BR112020008362A2 - composição farmacêutica, combinação, uso de uma combinação, e, método para tratar câncer. - Google Patents

composição farmacêutica, combinação, uso de uma combinação, e, método para tratar câncer. Download PDF

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Abstract

A presente descrição provê combinações farmacêuticas compreendendo pelo menos um modulador de spliceossoma e pelo menos um inibidor escolhido de inibidores de BCL2, BCL2/BCLxL e BCLxL. Também são providos métodos para tratar câncer compreendendo administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de pelo menos um modulador de spliceossoma e uma quantidade terapeuticamente eficaz de pelo menos um inibidor escolhido de inibidores de BCL2, BCL2/BCLxL e BCLxL.

Description

1 / 29 COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, COMBINAÇÃO, USO DE UMA COMBINAÇÃO, E, MÉTODO PARA TRATAR CÂNCER
[001] Este pedido reivindica prioridade do Pedido Provisório U.S. No. 62/579.666, depositado em 31 de outubro de 2017 e Pedido Provisório U.S. No. 62/580.364, depositado em 1 de novembro de 2017, cada um dos quais é por meio deste incorporado por referência em sua totalidade.
[002] Os genes da família BCL2 codificam proteínas antiapoptóticas/pró-sobrevivência contendo domínio BH, que desempenham um papel particularmente importante na regulagem da apoptose. Existem pelo menos cinco proteínas BCL2, BCL2, BCL2L1, BCL2L2, BCL2A1 e MCL1, que estão envolvidas na sobrevivência de célula de tumor em uma variedade de tipos de câncer (ver, por exemplo, Delbridge ARD, et al., 2016, Nat. Rev. Cancer 16, 99–109; Czabotar PE, et al., 2014, Nat. Rev. Mol. Cell Bio. 15, 49–63). Diversos compostos foram desenvolvidos para inibir as proteínas da família BCL2, incluindo, por exemplo, ABT199 (venetoclax), ABT263 (navitoclax), A-1331852 e ABT737. Embora os inibidores de BCL2 tenham se mostrado promissores como agentes citotóxicos, estes compostos são incapazes de inibir os efeitos antiapoptóticos de MCL1. Particularmente, MCL1 é focalmente amplificado em muitos tipos de câncer (Zack TI, et al., 2013, Nature Genet. 45, 1134–1140). Foi relatado que a alta expressão de BCL2L1 (BCLxL) confere resistência à repressão de MCL1 e a amplificação/ superexpressão de MCL1 é o mecanismo principal conferindo resistência aos inibidores de BCL2, BCL2/BCLxL e BCLxL (ver, por exemplo, Wei G, et al., 2012, Cancer Cell 21(4): 547–562; Lin X, et al., 2007, Oncogene 26(27): 3972-3979; Teh TC, et al, 2017, Leukemia. doi: 10.1038/leu.2017,243). Terapias eficazes para superar a resistência aos inibidores de BCL2, BCL2/BCLxL e BCLxL são necessárias.
[003] Um corpo crescente de evidências indica que as terapias de combinação podem ajudar a superar respostas incompletas e resistência
2 / 29 terapêutica ao tratamento com agente único de câncer. (Sellers WR., 2011, Cell 147(1): 26-31). Por exemplo, a combinação de inibidores do caminho de MAPK vemurafenib (inibidor de RAF) e cobimetinib (inibidor de MEK) foi aprovada pelo FDA para tratar pacientes com melanoma portando mutações B-RAF. (Flaherty KT, et al., 2012, N Engl J Med 367: 1694-1703). Entretanto, o desenvolvimento das terapias de combinação eficazes foi desafiante parcialmente devido à falta de abordagens pré-clínicas eficientes que são preditivas da atividade de combinação clínica, particularmente para combinações medicamentosas com base em evidência. As estratégias da combinação de fármacos com base no mecanismo foram aplicadas em cenários pré-clínicos e clínicos contando com as verificações biológicas relacionadas com o alvo e caminho a partir de pesquisa básica. Dada a complexidade dos mecanismos de ação, houve muitos obstáculos para identificar combinações eficazes para agentes citotóxicos.
SUMÁRIO
[004] A presente descrição está fundamentada na observação de que a combinação de certos moduladores de spliceossoma (por exemplo, compostos pladienolídeos) e inibidores de BCL2, BCL2/BCLxL ou BCLxL mostram efeitos anticâncer melhorados (por exemplo, sinergísticos). Os compostos pladienolídeos que alvejam o spliceossoma e mutações nesse ponto são particularmente úteis. Assim, são aqui providas terapias de combinação para tratar câncer compreendendo administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de pelo menos um modulador de spliceossoma pladienolídico (por exemplo, E7107 e/ou H3B-8800) e uma quantidade terapeuticamente eficaz de pelo menos um inibidor escolhido de Inibidores de BCL2, BCL2/BCLxL e BCLxL.
[005] Métodos, terapias de combinação, composições farmacêuticas e kits para tratar câncer usando uma combinação de uma quantidade terapeuticamente eficaz de pelo menos um pladienolídeo modulador de
3 / 29 spliceossoma (por exemplo, E7107 e/ou H3B-8800) e uma quantidade terapeuticamente eficaz de pelo menos um inibidor escolhido de inibidores de BCL2, BCL2/BCLxL e BCLxL também são providos.
[006] Outros recursos da presente descrição estarão evidentes a partir da seguinte descrição detalhada, dos desenhos e das reivindicações.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[007] As FIGS. 1 e 2 mostram a identificação de MCL1 superexpresso e linhagens de célula de carcinoma pulmonar de célula não pequena dependente de MCL1 (NSCLC). A FIG. 1 representa uma Análise de Western Blot de MCL1L (MCL1 de tamanho natural) e GAPDH (controle de carga). A diluição de lisados foi usada como padrões de semiquantificação. A FIG. 2 representa a inibição do crescimento de linhagens de célula no silenciamento de MCL1 pelo shRNA. CNTRL: shRNA de Controle; Dox: doxiciclina.
[008] As FIGS. 3 a 5 mostram que E7107 induz a modulação de junção de MCL1 nas células NCIH1568. A FIG. 3 é uma representação esquemática da junção de gene MCL. A FIG. 4 representa a detecção da RT- PCR quantitativa de mRNAs de MCL1: MCL1L: forma longa contendo exons 1, 2 e 3; MCL1S: forma curta contém os exons 1 e 3; MCL1 pré-mRNA: mRNA com retenção de intron 1. A FIG. 5 representa uma Análise de Western Blot de MCL1L (tamanho natural), MCL1 truncada, PARP clivada e tubulina (controle de carga) depois do tratamento com E7107 durante 6 horas.
[009] As FIGS. 6 a 9 mostram que a citotoxicidade induzida por E7107 é dependente de MCL1 e BCLxL. A FIG. 6 representa expressão de cDNA indutível de MCL1L nas células NCIH1568. A Análise de Western Blot mostrou a expressão de MCL1L e GAPDH (controle de carga). CNTRL: vetor de controle. A FIG. 7 representa inibição do crescimento de linhagens de célula NCIH1568 com vetor vazio (controle) e superexpressão de cDNA de MCL1L. A FIG. 8 representa silenciamento mediado pelo shRNA
4 / 29 indutível mediado pelo BCLxL (codificado por BCL2L1) em células A549. A Análise de Western Blot mostrou a expressão de BCLxL e GAPDH (controle de carga). A FIG. 9 representa a inibição do crescimento de linhagens de célula A549 no silenciamento induzido por Dox de BCLxL. Dox: doxiciclina.
[0010] A FIG. 10 mostra o efeito sinergístico do tratamento com E7107 e ABT263 em quatro linhagens de célula NSCLC. Este estudo foi realizado em controle de vetor ou BCLxL shRNA.
[0011] A FIG. 11 mostra o efeito sinergístico de tratamento com E7107 e ABT199 na linhagem de célula A549. Este estudo foi realizado no controle de vetor ou BCLxL shRNA.
[0012] A FIG. 12 mostra o efeito sinergístico do tratamento com H3B-8800 e ABT263 em duas linhagens de célula de mieloma múltiplo: U266B1 e RPMI8226.
[0013] A FIG. 13 mostra o efeito sinergístico do tratamento com H3B-8800 e ABT199 em duas linhagens de célula de mieloma múltiplo: JJN3 e RPMI8226.
[0014] A FIG. 14 mostra o efeito sinergístico do tratamento com H3B-8800 e A-1331852 em duas linhagens de célula de mieloma múltiplo: RPMI8226 e MM1S.
[0015] Como aqui usadas, as seguintes definições devem ser aplicadas a menos que de outro modo indicado.
[0016] “Isômeros” se referem aos compostos tendo o mesmo número e tipo de átomos e consequentemente o mesmo peso molecular, mas diferente com respeito ao arranjo ou configuração dos átomos. “Estereoisômeros” se referem aos compostos que têm a mesma conectividade atômica mas arranjos diferentes de seus átomos no espaço. “Diastereoisômeros” ou “diastereômeros” se referem aos estereoisômeros que não são enantiômeros. “Enantiômeros” se referem aos estereoisômeros que não são imagens de espelho sobrepostas um do outro. “Isômeros geométricos” se referem aos
5 / 29 isômeros cis-trans tendo posições diferentes de grupos com respeito a uma ligação dupla ou anel ou átomo central.
[0017] Os enantiômeros aqui divulgados podem incluir isômeros “enantiomericamente puros” que compreendem substancialmente um enantiômero único, por exemplo, maior do que ou igual a 90%, 92%, 95%, 98% ou 99% ou igual a 100% de um único enantiômero, em um centro ou centros assimétricos particulares. Um “centro assimétrico” ou “centro quiral” se referem a um átomo de carbono tetraédrico que compreende quatro substituintes diferente.
[0018] “Estereomericamente puro” como aqui usado significa um composto ou composição do mesmo que compreenda um estereoisômero de um composto e seja substancialmente livre de outros estereoisômeros deste composto. Por exemplo, uma composição estereomericamente pura de um composto tendo um centro quiral será substancialmente livre do enantiômero oposto do composto. Uma composição estereomericamente pura de um composto tendo dois centros quirais será substancialmente livre de diastereômeros e substancialmente livre do enantiômero oposto, do composto. Um composto estereomericamente puro típico compreende mais do que cerca de 80% em peso de um estereoisômero do composto e menos do que cerca de 20% em peso dos outros estereoisômeros do composto, mais preferivelmente mais do que cerca de 90% em peso de um estereoisômero do composto e menos do que cerca de 10% em peso dos outros estereoisômeros do composto, ainda mais preferivelmente mais do que cerca de 95% em peso de um estereoisômero do composto e menos do que cerca de 5% em peso dos outros estereoisômeros do composto e o mais preferivelmente mais do que cerca de 97% em peso de um estereoisômero do composto e menos do que cerca de 3% em peso dos outros estereoisômeros do composto. Ver, por exemplo, a Patente US No. 7.189.715.
[0019] “R” e “S” como termos descrevendo isômeros são descritores
6 / 29 da configuração estereoquímica em um átomo de carbono assimetricamente substituído. A designação de um átomo de carbono assimetricamente substituído como “R” ou “S” é feita pela aplicação das regras de prioridade de Cahn-Ingold-Prelog, como são bem conhecidas por aqueles versados na técnica e descritas no International Union of Pure and Applied Chemistry (IUPAC) Rules for the Nomenclature of Organic Chemistry. Seção E, Stereochemistry.
