BR112020008442A2 - uso de um rnasi contra proteína s na preparação de um medicamento para o tratamento de hemofilia, forma de dosagem para a prevenção ou tratamento de hemofilia - Google Patents
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Abstract
A presente invenção se refere a um RNAsi contra proteína S para uso em um método de tratamento de hemofilia. Está igualmente no escopo da presente invenção um método para tratar hemofilia em um paciente que precisa do mesmo, compreendendo administrar ao paciente uma molécula compreendendo um RNAsi de acordo com a invenção, e um forma de dosagem para a prevenção ou tratamento de hemofilia, compreendendo uma molécula compreendendo um RNAsi de acordo com a invenção.
Description
Relatório Descritivo da Patente de Invenção para “USO DE UM RNAsi CONTRA
[001] A presente invenção se refere a um tratamento de hemofilia usando RNAsi direcionado contra a proteína S.
[002] Hemofilia A (HA) e B (HB) são distúrbios hereditariamente ligados ao X. Estes são causados por mutações no gene (F8) do fator VIII (FVIII) ou gene (F9) do fator IX (FIX), respectivamente, levando à deficiência da proteína codificada, que é um componente essencial da via intrínseca de coagulação (Fig. 1A).
[003] Pacientes com hemofilia grave frequentemente sofrem de sangramento espontâneo no sistema musculoesquelético, tal como hemartrose. Isto pode resultar em deficiência em tenra idade, se não for tratada.
[004] O tratamento atual para hemofilia envolve terapia de reposição de fator. Esta terapia melhora a qualidade de vida (QoL), mas algumas desvantagens permanecem. Os fatores são administrados intravenosamente e, em decorrência de sua curta meia vida, estes podem ser infundidos repetitivamente, uma prática que carrega um grande desconforto para o paciente e um risco para infecção e dano venoso. De maneira mais importante, os pacientes em terapia de substituição de fator podem desenvolver aloanticorpos inibitórios. Os inibidores tornam a terapia de substituição ineficiente, limitam o acesso do paciente a um padrão seguro e eficiente de cuidado e os predispõe a um maior risco de morbidade e mortalidade.
[005] Novas terapias focam no desenvolvimento de produtos capazes de diminuir a frequência de infusões profiláticas, melhorando potencialmente assim o aumento tanto na conformidade à terapia quanto na QoL. Além de FVIII e FIX de longa duração, abordagens inéditas compreendem a substituição do gene necessário para a produção do fator de coagulação endógeno, a tecnologia de anticorpo bi-específico para mimetizar a função de coagulação do fator ausente, e o alvejamento de inibidores de coagulação tal como inibidor da via de fator tecidual (TFPI) ou antitrombina como uma estratégia para reequilibrar a coagulação em pacientes com hemofilia. Recentemente, observou-se que uma serpina específica de proteína C ativada (APC) recupera a geração de trombina in vitro e restabelece a hemostase em modelos de camundongo com hemofilia.
[006] Com base na tecnologia de ponta mencionada anteriormente, o objetivo da presente invenção é prover meios e métodos para prover um tratamento inédito para a hemofilia. Este objetivo é atingido pelas reivindicações da presente especificação.
[007] Um primeiro aspecto da invenção provê um RNAsi contra proteína S para uso em um método de tratamento de hemofilia.
[008] O termo hemofilia, no contexto da presente especificação, se refere a uma condição na qual a capacidade do corpo em produzir coágulos sanguíneos é prejudicada. As formas genéticas de hemofilia incluem os distúrbios genéticos de hemofilia A, hemofilia B e hemofilia C.
[009] Proteína S, no contexto da presente especificação, se refere à "proteína S dependente de vitamina K" humana (UniProt ID P07225), codificada pelo gene PROS1 (NCBI Gene ID: 5627).
[010] Duas variações de transcrição de proteína S humana existem. A variação de transcrição 2 é carente em um éxon enquadrado alternado na região codificante 5' comparada à variação de transcrição 1. A isoforma codificada 2 é menor que as isoforma 1. A variação de transcrição 2 é caracterizada por SEQ ID NO 001. À variação de transcrição 1 é caracterizada por SEQ ID NO 002.
[011] O termo RNAsi (RNA de interferência pequena/curta) no contexto da presente especificação se refere a uma molécula de RNA capaz de interferir com a expressão (em outras palavras: prevenindo a expressão) de um gene que compreende uma sequência de ácido nucleico complementar à sequência do RNAsi em um processo denominado interferência de RNA. O termo RNAsi significa incluir tanto RNAsi de fita simples quanto RNAsi de fita dupla. RNAsi é em geral caracterizado por um tamanho de 17-24 bp. O RNAsi de dupla fita é derivado de moléculas de RNA dupla fita maiores | (RNAds). O RNAds longo é clivado por uma endo-ribonuclease (denominado Dicer) para formar RNAsi dupla fita. Em um complexo de nucleoproteína (denominado RISC), o RNAsi dupla fita é desenrolado para formar RNAsi de fita simples. A interferência do RNA frequentemente funciona por meio da ligação de uma molécula de RNAsi a uma molécula de RNAm com uma sequência complementar, resultando na degradação do RNAm. A interferência de RNA também é possível pela ligação de uma molécula de RNAsi em uma sequência intrônica de um pré-RNAm (um RNAm imaturo, não unido) no núcleo de uma célula, resultando em degradação do pré-RNAm.
[012] Os inventores investigaram se alvejar a proteína S (PS) pode promover a hemostase em hemofilia reequilibrando a coagulação (Fig. 1B). PS, codificada pelo gene PROS7, atua como cofator para APC na inativação de fator Va (FVa) e FVlIlla, e para TFPI na inibição de FXa. Este papel duplo torna PS um regulador chave de geração de trombina.
[013] Em certas modalidades, o RNAsi compreende 17-24 nucleotídeos.
[014] Em certas modalidades, o RNAsi compreende 18-22 nucleotídeos.
[015] Em certas modalidades, o RNAsi compreende 19 nucleotídeos.
[016] Em certas modalidades, o RNAsi é caracterizado por uma sequência reversa complementar à SEQ ID 001.
[017] Em certas modalidades, o RNAsi é caracterizado por uma sequência reversa complementar à SEQ ID 002.
[018] Em certas modalidades, é caracterizado por uma sequência reversa complementar a uma sequência selecionada do grupo compreendendo SEQ ID NO 003, SEQ ID NO 004, SEQ ID NO 005, SEQ ID NO 006, SEQ ID NO 007, SEQ ID NO 008, SEQ ID NO 009, SEQ ID NO 010, SEQ ID NO 011, SEQ ID NO 012, SEQID NO 013, SEQ ID NO 014, SEQ ID NO 015, SEQ ID NO 016, SEQ ID NO 017 e SEQ ID NO 018.
[019] Em certas modalidades, o RNAsi é caracterizado por uma sequência reversa complementar à SEQ ID NO 003.
[020] Em certas modalidades, o RNAsi é caracterizado por uma sequência reversa complementar à SEQ ID NO 004.
[021] Em certas modalidades, o RNAsi é caracterizado por uma sequência reversa complementar à SEQ ID NO 005.
[022] Em certas modalidades, o RNAsi é caracterizado por uma sequência reversa complementar à SEQ ID NO 006.
[023] Em certas modalidades, o RNAsi é caracterizado por uma sequência reversa complementar à SEQ ID NO 007.
[024] Em certas modalidades, o RNAsi é caracterizado por uma sequência reversa complementar à SEQ ID NO 008.
[025] Em certas modalidades, o RNAsi é caracterizado por uma sequência reversa complementar à SEQ ID NO 009.
[026] Em certas modalidades, o RNAsi é caracterizado por uma sequência reversa complementar à SEQ ID NO 010.
[027] Em certas modalidades, o RNAsi é caracterizado por uma sequência reversa complementar à SEQ ID NO 011.
[028] Em certas modalidades, o RNAsi é caracterizado por uma sequência reversa complementar à SEQ ID NO 012.
[029] Em certas modalidades, o RNAsi é caracterizado por uma sequência reversa complementar à SEQ ID NO 013.
[030] Em certas modalidades, o RNAsi é caracterizado por uma sequência reversa complementar à SEQ ID NO 014.
[031] Em certas modalidades, o RNAsi é caracterizado por uma sequência reversa complementar à SEQ ID NO 015.
[032] Em certas modalidades, o RNAsi é caracterizado por uma sequência reversa complementar à SEQ ID NO 016.
[033] Em certas modalidades, o RNAsi é caracterizado por uma sequência reversa complementar à SEQ ID NO 017.
[034] Em certas modalidades, o RNAsi é caracterizado por uma sequência reversa complementar à SEQ ID NO 018.
[035] Em certas modalidades, o RNAsi é caracterizado por uma sequência reversa complementar a uma sequência formada justapondo quaisquer duas sequências consecutivas das sequências definidas anteriormente. A título de exemplo não limitante, o RNAsi é caracterizado por uma sequência reversa complementar a uma sequência formada justapondo SEQ ID NO 014 e SEQ ID NO 015.
[036] Em certas modalidades, o RNAsi é caracterizado por uma sequência reversa complementar a uma sequência selecionada do grupo compreendendo em SEQ ID NO 014 (éxon 12), SEQ ID NO 011 (éxon 9), SEQ ID NO 006 (éxon 4), SEQ ID NO 012 (éxon 10) e SEQ ID NO 013 (éxon 11).
[037] Em certas modalidades, o RNAsi é caracterizado por uma sequência reversa complementar a uma sequência caracterizada por nucleotídeos 1-100, 101- 200, 201-300, 301-400, 301-400, 401-500, 501-600, 601-700, 701-800, 801-900, 901- 1000, 1001-1100, 1101-1200, 1201-1300, 1301-1400, 1501-1600, 1701-1800, 1801- 1900, 1901-2000, 2001-2100, 2101-2200, 2201-2300, 2301-2400, 2501-2600, 2701- 2800, 2801-2900, 2901-3000, 3001-3100, 3101-3200, 3201-3300, 3301-3400, 3401- 3500 ou 3501-3580 de SEQ ID NO 001.
[038] Em certas modalidades, o RNAsi é caracterizado por uma sequência reversa complementar a uma sequência caracterizada por nucleotídeos 1-100 de SEQ ID NO 001.
[039] Em certas modalidades, o RNAsi é caracterizado por uma sequência reversa complementar a uma sequência caracterizada por nucleotídeos 101-200 de SEQ ID NO 001.
[040] Em certas modalidades, o RNAsi é caracterizado por uma sequência reversa complementar a uma sequência caracterizada por nucleotídeos 201-300 de SEQ ID NO 001.
[041] Em certas modalidades, o RNAsi é caracterizado por uma sequência reversa complementar a uma sequência caracterizada por nucleotídeos 301-400 de
SEQ ID NO 001.
[042] Em certas modalidades, o RNAsi é caracterizado por uma sequência reversa complementar a uma sequência caracterizada por nucleotídeos 401-500 de SEQ ID NO 001.
[043] Em certas modalidades, o RNAsi é caracterizado por uma sequência reversa complementar a uma sequência caracterizada por nucleotídeos 501-600 de SEQ ID NO 001.
[044] Em certas modalidades, o RNAsi é caracterizado por uma sequência reversa complementar a uma sequência caracterizada por nucleotídeos 601-700 de SEQ ID NO 001.
