BR112020011354A2

BR112020011354A2 - métodos para produzir uma semente de planta lactuca e para cruzamento de uma planta lactuca.

Info

Publication number: BR112020011354A2
Application number: BR112020011354-9A
Authority: BR
Inventors: Shingo Horiuchi; Takao Suzuki; Atsushi Izumida
Original assignee: Sakata Seed Corporation
Priority date: 2017-12-06
Filing date: 2018-12-05
Publication date: 2020-11-17
Also published as: KR102277832B1; KR20200091896A; JPWO2019111975A1; AU2018381397A1; CA3084968C; CN111683522A; JP6783955B2; PT3721705T; US11388864B2; CN111683522B; EP3721705B1; WO2019111975A1; CL2020001498A1; EP3721705A1; EP3721705A4; MX2020005953A; ZA202003870B; AU2018381397B2; CA3084968A1; US20200352114A1

Abstract

A presente invenção refere-se a um método para produzir sementes de uma planta Lactuca, o método incluindo hibridização da planta Lactuca, usando abelhas Megachile como um meio de polinização, e uso, como uma planta fonte de néctar auxiliar, além da planta Lactuca precursora de pólen e da planta Lactuca precursora de semente, de uma planta que é preferencialmente visitada pelas abelhas Megachile, a preferência de visita sendo, portanto, igual a ou inferior à da planta de Lactuca. De acordo com a presente invenção, sementes da planta Lactuca podem ser produzidas mais eficientemente e economicamente do que em métodos anteriores, enquanto as abelhas Megachile podem ser usadas como meio de polinização.

Description

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MÉTODOS PARA PRODUZIR UMA SEMENTE DE PLANTA LACTUCA E PARA CRUZAMENTO DE UMA PLANTA LACTUCA REFERÊNCIA(S) CRUZADA(S) AOS PEDIDOS RELACIONADOS

[001] Este pedido reivindica o benefício de prioridade para o Pedido de Patente Japonês No. 2017-234674, data de depósito: 6 de dezembro de 2017, os conteúdos inteiros do qual são aqui incorporados por referência. Campo Técnico

[002] A presente invenção se refere a um método de produzir eficientemente uma semente de planta Lactuca usando uma abelha Megachile como meio de polinização. Mais especificamente, a presente invenção se refere a um método de produzir uma semente de planta Lactuca usando uma abelha Megachile como meio de polinização e usando uma planta de néctar auxiliar além de uma planta Lactuca precursora de pólen e uma planta Lactuca precursora de semente. Mais especificamente, a presente invenção se refere a um método para produzir uma semente de primeira geração filial (híbrido F1) de alface. Fundamentos da Técnica

[003] As variedades de planta incluem variedade polinizada aberta e variedades de primeira geração filial (daqui em diante, algumas vezes abreviada como “F1”), e em safras principais, as variedades F1 são amplamente usadas.

[004] As variedades F1 têm vantagens significantes tais como crescimento vigoroso devido à heterose, crescimento rápido e rendimento melhorado. Como um resultado do crescimento vigoroso, as variedades F1 também podem ser esperadas ter resistência à praga melhorada e adaptabilidade ambiental melhorada tal como tolerância ao frio e calor. Além disso, visto que os genótipos das variedades F1 são tanto heterogênicas quanto próximos a idênticos, os fenótipos mostram uniformidade extremamente alta, tal que a comercialidade dos produtos é realçada. Além

2 / 38 disso, traços úteis controlados pelos genes dominantes podem ser acumulados nos parentes das variedades F1 que possibilitam procriação rápida das variedades F1. Devido às vantagens descritas acima, as variedades F1 têm se tornado a tendência dominante dos cultivares nas safras principais.

[005] As plantas pertencentes ao gênero Lactuca, em particular, alface (Lactuca sativa) são produzidas em vários países ao redor do mundo. A alface é um vegetal tendo uma escala de mercado muito grande e as variedades F1 são altamente desejadas. Os presentes inventores tiveram êxito no desenvolvimento de uma alface citoplásmica estéril macho necessária para o desenvolvimento da variedade F1 de alface e mostraram que os híbridos F1 podem ser produzidos na alface (WO 2007/049730 A) (Documento Patentário 1)).

[006] A produção de semente de híbridos F1 de alface pode ser realizada pela polinização manual. A alface apenas floresce por várias horas pela manhã, levando à eficiência de trabalho diminuída, o número de sementes obtidas pelo cruzamento de uma flor pode ser tão pouco quanto 10 grãos. Por esta razão, a produção de semente pela polinização manual tem baixa eficiência econômica e há muita necessidade quanto a um método de produção de sementes altamente econômico e eficiente. Como é praticado em outras safras, é desejável desenvolver um método de transferência de pólen altamente econômico usando um inseto polinizador. Entretanto, visto que a Apis mellifera, um inseto polinizador habitualmente utilizado, não visita a alface, existe uma necessidade para utilizar insetos polinizadores outros que não a Apis mellifera.

[007] De modo a resolver os problemas anteriormente mencionados, na alface, a utilização de vários insetos polinizadores foi examinada.

[008] Por exemplo, a JP 3635036 B2 (Documento Patentário 2) divulga um método de produção de semente de híbridos F1 de alface usando a Lasioglossum villosultum trichopse. Entretanto, a Lasioglossum villosultum

3 / 38 trichopse tem uma população pequena e mesmo que a mesma possa ser capturada, um método da sua propagação não é divulgado. Além disso, de acordo com os dados descritos no Documento Patentário 2, a eficiência de produção de semente da Lasioglossum villosultum trichopse pode ser tão pequeno quanto 330 grãos (o peso de 1000 grãos da alface é de cerca de 1 g, assim a da Lasioglossum villosultum trichopse é de cerca de 0,33 g) por planta. Portanto, a partir de uma perspectiva econômica, a Lasioglossum villosultum trichopse é considerada ser difícil de usar para a produção comercial de semente. Além disso, a Lasioglossum villosultum trichopse não está disponível do mercado e é geralmente difícil de se obter e, portanto, é considerada ser difícil de usar para a produção comercial de semente requerendo um grande número de insetos polinizadores.

[009] Além disso, a JP 4471983 B2 (Documento Patentário 3) divulga um método de produção de semente de híbridos F1 de lettus usando Lucilia sericata. Entretanto, de acordo com os resultados do teste de capacidade de polinização de Lucilia sericata divulgada no Documento Patentário 3, o número de sementes permanece em um total de 245 sementes (cerca de 0,245 g) a partir de duas plantas e como divulgado no Documento Patentário 2, a Lucilia sericata pode ser difícil de usar para a produção comercial de semente a partir de uma perspectiva econômica. Também, visto que moscas não têm um instinto de retorno, a produção de semente requer uma instalação fechada. Na produção comercial de semente, é desejável ser capaz de produzir sementes em um campo aberto com baixos custos de produção. Portanto, o método do Documento Patentário 2 pode levar a um aumento no custo.

[0010] A JP 5627894 B2 (Documento Patentário 4) divulga um método de produção de semente de híbridos F1 de alface usando Calliphora vomitaria, Calliphora erythrocephaia, ou Luciiia Caesar, que são membros da Calliphoridae na ordem Diptera. De acordo com o método do Documento

4 / 38 Patentário 4, 1,67 g a 11,25 g de híbridos F1 por planta da alface pode ser obtido.

[0011] Entretanto, como descrito no parágrafo 0040 do Documento Patentário 4, os Dípteros não são insetos que normalmente polinizam flores de alface, não é conhecido se os Dípteros também se alimentam de néctar. O Documento Patentário 4 divulga apenas que os Dípteros atuam como uma polinizadora da alface se números excessivos são introduzidos dentro de um ambiente fechado. Além disso, de acordo com o documento de exame (escrito pelos requerentes) do processo de exame do Documento Patentário 4, os Dípteros não são especificamente atraídos para as flores de alface, mas está descrito que pela introdução de uma grande população de Dípteros, pelo menos uma parte dos Dípteros estocasticamente pousaram na corola e entraram em contato com o pólen para obter polinização. Portanto, neste método, é necessário introduzir um número excessivo de dípteros, visto que a eficiência de polinização é insuficiente comparada com os insetos polinizadores que ativamente visitam flores para procurar alimento. Além disso, como no caso do Documento Patentário 3, visto que as moscas não têm a capacidade de retorno, a produção de semente requer instalação fechada. Portanto, é provável que leve a um aumento no custo de produção.

[0012] A JP 2009-539409 A (Documento Patentário 5) (WO 2007/146420 A) divulga um método de produção de semente de híbridos F1 de alface usando uma abelha Megachile, especificamente, a abelha cortadora da folha da alfafa (Megachile rotundata). Aqui, um método de atrair Megachile rotundata para visitar uma flor de alface pelo cultivo de alfafa perto da alface é divulgado. Além disso, na WO 2009/086173 a (Documento Patentário 6), como no Documento Patentário 5, um método de produção de semente de híbridos F1 de alface usando uma abelha Megachile, especificamente, a abelha cortadora da folha da alfafa é divulgado.

[0013] Entretanto, o exemplo do Documento Patentário 5 divulga

5 / 38 apenas que flores tendo 5,6 grãos em média são obtidas para 24 flores estéreis machos (parágrafo 0065 no Documento Patentário 5), 13 fêmeas de Megachile rotundata diferentes são observadas a cada 2 minutos, visitando 7,1 flores em média a cada minuto (parágrafo 0096 no Documento Patentário 5). O Documento Patentário 5 não divulga uma quantidade específica e quantitativa de semente produzida, por exemplo, o rendimento dos híbridos F1 de alface por planta e o rendimento dos híbridos F1 da alface por unidade de área de campo. O mesmo também é verdadeiro para o Documento Patentário 6.

