0 pg/ml no caso de gripe pandêmica e mais do que cerca de 9,3 pg/ml no caso de gripe sazo-

nal.

[0074] A influenza severa pode ser caracterizada em algumas mo- dalidades por ativação sustentada das citocinas proinflamatórias (IL-6, IL-8, IP10, MCP-1, sTNFR-1 e/ou MIP-1a; por exemplo, IL-6, IL-8, IP10, MCP-1 e/ou sTNFR-1). A presente invenção provê um inibidor de p38 MAPK para uso como aqui divulgado (por exemplo, para uso no tratamento ou prevenção de hipercitocinemia (por exemplo, hiperci- tocinemia associada com infecção pelo vírus da influenza severa) e/ou para uso no tratamento ou prevenção de influenza severa), em que o inibidor de p38 MAPK inibe a liberação de citocinas proinflamatórias a partir de células endoteliais e/ou células imunes e/ou células epiteliais; por exemplo, a partir de células endoteliais e células imunes; ou de células endoteliais, células imunes e células epiteliais. O inibidor de p38 MAPK pode ser administrado em combinação com um agente adi- cional. Em particular, a presente invenção também provê um inibidor de p38 MAPK administrado em combinação com um agente antimicro- biano (tal como um agente antiviral), ou um agente anticâncer, e prefe- rivelmente com um agente antimicrobiano (tal como um agente antivi- ral), em que o inibidor de p38 MAPK inibe a liberação de citocinas proinflamatórias a partir de células endoteliais e/ou células imunes e/ou células epiteliais; por exemplo, a partir de células endoteliais e células imunes; ou de a partir de células endoteliais, células imunes e células epiteliais.

[0075] A presente invenção também provê um método de trata- mento ou prevenção de hipercitocinemia e/ou influenza severa em um indivíduo (por exemplo, um paciente humano ou um animal) com ne- cessidade do mesmo como aqui descrito (por exemplo, um método de tratamento ou prevenção de hipercitocinemia (por exemplo, hipercito- cinemia associada com infecção pelo vírus influenza sevara) e/ou um método de tratamento ou prevenção de influenza severa) em que o inibidor de p38 MAPK inibe a liberação de citocinas proinflamatórias a partir de células endoteliais e/ou células imunes e/ou células epiteliais; por exemplo, a partir de células endoteliais e células imunes; ou a par- tir de células endoteliais, células imunes e células epiteliais. O inibidor de p38 MAPK pode ser administrado em combinação com um agente adicional. Em particular, a presente invenção também provê um méto- do de tratamento ou prevenção de hipercitocinemia e/ou influenza se- vera em um indivíduo (por exemplo, um paciente humano ou um ani- mal) com necessidade do mesmo como aqui descrito, em que o inibi- dor de p38 MAPK é administrado em combinação com um agente an- timicrobiano (tal como um agente antiviral, ou um agente anticâncer, e preferivelmente com um agente antimicrobiano, tal como um agente antiviral), e em que o inibidor de p38 MAPK inibe a liberação de citoci- nas proinflamatórias a partir de células endoteliais e/ou células imunes e/ou células epiteliais; por exemplo, a partir de células endoteliais e células imunes; ou a partir de células endoteliais, células imunes e cé- lulas epiteliais.

[0076] Níveis de citocinas podem ser detectados no sangue inte- gral, soro, plasma, lavagem nasal, secreções nasais ou lavagem bron- quiolar alveolar do paciente. Os níveis de citocina podem ser quantifi- cados usando qualquer técnica adequada conhecida daqueles versa- dos na técnica. Adequadamente, um ensaio imunoabsorvente ligado à enzima (ELISA) ou classificação de célula automatizada fluorescente (FACs) pode ser usado. A título de exemplo, o sistema de imunoen- saio quimioluminescente tal como, por exemplo, aquele que está dis- ponível da Meso Scale Diagnostics LLC (http://web.archive.org/web/20160522190937/https://www.mesoscale.c om/) pode ser empregado por sua velocidade e sensibilidade.

[0077] Ainda ou alternativamente, a influenza severa pode ser acompanhada por contagens de glóbulos brancos total significante-

mente maior. Um paciente com influenza severa pode ter contagens de neutrófilo absolutas significantemente maiores do que um paciente com influenza leve ou moderada. Tipicamente, um paciente com influ- enza severa após 2-9 dias de doença pode ter uma contagem de neu- trófilo na faixa de 2,1-24,5 x 103/μl (comparado com um paciente com influenza moderada após 1-9 dias de doença que pode ter uma conta- gem de neutrófilo na faixa de 0,62-10,88 x 103/μl ou um paciente com influenza leve após 3-8 dias de doença que pode ter uma contagem de neutrófilo na faixa de 0,5-6,5 x 103/μl). Em algumas modalidades, a contagem de plaqueta absoluta pode ser significantemente menor em pacientes com doença severa após 2-9 dias de doença, por exemplo, 27-250 x 103/μl (como comparado com um paciente com influenza moderada após 1-9 dias de doença que pode ter uma contagem de plaqueta na faixa de 55-345 x 103/μl ou um paciente com influenza le- ve após 3-8 dias de doença que pode ter uma contagem de plaqueta na faixa de 79-370 x 103/μl (Hoang e outros, 2014).

[0078] Ainda, ou alternativamente, a influenza severa pode ser ca- racterizada por sintomas ou sinais de hipoxemia ou insuficiência cardi- opulmonar. Em algumas modalidades, o paciente pode ter uma satu- ração de oxigênio arterial de ≤ 92% em ar ambiente através de um mé- todo transcutâneo. Tipicamente, os sintomas ou sinais de hipoxemia ou insuficiência cardiopulmonar podem incluir um ou mais de dispneia, taquipneia, cianose, pressao sanguínea baixa (designada com abaixo da faixa normal para idade e seco) e taquicardia.

[0079] Em algumas modalidades, o paciente pode ter taquipneia (taxa respiratória ≥ 30 para idades ≥ 12 anos, taxa ≥ 40 para idades de 6 a 12 anos, taxa ≥ 45 para idades de 3 a 6 anos, taxa ≥ 50 para ida- des de 1 a 3 anos).

[0080] Em algumas modalidades, o paciente pode ter ou mostrar sinais de desconforto com respiração ou dispneia (incapaz de falar fra-

ses completas, parece sem ar, usando músculos respiratórios acessó- rios).

[0081] Ainda, ou alternativamente, a influenza severa pode ser ca- racterizada por comorbidade com um distúrbio respiratório inferior com ou sem infiltrados pulmonares radiológicos.

[0082] Ainda, ou alternativamente, a influenza severa pode ser ca- racterizada por sintomas ou sinais sugerindo distúrbios neuromuscula- res do SNC e/ou periféricos tais como, por exemplo, encefalite, mielite ou rabdomiólise, incluindo estado mental alterado, inconsciência, so- nolência, dificuldade de acordar, convulsões recorrentes, confusão, dor muscular, fraqueza severa, paralisia e anormalidade sensoriais (por exemplo, formigamento nos membros, perda de sensação de dor normal).

[0083] Ainda, ou alternativamente, a influenza severa pode ser ca- racterizada por desidratação severa. A OMS define desidratação seve- ra em adultos como >9% de perda do peso corporal (em crianças > 15%) (K. Sinha e M. Davenport (eds.), Handbook of Pediatric Surgery, doi: 10.1007/978-1-84882-132-3_2.1, Springer-Verlag London Limited 2010). De acordo com a presente invenção, a influenza severa pode envolver >9%, por exemplo, 10-15%, de perda de fluidos corporais.

[0084] Ainda, ou alternativamente, a influenza severa pode ser ca- racterizada por níveis anormais de fadiga e/ou letargia.

[0085] Ainda, ou alternativamente, a influenza severa pode ser ca- racterizada pela presença de infiltrado pulmonar radiológico.

[0086] Ainda, ou alternativamente, a influenza severa envolve evi- dência de infecção ou replicação viral sustentada. Em algumas moda- lidades, o paciente pode exibir mais de 2 dias de replicação viral cons- tante ou alta que pode ser ensaiada usando métodos de laboratório padrão ou diagnosticada pela identificação de sintomas persistentes ou que pioram. Em algumas modalidades, o paciente pode exibir 3, 4,

5 ou mais dias de replicação viral constante ou que aumenta. Portanto, em algumas modalidades, a influenza severa de acordo com a presen- te invenção pode ser caracterizada por sintomas que persistem ou re- correm por mais de 2, 3, 4, 5 ou mais dias dentro de sinais de melhora. Os sintomas que persistem ou recorrem podem incluir febre (isto é, uma temperatura maior do que 38º C/100º F), letargia, dor, congestão, tosse, congestão sinusal, drenagem sinusal ou congestão ou inflama- ção respiratória superior.

[0087] Ainda, ou alternativamente, a influenza severa pode ser ca- racterizada por uma infecção bacteriana secundária.

[0088] Ainda, ou alternativamente, a influenza severa pode ser ca- racterizada por um distúrbio ou inflamação do trato respiratório inferior.

[0089] Ainda, ou alternativamente, a influenza severa pode ser ca- racterizada por falência de órgão único ou múltipla dos órgãos (por exemplo, falência respiratória ou falência renal) ou choque séptico.

[0090] Em algumas modalidades, o paciente pode ser um bebê (isto é, menos de um ano de vida) ou idoso (isto é, 65 anos de idade ou mais) ou pode ser uma mulher grávida.

[0091] Em algumas modalidades, o paciente humano pode ter uma ou mais comorbidades subjacentes que predispõem o paciente à influenza severa. Por exemplo, o paciente pode ser imunocomprometi- do ou pode sofrer de COPD, anemia genética severa, asma ou diabe- tes, insuficiência hepática ou renal crônica, obesidade ou um distúrbio ou condição cardiovascular.

[0092] Desta maneira, em algumas modalidades, o inibidor de p38 MAPK pode ser administrado ao paciente profilaticamente, especial- mente onde o paciente está em um grupo de "alto risco" ou "sob risco" como mencionado nos parágrafos precedentes.

[0093] O inibidor de p38 MAPK pode ser administrado ao paciente após hipercitocinemia ter se desenvolvido, por exemplo, após o paci-

ente ter sido admitido no hospital. O inibidor de p38 MAPK pode ser administrado após o ponto crítico (limiar ou ponto de inflexão) onde a resposta inflamatória normal se torna uma resposta anormal. O inibidor de p38 MAPK pode ser administrado para evitar desenvolvimento de hipercitocinemia, isto é, antes do ponto crítico ser atingido. Esse ponto crítico é caracterizado por um nível limiar de citocinas. O nível limiar de citocinas será, em parte, dependente do paciente. O inibidor de p38 MAPK pode ser primeiro administrado pelo menos 8 horas após uma resposta imune ser disparada, por exemplo, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46 ou 47 horas após a resposta imune ser disparada. O inibidor de p38 MAPK pode ser primeiro admi- nistrado ao paciente pelo menos 48 horas após uma resposta imune ser disparada, pelo menos 60 horas, pelo menos 72 horas, pelo menos 84 horas, pelo menos 96 horas, pelo menos 108 horas, pelo menos 120 horas, pelo menos 132 horas, pelo menos 144 horas, pelo menos 156 horas, pelo menos 168 horas, pelo menos 180 horas, pelo menos 192 horas, pelo menos 204 horas, pelo menos 216 horas, pelo menos 228 horas, pelo menos 240 horas após uma resposta imune ser dispa- rada. O inibidor de p38 MAPK pode ser administrado em ocasiões múl- tiplas em pontos de tempo múltiplos após uma resposta imune ser dis- parada. A resposta imune pode ser disparada, por exemplo, através de exposição a um patógeno, por exemplo, infecção pelo vírus influenza levando à infecção pelo vírus influenza severa, ou a resposta imune pode ser disparada por câncer ou pode ser disparada por uma respos- ta autoimune.

[0094] O inibidor de p38 MAPK pode ser administrado em uma do- se entre cerca de 10 mg e cerca de 1000 mg, por exemplo, entre 10 mg e 1000 mg ou entre 10 mg e 400 mg. Até 1000 mg podem ser ad- ministrados por dia em uma dose única ou múltiplas por entre 1 e 10 dias, por exemplo, por 2 dias, 3 dias, 4 dias, 5 dias, 6 dias, 7 dias, 8 dias, 9 dias ou 10 dias.

[0095] A presente invenção também provê um inibidor de p38 MAPK administrado em combinação com um agente adicional. Em particular, a presente invenção também provê um inibidor de p38 MAPK administrado em combinação com um agente antimicrobiano, tal como um agente antiviral, ou um agente anticâncer, e preferivel- mente com um agente antimicrobiano, tal como um agente antiviral. Onde o inibidor de p38 MAPK é administrado em combinação com um agente adicional (por exemplo, um agente antimicrobiano, tal como um agente antiviral ou um agente anticâncer), o inibidor de p38 MAPK e agente adicional pode ser administrado simultaneamente ou o inibidor de p38 MAPK e o agente adicional podem ser administrados sequen- cialmente ou o inibidor de p38 MAPK e o agente adicional podem ser administrados separadamente. Em particular, o agente adicional pode ser administrado antes do inibidor de p38 MAPK.

[0096] Preferivelmente, o inibidor de p38 MAPK e o agente adicio- nal (por exemplo, um agente antimicrobiano, tal como um agente anti- viral ou um agente anticâncer) podem ser administrados simultanea- mente, por exemplo, em uma forma de dosagem única para adminis- tração simultânea, por exemplo, para administração oral simultânea. Uma forma de dosagem única pode ser também referida como uma ‘dose unitária’ ou ‘forma de dosagem unitária’. Uma forma de dosagem única compreendendo um inibidor de p38 MAPK e um agente adicional compreende uma mistura do inibidor de p38 MAPK e o agente adicio- nal, e opcionalmente também componentes inativos tais como excipi- entes farmaceuticamente aceitáveis. A forma de dosagem única para administração oral simultânea pode, por exemplo, ser um comprimido, pó ou cápsula.

[0097] A presente invenção também provê um inibidor de p38

MAPK para uso como descrito aqui (por exemplo, para uso no trata- mento ou prevenção de hipercitocinemia (por exemplo, hipercitocine- mia associada com infecção pelo vírus influenza severa) e/ou para uso no tratamento ou prevenção de influenza severa), em que o inibidor de p38 MAPK é administrado sistemicamente ou não sistemicamente, e preferivelmente sistemicamente, e em particular oralmente.

[0098] A presente invenção também provê uma composição far- macêutica para uso como aqui descrito (por exemplo, para uso no tra- tamento ou prevenção de hipercitocinemia (por exemplo, hipercitoci- nemia associada com infecção pelo vírus influenza severa) e/ou para uso no tratamento ou prevenção de influenza severa), em que a com- posição farmacêutica é formulada para administração oral.

[0099] As modalidades da invenção provendo um inibidor de p38 MAPK (por exemplo, um inibidor de p38 MAPK de fórmula I) adminis- trado em combinação com um agente antiviral (por exemplo, um agen- te antiviral inibidor de neuraminidase (por exemplo, fosfato de oselta- mivir)) são especialmente preferidas como modalidades da invenção porque os inventores constataram surpreendentemente que um inibi- dor de p38 MAPK não interfere com o efeito de um agente antiviral (por exemplo, um agente antiviral inibidor de neuraminidase (por exemplo, fosfato de oseltamivir)) e um agente antiviral (por exemplo, um agente antiviral inibidor de neuraminidase (por exemplo, fosfato de oseltamivir)) não interfere com o efeito de um inibidor de p38 MAPK.

[00100] Em um outro aspecto da presente invenção é provido um método de tratamento como aqui descrito (por exemplo, para um mé- todo de tratamento ou prevenção de hipercitocinemia (por exemplo, hipercitocinemia associada com infecção pelo vírus influenza severa) e/ou um método de tratamento ou prevenção de influenza severa) em um indivíduo (por exemplo, um paciente humano ou animal) que com- preende administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de um inibidor de p38 MAP cinase a um indivíduo com necessidade do mes- mo em que o inibidor de p38 MAPK é administrado sistemicamente ou não sistemicamente ao indivíduo (por exemplo, um paciente humano ou animal), e preferivelmente sistemicamente, e em particular oralmen- te. Descrição Detalhada da Invenção

[00101] Inibidores de p38 MAPK são uma classe estabelecida de agentes ativos (vide, por exemplo, Zarubin e Han, Cell Research (2005) 15, 11–18. doi:10.1038/sj.cr.7290257). Uma ampla faixa de ini- bidores de p38 MAPK está disponível àqueles versados na técnica (vi- de, por exemplo, Lee e outros, Inhibition of p38 MAP kinase as a the- rapeutic strategy, Immunopharmacol., 2000; 47(2-3): 185–201. doi:10.1016/S0162-3109(00)00206-X, que é aqui incorporado a título de referência). Exemplos de inibidores de p38 MAPK incluem VX-745, VX-702, RO-4402257, SCIO-469, BIRB-746, SD-0006, PH-787804, AMG-548, SB-681323 (Dilmapimode), LY2228820, GW-856553, RWJ67657 e BCT-197 (Xing, L., MAP Kinase 2015, Vol. 4:5508, que é aqui incorporado a título de referência). Esses são exemplos de inibi- dores de p38 MAPK que atingiram testes humanos.

[00102] Um inibidor de p38 MAPK preferido da presente invenção é representado pela Fórmula I ou um sal ou solvato farmaceuticamente aceitável do mesmo: Fórmula I em que R é como acima definido.

[00103] O inibidor de p38 MAPK de Fórmula I pode ter Fórmula II ou um sal ou solvato farmaceuticamente aceitável do mesmo: Fórmula II

[00104] O inibidor de p38 MAPK de Fórmula I pode ter Fórmula III ou um sal ou solvato farmaceuticamente aceitável do mesmo: Fórmula III

[00105] Os inibidores de p38 MAPK de Fórmulas I, II e III têm uma estrutura similar e são todos imaginados interagir com o sítio ativo de P38 MAPK para inibir sinalização mediada por p38 MAPK. Os inibido- res de Fórmulas I, II e III são pensados inibir especificamente p38α e p38β.

[00106] Os compostos de Fórmula I podem ter vantagens particula- res como inibidores de p38 MAPK, tais como aqueles descritos abaixo. Certos compostos dentro do escopo de Fórmula I podem ter proprie- dades farmacocinéticas particularmente favoráveis (e em particular propriedades farmacocinéticas favoráveis que os tornem especialmen- te adequados para administração oral), e/ou propriedades favoráveis devido a terem um perfil de efeito colateral baixo e/ou toxicidade baixa.

Tais compostos incluem compostos de Fórmula I em que R é um gru- po C1-3 alquila substituído e/ou em que R é uma porção propila substi- tuída ou não substituída, por exemplo, o composto de Fórmula II em que R é propano-3-ol.

[00107] O uso de um inibidor de p38 MAPK de acordo com a pre- sente invenção tem como objetivo tratar ou evitar hipercitocinemia. Como mostrado acima, hipercitocinemia é caracterizada por uma res- posta inflamatória exagerada e há um ponto crítico (isto é, limiar ou ponto de inflexão) onde a resposta normal se torna uma resposta anormal e hipercitocinemia se desenvolve. Esse ponto crítico é carac- terizado por um nível limiar de citocinas. O nível limiar de citocinas se- rá, em parte, dependente do paciente.

[00108] Hipercitocinemia pode estar associada com várias condi- ções infecciosas e condições não infecciosas. Em particular, hipercito- cinemia pode estar associada com infecção pelo vírus influenza seve- ra; doença enxerto-versus-hospedeiro (GVHD); síndrome do descon- forto respiratório agudo (ARDS); sepse; Ebola; varíola; síndrome da resposta inflamatória sistêmica (SIRS); infecção bacteriana; e câncer.

