BR112020012190A2

BR112020012190A2 - partícula de replicon de alfavírus

Info

Publication number: BR112020012190A2
Application number: BR112020012190-8A
Authority: BR
Inventors: Wataru Akahata; Ryuji Ueno
Original assignee: Vlp Therapeutics, Llc
Priority date: 2017-12-20
Filing date: 2018-12-19
Publication date: 2020-11-24
Also published as: CA3086219A1; SG11202005792RA; AU2018388071A1; RU2020123508A; BR112020012190A8; AR114942A1; WO2019124441A1; JP2024016216A; KR20200100126A; JP7412002B2; EP3728611A1; CN111742053A; US20220002682A1; IL275436A; JP2021507713A; US20190185822A1; EP3728611A4; MX2020006567A; TW201930335A

Abstract

A presente invenção refere-se a uma partícula de replicon de alfavírus (ARP), a qual compreende: (i) proteínas estruturais de alfavírus, as quais compreendem capsídeo e/ou envelope, e (ii) um replicon de alfavírus, o qual compreende um polinucleotídeo codificando as proteínas não estruturais de alfavírus nsp1, nsp2, nsp3 e nsp4 e no mínimo um gene de interesse, em que no mínimo um entre capsídeo, e E3 e E2 no envelope compreendem alteração de um ou mais aminoácidos porém E1 no envelope não compreende nenhuma alteração de aminoácido.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para “PARTÍ- CULA DE REPLICON DE ALFAVÍRUS”. Campo Técnico

[0001] A presente invenção se refere a uma partícula de replicon de alfavírus que pode ser usada como um sistema de liberação gené- tica. Antecedentes da Arte

[0002] A terapia genética é desenhada para introduzir material ge- nético dentro das células de modo a compensar genes anormais ou de modo a produzir uma proteína benéfica. Se um gene mutado fizer com que uma proteína necessária seja defeituosa ou ausente, a terapia ge- nética pode ser capaz de introduzir uma cópia normal do gene, de mo- do a restaurar a função da proteína.

[0003] A terapia genética é um campo emergente nas ciências médica e farmacêutica devido a seu potencial de tratar doenças crôni- cas como o câncer, infecções virais, enfartes do miocárdio, e distúr- bios genéticos, etc.

[0004] Um gene que é inserido diretamente dentro de uma célula geralmente não funciona. Em vez disso, um portador denominado um vetor é manipulado geneticamente para liberar o gene. Certos vírus são frequentemente usados como vetores porque podem liberar o no- vo gene infectando a célula. Os vírus são modificados de modo a que não possam provocar doença quando usados em pessoas. Alguns ti- pos de vírus, tais como os retrovírus, integram seu material genético (incluindo o novo gene) dentro de um cromossoma na célula humana. Outros vírus, tais como os adenovírus, introduzem seu gene dentro do núcleo da célula, mas o gene não é integrado dentro do cromossoma.

[0005] O vetor pode ser injetado diretamente dentro de um tecido específico, onde é absorvido pelas células individuais ou administrado por via intravenosa (por IV) no corpo. Alternativamente, uma amostra das células do paciente pode ser removida e exposta ao vetor em um ambiente de laboratório. As células contendo o vetor são então retor- nadas para o paciente. No caso do tratamento ser bem sucedido, o novo gene liberado pelo vetor vai produzir uma proteína funcionante. (https://ghr.nlm.nih.gov/iniciador/therapy/procedures, Int J Pharm In- vestig. 2013 Jan-Mar; 3(1): 1-7.)

[0006] Alfavírus compreendem um conjunto de vírus transmitidos por mosquitos relacionados genéticamente, estruturalmente, e sorolo- gicamente da família Togaviridae. Os alfavírus incluem o Vírus da En- cefalite Equina Oriental (EEEV), o Vírus da Encefalite Equina Vene- zuelana (VEEV), o Vírus Everglades, o Vírus Mucambo, o Vírus Pixu- na, o Vírus da Encefalite Equina Ocidental (WEEV), o Vírus Sindbis, o Vírus da Floresta de Semliki, o Vírus Middleburg, o Vírus Chikungunya (CHIKV), o Vírus O’nyong-nyong, o Vírus Ross River, o Vírus da Flo- resta de Barmah, o Vírus Getah, o Vírus Sagiyama, o Vírus Bebaru, o Vírus Mayaro, o Una Vírus, o Aura Vírus, o Vírus Whataroa, o Vírus Babanki, o Vírus Kyzylagach, o Vírus Highlands J, o Vírus Fort Mor- gan, o Vírus Ndumu, e o Vírus Buggy Creek. Subunidades estruturais contendo uma única proteína viral, capsídeo, associam com o genoma do RNA em um nucleocapsídeo icosaédrico. No vírion, o capsídeo é circundado por um envelope lipídico coberto com uma matriz regular de picos de proteínas transmembrana, cada um dos quais consiste em um complexo heterodimérico de duas glicoproteínas, E1 e E2.

[0007] Uma partícula de replicon de alfavírus (ARP) é produzida em células ou culturas e incorpora um “replicon” que pode expressar genes não alfavírus dentro da concha do vírion compreendendo prote- ínas estruturais de alfavírus e lipídeo membrana.

[0008] Partículas de replicon de alfavírus são descritas na Pat. U.S. No. 7.045.335, na WO 2004/085660 e em Virology 239, 389-401,

1997. Processos para sua fabricação são descritos na Pat. U.S. No.

7.078.218, o conteúdo dos documentos citados neste parágrafo é in- corporado por meio de referência.

[0009] A aplicação clínica de terapia genética ainda é limitada de- vido à falta de métodos adequados para introdução apropriada de ge- nes dentro de células e, portanto, esta é uma área de interesse para muitos pesquisadors. De modo a realizar terapia genética com suces- so, o desenvolvimento de sistemas de liberação genética apropriados pdoe ser um dos fatores mais importantes (Int. J Pharm Investig. 2013 Jan-Mar; 3(1): 1-7). Lista de Citação Literatura de Patente

[0010] PTL 1: Patente US No. 7.045.335 PTL 2: WO2004/085660 PTL 3: Patente US No. 7.078.218 Literatura Não Patente

[0011] NPL 1: Int J Pharm Investig. 2013 Jan-Mar; 3(1): 1-7 NPL 2: Virology 239, 389-401, 1997 Sumário da Invenção

[0012] A presente invenção se refere a um sistema de liberação genética compreendendo uma partícula de replicon de alfavírus apri- morada.

[0013] Em um aspecto, uma partícula de replicon de alfavírus (ARP), a qual compreende (i) proteínas estruturais de alfavírus, as quais compreendem capsídeo e/ou envelope, e (ii) um replicon de alfavírus, o qual compreende um polinu- cleotídeo codificando as proteínas não estruturais de alfavírus nsp1, nsp2, nsp3 e nsp4 e no mínimo um gene de interesse, em que no mínimo um entre capsídeo, E3 e E2 no envelope compreendem alteração de um ou mais aminoácidos porém E1 no en-

velope não compreende nenhuma alteração de aminoácido.

[0014] Em um aspecto, a invenção proporciona uma ARP, em que a proteína estrutural do vírus tem uma ou mais alterações no Sinal de Localização Nuclear (NLS) da proteína do capsídeo de alfavírus.

[0015] Em um aspecto, a proteína do capsídeo de alfavírus é uma proteína do capsídeo do EEEV, do WEEV, do VEEV, do CHIKV, do Vírus Ross River, ou do Vírus da Floresta de Barmah. Em várias mo- dalidades dos aspectos acima ou qualquer outro aspecto da invenção descrita aqui, neste requerimento de patente, a uma ou mais altera- ções é em um NLS nos aminoácidos 67 a 70 de uma proteína do cap- sídeo do EEEV; nos aminoácidos 67 a 70 de uma proteína do capsí- deo do WEEV; nos aminoácidos 64 a 68 de uma proteína do capsídeo do VEEV; nos aminoácidos 62 a 69 de uma proteína do capsídeo do CHIKV; nos aminoácidos 71 a 74 de uma proteína do capsídeo do Ví- rus Ross River; ou nos aminoácidos 64 a 68 de uma proteína do cap- sídeo do Vírus da Floresta de Barmah.

[0016] Em várias modalidades dos aspectos acima ou qualquer outro aspecto da invenção descrita aqui, neste requerimento de paten- te, a alteração é uma substituição em um aminoácido carregado do NLS ou aminoácido carregado básico do NLS. Em algumas modalida- des, o aminoácido carregado ou aminoácido carregado básico é lisina ou arginina. Em determinadas modalidades, a lisina ou arginina é substituída com alguns aminoácidos não lisina ou não arginina. Em modalidades específicas, a lisina ou arginina é substituída com aspa- ragina ou alanina.

[0017] Em várias modalidades dos aspectos acima ou de qualquer outro aspecto da invenção descrita aqui, neste requerimento de paten- te, o NLS da proteína do capsídeo do vírus EEEV é alterado no ami- noácido 67. Em modalidades particulares, o NLS da proteína do cap- sídeo do vírus EEEV tem uma substituição K67N.

[0018] Em várias modalidades dos aspectos acima ou qualquer outro aspecto da invenção descrita aqui, neste requerimento de paten- te, o NLS da proteína do capsídeo do vírus WEEV é alterado em um ou mais dos aminoácidos 67, 68, e 69. Em modalidades particulares, o NLS da proteína do capsídeo do vírus WEEV compreende K67N, K68N, e/ou K69N.

[0019] Em várias modalidades dos aspectos acima ou qualquer outro aspecto da invenção descrita aqui, neste requerimento de paten- te, o NLS da proteína do capsídeo do vírus VEEV é alterado em um ou mais dos aminoácidos 64, 65, e 67. Em modalidades particulares, o NLS da proteína do capsídeo do vírus VEEV compreende K64N, K65A ou K65N, e/ou K67A ou K67N.

[0020] Em várias modalidades dos aspectos acima ou qualquer outro aspecto da invenção descrita aqui, neste requerimento de paten- te, o NLS da proteína do capsídeo do Vírus Ross River é alterado em um ou mais dos aminoácidos 71, 72, 73, e 74. Em modalidades parti- culares, o NLS da proteína do capsídeo do Vírus Ross River compre- ende R71N, R72N, R73N, e/ou R74N.

[0021] Em várias modalidades dos aspectos acima ou qualquer outro aspecto da invenção descrita aqui, neste requerimento de paten- te, o NLS da proteína do capsídeo do Vírus da Floresta de Barmah é alterado em um ou mais dos aminoácidos 64, 65, 67, e 68. Em modali- dades particulares, o NLS da proteína do capsídeo do Vírus da Flores- ta de Barmah compreende K64A, K65A ou K65N, K67A, K67N, K68A e/ou K68N.

[0022] Alteração no NLS do capsídeo é descrita em detalhes na Publicação de Patente US de Nos. 2014-170186 ou 2017-073377. O conteúdo destas publicações é incorporado aqui, a este requerimento de patente, por meio de referência.

[0023] Em um aspecto, a proteína E2 do alfavírus pode ter um re-

síduo não lisina (por exemplo, asparagina) na posição do aminoácido correspondente ao aminoácido 234 na proteína E2 do CHIKV e/ou uma modificação na posição do aminoácido correspondente ao ami- noácido 251 na proteína E2 do CHIKV que desestabiliza a proteína E2 durante o brotamento viral.

[0024] Em um aspecto, a proteína E3 do alfavírus pode compre- ender uma alteração / mutação na sequência de aminoácidos no sítio de furina (Arg-X-X-Arg).

[0025] O termo “Arg-X-X-Arg” indica o sítio de clivagem mínima de furina e “X-X” inclui qualquer combinação de dois aminoácidos. Exem- plo da alteração para a sequência de aminoácidos no sítio de furina inclui a alteração para Ile-Glu/Asp-Gly-Arg, Asp-Asp-Asp-Asp-Lys ou Ser-Gly-Gly-Gly-Ser. Detalhes com respeito à alteração do sítio de fu- rina são descritos na Publicação de Patente US de Nos. 2016- 0040134 e 2016-0200775 (os documentos citados são incorporados aqui, a este requerimento de patente, por meio de referência).

[0026] Por exemplo, a cepa CT83 do VEEV tem um sítio de furina de RKRR ao final de sua região E3 e RKRR pode ser substituído com SGGGS.

[0027] De acordo com a presente invenção, o replicon de alfavírus compreende nucleotideo codificando as proteínas não estruturais de alfavírus nsp1, nsp2, nsp3 e nsp4, e no mínimo um gene de interesse. As proteínas não estruturais de alfavírus podem ser as derivadas do mesmo alfavírus que o alfavírus a partir do qual as proteínas estrutu- rais são derivadas. As proteínas não estruturais de alfavírus podem ser as derivadas de um alfavírus diferente do alfavírus a partir do qual as proteínas estruturais são derivadas (partícula de replicon de alfaví- rus quimérico).