[0020] “Tratamento,” “tratar,” ou “tratando” câncer se referem a reverter (por exemplo, superar um bloqueio de diferenciação das células), aliviar (por exemplo, aliviar um ou mais sintomas, tais como fadiga de anemia, contagens sanguíneas baixas, etc.), e/ou retardar a progressão de (por exemplo, retardar a progressão da condição tal como transformação para AML) um câncer como aqui descrito.
[0021] “Indivíduo”, como aqui usado, significa um indivíduo animal, preferivelmente um indivíduo mamífero e particularmente seres humanos.
[0022] “Carreador farmaceuticamente aceitável” como aqui usado se refere a um carreador, adjuvante ou veículo não tóxicos que não destruam a atividade farmacológica do composto com a qual o mesmo é formulado. carreadores, adjuvantes ou veículos farmaceuticamente aceitáveis que podem ser usados nas composições desta invenção incluem, mas não são limitados a, trocadores de íon, alumina, estearato de alumínio, lecitina, proteínas séricas, tais como albumina sérica humana, substâncias tamponizantes tais como fosfatos, glicina, ácido sórbico, sorbato de potássio, misturas parciais de glicerídeo de ácidos graxos vegetais saturados, água, sais ou eletrólitos, tais como sulfato de protamina, hidrogeno fosfato de sódio, hidrogeno fosfato de potássio, cloreto de sódio, sais de zinco, sílica coloidal, trissilicato de magnésio, polivinil pirrolidona, substâncias com base em celulose, polietileno glicol, ciclodextrinas, carboximetilcelulose sódica, poliacrilatos, ceras, polímeros de bloco de polietileno-polioxipropileno, polietileno glicol e
7 / 29 gordura de lã.
[0023] Um “sal farmaceuticamente aceitável” é um sal que retém a atividade biológica desejada do composto precursor e não comunicam efeitos toxicológicos indesejados. Os exemplos de tais sais são: (a) sais de adição de ácido formados com ácidos inorgânicos, por exemplo, ácido clorídrico, ácido bromídrico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico, ácido nítrico e similares; e sais formados com ácidos orgânicos, por exemplo, ácido acético, ácido oxálico, ácido tartárico, ácido succínico, ácido maléico, ácido fumárico, ácido glucônico, ácido cítrico, ácido málico, ácido ascórbico, ácido benzóico, ácido tânico, ácido palmítico, ácido algínico, ácido poliglutâmico, ácido naftalenossulfônico, ácido metanossulfônico, ácido p-toluenossulfônico, ácido naftalenidissulfônico, ácido poligalacturônico e similares; e (b) sais formados a partir de ânions elementares tais como cloro, bromo e iodo. Ver, por exemplo, Haynes et al., “Commentary: Occurrence of Pharmaceutically Acceptable Anions and Cations in the Cambridge Structural Database,” J. Pharmaceutical Sciences, vol. 94, no. 10 (2005), e Berge et al., “Pharmaceutical Salts”, J. Pharmaceutical Sciences, vol. 66, no. 1 (1977), que são aqui incorporados por referência.
[0024] A menos que de outro modo estabelecido, os compostos aqui representados podem incluir misturas do composto aqui incorporado e qualquer uma das formas enantiomérica, diastereomérica, e/ou geométrica (ou conformacional) da estrutura; por exemplo, as configurações R e S para cada centro assimétrico, isômeros de ligação dupla (Z) e (E) e isômeros conformacionais (Z) e (E). A menos que de outro modo estabelecido, os compostos aqui incorporados coexistindo com formas tautoméricas estão dentro do escopo da invenção. Adicionalmente, a menos que de outro modo estabelecido, as estruturas aqui incorporadas também são intencionadas incluir compostos que diferem apenas na presença de um ou mais átomos isotopicamente enriquecidos. Por exemplo, compostos tendo as presentes
8 / 29 estruturas exceto para a substituição de hidrogênio por deutério ou trítio ou a substituição de um carbono por um carbono enriquecido por 13C ou 14C estão dentro do escopo desta invenção. Tais compostos podem ser úteis, por exemplo, como ferramentas ou sondas analíticas em ensaios biológicos.
[0025] Vários compostos pladienolídeos foram desenvolvidos como moduladores de junção para o tratamento de câncer, incluindo aqueles divulgados nos seguintes pedidos de patente: WO 2002/060890; WO 2004/011459; WO 2004/011661; WO 2004/050890; WO 2005/052152; WO 2006/009276; WO 2008/126918; e WO 2015/175594, cada um dos quais são aqui incorporados por referência. Por exemplo, um composto pladienolídeo (8E,12E,14E)-7-((4-Cicloheptilpiperazin-1-il)carbonil)óxi-3,6,16,21- tetrahidróxi-6,10,12,16,20-pentametil-18,19-epoxitricosa-8,12,14-trien-11- olídeo, também conhecido como E7107, é um derivado semissintético do produto natural pladienolídeos D e os resultados do seu estudo de Fase I foram relatados: .
[0026] Como um outro exemplo, o composto pladienolídeo piridina 4- metilpiperazina-1-carboxilato de (2S,3S,6S,7R,10R,E)-7,10-dihidróxi-3,7- dimetil-12-oxo-2-((R,2E,4E)-6-(piridin-2-il)hepta-2,4-dien-2- il)oxaciclododec-4-en-6-ila (também denominado “4-metilpiperazina-1- carboxilato de (2S,3S,4E,6S,7R,10R)-7,10-dihidróxi-3,7-dimetil-12-oxo-2- ((2E,4E,6R)-6-(piridin-2-il)hepta-2,4-dien-2-il)oxaciclododec-4-en-6-ila”), também conhecido como H3B-8800, recebeu a designação de fármaco órfão para o tratamento de certos cânceres hematológicos e tem a seguinte estrutura:
9 / 29
O N O OH
N H3 C
O N O OH .
[0027] Em algumas modalidades, o pelo menos um pladienolídeo modulador de spliceossoma para uso em terapia de combinação é escolhido de um composto da fórmula 1 (“E7107”): e sais farmaceuticamente aceitáveis do mesmo.
[0028] Em algumas modalidades, o pelo menos um pladienolídeo modulador de spliceossoma para uso em terapia de combinação é escolhido de um composto da fórmula 2 (“H3B-8800”):
O N O OH
N H3 C
O
N O OH e sais farmaceuticamente aceitáveis do mesmo.
[0029] Como aqui usado, o pelo menos um inibidor escolhido dos inibidores de BCL2, BCL2/BCLxL e BCLxL inclui, mas não é limitado a, HA14-1, BH3I-1, antimicina A, queleritrina, gossipol (NSC19048), apogossipol (NSC736630), TW-37, 4-(3-metóxi-fenilsulfonil)-7-nitro- benzofuran-3-óxido (MNB), TM12-06, obatoclax (GX15-070), venetoclax (ABT199), navitoclax (ABT263), A-1331852 e ABT737.
[0030] Em algumas modalidades, o pelo menos um inibidor escolhido
10 / 29 de inibidores de BCL2, BCL2/BCLxL e BCLxL é escolhido de venetoclax (ABT199), navitoclax (ABT263), A-1331852, ABT737 e sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos.
[0031] Os métodos aqui divulgados podem ser usados para tratar vários tipos de cânceres, incluindo malignidades hematológicas e tumores sólidos.
[0032] As malignidades hematológicas podem incluir cânceres do sangue (por exemplo, leucemia) ou cânceres dos linfônodos (por exemplo, linfomas) ou outros cânceres relacionados. As leucemias podem incluir leucemia linfoblástica leucemia linfoblástica aguda (ALL), leucemia mielógena aguda (AML), leucemia linfocítica crônica (CLL), leucemia mielógena crônica (CML), Leucemia mielomonocítica crônica (CMML), leucemia monocítica aguda (AMoL), etc. Linfomas podem incluir linfoma de Hodgkin e linfoma de não Hodgkin. Outras malignidades hematológicas podem incluir síndrome mielodisplástica (MDS) e mieloma múltiplo (MM).
[0033] Tumores sólidos podem incluir carcinomas tais como adenocarcinoma, por exemplo, câncer mamário, câncer pancreático, câncer prostático, câncer de cólon ou colorretal, câncer pulmonar (incluindo carcinoma pulmonar de célula não pequena (NSCLC) e carcinoma pulmonar de célula pequena (SCLC)), câncer gástrico, câncer cervical, câncer endometrial, câncer ovariano, colangiocarcinoma, glioma, melanoma e similares.
[0034] Os métodos aqui divulgados também podem ser usados para tratar cânceres que possam ser responsivos aos agentes que alvejam um gene ou proteína de spliceossoma, por exemplo, SF3B1. Os exemplos de tais cânceres incluem, mas não são limitados a, síndrome mielodisplástica, mieloma múltiplo, leucemia linfocítica crônica, leucemia linfoblástica aguda, leucemia mielomonocítica crônica, leucemia mieloide aguda, câncer de cólon, câncer pancreático, câncer endometrial, câncer ovariano, câncer mamário,
11 / 29 melanoma uveal, câncer gástrico, colangiocarcinoma ou câncer pulmonar (incluindo carcinoma pulmonar de célula não pequena (NSCLC) e carcinoma pulmonar de célula pequena (SCLC)). Os genes ou proteínas de spliceossoma exemplares incluem, mas não são limitados a, fator de junção 3B subunidade 1 (SF3B1), fator 1 auxiliar de RNA nuclear pequeno U2 (U2AF1), fator de junção 2 rico em serina/arginina (SRSF2), motivo de ligação de RNA dedo de zinco (tipo CCCH) e rico em serina/arginina 2 (ZRSR2), fator de junção 8 do pré-processamento de mRNA (PRPF8), fator 2 auxiliar de RNA nuclear pequeno U2 (U2AF2), fator de junção 1 (SF1), fator de junção 3a subunidade 1 (SF3A1), fator 40 de processamento de pré-mRNA PRP40 homólogo B (PRPF40B), proteína 10 do motivo de ligação de RNA (RBM10), proteína de ligação de poli(rC) 1 (PCBP1), fator de junção 1 de pré-mRNA de pescoço torto (CRNKL1), DEAH (Asp-Glu-Ala-His) caixa de helicase 9 (DHX9), tipo peptidil-prolil cis-trans isomerase 2 (PPIL2), proteína 22 do motivo de ligação de RNA (RBM22), ribonucleoproteína nuclear pequena Sm D3 (SNRPD3), RNA helicase dependente de ATP provável DDX5 (DDX5), RNA helicase dependente de ATP de fator de junção de pré-mRNA DHX15 (DHX15) e proteína 1 de ligação de poliadenilato (PABPC1).
[0035] Os métodos aqui divulgados também podem ser usados para tratar cânceres dependentes de MCL1. Os exemplos de cânceres dependentes de MCL1 podem incluir, mas não são limitados a mieloma múltiplo, leucemias, linfomas e tumores sólidos. As leucemias dependentes de MCL1 podem incluir, mas não são limitadas à leucemia linfoblástica aguda, leucemia mielógena aguda, leucemia linfocítica crônica, leucemia mielógena crônica, leucemia mielomonocítica crônica e leucemia monocítica aguda. Os linfomas dependentes de MCL1 podem incluir, mas não são limitados ao linfoma de Hodgkin e linfoma de não Hodgkin. Os tumores sólidos dependentes de MCL1 podem incluir, mas não são limitados ao câncer pulmonar (por exemplo, carcinoma pulmonar de célula não pequena e carcinoma pulmonar
12 / 29 de célula pequena), câncer mamário, câncer pancreático, câncer prostático, câncer de cólon ou colorretal, câncer gástrico, câncer cervical, câncer endometrial, câncer ovariano, colangiocarcinoma, glioma e melanoma.
