KR20200074193A - 단백질 S에 특이적인 siRNA의 혈우병 치료 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 혈우병 치료 방법에 사용하기 위한 단백질 S에 대한 siRNA를 제공한다. 본 발명에 따른 siRNA를 포함하는 분자, 및 본 발명에 따른 siRNA를 포함하는 분자를 포함하는 혈우병 예방 또는 치료를 위한 투약 형태를 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 필요로 하는 환자의 혈우병 치료방법 또한 본 발명의 범위에 속한다.

Description

단백질 S에 특이적인 siRNA의 혈우병 치료 용도

본 발명은 단백질 S에 대하여 지시되는 siRNA를 사용한 혈우병 치료에 관한 것이다.

발명의 배경

혈우병 A (HA) 및 B (HB)는 유전적 X-연관 장애이다. 이들은 각각 인자 VIII (FVIII) (F8) 또는 인자 IX (FIX) 유전자 (F9)의 돌연변이에 의해 유발되며, 이는 고유한 응고 경로의 필수 성분인 인코드된 단백질의 결핍을 초래한다 (도 1A).

중증 혈우병 환자는 종종 근골격계 내부에서의 자연 출혈, 가령, 근육염을 겪는다. 이를 치료하지 않고 두게 되면 어린 나이에 장애가 생길 수 있다.

현재 혈우병 치료에는 인자 대체 요법이 포함된다. 이 요법은 삶의 질 (QoL)을 향상시키지만 여전히 몇 가지 단점이 있다. 인자는 정맥내 투여되며, 반감기가 짧기 때문에 반복적으로 주입해야 하고, 환자에게 큰 불편함을 주고, 감염 및 정맥 손상의 위험이 있다. 더 중요하게는, 인자 대체 요법하의 환자는 억제성 동종항체를 발달시킬 수 있다. 억제제는 대체 요법을 비효율적이게 하고 환자의 안전하고 효과적인 치료 표준에 대한 접근을 제한하여 환자의 이환율과 사망률 위험을 증가시킨다.

새로운 요법은 예방 주입 빈도를 감소시켜 치료법과 QoL에 대한 순응도를 잠재적으로 개선 할 수 있는 산물의 개발에 중점을 둔다. 오래 지속되는 FVIII 및 FIX 이외에, 신규한 접근법은 혈우병 환자의 응고 균형을 재조정하는 전략으로서, 내인성 응고 인자의 생산에 필요한 유전자의 대체, 결손 인자의 응고 기능을 모방하는 이중특이적 항체 기술 및 조직 인자 경로 억제제 (TFPI) 또는 안티트롬빈과 같은 응고 억제제의 표적화를 포함한다. 최근에, 활성화된 단백질 C (APC)-특이적 세르핀이 시험관내 트롬빈 생성을 구제하고 혈우병 마우스 모델에서 지혈을 회복시키는 것으로 나타났다.

상기 기술 상황에 기초하여, 본 발명의 목적은 새로운 혈우병 치료를 제공하는 수단 및 방법을 제공하는 것이다. 이 목적은 본 명세서의 청구범위에 의해 달성된다.

발명의 설명

본 발명의 제 1 양상은 혈우병 치료 방법에 사용하기 위한 단백질 S에 대한 siRNA를 제공한다.

본 명세서의 내용에서 용어 혈우병은 응혈을 만드는 신체의 능력이 손상되는 병태와 관련이 있다. 혈우병의 유전적 형태에는 유전 질환 혈우병 A, 혈우병 B 및 혈우병 C가 포함된다.

본 명세서의 내용에서 단백질 S는 유전자 PROS1 (NCBI 유전자 ID: 5627)에 의해 인코드되는 인간 "비타민 K-의존성 단백질 S" (UniProt ID P07225)에 관한 것이다.

인간 단백질 S의 2개의 전사 변이체가 존재한다. 전사 변이체 2는 전사 변이체 1과 비교하여 5' 코딩 영역 내 교번 인-프레임 엑손이 없다. 인코드된 아이소형 2는 아이소형 1 보다 더 짧다. 전사 변이체 2는 서열 번호 001로 특징된다. 전사 변이체 1은 서열 번호 002로 특징된다.

본 명세서의 내용에서 용어 siRNA (작은/짧은 간섭 RNA)는 RNA 간섭이라 불리는 과정에서 siRNA의 서열에 상보적인 핵산 서열을 포함하는 유전자의 발현을 간섭 (다시 말하면: 발현을 저해) 할 수 있는 RNA 분자에 관한 것이다. 용어 siRNA는 단일 가닥 siRNA 및 이중 가닥 siRNA 모두를 포함하는 것을 의미한다. SiRNA는 일반적으로 17-24 bp의 길이를 특징으로 한다. 이중 가닥 siRNA는 보다 긴 이중 가닥 RNA 분자 (dsRNA)로부터 유래된다. 긴 dsRNA는 엔도-리보뉴클레아제 (다이서 (Dicer)라 함)에 의해 절단되어 이중 가닥 siRNA를 형성한다. 핵 단백질 복합체 (RISC라 함)에서, 이중 가닥 siRNA는 풀려서 단일 가닥 siRNA를 형성한다. RNA 간섭은 종종 상보적 서열을 갖는 mRNA 분자에 대한 siRNA 분자의 결합을 통해 작용하여 mRNA를 분해시킨다. RNA 간섭은 또한 세포의 핵 내 전구-mRNA (미성숙, 스플라이스되지 않은 mRNA)의 인트론 서열에 대한 siRNA 분자의 결합에 의해 가능하며, 전구-mRNA를 분해한다.

본 발명자들은 표적 단백질 S (PS)가 응고를 재조정함으로써 혈우병의 지혈을 촉진 할 수 있는지를 조사하였다 (도 1B). PROS1 유전자에 의해 인코드되는 PS는 인자 Va (FVa) 및 FVIIIa의 불활성화에서 APC에 대해 및 FXa의 억제에서 TFPI에 대해 보조인자로 작용한다. 이러한 이중 역할은 PS를 트롬빈 생성의 주요 조절인자가 되게 한다.

특정 구체예들에서, siRNA는 17-24개의 뉴클레오티드를 포함한다.

특정 구체예들에서, siRNA는 18-22개의 뉴클레오티드를 포함한다.

특정 구체예들에서, siRNA는 19개의 뉴클레오티드를 포함한다.

특정 구체예들에서, siRNA는 서열 번호 001에 역 상보적인 서열로 특징된다.

특정 구체예들에서, siRNA는 서열 번호 002에 역 상보적인 서열로 특징된다.

특정 구체예들에서, siRNA는 서열 번호 003, 서열 번호 004, 서열 번호 005, 서열 번호 006, 서열 번호 007, 서열 번호 008, 서열 번호 009, 서열 번호 010, 서열 번호 011, 서열 번호 012, 서열 번호 013, 서열 번호 014, 서열 번호 015, 서열 번호 016, 서열 번호 017 및 서열 번호 018을 포함하는 그룹에서 선택된 서열에 역 상보적인 서열로 특징된다.

특정 구체예들에서, siRNA는 서열 번호 003에 역 상보적인 서열로 특징된다.

특정 구체예들에서, siRNA는 서열 번호 004에 역 상보적인 서열로 특징된다.

특정 구체예들에서, siRNA는 서열 번호 005에 역 상보적인 서열로 특징된다.

특정 구체예들에서, siRNA는 서열 번호 006에 역 상보적인 서열로 특징된다.

특정 구체예들에서, siRNA는 서열 번호 007에 역 상보적인 서열로 특징된다.

특정 구체예들에서, siRNA는 서열 번호 008에 역 상보적인 서열로 특징된다.

특정 구체예들에서, siRNA는 서열 번호 009에 역 상보적인 서열로 특징된다.

특정 구체예들에서, siRNA는 서열 번호 010에 역 상보적인 서열로 특징된다.

특정 구체예들에서, siRNA는 서열 번호 011에 역 상보적인 서열로 특징된다.

특정 구체예들에서, siRNA는 서열 번호 012에 역 상보적인 서열로 특징된다.

특정 구체예들에서, siRNA는 서열 번호 013에 역 상보적인 서열로 특징된다.

특정 구체예들에서, siRNA는 서열 번호 014에 역 상보적인 서열로 특징된다.

특정 구체예들에서, siRNA는 서열 번호 015에 역 상보적인 서열로 특징된다.

특정 구체예들에서, siRNA는 서열 번호 016에 역 상보적인 서열로 특징된다.

특정 구체예들에서, siRNA는 서열 번호 017에 역 상보적인 서열로 특징된다.

특정 구체예들에서, siRNA는 서열 번호 018에 역 상보적인 서열로 특징된다.

특정 실시 양태에서, siRNA는 상기 정의된 서열 중 임의의 2개의 연속 서열을 병치함으로써 형성된 서열에 역 상보적인 서열로 특징된다. 비 제한적인 예로서, siRNA는 서열 번호 014 및 서열 번호 015를 병치함으로써 형성된 서열에 역 상보적인 서열로 특징된다.

특정 구체예들에서, siRNA는 서열 번호 014 (엑손 12), 서열 번호 011 (엑손 9), 서열 번호 006 (엑손 4), 서열 번호 012 (엑손 10) 및 서열 번호 013 (엑손 11)으로 구성된 그룹에서 선택된 서열에 역 상보적인 서열로 특징된다.

특정 구체예들에서, siRNA는 서열 번호 001의 뉴클레오티드 1-100, 101-200, 201-300, 301-400, 301-400, 401-500, 501-600, 601-700, 701-800, 801-900, 901-1000, 1001-1100, 1101-1200, 1201-1300, 1301-1400, 1501-1600, 1701-1800, 1801-1900, 1901-2000, 2001-2100, 2101-2200, 2201-2300, 2301-2400, 2501-2600, 2701-2800, 2801-2900, 2901-3000, 3001-3100, 3101-3200, 3201-3300, 3301-3400, 3401-3500 또는 3501-3580으로 특징되는 서열에 역 상보적인 서열로 특징된다.

특정 구체예들에서, siRNA는 서열 번호 001의 뉴클레오티드 1-100으로 특징되는 서열에 역 상보적인 서열로 특징된다.

특정 구체예들에서, siRNA는 서열 번호 001의 뉴클레오티드 101-200으로 특징되는 서열에 역 상보적인 서열로 특징된다.

특정 구체예들에서, siRNA는 서열 번호 001의 뉴클레오티드 201-300으로 특징되는 서열에 역 상보적인 서열로 특징된다.

특정 구체예들에서, siRNA는 서열 번호 001의 뉴클레오티드 301-400으로 특징되는 서열에 역 상보적인 서열로 특징된다.

특정 구체예들에서, siRNA는 서열 번호 001의 뉴클레오티드 401-500으로 특징되는 서열에 역 상보적인 서열로 특징된다.

특정 구체예들에서, siRNA는 서열 번호 001의 뉴클레오티드 501-600으로 특징되는 서열에 역 상보적인 서열로 특징된다.

특정 구체예들에서, siRNA는 서열 번호 001의 뉴클레오티드 601-700으로 특징되는 서열에 역 상보적인 서열로 특징된다.

특정 구체예들에서, siRNA는 서열 번호 001의 뉴클레오티드 701-800으로 특징되는 서열에 역 상보적인 서열로 특징된다.

특정 구체예들에서, siRNA는 서열 번호 001의 뉴클레오티드 801-900으로 특징되는 서열에 역 상보적인 서열로 특징된다.

특정 구체예들에서, siRNA는 서열 번호 001의 뉴클레오티드 901-1000으로 특징되는 서열에 역 상보적인 서열로 특징된다.

특정 구체예들에서, siRNA는 서열 번호 001의 뉴클레오티드 1001-1100으로 특징되는 서열에 역 상보적인 서열로 특징된다.

특정 구체예들에서, siRNA는 서열 번호 001의 뉴클레오티드 1100-1200으로 특징되는 서열에 역 상보적인 서열로 특징된다.

특정 구체예들에서, siRNA는 서열 번호 001의 뉴클레오티드 1201-1300으로 특징되는 서열에 역 상보적인 서열로 특징된다.

특정 구체예들에서, siRNA는 서열 번호 001의 뉴클레오티드 1301-1400으로 특징되는 서열에 역 상보적인 서열로 특징된다.

특정 구체예들에서, siRNA는 서열 번호 001의 뉴클레오티드 1401-1500으로 특징되는 서열에 역 상보적인 서열로 특징된다.

특정 구체예들에서, siRNA는 서열 번호 001의 뉴클레오티드 1501-1600으로 특징되는 서열에 역 상보적인 서열로 특징된다.

특정 구체예들에서, siRNA는 서열 번호 001의 뉴클레오티드 1601-1700으로 특징되는 서열에 역 상보적인 서열로 특징된다.

특정 구체예들에서, siRNA는 서열 번호 001의 뉴클레오티드 1701-1800으로 특징되는 서열에 역 상보적인 서열로 특징된다.

특정 구체예들에서, siRNA는 서열 번호 001의 뉴클레오티드 1801-1900으로 특징되는 서열에 역 상보적인 서열로 특징된다.

특정 구체예들에서, siRNA는 서열 번호 001의 뉴클레오티드 1901-2000으로 특징되는 서열에 역 상보적인 서열로 특징된다.

특정 구체예들에서, siRNA는 서열 번호 001의 뉴클레오티드 2001-2100으로 특징되는 서열에 역 상보적인 서열로 특징된다.

특정 구체예들에서, siRNA는 서열 번호 001의 뉴클레오티드 2100-2200으로 특징되는 서열에 역 상보적인 서열로 특징된다.

특정 구체예들에서, siRNA는 서열 번호 001의 뉴클레오티드 2201-2300으로 특징되는 서열에 역 상보적인 서열로 특징된다.

특정 구체예들에서, siRNA는 서열 번호 001의 뉴클레오티드 2301-2400으로 특징되는 서열에 역 상보적인 서열로 특징된다.

특정 구체예들에서, siRNA는 서열 번호 001의 뉴클레오티드 2401-2500으로 특징되는 서열에 역 상보적인 서열로 특징된다.

특정 구체예들에서, siRNA는 서열 번호 001의 뉴클레오티드 2501-2600으로 특징되는 서열에 역 상보적인 서열로 특징된다.

특정 구체예들에서, siRNA는 서열 번호 001의 뉴클레오티드 2601-2700으로 특징되는 서열에 역 상보적인 서열로 특징된다.