[0028] Por exemplo, podem ser proporcionadas ARPs compreen- dendo as proteínas estruturais de alfavírus derivadas do CHIKV e re-

plicon de alfavírus, o qual compreende nucleotídeos codificando nsp1, nsp2, nsp3 e nsp4 de VEEV e um gene de interesse de acordo com a presente invenção.

[0028] Em um aspecto, a presente invenção proporciona uma par- tícula de replicon de alfavírus (ARP), a qual compreende: (i) proteínas estruturais do CHIKV compreendendo capsí- deo e/ou envelope, e (ii) um replicon do VEEV compreendendo um polinucleotí- deo codificando as proteínas não estruturais do VEEV nsp1, nsp2, nsp3 e nsp4 e no mínimo um gene de interesse.

[0029] O gene de interesse pode ser escolhido entre uma ampla variedade de sequências derivadas de qualquer origem desejada, por exemplo, vírus, procariotas, eucariotas, archaea. Exemplos de catego- rias de gene de interesse incluem, por exemplo, imunogênios, incluin- do proteínas antigênicas, citocinas, toxinas, proteínas terapêuticas, enzimas, sequências antisense, e moduladores da resposta imune.

[0030] Em outro aspecto, a invenção proporciona um método para preparar partículas de replicon de alfavírus, compreendendo as etapas de: co-transfecção das células com i) um vetor compreendendo um polinucleotídeo codificando proteína não estrutural de alfavírus nsp1, nsp2, nsp3 e nsp4, e no mí- nimo um gene de interesse, ii) um vetor compreendendo um polinucleotídeo codificando uma proteína do capsídeo de alfavírus, e iii) um vetor compreendendo um polinucleotídeo codificando uma E3-E2-6K-E1 do alfavírus, em que no mínimo um entre o capsídeo, E3 e E2 compre- ende alteração de um ou mais aminoácidos, mas E1 não compreende nenhuma alteração de aminoácido,

cultura das células transfectadas, e purificação das ARPs da cultura celular.

[0031] Em geral, nucleotídeos codificando proteínas estruturais de alfavírus compreendem os nucleotídeos codificando E1, E2, 6k e E3. Depois da expressão da proteínas estruturais do vírus selvagem, 6K e E3 são clivadas naturalmente durante o processo de montagem e re- movidas das ARPs. As ARPs selvagens maduras podem compreender capsídeo, proteínas E1 e E2. Quando uma ou mais alterações das se- quências de aminoácidos são introduzidas, por exemplo, no sítio de furina da proteína E3, E3 não pode ser clivada e contida nas ARPs. Na presente especificação e reivindicações, "proteínas estruturais virais" se refere não somente às proteínas tendo 6k e/ou E3 mas também às proteínas não tendo 6K e/ou E3.

[0032] ARPs típicas em que o alfavírus é CHIKV ou VEEV são exemplificadas pela Figura 1.

[0033] Em um aspecto, a presente invenção proporciona uma par- tícula de replicon de alfavírus quimérico, (i) proteínas estruturais do CHIKV compreendendo capsí- deo e/ou envelope, e (ii) um replicon do VEEV compreendendo um polinucleotí- deo codificando as proteínas não estruturais do VEEV nsp1, nsp2, nsp3 e nsp4 e no mínimo um gene de interesse. Breve Descrição dos Desenhos

[0034] [Fig. 1] A Figura 1 mostra um protocolo esquemático para a produção de ARPs. [Fig. 2] A Figura 2 mostra a construção da partícula de replicon do VEEV. [Fig. 3]

A Figura 3 mostra o vetor VEEV_pBR322_NLuc. [Fig. 4] A Figura 4 mostra o vetor TC83_CMV_CAwt_helper 1p. [Fig. 5] A Figura 5 mostra o vetor TC83_CMV_CAmut_helper 1P. [Fig. 6] A Figura 6 mostra o vetor TC83_CMV_WTgp_helper 2P. [Fig. 7] A Figura 7 mostra o vetor TC83_CMV_E3gp_helper 2P. [Fig. 8] A Figura 8 mostra o protocolo esquemático para para de- terminar a capacidade de acondicionamento do replicon do VEEV den- tro das VRPs do VEE. [Fig. 9] A Figura 9 mostra os resultados do teste mostrado na Figu- ra 8. [Fig. 10] A Figura 10 mostra a incorporação de sítio de clonagem múltipla na construção da partícula de replicon do VEEV. [Fig. 11] A Figura 11 mostra o vetor VE- EV_pBR322_MCS_NLuc_Putative. [Fig. 12] A Figura 12 mostra o resultado de western blotting de partí- culas de replicon do vírus VEE purificadas. [Fig. 13] A Figura 13 mostra western blotting das células infectadas por VRPs compreendendo um nucleotideo codificando IKK.

Alameda 1, células infectadas por VRPs, Alameda 2, células transfectadas por vetor de plasmídeo de IKK (controle positivo).

[Fig. 14] A Figura 14 mostra western blotting das células infectadas por VRPs compreendendo um nucleotideo codificando JNK2. [Fig. 15] A Figura 15 mostra os resultados do ensaio de luciferase das células infectadas com VRPs compreendendo um gene codifican- do luciferase. [Fig. 16] A Figura 16 mostra a expressão de GFP nas células infec- tadas com VRPs compreendendo um gene codificando GFP. [Fig. 17] A Figura 17 mostra a expressão de GFP em células de ma- crófagos polarizadas M2 infectadas com VRPs compreendendo um gene codificando GFP. [Fig. 18] A Figura 18 mostra o protocolo esquemático do Exemplo 9. [Fig. 19] A Figura 19 mostra os resultados do Exemplo 9. [Fig. 20] A Figura 20 mostra western blotting de ARPs quiméricas purificadas obtidas a partir de proteínas estruturais do CHIKV e repli- con do VEEV. [Fig. 21] A Figura 21 mostra análise FACS das células infectadas pelas ARPs da Figura 20. Descrição de Modalidades Definições

[0036] Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, "al- favírus" destina-se a se referir a vírus contendo RNA que pertencem à família Togaviridae de vírus. Exemplos de vírus Togaviridae incluem,

mas não estão limitados ao Vírus da Encefalite Equina Oriental (EE- EV), o Vírus da Encefalite Equina Venezuelana (VEEV), o Vírus Everglades, o Vírus Mucambo, o Vírus Pixuna, o Vírus da Encefalite Equina Ocidental (WEEV), o Vírus Sindbis, o Vírus da Floresta de Semliki, o Vírus Middleburg, o Vírus Chikungunya (CHIKV), o Vírus O’nyong-nyong, o Vírus Ross River, o Vírus da Floresta de Barmah, o Vírus Getah, o Vírus Sagiyama, o Vírus Bebaru, o Vírus Mayaro, o Una Vírus, o Aura Vírus, o Vírus Whataroa, o Vírus Babanki, o Vírus Ky- zylagach, o Vírus Highlands J, o Vírus Fort Morgan, o Vírus Ndumu, o Vírus Buggy Creek e o Vírus Ockelbo.

[0035] Por “proteína estrutural de alfavírus" se indica um polipeptí- deo ou fragmento do mesmo tendo no mínimo cerca de 80% de identi- dade de sequência de aminoácidos com uma proteína do capsídeo ou do envelope virais que ocorre naturalmente. Em uma modalidade, a proteína estrutural de alfavírus tem no mínimo cerca de 85%, 90%, 95% ou mais de identidade de sequência de aminoácidos com o Vírus da Encefalite Equina Oriental (EEEV), o Vírus da Encefalite Equina Venezuelana (VEEV), o Vírus Everglades, o Vírus Mucambo, o Vírus Pixuna, o Vírus da Encefalite Equina Ocidental (WEEV), Vírus Sindbis, o Vírus da Floresta de Semliki, o Vírus Middleburg, o Vírus Chikun- gunya (CHIKV), o Vírus O’nyong-nyong, o Vírus Ross River, o Vírus da Floresta de Barmah, o Vírus Getah, o Vírus Sagiyama, o Vírus Bebaru, o Vírus Mayaro, o Una Vírus, o Aura Vírus, o Vírus Whataroa, o Vírus Babanki, o Vírus Kyzylagach, o Vírus Highlands J, o Vírus Fort Mor- gan, o Vírus Ndumu, e o Vírus de Buggy Creek. Sequências de ami- noácidos selvagens de proteínas estruturais de alfavírus podem ser obtidas do GenBank.

[0036] Em modalidades específicas, o alfavírus é um CHIKV, por exemplo CHIKV cepa 37997 ou LR2006 OPY-1. Em outras modalida- des, o alfavírus é um VEEV, por exemplo cepa TC-83 do VEEV.

[0037] Por “um replicon de alfavírus" se indica uma molécula de RNA a qual pode dirigir sua própria amplificação in vivo em uma célula alvo. O replicon codifica a uma ou mais polimerases, as quais catali- sam amplificação de RNA (nspl, nsp2, nsp3, nsp4) e contém sequên- cias de RNA cis requeridas para replicação, as quais são reconhecidas e utilizadas pela uma ou mais polimerases codificadas. Um replicon de alfavírus tipicamente contém os seguintes elementos ordenados: UTR 5', sequências as quais codificam proteínas não estruturais de alfavírus (nspl, nsp2, nsp3, nsp4), UTR 3', e um sinal de poli A. Um replicon de alfavírus também contém um ou mais promotores sub- genômicos virais direcionando a expressão do gene de interesse. Aquelas sequências podem ter uma ou mais mutações ensinadas em uma arte anterior.

[0038] Por “partícula de replicon de alfavírus" (ARP) se indica um replicon de alfavírus embalado com proteínas estruturais de alfavírus. ARP não contém polinucleotídeo codificando qualquer uma das proteí- nas estruturais de alfavírus.

[0039] Por “agente" se indica qualquer composto químico de molé- cula pequena, anticorpo, molécula de ácido nucleico, ou polipeptídeo, ou fragmentos dos mesmos.

[0040] Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, o termo "adjuvante" destina-se a se referir a um composto que, quando usado em combinação com um imunogênio específico em uma formu- lação, vai aumentar, alterar ou modificar a resposta imune resultante. Em determinadas modalidades, o adjuvante é usado em combinação com uma ARP. Modificação da resposta imune inclui intensificação ou ampliação da especificidade de qualquer um ou tanto do anticorpo quanto das respostas imunes celulares. Modificação da resposta imu- ne também pode significar diminuir ou suprimir determinadas respos- tas imunes específicas contra o antígeno. Em uma modalidade, o ad-

juvante é adjuvante Ribi.

[0041] Por “melhorar" se indica reduzir, suprimir, atenuar, diminuir, parar, ou estabilizar o desenvolvimento ou a progressão de uma doen- ça ou um sintoma da mesma.

[0042] Por “alteração" se indica uma modificação em um aminoá- cido ou nucleotídeo em uma posição especificada com referência a uma sequência de polipeptídeo ou sequência de polinucleotídeo. Con- forme usado aqui, neste requerimento de patente, uma alteração inclui uma substituição, deleção, ou inserção de um aminoácido ou nucleotí- deo em uma posição especificada de um polipeptídeo ou polinucleotí- deo. Em algumas modalidades, uma alteração em um sinal de locali- zação nuclear da proteína do capsídeo de alfavírus inclui substituição de um aminoácido carregado (por exemplo, lisina ou arginina) com um aminoácido não carregado (por exemplo, alanina ou asparagina, ou qualquer um aminoácido com exceção de um aminoácido carregado básico tal como lisina ou arginina).

[0043] Por “alteração" se indica uma modificação (aumento ou di- minuição) com referência aos níveis de expressão ou atividade de um gene ou polipeptídeo conforme detectado por métodos conhecidos na arte de rotina, tais como os descritos aqui, neste requerimento de pa- tente. Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, uma alte- ração inclui uma modificação de 10%, 25%, 50%, 75%, 100% ou maior nos níveis de expressão. Uma alteração inclui uma modificação de 10, 20, 50, 70, 80, 90, 100, 200, 500, 1000 vezes ou maior nos níveis de expressão.

[0044] Por “análogo" se indica uma molécula que não é idêntica, mas tem características análogas funcionais ou estruturais. Por exem- plo, um análogo polipeptídico conserva a atividade biológica de um polipeptídeo que ocorre naturalmente correspondente, ao mesmo tem- po que tendo determinadas modificações bioquímicas que reforçam a função do análogo em relação a um polipeptídeo que ocorre natural- mente. As modificações bioquímicas referidas podem aumentar a re- sistência a protease, a permeabilidade da membrana, ou a meia vida do análogo, sem alterar, por exemplo, a ligação a ligante. Um análogo pode incluir um aminoácido não natural.