[0036] Foi mostrado que cânceres com alta expressão de MCL1 são sensíveis à inibição de MCL1 pela inibição alvo direta ou perturbação do nível de gene, por exemplo inibição transcricional ou de junção (Gao Y, Koide K., 2013, ACS Chem Biol. 8(5): 895-900; Wei G, et al., 2012, Cancer Cell 21(4): 547–562). Também foi indicado que a alta expressão de BCL-xL confere resistência à repressão de MCL1 e a amplificação/superexpressão de MCL1 é o mecanismo principal conferindo resistência aos inibidores de BCL2/xL (ver, por exemplo, Wei G, et al., 2012, Cancer Cell 21(4): 547–562; Lin X, et al., 2007, Oncogene 26(27): 3972-3979; Teh TC, et al, 2017, Leukemia. doi: 10.1038/leu.2017.243). Sem desejar estar ligado por nenhuma teoria particular, como aqui descrito, os derivados de pladienolídeos E7107 e H3B-8800 podem induzir modulação de junção potente do gene MCL1, levando à expressão reduzida da proteína funcional de tamanho completo. A proteína MCL1 diminuída pode causar morte de célula robusta em linhagens de célula de câncer. A combinação de pelo menos um derivado de pladienolídeo (por exemplo, E7107 e/ou H3B-8800) e o pelo menos um inibidor escolhido dos inibidores de BCL2, BCL2/BCLxL e BCLxL pode induzir inibição sinergística do crescimento de células cancerosas. Assim, a combinação de pelo menos um dos moduladores da junção de molécula pequena e o pelo menos um inibidor escolhido dos inibidores de BCL2, BCL2/BCLxL e BCLxL pode ser usada para tratar cânceres tais como aqueles dependentes dos genes antiapoptóticos.
[0037] Também são aqui divulgadas composições farmacêuticas compreendendo pelo menos um pladienolídeo modulador de spliceossoma e pelo menos um inibidor escolhido dos inibidores de BCL2, BCL2/BCLxL e BCLxL. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica compreende
13 / 29 ainda pelo menos um carreador farmaceuticamente aceitável. O pelo menos um carreador farmaceuticamente aceitável pode ser escolhido de acordo com a via pretendida de administração.
[0038] As composições farmacêuticas aqui divulgadas podem ser formulados para administração parenteral, oral, com pulverização de inalação, tópica, retal, nasal, bucal, vaginal ou com reservatório implantado, etc. O termo “parenteral” como aqui usado inclui técnicas de injeção ou infusão subcutâneas, intravenosas, intramusculares, intra-articulares, intrassinoviais, intraesternais, intratecais, intra-hepáticas, intralesionais e intracranianas. Em modalidades particulares, os compostos da terapia de combinação são administrados intravenosamente, oralmente, subcutaneamente ou via administração intramuscular. As formas injetáveis estéreis das composições da presente descrição podem ser de suspensão aquosa ou oleaginosa. Estas suspensões podem ser formuladas de acordo com técnicas conhecidas no ramo usando agentes de dispersão ou umectação adequados e agentes de suspensão. A preparação injetável estéril também pode ser uma solução ou suspensão injetáveis estéreis em um diluente ou solvente não tóxicos parenteralmente aceitáveis, por exemplo, como uma solução em 1,3- butanodiol. Entre os veículos e solventes aceitáveis que podem ser utilizados são água, solução de Ringer e solução de cloreto de sódio isotônica. Além disso, óleos fixos, estéreis são convencionalmente utilizados como um solvente ou meio de suspensão.
[0039] Para este propósito, qualquer óleo fixo brando pode ser utilizado incluindo mono- ou di-glicerídeos sintéticos. Ácidos graxos, tais como ácido oléico e seus derivados de glicerídeo são úteis na preparação de injetáveis, como são os óleos naturais farmaceuticamente aceitáveis, tais como óleo de oliva e óleo de mamona, especialmente nas suas versões polioxietiladas. Estas soluções ou suspensões oleosas também podem conter um diluente ou dispersante de álcool de cadeia longa, tais como carboximetil
14 / 29 celulose ou agentes de dispersão similar que são habitualmente usados na formulação de formas de dosagem farmaceuticamente aceitáveis incluindo emulsões e suspensões. Outros tensoativos habitualmente usados, tais como Tweens, Spans e outros agentes de emulsificantes ou realçadores de biodisponibilidade que são habitualmente usados na fabricação de sólido, líquido ou outras formas de dosagem farmaceuticamente aceitáveis, também podem ser usados para os propósitos da formulação.
[0040] Para a administração oral, o pelo menos um pladienolídeo modulador de spliceossoma e/ou pelo menos um inibidor escolhido de inibidores de BCL2, BCL2/BCLxL e BCLxL podem ser providos em uma forma de dosagem oral aceitável, incluindo, mas não limitado a, cápsulas, tabletes, suspensões ou soluções aquosas. No caso de tabletes para uso oral, carreadores podem ser escolhidos de, por exemplo, lactose e amido de milho. Os agentes lubrificantes, tais como estearato de magnésio, também podem ser adicionados. Para a administração oral em uma forma de cápsula, os diluentes úteis incluem lactose e amido de milho seco. Quando suspensões aquosas são requeridas para uso oral, o ingrediente ativo é combinado com um agente emulsificante e/ou de suspensão. Se desejado, certos agentes adoçantes, flavorizantes ou corantes também podem ser adicionados.
[0041] Em algumas modalidades, pelo menos um pladienolídeo modulador de spliceossoma e pelo menos um inibidor escolhido de inibidores de BCL2, BCL2/BCLxL e BCLxL aqui divulgados são administrados a um indivíduo em uma forma de dosagem única ou pela administração separada ou sequencial de cada agente ativo.
[0042] Em algumas modalidades, pelo menos um pladienolídeo modulador de spliceossoma e pelo menos um inibidor escolhido de inibidores de BCL2, BCL2/BCLxL e BCLxL são formulados em tabletes, pílulas, cápsulas ou soluções. Em algumas modalidades, pelo menos um pladienolídeo modulador de spliceossoma e/ou pelo menos um inibidor
15 / 29 escolhido de inibidores de BCL2, BCL2/BCLxL e BCLxL são formulados em uma solução para administração parenteral. Em algumas modalidades, o pelo menos um pladienolídeo modulador de spliceossoma e pelo menos um inibidor escolhido de inibidores de BCL2, BCL2/BCLxL e BCLxL são formulados em regiões segregadas ou cápsulas distintas de inserido dentro de uma cápsula. Em algumas modalidades, pelo menos um pladienolídeo modulador de spliceossoma e pelo menos um inibidor escolhido de inibidores de BCL2, BCL2/BCLxL e BCLxL são formulados em camadas isoladas em um tablete.
[0043] Em algumas modalidades, a composição farmacêutica compreende: uma quantidade terapeuticamente eficaz de pelo menos um pladienolídeo modulador de spliceossoma, uma quantidade terapeuticamente eficaz de pelo menos um inibidor escolhido de inibidores de BCL2, BCL2/BCLxL e BCLxL e pelo menos um carreador farmaceuticamente aceitáveis.
[0044] Em algumas modalidades, a composição farmacêutica compreende: uma quantidade terapeuticamente eficaz de E7107, uma quantidade terapeuticamente eficaz de pelo menos um inibidor escolhido de inibidores de BCL2, BCL2/BCLxL e BCLxL e pelo menos um carreador farmaceuticamente aceitáveis.
[0045] Em algumas modalidades, a composição farmacêutica compreende: uma quantidade terapeuticamente eficaz de H3B-8800, uma quantidade terapeuticamente eficaz de pelo menos um inibidor escolhido de inibidores de BCL2, BCL2/BCLxL e BCLxL e pelo menos um carreador farmaceuticamente aceitáveis.
[0046] Em algumas modalidades, o pelo menos um pladienolídeo modulador de spliceossoma e pelo menos um inibidor escolhido de inibidores de BCL2, BCL2/BCLxL e BCLxL podem ser administrados como composições separadas e opcionalmente como formas diferentes, por
16 / 29 exemplo, como tabletes ou soluções separadas. Adicionalmente como um exemplo não limitante, tanto o pelo menos um pladienolídeo modulador de spliceossoma quanto pelo menos um inibidor escolhido de inibidores de BCL2, BCL2/BCLxL e BCLxL podem ser administrados, separadamente, como tabletes orais.
[0047] Em algumas modalidades, o pelo menos um pladienolídeo modulador de spliceossoma e pelo menos um inibidor escolhido de inibidores de BCL2, BCL2/BCLxL e BCLxL devem ser administrados como composições separadas: uma composição farmacêutica compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz de pelo menos um inibidor escolhido de inibidores de BCL2, BCL2/BCLxL e BCLxL e pelo menos um carreador farmaceuticamente aceitáveis; e uma composição farmacêutica compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz de pelo menos um pladienolídeo modulador de spliceossoma e pelo menos um carreador farmaceuticamente aceitável.
[0048] Em algumas modalidades, é aqui provido um kit compreendendo uma primeira composição farmacêutica compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz de pelo menos um pladienolídeo modulador de spliceossoma, uma segunda composição farmacêutica compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz de pelo menos um inibidor escolhido de inibidores de BCL2, BCL2/BCLxL e BCLxL e instruções para uso do kit no tratamento de câncer.
[0049] Em algumas modalidades, o pelo menos um pladienolídeo modulador de spliceossoma e pelo menos um inibidor escolhido de inibidores de BCL2, BCL2/BCLxL e BCLxL são administrados simultaneamente. Em algumas modalidades, o pelo menos um pladienolídeo modulador de spliceossoma e pelo menos um inibidor escolhido de inibidores de BCL2,
17 / 29 BCL2/BCLxL e BCLxL são administrados sequencialmente. Em algumas modalidades, o pelo menos um pladienolídeo modulador de spliceossoma e pelo menos um inibidor escolhido de inibidores de BCL2, BCL2/BCLxL e BCLxL são administrados intermitentemente. A duração de tempo entre as administrações do pelo menos um pladienolídeo modulador de spliceossoma e pelo menos um inibidor escolhido de inibidores de BCL2, BCL2/BCLxL e BCLxL pode ser ajustada para se obter o efeito terapêutico desejado. Em algumas modalidades, o pelo menos um pladienolídeo modulador de spliceossoma e pelo menos um inibidor escolhido de inibidores de BCL2, BCL2/BCLxL e BCLxL são administrados apenas uns poucos minutos separadamente. Em algumas modalidades, o pelo menos um pladienolídeo modulador de spliceossoma e pelo menos um inibidor escolhido de inibidores de BCL2, BCL2/BCLxL e BCLxL são administrados várias horas (por exemplo, cerca de 2, 4, 6, 10, 12, 24 ou 36 h) separadamente. Em algumas modalidades, pode ser vantajoso administrar mais do que uma dosagem de um do pelo menos um pladienolídeo modulador de spliceossoma e pelo menos um inibidor escolhido de inibidores de BCL2, BCL2/BCLxL e BCLxL entre administrações do agente terapêutico remanescente. Por exemplo, um agente terapêutico pode ser administrado em 1 hora e depois novamente nas 11 horas seguintes da administração do outro agente terapêutico. Em algumas modalidades, os efeitos terapêuticos de cada pladienolídeo modulador de spliceossoma e inibidor de BCL2, BCL2/BCLxL ou BCLxL devem se sobrepor durante pelo menos uma porção da duração, de modo que o efeito terapêutico global da terapia de combinação possa ser atribuível em parte aos efeitos combinados ou sinergísticos da terapia de combinação.