특정 구체예들에서, siRNA는 서열 번호 001의 뉴클레오티드 2701-2800으로 특징되는 서열에 역 상보적인 서열로 특징된다.

특정 구체예들에서, siRNA는 서열 번호 001의 뉴클레오티드 2801-2900으로 특징되는 서열에 역 상보적인 서열로 특징된다.

특정 구체예들에서, siRNA는 서열 번호 001의 뉴클레오티드 2901-3000으로 특징되는 서열에 역 상보적인 서열로 특징된다.

특정 구체예들에서, siRNA는 서열 번호 001의 뉴클레오티드 3001-3100으로 특징되는 서열에 역 상보적인 서열로 특징된다.

특정 구체예들에서, siRNA는 서열 번호 001의 뉴클레오티드 3100-3200으로 특징되는 서열에 역 상보적인 서열로 특징된다.

특정 구체예들에서, siRNA는 서열 번호 001의 뉴클레오티드 3201-3300으로 특징되는 서열에 역 상보적인 서열로 특징된다.

특정 구체예들에서, siRNA는 서열 번호 001의 뉴클레오티드 3301-3400으로 특징되는 서열에 역 상보적인 서열로 특징된다.

특정 구체예들에서, siRNA는 서열 번호 001의 뉴클레오티드 3401-3500으로 특징되는 서열에 역 상보적인 서열로 특징된다.

특정 구체예들에서, siRNA는 서열 번호 001의 뉴클레오티드 3501-3580으로 특징되는 서열에 역 상보적인 서열로 특징된다.

특정 실시 양태에서, siRNA는 상기 정의된 서열 중 임의의 2개의 연속 서열을 병치함으로써 형성된 서열에 역 상보적인 서열로 특징된다. 비 제한적인 예로서, siRNA는 서열 번호 001의 1501-1600 및 서열 번호 001의 1501-1600을 병치함으로써 형성된 서열에 역 상보적인 서열로 특징된다.

특정 구체예들에서, siRNA는 단백질 S의 인트론 서열에 대해 지시된다.

특정 구체예들에서, siRNA는 서열 번호 014 (엑손 12), 서열 번호 011 (엑손 9), 서열 번호 006 (엑손 4), 서열 번호 012 (엑손 10) 및 서열 번호 013 (엑손 11)으로 구성된 그룹에서 선택된 서열에 역 상보적인 서열로 특징된다.

특정 구체예들에서, siRNA는 서열 번호 019 (siRNA_1), 서열 번호 020 (siRNA_2), 서열 번호 021 (siRNA_3), 서열 번호 022 (siRNA_4), 서열 번호 023 (siRNA_5), 서열 번호 024 (siRNA_6), 서열 번호 025 (siRNA_7), 서열 번호 026 (siRNA_8), 서열 번호 027 (siRNA_9), 서열 번호 028 (siRNA_10), 서열 번호 029 (siRNA_11), 서열 번호 030 (siRNA_12), 서열 번호 031 (siRNA_13), 서열 번호 032 (siRNA_14), 서열 번호 033 (siRNA_15), 서열 번호 034 (siRNA_16), 서열 번호 035 (siRNA_17), 서열 번호 036 (siRNA_18), 서열 번호 037 (siRNA_19), 서열 번호 038 (siRNA_20), 서열 번호 039 (siRNA_21), 서열 번호 040 (siRNA_22), 서열 번호 041 (siRNA_23), 서열 번호 042 (siRNA_24), 서열 번호 043 (siRNA_25), 서열 번호 044 (siRNA_26), 서열 번호 045 (siRNA_27), 서열 번호 046 (siRNA_28), 서열 번호 047 (siRNA_29), 서열 번호 048 (siRNA_30), 서열 번호 049 (siRNA_31), 서열 번호 050 (siRNA_32), 서열 번호 051(siRNA_33), 서열 번호 052 (siRNA_34), 서열 번호 053 (siRNA_35), 서열 번호 054 (siRNA_36), 서열 번호 055 (siRNA_37), 서열 번호 056 (siRNA_38), 서열 번호 057 (siRNA_39), 서열 번호 058 (siRNA_40), 서열 번호 059 (siRNA_41), 서열 번호 060 (siRNA_42), 서열 번호 061 (siRNA_43), 서열 번호 062 (siRNA_44), 서열 번호 063 (siRNA_45), 서열 번호 064 (siRNA_46), 서열 번호 065 (siRNA_47), 서열 번호 066(siRNA_48), 서열 번호 067 (siRNA_49), 및 서열 번호 068 (siRNA_50)을 포함하는 그룹에서 선택된 서열을 포함하는 또는 이러한 서열로 구성된 서열로 특징된다.

특정 구체예들에서, siRNA는 혈우병 A의 치료 방법에 사용하기 위해 제공된다.

특정 구체예들에서, siRNA는 혈우병 B의 치료 방법에 사용하기 위해 제공된다.

유사하게, 본 발명의 범위에는 본 발명에 따른 siRNA를 포함하는 분자를 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 필요로 하는 환자에서 혈우병을 치료하는 방법이 속한다.

유사하게, 본 발명에 따른 siRNA를 포함하는 분자를 포함하는 혈우병의 예방 또는 치료를 위한 투여 형태가 제공된다.

본 명세서의 내용에서, "본 발명에 따른 siRNA를 포함하는 분자"라는 표현은 이로부터 RNA 간섭 경로에 의해 포유 동물 세포 내에서 본 발명에 따른 siRNA가 생성 될 수 있는, 본 발명에 따른 siRNA 및 분자, 특히, dsRNA 분자를 포함한다.

본 발명의 내용에서 "뉴클레오티드"는 핵산 또는 핵산 유사체 빌딩 블록이며, 이의 올리고머는 염기 쌍을 기초로 RNA 올리고머와의 선택적 하이브리드를 형성 할 수 있다. 이와 관련하여 용어 뉴클레오티드는 고전적인 리보뉴클레오티드 빌딩 블록 아데노신, 구아노신, 우리딘 (및 리보실티민), 시티딘, 고전적인 데옥시리보뉴클레오티드 데옥시아데노신, 데옥시구아노신, 티미딘, 데옥시우리딘 및 데옥시시티딘을 포함한다. 또한 이는 핵산의 유사체, 가령, 포스포티오에이트, 2'O-메틸포스포티오에이트, 펩티드 핵산 (PNA; 펩티드 링키지에 의해 연결된 N-(2-아미노에틸)-글리신 단위, 핵염기가 글리신의 알파-탄소에 부착됨) 또는 잠금 핵산 (LNA; 2'O, 4'C 메틸렌 가교된 RNA 빌딩 블록)을 포함한다. 혼성화 서열은 임의의 상기 뉴클레오티드, 또는 이들의 혼합물로 구성 될 수 있다.

특정 구체예들에서, 본 발명에 따른 siRNA의 혼성화 서열은 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 또는 27 개의 뉴클레오티드를 포함한다.

특정 구체예들에서, 혼성화 서열은 서열 번호 001 또는 서열 번호 002의 역 상보적 서열과 95% 이상 동일하고, 보다 바람직하게는 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일하다. 특정 구체예들에서, 혼성화 서열은 데옥시뉴클레오티드, 포스포티오에이트 데옥시뉴클레오티드, LNA 및/또는 PNA 뉴클레오티드 또는 이들의 혼합물을 포함한다.

본 명세서의 내용에서, 서열 동일성 및 서열 동일성 백분율이라는 용어는 2개의 정렬된 서열을 비교함으로써 결정된 값을 지칭한다. 비교를 위한 서열 정렬 방법은 해당 분야에 잘 공지되어 있다. 비교를 위한 서열의 정렬은 Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)의 국소 상동성 알고리즘, Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970)의 전역 정렬 알고리즘, Pearson and Lipman, Proc. Nat. Acad. Sci. 85:2444 (1988)의 유사성 방법을 위한 연구 또는 CLUSTAL, GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA 및 TFASTA를 비롯한 (그러나 이에 제한되는 것은 아님) 이들 알고리즘의 컴퓨터 수행에 의해 수행될 수 있다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 공개적으로, 예를 들어, 국립 생명 공학 정보 센터 (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)를 통해 이용할 수 있다.

아미노산 서열을 비교하는 한 가지 예는 다음과 같은 기본 설정을 사용하는 BLASTP 알고리즘이다: 예상 임계값: 10; 워드 크기: 3; 쿼리 범위 내 최대 일치:　0; 매트릭스: BLOSUM62; 갭 코스트: 존재 11, 확장 1; 구성 조정: 조건부 구성 점수 매트릭스 조정. 핵산 서열의 비교를 위한 하나의 이러한 예는 기본 설정을 사용하는 BLASTN 알고리즘이다: 예상 임계값: 10; 워드 크기: 28; 쿼리 범위 내 최대 일치:　0; 일치/불일치 점수:　1.-2; 갭 코스트: 선형. 달리 언급되지 않는 한, 본원에 제공된 서열 동일성 값은 단백질 및 핵산 비교 각각에 대한 상기 확인된 기본 변수를 사용하는 BLAST 수이트 (suite) 프로그램 (Altschul 외, J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990))을 사용하여 수득된 값을 지칭한다.

일부 구체예에서, 혼성화 서열은 리보뉴클레오티드, 포스포티오에이트 및/또는 2'-O-메틸-변형 포스포티오에이트 리보뉴클레오티드를 포함한다.

일부 구체예에서, 혼성화 서열은 데옥시뉴클레오티드, 포스포티오에이트 데옥시 뉴클레오티드, 포스포티오에이트 리보뉴클레오티드 및/또는 2'-O-메틸-변형 포스포티오에이트 리보뉴클레오티드를 포함한다.

단일의 분리가능한 특징들에 대한 대안이 본 명세서에서 "구체예"로 제시되는 경우, 이러한 대안은 자유롭게 조합되어 본 명세서에 개시된 본 발명의 개별 구체예를 형성할 수 있음을 이해해야 한다.

본 발명은 하기 실시예 및 도면에 의해 추가로 예시되며, 이로부터 추가의 구체예 및 이점을 얻을 수 있다. 이들 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 것이지 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.