[045] Em certas modalidades, o RNAsi é caracterizado por uma sequência reversa complementar a uma sequência caracterizada por nucleotídeos 701-800 de SEQ ID NO 001.
[046] Em certas modalidades, o RNAsi é caracterizado por uma sequência reversa complementar a uma sequência caracterizada por nucleotídeos 801-900 de SEQ ID NO 001.
[047] Em certas modalidades, o RNAsi é caracterizado por uma sequência reversa complementar a uma sequência caracterizada por nucleotídeos 901-1000 de SEQ ID NO 001.
[048] Em certas modalidades, o RNAsi é caracterizado por uma sequência reversa complementar a uma sequência caracterizada por nucleotídeos 1001-1100 de SEQ ID NO 001.
[049] Em certas modalidades, o RNAsi é caracterizado por uma sequência reversa complementar a uma sequência caracterizada por nucleotídeos 1100-1200 de SEQ ID NO 001.
[050] Em certas modalidades, o RNAsi é caracterizado por uma sequência reversa complementar a uma sequência caracterizada por nucleotídeos 1201-1300 de SEQ ID NO 001.
[051] Em certas modalidades, o RNAsi é caracterizado por uma sequência reversa complementar a uma sequência caracterizada por nucleotídeos 1301-1400 de SEQ ID NO 001.
[052] Em certas modalidades, o RNAsi é caracterizado por uma sequência reversa complementar a uma sequência caracterizada por nucleotídeos 1401-1500 de SEQ ID NO 001.
[053] Em certas modalidades, o RNAsi é caracterizado por uma sequência reversa complementar a uma sequência caracterizada por nucleotídeos 1501-1600 de SEQ ID NO 001.
[054] Em certas modalidades, o RNAsi é caracterizado por uma sequência reversa complementar a uma sequência caracterizada por nucleotídeos 1601-1700 de SEQ ID NO 001.
[055] Em certas modalidades, o RNAsi é caracterizado por uma sequência reversa complementar a uma sequência caracterizada por nucleotídeos 1701-1800 de SEQ ID NO 001.
[056] Em certas modalidades, o RNAsi é caracterizado por uma sequência reversa complementar a uma sequência caracterizada por nucleotídeos 1801-1900 de SEQ ID NO 001.
[057] Em certas modalidades, o RNAsi é caracterizado por uma sequência reversa complementar a uma sequência caracterizada por nucleotídeos 1901-2000 de SEQ ID NO 001.
[058] Em certas modalidades, o RNAsi é caracterizado por uma sequência reversa complementar a uma sequência caracterizada por nucleotídeos 2001-2100 de SEQ ID NO 001.
[059] Em certas modalidades, o RNAsi é caracterizado por uma sequência reversa complementar a uma sequência caracterizada por nucleotídeos 2100-2200 de SEQ ID NO 001.
[060] Em certas modalidades, o RNAsi é caracterizado por uma sequência reversa complementar a uma sequência caracterizada por nucleotídeos 2201-2300 de SEQ ID NO 001.
[061] Em certas modalidades, o RNAsi é caracterizado por uma sequência reversa complementar a uma sequência caracterizada por nucleotídeos 2301-2400 de SEQ ID NO 001.
[062] Em certas modalidades, o RNAsi é caracterizado por uma sequência reversa complementar a uma sequência caracterizada por nucleotídeos 2401-2500 de SEQ ID NO 001.
[063] Em certas modalidades, o RNAsi é caracterizado por uma sequência reversa complementar a uma sequência caracterizada por nucleotídeos 2501-2600 de SEQ ID NO 001.
[064] Em certas modalidades, o RNAsi é caracterizado por uma sequência reversa complementar a uma sequência caracterizada por nucleotídeos 2601-2700 de SEQ ID NO 001.
[065] Em certas modalidades, o RNAsi é caracterizado por uma sequência reversa complementar a uma sequência caracterizada por nucleotídeos 2701-2800 de SEQ ID NO 001.
[066] Em certas modalidades, o RNAsi é caracterizado por uma sequência reversa complementar a uma sequência caracterizada por nucleotídeos 2801-2900 de SEQ ID NO 001.
[067] Em certas modalidades, o RNAsi é caracterizado por uma sequência reversa complementar a uma sequência caracterizada por nucleotídeos 2901-3000 de SEQ ID NO 001.
[068] Em certas modalidades, o RNAsi é caracterizado por uma sequência reversa complementar a uma sequência caracterizada por nucleotídeos 3001-3100 de SEQ ID NO 001.
[069] Em certas modalidades, o RNAsi é caracterizado por uma sequência reversa complementar a uma sequência caracterizada por nucleotídeos 3100-3200 de SEQ ID NO 001.
[070] Em certas modalidades, o RNAsi é caracterizado por uma sequência reversa complementar a uma sequência caracterizada por nucleotídeos 3201-3300 de
SEQ ID NO 001.
[071] Em certas modalidades, o RNAsi é caracterizado por uma sequência reversa complementar a uma sequência caracterizada por nucleotídeos 3301-3400 de SEQ ID NO 001.
[072] Em certas modalidades, o RNAsi é caracterizado por uma sequência reversa complementar a uma sequência caracterizada por nucleotídeos 3401-3500 de SEQ ID NO 001.
[073] Em certas modalidades, o RNAsi é caracterizado por uma sequência reversa complementar a uma sequência caracterizada por nucleotídeos 3501-3580 de SEQ ID NO 001.
[074] Em certas modalidades, o RNAsi é caracterizado por uma sequência reversa complementar a uma sequência formada justapondo quaisquer duas sequências consecutivas das sequências definidas anteriormente. A título de exemplo não limitante, o RNAsi é caracterizado por uma sequência reversa complementar a uma sequência formada justapondo 1501-1600 de SEQ ID NO 001 e 1501-1600 de SEQ ID NO 001.
[075] Em certas modalidades, o RNAsi é direcionado contra uma sequência intrônica de proteína S.
[076] Em certas modalidades, é caracterizado por uma sequência reversa complementar a uma sequência selecionada do grupo compreendendo em SEQ ID NO 014 (éxon 12), SEQ ID NO 011 (éxon 9), SEQ ID NO 006 (éxon 4), SEQ ID NO 012 (éxon 10) e SEQ ID NO 013 (éxon 11).
[077] Em certas modalidades, o RNAsi é caracterizado por uma sequência compreendendo ou consistindo em uma sequência selecionada do grupo compreendendo SEQ ID NO 019 (RNAsi 1), SEQ ID NO 020 (RNAsi 2), SEQID NO 021 (RNAsi 3), SEQ ID NO 022 (RNAsi 4), SEQ ID NO 023 (RNAsi 5), SEQ ID NO 024 (RNAsi 6), SEQ ID NO 025 (RNAsi 7), SEQ ID NO 026 (RNAsi 8), SEQ ID NO 027 (RNAsi 9), SEQ ID NO 028 (RNAsi 10), SEQ ID NO 029 (RNAsi 11), SEQ ID NO 030 (RNAsi 12), SEQ ID NO 031 (RNAsi 13), SEQ ID NO 032 (RNAsi 14), SEQ
ID NO 033 (RNAsi 15), SEQ ID NO 034 (RNAsi 16), SEQ ID NO 035 (RNAsi 17), SEQ ID NO 036 (RNAsi 18), SEQ ID NO 037 (RNAsi 19), SEQ ID NO 038 (RNAsi 20), SEQ ID NO 039 (RNAsi 21), SEQ ID NO 040 (RNAsi 22), SEQ ID NO 041 (RNAsi 23), SEQ ID NO 042 (RNAsi 24), SEQ ID NO 043 (RNAsi 25), SEQ ID NO 044 (RNAsi 26), SEQ ID NO 045 (RNAsi 27), SEQ ID NO 046 (RNAsi 28), SEQ ID NO 047 (RNAsi 29), SEQ ID NO 048 (RNAsi 30), SEQ ID NO 049 (RNAsi 31), SEQ ID NO 050 (RNAsi 32), SEQ ID NO O051(RNAsi 33), SEQ ID NO 052 (RNAsi 34), SEQ ID NO 053 (RNAsi 35), SEQ ID NO 054 (RNAsi 36), SEQ ID NO 055 (RNAsi 37), SEQ ID NO 056 (RNAsi 38), SEQ ID NO 057 (RNAsi 39), SEQ ID NO 058 (RNAsi 40), SEQ ID NO 059 (RNAsi 41), SEQ ID NO 060 (RNAsi 42), SEQ ID NO 061 (RNAsi 43), SEQ ID NO 062 (RNAsi 44), SEQ ID NO 063 (RNAsi 45), SEQ ID NO 064 (RNAsi 46), SEQ ID NO 065 (RNAsi 47), SEQ ID NO O66(RNAsi 48), SEQ ID NO 067 (RNAsi 49), e SEQ ID NO 068 (RNAsi 50).
[078] Em certas modalidades, o RNAsi é provido para uso em um método de tratamento de hemofilia A.
[079] Em certas modalidades, o RNAsi é provido para uso em um método de tratamento de hemofilia B.
[080] De maneira similar, está no escopo da presente invenção um método para tratar hemofilia em um paciente que precisa do mesmo, compreendendo administrar ao paciente uma molécula compreendendo um RNAsi de acordo com a invenção.
[081] De maneira similar, é provida uma forma de dosagem para a prevenção ou tratamento de hemofilia, compreendendo uma molécula compreendendo um RNAsi de acordo com a invenção.
[082] No contexto da presente especificação, a expressão "uma molécula compreendendo um RNAsi de acordo com a invenção", significa que inclui um RNAsi de acordo com a invenção e uma molécula, em particular uma molécula de RNAds, a partir da qual um RNAsi de acordo com a invenção pode ser gerado em um célula de mamífero pela via do RNA de interferência.
[083] “Nucleotídeos”, no contexto de a presente invenção, são blocos de construção de ácido nucleico ou análogo de ácido nucleico, oligômeros a partir dos quais são capazes de formar híbridos seletivos com oligômeros de RNA na base de pareamento de base. O termo nucleotídeos, neste contexto, inclui os blocos de construção de ribonucleotídeo clássico adenosina, guanosina, uridina (e ribosiltimina), citidina, os desoxirribonucleotídeos clássicos desoxiadenosina, desoxiguanosina, timidina, desoxiuridina e desoxicitidina. Inclui adicionalmente análogos de ácidos nucleicos tais como fosfotioatos, 2'O-metilfosfotioatos, ácidos nucleicos peptídicos (PNA; unidades de N-(2-aminoetil)-glicina ligadas por ligação peptídica, com a base nitrogenada anexada ao alfa-carbono da glicina) ou ácidos nucleicos bloqueados (LNA; 2'O, 4'C blocos de construção de RNA ligados ao metileno). A sequência de hibridização pode ser composta de qualquer dos nucleotídeos anteriores, ou misturas dos mesmos.
[084] Em certas modalidades, a sequência de hibridização do RNAsi de acordo com a invenção compreende 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 ou 27 nucleotídeos.
[085] Em certas modalidades, a sequência de hibridização é pelo menos 95 % idêntica, mais preferivelmente 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % idêntica à sequência complementar reversa de SEQ ID 001 ou SEQ ID 002. Em certas modalidades, a sequência de hibridização compreende desoxinucleotídeos, fosfotioato desoxinucleotídeos, LNA e/ou PNA nucleotídeos ou misturas dos mesmos.