[0050] O pelo menos um pladienolídeo modulador de spliceossoma e pelo menos um inibidor escolhido de inibidores de BCL2, BCL2/BCLxL e BCLxL aqui divulgados podem ser administrados a um indivíduo em uma quantidade eficaz para o tratamento ou terapeuticamente eficaz. A quantidade
18 / 29 de cada um do pelo menos um pladienolídeo modulador de spliceossoma e pelo menos um inibidor escolhido de inibidores de BCL2, BCL2/BCLxL e BCLxL que pode ser combinada com pelo menos um carreador farmaceuticamente aceitável para produzir uma forma de dosagem única variará dependendo do indivíduo tratado e da via pretendida de administração.
[0051] Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas são formuladas de modo que uma dosagem de 0,01 a 100 mg/kg de peso corporal/dia de cada um do pelo menos um pladienolídeo modulador de spliceossoma e pelo menos um inibidor escolhido de inibidores de BCL2, BCL2/BCLxL e BCLxL é administrada a um indivíduo. Em algumas modalidades, uma dosagem variando de 1 a 100 mg/kg de peso corporal/dia de cada um do pelo menos um pladienolídeo modulador de spliceossoma e pelo menos um inibidor escolhido de inibidores de BCL2, BCL2/BCLxL e BCLxL é administrada a um indivíduo. Em algumas modalidades, uma dosagem variando de 0,01 mg a 50 mg de cada um do pelo menos um pladienolídeo modulador de spliceossoma e pelo menos um inibidor escolhido de inibidores de BCL2, BCL2/BCLxL e BCLxL é administrada a um indivíduo. Em algumas modalidades, uma dosagem variando de 1 mg a 50 mg, de 0,1 mg a 25 mg ou de 5 mg a 40 mg, de cada um do pelo menos um pladienolídeo modulador de spliceossoma e pelo menos um inibidor escolhido de inibidores de BCL2, BCL2/BCLxL e BCLxL é provida.
[0052] Em algumas modalidades, o pelo menos um pladienolídeo modulador de spliceossoma é administrado em uma faixa de dosagem de 1 mg/kg a 10 mg/kg. Em algumas modalidades, o pelo menos um pladienolídeo spliceossoma é administrado em uma dosagem de 1 mg/kg, 1,25 mg/kg, 2 mg/kg, 2,5 mg/kg, 3 mg/kg, 4 mg/kg, 5 mg/kg, 6 mg/kg, 7 mg/kg, 8 mg/kg, 9 mg/kg ou 10 mg/kg. Em algumas modalidades, o pelo menos um pladienolídeo spliceossoma é administrado em uma dosagem de 5 mg/kg. Em algumas modalidades, o pelo menos um pladienolídeo spliceossoma é
19 / 29 administrado em uma dosagem de 8 mg/kg.
[0053] Em algumas modalidades, E7107 é administrado intravenosamente em uma dosagem de 5 mg/kg durante cinco dias consecutivos. Em algumas modalidades, H3B-8800 é administrado oralmente em uma dosagem de 8 mg/kg durante cinco dias consecutivos seguidos por um repouso de nove dias.
[0054] Uma pessoa de habilidade comum entenderá que um regime de dosagem e tratamento específicos para qualquer paciente particular dependerá de uma variedade de fatores, incluindo a atividade do composto específico utilizado, a idade, peso corporal, saúde geral, sexo, dieta, tempo de administração, taxa de excreção, combinação medicamentosa, o julgamento do médico responsável e a severidade da doença particular sendo tratada. A quantidade de cada agente ativo da terapia de combinação também dependerá do composto/sal particular na composição.
[0055] Os seguintes exemplos são apresentados de modo que as modalidades aqui descritas e usos dos mesmos, possam ser mais completamente entendidos. Deve ser entendido que estes exemplos são apenas para propósitos ilustrativos e não devem ser interpretados como limitando de nenhuma maneira.
EXEMPLOS A. Materiais e Métodos
1. Linhagens de célula e protocolo de cultura de célula
[0056] As linhagens de célula de Câncer Pulmonar de Célula Não Pequena (NSCLC) A549, NCI-H23, NCI-H1568, NCI-H1650, NCI-H1975 e NCI-H2110 foram obtidas da American Type Culture Collection (ATCC) e cultivadas como pelas instruções do fabricante. As linhagens indutíveis de shRNA e cDNA geradas pela transdução lentiviral foram cultivadas de acordo com as instruções do fabricante utilizando Tet System Approved FBS (Clontech) ao invés de soros padrões. LentiX-293T (Clontech) foi usado para
20 / 29 a geração de vírus de superexpressão de shRNA e cDNA para a infecção e cultivados de acordo com as instruções do fabricante. As linhagens de célula foram testadas quanto à contaminação de micoplasma e autenticadas para confirmar a identidade celular. Puromicina (0,25 a 1,25 µg/ml, Thermo Fisher Scientific) foi usada para a seleção de células expressando shRNA; G418 (0,5 a 2 mg/mL, Thermo Fisher Scientific) foi usado para a seleção de células expressando cDNA indutível. Hiclato de Doxiciclina (Sigma) (Dox) foi usado para a indução do shRNA e cDNA.
[0057] As células NKM1 e KO52 são obtidas da Japanese Collection of Research Bioresources Cell Bank. As células HNT34, MONOMAC6 e MUTZ3 são obtidas da Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen. As células HNT34 e NKM1 são mantidas em RPMI (ATCC) com 10% de soro bovino fetal. As células KO52 são mantidas em Alfa-MEM (ATCC) com 10% de soro bovino fetal. As células MONOMAC6 são mantidas em RPMI (ATCC) com 20% de soro bovino fetal. As células MUTZ3 são mantidas em Alfa-MEM (ATCC) com 20% de soro bovino fetal e 20% de meio 5637 condicionado. As linhagens de célula são incubadas em um incubador a 37°C com 5% de CO2.
2. Análise de Western Blot do protocolo MCL1 e BCLxL
[0058] As linhagens de célula foram lisadas em tampão RIPA (Boston BioProducts) mais coquetel inibidor de protease (Mini-completo, livre de EDTA, Roche) e inibidor de fosfatase PhosSTOP (Roche). Os lisados foram diluídos em tampão RIPA com 4X Tampão de Amostra LDS (Nupage, Thermo Fisher Scientific) e 10X Reagente Redutor (Nupage, Thermo Fisher Scientific) e fervidos durante 5 minutos. Vinte e cinco microgramas de proteína foram carregados por poço em 4 a 12% de géis de Bis-Tris SDS Page (Novex, Thermo Fisher Scientific). Os géis foram transferidos para membranas de nitrocelulose usando o sistema iBlot (Thermo Fisher Scientific). As membranas foram bloqueadas em tampão de bloqueio (1x
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Solução Salina Tamponada com Tris + 0,1% de Tween-20 (Boston Bioproducts) + 5% de Leite em Pó Desnatado (Bio-Rad)) durante 1 hora e depois cortadas.
Cada seção foi sondada separadamente com anticorpos para cada uma das seguintes proteínas no tampão de bloqueio: MCL1 (Cell Signaling Technologies 5453) (D35A5) monoclonal de coelho diluído 1:500, BCL-xL (Cell Signaling Technologies 2764) (54H6) monoclonal de coelho diluído 1:500, Cleaved Parp (Cell Signaling Technologies 5625) (D64P10) monoclonal de coelho diluído 1:500 e GAPDH (Sigma G8795) monoclonal de camundongo a 100 ng/mL.
As manchas foram incubadas com diluições de anticorpos primários agitando a 4ºC durante a noite.
Western blots foram depois manchadas com anticorpos secundários Odyssey Licor ou HRP.
As manchas foram depois lavadas quatro vezes usando tampão de lavagem (1x Solução Salina Tamponada com Tris + 0,1% de Tween-20). As manchas imageadas usando Licor foram sondadas agitando na temperatura ambiente durante 1 hora com anticorpos secundários rotulados com Licor IR, IgG anticoelho de Cabra IRDye® 800CW (Odyssey 925-32211) e IgG anticamundongo de Cabra IRDye® 680LT (Odyssey 925-68020) diluída 1:10.000 em tampão de bloqueio.
As manchas foram depois lavadas três vezes com tampão de lavagem.
A detecção de corante IR foi realizada usando o sistema de imageamento Licor (Odyssey) de acordo com a instrução do fabricante.
As manchas imageadas usando HRP foram sondadas agitando na temperatura ambiente durante 1 hora com IgG anticamundongo, anticorpo ligado a HRP (Cell Signaling Technologies 7076) e IgG anticoelho, Anticorpo ligado a HRP (Cell Signaling Technologies 7074) diluído 1:5000 em tampão de bloqueio.
As manchas foram depois lavadas três vezes com tampão de lavagem.
A detecção de HRP foi realizada usando SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate (Thermo Fisher Scientific) e imageado com imageador biomolecular ImageQuant® LAS 4000 (GE Healthcare Life Sciences) de acordo com as instruções do fabricante.