[0014] Portanto, foi difícil considerar que aqueles versados na técnica revisando o Documento Patentário 5 e Documento Patentário 6 poderiam realizar a produção comercial de semente dos híbridos F1 de alface usando-se o método aqui divulgado. Lista da Técnica Anterior Documento Patentário Documento Patentário 1: WO 2007/049730 A Documento Patentário 2: Publicação de Patente Japonesa No. 3635036 (JP 3635036 B2) Documento Patentário 3: Publicação de Patente Japonesa No. 4471983 (JP 4471983 B2) Documento Patentário 4: Publicação de Patente Japonesa No. 5627894 (JP 5627894 B2) Documento Patentário 5: Pedido de Patente Japonês Aberto ao Público No. 2009-539409 A (JP 2009-539409 A (WO 2007/146420 A)) Documento Patentário 6: WO 2009/086173 A

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

6 / 38 Problemas a serem resolvidos pela Invenção

[0015] Um objetivo da presente invenção é prover um método mais eficientemente e economicamente praticável para produzir uma semente de planta Lactuca do que antes usando uma abelha Megachile como os meios de polinização. Meios para Resolver os Problemas

[0016] Uma abelha cortadora de folhas de alfafa é o polinizador mais amplamente usado para a produção de semente de alfafa na América do Norte (Documento de Referência 1 (W.P. KEMP et al., (2000)), p904). Além disso, a abelha cortadora de folhas de alfafa também é conhecida como uma polinizadora de safras outras que não alfafa, especificamente, Mirtilos, Borragem, Canola, Cenouras, Oxicocos, Ervilhaca de coroa, Ervilhaca peluda, Hortelã, Cebola e Ervilhaca doce (Documento de Referência 2 (Eric Mader et al., (2010)), p10, Tabela 1.2). A abelha cortadora de folhas de alfafa tem caraterísticas excelentes (univoltinismo, capacidade de visitar flor alogênica sequencial, alta eficiência de polinização, facilidade de manuseio, capacidade de fazer ninho adaptada para ambiente artificial) como uma polinizadora (Documento de Referência 3 (Matsuoka Mitsuo, “Insect Utilization Science Series 7” (1996), p99).

[0017] As abelhas, tais como a abelha cortadora de folhas de alfafa precisam coletar o pólen ou néctar para a sua progênie, resultando em altas eficiências de polinização independente da espécie. Por outro lado, as moscas precursoras apenas depositam ovos e as larvas descendentes são deixadas forragear de matérias putrefatas e semelhantes, tal que as moscas precursoras precisem apenas coletar néctar como uma fonte de nutrientes para produzir sua própria energia e ovos.

[0018] No caso das abelhas, visto que as abelhas precursoras precisam coletar e prover uma fonte de nutrientes até que a progênie se torne um adulto, uma quantidade grande de mel e pólen por progênie é requerida. Em

7 / 38 particular, no caso da abelha solitária, a procriação da geração seguinte depende do trabalho das abelhas precursoras, assim a abelha tenta obter a procriação da geração seguinte em um curto período de tempo. Por esta razão, nas abelhas, a atividade de um indivíduo é extraordinária, que mostra 20 a 80 vezes aquela das abelhas melíferas sociáveis.

[0019] Assim, a abelha cortadora de folhas de alfafa tem uma capacidade muito alta como uma polinizadora e é considerada ser uma substituição promissora para as abelhas melíferas como uma polinizadora para várias safras. Além disso, a produção de semente de alfafa da alfafa é principalmente realizada no oeste dos Estados Unidos e a abelha cortadora de folhas de alfafa é produzida no Canadá, depois importada para os Estados Unidos em quantidades grandes a cada ano. Visto que a área principal de produção de semente de alface também é no oeste dos Estados Unidos, é vantajoso em que uma grande quantidade de abelha cortadora de folhas de alfafa possa estar facilmente disponível.

[0020] A abelha cortadora de folhas de alfafa foi relatada ser uma espécie eurífaga que visita flores de uma ampla faixa de plantas Asteraceae, mas tem forte preferência pelas plantas leguminosas (Documento de Referência 4 (Dave Goulson, Annu. Rev. Ecol. Evol. Syst. 34: 1-26 (2003)), p3).

[0021] No método do Documento Patentário 5 (JP 2009-539409 A) descrito acima, a alfafa é usada como uma planta atrativa. Entretanto, visto que a abelha cortadora de folhas de alfafa prefere visitar a alfafa em detrimento da alface, quando o plantio associado de alface e alfafa é feito, a abelha cortadora de folhas de alfafa preferirá visitar a alfafa. Como um resultado, a produção de semente teve que ser limitada devido à falta de eficiência de polinização.

[0022] O Documento Patentário 5 (parágrafo 0048) divulga adicionalmente que depois da planta de alface florescer, é possível cortar fora

8 / 38 as flores da alfafa de modo que a abelha cortadora de folhas de alfafa se concentre na alface.

[0023] Entretanto, há um risco de que o corte das flores da alfafa cause os seguintes problemas sérios.

[0024] Visto que as flores de alface têm um hábito de floração especial fazendo com que as flores se abram de manhã cedo e se fechem depois de umas poucas horas, se as flores da alfafa são cortadas, depois que as flores de alface estão fechadas, todas as fontes de néctar são perdidas do campo de produção de semente. Por outro lado, se a temperatura for de cerca de 25°C ou mais alta, a abelha cortadora de folhas de alfafa tenta continuar as atividades de procurar alimento o dia todo. Por esta razão, o voo ativo para achar a fonte de mel é repetida e a maior parte dos indivíduos consomem a sua resistência física e se a fonte de mel for insuficiente, eles morem de fome durante o dia. Portanto, como descrito acima, se a fonte de néctar não estiver presente no campo de produção de semente depois do fechamento das flores da alface pelo corte das flores da alfafa, a abelha cortadora de folhas de alfafa morrerá de fome.

[0025] Além disso, cortar as flores de toda a alfafa no campo de produção de semente toda vez que a abelha cortadora de folhas de alfafa é liberada é trabalhoso e requer uma enorme quantidade de custo de mão de obra.

[0026] Como descrito acima, a alface tem um hábito de floração especial. As flores ficam abertas apenas durante umas poucas horas em cada manhã, mas como também é descrito no Documento Patentário 2 (parágrafo 006), muitos insetos polinizadores têm um padrão diurno de visita de flor que realiza a atividade de procurar alimento por um longo tempo.

[0027] Por esta razão, foi difícil realizar intensivamente a atividade de procurar alimento do inseto polinizador sobre uma planta específica durante um tempo curto durante a manhã.

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[0028] Além disso, o Documento Patentário 5 descrito acima divulga que além de usar alfafa como a planta atrativa, um extrato vegetal contendo uma composição de planta que atrai a abelha cortadora de folhas de alfafa é colocada na vicinidade da alface ou em contato com a alface. Entretanto, um tal extrato atrativo eficaz para a abelha cortadora de folhas de alfafa não é de fato relatado e não é especificamente divulgado no Documento Patentário 5. Por esta razão, foi difícil para aqueles versados na técnica obter e usar facilmente um tal extrato atrativo.

[0029] Sob estas circunstâncias, os inventores repetidamente fizeram um exame intensivo.

[0030] Os presentes inventores examinaram agora a preparação do pólen da planta Lactuca precursora e da semente da planta Lactuca precursora no campo de produção de semente da planta Lactuca quando da produção da semente de planta Lactuca e realizaram o cruzamento da planta Lactuca usando a abelha Megachile como o meio de polinização. Desta vez, de modo a prevenir uma abelha de ficar em um estado faminto quando as flores da planta Lactuca estão fechadas, uma planta de néctar auxiliar foi utilizada quando do cruzamento da planta Lactuca usando a abelha Megachile como os meios de polinização. A planta de néctar auxiliar ideal é uma espécie de planta na qual a abelha Megachile prefere visitar menos do que ou igualmente tanto quanto a planta Lactuca. Como um resultado, é possível prevenir a abelha de corte de folha de ficar em um estado de fome utilizando-se uma planta de néctar auxiliar. A produção de semente híbrida da planta Lactuca pode ser realizada com eficiência aumentada.

[0031] A presente invenção está fundamentada nos achados descritos acima.

[0032] Isto é, de acordo com a presente invenção, as seguintes invenções são providas

[0033] <1> Um método de produzir uma semente de planta Lactuca

10 / 38 compreendendo: usar uma abelha Megachile como meio de polinização; e prover a abelha Megachile com uma planta de néctar auxiliar para ter preferência em visita de flor, além de uma planta Lactuca precursora de pólen e uma planta Lactuca precursora de semente e realizar um cruzamento de uma planta Lactuca usando uma espécie de planta na qual a preferência em visita de flor é equivalente ou inferior à da planta Lactuca.

[0034] <2> O método de acordo com o <1> acima, em que a semente de planta Lactuca é uma semente de primeira geração filial (híbrido F1) da planta Lactuca.

[0035] <3> O método de acordo com o <1> ou <2> acima, em que a planta Lactuca é alface (Lactuca sativa).

[0036] <4> O método de acordo com qualquer um do <1> a <3> acima, em que a abelha Megachile é uma abelha cortadora de folhas de alfafa.

[0037] <5> O método de acordo com qualquer um do <1> a <4> acima, em que a planta de néctar auxiliar tem um hábito de floração no qual uma flor da planta de néctar auxiliar está aberta mesmo quando uma flor da planta Lactuca estiver fechada.

[0038] <6> O método de acordo com qualquer um do <1> a <5> acima, em que a planta de néctar auxiliar usada é uma ou mais dos gêneros selecionados do grupo que consiste em uma planta Anthemi, uma planta Coriandrum, uma planta Hyssopus, uma planta Monarda, uma planta Nepeta, uma planta Pentapetes, uma planta Salvia, uma planta Erigeron, uma planta Foeniculum, uma planta Melampodium, uma planta Portulaca e uma planta Torenia.