[086] No contexto da presente especificação, os termos identidade de sequência e percentual de identidade de sequência se referem aos valores determinados comparando duas sequências alinhadas. Métodos para alinhamento de sequências para comparação são bem conhecidos na técnica. O alinhamento de sequências para comparação pode ser conduzido pelo algoritmo de homologia local de Smith e Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981), pelo algoritmo de alinhamento global de Needleman e Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970), pela pesquisa pelo método de similaridade de Pearson e Lipman, Proc. Nat. Acad. Sci. 85:2444 (1988) ou por implementações computadorizadas destes algoritmos incluindo, mas sem limitação: CLUSTAL, GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA e TFASTA. O software para realizar análises BLAST é publicamente disponível, por exemplo, através do National Center for Biotechnology-lInformation (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/).
[087] Um exemplo para comparação de sequências de aminoácido é o algoritmo BLASTP que usa as configurações padrão: Limite esperado: 10; Tamanho da palavra: 3; Combinações máximas em um intervalo de consulta: 0; Matriz: BLOSUM62; Custos do intervalo: Existência 11, Extensão 1; Ajustes composicionais: Ajuste de matriz de escore composicional condicional. Un exemplo como este para comparação de sequências de ácido nucleico é o algoritmo BLASTN que usa as configurações padrões: Limite esperado: 10; Tamanho da palavra: 28; Combinações máximas em um intervalo de consulta: 0; Escores para alinhamento correto/incorreto: 1.-2; Custos do intervalo: Linear. A menos que de outra forma declarada, os valores de identidade de sequência aqui providos se referem ao valor obtido usando o pacote BLAST de programas (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)) que usa os parâmetros padrões identificados anteriormente para comparação de proteína e ácido nucleico, respectivamente.
[088] Em algumas modalidades, a sequência de hibridização compreende ribonucleotídeos, fosfotioato e/ou ribonucleotídeos fosfotioato 2'-O-metil-modificados.
[089] Em algumas modalidades, a sequência de hibridização compreende desoxinucleotídeos, desoxinucleotídeos fosfotioato, ribonucleotídeos fosfotioato e/ou ribonucleotídeos fosfotioato 2'-O-metil-modificados.
[090] Onde quer que alternativas para características únicas separáveis forem apresentadas aqui como “modalidades”, entende-se que tais alternativas podem ser combinadas livremente para formar modalidades distintas da invenção aqui descritas.
[091] A invenção é ilustrada adicionalmente pelos exemplos e figuras a seguir, a partir dos quais modalidades e vantagens adicionais podem ser estabelecidos. Estes exemplos servem para ilustrar a invenção, mas não limitam seu escopo.
[092] A figura 1 mostra que perda de atividade de X-ase recupera camundongos Pros1”. A, Modelo esquemático de geração de trombina em condição hemofílica. Um dos principais complexos de coagulação é o complexo tenase intrínseco (X-ase). X- ase compreende FIX ativado (FIXa) como a protease, FVIII ativado (FVIlla) como o cofator, e fator X (FX) como o substrato.
Embora a geração ou exposição de fator tecidual (TF) no sítio da lesão seja o evento principal no início da coagulação por meio da via extrínseca, a via intrínseca X-ase é importante em decorrência da quantidade limitada de TF ativo disponível in vivo, e da presença de TFPI que, quando complexado com FX ativado (FXa), inibe o complexo TF/fator VII ativado (FVlIla) (A figura 1a). Assim, a geração de trombina contínua depende da ativação tanto de FIX quanto FVIII (Figura 1a). Este processo é amplificado em decorrência de FVIII ser ativado tanto por FXa e trombina quanto FIX, tanto por FVIla quanto fator XI ativado (FXla), o último fator sendo previamente ativado por trombina.
Consequentemente, um aumento progressivo na ativação de FVIIl e FIX ocorre uma vez que FXa e trombina são formados.
B, a abordagem experimental para melhorar a geração de trombina em hemofilia grave A e B alvejando Pros1. C-D, Validação de modelo murino e avaliação de parâmetros hematológicos DIC em camundongos adultos hemofílicos com e sem deficiência em Pros1: níveis plasmáticos de PS (antigênica), FVIII (atividade coagulante) ou FIX (atividade coagulante) em camundongos adultos F8” Pros1**, F8/Pros1*” e F8/Pros1” (C), e F9ºPros1**, F9/Pros1*/ e F9/Pros1” (D) (n= 5/grupo); plaquetas (n= 7/grupo), fibrinogênio (n= 8/grupo), PT (n= 6/grupo) e TAT (n= 6/grupo) no grupo de hemofilia A (c); e plaquetas (n= 5/grupo), fibrinogênio (n= 4/grupo), PT (n= 4/grupo) e TAT (n= 4/grupo) no grupo de hemofilia B (D). E-F, Imagem macroscópica de pulmões de camundongos F8/Pros1* 24 horas após uma injeção intravenosa única de 2 U/g de infusão de FVIIIl recombinante (AdvateG) (E), e avaliação microscópica correspondente de coágulos de fibrina em corte de pulmão (F). G, Administração de FVIII recombinante (Advate&) em F8/Pros1** e F8/Pros1" : níveis plasmáticos de fibrinogênio e TAT em 24 horas após 5 injeções de 0,3 U/g AdvateO i.v. (pontos de tempo de injeção: 1 hora antes da inserção de cateter e 1 hora, 4 horas, 8 horas e 16 horas após a inserção de cateter) (n= 3) (G, colunas em preto e branco) e 24 horas após uma única injeção i.v. em F8/Pros1" (n= 3) (G,
coluna tracejada), e imuno-histoquímica representativa que permite a detecção de coágulos de fibrina em cortes de pulmão e fígado em F8”/Pros1" 24 horas após injeções i.v. repetidas de 0,3 U/g de AdvateO (H), e após uma única injeção i.v. de 0,3 U/g de AdvateO i.v. (i). Todos os dados são expressos como média + s.e.m.; ns, não significativos; *, P<0,05 **; P<0,005.
[093] A figura 2 mostra modelos murinos de trombose. A-C, tromboembolia venosa induzida por TF em camundongos F8** Pros1**, F8/ Pros1**, F8/ Pros1*” e F8” Pros1” (n= 10/genótipo) Os camundongos anestesiados foram injetados intravenosamente por meio da veia cava inferior, com diferentes doses de TF recombinante (Innovin): diluição 72 (TF -4,3 nM) em A e diluição 74 (TF -2,1 nM) em B-C. Em (A), um grupo de camundongos F8**Pros1** recebeu uma injeção da heparina de baixo peso molecular (enoxaparina 60 ug/g s.c.). O tempo até o início da parada respiratória que demorou pelo menos 2 minutos foi registrado. Os experimentos foram finalizados em 20 minutos. Curvas de sobrevivência de Kaplan- Meier (A-B). C, 2 minutos após o início da parada respiratória, ou no final do período de observação de 20 minutos, os pulmões foram excisados e investigados em relação aos coágulos de fibrina (imunocoloração para fibrina insolúvel, clone mAb 102-10). D, Formação de trombo em artérias mensentéricas lesadas com FeCl3 registrada por microscopia intravital em camundongos F8*** Pros1**, F8” Pros1** e F8/ Pros1”, experimento representativo (n= 3/genótipo). D, Formação de trombo em artérias mesentéricas lesadas com FeCl;s registrada por microscopia intravital em camundongos F8*'* Pros1*/+, F8/ Pros1** e F8/ Pros1”, experimento representativo (n= 3/genótipo).
[094] A figura 3 mostra modelos de sangramento de cauda. O sangue foi coletado após corte transversal da cauda de 2 mm (A) e 4 mm (B) por 30 minutos (A) e 10 minutos (B), em um tubo novo de salina; a perda total de sangue (uL) foi então medida. Camundongos F8*“Pros1** e F8**Pros1** (colunas brancas) funcionaram como controles (n = 5 para todos os grupos em A, n= 6 para todos os grupos em A). C, Um anticorpo de PS anti-humano alterou o sangramento de cauda após corte transversal de 4 mm.
[095] A figura 4 mostra um modelo de hemartrose aguda. A, Diferença entre o diâmetro do joelho 72 horas após a lesão e antes da lesão em camundongos F8” Pros1*”*, F8/Pros1*/., F8/Pros1” e F8**Pros1*/*. B, Avaliação microscópica (corante tricromo de Masson e imunocoloração para fibrina insolúvel) do espaço intra-articular do joelho de um representante com pernas lesadas e não lesadas após 72 horas em camundongos F8**Pros1*”*, F8/Pros1** e F8/-Pros1”. C, Silenciamento de mPS in vivo usando RNAsi específico: avaliação do diâmetro da articulação 72 horas após a lesão em camundongos F8”Pros1*” e F8/Pros1** tratados com uma única infusão i.p. de RNAsi mPS ou RNAsi controle. D, Avaliação microscópica (corante tricromo de Masson) do espaço intra-articular do joelho de um representante com perna lesada após 72 horas em camundongos F8“”Pros1*** previamente tratados com RNAsi mPS ou RNAsi Ctrl. As avaliações são apresentadas como média + s.e.m. *, P<0,05; **, P<0,005; ***, P<0,0005; ****, P<0,0001.
[096] A figura 5 mostra que tanto PS quanto TFPI são expressos em sinóvia de murino. A, Imunocoloração para PS e TFPI no espaço intra-articular do joelho, de joelhos lesados de camundongos F8”Pros1*/* previamente tratados com Ctrl-RNAsi ou mPS-RNAsi. As pontas da seta apontam para tecido sinovial e as setas para as estruturas vasculares, todas positivas tanto para PS quanto para TFPI. As caixas nas figuras superiores (Barras de escala: 200 um) mostram a área ampliada no painel a seguir (Barras de escala: 50 um). B, Imunocoloração para TFPI no espaço intra- articular do joelho, de joelhos não lesados de camundongos F8”/Pros1** e F8*Pros1- 4, C-E, Análise Western Blot de meios condicionados de sinoviócitos primários do tipo fibroblasto de murino (FLS) cultivados usando anticorpos anti-PS (c) e anti-TFPI (d). Plasma livre de plaquetas (PFP), lisados de proteína de plaquetas (PLT), PS de murino (mPS) foram usados como controles positivos (c). Expressão da isoforma de TFPI determinada comparando pesos moleculares de TFPI desglicosilados e de TFPI completamente glicosilados. A placenta de murino foi usada como controle positivo para TFPla. E-F, Análise Western Blot de lisados proteicos totais isolados de FLS após 24 horas de cultura, na presença de trombina (Thr, +) ou de um veículo (-) usando anticorpos anti-PS (f) e anti-TFPI (e). TFPI recombinante humano de tamanho completo foi usado como controle positivo para TFPla (hrTFPI). As manchas são representativas de três experimentos independentes.