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3. PCR em tempo real quantitativa de protocolo MCL1
[0059] Os lisados de RNA foram isolados das células tratadas com compostos em placas de 96 poços e transcritos de modo reverso usando o Kit TaqMan Gene Expression Cells-to-CT (Thermo Fisher Scientific) de acordo com as instruções do fabricante. A PCR quantitativa foi realizada usando TaqMan Gene Expression Master Mix (Thermo Fisher Scientific) com sondas transcritas em MCL1 (Integrated DNA technologies FAM-ZEN/IBFQ) duplexados com 18S rRNA VIC-PL (Thermo Fisher Scientific ID do ensaio Hs99999901_s1) e quantificado usando o método ΔΔCt. Conjunto de sonda MCL1L
[0060] iniciador ATATGCCAAACCAGCTCCTAC iniciador AAGGACAAAACGGGACTGG sonda AGAACTCCACAAACCCATCCCAGC Conjunto de sonda MCL1S
[0061] iniciador AAAGCCAATGGGCAGGT iniciador CCACCTTCTAGGTCCTCTACAT sonda TCCACAAACCCATCTTGGAAGGCC Conjunto de sonda MCL1 pré-mRNA intron1-exon2
[0062] iniciador GACAAAGGAGGCCGTGAGGA iniciador GTTTGTTACGCCGTCGCTGAAA sonda TCAGGCATGCTTCGGAAACTGGA
4. Protocolo de shRNA e cDNA indutível
[0063] BCL-xL shRNA 1 (GCTCACTCTTCAGTCGGAAAT) (Wei G, et al., 2012, Cancer Cell 21(4): 547–562) foi clonado em AgeI e EcoRI do vetor puro pLKO-iKD-H1 lentiviral indutível em Tet (Wiederschain D, et al., 2009, Cell Cicle 8(3): 498-504). MCL1 shRNA 48 (GCATCGAACCATTAGCAGAAA) (Wei G, et al., 2012, Cancer Cell 21(4): 547–56) foi clonado em AgeI e EcoRI do vetor puro pLKO-iKD-U6 lentiviral indutível em Tet. MCL1-L pENTR-D-TOPO foi clonado em Gateway (LR
23 / 29 clonase, Thermo Fisher Scientific) em pINDUCER20 (Meerbrey KL, et al., 2011, Proc Natl Acad Sci U S A. 108(9): 3665-3670). Lentivírus foram preparados em células LentiX-293T. 2,5 M de células em placas de 10 cm Biocoat Collagen II (Corning) foram transfectadas com 2,4 µg de plasmídeo alvo pLKO-shRNA ou pINDUCER20, mais 2,4 µg de pΔ8,91 (embalagem) e 0,6 µg VSVG (envelope) usando reagente TransIT (Mirus). pINDUCER20 + MCL1-L, vetor pINDUCER20, vírus vetoriais pLKO-iKD-U6 puro + MCL1 shRNA 48 e pLKO-iKD-U6 puro foram usados para infectar A549, NCI-H23, NCI-H1568, NCI-H1650, NCI-H1975 e NCI-H2110. Os vírus pLKO-iKD-H1 puro + BCL-xL shRNA 1 e pLKO-iKD-H1 puro foram usados para infectar A549, NCI-H23, NCI-H1568 e NCI-H2110. As células foram infectadas com ou sem infecção por rotação usando Polibrene (Millipore). Um a três dias depois da infecção, as células foram cultivadas em Geneticina (pINDUCER20) ou Puromicina (pLKO shRNAs). As células selecionadas foram cultivadas na presença ou ausência de Dox (300 ng/ml). As células foram colhidas para proteína e RNA três a cinco dias após a indução. O RNA foi isolado como na seção de PCR em tempo real MCL1. Os extratos de proteína foram preparados como na seção de Procedimento de Western Blot de MCL1 e BCL-xL acima.
5. Viabilidade Celular e protocolo de recuperação MCL1
[0064] Para experimentos de shRNA indutível, as células foram cultivadas em 96 poços com ou sem 300 ng/mL de Dox durante 72 horas e depois lisadas com Ensaio de Viabilidade celular Luminescente CellTiter-Glo (Promega) de acordo com as instruções do fabricante e analisadas usando Perkin-Elmer Envision. Os poços tratados com Dox foram normalizados para nenhum tratamento para cada linhagem de célula.
[0065] Para os experimentos de dose de composto-resposta, as células foram plaqueadas em placas de 96 ou 384 poços a 1.000 células em 50 µl por poço. Os compostos foram adicionados a partir de uma série de diluições em
24 / 29 série de 11 pontos em 90% de DMSO às células em média pela transferência acústica. A concentração de DMSO final foi de 0,1%. As placas foram tampadas e as células foram deixadas crescer a 37°C e 5% de CO2. Em t = 0, as células não tratadas foram lisadas com CellTiter-Glo e medidas em uma leitora de placa Envision. Em t = 72 (72 horas depois da adição de composto), as células tratadas com composto foram lisadas com CellTiter-Glo e analisadas no Envision. O valor de luminescência de cada amostra de tratamento foi normalizada para o valor médio do respectivo controle de DMSO.
[0066] Para os experimentos de recuperação de MCL1, as linhagens de célula foram cultivadas durante 72 horas com 300 ng/mL de dox, depois subcultivadas e semeadas em placas de 96 ou 384 poços com 300 ng/mL de dox.
6. Estudos de Combinação
[0067] As diluições de composto em série foram realizadas para um modulador de junção (por exemplo, E7107 ou H3B-8800) e um inibidor de BCL2, BCL2/BCLxL ou BCLxL (por exemplo, ABT263, ABT199 ou A- 1331852) e células foram tratadas como debatido na Viabilidade Celular e protocolo de recuperação de MCL1. Para silenciamento BCL-xL, as células foram tratadas com 300 ng/mL de dox como para a Viabilidade Celular e protocolo de recuperação de MCL1 antes da semeadura em placas de 384 poços. A concentração de DMSO final foi de 0,2%. CellTiter-Glo foi realizado como para a Viabilidade celular e o protocolo de recuperação de MCL1. Os dados foram analisados usando o software Chalice Bioinformatics (Horizon Discovery, Cambridge, UK). Para estimar a sinergia do composto para um modulador de junção (por exemplo, E7107 ou H3B-8800) e um inibidor de BCL2, BCL2/BCLxL ou BCLxL (por exemplo, ABT263, ABT199 ou A-1331852), o modelo Horizon Discovery’s Loewe Additivity foi usado e Loewe Excess foi calculado subtraindo-se o Modelo Loewe
25 / 29 (aditividade pura com base no composto autocruzado) da matriz de Dose- Resposta.
7. Estudos com Animal
[0068] Para identificar a doses tolerada a usar para o ramo de combinação do estudo de eficácia, camundongos são administrados com modulador de spliceossoma (por exemplo, E7107 ou H3B-8800) intravenosamente uma vez ao dia durante 5 dias consecutivos (QDx5) em níveis de dose bem toleradas (por exemplo, 1,25, 2,5 e 5 mg/kg para E7107) ou o inibidor BCL2, BCL2/BCLxL ou BCLxL oralmente uma vez ao dia (QD) nas doses toleradas (100, 50 e 25 mg/kg) sozinhos ou em combinação. Depois da dosagem, os animais são monitorados até que o problema de saúde desenvolvesse (por exemplo, paralisia ou perda de peso corporal excessiva). A dose de combinação tolerada máxima e as respectivas doses únicas de cada composto são usadas no estudo de eficácia em animais portando tumor.
[0069] A atividade antitumor da combinação de E7107 e inibidor de BCL2, BCL2/BCLxL ou BCLxL é avaliada in vivo em um modelo subcutâneo de A549 e NCIH1568. As células (H1568 5 x 106 e A549 10 x 106 células) são subcutaneamente implantadas no flanco de camundongos nus. Os animais são administrados com modulador de spliceossoma e um inibidor de BCL2, BCL2/BCLxL ou BCLxL com base nas doses identificadas no estudo anterior. B. Resultados
1. Identificação de linhagens de célula NSCLC superexpressas em MCL1 e dependentes de MCL1
[0070] De modo a identificar os modelos de linhagem de célula para avaliar a atividade combinatória de moduladores de pladienolídeos spliceossoma e inibidores de BCL2, BCL2/BCLxL ou BCLxL, seis linhagens de célula de carcinoma pulmonar de célula não pequena (NSCLC) com ou sem amplificação de MCL1 foram selecionadas com base em um relato
26 / 29 anterior (Wei G, et al., 2012, Cancer Cell 21(4): 547–562). A Análise de Western Blot foi conduzida para a expressão de proteína MCL1 nestas linhagens de célula. Como mostrado na FIG. 1, NCIH1568, NCIH23 e NCIH2110 amplificadas no gene MCL1 expressam níveis mais altos de expressão de MCL1 em comparação com linhagens de célula NCIH1650, NCIH1975 e A549 não amplificadas. Em seguida, a dependência sobre MCL1 foi testada nestas linhagens de célula usando um shRNA indutível que especificamente infrarregula MCL1, demonstrando uma dependência de MCL seletiva nas linhagens de célula amplificadas com MCL mas não nas não amplificadas (FIG. 2). Os modelos da linhagem de célula NSCLC superexpressas em MCL1 e dependentes de MCL1 foram identificados para uso em estudos funcionais adicionais.
2. E7107 induz a modulação de junção de MCL1
[0071] A modulação da junção do gene MCL1 pelos derivados de pladienolídeos E7107 foi estudada. O gene MCL1 contém três exons e dois introns que podem ser alternativamente unidos a dois transcritos principais: MCL1L que codifica a proteína de tamanho completo funcional e MCL1S que codifica uma proteína de perda de função putativa (FIG. 3). Como parte do estudo, a retenção de intron de MCL1 foi medida visto que E7107 perturba o mecanismo de junção. O tratamento de seis horas das células NCIH1568 com E7107 induziu a redução robusta de mRNA de MCL1L, expressão transitória de mRNA de MCL1S e indução contínua do pré-mRNA MCL1 com retenção de intron (FIG. 4).
[0072] A expressão de proteína de MCL1 foi adicionalmente testada nas células NCIH1568. Compatível com os dados de mRNA, E7107 deflagrou uma infrarregulagem dependente da dose da proteína MCL1 de tamanho completo, ao passo que um produto de proteína de forma curta truncada foi aumentado em uma maneira dependente da dose. A alteração dos níveis de proteína de MCL foi associada com uma indução da proteína de
27 / 29 PARP clivada que é um indicador de apoptose, sugerindo que a modulação da junção de MCL1 pelo E7107 pode causar a morte da célula nas células NCIH1568 (FIG. 5).
3. A morte celular induzida por E7107 é dependente de MCL1 e BCLxL
[0073] Para confirmar que a infrarregulagem induzida por E7107 de MCL1 é a causa de morte celular, o cDNA de MCL1L foi superexpresso nas células NCIH1568, como mostrado pela Análise de Western Blot (FIG. 6). A superexpressão de cDNA de MCL1L recuperou a morte celular induzida por E7107 na linhagem de célula dependente de MCL1 (FIG. 7). O papel de BCLxL (codificado por BCL2L1) nas células A549 tratadas com E7107 independentes de MCL1 foi adicionalmente explorado. Embora E7107 induzisse apenas uma inibição citostática como esperado, silenciamento indutível de BCLxL (FIG. 8) levou a uma morte celular certa no tratamento com E7107 (FIG. 9). Em resumo, estes dados sustentam que a inibição tanto de MCL1 quanto de BCLxL resulta na atividade sinergística levando à citotoxicidade nas células cancerosas tanto dependente quanto independentes de MCL1.
4. A combinação de E7107 com inibidores de BCL2, BCL2/BCLxL ou BCLxL demonstra efeito sinergístico
[0074] Visto que E7107 pode modular MCL1 e outras proteínas BCL2 podem agir contra a citotoxicidade induzida pela inibição de MCL1, a combinação de E7107 com inibidores de BCL2, BCL2/BCLxL ou BCLxL pode prover morte celular realçada através de alvejamento amplo de todas as proteínas BCL2 antiapoptóticas.
[0075] ABT263 (Navitoclax), um inibidor total de BCL2/BCLxL/BCLw, foi testado em combinação com E7107 em um modo de matriz de dose 8 x 8 (FIG. 10). De fato, a combinação dos dois inibidores mostrou efeito sinergístico forte com excesso grande em relação ao modelo de aditividade de Loewe (FIG. 10, painéis esquerdos) em quatro modelos de
28 / 29 linhagem de célula expressando vetor vazio diferentes incluindo NCIH23 dependente de MCL1 (contagem de sinergia = 50,8), NCIH2110 (contagem de sinergia = 50,2), NCIH1568 (contagem de sinergia = 35,2) e células A549 independentes de MCL1 (contagem de sinergia = 85,4). Além disso, a depleção de shRNA de BCLxL amplamente diminuiu esta sinergia entre E7107 e ABT263 (FIG. 10, painéis direitos), confirmando que a manipulação genética de shRNA e o inibidor farmacológico (ABT263) impingiu no mesmo nó BCLxL para alcançar o efeito sinergístico. Especificamente, a contagem de sinergia é enormemente reduzida na NCIH23 (7,42), NCIH2110 (7,03), NCIH1568 (12,7) e A549 (28,3).