[00109] Em particular, o uso de um inibidor de p38 MAPK de acordo com a presente invenção tem como objetivo atenuar a resposta infla- matória em um paciente com influenza severa, ao invés de realizar sua ablação, com o objetivo de embotar os efeitos danosos da inflamação fora de controle, enquanto preservando seus efeitos protetores e de pró-resolução de doença. Ablação total de inflamação seria provável promove mortalidade em influenza severa, enquanto atenuação desse processo explosivo deve prover proteção contra os efeitos danosos causados por respostas inflamatórias excessivas enquanto preservan- do as atividades de defesa inatas essenciais do hospedeiro. A presen- te invenção desta maneira tem como objetivo "reequilibrar o sistema" ao invés de inativar os componentes em sua totalidade.

[00110] Os inibidores de p38 MAPK que são especialmente úteis em "sistema de reequilíbrio" através da atenuação da resposta infla- matória em um paciente com hipercitocinemia associada com influen- za severa incluem os compostos de Fórmula I e, em particular, os compostos de Fórmula I em que R é grupo C1-3 alquila substituído e/ou em que R é um grupo propila substituído ou não substituído, por exemplo, o composto de Fórmula II em que R é propan-3-ol. Tais compostos podem ser muito eficazes na atenuação da resposta infla- matória em um paciente com influenza severa, mas não ablatem a resposta imune em sua totalidade; por exemplo, como mostrado pelos resultados dos Exemplos 6 e 8 nas FIGS. 17, 18, 20 e 21 abaixo.

[00111] Ainda, a partir do Exemplo 6 e Exemplo 8 abaixo, o com- posto de Fórmula II exibiu efeitos consistentemente melhores do que o composto de Fórmula III na atenuação da resposta inflamatória em células endoteliais e imunes quando estímulos simples (TNFα mais IL- 6) e complexos (sopa viral de HBEC ou A459) foram aplicados para estimular a interação de mediadores inflamatórios produzidos por célu- las epiteliais infectadas por influenza em células endoteliais e células imunes. Portanto, em certas modalidades, o composto de Fórmula I é preferivelmente um em que R é um grupo C2-3 alquila substituído e/ou em que R é uma porção propila substituída ou não substituída e mais preferivelmente o composto de Fórmula I é o composto de Fórmula II.

[00112] O inibidor de p38 MAPK pode ser administrado em combi- nação com um agente antimicrobiano. O agente antimicrobiano pode ser qualquer um, ou mais, do que segue: um anticorpo monoclonal an- tibacteriano, um antibiótico, um antifúngico, um antiviral, um antiparasí- tico e/ou um antimicrobiano. Um anticorpo monoclonal antimicrobiano é qualquer anticorpo monoclonal que é usado para tentar tratar ou prevenir doença microbiana.

[00113] Em particular, o inibidor de p38 MAPK pode ser administra-

do em combinação com um agente antiviral. O agente antiviral pode ser qualquer um, ou mais, dos que seguem ou sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos: amantadina; rimantadina; ribavirina; idoxuridi- na; trifluridina; vidarabina; aciclovir; ganciclovir; foscarnete; zidovudina; didanosina; zalcitabina; estavudina; famciclovir; valaciclovir; antitussí- genos; mucolíticos; expectorantes; antipiréticos; analgésicos e/ou des- congestionantes nasais. Preferivelmente, o agente antiviral é um inibi- dor de neuraminidase tal como: fosfato de oseltamivir, zanamivir, pe- ramivir e/ou laninamivir. Em um aspecto preferido o inibidor de p38 MAPK é administrado em combinação com oseltamivir ou um sal far- maceuticamente aceitável do mesmo (por exemplo, fosfato de oselta- mivir). Embora não desejando ser limitado pela teoria, é tomado como hipótese que o fosfato de oseltamivir combate a infecção por influenza (tem um efeito antiviral) enquanto o inibidor de p38 MAPK tem um efei- to imunomodulador contra hipercitocinemia.

[00114] Foi surpreendentemente constatado pelos presentes inven- tores que inibidores de p38 MAPK e agentes antivirais (tais como agentes antivirais inibidores de neuraminidase (por exemplo, fosfato de oseltamivir)), e mais especialmente inibidores de p38 MAPK de Fórmula I e agentes antivirais inibidores de neuraminidase (por exem- plo, fosfato de oseltamivir), não interferem significantemente com a atividade um do outro, isto é, agentes antivirais não anulam os efeitos anti-inflamatórios atenuantes de inibidores de p38 MAPK; e os inibido- res de p38 MAPK não anulam os efeitos antivirais de agentes antivi- rais. Por exemplo, os resultados do Exemplo 9 nas FIGS. 22 e 23 abaixo mostram que quando oseltamivir foi combinado com compostos de Fórmula II, TCID50 foi reduzida para o nível visto com oseltamivir sozinho, indicando que a terapia com inibidor de p38 MAPK pode ser usada em combinação com oseltamivir sem impactar materialmente sua atividade antiviral (FIG. 22); e também que oseltamivir não tinha nenhum efeito observado sobre as propriedades anti-inflamatórias do composto de Fórmula II (FIG. 23).

[00115] A não interferência entre esses agentes é especialmente vantajosa porque, como descrito acima, as propriedades anti- inflamatórias do composto inibidor de p38 MAPK podem ser usadas de acordo com a presente invenção para "reequilibrar o sistema" de in- flamação no corpo quando usado no tratamento de hipercitocinemia associada com influenza severa. Portanto, qualquer aumento ou dimi- nuição nas propriedades anti-inflamatórias do inibidor de p38 MAPK poderia levar a uma perda do efeito de equilíbrio do composto inibidor de p38 MAPK, por exemplo, uma diminuição nas propriedades anti- inflamatórias do inibidor de p38 MAPK pode não embotar suficiente- mente os efeitos danosos da inflamação fora de controle, e um aumen- to nas propriedades anti-inflamatórias do inibidor de p38 MAPK pode realizar ablação dos efeitos protetores e de pró-resolução de doença necessários da resposta inflamatória do corpo. É também vantajoso que o composto inibidor de p38 MAPK não afete de modo adverso os efeitos antivirais do agente antiviral.

[00116] Desta maneira, em uma outra modalidade, a presente in- venção provê um inibidor de p38 MAPK para uso na presente inven- ção (por exemplo, para uso no tratamento ou prevenção de hipercito- cinemia (por exemplo, hipercitocinemia associada com infecção pelo vírus influenza severa) e/ou para uso no tratamento ou prevenção de influenza severa), em que o inibidor de p38 MAPK é administrado a um paciente que foi administrado com um agente antiviral para o tra- tamento de gripe severa. Em tais modalidades, o inibidor de P38 MAPK pode ser administrado, por exemplo, dentro de 72 horas, 60 ho- ras, 48 horas, 36 horas, 24 horas, 16 horas, 12 horas, 10 horas, 8 ho- ras, 6 horas, 4 horas ou 1 hora de administração do agente antiviral. O agente antiviral pode ser um como acima descrito (por exemplo, fosfa-

to de oseltamivir.

[00117] Em uma modalidade adicional, a presente invenção provê um inibidor de p38 MAPK para uso na presente invenção (por exem- plo, para uso no tratamento ou prevenção de hipercitocinemia (por exemplo, hipercitocinemia associada com infecção pelo vírus influenza severa) e/ou para uso no tratamento ou prevenção de influenza seve- ra), em que o inibidor de p38 MAPK é administrado a um paciente que está sob tratamento de gripe severa compreendendo administrar um agente antiviral. Em tais modalidades, o paciente pode ter passado por tratamento de gripe severa compreendendo administrar um agente an- tiviral por pelo menos 1 hora (por exemplo, 1 hora, 2 horas, 4 horas, 8 horas, 12 horas, 1 dia, 2 dias, 3 dias, 4 dias, 5 dias, 6 dias, 7 dias, 9 dias ou 10 dias), pelo menos 2 horas (por exemplo, 2 horas, 4 horas, 8 horas, 12 horas, 1 dia, 2 dias, 3 dias, 4 dias, 5 dias, 6 dias, 7 dias, 9 dias ou 10 dias), pelo menos 4 horas (por exemplo, 4 horas, 8 horas, 12 horas, 1 dia, 2 dias, 3 dias, 4 dias, 5 dias, 6 dias, 7 dias, 9 dias ou 10 dias), pelo menos 8 horas (por exemplo, 8 horas, 12 horas, 1 dia, 2 dias, 3 dias, 4 dias, 5 dias, 6 dias, 7 dias, 9 dias ou 10 dias), pelo me- nos 12 horas (por exemplo, 12 horas, 1 dia, 2 dias, 3 dias, 4 dias, 5 dias, 6 dias, 7 dias, 9 dias ou 10 dias) pelo menos 1 dia (1 dia, 2 dias, 3 dias, 4 dias, 5 dias, 6 dias, 7 dias, 9 dias ou 10 dias), pelo menos 2 dias (por exemplo, 2 dias, 3 dias, 4 dias, 5 dias, 6 dias, 7 dias, 9 dias ou 10 dias) ou 3 dias (por exemplo, 3 dias, 4 dias, 5 dias, 6, dias 7 di- as, 9 dias ou 10 dias), antes do tratamento com o inibidor de p38 MAPK. O agente antiviral pode ser um como acima descrito (por exemplo, fosfato de oseltamivir).

[00118] Em uma outra modalidade, a presente invenção provê um método de tratamento ou prevenção de hipercitocinemia em um paci- ente humano com descrito aqui (por exemplo, um método de tratamen- to ou prevenção de hipercitocinemia (por exemplo, hipercitocinemia associada com infecção pelo vírus influenza severa) e/ou um método de tratamento ou prevenção de influenza severa), em que o inibidor de p38 MAPK é administrado a um paciente que foi administrado com um agente antiviral para o tratamento de gripe severa. Em tais modalida- des, o inibidor de p38 MAPK pode ser administrado, por exemplo, den- tro de 72 horas, 60 horas, 48 horas, 36 horas, 24 horas, 16 horas, 12 horas, 10 horas, 8 horas, 6 horas, 4 horas, 2 horas ou 1 hora de admi- nistração do agente antiviral. O agente antiviral pode ser um como acima descrito (por exemplo, fosfato de oseltamivir).

[00119] Em modalidades onde o agente antiviral é oseltamivir ou um sal do mesmo, e em particular em modalidades onde o agente an- tiviral é fosfato de oseltamivir, o oseltamivir ou um sal do mesmo (por exemplo, o fosfato de oseltamivir) pode ser administrado em uma dose de a partir de cerca de 1 mg a 200 mg, por exemplo, entre 5 mg e 100 mg (por exemplo, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20, 30, 45, 50, 75 ou 100 mg), e preferivelmente entre 6 mg e 75 mg, preferivelmente 6, 12, 30, 45 ou 75 mg). Doses simples ou múltiplas do agente antiviral podem ser administradas em um dia, por exemplo, 1 dose por dia ou 2 doses por dia.

[00120] Em modalidades onde o agente antiviral é oseltamivir ou um sal do mesmo, e em particular em modalidades onde o agente an- tiviral é fosfato de oseltamivir, o oseltamivir ou um sal do mesmo (por exemplo, o fosfato de oseltamivir) pode ser administrado como uma dose para atingir um nível no plasma sanguíneo de carboxilato de oseltamivir de 1 a 750 μg/L, preferivelmente 5 a 600 μg/L, preferivel- mente 10 a 500 μg/mL, mais preferivelmente 25 a 500 μg/mL e mais preferivelmente 50 a 500 μg/L, por exemplo, 100 a 400 μg/L. Doses simples ou múltiplas do agente antiviral podem ser administradas em um dia, por exemplo, 1 dose por dia, ou duas doses por dia, para atin- gir um nível no plasma sanguíneo de carboxilato de oseltamivir como acima descrito.

[00121] Em uma modalidade adicional, a presente invenção provê um método de tratamento ou prevenção de hipercitocinemia em um paciente humano como descrito aqui (por exemplo, um método de tra- tamento ou prevenção de hipercitocinemia (por exemplo, hipercitoci- nemia associada com infecção pelo vírus influenza severa) e/ou um método de tratamento ou prevenção de influenza severa), em que o inibidor de p38 MAPK é administrado a um paciente que está sob tra- tamento de gripe severa compreendendo administrar um agente antivi- ral. Em tais modalidades, o paciente pode ter passado por tratamento de gripe severa compreendendo administrar um agente antiviral por pelo menos 1 horas (por exemplo, 1 hora, 2 horas, 4 horas, 8 horas, 12 horas, 1 dia, 2 dias, 3 dias, 4 dias, 5 dias, 6 dias, 7 dias, 9 dias ou 10 dias), pelo menos 2 horas (por exemplo, 2 horas, 4 horas, 8 horas, 12 horas, 1 dia, 2 dias, 3 dias, 4 dias, 5 dias, 6 dias, 7 dias, 9 dias ou 10 dias), pelo menos 8 horas (por exemplo, 8 horas, 12 horas, 1 dia, 2 dias, 3 dias, 4 dias, 5 dias, 6 dias, 7 dias, 9 dias ou 10 dias), pelo me- nos 12 horas (por exemplo, 12 horas, 1 dia, 2 dias, 3 dias, 4 dias, 5 dias, 6 dias, 7 dias, 9 dias ou 10 dias), pelo menos 1 dia (1 dia, 2 dias, 3 dias, 4 dias, 5 dias, 6 dias, 7 dias, 9 dias ou 10 dias), pelo menos 2 dias (por exemplo, 2 dias, 3 dias, 4 dias, 5 dias, 6 dias, 7 dias, 9 dias ou 10 dias) ou 3 dias (por exemplo, 3 dias, 4 dias, 5 dias, 6 dias, 7 di- as, 9 dias ou 10 dias), antes do tratamento com o inibidor de p38 MAPK. O agente antiviral pode ser um como acima descrito (por exemplo, fosfato de oseltamivir).

[00122] O inibidor de p38 MAPK pode ser administrado em combi- nação com um agente anticâncer. Um agente anticâncer é qualquer agente que é usado para tentar tratar ou prevenir câncer.

[00123] O inibidor de p38 MAPK pode ser administrado sistemica- mente ou não sistemicamente, tal como oralmente, ou topicamente,

incluindo epidermalmente, bucalmente, intranasalmente ou via inala- ção (aerossol) ou ambos intranasalmente ou via inalação ou parente- ralmente (por exemplo, intravenosamente, subcutaneamente) ou em combinação topicamente ou parenteralmente.

[00124] Como aqui usado, "topicamente" inclui administrado não sistêmica. Isso inclui a aplicação de um composto externamente à epi- derme ou à cavidade bucal e/ou a instilação de tal composto no ouvi- do, olho ou nariz.

[00125] Como aqui usado, "administração sistêmica" se refere à administração oral intravenosa, intraperitoneal e intramuscular, intra- nasal subcutânea, intrarretal ou intravaginal.

[00126] Em particular o inibidor de p38 MAPK pode ser administra- do intravenosamente. Preferivelmente o inibidor de p38 MAPK é admi- nistrado oralmente. Administração oral permite um efeito sistêmico ao invés de localizado. Isso é vantajoso uma vez que pode permitir que todos os tipos de célula associados com e/ou afetados por hipercitoci- nemia (em particular hipercitocinemia associada com gripe severa) se- jam tratados com o inibidor de p38 MAPK (isto é, células endoteliais, células epiteliais e/ou células imunes). Ainda, formulações orais, por exemplo, comprimidos, são fáceis de tomar e então estão associadas com melhor obediência do paciente. Administração oral é particular- mente vantajosa quando outras vias de administração, tal como inala- ção, seriam difíceis, por exemplo, quando um paciente está sofrendo de complicações pulmonares.

[00127] Será reconhecido por aqueles versados na técnica que a quantidade e espaçamento ótimos das dosagens individuais de um inibidor de p38 MAPK serão determinados pela natureza e grau da condição sendo tratada, a forma, via e sítio de administração e o paci- ente particular sendo tratado, e que tais ótimos podem ser determina- dos através de técnicas convencionais. Será também compreendido por um versado na técnica que o curso ótimo de tratamento, isto é, o número de doses de um inibidor de p38 MAPK dado por dia por um número definido de dias, pode ser determinado por aqueles versados na técnica usando testes de determinação de curso de tratamento convencionais. No entanto, em vista de seu papel de sinalização- chave, se direcionar à p38 MAP cinase pode resultar em efeitos cola- terais indesejados. A fim de minimizar quaisquer tais efeitos colaterais, o inibidor de p38 MAPK pode ser administrado a um paciente de acor- do com a presente invenção por um período máximo de 1-5 dias, pre- ferivelmente 1-3 dias. Em algumas modalidades, o inibidor de p38 MAPK pode ser administrado por apenas um ou dois dias. Tratamento uma vez por dia pode ser também preferido para minimizar quaisquer efeitos colaterais prejudiciais.

[00128] Em ainda um outro aspecto da presente invenção é provida uma composição farmacêutica para uso no tratamento ou prevenção de hipercitocinemia em um paciente humano, a composição compre- endendo um inibidor de p38 MAPK tendo Fórmula, I, Fórmula II e/ou Fórmula III, sais ou solvatos farmaceuticamente aceitáveis dos mes- mos.

[00129] Em particular, é provida uma composição farmacêutica para uso no tratamento ou prevenção de influenza severa em um paciente humano, a composição compreendendo um inibidor de p38 MAPK tendo Fórmula I, Fórmula II e/ou Fórmula III, e sais ou solvatos farma- ceuticamente aceitáveis dos mesmos, opcionalmente em combinação com um ou mais diluentes ou carreadores farmaceuticamente aceitá- veis. Diluentes e carreadores podem incluir aqueles adequados para administração parenteral oral, tópica, mucosal e retal.

[00130] Uma composição farmacêutica compreendendo um inibidor de p38 MAPK (por exemplo, um inibidor de p38 MAPK de Fórmula I, Fórmula II e/ou Fórmula III ou sais ou solvatos farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos) pode compreender ainda, ou ser administrada em combinação com, um agente adicional. O agente adicional pode ser um agente antimicrobiano ou agente anticâncer. Em particular, o agente adicional pode ser um agente antiviral e mais especificamente oseltamivir ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo (por exemplo, fosfato de oseltamivir).

[00131] Como aqui usado, o termo "sais ou solvatos farmaceutica- mente aceitáveis" se refere a sais ou solvatos que retêm a atividade biológica desejada do composto-objeto e exibem efeitos toxicológicos indesejados mínimos. Esses sais farmaceuticamente aceitáveis podem ser preparados in situ durante o isolamento e purificação finais do composto ou reagindo separadamente o composto purificado em sua forma de ácido livre ou base livre com uma base ou ácido adequado, respectivamente.

[00132] Os compostos da invenção podem existir em forma cristali- na ou não cristalina (amorfa) ou como misturas das mesmas. Para compostos da invenção que estão em forma cristalina, o versado com- preenderá que solvatos farmaceuticamente aceitáveis podem ser for- mados, em que as moléculas solventes são incorporadas ao látice cristalino durante cristalização. Solvatos podem envolver solventes não aquosos tais como etanol, isopropanol, DMSO, ácido acético, eta- nolamina e acetato de etila, ou eles podem envolver água como o sol- vente que é incorporado ao látice cristalino. Solvatos em que água é o solvente que é incorporado ao látice cristalino são tipicamente referi- dos como "hidratos". Hidratos incluem hidratos estequiométricos bem como composições contendo quantidades viáveis de água. A invenção inclui também tais solvatos.

[00133] Certos compostos da invenção que existem em forma cris- talina, incluindo os vários solvatos dos mesmos, podem exibir polimor- fismo (isto é, a capacidade de ocorrer em estruturas cristalinas diferen-

tes). Essas formas cristalinas diferentes são tipicamente conhecidas como "polimorfos". A invenção inclui todos tais polimorfos. Polimorfos têm a mesma composição química, mas diferem em empacotamento, arranjo geométrico e outras propriedades descritivas do estado sólido cristalino. Polimorfos, portanto, podem ter propriedades físicas diferen- tes tais como formato, densidade, dureza, deformabilidade, estabilida- de e propriedades de dissolução. Polimorfos exibem tipicamente pon- tos de fusão diferentes, espectros de IR e padrões de difração de raio- X em pó que podem ser usados para identificação. Polimorfos diferen- tes podem ser produzidos, por exemplo, mudando ou ajustando as condições de reação ou reagentes usados na fabricação do composto. Por exemplo, mudanças em temperatura, pressão ou solvente podem resultar em polimorfos. Ainda, um polimorfo pode converter esponta- neamente em um outro polimorfo sob certas condições.

