BR112020011265A2

BR112020011265A2 - métodos e composições compreendendo lipídeos catiônicos para estimular genes interferon tipo i

Info

Publication number: BR112020011265A2
Application number: BR112020011265-8A
Authority: BR
Inventors: Frank Bedu-Addo; Greg Conn; Siva K. Gandhapudi; Martin Ward; Jerold Woodward
Original assignee: Pds Biotechnology Corporation
Priority date: 2017-12-05
Filing date: 2018-12-05
Publication date: 2020-11-17
Also published as: JP2021505606A; JP2024036364A; US20190321321A1; EP3720423A4; TW201924722A; WO2019113200A1; KR20200096800A; IL275145A; IL275145B1; CA3084957A1; CN111655238A; AU2018378588A1; EP3720423A1

Abstract

Métodos e composições para modificar as vias de sinalização de IFN tipo I em um indivíduo compreendendo a administração de um lipídeo catiônico ao indivíduo são fornecidos. Os lipídeos catiônicos compreendem 1,2-dioleoil-3-trimetilamônio propano (DOTAP), cloreto de N-1-(2,3-dioleoilóxi)-propil-N,N,N-trimetil amônio (DOTMA), 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-etilfosfocolina (DOEPC), enantiômeros e suas combinações. As composições podem ainda compreender um ou mais componentes antigênicos, em que esses componentes são autólogos ou não autólogos.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTO- DOS E COMPOSIÇÕES COMPREENDENDO LIPÍDEOS CATIÔNI- COS PARA ESTIMULAR GENES INTERFERON TIPO I".

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[0001] O presente pedido reivindica prioridade e todos os benefí- cios do Pedido de Patente Provisório Norte Americano No. 62/594.815, depositado em 5 de Dezembro de 2017, que é por este meio expres- samente incorporado aqui por referência em sua totalidade.

ANTECEDENTE DA INVENÇÃO

1. Campo da Invenção

[0002] A presente invenção refere-se geralmente a métodos e composições para modificar as vias de sinalização de IFN tipo I com- preendendo a administração de lipídeos catiônicos.

2. Descrição da Técnica Relacionada

[0003] Os interferons tipo I (IFN-I) na última década demonstraram ser de importância crítica na resposta imune dos mamíferos contra a doença. Os interferons tipo I foram chamados interferons "virais" devi- do à sua indução direta por infecções virais, em contraste com o IFN "imune" ou IFN-γ, que é sintetizado após o envolvimento do receptor das células T e das células exterminadoras naturais (NK) durante as respostas imunes. Os IFN-I também são indutores bem documentados de apoptose de células tumorais e antiangiogênese por meio de sinali- zação através do receptor de interferon alfa (IFNAR). Devido ao papel crítico de IFN-I na resposta imune terapêutica, uma ênfase significativa está agora focada na identificação de métodos seguros e eficazes de ativação do IFN-I, a fim de melhorar ambos benefícios preventivos e terapêuticos de vacinas, imunoterapias e outras farmacêuticas basea- das imunes. Por exemplo, estudos pré-clínicos em camundongos mos- traram que os IFNs-I ativam diretamente outras células críticas do sis- tema imunológico, como células dendríticas (DC) apresentadoras de antígenos e células T CD4 e CD8. Os IFNs-I também aumentam a apresentação de antígenos das células tumorais a serem reconheci- das pelos linfócitos T, apresentando, portanto, um papel potencial im- portante na imunoterapia do câncer.

[0004] No campo do desenvolvimento de vacinas, métodos e abordagens que produzem um grande número de células T citotóxicas específicas para antígenos em humanos, a fim de tratar doenças cau- sadas por patógenos ou para tratar câncer, ainda permanecem uma necessidade médica não atendida. As vacinas baseadas em proteínas e peptídeos usadas em combinação com estimuladores imunes, como adjuvantes, são uma das abordagens mais promissoras que foram avaliadas para o desenvolvimento de células T citotóxicas. No entanto, a maioria dos adjuvantes que são atualmente aprovados para uso hu- mano são indutores fracos de interferons tipo I e células T citotóxicas e falharam no estabelecimento de benefício terapêutico ou protetor du- radouro.

[0005] Os interferons (IFN-α/β/γ) são algumas das citocinas esti- muladoras imunes mais potentes e desempenham um papel importan- te no desenvolvimento de células T citotóxicas CD8+. Os interferons também são cruciais para a imunidade antiviral. A imunidade eficaz de células T requer a ativação de células T com antígeno (sinal 1) na pre- sença de sinais coestimuladores apropriados (sinal 2) e citocinas (sinal 3) para conduzir uma resposta imune específica de células T, promo- vendo a expansão, sobrevivência, diferenciação e funções efetoras das células T. O IFN-I pode atuar diretamente nas células T como sinal 3 para induzir a ativação das células T e conduzir suas funções ideais de expansão, sobrevivência e efetoras. Inicialmente identificado como citocinas antivirais, demonstrou-se que o IFN-I melhora a expansão, sobrevivência e as funções efetoras de células T CD8. Os interferons também conduzem a maturação das células apresentadoras de antí-

genos, super-regulando moléculas coestimuladoras e melhorando a apresentação cruzada de antígenos necessária para a ativação das células T. Além disso, demonstrou-se que os interferons têm proprie- dades antitumorais diretas, bem como propriedades antitumorais indi- retas através da produção de IL-15. Como resultado dessas proprie- dades imunológicas significativas, vários agentes indutores de IFN-I, bem como a terapia recombinante de IFN-I, estão atualmente sendo testados em testes em humanos.

[0006] Os IFNs tipo I foram relatados para impedir a transformação celular in vitro, sustentando a expressão do gene supressor de tumor p53 (Takaoka A, Hayakawa S, Yanai H, Stoiber D, Negishi H, Kikuchi H, et al. Integration of interferon-α/β signaling to p53 responses in tu- mor suppression and antiviral defense. Nature (2003)424:516–23). Pa- péis específicos para sinalização de IFN-I na subregulação da prolife- ração de células tumorais e no desencadeamento da morte celular em linhagens celulares de câncer humano também foram demonstrados (Zitvogel L, Galluzzi L, Kepp O, Smyth MJ, Kroemer G.Type I interfe- rons in anticancer immunity. Nat Rev Immunol (2015) 15:405–14). In vivo, a deleção de IFNAR1 das células epiteliais intestinais aumentou a formação de tumores em camundongos (Tschurtschenthaler M, Wang J, Fricke C, Fritz TMJ, Niederreiter L, Adolph TE, et al. Type I interferon signaling in the intestinal epithelium affects Paneth cells, mi- crobial ecology and epithelial regeneration. Gut (2014) 63:1921–31). Vários estudos geraram fortes evidências de que o IFN-I induz efeitos antitumorais predominantemente via estimulação indireta de células imunes para eliminar rapidamente células malignas. Vários estudos sugerem fortemente que o IFN-I promove respostas imunológicas anti- câncer que são análogas à reação do hospedeiro contra patógenos.

[0007] Como um resultado da expressão ubíqua de IFNAR, foi demonstrado que o IFN-I tem efeitos reguladores críticos nas células imunológicas no contexto de doenças inflamatórias e virais (Decker T, Müller M, Stockinger S. The yin and yang of type I interferon activity in bacterial infection. Nat Rev Immunol (2005) 5:675–87; Stetson DB, Medzhitov R. Type I interferons in host defense. Immunity (2006) 25:373–81). Portanto, é evidente que os mediadores celulares da res- posta inata, bem como a resposta imune adaptativa, podem muito bem ser regulados pelo IFN-I na proteção contra doenças malignas.

[0008] O IFN-I demonstrou ser importante na vigilância imunológi- ca do tumor (Dunn GP, Bruce AT, Sheehan KCF, Shankaran V, Uppa- luri R, Bui JD, et al. A critical function for type I interferons in cancer immunoediting. Nat Immunol (2005)6:722–9). Ao contrário do IFN-γ, o IFN-I foi encontrado em experimentos de transferência de medula ós- sea para atuar nas células hematopoiéticas do hospedeiro, em vez da própria célula tumoral durante a indução de uma resposta imune anti- tumoral protetora. Muito tem sido relatado sobre os mecanismos pelos quais os IFNs tipo I impactam as células do sistema imunológico inato e adaptativo no contexto da vigilância de tumores [Zitvogel L, Galluzzi L, Kepp O, Smyth MJ, Kroemer G. Type I interferons in anticancer immunity. Nat Rev Immunol (2015) 15:405–14; Parker BS, Rautela J, Hertzog PJ. Antitumour actions of interferons: implications for cancer therapy. Nat Rev Cancer (2016) 16:131–44)]. Vários estudos identifica- ram um papel fundamental dos IFNs tipo I na ativação de células apre- sentadoras de antígeno hospedeiro (Fuertes MB, Kacha AK, Kline J, Woo S-R, Kranz DM, Murphy KM, et al. Host type I IFN signals are re- quired for antitumor CD8+ T cell responses through CD8α+ dendritic cells. J Exp Med (2011) 208:2005–16; Diamond MS, Kinder M, Mat- sushita H, Mashayekhi M, Dunn GP, Archambault JM, et al. Type I in- terferon is selectively required by dendritic cells for immune rejection of tumors. J Exp Med (2011) 208:1989–2003). Foi determinado que os IFNs tipo I produzidos precocemente atuam no nível de células dendrí-

ticas CD8α+ (DCs) necessárias para a ativação bem-sucedida de linfó- citos T CD8+ citotóxicos específicos para antígenos tumorais (CTLs). A sinalização de IFN tipo I promove especificamente a capacidade das DCs CD8α+ de apresentarem cruzadamente antígenos (Diamond MS, Kinder M, Matsushita H, Mashayekhi M, Dunn GP, Archambault JM, et al. Type I interferon is selectively required by dendritic cells for immune rejection of tumors. J Exp Med (2011) 208:1989–2003). Foi postulado que este efeito é um resultado do IFN-I para realçar a sobrevivência de DCs e, portanto, também realçar a persistência de antígenos na super- fície celular durante a apresentação cruzada (Lorenzi S, Mattei F, Sis- tigu A, Bracci L, Spadaro F, Sanchez M, et al. Type I IFNs control anti- gen retention and survival of CD8α(+) dendritic cells after uptake of tu- mor apoptotic cells leading to cross-priming. J Immunol (2011) 186:5142–50; Schiavoni G, Mattei F, Gabriele L. Type I interferons as stimulators of DC-mediated cross-priming: impact on anti-tumor res- ponse. Front Immunol (2013) 4:483). IFNs tipo I promovem a matura- ção, diferenciação e migração de DC (Fuertes MB, Woo S-R, Burnett B, Fu Y-X, Gajewski TF. Type I interferon response and innate immune sensing of cancer. Trends Immunol (2013) 34:67–73).

[0009] É importante observar que os IFNs tipo I são capazes de induzir a liberação de interleucina 15 (IL15) pelas DCs (Mattei F, Schi- avoni G, Belardelli F, Tough DF. IL-15 is expressed by dendritic cells in response to type I IFN, double-stranded RNA, or lipopolysaccharide and promotes dendritic cell activation. J Immunol (2001) 167:1179–87). Isso promove a sobrevivência de células de memório CD8+ e células NK (Huntington ND. The unconventional expression of IL-15 and its role in NK cell homeostasis. Immunol Cell Biol (2014) 92:210–3). Este efeito não é restrito às células NK. Os CTLs também demonstraram adquirir funções efetoras completas em resposta aos IFNs tipo I (Curt- singer JM, Mescher MF. Inflammatory cytokines as a third signal for T cell activation. Curr Opin Immunol (2010) 22:333–40; Fuertes MB, Ka- cha AK, Kline J, Woo S-R, Kranz DM, Murphy KM, et al. Host type I IFN signals are required for antitumor CD8+ T cell responses through CD8α+ dendritic cells. J Exp Med (2011) 208:2005–16). Também por ter a capacidade de impactar outros subconjuntos de células imunes inatas, como neutrófilos (Wu C-F, Andzinski L, Kasnitz N, Kröger A, Klawonn F, Lienenklaus S, et al. The lack of type I interferon induces neutrophil-mediated pre-metastatic niche formation in the mouse lung. Int J Cancer(2015) 137:837–47; Jablonska J, Wu C-F, Andzinski L, Leschner S, Weiss S. CXCR2-mediated tumor-associated neutrophil recruitment is regulated by IFN-β. Int J Cancer (2014) 134:1346–58), células T γδ e NKT (Woo S-R, Corrales L, Gajewski TF. Innate immune recognition of cancer. Annu Rev Immunol (2015) 33:445–74), IFNs tipo I exibem propriedades limitadoras do crescimento de tumores.