[0039] <7> O método de acordo com qualquer um do <1> a <6> acima, em que a planta de néctar auxiliar usada é uma ou mais das espécies selecionadas do grupo que consiste em camomila amarela (Anthemis tinctoria), coentro (Coriandrum sativum), hissopo (Hyssopus officinalis), bergamota (Monarda didyma), erva de gato (Nepeta cataria), flor do meio-dia

11 / 38 (Pentapetes phoenicea), sálvia azul (Salvia azurea), margacinhas (Erigeron karvinskianus), erva-doce (Foeniculum vulgare), botão de ouro (Melampodium paludosum), onze-horas (Portulaca grandiflora) e amor- perfeito-de-verão (Torenia fournieri).

[0040] <8> O método de acordo com qualquer um do <1> a <7> acima, em que a planta de néctar auxiliar usada é uma ou mais espécies selecionadas do grupo que consiste em margacinhas, erva-doce, botão de ouro, onze-horas e amor-perfeito-de-verão.

[0041] <9> O método de acordo com qualquer um do <1> a <8> acima, em que a planta de néctar auxiliar usada é uma ou duas espécies selecionadas do grupo que consiste em botão de ouro e amor-perfeito-de- verão.

[0042] <10> O método de acordo com qualquer um do <1> a <9> acima, em que a planta de néctar auxiliar usada é o botão de ouro.

[0043] <11> O método de acordo com qualquer um do <1> a <10> acima, em que a planta Lactuca precursora de pólen é uma linhagem fértil macho e a planta Lactuca precursora de semente é uma linhagem estéril macho.

[0044] <12> Um método de cruzar uma planta Lactuca usando uma abelha Megachile como meio de polinização, em que a planta de néctar auxiliar usada é preferencial para a abelha Megachile para visita em flor e é uma espécie de planta na qual a preferência em visita de flor equivalente ou inferior à da planta Lactuca.

[0045] <13> O método de acordo com o <12> acima, em que um cruzamento da planta Lactuca é para obter híbridos (F1) de uma primeira geração filial da planta Lactuca.

[0046] <14> O método de acordo com o <12> ou <13> acima, em que a planta Lactuca é alface (Lactuca sativa).

[0047] <15> O método de acordo com qualquer um do <12> a <14>

12 / 38 acima, em que a abelha Megachile é uma abelha cortadora de folhas de alfafa.

[0048] <16> O método de acordo com qualquer um do <12> a <15> acima, em que a planta de néctar auxiliar tem um hábito de floração qual uma flor da planta de néctar auxiliar está aberta quando uma flor da planta Lactuca estiver fechada. Efeitos da Invenção

[0049] De acordo com a presente invenção, a semente de planta Lactuca, que foi difícil para produzir eficientemente por um inseto polinizador pode agora ser mais eficientemente produzida produzindo-se a planta de néctar auxiliar no campo de produção de semente da planta Lactuca e usando a abelha Megachile como o meio de polinização quando comparada com a técnica relacionada. Além disso, o método da presente invenção pode significantemente reduzir o custo e mão de obra para produzir a semente de planta Lactuca.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DOS DESENHOS

[0050] A Fig. 1 é um gráfico mostrando resultados de investigação sobre uma frequência em visita de flor entre espécies diferentes de planta no Exemplo 3.

[0051] A Fig. 2 é um diagrama mostrando um arranjo de uma precursora de semente, uma precursora de pólen e uma planta de néctar auxiliar (alfafa ou botão de ouro) (planta de abelha auxiliar no diagrama) em uma estufa no Exemplo 4.

[0052] A Fig. 3 é um diagrama mostrando um arranjo de uma precursora de semente, uma precursora de pólen e uma planta de néctar auxiliar (Torenia fournieri) (planta de abelha auxiliar no diagrama) em uma estufa no Exemplo 5.

MODALIDADES DA INVENÇÃO

[0053] As modalidades da invenção serão descritas abaixo em detalhes.

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[0054] Como descrito acima, um método de produzir uma semente de planta Lactuca de acordo com a presente invenção inclui usar uma abelha Megachile como meio de polinização e prover a abelha Megachile com uma planta de néctar auxiliar para ter preferência em visita de flor, além de uma planta Lactuca precursora de pólen e uma planta Lactuca precursora de semente e realizar um cruzamento de uma planta Lactuca usando a espécie de planta que a abelha Megachile prefere de modo equivalente ou inferior à da planta Lactuca.

[0055] Na presente invenção, uma semente de planta Lactuca é produzida. Aqui, um meio de produção de semente de produzir uma semente pelo cruzamento de uma planta Lactuca que sirva como uma precursora de pólen e uma planta Lactuca que sirva como uma precursora de semente, isto é, transferir um pólen da precursora de pólen para uma precursora de semente e produzir uma semente obtida cultivando-se a precursora de semente.

[0056] Aqui, os exemplos da planta Lactuca incluem alface (Lactuca sativa), Lactuca serriola, L. aculeate, L. scarioloides, L. azerbaijanica, L. georgica, L. dregeana, L. altaica, L. saligna, L. virosa, L. tatarica, L. indica, L. debilis ou semelhantes. Além disso, a planta Lactuca também pode incluir híbridos por uma fusão de célula da alface (Lactuca sativa) com a espécie de planta Lactuca descrita acima outra que não a alface ou híbridos pela hibridização interespecífica e intergenérica. Preferivelmente, a planta Lactuca é um ou mais selecionada do grupo de espécies listadas acima e mais preferivelmente alface (Lactuca sativa).

[0057] No método da presente invenção, um inseto que visita flor é usado como meio de polinização para transportar um pólen de uma planta precursora de pólen e polinizar uma planta precursora de semente. Um inseto que visita flor, por exemplo uma abelha Megachile, que é conhecida visitar flores da planta Lactuca, é usado. A abelha Megachile não é particularmente limitada, mas especificamente, seus exemplos incluem abelha cortadora de

14 / 38 folhas de alfafa (Megachile rotundata), M. latimanus (Documento de Referência 5), M. brevis (Documento de Referência 6), M. montivaga (Documento de Referência 7), M. onobrychidis (Documento de Referência 8), M. dentitarsus (Documento de Referência 9), M. relativa (Documento de Referência 10). Estas podem ser usadas sozinhas ou em combinação de duas ou mais. A abelha Megachile é usada como o inseto que visita flor na presente invenção e é preferível porque a mesma é facilmente disponível no mercado.

[0058] A semente de planta Lactuca a ser produzida na presente invenção é preferivelmente uma semente de primeira geração filial (híbrido F1). Aqui, a primeira geração filial (F1) se refere a uma progênie de primeira geração gerada pela hibridização entre precursores tendo certos alelomorfos em homo.

[0059] Na presente invenção, a precursora de semente é uma linhagem precursora da semente produzida pelo método da presente invenção e se refere a uma planta precursora que é tratada (tal como lavagem do pólen com água) ou produzida (isto é, produzida para ter esterilidade masculina) de modo a não ser polinizada pelo pólen tendo a sua própria fertilidade. Quando a semente produzida na presente invenção é o híbrido F1, a precursora de semente é preferivelmente uma linhagem (linhagem estéril macho) que é produzida tal que pólen fértil não possa ser formado. Especificamente, por exemplo, uma linhagem tendo citoplasma estéril macho é usada como uma planta mãe e uma precursora não recorrente, uma linhagem alvo que é confirmada não ter nenhum fator genético de recuperação de fertilidade é utilizada como um precursor recorrente. Depois que a hibridização é realizada e o citoplasma da linhagem alvo é substituída com o citoplasma estéril macho, tornando deste modo possível comunicar esterilidade masculina à linhagem alvo e obter uma linhagem precursora de semente.

[0060] Além disso, na presente invenção, a “planta Lactuca precursora de semente” significa a planta Lactuca que se torna uma

15 / 38 precursora de semente. A planta Lactuca precursora de semente é preferivelmente uma linhagem estéril macho, mais preferivelmente uma linhagem de citoplasma estéril macho (CMS). Um exemplo de uma tal linhagem CMS está descrito no Documento Patentário 1.

[0061] Na presente invenção, a precursora de pólen é uma linhagem precursora das sementes produzidas pelo método da presente invenção e se refere a uma linhagem que supre pólen. Quando as sementes produzidas na presente invenção são híbridos F1, a precursora de pólen é a linhagem fértil macho.

[0062] Além disso, na presente invenção, a “planta precursora de pólen Lactuca” significa a planta Lactuca que se torna a precursora de pólen. A planta precursora de pólen Lactuca é preferivelmente a linhagem fértil macho.

[0063] Usualmente, no campo de produção de semente, a precursora de pólen (preferivelmente uma linhagem fértil macho) e a precursora de semente (preferivelmente um linhagem estéril macho) são preferivelmente plantadas em uma razão 1:1 de fileiras alternadas. Isto diferiria dependendo da razão da precursora de pólen e da precursora de semente necessárias de modo a ter polinização uniforme da precursora de pólen.

[0064] Na presente invenção, além da planta precursora de pólen e da planta precursora de semente, a planta de néctar auxiliar é usada.

[0065] As flores da planta Lactuca, incluindo aquelas de alface, têm um hábito de floração no qual as flores abrem de manhã cedo e fecham depois de várias horas. Por esta razão, a planta de néctar auxiliar é usada na presente invenção para prevenir as abelhas polinizadoras de passar fome devido à falta de uma fonte de néctar quando as flores da alface estão fechadas. A planta de néctar auxiliar é preparada em torno de uma caixa de nidificação de abelhas ou em torno da precursora de pólen e/ou planta Lactuca precursora de semente e é usada como uma fonte de néctar.