[0045] Na presente divulgação, "compreende," "compreendendo," "contendo" e "tendo" e semelhantes podem ter o significado atribuído aos mesmos na legislação de Patente dos Estados Unidos e pode sig- nificar "inclui," "incluindo," e semelhantes; "consistindo essencialmente em" ou "consiste essencialmente" do mesmo modo tem o significado atribuído na legislação de Patente dos Estados Unidos e o termo é aberto, permitindo a presença de mais do que o que é mencionado contanto que características básicas ou novas daquilo que é mencio- nado não sejam alteradas pela presença de mais do que o que é men- cionado, mas exclui modalidades da arte anterior.

[0046] "Detectar" se refere a identificar a presença, a ausência ou a qyuantidade do analito a ser detectado.

[0047] Por “doença" se indica qualquer condição ou distúrbio que danifica ou interfere com a função normal de uma célula, de um tecido, ou de um órgão.

[0048] Por “quantidade efetiva" se indica a quantidade de um agente necessária para melhorar os sintomas de uma doença em rela- ção a um paciente não tratado. A quantidade efetiva de composto(s) ativo(s) usada para praticar a presente invenção para prevenção ou tratamento de uma doença varia dependendo da maneira de adminis- tração, da idade, do peso corporal, e da saúde geral do indivíduo. Em última análise, o veterinário ou médico assistente vai decidir o regime de dosagem e a quantidade apropriados. A quantidade referida é refe- rida como uma quantidade "efetiva".

[0049] Por “fragmento" se indica uma porção de uma molécula de ácido nucleico ou polipeptídeo. Esta porção contém, de modo prefe- rencial, no mínimo 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, ou 90% de todo o comprimento da molécula de ácido nucleico ou polipep- tídeo de referência. Um fragmento pode conter 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, ou 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, ou 1000 nucleotídeos ou aminoácidos.

[0050] Por “marcador" se indica qualquer proteína ou polinucleotí- deo tendo uma alteração no nível de expressão ou atividade que é as- sociada com uma doença ou distúrbio.

[0051] Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, "Si- nal de Localização Nuclear" ou "NLS" é uma sequência de aminoáci- dos que, quando presente sobre a superfície de um polipeptídeo, dire- cionad o polipeptídeo para o núcleo da célula. Sequências de NLS são conhecidas na arte. Vide, por exemplo, Goldfarb, D., e N. Michaud (1991) Trends Cell Biol. 1, 20-24; Gorlich, D., e I. W. Mattaj (1996) Sci- ence 271, 1513-1518). Em uma modalidade, um NLS inclui uma ou mais sequências curtas de aminoácidos positivamente carregados, tais como lisinas ou argininas. Sequências de consenso para NLS incluem K-K/R-X-K/R (Schneider, J. et al. (1988) Cell 54,117-125) e dois clus- ters de aminoácidos básicos, separados por um espaçador de cerca de 10 aminoácidos, por exemplo, KR[PAATKKAGQA] KKKK (Dingwall et al., / Cell Biol. 107 (3): 841-9). Com referência às sequências de aminoácidos de alfaviíus da invenção, NLS estão presentes nos ami- noácidos 67 a 70 de uma proteína do capsídeo do EEEV (KRKK); nos aminoácidos 67 a 70 de uma proteína do capsídeo do WEEV (KKKK); nos aminoácidos 64 a 68 de uma proteína do capsídeo do VEEV (KKPKK); nos aminoácidos 62 a 69 de uma proteína do capsídeo do CHIKV (RRNRKNKK); nos aminoácidos 71 a 74 de uma proteína do capsídeo do Vírus Ross River (RKKK); e nos aminoácidos 64 a 68 de uma proteína do capsídeo do Vírus da Floresta de Barmah (KKPKK).

Por exemplo, pode ser empregado K64N da proteína do capsídeo TC83 do VEEV.

[0052] Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, "ob- ter" como em "obter um agente" inclui sintetizar, comprar, ou adquirir o agente de modo diverso.

[0053] Por “reduz" se indica uma alteração negativa de no mínimo 10%, 25%, 50%, 75%, ou 100%.

[0054] Por “referência" se indica uma condição padrão ou de con- trole.

[0055] Uma "sequência de referência" é uma sequência definida usada como uma base para comparação de sequências. Uma se- quência de referência pode ser um subgrupo de uma sequência espe- cífica ou a sequência específica inteira; por exemplo, um segmento de uma sequência genética ou de cDNA de comprimento total, ou a se- quência genética ou de cDNA completa. Para polipeptídeos, o com- primento da sequência de polipeptídeos de referência geralmente vai ser de no mínimo cerca de 16 aminoácidos, de modo preferencial de no mínimo cerca de 20 aminoácidos, de modo mais preferencial de no mínimo cerca de 25 aminoácidos, e de modo ainda mais preferencial de cerca de 35 aminoácidos, cerca de 50 aminoácidos, ou cerca de 100 aminoácidos. Para ácidos nucleicos, o comprimento da sequência de ácido nucleico de referência geralmente vai ser de no mínimo cerca de 50 nucleotídeos, de modo preferencial de no mínimo cerca de 60 nucleotídeos, de modo mais preferencial de no mínimo cerca de 75 nucleotídeos, e de modo ainda mais preferencial de cerca de 100 nu- cleotídeos ou cerca de 300 nucleotídeos ou qualquer inteiro nas ime- diações ou entre os mesmos.

[0056] Identidade de sequência é tipicamente medida usando sof- tware de análise de sequência (por exemplo, os programas Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group, Univer-

sity of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Ma- dison, Wis. 53705, BLAST, BESTFIT, GAP, ou PILEUP/PRETTYBOX). O software referido equipara sequências idênticas ou similares atribu- indo graus de homologia a várias substituições, deleções, e/ou outras modificações. Substituições conservadoras tipicamente incluem substi- tuições dentro dos grupos que se seguem: glicina, alanina; valina, iso- leucina, leucina; ácido aspártico, ácido glutâmico, asparagina, glutami- na; serina, treonina; lisina, arginina; e fenilalanina, tirosina. Em uma abordagem de exemplo para determinar o grau de identidade, pode ser usado um programa BLAST, com um escore de probabilidade en- tre e<"3> e e<"100> indicando uma sequência intimamente relaciona- da.

[0057] Por “poliproteína estrutural" se indica uma molécula de aminoácido composta compreendendo no mínimo dois polipeptídeos separáveis, que contribuem para um capsídeo ou envelope viral. Em uma modalidade, os polipeptídeos são suscetíveis a clivagem com uma enzima viral (por exemplo, capsídeo autoproteinase e signala- ses).

[0058] Por “indivíduo" se indica um mamífero, incluindo, mas não limitado a, um mamífero humano ou não-humano, tal como um bovino, equino, canino, ovino, ou felino.

[0059] As faixas proporcionadas aqui, neste requerimento de pa- tente, são entendidas como sendo abreviadas para todos os valores dentro da faixa. Por exemplo, uma faixa de 1 a 50 deve ser entendida como incluindo qualquer número, combinação de números, ou sub- conjunto entre o grupo que consiste em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, ou 50.

[0060] Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, os termos "tratar," tratando," "tratamento," e semelhantes se referem a reduzir ou melhorar um distúrbio e/ou sintomas associados com o mesmo. Será reconhecido que, embora não excluído, tratar um distúr- bio ou condição não requer que o distúrbio, condições ou sintomas as- sociados com os mesmos sejam completamente eliminados.

[0061] A menos que especificamente declarado ou óbvio a partir do contexto, conforme usado aqui, neste requerimento de patente, o termo "ou" é entendido como sendo inclusivo.

[00624] A menos que especificamente declarado ou óbvio a partir do contexto, conforme usado aqui, neste requerimento de patente, os termos "um", "uma", e "o", “a” são entendidos como sendo singular ou plural.

[0063] A menos que especificamente declarado ou óbvio a partir do contexto, conforme usado aqui, neste requerimento de patente, o termo "cerca de" é entendido como dentro de uma faixa de tolerância normal na arte, por exemplo, dentro de 2 desvios padrão da média. Cerca de pode ser entendido como dentro de 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,5%, 0,1%, 0,05%, ou 0,01% do valor declara- do. A menos que claro de outro modo a partir do contexto, todos os valores numéricos proporcionados aqui, neste requerimento de paten- te, são modificados pelo termo cerca de.

[0064] Quaisquer composições ou métodos proporcionados aqui, neste requerimento de patente, podem ser combinados com uma ou mais das outras composições e métodos proporcionados aqui, neste requerimento de patente. Replicon de alfavírus

[0067] O replicon de alfavírus, quando liberado a uma célula eucariota, pode levar à produção de múltiplas RNAs filhas por transcrição a partir de si mesmos (através de uma cópia antisense a qual gera a partir de si mesma). O replicon de alfavírus pode ser traduzido diretamente depois de liberação para uma célula, e esta tradução proporciona uma polimerase de RNA dependente de RNA, a qual em seguida produz tanto transcriptos antisense quanto sense a partir do RNA liberado. Deste modo o RNA liberado leva à produção de múltiplas RNAs filhas. Estas RNAs filhas, bem como transcriptos subgenômicos collineares, podem ser traduzidos para proporcionar expressão in situ de uma proteína codificada, ou podem ser transcritos para proporcionar transcriptos adicionais com o mesmo sentido que o RNA liberado, os quais são traduzidos para proporcionar expressão in situ da proteína. O resultado total desta sequência de transcrições é uma enorme amplificação no número dos RNAs do replicon introdu- zido e portanto a proteína codificada se torna um produto polipeptídico principal das células.

[0065] De acordo com a presente invenção, o replicon de alfavírus compreende polinucleotídeos que codificam as proteínas não estruturais n1, n2, n3 e n4, e no mínimo um gene de interesse. Replicon de alfavírus não codifica qualquer uma das proteínas estruturais de alfavírus.

[0066] As proteínas não estruturais de alfavírus podem ser proteí- nas selvagens derivadas de um dos alfavírus discutidos acima ou po- dem ter uma ou mais alterações nas sequências de aminoácidos sel- vagens. Alterações das proteínas não estruturais de alfavírus são re- veladas em várias referências da arte anterior e a arte pode escolher uma proteína não estrutural de alfavírus adequada com base naquelas informações conhecidas publicamente.

[0067] Replicons de alfavírus são de conhecimento geral na arte e podem ser empregados quaisquer dos replicons previamente reve- lados (por exemplo, Virology. 1997 Dec 22;239(2):389-401., WO2009/131604, WO2011/005799, WO2012/031043, WO2014/1270493 e WO2015/095167, o conteúdo dos documentos citados são incorporados aqui, a este requerimento de patente, por meio de referência). Proteínas estruturais de alfavírus

[0071] A ARP tem proteínas estruturais de alfavírus do capsídeo e proteínas do envelope. De modo preferencial, as proteínas estruturais de alfavírus compreendem a proteína do capsídeo e as proteínas E2 e E1 do envelope, e também pode ter a proteína E3 do envelope. De acordo com a presente invenção, no mínimo um entre capsídeo e en- velope tem no mínimo uma alteração que reforça a expressão de ARP em células de mamíferos.

[0068] Em uma modalidade, as proteínas estruturais de alfavírus incluem no mínimo uma proteína do capsídeo de alfavírus tendo um resíduo não lisina (por exemplo, alanina ou asparagina) em uma posi- ção do aminoácido correspondente a um resíduo de lisina na proteína do capsídeo de alfavírus NLS e/ou um resíduo não arginina (por exemplo, alanina ou asparagina) em uma posição do aminoácido cor- respondente a um resíduo de arginina na proteína do capsídeo de al- favírus NLS. Em modalidades específicas, a proteína do capsídeo de alfavírus é uma proteína do capsídeo da cepa CBA87 do WEEV tendo uma ou mais das alterações K67N, K68N, e K69N. Em determinadas modalidades, a proteína do capsídeo de alfavírus é uma proteína do capsídeo da cepa TC83 do VEEV tendo uma ou mais das alterações K64N, K65A, K65N, K67A, e K67N. Em algumas modalidades, a prote- ína do capsídeo de alfavírus é uma proteína do capsídeo da cepa PE- 6 do EEEV tendo uma alteração K67N. Em modalidades particulares, a proteína do capsídeo de alfavírus é uma proteína do capsídeo da cepa 37997 do CHIKV tendo uma ou mais das alterações R62A, R63A, R65A, K66A, K68A, e K69A; a proteína do capsídeo de alfaví- rus é uma proteína do capsídeo do Vírus Ross River tendo uma ou mais das alterações R71N, K72N, K73N, e K74N; a proteína do capsí-

deo de alfavírus é uma proteína do capsídeo do Vírus da Floresta de Barmah tendo uma ou mais das alterações K64A, K64N, K65A, K65N, K67A, K67N, K68A e K68N. As sequências de aminoácidos de proteí- nas do capsídeo selvagens dos alfavírus discutidos acima estão dis- poníveis no GenBank.