[0010] Os IFNs tipo I são liberados muito cedo durante infecções (Biron CA. Initial and innate responses to viral infections – pattern set- ting in immunity or disease. Curr Opin Microbiol (1999) 2:374–81), e são importantes reguladores de subconjuntos de células imunes ina- tas, como DCs e células NK, nas respostas do hospedeiro anticâncer. Para células NK, os IFNs tipo I foram demonstrados na infecção viral como importantes na capacidade de gerar respostas precoces à infec- ção, e acredita-se que realcem a citotoxicidade das células NK e a produção de citocinas (Lee CK, Rao DT, Gertner R, Gimeno R, Frey AB, Levy DE. Distinct requirements for IFNs and STAT1 in NK cell function. J Immunol (2000) 165:3571–7; Nguyen KB, Salazar-Mather TP, Dalod MY, Van Deusen JB, Wei X, Liew FY, et al. Coordinated and distinct roles for IFN-alpha beta, IL-12, and IL-15 regulation of NK cell responses to viral infection. J Immunol (2002) 169:4279–87).

[0011] Em seres humanos, é relatado que os interferons tipo I são geralmente desencadeados pelo envolvimento de receptores de reco-

nhecimento de padrões associados a patógenos, como receptores toll like, receptores tipo NOD e receptores do tipo Gene Indutível ao Ácido Retinoico I (RIG-I). Além disso, uma variedade de mensageiros secun- dários citosólicos (c-GMP) e sensores de ácidos nucleicos citosólicos também podem desencadear a produção de interferon tipo I através da ativação da via do Estimulador de Genes de Interferon (STING).

[0012] Pensa-se que o IFN-I pode mediar a atividade antitumoral de várias maneiras. Por exemplo, o Interferon pode atuar diretamente nas células tumorais, alterando sua capacidade de sobreviver e cres- cer [Parker, B.S., J. Rautela, and P.J. Hertzog, Antitumour actions of interferons: implications for cancer therapy. Nat Rev Cancer, 2016. 16(3): p. 131-443].

[0013] Vários métodos estão sendo investigados em humanos pa- ra subordinar propriedades imunológicas mediadas tipo I. A adminis- tração de monoterapia com IFN-I recombinante foi clinicamente com- provada no tratamento da hepatite C crônica pela administração de interferon-alfa recombinante (Adrian M. Di Bisceglie, M.D., Paul Mar- tin, M.D., Chris Kassianides, M.D., Mauricio Lisker-Melman, M.D., Linda Murray, R.N., Jeanne Waggoner, B.A., Zachary Goodman, M.D., Steven M. Banks, Ph.D., and Jay H. Hoofnagle, M.D., Recom- binant Interferon Alfa Therapy for Chronic Hepatitis C, November 30, 1989 N Engl J Med 1989; 321:1506-1510). Outra abordagem envolve a administração de agonistas de receptores toll-like (TLR), como RNAs de fita dupla (Poly I: C), oligonucleotídeos de CpG, Imiquimode, RNA padrão único, etc. para desencadear a produção endógena de interfe- rons tipo I (Munir Akkaya, Billur Akkaya, Patrick Sheehan, Pietro Mioz- zo, Mukul Rawat, Mirna Pena, Ann S Kim, Olena Kamenyeva, Juraj Kabat, Chen-Feng Qi, Silvia Bolland, Akanksha Chaturvedi and Susan K Pierce, The Toll-like receptor ligand CpG-A induces type 1 interferons in B cells contrasting the proinflammatory inducing activity of CpG-B, J Immu-

nol May 1, 2017, 198 (1 Supplement) 152.4). Mais recentemente, os agonistas da via de STING estão ganhando mais importância como um ativador de interferon tipo I focado para imunidade antitumoral [Corrales, L., et al., The host STING pathway at the interface of cancer and immunity. J Clin Invest, 2016. 126(7): p. 2404-11].

[0014] No entanto, continua a existir uma clara necessidade de métodos eficazes para promover uma forte ativação da via do interfe- ron tipo I. Dados os muitos benefícios terapêuticos associados às con- sequências da ativação da via do interferon tipo I, métodos melhora- dos para isso são claramente desejáveis.

[0015] Portanto, são necessários métodos e composições melho- rados para vacinas que possibilitem a ativação potente do IFN1 (IFN- α/β/γ). Além disso, são necessários métodos e composições realça- das, como vacinas que eliciam uma resposta imune forte de células T citotóxicas, com ou sem um antígeno, como um antígeno de peptídeo ou proteína. Preferivelmente, essas composições e vacinas incorpo- ram o uso de agentes imunoterapêuticos que são seguros, fáceis de administrar e têm efeitos colaterais ou toxicidade mínimos.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0016] São aqui fornecidos novos métodos e composições para vacinas compreendendo lipídeos catiônicos como ativadores potentes de IFN1 (IFN-α/β/γ). Como aqui descrito, as presentes composições permitem a indução de uma resposta imune de célula T citotóxica efi- caz e forte quando administrada a um hospedeiro. As composições compreendem lipídeos catiônicos, opcionalmente combinados com antígenos de peptídeo ou proteína; em certas modalidades, os lipídeos catiônicos estão na forma de lipossomas. Como descrito em detalhes abaixo, as composições da presente invenção resultam em células ci- totóxicas ativadas por IFN-I que são potentes na regressão de tumores estabelecidos em mamíferos, como camundongos. A presente inven-

ção fornece ainda o uso de lipossomas catiônicos para uso especifi- camente na ativação de IFN-I, a fim de desenvolver prevenções mais eficazes contra patógenos infecciosos, bem como terapias para câncer e outras doenças.

[0017] Outras características e vantagens da presente invenção serão facilmente apreciadas, à medida que a mesma se tornar melhor compreendida, após a leitura da descrição subsequente tomada em conjunto com os desenhos anexos.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0018] A Figura 1 fornece um gráfico demonstrando o recrutamen- to rápido e persistente induzido por Versamune® (R-DOTAP) de célu- las imunes nos linfonodos DE drenagem. Os dados na Figura 1 cor- respondem a uma experiência em que camundongos C57BL/6J (n = 4) foram injetados com 100 µL de nanopartículas de lipossomas R- DOTAP 12mM por via subcutânea atrás do pescoço. Camundongos injetados com PBS e LPS (50 µg/camundongo) (ponto de tempo de 24 horas) foram usados como controles negativo e positivo, respectiva- mente. 4hs ou 24hs após a injeção, os linfonodos de drenagem axilar e braquial de cada camundongo foram reunidos e processados por digestão com colagenase. As células CD11c positivas (~ 20.000 célu- las) nessas suspensões de células linfonodais foram purificadas por classificação e lisadas em tampão RLT e processadas para análise de expressão gênica relativa usando o kit de inflamação de camundongo nCounter® e tecnologias nanostring. Os dados demonstram a super- regulação dos genes de Interferon tipo I pelo R-DOTAP e representam a média de 4 camundongos em cada grupo.

[0019] A Figura 2 fornece um gráfico demonstrando a expressão do gene IFN tipo I induzido por R-DOTAP na drenagem de linfonodos. Os dados na Figura 2 correspondem a uma experiência em que ca- mundongos C57BL/6J (n = 2) foram injetados com 50 µL de nanopartí-

culas R-DOTAP ou S-DOTAP 6 mM subcutaneamente nas almofadas das patas. Camundongos injetados com PBS e LPS (50 µg/camundongo) (ponto de tempo de 24 horas) foram usados como controles negativo e positivo, respectivamente. 3hs ou 24 hs após a injeção, os linfonodos de drenagem poplítea de cada camundongo fo- ram reunidos e lisados em tampão RLT e processados para análise de expressão gênica relativa usando o ensaio de expressão gênica Taqman e RT-PCR. Os dados demonstram a super-regulação dos ge- nes de Interferon tipo I por ambos S-DOTAP e R-DOTAP.

[0020] As Figuras 3A, 3B e 3C fornecem gráficos demonstrando o recrutamento de células induzidas por R-DOTAP e a expressão de CD69 em linfonodos drenantes. Os dados na Figura 3 correspondem a uma experiência em que A) camundongos C57BL/6J (n = 3) foram in- jetados com 50 µL de R-DOTAP 6 mM ou sacarose 280 mM por via subcutânea nas almofadas das patas. Nos tempos indicados, isola- ram-se os linfonodos de drenagem poplítea de cada rato e enumera- ram-se suspensões únicas de linfonodos utilizando hemocitômetro pa- ra obter o número total de células. B) Os camundongos C57BL/6J (n = 3) ou IFNAR-/- (n=3) foram injetados com 50 µl de R-DOTAP 6 mM ou sacarose 280 mM na almofada da pata e os linfonodos poplíteos de drenagem foram coletados de cada camundongo e enzimaticamente os linfonodos digeridos foram avaliados quanto ao número total de cé- lulas em 24 hs (B) usando hemocitômetro e a expressão de CD69 em células T CD3+ (B) foi avaliada por citometria de fluxo. A-B) dados re- presentam o número total de células em cada linfonodo de drenagem. C) Os dados representam porcentagem de células CD69 + em cada grupo 24 hs após a vacinação (n = 3 camundongos por grupo).

[0021] A Figura 4 fornece gráficos demonstrando a indução da produção de interferon tipo I por células dendríticas por lipídeos catiô- nicos. Os dados na Figura 4 correspondem a um experimento em que

A) Células dendríticas derivadas da medula óssea (BMDCs) de ca- mundongos IFNAR-Ko foram estimuladas com concentrações indica- das (6-400 µM) de lipídeos catiônicos ou controle positivo de LPS (1- 500 ng/ml ) por 24 horas. B) BMDCs induzidas por FLT3 (pDCs) e BMDC derivadas de GM-CSF/IL-4 (cBMDCs) foram estimuladas com a concentração indicada (6-400 µM) de lipídeos catiônicos ou controle positivo de LPS (1-500 ng/ml) para 24 hs. Para medir a produção de interferon tipo I, os sobrenadantes celulares (100 µl) foram adicionados às culturas de células repórter (célula B16.Blue-IFNα/β de InvivoGen, USA) e incubados por 18 horas para estimular a produção induzida por interferon tipo I de fosfatase alcalina secretada (SEAP) por células re- pórter. A atividade SEAP nos sobrenadantes das células repórter foi quantificada utilizando o kit de ensaio de SEAP colorimétrico de acor- do com o protocolo de fabricação. Os interferons tipo I secretados por BMDC foram quantificados utilizando uma curva padrão gerada utili- zando a atividade de SEAP estimulada por IFN-β de camundongo re- combinante na linhagem de célula repórter.

[0022] A Figura 5 fornece gráficos demonstrando a eficácia da va- cina baseada em R-DOTAP em camundongos deficientes em sinal de IFN tipo I. Os dados na Figura 5 correspondem a um experimento em que os camundongos C57BL/6J (n = 6) ou camundongos IFNAR -/- de Jackson foram injetados por via subcutânea com 100 µl de formula- ções de vacina (Versamune® ou adjuvante de Freund completo) con- tendo peptídeo SIINFEKL (A) (SEQ ID NO: 1) ou peptídeo RF9 (B) (SEQ ID NO: 2) no dia 0 e no dia 7. Sete dias após a segunda vacina- ção, o baço dos camundongos vacinados e de controle foi processado para medir as respostas de células T CD8 específicas de antígeno in- duzidas pelas formulações de vacina nos camundongos IFNAR-/- e tipo selvagem. As respostas das células CD8T específicas do antígeno foram avaliadas medindo-se a produção de células T CD8 específicas de SIINEKL (A) (SEQ ID NO: 1) e específicas do peptídeo RF9 (B) (SEQ ID NO: 2) de IFN-γ em um ensaio ELISPOT. Os dados são re- presentativos de vários experimentos com resultados semelhantes. A significância estatística dos dados foi estimada usando ANOVA unidi- recional e comparações múltiplas foram analisadas usando o teste de Tukey. **Estatisticamente significante (p <0,05) em comparação ao grupo vacinado com WT Versamune®.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0023] A presente invenção pode ser entendida mais facilmente por referência à seguinte descrição detalhada das modalidades espe- cíficas aqui incluídas. Embora a invenção tenha sido descrita com refe- rência a detalhes específicos de certas modalidades da mesma, não se pretende que esses detalhes sejam considerados limitações no es- copo da invenção.