[097] A figura 6 mostra PS e TFPI em sinóvia de humano. A, PS e TFPI são expressos no tecido sinovial de pacientes com HA (sob demanda e em profilaxia), HB sob demanda ou osteoartrite (OA). As pontas das setas apontam para a camada de revestimento sinovial e as setas para estruturas vasculares na camada de sub- revestimento, todos positivos tanto para PS quanto para TFPI. Barras de escala: 50 um. B, Análise Western Blot de meios condicionados de cultura de FLS primário humano (hFLS) de um indivíduo saudável e um paciente OA antes e depois da desglicosilação usando anticorpo anti-TFPI. Lisado de plaqueta humana (hPLT) foi usado como controle positivo para TFPla. As manchas são representativas de três experimentos independentes.
[098] A figura 7 mostra geração de trombina e rede de fibrina em hemofilia A, TF- (1 pM) induziu a geração de trombina em PRP de camundongos F8“” Pros1** e F8” Pros1”, representando a atividade de PS dependente de TFPI. B, Atividade de PS dependente de APC em PRP e PFP de camundongos F8” Pros1** e F8* Pros1”. C, Imagens de microscopia eletrônica de varredura representativas de estrutura de fibrina de F8*** Pros1*/*, F8* Pros1** e F8* Pros1”, e de F9*/* Pros1*/*, F9/ Pros1*/* e F9” Pros1”. D-G, Geração de trombina ativada por baixa concentração de TF (1 pM) em PFP (D-E) e PRP (F-G) de pacientes com HA grave (FVIIl <1 %) sem (D, F) e com uma titulação alta de inibidor (E, G). As medições são apresentadas como média + s.e.m. **, P<0,005; ***, P<0,0005.
[099] A figura 8 mostra abordagem de genotipagem. Genótipos obtidos pelo cruzamento de camundongos F8“”Pros1*” (a-c) e F9/Pros1*” (d-f). a, alelos Pros1 foram amplificados por uma PCR multiplex. Os produtos de PCR foram então submetidos à eletroforese; a banda wt apresentou um peso molecular menor (234 bp) comparada à banda nula (571 bp), de acordo com Saller, 2009. b, Configuração de
PCR multiplex para amplificar a banda wt (620 bp) e a banda nula (420 bp) de alelos F8 de DNA genômico. c, Produtos de PCR de amplificação de alelos F8 (banda nula: 420 bp) nas mesmas amostras que em (A). d, Alelos Pros1 foram amplificados por uma PCR multiplex. Os produtos de PCR foram então submetidos à eletroforese; a banda wt apresentou um peso molecular menor (234 bp) comparada à banda nula (571 bp), de acordo com Saller, 2009. e, Configuração de PCR multiplex para amplificar a banda wt (320 bp) e a banda nula (550 bp) de alelos F9 de DNA genômico. f, Produtos de PCR de amplificação de alelos F9 (banda nula: 550 bp) nas mesmas amostras que em (d).
[0100] A figura 9 mostra histologia em condição fisiológica. Imunocoloração para fibrina insolúvel nos cortes de fígado, pulmão, rim, cérebro em camundongos F8” Pros1” e em F8ºPros1**, bem como em F9/Pros1** e F9/Pros1”. Barra de escala: 100 um.
[0101] A figura 10 mostra que a perda genética de Pros1 previne hemartrose em camundongos com hemofilia B. A, Diferença entre os diâmetros do joelho 72 horas após a lesão e antes da lesão em camundongos F9”Pros1*”*, F9/-Pros1*”, F9/Pros1- r- e F9**Pros1**. B, Avaliação microscópica (corante de tricromo de Masson e coloração para fibrina insolúvel, clone mAb 102-10) do espaço intra-articular do joelho de um representante de pernas não lesadas e lesadas, após 72 horas, em camundongos F9**Pros1*'*, F9/Pros1** e F9/Pros1”. Barra de escala: 500 um. As medições são apresentadas como média + s.e.m. ***, P<0,0005.
[0102] A figura 11 mostra esta quantificação de densidade de rede de fibrina e ramificação de fibras. a-b, Rede de fibrina de camundongos F8** Pros1*”*, F8% Pros1*** e F8º Pros1”. c-d, Rede de fibrina de F9*** Pros1*'+*, F9/ Pros1*!** e F9/ Pros1”. Quantificação de densidade rede de fibrina (a e c). Quantificação de ramificação de fibras (b e d). As medições são apresentadas como média t+ s.e.m. ***, P<0,0005.
EXEMPLOS EXEMPLO 1: PERDA DE ATIVIDADE DE X-ASE RECUPERA
CAMUNDONGOS PROS1”
[0103] —Pros1* fêmeas cruzados com F8” machos produziram 25 % progênie F8*/ Pros1*”. F8*-Pros1*/ fêmeas reproduzidas com F8” machos resultaram em 25 % de progênie F8/Pros1*” (Figura 8A-C). Observações similares foram realizadas com camundongos F9-Pros1*” (Figura 8D-F). Da maneira esperada, camundongos F8” Pros1” e F9” Prost” não exibiram atividade plasmática de FVIII e FIX, respectivamente, e PS não foi detectado no plasma de camundongos F8* Pros1” e F9* Pros1” (Figura 1C-D). Os níveis de PS em F8/Pros1*” e F9/Pros1*/ foram —-50- 60 % menores que em camundongos F8”Pros1** e F9/Pros1*** (Figura 1C-D), da maneira relatada.
[0104] De 295 filhotes de pares reprodutores F8”Pros1*”, 72 (24 %) foram F8” Pros1*”*, 164 (56 %) foram F8“Pros1*” e 59 (20 %) foram F8“Pros1” (x?= 4,8, P= 0,09). Assim, camundongos F8“” Pros1” estavam presentes na razão Mendeliana esperada. Ao contrário, de 219 filhotes dos pares reprodutores F9"/-Pros1*”, 56 (26 %) foram F9/Pros1*”*, 132 (60 %) foram F9/Pros1*/ e 31 (14 %) foram F9/Pros1” (X?= 14,95, P= 0,001). Isto é compatível com uma distorção de razão de transmissão para camundongos F9”Pros1”, consistente com os tamanhos reduzidos de ninhada, comparados àqueles de acasalamentos de camundongos F9**Pros1** (5,2 + 0,7 versus 9,8 + 1.8, n= 4 acasalamentos/acima das 3º gerações, P= 0,046).
[0105] Os camundongos F8” Pros1” e F9” Pros1” surgiram completamente normais. Suas viabilidades foram monitoradas até 20 (n= 4) e 16 meses (n= 2), respectivamente, sem mostrar nenhuma diferença, comparados aos camundongos F8”Pros1** e F9/Pros1*/*, respectivamente.
[0106] Uma vez que uma deficiência completa de Pros1 em camundongos leva à coagulopatia de consumo”, avaliou-se se camundongos F8* Pros1” e F9” Pros1” desenvolveram DIC. Os parâmetros de DIC foram comparáveis em camundongos F8 rPros1**+*, F8/Pros1*/ e F8” Pros1” (Figura 1C), e em camundongos F9”Pros1**, F9*Pros1*” e F9” Pros1” (Figura 1D). O tempo de tromboplastina parcial ativada (aPTT) foi igualmente prolongado em camundongos F8”Pros1** (69 + 2 segundos),
F8“/Pros1*” (68 + 3 segundos) e F8/Pros1” (63 + 3 segundos) (média + s.e.m., n= 6 por grupos, P= 0,3) em decorrência da ausência de FVIIl. Os dados comparáveis foram obtidos com camundongos F9/Pros1*'*, F9/-Pros1*” e F9/ Pros1”. Além disso, nenhuma trombose ou deposição de fibrina foi observada no cérebro, pulmões, fígado e rim de camundongos F8* Pros1” e F9“” Pros1” (Figura 9).
[0107] Portanto, a perda de atividade de X-ase recupera a letalidade embrionária de deficiência completa de Pros71. Entretanto, A recuperação foi apenas parcial com a perda de atividade FIX. Uma possível explicação é que HB grave parece ser uma condição menos séria, comparada à HA grave. Consequentemente, a interrupção de F9 em camundongos Pros1* foi menos eficiente em reequilibrar a coagulação do que a interrupção de F8.
[0108] Para explorar se restaurar a atividade intrínseca de X-ase por infusão de FVIII induz DIC, trombose e púrpura fulminante em camundongos F8” Pros1”, administrou-se FVIIl recombinante (rFVIII) intravenosamente. Nenhum camundongo morreu após injeção por rFVIII. Trombos em vários vasos sanguíneos e sangramento nos pulmões foram observados em camundongos F8“” Pros1” 24 horas após uma única injeção de uma superdosagem de rFVIII (Figura 1E-F). Vinte e quatro horas após a administração repetida de uma dose normal de rFVIII, análises de coagulação mostraram tempo de protrombina incoagulável (PT) (não mostrado), níveis baixos de fibrinogênio e altos de trombina-antitrombina (TAT), compatíveis com um DIC observável (Figura 1G). Ao contrário, após uma única injeção de uma dose normal de rFVIIl em camundongos F8” Pros1”, os níveis de fibrinogênio e TAT foram comparáveis àqueles de camundongos F8“ Pros1* não tratados (Figura 1G). Embora vários trombos estivessem visíveis nos pulmões e fígado (Figura 1H-I), nenhum destes camundongos desenvolveu púrpura fulminante.
EXEMPLO 2: PERDA DE ATIVIDADE DE X-ASE NÃO PREVINE
LETALIDADE CAUSADA POR TROMBOEMBOLISMO INDUZIDO POR TF EM CAMUNDONGOS PROS1”
[0109] Demostrou-se previamente que, embora 88 % de camundongos Pros1**
tenham sobrevivido a um modelo de tromboembolismo induzido por TF, apenas 25 % de camundongos Pros1*” ainda estavam vivos 20 minutos após uma injeção de baixa dose de TF (-1,1 nM). Durante o uso de uma dosagem maior de TF (-4,3 nM), tanto os camundongos Pros1** quanto Pros1*” morreram em 20 minutos. Entretanto, Pros1*” morreram mais cedo que Pros1**. Os camundongos HA e WT foram igualmente sensíveis a esta dose alta de TF, com mais de 85 % destes sucumbindo em 15 minutos (Figura 2A). Ao contrário, >75 % dos camundongos WT em tromboprofilaxia com uma heparina de baixo peso molecular (LMWH) sobreviveram (Figura 2A). Assim, ao contrário de LMWH, HA não protege camundongos contra tromboembolismo induzido por TF. Investigou-se então os camundongos F8“”-Pros1**, F8”Pros1*” e F8” Pros1” no mesmo modelo. Após a infusão de TF (-2,1 nM), 40-60 % dos camundongos morreram (P>0,05), independentemente de seu genótipo Pros1 (Figura 2B). Entretanto, houve apenas uma tendência de camundongos F8“”Pros1” e F8”Pros1*” sucumbirem mais cedo do que F8”Pros1*”*, e de camundongos F8” Pros1*” morrerem mais cedo que F8”Pros1** (tempo médio para morte: 12 + 4 minutos para camundongos F8/Pros1**, 7 + 2 minutos para F8/Pros1*, 8 + 3 minutos para camundongos F8” Pros1”, n= 4-6/grupo, P= 0,43). Dados similares foram obtidos com camundongos F9/Pros1**, F9/Pros1*” e F9/ Pros1” (dados não mostrados).