[00134] A composição farmacêutica da invenção pode ser prepara- da, por exemplo, para administração parenteral, subcutânea, intra- muscular, intravenosa, intra-articular ou peri-articular, particularmente na forma de soluções ou suspensões líquidas; para administração oral, particularmente na forma de comprimidos ou cápsulas; para adminis- tração tópica, por exemplo, pulmonar ou intranasal, particularmente na forma de pós, gotas nasais ou aerossóis e administração transdermal; para administração mucosal, por exemplo, à mucosa bucal, sublingual ou vaginal, e para administração retal, por exemplo, na forma de um supositório.

[00135] A composição pode ser convenientemente administrada em forma de dosagem unitária e pode ser preparada através de qual- quer um dos métodos bem conhecidos na técnica farmacêutica, por exemplo, como descrito em Remington’s Pharmaceuticam Sciences, 17ª ed, Mack Publishing Company, Easton, Pa., (1985). Uma formula- ção para administração parenteral pode conter como excipientes água estéril ou solução salina, alquileno glicóis tal como propileno glicol, po- lialquileno glicóis tal como polietileno glicol, óleos de origem vegetal, naftalenos hidrogenados e similar. Uma formulação para administra- ção nasal pode ser sólida e pode conter excipientes, por exemplo, lac- tose ou dextrano, ou pode ser soluções aquosas ou oleosas para uso na forma de gotas nasais ou spray medido. Para administração bucal excipientes típicos incluem açúcares, estearato de cálcio, estearato de magnésio, amido pré-gelatinizado e similar.

[00136] Em particular, a composição farmacêutica pode ser formu- lada para administração oral. Uma composição adequada para admi- nistração oral pode compreender um ou mais carreadores e/ou excipi- entes fisiologicamente compatíveis e pode estar em forma sólida ou líquida. Comprimidos e cápsulas podem ser preparados com agentes de ligação, por exemplo, xarope, acácia, gelatina, sorbitol, tragacanto ou poli-vinilpirrolidona; cargas, tais como lactose, sacarose, amido de milho, fosfato de cálcio, sorbitol ou glicina; lubrificantes, tais como es- tearato de magnésio, talco, polietileno glicol ou sílica; e tensoativos, tal como lauril sulfato de sódio. Uma composição líquida pode conter adi- tivos convencionais tais como agentes de suspensão, por exemplo, xarope de sorbitol, metil celulose, xarope de açúcar, gelatina, carboxi- metil-celulose ou gorduras comestíveis; agentes emulsificantes tais como lecitina ou acácia; óleos vegetais tais com óleo de amêndoa, óleo de coco, óleo de fígado de bacalhau ou óleo de amendoim; con- servantes tal como hidroxianisol butilado (BHA) e hidroxitolueno butila- do (BHT). Uma composição líquida pode ser encapsulada em, por exemplo, gelatina para prover uma forma de dosagem unitária.

[00137] Uma forma de dosagem oral sólida pode incluir comprimi- dos, cápsulas de casca dura de duas peças e cápsulas de gelatina elásticas macias (SEG).

[00138] Uma formulação de casca seca compreende tipicamente cerca de 40% a 60% de concentração de gelatina, uma concentração de cerca de 20% a 30% de plastificante (tal como gelatina, sorbitol ou propileno glicol) e uma concentração de cerca de 30% a 40% de água. Outros materiais tais como conservantes, corantes, opacificantes e saborizantes também podem estar presentes. O material de preenchi- mento líquido pode compreender um fármaco sólido que foi dissolvido, solubilizado ou disperso (com agentes de suspensão tal como cera de abelha, óleo de rícino hidrogenado ou polietileno glicol 400) ou um fármaco líquido em veículos ou combinações de veículos tais como óleo mineral, óleos vegetais, triglicerídeos, glicóis, polióis e agentes tensoativos.

[00139] Em algumas modalidades, as composições da invenção podem ser administradas topicamente ao pulmão. Em algumas moda- lidades, portanto, a composição da invenção pode compreender um inibidor de p38 MAPK opcionalmente em combinação com um ou mais diluentes ou veículos topicamente aceitáveis. Administração tópica ao pulmão pode ser obtida através do uso de uma formulação aerossol. Formulações aerossol compreendem tipicamente o ingrediente ativo suspenso ou dissolvido em um propelente aerossol adequado, tal co- mo clorofluorcarboneto (CFC) ou um hidrofluorcarboneto (HFC). Pro- pelentes de CFC adequados incluem tricloromonofluormetano, dicloro- tetrafluormetano e diclorodifluormetano. Propelentes de HFC adequa- dos incluem tetrafluormetano (HFC-134a) e heptafluorpropano (HFC- 227). O propelente compreende tipicamente 40% a 99,5%, por exem- plo, 40% a 90% em peso da composição de inalação total. A formula- ção pode compreender excipientes incluindo cossolventes (por exem- plo, etanol) e tensoativos (por exemplo, lecitina, trioleato de sorbitano e similar). Formulações aerossóis são empacotadas em latas e uma dose adequada é administrada por meio de uma válvula de medição (por exemplo, conforme provido pela Bespak, Valois ou 3M).

[00140] Administração tópica ao pulmão também pode ser obtida através do uso de uma formulação não pressurizada tal como uma so- lução ou suspensão aquosa. Isso pode ser administrado por meio de um nebulizador. Administração tópica ao pulmão pode ser também ob- tida através do uso de um inalador de dose medida pressurizado (pMDI) ou uma formação em pó seco. Uma formulação em pó seco conterá o inibidor de p38 MAPK em forma finamente dividida, tipica- mente com um diâmetro de massa médio (MMAD) de 1-10 mícrons. A formulação conterá tipicamente um diluente topicamente aceitável tal como lactose, geralmente de tamanho de partícula grande, por exem- plo, um diâmetro de massa médio (MMAD) de 100 μm ou mais. Siste- mas de administração em pó seco exemplares incluem SPINHALER, DISKHALER, TURBOHALER, DISKUS e CLICKHALER.

[00141] Em ainda um outro aspecto da presente invenção é provido um método para tratamento ou prevenção de hipercitocinemia em um paciente humano com necessidade do mesmo compreendendo admi- nistrar ao paciente uma quantidade terapeuticamente ou profilatica- mente eficaz de um inibidor de p38 MAPK tendo a Fórmula I, Fórmula II ou Fórmula III ou sais ou solvatos farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos. Em particular, é provido um método para tratamento ou pre- venção de infecção pelo vírus influenza severa.

[00142] O método pode incluir administrar um inibidor de p38 MAPK em combinação com um agente adicional. O agente adicional pode ser um agente antimicrobiano ou um agente anticâncer. Em particular, o agente adicional pode ser um agente antiviral e mais especificamente oseltamivir ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo (por exemplo, fosfato de oseltamivir). Em particular, o inibidor de p38 MAPK pode ser administrado oralmente.

[00143] Será compreendido que a descrição da presente invenção até agora uma vez que ela se refere a inibidores de p38 MAP cinase para uso na presente invenção (por exemplo, para uso no tratamento ou prevenção de hipercitocinemia (por exemplo, hipercitocinemia as- sociada com infecção pelo vírus influenza sevara) e/ou para uso no tratamento ou prevenção de influenza severa) é igualmente aplicável aos vários aspectos da invenção mostrados aqui que pertencem a mé- todos de tratamento da invenção em humanos e animais (por exemplo, métodos de tratamento ou prevenção de hipercitocinemia (por exem- plo, hipercitocinemia associada com infecção pelo vírus influenza se- vera) em um indivíduo (por exemplo, um paciente humano) em neces- sidade do mesmo e/ou métodos de tratamento ou prevenção de influ- enza severa em um indivíduo (por exemplo, um paciente humano) com necessidade do mesmo)). Breve Descrição dos Desenhos

[00144] A FIG. 1 ilustra a identificação de vias de sinalização.

[00145] A FIG. 2 ilustra o mapeamento da atividade de genes em vias estimuladas por IL-1, TNFα e IL-6. Essas citocinas são produzidas por células infectadas por vírus influenza e verificadas ser aumentadas no sangue de pessoas infectadas com influenza, particularmente aquelas hospitalizadas com influenza severa. As linhas hachuradas indicam níveis de expressão de gene com linhas inclinando da es- querda superior para a esquerda inferior indicando suprarregulagem (por exemplo, TNF-α) e linhas inclinadas da esquerda superior para a direita inferior (por exemplo, LBP) indicando sub-regulagem; genes que são ambos suprarregulados e sub-regulados são indicados por linhas cruzadas-hachuradas. O espaçamento de linhas representa a intensidade de supra- e sub-regulagem, com linhas mais densamente empacotadas indicando atividade maior. Os mapas foram gerados usando IPA. Uma "rota" através de uma via é definida como uma co- nexão contínua única de proteínas que se estende a partir da mem- brana plasmática através do núcleo.

[00146] A FIG. 3 mostra um exemplo de classificação de uma rota através da via de IL-6 da FIG. 2.

[00147] A FIG. 4 mostra três tipos de célula-chave envolvidos na patologia de influenza severa.

[00148] A FIG. 5 é um esquema de produção de ‘sopa’ de influenza e análise de quimioluminescência eletrogerada em células epiteliais humanas. "Sopas" de célula infectadas contêm citocinas-chave encon- tradas em amostras clínicas.

[00149] A FIG. 6 mostra Western blotting de P38 e HSP27 fosforila- dos em resposta à aplicação de sopa viral e efeitos de inibição de P38 em células epiteliais usando o inibidor de p38 MAPK pH 797804. Aná- lise de quimioluminescência eletrogerada de produção de citocina in- flamatória em resposta à aplicação de sopa viral e efeitos de inibição de P38 em células epiteliais.

[00150] A FIG. 7 mostra Western blotting de HSP27 fosforilada em resposta à aplicação de sopa viral e efeitos de inibição de P38 em cé- lulas endoteliais. Análise de quimioluminescência eletrogerada de pro- dução de citocina inflamatória em resposta à aplicação de sopa viral e efeitos de inibição de P38 em células endoteliais.

[00151] A FIG. 8 mostra Western blotting de HSP27 fosforilada em resposta à aplicação de sopa viral e efeitos de inibição de P38 em cé- lulas imunes. Análise de quimioluminescência eletrogerada de produ- ção de citocina inflamatória em resposta à aplicação de sopa viral, e efeitos de inibição de p38 em células imunes. Viabilidade celular de células imunes em resposta a concentrações altas de inibidor de p38 MAPK.

[00152] A FIG. 9 mostra análise de quimioluminescência eletroge- rada de produção de citocina inflamatória em resposta à aplicação de LPS, CD-3 e sopa viral. Efeitos de inibição de P38 sobre citocina in- flamatória induzida por sopa viral em células imunes.

[00153] A FIG. 10 mostra os efeitos de inibidores de p38 e MEK so- bre produção de IP10 por HUVECs estimulada com sopa viral de HBEC 70%. Níveis de citocina secretados foram ensaiados através de quimioluminescência eletrogerada. Significância estatística foi calcula- da usando ANOVA de uma via com teste post hoc de comparação múltipla de Dunnett.

[00154] A FIG. 11 mostra efeitos de composto sobre produção de IL-1b a partir de células imunes. Cada ponto no gráfico de pontos re- presenta um experimento individual. Significância estatística foi calcu- lada usando ANOVA de uma via com teste post hoc de comparação múltipla de Dunnett.

[00155] A FIG. 12 mostra efeitos de composto sobre produção de TNFα a partir de células imunes. Cada ponto no gráfico de pontos re- presenta um experimento individual. Significância estatística foi calcu- lada usando ANOVA de uma via com teste post hoc de comparação múltipla de Dunnett.

[00156] A FIG. 13 mostra efeitos de composto sobre produção de IP10 a partir de células endoteliais. Cada ponto no gráfico de pontos representa um experimento individual. Significância estatística foi cal- culada usando ANOVA de uma via com teste post hoc de comparação múltipla de Dunnett.

[00157] A FIG. 14 mostra efeitos de composto sobre produção de IL8 a partir de células endoteliais. Cada ponto no gráfico de pontos re- presenta um experimento individual. Significância estatística foi calcu- lada usando ANOVA de uma via com teste post hoc de comparação múltipla de Dunnett.

[00158] A FIG. 15 mostra os níveis de citocina em 28 voluntários saudáveis infectados com vírus influenza (amostras coletadas no Dia 1 até o Dia 28, pontos ocos) e 30 indivíduos hospitalizados com influen- za severa (pontos pontilhados). Amostras de sangue dos pacientes severos foram coletadas entre 24 e 72 horas após admissão no hospi- tal. A significância estatística de diferenças em níveis de citocina entre os voluntários saudáveis infectados (D2 e D3) e os pacientes hospitali- zados (influenza A ou B) foi calculada usando o teste U de Mann- Whitney.

[00159] A FIG. 16 mostra o efeito de sopa viral de HBEC sobre pro- dução de mediador inflamatório em células HBEC medida através de análise MSD e o efeito inibidor do composto de Fórmula III.

[00160] A FIG. 17 mostra produção de citocina inflamatória por cé- lulas HUVEC tratadas ou com TNFα mais IL-6 ou sopa viral de HBEC conforme medido através de análise MSD em células endoteliais e o efeito inibidor do composto de Fórmula III.

[00161] A FIG. 18 mostra produção de citocina inflamatória em célu- las imunes tratadas ou com TNFα mais IL-6 ou sopa viral de A549 con- forme medido através de análise MSD em células imunes e o efeito inibidor do composto de Fórmula III.

[00162] A FIG. 19 mostra o efeito de combinação de inibidores de p38 MAPK com oseltamivir.

[00163] A FIG. 20 mostra produção de citocina inflamatória por cé- lulas HUVEC tratadas ou com TNFα mais IL-6 ou sopa viral de HBEC conforme medido através de análise MSD em células endoteliais e o efeito inibidor do composto de Fórmula II.

[00164] A FIG. 21 mostra produção de citocina inflamatória em célu- las imunes tratadas ou com TNFα mais IL-6 ou sopa viral de A549 con- forme medido através de análise MSD em células imunes e o efeito inibidor do composto de Fórmula II.

[00165] A FIG. 22 mostra o efeito de combinar o composto de Fór- mula II com oseltamivir sobre as propriedades antivirais de oseltamivir.

[00166] A FIG. 23 mostra o efeito de combinar oseltamivir com o composto de Fórmula II sobre as propriedades anti-inflamatórias do composto de Fórmula II. Exemplos Exemplo 1: identificação de p38 MAPK através de análise transcriptô- mica

[00167] Análise bioinformática de dados transcriptômicos a partir de amostras de sangue coletadas de voluntários humanos e pacientes infectados com influenza foi usada para mapear as vias de sinalização ativadas na resposta de hospedeiro humano à infecção por influenza em ambas influenza não complicada (leve e moderada) e severa (vide PHE Guidance on Use of Anti-Viral Agents for the Treatment and Pro- phylaxis of Seasonal Influenza (2015-16), versão 6.0, Setembro de 2015). Estudos de provocação viral humana foram realizados e dados transcriptômicos desses estudos foram usados para mapeamento do primeiro, enquanto dados transcriptômicos de um estudo de amostra- gem baseado em campo (Hoang, L. T. e outros, 2014) foram usados para mapeamento do último. Comparação de vias de sinalização iden- tificadas comparando ambos os conjuntos de dados permitiu a identifi- cação de vias de sinalização que são muito ativas em influenza severa versus influenza leve e moderada. Análise adicional de componentes da via individuais identificou p38 MAPK como um "nó"-chave em várias dessas vias ativas.

[00168] Voluntários humanos saudáveis foram intranasalmente pro- vocados com influenza A/Wisconsin/67/2005 (H3N2) (Zaas, A.K. e ou- tros, Gene expression signatures diagnose influenza and other symp- tomatic respiratory viral infection in humans, Cell Host Microbe, 2009; 17: 207- 217 e Davenport, E.E. e outros, Transcriptomic profiling facili- tates classification of response to influenza challenge, J. Mol. Med., 2015; 93: 105-114) ou com influenza A/Perth/16/2009 (H3N2) (estudo interno, não publicado). Amostras de PAXgeneTM de sangue integral foram coletadas de voluntários em vários pontos de tempo para análi-

se de transcriptoma subsequente. Métodos para provocação viral com influenza A/Wisconsin/67/2005 (H3N2), definições de casos, coleta de amostra, purificação de RNA e análise de microdisposição são como detalhado em Zaas e outros, 2009 e Davenport e outros, 2015. Méto- dos para provocação viral com influenza A/Perth/16/2009 (H3N2), de- finições de caso e coleta de amostra foram como descrito para cepa Wisconsin exceto purificação de RNA e análise de microdisposição usando disposições Affymetrix HGU133 Plus 2.0 que foram realizados pela Almac (https://web.archive.org/web/20160317153848/http://www.almacgroup. com/). Métodos para recrutamento de pacientes com influenza severa, coleta de amostra de sangue, purificação de RNA e análise de micro- disposição são como detalhado em Hoang e outros, 2014.

[00169] Arquivos de dados de microdisposição para os estudos de Zaas e outros, 2009, Davenport e outros, 2015 e Hoang e outros, 2014 foram baixados do banco de dados Gene Expression Omnibus (GEO) (https://web.archive.org/web/20160622040853/http://www.ncbi.nlm.nih. gov/geo/) usando os números de acesso GSE52428, GSE61754 e GSE61821, respectivamente. Arquivos de dados de microdisposição (.CEL) para o estudo não publicado foram baixados da Almac e arma- zenados localmente para análise de bioinformática. Todos os quatro conjuntos de dados transcriptômicos foram processados e analisados usando o suíte integrado R (versão 3.0.2.) de instalações de software para manipulação de dados, cálculo e exibição gráfica (https://web.archive.org/web/20160623011408/http://www.R- project.org). Avaliação de qualidade de dados de microdisposição bru- tos foi realizada usando métodos estatísticos padrão na técnica (por exemplo,Heber, S. e Sick, B., Quality assessment of affymetrix gene- chip data, Omics, 2006; 10: 358-368). Conjuntos de dados Affymetrix foram normalizados usando o método Robust Multi-array Average

(RMA)[https://www.bioconductor.org/packages/3.3/bioc/manuals/affy/m an/affy.pdf] e bancos de dados Illumina foram normalizados usando o pacote Lumi [https://www.bioconductor.org/packages/3.3/bioc/manuals/lumi/man/lu mi.pdf]. Ambos os pacotes foram executados no ambiente R. Para fa- cilitar anotação de conjuntos de sondas e nomes de gene, arquivos de definição de chip Affymetrix (versão 17.1.0) foram baixados do website (https://web.archive.org/web/2016062311275 820160623112758/http://brainarray.mbni.med.umich.edu/Brainarray/ Database/CustomCDF/17.1.0/ensg.asp) e arquivos de definição de chip Illumina (illuminaHumanv4.db) foram baixados do website da Bi- oconductor (https://web.archive.org/web/20151209032754/http://bioconductor.org/ packages/release/data/annotation/html/illuminaHumanv4.db.html).

[00170] Os últimos arquivos foram usados com dados de microdis- posição de Davenport e outros, 2015 e Hoang e outros, 2014.