도면의 설명
도 1은 X-ase 활성의 소실이 Pros1-/-마우스를 구제한다는 것을 보여준다. A, 혈우병 상태에서 트롬빈 생성의 개략도. 주요 응고 복합체 중 하나는 고유 테나제 (X-ase) 복합체이다. X-ase는 프로테아제로서 활성화된 FIX (FIXa), 보조 인자로서 활성화된 FVIII (FVIIIa) 및 기질로서 인자 X (FX)를 포함한다. 손상 부위에서 조직 인자 (TF)의 생성 또는 노출이 외인성 경로를 통한 응고를 개시하는 주요 사건이지만, 내인성 경로 X-ase는 생체내에서 이용가능한 활성 TF의 제한된 양으로 인해 중요하며, 활성화 FX (FXa)과 복합체를 형성할 때 TFPI의 존재는 TF/활성화 인자 VII (FVIIa) 복합체를 억제한다 (도 1a). 따라서, 지속적인 트롬빈 생성은 FIX 및 FVIII의 활성화에 의존한다 (도 1a). FVIII는 FXa 및 트롬빈 모두에 의해 활성화되고, FIX는 FVIIa 및 활성화 인자 XI (FXIa) 모두에 의해 활성화되며, 이 때 후자는 트롬빈에 의해 사전에 활성화되기 때문에 이 과정이 증폭된다. 결과적으로, FVIII 및 FIX 활성화의 점진적인 증가는 FXa 및 트롬빈이 형성 될 때 발생하고, B는 Pros1을 표적화함으로써 심각한 혈우병 A 및 B에서 트롬빈 생성을 향상시키는 실험적 접근법이다. C-D, Pros1 결핍의 유무에 관계없이 혈액친화성 성체 마우스에서 DIC 혈액 변수의 평가: F8 ^-/- Pros1 ^+/+ , F8 ^-/- Pros1 ^+/- 및 F8 ^-/- Pros1 ^{-/ -} (C), 및 F9 ^-/- Pros1 ^+/+ , F9 ^-/- Pros1 ^+/- 및 F9 ^-/- Pros1 ^{-/ -} 성체 마우스 (D) (n=5/그룹)에서 PS (항원성), FVIII (응고 활성) 또는 FIX (응고 활성) 혈장 수준; 혈우병 A 그룹에서 혈소판 (n=7/그룹), 피브리노겐 (n=8/그룹), PT (n=6/그룹) 및 TAT (n=6/그룹) (c); 및 혈우병 B 그룹에서 혈소판 (n=5/그룹), 피브리노겐 (n=4/그룹), PT (n=4/그룹) 및 TAT (n=4/그룹) (D). EF, 2U/g 재조합 FVIII (Advate®주입의 단회 정맥 주사 후 24시간에 F8-/-Pros1-/- 마우스로부터의 폐의 육안 이미지 (E) 및 폐 구역에서 피브린 응혈에 대한 상응하는 현미경 평가 (F). G, F8 ^-/- Pros1 ^+/+ 및 F8 ^-/- Pros1 ^{- /-}에서 재조합 FVIII (Advate®투여: 0.3 U/g Advate®의 5회 iv 주사 (주사 시점: 카테터 삽입 1 시간 전 및 카테터 삽입 후 1시간, 4시간, 8시간 및 16시간) 후 24시간에 (n=3) (G, 흰색 및 검은색 컬럼) 그리고 F8 ^-/- Pros1 ^{- /-} 에서 단회 i.v. 주사 후 24시간에(n=3) (G, 점선 컬럼) 피브리노겐 및 TAT의 혈장 수준, 그리고 0.3 U/g의 Advate®의 반복 i.v. 주사 후 (H) 그리고 0.3 U/g Advate®i.v.의 단회 i.v. 주사 후 (i) 24시간에 F8 ^-/- Pros1 ^{- /-}에서 폐 및 간 구역 내 피브린 응혈을 검출할 수 있는 대표적인 면역조직화학. 모든 데이터는 평균 ± sem으로 표현됨; ns, 유의하지 않음; *, P<0.05 **; P<0.005.
도 2는 쥐과 혈전증 모델을 보여준다. A-C, F8 ^+/+ Pros1 ^+/+ , F8 ^-/- Pros1 ^+/+ , F8 ^-/- Pros1 ^{+ /-} 및 F8 ^-/- Pros1 ^-/- 마우스에서 TF-유도 정맥 혈전색전증 (n=10/유전자형). 마취된 마우스에 다음과 같은 상이한 용량의 재조합 TF (Innovin): A에서 ½ 희석 (~4.3 nM TF) 그리고 B-C에서 ¼희석 (~2.1 nM TF)을 하대 정맥을 통해 정맥내 주사하였다. (A)에서, 한 그룹의 F8 ^+/+ Pros1 ^+/+ 마우스는 저 분자량 헤파린 (에녹사파린 60 μg/g s.c.) 주사를 제공받았다. 최소 2분 동안 지속되었던 호흡 정지 시작까지의 시간이 기록되었다. 실험은 20분에 종료되었다. 카플란-마이어 생존 곡선 (A-B). C, 호흡 정지 시작 2분 후 또는 20분 관찰 기간의 완료시, 폐를 절제하고 피브린 응혈 (불용성 피브린에 대한 면역염색, mAb 클론 102-10)을 조사하였다. D, F8 ^+/+ Pros1 ^+/+ , F8 ^-/- Pros1 ^+/+ 및 F8 ^-/- Pros1 ^-/- 마우스에서 생체 현미경에 의해 기록된 FeCl₃-손상 장간막 동맥에서의 혈전 형성, 대표적 실험 (n=3/유전자형). D, F8 ^+/+ Pros1 ^+/+ , F8 ^-/- Pros1 ^+/+ 및 F8 ^-/- Pros1 ^-/- 마우스에서 생체 현미경에 의해 기록된 FeCl₃-손상 장간막 동맥에서의 혈전 형성, 대표적 실험 (n=3/유전자형).
도 3은 꼬리 출혈 모델을 보여준다. 새로운 식염수 튜브에서 30분 (A) 및 10분 (B) 동안 2mm (A) 및 4mm (B) 꼬리 절개 후 혈액을 수집하였다; 이어서 총 혈액 손실 (μl)을 측정하였다. F8 ^+/- Pros1 ^+/+ 및 F8 ^+/+ Pros1 ^+/+ 마우스 (흰색 컬럼)가 대조군으로 사용되었다 (A의 모든 그룹에 대해 n=5, B의 모든 그룹에 대해 n=6). C, 항-인간 PS 항체는 4 mm 절개 후 꼬리 출혈을 변경시켰다.
도 4는 급성 간경변증 모델을 보여준다. A, F8 ^-/- Pros1 ^+/+ , F8 ^-/- Pros1 ^+/- , F8 ^-/- Pros1 ^-/- 및 F8 ^+/+ Pros1 ^+/+ 마우스에서 부상 72h 후 및 부상 전 사이의 무릎 직경 차이. B, F8 ^+/+ Pros1 ^+/+ , F8 ^-/- Pros1 ^+/+ 및 F8 ^-/- Pros1 ^-/- 마우스에서 72h 후 대표적인 부상입지 않은 및 부상입은 다리들의 무릎 관절내 공간에 대한 현미경 평가 (불용성 피브린에 대한 메이슨의 트라이크롬 염색 및 면역염색). C, 특이적 siRNA를 사용한 생체내 mPS 침묵: mPS siRNA 또는 대조 siRNA의 단일 ip 주입으로 처리된 F8 ^-/- Pros1 ^+/- 및 F8 ^-/- Pros1 ^+/+ 마우스에서 손상 72h 후의 관절 직경 평가. D, mPS siRNA 또는 대조 siRNA로 사전에 처리된 F8 ^-/- Pros1 ^+/+ 마우스에서 72h 후 대표적인 부상입은 다리의 무릎 관절내 공간의 현미경 평가 (Masson의 트라이크롬 염색법). 측정값들은 평균±s.e.m으로 제시된다. *, P<0.05; **, P<0.005; ***, P<0.0005; ****, P<0.0001.
도 5는 PS 및 TFPI 모두가 쥐과 활액에서 발현됨을 보여준다. A, 대조-siRNA 또는 mPS-siRNA로 사전에 처리된 F8 ^-/- Pros1 ^+/+ 마우스로부터의 부상 무릎의 무릎 관절내 공간에서 PS 및 TFPI에 대한 면역염색법. 화살표 머리는 활액 조직을, 화살은 혈관 구조를 가리키며, 이들 모두 PS 및 TFPI 모두에 대하여 양성이다. 상부 도면내 상자들 (스케일바: 200 μm)은 하부 패널에서 확대된 영역을 보여준다 (스케일바: 50 μm). B, F8 ^-/- Pros1 ^+/+ 및 F8 ^-/- Pros1 ^-/- 마우스의 부상없는 무릎의 무릎 관절내 공간에서 TFPI에 대한 면역염색법. C-E, 항-PS (c) 및 항-TFPI (d) 항체를 사용하여 일차 쥐과 섬유모세포-유사 활액 세포 (FLS) 배양물로부터의 조건화 배지의 웨스턴 블롯 분석. 무-혈소판 혈장 (PFP), 혈소판의 단백질 용해물 (PLT), 쥐과 PS (mPS)는 양성 대조(c)로 사용되었다. 탈당화된 TFPI 및 완전 당화된 TFPI의 분자량을 비교하여 결정된 TFPI 아이소형 발현. 쥐과 태반을 TFPIα에 대한 양성 대조로 사용하였다. E-F, 항-PS (f) 및 항-TFPI (e) 항체를 사용하여 트롬빈 (Thr, +) 또는 비히클 (-)의 존재하에 24시간 배양 후 FLS로부터 단리된 총 단백질 용해물의 웨스턴 블롯 분석. 인간 재조합 전장 TFPI를 TFPIα에 대한 양성 대조로 사용하였다 (hrTFPI). 블롯들은 3회 독립 실험들을 대표한다.
도 6은 인간 활액에서 PS 및 TFPI를 나타낸다. A, PS 및 TFPI는 HA (대증요법 및 예방요법), 대증요법 HB 또는 골관절염 (OA) 환자의 활액 조직에서 발현된다. 화살표머리는 활액 내막층을 및 화살은 내막하층의 혈관 구조를 가리키며, 이들 모두 PS 및 TFPI 모두에 대해 양성이다. 스케일바: 50 μm. B, 항-TFPI 항체를 사용한 탈당화 전후의 건강한 개체 및 OA 환자로부터의 일차 인간 FLS (hFLS) 배양물의 조건화 배지의 웨스턴 블롯 분석. 인간 혈소판 용해물 (hPLT)을 TFPIα에 대한 양성 대조로 사용하였다. 블롯들은 3회 독립 실험들을 대표한다.
도 7은 혈우병 A에서 트롬빈 생성 및 피브린 망을 보여주며, TF-(1 pM)는 TFPI-의존적 PS 활성을 나타내는 F8 ^-/- Pros1 ^+/+ 및 F8 ^-/- Pros1 ^-/- 마우스로부터의 PRP에서 트롬빈 생성을 유도하였다. B, F8 ^-/- Pros1 ^+/+ 및 F8 ^-/- Pros1 ^-/- 마우스로부터의 PRP 및 PFP에서 APC-의존적 PS 활성. C, F8 ^+/+ Pros1 ^+/+ , F8 ^-/- Pros1 ^+/+ 및 F8 ^-/- Pros1 ^-/- 로부터의, 그리고 F9 ^+/+ Pros1 ^+/+ , F9 ^-/- Pros1 ^+/+ 및 F9 ^-/- Pros1 ^-/- 피브린 구조로부터의 대표적인 주사 전자 현미경 이미지. D-G, 트롬빈 생성은 중증 HA 환자 (FVIII <1 %)의 PFP (D-E) 및 PRP (F-G)에서 높은 역가의 억제제 없이 (D, F) 그리고 억제제와 함께 (E, G) 낮은 TF 농도 (1 pM)에 의해 유발되었다. 측정값들은 평균±s.e.m으로 제시된다. **, P<0.005; ***, P<0.0005.
도 8은 유전자형 분석 접근법을 보여준다. F8 ^-/- Pros1 ^+/- (a-c) 및 F9 ^-/- Pros1 ^+/- (d-f) 마우스를 교배하여 얻은 유전자형. a, Pros1 대립유전자는 다중 PCR에 의해 증폭되었다. 이어서 PCR 생성물들을 전기영동하였으며; Saller, 2009에 따르면, wt 밴드는 널 (null) 밴드 (571 bp)에 비해 더 낮은 분자량 (234 bp)을 가졌다. b, 게놈 DNA로부터 F8 대립유전자의 wt 밴드 (620 bp) 및 널 밴드 (420 bp)를 증폭시키기 위한 다중 PCR의 셋업. c, (a)에서와 동일한 샘플에 대한 F8 대립유전자 증폭 (널 밴드: 420 bp)의 PCR 생성물. d, Pros1 대립유전자들은 다중 PCR에 의해 증폭되었다. 이어서 PCR 생성물들을 전기영동하였으며; Saller, 2009에 따르면, wt 밴드는 널 (null) 밴드 (571 bp)에 비해 더 낮은 분자량 (234 bp)을 가졌다. e, 게놈 DNA로부터 F9 대립유전자의 wt 밴드 (320 bp) 및 널 밴드 (550 bp)를 증폭시키기 위한 다중 PCR의 셋업. f, (d)에서와 동일한 샘플에 대한 F9 대립유전자 증폭 (널 밴드: 550 bp)의 PCR 생성물.
도 9는 생리학적 상태에서의 조직학을 보여준다. F8 ^-/- Pros1 ^-/- 및 F8 ^-/- Pros1 ^+/+ 마우스에서 그리고 F9 ^-/- Pros1 ^+/+ 및 F9 ^-/- Pros1 ^-/- 에서 간, 폐, 신장, 뇌 구역들에 대한 불용성 피브린에 대한 면역염색법. 스케일바: 100 μm.
도 10은 Pros1의 유전자 손실이 혈우병 B 마우스에서 혈종을 예방함을 보여준다. A, F9 ^-/- Pros1 ^+/+ , F9 ^-/- Pros1 ^+/- , F9 ^-/- Pros1 ^-/- 및 F9 ^+/+ Pros1 ^+/+ 마우스에서 부상 72h 후 및 부상 전 무릎 직경간의 차이. B, F9 ^+/+ Pros1 ^+/+ , F9 ^-/- Pros1 ^+/+ 및 F9 ^-/- Pros1 ^-/- 마우스에서 72h 후 대표적인 부상없는 및 부상입은 다리들의 무릎 관절내 공간에 대한 현미경 평가 (불용성 피브린, mAb 클론 102-10에 대한 메이슨의 트라이크롬 염색 및 염색법). 스케일바: 500 μm. 측정값들은 평균±s.e.m으로 제시된다. ***, P<0.0005.
도 11은 피브린 망 밀도 및 섬유 분지형성의 정량을 보여준다. a-b, F8 ^+/+ Pros1 ^+/+ , F8 ^-/- Pros1 ^+/+ 및 F8 ^-/- Pros1 ^-/- 마우스의 피브린 망. c-d, F9 ^+/+ Pros1 ^+/+ , F9 ^-/- Pros1 ^+/+ 및 F9 ^-/- Pros1 ^-/- 의 피브린 망. 피브린 망 밀도의 정량 (a 및 c). 섬유 분지형성의 정량 (b 및 d). 측정값들은 평균±s.e.m으로 제시된다. ***, P<0.0005.

실시예

실시예 1: X-ase 활성의 소실은 Pros1 ^-/- 마우스를 구제한다

F8 ^-/- 수컷과 교배한 Pros1 ^+/- 암컷은 25% F8 ^+/- Pros1 ^+/- 자손을 생산하였다. F8 ^-/- 수컷과 함께 번식한 F8 ^+/- Pros1 ^+/- 암컷은 25% F8 ^-/- Pros1 ^+/- 자손을 가져왔다 (도 8A-C). F9 ^-/- Pros1 ^+/- 마우스에서도 유사한 관찰이 이루어졌다 (도 8D-F). 예상한 바와 같이, F8 ^-/- Pros1 ^-/- 및 F9 ^-/- Pros1 ^-/- 마우스는 각각 FVIII 및 FIX 혈장 활성을 나타내지 않았으며, PS는 F8 ^-/- Pros1 ^-/- 및 F9 ^-/- Pros1 ^-/- 마우스 혈장에서 검출되지 않았다 (도 1C-D). 보고된 바와 같이, F8 ^-/- Pros1 ^+/- 및 F9 ^-/- Pros1 ^+/- 에서의 PS 수준은 F8 ^-/- Pros1 ^+/+ 및 F9 ^-/- Pros1 ^+/+ 마우스에서보다 ~ 50-60 % 낮았다 (그림 1C-D).

F8 ^-/- Pros1 ^+/- 번식 쌍으로부터의 295마리 새끼들 중, 72마리 (24%)는 F8 ^-/- Pros1 ^+/+ 이었고, 164마리 (56%)는 F8 ^-/- Pros1 ^+/- 이었으며 59마리 (20%)는 F8 ^-/- Pros1 ^-/- 이었다 (χ²=4.8, P=0.09). 그러므로, F8 ^-/- Pros1 ^-/- 마우스들은 예상된 멘델 비율로 존재하였다. 대조적으로, F9 ^-/- Pros1 ^+/- 번식 쌍으로부터의 219마리 새끼들 중, 56마리 (26%)는 F9 ^-/- Pros1 ^+/+ 이었고, 132마리 (60%)는 F9 ^-/- Pros1 ^+/- 이었으며 31마리 (14%)는 F9 ^-/- Pros1 ^-/- 이었다 (χ²=14.95, P=0.001). 이는 F9 ^-/- Pros1 ^-/- 마우스에 대한 전달 비율 변형 (transmission ratio distortion)과 양립가능하며 F9 ^+/+ Pros1 ^+/+ 마우스로부터의 교배와 비교시 감소된 한배새끼 크기와 합치한다 (5.2±0.7 대 9.8±1.8, n=4 교배/3^t 세대에 걸침, P=0.046).

F8 ^-/- Pros1 ^-/- 및 F9 ^-/- Pros1 ^-/- 마우스는 완전히 정상인 것으로 나타났다. 이들의 생존력은 각각 최대 20 (n=4) 및 16 개월 (n=2)로 모니터되었으며, F8 ^-/- Pros1 ^+/+ 및 F9 ^-/- Pros1 ^+/+ 마우스 각각과 비교하여 차이를 나타내지 않았다.