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[0066] Por esta razão, na presente invenção, a planta de néctar auxiliar é uma espécie de planta na qual a abelha Megachile visitará em flor e prefere visitar igualmente o mesmo ou menos do que aquela planta Lactuca. Mesmo se a preferência da planta de néctar auxiliar for equivalente àquela da planta Lactuca, se, quando as flores estiverem abertas, a planta Lactuca seria uma fonte de néctar, é possível produzir eficazmente a semente de planta Lactuca usando a abelha Megachile. O método, mais tarde descrito no Exemplo 1, é um exemplo que pode ser utilizado para confirmar se a preferência em visita de flor pelas abelhas é equivalente a ou inferior à da planta Lactuca. Preferivelmente, a planta de néctar auxiliar é uma espécie de planta preferida pela abelha cortadora de folhas de alfafa e cuja preferência em visita de flor é equivalente a ou menor do que aquela da alface.

[0067] Mais preferivelmente, a planta de néctar auxiliar é uma espécie de planta preferida pela abelha Megachile e que a preferência em visita de flor é menor do que aquela da planta Lactuca e mais preferivelmente uma espécie de planta preferida pela abelha cortadora de folhas de alfafa e que a preferência em visita de flor é menor do que aquela da alface.

[0068] Idealmente, a espécie de planta escolhida para a planta de néctar auxiliar, além da preferência em visita de flor mencionada acima, preferivelmente teria um hábito de floração oposta àquele da alface. Especificamente, a espécie de planta escolhida para a planta de néctar auxiliar preferivelmente tem a sustentabilidade de floração excelente como mais tarde descrito no Exemplo 1. Além disso, a espécie de planta escolhida para a planta de néctar auxiliar é preferivelmente uma que tivesse excelente tolerância ao calor. A tolerância ao calor aqui mencionada pode ser avaliada, por exemplo, pelo método descrito mais tarde no Exemplo 1.

[0069] Na presente invenção, as plantas adequadas para serem a planta de néctar auxiliar não são particularmente limitadas, mas um exemplo da mesma inclui uma planta Anthemi, uma planta Coriandrum, uma planta

17 / 38 Hyssopus, uma planta Monarda, uma planta Nepeta, uma planta Pentapetes, uma planta Salvia, uma planta Erigeron, uma planta Foeniculum, uma planta Melampodium, uma planta Portulaca e uma planta Torenia. De acordo com uma modalidade preferida da presente invenção, uma ou mais espécies selecionadas de plantas dos gêneros listados acima podem ser usadas como a planta de néctar auxiliar. Na presente invenção, as plantas mais preferíveis dos gêneros listados são aqueles tendo um hábito de floração oposta àquele da alface, além da preferência em visita de flor mencionada acima nas plantas destes gêneros.

[0070] De acordo com uma modalidade adicional preferida da presente invenção, das plantas que são adequadas para a planta de néctar auxiliar, uma ou mais selecionadas da planta Erigeron, da planta Foeniculum, da planta Melampodium, da planta Portulaca e da planta Torenia podem ser usadas, mais preferivelmente, uma ou duas espécies selecionadas do grupo que consiste na planta Melampodium e na planta Torenia são usadas e o mais preferivelmente, a planta Melampodium é usada.

[0071] De acordo com o aspecto preferido da presente invenção, os exemplos das espécies de planta que são adequadas para a planta de néctar auxiliar incluem camomila amarela (Anthemis tinctoria), coentro (Coriandrum sativum), hissopo (Hyssopus officinalis), bergamota (Monarda didyma), erva de gato (Nepeta cataria), flor do meio-dia (Pentapetes phoenicea), sálvia azul (Salvia azurea), margacinhas (Erigeron karvinskianus), erva-doce (Foeniculum vulgare), botão de ouro (Melampodium paludosum), onze-horas (Portulaca grandiflora) e amor- perfeito-de-verão (Torenia fournieri). De acordo com uma modalidade preferida da presente invenção, uma ou mais espécies selecionadas das espécies de planta listadas podem ser usadas como a planta de néctar auxiliar.

[0072] De acordo com uma modalidade mais preferida da presente invenção, no método da presente invenção, uma ou mais espécies

18 / 38 selecionadas do grupo que consiste em margacinhas, erva-doce, botão de ouro, onze-horas e amor-perfeito-de-verão são usadas como a planta de néctar auxiliar. Mais preferivelmente, uma ou duas espécies selecionadas do grupo que consiste em botão de ouro e amor-perfeito-de-verão são usadas como a planta de néctar auxiliar e de modo particularmente preferível, botão de ouro é usado.

[0073] É preferencial para apropriadamente ajustar o tempo de plantação da planta de néctar auxiliar para se igualar com o tempo de floração da planta Lactuca de acordo com a propriedade de floração. Por exemplo, o botão de ouro e o amor-perfeito-de-verão desabrocham em flor cerca de 1,5 mês depois de serem semeadas na primavera. Ambas as plantas têm uma propriedade de floração contínua e continuarão a desabrochar até o final do outono. Neste caso, as plantas não são requeridas se igualar ao tempo de floração da planta Lactuca, mas o trabalho pode ser realizado eficientemente semeando-se e plantando-se a planta de néctar auxiliar simultaneamente com a planta Lactuca. Portanto, é preferencial semear e plantar o botão de ouro e o amor-perfeito-de-verão simultaneamente com a planta Lactuca. Por outro lado, quando uma espécie de planta tendo propriedade de floração contínua baixa é usada como a planta de néctar auxiliar, é necessário ajustar apropriadamente o tempo de plantio para igualar o tempo de floração da planta Lactuca de acordo com a propriedade de floração.

[0074] A razão de número de plantio da planta de néctar auxiliar e da planta Lactuca não é particularmente limitado, mas pode ser opcionalmente ajustado de acordo com o tipo de plantas de néctar auxiliares e o ambiente de cultivo. Por exemplo, a razão do número de plantio está na faixa de planta Lactuca : planta de néctar auxiliar = 2 : 1 a 20 : 1, preferivelmente, na range da planta Lactuca : planta de néctar auxiliar = 2 : 1 a 4 : 1 e mais preferivelmente, está na faixa da planta Lactuca : planta de néctar auxiliar = cerca de 5 : 2.

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[0075] É preferível que o local de plantio da planta de néctar auxiliar esteja em torno de uma colmeia que é o meio de polinização, mas o local de plantio da planta de néctar auxiliar pode ser distribuído no campo ou em torno do campo.

[0076] A atividade de visita em flor ativa pela abelha Megachile (por exemplo, a abelha cortadora da folha da alfafa) usualmente requer uma temperatura de 25°C ou mais alta. Por esta razão, é preferencial cultivar a planta Lactuca usada para a produção de semente no ambiente que a temperatura do tempo de floração seja 25°C ou mais alta durante o dia.

[0077] A abelha Megachile (por exemplo, a abelha cortadora da folha da alfafa) tem capacidade de retorno e, portanto, pode ser usada mesmo no campo aberto e semelhantes, além de uma gaiola de rede da instalação fechada. Isto é, a presente invenção pode ser praticada ainda na instalação em campo de qualquer um de aberto ou fechado. Portanto, em um ambiente onde uma planta Lactuca que é provavelmente a causa de hibridização não intencional e indesejável não existe em torno, o método é preferivelmente usado no campo aberto onde o custo de produção é baixo.

[0078] Como um método de incubar e liberar uma abelha Megachile e semelhantes, os métodos convencionais conhecidos por aqueles versados na técnica podem ser usados. Por exemplo, o Documento de Referência 3 pode servir como referência como apropriado. Além disso, o método de incubar e liberar a abelha cortadora de folhas de alfafa e semelhantes pode ser praticado de acordo com o método de produção convencional de semente de alfafa.

[0079] Quando a abelha Megachile (por exemplo, a abelha cortadora da folha da alfafa) é usada para a produção de semente da planta Lactuca, é preferencial liberar a abelha Megachile em um intervalo de 1 a 2 semanas.

[0080] Além disso, a densidade de liberação preferida da abelha Megachile (por exemplo, da abelha cortadora da folha da alfafa) é preferivelmente 5 ou mais por liberação por planta, mas a densidade de

20 / 38 liberação depende do ambiente de cultivo assim como da diferença na linhagem da planta Lactuca usada e portanto é preferencial fazer ajustes apropriados em consideração também do custo.

[0081] A liberação da abelha Megachile (por exemplo, a abelha cortadora da folha da alfafa) é preferivelmente praticada na tarde do dia anterior ou de manhã cedo antes do nascer do sol. Visto que a precursora de pólen da planta Lactuca interrompe a floração quando a semente é formada, é preferencial forçar a precursora de pólen a florescer continuamente e apropriadamente encurtar a precursora de pólen de modo que o pólen possa ser suprido durante um período longo de tempo. Documento de Referência

[0082] [Documento de Referência 1] W. P. KEMP et al., “Development and Emergence of the Alfalfa Pollinator Megachile rotundata (Hymenoptera: Megachilidae)”, Annals of the Entomological Society of America, 93(4):904-911(2000) [Documento de Referência 2] Eric Mader et al., “Managing Alternative Pollinators: A Handbook for Beekeepers, Growers, and Conservationists”, SARE Handbook 11 (2010), p10 [Documento de Referência 3] Matsuka Mitsuo, “Insect Utilization Science Series 7 Pollinator”, Primeira Edição, Science House, Inc., fevereiro de 1996, p. 97-112 [Documento de Referência 4] Dave Goulson, “EFFECTS OF INTRODUCED BEES ON NATIVE ECOSYSTEMS”, Annu. Rev. Ecol. Evol. Syst. 34:1-26 (2003), p6, [Documento de Referência 5] “American Museum of Natural History, Bee Specimen Record database”, ID_parent AMNH_BEE00026543, [on line], American Museum of Natural History, [Pesquisa em 6 de novembro de 2017], Internet (http://www.discoverlife.org/mp/20l?id=AMNH_BEE00026543;AMNH_B