[0110] Coágulos de fibrina foram detectados em artérias pulmonares de camundongos F8“ºPros1** e F8” Pros1” que morreram durante o desafio tromboembolítico induzido por TF (Figura 2C). De maneira importante, haviam mais trombos em pulmões de camundongos F8/Pros1” do que de F8/Pros1*”* (n= 48 versus 26, respectivamente). Além do mais, a maioria das artérias em pulmões de F8 rPros1” estava completamente obstruída, enquanto estavam apenas parcialmente obstruídas em pulmões de F8/Pros1**.
[0111] Nenhum dos camundongos F8” Pros1” que sucumbiu durante o desafio tromboembolítico induzido por TF desenvolveu púrpura fulminante. Dados similares foram obtidos com camundongos F9”Pros1**, F9/Pros1* e F9” Pros1” (não mostrado).
EXEMPLO 3: PERDA DE FVIl PROTEGE PARCIALMENTE CAMUNDONGOS PROS1T” CONTRA TROMBOSE EM ARTERÍOLAS
[0112] Registrou-se então a formação de trombo em arteríolas mesentéricas, um modelo sensível a defeitos na via intrínseca de coagulação. Em camundongos F8**Pros1*”*, os trombos cresceram em tamanhos de obstrução em 20 minutos, e todas as arteríolas lesadas foram obstruídas (Figura 2D). Da maneira esperada, nenhuma das arteríolas de F8/Pros1*/* exibiu trombose, ao passo que camundongos F8” Pros1” mostraram tombos parciais (Figura 2D).
[0113] Êmbolos foram gerados durante a formação do trombo em camundongos F8**Pros1*'*, mas não em camundongos F8”Pros1**. Em camundongos F8* Pros1 4, múltiplos micro-êmbolos se destacaram durante o crescimento parcial do trombo, prevenindo a formação de trombos obstrutivos.
EXEMPLO 4: ALVEJAMENTO DE PROS1 LIMITA, MAS NÃO ANULA O
[0114] O fenótipo de sangramento foi avaliado por transfecção da cauda usando um modelo de sangramento moderado ou um grave.
[0115] Em ambos os modelos, a perda de sangue foi reduzida em camundongos F8/Pros1” comparados aos F8/Pros1** (Figura 3A-B). Quando desafiados pelo modelo moderado, camundongos F8/Pros1*” sangraram menos que F8”Pros1** (Figura 3A). Ao contrário, quando expostos ao modelo grave, os camundongos F8” Pros1” e F8/Pros1*” exibiram perda de sangue comparável (Figura 3B). Entretanto, os camundongos F8*” Pros1” sangraram mais que F8*Pros1*** e F8*"*Pros1** em ambos os modelos (Figura 3A-B), indicando que a perda de Pros1 em camundongos F8* corrigiu apenas parcialmente o fenótipo de sangramento de camundongos F8“”.
[0116] A seguir, um anticorpo que neutraliza PS foi usado para investigar como a inibição da atividade de PS altera o sangramento de cauda em camundongos F8% Pros1*” . Este anticorpo limitou a perda de sangue em camundongos F8“”Pros1*”
(Figura 3C) no mesmo grau que a perda genética completa de Pros1 (Figura 3B).
EXEMPLO 5: ALVEJAMENTO DE PROS1 OU INIBIÇÃO DE PS
[0117] Embora o sangramento possa aparecer em qualquer local em pacientes com hemofilia, a maioria das hemorragias ocorre nas articulações. Para determinar se a perda de Pros1 previne a hemartrose em camundongos hemofílicos, aplicou-se um modelo AH em camundongos F8“ºPros1*”*, F8/-Pros1*”, F8ºPros1” e F8*"*Pros1*”*. O inchaço nos joelhos após lesão foi reduzido em camundongos F8”/Pros1” e F8**Pros1*'*, comparados aos camundongos F8”Pros1*”* e F8/Pros1*” (Figura 4A). Não houve nenhuma diferença no inchaço dos joelhos entre camundongos F8“”Pros1- r e F8“*Pros1** (Figura 4A). O sangramento foi observado no espaço articular e sinóvia de camundongos F8“”Pros1** (IBS= 2, n= 5), mas não de F8/Pros1” (IBS= O, n= 5) e F8*"*Pros1** (IBS= O, n= 5) (Figura 4B). Havia mais fibrina no espaço articular e sinóvia de camundongos F8”Pros1*”* do que de F8/Pros1” e F8**Pros1** (Figura 4B). Dados similares foram obtidos com camundongos F9“”Pros1** e F9/ Pros1” (IBS= O, n= 3 e IBS= 2, n= 3, respectivamente) (Figura 9A-B).
[0118] Estes resultados foram confirmados pela infusão subcutânea contínua durante 4 dias de um anticorpo que neutraliza PS, ou um anticorpo controle em camundongos F8“Pros1*” (iniciando 1 dia antes da indução de AH) (inchaço do joelho no grupo com anticorpo que neutraliza PS foi 0,43 + 0,07 versus 0,69 + 0,09 mm no grupo controle, n= 9, P= 0,04). O nível plasmático de PS no grupo que neutraliza PS foi 26 + 6 % versus 45 + 3 % nos controles (n= 5, P= 0,017). Além do mais, a inibição de PS foi atingida alternativamente por injeção intravenosa de um RNAsi de PS de murino (mPS) antes do desafio com AH em camundongos F8”Pros1*“- e F8/Pros1** (Figura 4C-D). A avaliação de IBS confirmou a ausência de sangramento intra-articular em camundongos F8“”Pros1** tratados com RNAsi mPS (IBS= 0,5, n= 3), quando comparados com aqueles tratados com RNAsi controle (IBS= 2, n= 3), (Figura 4C). De maneira importante, a expressão de PS foi reduzida por RNAsi mPS tanto no plasma (26 + 3 % versus 84 + 11 % nos controles, n= 3, P= 0,006) quanto na sinóvia (Figura 5A).
EXEMPLO 6: TANTO PS QUANTO TFPI SÃO EXPRESSOS NA SINÓVIA
[0119] Para entender o efeito hemostático intra-articular proeminente da perda genética da inibição de Pros1 e PS em camundongos hemofílicos, cortes do joelho foram imunocoradas em relação a PS e TFPI. PS estava presente principalmente na camada de revestimento do tecido sinovial de camundongos F8“Pros1** com AH, tratados com RNAsi controle, ao passo que a coloração sinovial em relação à PS foi acentuadamente reduzida em camundongos F8”Pros1** com AH que receberam RNAsi mPS (Figura 5A). Ao contrário, a coloração TFPI foi mais proeminente no tecido sinovial de camundongos hemofílicos, que receberam o RNAsi mPS, do que naqueles que foram tratados pelo RNAsi controle (Figura 5a). Entretanto, a expressão de TFPI foi comparável na calada de revestimento sinovial tanto de camundongos F8”Pros1** quanto F8” Pros1” (Figura 5B).
[0120] Para demonstrar adicionalmente que PS é expresso por sinoviócitos do tipo fibroblasto (FLS), realizou-se Western Blots em meios condicionados coletados de FLS de F8**Pros1**, F8/Pros1** e F8“Pros1”. Da maneira mostrada na figura 5C, os meios de FLS de F8**Pros1*”* e F8“Pros1** exibiram uma banda em um peso molecular -75 kDa comparável à PS, e similar àquela observada no plasma e plaquetas. Da maneira esperada, nenhuma coloração foi detectada nos meios obtidos a partir de FLS de F8**Pros1*” (Figura 5C).
[0121] Estudou-se também a expressão de TFPI em meio condicionados de FLS de F8“Pros1*** e F8/Pros1*” (Figura 5D). Todos os meios exibiram uma banda em —50 kDa, similar àquela observada com lisados placentares. A expressão da isoforma de TFPI foi investigada após deglicosilação proteica, em decorrência de TFPIla e TFPIB completamente glicosilados migrarem no mesmo peso molecular?º. TFPI deglicosilado dos meios de FLS migrou como uma única banda no peso molecular de TFPla similar ao TFPI da placenta (controle positivo para TFPla) (Figura 5D). Isto indica que FLS expressa TFPla, mas não TFPIB. Além disso, a expressão de PS e TFPI aumentou em F8“Pros1*”* FLS após a estimulação com trombina (Figura 5E-F).
EXEMPLO 7: TANTO PS QUANTO TFPI SÃO EXPRESSOS NA SINÓVIA
[0122] Tecidos sinoviais de HA, HB e osteoartrite humana foram então analisados tanto em relação à PS quanto ao TFPI (Figura 6A). Um sinal forte foi observado para TFPI e PS nas camadas de revestimento e sub-revestimento sinovial de pacientes com HA sob demanda (n= 7). Ao contrário, a imunocoloração tanto para PS quanto para TFPI diminuiu em pacientes com HA em profilaxia (n= 5). Pacientes com HB exibiram sob demanda menos sinal tanto para PS quanto para TFPI nas camadas de revestimento e sub-revestimento sinovial (n= 4) do que paciente com HA sob demanda. Os cortes de pacientes com osteoartrite (n= 7) não mostraram uma coloração intensa para TFPI e PS, de maneira similar aos pacientes hemofílicos em profilaxia. Para avaliar qual isoforma de TFPI é expressa por FLS de humano, foi realizado Western Blotting em meios condicionados de FLS de humano, isolado de sujeitos saudáveis e pacientes com osteoartrite. De maneira similar ao FLS de murino, FLS de humano expressa TFPla, mas não TFPIB (Figura 6B).
EXEMPLO 8: PERDA DE PROS1 É RESPONSÁVEL PELA AUSÊNCIA
[0123] A proteção completa de contra AH em camundongos com HA ou HB que não apresentam Pros1, ou nos quais a PS foi inibida, pode ser explicada pelo menos em parte pela ausência da atividade de cofator de PS para APC e TFPI na articulação. Entretanto, a razão para um efeito hemostático parcial da ausência de inibição de Pros1 ou PS em camundongos com HA, desafiados nos modelos de sangramento de cauda, precisa ser mais investigada.
[0124] O teste de geração de trombina iniciado por TF ex vivo mostrou uma correlação entre a capacidade de plasma gerar trombina e a gravidade clínica de hemofilia. Portanto, investigou-se o impacto de perda de Pros1 na geração de trombina em plasma de camundongos com HA. A atividade de PS dependente de TFPI não foi avaliada em plasma livre de plaqueta (PFP), mas em plasma rico em plaqueta (PRP), em decorrência atividade cofator de TFPI de PS não poder ser demonstrada em plasma de camundongo usando testes de geração de trombina. Isto é explicado pela perda de TFPla no plasma de camundongo e sua presença em plaquetas de camundongo.
[0125] Tanto o pico de trombina quanto o potencial endógeno de trombina (ETP) foram significativamente maiores em PRP de F8/Pros1* do que em F8/Pros1*/*, em resposta a TF 1 pM (1072 + 160 vs 590 + 10 nmol/L.min, n= 3/grupo, P= 0,04), sugerindo a ausência de atividade de cofator TFPI| de PS em PRP de F8/Pros1” (Figura 7A). Consistente com o trabalho prévio, tanto o pico de trombina quanto e ETP foram comparáveis em PFP de camundongos F8”Pros1*”* e F8* Pros1” na presença de 1, 2,5 ou 5 pM de TF (dados não mostrados).