마우스에서 완전한 Pros1 결핍은 소모성 응고병증¹⁵으로 이어지므로, 우리는 F8 ^-/- Pros1 ^-/- 및 F9 ^-/- Pros1 ^-/- 마우스가 DIC를 발병하였는지 여부를 평가하였다. DIC 변수들은 F8 ^-/- Pros1 ^+/+ , F8 ^-/- Pros1 ^+/- 및 F8 ^-/- Pros1 ^-/- 마우스에서 (도 1C), 그리고 F9 ^-/- Pros1 ^+/+ , F9 ^-/- Pros1 ^+/- 및 F9 ^-/- Pros1 ^-/- 마우스에서 (도 1D) 비등하였다. 활성화된 부분 트롬보플라스틴 시간은 FVIII의 부재로 인해 F8 ^-/- Pros1 ^+/+ (69±2 초), F8 ^-/- Pros1 ^+/- (68±3 초) 및 F8 ^-/- Pros1 ^-/- (63±3 초) 마우스에서 동일하게 연장되었다 (평균±s.e.m., 그룹 당 n=6, P=0.3). F9 ^-/- Pros1 ^+/+ , F9 ^-/- Pros1 ^+/- 및 F9 ^-/- Pros1 ^-/- 마우스를 이용하여 비등한 데이터를 수득하였다. 더욱이, F8 ^-/- Pros1 ^-/- 및 F9 ^-/- Pros1 ^-/- 마우스의 뇌, 폐, 간 및 신장에서 혈전증 또는 피브린 침착이 발견되지 않았다 (도 9).

따라서, X-ase 활성의 손실은 완전한 Pros1 결핍의 배아 치사를 구제한다. 그러나 구제는 FIX 활성 손실로 인해 부분적이었다. 가능한 설명은 중증 HB가 중증 HA에 비해 덜 심각한 병태인 것으로 보인다는 것이다. 결과적으로, Pros1 ^-/- 마우스에서 F9 붕괴는 F8 붕괴보다 응고 재조정면에서 덜 효율적이었다.

FVIII 주입에 의한 고유의 X-ase 활성을 회복시키는 것이 F8 ^-/- Pros1 ^-/- 마우스에서 DIC, 혈전증 및 전격자색반병을 유도하는지 여부를 조사하기 위하여, 재조합 FVIII (rFVIII)을 정맥내 투여하였다. rFVIII 주사 후 마우스가 사망하지 않았다. 과량의 rFVIII의 단회 주사 24h 후 F8 ^-/- Pros1 ^-/- 마우스에서 수많은 혈관내 혈전 및 폐에서의 출혈이 발견되었다 (도 1E-F). 정상 용량의 rFVIII 반복 투여 후 24시간에, 응고 분석은 응고불가능한 프로트롬빈 시간 (PT) (도시되지 않음), 낮은 피브리노겐 및 높은 트롬빈-안티 트롬빈 (TAT) 수준을 나타내었고, 이는 명백한 DIC와 합치한다 (도 1G). 대조적으로, F8 ^-/- Pros1 ^-/- 마우스에서 정상 용량의 rFVIII의 단회 주사 후, 피브리노겐 및 TAT 수준은 비처리 F8 ^-/- Pros1 ^-/- 마우스과 비등하였다 (도 1G). 폐와 간에서 수많은 혈전이 보였지만 (도 1H-I), 이들 마우스 중 어느 것도 전격자색반병이 발병하지 않았다.

실시예 2: X-ase 활성의 손실은 Pros1 ^-/- 마우스에서 TF-유도된 혈전색전증에 의한 치사를 예방하지 못한다

우리는 이전에, Pros1 ^+/+ 마우스의 88%가 TF-유도된 혈전색전증 모델에 대해 생존하였지만, 낮은 TF 용량 주사 (~ 1.1 nM) 20분 후에 Pros1 ^+/- 마우스의 25%만이 여전히 살아있었음을 입증하였다. 더 높은 TF 용량 (~ 4.3 nM)을 사용하는 경우, Pros1 ^+/+ 및 Pros1 ^+/- 마우스 모두 20분 이내에 사망하였다. 그러나 Pros1 ^+/- 는 Pros1 ^+/+ 보다 일찍 사망했다. HA 및 WT 마우스는 이러한 높은 TF-용량에 동일하게 민감하였으며, 이들 중 85% 이상이 15분 이내에 사망하였다 (도 2A). 대조적으로, 저 분자량 헤파린 (LMWH)을 갖는 혈전예방전략하에서 >75% WT 마우스가 생존하였다 (도 2A). 따라서, LMWH와 달리, HA는 TF-유도된 혈전색전증으로부터 마우스를 보호하지 못한다. 이어서 동일한 모델에서 F8 ^-/- Pros1 ^+/+ , F8 ^-/- Pros1 ^+/- 및 F8 ^-/- Pros1 ^-/- 마우스를 조사하였다. TF (~2.1 nM)의 주입 후, 마우스의 40-60%가 그들의 Pros1 유전자형과 무관하게 사망 하였다 (P> 0.05) (도 2B). 그러나, F8 ^-/- Pros1 ^-/- 및 F8 ^-/- Pros1 ^+/- 가 F8 ^-/- Pros1 ^+/+ 마우스보다 일찍 사망하였고, 그리고 F8 ^-/- Pros1 ^+/- 가 F8 ^-/- Pros1 ^+/+ 마우스보다 일찍 사망하는 경향이 존재하였다 (평균 사망 시간: F8 ^-/- Pros1 ^+/+ 는 12±4 분, F8 ^-/- Pros1 ^+/- 는 7±2 분, F8 ^-/- Pros1 ^-/- 마우스는 8±3 분, n=4-6/그룹, P=0.43). F9 ^-/- Pros1 ^+/+ , F9 ^-/- Pros1 ^+/- 및 F9 ^-/- Pros1 ^-/- 마우스에 대해 유사한 데이터를 수득하였다 (데이터 제시되지 않음).

TF-유도 혈전색전증 시험감염동안 사망한 F8 ^-/- Pros1 ^+/+ 및 F8 ^-/- Pros1 ^-/- 마우스의 폐 동맥에서 피브린 응혈이 검출되었다 (도 2C). 중요하게도, F8 ^-/- Pros1 ^+/+ 마우스보다 F8 ^-/- Pros1 ^-/- 의 폐에 더 많은 혈전이 있었다 (각각 n = 48 대 26). 또한, F8 ^-/- Pros1 ^-/- 폐의 대부분의 동맥은 완전히 폐색된 반면, F8 ^-/- Pros1 ^+/+ 폐에서는 부분적으로만 폐색되었다.

TF-유도된 혈전색전증-시험감염 중에 사망한 F8 ^-/- Pros1 ^-/- 마우스 어느 것도 전격자색반병이 발병하지 않았다. F9 ^-/- Pros1 ^+/+ , F9 ^-/- Pros1 ^+/- 및 F9 ^-/- Pros1 ^-/- 마우스에 대해 유사한 데이터를 수득하였다 (제시되지 않음).

실시예 3: FVIII의 손실은 장간막 세동맥에서 혈전증으로부터 Pros1 ^-/- 마우스를 부분적으로 보호한다

이어서 고유 응고 경로에서의 결합에 민감한 모델인 장간막 세동맥에서의 혈전 형성을 기록하였다. F8 ^+/+ Pros1 ^+/+ 마우스에서, 혈전은 20분 안에 폐색 크기로 성장하였고, 모든 손상된 동맥은 폐색되었다 (도 2D). 예상한 바와 같이, F8 ^-/- Pros1 ^+/+ 의 세동맥은 혈전증을 보이지 않았던 반면, F8 ^-/- Pros1 ^-/- 마우스는 부분 혈전을 보였다 (도 2D).

F8 ^+/+ Pros1 ^+/+ 마우스에서는 혈전 형성 동안 색전이 생성되었지만 F8 ^-/- Pros1 ^+/+ 마우스에서는 생성되지 않았다. F8 ^-/- Pros1 ^-/- 마우스에서, 부분 혈전 성장 동안 다수의 마이크로-색전이 분리되어 폐색성 혈전 형성을 방지하였다.

실시예 4: HA가 있는 마우스에서 Pros1 표적화는 한정되지만 꼬리 출혈은 없어지지 않는다

출혈 표현형은 경증 또는 중증 출혈 모델을 사용하여 꼬리 절개에 의해 평가되었다.

두 모델 모두에서, F8 ^-/- Pros1 ^+/+ 마우스와 비교하여 F8 ^-/- Pros1 ^-/- 에서 혈액 손실이 감소되었다 (도 3A-B). 경증 모델에 의해 시험감염 되었을 때, F8 ^-/- Pros1 ^+/- 마우스는 F8 ^-/- Pros1 ^+/+ 마우스 보다 출혈이 더 적었다 (도 3A). 대조적으로, 중증 모델에 노출되었을 때, F8 ^-/- Pros1 ^-/- 및 F8 ^-/- Pros1 ^+/- 마우스는 비등한 혈액 손실을 나타내었다 (도 3B). 그러나, F8 ^-/- Pros1 ^-/- 마우스는 두 모델 모두에서F8 ^+/- Pros1 ^+/+ 및 F8 ^+/+ Pros1 ^+/+ 마우스보다 출혈이 더 많았으며 (도 3A-B), 이는 F8 ^-/- 마우스에서 Pros1의 손실이 F8 ^-/- 마우스의 출혈 표현형을 부분적으로만 교정하였음을 나타낸다.

이어서, PS-중화 항체를 사용하여 PS 활성의 억제가 F8 ^-/- Pros1 ^+/- 마우스에서 꼬리 출혈을 어떻게 변화시키는 지 조사하였다. 이 항체는 F8 ^-/- Pros1 ^+/- 마우스 (도 3C)에서의 혈액 손실을 Pros1의 완전한 유전자 손실 (도 3B)과 동일한 정도로 제한하였다.

실시예 5: Pros1 표적화 또는 PS 억제는 HA 또는 HB 마우스를 급성 출혈관절증 (AH)으로부터 완전히 보호한다

출혈은 혈우병 환자의 어디에서나 나타날 수 있지만 대부분의 출혈은 관절에서 발생한다.. Pros1 손실이 혈우병 마우스에서 출혈관절증을 예방하는지 여부를 결정하기 위해, F8 ^-/- Pros1 ^+/+ , F8 ^-/- Pros1 ^+/- , F8 ^-/- Pros1 ^-/- 및 F8 ^+/+ Pros1 ^+/+ 마우스에 AH 모델을 적용하였다. F8 ^-/- Pros1 ^+/+ 및 F8 ^-/- Pros1 ^+/- 마우스와 비교하여 F8 ^-/- Pros1 ^-/- 및 F8 ^+/+ Pros1 ^+/+ 마우스에서 손상 후 무릎 부종이 감소되었다 (도 4A). F8 ^-/- Pros1 ^-/- 및 F8 ^+/+ Pros1 ^+/+ 마우스 간에 무릎 부종의 차이는 없었다 (도 4A). F8 ^-/- Pros1 ^+/+ 의 관절 공간과 활액에서 출혈이 관찰되었으나 (IBS=2, n=5) F8 ^-/- Pros1 ^-/- (IBS=0, n=5) 및 F8 ^+/+ Pros1 ^+/+ 마우스에서는 관찰되지 않았다 (IBS=0, n=5) (도 4B). F8 ^-/- Pros1 ^-/- 및 F8 ^+/+ Pros1 ^+/+ 마우스보다 F8 ^-/- Pros1 ^+/+ 의 관절 공간 및 활액에 피브린이 더 많았다 (도 4B). F9 ^-/- Pros1 ^+/+ 및 F9 ^-/- Pros1 ^-/- 마우스에 대해 유사한 데이터를 수득하였다 (각각 IBS=0, n=3 및 IBS=2, n=3) (도 9A-B).

이러한 결과는 F8 ^-/- Pros1 ^+/- 마우스에서 PS 중화 항체 또는 대조 항체를 4일 동안 연속 피하 주입하여 (AH 유도 1일 전 시작) 확인되었다 (무릎 부종은 PS-중화 항체 그룹에서 0.43±0.07 대 대조 그룹에서 0.69±0.09 mm 였다, n=9, P=0.04). PS 혈장 수준은 PS-중화 항체 그룹에서 26±6% 대 대조에서 45±3% 였다 (n=5, P=0.017). 또한, PS 억제는 대안적으로 F8 ^-/- Pros1 ^+/- 및 F8 ^-/- Pros1 ^+/+ 마우스에서 AH 시험감염 이전에 쥐과 PS (mPS) siRNA를 정맥 주사하여 구현되었다 (도 4C-D). IBS 평가로 대조 siRNA (IBS=2, n=3)로 처리시와 비교할 때 mPS siRNA (IBS= 0.5, n=3)로 처리된 F8 ^-/- Pros1 ^+/+ 마우스에서 관절내 출혈이 없음을 확인하였다, (도 4C). 중요하게도, PS 발현은 혈장 (26±3% 대 대조에서 84±11%, n=3, P=0.006) 및 활액 모두에서 mPS siRNA에 의해 감소되었다 (도 5A).

실시예 6: PS 및 TFPI 모두 마우스의 활액에서 발현된다

혈우병 마우스에서 Pros1 및 PS 억제의 유전적 손실의 현저한 관절내 지혈 효과를 이해하기 위해, 무릎 부분을 PS 및 TFPI에 대해 면역염색하였다. PS는 대조 siRNA로 처리된 AH를 가지는 F8 ^-/- Pros1 ^+/+ 마우스 활액 조직의 내막층에 주로 존재하는 반면, PS에 대한 활액 염색은 mPS siRNA를 받은 AH를 가지는 F8 ^-/- Pros1 ^+/+ 마우스에서 현저하게 감소되었다 (도 5A). 대조적으로, TFPI 염색은 대조 siRNA에 의해 처리시 보다 mPS siRNA를 받은 혈우병 마우스로부터의 활액 조직에서 더욱 두드러졌다 (도 5a). 그러나, TFPI 발현은 F8 ^-/- Pros1 ^+/+ 및 F8 ^-/- Pros1 ^-/- 마우스 모두의 활액 내막층에서 비등하였다 (도 5B).