[0069] Em uma modalidade, a proteína E2 do alfavírus tem um re- síduo não lisina (por exemplo, asparagina) na posição do aminoácido correspondente ao aminoácido 234 na proteína E2 do CHIKV e/ou uma modificação na posição do aminoácido correspondente ao ami- noácido 251 na proteína E2 do CHIKV que desestabiliza a proteína E2 durante o brotamento viral.

[0070] Em uma modalidade, o polinucleotídeo codificando a prote- ína E3 do alfavírus pode ser modificado para compreender uma altera- ção / mutação para a sequência de aminoácidos no sítio de furina (Arg-X-X-Arg).

[0071] O termo “Arg-X-X-Arg” indica o sítio de clivagem mínima de furina e “X-X” inclui qualquer combinação de dois aminoácidos. Exem- plo da alteração para a sequência de aminoácidos no sítio de furina inclui a alteração para Ile-Glu/Asp-Gly-Arg, Asp-Asp-Asp-Asp-Lys ou Ser-Gly-Gly-Gly-Ser. Descrições detalhadsa descritas na Publicação de Patente US de Nos. 2016-0040134 e 2016-0200775 (os documen- tos citados são incorporados aqui, a este requerimento de patente, por meio de referência).

[0072] Por exemplo, a cepa CT83 do VEEV tendo um sítio de furi- na inclui RKRR ao final de sua região E3 e a sequência de polinucleo- tídeo codificando RKRR pode ser substituída com a seqüência codifi- cando SGGGS.

[0073] Em algumas modalidades da invenção, proteínas podem compreender mutações contendo alterações as quais produzem subs- tituições, adições, ou deleções silenciosas, mas não alteram as propri-

edades ou atividades da proteína codificada ou como as proteínas são produzidas. Método de preparação de ARPs

[0078] ARPs podem ser preparadas por procedimentos que são conhecidos na arte. Um procedimento de exemplio para a produção de ARPs é revelado em Virology 239, 389-401, 1997, cujo conteúdo do documento citado é incorporado aqui, a este requerimento de patente, por meio de referência.

[0074] Em geral, ARPs podem ser produzidas por co-transfecção de células hospedeiras adequadas com um vetor codificando um repli- con de alfavírus, isto é, um vetor compreendendo um polinucleotídeo codificando nsp1, nsp2, nsp3 e nsp4, e um gene de interesse; e no mínimo um vetor auxiliar codificando as proteínas estruturais do vírus alfavírus. De modo preferencial, as céluals são co-transfectadas com um vetor codificando um replicon de alfavírus, um vetor codificando uma proteína do capsídeo e um vetor codificando proteínas do envelo- pe.

[0075] Em particular, a invenção proporciona um método para pre- parar partículas de replicon de alfavírus, compreendendo as etapas de co-transfecção das células com i) um vetor compreendendo um polinucleotídeo as codifi- cando proteínas não estruturais de alfavírus nsp1, nsp2, nsp3 e nsp4, e no mínimo um gene de interesse, ii) um vetor compreendendo um polinucleotídeo codificando uma proteína do capsídeo de alfavírus, e iii) um vetor compreendendo um polinucleotídeo codificando uma E3-E2-6K-E1 do alfavírus, em que no mínimo um entre o capsídeo, E3 e E2 compre- ende alteração de um ou mais aminoácidos, mas E1 não compreende nenhuma alteração de aminoácido,

[0076] Os versados no campo da biologia molecular vão entender que qualquer um de uma ampla variedade de sistemas de expressão pode ser usado para produzir ARPs. A célula precisa a ser co- transfectada (células hospedeiras) não é crucial para a invenção. ARP pode ser produzida em um hospedeiro procariótico (por exemplo, E. coli) ou em um hospedeiro eucariótico (por exemplo, Saccharomyces cerevisiae, células de insetos, por exemplo, células Sf21, ou células de mamíferos, por exemplo, células NIH 3T3, HeLa, COS). As células re- feridas estão disponíveis a partir de uma amnpla faixa de fontes (por exemplo, the American Type Culture Collection, Rockland, Md.; vide, também, por exemplo, Ausubel et al., supra). Exemplos não limitantes de células de insetos são, células de Spodoptera frugiperda (Sf), por exemplo, Sf9, Sf21, células de Trichoplusia ni, por exemplo, células High Five, e células de Drosophila S2. Exemplos de células hospedei- ras de fungos (incluindo leveduras) são S. cerevisiae, Kluyveromyces lactis (K lactis), espécies de Candida incluindo C. albicans e C. glabra- ta, Aspergillus nidulans, Schizosaccharomyces pombe (S. pombe), Pi- chia pastoris, e Yarrowia lipolytica. Exemplos de células de mamíferos são células COS, células de rim de bebê de hamster, células de ca- mundongos L, células LNCaP, células de ovário de hamster chinês (CHO), células de rim embrionário humano (HEK), células de macaco verde africano, células CV1, células HeLa, células MDCK, células Vero e Hep-2. oócitos de Xenopus laevis, ou outras células de origem anfí- bia, também podem ser usadas. Células hopedeiras procarióticas in- cluem células bacterianas, por exemplo, E. coli, B. subtilis, e micobac- térias.

[0077] Métodos de obtenção de polinucleotídeos codificando as proteínas referidas são conhecidos na arte. Por exemplo, o gene codi-

ficando uma proteína de alfavírus específica, por exemplo, uma proteí- na estrutural do CHIKV, do WEEV, do EEEV, do VEEV, do Vírus Ross River, ou do Vírus da Floresta de Barmah pode ser isolado por RT- PCR a partir de mRNA poliadenilado extraído de células as quais te- nham sido infectadas com o vírus referido. O produto genético resul- tante pode ser clonado como um inserto polinucleotídico em um vetor.

[0078] O termo "vetor" se refere aos meios pelos quais uma se- qüência de ácido nucleico pode ser propagada e/ou transferida entre organismos, células, ou componentes celulares. Vetores incluem plasmídeos, vírus, bacteriófagos, pró-vírus, fagemídeos, transposons, cromossomas artificiais, e semelhantes, que replicam de maneira au- tônoma ou podem integrar em um cromossoma de uma célula hospe- deira. Um vetor também pode ser um polinucleotídeo de RNA nú, um polinucleotídeo de DNA nú, um polinucleotídeo composto tanto de DNA quanto de RNA dentro da mesma cadeia, um DNA ou RNA con- jugado a poli-lisina, um DNA ou RNA conjugado a peptídeo, um DNA conjugado a lipossoma, ou semelhante, que não esteja replicando au- tonomamente. Em muitas modalidades comuns, mas não todas, os vetores da presente invenção são plasmídeos ou bacmídeos.

[0079] Tipicamente, a molécula de ácido nucleico a ser expressa é "ligada operacionalmente" a um promotor e/ou reforçador, e está sujei- ta a controle regulador de transcrição pelo promotor e/ou reforçador.

[0080] O método de transfecção e a escolha do veículo de expres- são vão depender do sistema hospedeiro selecionado. Métodos de transfecção são descritos, por exemplo, em Ausubel et al. (supra); veí- culos de expressão podem ser escolhidos entre os proporcionados, por exemplo, em Cloning Vectors: A Laboratory Manual (P. H. Pouwels et al., 1985, Supp. 1987). As referências citadas neste parágrafo são incorporadas aqui, a este requerimento de patente, por meio de refe- rência.

[0081] Exite uma variedade de sistemas de expressão para a pro- dução das ARPs da invenção. Vetores de expressão úteis para a pro- dução das referidas ARPs incluem, sem limitação, vetores cromossô- micos, epissômicos, e vetores derivados de vírus, por exemplo, veto- res derivados de plasmídeos bacterianos, de bacteriófago, de transpo- sons, de epissomas de leveduras, de elementos de inserção, de ele- mentos cromossômicos de leveduras, de vírus tais como baculovírus, vírus papova, tais como SV40, vírus vaccinia, adenovírus, vírus da ca- tapora, vírus pseudorabies e retrovírus, e vetores derivados de combi- nações dos mesmos.

[0082] Os constructos e/ou vetores usados aqui, neste requeri- mento de patente, compreendem polinucleotídeos de alfavírus que co- dificam proteínas estruturais, incluindo proteínas do envelope ou prote- ína do capsídeo conforme descrito aqui, neste requerimento de paten- te. Além disso, constructos e/ou vetores usados aqui, neste requeri- mento de patente, compreendem polinucleotídeos de alfavírus que co- dificam proteínas não estruturais nsp1, nsp2, nsp3 e nsp4 e um gene de interesse.

[0083] O vetor pode ser, por exemplo, um fago, plasmídeo, vetor viral ou retroviral. Os constructos e/ou vetores que compreendem os nucleotídeos devem ser ligados operacionalmente a um promotor apropriado, tal como o promotor do CMV, promotor do fago lâmbda PL, os promotores de E. coli lac, phoA e tac, os promotores de SV40 precoce e tardio, e os promotores LTRs retrovirais são exemplos não limitantes. Outros promotores adequados vão ser de conhecimento do técnico versado dependendo da célula hospedeira e/ou a taxa de ex- pressão desejada. Os constructos de expressão vão conter adicional- mente sítios para iniciação de transcrição, terminação, e, na região transcrita, um sítio de ligação ao ribossoma para translação. A porção codificante dos transcriptos expressos pelos constructos de modo pre-

ferencial vai incluir um codon de iniciação de translação no início e um codon de terminação adequadamente posicionado na extremidade do polipeptídeo a ser traduzido.

[0084] Vetores vão incluir preferencialmente no mínimo um mar- cador selecionável. Os marcadores referidos incluem genes de resis- tência a diidrofolato redutase, G418 ou neomicina para cultura de célu- las eucarióticas e de resistência a tetraciclina, canamicina ou ampicili- na para cultura em E. coli e outras bactérias. Entre vetores preferenci- ais estão vetores de vírus, tais como baculovírus, vírus da varíola (por exemplo, vírus vaccinia, vírus da varíola aviária, vírus da varíola no canário, vírus da catapora, vírus da varíola do guaxinim, vírus da varío- la suína, etc.), adenovírus (por exemplo, adenovírus canino), herpes vírus, e retrovírus. Outros vetores que podem ser usados com a inven- ção compreendem vetores para uso em bactérias, os quais compreen- dem pQE70, pQE60 e pQE-9, vetores pBluescript, vetores Phages- cript, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A, ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5. Entre vetores eucarióticos preferenciais estão pFastBacl pWINEO, pSV2CAT, pOG44, pXTl e pSG, pSVK3, pBPV, pMSG, e pSVL. Outros vetores adequados serão prontamente evidentes para o técnico versado.

[0085] Constructos recombinantes podem ser preparados e usa- dos para transfectar, podem expressar proteínas virais, incluindo os descritos aqui, neste requerimento de patente, em células eucarióticas e/ou células procarióticas. Portanto, a invenção proporciona células hospedeiras as quais compreendem um vetor (ou vetores) que contêm ácidos nucleicos os quais codificam proteínas estruturais de alfavírus, incluindo capsídeo, E3, E2, 6K, e El ou porções dos mesmos, e um vetor que compreende ácidos nucleicos os quais codificam nsp1, nsp2, nsp3 e nsp4 de alfavírus, e no mínimo um de gene de interesse sob condições as quais permitem a formação de ARPs.

[0086] Em uma modalidade, o vetor referido é um baculovírus re- combinante. Em outra modalidade, o referido baculovírus recombinan- te é transfectado em uma célula de inseto. Em outra modalidade prefe- rencial, a célula referida é uma célula de inseto. Em outra modalidade, a referida célula de inseto é uma célula Sf9.

[0087] Um sistema de expressão bacteriana particular para produ- ção polipeptídeo é o sistema de expressão pET de E. coli (Novagen, Inc., Madison, Wis). De acordo com este sistema de expressão, DNA codificando um polipeptídeo é inserido dentro de um vetor pET em uma orientação desenhada para permitir expressão. Como o gene co- dificando um polipeptídeo semelhante está sob o controle dos sinais regulatórios de T7, a expressão do polipeptídeo é obtida induzindo a expressão de polimerase de RNA T7 na célula hospedeira. Isto é reali- zado tipicamente usando cepas hospedeiras que expressam polimera- se de RNA T7 em resposta a indução por IPTG. Uma vez produzido, um polipeptídeo recombinante é em seguida isolado de acordo com métodos de rotina conhecidos na arte, por exemplo, os descritos aqui, neste requerimento de patente.