[00171] Conjuntos de dados normalizados de Zaas e outros, 2009, Davenport, 2015 e Perth foram individualmente fundidos com o banco de dados de Hoang e outros, 2014 usando o módulo COMBAT no pa- cote InSilicoMergin em Bioconductor (https://web.archive.org/web/20150905151657/http://www.bioconductor .org/packages/release/bioc/html/inSilicoMerging.html). Análise de ex- pressão de gene diferencial em conjuntos de dados fundidos foi reali- zada usando o pacote limma em R (https://www.bioconductor.org/packages/3.3/bioc/vignettes/limma/ inst/doc/usersguide.pdf). Para comparações em pares apenas dados de voluntários infectados nos conjuntos de dados de Zaas e outros, 2009, Davenport e outros, 2015 e Perth foram usados, igualando a 11, 14 e 5 indivíduos, respectivamente. Do banco de dados de Hoang e outros, 2014, apenas dados para os três pacientes com influenza se-

vera infectados com H3N2 no conjunto de dados foram usados. Para conjunto de dados fundido, dois comparações em pares foram realiza- das para identificar gênese que estavam suprarregulados para níveis de linha basal após infecção com vírus e então suprarregulados mais nas amostras de paciente severos: Perth: dia -1 vs. dia 3 e; dia 3 vs. Hoang e outros, 2014 severo Zaas e outros, 2009: dia -1 vs. 60 horas e; 60 horas vs. Hoang e ou- tros, 2014 severo. Davenport e outros, 2015: dia 0 vs. 48 horas e; 48 h vs. Hoang e ou- tros, 2014 severo.

[00172] Para maximizar o número de genes suprarregulados que poderiam ser mapeados para vias, todos os genes mostrando razões de vezes > 0 foram identificados. Cada uma das 6 listas de gene resul- tantes foi analisada através do uso de Ingenuity® Pathway Analysis da Qiagen (IPA®, QIAGEN Redwood City, https://web.archive.org/web/20131021061639/http://www.ingenuity.co m/). Isso resultou na identificação de 650 vias de sinalização que fo- ram reduzidas para 353 após a remoção de 297 vias metabólicas. A FIG. 1 sumariza esse processo.

[00173] A fim de interrogar a relevância de cada uma dessas vias de sinalização para a patogênese de influenza severa, uma aborda- gem de classificação manual foi idealizada para identificar "rotas" mui- to ativas dentro dessas vias nos conjuntos de dados de influenza com- plicados versus "não complicados". Nesse contexto, "rotas" são definidas como cone- xões contíguas de proteínas em uma via canônica que se estendem a partir da membrana plasmática através do núcleo. Como resultado, uma via canônica pode ter várias rotas diferentes através dela. Usando essa abordagem de classificação, rotas dentro de vias canônicas de IPA foram mapeadas direcionalmente a partir da membrana plasmáti-

ca para o núcleo e a função ‘overlay’ foi usada para mostrar atividade de gene. Para ilustrar esse processo, um exemplo de três vias identifi- cado usando esse método é mostrado na FIG. 2.

[00174] Rotas individuais nas 353 vias identificadas foram manual- mente classificadas quanto à atividade de gene como exemplificado na FIG. 3 para uma via através da via canônica IL-1 em que: Tabela 1 Via Rota Nós Suprar- Nós Não Su- regulados prarregulados Sinalização IL6R + GP130–SHC-GRB2- 81% SHC-Ras de IL-6 SOS-Ras-cRAF-MEK-ERK- ELK+SRF

[00175] No total, 491 vias mostrando >75% de nós suprarregulados foram identificadas (exemplificadas na Tabela 2 abaixo). Dessas, 95 rotas contendo >3 nós foram identificadas em que 100% de todos os nós na rota foram suprarregulados nos conjuntos de dados de influen- za severa de Hoang e outros, 2014, versus linha basal (D-1 ou D0) nos conjuntos de dados de Zaas e outros, 2009, Davenprot e outros, 2015 e Perth (Tabela 3). Vinte e quatro essas 95 vias foram mostradas ser >75% suprarreguladas comparado com as vias derivadas dos conjun- tos de dados de influenza H3N2 e H1N1 leve e moderada de Hoang e outros, 2014 (H3N2 e H1N1 – leve e moderada) e Zaas e outros, 2009 (H1N1 - D-1 e 60 h; Tabela 4).

[00176] Inspeção de 95 rotas destacou vários nós potencialmente segmentáveis a partir dos quais p38 MAPK foi escolhida devido ao seu papel bem caracterizado em inflamação e a disponibilidade de inibido- res de molécula pequena clinicamente testados de alta qualidade para uso em estudos in vitro e ex vivo.

Tabela 2. Um exemplo de análise de classificação de rota Via Rota Nós Nós↑ ↓Nós (%) NFKB receptores de fator de crescimento-RAS-RAF-MEKK1-IKKa- 10 92 IKKB NFKB2-RELB-linfogênese NFKB IL-1R/TLR-MYD88-TYRAP-IRAP-IRAK-TRAF6-TAK1-IKKa- 8 93 IKKB IKBP65-P65NFKB-P65NFKB-inflamação Papel de JAK1 e JAK3 em IL21Ralfa/IL2Rgama-JAK3-STAT1/3/5 4 100 sinalização de citocina Sinalização de PI3K-AKT Integrina-PINCH-ILK-PI3K-PP2A-AKT-CRAF-MEK1/2- 9 89

57/99 RTK ERK1/2-P70S6K-crescimento celular Sinalização de PI3K-AKT Integrin-PINCH-ILK-PI3K-PP2A-AKT-CRAF-MEK1/2- 9 89 RTK ERK1/2-P70S6K-crescimento celular Sinalização de PI3K-AKT Integrin-PINCH-ILK-PI3K-PP2A-AKT-CRAF-MEK1/2- 9 78 Integrina ERK1/2-P70S6K-crescimento celular NFKB TNF-TANK-TRAF-FADD-RIP-MAP3K3-IKKa-IKBP65- 7 87.5 TNF- P65NFKB-P65NFKB-inflamação R/IKKB Sinalização de CNTF (CNTFR-LIFR-GP130)-JAK1/2-SHP2-GRB2-SOS-RAS- 10 90 SHP2 CRAF-MEK1/2-ERK1/2-P()RSK-expressão de gene Sinalização de CNTF (CNTFR-LIFR-GP130)-TYK2-STAT1/3-expressão de gene 3 100

Via Rota Nós Nós↑ ↓Nós (%) Papel de JAK em sinaliza- (GP130-OSMR)-sinalização de intermediário- ERK1/2- 4 100 ção de citocina tipo IL-6 p38MAPK-JNK -sinalização Papel de JAK em sinaliza- (GP130-OSMR)-JAK2-STAT1/3/5-expressão de gene 3 100 ção de citocina tipo IL-6 Papel de JAK em sinaliza- (GP130-OSMR)-STAT1/3-expressão de gene 2 100 ção de citocina tipo IL-6 Sinalização de HER-2 em (HER1/HER2)-GRB2-SOS-RAS-(CYCLIND1-CDK6- 5 80 HER1- câncer de mama CYCLINE-p27KIP1)-progressão e proliferação de ciclo celu- HER2

58/99 lar Sinalização de HER-2 em (HER1/HER2)-PI3K-AKT-CYCLIND1-progressão de ciclo ce- 4 75 HER1- câncer de mama lular HER2 Papel de JAk1, JAK2 e (IFNAR1-IFNAR2)-TYK2-STAT2-STAT1-expressão de gene 4 100 TYK2 em sinalização de in- terferon Sinalização de IL-9 (IL-9R-IL2R)-JAK3-IRS1/2-PI3K-PI3k-sinalização 5 100

Tabela 3. Noventa e cinco rotas contendo nós 100% suprarregulados no conjunto de dados de influenza severa de Hoang e outros, 2014 versus os conjuntos de dados de linha basal de Zaas e outros, 2009, Davenport e outros, 2015 e Perth Via Rota Número de Nós Sinalização de leu- FLT3-GRB2-SOS-RAS-RAF-MEK- 7 cemia mieloide aguda ERK1/2-proliferação celular Sinalização de Gaq GqR-Ga/b/y-PYK2-PI3K-AKT-IKK- 7 NFkB Sinalização de p38 TNFR/fas-TRADD/FAD-TRAF2- 7 MAPK Ask1-MKK4-P38MAKa-CHOP- transcrição Sinalização de p38 TNFR/fas-TRADD/FAD-TRAF2- 7 MAPK Ask1-MKK4-P38MAKa-ELK1- transcrição Sinalização de p38 TNFR/fas-TRADD/FAD-TRAF2- 7 MAPK Ask1-MKK4-P38MAPKa-MEF2 Sinalização de TRADD/RIP/FADD-TRAF2-GCKs- 7 SAPK/JNK MEKK1-MKK4/7-JNK-ELK-1 Sinalização de junção CLDN-ZO2-factina-actinina alfa- 7 de célula Sertoli- tubulina-KEAP1- Myo7a-dinâmica célula Sertoli de junção Sinalização de HIF1a RTK-PI3K-AKT-HIF1a-ARNT-ET1- 6 tônus vascular Sinalização de HIF1a Regulagem de RTK-PI3K-AKT- 6 HIF1a-ARNT-MMPs-ECM Sinalização de IL6 TNFR-TRAF2-TAK1-MKK4/7-JNK- 6 ELK1 Sinalização de Prote- PKAr/PKAc-RAP1-BRAF-MEK1/2- 6 ína Cinase A ERK1/2-ELK1 Sinalização de TRADD/RIP/FADD-TRAF2-ASK1- 6 SAPK/JNK MKK4/7-JNK-ELK1 Sinalização de ERK5 SRC-MEKK2/3-MEK5-ERK5-SAP1 5

Via Rota Número de Nós Sinalização de Re- RECEPTOR DE CITOCINA- 5 ceptor Glucocorticoi- TRAF2-TAK1-MKK4/7-P38MAPK- de ESTABILIZAÇÃO DE MRNA,

TRADUÇÃO Sinalização de Hor- GHR-JAK2-ERK1/2-CEBPA 5 mônio do Crescimen- to Sinalização de Hor- GHR-JAK2-ERK1/2-P90RSK- 5 mônio do Crescimen- SRF/ELK1 to Sinalização de HIF1a RTK-PI3K-AKT-HIF1a-ARNT- 5

GLUT Sinalização de HIF1a RTK-PI3K-AKT-HIF1a-ARNT- 5

VEGF Sinalização de IL-22 IL22R1/2-TYK2-STAT1/3/5- 5 SOCS3 IL-8 CXCR1/2 - PI3K-Akt-AP1- 5 IntegrinaAlfavBeta3 (Quimiotaxia) IL-8 CXCR1/2 - Ras-Raf-MEK1/2- 5 ERK1/2- (Desgranulação de Neu- trófilo) Sinalização de leptina LEPR-JAK2-STAT3-(SOCS3- 5 em obesidade POMC)-aMSH-anorexia Sinalização de Paxil- Integrina/b-FAK-GRB2-SOS-Ras- 5 lina ERK/MAPK Papel de receptores dsRNA-RIG1-IPS1-TRAF3-TBK1- 5 do tipo RIG em imu- IRF7-(IFNa-MDA5/LGP2/RIG1) nidade inata antiviral Papel de receptores MDA5-IPS1-TRAF3-TBK1-IRF7- 5 do tipo RIG em imu- (IFNa-MDA5/LGP2/RIG1) nidade inata antiviral Papel de receptores TRIM25-RIG1-IPS1-TRAF3-IRF7- 5 do tipo RIG em imu- (IFNa-MDA5/LGP2/RIG1) nidade inata antiviral

Via Rota Número de Nós Sinalização de CD40 CD40-JAK3-STAT3-ICAM1 4 Sinalização de cera- EDG-SPHK-NFKB-AP1-ativação 4 mida de genes inflamatórios Sinalização de cera- SMPD-(ceramida)-PI3K-AKT- 4 mida apoptose Sinalização de eico- PLA2-ALOX5-LTA4h-LTB4R- 4 sanoide quimiotaxia/proliferação/asma alérgica/angiogênese/ Sinalização de G alfa RECEPTOR ACOPLADO A Gi- 4 I Galfhai/Gbeta/Ggama-SRC-STAT3 Sinalização de Jun- TGFbetaR-RAS-MEK1/2-ERK1/2- 4 ção de Célula Germi- despolimerização de actina nativa-Célula Sertoli Sinalização de GM- GMCSFRA-HCK-PI3K-AKT- 4 CSF sobrevivência celular/proliferação celular Sinalização de GM- GMCSFRA-JAK2-STAT3-(BCLXL - 4 CSF CYCLIND1) Sinalização de Re- Receptor acoplado a Gi-GALFAi/0- 4 ceptor Acoplado à SRC-STAT3 Proteína G Sinalização de IGF-1 IGF1R-JAK 1/2-STAT3-SOCS3 4 IL-8 CXCR1/2 - JNK - NFkB - ICAM-1 4 IL-8 CXCR1/2 - PI3K-MEK1/2-ERK1/2- 4 (Desgranulação de Neutrófilo) IL-8 CXCR1/2 - Rho - NFkB - ICAM-1 4 JAK/STAT Receptor de citocina-JAK-STAT- 4 (CFOS-IL6-SOCS-BCLXL) Via de sinalização de RON-PI3K-PKC zeta- F-ACTIN- 4 MSP-RON atividade fagocítica em macrófa- gos Sinalização de PI3K IL4R-IRS-P85/PI3K-P110/PI3K- 4 em linfócitos B NFKB

Via Rota Número de Nós Ativação de ADIPOR-AMPK-P38MAPK- 4 PPARα/RXRα PPARalfa Produção de óxido ní- TLR2/4-PI3K-AKT-NFKB-Inos 4 trico e ROS em ma- crófagos Produção de óxido ní- TLR2/4-MKK4/-JNK-AP1 4 trico e ROS em ma- crófagos Ativação de RAR IL-3Ra/b- JAK2- STAT5-RAR/RXR 4 Papel de sinalização ASK-1-MKK4/7-JNK-CASP3- 4 de MAPK na Patogê- APOPTOSIS nese de Influenza Papel de receptores dsRNA-RIG1-IPS1-TRAF3-IRF7- 4 do tipo RIG em uma (IFNa-MDA5/LGP2/RIG1) imunidade inata anti- viral Papel de receptores MDA5-IPS1-TRAF3-IRF7-(IFNa- 4 do tipo RIG em uma MDA5/LGP2/RIG1) imunidade inata anti- viral Sinalização por Integrina-ARHGEF-RHO-FAK- 4 GTPases da família reorganização citoesqueletal Rho Sinalização por Integrina-ARHGEF-RHO-PKNI- 4 GTPases da família tráfego celular Rho Sinalização de Esfin- SIPR(2/3/4)-GAI-PI3K-AKT- 4 sogina-1-fosfato SOBREVIVÊNCIA CELULAR Sinalização de Tec Integrina-FAK-TEC CINASE- 4 cinase (FAK,PKC,PAK,VAV,FACTIN, RHOGTPASE,NFKB,JNK,STAT- TFII-1)

Via Rota Número de Nós Sinalização de Tec TCR-SRC-TEC CINASE- 4 cinase (FAK,PKC,PAK,VAV,FACTIN, RHOGTPASE,NFKB,JNK,STAT- TFII-1) Sinalização de leu- FLT3-STAT3/5-PIM1-regula apop- 3 cemia mieloide aguda tose Ação antioxidante de CSF2Ralfa/beta-JAK2-STAT5- 3 vitamina C expressão de gene Sinalização de CNTF (CNTFR-LIFR-GP130)-TYK2- 3 STAT1/3-expressão de gene Maturação de célula LTbetaR-IKK-RELB/NFKB- 3 dendrítica apresentação cruzada Sinalização de RE- EPHA-JAK2-STAT3- 3

CEPTOR DE EFRINA PROLIFERAÇÃO CELULAR Sinalização de RE- EPHB-PI3KG-AKT-MIGRAÇÃO 3 CEPTOR DE EFRINA CELULAR, PROLIFERAÇÃO CE-

LULAR Sinalização de RE- INTEGRIN-AMEK1/2-ERK1/2- 3 CEPTOR DE EFRINA ORIENTAÇÃO DE AXÔNIO, PRO-

LIFERAÇÃO CELULAR Sinalização de FCyR-BTK-JNK-apoptose 3 FcyRIIB em linfócitos

B Sinalização de Re- RECEPTOR DE CITOCINA-JAK2- 3 ceptor de Glucocorti- STAT1 coide Sinalização de Re- RECEPTOR DE CITOCINA-JAK3- 3 ceptor de Glucocorti- STAT3/5 coide Sinalização de GNRH GnRHR - Gai - NfkB 3 IL-12 Sinalização de TLR4-p38/MAPK-IL12 3 e Produção em Ma- crófagos

Via Rota Número de Nós Sinalização de IL-3 IL3Ralfa/beta-JAK1/2- 3 STAT1/3/5/6-expressão de gene Sinalização de IL6 GP130 (IL6R)-JAK2-STAT3- 3 expressão de gene IL-8 CXCR1 - PLD - NADPH oxidase - 3 (Produção de superóxido – Explo- são Respiratório) IL-8 CXCR1-G Proteína al- 3 fa/beta/gama-PI3Ky - (Quimiotaxia- Explosão Respiratória) Sinalização de MAPK TLR4-IKK-IKB-NFKB-expressão de 3 estimulada para LPS gene Sinalização de mTOR Nutrientes-Sinalização de RHEB- 3 mTORc2-AKT-PI3K/AKT Sinalização de mTOR Nutrientes-RHEB-mTORc2-AKT- 3 (Rho/PKC)-organização de actina PDGF Sinalização de PDGFRa/b-SPHK-CRK- 3 mitogênese Sinalização de Prote- PKA-PHK-PYG-glicólise 3 ína Cinase A Regulagem de mecâ- CNG-CALPAIN-RB 3 nica celular por calpa- ína protease Papel de JAK em si- (GP130-OSMR)-JAK2-STAT1/3/5- 3 nalização de citocina expressão de gene tipo IL-6 Papel de JAK2 em SINALIZAÇÃO DE GHR-JAK2- 3 sinalização de citoci- IRS-PI3K/AKT na do tipo hormônio Papel de JAK2 em GHR-JAK2-STAT1/3-EXPRESSÃO 3 sinalização de citoci- DE GENE na do tipo hormônio

Via Rota Número de Nós Papel de JAK2 em GHR-JAK2-STAT5-EXPRESSÃO 3 sinalização de citoci- DE GENE na do tipo hormônio Papel de Macrófagos, GP130-JAK2-STAT3-expressão de 3 Fibroblastos e Célu- gene las Endoteliais em Ar- trite Reumatoide Papel de Receptores NALP3-casp1-IL1b 3 de Reconhecimento de Padrão em Reco- nhecimento de Bacté- rias e Vírus Papel de Receptores NOD1-Casp1-IL1b 3 de Reconhecimento de Padrão em Reco- nhecimento de Bacté- rias e Vírus Papel de sinalização PI3K-AKT-IKB,NFKB 3 de PI3K/AKT Sinali- zação na patogênese de influenza Papel de fator de te- PAR2-ERK1/2-HBEGF- 3 cido em câncer angiogênese Papel de fator de te- PAR2-ERK1/2-VEGFa- 3 cido em câncer angiogênese Papel de fator de te- PAR2-p38/MAPK-uPar-invasão de 3 cido em câncer tumor Papel de fator de te- PAR2-p38/MAPK-IL-1b- 3 cido em câncer angiogênese Papel de fator de te- PAR2-p38/MAPK-VEGFa- 3 cido em câncer angiogênese

Via Rota Número de Nós Via de STAT3 Receptores de citocina- 3 TYK2/JAK2-STAT3-transcripção- resposta imune-proliferação- sobrevivência Via de STAT3 GFR-JAK2/SRC-STAT3- 3 transcrição-resposta imune- proliferação-sobrevivência Depressão a longo AMPAR-Lyn-PKC-Fosforilação 3 prazo sináptica Sinalização de Tec FCeR1-TEC cinase- 3 Cinase (FAK,PKC,PAK,VAV,FACTIN, RHOGTPASE,NFKB,JNK,STAT- TFII-1) Sinalização de Tec TLR4-TEC cinase- 3 Cinase (FAK,PKC,PAK,VAV,FACTIN, RHOGTPASE,NFKB,JNK,STAT- TFII-1)

Tabela 4. Comparação de classificações de rota entre H3N2 e H1N1 H3N2 H1N1 Via Rota H3N2 H3N2 H3N2 H3N2 H1N1 H1N1 H1N1 H1N1 Severa Severa Severa Severa Severa Severa Severa Severa vs.