PS가 섬유모세포-유사 활액 세포 (FLS)에 의해 발현됨을 추가로 입증하기 위해, F8 ^+/+ Pros1 ^+/+ , F8 ^-/- Pros1 ^+/+ 및 F8 ^-/- Pros1 ^-/- FLS로부터 수집된 조건화 배지에서 웨스턴 블롯을 수행하였다. 도 5C에 도시된 바와 같이, F8 ^+/+ Pros1 ^+/+ 및 F8 ^-/- Pros1 ^+/+ FLS의 배지는 ~ 75 kDa의 분자량에서 밴드를 나타냈으며, 이는 PS와 비등하고 혈장 및 혈소판에서 관찰된 것과 유사하다. 예상한 바와 같이, F8 ^+/+ Pros1 ^-/- FLS로부터 얻은 배지에서 염색이 검출되지 않았다 (도 5C).

또한 F8 ^-/- Pros1 ^+/+ 및 F8 ^-/- Pros1 ^-/- FLS 조건화 배지에서 TFPI 발현을 연구하였다 (도 5D). 모든 배지는 ~50 kDa에서 밴드를 나타냈으며, 이는 태반 용해물에서 관찰된 것과 유사하다. 완전히 당화된 TFPIα 및 TFPIβ가 동일한 분자량³⁰에서 이동하기 때문에 TFPI 아이소형 발현은 단백질 탈당화 이후 조사되었다. FLS 배지로부터 탈당화된 TFPI는 태반 TFPI (TFPIα에 대한 양성 대조)와 유사한 TFPIα의 분자량에서 단일 밴드로서 이동하였다 (도 5D). 이는 FLS가 TFPIα를 발현하지만 TFPIβ는 발현하지 않음을 나타낸다. 또한, 트롬빈 자극 후 F8 ^-/- Pros1 ^+/+ FLS에서 PS 및 TFPI 발현이 증가 하였다 (도 5E-F).

실시예 7: PS 및 TFPI 모두 HA 또는 HB 환자의 활액에서 발현된다

이어서 인간 HA, HB 및 골관절염 무릎 활액 조직을 PS 및 TFPI 모두에 대해 분석하였다 (도 6A). 대증요법 HA 환자의 활액 내막층 및 내막하층에서 TFPI 및 PS에 대한 강한 신호가 발견되었다 (n = 7). 대조적으로, PS 및 TFPI 모두에 대해 면역염색은 예방요법 중인 HA 환자에서 감소되었다 (n=5). 대증요법 HB 환자는 대증요법 HA 환자보다 활액 내막층 및 내막하층에서 (n=4) PS 및 TFPI 모두에 대해 더 적은 신호를 나타냈다. 골관절염 환자 (n = 7)로부터 얻은 구역들은 예방요법 중인 혈우병 환자와 유사하게 TFPI 및 PS에 대해 강한 염색을 나타내지 않았다. 어떠한 TFPI 아이소형이 인간 FLS에 의해 발현되는지를 평가하기 위해, 건강한 대상체 및 골관절염 환자로부터 단리된 인간 FLS의 조건화 배지에 대한 웨스턴 블롯을 수행하였다. 쥐과 FLS와 유사하게, 인간 FLS는 TFPIα를 발현하지만 TFPIβ는 발현하지 않는다 (도 6B).

실시예 8: Pros1 의 손실은 HA 마우스에서 TFPI-의존적 PS 활성 없음 및 APC에 대한 내성의 원인이다

Pros1이 없거나 PS가 억제된 HA 또는 HB 마우스에서 AH에 대한 완전한 보호는 적어도 부분적으로 관절에서 APC 및 TFPI에 대한 PS 보조인자 활성이 없음에 의해 설명 될 수 있다. 그러나, 꼬리 출혈 모델에서 시험감염된 HA 마우스에서 Pros1 또는 PS 억제 없음의 부분 지혈 효과에 대한 이유를 추가로 조사할 필요가 있다.

생체외 TF-개시된 트롬빈 생성 테스트는 트롬빈을 생성하는 혈장의 용량과 혈우병의 임상적 중증도 사이의 상관관계를 보여주었다. 따라서, HA 마우스의 혈장에서 트롬빈 생성에 대한 Pros1 손실의 영향을 조사하였다. TFPI-의존적 PS 활성은 무-혈소판 혈장 (PFP)에서가 아닌 혈소판-풍부 혈장 (PRP)에서 평가되었는데, 왜냐하면 PS의 TFPI-보조인자 활성은 트롬빈 생성 테스트를 사용하여 마우스 혈장에서 입증될 수 없기 때문이다. 이는 마우스 혈장에서의 TFPIα 부재 및 마우스 혈소판에서의 이의 존재에 의해 설명된다.

트롬빈 피크 및 내인성 트롬빈 전위 (ETP)는 1 pM TF에 대한 반응으로 F8 ^-/- Pros1 ^+/+ PRP에서보다 F8 ^-/- Pros1 ^-/- 에서 유의하게 더 높았으며 (1072±160 대 590±10 nmol/L.분, n=3/그룹, P=0.04), 이는 F8 ^-/- Pros1 ^-/- PRP에서 PS TFPI-보조인자 활성이 없음을 제시하는 것이다 (도 7A). 이전 연구와 일관되게, 트롬빈 피크 및 ETP는 1, 2.5 또는 5pM TF의 존재하에 F8 ^-/- Pros1 ^+/+ 및 F8 ^-/- Pros1 ^-/- 마우스의 PFP에서 비등하였다 (데이터 제시되지 않음).

F8 ^-/- Pros1 ^-/- 마우스가 결함성의 기능적 APC-의존성 PS 활성을 나타내었는지를 평가하기 위해, APC의 부재하에, 야생형 (WT) 재조합 APC의 존재하에, 또는 돌연변이된 (L38D) 재조합 마우스 APC (L38D APC, 제거된 PS 보조인자 활성을 갖는 변이체)의 존재하에 Ca²⁺ 이오노포어-활성화된 PRP에서의 트롬빈 생성 테스트를 사용하였다. 이 분석에서, APC 적정은 8 nM WT APC의 첨가가 WT 마우스의 활성화된 PRP에서 ETP를 90% 감소시킬 수있는 반면, 동일한 농도의 L38D APC는 ETP를 단지 30% 감소시켰음 (데이터는 제시되지 않음)을 보여주었다. 이들 데이터에 기초하여, 트롬빈 생성 곡선이 활성화된 PRP (3마리 마우스/검정)에 대해 기록되었다. 계산된 APC 비 (ETP _{+ APC WT} / ETP _{+APC L38D} )는 F8 ^-/- Pros1 ^-/- p혈장에서는 APC 내성을 나타내었으나 F8 ^-/- Pros1 ^+/+ 혈장에서는 그러하지 않았다 (각각 0.87±0.13 대 0.23±0.08, P=0.01) (도 7B).

APC-의존적 PS 활성 또한 2 nM WT APC 및 L38D APC의 존재하에 F8 ^-/- Pros1 ^+/+ 및 F8 ^-/- Pros1 ^-/- 마우스 (2마리 마우스/검정)의 PFP에서 테스트되었다. 계산된 APC 비율은 F8 ^-/- Pros1 ^-/- 에서 APC 저항성을 나타내었지만 F8 ^-/- Pros1 ^+/+ 마우스에서는 그렇지 않았다 (각각 1.08±0.04 대 0.25±0.09, P=0.0003) (도 7B).

실시예 9: Pros1 이 없는 HA 마우스에서 개선된 피브린 망

꼬리 출혈 마우스 모델은 혈소판 기능장애 뿐만 아니라 응고 및 피브린용해 변화에도 민감하다. 꼬리 출혈과 관련하여 연구된 유전자형 간의 차이를 이해하기 위해, 주사 전자 현미경 이미지를 사용하여 피브린 구조를 조사했다 (도 7C). F8 ^+/+ Pros1 ^+/+ 및 F8 ^-/- Pros1 ^-/- 혈장으로부터의 응혈들은 F8 ^-/- Pros1 ^+/+ 혈장 응혈들에 비해 보다 밀도있는 고도로 분지형성된 피브린 섬유들의 망을 보여주었다 (도11a-b). 대조적으로, F9 ^+/+ Pros1 ^+/+ 및 F9 ^-/- Pros1 ^-/- 혈장으로부터의 응혈은 F9 ^-/- Pros1 ^+/+ 혈장 응혈보다 밀도있는 망을 보여주지 않았으나, 섬유 분지형성 증가 경향을 보여주었다 (도 11c-d).

F8 ^-/- Pros1 ^-/- 및 F8 ^-/- Pros1 ^+/+ 마우스, 및 F9 ^-/- Pros1 ^-/- 및 F9 ^-/- Pros1 ^+/+ 마우스로부터의 피브린 섬유는, F8 ^+/+ Pros1 ^+/+ 마우스 또는 F9 ^+/+ Pros1 ^+/+ 마우스 각각으로부터의 섬유들에 비해 더 큰 직경을 나타내었다. 그럼에도 불구하고, F8 ^-/- Pros1 ^-/- 및 F9 ^-/- Pros1 ^-/- 마우스의 섬유 표면은 F8 ^-/- Pros1 ^+/+ 또는 F9 ^-/- Pros1 ^+/+ 마우스 각각에 비해 더 작은 다공성을 보였으며, 이는 F8 ^-/- Pros1 ^-/- 및 F9 ^-/- Pros1 ^-/- -유래 섬유들이 F8 ^-/- Pros1 ^+/+ 또는 F9 ^-/- Pros1 ^+/+ -유래 섬유들보다 투과성이 더 작아서 피브린분해에 보다 내성일 수 있음을 제시하는 것이다³⁸. 이들 데이터는, TFPI 및 APC 보조인자 활성 결과들 (도 7A-B) 모두를 보완하여, F8 ^-/- Pros1 ^-/- 에서의 꼬리 출혈이 F8 ^-/- Pros1 ^+/+ 마우스에 비해 개선되었으나 F8 ^+/+ Pros1 ^+/+ 마우스에서와 같이 완전히 교정되지 않은 이유를 설명함에 도움을 준다.

실시예 10: 혈장에서의 PS 억제는 HA 환자에서 트롬빈 생성을 회복시킨다

이어서 인간 HA 혈장에서 트롬빈 생성에 대한 PS 억제의 효과를 조사했다. PFP의 ETP는 PS-중화 항체의 존재하에서 2-4배 증가하였다. FVIII 억제제의 존재하에서조차 C-말단 도메인에 대한 항-인간 TFPI 항체를 사용하여 효율적인 FXa 억제에 대한 유사한 결과를 얻었다 (도 7D-E). PS 억제는 PRP 샘플에서 ETP가 10배 이상 증가한 경우 현저한 영향을 미쳤다 (1912±37 및 1872±64 nM*분) (각각 도 7F 및 G). 따라서, PS 억제는 혈우병 혈장에서 ETP를 완전히 회복시켰다 (비교를 위해, 정상 혈장에서 ETP:1495±2nM*분). 항-TFPI 항체를 사용하여 유사한 결과를 얻었다 (도 7D-G). 이러한 데이터는, 마우스에서 관찰되었던 PS 억제에 의해 유도된 HA PFP 및 PRP에서의 트롬빈 생성 개선을 인간에서 확인시켜 주었다.

실시예 11: 재료와 방법

마우스

C57BL/6J 바탕의 F8 ^-/- 마우스 (B6;129S4-F8 ^tm1Kaz /J) 및 F9 ^-/- 마우스 (B6.129P2-F9 ^tm1Dws /J) 를 The Jackson Laboratory로부터 얻었다. Pros1 ^+/- 마우스는 최초 콜로니의 자손이었다¹⁵. 스위스 연방 수의사 협회가 실험을 승인하였다. 마우스들을 문헌에 설명된 바와 같이 유전자형화하였다^15-17.

TF-유도된 폐색 전증

정맥 혈전색전증 모델은 Weiss 등의 문헌¹⁸으로부터 약간 변형되어 조정되었다¹⁵. 6-9주령의 마취된 마우스는, 4.25 nM (1:2 희석) 또는 2.1 nM (1:4 희석)의 인간 재조합 TF (hrTF, Dade Innovin, Siemens)를 정맥내 (2 μL/g) 투여받았다. 호흡 정지가 시작되고 2분 후 또는 20분 관찰 기간이 종료시 폐를 수확하여 4% PFA에서 고정시켰다. 폐 구역을 헤마톡실린 및 에오신으로 그리고 피브린에 대해 염색하였다. 폐에서 피브린 응혈 정도는 10개의 무작위로 선택된 비 중첩 영역에서 혈관내 혈전(thrombi)의 수로 평가되었다 (×10 배율).

HA 마우스의 꼬리 클리핑 모델

출혈 표현형을 평가하기 위한 2개의 상이한 꼬리 클리핑 모델을 설명된 바와 같이 평가하였다¹⁴. 간단히 말하면, 8-10주령 마우스의 원위 꼬리는 2 mm (경증 손상)에서 절개되었고, 출혈은 정맥 또는 4 mm (중증 손상)였으며, 출혈은 동맥 및 정맥이었다¹⁹. 출혈은 각각 30분 또는 10분 후 손실된 혈액으로 정량화되었다. 중증 손상 모델에서, 일부 F8 ^-/- Pros1 ^+/- 마우스는 꼬리 절개 2분 전에 2.1 mg/kg의 용량의 토끼 항-인간 PS-IgG (Dako) 또는 토끼 아이소형 IgG (R&D Systems)를 정맥내 투여받았다.

급성 출혈관절증 모델

Øvlisen 등²⁰의 문헌에 따라, 마취된 9-12주령 마우스에서 관절 출혈의 유도, 무릎 직경 측정 및 진통 커버리지를 수행하였다. 관절 직경은 0 및 72h에 디지털 캘리퍼 (Mitutoyo 547-301, Kanagawa)로 측정하였다. 72h에, 마우스를 희생시키고 무릎을 단리하고, 4% PFA에서 고정시키고, 석회제거하여 파라핀에 침지시켰다. 관절내 출혈 점수 (IBS)를 문헌에 기재된 바와 같이 평가하였다²¹.

생체내 PS 억제

10주령 마우스에게 피하 삼투압 미니 펌프 (model2001, Alzet)를 통해 토끼 항-인간 PS-IgG (Dako Basel, Switzerland) 또는 토끼 아이소형 IgG (R&D Systems)를 1mg/kg/일로 연속 주입하였다.