[0088] Outro sistema de expressão bacteriana para a produção de polipeptídeos é o sistema de expressão pGEX (Pharmacia). Este sis- tema emprega um sistema de fusão genética GST que é desenhado para alto nível de expressão de genes ou fragmentos genéticos como proteínas de fusão com rápida purificação e recuperação de produtos genéticos funcionais. A proteína de interesse é fundida ao terminal carboxila da proteína glutationa S-transferase de Schistosoma japoni- cum e é prontamente purificada a partir de lisados bacterianos por cromatografia por afinidade usando Glutathione Sepharose 4B. Proteí- nas de fusão podem ser recuperadas sob condições brandas por elu- triação com glutationa. A clivagem do domínio glutationa S-transferase da proteína de fusão é facilitada pela presença de sítios de reconhe-

cimento para proteases específicas para os sítios a montante deste domínio. Por exemplo, proteínas expressas em plasmídeos pGEX-2T podem ser clivadas com trombina; as expressas em pGEX-3X podem ser clivadas com fator Xa.

[0089] Dependendo dos vetores e das células hospedeiras seleci- onadas, as ARPs são produzida cultivando células hospedeiras trans- fectadas pelos vetores sob condições por meio das quais são expres- sas as proteínas recombinantes e é gerado o replicon de alfavírus, e são formadas ARPs contendo replicon de alfavírus sendo embalado com a partícula de proteínas estruturais de alfavírus. Em uma modali- dade, a invenção compreende um método de produção de uma ARP, que envolve a co-transfecção de um vetor compreendendo um polinu- cleotídeo codificando as proteínas não estruturais de alfavírus nsp1, nsp2, nsp3 e nsp4, e no mínimo um gene de interesse, no mínimo al- guns vetores cada um codificando no mínimo uma proteína de alfaví- rus em células hospedeiras adequadas e expressando a referida pro- teína de alfavírus sob condições que permitem a formação de ARPs. Em outra modalidade, a célula eucariótica é selecionada entre o grupo que consiste em células de leveduras, insetos, anfíbios, aves ou ma- míferos. A seleção das condições de crescimento apropriadas está dentro do conhecimento de uma pessoa versada de alguém com co- nhecimento regular na arte.

[0090] Métodos para cultivar as células que produzem ARPs da invenção incluem, mas não estão limitados a, técnicas de cultura celu- lar em descontínuo, de alimentação em descontínuo, contínua e de perfusão. Em uma modalidade, células co-transfectadas com um vetor codificando um replicon de alfavírus e um vetor compreendendo um polipeptídeo codificando capsídeo, e um vetor compreendendo um po- linucleotídeo codificando proteínas do envelope, tais como as deriva- das de um CHIKV ou de um VEEV são cultivadas em um biorreator ou de uma câmara de fermentação onde as células se propagam e ex- pressam proteína (por exemplo, proteínas recombinantes) para purifi- cação e isolamento. Tipicamente, a cultura celular é realizada sob condições atmosféricas e de temperatura controladas e estéreis. Um biorreator é uma câmara usada para cultura de células na qual podem ser monitoradas as condições ambientais, tais como a temperatura, a atmosfera, a agitação e/ou o pH. Em uma modalidade, o biorreator é uma câmara de aço inoxidável. Em outra modalidade, o biorreator re- ferido é uma bolsa plástica pré-esterilizada (por exemplo, Cell- bag.RTM., Wave Biotech, Bridgewater, N.J.). Em outra modalidade, as bolsas plásticas pré-esterilizadas referidas são bolsas de cerca de 50 L a 1000 L.

[0091] As ARPs são isoladas usando métodos que preservam a integridade das mesmas, tal como por centrifugação em gradiente, por exemplo, cloreto de césio, sacarose e iodixanol, bem como técnicas de purificação de rotina incluindo, por exemplo, cromatografia de permuta de íons e de filtração por gel.

[0092] Segue-se um exemplo de como as ARPs da invenção po- dem ser produzidas, isoladas e purificadas. Uma pessoa com conhe- cimento da arte vai reconhecer que existem métodos adicionais que podem ser usados para produzir e purificar ARPs. Por conseguinte, a invenção não é limitada aos métodos descritos aqui, neste requeri- mento de patente.

[0093] Em geral, a produção de ARPs da invenção é realizada por semeadura de uma célula de mamífero (por exemplo, células renais embrionárias humanas (293T)) ou de células Sf9 (não-infectadas) den- tro de frascos de shaker, permitindo que as células se expandam e escalonando à medida que as células crescem e se multiplicam (por exemplo a partir de um frasco de 125 ml até uma bolsa de 50 L Wave bag). O meio usado para crescer as células é formulado para a linha-

gem celular apropriada (de modo preferencial meio livre de soro, por exemplo, meio de insetos ExCell-420, JRH). Em seguida, as células são transfectadas ou infectadas com um vetor apropriado (por exem- plo, vetor de expressão em mamíferos ou para SF (células de baculo- vírus recombinantes na multiplicidade de infecção mais eficiente (por exemplo, a partir de cerca de 1 a cerca de 3 unidades formadoras de placas por célula). Os polinucleotídeos, ou porções dos mesmos, são expressos nas células onde se auto-montam em ARPs e são secreta- dos pelas células aproximadamente 24 a 72 horas pós infecção (hpi). De modo geral, a transfecção ou infecção é mais eficiente quando as células estão na fase intermediária do crescimento (4-8.x10<6> céu- las/ml) e são no mínimo cerca de 90% viáveis. Adicionalmente, as cé- lulas transfectadas podem ser expostas a condições de pH elevado em cultura celular (pH > 7.2, por exemplo, pH 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8,0, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, ou superior) de modo a aumentar a produção de ARPs.

[0094] As ARPs da invenção são colhidas em aproximadamente 48 a 120 horas pós infecção, quando os níveis de ARPs no meio da cultura celular estão próximos do máximo mas antes de extensiva lise celular. A densitade e a viabilidade celulares por ocasião da colheita podem ser de cerca de 0,5x106 células/ml a cer4ca de 1,5x106 célu- las/ml com no mínimo 20% de viabilidade, conforme mostrado por tes- te de exclusão de corante. Em seguida, o meio é removido e clarifica- do. NaCl pode ser adicionado ao meio até uma concentração de cerca de 0,4 até cerca de 1,0 M, de modo preferencial até cerca de 0,5 M, para evitar agregação de ARPs. A remoção de células e detritos celu- lares do meio da cultura celular contendo as ARPs da invenção pode ser realizada por filtração de fluxo tangencial (TFF) com um cartucho de filtro de fibra oca de uso único, pré-esterilizado de 0,5 ou 1,00 μm ou com um dispositivo similar.

[0095] Adicionalmente, as ARPs podem ser expostas a condições de pH elevado durante a purificação (pH > 7,2, por exemplo, pH 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8,0, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, ou superior) de modo a aumentar a produção de ARPs.

[0096] Em seguida, as ARPs no meio de cultura clarificado são concentradas por ultrafiltração usando um cartucho de fibra oca des- cartável, pré-esterilizado de corte de peso molecular de 500.000. As ARPs concentradas podem ser diafiltradas contra 10 volumes de sali- na tamponada com fosfato de pH 7,0 a 8,0 (PBS) contendo 0,5 M de NaCl de modo a remover componentes residuais do meio.

[0097] As ARPs diafiltradas e concentradas podem ser adicional- mente purificadas em um gradiente de sacarose descontínuo a 20% a 60% em tampão PBS de pH 7,2 com NaCl a 0,5 M por centrifugação a

6.500 x g por 18 horas em cerca de 4 C a cerca de 10 C. Geralmente as ARPs vão formar uma banda visível distinta entre cerca de 30% a cerca de 40% de sacarose ou na interface (em uma etapa de gradiente de 20% e 60%) que pode ser coletada a partir do gradiente e armaze- nada. Este produto pode ser diluído de modo a compreender 200 mM de NaCl na preparação para a etapa seguinte no processo de purifica- ção. Este produto contém ARPs e pode conter in partículas intactas de baculovírus.

[0098] Pode ser obtida purificação adicional de ARPs por croma- tografia de permuta de ânions, ou 44% centrifugação com almofada de sacarose isopícnica. Em cromatografia de permuta de ânions, a amos- tra do gradiente de sacarose (vide acima) é carregada para dentro da coluna que contém um meio com um ânion (por exemplo, Matrix Frac- togel EMD TMAE) e evitada por meio de um gradiente salino (a partir de cerca de 0,2 M a cerca de 1,0 M de NaCl) que pode separar a ARP dos outros contaminados (por exemplo, baculovírus e DNA/RNA). No método de almofada de sacarose, a amostra que compreende as

ARPs é adicionada a uma almofada de sacarose a 44% e centrifugada por cerca de 18 horas a 30.000 g. ARPs de uma banda no topo de 44% de sacarose, while baculovirus se precipita no fundo e outras pro- teínas contaminantes permanecem na camada de sacarose a 0% no topo. O pico ou banda de ARP é coletado.

[0099] O baculovírus intacto pode ser inativado, caso desejado. A inativação pode ser realizada por métodos químicos, por exemplo, formalina ou .beta.-propiolactono (BPL). A remoção e/ou inativação de baculovírus intacto também pode ser amplamente realizada usando métodos de precipitação seletiva e cromatográficos conhecidos na ar- te, conforme exemplificado acima. Métodos de inativação compreen- dem incubação da amostra contendo as ARPs em 0,2% de BPL por 3 horas em cerca de 25°C a cerca de 27°C. O baculovírus também pode ser inativado por incubação da amostra contendo as ARPs a 0,05% de BPL em 4°C por 3 dias, em seguida em 37°C por uma hora.

[0100] Depois da etapa de inativação / remoção, o produto com- preendendo ARPs pode ser passado através de outra etapa de diafil- tração de modo a remover qualquer reagente da etapa de inativação e/ou qualquer sacarose residual, e a colocar as ARPs dentro do tam- pão desejado (por exemplo, PBS). A solução compreendendo ARPs pode ser esterilizada por métodos conhecidos na arte (por exemplo, filtração estéril) e armazenada no refrigerador ou no freezer.

[0101] As técnicas acima podem ser praticadas através de uma variedade de escalas. Por exemplo, frascos em T, frascos de agitação, garrafas giratórias, até biorreatores de tamanho industrial. Os biorrea- tores podem compreender ou um tanque de aço inoxidável ou em uma bolsa plástica pré-esterilizada (por exemplo, o sistema vendido pela Wave Biotech, Bridgewater, N.J.). Uma pessoa com conhecimento da arte vai saber o que é mais desejável para seus fins.

[0102] Confome descrito aqui, neste requerimento de patente, de-

pois de administração a um hospedeiro desejado, as ARPs da presen- te invenção são apreendidas por células normalmente infectadas pelo alfavírus a partir do qual as proteínas estruturais são derivadas. O ge- ne de interesse contido no replicon é internalizado dentro da célula depois da entrada das ARPs. Esta propriedade facilita o uso das ARPs descritas aqui, neste requerimento de patente, como veículos de libe- ração do gene porque permitem a liberação do gene de interesse den- tro de uma célula desejada.

[0103] Enquanto que os genomas de alfavírus naturais codificam proteínas estruturais do vírus além da poliproteina replicase não estru- tural, o replicon de alfavírus não codifica proteínas estruturais de alfa- vírus. Portanto, o replicon de alfavírus pode levar à produção de có- pias de genômico RNA de si mesmo em uma célula, mas não à produ- ção de vírions contendo RNA. A incapacidade de produzir estes vírions significa que, diferentemente de um alfavírus selvagem, o replicon não pode perpetuar a si mesmo em forma infecciosa. As proteínas estrutu- rais de alfavírus as quais são necessárias para perpetuação em vírus selvagens estão ausentes do replicon e seu local place é tomado por no mínimo um gene de interesse, de tal modo que o transcripto sub- genômico codifica a proteína de interesse ao invés das proteínas es- truturais de alfavírus.

[0104] Portanto, em determinadas modalidades, a ARP compre- ende um gene de interesse que pode ser, ou pode codificar, tal como um ou mais agentes terapêuticos ou diagnóstico que precisem ser libe- rados para um indivíduo, por exemplo, agente de imaging, sequência de ácido nucleico (incluindo siRNA e microRNA), radionuclídeo, hor- mônio, peptídeo, agente antiviral, agente antitumoral / quimioterápico, agente de modulação do crescimento celular, inibidor do crescimento celular, citocina, antígeno, adjuvante e toxina. O replicon embalado na partícula das proteínas estruturais do vírus não devem afetar de ma-

neira adversa a estabilidade da ARP. Isto pode ser determinado por produção de ARP contendo um determinado gene de interesse e ava- liando seus efeitos, se houver, sobre a estabilidade da ARP.

[0105] Por conseguinte, a presente invenção proporciona métodos para introduzir um gene de interesse dentro de uma célula. De acordo com a presente invenção, o gene de interesse está contido no replicon de alfavírus e o replicon de alfavírus é embalado com a partícula de proteínas estruturais de alfavírus. Em modalidades relacionadas, a ARP é posta em contato com uma célula. Em modalidades relaciona- das, a ARP é deixada para penetrar na célula, deste modo resultando em liberação do gene de interesse dentro da célula.