21 / 38 EE00026532;AMNH_BEE00026530;AMNH_BEE00107964) [Documento de Referência 6] “American Museum of Natural History, Bee Specimen Record database”, ID_parent AMNH_BEE00015546, [on line], American Museum of Natural History, [Pesquisa em 6 de novembro de 2017], Internet (http://www.discoverlife.org/mp/20l?id=AMNH_BEE00015546;AMNH_B EE00015755) [Documento de Referência 7] John Pickering, “DISCOVER LIFE”, [on line], [Pesquisa em 6 de novembro de 2017], Internet (http://www.discoverlife.org/mp/20q ) [Documento de Referência 8] “American Museum of Natural History, Bee Specimen Record database”, ID_parent AMNH_BEE00220721, [on line], American Museum of Natural History, [Pesquisa em 6 de novembro de 2017], Internet (http://www.discoverlife.org/mp/20l?id=AMNH_BEE00220721;AMNH_B EE00015741) [Documento de Referência 9] “Bee Biology and Lineatics Laboratory database”, ID_parent BBSL200815, [on line], Bee Biology and Lineatics Laboratory, [Pesquisa em 6 de novembro de 2017], Internet (http://www.discoverlife.org/mp/20l?id = BBSL200815) [Documento de Referência 10] “American Museum of Natural History, Bee Specimen Record database”, ID_parent AMNH_BEE00107046, [on line], American Museum of Natural History, [Pesquisa em 6 de novembro de 2017], Internet (http://www.discoverlife.org/mp/20l?id=AMNH_BEE00107046;AMNH_B EE00107116)

EXEMPLOS

[0083] Daqui em diante, a presente invenção será descrita em mais detalhes com referência aos seguintes exemplos, mas a presente invenção não

22 / 38 é de modo algum limitada por estes exemplos. Exemplo 1: Exame de planta de néctar auxiliar

[0084] Na presente invenção, características importantes como uma 2wplanta de néctar auxiliar são que uma abelha Megachile tem preferência em visita de flor e a preferência em visita de flor é equivalente ou mais baixa do que aquela da planta Lactuca. Portanto, as espécies de planta tendo tais características foram selecionadas e examinadas.

[0085] Em um teste, a abelha cortadora de folhas de alfafa foi usada como a abelha Megachile e a alface foi usada como a planta Lactuca.

[0086] Uma área de produção de semente de alface primária é a San Joaquin Valley na Califórnia, USA que é um clima do interior quente e seco. Na produção de semente em San Joaquin Valley, uma planta de néctar auxiliar precisa ter tolerância ao calor porque uma temperatura máxima na qual a alface floresce e dá semente pode ser 40°C ou mais alta. Geralmente, uma temperatura de cultivo ideal para a alface está em torno de 20°C. Entretanto, sob o ambiente de temperatura alta, com o propósito de produzir sementes livre de vírus, as sementes são produzidas em ambiente de alta temperatura porque afídeos que transmitem este vírus para a alface não pode sobreviver. A alface tem baixa tolerância ao calor na presença de folhas na forma de cabeça, mas a alface tem alta tolerância ao calor removendo-se apropriadamente as folhas na forma de cabeça e mostra que a alface tem tolerância ao calor extremamente alta quando a mesma muda para a fase reprodutiva.

[0087] O período de floração da alface varia de um a dois meses. Visto que é necessário para a planta de néctar auxiliar florescer durante este período, a planta de néctar auxiliar preferivelmente é uma espécie de planta tendo uma propriedade de floração contínua. Além disso, se a área de cultivo da planta de néctar auxiliar for ampla, visto que a área de cultivo da alface é limitada e o rendimento de produção de semente da alface por área unitária é

23 / 38 diminuída, espécie de planta multifloral tendo muitas flores é preferível.

[0088] De modo a achar espécies de planta que sejam candidatas para uma planta de néctar auxiliar na produção de semente de híbridos F1 de alface, 57 espécies de planta possuindo tolerância ao calor relativamente alta e florações na estação do verão foram selecionadas e as suas características foram avaliadas.

[0089] A alface e outras espécies de planta que sejam candidatas para a fonte de néctar auxiliar começaram a ser semeadas e produzidas no início de maio usando uma estufa de vidro não aquecida na cidade de Kakegawa, prefeitura de Shizuoka.

[0090] Cada espécie de planta foi plantada em um vaso plástico tendo um diâmetro de 15 cm como uma ou duas plantas em um tempo adequado. Cada planta foi cultivada em uma temperatura de 35°C que foi mais alta do que a temperatura de cultivo usual de modo a selecionar a espécie de planta que suportaria a alta temperatura da área principal de produção de semente. De fato, rem um dia claro durante julho a agosto, a temperatura na estuda frequentemente excedeu 40°C e a temperatura foi consideravelmente alta. Visto que o cultivo da alface depende do método real de produção de semente, uma operação de remover as folhas na forma de cabeça foi realizada até o pendoamento.

[0091] Portanto, o seguinte teste foi realizado para avaliar a preferência de procurar alimento em flor de uma abelha cortadora de folhas de alfafa.

[0092] Especificamente, o tempo a partir de um início de visita em flor da abelha cortadora de folhas de alfafa até o tempo de visita em flor de uma outra espécie de planta foi investigado. Este foi um critério para a seleção da espécie ideal de planta de néctar auxiliar. Avaliação de preferência em visita de flor

[0093] Cinquenta e sete tipos de plantas selecionadas foram

24 / 38 cultivados na mesma estufa e colocadas sobre uma prateleira de cultivo em intervalos de 30 cm. Um vaso da espécie de planta a ser investigada foi transferido para uma prateleira de cultivo separada a uma distância de 1 metro e o comportamento de visita em flor da abelha cortadora de folhas de alfafa foi investigado. Cerca de 300 abelhas cortadoras de folha de alfafa foram liberadas em uma estufa de vidro e a visita em flor foi investigada cinco vezes por espécie de planta para calcular um tempo médio de visita em flor.

[0094] A preferência em visita de flor foi avaliada dividindo-se o tempo médio de visita em flor a partir do início da visita em flor até o tempo para visita em flor para outra espécie de planta dentro da seguinte classificação de cinco estágios. Classificação (tempo médio de visita em flor)

[0095] 1: Nenhuma visita em flor, 2: 1 segundo ou mais e menos do que 15 segundos, 3: 15 segundos ou mais e menos do que 30 segundos, 4: 30 segundos ou mais e menos do que 60 segundos, 5: 60 segundos ou mais

[0096] Os resultados são mostrados na Tabela 1.

[0097] O “-” na tabela indica que nenhuma floração da espécie de planta foi observada no tempo de floração da alface, ou nenhuma floração foi observada porque a espécie de planta morre durante o cultivo.

[0098] Como um resultado de observar o comportamento da abelha cortadora de folhas de alfafa no tempo de visita em flor, foi observado que na espécie de planta tendo alta preferência em visita de flor, o tempo do início de visita em flor para transferir para uma outra espécie de planta é longo e a abelha cortadora de folhas de alfafa tem a tendência de visitar a mesma espécie de planta repetidamente.

[0099] A partir dos resultados de avaliação da preferência em visita de flor na Tabela 1, foi confirmado que a abelha cortadora de folhas de alfafa

25 / 38 visita 30 das 33 espécies de planta que atingiram floração e tem a preferência em visita de flor para uma ampla faixa de espécies de planta.

[00100] Como um resultado, uma classificação da preferência em visita de flor da alface foi 3.

[00101] As sete espécies de planta consideradas ter preferência em visita de flor pela abelha cortadora de folhas de alfafa equivalente àquela da alface foram camomila amarela, coentro, hissopo, bergamota, erva de gato, flor do meio-dia e sálvia azul, que têm uma classificação de visita em flor de

3.

[00102] As cinco espécies de planta consideradas ter preferência em visita de flor pela abelha cortadora de folhas de alfafa mais baixas do que a de alface foram margacinhas, erva-doce, botão de ouro, onze-horas e amor- perfeito-de-verão, que têm uma classificação de visita em flor de 2. Avaliação de tolerância ao calor

[00103] Além da avaliação mencionada acima de preferência em visita de flor, tolerância ao calor foi avaliada.

[00104] O teste de tolerância ao calor foi avaliado realizando-se o cultivo em uma estufa ajustada a 35°C e visualmente observando a situação de desenvolvimento de cada espécie de planta no tempo de floração da alface. Especificamente, as espécies de planta que morreram foram classificadas 1 (morte da planta), as espécies de planta que têm um desenvolvimento fraco quando comparadas com um desenvolvimento normal sob ambiente de temperatura apropriada foram classificadas 2 (tolerância fraca ao calor) e espécie de planta que têm um desenvolvimento equivalente quando comparadas com o desenvolvimento normal sob o ambiente em temperatura apropriada foram classificadas 3 (tolerância forte ao calor).

[00105] Os resultados são mostrados na Tabela 1.

[00106] Neste teste, visto que a espécie de planta tendo tolerância ao calor e floração relativamente altas durante a estação de verão foram

26 / 38 selecionados como candidatos em ambiente de temperatura extremamente alta, como mostrado nos resultados de avaliação da tolerância ao calor mostrados na Tabela 1, 21 espécies de plantas morreram (uma classificação de tolerância ao calor é 1) e 20 espécies de plantas tornaram-se falhas no desenvolvimento devido à alta temperatura (uma classificação de tolerância ao calor é 2).

[00107] Neste teste, a classificação à tolerância ao calor da alface foi 3 e nenhuma falha no desenvolvimento foi observada. A alface pendoada teve tolerância ao calor extremamente alta, tal que para ser considerada uma planta de néctar auxiliar é requerido que a mesma também tenha a mesma tolerância ao calor.