Li- vs.

Pi- vs.

Le- vs. vs.

Li- vs.

Pi- vs.

Le- vs. nha co ve Mode- nha co ve Mode- basal rada basal rada Sinalização de GHR-JAK2-ERK1/2- 100,00 93,33 100,00 100 75 75 75 75 hormônio do CEBPA crescimento

67/99 Ativação de ADIPOR-AMPK- 100,00 100,00 100,00 100 100 100 100 75 PPARα/RXRα P38MAPK-PPARalfa- REGULAGEM de genes de hormônio do cresci- mento Sinalização de GMCSFRA-HCK-PI3K- 100,00 100,00 100,00 100 100 100 100 100 GM-CSF AKT-sobrevivência celu- lar/proliferação celular Sinalização de SIPR(2/3/4)-GAI-PI3K- 100,00 100,00 100,00 100 100 100 100 100 Esfingosina-1- AKT-CELL SURVIVAL fosfato

H3N2 H1N1 Via Rota H3N2 H3N2 H3N2 H3N2 H1N1 H1N1 H1N1 H1N1 Severa Severa Severa Severa Severa Severa Severa Severa vs.

Li- vs.

Pi- vs.

Le- vs. vs.

Li- vs.

Pi- vs.

Le- vs. nha co ve Mode- nha co ve Mode- basal rada basal rada Sinalização de SMPD-(ceramida)-PI3K- 100,00 100,00 100,00 100 100 100 100 100 ceramida AKT-apoptose IL-8 CXCR1/2 - PI3K-MEK1/2- 100,00 93,33 100,00 100 75 75 100 100 ERK1/2- (Desgranulação

68/99 de Neutrófilo) Sinalização de Integrina/b-FAK-GRB2- 100,00 100,00 100,00 100 100 100 100 100 Paxilina SOS-Ras-ERK/MAPK Sinalização de FCeR1-TEC cinase- 100,00 100,00 100,00 100 100 100 100 100 Tec cinase (FAK,PKC,PAK,VAV,FAC TINA, RHOG- TPASE,NFKB,JNK,STAT -TFII-1)

H3N2 H1N1 Via Rota H3N2 H3N2 H3N2 H3N2 H1N1 H1N1 H1N1 H1N1 Severa Severa Severa Severa Severa Severa Severa Severa vs.

Li- vs.

Pi- vs.

Le- vs. vs.

Li- vs.

Pi- vs.

Le- vs. nha co ve Mode- nha co ve Mode- basal rada basal rada Sinalização de TCR-SRC-TEC CINASE- 100,00 100,00 100,00 100 100 100 100 100 Tec cinase (FAK,PKC,PAK,VAV,FAC TIN, RHOG- TPASE,NFKB,JNK,STAT

69/99 -TFII-1) Sinalização de TLR4-TEC cinase- 100,00 100,00 100,00 100 100 100 100 100 Tec cinase (FAK,PKC,PAK,VAV,FAC TINA, RHOG- TPASE,NFKB,JNK,STAT -TFII-1) Sinalização por Integrina-ARHGEF-RHO- 100,00 100,00 100,00 100 75 75 75 75 GTPases da Fa- PKNI-tráfego celular mília Rho

H3N2 H1N1 Via Rota H3N2 H3N2 H3N2 H3N2 H1N1 H1N1 H1N1 H1N1 Severa Severa Severa Severa Severa Severa Severa Severa vs.

Li- vs.

Pi- vs.

Le- vs. vs.

Li- vs.

Pi- vs.

Le- vs. nha co ve Mode- nha co ve Mode- basal rada basal rada Regulagem de CNG-CALPAÍNA-RB 100,00 100,00 100,00 100 100 100 100 100 mecânica celular por calpaína pro- tease

70/99 Sinalização de Integrina-FAK-TEC CI- 100,00 100,00 100,00 100 100 100 100 100 Tec cinase NASE- (FAK,PKC,PAK,VAV,FAC TINA, RHOG- TPASE,NFKB,JNK,STAT -TFII-1) Sinalização de FLT3-GRB2-SOS-RAS- 100,00 100,00 100,00 85,71 100 100 100 100 leucemia mieloi- RAF-MEK-ERK1/2- de aguda proliferação celular

H3N2 H1N1 Via Rota H3N2 H3N2 H3N2 H3N2 H1N1 H1N1 H1N1 H1N1 Severa Severa Severa Severa Severa Severa Severa Severa vs.

Li- vs.

Pi- vs.

Le- vs. vs.

Li- vs.

Pi- vs.

Le- vs. nha co ve Mode- nha co ve Mode- basal rada basal rada Sinalização por Integrina-ARHGEF-RHO- 100,00 95,23 100,00 100 100 100 100 100 GTPases da Fa- FAK-reorganização citoe- mília Rho squeletal IL-8 CXCR1/2 - Ras-Raf- 100,00 91,67 100,00 100 80 80 100 100

71/99 MEK1/2-ERK1/2- (Des- granulação de Neutrófilo) JAK/STAT receptor de citocina-JAK- 100,00 91,67 100,00 100 75 75 100 100 STAT-(CFOS-IL6-SOCS- BCLXL) Via de sinaliza- RON-PI3K-PKC zeta- F- 100,00 91,67 100,00 100 75 100 75 75 ção de MSP- ACTIN-atividade fagocíti- RON ca em macrófagos

H3N2 H1N1 Via Rota H3N2 H3N2 H3N2 H3N2 H1N1 H1N1 H1N1 H1N1 Severa Severa Severa Severa Severa Severa Severa Severa vs.

Li- vs.

Pi- vs.

Le- vs. vs.

Li- vs.

Pi- vs.

Le- vs. nha co ve Mode- nha co ve Mode- basal rada basal rada Sinalização de TGFbetaR-RAS-MEK1/2- 100,00 91,67 100,00 100 100 100 100 100 Junção de Célula ERK1/2- Germinativa- despolimerização de ac- Célula Sertoli tina

72/99 Papel de sinali- ASK-1-MKK4/7-JNK- 100,00 83,33 100,00 100 75 75 75 75 zação de MAPK CASP3-APOPTOSE na Patogênese de Influenza Papel de sinali- PI3K-AKT-IKB,NFKB 100,00 77,78 100,00 100 100 100 75 75 zação de PI3K/AKT na Pa- togênese de In- fluenza

H3N2 H1N1 Via Rota H3N2 H3N2 H3N2 H3N2 H1N1 H1N1 H1N1 H1N1 Severa Severa Severa Severa Severa Severa Severa Severa vs. Li- vs. Pi- vs. Le- vs. vs. Li- vs. Pi- vs. Le- vs. nha co ve Mode- nha co ve Mode- basal rada basal rada Sinalização de PKAr/PKAc-RAP1-BRAF- 100,00 100,00 83,33 83,33 100 83,33 83,33 83,33 Proteína Cinase MEK1/2-ERK1/2-ELK1

A IL-8 CXCR1/2 - PI3K-Akt- 100,00 80,55 80,00 100 75 80 100 100 73/99 AP1-IntegrinaAlfavBeta3 (Quimiotaxia) Produção de óxi- TLR2/4-MKK4/7-JNK- 100,00 91,67 75,00 100 100 100 100 100 do nítrico e ROS AP1 em macrófagos

Exemplo 2: efeitos de inibição de p38 MAPK sobre liberação de medi- ador inflamatório em tipos de célula-chave relevantes para influenza severa

[00177] Dois inibidores de p38 MAPK foram usados em experimen- tos in vitro e ex vivo: 1) PH797804, um inibidor de p38 altamente po- tente competitivo com ATP, seletivo e metabolicamente estável (Hope, HR1 e outros, Anti-inflammatory properties of a novel N-phenyl pyridi- none inhibitor of p38 mitogen-activated protein kinase: preclinical-to- clinical translation, J. Pharmacol. Exp. Ther., 2009 (Dec); 331(3): 882- 95); e 2) Dilmapimode (SB-681323 - Betts JC1, e outros, Gene ex- pression changes caused by the p38 MAPK inhibitor Dilmapimode in COPD patients: analysis of blood and sputum samples from a rando- mized, placebo-controlled clinical trial, Pharmacol. Res. Perspect., 2015 (Fev); 3(1): e00094). As estruturas desses compostos são como segue: Dilmapimode PH797804

[00178] Teste experimental de inibição de p38 MAPK foi realizado em três tipos de célula que são participantes principais na patologia de influenza severa: células epitelial; endotelial; e imune (FIG. 4). Nesses experimentos, as células foram pretratadas com estímulos simples e/ou complexos a fim de simular a ação de mediadores inflamatórios que são produzidos a partir de células epiteliais infectadas com influ- enza. No caso do primeiro, fator alfa de necrose tumoral (TNFα) mais interleucina 6 (IL-6) foi usado para estimular células endoteliais e imu- nes. No caso do último, meio condicionado ("sopa" viral) derivado ou de células A549 infectadas com vírus influenza (células epiteliais ba- sais alveolares humanas de adenocarcinoma) ou células epiteliais brônquicas humanas primárias (HBECs) foi usado para estimular célu- las epiteliais, endoteliais e imunes. Células epiteliais

[00179] Células A549 (células epiteliais basais alveolares humanas de adenocarcinoma) ou HBEC (Células Epiteliais Brônquicas Huma- nas) foram infectadas com vírus A/Perth/16/2009(H3N2) do qual meio condicionado viral (ou ‘sopa viral’) foi coletado. Nos experimentos des- critos aqui, a aplicação de sopa viral ou de volta em células epiteliais ou nos outros tipos de célula de interesse (endotelial e imune) foi reali- zada a fim de simular a ação de mediadores inflamatórios que são produzidos a partir de células epiteliais infectadas por Influenza.

[00180] Para infecção, estoques de título alto de vírus Influenza (H3N2) foram produzidos através de infecção de células MDCK-RVL (disponível da ATCC como MDCK (NBL-2) (ATCC® CCL-34), deriva- das de um rim de um Cocker spaniel fêmea adulto aparentemente normal, Setembro, 1958, de S.H. Madin e N.B. Darby. A linhagem é hiperdiploide, e há uma distribuição de número de cromossomo bimo- dal. Não há quaisquer cromossomos marcadores identificáveis consis- tentes. Um cromossomo X normal está presente na maioria das exten- sões. As células são positivas para queratina através de tingimento com imunoperoxidase). Células MDCK-RVL foram plaqueadas em frasco T175 e deixadas crescer para 85-90% de confluência. No dia seguinte, as células foram lavadas duas vezes com meios de infecção. O estoque de Influenza A/Perth/16/2009 (H3N2) foi removido de -80º C e descongelado em gelo. A células foram infectadas com estoque de vírus a 0,01 de MOI por uma hora em meios de infecção. No final do período de incubação, vírus não ligado foi removido as células. As cé- lulas foram lavadas uma vez com meios de infecção e cobertas com meios de infecção e deixadas incubar por 48 horas em 37º C a 5% de CO2/incubadora de ar. Após incubação, os frascos foram congelados a -80º C por um dia. No dia seguinte, os frascos foram descongelados em temperatura ambiente e sobrenadante de vírus foi centrifugado (2000 g, 10 min) e reunido. O estoque de vírus foi separado em alíquo- tas e armazenado a -80º C.

[00181] "Sopas" virais foram preparadas usando a linhagem de cé- lula A549 e células epiteliais brônquicas humanas primárias (HBECs). Para a preparação de sopas de A549, as células foram plaqueadas em um frasco T175 e deixadas crescer para obter 85-90% de confluência. As células foram lavadas duas vezes com meios infectados. O estoque de influenza A/Perth/16/2009 (H3N2)-WGC foi removido de -80º C e descongelado em gelo. As células foram infectadas com estoque de vírus a 0,01 de MOI por uma hora em meio de infecção. O vírus não ligado foi removido das células no final do período de incubação e as células foram lavadas uma vez com meios de infecção antes de cobrir com meios de infecção. As células foram incubadas por 48 horas em 37º C a 5% de CO2/incubadora de ar. Após incubação, o meio (‘sopa viral’) foi coletado de todos os frascos, centrifugado (2000 g, 10 min) e reunido. A sopa viral foi separada em alíquotas e armazenada a -80º C. Para a preparação de sopa viral de HBEC, as células foram cultu- radas para passagem P-3 ou P-4 em Meio de Crescimento de Célula Epitelial Brônquica (BECGM; Lonza). Para infecção, as células foram lavadas duas vezes com BECGM, então infectadas com estoque de vírus Influenza A/Perth/16/2009 (H3N2) a 0,01 de MOI por uma hora em meio de infecção (BECGM contendo 1,06 unidades USP/NF por ml de tripsina (TPCK). As células foram então cobertas com meio de in- fecção e incubadas por 48 horas a 37º Cem CO2 5%/ar. A sopa viral de HBEC foi então processada de uma maneira similar à soma de A549.

[00182] Cinéticas de crescimento viral foram otimizadas para gera- ção de sopas virais. Para determinar curvas de crescimento de múlti- plas etapas, células A549 ou HBECs foram infectadas com vírus em MOI de 0,01 TCID50/célula a 37º C por uma hora. Seguindo incuba- ção, as células foram lavadas e cobertas com respectivos meios de infecção. As amostras foram coletadas para títulos virais e medição de citocinas em vários pontos de tempo por 72 horas. Os títulos virais fo- ram obtidos por TCID50 em céluals MDCK e a presença de mediado- res inflamatórios foi avaliada através de ensaio de quimioluminescên- cia MSD usando métodos conforme recomendado pelo vendedor (https://web.archive.org/web/20160522190937/https://www.mesoscale. com/).

[00183] Antes do teste experimental, ambas as preparações de so- pa de A549 e HBEC foram avaliadas através de quimioluminescência eletrogerada quanto à presença de mediadores inflamatórios usando métodos como recomendado pelo vendedor (https://web.archive.org/web/20160522190937/https://www.mesoscale. com/). Ambas as preparações de sopa foram verificadas conter níveis elevados das citocinas que seguem(IL1-β, IL-6, IL-8, IL-10, TNFα e RANTES; FIG. 5).

[00184] Dados in vitro foram gerados a partir de células A549 para testar o efeito de aplicação de sopa viral de A549 sobre ativação de p38 conforme medido através de Western blotting do estado de fosfori- lação do próprio p38 MAPK e sinalização a jusante do alvo, HSP27. Para Western blotting, células confluentes foram lavadas em PBS e lisadas em RIPA com inibidor de protease (Sigma-P8340), coquetéis inibidores de fosfatase 2 e 3 (Sigma P5726 e P0044) e inibidores de fosfatase Na3VO4 e NaF em gelo. Concentrações de proteína foram determinadas usando o Pierce BCA Protein Assay Kit e concentrações iguais de cada amostra criadas em tampão de amostra Laemmli 4X (BIO-RAD 161-0747) com 2-mercaptoetanol. As amostras foram admi- nistradas em um gel 12% e então transferidas para nitrocelulose. As membranas foram bloqueadas usando leite em pó 5%, então hibridi- zadas com anticorpo de coelho p38 MAPK (Cell Signalling Technologi- es, no. cat. 9212S) e anticorpo de coelho p38 MAPK fosforilado (Cell Signalling Technologies, no. cat. 9211S) ou anticorpo HSP27 (Cell Signalling Technologies no. cat. 2402) e anticorpo fosfo-HSP27 (Cell signalling Technologies, no. cat. 9709). Anticorpos secundários foram HRP anticoelho (no. de catálogo Cell signalling Technologies CS7074P2) e HRP anticamundongo (Cell signalling, no. de catálogo 7076S), respectivamente. As membranas foram arrancadas para novo exame usando Restore™ PLUS Western Blot Stripping Buffer (Life technologies # 46430). As membranas foram tratadas com Amersham ECL Prime Western blotting Detection Reagent (GE/Amersham #RPN2232) e imagem feita com ChemiDocTM Touch Imaging System (BIORAD). Análise foi realizada usando o Image Lab software.

[00185] Indução de fosforilação em ambas essas enzimas foi detec- tada indicando que p38 MAPK é ativado seguindo aplicação de sopa viral de A549 (FIG. 6). Ainda, incubação com inibidores de p38 MAPK (Dilmapimode e PH 797804) foi mostrada inibir dependentemente da dose a indução de fosforilação de ambos p38MAPK e HSP27 pela so- pa viral de A549 da requerente, confirmando que essa indução é um processo dependente de p38MAPK dentro dessas células epiteliais.

[00186] O efeito de sopa viral de A549 sobre produção de citocina inflamatória em células A549 conforme medido através de quimiolumi- nescência eletrogerada foi também explorado. Como mostrado na FIG. 6, sopa de A549 foi verificada induzir a produção de citocinas inflama- tórias-chave (IL-6 e IP-10) para um grau maior comparado com a sopa de A549 não infectada. Aplicação dos dois inibidores de p38 MAPK às células A549 antes da aplicação de sopa viral de A549 atenuou signifi- cantemente liberação de ambos IL-6 e IP-10 (FIG. 6 mostra os dados para o inibidor de p38 MAPK pH 797804). Esses dados demonstram que a liberação de mediadores inflamatórios em resposta à aplicação de sopa viral de A549 a células A549 é um processo dependente de p38MAPK. Células endoteliais

[00187] A aplicação de sopa viral de HBEC em Células Endoteliais da Veia Umbilical Humana (HUVECs) foi realizada a fim de simula a interação de mediadores inflamatórios que são produzidos a partir de células epiteliais infectadas com Influenza em células endoteliais.

[00188] Dados in vitro foram gerados a partir de células HUVEC pa- ra testar o efeito de aplicação de sopa viral de HBEC sobre ativação de p38 conforme medido através de Western blotting do estado de fos- forilação do alvo de sinalização a jusante de p38MAPK, HSP27. Indu- ção de fosforilação em HSP27 foi detectada indicando que p38MAPK é ativado seguindo aplicação de sopa viral de HBEC (FIG. 7). Ainda, pré-incubação com inibidores de p38 MAPK (Dilmapimode e PH 797804) foi mostrada inibir dependentemente da dose a indução de fosforilação de HSP27 pela sopa viral de HBEC, confirmando que essa indução é um processo dependente de p38MAPK dentro dessas célu- las endoteliais.

[00189] O efeito da sopa viral de HBEC sobre produção de citocina inflamatória em células HUVEC conforme medido através de quimio- luminescência eletrogerada (vide métodos) foi também explorado. Como mostrado na FIG. 7, sopa viral de HBEC foi verificada induzir a produção de citocinas inflamatórias-chave (IL-6 e IP-10) para um grau maior comparado com sopa não infectada de HBEC controle. Incuba- ção de células HUVEC com os dois inibidores de p38 MAPK antes da aplicação da sopa viral de HBEC foi verificada atenuar significante- mente a liberação induzida pela sopa viral de HBEC de ambas IL-6 e IP-10 (FIG. 7). Esses dados demonstram que a liberação de mediado- res inflamatórios em resposta à aplicação de sopa viral de HBEC em célula endotelial HUVEC é um processo dependente de p38MAPK. Células imunes

[00190] A aplicação de sopa viral de A549 a Células Mononucleares de Sangue Periférico (PBMCs) foi realizada a fim de simular a intera- ção de mediadores inflamatórios que são produzidos a partir de célu- las epiteliais infectadas por Influenza a células imunes. PBMCs foram isoladas de acordo com as recomendações dos fabricantes (Bøyum, A., Separation of leucocytes from blood and bone marrow, Scand. J. Clin. Lab. Invest., 1968, 21, suppl. 97).

[00191] Dados ex vivo foram gerados a partir de células imunes pa- ra testar o efeito de aplicação de sopa viral de A549 sobre ativação de p38 conforme medido através de Western blotting (vide acima quanto ao método) do estado de fosforilação do alvo de sinalização a jusante de p38MAPK, HSP27. Indução de fosforilação em HSP27 foi detecta- da, indicando que p38MAPK é ativada seguindo aplicação de sopa vi- ral de A549 (FIG. 8). Ainda, preincubação com inibidores de p38 MAPK (Dilmapimode e PH 797804) foi mostrada inibir dependente- mente da dose a indução de fosforilação de HSP27 pala sopa viral de A549, confirmando que essa indução é um processo dependente de p38MAPK dentro dessas células imunes (FIG. 8).