[0106] Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, os termos "tratar," tratando," "tratamento," e semelhantes se referem a reduzir ou melhorar um distúrbio e/ou sintomas associados com o mesmo. Vai ser reconhecido que, embora não excluído, o tratamento de um distúrbio ou condição não requer que o distúrbio, condição ou sintomas associados com os mesmos sejam completamente elimina- dos.

[0107] Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, os termos "prevenir," "prevenindo," "prevenção," "tratamento profilático" e semelhantes se referem a reduzir a probabilidade de desenvolvimento de um distúrbio ou condição em um indivíduo, o qual não tenha, mas esteja em risco de ou seja suscetível a desenvolver um distúrbio ou condição.

[0108] O gene de interesse pode ser um gene que codifica um an- tígeno. As ARPs da presente invenção podem ser preparadas em uma forma injetável, quer como uma solução líquida ou como uma suspensão. Formas sólidas adequadas para injeção também podem ser preparadas como emulsões, ou com as ARPs encapsuladas em lipossomas. Antígenos de vacina geralmente são combinados com um veículo farmaceuticamente aceitável, o qual inclui qualquer veículo que não induz a produção de anticorpos prejudiciais para o indivíduo rece- bendo o veículo. Veículos adequados tipicamente compreendem ma- cromoléculas grandes que são metabolizadas lentamente, tais como proteínas, polissacarídeos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos, agregados li- pídicos, e partículas de vírus inativos. Os veículos referidos são de co- nhecimento geral dos versados na arte. Estes veículos também podem funcionar como adjuvantes.

[0109] As ARPs descritas aqui, neste requerimento de patente, podem ser administradas em combinação com um adjuvante (por exemplo, Ribi). Adjuvantes são agentes imunoestimulantes que refor- çam a efetividade da vacina. Caso desejado, ARPs compreendendo um ou mais polipeptídeos de alfavírus ou fragmentos ou variantes dos mesmos são administradas em combinação com um adjuvante que reforça a efetividade da resposta imune gerada contra o antígeno de interesse. Adjuvantes efetivos incluem, mas não estão limitados a, sais de alumínio tais como hidróxido de alumínio e fosfato de alumínio, peptídeos de muramil, componentes da parede celular bacteriana, ad- juvantes de saponina, e outras substâncias que agem como agentes imunoestimulantes para reforçar a efetividade da composição.

[0110] Composições imunogênicas, isto é, as ARPs descritas aqui, neste requerimento de patente, veículo farmaceuticamente aceitável e adjuvante, também contêm tipicamente diluentes, tais como água, sa- lina, glicerol, etanol. Substâncias auxiliares também podem estar pre- sentes, tais como agentes umectantes ou emulsificantes, substâncias de tamponamento de pH, e semelhantes. Proteínas podem ser formu- ladas dentro da vacina como formas neutras ou salinas. As composi- ções imunogênicas tipicamente são administradas por via parenteral, por injeção; a injeção referida pode ser ou por via subcutânea ou por via intramuscular. Formulações adiionais são adequadas para outras formas de administração, tais como por supositório ou por via oral. Composições orais podem ser administradas como uma solução, sus- pensão, comprimido, pílula, cápsula, ou formulação de liberação gra- dual.

[0111] As composições imunogênicas são administradas em uma maneira compatível com a formulação da dose. A composição imuno- gênica compreende uma quantidade imunologicamente efetiva da ARP descrita aqui, neste requerimento de patente, e outros componentes previamente mencionados. Por uma quantidade imunologicamente efetiva se indica uma única dose, ou uma composição administrada em um esquema de múltiplas doses, que seja efeicaz para o tratamen- to ou para a prevenção de uma infecção. A dose administrada vai vari- ar, dependendo do indivíduo a ser tratado, da saúde e da condição física do indivíduo, da capacidade do sistema imune do indivíduo para produzir anticorpos, do grau de proteção desejado, e de outros fatores relevantes. As quantidades precisas do ingrediente ativo requeriddas vão depender do critério do clínico, mas tipicamente variam entre 5 μg a 250 μg de antígeno por dose. Composições Farmacêuticas e Administração

[0117] A invenção caracteriza composições farmacêuticas que compreendem ARPs conforme descrito aqui, neste requerimento de patente. As composições farmacêuticas úteis aqui, neste requerimento de patente, contêm um veículo farmacêuticamente aceitável, incluindo qualquer diluente ou excipiente adequado, o qual inclui qualquer agen- te farmacêutico, o qual não induza, o mesmo, a produção de uma res- posta imune prejudicial para o vertebrado recebendo a composição, e o qual possa ser administrado sem indevida toxicidade e uma ARP da invenção. Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, o termo "farmaceuticamente aceitável" significa sendo aprovado por uma agência reguladora do governo Federal ou de um governo estadual ou listado na Farmacopéia dos Estados Unidos, na Farmacopéia Euro- péia ou em outra na farmacopéia reconhecida de modo geral para uso em mamíferos, e mais particularmente em seres humanos. Estas composições podem ser úteis como uma vacina e/ou composições an- tigênicas para induzir uma resposta imune protetora em um vertebra- do.

[0112] Veículos farmaceuticamente aceitáveis incluem, mas não estão limitados a, salina, salina tamponada, dextrose, água, glicerol, tampão aquoso isotônico estéril, e combinações dos mesmos. Uma discussão completa de veículos farmaceuticamente aceitáveis, diluen- tes, e outros excipientes é apresentada em Remington's Pharmaceuti- cal Sciences (edição corrente da Mack Pub. Co. N.J.). A formulação deve se adequar ao modo de administração. Em outra modalidade preferencial, a formulação é adequada para administração aos seres humanos, de modo preferencial é estéril, não-particulada e/ou não- pirogênica.

[0113] A composição, caso desejado, também pode conter quanti- dades menores de agentes umectantes ou emulsificantes, ou agentes de tamponamento de pH. A composição pode ser uma forma sólida, tal como um pó liofilizado adequado para reconstituição, uma solução lí- quida, suspensão, emulsão, comprimido, pílula, cápsula, formulação de liberação gradual, ou pó. Formulação oral pode incluir veículos de rotina tais como graus farmacêuticos de manitol, lactose, amido, estea- rato de magnésio, sacarina de sódio, celulose, carbonato de magné- sio, etc.

[0114] Em determinadas modalidades, a composição de ARPs é suprida em forma líquida, por exemplo em um recipiente vedado indi- cando a quantidade e a concentração da composição de ARPs.

[0115] De modo preferencial, a forma líquida da composição de

ARPs é suprida em um recipiente hermeticamente vedado de no mí- nimo cerca de 50 μg/ml, de modo mais preferencial de no mínimo cer- ca de 100 μg/ml, de no mínimo cerca de 200 μg/ml, de no mínimo 500 μg/ml, ou de no mínimo 1 mg/ml.

[0116] Alternativamente, a formulação de vacina é administrada por via intranasal, quer por gotas, por aerosol de partículas grandes (maiores do que cerca de 10 micra), ou pulverização dentro do trato respiratório superior ou por aerosol de partículas pequenas (menos de 10 micra) ou pulverização dentro do trato respiratório inferior. Apesar de qualquer uma das vias de liberação acima resultar em uma respos- ta imune, a administração intranasal confere o benefício adicional de provocar imunidade da mucosa no sítio de entrada de muitos vírus, inclusive dos alfavírus, por exemplo CHIKV ou VEEV.

[0117] Portanto, a invenção também compreende um método de formular uma vacina ou de uma composição antigênica que induz imu- nidade para uma infecção ou no mínimo para um sintoma da mesma a um mamífero, compreendendo adicionar, à referida formulação, uma dose efetiva de ARPs, por exemplo, alfavírus (por exemplo, CHIKV ou VEEV).

[0118] Em alguns casos, a estimulação de imunidade com uma dose única é preferencial, no entanto dosagens adicionais também podem ser administradas, pela mesma via ou por via diferente, de mo- do a obter o efeito desejado. Em neonatos e bebêas, por exemplo, po- dem ser necessárias múltiplas administrações para provocar níveis suficientes de imunidade. A administração pode continuar em interva- los por toda a infância, conforme necessário, para manter níveis ou proteção suficientes.

[0119] De modo similar, adultos que sejam particularmente susce- tíveis a infecções repetidas ou graves, tais como, por exemplo, profis- sionais de saúde, trabalhadores de creches, membros da família de crianças pequenas, os idosos, e indivíduos com sistemas imunes ou função cardiopulmonar comprometidos podem necessitar de múltiplas imunizações de modo a estabelecer e/ou manter respostas imunes protetoras. Os níveis de imunidade induzida podem ser monitorados, por exemplo, medindo as quantidades de anticorpos neutralizantes secretores e séricos, e as dosagens podem ser ajustadas ou as vaci- nações repetidas conforme necessário de modo a provocar e manter níveis desejados de proteção.

[0120] A dosagem da formulação farmacêutica pode ser pronta- mente determinada pelo técnico versado, por exemplo, primeiro identi- ficando doses efetivas para provocar uma resposta imune profilática ou terapêutica, por exemplo, medindo o título sérico de imunoglobuli- nas de vírus específicos ou medindo a proporção inibitória de anticor- pos em amostra de soro, ou amostras de urina, ou secreções de mu- cosa. As dosagens referidas podem ser determinadas a partir de estu- dos com animais. Uma lista não limitante de animais usados para es- tudar a eficácia de vacinas inclui o porquinho da índia, hamster, furões, chinchila, camundongo e rato de algodão, e primatas não humanos. A maioria dos animais não são hospedeiros naturais para agentes infec- ciosos, mas ainda podem servir em estudos de vários aspectos da do- ença. Por exemplo, qualquer um dos animais acima pode ser dosado com um candidato a vacina, por exemplo, ARPs da invenção, para ca- racterizar parcialmente a resposta imune induzida, e/ou para determi- nar se foram produzidos quaisquer anticorpos neutralizantes. Por exemplo, foram conduzidos muitos estudos no modelo de camundon- go porque os camundongos são de tamanho pequeno e seu baixo cus- to permite aos pesquisadores conduzir estudos em uma maior escala.

[0121] Além disso, podem ser realizados estudos clínicos huma- nos para determinar a dose efetiva preferencial para os seres huma- nos por um especialista na técnica. Os estudos clínicos referidos são de rotina e são de conhecimento geral na arte. A dose precisa a ser empregada também vai depender da via de administração. Doses efe- tivas podem ser extrapoladas a partir de curvas de dose-resposta deri- vadas de sistemas de teste in vitro ou em animais.

[0122] Conforme também é de conhecimento geral na arte, a imu- nogenicidade de uma composição particular pode ser reforçada pelo uso de estimuladores inespecíficos da resposta imune, conhecidos como adjuvantes. Adjuvantes têm sido usados experimentalmente pa- ra promover um aumento generalizado na imunidade contra antígenos desconhecidos. Os protocolos de imunização têm usado adjuvantes para estimular respostas por muitos anos, e como tais, adjuvantes são de conhecimento geral de uma pessoa de conhecimento ordinário na arte. Alguns adjuvantes afetam o modo no qual os antígenos são apresentados. Por exemplo, a resposta imune é aumentada quando antígenos de proteínas são precipitados por alúmen. A emulsificação de antígenos também prolonga a duração da apresentação de antíge- nos. A inclusão de qualquer adjuvante descrito em Vogel et al., "A Compendium of Vaccine Adjuvants and Excipients (2nd Edition)," in- corporada aqui, a este requerimento de patente, por meio de referên- cia em sua totalidade para todos os fins, é prevista dentro do âmbito desta invenção.

[0123] Exemplos de adjuvantes incluem adjuvante completo de Freund (um estimulador inespecífico da resposta imune contendo Mycobacterium tuberculosis morto), adjuvantes incompleto de Freund e adjuvante de hidróxido de alumínio. Outros adjuvantes compreen- dem GMCSP, BCG, hidróxido de alumínio, compostos de MDP, tais como thur-MDP e nor-MDP, CGP (MTP-PE), lipídeo A, e monofosforil lipídico A (MPL). RIBI, o qual contém três componentes extraídos de bactérias, MPL, trealose dimicolato (TDM) e esqueleto da parede celu- lar (CWS) em uma emulsão a 2% de esqualeno / Tween-80 também é contemplado. MF-59, Novasomes.RTM., antígenos do MHC também podem ser usados.

[0124] As ARPs da invenção também podem ser formuladas com "imuno estimuladores." Estes são os mensageiros químicos do próprio corpo (citocinas) para aumentar a resposta do sistema imune. Imuno estimuladores incluem, mas não estão limitados a, várias citocinas, linfocinas e quimiocinas com atividades imunoestimuladoras, de imu- nopotenciação, e pró-inflamatórias, tais como interleucinas (por exem- plo, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-12, IL-13); fatores de crescimento (por exemplo, fator estimulante de colônias de macrófagos granulócitos ((GM)-CSF)); e outras moléculas imunoestimuladoras, tais como fator inflamatório de macrófagos, ligante Flt3, B7.1; B7.2, etc. As moléculas imunoestimuladoras podem ser administradas na mesma formulação que as ARPs, ou podem ser administradas separadamente. Ou a pro- teína ou um vetor de expressão codificando a proteína pode ser admi- nistrado para produzir um efeito imunoestimulador. Portanto, em uma modalidade, a invenção compreende formulações antigênicas e de va- cina compreendendo um adjuvant e/ou um imuno estimulador.