[00108] Portanto, considerando a tolerância ao calor junto com os resultados da avaliação de floração, as margacinhas, erva-doce e onze-horas têm tolerância ao calor um tanto menor, tal que foi considerado que o botão de ouro e o amor-perfeito-de-verão são um candidato mais promissor como a planta de néctar auxiliar. Avaliação de sustentabilidade de floração

[00109] Um teste de avaliação para a sustentabilidade de floração também foi conduzido junto com um teste de avaliação para preferência em visita de flor descrito acima.

[00110] Especificamente, a sustentabilidade de floração foi avaliada dividindo-se um período de um início de floração a um final de floração nos seguintes cinco estágios. Classificação (Período a partir do início de floração até o final de floração)

[00111] 1: Menos do que 2 semanas, 2: 2 semanas ou mais e menos do que 1 mês, 3: 1 mês ou mais e menos do que 2 meses, 4: 2 meses ou mais e menos do que 3 meses, 5: 3 meses ou mais

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[00112] Os resultados são mostrados na Tabela 1.

[00113] Na avaliação da sustentabilidade de floração, seria confirmado que a alface começou a florir a partir de meados de agosto, ao passo que o botão de ouro começou a florir a partir do final de junho, o amor-perfeito-de- verão começou a florir a partir do começo de julho e ambas as espécies continuamente floriram até que a colheita de híbridos F1 de alface fosse completada e a sustentabilidade de floração não teve nenhum problema.

[00114] A partir dos resultados acima, margacinhas, erva-doce e onze- horas poderiam ser usadas como a planta de néctar auxiliar se as áreas de produção de semente não estivessem sob ambiente de alta temperatura, mas foi concluído que o botão de ouro e amor-perfeito-de-verão foram mais promissores como a planta de néctar auxiliar sob ambientes de alta temperatura como as áreas de produção de semente principais correntes para alface. Tabela 1A Tabela 1: Avaliação sobre características de planta de néctar auxiliar No. Nome da espécie Nome botânico Preferência na Tolerância ao Sustentabilida visita em flor calor de de floração (1-5) (1-3) (1-5) 1 Alface Lactuca sativa 3 3 3 2 Espirradeira Achillea ptarmica 1 3 3 3 Anêmona alta Anemone virginiana - 1 - 4 Camomila amarela Anthemis tinctoria 3 2 3 5 Borragem Borago officinallis 5 3 3 6 Calaminta menor Calamintha nepetoides 4 3 2 7 Áster chinesa Callistephus chinensis 5 2 2 8 Campânula rampion Campanula Rapunciloides - 1 - 9 Celósia crista de galo Celosia argentea 5 2 5 10 Valeriana vermelha Centranthus ruber - 1 - 11 Flor aranha Cleome hassleriana - 1 - 12 Campainha Convolvulus cneorum - 1 - 13 Coentro Coriandrum sativum 3 2 2 14 Margarida de Dorotheanthus - 1 - Livingstone bellidiformis 15 Equinácea Echinacea purpurea 4 3 3 16 Margacinhas Erigeron karvinskianus 2 2 2 17 Flor de névoa Eupatorium coelestinum - 1 - 18 Trigo sarraceno Fagopyrum esculentum 5 2 4 19 Erva-doce Foeniculum vulgare 2 2 3 20 Vela-Branca-da- Gaura lindheimeri 4 2 2 pradaria 21 Perpétua Gomphrena globosa 4 2 5 22 Girassol Helianthus annuus 5 3 1

28 / 38 23 Erva de São João Hypericum perforatum - 1 - 24 Hissopo Hyssopus officinalis 3 2 3 25 Iberis Iberis sempervirens 5 1 2 26 Cacto-margarida Lampranthus spectabilis - 1 - 27 Tree marrow Lavatera thuringiaca - 2 2 28 Boca-de-leão Linaria purpurea - 2 - espigado 29 Grama carpete Lippia repens - 3 - 30 Robin irregular Lychnis ftos-cucuii - 1 - 31 Alfafa Medicago sativa 4 3 2 32 Botão de ouro Melampodium paludosum 2 3 5 33 Poejo Mentha pulegium 4 2 4 34 Bergamota Monarda didyma 3 2 2 35 Nêveda Nepeta x faassenii 4 2 4 36 Erva-dos-gatos Nepeta cataria 3 3 5 37 Cup flower Nierembergia caerutea 1 2 4 38 Manjerona Origanum majorana 5 3 4 Tabela 1B No. Nome da espécie Nome botânico Preferência na Tolerância ao Sustentabilida visita em flor calor de de floração (1-5) (1-3) (1-5) 39 Estrela do sul Oxypetatum coeruleum - 1 - 40 Beardtongue Penstemon digitalis - 1 - 41 Flor do meio-dia Pentapetes phoenicea 3 2 2 42 Flox rastejante Phlox stotonifera - 1 - 43 Caucasian crossword Phuopsis stylosa - 1 - 44 Onze-horas Portulaca grandiflora 2 2 5 45 Potentilha alpina Potentilla crantzii - 1 - 46 Salvia azul Salvia azurea 3 2 2 47 Salvia cereja Salvia microphylla - 1 - 48 Salvia noite de maio Salvia nemorosa 4 3 2 49 Escabiosa Scabiosa columbaria - 1 - 50 Calêndula Tagetes patula 1 3 5 51 Tansy Branco Tanacetum niveum - 1 - 52 Tomilho comum Thymus vulgaris 4 2 3 53 Amor-perfeito-de- Torenia fournieri 2 3 5 verão 54 Trevo Branco Trifolium repens - 3 - 55 Verbena púrpura Verbena bonariensis 4 3 3 56 Verbena azul Verbena hastata - 1 - 57 Verônica da folha Veronica longifolia - 1 - larga Exemplo 2: Investigação da resistência à fome da abelha cortadora de folhas de alfafa

[00115] Visto que a alface teve um hábito de floração especial no qual ela floresce cedo pela manhã e está fechada depois de diversas horas, quando a abelha cortadora de folhas de alfafa é liberada no campo de produção de semente de alface, uma fonte de néctar é perdida depois que as flores da alface fecham. A abelha cortadora de folhas de alfafa tem a propriedade de

29 / 38 ativamente continuar a atividade de procurar alimento se a temperatura for de 25°C ou mais alta e o tempo estiver claro.

[00116] Portanto, o efeito da perda da fonte de néctar, isto é, a resistência à fome da abelha cortadora de folhas de alfafa foi avaliada.

[00117] O teste foi realizado como segue.

[00118] Oito vasos de alface que é cultivada em vasos No 10, respectivamente, (cerca de 30 cm no diâmetro) e está na estação de floração foram colocadas na estufa de vidro na cidade de Kakegawa, prefeitura de Shizuoka e apenas 4 vasos de botão de ouro foram colocados em uma estufa de vidro. Uma estufa de vidro na qual o botão de ouro não é colocado foi marcada como área de teste A e uma estufa de vidro na qual o botão de ouro é colocado foi marcada como área de teste B.

[00119] Cerca de 50 abelhas cortadoras de folhas de alfafa foram introduzidas dentro de cada estufa de vidro na tarde do dia antes da investigação e o número de insetos visitando em flores da abelha cortadora de folhas de alfafa foi investigada.

[00120] A investigação do número de insetos visitando flores foi feita pela manhã no tempo da floração da alface e o número de abelhas cortadoras de folhas de alfafa visitando flores de 8 vasos de alface foi visualmente contado. Isto foi repetido três vezes em intervalos de cerca de 5 minutos.

[00121] Como o número de insetos visitando em flores, uma média de insetos visitando em flor de abelha cortadora de folhas de alfafa visitando a alface foi obtida.

[00122] Os resultados são mostrados na Tabela 2. Tabela 2 Tabela 2: Investigação sobre a resistência à fome de abelha cortadora de folhas de alfafa Área de Planta de néctar Número de insetos que visitam em flor teste auxiliar Primeiro dia Segundo dia Terceiro dia Quarto dia Quinto dia A Nenhuma 28,0 3,7 2,0 0,0 0,0 B Botão de ouro 25,7 23,0 18,0 14,7 19,3

30 / 38

[00123] Durante o período de teste, as flores da alface abriram em torno das 7 da manhã e fecharam em torno das 9 da manhã.

[00124] O número de insetos visitando as flores da abelha cortadora de folhas de alfafa na manhã do primeiro dia (o dia depois que a abelha cortadora de folhas de alfafa foi introduzida) foi 28,0 na área de teste A e 25,7 na área de teste B, o que não foi uma diferença significante.

[00125] No segundo dia, o número de insetos visitando as flores da abelha cortadora de folhas de alfafa foi 3,7 na área de teste A e 23,0 na área de teste B, que foi uma diferença significante.

[00126] Na área de teste A, a maior parte das abelhas cortadoras de folhas de alfafa consumiram a sua resistência física e passaram fome até a morte ou perderam a sua capacidade de visita em flor porque as fontes de néctar foram perdidas da estufa depois que as flores da alface foram fechadas. Na área de teste A, o número de abelhas cortadoras de folhas de alfafa foi 2 no terceiro dia e nenhuma visita em flor foi observada depois do quarto dia e todas as abelhas cortadoras de folhas de alfafa morreram de fome.

[00127] Na área de teste B, embora o número de insetos visitando flores tende a ser diminuído, no quinto dia, a visita em flor de cerca de 20 abelhas cortadoras de folhas de alfafa foi observada e 20 abelhas cortadoras de folhas de alfafas foram acomodadas em uma estufa de vidro e atividade de polinização estável foi observada.