대안적으로, 10주령 마우스를 제조업체의 지침에 따라 형질감염 물질 (Invivofectamine 3.0, Invitrogen, Life Technologies)를 사용하여 1 mg/kg 단회 용량의 마우스 특이적 siRNA (s72206, Life Technologies) 또는 대조 siRNA (4459405, 생체내 음성 대조 #1 Ambion, Life Technologies)로 처리하였다. PS 억제 후 2.5일에 급성 출혈관절증 모델을 적용하였다.

통계 방법

값은 평균 ± sem으로 표현되었다. 비-연관 유전자 좌위에 대한 카이-제곱을 사용하여 멘델 대립유전자 분리를 평가하였다. TF-유도된 정맥 혈전색전증 모델에서의 생존 데이터를 카플란-마이어법을 사용하여 플롯하였다. 로그-랭크 테스트를 이용하여 곡선을 통계적으로 비교하였다 (Prism 6.0d; GraphPad). 다른 데이터는 GraphPad Prism 6.0d를 사용한 t-검정, 일원 및 이원 ANOVA 테스트에 의해 분석되었다. 0.05 미만의 P-값은 통계학적으로 유의한 것으로 간주되었다.

쥐과 혈장의 준비

6-9주령 마우스를 펜토바르비탈 (40 mg/kg)로 마취시키고, 전혈을 하대정맥으로부터 into 3.13% 시트레이트로 채혈하였다 (1 vol 항응고제/9 vol 혈액). 혈소판 풍부 혈장 (PRP)을 얻기 위해 26°C로 예열된 원심분리기로 혈액을 1031 g에서 10분 동안 원심분리하였다. 대안적으로 혈액을 실온 (RT)에서 2400g에서 10분 동안 원심분리하여 혈소판 부족 혈장 (PPP)을 수득하였다. 무-혈소판 혈장 (PFP)을 얻기 위해, 10분 동안 10000g에서 추가 원심분리를 수행하였다.

혈소판 수 및 응고 변수 측정

혈소판 수는 자동 세포 계수기 (Procyte Dx Hematology Analyzer, IDEXX)로 수행하였다. 피브리노겐, FVIII 및 FIX 활성은 자동화된 Sysmex CA-7000 응고 분석기 (Sysmex Digitana)에서 측정되었다. 프로트롬빈 시간 (PT) 및 활성화된 부분 트롬보플라스틴 시간 (APTT)을 응고측정기 (MC4plus, Merlin Medical)에서 측정하였다.

ELISA에 의한 쥐과 PS 항원 및 TAT 복합체의 측정

96-웰 플레이트 (Maxisorb, Thermo)의 웰들을 웰 당 50 μL의 10 μg/mL의 토끼 폴리클로날 항-인간 PS (DAKO Cytomation)로 코팅하고 4°C에서 밤새 배양하였다. TBS 완충액 (0.05 M 트리스(하이드록시메틸)아미노메테인, 0.15 M NaCl, pH 7.5, 0.05% Tween 20)으로 3회 세척 후, 플레이트를 TBS-BSA 2%로 차단시켰다. 희석된 혈장 샘플들 (희석 범위: 1:300-1:600)을 웰에 첨가하고 RT에서 2h 동안 배양하였다. 3회 세척 후, 50 μL의 1μg/mL 비오티닐화 닭 다클론 항-쥐과 단백질 S를 첨가하고 실온에서 2시간 동안 배양하였다. 스트렙타비딘-HRP 접합된 홀스래디쉬 퍼옥시다제 (Thermo)를 첨가하여 신호를 증폭시키고, 플레이트를 1시간 동안 배양하였다. 플레이트를 3회 세척하고 100 μLTMB 기질 (KPL)을 첨가하였다. 100 μL HCl (1M)을 첨가하여 반응을 중지시켰다. 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 14마리의 건강한 마우스 (수컷 8마리 및 암컷 6마리, 7-12주령)로부터 얻은 풀링된 정상 혈장의 연속 희석액을 사용하여 표준 곡선을 설정하였다. 풀링된 정상 혈장에 대한 결과를 백분율로 표시하였다.

제조업체의 지침에 따라 시판 ELISA (Enzygnost TAT micro, Siemens)를 사용하여 각 혈장 샘플에 대해 TAT 수준을 2회 측정하였다.

마우스 조직 가공 및 절편화, 면역화학 및 현미경

전처리 하지 않은 조직 절편 (4 μm)을 헤마톡실린/에오신 또는 메이슨 트라이크롬으로 염색하거나 불용성 피브린, PS 또는 TFPI에 대해 면역염색하였다. 다음 항체들이 사용되었다: 피브린 (mAb 클론 102-10)¹ 최종 농도 15.6 μg/mL, 30분 동안 RT에서 배양, 이차 항체 토끼 항-인간, (ab7155 Abcam, Cambridge, UK) 1:200 희석, 30분 동안 RT에서 배양; PS (MAB 4976, R&D, 희석 1:50) 30분 동안 RT에서 배양, 이차 항체 토끼 항-랫트, (ab7155 Abcam)-1:200 희석, 30분 동안 RT에서 배양; TFPI (PAHTFPI-S, Hematological Technologies) 최종 농도 18.6 μg/mL, 30분 동안 RT에서 배양, 이차 항체 토끼 항-양 IgG (ab7106, Abcam) 1:200 희석, 30분 동안 RT에서 배양. 모든 염색은 제조업체의 지시에 따라 면역염색제 BOND RX (Leica Biosystems, Muttenz, Switzerland)로 수행하였다. 20x (NA 0.8), 40x (NA 0.95) 공기 대물렌즈가 있는 3D HISTECH Panoramic 250 Flash II를 사용하여 전체 슬라이드들을 스캔하였다. 이미지 처리는 파노라마 뷰어 소프트웨어를 사용하여 수행되었다.

F8이 완전히 손실된 마우스에 FVIII의 생체내 투여

6-9 주령 마우스를 케타민 (80mg/kg) 및 자일라진 (16mg/kg)으로 마취시켰다. 1h에 100% FVIII 수준에 도달할때까지 0.3 U/kg의 재조합 FVIII (Advate®Baxalta)를 (정상 용량) 또는 1h에 >200%에 도달할때까지 과량의 재조합 FVIII (2 U/kg)를 정맥내 투여하였다. 경정맥 카테터 (마우스 JVC 2Fr PU 10 cm, Instech)의 도입 1 시간 전과 1 시간 후, 중앙선 배치 후 4 시간, 8 시간 및 16 시간에 정상 용량 또는 과량을 주사 하였다. 첫 주사 24 시간 후에 마우스를 희생시켰다. 혈액을 채취하고 장기를 수확했다. FVIII, 피브리노겐 및 트롬빈-안티트롬빈 복합체 (TAT)를 실시예에 기재된 바와 같이 측정하였다. 폐를 단리하고, 4% 파라포름알데히드 (PFA)에 고정시키고 파라핀에 포매시켰다.

장간막 동맥에서의 FeCl ₃ 손상 혈전증 모델

장간막 동맥의 혈전증 모델은 생체 현미경을 사용하여 참고문헌²에 따르되 약간 수정을 가하여 수행되었다. 케타민 (80 mg/kg) 및 자일라진 (16 mg/kg) 혼합물을 복강내 주사하여 마우스를 마취시켰다. 혈소판은 100 μL 로다민 6G (1.0 mM)를 주사하여 직접 생체내 표지되었다. 연구 분야의 선택 후, 용기 벽 손상은 10% FeCl₃로 포화된 여과지 (1mm 직경의 1M Whatmann 종이 패치)에 의해 1분 동안 국소 처리하여 생성되었다. 혈전 형성은 친화력 보정된 침수형 광학장치(Zeiss, Germany)가 장착된, FITC 필터 세트를 구비한 형광 현미경 (IV-500, Micron instrument, San Diego, CA) 하에서 실시간으로 모니터 되었다. 밝은 형광 표지된 혈소판 및 백혈구는 비디오 촉발된 스트로보스코프 에피-조명 (Chadwick Helmuth, El Monte, CA)을 통해 1355μm X 965μm의 시야를 관찰 할 수 있게 하였다. NA0.3.의 10X 대물렌즈 Zeiss Plan-Neofluar를 사용하였다. 모든 장면은 맞춤형 저-지연 실리콘 강화 타겟 카메라 (Dage MTI, IN, Michigan city), 타임베이스 생성기 및 Hi-8 VCR (EV, C-100, Sony, Japan)을 사용하여 비디오 테이프에 기록되었다. 혈액 세포 흐름의 중단에 의해 결정된, 혈관벽 폐색 시간을 측정하였다.

섬유모세포-유사 활액 세포 (FLS) 분리, 배양 및 유세포 분석

문헌³에 따라 8-10 주령의 마우스로부터 쥐과 FLS를 단리하고 배양하였다. 3계대 후, 세포의 위상차 이미지를 취하고, 세포를 FITC-접합된 랫트 항-마우스 CD11b 항체 (M1/70, Pharmingen, BD Biosciences), PE-접합된 랫트 항-마우스 CD90.2 항체 (30-H12, Pharmingen, BD Biosciences), FITC-접합된 랫트 항-마우스 CD106 항체 (429 MVCAM.A, Pharmingen, BD Biosciences), PE-접합된 햄스터 항-마우스 CD54 항체 (3E2, Pharmingen, BD Biosciences) 및 플루오로크롬-접합된 이이소형 대조군 항체와 함께 4℃ 암실에서 30분 동안 배양하였다. 최종 세척 및 원심분리 단계 후, 모든 배양된 세포를 LSR II 유세포 분석기 (BD Biosciences) 및 FACS Diva 7.0 소프트웨어 (BD Biosciences)에서 분석하였다. 건강한 개인 및 OA 환자로부터의 인간 FLS를 Asterand, Bioscience로부터 구입하여 제조업체의 지침에 따라 배양하였다.

웨스턴 블롯팅

PS 및 TFPI는 환원 조건하에서 소듐 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (12% 구배 SDS-PAGE, Bio-Rad)에 의해 인간 및 마우스 샘플에서 검출되었다. 단백질을 니트로셀룰로스 막 (Bio-Rad)으로 옮긴 후, 쥐과 PS는 2ug/mL 단일 클론 MAB-4976 (R&D 시스템), 쥐과 TFPI의 경우 1μg/mL 다클론 AF2975 (R&D 시스템)를 사용하여 시각화하였다. 재조합 쥐과 PS⁴ (30 ng), 재조합 인간 TFPI 전장 (T. Hamuro, Kaketsuken, Japan 제공), 세척된 혈소판의 용해물, F8 ^-/- Pros1 ^+/+ 마우스의 PFP 및 F8 ^+/+ Pros1 ^+/+ 마우스의 태반 용해물을 PS, TFPIα 대조로 사용하였다. 합류된 쥐과 및 인간 FLS 조건화 배지로부터의 샘플을 무-혈청 배지 (OptiMem)에서 24h-배양 후 수집하고 Amicon 필터 장치 (Millipore, 10 kDa 컷오프)를 사용하여 40배 농축하였다. TFPI 웨스턴 블롯팅을 위해, 샘플들을 겔에 적재하기 전에 37 ℃에서 12시간 동안 5개의 단백질 탈당화효소 (PNGase F, O-글리코시다제, 뉴라미다제, β갈락토시다제, β아세틸글루코사미니다제, 탈당화 키트, V4931, Promega)의 혼합물로 처리하였다. 최종 검출은 홀스래디쉬 퍼옥시다제-접합된 이차 항체 (Dako) 및 Supersignal West Dura 장기 화학발광 기질 (Pierce)를 사용하여 완료하였으며, Fuji LAS 3000IR CCD 카메라를 사용하여 모니터하였다.

인간의 무릎 활액에 대한 면역조직화학

12명의 HA 환자 및 중증 무릎 관절증으로 관절성형술을 시행한 4명의 HB 환자의 활액 조직의 파라핀-포매 표본들을 다른 분헌들^5,6에 기재된 바와 같이 피렌체 대학교 실험 및 임상 의학 학과, 해부학 및 조직학 분야의 기록보관소에서 수집하였다. 7명의 HA 환자를 필요에 따라 치료하고 5명을 이차 예방요법 치료하였다. 모든 4명의 HB 환자를 필요에 따라 치료하였다. 7명의 골관절염 (OA) 환자의 활액 샘플을 대조로 사용하였다^5,6. 면역조직화학 분석을 위해, 활액 조직 절편 (두께 5 μm)을 탈파라핀화하고, 재수화시키고, 항원 회수를 위해 시트르산 나트륨 완충액 (10 mM, pH 6.0)에서 10 분 동안 끓인 후 메탄올에서의 3% H₂O₂로 실온에서 15분 동안 처리하여, 내인성 퍼옥시다제 활성을 차단하였다. 이어서, 졀편들을 PBS에서 세척하고 제조업체의 프로토콜에 따라 실온에서 10 분 동안 Ultra V 블록 (UltraVision 대용량 검출 시스템 항-다가, HRP, 카탈로그 번호 TP-125-HL, LabVision)과 함께 배양하였다. 비특이적 부위 결합을 차단한 후, 슬라이드를 PBS에 희석된 토끼 다클론 항-인간 단백질 S/PROS1 항체 (1:50 희석, 카탈로그 번호 NBP1-87218, Novus Biologicals) 또는 양 다클론 항-인간 조직 인자 경로 억제제 (TFPI) 항체 (1:500 희석, 카탈로그 번호 PAHTFPI-S, Haematologic Technologies)와 함께 4 ℃에서 밤새 배양하였다. PS 면역염색의 경우, 조직 절편들을 제조업체의 프로토콜에 따라 비오티닐화된 이차 항체, 이어서 스트렙타비딘 퍼옥시다제 (UltraVision Large Volume Detection System Anti-Polyvalent, HRP; LabVision)와 함께 배양하였다. TFPI 면역염색의 경우, 조직 절편들을 대신 30분 동안 HRP-접합된 당나귀 항-양 IgG (1:1000 희석; 카탈로그 번호 ab97125; Abcam)와 함께 배양하였다. 면역반응성은 염색체로서 3-아미노-9-에틸카르바졸 (AEC 키트, 카탈로그 번호 TA-125-SA; LabVision)을 사용하여 전개되었다. 활액 절편들을 최종적으로 메이어 헤마톡실린 (Bio-Optica)으로 염색하고, 세척하고, 수성 봉입제에 봉입시키고, Leica DM4000 B 현미경 (Leica Microsystems)으로 관찰하였다. 일차 항체에 노출되지 않거나 아이소형입-매칭 및 농도-매칭 비-면역 IgG (Sigma-Aldrich)와 함께 배양된 절편들은 항체 특이성에 대한 음성 대조로 포함되었다. Leica 소프트웨어 애플리케이션 스위트 LAS V3.8 (Leica Microsystems)가 장착된 Leica DFC310 FX 1.4-메가픽셀 디지털 컬러 카메라로 광학 현미경 이미지들을 캡쳐하였다.