[0126] Para avaliar se camundongos F8” Pros1” exibiram atividade de PS dependente de APC funcional deficiente, utilizou-se o teste de geração de trombina em PRP ativado por ionóforo Ca?* na ausência de APC, na presença de APC recombinante tipo selvagem (WT), ou na presença de uma APC de camundongo recombinante mutada (L38D) (APC L38D, uma variação com atividade cofator de PS removida). Neste ensaio, a titulação de APC mostrou que a adição de APC WT 8 nM foi capaz de reduzir ETP em 90 % em PRP ativado de camundongos WT, ao passo que a mesma concentração de APC L38D diminuiu ETP em apenas 30 % (dados não mostrados). Com base nestes dados, as curvas de geração de trombina foram registradas para PRP ativado (3 camundongos/ensaio). A razão de APC calculada (ETP+ aPc wr/ ETP+4Pc 1.38D) indicou uma resistência à APC no plasma de F8“Pros1” , mas não no plasma de F8/Pros1** (0,87 + 0,13 versus 0,23 + 0,08, respectivamente, P= 0,01) (Figura 7B).
[0127] A atividade de PS dependente de APC também foi testada em PFP de camundongos F8“”Pros1** e F8” Pros1” (2 camundongos/ensaio) na presença de APC WT 2 nM e APC L38D. A razão de APC calculada mostrou uma resistência à
APC em camundongos F8-ºPros1”, mas não em F8/Pros1** (1,08 + 0,04 versus 0,25 + 0,09, respectivamente, P= 0,0003) (Figura 7B).
EXEMPLO 9: REDE DE FIBRINA MELHORADA EM CAMUNDONGOS HA, AUSENTE EM CAMUNDONGOS PROS1
[0128] Os modelos de sangramento de cauda em camundongo não são sensíveis apenas à disfunção de plaquetas, mas também a alterações na coagulação e fibrinólise. Para entender as diferenças entre os genótipos estudados com relação ao sangramento de cauda, utilizou-se imageamento por microscopia eletrônica de varredura para investigar a estrutura de fibrina (Figura 7C). Coágulos de plasma de F8**Pros1** e F8/Pros1” mostraram uma rede mais densa de fibras de fibrina altamente ramificadas, comparados aos coágulos do plasma de F8/Pros1** (Figura 11a-b). Ao contrário, coágulos de plasma de F9**Pros1*”* e F9/Pros1” não exibiram uma rede mais densa d que coágulos de plasma de F9”Pros1**, mas uma tendência para ramificação de fibras aumentada (Figura 11c-d).
[0129] As fibras de fibrina de camundongos F8”Pros1” e F8/Pros1** e de camundongos F9-/Pros1” e F9/Pros1** exibiram um diâmetro maior, comparadas às fibras de camundongos F8“"Prosi”* ou camundongos F9**Pros1**, respectivamente. Todavia, a superfície da fibra de camundongos F8* Pros1” e F9/ Pros1” mostrou menos porosidade comparada aos camundongos F8/Pros1** ou F9- rPros1**, respectivamente, sugerindo que as fibras derivadas de F8“Pros1” e F9/ Pros1” podem ser menos permeáveis e, por meio disso, mais resistentes à fibrinólise, do que fibras derivadas de F8/Pros1** ou F9úPros1** 8, Estes dados, em complemento tanto aos resultados de atividade de TFPI quanto de cofator de APC (Figura 7A-B), ajudam a explicar por que o sangramento de cauda em camundongos F8”Pros1” foi melhor, quando comparado aos de F8úPros1*”*, mas não completamente corrigidos como nos camundongos F8**Pros1**.
EXEMPLO 10: INIBIÇÃO DE PS NO PLASMA RESTABELECE
[0130] Examinou-se então o efeito da inibição de PS na geração de trombina no plasma de HA humana. ETP em PFP aumentou 2-4 vezes na presença de um anticorpo que neutraliza PS. Resultados similares foram obtidos usando um anticorpos anti-humano TFPI contra o domínio C-terminal para inibição eficiente de FXa, mesmo na presença de inibidor de FVIII (Figura 7D-E). A inibição de PS apresentou um efeito notável em amostras de PRP, onde aumenta ETP mais de 10 vezes (1912 + 37 e 1872 + 64 nM*minutos) (Figura 7F e G, respectivamente). Assim, a inibição de PS restabeleceu completamente ETP em plasma hemofílico (para comparação, ETP em plasma normal: 1495 + 2nM*minutos). Resultados similares foram obtidos usando o anticorpo anti-TFPI (Figura 7D-G). Estes dados confirmam em humanos a melhoria de geração de trombina em PFP e PRP de HA direcionada por inibição de PS, que foi observada em camundongos EXEMPLO 11: MATERIAIS E MÉTODOS
[0131] —Camundongos F8*“ (B6;129S4-F8tmiKaz/J) e camundongos F9*” (B6.129P2- F9tmibws/J) com origem C57BL/6J foram obtidos de The Jackson Laboratory. Camundongos Pros1*” foram a progênie da colônia original**. O Swiss Federal Veterinary Office aprovou os experimentos. Os camundongos foram genotipados da maneira descrita 57,
[0132] Um modelo de tromboembolia venosa foi adaptado a partir de Weiss et al'º com modificações pequenas *º. Camundongos anestesiados, com idade de 6-9 semanas, receberam TF recombinante humana (hrTF, Dade Innovin, Siemens) intravenosamente (2 ul/g) em 4,25 nM (diluição 1:2) ou 2,1 nM (diluição 1:4). Dois minutos após o início da parada respiratória ou na conclusão do período de observação de 20 minutos, os pulmões foram coletados e fixados em 4 % de PFA. Os cortes de pulmão foram corados com hematoxilina e eosina, e para fibrina. A dimensão de coágulos de fibrina nos pulmões foi avaliada como número de trombos intravascularaes em 10 campos não sobrepostos escolhidos aleatoriamente (magnificação x10).
[0133] Dois diferentes modelos de recorte de cauda para avaliar fenótipo de sangramento foram avaliados da maneira descrita?!. Resumidamente, a cauda distal de camundongos de 8-10 semanas foi cortada transversalmente em 2 mm (lesão leve) e o sangramento foi venoso, ou em 4 mm (lesão grave) e o sangramento foi arterial e venoso'º. O sangramento foi quantificado como sangue perdido após 30 ou 10 minutos, respectivamente. No modelo de lesão severa, alguns camundongos F8“” Pros1*” receberam um PS-IgG de coelho anti-humano (Dako), ou IgG isotipo de coelho (R&D Systems), intravenosamente, em uma dose de 2,1 mg/kg 2 minutos antes do corte transversal da cauda.
[0134] A indução de sangramento arterial em camundongos anestesiados de 9-12 semanas, medidas do diâmetro do joelho e cobertura analgésica foram realizadas de acordo com Qvlisen et al?º. Os diâmetros articulares foram medidos em O e 72 horas com um calibrador digital (Mitutoyo 547-301, Kanagawa). Em 72 horas, os camundongos foram sacrificados, os joelhos foram isolados, fixos em PFA 4 %, descalcificados e embebidos em parafina. O escore de sangramento intra-articular (IBS) foi avaliado da maneira descrita?!.
[0135] Camundongos de 10 semanas receberam uma infusão contínua de PS-IlgG anti-humana de coelho (Dako Basel, Suíça) ou IgG isotipo de coelho (R&D Systems), em 1 mg/kg/dia, através de minibombas osmóticas subcutâneas (modelo 2001, Alzet).
[0136] Alternativamente, camundongos de 10 semanas foram tratados com uma dose única de RNAsi específico de camundongo (s72206, Life Technologies) ou RNAsi controle (4459405, controle negativo in vivo tt1 Ambion, Life Technologies), em 1 mg/kg, usando um agente de transfecção (Invivofectamina 3.0, Invitrogen, Life Technologies), seguindo as instruções do fabricante. O modelo de hemartrose aguda foi aplicado 2,5 dias após inibição de PS.
[0137] Os valores foram expressos como média + sem. O qui-quadrado para loci genéticos não ligados foi usado para avaliar a segregação mendeliana de alelo. Os dados de sobrevivência no modelo de tromboembolia venosa induzida por TF foram registrados graficamente usando o método de Kaplan-Meier. Um teste de Log-Rank foi usado para comparar estatisticamente as curvas (Prism 6.0d; GraphPad). Os outros dados foram analisados por teste t, teste ANOVA com um fator e dois fatores com GraphPad Prism 6.0d. Um valor P menor que 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.
[0138] Camundongos com 6-9 semanas foram anestesiados com pentobarbital (40 mg/kg), e sangue completo foi retirado a partir da veia cava inferior em 3,13 % de citrato (1 vol de anticoagulante/9 vol de sangue). O sangue foi centrifugado em 1031 g por 10 minutos com a centrífuga pré-aquecida a 26 ºC para obter plasma rico em plaqueta (PRP). Alternativamente, o sangue foi centrifugado em 2.400 g por 10 minutos em temperatura ambiente (RT), para obter plasma pobre em plaqueta (PPP). Para obter o plasma livre de plaqueta (PFP), uma centrifugação adicional em 10.000 g por 10 minutos foi realizada.
[0139] As contagens de plaquetas foram realizadas com um contador de célula automatizado (Analisador hematológico Procyte Dx, IDEXX). A atividade de fibrinogênio, FVIIl e FIX foram medidas em um analisador de coagulação automatizado Sysmex CA-7000 (Sysmex Digitana). O tempo de protrombina (PT) e o tempo de tromboplastína parcial ativada (APTT) foram medidos em um coagulômetro (MC4plus, Merlin Medical).
[0140] Os poços de placas de 96 poços (Maxisorb, Thermo) foram revestidos com 50 ul por poço de 10 pg/ml de PS anti-humano policlonal de coelho (DAKO
Cytomation), e incubados por toda a noite a 4 ºC. Após 3 lavagens com tampão TBS (tris(hidroximetil)aminometano 0,05 M, NaCl 0,15 M, pH 7,5, Tween 20 0,05 %), a placa foi bloqueada com TBS-BSA 2 %. As amostras de plasma diluído (faixa de diluição: 1:300-1:600) foram adicionadas aos poços e incubadas em RT por 2 horas. Após 3 lavagens, 50 ul de proteína S anti-murina policlonal de galinha biotinilada 1 Vpg/mL foram adicionados e incubados por 2 horas em RT. O sinal foi amplificado por peroxidase de rábano silvestre conjugada com estreptavidina-HRP (Thermo), foi adicionado e as placas foram incubadas por 1 hora. As placas foram lavadas 3 vezes e 100 ul de substrato TMB (KPL) foram adicionados. As reações foram paradas adicionando 100 ul de HCI (1M). A absorbância foi em 450 nm. As curvas padrão foram estabelecidas usando diluição seriada de plasma normal agrupado, obtido de 14 camundongos saudáveis (8 machos e 6 fêmeas, 7-12 semanas). Os resultados foram expressos em percentual relativo com o plasma normal agrupado.
[0141] O nível de TAT foi medido em duplicata para cada amostra de plasma usando um ELISA comercialmente disponível (Enzygnost TAT micro, Siemens), de acordo com as instruções do fabricante.