[0024] O texto completo das referências aqui mencionadas é aqui incorporado em sua totalidade por referência, incluindo o Pedido de Patente Provisório Norte Americano 62/594.815, Patente Norte Ameri- cana Nos. 7.303.881, 8.877.206, 9.789.129, e Pedido de Patente Norte Americano No. Serial 14/344.327, 14/407.419, 14/429.123 e 15/775.680.

[0025] São aqui fornecidos novos métodos e composições que compreendem o uso de lipídeos catiônicos, para a modificação dos genes de Interferon tipo I. Em certas modalidades, os genes de Interfe- ron tipo I são super-regulados e induzem ou ativam a sinalização de interferon tipo I. Em certas modalidades, os genes de Interferon tipo I são subregulados e deprimem ou desativam a sinalização de interfe- ron tipo I. Também são fornecidos novos métodos e composições que compreendem o uso de lipídeos catiônicos para promover e aumentar a potência da população de células T CD8+ específicas da doença via o efeito dos interferons tipo I. Em certas modalidades, os métodos e composições aqui reivindicados podem compreender o uso de antíge- nos específicos da doença destinados a direcionar a atividade citolítica contra células infectadas ou doentes específicas.

[0026] Os lipossomas catiônicos têm sido extensivamente utiliza- dos in vivo para liberar fármacos de pequeno peso molecular, DNA plasmídico, oligonucleotídeos, proteínas e peptídeos e também como adjuvantes de vacina. Na presente invenção, como um resultado de estudos realizados para entender melhor como os lipídeos catiônicos podem interagir com o sistema imunológico e as razões mecanicistas da capacidade de certos lipídeos catiônicos para facilitar a apresenta- ção cruzada, a capacidade exclusiva dos lipídeos catiônicos de super- regular os interferons tipo I foi descoberta. Foi relatado que os IFNs tipo I produzidos precocemente atuam no nível de células dendríticas CD8α+ (DCs) que são necessárias para a ativação bem-sucedida de linfócitos T CD8+ citotóxicos específicos para o antígeno tumoral (CTLs), e a sinalização de IFN Tipo I promove especificamente a ca- pacidade das DCs CD8α+ de apresentarem cruzadamente os antíge- nos. Esta capacidade dos lipídeos catiônicos de facilitar a apresenta- ção cruzada de antígeno, levando a respostas de células T CD8+ es- pecíficas ao antígeno, foi agora demonstrada em ambos estudos clíni- cos pré-clínicos e humanos. A capacidade de usar lipídeos catiônicos para ativar com segurança os interferons tipo I para promover a apre- sentação cruzada de antígenos e a indução de células T CD8+ em humanos apresenta o potencial de voltar-se bem sucedidamente a uma necessidade médica não atendida significativa no campo da imu- nologia terapêutica.

[0027] Em uma modalidade aqui contemplada, um lipídeo catiôni- co é administrado para ativar a via de interferon Tipo I em um indiví- duo.

[0028] Em outra modalidade, um lipídeo catiônico é combinado com um antígeno específico da doença para ativar os interferons Tipo I e facilitar a apresentação cruzada de antígenos para preparar células T CD8+ específicas da doença para tratar uma doença em um indiví- duo.

[0029] Em outra modalidade, é fornecido um método de tratamen- to de câncer, em que o método compreende a etapa de tratamento do indivíduo com um lipídeo catiônico ativador de interferon Tipo I combi- nado com um antígeno de proteína.

[0030] Em outra modalidade, é fornecido um método de tratamen- to de câncer, em que o método compreende a etapa de tratamento do indivíduo com um lipídeo catiônico combinado com uma vacina de ati- vação de células T.

[0031] Em outra modalidade, é fornecido um método de tratamen- to de câncer, em que o método compreende a etapa de tratamento do indivíduo com um lipídeo catiônico combinado com um antígeno de tumor de proteína ou peptídeo e em combinação com um adjuvante.

[0032] Em outra modalidade, é fornecido um método de tratamen- to de câncer, em que o método compreende a etapa de tratamento do indivíduo com um lipídeo catiônico combinado com qualquer antígeno tumoral, incluindo um antígeno baseado em DNA ou RNA.

[0033] Em outra modalidade, é fornecido um método de tratamen- to de câncer, em que o método compreende a etapa de tratamento do indivíduo com um lipídeo catiônico para ativar a via do interferon tipo I opcionalmente combinada com um antígeno tumoral em combinação com um adjuvante e/ou qualquer agente que combata a supressão imunológica do tumor através da redução de MDSC, Tregs ou bloqueio de pontos de checagem imunes.

[0034] Em outra modalidade, é fornecido um método de tratamen- to de câncer, em que o método compreende a etapa de tratamento do indivíduo com uma vacina baseada em lipídeos catiônicos combinada com um antígeno tumoral baseado em DNA ou RNA em combinação com um adjuvante e/ou qualquer agente que combata a supressão imunológica do tumor.

[0035] Em ainda outra modalidade, é fornecido um método para aumentar uma resposta imune antitumoral em um mamífero. O método compreende a etapa de tratamento do mamífero com um lipídeo catiô- nico ativador de interferon tipo I ou com um ou mais lipídeos catiôni- cos, juntamente com fatores de crescimento em alguns casos, como GM-CSF e citocinas.

[0036] Nas várias modalidades, a composição compreende um ou mais lipídeos com pelo menos um lipídeo catiônico ativador de interfe- ron tipo I e pelo menos um antígeno. Em certas modalidades, mais de um antígeno está incluído.

[0037] Em uma modalidade, são fornecidos métodos e composi- ções para modificar uma via de sinalização de IFN tipo I em um indiví- duo, como um mamífero, em que os métodos compreendem a admi- nistração de composições compreendendo lipídeos catiônicos ao indi- víduo. Em uma modalidade, o lipídeo catiônico compreende 1,2- dioleoil-3-trimetilamônio propano (DOTAP), cloreto de N-1-(2,3- dioleoilóxi)-propil-N,N,N-trimetil amônio (DOTMA), 1,2-dioleoil-sn- glicero-3-etilfosfocolina (DOEPC) e suas combinações. As composi- ções podem compreender enantiômeros específicos do lípido catiôni- co. Em uma modalidade, o lipídeo catiônico é o 1,2-dioleoil-3- trimetilamônio propano (DOTAP); em uma modalidade, o lipídeo catiô- nico é o enantiômero R de DOTAP, (R)-1,2-dioleoil-3-trimetilamônio propano (R-DOTAP). Em certas modalidades, as composições com- preendem ainda antígenos, como antígenos de proteínas ou peptídi- cos.

[0038] Em certas modalidades, a modificação da via de sinaliza- ção de IFN tipo I em um indivíduo compreende a super-regulação ou ativação da via. Em certas modalidades, a modificação da via de sina- lização de IFN tipo I em um indivíduo compreende a subregulação ou a desativação da via. Em certas modalidades, a resposta das células T é elevada, as respostas das células T CD8+ específicas do antígeno são elevadas e/ou a imunogenicidade da composição é realçada. Em uma modalidade, é fornecido um método para o tratamento de câncer em um indivíduo, em que o método compreende a administração de uma composição compreendendo um lipídeo catiônico e em que a administração do lipídeo catiônico resulta na estimulação de uma via de sinalização de IFN tipo I. Antígenos

[0039] Em uma modalidade, os novos métodos reivindicados aqui compreendem a administração de lipídeos catiônicos com um ou mais antígenos autólogos, como antígenos derivados do próprio tumor de um indivíduo. Em outra modalidade, os métodos compreendem a ad- ministração da composição compreendendo um lipídeo catiônico em combinação com um ou mais antígenos não autólogos, como, porém, não limitados a, peptídeos sintéticos, proteínas recombinantes, RNA ou DNA ou fragmentos ativos dos mesmos. Em cada caso, o objetivo é ativar os interferons tipo I para facilitar a indução de uma forte resposta da célula T CD8+ específica do antígeno. O antígeno pode ser qual- quer antígeno associado à doença conhecido por alguém versado na técnica.

[0040] Um "antígeno associado ao tumor", quando aqui utilizado, é uma molécula ou composto (por exemplo, uma proteína, peptídeo, po- lipeptídeo, lipoproteína, lipopeptídeo, glicoproteína, glicopeptídeos, li- pídeos, glicolipídeo, carboidratos, RNA e/ou DNA, ou seu fragmento ativo) associado a um tumor ou célula cancerígena e que é capaz de provocar uma resposta imune (humoral e/ou celular) quando expresso na superfície de uma célula apresentadora de antígeno no contexto de uma molécula de MHC. Os antígenos associados a tumores incluem autoantígenos, bem como outros antígenos que podem não estar es- pecificamente associados a um câncer, porém, no entanto, realçam uma resposta imune e/ou reduzem o crescimento de um tumor ou cé- lula cancerígena quando administrados a um animal. Modalidades es- pecíficas adicionais são fornecidas aqui.

[0041] Um "antígeno microbiano", quando aqui utilizado, é um an- tígeno de um micro-organismo e inclui, porém, não está limitado a, ví- rus infeccioso, bactérias infecciosas, parasitas infecciosos e fungos infecciosos. Os antígenos microbianos podem ser micro-organismos intactos e isolados naturais, fragmentos ou derivados dos mesmos, compostos sintéticos que são idênticos ou semelhantes aos antígenos microbianos de ocorrência natural e, preferivelmente, induzem uma resposta imune específica para o micro-organismo correspondente (do qual o antígeno microbiano de ocorrência natural é originado). Em uma modalidade preferida, um composto é semelhante a um antígeno de micro-organismo de ocorrência natural se induz uma resposta imune (humoral e/ou celular) semelhante a um antígeno de micro-organismo de ocorrência natural. Os compostos ou antígenos que são semelhan- tes a um antígeno de micro-organismo de ocorrência natural são bem conhecidos por aqueles versados na técnica como, por exemplo, uma proteína, peptídeo, polipeptídeo, lipoproteína, lipopeptídeo, glicoprote- ína, glicopeptídeos, lipídeos, glicolipídeos, carboidrato, RNA e/ou DNA. Outro exemplo não limitativo de um composto que é semelhante a um antígeno de micro-organismo de ocorrência natural é um imitador de peptídeo de um antígeno de polissacarídeo. Modalidades mais especí- ficas são fornecidas aqui.

[0042] O termo "antígeno" pretende ainda abranger análogos de peptídeo ou proteínas de antígeno conhecidos ou tipo selvagem, como os descritos neste relatório descritivo. Os análogos podem ser mais solúveis ou mais estáveis que o antígeno tipo selvagem e também po- dem conter mutações ou modificações que tornam o antígeno mais imunologicamente ativo. O antígeno pode ser modificado de qualquer maneira, como a adição de porções lipídicas ou de açúcar, mutação de sequências de peptídeos ou aminoácidos de proteínas, mutação da sequência de DNA ou RNA ou qualquer outra modificação conhecida por alguém versado na técnica. Os antígenos podem ser modificados usando métodos padrão conhecidos por alguém versado na técnica.

[0043] Também úteis nas composições e métodos da presente invenção são peptídeos ou proteínas que têm sequências de aminoá- cidos homólogas à sequência de aminoácidos de um antígeno deseja- da, em que o antígeno homólogo induz uma resposta imune ao res- pectivo tumor, micro-organismo ou célula infectada.