피브린 응혈 초미세구조 조사

~ 5 nM TF (Dade Innovin, Siemens)를 첨가하여 PFP로부터 37℃에서 피브린 응혈을 제조하였다. 이어서 Zubairova 등의 문헌⁷에 따라 주사 전자 현미경을 사용하여 시각화 하기 위해 이들을 2% 글루타르알데히드에 고정시키고, 탈수시키고, 건조시키고, 금 팔라듐으로 스퍼터-코팅하였다. 망 밀도 및 섬유 분지형성의 반 정량 평가를 STEPanizer 소프트웨어 (www.stepanizer.com)를 사용하여 수행하였다.

쥐과 샘플에서 보정된 자동화 혈전 분석

PFP 및 PRP에서의 트롬빈 생성은 보정된 자동화 트롬보그램 (CAT) 방법을 사용하여 결정되었다.

TFPI 의존적 PS 활성을 다음과 같이 PRP (150 G/L)에서 평가하였다. 간략히 말하면, 10 μL 마우스 PRP (150 G/L)를 10 μL PRP 시약 (Diagnostica Stago) 및 30 μL의 완충액 A (25 mm Hepes, 175 mm NaCl, pH 7.4, 5 mg/mL BSA)와 혼합하였다. 트롬빈 생성은 10 μL의 형광원성 기질/CaCl₂ 혼합물을 사용하여 37℃에서 시작되었다. 최종 농도는 다음과 같았다: 16.6% 마우스 혈장, 1 pM hrTF, 4 μM 인지질, 16 mM CaCl₂, 및 0.42 mM 형광원성 기질.

APC 의존성 PS 활성은 Dargaud Y 등⁸에 따라 마우스 PFP 및 PRP의 CAT-기반 APC 내성 테스트에서 평가되었다. PRP (150 G/L)는 37℃에서 5분 동안 40 μM Ca²⁺ 이오노포어 (A23187)를 사용하여 미리 활성화되었다. 최종 농도는 다음과 같았다: 16.6% 마우스 혈장, 22 μM A23187, 1 pM hrTF, 4 μM 인지질, 2nM (PFP의 경우) 또는 8 nM (PRP의 경우) 야생형 재조합 마우스 APC (wt-rmAPC)⁵ 또는 돌연변이된 재조합 마우스 APC (rmAPC L38D), 16 mM CaCl₂, 및 0.42 mM 형광원성 기질. rmAPC L38D의 생성 및 특성화는 참고문헌 ^9,10 에 따라, 그리고 정제는 참고문헌^11,12에 따라 수행되었다.

PFP에 대한 TF 적정을 위해, 다음 시약들이 사용되었다: PPP 시약 및 MP 시약 (Diagnostica Stago).

디스펜서가 장착된 Fluoroscan Ascent®형광계를 사용하여 형광을 측정하였다. 390nm (여기 필터) 및 460nm (방출 필터)의 파장에서 형광 강도가 검출되었다. 전용 소프트웨어 프로그램 Thrombinoscope®버전 3.0.0.29 (Thrombinoscope bv)를 통해 교정기 (Thrombinoscope bv)에 대한 트롬빈 활성을 계산할 수 있었으며 시간에 따라 트롬빈 활성을 표시하였다. 모든 실험들은 37°　C에서 2회 실시되었으며 측정은 통상적으로 60분 지속되었다.

인간 샘플에서 CAT 분석

환자로부터 서면 동의를 얻었다. 정맥혈을 3.2% 시트르산 나트륨 (부피/부피)에서 정맥천자에 의해 채취하고 2000g에서 5분 동안 원심분리하였다. 이어서 혈소판 부족 혈장 (PPP)을 10000g에서 10분 동안 원심분리하여 PFP를 수득하였다. PFP를 분취하고, 급속 냉동하고, 사용하기 전까지 -80 ℃에서 보관하였다. PRP의 경우, 혈액을 180 gx 10 분에서 원심분리하였다. 모든 대상체들은 참여에 대해 사전 동의하였다. 참고문헌¹³ 기재내용을 약간 변형하여 트롬빈 생성을 인간 PFP 및 PRP에서 평가하였다. 간단히 말하면, 68 μL PFP 또는 PRP (150 G/L)를 12 μL의 다클론 토끼 항-인간 PS-IgG 항체 (0.42 mg/mL, Dako) 또는 TFPI에 대한 단클론 항체 (0.66 μm, MW1848, Sanquin) 또는 완충액 A와 함께 37°C에서 15분 동안 배양 하였다. PFP 샘플은 PPP 저 및 PPP 5　pm 시약 (Diagnostica Stago)의 7:1 혼합물 또는 PRP 샘플은 PRP 시약 (Diagnostica stago) 20　μL로 응고가 시작되었다. 20　μL의 CaCl₂ 및 형광원성 기질 (I-1140; Bachem) 첨가 후, Fluoroskan Ascent 판독기 (Thermo Labsystems)에서 트롬빈 생성이 이어졌다.

논의

PS는 트롬빈 생성의 주요 조절인자여서, 우리는 PS를 표적으로 하는 것이 잠재적인 혈우병 치료법을 구성할 수 있다고 생각했다.

마우스에서의 광범위한 연구는 혈우병 마우스에서 출혈 및 심각한 관절 손상에 대한 원인으로서의 PS 및 TFPI에 대한 중추적 역할을 뒷받침하는 개념 증명 데이터를 제공한다. Pros1을 표적화하거나 PS를 억제하는 것은 꼬리 출혈 분석에서 출혈 표현형의 생체내 개선 및 출혈관절증에 대한 완전한 보호에 의해 판단되는 바와 같이 마우스에서 혈우병을 개선하는 능력을 갖는다 (도 3A-C 및 4). 관절은 TF의 매우 약한 발현을 나타내고 활액 세포는 많은 양의 TFPIα 및 PS를 생성하기 때문에 (도 5), 외인성 경로의 활성은 관절내에서 크게 감소하여 혈우병성 관절이 출혈되기 쉽다. 더욱이, 트롬보모듈린 (TM) 및 내피 단백질 C 수용체 (EPCR)는 FLS에 의해 발현되며, 이는 TM-트롬빈 복합체가 EPCR 결합된-PC를 활성화시켜 AH와 관련하여 매우 강력한 항응고제인 APC를 생성함을 시사한다. 중요하게도, TFPIα의 발현은 트롬빈에 의해 상향조절된다 (도 5F). 그러므로 수 일 내지 수 주간 지속될 수 있는 현저한 국소 염증 및 관절 증상들을 통상적으로 유발하는 AH 는 또한 다수의 항응고제들, 즉, APC, TFPIα, 및 이들의 상호 보조인자 PS의 국소 생성 및 분비를 촉진시키며, 이는 혈우병에서 관절 손상의 병태생리학을 설명함에 도움을 줄 수 있다.

혈우병 환자의 임상 샘플을 사용한 관찰결과는 쥐과 연구로부터 얻은 결과와 일관된다. 인간에서, 억제제를 사용한 또는 억제제를 사용하지 않은 HA 환자의 혈장에서 PS를 차단하는 것은 ETP를 정상화시킨다 (도 7D-G). HB 환자는 HA 환자보다 TFPI 및 PS의 관절내 발현이 적으며, HB 환자는 HA 환자보다 출혈이 더 적다는 현재의 지식과 일치한다 (도 6). 더욱이, 예방요법을 받는 HA 환자들은 출혈 상황, 즉, 소위 "대증 요법"에서만 FVIII 농축액을 투여받는 환자보다 적은 TFPI 및 PS 활액 발현을 나타낸다 (도 6A). 마지막으로, 인간 FLS는 마우스에서 관찰된 바와 같이 TFPIα 및 PS를 모두 분비하므로, 쥐과 혈우병 데이터의 인간에 대한 외삽을 강력하게 한다.

이 보고서에서의 중요한 발견에 근거하여 우리는 PS의 표적화가 잠재적으로 혈우병에 유용한 치료법으로 번역될 수 있음을 제안한다. 인간 및 쥐과 관절에서의 PS는 출혈관절증에 대한 새로운 병태생리학적 원인인자이며 특히 관절내 APC 및 TFPIα 모두에 대한 이중 보조인자 활성으로 인해 매력적인 잠재적 치료 표적을 구성한다. PS의 존재하에서, 출혈관절증은 활액에서 TFPIα 발현을 증가시킨다. 마우스에서 PS를 표적으로 하는 것은 출혈관절증으로부터 마우스들을 보호한다. 따라서, 우리는 FLS에 의해 생성되는 TFPIα 및 그의 보조인자 PS 모두가 TM-EPCR-PC 경로와 함께, 출혈관절증에 대한 중요한 병리학적 영향을 미치는 강력한 관절내 항응고제 시스템을 포함함을 제안한다. 우리가 성공적으로 혈우병 생쥐에서 사용했던 쥐과 PS 침묵 RNA (도 4H-I 및 도 5A)는 우리가 혈우병 환자를 위해 개발하게 될 치료적 접근법이다. 현재 인자 대체 요법에 비해 RNA를 침묵시키는 것의 이점은 주사 빈도 및 가능한 피하 투여 경로를 감소시키는 보다 긴 반감기이다.