[00192] O efeito de sopa viral de A549 sobre produção de citocina inflamatória em células imunes conforme medido através de quimiolu- minescência eletrogerada (vide acima) foi também explorado. Como mostrado na FIG. 8, sopa viral de A549 foi verificada induzir a produ- ção de citocinas inflamatórias-chave (TNFα, IL-1-β, IL-6 e CXCL8) pa- ra um grau maior comparado com sopa não infectada com A549 con-

trole. Preincubação de inibidores de p38 MAPK (Dilmapimode e PH 797804) sem células imunes antes da aplicação da sopa viral de A549 foi verificada atenuar significantemente a liberação induzida pela sopa viral de A549 de TNFα, IL-1-β, IL-6 e CXCL8 (FIG. 8). Esses dados demonstram que a liberação de mediadores inflamatórios em resposta à aplicação de sopa viral de A549 em células imunes é um processo direcionado por p38MAPK.

[00193] Dados ex vivo adicionais foram gerados a partir de células imunes, de modo que a indução de mediadores inflamatórios em res- posta à sopa viral de A549 foi comparada com estimulantes inflamató- rios conhecidos (anti-CD3 e LPS). A indução de TNFα, IL-1-β, IL-6 e IL-8 pela sopa viral de A549 foi verificada ser maior comparado com esses estimulantes inflamatórios conhecidos. Exemplo 3: atividade inibidora de p38 MAPK

[00194] A atividade inibidora de enzima de um composto pode ser determinada através de transferência de energia de ressonância de fluorescência (FRET) usando peptídeos sintéticos marcados com am- bos fluoróforos doador e aceitador (Z-LYTE, Invitrogen).

[00195] p38 MAPK gama fosforilada, recombinante, (MAPK12:Millipore) é diluída em tampão HEPES, misturada com o composto candidato em concentrações finais desejadas e incubada por duas horas em temperatura ambiente. O peptídeo FRET (2 μm) e ATP (100 μM) são em seguida adicionados à mistura de enzi- ma/composto e incubados por uma hora. Reagente de desenvolvimen- to (protease) é adicionado por uma hora antes da detecção em leitora de microplaca de fluorescência. A protease específica de sítio apenas cliva peptídeos não fosforilado e elimina o sinal de FRET. Níveis de fosforilação de cada reação são calculados usando a razão de emis- são de coumarina (doador) com relação à emissão de fluoresceína (aceitador) com razões altas indicando fosforilação alta e razões bai-

xas, níveis de fosforilação baixos. A inibição percentual de cada rea- ção é calculada com relação ao controle não inibido, e a concentração 50% inibidora (valor de IC50) então calculada a partir da curva de con- centração-resposta.

[00196] Para p38 MAPK alfa (MAPK14: Invitrogen), atividade de enzima é avaliada indiretamente através da determinação de ativa- ção/fosforilação da molécula a jusante, MAPKAP-K2. A proteína p38 MAPK α é misturada com sua MAPKAP-K2-alvo inativa (Invitrogen) e o composto candidato por duas horas em temperatura ambiente. O pep- tídeo FRET (2 μM), que é um alvo de fosforilação para MAPKAP-K2, e ATP (10 μM) são então adicionados à mistura de enzimas/composto e incubados por uma hora. Reagente de desenvolvimento é então adici- onado e a mistura incubada por uma hora antes da detecção através de fluorescência completar o protocolo de ensaio. Exemplo 4: inibição de P38MAPK (p38i) versus inibição de outros al- vos potenciais

[00197] Como indicado no Exemplo 1 acima, vários nós segmentá- veis nas 95 rotas de via destacadas por transcriptômica e bioinformáti- ca aforam identificados. Os experimentos de tração de perfil de com- posto no Exemplo 2 mostram que p38i é eficaz na redução da produ- ção de liberação de mediador inflamatório em tipos de célula relevan- tes para a patologia de influenza severa. Isso foi verificado nãos ser o caso para 9 outros nós que foram examinados: PI3K, MEK, ERK, JNK, JAK/STAT, PKC, SRC, BtK e mTor. Inibição de fármaco de nenhum desses 9 nós proveu um perfil de inibição tão eficaz quanto p38i em células epiteliais, endoteliais e imunes.

[00198] A título de exemplo, dados comparando p38i versus inibi- ção de proteína cinase ativada por mitógeno (MEK) (MEKi) por inibido- res de MEK Refametinibe (Iverson, C. e outros, RDEA119/BAY 869766: a potent, selective, allosteric inhibitor of MEK1/2 for the trea-

tment of cancer. Cancer Res., 2009; 69: 6839-6847) e Selumetinibe (Huynh, H. e outros, Targeted inhibition of the extracellular signal- regulated kinase pathway with AZD6244 (ARRY-142886) in the trea- tment of hepatocellular carcinoma, Molecular Cancer Therapeutics, 2007; 6:138-146) são apresentados na FIG. 10 dos desenhos acom- panhantes.

Refametinibe Selumetinibe

[00199] Nem Refametinibe nem Selumetinibe mostrou inibição de- pendente da dose de produção de IP-10 em células endoteliais estimu- ladas com sopa viral de HBEC e realmente pareceu aumentar níveis de IL-10 em concentrações de fármaco maiores (vide FIG. 10).

[00200] Vários alvos de fármaco potenciais foram propostos para influenza severa (por exemplo, Liu, Q. e outros, 2015 e Fedson, D.S., 2009). p38i foi também comparado versus compostos de fármaco para uma seleção desses alvos propostos.

[00201] Para esses experimentos, PH797804 foi referência versus corticosteroide (metil prednisolona), macrólido (Azitromicina), agonista de PPAR (Pioglitazona), inibidor de PDE4 (Roflumilaste), inibidor de NFB (EVP4593) e estatina (Pravastatina) em quatro concentrações de fármaco (1 nM, 10 nM, 100 nM e 1000 nM) em células endoteliais (HUVECs estimuladas com sopa viral de HBEC) ou células imunes (PMBCs mais granulócitos estimulados com sopa viral de A549 como descrito no Exemplo 2 acima).

[00202] Os efeitos de administração de composto de fármaco sobre produção de IP-10, IL-8 e MCP-1 a partir de células endoteliais e sobre produção de IL-1β, IL-6, IL-8 e TNFα a partir de células imunes foram ensaiados usando quimioluminescência eletrogerada.

Em células imu- nes, tratamento com fármaco corticosteroide e macrólido mostrou ini- bição dependente da dose de todas as quatro citocinas ensaiadas, en- quanto p38i mostrou inibição dependente da dose de apenas três das quatro.

O perfil inibidor dos outros fármacos testados era variável e não correspondia àquele de corticosteroide, macrólido ou p38i.

Os re- sultados são sumarizados na Tabela 5 abaixo.

Tabela 5. Comparação de efeitos inibidores de compostos de fármaco para alvos propostos pela literatura para influ- enza severa versus p38i.

PBMCs mais granulócitos foram isolados como descrito no Exemplo 2 e estimulados com sopa viral de A549. Níveis de citocina secretada foram ensaiados através de quimioluminescência eletrogerada e valo- res de IC50 e iMax foram calculados a partir das respostas de dose usando ajuste de regressão não linear usando um pacote de software de gráfico 2D científico e estatístico (software GraphPad PRISM® version 6.07). Onde os dados não mostraram uma inibição dependente da dose, os valores de IC50 e iMax não foram calculados (caixas vazias). Inibidor de Corticosteroi- Macrólido Azi- Agonista de Inibidor de Inibidor de Estatina p38 PH797804 de Metil Pred- tromicina PPAR Piogli- PDE4 i Roflu- NFkB Pravastatina nisolona tazona milaste QNZ

85/99 (EVP4593) IC50 iMax IC50 iMax IC50 iMax IC50 iMax IC50 iMax IC50 iMax IC50 iMax (nM) (%) (nM) (%) (nM) (%) (nM) (%) (nM) (%) (nM) (%) (nM) (%) IL1B 9,7 79% 8,4 77% 0,5 50% IL8 2,3 87% 8,4 90% 0,8 46% 0,1 37% 0,09 31% 0,2 47% TNFa 3,9 91% 20,2 79% 86,9 63% 10,8 74% 43,6 37% IL6 36,6 57% 119 45% 0,02 41%

[00203] Os gráficos de inibição para IL1-b e TNFα para os compos- tos testados são mostrados nas FIGS. 11 e 12.

[00204] Com células endoteliais, em contraste com células imunes, apenas inibidores de p38 e NFB mostraram inibição dependente da dose das três citocinas ensaiadas. Nenhum dos outros fármacos tes- tados mostrou um efeito inibidor comparável. Os resultados são suma- rizados na Tabela 6 abaixo.

Tabela 6. Comparação de efeitos inibidores de compostos de fármaco para alvos propostos pela literatura para influ- enza severa versus p38i.

Células HUVEC foram estimuladas com sopa viral de HBEC.

Níveis de citocina secretada foram ensaiados através de quimioluminescência eletrogerada e valores de IC50 e iMax foram calculados a partir da dose-resposta usando ajuste de regressão não linear com um pacote de software de gráfico 2D científico e estatístico (software GraphPad PRISM® version 6.07). Onde os dados não mostraram uma inibição dependente da dose, os valo- res de IC50 e iMax não foram calculados Inibidor de Corticosteroi- Macrólido Azi- Agonista de Inibidor de Inibidor de Estatina Pra- p38 PH797804 de Metil Pred- tromicina PPAR Piogli- PDE4 Roflumi- NFkB vastatina nisolona tazona laste QNZ

87/99 (EVP4593) IC50 iMax IC50 iMax IC50 iMax IC50 iMax IC50 iMax IC50 iMax IC50 iMax (nM) (%) (nM) (%) (nM) (%) (nM) (%) (nM) (%) (nM) (%) (nM) (%) IP10 7,5 88% 3,3 72% 78 35% IL8 28,9 86% 6,5 60% MCP1 13,1 36% 3,84 44%

[00205] Os gráficos de inibição para IP10 e IL8 são mostrados nas FIGS. 13 e 14.

[00206] Com base nos resultados obtidos nos experimentos de cé- lula imune, a superioridade de p38i versus os outros fármacos foi ines- perada, especialmente metil prednisolona, que é usada rotineiramente em ambientes clínicos para tratar uma gama de doenças inflamatórias (por exemplo, asma) e é comumente prescrita para influenza severa, embora haja incerteza com relação ao seu benefício ou prejuízo po- tencial (Rodrigo, C. e outros, Corticosteroids as adjunctive therapy in the treatment of influenza, Cochrane Database of Systematic Reviews, 2016, Issue 3. Art. No.: CD010406. DOI:

10.1002/14651858.CD010406.pub2]. NFB está a jusante de p38, desta maneira o perfil de inibição visto não é inesperado. Exemplo 5: níveis de várias citocinas em soro de pacientes hospitali- zados por influenza severa foram significantemente aumentados com relação a indivíduos infectados por influenza sem influenza severa

[00207] Os níveis de citocina em amostras de soro de 30 indivíduos hospitalizados com influenza severa durante a estação de influenza de 2015 e de 28 indivíduos saudáveis infectados após inoculação intrana- sal com vírus influenza A/H3N2 Perth/16/2009 foram ensaiados usan- do quimioluminescência eletrogerada. No caso do primeiro, uma amostra de soro preparada de uma amostra de sangue coletada 24-72 horas após o indivíduo ter sido admitido no hospital foi analisada. No caso do último, soro foi analisado de amostras de sangue coletadas em 12 intervalos predeterminados (Dia -1 até Dia 28). Oito citocinas foram observadas ser significantemente aumentadas nos indivíduos hospitalizados versus os saudáveis infectados: IL-8, IL-7, IL-16, Eota- xina, IP10, MCP1, MCP4 e VEGF. Os resultados para quatro dessas são mostrados na FIG. 15.

[00208] Os resultados mostram que os indivíduos hospitalizados são distinguíveis dos indivíduos infectados saudáveis em termos de seus perfis de citocina no soro. Exemplo 6: efeitos de inibição de p38 MAPK com o composto de Fór- mula III sobre liberação de mediador inflamatório em tipos de célula- chave relevantes para influenza severa ou persistente

[00209] O inibidor de p38 MAPK de Fórmula III foi usado em expe- rimentos in vitro e ex vivo (Exemplo 8 do WO 2004/076450 A1 (J. Uri- ach, Y., Compañia S.A.)).

[00210] Teste experimental de inibição de p38 MAPK pelo inibidor de Fórmula III foi realizado em três tipos de célula que são participan- tes-chave na patologia de influenza severa e persistente: células epite- liais; endoteliais; e imunes (FIG. 4). Nesses experimentos, as células foram pretratadas com estímulos simples e/ou complexos a fim de si- mular a ação de mediadores inflamatórios que são produzidos a partir de células epiteliais infectadas por influenza. No caso do primeiro, fator alfa de necrose de tumor (TNFα) mais interleucina 6 (IL-6) foi usado para estimular células endoteliais e imunes. No caso do último, meio condicionado ("sopa" viral) derivado de células A549 infectadas pelo vírus influenza (células epiteliais basais alveolares humanas de ade- nocarcinoma) ou células epiteliais brônquicas humanas primárias (HBECs) foi usado para estimular células epiteliais, endoteliais e imu- nes. Células epiteliais

[00211] Para a produção de meio condicionado (sopa viral), células A549 ou HBECs foram infectadas com estoques de título alto de vírus Influenza A/Perth/16/2009 (H3N2). Estoques virais foram produzidos através de infecção de Rim Canino Madin-Darby [células MDCK, dis- poníveis da American Type Culture Collection como MDCK (NBL-2) (ATCC® CCL-34™)]. Células MDCK foram culturadas para 85-90% de confluência em Meio Essencial Mínimo (MEM) contendo 10% de soro bovino fetal. As células foram lavadas duas vezes com meio de infec- ção (Meio da Eagle Modificado com da Dulbecco Avançado [DMEM] contendo 1,06 de unidades USP/NF por ml de tripsina TPCK). As célu- las foram infectadas com estoque de vírus Influenza A/Perth/16/2009 (H3N2) a 0,01 MOI por uma hora em meio de infecção. No final do pe- ríodo de incubação, partículas de vírus não ligadas foram removidas das células através da lavagem uma vez com meio de infecção. As células foram então cobertas com meio de infecção fresco e incubadas por 48 horas a 37º C em CO2 5%/ar. Após incubação, os frascos de células foram congelados a -80º C por 24 horas, descongelados em temperatura ambiente e sobrenadantes de vírus foram centrifugados (2000 g, 10 min) antes de agrupar juntos, separar em alíquotas e ar- mazenar a -80º C.

[00212] Os estoques virais preparados foram usados para a gera- ção de sopas virais. Cinéticas de crescimento viral foram otimizadas através da determinação de curvas de crescimento de múltiplas eta- pas. Células A 549 ou HBECs foram infectadas com vírus em um MOI de 0,01 a 37º C por uma hora. Seguindo incubação, as células foram lavadas e cobertas com meio de infecção. As amostras foram coleta- das em vários pontos de tempo por 72 horas para determinação de título viral através de ensaio de TCID50 em células MDCK e a presen- ça de mediadores inflamatórios foi avaliada através de ensaio de qui- mioluminescência MSD usando métodos conforme recomendado pelo vendedor (https://web.archive.org/web/20160522190937/https://www.mesoscale. com/).

[00213] Para a preparação de sopa viral de A549, as células foram culturadas em MEM mais soro bovino fetal 10% para 85-90% de con- fluência. As células foram lavadas duas vezes com meio de infecção, então infectadas com estoque de vírus Influenza A/Perth/16/2009

(H3N2) a 0,01 de MOI por uma hora em meio de infecção. Vírus não ligado foi removido das células no final do período de incubação atra- vés de lavagem uma vez com meio de infecção antes da cobertura com meio de infecção. As células foram incubadas por 48 horas a 37º C em CO2 5%/ar. Após incubação, a sopa viral foi coletada a partir dos frascos de cultura, centrifugada (2000 g, 10 min) e reunida. A sopa vi- ral foi separada em alíquotas e armazenada a -80º C. Para a prepara- ção de sopa viral, as células foram culturadas para passagem P-3 ou P-4 em Meio de Crescimento de Célula Epitelial Brônquica (BECGM; Lonza). Para infecção, as células foram lavadas duas vezes com BECGM, então infectadas com estoque de vírus Influenza A/Perth/16/2009 (H3N2) a 0,01 de MOI por uma hora em meio de in- fecção (BECGM contendo 1,06 unidades USP/NF por ml de tripsina TPCK). As células foram então cobertas com meio de infecção e incu- badas por 48 horas a 37º C em CO2 5%/ar. A sopa viral de HBEC foi então processada de uma maneira similar à sopa A549.

[00214] Antes do teste experimental, níveis de mediadores proin- flamatórios em ambas as preparações de sopa de A549 e HBEC foram medidos através de análise de quimioluminescência MSD. Ambas as preparações de sopa foram verificadas conter níveis elevados de cito- cinas proinflamatórias (IL1-, IL-6, IL-8, IL-10, TNF e RANTES; FIG. 5) e demonstraram induzir sinalização de p38MAPK através da de- monstração de fosforilação de ambos p38MAPK e fosforilação da pro- teína de sinalização a jusante HSP27 através de análise Western blot (FIG. 5). Para Western blotting, células tratadas com sopa viral foram lavadas com PBS e lisadas em tampão RIPA com inibidor de protease (Sigma-P8340), coquetéis inibidores de fosfatase 2 e 3 (Sigma P5726 e P0044) e inibidores de fosfatase ortovanadato de sódio e fluoreto de sódio (ambos, www.sigmaaldrich.com) em gelo. As concentrações de proteína foram determinadas usando o Pierce BCA Protein Assay Kit

(www.thermofisher.com). Concentrações equivalentes de cada amos- tra em tampão de amostra 4X Laemmli (BIO-RAD 161-0747) com 2- mercaptoetanol foram analisadas em um gel de poliacrilamida 12% em tampão Tris-glicina-SDS e então transferidas para membrana de nitro- celulose. As membranas foram bloqueadas usando leite em pó 5%, então hibridizadas com anticorpo de coelho p38 MAPK (Cell Signalling Technologies, no. cat. 9212S) e anticorpo de coelho p38 MAPK fosfori- lado (Cell Signalling Technologies, no. cat. 9211S) ou anticorpo HSP27 (Cell Signalling Technologies, no. cat. 2402) e anticorpo fosfo- HSP27 (no. de catálogo Cell signalling Technologies CS7074P2) ou HRP anticamundongo (Cell Signalling, no. catálogo 7076S), respecti- vamente. As membranas foram arrancadas para novo teste usando Restore™ PLUS Western Blot Stripping Buffer (Life technologies # 46430). As membranas foram tratadas com Amersham ECL Prime Western blotting Detection Reagent (GE/Amersham #RPN2232) e imagem feita usando ChemiDocTM Touch Imaging System (BIO-RAD). Análise foi realizada usando o Image Lab software.

[00215] O efeito de sopa viral de HBEC sobre produção de media- dor inflamatório em células HBEC foi medido através de análise MSD. Como mostrado na FIG. 16, sopa de HBEC induziu a produção de ci- tocinas inflamatórias-chave como exemplificado por IL-6 e IP-10. Tra- tamento de HBECs com o inibidor de p38 MAPK de Fórmula III antes da aplicação de sopa viral de HBEC atenuou liberação de ambas as citocinas (FIG. 16). Células endoteliais

[00216] Ambos estímulos simples (TNFα mais IL-6) e complexos (sopa viral de HBEC) foram aplicados a Células Endoteliais da Veia Umbilical Humana (HUVECs) para estimular a interação de mediado- res inflamatórios produzidos por células epiteliais infectadas por influ- enza com células endoteliais.