[00128] Durante o período de teste, por causa do bom tempo, a atividade da abelha cortadora de folhas de alfafa começou em torno das 7 da manhã e continuou até em torno das 4 da tarde. Isto é, foi considerado que a abelha cortadora de folhas de alfafa perdeu uma fonte de néctar na área de teste A durante cerca de 7 horas de 9 da manhã até as 4 da tarde.

[00129] A partir dos resultados acima, foi considerado que a abelha cortadora de folhas de alfafa consumiu a sua resistência física durante as 7 horas quando a fonte de néctar foi perdida e morreram de fome ou perderam a

31 / 38 reserva de energia de visita em flor, porque as flores da alface foram fechadas e a atividade de procura alimento continuou em um ambiente onde não havia nenhuma fonte de néctar. Portanto, como descrito no Documento Patentário 5 (parágrafo 0048), o corte das flores da alfafa de modo a concentrar a abelha cortadora de folhas de alfafa na alface foi considerado ser um fator importante de diminuir a polinização do dia seguinte da abelha cortadora de folhas de alfafa.

[00130] Por outro lado, foi confirmado que quando a planta de néctar auxiliar foi presente, mesmo depois que as flores da alface foram fechadas, a atividade normal de procurar alimento usando a fonte de néctar auxiliar das abelhas cortadoras das folhas de alfafa foi observado até o retorno em torno das 4 da manhã. A fome devido à perda da fonte de néctar poderia ser prevenida e a atividade de polinização do dia seguinte poderia ser continuada. Exemplo 3: Investigação da frequência da visita em flor pela diferença na espécie de planta

[00131] A atividade de procurar alimento da abelha cortadora de folhas de alfafa, isto é, a frequência da visita em flor foi investigada quando a alface, botão de ouro e amor-perfeito-de-verão foram colocados na mesma estufa de vidro.

[00132] O teste foi realizado como segue.

[00133] Oito potes de alface, 2 potes de botão de ouro e 2 potes de amor-perfeito-de-verão, que foram cada cultivados em vaso No 10 e no tempo da estação de floração foram colocados em uma estufa de vidro na cidade de Kakegawa, prefeitura de Shizuoka.

[00134] Cerca de 100 das abelhas cortadoras de folhas de alfafa foram introduzidas. O ajuste da temperatura da estufa foi 35°C, que é próxima da temperatura do local de produção principal de semente.

[00135] No teste, o número (VN) de abelhas cortadoras de folhas de alfafa que visitaram em flores e a taxa de ocupação (VS) de abelha cortadora

32 / 38 de folhas de alfafa que visitou em flores foram determinadas.

[00136] Os resultados foram mostrados na Tabela 3 e Fig. 1.

[00137] A Tabela 3 mostra os resultados de investigação da frequência de visita em flor entre espécies de planta diferentes e os resultados são mostrados na Fig. 1 em um gráfico. Tabela 3 Tabela 3: Investigação sobre a frequência de visita em flor entre espécies de planta diferentes Amor-perfeito-de- Soma da Alface Botão de ouro verão frequência de visita em flor da Tempo abelha cortadora

VN VS VN VS VN VS de folhas de alfafa 8:00 10 91% 0 0% 1 9% 11 8:05 13 87% 0 0% 2 13% 15 8:10 15 83% 1 6% 2 11% 18 8:15 12 75% 1 6% 3 19% 16 8:20 15 88% 2 12% 0 0% 17 8:25 21 91% 1 4% 1 4% 23 8:30 17 89% 0 0% 2 11% 19 8:35 13 76% 2 12% 2 12% 17 8:40 11 65% 3 18% 3 18% 17 8:45 13 62% 5 24% 3 14% 21 8:50 10 67% 3 20% 2 13% 15 8:55 9 45% 8 40% 3 15% 20 9:00 3 18% 11 65% 3 18% 17 9:05 3 23% 8 62% 2 15% 13 9:10 2 8% 20 80% 3 12% 25 9:15 3 14% 17 77% 2 9% 22 9:20 1 5% 16 80% 3 15% 20 9:25 0 0% 19 86% 3 14% 22 9:30 0 0% 17 81% 4 19% 21 9:35 0 0% 19 86% 3 14% 22 9:40 0 0% 19 90% 2 10% 21 9:45 0 0% 16 84% 3 16% 19 9:50 0 0% 15 83% 3 17% 18 9:55 0 0% 17 85% 3 15% 20 10:00 0 0% 12 71% 5 29% 17 VN: O número de abelhas cortadoras de folhas de alfafa visitando em flor VS: Ocupação da abelha cortadora de folhas de alfafa visitando em flor

[00138] As flores da alface começaram a abrir em torno de 7 da manhã.

[00139] A investigação da atividade de procurar alimento começou a partir de 8 da manhã e a maior parte das abelhas cortadoras de folhas de alfafa visitou as flores da alface. As flores da alface começaram a fechar em torno das 8:30 da manhã.

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[00140] A frequência da visita em flor (isto é, ocupação de visita em flor (VS)) da abelha cortadora de folhas de alfafa para o botão de ouro foi gradualmente aumentada em torno das 8:35 da manhã no que as flores da alface começaram a ser fechadas e a frequência da visita em flor da alface e do botão de ouro foram invertidas às 8:55 da manhã. Neste tempo, a maioria das flores de alface foram em um estado fechado e foi difícil para a abelha cortadora de folhas de alfafa forragear na alface. Todas as flores da alface foram completamente fechadas às 9:25 da manhã e a maior parte das abelhas cortadoras de folhas de alfafa visitou o botão de ouro. Neste tempo, a frequência da visita em flor para o amor-perfeito-de-verão foi suprimida para 10% ou menos. A razão foi que a preferência em visita de flor da abelha cortadora de folhas de alfafa para o botão de ouro foi mais alta do que aquela do amor-perfeito-de-verão e mais baixa do que aquela da alface.

[00141] A partir dos resultados acima, foi confirmado que a abelha cortadora de folhas de alfafa intensivamente visita as flores da alface durante a floração da alface e intensivamente visita as flores do botão de ouro durante o tempo que a flor de alface estiver fechada. Portanto, foi considerado que o botão de ouro é a planta de néctar auxiliar ideal na produção de semente dos híbridos F1 da alface. Foi considerado que a preferência em visita de flor da abelha cortadora de folhas de alfafa torna-se alta na ordem da alface, do botão de ouro e do amor-perfeito-de-verão. A partir dos resultados deste teste, seria confirmado que a preferência em visita de flor da abelha cortadora de folhas de alfafa para o amor-perfeito-de-verão foi mais baixa do que aquela da Lactuca sativa e mostrou que o amor-perfeito-de-verão pode ser usado como a planta de néctar auxiliar quando apenas a alface e o amor-perfeito-de-verão são colocados sozinhos. Exemplo 4: Teste de produção de semente de híbrido F1 de alface usando botão de ouro como planta de néctar auxiliar

[00142] De modo a avaliar a praticabilidade de um método usando

34 / 38 botão de ouro como uma planta de néctar auxiliar na produção de semente de híbridos F1 de alface, um teste de produção de semente foi praticado usando uma estufa de vidro.

[00143] “Alface V” de uma linhagem fértil macho foi testada como uma precursora de pólen e “CMS Valface” de uma linhagem citoplásmica estéril macho foi testada como uma precursora de semente.

[00144] A alface foi semeada em bandeja de 72 células em 10 de fevereiro de 2016 na cidade de Kakegawa, prefeitura de Shizuoka e foi produzida em uma câmara de crescimento artificial ajustada a 20°C e iluminada durante 16 horas de comprimento do dia. As mudas foram transplantadas para vasos No 3 (9 cm no diâmetro) em 16 de março e continuada a ser produzida em uma estufa não aquecida. As plantas foram transplantadas para vasos No 10 em 11 de abril e cultivadas em uma estufa de vidro ajustada a 30°C. Além disso, plantas de botão de ouro e alfafa, a serem usadas como plantas de néctar auxiliares, foram semeadas, transplantadas, plantadas e cultivadas no mesmo ambiente e no mesmo método no mesmo tempo com a alface.

[00145] De modo a comparar a utilidade do botão de ouro e da alfafa como as plantas de néctar auxiliares, duas estufas que estavam no mesmo ambiente na cidade de Kakegawa, prefeitura de Shizuoka foram usadas. Em cada estufa, cinco plantas de uma precursora de pólen e 5 plantas de uma precursora de semente de alface foram colocadas em uma estufa de vidro como mostrado na Fig. 2. Quatro plantas do botão de ouro e da alfafa, respectivamente, foram colocadas nas posições de plantas de abelha auxiliares na Fig. 2 nas suas respectivas estufas.

[00146] Entretanto, visto que a alfafa é privada de energia para estabelecer sementes e é temporariamente pausado de florescer, a alfafa precisa ser podada duas semanas antes da floração da alface ser esperada florescer de modo a ser sincronizada com o tempo de floração da alface.

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[00147] A abelha cortadora de folhas de alfafa foi armazenada em um refrigerador a 4°C antes do uso e as células de folha foram transferidas para uma câmara de crescimento artificial de 30°C 23 dias antes da data de liberação e foram submetidas à incubação para emergência. A liberação foi feita três vezes em intervalos de duas semanas na tarde de 28 de junho, 14 de julho e 5 de agosto. No momento da liberação a quantidade foi ajustada para ser 200 ml (cerca de 250 abelhas) como a capacidade das células de folha.

[00148] Visto que as plantas da linhagem fértil macho são pausadas de florescer quando do estabelecimento de semente, metade das precursoras de pólen foram podadas em 27 de junho e depois as precursoras de pólen foram podadas pela metade a cada duas semanas em 11 de julho e 25 de julho e as precursoras de pólen foram forçadas a florescer continuamente.

[00149] Depois de dois meses da floração de uma primeira flor, em 25 de agosto, as sementes foram colhidas de cada planta de precursora de semente. As sementes colhidas foram processadas e um peso de semente foi medido por uma balança eletrônica para cada planta de uma precursora de semente.