[0044] Em uma modalidade, os métodos aqui descritos compreen- dem composições em que o lipídeo catiônico é administrado sem um antígeno para ativar os interferons tipo I, a fim de facilitar a resposta imune desejada para tratar uma doença em um indivíduo, por exem- plo, ativando as células exterminadoras naturais para atacar e matar células doentes ou infectadas. Em outra modalidade, os métodos da presente invenção compreendem composições em que o lipídeo catiô- nico é administrado com um antígeno, em que o antígeno pode estar associado a um tumor ou câncer, ou seja, um antígeno associado a um tumor, para desenvolver um imunoterapêutico para prevenir ou tra- tar um tumor. Como tal, em uma modalidade, o tumor ou imunoterapia da presente invenção compreende ainda pelo menos um epítopo de pelo menos um antígeno associado ao tumor. Em outra modalidade, os métodos imunoterapêuticos da presente invenção compreendem ainda uma pluralidade de epítopos de um ou mais antígenos associa- dos a tumores. Os antígenos associados ao tumor utilizados com os lipídeos catiônicos e métodos da presente invenção podem ser ineren-

temente imunogênicos, ou não imunogênicos, ou levemente imunogê- nicos. Como demonstrado aqui, mesmo os autoantígenos associados ao tumor podem ser vantajosamente empregados nas imunoterapias objeto para efeito terapêutico, uma vez que as composições objeto são capazes de ativar os interferons Tipo I (IFNs) que são conhecidos para mediar os efeitos antitumorais contra vários tipos de tumores. Antíge- nos exemplares incluem, porém, não estão limitados a, antígenos sin- téticos, recombinantes, estranhos ou homólogos, e materiais antigêni- cos podem incluir, porém, não estão limitados a proteínas, peptídeos, polipeptídeos, lipoproteínas, lipopeptídeos, lipídeos, glicolipídeos, car- boidratos, RNA e DNA. Exemplos de tais terapias incluem, porém, não estão limitados ao tratamento ou prevenção de câncer de mama, cân- cer de cabeça e pescoço, melanoma, câncer cervical, câncer de pul- mão, câncer de próstata carcinoma intestinal ou qualquer outro câncer conhecido na técnica suscetível à imunoterapia. Em tais terapias, tam- bém é possível combinar o antígeno com o lipídeo catiônico sem en- capsulamento.

[0045] Os antígenos associados a tumores adequados para uso na presente invenção incluem ambas moléculas de ocorrência natural e modificadas que podem ser indicativas de um tipo de tumor único, compartilhado entre vários tipos de tumores e/ou exclusivamente ex- presso ou superexpresso em células tumorais em comparação com células normais. Além de proteínas, glicoproteínas, lipoproteínas, pep- tídeos e lipopeptídeos, padrões de expressão específicos de tumores de carboidratos, gangliosídeos, glicolipídeos e mucinas também foram documentados. Exemplos de antígenos associados a tumores para uso em vacinas contra o câncer incluem produtos proteicos de onco- genes, genes supressores de tumor e outros genes com mutações ou rearranjos exclusivos para células tumorais, produtos genéticos embri- onários reativados, antígenos oncofetais, antígenos de diferenciação específicos para tecidos (porém, não específicos para tumores), recep- tores de fator de crescimento, resíduos de carboidrato de superfície celular, proteínas virais estranhas e várias outras autoproteínas.

[0046] Modalidades específicas de antígenos associados a tumo- res incluem, por exemplo, antígenos mutados ou modificados, como os produtos proteicos dos proto-oncogenes Ras p21, supressor de tumor p53 e oncogenes HER-2/neu e BCR-abl, bem como CDK4, MUM1 , Caspase 8 e Beta catenina; antígenos superexpressos, como galectina 4, galectina 9, anidrase carbônica, Aldolase A, PRAME, Her2/neu, ErbB-2 e KSA, antígenos oncofetais, como alfa fetoproteína (AFP), gonadotrofina coriônica humana (hCG); autoantígenos, como antígeno carcinoembrionário (CEA) e antígenos de diferenciação de melanócito, como Mart 1/Melan A, gp100, gp75, Tirosinase, TRP1 e TRP2; antíge- nos associados à próstata, tais como PSA, PAP, PSMA, PSM-P1 e PSM-P2; produtos de genes embrionários reativados, como MAGE 1, MAGE 3, MAGE 4, GAGE 1, GAGE 2, BAGE, RAGE e outros antíge- nos de testículos de câncer, como NY-ESO1, SSX2 e SCP1; mucinas como Muc-1 e Muc-2; gangliosídeos como GM2, GD2 e GD3, glicolipí- deos e glicoproteínas neutros como Lewis (y) e globo-H; e glicoproteí- nas como Tn, antígeno de Thompson-Freidenreich (TF) e sTn. Tam- bém aqui incluídos como antígenos associados a tumores estão lisa- dos de células totais e de células tumorais, bem como porções imuno- gênicas dos mesmos, bem como idiotipos de imunoglobulina expres- sos em proliferações monoclonais de linfócitos B para uso contra lin- fomas de células B.

[0047] Antígenos associados a tumores e seus respectivos alvos de células tumorais incluem, por exemplo, citoqueratinas, particular- mente citoqueratina 8, 18 e 19, como antígenos para carcinoma. Antí- geno da membrana epitelial (EMA), antígeno embrionário humano (HEA-125), glóbulos de gordura do leite humano, MBr1, MBr8, Ber-

EP4, 17-1A, C26 e T16 também são antígenos de carcinoma conheci- dos. Desmina e actina específica do músculo são antígenos de sarco- mas miogênicos. A fosfatase alcalina placentária, gonadotrofina coriô- nica beta-humana e a alfa-fetoproteína são antígenos de tumores tro- foblásticos e de células germinativas. O antígeno específico da prósta- ta é um antígeno dos carcinomas prostáticos, antígeno carcinoembrio- nário dos adenocarcinomas do cólon. HMB-45 é um antígeno de me- lanomas. No câncer cervical, antígenos úteis podem ser codificados pelo papiloma vírus humano. A cromagranina-A e a sinafofisina são antígenos dos tumores neuroendócrinos e neuroectodérmicos. De par- ticular interesse são os tumores agressivos que formam massas tumo- rais sólidas tendo áreas necróticas. A lise de tais células necróticas é uma fonte rica de antígenos para células apresentadoras de antígenos e, portanto, a terapia objeto pode encontrar uso vantajoso em conjunto com quimioterapia convencional e/ou radioterapia.

[0048] Os antígenos associados ao tumor podem ser preparados por métodos bem conhecidos na técnica. Por exemplo, esses antíge- nos podem ser preparados a partir de células cancerígenas, preparan- do extratos brutos de células cancerígenas (por exemplo, como des- crito em Cohen et al., Cancer Res., 54:1055 (1994)), purificando parci- almente os antígenos, por recombinação tecnologia, ou pela síntese de novo de antígenos conhecidos. O antígeno também pode estar na forma de um ácido nucleico que codifica um peptídeo antigênico em uma forma adequada para expressão em um indivíduo e apresentação ao sistema imunológico do indivíduo imunizado. Além disso, o antíge- no pode ser um antígeno completo ou pode ser um fragmento de um antígeno completo compreendendo pelo menos um epítopo.

[0049] Antígenos derivados de patógenos conhecidos por pre- disporem a certos tipos de câncer também podem ser incluídos com vantagem nas vacinas contra o câncer da presente invenção. Estima-

se que cerca de 16% da incidência mundial de câncer possa ser atribuída a patógenos infecciosos; e várias malignidades comuns são caracterizadas pela expressão de produtos genéticos virais específi- cos. Assim, a inclusão de um ou mais antígenos de patógenos im- plicados em causar câncer pode ajudar a ampliar a resposta imune do hospedeiro e aumentar o efeito profilático ou terapêutico da vacina contra o câncer. Os patógenos de interesse particular para uso nas vacinas contra o câncer aqui fornecidas incluem: vírus da hepatite B (carcinoma hepatocelular), vírus da hepatite C (heptomas), vírus de Epstein Barr (EBV) (linfoma de Burkitt, câncer de nasofaringe, PTLD em indivíduos imunossuprimidos), HTLVL (leucemia de células T adultas), vírus do papiloma humano oncogênico tipos 16, 18, 33, 45 (câncer cervical adulto) e a bactéria Helicobacter pylori (linfoma gástri- co de células B). Outros microrganismos clinicamente relevantes que podem servir como antígenos em mamíferos e mais particularmente humanos são descritos extensivamente na literatura, por exemplo, C.G. A Thomas, Medical Microbiology, Bailliere Tindall, Great Britain 1983, cujo conteúdo inteiro está aqui incorporado por referência.

[0050] Em outra modalidade, o antígeno compreende um antíge- no derivado de ou associado a um patógeno, isto é, um antígeno mi- crobiano. Como tal, em uma modalidade, as vacinas de patógenos da presente invenção compreendem ainda pelo menos um epítopo de pe- lo menos um antígeno microbiano. Os patógenos que podem ser dire- cionados pelas imunoterapias em questão incluem, mas não estão li- mitados a, vírus, bactérias, parasitas e fungos. Em outra modalidade, as vacinas de patógenos da presente invenção compreendem ainda uma pluralidade de epítopos de um ou mais antígenos microbianos.

[0051] Os antígenos microbianos que encontram uso nas imuno- terapias lipídicas catiônicas e métodos podem ser inerentemente imu- nogênicos, ou não imunogênicos, ou levemente imunogênicos. Antí-

genos exemplares incluem, mas não estão limitados a, antígenos sin- téticos, recombinantes, estranhos ou homólogos, e materiais antigêni- cos podem incluir, mas não estão limitados a proteínas, peptídeos, po- lipeptídeos, lipoproteínas, lipopeptídeos, lipídeos, glicolipídeos, carboi- dratos, RNA e DNA .

[0052] Patógenos virais exemplares incluem, mas não estão limi- tados a, vírus que infectam mamíferos e, mais particularmente, huma- nos. Exemplos de vírus incluem, mas não estão limitados a: Retroviri- dae (por exemplo, vírus da imunodeficiência humana, como HIV-1 (também conhecido como HTLV-III, LAV ou HTLV-III/LAV ou HIV-III; e outros isolados, como HIV-LP; Picornaviridae (por exemplo, vírus da poliomielite, vírus da hepatite A; enterovírus, vírus Coxsackie humano, rinovírus, ecovírus); Calciviridae (por exemplo, cepas que causam gas- troenterite); Togaviridae (por exemplo, vírus da encefalite equina, vírus da rubéola); Flaviridae (por exemplo vírus da dengue, vírus da encefa- lite, vírus da febre amarela); Coronoviridae (por exemplo, coronavírus (por exemplo, vírus da estomatite vesicular, vírus da raiva); Corona- viridae (por exemplo, coronavírus); Rhabdoviridae (por exemplo, vírus da estomatite vesicular, vírus da raiva); Filoviridae (por exemplo, vírus ebola); Paramyxoviridae (por exemplo, vírus parainfluenza, vírus da caxumba, vírus do sarampo, vírus sincicial respiratório); Orthomyxo- viridae (por exemplo, vírus influenza); Bungaviridae (por exemplo, ví- rus Hantaan, vírus bunga, flebovírus e vírus Nairo); Arena viridae (ví- rus da febre hemorrágica); Reoviridae (por exemplo, reovírus, orbivírus e rotavírus); Birnaviridae; Hepadnaviridae (vírus da hepatite B); Parvo- virida (parvovírus); Papovaviridae (papilomavírus, poliomavírus); Ade- noviridae (a maioria dos adenovírus); vírus do herpes simples (HSV) 1 e 2 de herpesviridae, vírus da varicela zoster, citomegalovírus (CMV), vírus do herpes; Poxyiridae (vírus da varíola, vírus da vacínia, vírus da varíola); e Iridoviridae (por exemplo, vírus da peste suína africana); e vírus não classificados (por exemplo, os agentes etiológicos das ence- falopatias espongiformes, o agente da hepatite delta (considerado um satélite defeituoso do vírus da hepatite B), os agentes da hepatite não A e B (classe l = transmitida internamente; classe 2 = transmitida pa- renteralmente (Hepatite C); Norwalk e vírus relacionados, e astroví- rus).