[00217] Produção de citocina inflamatória por células HUVEC trata- das ou com TNFα mais IL-6 ou sopa viral de HBEC conforme medido através de análise MSD foi explorada. Como mostrado na FIG. 17, ambos os estímulos induziram a produção de citocinas inflamatórias- chave como exemplificado por IL-8 e IP-10. No entanto, tratamento de células HUVEC com inibidor de p38 MAPK de Fórmula III antes da es- timulação foi mostrado atenuar isso (FIG. 17). Células imunes

[00218] Ambos os estímulos simples (TNFα mais IL-6) e complexos (sopa viral de A549) foram aplicados a Células Mononucleares de Sangue Periférico (PBMCs) humanas para estimular a interação de mediadores inflamatórios que são produzidos a partir de células epite- liais infectadas por influenza em células imunes. PBMCs foram isola- das de sangue humano de acordo com as recomendações do fabri- cante (Bøyum, A., Separation of leucocytes from blood and bone mar- row, Scand. J. Clin. Lab. Invest., 1968, 21, suppl. 97).

[00219] Produção de citocina inflamatória em células imunes trata- das ou com TNFα mais IL-6 ou sopa viral de A549 conforme medido através de análise MSD foi explorada. Como mostrado na FIG. 18, ambos estímulos induziram a produção de citocinas inflamatórias- chave como exemplificado por TNFα e IL-8. No entanto, tratamento de PBMCs com o inibidor de p38 MAPK de Fórmula III antes da estimula- ção foi verificado atenuar isso (FIG. 18). Exemplo 7: combinação dos inibidores de p38 MAPK com o fármaco antiviral Oseltamivir

[00220] Terapia bem-sucedida de influenza severa é prevista de- pender de se direcionar efetivamente a ambas a fase de infecção viral (fase 1) por meio dos fármacos antivirais e a última fase inflamatória (pós infecção) (fase 2) com fármacos imunomoduladores. Tratamento antiviral é recomendado o mais cedo possível para qualquer paciente com influenza confirmada ou suspeita que: esteja hospitalizado; tenha doença severa, complicada ou progressiva; ou esteja sob risco maior para complicações por influenza [https://www.cdc.gov/flu/professionals/antivirals/summary- clinicians.htm], é importante que um imunomodulador não impeça a ação do fármaco antiviral uma vez que ambos serão dados ao mesmo tempo. Para examinar essa possibilidade, o efeito de combinar osel- tamivir com qualquer um de ambos inibidores de p38MAPK (PH797804 e Dilmapimode) foi investigado através do exame do efeito que esses dois fármacos tinham sobre a habilidade de oseltamivir em suprimir infecção viral em HBECs.

[00221] HBECs foram infectadas com estoque de vírus Influenza A/Perth/16/2009 (H3N2) a 0,01 de MOI e o efeito de oseltamivir em combinação ou com PH797804 ou Dilmapimode sobre infecção viral foi examinado. O oseltamivir usado nesse Exemplo estava na forma de carboxilato de oseltamivir, que é o metabolito ativo de oseltamivir e sais farmaceuticamente aceitáveis do mesmo (por exemplo, ele é o metabolito ativo de fosfato de oseltamivir). Título viral foi determinado através de ensaio TCID50 [manual OMS para o diagnóstico de labora- tório e pesquisa virológica de influen- za;http://whqlibdoc.who.int/publications/2011/9789241548090_eng.pdf ]. Enquanto tratamento com oseltamivir reduziu a TCID50, nem trata- mento com PH797804 nem com Dilmapimode mostrou esse efeito. Quando oseltamivir foi combinado ou com PH797804 ou Dilmapimode, TCID50 foi reduzida para o nível visto com oseltamivir sozinho, indi- cando que terapia com inibidor de p38MAPK poderia ser usada em combinação com oseltamivir sem impactar sua atividade antiviral (FIG. 19).

[00222] Em um cenário clínico é previsto que redução de carga viral (fase 1) por terapia antiviral seja monitorada através da medição de níveis de RNA usando transcriptase reversa quantitativa reação em cadeia da polimerase (qRT-PCR), e efeitos de inibição de p38 sobre inflamação (fase 2) seriam monitorados através da medição dos níveis de mediadores inflamatórios tais como aqueles vistos em pacientes com influenza severa (exemplo 5) através de, por exemplo, análise MSD de amostras de soro. Exemplo 8: efeitos de inibição de p38 MAPK com o composto de Fór- mula II sobre liberação de mediador inflamatório em tipos de célula- chave relevantes para influenza severa ou persistente

[00223] O inibidor de p38 MAPK de Fórmula II foi usado em expe- rimentos in vitro e ex vivo (Exemplo 18 do WO 2004/076450 A1 (J. Uriach Y Compañia S.A.)). Como descrito acima, a estrutura química desse compostos é como segue: Fórmula II

[00224] Teste experimental de inibição de p38 MAPK pelo inibidor de Fórmula II foi realizado em células endoteliais e imunes. Nesses experimentos, as células foram pretratadas com TNFα mais IL-6 ou sopas virais preparadas como acima descrito em [00190] a [00193]. Células endoteliais

[00225] Produção de citocina inflamatória por células HUVEC trata- das ou com TNFα mais IL-6 ou sopa viral de HBEC foi medida através de análise MSD. Como mostrado na FIG. 20, ambos os estímulos in- duziram a produção de citocinas inflamatórias-chave como exemplifi- cado por IL-8 e IP-10. No entanto, tratamento de células HUVEC com inibidor de p38 MAPK de Fórmula II antes da estimulação foi mostrado atenuar isso (FIG. 20). Células imunes

[00226] Ambos estímulos simples (TNFα mais IL-6) e complexos (sopa de vírus A549) foram aplicados a Células Mononucleares de Sangue Periférico (PBMCs) humanas isoladas para estimular a intera- ção de mediadores inflamatórios que são produzidos a partir de célu- las epiteliais infectadas por influenza em células imunes. PBMCs fo- ram isoladas de sangue humano de acordo com as recomendações do fabricante (Bøyum, A., Separation of leucocytes from blood and bone marrow, Scand. J. Clin. Lab. Invest., 1968, 21, suppl. 97).

[00227] Produção de citocina inflamatória em células imunes trata- das ou com TNFα mais IL-6 ou sopa de vírus de A549 conforme medi- do através de análise MSD foi explorada. Como mostrado na FIG. 21, ambos os estímulos induziram a produção de citocinas inflamatórias- chave como exemplificado por MIP-1a e IL-8 (TNFα mais IL-6 como estímulo) e TNFα e IL-8 (sopa de vírus de A549 como estímulo). No entanto, tratamento de PBMCs com o inibidor de p38 MAPK de Fórmu- la II antes da estimulação foi verificado atenuar isso (FIG. 21). Exemplo 9: combinação de composto com Fórmula II com o fármaco antiviral Oseltamivir

[00228] Como é importante que um imunomodulador não impeça a ação de fármacos antivirais que são prováveis ser dados ao mesmo tempo, o efeito de combinar composto de Fórmula II com oseltamivir foi investigado examinando o efeito que esse composto de fármaco tem sobre a habilidade de oseltamivir suprimir infecção viral em HBECs. Por outro lado, o efeito que essa combinação teria sobre as propriedades anti-inflamatórias de composto com Fórmula II foi tam- bém examinado.

[00229] HBECs foram infectadas com estoque de vírus Influenza

A/Perth/16/2009 (H3N2) a 0,01 de MOI e o efeito de oseltamivir em combinação com composto de Fórmula II sobre infecção viral foi exa- minado. O oseltamivir usado nesse Exemplo estava na forma de car- boxilato de oseltamivir, que é o metabolito ativo de oseltamivir e sais farmaceuticamente aceitáveis do mesmo (por exemplo, ele é o meta- bolito ativo de fosfato de oseltamivir). Título viral foi determinado atra- vés de ensaio TCID50 [manual OMS para o diagnóstico de laboratório e pesquisa virológica de influenza; http:/lwhqlibdoc.who.int/publications/2011/9789241548090 eng.pdf]. Enquanto tratamento com oseltamivir sozinho reduziu TCID50, trata- mento com o composto de Fórmula II sozinho não reduziu significan- temente o TCID50. Quando oseltamivir foi combinado com composto de Fórmula II, TCID50 foi reduzido para o nível visto com oseltamivir sozinho, indicando que terapia com inibidor de p38MAPK poderia ser usada em combinação com oseltamivir sem impactar a atividade anti- viral de oseltamivir (FIG. 22). Por outro lado, oseltamivir sozinho não teve nenhum efeito observável sobre as propriedades anti- inflamatórias do composto de Fórmula II (FIG. 23).

[00230] Em um cenário clínico é previsto que redução de carga viral por terapia antiviral seja monitorada através da medição de níveis de RNA usando transcriptase reversa quantitativa reação em cadeia da polimerase (qRT-PCR), e os efeitos de inibição de p38 sobre inflama- ção seriam monitorados através da medição dos níveis de mediadores inflamatórios tais como aqueles vistos em pacientes com influenza se- vera (exemplo 5) através de, por exemplo, análise MSD de amostras de soro. Abreviações ATP Trifosfato de adenosina A549 Células epiteliais basais alveolares humanas de ade- nocarcinoma

BECGM Meio de crescimento de célula epitelial brônquica Btk Tirosina cinase de Bruton CXCL8 Interleucina 8 CD3 Agrupamento de proteína 3 de diferenciação DMEM Meio da Eagle modificado com da Dulbecco ERK Cinases reguladas por sinal extracelular FRET Transferência de energia de ressonância de fluores- cência GSK Glaxo Smith-Kline HBEC Células epiteliais brônquicas humanas HEPES Ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinoetanossulfônico HSP27 Proteína de choque térmico 27 HUVEC Células endoteliais vasculares humanas IC50 Concentração inibidora metade-máxima iMax Inibição máxima (como uma %) IL1-b Interleucina 1 beta IL-6 Interleucina 6 IL-8 Interleucina 8 IPA Análise de Vias de Ingenuidade IP-10 Proteína induzida por Interferon gama 10 JAK/STAT Janus cinase/transdutor e ativador de sinal de trans- crição JNK Cinase c-Jun N-terminal LPS Lipopolissacarídeo MAPKAP-K2 Proteína cinase ativada por MAP cinase 2 MOI Multiplicidade de infecção MCP-1 Proteína quimiotática de monócitos 1 MDCK Rim canino de Madin Darby MEK Proteína cinase cinase ativada por mitógeno MEKi Inibição de MEK (por fármaco)

MEM Meio essencial mínimo mTOR Alvo mecanístico de rapamicina MSD Mesoscale Discovery NFκB Aumentador-de-cadeia-leve-kappa de fator nuclear de células B ativadas P38 MAPK Proteínas cinases ativadas por mitógeno P38 P38i inibição de p38 (por fármaco) PBMC Células mononucleares de sangue periférico PBS Solução salina tamponada com fosfato PDE4 Fosfodiesterase 4 PKC Proteína cinase PPAR Receptor ativado por proliferação de peroxissoma RANTES Célula T normal, regulada sob ativação, expressa e secretada RIPA Radioimunoensaio de precipitação SDS Dodecil sulfato de sódio SRC Src cinase TCID50 Dose infectiva de cultura de tecido TNFa/TNFα Fator alfa de necrose de tumor TPCK Tosil fenilalanil clorometil cetona USP/NF Farmacopeia dos Estados Unidos e a fórmula nacio- nal

Claims (88)

REIVINDICAÇÕES

1. Inibidor de p38 MAPK de Fórmula I ou um sal ou solvato farmaceuticamente aceitável do mesmo: Fórmula I caracterizado pelo fato de que é para uso no tratamento ou prevenção de hipercitocinemia em um paciente humano ou animal; em que R é C1-3 alquila, opcionalmente substituída por um ou mais halo, NR1R2 ou hidróxi e R1 e R2 são independentemente H, halo ou C1-3 alquila, opci- onalmente substituída por um ou mais F.

2. Inibidor de p38 MAPK para uso de acordo com a reivin- dicação 1, caracterizado pelo fato de que o inibidor de p38 MAPK é de Fórmula II ou um sal ou solvato farmaceuticamente aceitável do mes- mo: Fórmula II

3. Inibidor de p38 MAPK para uso de acordo com a reivin- dicação 1, caracterizado pelo fato de que o inibidor de p38 MAPK é de Fórmula III ou um sal ou solvato farmaceuticamente aceitável do mesmo:

Fórmula III

4. Inibidor de p38 MAPK para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a hiperci- tocinemia está associada com um ou mais do que segue: infecção pe- lo vírus influenza severa; doença enxerto-versus-hospedeiro (GVHD); síndrome do desconforto respiratório agudo (ARDS); sepse; ebola; va- ríola; síndrome da resposta inflamatória sistêmica (SIRS); infecção bacteriana; e câncer.

5. Inibidor de p38 MAPK de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que é para uso no tratamento ou prevenção de infecção pelo vírus influenza severa; ou para uso de acordo com a reivindicação 4 em que a hipercitocinemia é associada à infecção pelo vírus influenza severa.

6. Inibidor de p38 MAPK e agente antimicrobiano, caracte- rizados pelo fato de que são para uso no tratamento ou prevenção de hipercitocinemia.

7. Inibidor de p38 MAPK e agente antimicrobiano para uso de acordo com a reivindicação 6, caracterizados pelo fato de que o inibidor de p38 MAPK é um inibidor de p38 MAPK como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3.

8. Inibidor de p38 MAPK e agente antimicrobiano para uso de acordo com a reivindicação 6 ou 7, caracterizados pelo fato de que o agente antimicrobiano é: um anticorpo monoclonal antibacteria- no, um antibiótico, um antifúngico, um antiviral, um antiparasítico e/ou um antimicrobiano.

9. Inibidor de p38 MAPK para uso de acordo com a reivin- dicação 6, 7 ou 8, caracterizado pelo fato de que os agentes antimi- crobianos são um agente antiviral.

10. Inibidor de p38 MAPK para uso de acordo com a reivin- dicação 9, caracterizado pelo fato de que o agente antiviral é: amanta- dina; rimantadina; ribavirina; idoxuridina; trifluridina; vidarabina; aciclo- vir; ganciclovir; foscarnete; zidovudina; didanosina; zalcitabina; esta- vudina; famciclovir; um inibidor de neuraminidase tal como: fosfato de oseltamivir, zanamivir, peramivir ou Laninamivir, valaciclovir; antitussí- genos; mucolíticos; expectorantes; antipiréticos; analgésicos e/ou des- congestionantes nasais.

11. Inibidor de p38 MAPK e agente antiviral para uso de acordo com a reivindicação 10, caracterizados pelo fato de que são para o uso como definido na reivindicação 5.

12. Inibidor de p38 MAPK e agente antiviral para uso de acordo com a reivindicação 11, caracterizados pelo fato de que o agente antiviral é oseltamivir ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, por exemplo, fosfato de oseltamivir.

13. Inibidor de p38 MAPK e um agente antimicrobiano para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 12, caracteri- zados pelo fato de que o inibidor de p38 MAPK e o agente antimicrobi- ano são para administração simultânea, sequencial ou separada.

14. Inibidor de p38 MAPK e um agente antimicrobiano para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 13, caracteri- zados pelo fato de que o inibidor de p38 MAPK e o agente antimicrobi- ano são providos em forma de dosagem única para administração si- multânea, por exemplo, em uma forma de dosagem única, para admi- nistração oral simultânea.

15. Inibidor de p38 MAPK e um agente anticâncer, caracte-

rizados pelo fato de que são para uso em tratamento ou prevenção de hipercitocinemia.

16. Inibidor de MAPK e um agente anticâncer para uso de acordo com a reivindicação 15, caracterizados pelo fato de que o inibi- dor de p38 MAPK é um inibidor de p38 MAPK de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3.

17. Inibidor de p38 MAPK para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o inibidor é administrado: sistemicamente ou não sistemicamente, tal como oralmente, ou topicamente, incluindo epidermalmente, bucal- mente, intranasalmente ou via inalação (aerossol) ou ambos intrana- salmente e via inalação ou parenteralmente (por exemplo, intraveno- samente, subcutaneamente) ou em combinação topicamente e paren- teralmente.

18. Inibidor de p38 MAPK para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o inibidor de p38 MAPK é administrado oralmente.

19. Inibidor de p38 MAPK para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o inibidor de p38 MAPK é administrado intravenosamente.

20. Inibidor de p38 MAPK para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que a dita hipercitocinemia envolve níveis elevados de uma ou mais citocinas selecionadas de TNFα, IL-6, IL-8, IP10 e MIP-1a (por exemplo, uma ou mais citocinas selecionadas de TNFα, IL-6, IL-8 e IP10).

21. Inibidor de p38 MAPK para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o inibidor de p38 MAPK tem um efeito anti-inflamatório e/ou imunomodu- lador.

22. Inibidor de p38 MAPK para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que inibe a liberação de mediadores proinflamatórios a partir de células endoteliais e/ou células imunes.

23. Inibidor de p38 MAPK para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que inibe a liberação citocinas proinflamatórias a partir de células endoteli- ais e/ou células imunes.

24. Inibidor de p38 MAPK para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que inibe a liberação a partir de um ou mais de: IL1-β, IL-6, IL-8, IL-10, IP10, TNFα, RANTES e MIP-1a a partir de células endoteliais e/ou cé- lulas imunes (por exemplo, um ou mais de: IL1-β, IL-6, IL-8, IL-10, IP10, TNFα e/ou RANTES a partir de células endoteliais e/ou células imunes).

25. Inibidor de p38 MAPK para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que inibe a liberação de IL-10 a partir de células endoteliais e/ou células imunes.

26. Inibidor de p38 MAPK para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que inibe a liberação IL1-β, IL-6, IL-8, IL-10, IP10, TNFα e RANTES a partir de células endoteliais e/ou células imunes; ou que inibe a liberação de IL1-β, IL-6, IL-8, IL-10, IP10, TNFα, RANTES e MIP-1a a partir de célu- las endoteliais e/ou células imunes.

27. Inibidor de p38 MAPK para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que inibe a liberação de IL10 a partir de células endoteliais e/ou células imunes.

28. Inibidor de p38 MAPK para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que exibe inibição dependente da dose de liberação de citocina a partir de células endoteliais e/ou células imunes.

29. Inibidor de p38 MAPK para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que inibe a liberação de citocinas proinflamatórias a partir de células endo- teliais e/ou células imunes.

30. Inibidor de p38 MAPK para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que inibe a liberação de citocinas proinflamatórias a partir de células epite- liais.

31. Inibidor de p38 MAPK para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que inibe a liberação de citocinas proinflamatórias a partir de células epite- liais, células endoteliais e células imunes.

32. Inibidor de p38 MAPK para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 31, caracterizado pelo fato de que a dita infecção pelo vírus influenza severa é distinguida por sintomas ou si- nais de hipoxemia ou insuficiência cardiopulmonar.

33. Inibidor de p38 MAPK para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 32, caracterizado pelo fato de que os ditos sintomas ou sinais de hipoxemia ou insuficiência cardiopulmonar in- cluem um ou mais de dispneia, taquipneia, cianose, pressão sanguí- nea baixa e hipoxia.

34. Inibidor de p38 MAPK para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 33, caracterizado pelo fato de que a dita infecção pelo vírus influenza severa é distinguida por taquipneia (taxa respiratória ≥ 30 para idades ≥ 12 anos, taxa ≥ 40 para idades de 6 a 12 anos, taxa ≥ 45 para idades de 3 a 6 anos, taxa ≥ 50 para idades de 1 a 3 anos).

35. Inibidor de p38 MAPK para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 34, caracterizado pelo fato de que a dita infecção pelo vírus influenza severa é distinguida por qualquer descon- forto com respiração ou dispneia.

36. Inibidor de p38 MAPK para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 35, caracterizado pelo fato de que a dita infecção pelo vírus influenza severa é distinguida por comorbidade com um distúrbio respiratório inferior sem infiltrados pulmonares radio- lógicos.

37. Inibidor de p38 MAPK para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 36, caracterizado pelo fato de que a dita infecção pelo vírus influenza severa é distinguida por sintomas ou si- nais sugerindo distúrbios do SNC e/ou neuromusculares periféricos.