[0076] ABT199 (venetoclax) também foi testado em combinação com E7107. ABT199 é um inibidor mais seletivo de BCL2 que é ativo no BCLxL. A combinação de E7107 e ABT199 nas células A549 independentes de MCL1 demonstraram uma atividade sinergística (contagem = 32,6), ao passo que silenciamento de BCLxL enormemente reduziu o sinergismo (contagem = 16,4) (FIG. 11).
5. A combinação de H3B-8800 com inibidores de BCL2, BCL2/BCLxL ou BCLxL demonstra efeito sinergístico
[0077] H3B-8800, um outro modulador de junção alvejando SF3b, também foi avaliado quanto à atividade sinergística potencial com inibidores de BCL2/BCLxL, que pode prover morte celular realçada através de alvejamento amplo de todas as proteínas BCL2 antiapoptóticas.
[0078] ABT263 (Navitoclax), um inibidor total de BCL2/BCLxL/BCLw, foi testado em combinação com H3B-8800 em um modo de matriz de dose 12 x 12. A combinação dos dois inibidores mostrou efeito sinergístico forte com grande excesso em relação ao modelo de aditividade de Loewe (FIG. 12) em dois modelos de linhagem de célula de mieloma múltiplo diferentes incluindo U266B1 (contagem de sinergia = 41,3) e RPMI8226 (contagem de sinergia = 40,1).
29 / 29
[0079] ABT199 (venetoclax) também foi testado em combinação com H3B-8800. ABT199 é um inibidor mais seletivo de BCL2 que é ativo no BCLxL. A combinação de H3B-8800 e ABT199 também demonstrou uma atividade sinergística em dois modelos de linhagem de célula de mieloma múltiplo testados JJN3 (contagem de sinergia = 26,1) e RPMI8226 (contagem de sinergia = 19) (FIG. 13).
[0080] Além disso, A-1331852 também foi testado em combinação com H3B-8800. A-1331852 é um inibidor mais seletivo de BCLxL. A combinação de H3B-880 e A-1331852 demonstrou uma atividade sinergística substancial em dois modelos de linhagem de célula de mieloma múltiplo testados RPMI8226 (contagem de sinergia = 68,3) e MM1S (contagem de sinergia = 56,8) (FIG. 14).
[0081] Quando juntos, estes dados indicam que a combinação de moduladores de junção derivados de pladienolídeos (por exemplo, E7107 ou H3B-8800) com inibidores de BCL2, BCL2/BCLxL ou BCLxL (por exemplo, ABT263, ABT199 ou A-1331852) induz citotoxicidade sinergística em uma variedade de células cancerosas. Estes dados portanto sustentam usar a combinação de moduladores de junção de pladienolídeos e inibidores de BCL2, BCL2/BCLxL ou BCLxL no tratamento de câncer.

Claims (126)

1 / 19 REIVINDICAÇÕES
1. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende (i) uma quantidade terapeuticamente eficaz de pelo menos um modulador de spliceossoma e (ii) uma quantidade terapeuticamente eficaz de pelo menos um inibidor escolhido de inibidores de BCL2, inibidores de BCL2/BCLxL e inibidores de BCLxL.
2. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o pelo menos um modulador de spliceossoma é escolhido de derivados de pladienolídeos.
3. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que o pelo menos um modulador de spliceossoma é escolhido de E7107, H3B-8800 e sais farmaceuticamente aceitáveis do mesmo.
4. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que o pelo menos um modulador de spliceossoma é escolhido de E7107 e sais farmaceuticamente aceitáveis do mesmo.
5. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que o pelo menos um modulador de spliceossoma é escolhido de H3B-8800 e sais farmaceuticamente aceitáveis do mesmo.
6. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que o pelo menos um modulador de spliceossoma é estereoisomericamente puro.
7. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que o pelo menos um modulador de spliceossoma compreende mais do que cerca de 80% em peso de um estereoisômero.
8. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das
2 / 19 reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que o pelo menos um modulador de spliceossoma compreende mais do que cerca de 90% em peso de um estereoisômero.
9. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que o pelo menos um modulador de spliceossoma compreende mais do que cerca de 95% em peso de um estereoisômero.
10. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que o pelo menos um modulador de spliceossoma compreende mais do que cerca de 97% em peso de um estereoisômero.
11. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizada pelo fato de que o pelo menos um inibidor é escolhido de HA14-1, BH3I-1, antimicina A, cheleritrina, gossipol (NSC19048), apogossipol (NSC736630), TW-37, 4-(3-metóxi-fenilsulfonil)- 7-nitro-benzofuran-3-óxido (MNB), TM12-06, obatoclax (GX15-070), venetoclax (ABT199), navitoclax (ABT263), A-1331852, ABT737 e sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos.
12. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizada pelo fato de que o pelo menos um inibidor é escolhido de venetoclax (ABT199), navitoclax (ABT263), A- 1331852, ABT737 e sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos.
13. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizada pelo fato de que o pelo menos um inibidor é escolhido de venetoclax (ABT199) e sais farmaceuticamente aceitáveis do mesmo.
14. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizada pelo fato de que o pelo menos um inibidor é escolhido de navitoclax (ABT263) e sais farmaceuticamente
3 / 19 aceitáveis do mesmo.
15. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizada pelo fato de que o pelo menos um inibidor é escolhido de ABT737 e sais farmaceuticamente aceitáveis do mesmo.
16. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizada pelo fato de que o pelo menos um inibidor é escolhido de A-1331852 e sais farmaceuticamente aceitáveis do mesmo.
17. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizada pelo fato de que o pelo menos um modulador de spliceossoma é formulado para administração intravenosa, oral, subcutânea ou intramuscular.
18. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, caracterizada pelo fato de que o pelo menos um modulador de spliceossoma é formulado para a administração oral.
19. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, caracterizada pelo fato de que o pelo menos um inibidor é formulado para administração intravenosa, oral, subcutânea ou intramuscular.
20. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19, caracterizada pelo fato de que o pelo menos um inibidor é formulado para administração oral.
21. Combinação, caracterizada pelo fato de que compreende (i) pelo menos um modulador de spliceossoma e (ii) pelo menos um inibidor escolhido de inibidores de BCL2, inibidores de BCL2/BCLxL e inibidores de BCLxL, para uso no tratamento de câncer, em que o pelo menos um modulador de spliceossoma é administrado simultaneamente, separadamente ou sequencialmente com o pelo menos um inibidor.
4 / 19
22. Combinação para uso de acordo com a reivindicação 21, caracterizada pelo fato de que o pelo menos um modulador de spliceossoma é escolhido de derivados de pladienolídeos.
23. Combinação para uso de acordo com a reivindicação 21 ou 22, caracterizada pelo fato de que o pelo menos um modulador de spliceossoma é escolhido de E7107, H3B-8800 e sais farmaceuticamente aceitáveis do mesmo.
24. Combinação para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 23, caracterizada pelo fato de que o pelo menos um modulador de spliceossoma é escolhido de E7107 e sais farmaceuticamente aceitáveis do mesmo.
25. Combinação para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 23, caracterizada pelo fato de que o pelo menos um modulador de spliceossoma é escolhido de H3B-8800 e sais farmaceuticamente aceitáveis do mesmo.
26. Combinação para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 25, caracterizada pelo fato de que o pelo menos um modulador de spliceossoma é estereoisomericamente puro.
27. Combinação para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 25, caracterizada pelo fato de que o pelo menos um modulador de spliceossoma compreende mais do que cerca de 80% em peso de um estereoisômero.
28. Combinação para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 25, caracterizada pelo fato de que o pelo menos um modulador de spliceossoma compreende mais do que cerca de 90% em peso de um estereoisômero.
29. Combinação para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 25, caracterizada pelo fato de que o pelo menos um modulador de spliceossoma compreende mais do que cerca de 95% em peso
5 / 19 de um estereoisômero.
30. Combinação para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 25, caracterizada pelo fato de que o pelo menos um modulador de spliceossoma compreende mais do que cerca de 97% em peso de um estereoisômero.
31. Combinação para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 30, caracterizada pelo fato de que o pelo menos um inibidor é escolhido de HA14-1, BH3I-1, antimicina A, cheleritrina, gossipol (NSC19048), apogossipol (NSC736630), TW-37, 4-(3-metóxi-fenilsulfonil)- 7-nitro-benzofuran-3-óxido (MNB), TM12-06, obatoclax (GX15-070), venetoclax (ABT199), navitoclax (ABT263), A-1331852, ABT737 e sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos.
32. Combinação para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 31, caracterizada pelo fato de que o pelo menos um inibidor é escolhido de venetoclax (ABT199), navitoclax (ABT263), A- 1331852, ABT737 e sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos.
33. Combinação para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 32, caracterizada pelo fato de que o pelo menos um inibidor é escolhido de venetoclax (ABT199) e sais farmaceuticamente aceitáveis do mesmo.
34. Combinação para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 32, caracterizada pelo fato de que o pelo menos um inibidor é escolhido de navitoclax (ABT263) e sais farmaceuticamente aceitáveis do mesmo.
35. Combinação para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 32, caracterizada pelo fato de que o pelo menos um inibidor é escolhido de ABT737 e sais farmaceuticamente aceitáveis do mesmo.
36. Combinação para uso de acordo com qualquer uma das
6 / 19 reivindicações 21 a 32, caracterizada pelo fato de que o pelo menos um inibidor é escolhido de A-1331852 e sais farmaceuticamente aceitáveis do mesmo.
37. Combinação para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 36, caracterizada pelo fato de que o pelo menos um modulador de spliceossoma é formulado para a administração intravenosa, oral, subcutânea ou intramuscular.
38. Combinação para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 37, caracterizada pelo fato de que o pelo menos um modulador de spliceossoma é formulado para a administração oral.
39. Combinação para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 38, caracterizada pelo fato de que o pelo menos um inibidor é formulado para a administração intravenosa, oral, subcutânea ou intramuscular.
40. Combinação para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 39, caracterizada pelo fato de que o pelo menos um inibidor é formulado para a administração oral.
41. Combinação para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 40, caracterizada pelo fato de que o pelo menos um modulador de spliceossoma é administrado simultaneamente com o pelo menos um inibidor.
42. Combinação para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 40, caracterizada pelo fato de que o pelo menos um modulador de spliceossoma é administrado sequencialmente com o pelo menos um inibidor.
43. Combinação para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 40, caracterizada pelo fato de que o pelo menos um modulador de spliceossoma é administrado separadamente com o pelo menos um inibidor.
7 / 19
44. Combinação para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 43, caracterizada pelo fato de que o dito câncer é escolhido de síndrome mielodisplástica, mieloma múltiplo, leucemia linfocítica crônica, leucemia linfoblástica aguda, leucemia mielomonocítica crônica, leucemia mieloide aguda, câncer de cólon, câncer pancreático, câncer endometrial, câncer ovariano, câncer mamário, melanoma uveal, câncer gástrico, colangiocarcinoma e câncer pulmonar.
45. Combinação para uso de acordo com a reivindicação 44, caracterizada pelo fato de que o dito câncer é câncer pulmonar.