[0053] Além disso, bactérias gramnegativas e grampositivas po- dem ser direcionadas pelas composições e métodos em questão em animais vertebrados. Tais bactérias grampositivas incluem, mas não estão limitadas a espécies de Pasteurella, espécies de Staphylococci e espécies de Streptococcus. As bactérias gramnegativas incluem, entre outras, Escherichia coli, espécies de Pseudomonas e espécies de Salmonella. Exemplos específicos de bactérias infecciosas incluem, entre outros: Helicobacter pyloris, Borella burgdorferi, Legionella pneumophiliaii, Mycobacteria sps (por exemplo, M. tuberculosis, M. avium, M. intracelular, M. kansaii, M. gordonae), Staphylococcus au- reus, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Listeria mono- cytogenes, Streptococcus pyogenes (Estreptococo do grupo A), Strep- tococcus agalactiae (Estreptococo do grupo B), Streptococcus (grupo viridans), Streptococcus faecalis, Enterococcus bovis, Enterococcus (anaerobic sps.), Enterococcus pneumoniae, Campylobacter sp. pato- gênico, Enterococcus sp., Haemophilus infuenzae, Bacillus antracis, corynebacterium diphtheriae, corynebacterium sp., Erysipelothrix rhu- siopathiae, Clostridium perfringers, Clostridium tetani, Enterobacter aerogenes, Klebsiella pneumoniae, Pasturella multocida, Bacteroides sp., Fusobacterium nucleatumii, Streptobacillus moniliformis, Trepo- nema pallidium, Treponema pertenue, Leptospira, Rickettsia e Actino- myces israelli.

[0054] Polipeptídeos de patógenos bacterianos que podem ser utilizados como fontes de antígenos microbianos nas composições em questão incluem, mas não estão limitados a, uma proteína da mem- brana externa regulada por ferro ("IROMP"), uma proteína da mem- brana externa ("OMP"), e uma proteína A de Aeromonis salmonicida que causa furunculose, proteína p57 de Renibacterium salmoninarum que causa doença renal bacteriana ("BKD"), antígeno principal associ- ado à superfície ("msa"), uma citotoxina expressa na superfície ("mpr"), uma hemolisina expressa na superfície ("ish") e um antígeno flagelar de Yersiniose; uma proteína extracelular ("ECP"), uma proteí- na de membrana externa regulada por ferro ("IROMP") e uma proteína estrutural de Pasteurelose; uma OMP e uma proteína flagelar de Vi- brosis anguillarum e V. ordalii; uma proteína flagelar, uma proteína OMP, aroA e purA de Edwardsiellosis ictaluri e E. tarda; e antígeno de superfície de Ichthyophthirius; e uma proteína estrutural e reguladora de Cytophaga columnari; e uma proteína estrutural e reguladora de Rickettsia. Tais antígenos podem ser isolados ou preparados de forma recombinante ou por qualquer outro meio conhecido na técnica.

[0055] Exemplos de patógenos incluem ainda, mas não estão limitados a, fungos que infectam mamíferos e, mais particularmente, humanos. Exemplos de fungos incluem, entre outros: Cryptococcus neoformansi, Histoplasma capsulatum, Coccidioides immitis, Blas- tomyces dermatitidis, Chlamydia trachomatis, Candida albicans. Exemplos de parasitas infecciosos incluem Plasmodium, como Plas- modium falciparum, Plasmodium malariae, Plasmodium ovale e Plas- modium vivax. Outros organismos infecciosos (isto é, protistas) inclu- em Toxoplasma gondii. Os polipeptídeos de um patógeno parasitário incluem, mas não estão limitados, aos antígenos de superfície de Ichthyophthirius.

[0056] Outros microrganismos clinicamente relevantes que ser- vem como antígenos em mamíferos e mais particularmente em huma- nos são descritos extensivamente na literatura, por exemplo, veja, C.

G. A Thomas, Medical Microbiology, Bailliere Tindall, Great Britain 1983, cujo conteúdo inteiro está aqui incorporado por referência. Além do tratamento de doenças humanas infecciosas e patógenos huma- nos, as composições e métodos da presente invenção são úteis no tratamento de infecções de mamíferos não humanos. Muitas vacinas para o tratamento de mamíferos não humanos são descritas em Ben- nett, K. Compendium of Veterinary Products, 3rd ed. North American Compendiums, Inc., 1995; veja, também WO 02/069369, cuja descri- ção é expressamente incorporada aqui por referência.

[0057] Patógenos não humanos exemplares incluem, mas não estão limitados a, vírus tumorais mamários de camundongos ("MMTV"), vírus de sarcoma de Rous ("RSV"), vírus da leucemia aviá- ria ("ALV"), vírus da mieloblastose aviária ("AMV"), vírus da leucemia de murino ("MLV"), vírus da leucemia felina ("FeLV"), vírus do sarcoma de murino ("MSV"), vírus da leucemia do macaco gibão ("GALV"), vírus da necrose do baço ("SNV"), vírus da reticuloendoteliose ("RSV"), ví- rus do sarcoma símio ("SSV"), vírus do macaco Mason-Pfizer ("MPMV"), retrovírus símio tipo 1 ("SRV-1"), lentivírus como HIV-1, HIV-2, SIV, vírus Visna, vírus da imunodeficiência felina ("FIV") e vírus da anemia infecciosa equina ("EIAV"), vírus da leucemia de células T, como HTLV-1, HTLV-II, vírus símio da leucemia de células T ("STLV" ) e vírus da leucemia bovina ("BLV") e vírus espumosos, como vírus es- pumoso humano ("HFV"), vírus espumoso símio ("SFV") e vírus espu- moso bovino ("BFV").

[0058] Em algumas modalidades, "tratamento", "tratar" e "tratan- do", quando aqui usado com referência a patógenos infecciosos, refe- re-se a um tratamento profilático que aumenta a resistência de um in- divíduo à infecção por um patógeno ou diminui a probabilidade que o indivíduo será infectado com o patógeno; e/ou tratamento após o indi-

víduo ter sido infectado para combater a infecção, por exemplo, reduzir ou eliminar a infecção ou impedir que ela se agrave.

[0059] Os antígenos microbianos podem ser preparados por mé- todos bem conhecidos na técnica. Por exemplo, esses antígenos po- dem ser preparados diretamente a partir de células virais e bacteria- nas, preparando extratos crus, purificando parcialmente os antígenos ou, alternativamente, por tecnologia recombinante ou por síntese de novo de antígenos conhecidos. O antígeno também pode estar na forma de um ácido nucleico que codifica um peptídeo antigênico em uma forma adequada para expressão em um indivíduo e apresentação ao sistema imunológico do indivíduo imunizado. Além disso, o antíge- no pode ser um antígeno completo ou pode ser um fragmento de um antígeno completo compreendendo pelo menos um epítopo.

[0060] A fim de melhorar a incorporação do antígeno nas vesícu- las lipídicas catiônicas e também para melhorar a liberação às células do sistema imunológico, o antígeno pode ser modificado para aumen- tar sua hidrofobicidade ou a carga negativa no antígeno. A hidrofobici- dade de um antígeno pode ser aumentada, como, por exemplo, pela conjugação com uma cadeia lipídica ou aminoácidos hidrofóbicos, a fim de melhorar a solubilidade do antígeno nas cadeias acila hidrofóbi- cas do lipídeo catiônico, mantendo as propriedades antigênicas da mo- lécula. O antígeno modificado pode ser uma lipoproteína, um lipopep- tídeo, uma proteína ou peptídeo modificado com uma sequência de aminoácidos com hidrofobicidade aumentada e suas combinações. O antígeno modificado pode ter um ligante conjugado entre o lipídeo e o antígeno, como, por exemplo, uma .alfa. ou .epsilon.-palmitoil lisina N- terminal pode ser conectada ao antígeno através de um ligante de di- peptídeo serina-serina. Além disso, o antígeno pode ser manipulado para aumentar sua carga negativa alterando o tampão de formulação no qual o antígeno é encapsulado nos complexos lipídicos catiônicos ou anexando covalentemente porções aniônicas, como, por exemplo, aminoácidos aniônicos ao antígeno.

[0061] Em algumas modalidades aqui descritas, o lipídeo catiôni- co pode estar na forma de conjuntos de nanopartículas. Quando aqui usado, o termo "nanopartícula" refere-se a uma partícula com um ta- manho medido na escala de nanômetros. Quando aqui usada, a "na- nopartícula" refere-se a uma partícula com uma estrutura com um ta- manho inferior a cerca de 10.000 nanômetros. Em algumas modalida- des, a nanopartícula é um lipossoma.

[0062] As composições lipídicas catiônicas da presente invenção podem formar lipossomas que são opcionalmente misturados com an- tígeno e podem conter os lipídeos catiônicos quirais sozinhos ou lipí- deos catiônicos quirais em combinação com lipídeos neutros. As es- pécies lipídicas catiônicas quirais adequadas incluem, mas não estão limitadas, aos enantiômeros R e S.

[0063] Quando aqui usado, o termo "lipídeo catiônico" refere-se a qualquer uma de várias espécies lipídicas que carregam uma carga líquida positiva em pH fisiológico ou têm um grupo protonável e são carregadas positivamente em pH menor que o pKa. Lipídeos catiôni- cos adequados de acordo com a presente descrição podem incluir, mas não estão limitados a: 3-β[4N—(1N,8-diguanidino espermidina)- carbamoil]colesterol (BGSC); 3-β[N,N-diguanidinoetil-aminoetano)- carbamoil]colesterol; BGTC); N,N1N2N3Tetra- metiltetrapalmitilespermina (celfectina); N-t-butil-N′-tetradecil-3- tetradecil-aminopropion-amidina (CLONfectina); brometo de dimetildio- ctadecil amônio (DDAB); brometo de 1,2-dimiristiloxipropil-3-dimetil- hidroxi etil amônio (DMRIE); trifluoroacetato de 2,3-dioleoilóxi-N- [2(esperminacarboxamido)etil]-N,N-dimetil-1-p- -ropanamínio) (DOS- PA); 1,3-dioleoilóxi-2-(6-carboxispermil)-propil amida (DOSPER); 4- (2,3-bis-palmitoilóxi-propil)-1-metil-1H-imidazol (DPIM), iodeto de

N,N,N',N'-tetrametil-N,N'-bis(2-hidroxietil)-2,3-dioleoilóxi-1,4-butano- diamônio) (Tfx-50); cloreto de N-1-(2,3-dioleoilóxi)propil-N,N,N-trimetil amônio (DOTMA) ou outros tensoativos de N-(N,N-1-dialcóxi)-alquil- N,N,N-amônio trissubstituído; 1,2 dioleoil-3-(4'-trimetilamônio) butanol- sn-glicerol (DOBT) ou colesteril (4'trimetilammonia) butanoato (ChOTB), em que o grupo trimetilamônio está conectado por meio de uma subdivisão espaçadora de butanol à cadeia dupla (por DOTB) ou grupo colesterila (para ChOTB); DORI (DL-1,2-dioleoil-3- dimetilaminopropil-.beta.-hidroxietilamônio) ou DORIE (DL-1,2-O- dioleoil-3-dimetilaminopropil-.beta.-hidroxietilamônio) (DORIE) ou seus análogos, como descrito em WO 93/03709; Éster de colina de 1,2- dioleoil-3-succinil-sn-glicerol (DOSC); éster de hemissuccinato de co- lesterila (ChOSC); lipopoliaminas como dioctadecilamidoglicilespermi- na (DOGS) e dipalmitoil fosfatidiletanolamilespermina (DPPES), iodeto de colesteril-3.beta.-carboxil-amido-etilenotrimetilamônio, iodeto de 1- dimetilamino-3-trimetilamônio-DL-2-propil-colesteril carboxilato, coles- teril-3-O-carboxiamidoetilenoamina, iodeto de colesteril-3-.beta.- oxisuccinamido-etilenotrimetilamônio, iodeto de 1-dimetilamino-3- trimetilamônio-DL-2-propil-colesteril-3-.beta.-oxissuccinato, 2-(2- trimetilamônio)-etilmetilamino etil-colesteril-3-.beta.-oxissuccinato, io- deto de 3-.beta.-N-(N’,N'-dimetilaminoetano)carbamoil-colesterol (DC- col) e 3-.beta.-N-(polietilenoimina)-carbamoilcolesterol; O,O'-dimiristil- N-lisil aspartato (DMKE); O,O'-dimiristil-N-lisil-glutamato (DMKD); bro- meto de 1,2-dimiriloxipropil-3-dimetil-hidroxi etil amônio (DMRIE); 1,2- dilauroil-sn-glicero-3-etilfosfocolina (DLEPC); 1,2-dimiristoil-sn-glicero- 3-etilfosfocolina (DMEPC); 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-etilfosfocolina (DOEPC); 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-etilfosfocolina (DPEPC); 1,2- distearoil-sn-glicero-3-etilfosfocolina (DSEPC); 1,2-dioleoil-3- trimetilamônio propano (DOTAP); dimetilaminopropano de dioleoíla (DODAP); 1,2-palmitoil-3-trimetilamônio propano (DPTAP); 1,2-

distearoil-3-trimetilamônio propano (DSTAP), 1,2-miristoil-3- trimetilamônio propano (DMTAP); e dodecilsulfato de sódio (SDS). Além disso, variantes estruturais e derivados de qualquer um dos lipí- deos catiônicos descritos também são considerados.