[00150] Os resultados são mostrados na Tabela 4. Tabela 4 Tabela 4: Resultados de produção de semente de semente F1 de alface usando alfafa e botão de ouro como planta de néctar auxiliar Área de Planta de néctar Quantidade de produção de semente por Quantidade de produção teste auxiliar planta média de semente por (g) planta (g) 1 2 3 4 5 C Alfafa 4,6 7,1 4,3 7,3 4,2 5,5 D Botão de ouro 14,2 14,8 12,0 9,0 11,3 12,3

[00151] Na área de teste C onde a alfafa foi usada como a planta de néctar auxiliar, a quantidade de produção média de semente por planta foi 5,5 g. Na área de teste D onde a Melapodium paludosum foi usada como a planta de néctar auxiliar, a quantidade média de produção de semente por planta foi 12,3 g e 2,2 vezes quando comparada com o uso de alfafa.

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[00152] Quando a alfafa é usada como a planta de néctar auxiliar, a abelha cortadora de folhas de alfafa tem uma preferência em visita de flor muito alta para a alfafa quando comparada com a alface e mesmo se a Lactuca floresça, visto que a frequência da visita em flor para a alfafa é alta, foi considerado que uma quantidade de polinização do pólen da alface da precursora de pólen para a precursora de semente é reduzida. Por outro lado, quando a Melapodium paludosum é usada como a planta de néctar auxiliar, visto que a abelha cortadora de folhas de alfafa tem preferência em visita de flor baixa para a Melapodium paludosum quando comparada com a alface, foi considerado que a frequência da visita em flor da abelha cortadora de folhas de alfafa para a alface foi alta durante a floração da alface e a quantidade de polinização do pólen da alface da precursora de pólen para a precursora de semente foi grande. Foi considerado que visto que a abelha cortadora de folhas de alfafa visita as flores do botão de ouro e é mudada para a atividade de procurar alimento depois que as flores da alface estão fechadas, as flores do botão de ouro tiveram as funções eficazmente como a planta de néctar auxiliar.

[00153] O resultado de que a quantidade de produção de semente de híbridos F1 da alface é de duas vezes ou mais significa que usar o botão de ouro como a planta de néctar auxiliar pode reduzir o custo de produção pela metade ou menos, que é considerado que o valor de utilidade é muito alto. Além disso, uma vez que a alfafa estabeleceu semente, visto que a floração é pausada, a mesma precisa ser podada para igualar com o tempo de floração da alface, mas o botão de ouro tem uma alta propriedade de floração contínua e, portanto, não precisa ser podado. Portanto, foi considerado que o método de usar botão de ouro como uma planta de néctar auxiliar tem uma enorme vantagem em termos de redução de mão de obra. Exemplo 5: Teste de produção de semente de híbrido F1 de alface usando amor-perfeito-de-verão como planta de néctar auxiliar

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[00154] De modo a avaliar a praticabilidade de um método usando amor-perfeito-de-verão como uma planta de néctar auxiliar na produção de semente de híbridos F1 de alface, um teste de produção de semente separado foi praticado usando uma estufa de vidro.

[00155] “Alface V” de uma linhagem fértil macho foi testada como uma precursora de pólen e “CMS V alface” de uma linhagem citoplásmica estéril macho foi testada como uma precursora de semente.

[00156] A alface foi semeada em bandejas de 72 células em 16 de abril de 2017 na cidade de Kakegawa, prefeitura de Shizuoka e foi produzida em uma estufa de vidro não aquecida ajustada a 20°C.

[00157] As mudas foram transplantadas para vasos No 3 (9 cm no diâmetro) em 8 de maio e continuaram a ser produzidas em uma estufa de vidro não aquecida. As mudas foram transplantadas em vasos No 10 em 29 de maio e cultivadas em uma estufa de vidro ajustada a 30°C. Além disso, o amor-perfeito-de-verão usado como planta de néctar auxiliar foi semeado, transplantado, plantado e cultivado no mesmo ambiente e no mesmo método no mesmo tempo com a alface. De modo a investigar a utilidade do amor- perfeito-de-verão como a planta de néctar auxiliar, 5 plantas de uma precursora de pólen e 5 plantas de uma precursora de semente da alface foram colocadas em uma estufa de vidro como mostrado na Fig. 3.

[00158] Quatro plantas do amor-perfeito-de-verão foram colocadas em uma posição de uma planta de fonte de néctar na Fig. 3. Quatro vasos de amor-perfeito-de-verão foram testados para um total de oito plantas da precursora de semente e da precursora de pólen da alface. A liberação da abelha cortadora de folhas de alfafa foi feita três vezes em intervalos de duas semanas na tarde de 19 de julho, 2 de agosto e 16 de agosto. Uma quantidade liberada com o tempo foi ajustada para ser 200 ml (cerca de 250 abelhas) como a capacidade de células de folha. Visto que a alface da linhagem fértil macho é pausado de florescer quando do estabelecimento de semente, uma

38 / 38 metade das precursoras de pólen foi podada em 21 de julho e depois as precursoras de pólen foram podadas pela metade a cada duas semanas em 4 de agosto e 18 de agosto e as precursoras de pólen foram forçadas a florescer continuamente.

[00159] Depois de dois meses da floração de uma primeira flor, em 19 de setembro, as sementes foram colhidas de cada planta de uma precursora de semente. As sementes colhidas foram processadas e um peso de semente foi medido por uma balança eletrônica para cada planta de uma precursora de semente.

[00160] Os resultados são mostrados na Tabela 5. Tabela 5 Tabela 5: Resultado de produção de semente de semente de alface F1 usando amor-perfeito-de-verão como planta de néctar auxiliar Área de Planta de néctar Quantidade de produção de Quantidade de produção média de teste auxiliar semente por planta (g) semente por planta (g) 1 2 3 4 E Amor-perfeito- 4,4 10,5 11,3 9,2 8,9 de-verão

[00161] Na área de teste E onde o amor-perfeito-de-verão foi usado como a planta de néctar auxiliar, a quantidade média de produção de semente por planta foi 8,9 g e 1,6 vezes quando comparada com o uso de alfafa do Exemplo 4. Foi confirmado que comparado com o caso de usar o botão de ouro, a quantidade de produção de semente foi reduzida, mas o amor-perfeito- de-verão também pôde ser usado como a planta de néctar auxiliar.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Método para produzir uma semente de planta Lactuca, caracterizado pelo fato de que compreende usar uma abelha Megachile como meio de polinização; e prover à abelha Megachile uma planta de néctar auxiliar para ter preferência em visita de flor, além de uma planta Lactuca precursora de pólen e uma planta Lactuca precursora de semente, e para realizar um cruzamento de uma planta Lactuca, usando uma espécie de planta na qual a preferência em visita de flor é equivalente ou inferior à da planta Lactuca.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a semente da planta Lactuca é uma semente de primeira geração filial (híbrido F1) da planta Lactuca.

3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a planta Lactuca é alface (Lactuca sativa).

4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a abelha Megachile é uma abelha cortadora de folhas de alfafa.

5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a planta de néctar auxiliar tem um hábito de floração no qual uma flor da planta de néctar auxiliar está aberta mesmo quando uma flor da planta Lactuca estiver fechada.

6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a planta de néctar auxiliar usada é uma ou mais dos gêneros selecionados a partir do grupo que consiste em uma planta Anthemi, uma planta Coriandrum, uma planta Hyssopus, uma planta Monarda, uma planta Nepeta, uma planta Pentapetes, uma planta Salvia, uma planta Erigeron, uma planta Foeniculum, uma planta Melampodium, uma planta Portulaca e uma planta Torenia.

7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a

6, caracterizado pelo fato de que a planta de néctar auxiliar usada é uma ou mais das espécies selecionadas a partir do grupo que consiste em camomila amarela (Anthemis tinctoria), coentro (Coriandrum sativum), hissopo (Hyssopus officinalis), bergamota (Monarda didyma), erva de gato (Nepeta cataria), flor do meio-dia (Pentapetes phoenicea), sálvia azul (Salvia azurea), margacinhas (Erigeron karvinskianus), erva-doce (Foeniculum vulgare), botão de ouro (Melampodium paludosum), onze-horas (Portulaca grandiflora) e amor-perfeito-de-verão (Torenia fournieri).

8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a planta de néctar auxiliar usada é uma ou mais das espécies selecionadas a partir do grupo que consiste em margacinhas, erva-doce, botão de ouro, onze-horas e amor-perfeito-de-verão.

9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que a planta de néctar auxiliar usada é uma ou duas das espécies selecionadas a partir do grupo que consiste em botão de ouro e amor-perfeito-de-verão.

10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que a planta de néctar auxiliar usada é botão de ouro.

11. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que a planta Lactuca precursora de pólen é uma linhagem fértil macho e a planta Lactuca precursora de semente é uma linhagem estéril macho.

12. Método para cruzamento de uma planta Lactuca usando uma abelha Megachile como meio de polinização, caracterizado pelo fato de que a planta de néctar auxiliar usada é preferencial para a abelha Megachile para visita de flor e é uma espécie de planta na qual a preferência em visita de flor é equivalente ou inferior à da planta Lactuca.

13. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que um cruzamento da planta Lactuca é para obter híbridos (F1) de uma primeira geração filial da planta Lactuca.

14. Método de acordo com a reivindicação 12 ou 13, caracterizado pelo fato de que a planta Lactuca é alface (Lactuca sativa).

15. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 14, caracterizado pelo fato de que a abelha Megachile é uma abelha cortadora de folhas de alfafa.

16. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 15, caracterizado pelo fato de que a planta de néctar auxiliar tem um hábito de floração no qual uma flor da planta de néctar auxiliar está aberta quando uma flor da planta Lactuca estiver fechada.