38. Inibidor de p38 MAPK para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 37, caracterizado pelo fato de que a dita infecção pelo vírus influenza severa é distinguida por desidratação se- vera.

39. Inibidor de p38 MAPK para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 38, caracterizado pelo fato de que a dita infecção pelo vírus influenza severa é distinguida por fadiga e/ou letar- gia.

40. Inibidor de p38 MAPK para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 39, caracterizado pelo fato de que a dita infecção pelo vírus influenza severa é distinguida pela presença de infiltrado pulmonar radiológico.

41. Inibidor de p38 MAPK para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 40, caracterizado pelo fato de que a dita infecção pelo vírus influenza severa envolve evidência de infecção vi- ral sustentada.

42. Inibidor de p38 MAPK para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 41, caracterizado pelo fato de que a dita infecção pelo vírus influenza severa envolve infecção bacteriana se- cundária invasiva.

43. Inibidor de p38 MAPK para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 42, caracterizado pelo fato de que a dita infecção pelo vírus influenza severa envolve um distúrbio ou inflama- ção do trato respiratório inferior.

44. Inibidor de p38 MAPK para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 43, caracterizado pelo fato de que a dita infecção pelo vírus influenza severa é distinguida por falência mono- ou multiórgãos ou choque séptico.

45. Inibidor de p38 MAPK para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 44, caracterizado pelo fato de que o paci- ente é um bebê ou idoso ou é uma mulher grávida.

46. Inibidor de p38MAPK de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 45, caracterizado pelo fato de que uma ou mais co- morbidades subjacentes predispõem o paciente à infecção pelo vírus influenza severa.

47. Inibidor de p38 MAPK para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o inibidor de p38 MAPK é administrado ao paciente após a hipercitoci- nemia ter se desenvolvido.

48. Inibidor de p38 MAPK para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o inibidor de p38 MAPK é primeiro administrado ao paciente pelo menos 8 horas após uma resposta imune ser disparada.

49. Inibidor de p38 MAPK para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o inibidor de p38 MAPK é primeiro administrado ao paciente pelo menos 48 horas após uma resposta imune ser disparada.

50. Inibidor de p38MAPK para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 49, caracterizado pelo fato de que o inibi- dor de p38 MAPK é primeiro administrado ao paciente pelo menos 8 horas após infecção pelo vírus influenza.

51. Inibidor de p38MAPK de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 50, caracterizado pelo fato de que o inibidor de p38 MAPK é primeiro administrado ao paciente pelo menos 48 horas após infecção pelo vírus influenza.

52. Inibidor de p38 MAPK para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o inibidor de p38 MAPK é administrado ao paciente por um período má- ximo de 1-5 dias.

53. Inibidor de p38 MAPK para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o inibidor de p38 MAPK é administrado ao paciente uma vez ao dia.

54. Inibidor de p38 MAPK para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o inibidor de p38 MAPK é administrado em uma dose entre cerca de 10 mg e cerca de 1000 mg.

55. Inibidor de p38MAPK de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 54, caracterizado pelo fato de que o inibidor de p38 MAPK e o agente antimicrobiano ou agente anticâncer são administra- dos simultaneamente.

56. Inibidor de p38 MAPK para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 13 ou 15 a 54, caracterizado pelo fato de que o inibidor de p38 MAPK e o agente antimicrobiano ou agente anti- câncer são administrados sequencialmente.

57. Inibidor de p38 MAPK para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 13, 15 a 54 ou 56, caracterizado pelo fato de que o agente antimicrobiano ou agente anticâncer é administrado antes do inibidor de p38 MAPK.

58. Inibidor de p38 MAPK para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 57, caracterizado pelo fato de que o inibi- dor de p38 MAPK é administrado a um paciente que foi administrado com um agente antiviral para o tratamento de gripe severa.

59. Inibidor de p38 MAPK para uso de acordo com a reivin- dicação 58, caracterizado pelo fato de que o inibidor de p38 MAPK é administrado dentro de 72 horas, 60 horas, 48 horas, 36 horas, 24 ho- ras, 16 horas, 12 horas, 10 horas, 8 horas, 6 horas, 4 horas, 2 horas ou 1 hora de administração do agente antiviral.

60. Inibidor de p38 MAPK para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 57, caracterizado pelo fato de que o inibi- dor de p38 MAPK é administrado a um paciente que está sob trata- mento de gripe severa compreendendo administrar um agente antivi- ral.

61. Inibidor de p38 MAPK para uso de acordo com a reivin- dicação 60, caracterizado pelo fato de que o paciente sofreu tratamen- to de gripe severa compreendendo administrar um agente antiviral por pelo menos 1 hora (preferivelmente pelo menos 12 horas) antes do tratamento com o inibidor de p38 MAPK.

62. Inibidor de p38 MAPK para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 61, caracterizado pelo fato de que o inibi- dor de p38 MAPK é administrado a um paciente que tem uma concen- tração no plasma sanguíneo de carboxilato de oseltamivir de 1 a 750 μg/mL (por exemplo, 5 a 600 μg/mL, 10 a 500 μg/mL, 25 a 500 μg/mL, 50 a 500 μg/mL ou 100 a 400 μg/mL).

63. Composição farmacêutica para uso no tratamento ou prevenção de hipercitocinemia em um paciente humano ou animal, caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos um inibidor de p38 MAPK de Fórmula I ou um sal ou solvato farmaceuticamente acei- tável do mesmo:

Fórmula I em que R é C1-3alquila, opcionalmente substituída por um ou mais ha- lo, NR1R2 ou hidróxi e R1 e R2 são independentemente H, halo ou C1- 3alquila, opcionalmente substituída com um ou mais F.

64. Composição farmacêutica para uso de acordo com a reivindicação 63, caracterizada pelo fato de que o inibidor de p38 MAPK é de Fórmula II ou um sal ou solvato farmaceuticamente aceitá- vel do mesmo: . Fórmula II

65. Composição farmacêutica para uso de acordo com a reivindicação 63, caracterizada pelo fato de que o inibidor de p38 MAPK é de Fórmula III ou sal ou solvato farmaceuticamente aceitável do mesmo:

Fórmula III

66. Composição farmacêutica para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 63 a 65, caracterizada pelo fato de que a hipercitocinemia ocorre devido a um ou mais do que segue: in- fecção pelo vírus influenza severa; doença enxerto-versus-hospedeiro (GVHD); síndrome do desconforto respiratório agudo (ARDS); sepse; ebola; varíola; síndrome da resposta inflamatória sistêmica (SIRS); in- fecção bacteriana; e câncer.

67. Composição farmacêutica de acordo com a reivindica- ção 66, caracterizada pelo fato de que é para uso no tratamento ou prevenção de infecção pelo vírus influenza severa; ou para uso de acordo com a reivindicação 66 em que a hipercitocinemia é associada à infecção pelo vírus influenza severa.

68. Composição farmacêutica para uso no tratamento ou prevenção de hipercitocinemia em um paciente humano ou animal, caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos um inibidor de p38 MAPK e um agente antimicrobiano.

69. Composição farmacêutica para uso de acordo com a reivindicação 68, caracterizada pelo fato de que a composição farma- cêutica é como definida em qualquer uma das reivindicações 63 a 65.

70. Composição farmacêutica para uso de acordo com a reivindicação 68 ou 69, caracterizada pelo fato de que o agente anti- microbiano é um agente antiviral.

71. Composição farmacêutica para uso de acordo com a reivindicação 70, caracterizada pelo fato de que o agente antiviral é oseltamivir ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, por exemplo, fosfato de oseltamivir.

72. Composição farmacêutica para uso no tratamento ou prevenção de hipercitocinemia em um paciente humano ou animal, caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos um inibidor de p38 MAPK e um agente anticâncer.

73. Composição farmacêutica para uso de acordo com a reivindicação 72, caracterizada pelo fato de que a composição farma- cêutica é como definida em qualquer uma das reivindicações 63 a 65.

74. Composição farmacêutica para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 63 a 73, caracterizada pelo fato de que a composição farmacêutica é formulada para administração oral.

75. Método de tratamento ou prevenção de hipercitocinemia em um paciente humano ou animal com necessidade do mesmo, ca- racterizado pelo fato de que compreende administrar ao paciente uma quantidade terapeuticamente ou profilaticamente eficaz de um inibidor de p38 MAPK de Fórmula I ou um sal ou solvato farmaceuticamente aceitável do mesmo: Fórmula I em que R é C1-3alquila, opcionalmente substituída por um ou mais ha- lo, NR1R2 ou hidróxi e R1 e R2 são independentemente H, halo ou C1- 3alquila, opcionalmente substituída com um ou mais F.

76. Método de acordo com a reivindicação 75, caracteriza-

do pelo fato de que o inibidor de p38 MAPK é de Fórmula II ou um sal ou solvato farmaceuticamente aceitável do mesmo: Fórmula II

77. Método de acordo com a reivindicação 75, caracteriza- do pelo fato de que o inibidor de p38 MAPK é de Fórmula III ou um sal ou solvato farmaceuticamente aceitável do mesmo: Fórmula III

78. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 75 a 77, caracterizado pelo fato de que a hipercitocinemia ocorre devido a um ou mais do que segue: infecção pelo vírus influenza seve- ra; doença enxerto-versus-hospedeiro (GVHD); síndrome do descon- forto respiratório agudo (ARDS); sepse; ebola; varíola; síndrome da resposta inflamatória sistêmica (SIRS); infecção bacteriana; e câncer.

79. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 75 a 78, caracterizado pelo fato de que é para o tratamento ou prevenção de infecção pelo vírus influenza severa; ou um método co- mo definido em qualquer uma das reivindicações 74 a 77 em que a hipercitocinemia ocorre devido à infecção pelo vírus influenza severa.

80. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 75 a 79, caracterizado pelo fato de que compreende ainda admi- nistrar um agente antimicrobiano.

81. Método de tratamento ou prevenção de hipercitocine- mia em um paciente humano ou animal com necessidade do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao paciente uma quantidade terapeuticamente ou profilaticamente eficaz de um inibidor de p38 MAPK e compreendendo ainda administração de um agente antimicrobiano.

82. Método de acordo com a reivindicação 80 ou 81, carac- terizado pelo fato de que o agente antimicrobiano é um agente antivi- ral.

83. Método de acordo com a reivindicação 82, caracteriza- do pelo fato de que o agente antiviral é oseltamivir ou um sal farma- ceuticamente aceitável do mesmo, por exemplo, fosfato de oseltamivir.

84. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 75 a 79, caracterizado pelo fato de que compreende administrar um agente anticâncer.

85. Método de tratamento ou prevenção de hipercitocinemia em um paciente humano ou animal com necessidade do mesmo, ca- racterizado pelo fato de que compreende administrar ao paciente uma quantidade terapeuticamente ou profilaticamente eficaz de um inibidor de p38 MAPK e administrar ao paciente uma quantidade terapeutica- mente ou profilaticamente eficaz de um agente anticâncer.

86. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 75 a 85, caracterizado pelo fato de que o inibidor de p38 MAPK é administrado oralmente.

87. Método de tratamento ou prevenção de hipercitocine- mia em um indivíduo humano ou animal (por exemplo, um paciente humano) com necessidade do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamen- te ou profilaticamente eficaz de um inibidor de p38 MAP cinase como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 62 ou uma composi- ção como definida em qualquer uma das reivindicações 63 a 74.

88. Método de tratamento ou prevenção de hipercitocine- mia em um indivíduo humano ou animal (por exemplo, um paciente humano) com necessidade do mesmo de acordo com a reivindicação 87, caracterizado pelo fato de que é para o tratamento ou prevenção de hipercitocinemia como definido em qualquer uma das reivindica- ções 1 a 62.

Petição 870200102228, de 14/08/2020, pág. 120/149 D3 vs.

Severa 48 h vs.

Severa 60 h vs.

Severa

Suprarregulada Suprarregulada Suprarregulada Suprarregulada Suprarregulada Suprarregulada em D3 em Severa em D2 em Severa em D2 em Severa 1/24

Mapa para vias de sinalização em IPA

650 vias de sinalização

Remover 297 vias metabólicas

353 vias

Espaço extracelular

Citoplasma

Núcleo

Colágeno tipo I

Vírus da gripe

Células epiteliais das

Petição 870200102228, de 14/08/2020, pág. 124/149 vias aéreas

Qu im Liberação de mediadores proinflamatórios ioa tra ãoç d ec élul Liberação de citocina a si m un es Inflamação local 5/24

Células imunes Células endoteliais pulmonares

Permeabilidade vascular Liberação de mediadores proinflamatórios Ração de mediadores proinflamatórios

Inflamação sistêmica

Petição 870200102228, de 14/08/2020, pág. 125/149 6/24

Células epiteliais culturadas Quantificação da 'Sopa' Citocina (MSD) (A549/HBEC)

IL-1â, IL-6, IL-8, IL-10, TNFá e RANTES le le ro ro t t on on

C

C Sopa de +A549 Não tratado Fosfo-p38 Fosfo-Hsp27

Petição 870200102228, de 14/08/2020, pág. 127/149 Fosfo-Hsp27 do % % ta 70 70 tra do do ão ta c ta N f ec fe in In ão

N 8/24 Não tratado Sopa de +HBEC do % % ta 70 70 tra do do ão ta c ta N f ec fe in In ão

N

Petição 870200102228, de 14/08/2020, pág. 128/149 Controle Controle Controle 9/24

Fosfo-Hsp27

Não tratado PH797804 + sobrenadante viral de HBEC % de Viabilidade em relação ao controle

Controle Sobrenadante viral de HBEC

Petição 870200102228, de 14/08/2020, pág. 129/149 ) 9) ) ) =9 = 18) =9 =9 8) (n (n (n (n =1 os G (n= os G ( n h Ig 9) h Ig ) in le in l e 49 soz tro A 54 soz tro 5 n l( n (A os Co a os Co al ei vir ei vir

M M pa pa So So 10/24 ) 9) ) ) ) =9 = 18) =9 =9 24 (n (n (n (n = s G (n= s G (n ho Ig 9) ho Ig ) in e in e 49 soz tr ol 54 soz trol 5 n A n (A os Co a l( os Co al ei vir ei vir

M M pa pa So So

Dilmapimode Petição 870200102228, de 14/08/2020, pág. 130/149 do % % ta 70 70 tra do do ão ta cta N f ec fe in In ão

N 11/24 Refametanibe Selumatinibe pg/ml de proteína pg/ml de proteína do do ta a tra trat ão ão

N N

Inibidor de p38 – IL1B le 9 n tro A54 Co de pa So Corticosteroide – IL1B Agonista de PPAR – 1L1B le 49 le 49 ro ro o nt A5 o nt e A5 C de C ad pa p So So

Inibidor de PDE4 Macrólido – IL1B le 9 le 49 ro 54 ro o nt A o nt e A5 C de C a d pa p So So

Inibidor de NFKB – IL1B Estatina – IL1B le 49 le 9 nt ro A5 n tro A 54 C o d e Co de pa pa So So

Inibidor de p38 – TNFA le 9 n tro A54 Co de pa So Corticosteroide – TNFA Agonista de PPAR – TNFA le 49 le 49 ro ro o nt e A5 o nt e A5 C ad C ad p p So So

Inibidor de TNFA Macrólido – TNFA le 9 le 49 tro A 54 ro nt e A5 n o Co de C ad pa p So So

Inibidor de NFKB – TNFA Estatina – TNFA le 9 le 49 nt ro A 54 n tro 5 C o de Co d eA o pa p a S So

Inibidor de p38 – IL-8 le le EC n tro ntro

HB Co co de de pa pa So So Corticosteroide – IL-8 Inibidor de PDE4 - IL-8 le le C le le ro tro tro nt ro EC nt con HBE n co HB o C de de Co de de pa pa pa pa So So So So Estatina – IL-8 Macrólido – IL-8 le le C le le ro tro tro nt ro EC nt con HBE n co HB o C de de Co de de pa pa pa pa So So So So Agonista de PPAR – IL-8 Inibidor de NFKB – IL-8 le le le le tro nt ro EC tro nt ro EC n co HB n co HB Co de de Co de de pa pa pa pa So So So So

Inibidor de p38 – IL-8 le le EC n tro nt ro

HB Co co de de pa a So p So Corticosteroide – IL-8 Inibidor de PDE4 - IL-8 le le le le t ro tro EC t ro tro EC on co n HB on co n

HB C de de C de de pa pa pa pa So So So So Estatina – IL-8 Macrólido – IL-8 le le le le t ro tro E C t ro n tro EC on co n HB on co HB C de de C de de pa pa pa pa So So So So Agonista de PPAR – IL-8 Inibidor de NFKB – IL-8 le le le le tro nt ro EC tro nt ro EC n co HB n co HB Co de de Co de de pa pa pa pa So So So So

Petição 870200102228, de 14/08/2020, pág. 135/149 Concentração (pg/ml) Concentração (pg/ml)

I

I nf nf lu lu en en za za se se ve ve ra ra Concentração (pg/ml) Concentração (pg/ml) Eotaxina In In f f lue lue nz nz a a se se ve ve ra ra 16/24

Petição 870200102228, de 14/08/2020, pág. 136/149

C C on on tro tro le le So So pa pa de de A5 A5 17/24 49 49 So So pa pa de de A5 A5 49 49

Petição 870200102228, de 14/08/2020, pág. 137/149 le II ole II ntro la I ntr la I Co u Co u órm rm F Fó n M M 00 0 0n 10 10 18/24

Sopa de vírus de HBEC le % III le 0% III ntro 70 ula n tro 7 ula Co B EC órm Co EC ó rm eH F e HB F ad 0 nM p ad nM Sop 00 So 00 1 10

Petição 870200102228, de 14/08/2020, pág. 138/149 ole II ntr ula I Co F órm n M 00 10 19/24

Sopa de vírus de HBEC ole % II ole 0% II ntr C 70 la I ntr 7 la I Co BE u Co EC u órm HB rm eH F e Fó pad nM ad M So 00 p 00n 10 So 10

Petição 870200102228, de 14/08/2020, pág. 139/149 Se m fá O rm se ac lta o m (M ivi ei r os -1 0 ) 0 nM e

O se e lt O ami s e elta vir

O s m e elta ivir DIL e Oselt n = 2

O se miv ltam ir ivi r Se m fár O m se ac lta o m (M ivi ei r- os 10 ) 0 nM e

O se e lt O ami s e elta vir

O s m e el iv DIL e Oselt n = 2 O tam ir se iv ltam ir ivi r 20/24

Petição 870200102228, de 14/08/2020, pág. 140/149 o le I II II II ntr ula I ula ula ula le I I I I Co r m r m r m n tro u la I u la I u la I u la I F órm Fó Fó Fó Co rm rm rm rm Fó Fó Fó Fó 21/24

Sopa de vírus de HBEC ole I II II II le II II II II ntr ula I ula ula ula ntro ula ula ula ula Co órm r m r m r m Co rm rm rm rm F Fó Fó Fó Fó Fó Fó Fó

Petição 870200102228, de 14/08/2020, pág. 141/149 o le II II II II ole I I ntr la la la la ntr la I II II aI Co mu mu mu r mu Co u m ula m ula rmul Fór Fór r Fó rm r r Fó Fó Fó Fó Fó 22/24

Sopa de vírus de HBEC o le 9 II II II II le 9 II II II II ntr 54 la la la la n tro 54 ula ula ula Co eA mu mu mu mu Co A m m m m ula d ór ór ór ór de r r r r pa F F F F pa Fó Fó Fó Fó So So

Petição 870200102228, de 14/08/2020, pág. 142/149 Se m fá rm O ac o se lta (M m ei os ivi r- ) 10 0 nM Fó rm ula Fó II rm ula Fó Fó II rm rm 23/24 ula ula Fó II Fó II rm rm ula ula Fó II II rm ula Fó II rm ula

II

Petição 870200102228, de 14/08/2020, pág. 143/149 24/24 o II o II ratad ula ratad ula ot F órm ot ó rm Nã Nã F la II II II I I ula II II r mu ula u la I ula I r m ula ula Fó rm Fó rm rm Fó F órm F órm Fó Fó