[0064] Em algumas modalidades, o lipídeo catiônico é seleciona- do do grupo que consiste em DOTAP, DOTMA, DOEPC e combina- ções dos mesmos. Em outras modalidades, o lipídeo catiônico é DO- TAP. Em ainda outras modalidades, o lipídeo catiônico é DOTMA. Em outras modalidades, o lipídeo catiônico é DOEPC. Em algumas moda- lidades, o lipídeo catiônico é purificado.

[0065] Em algumas modalidades, o lipídeo catiônico é um enan- tiômero de um lipídeo catiônico. O termo "enantiômero" refere-se a um estereoisômero de um lipídeo catiônico que é uma imagem invertida não sobreponível de seu estereoisômero equivalente, por exemplo, enantiômeros R e S. Em vários exemplos, o enantiômero é R-DOTAP ou S-DOTAP. Em um exemplo, o enantiômero é R-DOTAP. Em outro exemplo, o enantiômero é S-DOTAP. Em algumas modalidades, o enantiômero é purificado. Em vários exemplos, o enantiômero é R- DOTMA ou S-DOTMA. Em um exemplo, o enantiômero é R-DOTMA. Em outro exemplo, o enantiômero é S-DOTMA. Em algumas modali- dades, o enantiômero é purificado. Em vários exemplos, o enantiôme- ro é R-DOEPC ou S-DOEPC. Em um exemplo, o enantiômero é R- DOEPC. Em outro exemplo, o enantiômero é S-DOEPC. Em algumas modalidades, o enantiômero é purificado.

[0066] Deve-se notar que, para fins de ilustração, vários exem- plos são realizados utilizando um modelo de antígeno de HPV que foi bem estudado e que serve como antígeno adequado para ilustrar o efeito da super-regulação do interferon tipo I na apresentação cruzada de antígenos para células T CD8+.

[0067] Em geral, ao se referir ao tratamento, as composições aqui discutidas podem ser administradas por via oral, parenteral (por exemplo, administração intravenosa ou subcutânea), por injeção in- tramuscular, por injeção intraperitoneal, por via transdérmica, extra- corpórea, por administração intracavidade, por via transdérmica ou tó- pica ou semelhante, incluindo administração tópica intranasal ou ad- ministração por inalante. A administração tópica pode ser oftalmica- mente, vaginal, retal ou intranasal. Quando aqui usado, "administração intranasal tópica" significa a liberação das composições no nariz e nas passagens nasais através de uma ou de ambas as narinas e pode compreender a liberação por um mecanismo de pulverização ou me- canismo de gotículas ou por aerossolização do ácido nucleico ou ve- tor. A administração das composições por inalante pode ser feita atra- vés do nariz ou da boca, via administração por um mecanismo de pul- verização ou gotícula. A liberação também pode ser diretamente em qualquer área do sistema respiratório (por exemplo, pulmões) via intu- bação.

[0068] Como aqui usado, "administração parenteral" da composi- ção, se usado, geralmente é caracterizado por injeção. Os injetáveis podem ser preparados em formas convencionais, como soluções ou suspensões líquidas, formas sólidas adequadas para solução de sus- pensão em líquido antes da injeção ou como emulsões. A administra- ção parenteral inclui o uso de uma liberação lenta, uma liberação de tempo ou um sistema de liberação prolongada, de modo que uma do- sagem constante seja mantida.

[0069] O termo "terapeuticamente eficaz" significa que a quanti- dade da composição utilizada é de quantidade suficiente para melho- rar uma ou mais causas ou sintomas de uma doença ou distúrbio, co- mo crescimento celular aberrante, desenvolvimento de tumores e cân- cer. Essa melhoria requer apenas uma redução ou alteração, não ne-

cessariamente eliminação. Essa melhoria pode compreender a obten- ção de uma resposta imune. Dosagens e esquemas eficazes para ad- ministrar as composições descritas podem ser determinados empiri- camente, e fazer tais determinações está dentro dos conhecimentos da técnica. As faixas de dosagem para a administração das composi- ções são aquelas grandes o suficiente para produzir o efeito desejado no qual os sintomas do distúrbio são afetados. A dosagem não deve ser tão grande que cause efeitos colaterais adversos, como reações cruzadas indesejadas, reações anafiláticas e similares. Geralmente, a dosagem varia com a idade, condição, sexo e extensão da doença no paciente, via de administração ou se outros fármacos estão incluídos no regime e pode ser determinada por alguém versado na técnica. A dosagem pode ser ajustada pelo médico em caso de contra-indicação. A dosagem pode variar e pode ser administrada em uma ou mais do- ses diárias, por um ou vários dias. Pode ser encontrada orientação na literatura para dosagens apropriadas para determinadas classes de produtos farmacêuticos.

[0070] A quantidade efetiva específica da composição adminis- trada para qualquer indivíduo ou paciente em particular dependerá de uma variedade de fatores, incluindo a doença ou distúrbio a ser tratado e a gravidade do distúrbio; a identidade e atividade da composição es- pecífica empregada; a idade, peso corporal, estado geral de saúde, sexo e dieta do paciente; o tempo de administração; a via de adminis- tração; a taxa de excreção da composição específica empregada; a duração do tratamento; drogas usadas em combinação ou coinciden- tes com a composição específica empregada e fatores semelhantes bem conhecidos nas técnicas médicas.

[0071] Por exemplo, está bem dentro da experiência da técnica iniciar doses de uma composição em níveis inferiores aos necessários para alcançar o efeito terapêutico desejado e aumentar gradualmente a dosagem até que o efeito desejado seja alcançado. Pode-se também avaliar os aspectos particulares da história médica, sinais, sintomas e exames laboratoriais objetivos que se sabe serem úteis na avaliação do status de um indivíduo que necessita de atenção para o tratamento de lesões por isquemia-reperfusão, trauma, lesão induzida por fárma- cos/tóxicos, doença neurodegenerativa, câncer ou outras doenças e/ou condições. Esses sinais, sintomas e exames laboratoriais objeti- vos variarão, dependendo da doença ou condição em particular a ser tratada ou prevenida, como será conhecido por qualquer clínico que trate esses pacientes ou um pesquisador que esteja realizando experi- ências nesse campo. Por exemplo, se, com base na comparação com um grupo de controle apropriado e/ou conhecimento da progressão normal da doença na população em geral ou no indivíduo ou paciente em particular: (1) a condição física de um indivíduo estiver melhorada (por exemplo, um tumor regrediu parcial ou totalmente), (2) a progres- são da doença ou condição é mostrada estabilizada, retardada ou re- vertida ou (3) a necessidade de outros medicamentos para tratar a do- ença ou condição é diminuída ou evitada, então um regime de trata- mento específico será considerado eficaz.

[0072] A quantidade eficaz de uma terapêutica prescrita pode ser administrada diariamente, a cada dois dias, semanalmente, mensal- mente, a cada dois meses, anualmente ou em qualquer outro intervalo que seja determinado pelo médico ou provedor como eficaz. Por exemplo, a dose diária eficaz pode ser dividida em doses múltiplas pa- ra fins de administração. Consequentemente, o tratamento terapêutico de dose única pode conter essas quantidades ou submúltiplos para formar a dose diária. A terapêutica descrita também pode ser adminis- trada como parte de uma combinação de tratamentos antitumorais ou anticâncer. Em um aspecto, as composições descritas podem ser ad- ministradas ao indivíduo ou paciente antes do tratamento com um tra-

tamento antitumoral ou anticâncer. Em um aspecto, as composições descritas podem ser administradas simultaneamente com o tratamento antitumoral ou anticâncer. Em um aspecto, a composição descrita po- de ser administrada subsequentemente ao tratamento antitumoral ou anticâncer. Em um aspecto, o paciente ou o indivíduo recebe os dois tratamentos em um horário alternado ou rotativo. Em um aspecto, o indivíduo ou paciente recebe um tratamento singular com a composi- ção descrita. Em um aspecto, o indivíduo ou paciente recebe pelo me- nos um tratamento com a composição descrita. Em um aspecto, o in- divíduo ou paciente recebe pelo menos um tratamento com a compo- sição descrita e pelo menos um outro tratamento antitumoral ou anti- câncer.

[0073] A dose pode ser ajustada pelo médico individual ou pelo indivíduo no caso de qualquer contra-indicação. A dosagem pode vari- ar e pode ser administrada em uma ou mais doses diárias, por um ou vários dias. Pode ser encontrada orientação na literatura para dosa- gens apropriadas para determinadas classes de produtos farmacêuti- cos.

[0074] A terminologia aqui usada tem o objetivo de descrever apenas aspectos particulares e não se destina a ser limitante.

[0075] Como usado no relatório descritivo e nas reivindicações anexas, as formas singulares "um", "uma" e "o(a)" podem incluir refe- rentes plurais, a menos que o contexto indique claramente o contrário. Assim, por exemplo, a referência a "um composto" inclui misturas de compostos, a referência a "um veículo farmacêutico" inclui misturas de dois ou mais desses veículos e similares.

[0076] As faixas podem ser expressas aqui como de "cerca de" um valor específico e/ou para "cerca de" outro valor específico. O ter- mo "cerca de" é usado aqui para significar aproximadamente, na regi- ão de, aproximadamente, ou em torno de. Quando o termo "cerca de"

é usado em conjunto com um faixa numérica, ele modifica essa faixa estendendo os limites acima e abaixo dos valores numéricos estabele- cidos. Em geral, o termo "cerca de" é usado aqui para modificar um valor numérico acima e abaixo do valor declarado por uma variação de 20%. Quando essa faixa é expressa, um aspecto inclui desde um valor em particular e/ou até outro valor em particular. Da mesma forma, quando os valores são expressos como aproximações, pelo uso do antecedente "cerca de", será entendido que o valor específico forma um aspecto. Será entendido ainda que os pontos finais de cada uma das faixas são significativos tanto em relação ao outro ponto final, quanto independentemente do outro ponto final.

[0077] A palavra "ou", quando aqui usada, significa qualquer membro de uma lista específica e também inclui qualquer combinação de membros dessa lista.

[0078] "Inibir", "inibindo" e "inibição" significam reduzir ou diminuir uma atividade, resposta, condição, doença ou outro parâmetro biológi- co. Isso pode incluir, entre outros, a ablação completa da atividade, resposta, condição ou doença. Isso também pode incluir, por exemplo, uma inibição ou redução de 10% na atividade, resposta, condição ou doença em comparação com o nível nativo ou de controle. Assim, em um aspecto, a inibição ou redução pode ser 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 por cento ou qualquer quantidade de redução intermediária em comparação com os níveis nativos ou de controle. Em um aspecto, a inibição ou redução é de 10 a 20, 20 a 30, 30 a 40, 40 a 50, 50 a 60, 60 a 70, 70 a 80, 80 a 90 ou 90 a 100 por cento em comparação com o nativo ou níveis de controle. Em um aspecto, a inibição ou redução é de 0 a 25, 25 a 50, 50 a 75 ou 75 a 100 por cento em comparação com os níveis nativos ou de controle.