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gtttcagtgt gccttccctt gaaccttgac acaaagtatg 1320 aattacttta cttggcggag cagtttgcag gggttgtttt atatttaaaa tttcgtttgc 1380 cagaaatcag cagattttca gcagaatttg atttccggac atatgattca gaaggcgtga 1440 tactgtacgc agaatctatc gatcactcag cgtggctcct gattgcactt cgtggtggaa 1500 agattgaagt tcagcttaag aatgaacata catccaaaat cacaactgga ggtgatgtta 1560 ttaataatgg tctatggaat atggtgtctg tggaagaatt agaacatagt attagcatta 1620 aaatagctaa agaagctgtg atggatataa ataaacctgg accccttttt aagccggaaa 1680 atggattgct ggaaaccaaa gtatactttg caggattccc tcggaaagtg gaaagtgaac 1740 tcattaaacc gattaaccct cgtctagatg gatgtatacg aagctggaat ttgatgaagc 1800 aaggagcttc tggaataaag gaaattattc aagaaaaaca aaataagcat tgcctggtta 1860 ctgtggagaa gggctcctac tatcctggtt ctggaattgc tcaatttcac atagattata 1920 ataatgtatc cagtgctgag ggttggcatg taaatgtgac cttgaatatt cgtccatcca 1980 cgggcactgg tgttatgctt gccttggttt ctggtaacaa cacagtgccc tttgctgtgt 2040 ccttggtgga ctccacctct gaaaaatcac aggatattct gttatctgtt gaaaatactg 2100 taatatatcg gatacaggcc ctaagtctat gttccgatca acaatctcat ctggaattta 2160 gagtcaacag aaacaatctg gagttgtcga caccacttaa aatagaaacc atctcccatg 2220 aagaccttca aagacaactt gccgtcttgg acaaagcaat gaaagcaaaa gtggccacat 2280 acctgggtgg ccttccagat gttccattca gtgccacacc agtgaatgcc ttttataatg 2340 gctgcatgga agtgaatatt aatggtgtac agttggatct ggatgaagcc atttctaaac 2400 ataatgatat tagagctcac tcatgtccat cagtttggaa aaagacaaag aattcttaag 2460 gcatcttttc tctgcttata ataccttttc cttgtgtgta attatactta tgtttcaata 2520 acagctgaag ggttttattt acaatgtgca gtctttgatt attttgtggt cctttcctgg 2580 gatttttaaa aggtcctttg tcaaggaaaa aaattctgtt gtgatataaa tcacagtaaa 2640 gaaattctta cttctcttgc tatctaagaa tagtgaaaaa taacaatttt aaatttgaat 2700 ttttttccta caaatgacag tttcaatttt tgtttgtaaa actaaatttt aattttatca 2760 tcatgaacta gtgtctaaat acctatgttt ttttcagaaa gcaaggaagt aaactcaaac 2820 aaaagtgcgt gtaattaaat actattaatc ataggcagat actattttgt ttatgttttt 2880 gtttttttcc tgatgaaggc agaagagatg gtggtctatt aaatatgaat tgaatggagg 2940 gtcctaatgc cttatttcaa aacaattcct cagggggaac agctttggct tcatctttct 3000 cttgtgtggc ttcacattta aaccagtatc tttattgaat tagaaaacaa gtgggacata 3060 ttttcctgag agcagcacag gaatcttctt cttggcagct gcagtctgtc aggatgagat 3120 atcagattag gttggatagg tggggaaatc tgaagtgggt acatttttta aattttgctg 3180 tgtgggtcac acaaggtcta cattacaaaa gacagaattc agggatggaa aggagaatga 3240 acaaatgtgg gagttcatag ttttccttga atccaacttt taattaccag agtaagttgc 3300 caaaatgtga ttgttgaagt acaaaaggaa ctatgaaaac cagaacaaat tttaacaaaa 3360 ggacaaccac agagggatat agtgaatatc gtatcattgt aatcaaagaa gtaaggaggt 3420 aagattgcca cgtgcctgct ggtactgtga tgcatttcaa gtggcagttt tatcacgttt 3480 gaatctacca ttcatagcca gatgtgtatc agatgtttca ctgacagttt ttaacaataa 3540 attcttttca ctgtatttta tatcacttat aataaatcgg tgtataattt taaaatgcat 3600 gtgaatatct ttattatatc aactgtttga ataaaacaaa attacataat agacatttaa 3660 ctcttcaaaa aaaaaaaaaa aa 3682 <210> 3 <211> 417 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 tttggaaacg tcacactgtg gaggaaaagc agcaactagg gagctggtga agaaggatgt 60 ctcagcagtg tttactaggc ctccaacact agagcccatc ccccagctcc gaaaagcttc 120 ctggaaatgt ccttgttatc acttcccctc tcgggctggg cgctgggagc gggcggtctc 180 ctccgccccc ggctgttccg ccgaggctcg ctgggtcgct ggcgccgccg cgcagcacgg 240 ctcagaccga ggcgcacagg ctcgcagctc cgcggcgcct agcgctccgg tccccgccgc 300 gacgcgccac cgtccctgcc ggcgcctccg cgcgcttcga aatgagggtc ctgggtgggc 360 gctgcggggc gctgctggcg tgtctcctcc tagtgcttcc cgtctcagag gcaaact 417 <210> 4 <211> 158 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 ttttgtcaaa gcaacaggct tcacaagtcc tggttaggaa gcgtcgtgca aattctttac 60 ttgaagaaac caaacagggt aatcttgaaa gagaatgcat cgaagaactg tgcaataaag 120 aagaagccag ggaggtcttt gaaaatgacc cggaaacg 158 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 gattattttt atccaaaata cttag 25 <210> 6 <211> 87 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 6 tttgtcttcg ctcttttcaa actgggttat tcactgctgc acgtcagtca actaatgctt 60 atcctgacct aagaagctgt gtcaatg 87 <210> 7 <211> 123 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 7 ccattccaga ccagtgtagt cctctgccat gcaatgaaga tggatatatg agctgcaaag 60 atggaaaagc ttcttttact tgcacttgta aaccaggttg gcaaggagaa aagtgtgaat 120 ttg 123 <210> 8 <211> 132 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 8 acataaatga atgcaaagat ccctcaaata taaatggagg ttgcagtcaa atttgtgata 60 atacacctgg aagttaccac tgttcctgta aaaatggttt tgttatgctt tcaaataaga 120 aagattgtaa ag 132 <210> 9 <211> 126 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 9 atgtggatga atgctctttg aagccaagca tttgtggcac agctgtgtgc aagaacatcc 60 caggagattt tgaatgtgaa tgccccgaag gctacagata taatctcaaa tcaaagtctt 120 gtgaag 126 <210> 10 <211> 122 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 10 atatagatga atgctctgag aacatgtgtg ctcagctttg tgtcaattac cctggaggtt 60 acacttgcta ttgtgatggg aagaaaggat tcaaacttgc ccaagatcag aagagttgtg 120 ag 122 <210> 11 <211> 116 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 11 gttgtttcag tgtgccttcc cttgaacctt gacacaaagt atgaattact ttacttggcg 60 gagcagtttg caggggttgt tttatattta aaatttcgtt tgccagaaat cagcag 116 <210> 12 <211> 190 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 12 attttcagca gaatttgatt tccggacata tgattcagaa ggcgtgatac tgtacgcaga 60 atctatcgat cactcagcgt ggctcctgat tgcacttcgt ggtggaaaga ttgaagttca 120 gcttaagaat gaacatacat ccaaaatcac aactggaggt gatgttatta ataatggtct 180 atggaatatg 190 <210> 13 <211> 68 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 13 gtgtctgtgg aagaattaga acatagtatt agcattaaaa tagctaaaga agctgtgatg 60 gatataaa 68 <210> 14 <211> 169 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 14 taaacccctc gtctagatgg atgtatacga agctggaatt tgatgaagca aggagcttct 60 ggaataaagg aaattattca agaaaaacaa aataagcatt gcctggttac tgtggagaag 120 ggctcctact atcctggttc tggaattgct caatttcaca tagattata 169 <210> 15 <211> 152 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 15 ataatgtatc cagtgctgag ggttggcatg taaatgtgac cttgaatatt cgtccatcca 60 cgggcactgg tgttatgctt gccttggttt ctggtaacaa cacagtgccc tttgctgtgt 120 ccttggtgga ctccacctct gaaaaatcac ag 152 <210> 16 <211> 226 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 16 gatattctgt tatctgttga aaatactgta atatatcgga tacaggccct aagtctatgt 60 tccgatcaac aatctcatct ggaatttaga gtcaacagaa acaatctgga gttgtcgaca 120 ccacttaaaa tagaaaccat ctcccatgaa gaccttcaaa gacaacttgc cgtcttggac 180 aaagcaatga aagcaaaagt ggccacatac ctgggtggcc ttccag 226 <210> 17 <211> 1384 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 17 atgttccatt cagtgccaca ccagtgaatg ccttttataa tggctgcatg gaagtgaata 60 ttaatggtgt acagttggat ctggatgaag ccatttctaa acataatgat attagagctc 120 actcatgtcc atcagtttgg aaaaagacaa agaattctta aggcatcttt tctctgctta 180 taataccttt tccttgtgtg taattatact tatgtttcaa taacagctga agggttttat 240 ttacaatgtg cagtctttga ttattttgtg gtcctttcct gggattttta aaaggtcctt 300 tgtcaaggaa aaaaattctg ttgtgatata aatcacagta aagaaattct tacttctctt 360 gctatctaag aatagtgaaa aataacaatt ttaaatttga atttttttcc tacaaatgac 420 agtttcaatt tttgtttgta aaactaaatt ttaattttat catcatgaac tagtgtctaa 480 atacctatgt ttttttcaga aagcaaggaa gtaaactcaa acaaaagtgc gtgtaattaa 540 atactattaa tcataggcag atactatttt gtttatgttt ttgttttttt cctgatgaag 600 gcagaagaga tggtggtcta ttaaatatga attgaatgga gggtcctaat gccttatttc 660 aaaacaattc ctcaggggga acagctttgg cttcatcttt ctcttgtgtg gcttcacatt 720 taaaccagta tctttattga attagaaaac aagtgggaca tattttcctg agagcagcac 780 aggaatcttc ttcttggcag ctgcagtctg tcaggatgag atatcagatt aggttggata 840 ggtggggaaa tctgaagtgg gtacattttt taaattttgc tgtgtgggtc acacaaggtc 900 tacattacaa aagacagaat tcagggatgg aaaggagaat gaacaaatgt gggagttcat 960 agttttcctt gaatccaact tttaattacc agagtaagtt gccaaaatgt gattgttgaa 1020 gtacaaaagg aactatgaaa accagaacaa attttaacaa aaggacaacc acagagggat 1080 atagtgaata tcgtatcatt gtaatcaaag aagtaaggag gtaagattgc cacgtgcctg 1140 ctggtactgt gatgcatttc aagtggcagt tttatcacgt ttgaatctac cattcatagc 1200 cagatgtgta tcagatgttt cactgacagt ttttaacaat aaattctttt cactgtattt 1260 tatatcactt ataataaatc ggtgtataat tttaaaatgc atgtgaatat ctttattata 1320 tcaactgttt gaataaaaca aaattacata atagacattt aactcttcaa aaaaaaaaaa 1380 aaaa 1384 <210> 18 <211> 96 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 18 tttgtttata ttttagaaat gattttatat acaaccgtgc atgcatttct gtattggtcg 60 gcttatctgg atgcaatttt ttctattcta tatgct 96 <210> 19 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 19 uauuccagaa gcuccuugc 19 <210> 20 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 20 uuugugucaa gguucaagg 19 <210> 21 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 21 auugacacag cuucuuagg 19 <210> 22 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 22 uauaucugua gccuucggg 19 <210> 23 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 23 aaccucacaa cucuucuga 19 <210> 24 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 24 uccaucacag cuucuuuag 19 <210> 25 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 25 auuugcacga cgcuuccua 19 <210> 26 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 26 uugcacaguu cuucgaugc 19 <210> 27 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 27 uauguggcca cuuuugcuu 19 <210> 28 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 28 uuuucaaaga ccucccugg 19 <210> 29 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 29 uuccacagac accauauuc 19 <210> 30 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 30 auauucacuu ccaugcagc 19 <210> 31 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 31 aagcugagca cacauguuc 19 <210> 32 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 32 uugacugcaa ccuccauuu 19 <210> 33 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 33 uucugcugaa aaucugcug 19 <210> 34 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 34 aaucuuucca ccacgaagu 19 <210> 35 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 35 uugguuucca gcaauccau 19 <210> 36 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 36 uagacuuagg gccuguauc 19 <210> 37 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 37 cuuugcagcu cauauaucc 19 <210> 38 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 38 ugcuuucauu gcuuugucc 19 <210> 39 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 39 ucacuuucca cuuuccgag 19 <210> 40 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 40 uuugacugca accuccauu 19 <210> 41 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 41 aucuccuggg auguucuug 19 <210> 42 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 42 aauagcaagu guaaccucc 19 <210> 43 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 43 uaucacgccu ucugaauca 19 <210> 44 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 44 ugcuucauca aauuccagc 19 <210> 45 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 45 uuauuccaga agcuccuug 19 <210> 46 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 46 uguucucaga gcauucauc 19 <210> 47 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 47 uaaccuccag gguaauuga 19 <210> 48 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 48 aauccuuucu ucccaucac 19 <210> 49 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 49 aacucuucug aucuugggc 19 <210> 50 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 50 uucacuuucc acuuuccga 19 <210> 51 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 51 aaaaucuccu gggauguuc 19 <210> 52 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 52 guucucagag cauucaucu 19 <210> 53 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 53 auccuuucuu cccaucaca 19 <210> 54 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 54 aguaucacgc cuucugaau 19 <210> 55 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 55 acaccauauu ccauagacc 19 <210> 56 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 56 uccacagaca ccauauucc 19 <210> 57 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 57 ucuuccacag acaccauau 19 <210> 58 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 58 uaauucuucc acagacacc 19 <210> 59 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 59 guucacuuuc cacuuuccg 19 <210> 60 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 60 aauuccagaa ccaggauag 19 <210> 61 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 61 aagggcacug uguuguuac 19 <210> 62 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 62 cuggcuucuu cuuuauugc 19 <210> 63 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 63 ucccuggcuu cuucuuuau 19 <210> 64 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 64 uuuccaucuu ugcagcuca 19 <210> 65 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 65 agcuuuucca ucuuugcag 19 <210> 66 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 66 uucugcguac aguaucacg 19 <210> 67 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 67 auaacaucac cuccaguug 19 <210> 68 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 68 guauacuuug guuuccagc 19

Claims (11)

1. 혈우병 치료 방법에 사용하기 위한 단백질 S에 대한 siRNA.
2. 청구항 1에 있어서, 상기 siRNA는 17-24개 뉴클레오티드를 포함하는, siRNA.
3. 상기 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 siRNA는 서열 번호 001 또는 서열 번호 002에 역 상보적인 서열로 특징되는, siRNA.
4. 상기 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 siRNA는 서열 번호 003, 서열 번호 004, 서열 번호 005, 서열 번호 006, 서열 번호 007, 서열 번호 008, 서열 번호 009, 서열 번호 010, 서열 번호 011, 서열 번호 012, 서열 번호 013, 서열 번호 014, 서열 번호 015, 서열 번호 016, 서열 번호 017 및 서열 번호 018을 포함하는 그룹에서 선택된 서열에 역 상보적인 서열로 특징되는, siRNA.
5. 상기 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 siRNA는 서열 번호 001의 뉴클레오티드 1-100, 101-200, 201-300, 301-400, 301-400, 401-500, 501-600, 601-700, 701-800, 801-900, 901-1000, 1001-1100, 1101-1200, 1201-1300, 1301-1400, 1501-1600, 1701-1800, 1801-1900, 1901-2000, 2001-2100, 2101-2200, 2201-2300, 2301-2400, 2501-2600, 2701-2800, 2801-2900, 2901-3000, 3001-3100, 3101-3200, 3201-3300, 3301-3400, 3401-3500 또는 3501-3580으로 특징되는 서열에 역 상보적인 서열로 특징되는, siRNA.
6. 상기 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 siRNA는 서열 번호 019 (siRNA_1), 서열 번호 020 (siRNA_2), 서열 번호 021 (siRNA_3), 서열 번호 022 (siRNA_4), 서열 번호 023 (siRNA_5), 서열 번호 024 (siRNA_6), 서열 번호 025 (siRNA_7), 서열 번호 026 (siRNA_8), 서열 번호 027 (siRNA_9), 서열 번호 028 (siRNA_10), 서열 번호 029 (siRNA_11), 서열 번호 030 (siRNA_12), 서열 번호 031 (siRNA_13), 서열 번호 032 (siRNA_14), 서열 번호 033 (siRNA_15), 서열 번호 034 (siRNA_16), 서열 번호 035 (siRNA_17), 서열 번호 036 (siRNA_18), 서열 번호 037 (siRNA_19), 서열 번호 038 (siRNA_20), 서열 번호 039 (siRNA_21), 서열 번호 040 (siRNA_22), 서열 번호 041 (siRNA_23), 서열 번호 042 (siRNA_24), 서열 번호 043 (siRNA_25), 서열 번호 044 (siRNA_26), 서열 번호 045 (siRNA_27), 서열 번호 046 (siRNA_28), 서열 번호 047 (siRNA_29), 서열 번호 048 (siRNA_30), 서열 번호 049 (siRNA_31), 서열 번호 050 (siRNA_32), 서열 번호 051(siRNA_33), 서열 번호 052 (siRNA_34), 서열 번호 053 (siRNA_35), 서열 번호 054 (siRNA_36), 서열 번호 055 (siRNA_37), 서열 번호 056 (siRNA_38), 서열 번호 057 (siRNA_39), 서열 번호 058 (siRNA_40), 서열 번호 059 (siRNA_41), 서열 번호 060 (siRNA_42), 서열 번호 061 (siRNA_43), 서열 번호 062 (siRNA_44), 서열 번호 063 (siRNA_45), 서열 번호 064 (siRNA_46), 서열 번호 065 (siRNA_47), 서열 번호 066(siRNA_48), 서열 번호 067 (siRNA_49), 및 서열 번호 068 (siRNA_50)을 포함하는 그룹에서 선택된 서열을 포함하는 또는 서열로 구성된 서열로 특징되는, siRNA.
7. 청구항 1 또는 2에 있어서, 상기 siRNA는 단백질 S의 인트론 서열에 대해 지시되는, siRNA.
8. 상기 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 혈우병 A의 치료 방법에 사용하기 위한, siRNA.
9. 상기 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 혈우병 B의 치료 방법에 사용하기 위한, siRNA.
10. 상기 청구항 중 어느 한 항의 siRNA를 포함하는 분자를 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 필요로 하는 환자의 혈우병 치료방법.
11. 청구항 1 내지 9 중 어느 한 항의 siRNA를 포함하는 분자를 포함하는, 혈우병의 예방 또는 치료를 위한 투약 형태.

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