46. Combinação para uso de acordo com a reivindicação 45, caracterizada pelo fato de que o dito câncer pulmonar é escolhido de carcinoma pulmonar de célula não pequena e carcinoma pulmonar de célula pequena.
47. Combinação para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 43, caracterizada pelo fato de que o dito câncer é escolhido de cânceres hematológicos.
48. Combinação para uso de acordo com a reivindicação 47, caracterizada pelo fato de que o dito câncer hematológico é escolhido de leucemia linfoblástica aguda, leucemia mielógena aguda, leucemia linfocítica crônica, leucemia mielógena crônica, leucemia mielomonocítica crônica, leucemia monocítica aguda, linfoma de Hodgkin, linfoma de não Hodgkin, síndrome mielodisplástica e mieloma múltiplo.
49. Combinação para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 43, caracterizada pelo fato de que o dito câncer é escolhido de tumores sólidos.
50. Combinação para uso de acordo com a reivindicação 49, caracterizada pelo fato de que o dito tumor sólido é escolhido de câncer mamário, câncer pancreático, câncer prostático, câncer de cólon ou colorretal, câncer pulmonar, câncer gástrico, câncer cervical, câncer endometrial, câncer
8 / 19 ovariano, colangiocarcinoma, glioma e melanoma.
51. Combinação para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 43, caracterizada pelo fato de que o dito câncer é escolhido de cânceres dependentes de MCL1.
52. Combinação para uso de acordo com a reivindicação 51, caracterizada pelo fato de que o dito câncer dependente de MCL1 é selecionado dentre leucemia linfoblástica aguda, leucemia mielógena aguda, leucemia linfocítica crônica, leucemia mielógena crônica, leucemia mielomonocítica crônica, leucemia monocítica aguda, linfoma de Hodgkin, linfoma de não Hodgkin, síndrome mielodisplástica, mieloma múltiplo, câncer pulmonar, câncer mamário, câncer pancreático, câncer prostático, câncer de cólon ou colorretal, câncer gástrico, câncer cervical, câncer endometrial, câncer ovariano, colangiocarcinoma, glioma e melanoma.
53. Combinação para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 43, caracterizada pelo fato de que o dito câncer é positivo para uma ou mais mutações em um gene ou proteína de spliceossoma.
54. Combinação para uso de acordo com a reivindicação 53, caracterizada pelo fato de que o dito gene ou proteína de spliceossoma é escolhido de fator de junção 3B subunidade 1 (SF3B1), fator 1 auxiliar de RNA nuclear pequeno U2 (U2AF1), fator de junção rico em serina/arginina 2 (SRSF2), motivo de ligação de RNA de dedo de zinco (tipo CCCH) e rico em serina/arginina 2 (ZRSR2), fator de junção de processamento de pré-mRNA 8 (PRPF8), fator 2 auxiliar de RNA nuclear pequeno U2 (U2AF2), fator de junção 1 (SF1), fator de junção 3a subunidade 1 (SF3A1), homólogo B do fator 40 de processamento de pré-mRNA PRP40 (PRPF40B), proteína 10 de motivo de ligação de RNA (RBM10), proteína de ligação de poli(rC) 1 (PCBP1), fator de junção 1 de pré-mRNA de pescoço torto (CRNKL1), caixa DEAH (Asp-Glu-Ala-His) helicase 9 (DHX9), peptidil-prolil cis-trans tipo isomerase 2 (PPIL2), proteína do motivo de ligação de RNA 22 (RBM22),
9 / 19 ribonucleoproteína nuclear pequena Sm D3 (SNRPD3), helicase DDX5 de RNA dependente de ATP provável (DDX5), helicase DDX15 de RNA dependente do fator de junção de ATP pré-mRNA (DHX15) e proteína de ligação de poliadenilato 1 (PABPC1).
55. Combinação para uso de acordo com a reivindicação 54, caracterizada pelo fato de que o dito gene ou proteína de spliceossoma é o fator de junção 3B subunidade 1 (SF3B1).
56. Uso de uma combinação, caracterizado pelo fato de que compreende (i) pelo menos um modulador de spliceossoma e (ii) pelo menos um inibidor escolhido de inibidores de BCL2, inibidores de BCL2/BCLxL e inibidores de BCLxL, na fabricação de um medicamento para o tratamento de câncer, em que o pelo menos um modulador de spliceossoma é administrado simultaneamente, separadamente ou sequencialmente com o pelo menos um inibidor.
57. Uso de acordo com a reivindicação 56, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um modulador de spliceossoma é escolhido de derivados de pladienolídeos.
58. Uso de acordo com a reivindicação 56 ou 57, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um modulador de spliceossoma é escolhido de E7107, H3B-8800 e sais farmaceuticamente aceitáveis do mesmo.
59. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 56 a 58, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um modulador de spliceossoma é escolhido de E7107 e sais farmaceuticamente aceitáveis do mesmo.
60. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 56 a 58, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um modulador de spliceossoma é escolhido de H3B-8800 e sais farmaceuticamente aceitáveis do mesmo.
61. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 56 a
10 / 19 58, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um modulador de spliceossoma é estereoisomericamente puro.
62. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 56 a 58, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um modulador de spliceossoma compreende mais do que cerca de 80% em peso de um estereoisômero.
63. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 56 a 58, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um modulador de spliceossoma compreende mais do que cerca de 90% em peso de um estereoisômero.
64. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 56 a 58, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um modulador de spliceossoma compreende mais do que cerca de 95% em peso de um estereoisômero.
65. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 56 a 58, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um modulador de spliceossoma compreende mais do que cerca de 97% em peso de um estereoisômero.
66. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 56 a 65, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um inibidor é escolhido de HA14-1, BH3I-1, antimicina A, cheleritrina, gossipol (NSC19048), apogossipol (NSC736630), TW-37, 4-(3-metóxi-fenilsulfonil)-7-nitro- benzofuran-3-óxido (MNB), TM12-06, obatoclax (GX15-070), venetoclax (ABT199), navitoclax (ABT263), A-1331852, ABT737 e sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos.
67. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 56 a 66, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um inibidor é escolhido de venetoclax (ABT199), navitoclax (ABT263), A-1331852, ABT737 e sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos.
11 / 19
68. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 56 a 67, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um inibidor é escolhido de venetoclax (ABT199) e sais farmaceuticamente aceitáveis do mesmo.
69. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 56 a 67, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um inibidor é escolhido de navitoclax (ABT263) e sais farmaceuticamente aceitáveis do mesmo.
70. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 56 a 67, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um inibidor é escolhido de ABT737 e sais farmaceuticamente aceitáveis do mesmo.
71. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 56 a 67, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um inibidor é escolhido de A- 1331852 e sais farmaceuticamente aceitáveis do mesmo.
72. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 56 a 71, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um modulador de spliceossoma é formulado para a administração intravenosa, oral, subcutânea ou intramuscular.
73. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 56 a 72, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um modulador de spliceossoma é formulado para a administração oral.
74. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 56 a 73, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um inibidor é formulado para a administração intravenosa, oral, subcutânea ou intramuscular.
75. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 56 a 74, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um inibidor é formulado para a administração oral.
76. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 56 a 75, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um modulador de spliceossoma é administrado simultaneamente com o pelo menos um inibidor.
77. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 56 a
12 / 19 75, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um modulador de spliceossoma é administrado sequencialmente com o pelo menos um inibidor.
78. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 56 a 75, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um modulador de spliceossoma é administrado separadamente com o pelo menos um inibidor.
79. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 56 a 78, caracterizado pelo fato de que o dito câncer é escolhido dentre síndrome mielodisplástica, mieloma múltiplo, leucemia linfocítica crônica, leucemia linfoblástica aguda, leucemia mielomonocítica crônica, leucemia mieloide aguda, câncer de cólon, câncer pancreático, câncer endometrial, câncer ovariano, câncer mamário, melanoma uveal, câncer gástrico, colangiocarcinoma e câncer pulmonar.
80. Uso de acordo com a reivindicação 79, caracterizado pelo fato de que o dito câncer é câncer pulmonar.
81. Uso de acordo com a reivindicação 80, caracterizado pelo fato de que o dito câncer pulmonar é escolhido de carcinoma pulmonar de célula não pequena e carcinoma pulmonar de célula pequena.
82. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 56 a 78, caracterizado pelo fato de que o dito câncer é escolhido de cânceres hematológicos.
83. Uso de acordo com a reivindicação 82, caracterizado pelo fato de que o dito câncer hematológico é escolhido de leucemia linfoblástica aguda, leucemia mielógena aguda, leucemia linfocítica crônica, leucemia mielógena crônica, leucemia mielomonocítica crônica, leucemia monocítica aguda, linfoma de Hodgkin, linfoma de não Hodgkin, síndrome mielodisplástica e mieloma múltiplo.
84. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 56 a 78, caracterizado pelo fato de que o dito câncer é escolhido de tumores sólidos.
13 / 19
85. Uso de acordo com a reivindicação 84, caracterizado pelo fato de que o dito tumor sólido é escolhido dentre câncer mamário, câncer pancreático, câncer prostático, câncer de cólon ou colorretal, câncer pulmonar, câncer gástrico, câncer cervical, câncer endometrial, câncer ovariano, colangiocarcinoma, glioma e melanoma.
86. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 56 a 78, caracterizado pelo fato de que o dito câncer é escolhido dentre cânceres dependentes de MCL1.
87. Uso de acordo com a reivindicação 86, caracterizado pelo fato de que o dito câncer dependente de MCL1 é selecionado dentre leucemia linfoblástica aguda, leucemia mielógena aguda, leucemia linfocítica crônica, leucemia mielógena crônica, leucemia mielomonocítica crônica, leucemia monocítica aguda, linfoma de Hodgkin, linfoma de não Hodgkin, síndrome mielodisplástica, mieloma múltiplo, câncer pulmonar, câncer mamário, câncer pancreático, câncer prostático, câncer de cólon ou colorretal, câncer gástrico, câncer cervical, câncer endometrial, câncer ovariano, colangiocarcinoma, glioma e melanoma.
88. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 56 a 78, caracterizado pelo fato de que o dito câncer é positivo para uma ou mais mutações em um gene ou proteína de spliceossoma.
89. Uso de acordo com a reivindicação 88, caracterizado pelo fato de que o dito gene ou proteína de spliceossoma é escolhido dentre fator de junção 3B subunidade 1 (SF3B1), fator 1 auxiliar de RNA nuclear pequeno U2 (U2AF1), fator de junção rico em serina/arginina 2 (SRSF2), motivo de ligação de RNA de dedo de zinco (tipo CCCH) e rico em serina/arginina 2 (ZRSR2), fator de junção de processamento de pré-mRNA 8 (PRPF8), fator 2 auxiliar de RNA nuclear pequeno U2 (U2AF2), fator de junção 1 (SF1), fator de junção 3a subunidade 1 (SF3A1), homólogo B do fator 40 de processamento de pré-mRNA PRP40 (PRPF40B), proteína 10 de motivo de
14 / 19 ligação de RNA (RBM10), proteína de ligação de poli(rC) 1 (PCBP1), fator de junção 1 de pré-mRNA de pescoço torto (CRNKL1), caixa DEAH (Asp- Glu-Ala-His) helicase 9 (DHX9), peptidil-prolil cis-trans tipo isomerase 2 (PPIL2), proteína do motivo de ligação de RNA 22 (RBM22), ribonucleoproteína nuclear pequena Sm D3 (SNRPD3), helicase DDX5 de RNA dependente de ATP provável (DDX5), helicase DDX5 de RNA dependente do fator de junção de ATP pré-mRNA (DHX15) e proteína de ligação de poliadenilato 1 (PABPC1).