[0125] De acordo com a invenção, o sistema de liberação compre- endendo a referida ARP pode liberar um gene de interesse dentro do citoplasma de células eucarióticas, deste modo pode tratar cânceres, infecções virais, transtornos neurológicos, doenças autoimunes, rejei- ção de enxerto e doenças hereditárias monogênicas ou poligênicas.

[0126] A invenção será descrita em detalhes com referência aos seguintes exemplos, os quais, no entanto, não se destinam a limitar o âmbito do presente requerimento. Exemplo 1

[0133] Construção de Partículas de Replicon do VEEV (VRPs)

[0134] O procedimento esquemático é mostrado na Figura 2. Estabelecimento de plasmídeo de Replicon do VEEV expressando lu-

ciferase

[0135] 1) Foi sintetizado fragmento de proteínas não estruturais de TC83 do VEEV de comprimento total (nsp)1, nsp2, nsp3 e nsp4 (ThermoFisher).

[0136] De modo similar, foram sintetizados gblocks corresponden- tes a vários fragmentos do constructo de Replicon (IDT) como se se- gue -

[0127] 2) gblock1 do VEEV - ClaI-RSVp-5’UTR-nsp1(bp1-470)- RsrII-ApaI-26Sp-sgRNA até ATG do gene CA do VEEV. Este fragmen- to teve uma sobreposição de 36 bp com o plasmídeo da espinha dor- sal pBR322 na extremidade 5’. Este é o fragmento no. 1.

[0128] 3) gblock2 do VEEV – Este fragmento teve uma sobreposi- ção de 64 bp com gblock1 do VEEV se iniciando no sítio ApaI até o códon de partida ATG. Isto foi seguido pela Nano Luciferase ORF (Promega) e as primeiras 72 bases da UTR 3’ do VEEV.

[0129] 4) Clonagem do fragmento no. 2 - gblock2 do VEEV, UTR 3’ do VEEV de comprimento total e o sinal de PoliA do VEEV (A(n=55)) foram primeiro montados por PCR de extensão de sobreposição usan- do os oligômeros mostrados na tabela abaixo: [Tabela 1] Sequência Nome do Iniciador VEEV_Oligo2 tem uma sobreposição de 15bp com o plas- mídeo de espinha dorsal pBR322.

[0140] 5) Em seguida, o gblock1 do VEEV (fragmento no. 1), frag- mento no. 2 e espinha dorsal pBR322 (digerida com ClaI e NruI-HF) foram montados usando Gibson Assembly de modo a obter o cons- tructo de espinha dorsal pBR322-RSVp-RsrII-ApaI-26Sp-sgRNA- NanoLuc-A(n=55)-SV40 pA (BB). Este constructo de espinha dorsal careceu do fragmento nsp1-4 TC83 de comprimento total.

[0130] 6) O fragmento nsp1-4 (bp 470-7461) foi amplificado a partir do plasmídeo Thermo sintetizado obtido em 1) usando iniciadores con- tendo os sítios de restrição RsrII e ApaI -

[0142] i) 5’-ccggccCGGACCGacaagtctctatcacc-3’ (SEQ ID NO: 11, iniciador fwd) e ii) 5’-ggccggGGGCCCctctcaggtagctgaatg-3’ (SEQ ID NO: 12, iniciador rev). Este fragmento nsp amplificado por PCR foi clo- nado no plasmídeo da espinha dorsal BB usando os sítios RsrII e ApaI de modo a obter o constructo do Replicon TC83 do VEEV de compri- mento total. (Figura 3) Plasmídeos Auxiliares

[0143] Constructos de plasmídeos auxiliares codificando o capsídeo TC83 do VEEV são mostrados nas Figuras 4 e 5. Os constructos expressam proteína do capsídeo do VEEV selvagem (SEQ ID NO: 1) e Capsídeo do VEEV tendo uma mutação no NLS (K64N, SEQ ID NO: 2), respectivamente.

[0131] Os constructos de plasmídeos auxiliares expressando as glicoproteínas de TC83 do VEEV E3-E2-6K-E1 usados aqui, neste requerimento de patente, são mostrados nas Figuras 6 e 7. Os constructos expressam as glicoproteínas de TC83 do VEEV selvagem E3-E2-6K-E1 (SEQ ID NO: 3) e E3-E2-6K-E1 com E3 modificada (sítio furina na extremidade de RKRR de E3 foi substituído com SGGGS, SEQ ID NO: 4), respectivamente. Cultura Celular e co-Transfecção

[0143] Células 293T foram semeadas em uma placa 6 cavidades em meio DMEM completo contendo 10% de FBS, Penicilina e Estrep- tomicina. As células foram co-transfectadas com iguais quantidades do constructo RSVp-NLuc do VEEV contendo (VR) (SEQ ID NO: 5) ou carecendo (BB) do fragmento de nsp1-4, junto com plasmídeo auxiliar codificando capsídeo e plasmídeo codificando glicoproteínas E1-6K- E2-E3 usando PEI (1,7 μg de cada plasmídeo). A combinação dos plasmídeos auxiliares foi (SEQ ID NO: 1 e 3), (SEQ ID NO: 1 e 4), (SEQ ID NO: 2 e 3) ou (SEQ ID NO: 2 e 4). As células foram incuba- das com a mistura de transfecção por cerca de 3 horas a 37°C, depois do que a mistura de transfecção foi removida, as células foram lavadas com 1X PBS e meio DMEM fresco foi adicionado. As Partículas de Replicon de Vírus (VRPs) acondicionadas foram colhidas ou 48 hpt (horas pós transfecção) ou 72 hpt. Para colher as VRPs, o sobrena- dante da cultura das células transfectadas foi obtido centrifugando a cultura celular a 1200 rpm por 5 min a 4°C para peletizar quaiquer de- tritos celulares. O sobrenadante foi filtrado através de um filtro de 0,45 μm. As VRPs colhidas foram armazenadas ou a 4°C ou a -80°C. Exemplo 2

[0132] Determinação da Capacidade de Acondicionamento do Re- plicon do VEEV dentro de Partículas de Replicon do Vírus VEE (VRPs) Infecção e Teste de Luciferase

[0145] O protocolo esquemático é mostrado na Figura 8.

[0146] Células 293T foram semeadas em meio DMEM completo em uma placa de 96 cavidades em uma densidade de aproximada- mente 10.000 células por cavidade. As células foram infectadas com diluições seriais de 2 vezes ou não diluídas das VRPs colhidas a 37°C. Em 14 horas pós infecção (hpi), as VRPs foram removidas; as células foram lavadas com PBS e meio DMEM fresco foi adicionado às cavi- dades. As células foram adicionalmente incubadas e colhidas para tes- te de Luciferase em 24, 48, e 72 hpi. Foi realizado teste de luciferase adicionando quantidades iguais de células infectadas e Nano-Glo Luci- ferase Assay System (Promega) a uma placa de 96 cavidades opaca de fundo branco (Costar). A atividade de luciferase foi medida imedia- tamente usando a leitora de microplacas Bio-Tek Synergy HTX. Resultado

[0147] Os resultados são mostrados na Figura 9. A expressão de luciferase foi confirmada nas células infectadas com as VRPs (VR) tão cedo quanto 24 hpi. As células infectadas com o constructo de espinha dorsal carecendo de nsp 1-4 (BB) expressaram quase nenhuma lucife- rase. Exemplo 3 Novos Constructos de Replicon do VEEV

[01488] Novos constructos de plasmídeos do replicon TC83 do VEEV foram preparados por introdução de sítio de clonagem múltipla (MCS) para permitir a introdução de vários "genes de interesse". O protocolo esquemático é mostrado na Figura 10. O constructo é mostrado na Figura 11 e na SEQ ID NO: 6. No constructo da Figura 11, um nucleotideo codificando luciferase é introduzido como gene de interesse. Pode ser selecionado promotor no plasmídeo em vista das células a serem infectadas. Exemplo 4

[0133] Preparação de VRPs com / sem uma mutação no Capsídeo e/ou em E3-E2-6K-E1, e tendo um gene de interesse

[0150] Neste exemplo, plasmídeo de replicon do VEEV contendo um gene de interesse foi co-transfectado com plasmídeo auxiliar de Capsídeo do VEEV e plasmídeo auxiliar das glicoproteínas E3-E2-6K- E1 do VEEV para células 293T em uma maneira similar ao Exemplo 1. Como o gene de interesse, foram empregados genes codificando luci- ferase, GFP, IKK ou JNK2.

[0134] Foram usados os seguintes plasmídeos:

[0152] i-1) plasmídeo compreendendo um polinucleotídeo codifi- cando proteína do capsídeo selvagem de CT83 do VEEV, ou

[0153] i-2) plasmídeo compreendendo um polinucleotídeo codifi- cando proteína do capsídeo de CT83 do VEEV tendo uma mutação no NLS (K64N).

[0154] ii-1) plasmídeo compreendendo um polinucleotídeo codifi- cando E3-E2-6K-E1 de CT83 do VEEV selvagem, ou

[0155] ii-2) plasmídeo compreendendo um polinucleotídeo codifi- cando E3-E2-6K-E1 de CT83 do VEEV, tendo mutação no sítio de fu- rina em E3 e

[0156] iii) plasmídeo compreendendo polinucleotídeo codificando nsp1, nsp2, nsp3 e nsp4 de CT83 do VEEV, e um gene de interesse codificando luciferase, GFP, IKK ou JNK2. Co-transfecção

[0157] Células 293T foram co-transfectadas com o plasmídeo de replicon TC83 do VEEV compreendendo o gene de interesse, um plasmídeo auxiliar codificando capsídeo do VEEV (selvagem ou muta- ção) e um plasmídeo auxiliar codificando E3-E2-6K-E1 (selvagem ou mutação). Três plasmídeos (1 μg de capsídeo, 1 μg de E3-E2-6K-E1 e 10 μg de replicon do VEEV contendo o gene de interesse) foram trans- fectados para células 293T (pelo método PEI) e as céluals foram incu- badas por 4 a 7 dias. Em seguida, as VRPs foram colhidas do sobre- nadante e purificadas por sedimentação por densidade optiprep.

[0135] As VRPs purificadas foram confirmadas por western blotting usando anticorpo anti-VEEV (ATCC) como o primeiro anticorpo (1:2000) e IgG anti-camundongo (1:4000) como o anticorpo secundário. Os resultados das VRPs obtidas usando os plasmídeos que se seguem são mostrados na Figura 12:

[0159] i) plasmídeo compreendendo um polinucleotídeo codifican-

do proteína do capsídeo de CT83 do VEEV tendo uma mutação no NLS (K64N).

[0160] ii) plasmídeo compreendendo um polinucleotídeo codifican- do E3-E2-6K-E1 de CT83 do VEEV selvagem, e

[0161] iii) plasmídeo compreendendo polinucleotídeo codificando nsp1, nsp2, nsp3 e nsp4 de CT83 do VEEV, e também um polinucleo- tídeo codificando GFP, IKK ou JNK2. Exemplo 5

[0136] Foram usadas VRPs obtidas no Exemplo 4 usando os vetores que se seguem:

[0163] i) plasmídeo compreendendo um polinucleotídeo codifican- do proteína do capsídeo de CT83 do VEEV tendo uma mutação no NLS (K64N).

[0164] ii) plasmídeo compreendendo um polinucleotídeo codifican- do E3-E2-6K-E1 de CT83 do VEEV selvagem, e

[0165] iii) plasmídeo compreendendo polinucleotídeo codificando nsp1, nsp2, nsp3 e nsp4 de CT83 do VEEV, e também um polinucleo- tídeo codificando IKK ou JNK2.

[0137] Células 293T foram infectadas com com VRPs que contêm gene IKK ou JNK2. A infecção de VRPs para células 293T foi conduzi- da da mesma maneira que no Exemplo 2.

[0138] A expressão de IKK nas células 293T infectadas com VRP foi confirmada por western blotting. Como controle positivo, foram sa- das células 293T transfectadas com plasmídeo de vetor de expressão de IKK. O lisado celular foi submetido a western blotting com anticorpo Rb anti-IKK (Proteintech) como o primeiro anticorpo (1:500) e IgG anti- Rb marcada com HRP como o anticorpo secundário (1:4000).