[0079] "Modular", "modulando" e "modulação", quando aqui usa- do, significam uma mudança na atividade ou função ou número. A mu-

dança pode ser um aumento ou uma diminuição, um realce ou uma inibição da atividade, função ou número.

[0080] "Promover", "promoção" e "promovendo" referem-se a um aumento em uma atividade, resposta, condição, doença ou outro pa- râmetro biológico. Isso pode incluir, mas não se limita, ao início da ati- vidade, resposta, condição ou doença. Isso também pode incluir, por exemplo, um aumento de 10% na atividade, resposta, condição ou do- ença em comparação com o nível nativo ou de controle. Assim, em um aspecto, o aumento ou promoção pode ser 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100% ou mais, ou qualquer quantidade de promoção entre os níveis nativo ou de controle. Em um aspecto, o aumento ou a promo- ção é de 10 a 20, 20 a 30, 30 a 40, 40 a 50, 50 a 60, 60 a 70, 70 a 80, 80 a 90 ou 90 a 100 por cento em comparação com o nativo ou níveis de controle. Em um aspecto, o aumento ou a promoção é de 0 a 25, 25 a 50, 50 a 75 ou 75 a 100 por cento ou mais, como 200, 300, 500 ou 1000 por cento a mais em comparação com os níveis nativos ou de controle. Em um aspecto, o aumento ou a promoção pode ser superior a 100% em comparação com os níveis nativos ou de controle, como 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500% ou mais, em compara- ção com o nativo ou níveis de controle.

[0081] Como aqui usado, o termo "determinação" pode se referir à medição ou determinação de uma quantidade ou quantia ou altera- ção de atividade. Por exemplo, determinar a quantidade de um poli- peptídeo descrito em uma amostra como aqui utilizado pode se referir às etapas que o especialista levaria para medir ou verificar algum valor quantificável do polipeptídeo na amostra. A técnica está familiarizada com as maneiras de medir uma quantidade dos polipeptídeos descri- tos e nucleotídeos descritos em uma amostra.

[0082] O termo "amostra" pode se referir a um tecido ou órgão de um indivíduo; uma célula (dentro de um indivíduo, tirada diretamente de um indivíduo ou de uma célula mantida em cultura ou de uma li- nhagem celular cultivada); um lisado celular (ou fração lisada) ou ex- trato celular; ou uma solução contendo uma ou mais moléculas deriva- das de uma célula ou material celular (por exemplo, um polipeptídeo ou ácido nucleico). Uma amostra também pode ser qualquer fluido corporal ou excreção (por exemplo, mas não limitado a, sangue, urina, fezes, saliva, lágrimas, bile) que contenha células ou componentes ce- lulares.

[0083] A invenção será ainda descrita com referência aos seguin- tes exemplos; no entanto, deve ser entendido que a invenção não está limitada a tais exemplos. Em vez disso, tendo em vista a presente descrição que descreve o melhor modo atual para a prática da inven- ção, muitas modificações e variações se apresentariam àqueles ver- sados na técnica sem se afastar do escopo e espírito desta invenção. Todas as alterações, modificações e variações dentro do significado e do alcance da equivalência das reivindicações devem ser considera- das dentro de seu escopo.

[0084] A presente invenção foi descrita de maneira ilustrativa. Deve-se entender que a terminologia usada tem como intenção ser da natureza das palavras de descrição e não de limitação.

[0085] Muitas modificações e variações da presente invenção são possíveis à luz dos ensinamentos acima. Portanto, dentro do es- copo das reivindicações anexas, a presente invenção pode ser prati- cada além da descrita especificamente.

EXEMPLOS

[0086] Para os Exemplos descritos abaixo, foram utilizados os seguintes materiais, métodos e protocolos. Materiais e Métodos

[0087] Animais: Camundongos C57BL6/J de seis a doze sema- nas de idade (camundongos B6), camundongos reprodutores transgê-

nicos B6. Cg-Tg (HLA-A/H2-D)2Enge/J expressando o gene HLA-A2 humano (camundongos AAD) e camundongos reprodutores nocaute de gene IFNAR -/-(B6.129S2-Ifnar1tm1Agt/Mmjax) obtidos de Jackson laboratories (Bar Harbor, ME) foram alojados em condições livres de patógenos específicos. Os procedimentos de criação, criação de ani- mais e experimentais foram realizados de acordo com os protocolos da IACUC aprovados pelo DLAR.

[0088] Peptídeos e Reagentes: Peptídeos e Reagentes: R- DOTAP e S-DOTAP de grau cGMP (1,2-dioleoil-3-trimetil-amônio- propano) foram fornecidos pela Merck & Cie, Shaffhausen, Switzer- land. As nanopartículas lipossômicas R-DOTAP de grau cGMP foram produzidas por processos padrão de fabricação de lipossomas. Antí- genos peptídicos (KF18: KSSGQAEPDRAHYNIVTF (SEQ ID NO: 3), SF9: SIINFEKL (SEQ ID NO: 1), RF9: RAHYNIVTF (SEQ ID NO: 2) foram sintetizados e purificados para > 95% de pureza por GenScript, Piscataway, New Jersey, USA. Todos os outros lipídeos catiônicos fo- ram adquiridos na Avanti polar Lipids, Birmingham, AL.

[0089] Linhagens celulares e cultura de células dendríticas deri- vadas da medula óssea: As células dendríticas derivadas da medula óssea foram obtidas por cultura das células hematopoiéticas da medu- la óssea por 8 dias em meio RPMI completo (meio RPMI contendo 10% de SFB, 1 mM de L-glutamina, 1mM de piruvato de sódio, amino- ácidos não essenciais MEM 1X, β-mercaptoetanol 50 μM, penicilina 100 u/ml, estreptomicina 100u/ml) suplementado com GM-CSF de ca- mundongo recombinante e IL-4 (para BMDCs convencionais (cDCs)) ou ligante flt3 recombinante (para BMDCs plasmocitoides (pDCs)). As células IFN-α/β B16-Blue™ usadas para detectar IFN tipo I induzido por lipídeos catiônicos foram adquiridas da InvivoGen, San Diego, Ca- lifornia, USA, e as culturas celulares foram mantidas e de acordo com o protocolo do fabricante.

[0090] Ensaio de células repórteres de IFN e análise fenotípica celular: Para detectar IFN, os sobrenadantes das células produtoras de IFN tipo I foram adicionados às células IFN-α/β B16-Blue™ em uma placa de 96 cavidades. Após 24 horas de incubação, os sobrenadan- tes foram analisados quanto à atividade de SEAP usando o reagente QUANTI-Blue™ (InvivoGen, USA), de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, 50 µl de sobrenadantes celulares conten- do SEAP foram misturados com 150 µl de reagente QUANTI-Blue™ e incubados por 3-4 horas a 37 °C, e a absorvência foi medida a 650 nm usando um espectrômetro. As concentrações de IFN tipo I nas amos- tras de teste foram quantificadas utilizando uma curva padrão gerada a partir de células IFN-α/β B16-Blue™ tratadas com IFNβ tipo I recombi- nante no mesmo ensaio. Para medir a expressão de CD69, as sus- pensões de células únicas de linfonodos foram coradas com CD3 con- jugado com fluorocromo e CD69, e as células T CD69+ CD3+ percen- tual em cada linfonodo de drenagem foram medidas usando citometria de fluxo.

[0091] Isolamento de RNA, Análise Nano string e ensaio de ex- pressão gênica: Para a análise da expressão gênica, os linfonodos poplíteos de drenagem (n = 4) foram digeridos enzimaticamente usan- do dissociação celular por 60 minutos a 37 °C, e suspensões de célu- las únicas foram usadas para classificar células CD11c+ usando o classificador de células Sony SY3200. As células CD11c+ purificadas por classificação (células 25K) foram lisadas no tampão de lise celular RLT da Qiagen (Qiagen, USA) e o RNA total foi isolado usando o kit de isolamento de RNA total da Qiagen (Qiagen, USA). O RNA total obtido foi enviado ao laboratório central de genômica da Universidade de Kentucky (Lexington, KY), onde o RNA total foi misturado com o painel de inflamação de camundongo ncounterTM (Nano String Technologies, Seattle, WA), que pode medir mais de 547 genes envol-

vidos na resposta imune. A ligação do mRNA foi detectada com o sis- tema de análise Nanso String nCounter, e os dados crus da contagem foram normalizados e analisados estatisticamente usando o programa SAS pelo laboratório central de genômica do UK. Para estudos de con- firmação usando RT-PCR, os linfonodos foram diretamente lisados no tampão de lise celular RLT, e o RNA total de isolamento foi transcrito reversamente em cDNA usando o kit de transcrição reversa Quanti- Tect (Qiagen, USA). O cDNA foi então amplificado usando o sistema de expressão gênica TaqMan (Applied biosystems, USA) para detectar e quantificar as transcrições de IFNα e IFNβ de camundongos em re- lação à expressão de GAPDH usando reação quantitativa de PCR.

[0092] Vacinação e Avaliação de respostas de células T específi- cas de antígeno: Os camundongos foram anestesiados com isoflurano e o sítio de injeção foi raspado e limpo com etanol a 70% antes da va- cinação. Para avaliar a resposta das células T específicas de antígeno usando ELISPOT, os camundongos foram vacinados com duas doses (100 µl/dose) de formulação de vacina contendo lipídeos catiônicos e peptídeos antigênicos liberados em intervalos de 7 dias ou uma dose da formulação de CFA preparada por emulsão de volumes iguais de adjuvante de freund completo e peptídeo antigênico liberado no dia 0. As respostas específicas do antígeno foram avaliadas 14 dias após a primeira vacina. Para medir as respostas específicas do antígeno, as células do baço dos camundongos sacrificados foram usadas para de- tectar as respostas das células T específicas do antígeno usando um ensaio IFN-Ɣ ELISPOT (Mabtech, Inc, Cincinnati, Ohio, USA). Para ensaios com IFN-Ɣ ELISPOT, foram estimuladas 2,5 x 105 células do baço processadas por 18-24 horas a 37 °C com epítopos de células T CD8 de interesse em uma placa de 96 cavidades pré-revestida com o anticorpo de captura de IFN-ɣ de camundongo. Após estimulação, as cavidades foram lavadas com PBS e incubadas com anticorpo anti-

IFN3 conjugado com biotina, seguido pelo anticorpo estreptavidina- HRP. Para visualizar as células produtoras de IFN- ɣ específicas do antígeno, as cavidades foram incubadas por 6 minutos com substrato de TMB, lavados com água e secados ao ar. Os pontos foram digitali- zados e contados usando o software CTL ImmunoSpot Analyzer e ImmunoSpot Ver.4 (Cellular Technology Limited, Cleveland, Ohio, USA). As contagens pontuais foram resumidas como valores media- nos de amostras em triplicata. Cada amostra tinha cavidades de con- trole não estimuladas e de PMA/Ionomicina para detectar anteceden- tes e controle positivo. As cavidades foram consideradas positivas se a contagem de manchas exceder 5 pontos e a resposta específica de antígeno como positiva se a contagem de manchas for superior a três vezes em comparação aos controles. Exemplo 1 R-DOTAP Induz a Expressão do Gene Interferon Tipo I nos Linfonodos de Drenagem

[0093] Para avaliar a expressão gênica induzida por nanopartícu- las catiônicas, os camundongos C57BL/6J foram injetados com 100 µl de nanopartículas de R-DOTAP 12 mM por via subcutânea atrás do pescoço, e expressão gênica inflamatória nos linfonodos de drenagem analisados 4 ou 24 horas após a vacinação. Camundongos injetados com PBS e LPS (50 µg/camundongo) (ponto de tempo de 24 horas) foram usados como controle negativo e positivo, respectivamente. 4h ou 24 horas após a injeção, os linfonodos de drenagem axilar e bra- quial de cada camundongo foram reunidos e processados por digestão com colagenase. As células dendríticas ativadas (CD11c+) nas sus- pensões de células linfonodais foram purificadas e lisadas em tampão RLT e processadas para análise de expressão genética relativa usan- do o kit de inflamação do camundongo nCounter® e tecnologias na- nostring. Verificou-se que a injeção de R-DOTAP altera significativa-

mente a expressão de vários genes inflamatórios nos dois momentos. Vários genes, incluindo IFN-1α e IFN-1β, apresentaram aumentos maiores que 5 vezes maiores que o LPS, o qual foi usado como con- trole positivo. A expressão de outros genes, incluindo Cxcl10, também foi significativamente aumentada e mais comparável aos níveis induzi- dos pelo LPS (Figura 1). EXEMPLO 2 R-DOTAP e S-DOTAP Induzem a Expressão de Gene Interferon-α e Interferon-β nos Linfonodos de Drenagem