[0142] Os cortes de tecido (4 um) sem nenhum pré-tratamento foram corados com hematoxilina/eosina ou tricromo de Masson, ou imunocorados por fibrina insolúvel, PS ou TFPI. Os seguintes anticorpos foram usados: fibrina (mAb clone 102-10)! concentração final 15,6 ug/mL, incubação por 30 minutos em RT, anticorpo secundário anti-humano de coelho, (ab7155 Abcam, Cambridge, UK) diluição 1:200, incubação por 30 minutos em RT; PS (MAB 4976, R&D, diluição 1:50) incubação por 30 minutos em RT, anticorpo secundário anti-rato de coelho, (ab7155 Abcam) diluição 1:200, incubação por 30 minutos em RT; TFPI (PAHTFPI-S, Hematological Technologies) concentração final 18,6 ug/mL, incubação por 30 minutos em RT, anticorpo secundário IgG anti-ovelha de coelho (ab7 106, Abcam) diluição 1:200, incubação por 30 minutos em RT. Todas as colorações foram realizadas com o imunocorador BOND RX (Leica
Biosystems, Muttenz, Suíça), seguindo as instruções do fabricante. As lâminas completas foram digitalizadas usando objetivas de ar 3D HISTECH Panoramic 250 Flash Il, com 20x (NA 0,8), 40x (NA 0,95). O processamento das imagens foi realizado usando software Panoramic Viewer.
ADMINISTRAÇÃO IN VIVO DE FVIII EM CAMUNDONGOS COM PERDA GENÉTICA COMPLETA DE F8
[0143] Camundongos de 6-9 semanas foram anestesiados com cetamina (80 mg/kg) e xilazina (16 mg/kg). Administrou-se intravenosamente tanto 0,3 U/kg de FVIII recombinante (AdvateO, Baxalta) para atingir um nível de FVIII de 100 % em 1 hora (dose normal) quanto uma superdosagem de FVIII recombinante (2 U/kg) para atingir >200 % em 1 hora. Tanto a dose normal quanto a superdosagem foram injetadas 1 hora antes e 1 hora após a introdução de um cateter na veia jugular (JVC 2Fr PU 10 cm de camundongo, Instech), e a seguir 4 horas, 8 horas e 16 horas após o posicionamento da linha central. Os camundongos foram sacrificados 24 horas após a primeira injeção. O sangue foi retirado e os órgãos foram coletados. FVIII, fibrinogênio e complexos de trombina-antitrombina (TAT) foram medidos da maneira descrita nos exemplos. Os pulmões foram isolados, fixos em 4 % de paraformaldeído (PFA) e embebidos em parafina.
[0144] Um modelo de trombose em artérias mesentéricas usando microscopia intravital foi realizado de acordo com a referência? com pequenas modificações. Os camundongos foram anestesiados por injeção intraperitoneal de uma mistura de cetamina (80 mg/kg) e xilazina (16 mg/kg). As plaquetas foram marcadas diretamente in vivo pela injeção de 100 uL de rodamina 6G (1,0 mM). Após a seleção do campo estudado, a lesão da parede do vaso foi gerada por um papel de filtro (adesivo com diâmetro de 1 mm de papel Whatmann 1M), saturado com FeCl3 10 %, aplicado topicamente por 1 minuto. A formação do trombo foi monitorada em tempo real sob um microscópio fluorescente (IV-500, Micron instruments, San Diego, CA), com um conjunto de filtro FITC, equipado com uma ótica de imersão em água corrigida por afinidade (Zeiss, Alemanha). As plaquetas e leucócitos marcados fluorescentes brilhantes permitiram a observação de campo de visão de 1355 um X 965 um por meio de epi-iluminação estrobóstica ativada por vídeo (Chadwick Helmuth, El Monte, CA). Uma objetiva 10X Zeiss Plan-Neofluar com NAO.3 foi usada. Todas as cenas foram registradas em fita de vídeo usando uma câmera alvo personalizada com intensificação de silício de baixa defasagem (Dage MTI, cidade de Michigan, EM), um gerador de base de tempo e um Hi-8 VCR (EV, C-100, Sony, Japão). O tempo para oclusão da parede do vaso foi medido, da maneira determinada cessando o fluxo de célula de sangue.
[0145] FLS de murino de camundongos com 8-10 semanas foram isolados e cultivados de acordo com?. Após três passagens, as imagens de contraste de fase das células foram obtidas, e as células foram incubadas com anticorpo CD11b anti- camundongo de rato conjugado com FITC (M1/70, Pharmingen, BD Biosciences), anticorpo CD90.2 anti-camundongo de rato conjugado com PE (30-H12, Pharmingen, BD Biosciences), anticorpo CD106 anti-camundongo de rato conjugado com FITC (429 MVCAM.A, Pharmingen, BD Biosciences), anticorpo CD54 anti-camundongo de hamster conjugado com PE (3E2, Pharmingen, BD Biosciences), e anticorpos de controle isotipo conjugado com fluorcromo por 30 minutos a 4 ºC no escuro. Após uma lavagem final e etapa de centrifugação, todas as células incubadas foram analisadas em um citômetro de fluxo LSR Il (BD Biosciences) e software FACS Diva 7.0 (BD Biosciences). FLS de humano, de paciente individual saudável e OA, foram obtidos de Asterand, Bioscience, e cultivados de acordo com as instruções do fabricante.
[0146] PS e TFPI foram detectados em amostras de humano e camundongo por eletroforese em gel de dodecil sulfato de sódio-poliacrilamida (12 % de gradiente SDS- PAGE, Bio-Rad), em condições reduzidas. As proteínas foram transferidas para membrana de nitrocelulose (Bio-Rad), e a seguir foram visualizadas usando: 2ug/mL de MAB-4976 monoclonal (R&D system) para PS de murino, 1ug/ml de AF2975 policlonal para TFPI de murino (R&D system). OS de murino recombinante* (30 ng), tamanho completo de TFPI recombinante humano (provido por T. Hamuro, Kaketsuken, Japão), lisado de plaquetas lavadas, PFP de camundongos F8/Pros1** e lisados de placenta de camundongos F8**Pros1** foram usados como PS, controles de TFPIa. As amostras de meios condicionados de FLS de murino e humano confluentes foram coletadas após 24 horas de incubação em um meio livre de soro (OptiMem), e concentradas 40 vezes usando dispositivos de filtro Amicon (Millipore, corte 10 kDa). Em relação a western blotting de TFPI, as amostras foram tratadas com uma mistura de cinco proteínas deglicosidases (PNGase F, O-Glicosidase, Neuraminidase, B1-4 Galactosidase, B-N-Acetilglucosaminidase, kit de deglicosilação, V4931, Promega) por 12 horas a 37 ºC antes de serem carregadas no gel. A detecção final foi completada usando um anticorpo secundário conjugado com peroxidase de rábano silvestre (Dako), e o substrato quimioluminescente de duração estendida Supersignal West Dura (Pierce), monitorada com uma câmera Fuji LAS 3000IR CCD. IMUNO-HISTOQUÍMICA EM SINÓVIA DE JOELHO HUMANO
[0147] Espécimes de tecido sinovial embebidos em parafina de doze pacientes com HA e quatro pacientes com HB, que foram submetidos à artroplastia por artropatia de joelho grave, foram coletados nos arquivos de Section of Anatomy and Histology, Department of Experimental and Clinical Medicine, University of Florence, da maneira descrita em outra parte”º, Sete pacientes com HA foram tratados sob demanda e cinco com profilaxia secundária. Todos os quatro pacientes com HB foram tratados sob demanda. As amostras sinoviais dos sete pacientes com osteoartrite (OA) foram usadas como controles”º. Para análise de imuno-histoquímica, cortes de tecido sinovial (espessura de 5 um) foram desparafinizados, reidratados, fervidos por 10 minutos em tampão de citrato sódio (10 mM, pH 6,0) para recuperação de antígeno, e subsequentemente tratados com 3 % de H2O2 em metanol por 15 minutos, em temperatura ambiente, para bloquear a atividade de peroxidase endógena. Os cortes foram então lavados em PBS e incubados com bloco Ultra V (Sistema de detecção UltraVision de grande volume anti-polivalente, HRP, número de catálogo TP-125-HL, LabVision) por 10 minutos em RT, de acordo com o protocolo do fabricante. Após bloquear o sítio de ligação não específico, as lâminas foram incubadas por toda a noite a 4 ºC com anticorpo S/PROS1 de proteína anti-humana policlonal de coelho (diluição 1:50, número de catálogo NBP1-87218, Novus Biologicals), ou anticorpo de inibidor da via de fator tecidual (TFPI) anti-humano policlonal de ovelha (diluição 1:500, número de catálogo PAHTFPI-S, Haematologic Technologies) diluído em PBS. Para imunocoloração de PS, os cortes teciduais foram a seguir incubados com anticorpos secundários biotinilados, seguido por peroxidase estreptavidina (Sistema de detecção UltraVision de grande volume anti-polivalente, HRP; LabVision), de acordo com o protocolo do fabricante. Para imunocoloração de TFPI, os cortes teciduais foram em vez disso incubados com IgG anti-ovelha de burro conjugado com HRP (diluição 1:1000; número de catálogo ab97125; Abcam) por 30 minutos. A imunorreatividade foi desenvolvida usando 3-amino-9-etilcarbazol (kit AEC, número de catálogo TA-125- SA; LabVision) como cromogênio. Os cortes sinoviais foram finalmente contrastados com hematoxilina de Mayer (Bio-Optica), lavados, montados em um meio de montagem aquoso e observados em um microscópio Leica DM4000 B (Leica Microsystems). Os cortes não expostos aos anticorpos primários ou incubados com IgG não imune, compatíveis em concentração e compatíveis com isotipo (Sigma- Aldrich), foram incluídos como controles negativos para especificidade de anticorpo. As imagens de microscopia ótica foram capturadas com uma câmera colorida digital Leica DFC310 FX 1,4-megapixel, equipada com o pacote de aplicação de software Leica LAS V3.8 (Leica Microsystems).
[0148] Coágulos de fibrina foram preparados a 37 ºC, a partir de PFP, pela adição de -5 nM TF (Dade Innovin, Siemens). Foram então fixos em glutaraldeído 2 %, desidratados, secos e revestidos por pulverização com ouro-paládio para visualização usando microscopia eletrônica de varredura, de acordo com Zubairova et al”. À avaliação semiquantitativa de densidade de rede e ramificação de fibras foi realizada usando software STEPanizer (www.stepanizer.com).
[0149] A geração de trombina em PFP e PRP foi determinada usando o método de trombograma automatizado calibrado (CAT).
[0150] A atividade de PS dependente de TFPI foi avaliada em PRP (150 G/L) da maneira a seguir. Resumidamente, 10 uL de PRP de camundongo (150 G/L) foram misturados com 10 uL de reagente PRP (Diagnostica Stago), e 30 ul de tampão À (Hepes 25 mm, NaCl 175 mm, pH 7,4, 5 mg/mL de BSA). A geração de trombina foi iniciada a 37 ºC com 10 uL de uma mistura de substrato fluorogênico/CaCl2. As concentrações finais foram da maneira a seguir: 16,6 % de plasma de camundongo, hrTF 1 pM, fosfolipídeos 4 uM, CaCl2 16 mM, e substrato fluorgênico 0,42 mM.