90. Uso de acordo com a reivindicação 89, caracterizado pelo fato de que o dito gene ou proteína de spliceossoma é fator de junção 3B subunidade 1 (SF3B1).
91. Método para tratar câncer, caracterizado pelo fato de que compreende administrar a um indivíduo em necessidade do mesmo (i) uma quantidade terapeuticamente eficaz de pelo menos um modulador de spliceossoma e (ii) uma quantidade terapeuticamente eficaz de pelo menos um inibidor escolhido de inibidores de BCL2, inibidores de BCL2/BCLxL e inibidores de BCLxL, em que o pelo menos um modulador de spliceossoma é administrado simultaneamente, separadamente ou sequencialmente com o pelo menos um inibidor.
92. Método de acordo com a reivindicação 91, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um modulador de spliceossoma é escolhido de derivados de pladienolídeos.
93. Método de acordo com a reivindicação 45 ou 92, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um modulador de spliceossoma é escolhido de E7107, H3B-8800 e sais farmaceuticamente aceitáveis do mesmo.
94. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 91 a 93, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um modulador de spliceossoma é escolhido de E7107 e sais farmaceuticamente aceitáveis do
15 / 19 mesmo.
95. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 91 a 93, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um modulador de spliceossoma é escolhido de H3B-8800 e sais farmaceuticamente aceitáveis do mesmo.
96. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 91 a 95, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um modulador de spliceossoma é estereoisomericamente puro.
97. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 91 a 95, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um modulador de spliceossoma compreende mais do que cerca de 80% em peso de um estereoisômero.
98. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 91 a 95, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um modulador de spliceossoma compreende mais do que cerca de 90% em peso de um estereoisômero.
99. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 91 a 95, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um modulador de spliceossoma compreende mais do que cerca de 95% em peso de um estereoisômero.
100. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 91 a 95, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um modulador de spliceossoma compreende mais do que cerca de 97% em peso de um estereoisômero.
101. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 91 a 100, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um inibidor é escolhido de HA14-1, BH3I-1, antimicina A, cheleritrina, gossipol (NSC19048), apogossipol (NSC736630), TW-37, 4-(3-metóxi-fenilsulfonil)-7-nitro- benzofuran-3-óxido (MNB), TM12-06, obatoclax (GX15-070), venetoclax
16 / 19 (ABT199), navitoclax (ABT263), A-1331852, ABT737 e sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos.
102. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 91 a 101, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um inibidor é escolhido de venetoclax (ABT199), navitoclax (ABT263), A-1331852, ABT737 e sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos.
103. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 91 a 102, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um inibidor é venetoclax (ABT199) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
104. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 91 a 102, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um inibidor é escolhido de navitoclax (ABT263) e sais farmaceuticamente aceitáveis do mesmo.
105. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 91 a 102, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um inibidor é escolhido de ABT737 e sais farmaceuticamente aceitáveis do mesmo.
106. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 91 a 102, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um inibidor é escolhido de A-1331852 e sais farmaceuticamente aceitáveis do mesmo.
107. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 91 a 106, caracterizado pelo fato de que o modulador de spliceossoma é formulado para a administração intravenosa, oral, subcutânea ou intramuscular.
108. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 91 a 107, caracterizado pelo fato de que o modulador de spliceossoma é formulado para a administração oral.
109. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 91 a 108, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um inibidor é formulado para a administração intravenosa, oral, subcutânea ou intramuscular.
17 / 19
110. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 91 a 109, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um inibidor é formulado para a administração oral.
111. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 91 a 110, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um modulador de spliceossoma e o pelo menos um inibidor são administrados sequencialmente.
112. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 91 a 110, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um modulador de spliceossoma e o pelo menos um inibidor são administrados separadamente.
113. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 91 a 110, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um modulador de spliceossoma e o pelo menos um inibidor são administrados simultaneamente.
114. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 91 a 113, caracterizado pelo fato de que o dito câncer é escolhido dentre síndrome mielodisplástica, mieloma múltiplo, leucemia linfocítica crônica, leucemia linfoblástica aguda, leucemia mielomonocítica crônica, leucemia mieloide aguda, câncer de cólon, câncer pancreático, câncer endometrial, câncer ovariano, câncer mamário, melanoma uveal, câncer gástrico, colangiocarcinoma e câncer pulmonar.
115. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 91 a 114, caracterizado pelo fato de que o dito câncer é câncer pulmonar.
116. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 91 a 115, caracterizado pelo fato de que o dito câncer é selecionado dentre carcinoma pulmonar de célula não pequena e carcinoma pulmonar de célula pequena.
117. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 91 a 113, caracterizado pelo fato de que o dito câncer é um câncer hematológico.
118. Método de acordo com a reivindicação 117, caracterizado
18 / 19 pelo fato de que o dito câncer hematológico é escolhido dentre linfoma de Hodgkin, linfoma de não Hodgkin, síndrome mielodisplástica, mieloma múltiplo, leucemia linfocítica crônica, leucemia linfoblástica aguda, leucemia mielógena aguda, leucemia mielógena crônica, leucemia mielomonocítica crônica e leucemia mieloide aguda.
119. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 91 a 113, caracterizado pelo fato de que o dito câncer é um tumor sólido.
120. Método de acordo com a reivindicação 119, caracterizado pelo fato de que o dito tumor sólido é escolhido dentre câncer de cólon ou colorretal, câncer pancreático, câncer endometrial, câncer ovariano, câncer mamário, melanoma, câncer gástrico, colangiocarcinoma, câncer prostático, câncer cervical, glioma e câncer pulmonar.
121. Método de acordo com a reivindicação 120, caracterizado pelo fato de que o dito melanoma é melanoma uveal.
122. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 91 a 113, caracterizado pelo fato de que o dito câncer é um câncer dependente de MCL1.
123. Método de acordo com a reivindicação 122, caracterizado pelo fato de que o dito câncer dependente de MCL1 é selecionado dentre leucemia linfoblástica aguda, leucemia mielógena aguda, leucemia linfocítica crônica, leucemia mielógena crônica, leucemia mielomonocítica crônica, leucemia monocítica aguda, linfoma de Hodgkin, linfoma de não Hodgkin, síndrome mielodisplástica, mieloma múltiplo, câncer pulmonar, câncer mamário, câncer pancreático, câncer prostático, câncer de cólon ou colorretal, câncer gástrico, câncer cervical, câncer endometrial, câncer ovariano, colangiocarcinoma, glioma e melanoma.
124. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 91 a 113, caracterizado pelo fato de que o dito câncer é positivo para uma ou mais mutações em um gene ou proteína de spliceossoma.
19 / 19
125. Método de acordo com a reivindicação 124, caracterizado pelo fato de que o dito gene ou proteína de spliceossoma é escolhido dentre fator de junção 3B subunidade 1 (SF3B1), fator 1 auxiliar de RNA nuclear pequeno U2 (U2AF1), fator de junção rico em serina/arginina 2 (SRSF2), motivo de ligação de RNA de dedo de zinco (tipo CCCH) e rico em serina/arginina 2 (ZRSR2), fator de junção de processamento de pré-mRNA 8 (PRPF8), fator 2 auxiliar de RNA nuclear pequeno U2 (U2AF2), fator de junção 1 (SF1), fator de junção 3a subunidade 1 (SF3A1), homólogo B do fator 40 de processamento de pré-mRNA PRP40 (PRPF40B), proteína 10 de motivo de ligação de RNA (RBM10), proteína de ligação de poli(rC) 1 (PCBP1), fator de junção 1 de pré-mRNA de pescoço torto (CRNKL1), caixa DEAH (Asp-Glu-Ala-His) helicase 9 (DHX9), peptidil-prolil cis-trans tipo isomerase 2 (PPIL2), proteína do motivo de ligação de RNA 22 (RBM22), ribonucleoproteína nuclear pequena Sm D3 (SNRPD3), helicase DDX5 de RNA dependente de ATP provável (DDX5), helicase DHX15 de RNA dependente do fator de junção de ATP pré-mRNA (DHX15) e proteína de ligação de poliadenilato 1 (PABPC1).
126. Método de acordo com a reivindicação 125, caracterizado pelo fato de que o dito gene ou proteína de spliceossoma é fator de junção 3B subunidade 1 (SF3B1).
diluição de lisado (%) amplificado não amplificado
Petição 870200052295, de 27/04/2020, pág. 62/88 níveis de MCL1 relativos (%) 1/24
% de crescimento (CTG)
MCL1 pré-mRNA alteração de número de mRNA (após 6 horas de exposição) MCL1 pré-mRNA
MCL1 truncado PARP clivado tubulina
+Vetor % de crescimento
% de crescimento vetor vazio contagem de sinergia matriz de dose excesso de Loewe
Petição 870200052295, de 27/04/2020, pág. 69/88 inibição do crescimento inibição do crescimento 8/24 contagem de sinergia matriz de dose excesso de Loewe inibição do crescimento inibição do crescimento matriz de dose contagem de sinergia excesso de Loewe
Petição 870200052295, de 27/04/2020, pág. 70/88 inibição do crescimento inibição do crescimento 9/24 contagem de sinergia matriz de dose excesso de Loewe inibição do crescimento inibição do crescimento contagem de sinergia matriz de dose excesso de Loewe
Petição 870200052295, de 27/04/2020, pág. 71/88 10/24 inibição do crescimento inibição do crescimento contagem de sinergia matriz de dose excesso de Loewe inibição do crescimento inibição do crescimento contagem de sinergia matriz de dose excesso de Loewe
Petição 870200052295, de 27/04/2020, pág. 72/88 11/24 inibição do crescimento inibição do crescimento contagem de sinergia matriz de dose excesso de Loewe inibição do crescimento inibição do crescimento vetor vazio contagem de sinergia matriz de dose excesso de Loewe
Petição 870200052295, de 27/04/2020, pág. 73/88 inibição do crescimento inibição do crescimento 12/24 contagem de sinergia matriz de dose excesso de Loewe inibição do crescimento inibição do crescimento
MATRIZ DE DOSE DE CONTAGEM DE SINERGIA excesso de Loewe
Petição 870200052295, de 27/04/2020, pág. 74/88 matriz de dose excesso de Loewe 13/24 inibição do crescimento inibição do crescimento inibição do crescimento
MODELO LOEWE
MODELO LOEWE inibição do crescimento excesso de Loewe inibição do crescimento matriz de dose inibição do crescimento
MODELO LOEWE
MATRIZ DE DOSE DE CONTAGEM DE SINERGIA excesso de Loewe matriz de dose excesso de Loewe
Petição 870200052295, de 27/04/2020, pág. 78/88 17/24 inibição do crescimento inibição do crescimento inibição do crescimento excesso de Loewe
MODELO LOEWE inibição do crescimento excesso de Loewe inibição do crescimento matriz de dose inibição do crescimento excesso de Loewe
MATRIZ DE DOSE DE CONTAGEM DE SINERGIA excesso de Loewe
Petição 870200052295, de 27/04/2020, pág. 82/88 matriz de dose excesso de Loewe 21/24 inibição do crescimento inibição do crescimento inibição do crescimento
MODELO LOEWE
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