[0094] Para comparar a expressão do gene interferon tipo I por R e S-DOTAP, foi realizado um estudo semelhante ao descrito no Exem- plo 1. Os camundongos C57BL/6J foram injetados com 50 µl de nano- partículas RDOTAP 6 mM por via subcutânea nas almofadas das pa- tas. Camundongos injetados com PBS e LPS (50 µg/camundongo) (ponto de tempo de 24 horas) foram usados como controle negativo e positivo, respectivamente. 3 h ou 24 horas após a injeção, os linfono- dos de drenagem poplítea de cada camundongo foram reunidos e li- sados em tampão RLT e processados para análise de expressão gêni- ca relativa usando o teste de expressão gênica Taqman® e RT-PCR. Os estudos confirmam que R e S-DOTAP são fortes indutores dos in- terferons tipo I (Figura 2). EXEMPLO 3 R-DOTAP e S-DOTAP Super-regulam a Expressão de CD69 Associa- do ao Interferon Tipo I em Células T

[0095] Para entender melhor o efeito e a capacidade dos lipídeos catiônicos de ativar os interferons tipo I, camundongos C57BL/6J ou IFNAR -/- foram injetados com 50 µl de nanopartículas de R-DOTAP 6 mM ou S-DOTAP 6 mM ou sacarose 280 mM subcutaneamente nas almofadas das patas. 24 horas após a injeção, foram isolados linfono- dos de drenagem poplíteos de cada camundongo, e suspensões de célula única de linfonodos foram coradas com CD3 e CD69 conjuga- dos com fluorocromo. R-DOTAP sozinho (sem antígeno) resultou em um aumento visível no tamanho do DLN e isso ocorreu devido a um aumento constante no número de células totais ao longo de um perío- do de 7 dias (Figura 3A). Estudos do influxo de células T para o DLN com toxina pertussis sugerem que os lipídeos estruturalmente relacio- nados ao R-DOTAP induzem quimiocinas do linfonodo, provavelmente um resultado direto da sinalização tipo I do IFN. Foi confirmado que este aumento no número de células totais depende da sinalização de IFN tipo I, pois foi bastante reduzido no camundongo nocaute de IFNαR (Figura 3B). Sabe-se que o IFN tipo I inibe a saída de linfócitos dos órgãos linfoides através da super-regulação de CD69 que, por sua vez, inibe o receptor de fosfato de esfingosina 1 necessário para a sa- ída de linfócitos. Postulamos, portanto, que a injeção de S-DOTAP e R-DOTAP resultaria na super-regulação de CD69 no DLN. De fato, a injeção subcutânea de ambos os lipídeos catiônicos em camundongos tipo selvagem resultou na super-regulação de CD69 mais fortemente nas células T. Em contraste, não foi observada super-regulação de CD69 após a injeção de R-DOTAP de camundongos nocaute de IFNαR, demonstrando que a super-regulação induzida por R-DOTAP de CD69 é dependente de IFN tipo I (Figura 3C). Os dados represen- tam a % de células T CD69+ CD3+ em cada linfonodo de drenagem. EXEMPLO 4 Vários Lipídeos Catiônicos Super-regulam os Interferons Tipo I

[0096] Foram realizados estudos in vitro para avaliar o potencial de vários lipídeos catiônicos para induzir os interferons tipo I. Neste estudo foram estudados os lipídeos catiônicos DOTAP, DOEPC e DOTMA. O lipídeo neutro DOPC também foi avaliado para confirmar a especificidade da super-regulação do interferon para lipídeos catiôni- cos. Em um estudo, células dendríticas derivadas da medula óssea

(BMDCs) de camundongos IFNAR-Ko foram estimuladas com concen- trações indicadas (6-400 µM) de lipídeos catiônicos ou controle positi- vo de LPS (1-500 ng/ml) por 24 horas (Figura 4A). Em um segundo estudo, BMDCs induzidas por FLT3 (pDCs) e BMDC derivada de GM- CSF/IL-4 (cBMDCs) foram estimuladas com a concentração indicada (6-400 µM) de concentrações de controle positivo R-DOTAP ou LPS (1-500 ng/ml) durante 24 horas (Figura 4B). Para medir a produção de interferon tipo I, os sobrenadantes celulares (100 µl) foram adicionados às culturas de células repórter (célula B16.Blue-IFNα/β da invivogen, USA) e incubados por 18 horas para estimular a produção induzida por interferon tipo I de fosfatase alcalina secretada (SEAP) por células re- pórteres. A atividade de SEAP nos sobrenadantes das células repórter foi quantificada utilizando o kit de ensaio colorimétrico SEAP de acordo com o protocolo de fabricação. Os interferons tipo I secretados por BMDC foram quantificados utilizando uma curva padrão gerada utili- zando a atividade de SEAP estimulada por IFN-p de camundongo re- combinante na linhagem celular repórter. Os estudos confirmam que a capacidade de super-regular os interferons tipo I não é específica do DOTAP, mas pode ser ativada por vários lipídeos catiônicos. Também confirma a incapacidade de lipídeos neutros em ativar a via do interfe- ron tipo I. EXEMPLO 5 Resposta das Células T CD8+ Mediada por Lipídeos Catiônicos Dimi- nuída é Observada em Camundongos com Deficiência de IFN Tipo I

[0097] A super-regulação demonstrada dos genes IFN tipo I por lipídeos catiônicos sugere que os lipídeos catiônicos têm como alvo a via do IFN tipo I para induzir respostas robustas das células T CD8+. Para confirmar ainda mais essa hipótese, uma formulação R-DOTAP contendo um epítopo de célula T CD8+ de camundongo bem caracte- rizado (SIINFEKL (SEQ ID NO: 1)) de ovalbumina de frango ou epíto-

po de célula T CD8 derivado da proteína HPV16 -E7 (RF9: RAHYNI- VTF ( SEQ ID NO: 2)) foi administrada a camundongos C57BL/6J tipo selvagem e a camundongos IFNAR -/- deficientes em sinal de interfe- ron tipo I nos dias 0 e 7. Os camundongos também foram vacinados com adjuvante de Freund completo (CFA) + SIINFEKL . A vacina so- mente para peptídeos foi usada como controle positivo. No dia 14, as respostas de células T CD8+ específicas do antígeno (SIINFEKL) in- duzidas por R-DOTAP ou CFA foram avaliadas usando o ensaio IFN-γ ELISPOT. Como mostrado na Figura 5A, a vacinação de camundon- gos tipo selvagem com a formulação DOTAP induziu respostas robus- tas de células T CD8+ específicas ao antígeno que são mais altas em magnitude do que a formulação com adjuvante CFA. Em contraste, a resposta das células T CD8+ induzida por R-DOTAP é drasticamente reduzida nos camundongos IFNAR -/-, embora nenhuma diferença se- ja observada com a formulação adjuvada por CFA. Observamos resul- tados semelhantes (Figura 5B) mesmo com um antígeno associado a um tumor expresso por tumores positivos para HPV16. Está bem do- cumentado que o adjuvante CFA tem como alvo várias vias TLR e, portanto, pode ignorar o requisito de sinalização de IFN tipo I para in- duzir respostas de células T CD8+ específicas do antígeno.

[0098] A perda da eficácia induzida por lipídeos catiônicos nos camundongos desprovidos de sinalização de IFN tipo I, associada à capacidade demonstrada de ativar fortemente os genes IFN tipo I, de- monstra fortemente que o R-DOTAP facilita efetivamente a apresenta- ção cruzada de antígenos e também ativa simultaneamente a via de IFN tipo I para gerar respostas imunes de células T de antígeno robus- to (Figura 5).

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Método para modificar uma via de sinalização de IFN tipo I em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende a admi- nistração de um lipídeo catiônico ao mamífero.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o lipídeo catiônico compreende 1,2-dioleoil-3- trimetilamônio propano (DOTAP), cloreto de N-1-(2,3-dioleoilóxi)- propil-N,N,N-trimetil amônio (DOTMA), 1,2-dioleoil-sn-glicero-3- etilfosfocolina (DOEPC) e suas combinações.

3. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o lipídeo catiônico compreende um enantiômero do lipídeo catiônico.

4. Método, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o lipídeo catiônico é o 1,2-dioleoil-3-trimetilamônio propano (DOTAP).

5. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o enantiômero é (R)-1,2-dioleoil-3-trimetilamônio pro- pano (R-DOTAP) ou (S)-1,2-dioleoil-3-trimetilamônio propano (S- DOTAP).

6. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a via de sinalização de IFN tipo I é super- regulada/ativada.

7. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a via de sinalização de IFN tipo I é sub- regulada/desativada.

8. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o lipídeo catiônico compreende 1,2-dioleoil-3- trimetilamônio propano (DOTAP), cloreto de N-1-(2,3-dioleoilóxi)- propil-N,N,N-trimetilamônio (DOTMA), 1,2-dioleoil-sn-glicero-3- etilfosfocolina (DOEPC) e suas combinações.

9. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o lipídeo catiônico compreende um enantiômero do lipídeo catiônico.

10. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o enantiômero é (R)-1,2-dioleoil-3-trimetilamônio pro- pano (R-DOTAP) ou (S)-1,2-dioleoil-3-trimetilamônio propano (S- DOTAP)

11. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda um antígeno.

12. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracteriza- do pelo fato de que compreende ainda um antígeno.

13. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracteriza- do pelo fato de que a resposta da célula T é elevada.

14. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracteriza- do pelo fato de que as respostas da célula T CD8+ específica do antí- geno são elevadas.

15. Método para induzir uma resposta imunogênica em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende a administração de uma composição compreendendo um lipídeo catiônico, em que a administração do lipídeo catiônico resulta na estimulação de uma via de sinalização de IFN tipo I.

16. Método, de acordo com a reivindicação 15, caracteriza- do pelo fato de que o lipídeo catiônico compreende 1,2-dioleoil-3- trimetilamônio propano (DOTAP), cloreto de N-1-(2,3-dioleoilóxi)- propil-N,N,N-trimetilamônio (DOTMA), 1,2-dioleoil-sn-glicero-3- etilfosfocolina (DOEPC) e suas combinações.

17. Método, de acordo com a reivindicação 16, caracteriza- do pelo fato de que o lipídeo catiônico compreende (R)-1,2-dioleoil-3- trimetilamônio propano (R-DOTAP).

18. Método, de acordo com a reivindicação 17, caracteriza-

do pelo fato de que a resposta da célula T é elevada.

19. Método, de acordo com a reivindicação 18, caracteriza- do pelo fato de que as respostas da célula T CD8+ específica do antí- geno são elevadas.

20. Método para tratamento de câncer em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende a administração de uma composição compreendendo um lipídeo catiônico, em que a adminis- tração do lipídeo catiônico resulta na estimulação de uma via de sinali- zação de IFN tipo I.

21. Método, de acordo com a reivindicação 20, caracteriza- do pelo fato de que o lipídeo catiônico compreende 1,2-dioleoil-3- trimetilamônio propano (DOTAP), cloreto de N-1-(2,3-dioleoilóxi)- propil-N,N,N-trimetilamônio (DOTMA), 1,2-dioleoil-sn-glicero-3- etilfosfocolina (DOEPC) e suas combinações.

22. Método, de acordo com a reivindicação 21, caracteriza- do pelo fato de que o lipídeo catiônico compreende (R)-1,2-dioleoil-3- trimetilamônio propano (R-DOTAP).

23. Método, de acordo com a reivindicação 20, caracteriza- do pelo fato de que compreende ainda a administração de um antíge- no.

24. Método, de acordo com a reivindicação 23, caracteriza- do pelo fato de que o antígeno é um antígeno tumoral.

25. Método, de acordo com a reivindicação 24, caracteriza- do pelo fato de que o antígeno tumoral é o HPV.