[0151] A atividade de PS dependente de APC foi avaliada em um teste de resistência APC a base de CAT, em PFP e PRP de camundongo, de acordo com Dargaud Y et alº. PRP (150 G/L) foi previamente ativado usando ionóforo Ca?* 40 uM (A23187) por 5 minutos a 37 ºC. As concentrações finais foram da maneira a seguir: 16,6 % de plasma de camundongo, A23187 22 uM, hrTF 1 pM, fosfolipídeos 4 UM, APC de camundongo recombinante tipo selvagem (wt-rmAPC)* 2nM (para PFP) ou 8 NM (para PRP), ou APC de camundongo recombinante mutado (rmAPC L38D), CaCl2 16 mM, e substrato fluorgênico 0,42 mM. A geração e caracterização de rmAPC L38D foi realizada de acordo com referências **º e a purificação de acordo com referências 117,12,
[0152] Para a titulação de TF em PFP, os seguintes reagentes foram usados: reagente PPP e reagente MP (Diagnostica Stago).
[0153] A fluorescência foi avaliada usando um fluorômetro Fluoroscan AscentO, equipado com um dispensador. A intensidade de fluorescência foi detectada em comprimentos de onda de 390 nm (filtro de excitação) e 460 nm (filtro de emissão). Um programa de software dedicado, Thrombinoscope& versão 3.0.0.29
(Thrombinoscope BV), possibilitou o cálculo de atividade de trombina contra o calibrador (Thrombinoscope BV) e exibiu a atividade de trombina com o tempo. Todas as experiências foram realizadas em duplicata a 37 ºC e as medições em geral duraram 60 minutos.
[0154] O consentimento informado por escrito foi obtido dos pacientes. Sangue venoso foi retirado por punção venosa em 3,2 % de citrato de sódio (vol/ívol) e centrifugado em 2.000 g por 5 min. O plasma pobre em plaqueta (PPP) foi então centrifugado em 10.000 g por 10 minutos para obter PFP. PFP foi aliquotado, congelado rapidamente e armazenado a -80 ºC até o uso. Em relação a PRP, o sangue foi centrifugado em 180 g x 10 min. Todos os sujeitos forneceram consentimento informado para participação. A geração de trombina foi avaliada em PFP e PRP de humano, de acordo com ref!?, com pequenas alterações. Resumidamente, 68 ul de PFP ou PRP (150 G/L) foram incubados por 15 min a 37 ºC com 12 uL tanto de um anticorpo policlonal PS-IgG anti-humano de coelho (0,42 mg/mL, Dako), ou anticorpos monoclonais contra TFPI (0,66 um, MW1848, Sanquin) quanto tampão A. A coagulação iniciou com 20 ul de uma mistura 7 : 1 dos reagentes PPP baixo e PPP 5 pm (Diagnostica Stago) para amostras de PFP, ou com amostras de reagente de PRP (Diagnostica stago) para PRP. Após a adição de 20 uL de CaCl? e substrato fluorgênico (1-1140; Bachem), a geração de trombina foi seguida em um leitor de ascensão Fluoroskan (Thermo Labsystems).
[0155] Sendo PS um regulador chave de geração de trombina, considera-se que alvejar PS pode constituir uma terapia potencial para hemofilia.
[0156] Estudos extensos em camundongos proveem prova de dados conceituais que auxiliam um papel central para PS e TFPI, uma vez que contribuem para o sangramento e dano articular grave em camundongos hemofílicos. Alvejamento de Pros1 ou inibição de PS apresenta a capacidade de melhorar a hemofilia em camundongos, da maneira julgada pela melhoria in vivo do fenótipo de sangramento nos ensaios de sangramento de cauda, e a proteção completa contra hemartrose (Figura 3A-C e 4). Em decorrência das articulações exibirem uma expressão muito fraca de TF, e células sinoviais produzirem uma grande quantidade de TFPla e PS (Figura 5), a atividade da via extrínseca é muito reduzida intra-articularmente, predispondo articulações hemofílicas a sangrarem. Além disso, tanto receptores de trombomodulina (TM) quanto proteína C endotelial (EPCR) são expressos por FLS, sugerindo que o complexo TM-trombina ativa PC ligada à EPCR para gerar o anticoagulante muito potente, APC, no contexto de AH. De maneira importante, a expressão de TFPla é regulada positivamente por trombina (Figura 5F). Assim, AH que resulta em geral em inflamação local acentuada e sintomas articulares, que podem durar por dias a semanas, também promovem a geração local e secreção de anticoagulantes múltiplos, ou seja APC, TFPIa, e seu cofator mútuo de PS, que podem ajudar a explicar a patofisiologia de dano articular em hemofilia.
[0157] Observações usando amostras clínicas de pacientes hemofílicos são consistentes com as lições aprendidas a partir dos estudos com murino. Em humanos, o bloqueio de PS no plasma de pacientes com HA, com ou sem inibidores, normaliza o ETP (Figura 7D-G). Pacientes com HB exibem menos expressão intra-articular de TFPI e PS do que pacientes com HA, consistente com o conhecimento atual de que pacientes com HB sangram menos que aqueles com HA (Figura 6). Além do mais, pacientes com HA que recebem profilaxia exibem menos expressão sinovial de TFP| e PS do que pacientes que recebem concentrados de FVIIl apenas no contexto de sangramento, isto é, a assim denominada “terapia sob demanda” (Figura 6A). Finalmente, FLS de humano secreta tanto TFPla quanto PS, da maneira observada em camundongos, fortalecendo assim a extrapolação de dados de hemofilia em murinos para humanos.
[0158] Os achados extensos neste relatório levam à proposta de que o alvejamento de PS pode ser potencialmente traduzido para terapias usadas para hemofilia. PS em articulações humanas e de murino é um contribuinte patofisiológico inédito para hemartrose, e constitui um alvo terapêutico potencial atraente especialmente em decorrência de sua atividade dupla de cofator tanto para APC quanto TFPIa nas articulações. Na presença de PS, hemartrose aumenta a expressão de TFPla na sinóvia. O alvejamento de PS em camundongos protege os mesmos de hemartrose. Assim, propõe-se que TFPla e seu cofator PS, ambos produzidos por FLS, junto com a via TM-EPCR-PC, compreendam um sistema anticoagulante intra- articular potente que apresenta um importante impacto patológico na hemartrose. O RNA silenciador a PS de murino PS que foi satisfatoriamente usado em camundongos hemofílicos (Figura 4H-Il e A figura 5A) é uma abordagem terapêutica que será desenvolvida para pacientes hemofílicos. A vantagem de RNA silenciador em relação à terapia de substituição de fator atual é sua meia vida mais longa, que reduz a frequência das injeções e sua possível via de administração subcutânea.
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Claims (10)
1. Uso de um RNAsi contra proteína S, caracterizado por ser na preparação de um medicamento para o tratamento de hemofilia.
2. Uso do RNAsi contra proteína S, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o dito RNAsi compreender 17-24 nucleotídeos.
3. Uso do RNAsi contra proteína S, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, o dito RNAsi caracterizado por uma sequência reversa complementar à SEQ ID 001 ou SEQ ID 002.
4. Uso do RNAsi contra proteína S, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, o dito RNAsi caracterizado por uma sequência reversa complementar a uma sequência selecionada a partir do grupo compreendendo SEQ ID NO 003, SEQ ID NO 004, SEQ ID NO 005, SEQ ID NO 006, SEQ ID NO 007, SEQ ID NO 008, SEQ ID NO 009, SEQ ID NO 010, SEQ ID NO 011, SEQ ID NO 012, SEQ ID NO 013, SEQ ID NO 014, SEQ ID NO 015, SEQ ID NO 016, SEQ ID NO 017 e SEQ ID NO 018.
5. Uso do RNAsi contra proteína S, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, o dito RNAsi caracterizado por uma sequência reversa complementar a uma sequência que compreende os nucleotídeos 1-100, 101-200, 201-300, 301-400, 301-400, 401-500, 501-600, 601-700, 701-800, 801-900, 901-1000, 1001-1100, 1101-1200, 1201-1300, 1301-1400, 1501-1600, 1701-1800, 1801-1900, 1901-2000, 2001-2100, 2101-2200, 2201-2300, 2301-2400, 2501-2600, 2701-2800, 2801-2900, 2901-3000, 3001-3100, 3101-3200, 3201-3300, 3301-3400, 3401-3500 ou 3501-3580 de SEQ ID NO 001.
6. Uso do RNAsi contra proteína S, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, o dito RNAsi caracterizado por uma sequência que compreende ou consiste em uma sequência selecionada a partir do grupo que compreende SEQ ID NO 019 (RNAsi 1), SEQID NO 020 (RNAsi 2), SEQ ID NO 021 (RNAsi 3), SEQ ID NO 022 (RNAsi 4), SEQ ID NO 023 (RNAsi 5), SEQ ID NO 024 (RNAsi 6), SEQ ID NO 025 (RNAsi 7), SEQ ID NO 026 (RNAsi 8), SEQ ID NO 027
(RNAsi 9), SEQ ID NO 028 (RNAsi 10), SEQ ID NO 029 (RNAsi 11), SEQID NO 030 (RNAsi 12), SEQ ID NO 031 (RNAsi 13), SEQ ID NO 032 (RNAsi 14), SEQ ID NO 033 (RNAsi 15), SEQ ID NO 034 (RNAsi 16), SEQ ID NO 035 (RNAsi 17), SEQ ID NO 036 (RNAsi 18), SEQ ID NO 037 (RNAsi 19), SEQ ID NO 038 (RNAsi 20), SEQ ID NO 039 (RNAsi 21), SEQ ID NO 040 (RNAsi 22), SEQ ID NO 041 (RNAsi 23), SEQ ID NO 042 (RNAsi 24), SEQ ID NO 043 (RNAsi 25), SEQ ID NO 044 (RNAsi 26), SEQ ID NO 045 (RNAsi 27), SEQ ID NO 046 (RNAsi 28), SEQ ID NO 047 (RNAsi 29), SEQ ID NO 048 (RNAsi 30), SEQ ID NO 049 (RNAsi 31), SEQ ID NO 050 (RNAsi 32), SEQ ID NO 051(RNAsi 33), SEQ ID NO 052 (RNAsi 34), SEQ ID NO 053 (RNAsi 35), SEQ ID NO 054 (RNAsi 36), SEQ ID NO 055 (RNAsi 37), SEQ ID NO 056 (RNAsi 38), SEQ ID NO 057 (RNAsi 39), SEQ ID NO 058 (RNAsi 40), SEQ ID NO 059 (RNAsi 41), SEQ ID NO 060 (RNAsi 42), SEQ ID NO 061 (RNAsi 43), SEQ ID NO 062 (RNAsi 44), SEQ ID NO 063 (RNAsi 45), SEQ ID NO 064 (RNAsi 46), SEQ ID NO 065 (RNAsi 47), SEQ ID NO 066(RNAsi 48), SEQ ID NO 067 (RNAsi 49), e SEQ ID NO 068 (RNAsi 50).
7. Uso do RNAsi contra proteína S, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizado por o dito RNAsi ser direcionado contra uma sequência intrônica de proteína S.
8. Uso do RNAsi contra proteína S, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por ser para o tratamento de hemofilia A.
9. Uso do RNAsi contra proteína S, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por ser para o tratamento de hemofilia B.
10. Forma de dosagem para a prevenção ou tratamento de hemofilia, caracterizada por compreender uma molécula que compreende um RNAsi como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9.
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