[0139] Os resultados são mostrados na Figura 13. Na Figura 13, a Alameda 1 mostra células 293T transfectadas com as VRPs. A Alame- da 2 mostra controle positivo, isto é, células transfectadas com plas-

mídeos de vetor de expressão de IKK. Conforme mostrado nesta figu- ra, as células 293T transfectadas com as VRPs expressaram proteína IKK.

[0140] A expressão de JNK2 a partir do gene JNK2 inserido no replicon nas células 293T infectadas foi confirmada por western blot- ting. Como o controle, foram usadas células 293T sem infecção. anti- corpo de camundongo anti-JNK2 (Santa Cruz) foi usado como o pri- meiro anticorpo (1:500) e IgG anti-camundongo marcada com HRP foi usada como o segundo anticorpo (1:4000). Os resultados são mostra- dos na Figura 14. Foi confirmado que as células 293T infectadas pelas VRPs tendo JNK2 como o gene de interesse expressam JNK2. Exemplo 6

[0141] Efeito de mutação no NLS do Capsídeo

[0171] Foram usados dois tipos de VRPs obtidas no Exemplo 4 usando os plasmídeos que se seguem:

[0172] i-1) plasmídeo compreendendo um polinucleotídeo codifi- cando proteína do capsídeo selvagem de CT83 do VEEV, ou

[0173] i-2) plasmídeo compreendendo um polinucleotídeo codifi- cando proteína do capsídeo de CT83 do VEEV tendo uma mutação no NLS (K64N).

[0174] ii) plasmídeo compreendendo um polinucleotídeo codifican- do E3-E2-6K-E1 de CT83 do VEEV selvagem, e

[0175] iii) plasmídeo compreendendo polinucleotídeo codificando nsp1, nsp2, nsp3 e nsp4 de CT83 do VEEV, e também um polinucleo- tídeo codificando luciferase.

[0142] Células 293T foram infectadas com as VRPs da mesma maneira que no Exemplo 2. Foi conduzido ensaio de Luciferase da mesma maneira que no Exemplo 2. Os resultados são mostrados na Figura 15.

[0143] Nesta Figura, controle corresponde a fundo de atividade de luciferase. VRPs com Capsídeo tendo mutação no NLS apresentaram atividade de luciferase muito maior (900556) comparadas com as VRPs com o capsídeo selvagem (118063).

[0144] Os dados indicaram que modificação do capsídeo leva a maior produção e expressão comparada com a partícula de replicon de alfavírus sem modificação no capsídeo. Exemplo 7

[0145] Foram usadas partículas de replicon de Vírus VEE (VRPs) obtidas no Exemplo 4 por co-transfecção de células 293T com os veto- res que se seguem:

[0180] i) plasmídeo compreendendo um polinucleotídeo codifican- do proteína do capsídeo de CT83 do VEEV tendo uma mutação no NLS (K64N).

[0181] ii) plasmídeo compreendendo um polinucleotídeo codifican- do E3-E2-6K-E1 de CT83 do VEEV selvagem.

[0182] iii) plasmídeo compreendendo polinucleotídeo codificando nsp1, nsp2, nsp3 e nsp4 de CT83 do VEEV, e um polinucleotídeo codi- ficando GFP.

[0183] Células 293T foram infectadas com as VRPs obtidas deste modo da mesma maneira que no Exemplo 2. O controle mostra células normais sem infecção. Foi confirmada a expressão de GFP nas célu- las. Os resultados são mostrados na Figura 16. Exemplo 8

[0146] Foram usadas as mesmas partículas de replicon do VEEV que as usadas no Exemplo 7. Células J774.A1 de macrófagos e Célu- las de macrófagos derivadas da medula óssea (BMDM) foram infecta- das com as VRPs. O gene de interesse codificando GFP foi expresso nas células de macrófagos transfectadas.

[0185] Ambas as células foram tratadas com IL-4 por 48 horas pa- ra serem polarizadas e analisadas para expressão de GFP. Os resul-

tados são mostrados na Figura 17. Exemplo 9

[0147] Estudo de eficácia in vivo sobre modelos de CT26

[0187] O protocolo esquemático deste exemplo é mostrado na Fi- gura 18. As VRPs usadas neste exemplo foram as preparadas no Exemplo 4 usando os plasmídeos que se seguem:

[0188] i) plasmídeo compreendendo um polinucleotídeo codifican- do proteína do capsídeo de CT83 do VEEV tendo uma mutação no NLS (K64N),

[0189] ii) plasmídeo compreendendo um polinucleotídeo codifican- do E3-E2-6K-E1 de CT83 do VEEV selvagem, e

[0190] iii) plasmídeo compreendendo polinucleotídeo codificando nsp1, nsp2, nsp3 e nsp4 de CT83 do VEEV, e um polinucleotídeo codi- ficando quinases IκB humanas (IKK).

[0148] Este estudo consiste em 4 braços, n=8, para um total de 32 animais. Os animais foram recebidos. Cada um dos animais foi ran- domizado no Dia 0 quando o volume tumoral atinge 60 a 100 mm3 e a dosagem vai se iniciar no Dia 0 com G1: veículo, G2: mAb anti-PD-1, G3: VRPs e G4: uma combinação de VRPs e mAb anti-PD-1 a 10 mg/kg (BIWx3 e IP). O crescimento tumoral foi monitorado até 30 dias depois do início do tratamento.

[0149] Para os grupos 1, 3 e 4, os camundongos foram injetados por via intra-tumoral com 50 μl de veículo ou VRPs dispersdas no veí- culo no dia 0, 2, 4, 6, 8 e 10. As VRPs ou veículo foram administrados dentro do tumor no flanco direito usando uma seringa do tipo de insuli- na de 0,3 ml. O objetivo foi usar um ponto de entrada, mas distribuir o material através do tumor, movendo a agulha para dentro e para fora.

[0150] Foram realizadas medições do tamanho tumoral duas ve- zes por semana. O ponto de encerramento humanitário para este es- tudo é carga tumoral de 3000 mm3 e/ou perda de peso corporal de

20% ou superior. Os resultados de todos os 8 animais em cada grupo são mostrados na Figura 19.

[0151] Os dados indicaram que VRPs compreendendo o gene co- dificando IKK e a combinação de VRPs e anticorpo anti-PD-1 demons- traram efeito anti-tumoral superior em relação ao controle e a imunote- rapia única com anti-PD-1. Exemplo 10

[0152] Partículas de replicon de alfavírus quimérico foram prepa- radas da mesma maneira que no Exemplo 4 usando os seguintes con- juntos de vetores. ARP 1 quimérico

[0196] i) plasmídeo compreendendo um polinucleotídeo codifican- do proteína do capsídeo da cepa 37997 do CHIKV selvagem,

[0197] ii) plasmídeo compreendendo um polinucleotídeo codifican- do E3-E2-6K-E1 da cepa 37997 do CHIKV selvagem, e

[0198] iii) plasmídeo compreendendo polinucleotídeo codificando nsp1, nsp2, nsp3 e nsp4 de CT83 do VEEV, e um polinucleotídeo codi- ficando GFP. ARP 2 quimérico

[0199] i) plasmídeo compreendendo um polinucleotídeo codifican- do proteína do capsídeo da cepa OPY-1 do CHIKV selvagem,

[0200] ii) plasmídeo compreendendo um polinucleotídeo codifican- do E3-E2-6K-E1 da cepa OPY-1 do CHIKV selvagem, e

[0201] iii) plasmídeo compreendendo polinucleotídeo codificando nsp1, nsp2, nsp3 e nsp4 de CT83 do VEEV, e um polinucleotídeo codi- ficando GFP.

[0153] As ARPs obtidas foram purificadas da mesma maneira que no Exemplo 1. As ARPs quiméricas purificadas foram confirmadas por western blotting usando soro de coelho anti-CHIKV (1:2000) como o primeiro anticorpo e IgG-HRP de cabra anti-Rabbit (1:4000) como o anticorpo secundário. Os resultados são mostrados na Figura 20. Foi confirmada a produção de ambas as ARPs quiméricas.

[0154] As células 293T foram infectadas com as ARPs quiméricas codificando GFP. Depois da infecção, as células foram incubadas por 48 horas e a expressão de GFP foi confirmada por análise FACS. Como um controle, foram usadas células sem infecção. Os resultados são mostrados na Figura 21. 5,21% e 4,07% das células infectadas com o ARPS expressaram GFP, sugerindo que as ARPs quiméricas expressaram com sucesso a proteína GFP (o gene de interesse é um nucleotideo codificando GFP) nas células.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Partícula de replicon de alfavírus (ARP), caracterizada pelo fato de que compreende: (i) proteínas estruturais de alfavírus, as quais compreendem capsídeo e/ou envelope, e (ii) um replicon de alfavírus, o qual compreende um polinu- cleotídeo codificando as proteínas não estruturais de alfavírus nsp1, nsp2, nsp3 e nsp4 e no mínimo um gene de interesse, em que no mínimo um entre capsídeo, e E3 e E2 no enve- lope compreendem alteração de um ou mais aminoácidos porém E1 no envelope não compreende nenhuma alteração de aminoácido.

2. Partícula de replicon de alfavírus (ARP) de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que as proteínas estruturais de alfavírus compreendem uma ou mais alterações no Sinal de Locali- zação Nuclear (NLS) da proteína do capsídeo de alfavírus.

3. Partícula de replicon de alfavírus (ARP) de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que um ou mais entre lisina ou arginina no Sinal de Localização Nuclear da proteína do capsídeo de alfavírus é substituído com asparagina ou alanina.

4. Partícula de replicon de alfavírus (ARP) de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que as proteínas estruturais de alfavírus compreendem uma ou mais alte- rações na proteína E2 do alfavírus.

5. Partícula de replicon de alfavírus (ARP) de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que as proteínas estruturais de alfavírus compreendem uma ou mais alte- rações no sítio de furina na proteína E3 do alfavírus.

6. Partícula de replicon de alfavírus (ARP) de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que o alfavírus é um CHIKV ou VEEV.

7. Partícula de replicon de alfavírus (ARP) de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que o CHIKV é CHIKV cepa 37997 ou cepa OPY-1.

8. Partícula de replicon de alfavírus (ARP) de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que o VEEV é VEEV cepa TC-83.

9. Partícula de replicon de alfavírus (ARP) de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizada pelo fato de que o gene de interesse codifica um antígeno.

10. Método para preparar partículas de replicon de alfaví- rus, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: co-transfecção das células com i) um vetor compreendendo um polinucleotídeo as codifi- cando proteínas não estruturais de alfavírus nsp1, nsp2, nsp3 e nsp4, e no mínimo um gene de interesse, ii) um vetor compreendendo um polinucleotídeo codificando uma proteína do capsídeo de alfavírus, e iii) um vetor compreendendo um polinucleotídeo codificando uma E3-E2-6K-E1 do alfavírus, em que no mínimo um entre o capsídeo, E3 e E2 compre- ende alteração de um ou mais aminoácidos, mas E1 não compreende nenhuma alteração de aminoácido, cultura das células transfectadas, e purificação das ARPs da cultura celular.

11. Método de acordo com a reivindicação 10, caracteriza- do pelo fato de que as proteínas estruturais de alfavírus compreendem uma ou mais alterações no Sinal de Localização Nuclear (NLS) da pro- teína do capsídeo de alfavírus.

12. Método de acordo com a reivindicação 11, caracteriza- do pelo fato de que um ou mais entre lisina ou arginina no Sinal de Lo-

calização Nuclear da proteína do capsídeo de alfavírus é substituído com asparagina ou alanina.

13. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 10 a 12, caracterizado pelo fato de que as proteínas estruturais de alfavírus compreendem uma ou mais alternações na proteína E2 do alfavírus.

14. Método de acordo com a reivindicação 13, caracteriza- do pelo fato de que as proteínas estruturais de alfavírus compreendem uma ou mais alterações no sítio de furina na proteína E3 do alfavírus.

15. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 10 a 14, caracterizado pelo fato de que o alfavírus é um CHIKV ou VEEV.

16. Método de acordo com a reivindicação 15, caracteriza- do pelo fato de que o CHIKV é CHIKV cepa 37997 ou cepa OPY-1.

17. Método de acordo com a reivindicação 15, caracteriza- do pelo fato de que o VEEV é VEEV cepa TC-83.

18. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 10 a 17, caracterizado pelo fato de que o gene de interesse codi- fica um antígeno.

19. Partícula de replicon de alfavírus (ARP), caracterizada pelo fato de que compreende: (i) proteínas estruturais do CHIKV compreendendo capsí- deo e/ou envelope, e (ii) um replicon do VEEV compreendendo um polinucleotí- deo codificando as proteínas não estruturais do VEEV nsp1, nsp2, nsp3 e nsp4 e no mínimo um gene de interesse.

20. Partícula de replicon de alfavírus (ARP) de acordo com a reivindicação 19, caracterizada pelo fato de que o CHIKV é CHIKV cepa 37997 ou cepa OPY-1, e o VEEV é VEEV cepa TC-83.